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CN107709362B - Igf-1r抗体及其用于癌症诊断的用途 - Google Patents

Igf-1r抗体及其用于癌症诊断的用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种能够结合IGF‑1R的新型抗体，尤其是单克隆抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。

Description

IGF-1R抗体及其用于癌症诊断的用途
技术领域
本发明涉及一种能够结合IGF-1R的新型抗体，尤其是单克隆抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。
背景技术
称为IGF-1R的胰岛素样生长因子1受体(或者，有时称为IGF1R)是一种具有酪氨酸激酶活性的受体，与胰岛素受体IR具有70％的同源性。IGF-1R是分子量约350,000的糖蛋白。它是每半由二硫桥连接的异四聚体受体，由细胞外的α-亚单元和跨膜的β-亚单元组成。IGF-1R以很高的亲和力结合IGF1和IGF2(Kd#1nM)，但是同样能够以低100至1000倍的亲和力结合胰岛素。相反地，IR以很高的亲和力结合胰岛素，虽然IGF仅以低100倍的亲和力结合胰岛素受体。IGF-1R和IR的酪氨酸激酶结构域具有很高的序列同源性，虽然较弱同源性的区域分别涉及位于α-亚单位和β-亚单位的C-末端部分的富含半胱氨酸的区域。在α-亚单位中观察到的序列的差异位于配体的结合区域，且因此产生IGF-1R和IR分别对IGF和胰岛素的相对亲和力。在β-亚单位的C-末端部分中的差异导致在两种受体的信号转导通路中的分歧；IGF-1R介导促有丝分裂、分化和抗凋亡作用，然而IR的激活主要涉及在代谢通路的水平的作用。
在最近20年，IGF系统在致癌作用中的作用成为深入研究的主题。发现这样的事实之后，这种兴趣随之而来，即除了它的促有丝分裂和抗凋亡特性，IGF-1R似乎是转化表型的建立和维持所需要的。事实上，已经证实过表达或组成型激活IGF-1R在很多不同的细胞中导致细胞不依赖于无胎牛血清介质的支持而进行生长，并且导致在裸鼠中形成肿瘤。这本身不是一种独特的特性，因为很多不同的过表达基因的产物能够转化细胞，包括很多生长因子的受体。然而，清楚地表明IGF-1R在转化中起到的主要作用的关键发现中，已经表明IGF-1R-细胞(其中编码IGF-1R的基因被灭活)完全耐受不同试剂的转化，这些试剂通常能够转化细胞，比如牛乳头瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的过表达、SV 40的T抗原、激活的Ras或最后这两种因子的组合。
在这种情况中，很长时间以来IGF-1R被认为是在肿瘤学中感兴趣的靶标。大量靶向IGF-1R的项目(人源化或人抗体或小分子)已经开始开发IGF-1R拮抗剂用于治疗癌症，并且在各种适应症中，已经进行超过70项临床试验。然而，目前这些项目没有成功，并且市场上没有IGF-1R抗体。
本发明旨在提供至少一种可用作诊断或预后生物标志物的试剂，用于检测和/或监测致癌疾病，尤其是特征为IGF-1R表达的那些或由异常IGF-1R表达介导的那些。
之前已经报道了开发可用作相关诊断或预后工具的有价值的抗体的尝试，但是没有一个令人满意。
从以下实施例将会显而易见，本发明人惊奇地表明了，目前通常使用的用于给表达IGF-1R的肿瘤进行评分的市售抗体似乎是不相关的，因为它们具有假阳性和/或假阴性。这个问题部分导致了采用IGF-1R抗体的临床试验失败，这是由于患者的选择，而不是IGF-1R抗体的真实活性而导致的。
此外，使用市售抗体进行的首次研究显示IGF-1R评分与靶向ADC疗法的抗肿瘤活性之间存在差异。
发明内容
本发明旨在通过提供新型抗体来补救该问题，与现有抗体不同，所述抗体能够承担这种压力(strain)，因为其与IGF-1R靶向疗法的药理学相关。
在第一方面，本发明的主题是一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以高亲和力结合IGF-1R，优选人IGF-1R，因此可用于诊断由IGF-1R表达介导的病理性过度增殖性致癌疾病的方法。
本发明的一个实施方案涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含序列SEQ IDNo.1、2、3、4、5和6的6个CDR。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包含：
i)具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、序列SEQ ID No.2的CDR-H2和序列SEQ IDNo.3的CDR-H3的重链；和
ii)具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、序列SEQ ID No.5的CDR-L2和序列SEQ IDNo.6的CDR-L3的轻链。
以最广泛的意义，术语“抗体(antibody)”、“抗体(antibodies)”、“ab”或“免疫球蛋白”可以互换使用，并且包括单克隆抗体、分离的、工程化的、化学合成的或重组的抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组抗体。
如本说明书中所使用的，表述“IGF-1R抗体”应以类似于“抗IGF-1R抗体”来解释，且指能够结合IGF-1R的抗体。
抗体的“IGF-1R结合片段”或“抗原结合片段”，意在表示保留了抗体的结合IGF-1R靶标(一般也称为抗原)能力的任意肽、多肽或蛋白。在一个实施方案中，这样的“抗原结合片段”选自Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或双特异抗体、或通过化学修饰，如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG)(“PEG”表示聚乙二醇)、或通过并入脂质体中来延长其半衰期的任意片段，所述片段具有至少一个根据本发明抗体的特征CDR。优选地，所述“抗原结合片段”将由如下构成或包括其所衍生自的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其所来自的抗体相同的结合特异性以及足够的亲和力，优选所述足够的亲和力至少等于其所来自的抗体对靶标亲和力的1/100、更优选至少1/10的方式。
优选地，所述“IGF-1R结合片段”或“抗原结合片段”至少包含：
i)序列SEQ ID No.1的CDR-H1、序列SEQ ID No.2的CDR-H2和序列SEQ ID No.3的CDR-H3；和
ii)序列SEQ ID No.4的CDR-L1、序列SEQ ID No.5的CDR-L2和序列SEQ ID No.6的CDR-L3。
“结合”等，意图表示抗体或其任意抗原结合片段与抗原形成生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于至少约1x10-6M或更小的平衡解离常数。确定两个分子是否结合的方法是本领域中公知的，并包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。为避免疑问，这并不意味着所述抗体不能以低水平结合或干扰另一个抗原。然而，作为一个实施方案，所述抗体仅结合所述抗原。
CDR区或CDR意在表示IMGT所定义的免疫球蛋白重链和轻链的高变区。
无论抗原受体、链类型或物种如何，都将IMGT独特的编号限定用来比较可变结构域(Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。在IMGT独特编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23(第1个CYS)、色氨酸41(保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特编号提供了框架区(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化定界。由于空位代表未占用的位置，CDR-IMGT长度(在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13])成为关键信息。在2D图解中使用IMGT独特编号，命名为IMGT Colliers de Perles(Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007))，并在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用(Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Tcell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004))。
必须理解的是，在本说明书中没有矛盾的说明，互补决定区或CDR意思是根据IMGT编号系统定义的免疫球蛋白重链和轻链的高变区。
