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WO2012141554A2 - 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2012141554A2
WO2012141554A2 PCT/KR2012/002873 KR2012002873W WO2012141554A2 WO 2012141554 A2 WO2012141554 A2 WO 2012141554A2 KR 2012002873 W KR2012002873 W KR 2012002873W WO 2012141554 A2 WO2012141554 A2 WO 2012141554A2
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WO
WIPO (PCT)
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cotinine
antibody
conjugate
complex
wkymvm
Prior art date
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PCT/KR2012/002873
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French (fr)
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WO2012141554A3 (ko
WO2012141554A8 (ko
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정준호
박선영
황도빈
이화경
Original Assignee
서울대학교산학협력단
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Publication date
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Priority to KR1020137029242A priority patent/KR101648960B1/ko
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Publication of WO2012141554A3 publication Critical patent/WO2012141554A3/ko
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to complexes in which an anti-cotinine antibody is conjugated to a conjugate of a conjugate material and cotinine, and to the use thereof.
  • Background of the Invention Numerous peptides and aptamer biopharmaceuticals have promising properties as drug candidates, but are easily degraded in the body by proteinases, peptides and nucleases. It is also known to have a short half-life in the body of several minutes to several hours because it is rapidly excreted through the kidneys (Sato AK et al., Curr Opin Biotechnol, 17, 638-642, 2006).
  • PEG polyethyleneglycol
  • Techniques have been implemented to prolong the residence time in the blood by inhibiting degradation and inhibiting absorption in the kidneys and blood vessels.
  • PEGylation takes a long time and requires specific optimization depending on the conjugation material, and also has a problem in that various molecular conjugates are produced because PEG is very heterogeneous.
  • the hapten In the light of its purpose for use as a novel delivery plat form, the hapten must meet the condition that it must be nontoxic to animals and humans and free from physiological activity. Cotinine is a major metabolite of nicotine and humans have been exposed to nicotine for a long time. Thus, cotinine is a hapten suitable for application to new delivery platforms. Cotinine also LD 50 in rats is a relatively safe substance at around 2-4 g / kg (Ri ah 0. et al., Toxicol. Lett., 109, 21-29, 1999), taking 1.8 g per day for 4 days No adverse reactions were reported even when it was used (Boley an, ER & Mc, KH, Jr., J. Pharmacol. Exp.
  • aptamers can be folded in specific and three-dimensional forms, enabling high-affinity, specific binding to targets similar to antibodies, and thus have been used in a variety of assays and experiments.
  • Conventional methods for preparing complexes with aptamers have been complexed with avidin and anti-digoxygenin antibodies by conjugating aptamers to biotin and digoxigenin. .
  • the inventors of the present invention prepared a complex in which an anti-cotinine antibody was conjugated to a conjugate between a conjugated substance and a cotinine by using a cotinine as a hapten, and the complex has a specific reactivity and a biological function of the conjugated substance, and a complement medium having inherent characteristics of the antibody.
  • the present invention has been completed by discovering that it can possess complement-mediated cell cytoxicity (CDC), antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), and long in vivo half-life.
  • Another object of the present invention is to provide a method characterized by using a conjugate of cotinine and a conjugate as an analytical tool in an in vitro biological assay. It is another object of the present invention to provide a method of increasing the in vivo half-life of a conjugated substance by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugated substance is conjugated with cotinine.
  • Another object of the present invention is to provide a method of causing complement dependent toxicity in cells to which the conjugate material binds by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugate material is conjugated with cotinine.
  • the present invention provides a complex in which an anti-cotinine antibody is bound to a conjugate of a conjugate material and cotinine.
  • the present invention provides a method characterized in that in the in vitro biological analysis method, using a conjugate of cotinine and a conjugate material as an analysis tool.
  • the present invention provides a method for increasing the in vivo half-life of the conjugate material by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugate material is conjugated with cotinine.
  • the present invention provides a method for causing complement-dependent toxicity to the cells to which the conjugate material binds by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugate material is conjugated with cotinine.
  • the present invention provides a method for causing antibody-dependent cytotoxicity to cells to which the conjugate material binds by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugate material is conjugated with cotinine.
