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WO2014126160A1 - がんの検査方法及び検査用キット - Google Patents

がんの検査方法及び検査用キット Download PDF

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WO2014126160A1
WO2014126160A1 PCT/JP2014/053355 JP2014053355W WO2014126160A1 WO 2014126160 A1 WO2014126160 A1 WO 2014126160A1 JP 2014053355 W JP2014053355 W JP 2014053355W WO 2014126160 A1 WO2014126160 A1 WO 2014126160A1
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直彦 越川
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer testing method for detecting an EphA2 protein fragment by MT1-MMP processing.
  • RTK receptor tyrosine kinase
  • Erythropoietin-producing hepatocyte receptor A2 is a receptor tyrosine kinase that is widely expressed in normal epithelial cells.
  • Eph receptor type kinase there are 10 types of EphA and 6 types of EphB as subfamily members.
  • EphA2 is one of EphA.
  • Eph receptor ligands are classified into ephrin A and ephrin B subgroups. Five ephrin A members have glycosyl phosphatidylinositol (GPI) at the C-terminus and are anchored to the cell membrane, whereas ephrin B members are soluble.
  • GPI glycosyl phosphatidylinositol
  • EphA and ephrin A are bound by contact between cells expressing each other, and the interaction between EphA and ephrin A causes signal transduction in each cell.
  • A1, A3, A4 and A5 bind to EphA2.
  • Ephrin A1 has been studied as a typical EphA2 ligand present in a wide range of tissues in the ephrin family.
  • ephrinA1 binds to EphA2
  • autophosphorylation of tyrosine residues in the cytoplasmic tail of EphA2 is induced.
  • the resulting downstream signal inhibits growth factor receptor mediated signals such as ErbB receptors.
  • ErbB receptor stimulation promotes cell proliferation by activating H-ras / Erk1 / 2 and PI3-k / Akt, but p120Ras-GAP down-regulates Ras activation when EphA2 autophosphorylation occurs Are recruited and growth-promoting signals are suppressed. That is, EphA2 plays an important role in maintaining the epithelial cell phenotype and suppressing proliferation-promoting signals in a ligand-dependent manner.
  • EphA2 has been reported to be highly expressed in various malignant cancers such as breast cancer, liver cancer, prostate cancer, glioma, melanoma, ovarian adenocarcinoma, and esophageal cancer. Since it is also related to height and poor prognosis, it has been considered promising as a molecular target for anticancer drugs.
  • EphA2 behaves like an oncogene product that promotes tumor development in tumor cells. Forced expression of EphA2 in cultured cells and mice promoted cancer cell proliferation, motility, angiogenesis, invasion, and metastasis. For example, when only EphA2 was expressed in the human breast epithelial cell line MCF-10A, tumors developed in mice.
  • EphA2 High level expression of EphA2 caused trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer patients. These findings support the carcinogenic function of EphA2. Recently, it has been reported that the carcinogenic signals by EphA2 are caused by ligand-independent activation. In the absence of EphA2 ligand, Akt activity is not inhibited by EphA2, and ErbB receptor stimulation activates PI3K / Akt, resulting in phosphorylation of the cytoplasmic serine residue of EphA2. The GDP-GTP exchange factor Ephexin4 is recruited to a phosphorylated serine residue and activated with RhoG as a GTP conjugate, which subsequently recruits ELMO2, Dock4, and Rac1.
  • EphA2 and ErbB receptor stimulation cooperate to cause actin reconstitution required for cell motility and invasion.
  • RhoG activation by EphA2 promotes invasion of breast cancer cells by inducing the formation of membrane protrusions called invapopodia.
  • Ligand-independent EphA2 activation has also been implicated in anoikis resistance of breast cancer cells (see Non-Patent Documents 1-5 for literature on EphA2).
  • EphA2 makes cancer malignant
  • EphA2 has become more promising as a molecular target for anticancer agents.
  • EphA2 has the contradictory functions of stabilizing epithelial tissue and malignant cancer as described above
  • EphA2 in order to apply EphA2 to treatment reliably, the bidirectional function of EphA2 on cancer cells It was necessary to clarify the molecular mechanism of how it can be switched.
  • EphA2 ligands are often expressed in cancer cells, and it was unclear how EphA2 is activated in a tumor tissue in a ligand-independent manner.
  • MT1-MMP membrane-bound type 1 matrix metalloproteinase
  • MT1-MMP membrane-bound type 1 matrix metalloproteinase
  • the present invention elucidates the molecular mechanism by which EphA2 is activated in a cancer cell in a ligand-independent manner, makes EphA2 a more useful target for cancer treatment, and cancer using the mechanism. It is an object to provide an inspection method and the like.
  • EphA2 ligand binding domain of EphA2 is cleaved by MT1-MMP.
  • EphA2 ligand-dependent autophosphorylation is enhanced in cells in which MT1-MMP is knocked down; Erk1 / 2 and Akt activities induced by EGF in the presence of ligand are significantly increased by MT1-MMP knockdown.
  • EphA2 is also processed by MT1-MMP in cancer tissues in vivo, and that EphA2 is processed by MT1-MMP. It was confirmed to correlate strongly with cancer malignancy. Furthermore, when normal ovarian tissue and ovarian cancer tissue were immunostained using an antibody recognizing the N-terminal side of EphA2 and an antibody recognizing the C-terminal side, the cancer tissue was an antibody recognizing the N-terminal side. Since it was not stained, it was confirmed that EphA2 was cleaved in cancer tissue while EphA2 remained intact in normal tissue. Then, it was confirmed that this phenomenon occurred similarly in gastric cancer and colorectal cancer.
  • the present invention [1] A method for examining cancer, comprising a step of measuring the amount of an EphA2 protein fragment having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa in a sample derived from a subject; [2] The method according to [1] above, wherein the EphA2 protein fragment is a fragment containing the N-terminus of the EphA2 protein; [3] The method according to [1] above, wherein the EphA2 protein fragment is at least one peptide of the following (i) to (iii): (I) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4; (Ii) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 4; and (iii) represented by SEQ ID NO: 1 to 4 A peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity; [4] The method
  • An anticancer agent comprising a double-stranded RNA consisting of any of the following sequences or a precursor thereof, or a nucleic acid encoding them: siRNA # 1 S: ggauggacacggagaauuutt (SEQ ID NO: 6) AS: aaauucuccguguccaucctt (SEQ ID NO: 7) siRNA # 2 S: gcgaugaagucuucacuuatt (SEQ ID NO: 8) AS: uaagugaagacuucaucgctt (SEQ ID NO: 9), and siRNA # 3 S: ggguagagacccugagacatt (SEQ ID NO: 10) AS: ugucucagggucucuaccctct (SEQ ID NO: 11); and [17] a method for treating cancer comprising inhibiting the expression or function of MT1-MMP, About.
  • the cancer test method and test kit of the present invention it is possible to determine the occurrence, malignancy, prognosis, etc. of cancer by a simple method of detecting an EphA2 fragment cleaved by MT1-MMP. it can. Further, according to the screening method of the present invention, it is possible to select a molecular target drug candidate that suppresses only the ligand-independent activity of EphA2.
  • FIG. 1A shows the result of detecting MT1-MMP and Cph-terminal Myc-labeled EphA2 into human fibroblastoma HT1080 cells, and detecting EphA2 stumps cut by Western blot with Myc antibody.
  • HT1080 cells forcibly expressing MT1-MMP an EphA2 processing fragment (small arrow) with a molecular weight of 65 and 60 kDa was detected in addition to full-length EphA2 (large arrow).
  • TIMP-2 and BB94 the production of these processing fragments was also suppressed as MT1-MMP activity was inhibited.
  • FIG. 1B shows the results of verifying by Western blot whether EphA2 processing occurs in various membrane-type MMPs.
  • EphA2 and MT1-6-MMP labeled with Myc at the C-terminus were forcibly expressed in HT1080 cells, the EphA2 processing fragment (small arrow) was detected only in cells into which MT1-MMP had been introduced. This suggested that MT1-MMP is the main membrane-type MMP for EphA2 processing. * Indicates a non-specific band.
  • FIG. 1C shows the results of N-terminal amino acid analysis of processing fragments A and B (stump side) using MT1-MMP.
  • EphA2 labeled with Myc at the C-terminus and wild type MT1-MMP were co-expressed in HT1080 cells, and the full-length EphA2 and fragment A and B were purified from the cells by immunoprecipitation with Myc antibody, and then purified EphA2 and fragment A, B was detected by Western blot with Myc antibody. Only full-length EphA2 was purified from cells treated with BB94. When the N-terminals of fragments A and B were analyzed by a peptide sequencer, fragment A was VSINQ and fragment B was NQTEPP. This result suggests that two different processes may occur on the cell membrane.
  • FIG. 1D shows the result of synthesizing a peptide chain containing the cleavage site found in FIG. 1C and performing in-vitro digestion with a recombinant protein of MT1-MMP in order to identify the cleavage site of EphA2 by MT1-MMP.
  • MT1-MMP cleaved two sites (arrows) between S426 and F427 and between 431S and 432V of the EphA2 peptide.
  • MT1-MMP cleaves between S at position 431 and V at position 432 on the cell membrane, and in conjunction with the cleavage, unknown proteases are I at 434 and N at 435.
  • FIG. 1E is a schematic view showing a cleavage site of MT1-MMP in EphA2. It can be seen that the cleavage site is a fibronectin site, and this processing liberates the ligand binding site.
  • FIG. 2 shows the results of examination of EphA2 processing and phosphorylation state of EphA2 by Ephrin-A1 using A431 cells obtained by knocking down MT1-MMP expression with siRNA.
  • FIG. 1E is a schematic view showing a cleavage site of MT1-MMP in EphA2. It can be seen that the cleavage site is a fibronectin site, and this processing liberates the ligand binding site.
  • FIG. 2 shows the results of examination of EphA2 processing and phosphorylation state of EphA2 by Ephrin-A1 using A431 cells obtained by knocking down MT1-MMP expression with siRNA.
  • 2A shows the results of immunoprecipitation of lysates of cells in which MT1-MMP expression disappeared by siRNA treatment with an antibody against the C-terminus of EphA2, and the precipitate was Western blotted with the same antibody and an anti-tyrosine phosphorylated antibody (A, EphA2, p-EphA2).
  • 2B to 2D show the results of determining the relative expression levels of EphA2, E-cadherin, and phosphorylated EphA2 from the results of FIG. 2A.
  • MT1-MMP was knocked down, 65 kDa and 60 kDa EphA2 processing fragments disappeared (A).
  • FIG. 2E shows that in order to detect the processing of EphA2 on the cell surface, the cell surface layer of A431 cells was biotinylated and the membrane protein fraction was purified by pulling down with avidin beads, and the amount of EphA2 in the purified membrane protein was expressed as EphA2. The result measured by the Western blot by an antibody is shown.
  • 2F and G show the results of determining the relative expression levels of EphA2 and E-cadherin from the results of FIG. 2E.
  • FIG. 3A to F show the results of examining the effect of EphA2 on EGF receptor downstream signals (PI3K, MAPK) in an Ephrin-A1-dependent manner after A431 cells knocked down with siRNA to express MT1-MMP. is there. Fig.
  • 3A shows the detection of EphA2 and p-EphA2 by IP-Western using an antibody that recognizes the C-terminus of EphA2, and p-Erk1 / 2, Erk1 / 2, p-Akt, and Akt were used for each specific antibody. The results detected by Western blotting are shown. The ratio of each phosphorylation was quantified by densitometry with Image J. In the presence of Ephrin-A1, the presence or absence of MT1-MMP expression did not affect EGF receptor activation (A, B). MT1-MMP knockdown enhanced phosphorylation of EphA2 itself (A, C).
  • FIGS. 3G to I show the results of examining the effects of EphA2 processing on EphA2 / Ephrin-A1-dependent cell growth inhibition in two-dimensional, three-dimensional (in collagen gel) and anchorage-independent cultures.
  • Two-dimensional and three-dimensional cell proliferative capacity was measured by counting the number of living cells with a hemocytometer (G, H), and spheroid proliferative capacity was calculated by comparing spheroid volume (I).
  • G, H hemocytometer
  • I spheroid volume
  • RhoG signal which is a small GTPase downstream of the EGF receptor
  • A431 cells in which MT1-MMP expression was knocked down with siRNA For detection of RhoG activity, bait was obtained by binding an ELMO2 / GST fusion protein, which is an effector of RhoG, to glutathione beads. RhoG activity was quantified by densitometry with Image J. RhoG activity was not detected in cells not treated with EGF (A). On the other hand, when EGF stimulation was performed, RhoG activity was significantly decreased by Ephrin-A1 treatment in MT1-MMP knocked-down cells (A, B).
  • FIG. 5 shows the results of experiments conducted using cells expressing a processing-resistant EphA2 mutant in order to examine the possibility that EphA2 processing by MT1-MMP enhances the metastatic potential of cancer cells.
  • A431 cells into which wild vector EphA2 and processing resistant EphA2 mutant were introduced were established (A, B).
  • SP signal peptide
  • EBD Ephrin-binding domain
  • TM transmembrane
  • F FLAG.
  • FIG. 6 shows the results of examination of EphA2 processing in ovarian cancer.
  • FIG. 6A shows that tissue extracts were prepared from frozen cancer tissue sections using RIPA buffer, and the amount of each tissue protein was measured by the CBB method. Then, EphA2 and MT1-MMP expressed in each tissue were expressed as EphA2. The result of having analyzed by the Western blot using the antibody with respect to C terminal and MT1-MMP monoclonal antibody is shown.
  • an EphA2 fragment, MT1-MMP contained in a lysate extracted from cells in which MT1-MMP ( ⁇ MMI) was introduced into A431 cells was used.