然而，也可根据Kabat编号系统定义CDR(Kabat等人，Sequences of proteins ofimmunological interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991和之后的版本)。有三个重链CDR和三个轻链CDR。此处，依据情况，术语“CDR”用于指代一个或多个、或甚至全部含有大多数氨基酸残基的区域，所述氨基酸残基负责其所识别的抗原或表位的抗体结合亲和力。为了简化本申请的阅读，未定义根据Kabat的CDR。然而，使用根据IMGT的CDR的定义、根据Kabat定义CDR将是本领域技术人员显而易见的。
在一个具体的实施方案中，根据本发明的IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQID No.7的或与序列SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任意序列的重链可变结构域。
在一个具体的实施方案中，根据本发明的IGF-1R抗体的特征在于其包含序列SEQID No.8的或与序列SEQ ID No.8具有至少90％同源性的任意序列的轻链可变结构域。
根据另一个实施方案，称为810D12的抗体的特征在于其包含重链可变结构域序列和/或包含轻链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ ID No.7或与序列SEQ ID No.7最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列；所述轻链可变结构域序列包含氨基酸序列SEQ ID No.8或与序列SEQ ID No.8最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列。
在本发明的含义中，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同源性”意指待比较的两条序列间相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最佳比对后获得，此百分比是纯粹统计上的，两条序列间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在对其最佳比对后比较序列来实施，所述比较能通过节段(segment)或通过使用“比对窗口”来执行。除了手动比较之外，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)(Ad.App.Math.2：482)、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)(J.Mol.Biol.48：443)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)或通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组，575Science Dr.，Madison，WI，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)可以实施待比较的序列的最佳比对。对于显示出与参考氨基酸序列有至少80％，优选至少85％、90％、95％和98％同源性的氨基酸序列，优选的实例包括包含参考序列、某些修饰(特别是删除、插入或取代至少一个氨基酸、截短或延长)的那些。在一个或多个连续或不连续的氨基酸被取代的情况下，优选在取代中所取代的氨基酸被“等价”氨基酸所代替。在此，表述“等价氨基酸”意指可能取代一个结构氨基酸、而不改变相应抗体生物学活性的任意氨基酸，以及下面定义的那些具体实例的任意氨基酸。
可以根据其与它们所取代的氨基酸的结构同源性、或者根据可能生成的各种抗原结合蛋白间生物活性比较测试的结果来确定等价氨基酸。
作为非限制性实例，下表1总结了可以实施而不导致相应修饰的抗原结合蛋白生物活性显著变化的可能取代；在同一条件下自然可以做相反的取代。
表1
原始残基 取代
Ala(A) Val、Gly、Pro
Arg(R) Lys、His
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala
His(H) Arg
Ile(I) Leu
Leu(L) Ile、Val、Met
Lys(K) Arg
Met(M) Leu
Phe(F) Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr、Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Phe、Trp
Val(V) Leu、Ala
本发明的一个具体的方面是抗体或其任意抗原结合片段，不与胰岛素受体(IR)结合。
在另一个实施方案中，本发明的抗体由单克隆抗体组成。
如在此使用的术语“单克隆抗体”或“Mab”指从大体上同质的抗体群获得的抗体，即除了可以以最小量存在的可能天然出现的突变之外，群中的单个抗体是相同的。单克隆抗体是针对单表位高度特异性的。这样的单克隆抗体可以通过单克隆的B细胞或杂交瘤生产。单克隆抗体也可以是重组的，即通过蛋白工程生产。单克隆抗体也可以是从噬菌体抗体库中分离的。此外，与典型地包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体的制备不同，每种单克隆抗体针对抗原的单表位。本发明涉及一种分离的抗体或者从天然来源通过纯化获得的抗体，或者通过基因重组或化学合成获得的抗体。
在另一个实施方案中，本发明的抗体由重组抗体组成。术语“重组抗体”指在活细胞中由重组DNA的表达获得的抗体。本发明的重组抗体通过使用本领域技术人员公知的基因重组的实验室方法创建不会在生物体中发现的DNA序列而获得。
在另一个实施方案中，本发明的抗体由化学合成抗体组成。
“IGF-1R抗体”包括(无相反说明)的鼠的，也包括嵌合的和人源化形式的所述IGF-1R抗体。
为了更清楚，下表2示出了根据IMGT定义的抗体810D12的序列。
表2
Figure BDA0001447787580000061
在一个实施方案中，本文中的单克隆抗体包括鼠的、嵌合的和人源化的抗体。该抗体可以衍生自提交在法国微生物培养物保藏中心(CNCM，法国巴黎巴斯德研究所)的鼠源杂交瘤，所述杂交瘤是通过Balb/C免疫的小鼠脾细胞/淋巴细胞和骨髓瘤Sp2/O-Ag14细胞系的细胞融合获得的。
根据另一方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，特别是在2014年9月17日以编号I-4893保藏于法国巴黎巴斯德研究所CNCM的鼠源的杂交瘤。
由所述杂交瘤I-4893分泌的单克隆抗体(这里称为810D12)或其任意抗原结合片段显然构成本发明的一部分。
本发明涉及一种IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其由编号I-4893的杂交瘤分泌，所述杂交瘤在2014年9月17日提交在巴黎巴斯德研究所CNCM。
本发明还描述了在2014年9月17日以编号I-4893提交在巴黎巴斯德研究所CNCM的鼠的杂交瘤。
本发明的一个新的方面涉及一种分离的核酸，其特征在于，其选自以下核酸：
a)编码根据本发明的抗体的核酸；
b)包含选自序列SEQ ID No.9或10的序列的核酸，或包含与序列SEQ ID No.9或10进行最佳比对后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同源性的序列的核酸；和
e)在a)或b)中定义的核酸的互补核酸。
下表3总结了关于本发明的抗体810D12的各种核苷酸序列。
表3
Figure BDA0001447787580000071
在本说明书中互换使用的术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”，表示无论有无修饰的确定核酸的片段或区域的精确核苷酸序列，其含有或不含非天然核苷酸，是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。
这里也应包括，本发明不涉及在天然染色体环境中(即，天然状态)的核苷酸序列。本发明的序列已经被分离和/或纯化，即例如通过复制，它们被直接地或间接地取样，它们的环境已经至少部分改变。在此还提及了例如通过宿主细胞的基因重组的方式获得分离的核酸，或者通过化学合成获得。
本发明还涉及包含本发明所述的核酸的载体。
本发明特别针对含有此类核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
本发明的载体优选含有在给定宿主细胞中允许核苷酸序列表达和/或分泌的元件。因而载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号、还有合适的转录调控区。它必须能够在宿主细胞中以稳定的方式维持，并且任选地具有指导翻译蛋白分泌的特异信号。根据所用的宿主细胞，本领域技术人员能选择和优化这些不同元件。为此目的，核苷酸序列能被插入至所选宿主内的自主复制载体，或者是所选宿主的整合载体。
此类载体以本领域技术人员通常使用的方法制备，而且产生的克隆能以如脂质转染、电穿孔、热激或化学方法的标准方法引入至合适的宿主。
载体是(例如)质粒或病毒来源的载体。它们被用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。