  • the present invention is to provide a conjugate of the conjugate material and the cotinine conjugated by the anti-cotinine antibody in the body of the conjugate material It provides a method characterized by changing the distribution to the distribution pattern in the body of the general antibody.
  • Example 2 and 3 show the structural formulas of the cotinine-WKYMVm-NH 2 conjugate synthesized in Example (3-1), and the cotinine-AS1411 and cotinine-pegactin conjugates synthesized in Example (3-2).
  • Figure 4 shows a graph analyzing the affinity of the anti-cotinine IgG antibody to the cotinine carried out in Test Example 1.
  • Figure 5 shows a graph showing the specific binding capacity of the cotinine-KYMVm-NH 2 / anti-cotinine IgG complex to the FPR2 cell receptor.
  • 6 to 8 show changes in intracellular calcium concentration, superoxide generation and chemotaxis of the cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / anti-cotinine IgG complexes, respectively.
  • 9 shows a graph and histogram comparing the half-life in vivo of mice with the cotinine-WKYMVm-NH 2 conjugate, and the cotinine-WKYMVm-NH 2 / anti-cotinine IgG complex.
  • FIG. 10 is a graph showing in vivo half-life of serum of anti-cotinine IgG.
  • FIG. 11 is a graph showing improved treatment efficiency in the sepsis model of cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / anti-cotinine IgG complex.
  • FIG. 12 is a graph comparing the half-life in vivo of the cotinine-pecatanib conjugate, and the cotinine-pecatanib / anti-cotinine IgG complex in mice.
  • FIG. 13 and FIG. 14 show the results of specific avidity test for nucleolin cell receptor of cotinine-AS1411 / anti-cotinine IgG complex.
  • FIG. 15 shows Western blot of the cotinine-AS1411 / anti-cotinine IgG complex. The result is.
  • Figure 16 shows the results of the immunoprecipitation test of nucleolins using the cotinine-AS1411 / anti-cotinine IgG complex.
  • 17 is a graph showing the binding of cortin-pegatanib / anti-cotinine IgG complex to VEGF.
  • FIG. 18 is a graph showing responsiveness to integrin alpha 2b beta 3 of apsiximab, apsiximab-cotinine conjugate, and cotinine-absiximab / anti-cotinine IgG complex.
  • Figure 19 shows the results of the binding test for platelets of the cotinine-absiximab / anti-cotinine IgG complex.
  • FIG. 20 shows the results of the avidity test for MCF-7 and SK-Br-3 cells of the cotinine-insulin / anti-cotinine antibody complex.
  • Figure 21 shows the complement dependent toxicity analysis of the cotinine-insulin / anti-cotinine antibody complex.
  • FIG. 22 shows a complex in which an anti-cotinine antibody is bound to a conjugate of a conjugate and a cotinine.
  • FIG. 23 shows the results of .affinity chromatography using protein A agarose to purify ScFv antibodies against human complement C5 from cell culture media.
  • antibody refers to a substance produced by stimulation of an antigen in the immune system, and the kind thereof is not particularly limited.An antibody is an animal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a complete antibody. All human antibodies are included herein, and antibodies also include fragments of antibodies, such as Fabs, that retain antigen binding capacity.
  • a “chimeric antibody” means that an antibody variable region or its complementarity-determining region (CDR) is selected from the antibody. Refers to an antibody derived from an animal different from the rest. Such antibodies can be, for example, antibody variable regions derived from animals other than humans (eg, mice, rabbits, poultry, etc.) and antibody constant regions can be antibodies derived from humans. Such chimeric antibodies can be prepared by methods such as genetic recombination known in the art.
  • Heavy chain herein refers to a full length heavy chain and fragment thereof comprising variable region domain V H and three constant region domains CHI, CH2 and CH3 comprising an amino acid sequence of sufficient variable region to confer specificity for the antigen It refers to all.
  • light chain refers to both the full-length light chain and fragments thereof including the variable region domain V L and the constant region domain C L , which comprise an amino acid sequence of sufficient variable region to confer specificity to the antigen.
  • complementarity determining region herein is meant a site that confers binding specificity with an antigen in the variable region of an antibody.
  • a “conjugate” is a heteromorphic molecule, which includes one or more non-polypeptide moieties such as polymer molecules, lipophilic compounds, carbohydrate moieties or organic derivatizing agents, in particular one or more polypeptides, typically one Can be made by covalently attaching a polypeptide.