  • EphA2 In ovarian cancer tissues, full-length EphA2 (intact) was detected only at a low level, and a fragment with a molecular weight of 60 kDa (EphA2 fragment) was the main one (A, lower panel).
  • the expression level of MT1-MMP in these tissues was detected with the MT1-MMP monoclonal antibody (A, upper panel). Since * was seen even without the primary antibody, it was considered to be a non-specific band (B). From these results, it was suggested that EphA2 was also processed by MT1-MMP in a cancer tissue in vivo to produce a 60 kDa fragment by processing.
  • FIGS. 6C and 6D show the results of detecting EphA2 and MT1-MMP in ovarian cancer tissue by immunostaining with a fluorescence microscope.
  • EphA2 was co-stained with an MT1-MMP antibody using an antibody that recognizes the C-terminus (C) and N-terminus (D), respectively.
  • the positive staining site of MT1-MMP co-localizes with the positive site of the EphA2 C-terminal antibody (C).
  • the positive staining site of the N-terminal antibody of EphA2 does not colocalize with that of MT1-MMP (D). This suggested that many EphA2 strongly expressed in cancer tissues may be stumps with N-terminal truncation.
  • FIG. 6E and F show the results of examining the kinetics of phosphorylation of EphA2 at the MT1-MMP expression site using two antibodies that recognize phosphorylation of the intracellular domain of EphA2.
  • MT1-MMP expression co-localized with EphA2 ligand-independent phosphorylation of the serine residue at position 897 (E).
  • MT1-MMP expression and ligand-dependent phosphorylation of the tyrosine residue at position 594 showed different localization (F).
  • FIG. 7 shows the results of examining the effect of MT1-MMP knockdown on EphA2 / Ephrin-A1 signal in human head and neck cancer cells SCC61.
  • FIG. 8 shows the results of the same analysis as in FIG. 6 performed on the head and neck cancer tissue. Since the expression level of MT1-MMP was lower than that of ovarian cancer, the processing rate of EphA2 was very low (C lower panel).
  • FIG. 9 shows the results obtained for the head and neck cancer tissue. The kinetics of phosphorylation of EphA2 at the MT1-MMP expression site are shown using two types of antibodies that recognize phosphorylation of the intracellular domain of EphA2.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a model in which MT1-MMP converts EphA2 to ligand-insensitive. In normal cells, EphA2 functions in a ligand-dependent manner and suppresses signals such as cell proliferation and survival.
  • FIG. 11 shows the results of immunostaining normal ovarian tissue (A) and ovarian cancer tissue (B) with an antibody recognizing the N-terminal side of EphA2 and an antibody recognizing the C-terminal side. Nuclei were stained with DAPI. Bar indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 12 shows immunostaining of gastric cancer tissue (A) and colorectal cancer tissue (B) with an antibody that detects phosphorylation of serine at position 897 independent of the ligand of EphA2 and an antibody that detects MT1-MMP. Results are shown. Nuclei were stained with DAPI. Bar indicates 50 ⁇ m. The localization of the expression of EphA2 and MT1-MMP phosphorylated at serine at position 897 was consistent in gastric cancer tissue and colon cancer tissue.
  • FIG. 12 shows immunostaining of gastric cancer tissue (A) and colorectal cancer tissue (B) with an antibody that detects phosphorylation of serine at position 897 independent of the ligand of EphA2 and an antibody that detects MT1-MMP. Results are shown. Nuclei were stained with DAPI. Bar indicates 50 ⁇ m. The localization of the expression of EphA2 and MT1-MMP phosphorylated at serine at position 897 was consistent in gastric cancer
  • FIG. 13 shows the results of expressing EphA2 mutants resistant to MT1-MMP cleavage in A431 cells.
  • Mock is a cell not expressing EphA2
  • EphA2-CF is a cell expressing normal EphA2
  • ucEphA2-CF-1 and ucEphA2-CF-2 are EphA2 mutants resistant to MT1-MMP cleavage.
  • the expressed cells are shown.
  • A431 cells have a spindle-shaped phenotype characteristic of malignant cancer cells (Mock and EphA2-CF), but cells expressing mutants resistant to MT1-MMP cleavage are normal epithelial cell phenotypes. Changed.
  • FIG. 14 shows the result of expressing EphA2 in A431 cells and detecting the fragment excised with endogenous MT1-MMP by Western blotting.
  • the cancer testing method includes a step of measuring the amount of an EphA2 protein fragment having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa in a sample derived from a subject.
  • an EphA2 protein fragment having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa in a sample derived from a subject.
  • proteases such as MT1-MMP
  • EphA2 is processed. Therefore, a cancer test can be performed by detecting such a processing fragment from a sample derived from a subject.
  • the fragment of EphA2 protein measured by the cancer testing method according to the present invention may be any fragment as long as it has a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa.
  • the amount of a fragment containing the N-terminus of EphA2 protein having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa may be measured.
  • the amount of at least one fragment of the following (i) to (iii) may be measured.
  • a peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity may be measured.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is an N-terminal fragment generated by cleaving between S431 and V432 of the EphA2 protein represented by SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 2 is C-terminal at this time. It is a fragment that occurs on the side.
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 3 is an N-terminal fragment generated by cleavage between I434 and N435, and SEQ ID NO: 4 is a fragment generated on the C-terminal side at this time.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 is a fragment resulting from EphA2 being processed by MT1-MMP.
  • the present inventors show that MT1-MMP expression is enhanced with canceration of cells, and EphA2 is converted to ligand-insensitive RTK by releasing the ligand-binding domain of EphA2. It was found that each signal pathway is activated by the action of ligand-independent EphA2 and contributes to the acquisition of malignant traits of cancer cells by controlling the cells in a direction that promotes proliferation, survival, and movement.
  • piece represented by sequence number: 2 and 4 is a fragment
  • any of the fragments represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 may be measured, and two or more fragments may be measured. Detection of the fragment represented by SEQ ID NO: 1 or 2 as a free fragment is easy.
  • the method for examining cancer includes (i) a peptide consisting of an amino sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, and (ii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4; Or a peptide consisting of an amino acid sequence in which several amino acids are added, substituted or deleted, or (iii) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4
  • the amount of peptide may be measured. Further, some of these peptides may be measured in combination.
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 4, or (iii) represented by SEQ ID NO: 1 to 4
  • a peptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with a specific amino acid sequence can be produced as a processing fragment when, for example, EphA2 contains a mutation that is not resistant to MT1-MMP processing.
  • the number of amino acids to be added, substituted or deleted is not particularly limited. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.
  • the position where addition, substitution or deletion is performed may be at the terminal or in the middle of the peptide, and may be at one place or at two or more places.
  • sequence identity may be any percentage as long as it is 80% or more. For example, 80%, 85%, 90% %, 95%, 98% and the like.
  • peptides that are fragments of EphA2 protein having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa in a sample derived from a subject including (i) to (iii) may be collectively referred to as “the peptide of the present invention”.
  • the step of “measuring the amount of protein fragments” not only specifically quantifies fragments, but also detects the presence or absence of fragments, and the amount of fragments in samples collected at multiple time points. Is also measured and compared to examine changes over time.
  • the amount of fragments in the test method according to the present invention can be measured using any method capable of detecting fragments in a sample.
  • immunoassay including agglutination method and turbidimetric method
  • Western blotting method surface Examples include, but are not limited to, plasmon resonance (SPR).
  • an immunoassay using an antibody against a fragment of EphA2 is simple and preferable.
  • the “antibody against an EphA2 fragment” may be any antibody as long as it specifically recognizes the above-mentioned EphA2 fragment. Examples thereof include the following antibodies.
  • An antibody that specifically recognizes a fragment of EphA2 protein having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa (2) An antibody that specifically recognizes a fragment of EphA2 protein having a molecular weight of 30 kDa to 80 kDa and containing the N-terminus of EphA2 ( 3) An antibody that specifically recognizes a peptide corresponding to any of the above (i) to (iii) (4) Cysteine rich domain (CRD, 180) of the amino acid sequence of EphA2 shown in SEQ ID NO: 5 Antibody having an epitope in the vicinity of position to position 340)
  • the antibodies (1) to (3) above can be prepared according to methods known to those skilled in the art.
  • a non-human animal may be immunized with the EphA2 fragment specified in each of (1) to (3) and prepared according to a conventional method.
  • non-human animals may be immunized using the full length of EphA2, and antibodies that bind to the fragments specified in each of (1) to (3) may be screened according to conventional methods.
  • the antibody of (4) above can also be prepared according to a method known to those skilled in the art.
  • a peptide containing an epitope sequence may be prepared by immunizing a non-human animal, or a peptide containing an epitope sequence may be immobilized on a solid phase carrier and an antibody library or antibody fragment library prepared by a phage display method or the like. What is necessary is just to select what couple
  • the cysteine-rich domain can be, for example, at positions 180 to 340 or 201 to 314 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the immunoassay uses an antibody against a detectably labeled fragment of EphA2 of the present invention or an antibody against a detectably labeled fragment of EphA2 of the present invention (secondary antibody).
  • the enzyme immunoassay EIA, ELISA, or ELISOPT
  • RIA radioimmunoassay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • FPIA fluorescent polarization immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase
  • radioactive substances such as 125 I, 131 I, 35 S and 3 H
  • Fluorescent substances such as isothiocyanate and near-infrared fluorescent materials
  • the CLIA method use antibodies labeled with luminescent substances such as luciferase, luciferin and aequorin.
  • nanoparticles such as colloidal gold and quantum dots can also be detected.
  • the antibody against the EphA2 fragment of the present invention can be detected by labeling with biotin and binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
  • the ELISA method using an enzyme label is preferable because it can measure a target peptide easily and rapidly.
  • the ELISA method includes a competitive method and a sandwich method.
  • an antibody against the EphA2 fragment of the present invention is immobilized on a solid phase carrier such as a microplate, and a sample is added to cause an antigen-antibody reaction. Once washed, it reacts with the enzyme substrate, develops color, and the absorbance is measured. If the amount of the EphA2 fragment of the present invention in the sample is large, the color development becomes weak, and if it is small, the color development becomes strong. Therefore, the amount of EphA2 fragment can be determined using a calibration curve.
  • an antibody against an EphA2 fragment of the present invention that recognizes another epitope labeled with an enzyme is immobilized after an antibody against the EphA2 fragment of the present invention is immobilized on a solid phase carrier, a sample is added and reacted. Add and react. After washing, it reacts with the enzyme substrate, develops color, and measures the absorbance, whereby the amount of EphA2 fragment of the present invention can be determined.
  • an unlabeled antibody primary antibody
  • an antibody against the unlabeled antibody is enzyme-labeled and further added. Also good.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • TMB 3,3′5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • NPP p-nitropheny phosphate
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it can immobilize the antibody, and is made of a microtiter plate made of glass, metal or resin, substrate, beads, nitrocellulose membrane, nylon membrane, PVDF. Examples include a membrane, and the target substance can be immobilized on these solid phase carriers according to a known method.
  • Antibodies to the EphA2 fragment of the present invention can be prepared according to known methods for both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies are obtained by, for example, isolating antibody-producing cells from a non-human mammal immunized with any of the peptides of the present invention, fusing them with myeloma cells, etc. to produce hybridomas, and producing antibodies produced by the hybridomas. It can be obtained by purification.
  • Polyclonal antibodies can also be obtained from the sera of animals immunized with the peptides of the present invention.
  • an existing antibody may be used as the antibody against the EphA2 fragment of the present invention.
  • Examples of the sample derived from the subject used in the test method according to the present invention include body fluids such as blood, lymph, and urine, feces, cell and tissue lysates, and these are suitable methods for measuring the amount of peptide. Can be used after processing.
  • the free fragment represented by SEQ ID NO: 1 or 3 is easy to detect from body fluids such as blood, blood, lymph, urine, stool, and the like.
  • the stump fragment represented by SEQ ID NO: 2 or 4 can be detected after treating a cell or tissue lysate with a buffer containing a highly soluble surfactant (for example, RIPA).
  • a highly soluble surfactant for example, RIPA
  • cancer is used in its broadest sense.
  • examples of cancer include brain tumor, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, anal cancer, rectal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, kidney cancer, renal cell cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone and meat species, Examples include, but are not limited to, gallbladder cancer, pancreatic cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, prostate cancer, testicular tumor, bladder cancer, and skin cancer.
  • the test method according to the present invention is particularly useful for cancers expressing EphA2.
  • a cancer cell expresses EphA2 can be easily confirmed by those skilled in the art, for example, breast cancer, liver cancer, prostate cancer, glioma, melanoma, ovarian adenocarcinoma, esophageal cancer, urinary tract
  • Examples include cancer (bladder cancer, renal pelvic cancer), pancreatic cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer and the like.
  • the “inspection method” means to examine a sample collected from a subject in order to obtain information necessary for diagnosis, and the inspection method of the present invention is performed by, for example, an inspection company. obtain.
  • the “cancer test method” means examining cancer and all phenomena caused by the cancer, for example, presence or absence of disease, degree of progression, malignancy, stop or delay of progression, metastasis. This means that a sample collected from a subject is examined in order to obtain information necessary for determining whether or not there is a therapeutic effect.
  • the “cancer test method” may be used for so-called companion diagnosis for predicting the effects and side effects of anticancer agents.
  • the “anticancer agent” is not particularly limited, and examples thereof include EphA2, MT1-MMP, and an anticancer agent targeting a downstream signal of EphA2 activated in a ligand-independent manner. When the amount of EphA2 fragments is significantly higher than that of healthy individuals or other cancer patients, anticancer agents targeting them are expected to be effective.