本发明还包含转化有或包含本发明所述的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以选自原核或真核系统，如细菌细胞，例如，还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。还能使用昆虫或植物细胞。
本发明还涉及具有根据本发明的转化细胞的动物(除了人)。
本发明的另一方面涉及用于生产根据本发明的抗体、或其功能片段之一的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)在介质中及在合适培养条件下培养根据本发明所述的宿主细胞；及
b)从培养介质或从所述培养的细胞中回收因此生产的所述抗体、或其功能片段之一。
根据本发明的转化细胞可用于制备根据本发明的重组多肽的方法。用于制备重组形式的根据本发明的多肽的方法也包含在本发明中，其特征在于，所述方法使用根据本发明的载体和/或转化有根据发明的载体的细胞。优选地，转化有根据本发明的载体的细胞在允许前述多肽得以表达和所述重组肽得以回收的条件下培养。
如已提及的，宿主细胞能选自原核或真核系统。尤其是，可能鉴定有利于在此原核或真核系统中分泌的本发明的核苷酸序列。携带这样序列的根据本发明的载体因此能有利地用于生产待分泌的重组蛋白。事实上，蛋白在细胞培养物上清中而非在宿主细胞内存在的事实将有利于这些兴趣重组蛋白的纯化。
还公开了本发明的抗体作为生物标志物的用途。方法可用于检测或诊断与IGF-1R表达相关的各种过度增殖性致癌疾病，所述过度增殖性致癌疾病例如但不限于前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、头颈癌或与IGF-1R表达相关的任意其它癌症。如本领域普通技术人员将认识到的，与具体疾病相关的抗体表达水平将依据预先存在的病症的性质和/或严重性而变化。
以本领域技术人员已知的任意常规方式施用(例如局部、胃肠外、肌肉内等)本发明的抗体，将提供非常有用的方法以检测样本中发育异常的细胞，以及允许临床医生监测正在接受与IGF-1R表达相关或IGF-1R表达介导的过度增殖性疾病治疗的患者的治疗方案。
本发明的抗体或其抗原结合片段将用于各种医学或研究目的，包括与IGF-1R表达相关的各种病理学的检测、诊断、预后和分期。
本发明的一个实施方案涉及如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，用作检测表达IGF-1R的肿瘤细胞的试剂。
本发明的另一个实施方案是如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，用于体外或离体诊断或预后与IGF-1R表达相关的致癌疾病。
本文所用的“诊断”疾病是指鉴定或检测与IGF-1R表达相关或IGF-1R表达介导的病理性过度增殖性致癌疾病的存在的过程，监测疾病的进展，以及鉴定或检测指示与IGF-1R表达相关疾病的细胞或样本。
本文使用的“预后”是指从疾病恢复的可能性，或预测疾病的可能发展或结果。例如，当来自受试者的样本对于用IGF-1R抗体染色是阴性时，则该受试者的“预后”比IGF-1R染色阳性的样本更好。如下文将更详细地描述的，可以以合适的标尺对样本的IGF-1R表达水平进行评分。
IGF-1R抗体可以以免疫缀合物或标记抗体的形式存在，以获得可检测/可定量的信号。当与合适的标记或其它合适的可检测的生物分子或化学物质一起使用时，IGF-1R抗体尤其可用于体外和体内诊断和预后应用。
用于免疫分析的标记一般是本领域技术人员已知的，并且包括酶、放射性同位素、和荧光、发光和显色物质，包括着色颗粒如胶体金或乳胶珠。合适的免疫分析包括酶联免疫吸附分析(ELISA)。各种类型的标记和将标记与IGF-1R抗体缀合的方法是本领域技术人员熟知的，如下文所示的。
如本文所用，术语“与IGF-1R表达相关的致癌疾病”意指包括在患有该疾病的受试者中存在高水平的IGF-1R(异常)的疾病和其它疾病，其已经显示或者被怀疑和疾病的病理生理有关或有助于疾病恶化的因素。或者，这些疾病可以被证明，例如通过患有该疾病的受试者的受影响的细胞或组织中细胞表面IGF-1R水平的增加。可以使用IGF-1R抗体检测IGF-1R水平的增加。
在某些实施方案中，涉及IGF-1R的“增加的表达”是指相对于对照，在表达上表现出统计学显著增加的蛋白或基因表达水平(通过RNA表达或蛋白表达测量)。
一个实施方案是如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，用于确定患有致癌疾病的患者是否可能受益于靶向IGF-1R通路的抑制剂的治疗，优选地，单独的、组合的或缀合的IGF-1R抗体。
如本说明书中所用的，表达“靶向IGF-1R通路的抑制剂”是指能够通过结合IGF-1R的配体或IGFR本身，降低或抑制IGF-1R的酪氨酸激酶活性的任意化合物。这种抑制剂的实例是作为IGF-1R拮抗剂的蛋白、肽、抗体或抗体药物缀合物或任意化学化合物、抑制IGF-1R基因表达或编码IGFR配体之一的基因表达的反义寡核苷酸或siRNA、或本领域技术人员已知的任意其它药物或化合物。
更具体地，在本说明书的含义中，靶向IGF-1R通路的抑制剂意指包括能够结合IGF-1R并抑制其配体结合的任意化合物或分子。
更具体地，在本说明书的含义中，靶向IGF-1R通路的抑制剂意指包括与IGF-1R结合的任意单克隆抗体。
在另一个优选的实施方案中，靶向IGF-1R通路的抑制剂由抗体药物缀合物(ADC)组成，其中抗体部分靶向IGF-1R，以及药物部分可以选自任意药物，如细胞毒性剂、细胞抑制剂、毒素等。在一个示例性实施方案中，药物部分可以由澳瑞他汀(auristatin)、类似物或衍生物组成。
本发明的另一个目的是描述一种用于体外或离体检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的存在和/或位置的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使来自所述受试者的生物样本与如上所述的根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本的结合。
本发明还涉及一种用于检测和/或定量和/或确定在受试者中，优选在受试者的细胞表面的IGF-1R表达水平的体外或离体方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使来自所述受试者的生物样本与如上所述的根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测和/或定量和/或确定所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本的结合水平。
IGF-1R抗体的结合可以通过本领域技术人员可获得的各种分析来检测和/或定量和/或确定。尽管用于进行分析的任意合适的方法包括在本发明中，但是尤其可以提及荧光活化的细胞分选(FACS)、ELISA、蛋白印迹(western blotting)和免疫组织化学(IHC)。优选的方法包括IHC和FACS。
本发明还描述了一种在体外或离体检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的百分比的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)定量生物样本中表达IGF-1R的细胞的百分比。
另一个实施方案是一种用于在体外或离体确定受试者的肿瘤细胞或肿瘤中IGF-1R的表达水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)将所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平进行定量。
如本领域技术人员将显而易见的，可以通过本领域技术人员已知的任意方式来定量与IGF-1R结合的IGF-1R抗体的水平。优选的方法涉及使用免疫酶促过程，如ELISA分析、免疫荧光、IHC、放射免疫分析(RIA)、或FACS。
根据本发明的方法，通过荧光活化的细胞分选(FACS)或免疫组织化学(IHC)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与IGF-1R的结合水平。
“生物样本”可以是可以从受试者获取的任意样本。这样的样本必须允许确定本发明的生物标志物的表达水平。因此，样本的性质将因此取决于肿瘤的性质。
如果癌症是液体肿瘤，则优选的生物样本包括样本如血液样本、血浆样本、或淋巴样本。
如果癌症是实体肿瘤，则优选的生物样本包括样本如活检样本或取自手术切除疗法的样本。
优选地，生物样本是生物流体，如人源的血清、全血细胞、组织样本或活检。例如，样本可以包括活检组织，其可以被方便地分析与IGF-1R表达相关的病理性致癌疾病的存在。
一旦确定测试的生物样本中的IGF-1R表达水平，可以将结果与对照样本的IGF-1R表达水平进行比较，所述对照样本以与测试的生物样本相似的方式获得，但是来自不具有与IGF-1R表达相关的致癌疾病的个体。当测试的生物样本中IGF-1R的水平显著升高时，则可以得出结论，其衍生自的受试者具有或将发展为所述疾病的可能性增加。
本发明涉及表达IGF-1R的肿瘤的体外或离体诊断或预后的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)通过根据本发明的或如上所述的用于在体外和离体确定受试者中的肿瘤细胞或肿瘤中的IGF-1R的表达水平的方法，来确定IGF-1R的表达水平，和(ii)将步骤(i)的表达水平与来自正常组织或不表达IGF-1R的组织的参照IGF-1R的表达水平进行比较。