  • the conjugates can be attached to one or more carbohydrate moieties, in particular using N- or 0-glycosylation.
  • Covalent attachment means that polypeptides and non-polypeptides are directly covalently bonded to one another or indirectly covalently linked to one another through an intermediary or moiety such as a bridging bridge, a SpaceBot moiety, or moiety. Means that.
  • conjugates in which the conjugate material disclosed herein is conjugated with cotinine are included in this definition.
  • the present invention provides a complex in which an anti-cotinine antibody is bound to a conjugate of a conjugate material and cotinine (FIG. 22).
  • the present invention provides a method, characterized in that the conjugate of cotinine and the conjugate material is used as an analytical tool in an in vitro biological assay.
  • the ex vivo biological assay method is a flow cell Assays, Western blot assays, immunoprecipitation assays and enzyme-linked immunochemical assays.
  • the complex in which the anti-cotinine antibody is conjugated to the conjugate of the conjugate material and the cotinine according to the present invention can retain both the conjugate material and the inherent properties of the antibody by using the cotinine as the hapten. Reactivity and function, and complement-mediated cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), and long in vivo half-life that are characteristic of antibodies.
  • the present invention provides a method of increasing the in vivo half-life of a conjugated substance by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugated substance is conjugated with cotinine.
  • the present invention provides a method of causing complement dependent toxicity to a cell to which the conjugate substance binds by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate conjugated with a conjugate substance.
  • the present invention also provides a method of causing antibody-dependent cytotoxicity to cells to which the conjugate substance binds by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate conjugated with cotinine.
  • the present invention provides a method characterized by changing the distribution of the conjugated substance in the body distribution of the general antibody by binding an anti-cotinine antibody to a conjugate in which the conjugated substance is conjugated with cotinine.
  • the complex according to the present invention is composed of one type of antibody and cotinine, it can be prepared by simply conjugating a short sequence of conjugation material to cotinine, and thus can act as a delivery platform of high density, easy development and simple form. Therefore, the complex according to the present invention can be used as a novel antibody whose antigenic reactivity is determined by a conjugated substance conjugated to cotinine, and used as a therapeutic antibody exhibiting inherent biological or chemical function.
  • Cortinine is a major metabolite of nicotine, the main component of tobacco smoke, and it is very small and even in small amounts even after humans have been exposed to tobacco smoke for a long time. Only immediate toxicity has been reported to date and is known to be a fairly stable molecule. This relative nontoxic nature of the cotinine, makes that cotinine is a conjugate for the ideal molecule to be used in vivo 'ra). In the present invention, the short half-life of the conjugated substance can be significantly improved by conjugating the cotinine with the conjugated substance.
  • Conjugation material in the present invention may be a variety of biological and chemical substances that exhibit a specific therapeutic activity or binding reactivity.
  • the conjugate material may be selected from the group consisting of, for example, peptides, aptamers, hormones, proteins and chemicals, preferably, WKYMVm-3 ⁇ 4 peptide (WKYMVm-N3 ⁇ 4), wkymvm-NH 2 peptide (wkymvm- NH 2 ), AS1411 3 ⁇ 4tammer, pegaptanib, apxisimab, and insulin. Absixabma (abciximab, which may be used as a bonding material in the present invention,
  • ReoPro is a mouse / human chimeric Fab that exhibits responsiveness to integrin alpha2b beta3, which is widely expressed on the surface of platelets.
  • a complex comprising a cotinine-absiximab conjugate prepared by conjugating said apsiximab with a cotinine, and an anti-cotinine antibody (hereinafter, the cotinine-absiximab / anti-cotinine antibody complex It can be seen that the complex maintains the same level of reactivity with 3 ⁇ 4siximab to integrin alpha 2b beta 3 and platelets (see Test Example 9, FIGS. 18 and 19 herein).
  • Insulin which can be used as a conjugate substance in the present invention, is an important hormone for regulating the metabolism of carbohydrates and fats in vivo. Insulin
  • a complex comprising a cotinine-insulin conjugate prepared by conjugating the insulin with cotinine, and an anti-cotinine antibody (hereinafter, a cotinine-insulin / anti-cotinine antibody complex) may be prepared.