  • the kit for testing cancer according to the present invention is a kit for testing cancer using the above-described testing method, and includes “an antibody against an EphA2 fragment” of the present invention.
  • the test kit of the present invention comprises a reagent and a device necessary for measuring the amount of the peptide of the present invention by an immunoassay utilizing an antigen-antibody reaction between the antibody against the EphA2 fragment of the present invention and the EphA2 fragment of the present invention. Including.
  • test kit is for measuring the amount of EphA2 fragment of the present invention by sandwich method, microtiter plate; antibody for capture of EphA2 fragment of the present invention; labeled with alkaline phosphatase or peroxidase An antibody against a fragment of EphA2 of the present invention; and an alkaline phosphatase substrate (NPP, etc.) or a peroxidase substrate (DAB, TMB, OPD, etc.).
  • NPP alkaline phosphatase substrate
  • DAB peroxidase substrate
  • TMB peroxidase substrate
  • OPD peroxidase substrate
  • test kit is for measuring the amount of the fragment of EphA2 of the present invention by a sandwich method using a secondary antibody, a microtiter plate; against the fragment of EphA2 of the present invention for capture An antibody against an EphA2 fragment of the invention as a primary antibody; an antibody against an antibody against an EphA2 fragment of the invention labeled with alkaline phosphatase or peroxidase as a secondary antibody; and an alkaline phosphatase (such as NPP) or peroxidase Substrate (DAB, TMB, OPD, etc.).
  • alkaline phosphatase such as NPP
  • DAB peroxidase Substrate
  • a capture antibody is immobilized on a microtiter plate, a sample is appropriately processed and added thereto, and then incubated, and the sample is removed and washed. Subsequently, the primary antibody is added to incubate and wash, and the enzyme-labeled secondary antibody is further added and incubated, and then the substrate is added to cause color development.
  • the amount of the EphA2 fragment of the present invention can be determined.
  • the reaction is amplified and the detection sensitivity can be increased.
  • the test kit according to the present invention may further include a necessary buffer solution, an enzyme reaction stop solution, a microplate reader, and the like.
  • Labeled antibody is not limited to an enzyme-labeled antibody, radioactive material (25 I, 131 I, 35 S, 3 H , etc.), fluorescent substance (fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, It may be an antibody labeled with a near-infrared fluorescent material or the like, a luminescent substance (luciferase, luciferin, aequorin, or the like), nanoparticles (gold colloid, quantum dots) or the like.
  • a biotinylated antibody can be used as a labeled antibody, and labeled avidin or streptavidin can be added to the kit.
  • the kit may contain a plurality of antibodies against the EphA2 fragment of the present invention.
  • the screening method for an anticancer drug according to the present invention comprises: Culturing cells expressing EphA2 under conditions under which MT1-MMP processes EphA2, Adding a test compound to the cell culture medium and incubating in the presence of MT1-MMP; Measuring the presence or absence of EphA2 processing; It is characterized by including.
  • EphA2 As cells expressing EphA2, existing cultured cancer cells may be used, or appropriate cells can be selected and these proteins can be forcibly expressed.
  • the forced expression method can be, for example, a method used in the examples of the present invention, but can be appropriately performed by a person skilled in the art by a known method or a method analogous thereto.
  • MT1-MMP may be co-expressed in cells expressing EphA2, or may be co-cultured by expressing in separate cells.
  • MT1-MMP may be prepared separately and added to the medium.
  • the conditions under which MT1-MMP processes EphA2 can be, for example, the culture conditions used in the examples of the present invention, but are not limited thereto, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • test compound is not particularly limited and may be any substance.
  • a low molecular compound, a high molecular compound, a nucleic acid, a peptide, a protein, a sugar, a lipid and the like are used.
  • a person skilled in the art can determine the concentration to be added and the incubation conditions according to each test compound.
  • the step of measuring the presence or absence of EphA2 processing can be performed using, for example, the above-described method for measuring the amount of the peptide of the present invention.
  • a test compound with reduced processing can be selected as an anticancer drug candidate as compared to the case where no test compound is present.
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer.
  • the method for diagnosing cancer is determined by the doctor using the results obtained by the test method of the present invention to determine the presence or absence of disease, the degree of progression, the degree of malignancy, the cessation or delay of progression, the presence or absence of metastasis, and the presence or absence of therapeutic effects. It means to do.
  • the anticancer agent according to the present invention includes siRNA having the following sequences, or precursors thereof, or nucleic acids encoding them.
  • siRNA is usually a double-stranded RNA of about 19 to 30 bases, for example, about 21 to 25 bases.
  • RNAi method is a sequence-specific gene expression suppression mechanism induced by a double-stranded nucleic acid.
  • siRNA is also highly safe because it has high target specificity and uses a gene expression suppression mechanism that originally exists in vivo.
  • a typical structure of siRNA is a 21-base-pair double-stranded RNA, and the 3 ′ portion of each RNA strand is a 2-base overhang.
  • siRNA is produced by cutting out hairpin RNA (shRNA) or longer double-stranded RNA with Dicer.
  • the shRNA or long double-stranded RNA before being cleaved by Dicer can be used for the anticancer agent according to the present invention as a precursor of siRNA.
  • siRNA can be designed according to a known method based on the base sequence of the target mRNA.
  • the siRNA may be a double-stranded RNA or a DNA-RNA chimeric double-stranded nucleic acid as long as it has an RNAi effect on the target mRNA, and has been subjected to artificial nucleic acid or various modifications. It may be a nucleic acid.
  • the anticancer agent according to the present invention also includes a nucleic acid that is transcribed into siRNA or a precursor thereof in a cell.
  • HT1080 cells that stably express c-myc-EphA2 were generated using the ViraPower TM lentiviral expression system using pl1080-plenti-c-myc-EphA2 vector, and the MT1-6-MMPs expression vector (pSG-MT1- 6-MMPs) were transiently introduced into the cells.
  • EphA2 and MT1-MMP were detected by Western blot using anti-Myc polyclonal antibody and anti-MT1-MMP monoclonal antibody.
  • Expression vectors for each MT-MMPs were introduced using FuGene6 (RACHe).
  • the purified 65,60 kDa processing fragment was identified by analyzing each purified protein (50 pmole) by the Edman degradation method using an ABI peptide seek sensor (Procise 494 HT) and determining 5 residues from the N-terminus (Appro. (Consigned to science). The results are shown in FIG. 1C.
  • the 65 kDa fragment A N-terminal sequence was VSINQ
  • the 60 kDa fragment B N-terminal sequence was NQTEPP. Therefore, in order to identify the cleavage site of EphA2 by MT1-MMP, a peptide chain containing the cleavage site found in FIG.
  • FIG. 1C was synthesized and digested in vitro with a recombinant protein of MT1-MMP. The results are shown in FIG. 1D.
  • MT1-MMP cleaved two sites (arrows) between S426 and F427 and between 431S and 432V of the EphA2 peptide.
  • MT1-MMP cleaves between S at position 431 and V at position 432 on the cell membrane, and in conjunction with the cleavage, unknown proteases are I at 434 and N at 435. It was suggested that there was a break between the two.
  • FIG. 1E is a schematic view showing a cleavage site of MT1-MMP in EphA2. It can be seen that the cleavage site is a fibronectin site, and this processing liberates the ligand binding site.
  • 2A. 2B to 2D show the results of determining the relative expression levels of EphA2, E-cadherin, and phosphorylated EphA2 from the results of FIG. 2A.
  • EphA2 E-cadherin
  • phosphorylated EphA2 from the results of FIG. 2A.
  • the percentage of phosphorylation was quantified by densitometry with Image J for the band obtained by Western blot.
  • the following antibodies were used: anti-p-Erk1 / 2 monoclonal antibody (Santa Cruz), anti-Erk1 / 2 polyclonal antibody (Santa Cruz), anti-p-Akt (Ser473) monoclonal antibody (Cell Signaling), anti-Akt (Ser473) Monoclonal antibody (Cell Signaling).
  • the results are shown in FIGS.
  • the result of having conducted the same experiment with human head and neck cancer SCC61 cells is shown in FIG. In the presence of Ephrin-A1, the presence or absence of MT1-MMP expression did not affect EGF receptor activation (A, B).
  • MT1-MMP knockdown enhanced phosphorylation of EphA2 itself (A, C).
  • Ephrin-A1 Erk1 / 2 and Akt activities induced by EGF were significantly suppressed by MT1-MMP knockdown (A, D, E).
  • Similar results were observed in human breast cancer BT549 cells and head and neck cancer SCC61 cells (F, FIG. 7), but ovarian cancer IGROV-1 cells and breast cancer BT-20 cells not expressing EphA2, and k- It was not observed in MDA-MB-231 cells with ras mutation (F).
  • Collagen I gels was extracted with acetic acid (3 mg / ml, Nitta Gelatin) with neutralization buffer (50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES), each cell were mixed, 2.5 x 10 4/250 ⁇ l / 48 well plate Cells were seeded. After the collagen gel was polymerized, it was cultured in a culture solution of 400 ⁇ l / well DMEM / 1% FCS for 7 days. After culturing, the collagen gel was dissolved with 0.1% collagenase, the cells were made into single cells with trypsin, and the number of cells was measured with a Coulter counter.
  • neutralization buffer 50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES
  • RhoG activity ( Figure 4) Using A431 cells in which MT1-MMP expression was knocked down with siRNA, the effect of Ephrin-A1-dependent EphA2 on the RhoG signal downstream of the EGF receptor was examined.
  • the RhoG effector ELMO2 and GST fusion protein was immobilized on glutathione beads, and the RhoG activity in the cell suspension solubilized with RIPA was detected by pull-down using ELMO2 / GST beads as a bait.
  • the coprecipitated RhoG was detected with an anti-RhoG polyclonal antibody (Santa Cruz), and the RhoG activity was quantified by densitometry with Image J.
  • RhoG activity was not detected in cells not treated with EGF (A).
  • RhoG activity was significantly decreased by Ephrin-A1 treatment in MT1-MMP knocked-down cells (A, B). Similar results were seen in SCC61 cells (C).
  • D, E cell motility was significantly suppressed by treatment with Ephrin-A1 in MT1-MMP knockdown cells (D, E). This suggests that EphA2 processing by MT1-MMP plays a role in enhancing small GTPase activity.
  • EphA2 in cells into which wild-type EphA2 or a processing-resistant EphA2 mutant was introduced was detected by Western blotting, the mutant lacking the cleavage site showed resistance to processing by MT1-MMP (C).
  • Phosphorylation of EphA2 mutant by Ephrin-A1 was confirmed by immunoprecipitation with EphA2 antibody (D).
  • Fig. 6A, B A tissue extract was prepared from a frozen cancer tissue using a RIPA buffer solution (100 ⁇ l / slide) from a thin layer section (5 ⁇ l) using a cryostat. The amount of protein extracted from each tissue was measured by the CBB method. EphA2 expressed in each tissue, its fragments, MT1-MMP, EphA2 at the C-terminal (Santa Cruz), and MT1-MMP monoclonal antibody (1D8) Analyzed by the Western blot used. As a control, ⁇ -actin was detected simultaneously.
  • EphA2 In ovarian cancer tissues, full-length EphA2 (intact) was detected only at a low level, and a fragment with a molecular weight of 60 kDa (EphA2 fragment) was the main one (A, lower panel).
  • the expression level of MT1-MMP in these tissues was detected with the MT1-MMP monoclonal antibody (A, upper panel). Since * was seen even without the primary antibody, it was considered to be a non-specific band (B). From these results, it was suggested that EphA2 was also processed by MT1-MMP in a cancer tissue in vivo to produce a 60 kDa fragment by processing.
  • FIG. 8 shows the results of a similar experiment performed using human head and neck cancer tissue. Since the expression level of MT1-MMP was lower than that of ovarian cancer, the processing rate of EphA2 was very low (C lower panel). When the head and neck cancer tissue was examined by immunostaining, EphA2 was expressed in tumor and non-tumor areas, whereas MT1-MMP showed a partial expression distribution in the tumor areas (A, B). ). This result suggests that EphA2 processing similar to ovarian cancer tissue may occur in tumor cells expressing MT1-MMP in head and neck cancer.
  • the primary antibody anti-MT1-MMP polyclonal antibody (rabbit IgG, Merck) / anti-EphA2 N-terminal domain (mouse IgG, R & D) or MT1-MMP polyclonal antibody / anti-EphA2 C-terminal domain (Santa Cruz)
  • anti-MT1-MMP polyclonal antibody rabbit IgG, Merck
  • anti-EphA2 N-terminal domain mouse IgG, R & D
  • MT1-MMP polyclonal antibody / anti-EphA2 C-terminal domain Santa Cruz
  • EphA2 After treatment with an encapsulant containing DAPI (Vector Lab), it was observed with a fluorescence microscope. In addition, localization of phosphorylated EphA2 is the same using anti-EphA2 phosphorylated tyr-594 polyclonal antibody (biorbyt limited), anti-EphA2 phosphorylated ser-897 polyclonal antibody (Cell Application Inc) and anti-MT1-MMP monoclonal antibody. It was detected by the method. The positive staining site of MT1-MMP co-localizes with the positive site of the EphA2 C-terminal antibody (C).
  • FIG. 9 shows the results of a similar experiment performed using human head and neck cancer tissue.
  • the kinetics of phosphorylation of EphA2 at the MT1-MMP expression site are shown using two types of antibodies that recognize phosphorylation of the intracellular domain of EphA2.
  • MT1-MMP expression colocalized with the expression of EphA2 ligand-independent phosphorylation of serine residue at position 897 (A).
  • MT1-MMP expression and ligand-dependent phosphorylation of the tyrosine residue at position 594 showed different localization (B).