关于靶向抗肿瘤疗法的发展，使用免疫组织化技术的诊断给出了受体表达水平的原位信息，因此能够根据这种治疗所需的受体的表达水平，选择对治疗敏感的患者。
分期确定具有潜在的预后价值，为设计最佳疗法提供了标准。Simpson等人，J.Clin.Oncology 18：2059(2000)。例如，实体肿瘤的治疗选择基于肿瘤分期，其通常使用美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的肿瘤/结节/转移(Tumor/Node/Metastasis，TNM)测试进行。通常认为，虽然这种测试和分期系统提供了关于在患者中已诊断出的实体癌症的分期的一些有价值的信息，但是它是不精确和不足的。尤其是它不能鉴定肿瘤进展的最早分期。
另一个实施方案由一种用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R评分的方法组成，所述方法包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；
(b)通过荧光活化的细胞分选(FACS)或免疫组织化学(IHC)将所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平进行定量；和
(c)通过基于染色强度和阳性细胞百分比的两个参数，将步骤(b)中获得的定量水平与合适的标尺进行比较，来对肿瘤细胞或肿瘤评分。
在一个实施方案中，当组织样本是福尔马林固定的、甲醛代替物固定的、Glyco-fixx固定的、石蜡包埋和/或冷冻的，IGF-1R抗体能够结合IGF-1R。
可以使用任意常规的风险分析方法来评估IGF-1R的预后价值。代表性的分析方法包括Cox回归分析，这是一种在存在删失案例的情况下，对存活或时间事件数据进行建模的半参数方法(Hosmer和Lemeshow，1999；Cox，1972)。与其它生存分析例如生命表(LifeTables)或Kaplan-Meyer不同，Cox允许在模型中包含预测变量(协变量)。使用常规分析方法例如Cox，可能能够测试关于原发性肿瘤中IGF-1R表达状态与疾病复发的发病时间(无病生存时间或疾病转移时间)或患病至死亡时间(总体生存时间)的相关性的假设。Cox回归分析也称为Cox比例风险分析。该方法是测试肿瘤标志物对患者生存时间的预后价值的标准。当用于多变量模式时，同时测试几个协变量的作用，以便可以鉴定具有独立预后价值的个体协变量，即最有用的标志物。术语阴性的或阳性的“IGF-1R状态”也可以称为[IGF-1R(-)]或[IGF-1R(+)]。
在诊断或监测癌症期间，样本可能被“评分”。以最简单的形式，通过免疫组织化学的样本的可视化检查判断，评分可以被分类为阴性的或阳性的。更多的定量评分涉及判断两个参数：被取样的染色(“阳性”)细胞的染色强度和比例。
本发明意义上的“IGF-1R状态”涉及基于通过任意方法如免疫组织化学(IHC)、荧光活化的细胞分选FACS或本领域技术人员已知的其它方法测量的IGF-1R的表达水平的确定，将肿瘤分类为IGF-1R阳性[IGF-1R(+)]或IGF-1R阴性[IGF-1R(-)]类别。
在一个实施方案中，为了确保标准化，样本可以以不同的标尺对IGF-1R表达水平进行评分，其中大部分基于对反应产物的强度和阳性细胞的百分比的评估(Payne等人，Predictive markers in breast cancer–the present,Histopathology 2008,52,82-90)。
在另一个实施方案中，所述评分，尤其是在本发明方法的步骤(c)中，包括使用基于染色强度和阳性细胞百分比的合适的标尺。
作为第一个实施例，通过与IHC评估雌激素受体和孕激素受体的Quick Allred评分类似的，结合反应强度和细胞染色的比例的评分，可以以从0至8的全局标尺对样本进行IGF-1R表达水平评分(Harvey JM,Clarck GM,Osborne CK,Allred DC；J.Clin.Oncol.1999；17；1474-1481)。更具体地，第一标准的反应强度以标尺0至3评分，0对应于“无反应”，3对应于“强反应”。第二标准的反应比例以标尺0至5评分，0对应于“无反应”，5对应于“67-100％反应比例”。然后将反应强度评分和反应比例评分相加，产生0至8的总评分。总评分为0至2被认为是阴性的，总评分为3至8被认为是阳性的。
根据该标尺，本说明书中使用的术语肿瘤或肿瘤细胞的阴性的或阳性的“IGF-1R状态”分别是指以Allred标尺，对应于评分0至2或3至8的IGF-1R的表达水平。
下表4说明了根据Allred方法解释IHC结果的指南。
表4
Figure BDA0001447787580000121
根据本发明，该方法的特征在于，所述合适的标尺是0至8的标尺，其中无反应被评分为0，并且67-100％比例的反应比例的强反应被评分为8。
因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的体外或离体确定受试者中肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R评分的方法的特征在于，在步骤(c)中，所述合适的标尺是0至8的标尺，其中无反应被评分为0，并且67-100％比例的反应比例的强反应被评分为8。
换言之，描述和要求了一种在体外或离体确定来自受试者的肿瘤或肿瘤细胞的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)根据Allred标尺，对来自受试者的肿瘤或肿瘤细胞进行评分，和
(b)-i)Allred评分为3至8，则确定肿瘤或肿瘤细胞的状态为[IGF-1R(+)]；或者
-ii)Allred评分为0至2，则确定肿瘤或肿瘤细胞的状态为[IGF-1R(-)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为3，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为4，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为5，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为6，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为7，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，Allred评分为8，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
在本发明的另一个具体的方面，Allred评分为3至8，肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]。
本文描述的用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态的另一个具体的方法的特征在于，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求18所述的方法，对来自所述受试者的IGF-1R肿瘤细胞或肿瘤进行评分；和
(b)评分为3至8，确定肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态为[IGF-1R(+)]；或者
(c)评分为0至2，确定肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态为[IGF-1R(-)]。
作为第二个实施例，例如，与HER-2受体的IHC评估的常规评分相类似的，样本可以以或多或少更简单的评分方法对IGF-1R表达水平进行评分，所述方法将染色强度(优选膜染色)和显示染色的细胞比例整合为0至3+的组合标尺。
在这个称为简化标尺的标尺中，0和1+是阴性的，而2+和3+表示阳性染色。然而，评分1+至3+可以被记录为阳性的，因为与评分0(阴性的)相比，每个阳性评分可能与复发和死亡疾病的更高风险显著相关，但阳性评分中的增加的强度可能提供额外的风险降低。
一般来说，在本说明书中使用的术语肿瘤或肿瘤细胞的阴性的或阳性的“IGF-1R状态”分别是指以简化的标尺，对应于评分0至1+或2+至3+的IGF-1R的表达水平。应该仅考虑侵袭性肿瘤的完整的周围膜的反应，并且通常类似于“铁丝网(chicken wire)”外观。根据目前的指南，需要进一步评估IGF-1R评分为边界线(2+或3+的评分)的样本。作为非限制性实例，当对照和所预期的不同、伪影(artifacts)涉及到大多数样本并且样本具有强的正常乳导管(内对照)膜阳性时，应避免IHC分析，也不要通过FISH、或者任何其他方法进行重复或测试，这表明过量的抗原恢复(retrieval)。
为了更清楚，下表5总结了这些参数。
表5
Figure BDA0001447787580000141
本发明的方法的特征在于，所述合适的标尺是0至3+的标尺，其中肿瘤细胞无膜反应被评分为0，10％以上的肿瘤细胞中强的完全反应被评分为3+。
更详细地说，如上所述，所述合适的标尺是0至3的标尺，其中肿瘤细胞无膜反应被评分为0；10％以上的肿瘤细胞中微弱的可察觉的膜反应被评分为1+；在10％以上的肿瘤细胞中的弱至中度的完全膜反应被评分为2+；在10％以上的肿瘤细胞中具有强的完全反应被评分为3+。