  • the WKYMVm-NH 2 peptide which can be used as a conjugate in the present invention, is an anti-septic therapeutic peptide, an antagonist to formyl peptide receptors (FPRs), and chemotactic migration in phagocytes. Induce migration and increase superoxide production of monocytes and neutrophils.
  • a complex comprising a cotinine-WKYMVm-N conjugate prepared by conjugating the WKYMVm-NH 2 peptide with cotinine (FIG. 2), and an anti-cotinine antibody (hereinafter, cotinine -WKYMVm-NH 2 / anti-cotinine antibody complex).
  • cotinine -WKYMVm-NH 2 / anti-cotinine antibody complex a complex comprising a cotinine-WKYMVm-N conjugate prepared by conjugating the WKYMVm-NH 2 peptide with cotinine (FIG. 2), and an anti-cotinine antibody (hereinafter, cotinine -WKYMVm-NH 2 / anti-cotinine antibody complex).
  • the WKYMVm-NH 2 peptide BoekSH, eta J., J Biol Che., 1996 Apr 5; 271 (14): 8170-5.PubMed PMID: 8626507
  • the complex of the present invention thus prepared exhibits reactivity to cells expressing the formyl peptide receptor in flow cytometry analysis, and it can be seen that the binding force of WKYMV m -NH 2 was preserved (FIG. 5). Reference). In addition, the cotinine-WKYMVm-NH 2 conjugate successfully released calcium from the cells, indicating that the biological function of YMVtn-N3 ⁇ 4 was maintained even after conjugation with cotinine (see FIGS. 6 to 8).
  • Pegaptanib which may be used as a conjugate material in the present invention, is a PEGylated anti-VEGF aptamer and binds to VEGF 165, which plays an important role in angiogenesis.
  • a complex comprising a conjugate of cotinine-peptagtanib prepared by conjugating the nucleic acid moiety of pegaptanib to cotinine (see FIG. 3), and an anti-cotinine antibody (hereinafter, cotinine-pegatanib / Anti-cotinine antibody complex), which can be seen that the half-life in vivo is significantly improved (see Test Example 7).
  • AS1411 aptamer that can be used as a conjugate material in the present invention is a G-rich oligonucleotide that binds to nucleolin that is expressed on the surface of cancer cells and is taken up into cancer cells, thereby nuclein such as DNA replication and cell proliferation. It is characterized by destroying the normal function of the.
  • a conjugate comprising a conjugate of cotinine AS1411 prepared by conjugating AS1411 with cotinine (see FIG. 3), and an anti-cotinine antibody (hereinafter, cotinine AS1411 / anti-cotinine antibody complex) It can be prepared, the complex can be seen that maintains the binding force to VEGF as well as AS1411 aptamer (see Test Example 8).
  • the conjugate material is characterized in that the cotinine is linked with a PEG linker (mini PEG-12) or an amino C6 linker.
  • the conjugate of the cotinine and the conjugate material forms a complex of the present invention by binding to an anti-cotinine antibody, wherein the conjugate may be bound to the heavy or light chain of the antibody, in particular to the antigen binding site of the anti-cotinine antibody.
  • the anti-cotinine antibody may be an antibody prepared and expressed in the IgG form of a high affinity anti-cotinine Fab • antibody (see US Pat. No. 8,008,448 B2).
  • the anti-cotinine antibody can be prepared according to the following manner.
  • Light and heavy chain genes prepared by modifying the manner described in US Pat. No. 8,008,448 are inserted into expression vectors (eg, pcDNA3.1), respectively.
  • Antibody-cotinine IgG antibodies according to the present invention can then be obtained by transforming mammalian cells to express the antibody protein and then purifying the cultures in a conventional manner.
  • mammalian CHO DG44 cells may be used as the mammalian cells.
  • the purification method may be concentrated, followed by purification with a Protein A column (Rep li gen, USA). It is desirable to.
  • the anti—cotinine antibody is selected from the above antibody; Antibody fragments selected from Fab, ScFv and domain antibodies; And a fusion protein comprising the antibody and the antibody fragment as constituents.
  • the complex in which an anti-cotinine antibody is conjugated to a conjugate of a conjugate substance and cotinine may include the steps of: 1) preparing a conjugate conjugated to a conjugate substance; 2) preparing an anti-cotinine antibody; And 3) binding the conjugate and the anti-cotinine antibody conjugated with the cotinine prepared above.