  • FIG. 12A The result of the stomach cancer tissue is shown in FIG. 12A
  • FIG. 12B the result of the colon cancer tissue is shown in FIG. 12B.
  • MT1-MMP and EphA2 p-Ser 897 had the same expression, but MT1-MMP and EphA2 p-Tyr 594 did not. (Data not shown). This strongly suggested that EphA2 processing by MT1-MMP occurred similarly in various cancers.
  • A431 cells have a spindle-shaped shape peculiar to malignant cancer cells (see the results of Mock and normal EphA2-expressing cells), but cells expressing EphA2 resistant to MT1-MMP processing have a round shape (ucEphA2- CF-1 and ucEphA2-CF-2) changed to normal epithelial cell-like morphology. This strongly suggests that a ligand-dependent antitumor signal is activated even in cancer cells unless processed by MT1-MMP.
  • SEQ ID Nos: 1 to 4 show the amino acid sequences of EphA2 fragments used in the testing method according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 5 shows the full-length amino acid sequence of EphA2.
  • SEQ ID Nos: 6 and 7 show the sequence of siRNA # 1.
  • SEQ ID Nos: 8 and 9 show the sequence of siRNA # 2.
  • SEQ ID Nos: 10 and 11 show the sequence of siRNA # 3.

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Abstract

　本発明は、ＥｐｈＡ２ががん細胞においてリガンド非依存的に活性化される分子機序を解明し、ＥｐｈＡ２をがん治療のためのより有用な標的とするとともに、その機序を用いたがんの検査方法等を提供することを課題とする。本発明は、被検者由来の試料中における分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量を測定する工程を含むがんの検査方法等を提供する。

Description

がんの検査方法及び検査用キット
　本発明は、ＭＴ１－ＭＭＰのプロセシングによるＥｐｈＡ２タンパク質断片を検出するがんの検査方法等に関する。
　悪性腫瘍は、特に先進国において死亡率の上位を占める疾患の一つであり、患者とその家族にも大きな打撃を与える。腫瘍細胞の増殖と転移を促進するシグナル経路と重要なタンパク質の同定は、分子標的治療を開発するために有望なアプローチである。
　受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）遺伝子と関連するシグナル伝達タンパク質はがん細胞で変異していることが多く、またそのような変異が見られない場合もその産物の異常な活性化が見られることも多い。したがって、ＲＴＫ仲介性シグナル経路は、治療標的の有力な候補の豊富な供給源である。
　エリスロポエチン産生肝細胞受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、正常上皮細胞に広く発現する受容体型チロシンキナーゼである。Ｅｐｈ受容体型キナーゼには、サブファミリーのメンバーとして１０種類のＥｐｈＡと６種類のＥｐｈＢが存在する。ＥｐｈＡ２は、ＥｐｈＡの１つである。
　Ｅｐｈ受容体のリガンドは、エフリンＡとエフリンＢのサブグループに分類される。５つのエフリンＡのメンバーは、Ｃ末端にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を有し、細胞膜に固定されているが、エフリンＢのメンバーは可溶型である。したがって、ＥｐｈＡとエフリンＡは、それぞれを発現する細胞同士の接触によって結合し、ＥｐｈＡとエフリンＡの相互作用が、それぞれの細胞におけるシグナル伝達を惹起する。５つのエフリンＡのメンバーのうち、Ａ１、Ａ３、Ａ４及びＡ５はＥｐｈＡ２に結合する。エフリンＡ１はエフリンファミリーのなかでも、広範な組織に存在する代表的なＥｐｈＡ２のリガンドとして研究されている。
　エフリンＡ１がＥｐｈＡ２に結合すると、ＥｐｈＡ２の細胞質尾部のチロシン残基の自己リン酸化が誘導される。その結果引き起こされる下流シグナルは、ＥｒｂＢ受容体などの成長因子受容体仲介性シグナルを阻害する。ＥｒｂＢ受容体刺激はＨ－ｒａｓ／Ｅｒｋ１／２及びＰＩ３－ｋ／Ａｋｔの活性化を引き起こして細胞増殖を促進するところ、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化が生じると、Ｒａｓ活性化を下方制御するｐ１２０Ｒａｓ－ＧＡＰがリクルートされ、増殖促進シグナルが抑制される。すなわち、ＥｐｈＡ２は、リガンド依存的に、上皮細胞の表現型の維持と増殖促進シグナルの抑制において重要な役割を果たす。
　一方で、ＥｐｈＡ２は、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、卵巣腺癌、及び食道癌などの様々な悪性がんで高発現していることが報告されており、悪性度の高さと予後の悪さにも関連しているため、抗がん剤の分子標的として有望であると考えられてきた。
　ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞においては、腫瘍の発生を促進する癌遺伝子産物のようにふるまう。培養細胞及びマウスでのＥｐｈＡ２の強制発現は、がん細胞の増殖、運動性、血管新生、浸潤、及び転移を促進した。例えば、ヒト乳房上皮細胞株ＭＣＦ－１０ＡにおいてＥｐｈＡ２のみを発現させると、マウスにおいて腫瘍を発生した。ＥｐｈＡ２の高レベルの発現は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者においてトラスツズマブ耐性を生じさせた。これらの知見は、ＥｐｈＡ２の発がん促進性の機能を裏付けるものである。
　最近、ＥｐｈＡ２による発がん促進性シグナルは、リガンド非依存的な活性化によって引き起こされることが報告された。ＥｐｈＡ２リガンドがないと、Ａｋｔ活性はＥｐｈＡ２によって阻害されず、ＥｒｂＢ受容体刺激がＰI３Ｋ／Ａｋｔを活性化し、その結果ＥｐｈＡ２の細胞質セリン残基をリン酸化する。ＧＤＰ－ＧＴＰ交換因子Ｅｐｈｅｘｉｎ４がリン酸化されたセリン残基にリクルートされ、ＲｈｏＧをＧＴＰ結合体にして活性化し、続いてこれがＥＬＭＯ２、Ｄｏｃｋ４、及びＲａｃ１をリクルートする。こうして、ＥｐｈＡ２のリガンド非依存的な活性化と、ＥｒｂＢ受容体刺激とが協調して、細胞の運動性や浸潤に必要なアクチン再構成を引き起こす。実際、ＥｐｈＡ２によるＲｈｏＧの活性化が、ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａと呼ばれる膜の突起形成を誘導することによって乳がん細胞の浸潤を促進することが報告されている。リガンド非依存性ＥｐｈＡ２活性化は、乳がん細胞のアノイキス耐性に関与することも示唆されている（ＥｐｈＡ２に関する文献として非特許文献１－５を参照）。
　このようにＥｐｈＡ２ががんを悪性化させる機序も解明されつつあり、ＥｐｈＡ２は抗がん剤の分子標的としてさらに有望視されるようになった。
　しかしながら、ＥｐｈＡ２は上述のとおり上皮組織の安定化とがんの悪性化という相反する機能を持つことから、ＥｐｈＡ２を治療に確実に応用するためには、ＥｐｈＡ２のがん細胞に対する双方向の機能がどのように切り替えられるのか、その分子機序を明らかにする必要があった。現に、がん細胞においてもＥｐｈＡ２リガンドは発現していることが多く、腫瘍組織においてＥｐｈＡ２どのようにリガンド非依存的に活性化されるのかは不明であった。
　ところで、膜結合型１マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１－ＭＭＰ）も悪性腫瘍において高発現していることが知られている。ＭＴ１－ＭＭＰは、ＥＣＭタンパク質に対するタンパク質分解作用を通じてがん細胞の浸潤と成長を促進する。ＭＴ１－ＭＭＰは、インテグリン、ＣＤ４４、トランスグルタミナーゼ、ｋｉｓｓ－１など様々な細胞表面タンパク質と相互作用し、このうちのいくつかはＭＴ１－ＭＭＰによって切断される。
Nat Rev Cancer. 2010 Mar;10(3):165-80. Semin Cell Dev Biol. 2012 Feb;23(1):109-15. Expert Opin Ther Targets. 2011 Jan;15(1):31-51. Cancer Metastasis Rev. 2003: 22(2-3):129-43. J Cell Sci. 2009 Sep 1;122:3015-24.
　本発明は、ＥｐｈＡ２ががん細胞においてリガンド非依存的に活性化される分子機序を解明し、ＥｐｈＡ２をがん治療のためのより有用な標的とするとともに、その機序を用いたがんの検査方法等を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、ＥｐｈＡ２のリガンド結合ドメインが、ＭＴ１－ＭＭＰによって切断されることを見出した。
　そして、ＭＴ１－ＭＭＰをノックダウンした細胞では、ＥｐｈＡ２のリガンド依存的な自己リン酸化が亢進すること；リガンド存在下において、ＥＧＦで誘導したＥｒｋ１／２、Ａｋｔ活性は、ＭＴ１－ＭＭＰノックダウンにより有意に抑制されること；同様の結果はＥｐｈＡ２を発現する各種がん細胞でも見られるが、ＥｐｈＡ２を発現していないがん細胞では見られないこと；ＭＴ１－ＭＭＰをノックダウンした細胞は、リガンド依存的に増殖が抑制されること；ＭＴ１－ＭＭＰをノックダウンした細胞では、リガンド存在下で、ＥＧＦで誘導したＲｈｏＧ活性や細胞運動が有意に抑制されることを確認した。
　さらに、ＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングに耐性を有するＥｐｈＡ２変異体を発現する細胞をマウスに移植したところ、野生型ＭＴ１－ＭＭＰを発現する細胞に比較して、肺への転移が有意に抑制されることを確認した。
　また、卵巣癌の凍結癌組織切片を用いた実験により、生体内の癌組織においてもＥｐｈＡ２はＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングを受けていることが示唆されること、及びＥｐｈＡ２のＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングががんの悪性化と強く相関することを確認した。さらに、正常な卵巣組織と卵巣癌組織について、ＥｐｈＡ２のＮ末端側を認識する抗体とＣ末端側を認識する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、癌組織はＮ末端側を認識する抗体で染色されなかったことから、癌組織においてはＥｐｈＡ２が切断されている一方、正常組織ではＥｐｈＡ２はインタクトなままであることを確認した。そして、この現象が、胃癌や大腸癌でも同様に生じていることを確認した。
　また、ＭＴ１ＭＭＰで切断されないＥｐｈＡ２の変異体を癌細胞（Ａ４３１細胞）で発現させたところ、当該癌細胞の表現型が正常な上皮細胞様に変化することを確認するとともに、Ａ４３１細胞で正常ＥｐｈＡ２を発現させ、内在性ＭＴ１－ＭＭＰで切り出される断片を抗体で検出できることを確認し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、
〔１〕がんの検査方法であって、被検者由来の試料中における分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量を測定する工程を含む、方法；
〔２〕前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片が、ＥｐｈＡ２タンパク質のＮ末端を含む断片である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つのペプチドである、上記〔１〕に記載の方法：
（ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；
〔４〕前記がんが、ＥｐｈＡ２を発現しているがんである、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔５〕前記試料は、血液、リンパ液、尿、及び糞便から選択される少なくとも１つである、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕抗がん剤の効果又は副作用を予測するために行われる、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔７〕前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量の測定が、ＥｐｈＡ２の断片を認識する抗体によって行われる、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔８〕前記ＥｐｈＡ２の断片を認識する抗体のエピトープが、ＥｐｈＡ２タンパク質上のシステインリッチドメインにある、上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕がんの検査用キットであって、分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片を検出可能な抗体を含む、キット；
〔１０〕前記断片が、ＥｐｈＡ２タンパク質のＮ末端を含む断片である、上記〔７〕に記載のキット；
〔１１〕前記抗体のエピトープが、ＥｐｈＡ２タンパク質上のシステインリッチドメインにある、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット；
〔１２〕前記抗体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つのペプチドに対する抗体である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット：
（ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；
〔１３〕抗がん剤の効果又は副作用を予測するために用いられる、上記〔９〕又は〔１２〕に記載の検査用キット；
〔１４〕ＥｐｈＡ２を発現する細胞を、ＭＴ１－ＭＭＰがＥｐｈＡ２をプロセシングする条件で培養する工程と、
　前記細胞の培地に被検化合物を加えて、ＭＴ１－ＭＭＰの存在下でインキュベートする工程と、
　ＥｐｈＡ２のプロセシングの有無を測定する工程と、
を含む抗がん剤のスクリーニング方法；
〔１５〕前記ＥｐｈＡ２のプロセシングの有無を検出する工程で、被検化合物が存在しない場合と比較して、プロセシングが低下する被検化合物を抗がん剤候補として選択する、上記〔１４〕に記載のスクリーニング方法；
〔１６〕以下のいずれかの配列からなる二本鎖ＲＮＡもしくはその前駆体、またはこれらをコードする核酸を含む、抗がん剤：
siRNA #1
S: ggauggacacggagaauuutt　（配列番号：６）
AS: aaauucuccguguccaucctt  （配列番号：７）
siRNA #2
S: gcgaugaagucuucacuuatt　（配列番号：８）
AS: uaagugaagacuucaucgctt  （配列番号：９）、及び
siRNA #3
S: ggguagagacccugagacatt　（配列番号：１０）
AS: ugucucagggucucuaccctt  （配列番号：１１）；及び
〔１７〕ＭＴ１－ＭＭＰの発現又は機能を阻害することを含む、がんの治療方法、
に関する。