换言之，描述和要求了一种在体外或离体确定受试者的肿瘤或肿瘤细胞的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)根据如上所述的简化标尺，对来自受试者的肿瘤或肿瘤细胞进行评分；和(b)评分为2+或3+，确定肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(+)]；或(c)评分为0或1+，确定肿瘤或肿瘤细胞的状态是[IGF-1R(-)]。
在本发明的一个具体的方面，评分为2+，肿瘤或肿瘤细胞是[IGF-1R(+)]。
在本发明的一个具体的方面，评分为3+，肿瘤或肿瘤细胞是[IGF-1R(+)]。
在本发明的另一个具体的方面，评分为2+或3+，肿瘤或肿瘤细胞是[IGF-1R(+)]。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于在体外或离体确定受试者中的肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)根据前述的本发明的方法，对来自所述受试者的所述IGF-1R肿瘤细胞或所述肿瘤进行评分；和
(b)-i)评分为2+或3+，确定肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态是[IGF-1R(+)]；或者
-ii)评分为0或1+，确定肿瘤细胞的IGF-1R状态为[IGF-1R(-)]。
一般地，测试或分析的结果可以以各种格式的任意一种呈现。结果可以以定性呈现。例如，测试报告可以仅指示是否检测到具体的多肽，也可能指示检测限。结果可以以半定量显示。例如，可以定义各种范围，并且可以对范围指定评分(例如，依据所使用的标尺，0至3+或0至8)，提供一定程度的定量信息。这样的评分可以反映各种因素，例如，其中检测IGF-1R的细胞数量、信号的强度(其可以指示IGF-1R或携带IGF-1R的细胞的表达水平)等。结果可以以定量的方式显示，例如检测到IGF-1R的细胞的百分比、蛋白浓度等。
如本领域普通技术人员将理解的，由测试提供的输出类型将依据测试的技术限制和与检测多肽相关的生物学意义而变化。例如，在某些多肽的情况下，仅定性输出提供了重要的信息(例如，是否在某一检测水平检测到多肽)。在其它情况下，需要更多的定量输出(例如，待测样本中多肽的表达水平与正常水平的比例)。
在另一方面，描述了一种在受试者中诊断病理性过度增殖性致癌疾病或与IGF-1R表达相关的病理性病症的易感性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过根据本发明的检测表达IGF-1R的细胞的方法和/或确定IGF-1R的表达水平的方法，确定样本中携带IGF-1R的细胞的存在或不存在，以及
(b)基于所述携带IGF-1R的细胞的存在或不存在，诊断病理性病况或对病理性病况的易感性。
在本文描述的方法中，表达IGF-1R的细胞或IGF-1R水平的增加的检测一般指示患者患有或怀疑呈现IGF-1R介导的疾病。
本发明还提供了一种用于预测个体发展癌症的风险的方法，所述方法包括通过根据本发明的用于检测表达IGF-1R的细胞的方法和/或确定IGF-1R的表达水平的方法，检测组织样本中IGF-1R的表达水平，其中高水平的IGF-1R表达指示发展癌症的高风险。
本发明还涉及一种用于评估肿瘤侵袭性的方法。
本文所用的“肿瘤侵袭性”是指肿瘤快速生长并趋于快速扩散。
在一个实施方案中，所述用于评估肿瘤侵袭性的方法包括以下步骤：
(a)通过根据本发明的检测表达IGF-1R的细胞的方法和/或确定IGF-1R的表达水平的方法，确定肿瘤样本中细胞表达的IGF-1R的水平，
(b)通过根据本发明的检测表达IGF-1R的细胞的方法和/或确定IGF-1R的表达水平的方法，确定在稍后时间来自相同个体获取的等价组织样本中表达的IGF-1R的水平，和
(c)确定步骤(a)中获得的表达水平与步骤(b)中获得的比例之间的比例，
其中肿瘤样本中随时间IGF-1R表达的比例提供关于癌症进展的风险的信息。
在一个优选的实施方案中，步骤(a)中获得的水平与步骤(b)中获得的水平的比例大于1指示侵袭性。在另一个实施方案中，小于或等于1的比例指示非侵袭性。
本发明的另一方面是通过根据本发明涉及的检测和/或定量IGF-1R的方法、和/或确定IGF-1R的表达水平的方法，监测IGF-1R表达对施用靶向IGF-1R通路的疗法的响应。当所述疗法触发IGF-1R的下调和/或降解时，这种监测可以是非常有用的。
本发明的另一个目的是描述一种用于确定致癌疾病是否对采用靶向IGF-1R通路的抗体药物治疗敏感的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)如上所述的根据本发明的评分方法，在体外或离体确定受试者肿瘤的肿瘤细胞的IGF-1R状态，以及
(b)当肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态是IGF-1R(+)时，则确定致癌疾病对靶向IGF-1R通路的抗体药物治疗是敏感的。
尤其是，监测细胞表面上的IGF-1R表达可能是评估临床试验和“个体化”治疗期间的治疗功效的关键工具。
因此，该应用提供了确定受试者合适的治疗方案的方法。
可以通过根据本发明的检测和/或确定表达水平的方法，确定IGF-1R水平的增加或降低，指示与IGF-1R相关的癌症的进展。因此，通过测量存在于各种组织或细胞中的表达IGF-1R的细胞数量的增加或IGF-1R浓度的变化，可以确定旨在改善与IGF-1R相关的恶性肿瘤的具体治疗方案是否有效。
本发明的另一个目的是一种用于在体外或离体确定治疗方案的功效的方法，所述治疗方案设计用于减轻患有与IGF-1R相关的致癌疾病的受试者中的所述疾病，所述方法包括以下步骤：
(a)通过如上所述的根据本发明的用于检测和/或确定表达水平的方法，在第一生物样本中，确定IGF-1R的第一表达水平，所述第一生物样本对应于所述治疗的第一时间点；
(b)通过如上所述的根据本发明的用于检测和/或确定表达水平的方法，在第二生物样本中，确定IGF-1R的第二表达水平，所述第二生物样本对应于所述治疗的第二、稍后的时间点；
(c)计算步骤(a)中获得的所述第一表达水平与步骤(b)中获得的所述第二表达水平的比例；和
(d)当步骤(c)的比例大于1时，确定所述治疗方案的功效是高的；或者当步骤(c)的比例小于或等于1时，确定所述治疗方案的功效低的。
在一个优选的实施方案中，所述的设计用于减轻患有与IGF-1R相关的致癌疾病的受试者中所述疾病的治疗方案，包括向所述受试者施用靶向IGF-1R通路的疗法。
本发明的另一个目的是提供一种使用根据本发明的检测和/或确定表达水平的方法，体内成像与IGF-1R表达相关的致癌疾病的方法。这种方法对于体内肿瘤细胞的定位以及监测其侵袭性是有用的。同样，该方法用于监测先前诊断为IGF-1R介导的癌症的患者的进展和/或对治疗的响应。
一个实施方案是一种用于检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的位置的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段施用至受试者；和
b)检测所述IGF-1R抗体的结合，
其中所述结合指示肿瘤细胞的存在。
对于表达肿瘤的存在的检测，可以使用本领域技术人员已知的许多技术。然而，优选的方式是IHC和FACS。
另一方面，本发明提供一种体内成像试剂，所述试剂包含根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，优选将所述IGF-1R抗体进行标记，更优选进行放射性标记。
本发明还涉及所述试剂在患有IGF-1R介导的癌症的患者的医学成像中的用途。
本发明的方法包括以下步骤：
(a)向所述患者施用成像有效量的本发明的成像试剂，和
(b)检测所述试剂。
在一个优选的实施方案中，成像试剂包含根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段以及活性部分。
本文使用的“活性部分”是允许在体内检测所述成像试剂的试剂。根据本发明的活性部分尤其包括如锝-99m(99mTc)、铜-67(Cu-67)、钪-47(Sc-47)，镥-77(Lu-177)、铜-64(Cu-64)、钇-86(Y-86)或碘-124(I-124)的放射性元素。
成像试剂以在哺乳动物如人中诊断使用的有效用量施用，然后检测成像试剂的定位和积累。成像试剂的定位和积累可以通过放射性核素成像、放射性闪烁照相法(radioscintigraphy)、核磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、计算机轴向断层扫描、X射线或磁共振成像方法、荧光检测和化学发光检测来检测。
关于靶向抗肿瘤疗法的发展，采用免疫组织化学技术的诊断给出了受体表达水平的原位信息，例如，关于肿瘤的尺寸和/或位置。因此，诊断使得能够根据这种治疗所需的受体的表达水平选择对治疗敏感的患者。
本发明的尤其有趣的方面是一种用于选择预期受益于或不受益于施用治疗量的靶向IGF-1R通路的抗体药物的癌症患者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)根据上述本发明的方法确定IGF-1R的表达水平；
(b)将前述步骤(a)的表达水平与参考表达水平进行比较；和