  • the method comprises the steps of: a) inserting a nucleic acid molecule encoding a complex in which an anti-cotinine antibody is conjugated to a conjugate between a conjugate and a cotinine; b) introducing said vector into a host cell; And c) culturing the host cell.
  • the preparation of a complex in which an anti-cotinine antibody is conjugated to a conjugate of a conjugate substance and a cotinine is required to establish an anti-cotinine antibody production system at a clinical stage. It can be a useful way to generate therapeutic antibodies.
  • the method for preparing a complex of the present invention provides a method for preparing a therapeutic antibody in the form of small molecules that can be synthesized quickly and easily in a high-volume manner at the clinical stage. It can manufacture.
  • the anti-cotinine antibody is bound to the conjugate to form a complex.
  • the antigenic reactivity of the antibody can be produced by a conjugate material conjugated to cotinine.
  • the complex of the present invention thus prepared retains all the features of the antibody, including complement-mediated cytotoxicity, antibody-dependent cytotoxicity, and long in vivo half-life.
  • the complexes of the present invention are expected to show additional advantages in immunological aspects.
  • conjugates of existing therapeutic molecules and antibodies can be used as hapten-carriers, and immunological reactions can be generated immediately for molecules bound directly to antibodies.
  • the molecule-antibody conjugate When the molecule-antibody conjugate is surrounded by an antigen presenting cell, the antibody will degrade into short peptides. Under these circumstances many therapeutic molecules will still be chemically cross-linked to the short peptides. If one of the peptides linked to the therapeutic molecule has a high affinity for a particular C molecule, it will appear well on the cell surface of the antigen presenting cell. This will effectively induce immunity to therapeutic molecules.
  • cDNA (about 0.5 g) ⁇ synthesized in US Pat. Nos. 8, 008, and 448 to perform PCR reactions, 60 pmol of forward and reverse primers, 10 ⁇ 10 PCR buffers, 8 2.5 mM dNTP traces, respectively.
  • the mixture and 0.5 ⁇ Taq polymerase were mixed and 100 distilled water was added thereto.
  • DNA amplified by the above process was subjected to electrophoresis on 1% agarose gel and purified using QIAquick gel extraction kit (QIAquick gel extraction kit, Qiagen, USA). ⁇
  • (1-3) Amplification of the light chain In order to perform PCR for amplifying the light chain, the antibody light chain variable region (V) of rabbits prepared and purified in Examples (1-1) and (1-2) L ) and human antibody light chain blunt regions (CK) were combined by overlap extension PCR to prepare light chain genes. Specifically, except for using 100 ng of V L and CK PCR products, respectively, the forward and reverse primers of the anti-cotinine rabbit / human chimeric antibody light chain (SEQ ID NOS: 7 and 8) for PCR reaction, respectively. PCR was carried out in the same manner as in Example (1-1). Then, amplified DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and purification in the same manner as in Example (1-1).
  • Example (5) Preparation of an expression vector comprising an anti-cotinine rabbit / human chimeric gene
  • a light chain PCR product prepared and purified in Example (1-3), and in Example (2-4)
  • the purified heavy chain PCR product was purified by restriction enzymes Hindi II / XbaI (NEB, USA) and restriction enzymes BamHI / Nhel (NEB, USA), cleaved pure and inserted into the site of the expression vector (pcDNA3.1) multiple clonining site (MCS).
  • Example 2 Purification of Anti-Cotinine Rabbit / Human Chimeric IgG Expression and In Vitro Assay
  • Expression mammalian CHO DG44 (invitrogen, USA) cells were transfected with expression vector DNA comprising an anti-cotinine rabbit / human chimeric IgG gene Injected.
  • Transfected cells were added to a CDOptiCHO TM expression medium (GIBC0) containing 100 U / ml penicillin and 100 g / ml straptomycin (GIBC0, USA) to add 500 ug / ml G418 at 37 ° C. and 135 rpm. Incubated with.
  • GIBC0 CDOptiCHO TM expression medium
  • lane 1 is a size marker
  • lane 2 is an unreduced anti-cotinine IgG (150 KDa)
  • lane 3 is a reduced anti-cotinine IgG that is light (25KDa) and heavy (50 KDa) Im knowing.