　本発明に係るがんの検査方法及び検査用キットによれば、ＭＴ１－ＭＭＰによって切断されたＥｐｈＡ２断片を検出するという簡便な方法で、がんの発生、悪性化、予後等を判定することができる。
　また、本発明に係るスクリーニング方法によれば、ＥｐｈＡ２のリガンド非依存的な活性のみ抑制する分子標的薬候補を選択することが可能である。
図１Ａは、MT1-MMPとC末端をMyc標識したEphA2とをヒト線維芽肉腫HT1080細胞へ導入し、Myc抗体によるウエスタンブロットで切断されたEphA2の切り株を検出した結果である。MT1-MMPを強制発現したHT1080細胞では、全長型EphA2（大矢印）に加え、分子量65、60kDaのEphA2プロセシング断片（小矢印）が検出された。MT1-MMPの阻害剤であるTIMP-2、BB94で細胞を処理すると、MT1-MMPの活性が阻害されるのに伴い、これらのプロセシング断片の産生も抑制された。　図１Ｂは、各種膜型MMPでEphA2のプロセシングが起こるか否かをウエスタンブロットで検証した結果である。C末端をMyc標識したEphA2とMT1～6-MMPをHT1080細胞にそれぞれ強制発現したところ、MT1-MMPを導入した細胞のみでEphA2のプロセシング断片（小矢印）が検出された。このことから、MT1-MMPがEphA2のプロセシングの主要な膜型MMPであることが示唆された。＊は非特異的なバンドを示す。　図１Ｃは、MT1-MMPによるプロセシング断片A、B（切り株側）のN末端アミノ酸解析の結果である。C末端をMyc標識したEphA2と野生型MT1-MMPをHT1080細胞に共発現させ、その細胞から全長型EphA2および断片A、BをMyc抗体による免疫沈降で精製した後、精製したEphA2と断片A、BをMyc抗体によるウエスタンブロットで検出した。BB94で処理した細胞からは全長型EphA2のみが精製された。断片A、BのN末端をペプチドシーケンサーで解析したところ、断片AはVSINQ、断片BはNQTEPPであった。この結果から、細胞膜上で2ヶ所の異なるプロセシングが起こっている可能性が示唆された。　図１Ｄは、MT1-MMPによるEphA2の切断部位を同定するため、図１Ｃで見出した切断部位を含むペプチド鎖を合成し、MT1-MMPのリコンビナントタンパク質によるin vitro消化を行った結果を示す。in vitro消化では、MT1-MMPはEphA2ペプチドのS426とF427の間と431Sと432Vの間の2カ所の部位（矢印）を切断した。図１Ｃと図１Ｄの結果から、MT1-MMPは細胞膜上で431位のSと432位のVの間を切断し、その切断と連動して未知のプロテアーゼが434位のIと435位のNの間を切断していることが示唆された。　図１Ｅは、EphA2におけるMT1-MMPの切断部位を示す概略図である。切断部位は、フィブロネクチン部位であり、このプロセシングによってリガンド結合部位が遊離することがわかる。 図２は、MT1-MMP発現をsiRNAでノックダウンしたA431細胞を用いて、EphA2のプロセシングと、Ephrin-A1によるEphA2のリン酸化の状態を、IP-ウエスタンで調べた結果である。図２Ａは、siRNA処理でMT1-MMP発現が消失した細胞のライゼートをEphA2のC末端に対する抗体で免疫沈降し、沈降物を同抗体と抗チロシンリン酸化抗体でウエスタンブロットした結果を示す（A、EphA2、p-EphA2）。図２Ｂから２Ｄは、図２Ａの結果から、EphA2、E-カドヘリン、リン酸化EphA2の相対発現量を求めた結果である。MT1-MMPをノックダウンすると、65kDaと60kDaのEphA2のプロセシング断片は消失した（Ａ）。一方、MT1-MMPの発現の有無でE-カドヘリンのプロセシングには変化がなかった（Ａ、Ｃ）。図２Ｅは、細胞表層でのEphA2のプロセシングを検出するために、A431細胞の細胞表層をビオチン化してアビジンビーズによるpull downで膜タンパク質分画を精製し、精製した膜タンパク質中のEphA2量をEphA2抗体によるウエスタンブロットで測定した結果を示す。図２Ｆ及びＧは、図２Ｅの結果から、EphA2及びE-カドヘリンの相対発現量を求めた結果である。MT1-MMPノックダウンで全長のEphA2量が増加し、TIMP-2処理を行っても同様の結果となった（Ｅ、Ｆ）。一方、細胞表層のE-カドヘリン発現量についてはMT1-MMPの発現の有無で変化は見られなかった（Ｅ、Ｇ）。 図３Ａ～Ｆは、MT1-MMPの発現をsiRNAでノックダウンしたA431細胞をEGF処理し、EphA2がEphrin-A1依存的にEGF受容体下流シグナル（PI3K、MAPK）に及ぼす影響を調べた結果である。図３Ａは、EphA2およびp-EphA2の検出をEphA2のC末端を認識する抗体によるIP-ウエスタンで検出し、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Akt、Aktをそれぞれの特異抗体を用いたウエスタンブロットで検出した結果を示す。それぞれのリン酸化の割合はImage Jによるデンシトメトリーで定量した。Ephrin-A1存在下において、MT1-MMP発現の有無はEGF受容体の活性化には影響を与えなかった（Ａ、Ｂ）。MT1-MMPノックダウンはEphA2自身のリン酸化を亢進した（Ａ、Ｃ）。また、Ephrin-A1の存在下において、EGFで誘導したErk1/2、Akt活性は、MT1-MMPノックダウンで有意に抑制された（Ａ、Ｄ、Ｅ）。同様の結果はヒト乳癌BT549細胞、頭頸部癌SCC61細胞においても見られた（Ｆ、図８）が、EphA2を発現していな卵巣癌IGROV-1細胞や乳癌BT-20細胞、さらに、k-rasの変異のあるMDA-MB-231細胞においては見られなかった（Ｆ）。 図３Ｇ～Ｉは、EphA2のプロセシングがEphA2/Ephrin-A1依存的な細胞増殖抑制に及ぼす影響を、2次元、3次元（コラーゲンゲル内）と足場非依存的な培養で調べた結果である。2次元、3次元の細胞増殖能は血球計算盤で生細胞数を計測し（Ｇ、Ｈ）、スフェロイド増殖能はスフェロイドの容積を計算して比較した（Ｉ）。2次元培養皿の条件下において、MT1-MMPの有無による、Ephrin-A1/EphA2依存的な細胞増殖抑制への影響はみられなかった（Ｇ、Ｈ）。しかし、コラーゲンゲル内の3次元培養および足場非依存的なスフェロイド形成においては、MT1-MMPノックダウンした細胞の増殖は、Ephrin-A1依存的に有意に抑制された（Ｉ）。４回の異なる実験を行い、統計処理はT-testを行った。 図４は、MT1-MMPの発現をsiRNAでノックダウンしたA431細胞を用いて、Ephrin-A1依存的EphA2がEGF受容体下流のsmall GTPaseであるRhoGシグナルに及ぼす影響を調べた結果である。RhoG活性の検出にはRhoGのエフェクターであるELMO2/GST融合タンパク質をグルタチオンビーズに結合したものをベイトとした。RhoG活性の定量はImage Jによるデンシトメトリーで行った。EGF未処理の細胞ではRhoG活性は検出されなかった（Ａ）。一方、EGF刺激を行った場合、MT1-MMPノックダウンした細胞では、Ephrin-A1処理によりRhoG活性が有意に低下した（Ａ、Ｂ）。同様の結果はSCC61細胞においても見られた（Ｃ）。EGF刺激した細胞の運動能をトランスウエルチャンバーで調べたところ、MT1-MMPノックダウン細胞では、Ephrin-A1処理により細胞運動が有意に抑制された（Ｄ、Ｅ）。このことから、MT1-MMPによるEphA2のプロセシングは、small GTPase活性を亢進する役割を担うことが示唆された。5回および3回の異なる実験を行い、統計処理はT-testを行った。 図５は、MT1-MMPによるEphA2のプロセシングが癌細胞の転移能を亢進する可能性を調べるために、プロセシング耐性のEphA2変異体を発現する細胞を用いて行った実験の結果である。ベクターのみ、野生型EphA2、プロセシング耐性EphA2変異体を導入したA431細胞を樹立した（Ａ、Ｂ）。SP：シグナルペプチド、EBD：Ephrin-binding domain、TM: transmembrane、F: FLAGを示す。野生型EphA2、又はプロセシング耐性EphA2変異体を導入した細胞のEphA2のプロセシングの状態をウエスタンブロットで検出したところ、切断部位を欠損した変異体は、MT1-MMPによるプロセシングに耐性を示した（Ｃ）。EphA2変異体のEphrin-A1によるリン酸化をEphA2抗体による免疫沈降で確認した（Ｄ）。 EphA2変異体がA431細胞の肺への転移能に与える影響を調べるために、実験マウス肺転移モデルを作製して検証した（n=5）。各細胞（5x106/100μl）はマウス尾静脈へ投与し、1ヶ月後にマウスを解剖して肺に形成された転移結節の観察を行った。プロセシング耐性EphA2変異型を導入した細胞を投与したマウスでは、肺における転移結節の形成が低下した（Ｅ、Ｆ）。また、HE染色の結果から、プロセシング耐性EphA2変異型を導入した細胞を投与したマウスでは、肺での癌細胞の増殖も有意に抑制されたことが示された（Ｇ）。統計処理はT-testを行った。 図６は、卵巣癌でのEphA2のプロセシングの検討の結果を示す。図６Ａは、凍結癌組織切片よりRIPA緩衝液を用いて組織抽出液を作製し、それぞれの組織タンパク質量をCBB法で測定した後、各組織に発現するEphA2とMT1-MMPを、それぞれEphA2のC末端に対する抗体とMT1-MMPモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで解析した結果を示す。陽性対照として、A431細胞にMT1-MMP（±MMI）を導入した細胞から抽出したライゼートに含まれるEphA2断片、MT1-MMPを用いた。卵巣癌組織では全長型EphA2（intact）は低レベルでしか検出されず、分子量60kDaの断片（EphA2 fragment）が主要なものであった（Ａ、下段のパネル）。これら組織中のMT1-MMPの発現量をMT1-MMPモノクローナル抗体で検出した（Ａ、上段のパネル）。＊は1次抗体なしでも見られることから非特異的なバンドであると考えられた（Ｂ）。これらの結果から、生体内の癌組織においても、EphA2はMT1-MMPによるプロセシングを受け、プロセシングによる60kDaの断片を生じることが示唆された。 図６Ｃ及びＤは、卵巣癌組織のEphA2とMT1-MMPを蛍光顕微鏡による免疫染色法で検出した結果を示す。EphA2はC末端（Ｃ）、N末端（Ｄ）をそれぞれ認識する抗体を用いて、MT1-MMP抗体との共染色を行った。MT1-MMPの陽性染色部位はEphA2のC末端抗体の陽性部位と共局在する（Ｃ）。一方、EphA2のN末端抗体の陽性染色部位はMT1-MMPのそれと共局在しない（Ｄ）。このことから、癌組織で強発現している多くのEphA2はN末端が切断された切り株である可能性が示唆された。 図６Ｅ及びＦは、MT1-MMPの発現部位でのEphA2のリン酸化の動態をEphA2の細胞内ドメインのリン酸化を認識する2種の抗体を用いて検討した結果を示す。卵巣癌組織において、MT1-MMPの発現はEphA2のリガンド非依存的な897位のセリン残基のリン酸化の発現と共局在した（Ｅ）。一方、MT1-MMPの発現とリガンド依存的な594位のチロシン残基のリン酸化とは異なる局在を示した（Ｆ）。 図７は、MT1-MMPノックダウンによるEphA2/Ephrin-A1シグナルのへ影響を、ヒト頭頸部癌細胞SCC61で調べた結果を示す。EGF刺激したSCC61細胞のEGFR、EphA2、Erk1/2、Aktのリン酸化をIP、WBで調べた。Erk1/2、Aktのリン酸化率については、Image Jによるデンシトメトリーで定量した。３回の異なる実験を行い、統計処理はT-testを行った。 図８は、図６と同様の解析を頭頸部癌組織について行った結果を示す。MT1-MMPの発現量が卵巣癌に比べ低いため、EphA2のプロセシングの割合は非常に低かった（Ｃ下段のパネル）。頭頸部癌組織を免疫染色法で調べると、EphA2が腫瘍部および非腫瘍部で発現しているのに対して、MT1-MMPは腫瘍部内での部分的な発現分布を示した（Ａ、Ｂ）。この結果は、頭頸部癌でもMT1-MMPを発現する腫瘍細胞内では卵巣癌組織同様のEphA2のプロセシングが起こっている可能性を示唆する。 図９は、頭頸部癌組織について行った結果を示す。MT1-MMPの発現部位でのEphA2のリン酸化の動態を、EphA2の細胞内ドメインのリン酸化を認識する2種の抗体を用いて検討した結果を示す。頭頸部癌組織においても、MT1-MMPの発現はEphA2のリガンド非依存的な897位のセリン残基のリン酸化の発現と共局在した（Ａ）。一方、MT1-MMPの発現とリガンド依存的な594位のチロシン残基のリン酸化とは異なる局在を示した（Ｂ）。 図１０は、MT1-MMPがEphA2をリガンド非感受性に変換するモデルの概略図である。正常細胞では、EphA2はリガンド依存的に機能し、細胞増殖や生存などのシグナルを抑制的に制御する。一方、細胞が癌化するに伴ってMT1-MMPの発現が亢進し、EphA2のリガンド結合ドメインを遊離させることで、EphA2をリガンド非感受性なRTKへ変換する。このことで、リガンド非依存的にEphA2が作用し、それぞれのシグナル経路を惹起することで細胞増殖、生存、運動を促進する方向に制御し、癌細胞の悪性形質の獲得に寄与する。 図１１は、正常な卵巣組織（Ａ）と、卵巣癌組織（Ｂ）を、EphA2のN末端側を認識する抗体と、C末端側を認識する抗体で免疫染色した結果を示す。核はDAPIで染色した。バーは50μmを示す。EphA2のC末端側を認識する抗体による免疫染色では、正常卵巣組織と卵巣癌組織で同様の結果が得られたが、卵巣癌組織は、N末端側を認識する抗体によって染色されなかった。 図１２は、胃癌組織（Ａ）と、大腸癌組織（Ｂ）を、EphA2のリガンド非依存的な897位のセリンのリン酸化を検出する抗体と、MT1-MMPを検出する抗体で免疫染色した結果を示す。核はDAPIで染色した。バーは50μmを示す。897位のセリンがリン酸化されたEphA2とMT1-MMPの発現の局在は、胃癌組織及び大腸癌組織においても一致した。 図１３は、MT1-MMPの切断に耐性を有するEphA2変異体を、A431細胞で発現させた結果を示す。Mockは、EphA2を発現させていない細胞、EphA2-CFは、正常EphA2を発現させた細胞、ucEphA2-CF-1及びucEphA2-CF-2は、MT1-MMPの切断に耐性を有するEphA2変異体を発現させた細胞を示す。A431細胞は、悪性癌細胞特有の紡錘状の表現型を有するが（Mock、及びEphA2-CF）、MT1-MMPの切断に耐性を有する変異体を発現する細胞は、正常な上皮細胞の表現型に変化した。 図１４は、EphA2をA431細胞で発現させ、内在性のMT1-MMPで切り出される断片をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
［がんの検査方法］
　本発明に係るがんの検査方法は、被検者由来の試料中における分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量を測定する工程を含む。
　がん組織においては、ＭＴ１－ＭＭＰなどのプロテアーゼの発現が亢進し、ＥｐｈＡ２がプロセシングを受ける。したがって、かかるプロセシング断片を被検者由来の試料から検出することにより、がんの検査を行うことができる。
　本発明に係るがんの検査方法で測定するＥｐｈＡ２タンパク質の断片は、分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａの断片であれば、どのような断片であってもよい。
　本発明に係るがんの検査方法の一態様として、分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａである、ＥｐｈＡ２タンパク質のＮ末端を含む断片の量を測定してもよい。
　また、本発明に係るがんの検査方法の一態様として、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つの断片の量を測定してもよい。
（ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、及び
（ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
　配列番号：１で表されるペプチドは、配列番号：５で表されるＥｐｈＡ２タンパク質のＳ４３１とＶ４３２の間で切断されて生じるＮ末端側の断片であり、配列番号：２は、このときＣ末端側に生じる断片である。
　配列番号：３で表されるペプチドは、Ｉ４３４とＮ４３５の間で切断されて生じるＮ末端側の断片であり、配列番号：４は、このときＣ末端側に生じる断片である。