(c)当(a)中获得的表达水平与参考表达水平的比例大于1时，则选择预测受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的患者；或者
(d)当(a)中获得的表达水平与参考表达水平的比例小于或等于1时，则选择预测不受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的患者。
有利地，IGF-1R的表达水平相对于对照细胞或样本中的水平(也称为“参考水平”或“参考表达水平”)进行比较或测量。“参考水平”、“参考表达水平”、“对照水平”和“对照”在说明书中可以互换使用。“对照水平”是指在可比较的对照细胞中测量的单独的基线水平，所述对照细胞通常为无疾病或癌症的。所述对照细胞可以来自相同的个体，因为即使在癌症患者中，肿瘤部位的组织仍然包含非肿瘤健康组织。它也可能起源于正常的或者不存在患病或测试样本获得的相同疾病的另一个体。在本发明的上下文中，术语“参考水平”是指IGF-1R表达的“对照水平”，其用于评估含有癌症细胞的患者样本中IGF-1R表达的测试水平。例如，当患者生物样本中的IGF-1R水平高于IGF-1R的参考水平时，细胞将被认为具有高水平的IGF-1R的表达或过表达。参考水平可以通过多种方法来确定。因此，表达水平可以定义携带IGF-1R的细胞，或者可选地与表达IGF-1R的细胞数目无关的IGF-1R的表达水平。因此，每个患者的参考水平可以通过IGF-1R的参考比例来规定，其中参考比例可以通过本文所述的用于确定参考水平的任意方法来确定。
例如，对照可以是采取各种形式的预定值。它可以是单个截断值，如中位数或平均值。“参考水平”可以是同样适用于每个个体患者的单个数，或者参考水平可以根据患者的特定亚群而变化。因此，例如，同样的癌症，老年人可能具有与年轻人不同参考水平，以及同样的癌症，女性可能具有与男性不同的参考水平。或者，可以通过测量来自与待测试的肿瘤细胞的组织相同组织的非致癌癌症细胞中IGF-1R的表达水平来确定“参考水平”。同样，“参考水平”可能是患者肿瘤细胞中IGF-1R相对于同一患者中非肿瘤细胞中IGF-1R水平的某一比例。“参考水平”也可以是体外培养细胞的IGF-1R水平，其可以被操纵以模拟肿瘤细胞，或者可以以产生精确确定参考水平的表达水平的任意其它方式进行操纵。另一方面，可以基于比较组建立“参考水平”，如不具有升高的IGF-1R水平的组和具有升高的IGF-1R水平的组。比较组的另一个实例是具有具体疾病、病症或症状的组，以及没有疾病的组。预定值可以被设定，例如，将测试的群平均(或不平均)分成组，如低风险组、中等风险组和高风险组。
参考水平也可以通过比较具有相同癌症的患者的群的IGF-1R水平来确定。这可以通过例如直方图分析完成，其中以图形方式呈现整个患者队列，其中第一轴表示IGF-1R的水平，第二轴表示在该队列中肿瘤细胞在给定水平表达IGF-1R的患者的数量。可以通过鉴定具有相同或相似IGF-1R水平的队列的子集群，来确定两个或多个单独的患者组。然后可以基于能够最好地将这些单独的组区分开的水平，来确定参考水平。参考水平也可以表示两种或多种标志物的水平，其中之一是IGF-1R。两种或多种标志物可以例如通过每种标记物的水平的值的比例来表示。
同样，显然健康的群与已知具有与IGF-1R表达相关的病症的群具有不同的“正常”范围。因此，所选择的预定值可以考虑个体落入的类别。本领域普通技术人员可以通过不超过常规的实验来选择合适的范围和类别。“升高”、“增加”是指相对于所选择的对照是高的。通常，对照将基于合适年龄段中显然健康的正常个体。
还将理解，除了预定值之外，根据本发明的对照可以是与实验材料同时测试的材料样本。实例包括来自相同受试者的在相同时间获得的组织或细胞，例如，单次活检的部分，或者来自受试者的单细胞样本的部分。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于在体内成像与IGF-1R表达相关的致癌疾病的药物组合物，所述药物组合物包含被标记的上述的根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、或其抗原结合片段、和药学上可接受的载体。
在另一个方面，还描述了一种用于检测患者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含如上所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，优选抗体810D12。
包含预定量的试剂组合和用于进行诊断分析的说明书的包装材料也在本发明的范围内，例如，试剂盒。试剂盒含有用于体外检测和定量IGF-1R的IGF-1R抗体，例如，在ELISA中。当IGF-1R抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。这种试剂盒可以包含被区划的底座(receptacle)，以接纳一个或多个容器如小瓶、管等，这种容器持有本发明的单独的元素。例如，一个容器可以含有结合至不溶性或部分可溶性载体的第一抗体。第二容器可含有冻干形式或在溶液中的可溶性的可检测标记的第二抗体。底座还可以包含第三容器，其持有冻干形式或在溶液中的可检测标记的第三抗体。这种性质的试剂盒可用于本发明的夹心分析。标签或包装插页可以提供组合物的描述以及预期的体外或诊断用途的说明书。
各种试剂的相对量可以广泛变化以提供在试剂溶液中的浓度，其实质上优化了分析的灵敏度。尤其是，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，这包括赋形剂，其在溶解时将提供具有合适浓度的试剂溶液。
在另一个方面，提供根据本发明本文详细描述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其标记有可检测部分，使得它们可以包装并例如在试剂盒中使用，以诊断或鉴定具有上述抗原的细胞。这种标记的非限制性实例包括荧光团，如异硫氰酸酯荧光素；发色团、放射性核素、生物素或酶。这种标记的IGF-1R抗体可用于例如抗原的组织学定位、ELISA、细胞分选以及用于检测或定量IGF-1R以及携带该抗原的细胞的其它免疫技术。
本发明还涉及一种试剂盒，其中所述试剂盒的特征在于其包含根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及一种试剂盒，其中所述试剂盒的特征在于其包含嵌合的或人源化的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，可以从根据本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段的具有序列SEQ ID No.1-6的6个CDR获得。
还提供了可用作从细胞中纯化或免疫沉淀IGF-1R的阳性对照的试剂盒。为了分离和纯化IGF-1R，试剂盒可以含有偶联到珠(例如琼脂糖珠)上的根据本发明本文详细描述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段。可以提供含有用于体外检测和定量IGF-1R的抗体的试剂盒，例如，在ELISA中。试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。可以包括额外的容器，其含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体。标签或包装插页可以提供组合物的描述以及预期的体外或诊断用途的说明书。
更具体地，本发明涉及一种通过本文所述的方法体外或离体确定受试者中肿瘤的肿瘤细胞的IGF-1R状态的试剂盒。在一个优选的实施方案中，如将在实施例中描述的，本发明涉及一种用于通过IHC和/或FACS方法确定肿瘤或肿瘤细胞的IGF-1R状态的试剂盒。
在一个具体的实施方案中，本发明包括至少包含如上所述的本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段的试剂盒，所述抗体被标记。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的试剂盒还包含可用于检测所述IGF-1R抗体与IGF-1R之间的结合程度的试剂。
在另一个优选的实施方案中，可用于体外或离体确定表达IGF-1R的肿瘤中IGF-1R的表达水平的本发明的试剂盒，其还包含用于定量所述标记的IGF-1R抗体和IGF-1R之间的结合水平的试剂。
在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒还包含：i)用于检测所述标记的IGF-1R抗体和IGF-1R之间的结合程度的试剂；和ii)用于评分IGF-1R表达水平的阳性和阴性对照样本。
所述试剂盒还可以包含对鼠抗体或人的/人源化的抗体特异性的多克隆抗体，优选对鼠的、人源化的或人的抗体特异性的所述多克隆抗体进行标记。
根据本发明的一个具体的实施方案，用于在体外选择预期受益于或不受益于靶向IGF-1R通路的抑制剂的治疗性施用的癌症患者的试剂盒，其可以包括：i)可用于检测所述IGF-1R抗体与IGF-1R之间的结合程度的试剂；ii)与IGF-1R抑制剂的敏感性相关的对照水平，和/或iii)与IGF-1R抑制剂的耐受相关的对照水平。
本发明还涉及用于确定患有致癌疾病的患者是否可能受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含如上所述本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，所述试剂盒的特征在于，其还包括：