  • Example 3 Preparation of Conjugates of Cotinine and Conjugates (3-1) Conjugate Peptides of Cotinine and Peptides WKYMVm-NH 2 peptide (WKYMVm-NH 2 , SEQ ID NO: 1) ' and wkymvm-NH 2 peptide (wkymvm- NH 2 , SEQ ID NO: 2) was used.
  • WKYMVm-NH 2 and wkymvm-N3 ⁇ 4 were synthesized in an ASP48S peptide synthesizer by solid phase peptide synthesis. Afterwards, purified by reverse phase HPLC (> 95% purity) using Vydac Everest C18 column (250 ⁇ X 22 mm, 10 ⁇ ), and confirmed peptide size by LC / MS (Agilent HP1100 series) (> 95% purity).
  • the method for preparing a conjugate of cotinine and a peptide is the basic peptide
  • WKYMVm-N3 ⁇ 4 and wkymvm-NH 2 peptides synthesized above and cotinine-peptide conjugates were dissolved in DMS0 and stored at -20 ° C.
  • the structure of the cotinine-WKYMVm-NH2 conjugate thus prepared is shown in FIG. 2.
  • Cotinine-AS1411, Cotinine-CR026, and Cotinine-Pegaptanib the conjugates of cotinine and aptamers, are 3 'to 5' in an oligonucleotide synthesizer by solid phase oligonucleotide synthesis. After synthesis, amino C6 linker (ST Pharm, Korea) was added at the end of the synthesis. It was then purified (> 95% purity) by reversed-phase high-pressure liquid chromatography using Xbridge Prep C18 column (5 ⁇ , 10 x 150 mm, Waters Corp., USA), followed by MS (mass spectrometry) to determine the size of the aptamers.
  • Xbridge Prep C18 column 5 ⁇ , 10 x 150 mm, Waters Corp., USA
  • Cotinine-AS1411 and cotinine-CR026 synthesized above are dissolved in distilled water, and cotinine-pegotanib is RNA, so it is dissolved in distilled water treated with diethyl pyrocarbonate, and then allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes, at room temperature. After cooling slowly for 30 minutes, it was stored at -20 ° C.
  • the structures of the cotinine-AS1411 and the cotinine-pegatannib thus prepared are shown in FIG. 3.
  • Conjugates of cotinine and absiximab were prepared using the active ester method. 0.1 mmol of cotinine was added to 1 ml of DMF, and then dissolved at room temperature. Then, a small amount of DMAP, DCC 0.118 ⁇ ol, and NHS 0.12 ⁇ were added and then rotated at room temperature for 4 hours. Only the supernatant was separated by centrifugation at 10000 xg for 30 minutes. 20 mg of Apsimab was dissolved in 2 ml of carbonate buffer, 1 ml of DMF was added, and the supernatant was slowly added and rotated at room temperature for about 3 hours. Thereafter, the conjugate was prepared by dialysis at 4 ° C. for 6 hours or more and centrifugation to obtain only the supernatant.
  • the conjugate of cotinine and insulin was prepared in the same manner as in the preparation method of the conjugate of cotinine and absiximab of Example 3-3.
  • Example 4 Preparation of a Complex Comprising a Conjugate Conjugate of Cotinine with a Conjugate Substance and an Anti-Cotinine Antibody Cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / anti-cotinine IgG complexes were prepared as follows. Test Example 1 Analysis of Affinity of Anti-Cotinine Rabbit / Human Chimeric IgG to Cotinine The affinity of anti-cotinine rabbit / human chimeric IgG to cotinine was determined by BIAcore.
  • CM5 carboxymethyldextran-modi f ied (CM5) sensor chip (Biacore AB) with the amine coupling kit (Biacore AB) was flowed along with a 10 mM sodium acetate complete solution (pH 4.0) at a rate of 5 minutes.
  • Cotinine-OVMovalbumin was immobilized.
  • Anti-Cotinine rabbit / human chimeric IgG antibody dissolved in PBS (pH 7.4) containing 0.005% TR20 (sigma, USA) was chipped at a rate of 30 minutes at 25 ° C. Injected into.