　配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＥｐｈＡ２がＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングを受けた結果生じる断片である。本発明者らは、図１０に示すように、細胞の癌化に伴ってＭＴ１－ＭＭＰの発現が亢進し、ＥｐｈＡ２のリガンド結合ドメインを遊離させることでＥｐｈＡ２をリガンド非感受性のＲＴＫへ変換する結果、リガンド非依存的なＥｐｈＡ２の作用によってそれぞれのシグナル経路が活性化され、増殖、生存、運動を促進する方向に細胞を制御して癌細胞の悪性形質の獲得に寄与することを見出した。
　したがって、被検者由来の試料中における配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの量を測定することにより、細胞の癌化の程度を判定することが可能である。
　なお、配列番号：２及び４で表される断片は、膜貫通領域（ＴＭ）含む断片であり、本明細書においてはこれらを「切り株」と呼ぶことがある。
　本発明に係るがんの検査方法では、配列番号：１～４で表される断片のいずれを測定してもよく、２以上の断片を測定してもよい。遊離断片である配列番号１又は２で表される断片の検出が容易である。
　本発明に係るがんの検査方法は、（ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ配列からなるペプチドに加え、（ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチドや、（ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドの量を測定してもよい。また、これらのペプチドの中からいくつかを組み合わせて測定してもよい。
　（ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチドや、（ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、ＥｐｈＡ２が、ＭＴ１－ＭＭＰのプロセシングに耐性を有しない変異を含む場合にプロセシング断片として生じ得るものである。
　本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列」という場合、付加、置換又は欠失されるアミノ酸の個数は特に限定されないが、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個等とすることができる。また付加、置換又は欠失される位置は、ペプチドの末端であっても中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
　本明細書において、「８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」という場合、配列同一性は、８０％以上である限り何％であってもよいが、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％等であってもよい。
　以下、（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、被検者由来の試料中における分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片であるペプチドを纏めて、「本発明のペプチド」という場合もある。
　本明細書において「タンパク質の断片の量を測定する」工程には、断片を具体的に定量することだけでなく、断片の有無を検出することや、複数の時点で採取した試料中の断片量を測定して比較し、経時的な変化を調べることも含まれる。
　本発明に係る検査方法における断片の量の測定は、試料中の断片を検出できるあらゆる方法を用いて行うことができ、例えば、イムノアッセイ（凝集法、比濁法を含む）、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等が挙げられるが、これらに限定されない。
　例えば、ＥｐｈＡ２の断片に対する抗体を用いたイムノアッセイは、簡便で好ましい。
　本明細書において「ＥｐｈＡ２の断片に対する抗体」は、上述したＥｐｈＡ２の断片を特異的に認識する抗体であれば、どのような抗体であってもよく、例えば以下の抗体が挙げられる。
（１）ＥｐｈＡ２タンパク質の分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａの断片を特異的に認識する抗体
（２）ＥｐｈＡ２タンパク質の分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａの断片であって、ＥｐｈＡ２のＮ末端を含む断片を特異的に認識する抗体
（３）上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに該当するペプチドを特異的に認識する抗体（４）配列番号：５に示されるＥｐｈＡ２のアミノ酸配列のシステインリッチドメイン（Cysteine rich domain;ＣＲＤ、１８０位～３４０位付近）にエピトープを有する抗体
　上記（１）～（３）の抗体は、当業者が公知の方法に従って作製することができる。例えば、（１）～（３）のそれぞれで特定されたＥｐｈＡ２の断片を用いて非ヒト動物を免疫し、常法に従って作製してもよい。また、ＥｐｈＡ２全長を用いて非ヒト動物を免疫し、得られた抗体の中から、（１）～（３）のそれぞれで特定された断片に結合するものを、常法に従ってスクリーニングしてもよい。
　上記（４）の抗体も、当業者が公知の方法に従って作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドで、非ヒト動物を免疫して作製してもよいし、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、ファージディスプレイ法等で作製した抗体ライブラリや抗体フラグメントライブラリから、当該エピトープに結合するものを選択すればよい。システインリッチドメインは、例えば配列番号：５に示されるアミノ酸配列の１８０位～３４０位、又は２０１位～３１４位とすることができる。
　イムノアッセイは、検出可能に標識した本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体、又は、検出可能に標識した本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、又はＥＬＩＳＯＰＴ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
　ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
　また、イムノアッセイでは、本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
　イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に標的ペプチドを測定することができて好ましい。
　ＥＬＩＳＡ法には競合法とサンドイッチ法がある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体を固定し、試料を添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。試料中の本発明のＥｐｈＡ２の断片量が多ければ発色は弱くなり、少なければ発色が強くなるので、検量線を用いてＥｐｈＡ２の断片量を求めることができる。
　サンドイッチ法では、固相担体に本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体を固定し、試料を添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、本発明のＥｐｈＡ２の断片量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と試料を反応させた後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
　酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３'５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
　本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチドのいずれかで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドで免疫した動物の血清から得ることができる。
　本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体は、既存の抗体を用いてもよい。
　本発明に係る検査方法に用いられる被検者由来の試料としては、例えば血液、リンパ液、尿などの体液、糞便、細胞や組織のライゼートが挙げられ、これらをペプチド量の測定法に適した方法で処理してから使用することができる。
　配列番号：１又は３で表される遊離断片は、血液、血液、リンパ液、尿などの体液、糞便等から検出しやすい。配列番号：２又は４で表される切り株方断片は、細胞や組織のライゼートを、可溶性の高い界面活性剤（例えばＲＩＰＡ）を含む緩衝液で処理してから、検出することができる。
　本明細書において「がん」はその最も広い意味で用いられる。がんとしては、例えば、脳腫瘍、頭頚部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肛門癌、直腸癌、肝癌、肝細胞癌、腎臓癌、腎細胞癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨肉種、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、前立腺癌、精巣腫瘍、膀胱癌、皮膚癌が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明に係る検査方法は、特に、ＥｐｈＡ２を発現している癌に有用である。癌細胞がＥｐｈＡ２を発現しているか否かは当業者が簡単に確認することができるが、例えば、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、卵巣腺癌、食道癌、尿路癌（膀胱癌、腎盂癌）、膵臓癌、肺癌、胃癌、大腸癌などが挙げられる。
　本明細書において、「検査方法」とは、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味し、本発明の検査方法は、例えば検査会社等で実施され得る。
　本明細書において、「がんの検査方法」とは、がん及びそれによって引き起こされるあらゆる現象を調べることを意味し、例えば、罹患の有無、進行度、悪性度、進行の停止や遅延、転移の有無、治療効果の有無の判定に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味する。
　本明細書において、「がんの検査方法」は、抗がん剤の効果や副作用を予測する、いわゆるコンパニオン診断に用いてもよい。「抗がん剤」は特に限定されないが、例えばＥｐｈＡ２やＭＴ１－ＭＭＰ、リガンド非依存的に活性化されるＥｐｈＡ２の下流シグナルを標的とした抗がん剤が挙げられる。ＥｐｈＡ２の断片の量が健常者、又は他のがん患者に比較して有意に多い場合、これらを標的とする抗がん剤が有効であることが予測される。
［がんの検査用キット］
　本発明に係るがんの検査用キットは、上述した検査方法を使用してがんの検査を行うためのキットであり、本発明の「ＥｐｈＡ２の断片に対する抗体」を含む。
　本発明の検査用キットは、本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体と本発明のＥｐｈＡ２の断片との抗原抗体反応を利用するイムノアッセイによって、本発明のペプチド量を測定するために必要な試薬及び装置を含む。
　検査用キットの一態様は、サンドイッチ法によって本発明のＥｐｈＡ２の断片量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体；及び、アルカリホスファターゼ基質（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含む。捕獲抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。
　このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに試料を適宜処理して添加した後インキュベートした後、試料を除去して洗浄する。次に、標識した抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、本発明のＥｐｈＡ２の断片量を求めることができる。
　検査用キットの別の態様は、二次抗体を使用してサンドイッチ法により本発明のＥｐｈＡ２の断片の量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体；一次抗体として、本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した、本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体に対する抗体；及び、アルカリホスファターゼ（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含む。
　捕獲抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。
　このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに試料を適宜処理して添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、本発明のＥｐｈＡ２の断片の量を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
　本発明に係る検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むものであってもよい。
　標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（25Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。
　キットには、本発明のＥｐｈＡ２の断片に対する抗体が複数種類含まれていてもよい。
［抗がん剤のスクリーニング方法］
　本発明に係る抗がん剤のスクリーニング方法は、
　EphA2を発現する細胞を、MT1-MMPがEphA2をプロセシングする条件で培養する工程と、
　前記細胞の培地に被検化合物を加えて、MT1-MMPの存在下でインキュベートする工程と、
　EphA2のプロセシングの有無を測定する工程と、
を含むことを特徴とする。
EphA2を発現する細胞は、既存の培養癌細胞を用いてもよいし、適当な細胞を選択し、これらのタンパク質を強制発現させて用意することもできる。強制発現の方法は、例えば本発明の実施例で用いられる方法とすることができるが、当業者であれば公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜行うことができる。
　「MT1-MMPの存在下でインキュベートする工程」は、EphA2を発現する細胞で、MT1-MMPを共発現させてもよいし、別々の細胞で発現させて共培養してもよい。また、MT1-MMPを別途調製して、培地に加えてもよい。MT1-MMPがEphA2をプロセシングする条件も、例えば本発明の実施例で用いられた培養条件とすることができるがこれに限定されず、当業者が適宜選択することができる。
　被検化合物は特に限定されず、あらゆる物質とすることができるが、例えば、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質等が用いられる。当業者は、それぞれの被検化合物にあわせて添加する濃度やインキュベートの条件を決定することができる。
　EphA2のプロセシングの有無を測定する工程は、例えば、上述した本発明のペプチドの量を測定する方法を用いて行うことができる。当該工程では、被検化合物が存在しない場合と比較して、プロセシングが低下する被検化合物を抗がん剤候補として選択することができる。
［がんの診断方法］
　本発明はまた、がんの診断の方法も提供する。がんの診断方法は、本発明の検査方法によって得られた結果を用いて医師等が、罹患の有無、進行度、悪性度、進行の停止や遅延、転移の有無、治療効果の有無を判定することを意味する。