i)用于检测所述IGF-1R抗体与肿瘤细胞表面上的IGF-1R之间结合程度的试剂；和/或
ii)用于定量所述IGF-1R抗体与肿瘤细胞表面上的IGF-1R之间的结合水平的试剂。
本发明的其它特征和优点出现在以下实施例和附图的继续描述中，附图说明在下面示出。
附图说明
图1：在rhIGF1R ELISA中采用810D12抗体获得的OD值的图示。使用Prism应用程序确定数据拟合和EC50确定。
图2A-2C：采用810D12(图2A)、G11抗IGF-1R抗体(Roche Ventana)(图2B)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体(图2C)的石蜡包埋的肿瘤MCF-7的免疫组织化学(IHC)模式识别。
图3：抗IGF-1R ADC在MCF-7异种移植模型中的体内活性。
图4A-4C：采用810D12、G11抗IGF-1R抗体(Roche Ventana)(图4B)或AF-305(R&Dsystem)抗IGF-1R抗体(图4C)的石蜡包埋的肿瘤SBC-5的免疫组织化学(IHC)模式识别。
图5：抗IGF-1R ADC在SBC-5异种移植模型中的体内活性。
具体实施方式
实施例1：810D12生成和选择
如下所述的产生并选择针对rhIGF-1R生成的Mab。
通过采用10μg的重组人IGF-1R蛋白(R and D Systems，391-GR)与弗氏佐剂皮下注射来免疫雌性Balb/C小鼠。每隔两周重复免疫接种3次。在佐剂存在下通过腹膜内注射进行第四次注射。
三天后，采用PEG 50％将脾细胞与SP2OAg14骨髓瘤细胞融合。在HAT代谢选择14天后，通过FACS使用人MCF7乳癌细胞测试杂交瘤上清液。只保留了结合MCF7的抗体。
然后通过有限稀释克隆感兴趣的抗体。克隆后8天，通过FACS使用MCF7细胞再次选择上清液。对每个杂交瘤保留三个阳性克隆。使用来自Southern Biotechnologies的SBA克隆分型系统HRP试剂盒(Cat：5300-05)确定分泌的抗体的分型。最后，一个克隆被扩增和冷冻。
然后使用杂交瘤上清液如rhIGF-1R或rmIGF-1R或rhIR ELISA进行810D12抗体的进一步表征。在所有直接ELISA中，将感兴趣的蛋白固定(1μg/ml)到每个孔的底部。饱和后，将杂交瘤上清液加入孔中。在1小时的孵育期和洗涤步骤之后，山羊抗小鼠IgG-HRP标记的多克隆抗体的溶液用于检测，之后添加TMB底物。用1M H2SO4溶液终止反应，之后在450nm波长用分光光度计读取OD。数据见下表6。
表6
Figure BDA0001447787580000221
810D12抗体对rhIGF-1R包被的剂量反应曲线如图1所示。使用Prism应用程序确定EC50值。
数据显示，810D12抗体仅识别rh IGF-1R，EC50为0.51nM。它不与鼠形式的IGF-1R，也不和人IR结合。
实施例2：分期与本发明的抗体的相关性的评估，以及在MCF-7异种移植模型中靶 向IGF-1R的ADC的活性。
为了将肿瘤的分级与药理学相关联，肿瘤已经被分级(2.1节)，然后采用ADC来进行MCF-7异种移植模型的体内实验，所述ADC包含靶向已知被内在化的IGF-1R的抗体部分和由澳瑞他汀组成的药物部分(2.2节)。
2.1：免疫组织化学检测MCF-7异种移植模型的IGF-1R的表达。
将来自MCF-7异种移植的组织切片脱蜡，再水化，并置于在98℃预热的沸腾浴中的Target Retrieval缓冲液1×(Dako S1699)中，在98℃下40分钟，然后在Target Retrieval缓冲液中额外的20分钟进行热诱导表位恢复。在Tris缓冲盐水-0.05％吐温20(TBS-T)(Dako S3006)中洗涤3次后，使用过氧化物酶封闭试剂(Peroxidase Blocking Reagent，Dako K4007)封闭内源性过氧化物酶活性5分钟。用TBS-T洗涤切片，并用封闭试剂(UltraVblock-TA-125UB-LabVision)孵育5分钟，之后与810D12单克隆抗体(5μg/ml)或作为阴性对照的小鼠IgG1/κ(5μg/ml，X0931，Dako)在室温下孵育1小时。切片用TBS-T洗涤并与Envision(Dako)孵育30分钟。二氨基联苯胺用于棕色反应产物(Dako K3468)显色(development)。将玻片浸在苏木精中2分钟以复染(Dako S3309)。
本发明的抗IGF-1R单克隆抗体810D12对MCF-7的细胞膜进行差异性染色。在该IHC规程中，棕色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，棕色反应产物的缺乏与阴性染色和未观察到细胞膜相关。使用膜算法，MCF-7肿瘤细胞染色评分为3+(图2A)。使用G11抗体(RocheVentana)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体，相同肿瘤切片评分为2+(分别为图2B和2C)。
2.2：在MCF-7异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
在MCF-7异种移植模型中，已经在体内评估了抗IGF-1R ADC。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令(Directive onthe protection of animals used for scientific purposes)的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所(Pierre Fabre Institute)的动物伦理委员会(Animal EthicalCommittee)批准。将5百万个MCF-7细胞皮下注射入7周龄的Swiss/Nude小鼠。在细胞注射之前，将雌激素丸(Innovative Research of America)植入小鼠的左侧(left flank)，以释放MCF-7肿瘤体内生长所必需的雌激素。
MCF-7细胞植入二十天后，当肿瘤达到平均尺寸120-150mm3时，根据肿瘤尺寸和外表(aspect)将动物分成6只小鼠的组。抗IGF-1R ADC通过腹膜内注射接种，每4天6次注射周期(Q4d4)。每日监测动物的健康状态。每周用电子卡尺测量肿瘤体积两次，直到研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长×宽×高。根据动物重量每周评估毒性三次。使用Mann-Whitney测试在每次测量中进行统计学分析。
如预期的，对于分级3+的肿瘤而非分级2+的肿瘤，注射抗IGF-1R ADC显著抑制并且甚至诱导肿瘤生长的完全退化(图3)。
实施例3：分期与本发明的抗体的相关性的评估，以及在SBC-5异种移植模型中靶 向IGF-1R的ADC的活性。
为了将肿瘤的分级与药理学相关联，肿瘤已经被分级(3.1节)，然后采用ADC来进行SBC-5异种移植模型的体内实验，所述ADC包含靶向IGF-1R的抗体部分和由澳瑞他汀组成的药物部分(3.2节)。
3.1免疫组织化学检测SBC-5异种移植模型的IGF-1R的表达。
使用与之前实施例2的2.1节所述相同的方案分析IGF-1R水平。
当用810D12检测IGF-1R时，检测到低水平(1+)(图4A)。当用G11抗体(RocheVentana)或AF-305(R&D system)抗IGF-1R抗体检测IGF-1R时，来自相同肿瘤的切片被评分为3+(分别为图4B和4C)。
3.2：在SBC-5异种移植模型中抗IGF-1R ADC的体内活性。
在SBC-5异种移植模型中，已经在体内评估了抗IGF-1R ADC。
所有动物规程均根据2010/63/UE保护用于科学目的动物的指令的指南进行。方案经皮埃尔法布雷研究所的动物伦理委员会批准。将5百万个SBC-5细胞皮下注射入7周龄的无胸腺小鼠(Athymic mice)。细胞植入二十天后，当肿瘤达到平均尺寸150mm3时，根据肿瘤尺寸和外表将动物分成6只小鼠的组。抗IGF-1R ADC通过腹膜内注射接种，每4天6次注射周期(Q4d6)。每日监测动物的健康状态。每周用电子卡尺测量肿瘤体积两次，直到研究结束。肿瘤体积用下式计算：π/6×长×宽×高。根据动物重量每周评估毒性三次。使用Mann-Whitney测试在每次测量中进行统计学分析。
如预期的，对于分级1+的肿瘤而非分级3+的肿瘤，SBC-5肿瘤细胞的肿瘤进展不受抗IGF-1R ADC注射的影响(图5)。
序列表
<110> 皮埃尔法布雷医药公司
A·茹阿诺
<120> 新型IGF-1R抗体及其用于癌症诊断的用途
<130> D34867
<150> EP 15305644.5
<151> 2015-04-27
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
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aatgagaact tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgt aactaccgcc 300
tactatggta acggccggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 810D12 I-4893, 轻链, 可变结构域
<400> 10