［抗がん剤］
　本発明に係る抗がん剤は、以下の配列からなるｓｉＲＮＡ、若しくはその前駆体、またはこれらをコードする核酸を含む。
siRNA #1
S: ggauggacacggagaauuutt　（配列番号：６）
AS: aaauucuccguguccaucctt  （配列番号：７）
siRNA #2
S: gcgaugaagucuucacuuatt　（配列番号：８）
AS: uaagugaagacuucaucgctt  （配列番号：９）
siRNA #3
S: ggguagagacccugagacatt　（配列番号：１０）
AS: ugucucagggucucuaccctt  （配列番号：１１）
　ｓｉＲＮＡは、通常１９～３０塩基程度、例えば２１塩基～２５塩基程度の二本鎖ＲＮＡであり、一般に、その一方が標的ｍＲＮＡの一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有するが、標的ｍＲＮＡには完全に相補的でなくてもよい。
　ｓｉＲＮＡを用いる発現阻害法、すなわちＲＮＡｉ法は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。ｓｉＲＮＡも標的特異性が高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
　ｓｉＲＮＡの典型的な構造は、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡであり、各ＲＮＡ鎖の３'部分が２塩基のオーバーハングとなっている。ｓｉＲＮＡはヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）や、より長い二本鎖ＲＮＡからＤｉｃｅｒによって切り出されて産生される。Ｄｉｃｅｒに切断される前のｓｈＲＮＡや長い二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体として、本発明に係る抗がん剤に用いることができる。
　ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ効果を有する限り、二本鎖ＲＮＡであっても良いし、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
　また、本発明に係る抗がん剤は、細胞内でｓｉＲＮＡ又はその前駆体に転写される核酸も包含する。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．トランスフェクタントの作製（図１）
　HT1080にplenti-c-myc-EphA2ベクターを用いたViraPowerTM レンチウイルス発現システムでc-myc-EphA2を安定的に発現するHT1080細胞を作製し、MT1-6-MMPsの発現ベクター（pSG-MT1-6-MMPs）をその細胞に一過性に導入した。EphA2およびMT1-MMPの検出は、抗Mycポリクローナル抗体、抗MT1-MMPモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで行った。それぞれのMT-MMPsの発現ベクターはFuGene6(Rhoche)を用いて導入した。c-myc-EphA2と野生型MT1-MMPの発現の確認は、それぞれの細胞（10cm）をRIPAで可溶化し、抗C-myc抗体によるEphA2およびその切り株の免疫沈降(IP)を行った。また、MT1-MMPのプロテアーゼ活性を抑制するため、MMP阻害剤であるBB94、あるいはTIMP-2を培養液中に添加した。
　図１Ａに示されるとおり、MT1-MMPを強制発現したHT1080細胞では、全長型EphA2（大矢印）に加え、分子量65、60kDaのEphA2プロセシング断片（小矢印）が検出された。MT1-MMPの阻害剤であるTIMP-2、BB94で細胞を処理すると、MT1-MMPの活性が阻害されるのに伴い、これらのプロセシング断片の産生も抑制された。
　図１Ｂに示されるとおり、C末端をMyc標識したEphA2とMT1～6-MMPをHT1080細胞にそれぞれ強制発現したところ、MT1-MMPを導入した細胞のみでEphA2のプロセシング断片（小矢印）が検出された。このことから、MT1-MMPがEphA2のプロセシングの主要な膜型MMPであることが示唆された。
　精製された65，60kDaのプロセシング断片の同定は、それぞれの精製蛋白質（50　pmole）をABIペプチドシークセンサー（Procise 494 HT）によるエドマン分解法で解析し、N末端から5残基を決定した（アプロサイエンスへ委託）。結果を図１Ｃに示す。65kDaの断片AのN末端配列はVSINQ、60kDaの断片BのN末端配列はNQTEPPであった。
　そこで、MT1-MMPによるEphA2の切断部位を同定するため、図１Ｃで見出した切断部位を含むペプチド鎖を合成し、MT1-MMPのリコンビナントタンパク質によるin vitro消化を行った。結果を図１Ｄに示す。in vitro消化では、MT1-MMPはEphA2ペプチドのS426とF427の間と431Sと432Vの間の2カ所の部位（矢印）を切断した。図１Ｃと図１Ｄの結果から、MT1-MMPは細胞膜上で431位のSと432位のVの間を切断し、その切断と連動して未知のプロテアーゼが434位のIと435位のNの間を切断していることが示唆された。
　図１Ｅは、EphA2におけるMT1-MMPの切断部位を示す概略図である。切断部位は、フィブロネクチン部位であり、このプロセシングによってリガンド結合部位が遊離することがわかる。
２．MT1-MMPノックダウン（図２）
　MT1-MMPのノックダウンはMT1-MMPに対して2種類の特異的なトリオミックスsiRNA（3種の異なるsiRNA、B-bridge社）を用いてMT1-MMP発現をノックダウンした。
siRNA #1
S: ggauggacacggagaauuutt　（配列番号：６）
AS: aaauucuccguguccaucctt  （配列番号：７）
siRNA #2
S: gcgaugaagucuucacuuatt　（配列番号：８）
AS: uaagugaagacuucaucgctt  （配列番号：９）
siRNA #3
S: ggguagagacccugagacatt　（配列番号：１０）
AS: ugucucagggucucuaccctt  （配列番号：１１）
２－１．EphA2およびその切り株の検出（図２Ａ～Ｄ）
　A431細胞をRIPAで可溶化し、そのライゼート中のEphA2及びその切り株を抗EphA2抗体（C末端の細胞内ドメインを認識、Santa Cruz）でIPし、IPされた分画を同EphA2抗体および抗チロシンリン酸化抗体（４G10、Millipore）を用いてウエスタンブロットした（A、EphA2、p-EphA2）。一方、陰性コントロールとして、E-カドヘリンの発現は抗E-カドヘリンモノクローナル抗体（Merck）を用いたウエスタンブロットで調べた。
　結果を図２Ａに示す。図２Ｂ～Ｄは、図２Ａの結果から、EphA2、E-カドヘリン、リン酸化EphA2の相対発現量を求めた結果である。MT1-MMPをノックダウンすると、65kDaと60kDaのEphA2のプロセシング断片は消失した（Ａ）。一方、MT1-MMPの発現の有無でE-カドヘリンのプロセシングには変化がなかった（Ａ、Ｃ）。
２－２．細胞表層のEphA2およびその切り株の検出（図２Ｅ～Ｇ）
　細胞表層のEphA2のプロセシングを調べるため、A431細胞の膜蛋白をLC-ビオチン（Pierce）で標識し、アビジンビーズ（Immobilized Streptavidin, Pierce）によるpull downで膜蛋白質を精製した。精製した膜蛋白質中のEphA2量を抗EphA2抗体によるウエスタンブロットで比較した。それぞれの蛋白質の比較はImage-Jによるデンシトグラフで行った。
　結果を図２Ｅに示す。図２Ｆ及びＧは、図２Ｅの結果から、EphA2及びE-カドヘリンの相対発現量を求めた結果である。MT1-MMPノックダウンで全長のEphA2量が増加し、TIMP-2処理を行っても同様の結果となった（Ｅ、Ｆ）。一方、細胞表層のE-カドヘリン発現量についてはMT1-MMPの発現の有無で変化は見られなかった（Ｅ、Ｇ）。
３－１．EphA2、Erk、Aktのリン酸化の検出（図３Ａ～Ｆ）
　それぞれの細胞は脱リン酸化酵素阻害剤（オルトバナジン(V)酸ナトリウム、フッ化ナトリウム）を添加したRIPAで可溶化した後、EphA2およびp-EphA2の検出はEphA2のC末端を認識する抗体によるIPを行い、それぞれ抗EphA2抗体、抗チロシンリン酸化抗体（４G10）によるウエスタン（IP-ウエスタン）で検出した。また、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Akt、Aktはそれぞれの特異抗体を用いてウエスタンブロットで検出した。リン酸化の割合はウエスタンブロットで得られたバンドをImage Jによるデンシトメトリーで定量化した。
　抗体は、以下のものを用いた：抗p-Erk1/2モノクローナル抗体（Santa Cruz）、抗Erk1/2ポリクローナル抗体（Santa Cruz）、抗p-Akt（Ser473）モノクローナル抗体（Cell Signaling）、抗Akt（Ser473）モノクローナル抗体（Cell Signaling）。
　結果を図３Ａ～Ｆに示す。また、同様の実験を、ヒト頭頸部癌SCC61細胞で行った結果を図７に示す。
　Ephrin-A1存在下において、MT1-MMP発現の有無はEGF受容体の活性化には影響を与えなかった（Ａ、Ｂ）。MT1-MMPノックダウンはEphA2自身のリン酸化を亢進した（Ａ、Ｃ）。また、Ephrin-A1の存在下において、EGFで誘導したErk1/2、Akt活性は、MT1-MMPノックダウンで有意に抑制された（Ａ、Ｄ、Ｅ）。同様の結果はヒト乳癌BT549細胞、頭頸部癌SCC61細胞においても見られた（Ｆ、図７）が、EphA2を発現していな卵巣癌IGROV-1細胞や乳癌BT-20細胞、さらに、k-rasの変異のあるMDA-MB-231細胞においては見られなかった（Ｆ）。
３－２．細胞増殖アッセイ（2次元、3次元培養、スフェロイド形成）（図３Ｇ～Ｉ）
（２次元培養）
　野生型、MT1-MMPノックダウンA431細胞を培養ディッシュ（2次元培養）にそれぞれ播種し（8 x 103個/2ml/6 well plate）、DMEM/1%FCSの培養液で4日間の培養を行った。細胞数は血球計算盤を用いて計測した。
（3次元培養）
　酢酸で抽出したコラーゲンIゲル（3mg/ml、新田ゼラチン）と中和緩衝液（50mM NaOH、260mM NaHCO3, 200mM HEPES）、それぞれの細胞を混合し、2.5 x 104/250 μl/48 well plateに細胞を播種した。コラーゲンゲルが重合した後、400μl/wellのDMEM/1%FCSの培養液で7日間の培養を行った。培養後、0.1%コラゲナーゼでコラーゲンゲルを溶解し、細胞はトリプシンで単一細胞にした後、コールターカウンターで細胞数を測定した。
（スフェロイド形成）
　それぞれの細胞をトリプシンで剥離し、細胞数を血球計算盤で計測した。それぞれの細胞蛋白質の低吸着プレート（PrimeSurface（登録商標）、住友ベークライト）に播種し（100 cells/100μl/96 well plate）、DMEM/1%FCSの培養液で7日間の培養を行った。スフェロイド形成した細胞数はその容積（1/2 x 長径 x 短径2）を測定して計測した。
　結果を図３Ｇ～Ｉに示す。2次元培養皿の条件下において、MT1-MMPの有無による、Ephrin-A1/EphA2依存的な細胞増殖抑制への影響はみられなかった（Ｇ、Ｈ）。しかし、コラーゲンゲル内の3次元培養および足場非依存的なスフェロイド形成においては、MT1-MMPノックダウンした細胞の増殖は、Ephrin-A1依存的に有意に抑制された（Ｉ）。
４．RhoG活性の測定（図４）
　MT1-MMPの発現をsiRNAでノックダウンしたA431細胞を用いて、Ephrin-A1依存的EphA2がEGF受容体下流のRhoGシグナルに及ぼす影響を調べた。
　RhoGのエフェクターであるELMO2とGSTの融合蛋白質をグルタチオンビーズに固相化し、RIPAで可溶化した細胞懸濁液中のRhoG活性をELMO2/GSTビーズをベイトとしたpull-downで検出した。共沈したRhoGは抗RhoGポリクローナル抗体（Santa Cruz）で検出し、RhoG活性の定量はImage Jによるデンシトメトリーで行った。ELMO2の発現ベクターは東京大学医科学研究所細菌感染分野の笹川千尋教授より恵与して頂いた。
　結果を図４に示す。EGF未処理の細胞ではRhoG活性は検出されなかった（Ａ）。一方、EGF刺激を行った場合、MT1-MMPノックダウンした細胞では、Ephrin-A1処理によりRhoG活性が有意に低下した（Ａ、Ｂ）。同様の結果はSCC61細胞においても見られた（Ｃ）。EGF刺激した細胞の運動能をトランスウエルチャンバーで調べたところ、MT1-MMPノックダウン細胞では、Ephrin-A1処理により細胞運動が有意に抑制された（Ｄ、Ｅ）。このことから、MT1-MMPによるEphA2のプロセシングは、small GTPase活性を亢進する役割を担うことが示唆された。
５－１．MT1-MMPプロセシングに耐性な変異体の作製（図５Ａ～Ｄ）
　MOCK、野生型、MT1-MMPでプロセシングを受ける部位を欠失したC末端にFLAG標識したEphA2の発現ベクターを構築し、ViraPowerTM レンチウイルス発現システムを用いてA431細胞に発現遺伝子を導入した（図５Ａ、Ｂ）。それぞれの発現蛋白質の確認は、RIPAで可溶化した細胞懸濁液中のEphA2の発現を抗FLAG抗体（M2）、抗EphA2ポリクローナル抗体（Santa Cruz）を用いたウエスタンブロットで検出した。MT1-MMPの発現は抗MT1-MMPモノクローナル抗体（1D8）を用いたウエスタンブロットで検出した。
　野生型EphA2、又はプロセシング耐性EphA2変異体を導入した細胞のEphA2のプロセシングの状態をウエスタンブロットで検出したところ、切断部位を欠損した変異体は、MT1-MMPによるプロセシングに耐性を示した（Ｃ）。EphA2変異体のEphrin-A1によるリン酸化をEphA2抗体による免疫沈降で確認した（Ｄ）。
５－２．実験肺転移実験（図５Ｅ～Ｇ）
　それぞれの細胞（5x106/100μl）はヌードマウス（BALB/c-nu）の尾静脈へ投与し、1ヶ月後にマウスを屠殺の後、解剖して肺へ形成した癌細胞の転移結節の観察を行った。また、微小な転移巣は、肺組織をHE染色して顕微鏡下で観察した。5匹のマウスを用いて実験を行い、統計処理はT-testを行った。
　プロセシング耐性EphA2変異型を導入した細胞を投与したマウスでは、肺における転移結節の形成が低下した（Ｅ、Ｆ）。また、HE染色の結果から、プロセシング耐性EphA2変異型を導入した細胞を投与したマウスでは、肺での癌細胞の増殖も有意に抑制されたことが示された（Ｇ）。
６－１．癌組織でのEphA2断片の検出（図６Ａ、Ｂ）
　凍結癌組織よりクリオスタットにて薄層切片（5μl）よりRIPA緩衝液（100μl/slide）を用いて組織抽出液を作製した。それぞれの組織抽出した蛋白質量はCBB法で測定し、各組織に発現するEphA2、その断片、MT1-MMPをそれぞれC末端のEphA2を認識抗体（Santa Cruz）、MT1-MMPモノクローナル抗体（1D8）を用いたウエスタンブロットで解析した。対照としてβアクチンを同時に検出した。
　卵巣癌組織では全長型EphA2（intact）は低レベルでしか検出されず、分子量60kDaの断片（EphA2 fragment）が主要なものであった（Ａ、下段のパネル）。これら組織中のMT1-MMPの発現量をMT1-MMPモノクローナル抗体で検出した（Ａ、上段のパネル）。＊は1次抗体なしでも見られることから非特異的なバンドであると考えられた（Ｂ）。これらの結果から、生体内の癌組織においても、EphA2はMT1-MMPによるプロセシングを受け、プロセシングによる60kDaの断片を生じることが示唆された。
　また、同様の実験を、ヒト頭頸部癌組織を用いて行った結果を図８に示す。MT1-MMPの発現量が卵巣癌に比べ低いため、EphA2のプロセシングの割合は非常に低かった（Ｃ下段のパネル）。頭頸部癌組織を免疫染色法で調べると、EphA2が腫瘍部および非腫瘍部で発現しているのに対して、MT1-MMPは腫瘍部内での部分的な発現分布を示した（Ａ、Ｂ）。この結果は、頭頸部癌でもMT1-MMPを発現する腫瘍細胞内では卵巣癌組織同様のEphA2のプロセシングが起こっている可能性を示唆する。
６－２．N、C末端EphA2およびMT1-MMPの免疫組織科学的解析（図６Ｃ～Ｆ、８）
　卵巣癌組織のEphA2とMT1-MMPの局在を蛍光免疫組織科学的手法で解析した。まず、凍結組織切片（4μm）を4％フォルマリン/PBS緩衝液に室温で10分処理をした。PBSで5分、3回の洗浄を行った後、0.2％ヤギ血清/0.05% Triton-X100/PBSでブロッキングを行った（室温1時間）。その後、1次抗体（抗MT1-MMPポリクローナル抗体（ウサギ IgG, Merck）/抗EphA2 N-terminalドメイン(マウス IgG, R&D)、あるいはMT1-MMPポリクローナル抗体/ 抗EphA2 C-terminalドメイン（Santa Cruz）を4℃、オーバーナイト処理した。
　反応後、PBSで5分、3回の洗浄を行った後、抗マウスIgG-Alexa 568（Invitrogen）及び抗ウサギIgG-Alexa-488（Invitrogen）（各1μg/ml）で、室温で1時間処理した。DAPIを含む封入剤（Vector Lab）で処理した後、蛍光顕微鏡で観察をした。また、リン酸化EphA2の局在は、抗EphA2リン酸化tyr-594 ポリクローナル抗体（biorbyt limited）、抗EphA2リン酸化ser-897ポリクローナル抗体(Cell Application Inc)と抗MT1-MMPモノクローナル抗体を用いて、同様の方法で検出した。
　MT1-MMPの陽性染色部位はEphA2のC末端抗体の陽性部位と共局在する（Ｃ）。一方、EphA2のN末端抗体の陽性染色部位はMT1-MMPのそれと共局在しない（Ｄ）。このことから、癌組織で強発現している多くのEphA2はN末端が切断された切り株である可能性が示唆された。卵巣癌組織において、MT1-MMPの発現はEphA2のリガンド非依存的な897位のセリン残基のリン酸化の発現と共局在した（Ｅ）。一方、MT1-MMPの発現とリガンド依存的な594位のチロシン残基のリン酸化とは異なる局在を示した（Ｆ）。
　また、同様の実験を、ヒト頭頸部癌組織を用いて行った結果を図９に示す。MT1-MMPの発現部位でのEphA2のリン酸化の動態を、EphA2の細胞内ドメインのリン酸化を認識する2種の抗体を用いて検討した結果を示す。頭頸部癌組織においても、MT1-MMPの発現はEphA2のリガンド非依存的な897位のセリン残基のリン酸化の発現と共局在した（Ａ）。一方、MT1-MMPの発現とリガンド依存的な594位のチロシン残基のリン酸化とは異なる局在を示した（Ｂ）。
６－３．正常卵巣組織と卵巣癌組織におけるEphA2のN末端及びC末端の免疫染色（図１１）
　６－２．と同様の方法で、正常卵巣組織と卵巣癌組織を、抗EphA2 N-terminalドメイン(マウス IgG, R&D)又は抗EphA2 C-terminalドメイン（Santa Cruz）で染色した。正常卵巣組織の結果を図１１Ａに、卵巣癌組織の結果を図１１Ｂに示す。図１１に示されるとおり、正常癌組織では、EphA2のN末端とC末端がいずれも検出され、EphA2がインタクトな状態であることが確認された。一方、卵巣癌組織では、N末端が染色されず、EphA2がプロセシングを受けてN末端を失っていることが確認された。
６－４．胃癌組織と大腸癌組織におけるEphA2のリン酸化の確認（図１２）
　６－２．と同様の方法で、胃癌組織と大腸癌組織におけるEphA2のリン酸化を調べた。MT1-MMPは、抗MT1-MMPマウスモノクローナル抗体を結合させた後、Alexa Fluor（登録商標）-568を結合させた二次抗体で染色した。また、EphA2 p-Ser897とEphA2 p-Tyr594は、それぞれ抗EphA2 p-Ser897又は抗EphA2 p-Tyr594ウサギポリクローナル抗体を結合させた後、Alexa Fluor（登録商標）-488を結合させた二次抗体で染色した。
　胃癌組織の結果を図１２Ａに、大腸癌組織の結果を図１２Ｂに示す。いずれも、胃癌組織、大腸癌組織のいずれも、MT1-MMPとEphA2 p-Ser897の発現の局在は一致したが、MT1-MMPとEphA2 p-Tyr594の発現の局在は一致しなかった（データ示さず）。
　このことから、MT1-MMPによるEphA2のプロセシングは、種々の癌で同様に生じていることが強く示唆された。
６－５．MT1-MMPプロセシング耐性のEphA2による癌細胞の表現型への影響（図１３）
　５－１．と同様の方法で、A431細胞でMT1-MMPプロセシング耐性のEphA2を発現させ、10％FCSを含むDMEM培地に播種し、24時間培養後に細胞の形態を顕微鏡（200倍）で観察した。
　結果を図１３に示す。A431細胞は、悪性の癌細胞特有の紡錘状の形状を有する（Mock及び正常EphA2発現細胞の結果を参照）が、MT1-MMPプロセシング耐性のEphA2を発現させた細胞は、丸い形状となり（ucEphA2-CF-1及びucEphA2-CF-2）、正常な上皮細胞様の形態に変化した。このことは、癌細胞においても、MT1-MMPによるプロセシングを受けなければリガンド依存的な抗腫瘍性のシグナルが活性化されることを強く示唆する。
６－６．A431細胞におけるEphA2の断片の産生の確認（図１４）
　１．と同様の方法で、A431細胞でEphA2を発現させ、内在性のMT1-MMPで切断される断片をウエスタンブロッティングにより検出した。用いた抗体は、EphA2タンパク質のシステインリッチドメインにエピトープを有する。2つのバンドが見られるのは、EphA2が、本発明者らが確認した部位に加えて別の部位でも切断されるためと考えられた。
　配列番号：１～４は、本発明に係る検査方法に用いられるEphA2断片のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：５は、EphA2の全長のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：６及び７は、siRNA#1の配列を示す。
　配列番号：８及び９は、siRNA#2の配列を示す。
　配列番号：１０及び１１は、siRNA#3の配列を示す。

Claims (17)

  1. 　がんの検査方法であって、被検者由来の試料中における分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量を測定する工程を含む、方法。
  2. 　前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片が、ＥｐｈＡ２タンパク質のＮ末端を含む断片である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つのペプチドである、請求項１に記載の方法：
    （ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
    （ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチド；及び
    （ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
  4. 　前記がんが、ＥｐｈＡ２を発現しているがんである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記試料は、血液、リンパ液、尿、及び糞便から選択される少なくとも１つである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　抗がん剤の効果又は副作用を予測するために行われる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記ＥｐｈＡ２タンパク質の断片の量の測定が、ＥｐｈＡ２の断片を認識する抗体によって行われる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記ＥｐｈＡ２の断片を認識する抗体のエピトープが、ＥｐｈＡ２タンパク質上のシステインリッチドメインにある、請求項７に記載の方法。
  9. 　がんの検査用キットであって、
    　分子量３０ｋＤａ～８０ｋＤａのＥｐｈＡ２タンパク質の断片を検出可能な抗体を含む、キット。
  10. 　前記断片が、ＥｐｈＡ２タンパク質のＮ末端を含む断片である、請求項９に記載のキット。
  11. 　前記抗体のエピトープが、ＥｐｈＡ２タンパク質上のシステインリッチドメインにある、請求項９又は１０に記載のキット。
  12. 　前記抗体が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つのペプチドに対する抗体である、請求項９又は１０に記載のキット：
    （ｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
    （ｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなるペプチド；及び
    （ｉｉｉ）配列番号：１～４で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
  13. 　抗がん剤の効果又は副作用を予測するために用いられる、請求項９から１２のいずれか１項に記載の検査用キット。
  14. 　ＥｐｈＡ２を発現する細胞を、ＭＴ１－ＭＭＰがＥｐｈＡ２をプロセシングする条件で培養する工程と、
    　前記細胞の培地に被検化合物を加えて、ＭＴ１－ＭＭＰの存在下でインキュベートする工程と、
    　ＥｐｈＡ２のプロセシングの有無を測定する工程と、
    を含む抗がん剤のスクリーニング方法。
  15. 　前記ＥｐｈＡ２のプロセシングの有無を検出する工程で、被検化合物が存在しない場合と比較して、プロセシングが低下する被検化合物を抗がん剤候補として選択する、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
  16. 　以下のいずれかの配列からなる二本鎖ＲＮＡもしくはその前駆体、またはこれらをコードする核酸を含む、抗がん剤：
    siRNA #1
    S: ggauggacacggagaauuutt　（配列番号：６）
    AS: aaauucuccguguccaucctt  （配列番号：７）
    siRNA #2
    S: gcgaugaagucuucacuuatt　（配列番号：８）
    AS: uaagugaagacuucaucgctt  （配列番号：９）、及び
    siRNA #3
    S: ggguagagacccugagacatt　（配列番号：１０）
    AS: ugucucagggucucuaccctt  （配列番号：１１）。
  17. 　ＭＴ１－ＭＭＰの発現又は機能を阻害することを含む、がんの治療方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018135653A1 (ja) 2017-01-23 2018-07-26 学校法人東洋大学 抗ｅｐｈａ２抗体及びこれを用いたｅｐｈａ２の免疫学的検出
US10385343B2 (en) 2014-08-29 2019-08-20 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018034332A1 (ja) * 2016-08-19 2018-02-22 国立大学法人東京大学 ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003516930A (ja) * 1999-08-17 2003-05-20 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 転移性疾患の治療
JP2005532805A (ja) * 2002-07-17 2005-11-04 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 癌細胞浸潤の診断及び予防
US20110281279A1 (en) * 2007-12-21 2011-11-17 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. CIRCULATING Epha2 RECEPTOR
JP2012103264A (ja) * 1999-08-17 2012-05-31 Purdue Res Found 癌診断用抗体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192698B1 (en) * 1999-08-17 2007-03-20 Purdue Research Foundation EphA2 as a diagnostic target for metastatic cancer
WO2004101764A2 (en) * 2003-05-13 2004-11-25 Chiron Corporation Methods of modulating metastasis and skeletal related events resulting from metastases
RU2007133108A (ru) * 2005-02-04 2009-03-10 Рэйвен Байотекнолоджиз, Инк. (Us) АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С EphA2, И МЕТОДЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
MX2010002248A (es) * 2007-08-30 2010-03-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-epha2.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003516930A (ja) * 1999-08-17 2003-05-20 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 転移性疾患の治療
JP2012103264A (ja) * 1999-08-17 2012-05-31 Purdue Res Found 癌診断用抗体
JP2005532805A (ja) * 2002-07-17 2005-11-04 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 癌細胞浸潤の診断及び予防
US20110281279A1 (en) * 2007-12-21 2011-11-17 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. CIRCULATING Epha2 RECEPTOR

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUGIYAMA NAMI ET AL.: "EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion", J CELL BIOL, vol. 201, no. 3, 29 April 2013 (2013-04-29), pages 467 - 484 *
YANG PU ET AL.: "Overexpression of EphA2, MMP-9, and MVD- CD 34 in hepatocellular carcinoma: Implications for tumor progression and prognosis", HEPATOL RES, vol. 39, no. 12, December 2009 (2009-12-01), pages 1169 - 1177 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10385343B2 (en) 2014-08-29 2019-08-20 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer
US11180762B2 (en) 2014-08-29 2021-11-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer
WO2018135653A1 (ja) 2017-01-23 2018-07-26 学校法人東洋大学 抗ｅｐｈａ２抗体及びこれを用いたｅｐｈａ２の免疫学的検出
CN110198956A (zh) * 2017-01-23 2019-09-03 学校法人东洋大学 抗epha2抗体和使用该抗epha2抗体的epha2免疫检测

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