gatatccaga tgacacagac tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattatttaa cctggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaagttct gatctactac acatcaagat tatactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattaacaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttattcgc ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

Claims (16)

1.一种IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其包含：
i)重链，其具有序列SEQ ID No.1的CDR-H1、序列SEQ ID No.2的CDR-H2和序列SEQ IDNo.3的CDR-H3；和
ii)轻链，其具有序列SEQ ID No.4的CDR-L1、序列SEQ ID No.5的CDR-L2和序列SEQ IDNo.6的CDR-L3；
其中，所述抗原结合片段选自：Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段、双特异抗体、和通过添加聚(亚烷基)二醇来延长半衰期的片段。
2.根据权利要求1所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包含序列SEQID No.7的或与序列SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任意序列的重链可变结构域；和/或序列SEQ ID No.8的或与序列SEQ ID No.8具有至少90％同源性的任意序列的轻链可变结构域。
3.一种IGF-1R抗体或其抗原结合片段，其中所述IGF-1R抗体由编号I-4893的杂交瘤分泌，所述杂交瘤在2014年9月17日提交在巴黎巴斯德研究所CNCM；
其中所述抗原结合片段选自：Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段、双特异抗体、和通过添加聚(亚烷基)二醇来延长半衰期的片段。
4.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测表达IGF-1R的肿瘤细胞或确定表达IGF-1R的肿瘤细胞的表达水平。
5.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于在体外或离体诊断或预后与IGF-1R表达相关的致癌疾病。
6.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于确定患有致癌疾病的患者是否可能受益于采用靶向IGF-1R通路的抑制剂的治疗。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述靶向IGF-1R通路的抑制剂是单独的、组合的或缀合的IGF-1R抗体。
8.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于体外或离体检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的存在和/或位置，所述检测包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本的结合。
9.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于在体外或离体检测受试者中表达IGF-1R的肿瘤细胞百分比，所述检测包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)定量生物样本中表达IGF-1R的细胞的百分比。
10.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞中IGF-1R的表达水平，所述确定包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平。
11.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于在体外或离体确定受试者中肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R评分，所述确定包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；
(b)通过荧光活化的细胞分选(FACS)或免疫组织化学(IHC)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平；和
(c)通过将步骤(b)中获得的定量水平与合适的标尺比较，对肿瘤细胞或肿瘤评分，所述合适的标尺基于两个参数：染色的强度和阳性细胞的百分比。
12.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于确定受试者中致癌疾病是否对采用靶向IGF-1R通路的抗体药物治疗敏感，所述确定包括以下步骤：
(a)将来自所述受试者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；
(b)通过荧光活化的细胞分选或免疫组织化学，定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平；和
(c)通过将步骤(b)中获得的定量水平与合适的标尺比较，对肿瘤细胞或肿瘤进行评分，所述合适的标尺基于两个参数：染色的强度和阳性细胞的百分比，和
(d)当肿瘤细胞或肿瘤的IGF-1R状态是IGF-1R(+)时，则确定致癌疾病对采用靶向IGF-1R通路的抗体药物治疗敏感。
13.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于在体外或离体确定治疗方案的功效，所述治疗方案设计用于减轻患有与IGF-1R相关的致癌疾病的受试者中的所述疾病，所述确定包括以下步骤：
(a)在第一生物样本中确定IGF-1R的第一表达水平，所述第一生物样本对应于所述治疗方案的第一时间点；其中所述确定包括：
i)将来自所述受试者的第一生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
ii)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述第一生物样本中的IGF-1R的结合水平；
(b)在第二生物样本中确定IGF-1R的第二表达水平，所述第二生物样本对应于所述治疗方案的第二时间点，所述第二时间点晚于所述第一时间点；其中所述确定包括：
i)将来自所述受试者的第二生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
ii)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述第二生物样本中的IGF-1R的结合水平；
(c)计算步骤(a)中获得的所述第一表达水平与步骤(b)中获得的所述第二表达水平的比例；和
(d)当步骤(c)的比例大于1时，确定所述治疗方案的功效是高的；或者当步骤(c)的比例小于或等于1时，确定所述治疗方案的功效是低的。
14.权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于选择预期从施用治疗量的靶向IGF-1R通路的抗体药物受益或不受益的癌症患者，所述选择包括以下步骤：
(a)确定IGF-1R的表达水平；其中所述确定包括：
i)将来自所述患者的生物样本与所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段接触；和
ii)定量所述IGF-1R抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的IGF-1R的结合水平；
(b)将前述步骤(a)的表达水平与参考表达水平进行比较；和
(c)当(a)中获得的表达水平与参考表达水平的比例大于1时，则选择预测受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的患者；或者
(d)当(a)中获得的表达水平与参考表达水平的比例小于或等于1时，则选择预测不受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的患者。
15.一种用于检测患者中表达IGF-1R的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含根据权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
16.一种用于确定患有致癌疾病的患者是否可能受益于靶向IGF-1R通路的抗体药物的治疗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含根据权利要求1至3中任一项所述的IGF-1R抗体或抗原结合片段。
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