  • Anti-Cotinine rabbit / human chimeric IgG antibody was diluted at a concentration of 0.15625-10 nM.
  • the surface was regenerated with 1M NaCl / 50mM NaOH, and the kinetic constants (kon and koff) and equilibrium dissociation constants were analyzed using BIA evaluation software.
  • Test Example 2 Semi-Amplification Experiment of Cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / Anti-Cotinine IgG Complex on Cell Receptor Flow rate to confirm that the cotinine-WKYMVm-N / anti-Cotinine IgG complex binds to the cell receptor of WKYMVm-N3 ⁇ 4, FPR2 Flow cytometry was performed.
  • RBL-2H3 cells (Yoe-Sik Bae et al J Immunol 2004; 173; 607—614) transfected with FPR2 or vector (pcDNA3.1) were transferred to 37 ° C in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS). And 5% C0 2 conditions. Thereafter, 1 ⁇ 10 5 cells were dispensed per well of a 96-well plate and washed twice with PBS and once with assay buffer (containing 1% FBS and 0.02% sodium azide in PBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the IgG complex was diluted in assay buffer, added 50 ⁇ l, and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • cotinine-WKYMVm_N3 ⁇ 4 was tested for 4 concentrations of 0, 1, 10 and 100 nM, and anti-cotinine IgG was fixed at 100 nM.
  • transfected FPR2 to another control group injected RBL-2H3 cells to cotinine -WKYMVm-NH 2 / non-specific Ig0 (Pal ivizumab; Sina Registry (Synagis) ®; Abbot
  • FTTC-labeled monoclonal anti-human Fc specific IgG (Thermo Fisher Scientific, USA) was diluted 1: 100 in assay buffer and 50 ⁇ was added to each well. , Reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the cells were then washed twice with assay buffer and then resuspended with PBS, fixed with 2% paraformaldehyde (l: l (v / v)) and then FACSCanto TM II flow cytometer (BD). Data was analyzed using flowJo data analysis software (Treestar, USA). The results are shown in FIG.
  • the cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / anti-cotinine IgG complex specifically binds to RBL-2H3 cells transfected with FPR2, and the binding force increases as the concentration of cotinine-WKYMVM-N3 ⁇ 4 increases.
  • Intracellular calcium concentration [Ca 2+ ] i) was determined by Grynkiewicz's method using Fura-2 / ⁇ (Grynkiewicz G. et al., J Biol Chem. 260 p3440-34501985).
  • Neutrophils were freshly separated from human peripheral blood using dextran sedimentation, hypotonic lysis of erythrocytes, and lymphocyte separation medium gradient. Then, 3 ⁇ diluted in 4 mL fresh serum-free RPMI 1640 here Fura-2 / ⁇ was added and incubated at 37 ° C for 50 min with continuous stirring. After washing three times with serum-free RPMI 1640, 1 ml Radix- Ca 2+ Locke solution (154 mM NaCl, 5.6 mM KC1, 1.2 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES [pH 7.3], 10 mM glucose, and 0.2 mM EGTA) 2 x 10 6 cells were dispensed.
  • WKYMVm-N (1, 2.5, 5, 10 and 100 nM)
  • cotinine -WKYMVm_NH 2 (1, 2.5, 5, 10 and 100 ⁇ )
  • cotinine WKYMVm-NH 2 (1, 2.5, 5, 10 and 100 nM) / anti-cotinine IgG complex (molarity 2: 1) were added respectively.
  • the experimental group treated with non-specific peptides wkymvm-NH2 (100 nM), cotinine -wkymvm-N3 ⁇ 4 (100 nM), and cotinine -wkymvm_NH 2 (100 nM) / 50 nM anti-cotinine IgG were used as a comparison group.
  • WKYMVm-NH 2 As shown in Figure 6, WKYMVm-NH 2, cotinine -WKYMVm-NH 2 and cotinine -WKYMVm-NH 2 / anti-IgG conjugate is cotinine concentration dependent
  • human neutrophils dispensed with 2 ⁇ 10 6 in RPMI 1640 medium were preincubated at 50 ⁇ cytochrome c and 37 ° C. for 1 minute, followed by WKYMVm-NH 2 (0, 10, 100 and 1,000). nM), Cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 (0, 10, 100 and 1,000 nM), and Cotinine-WKYMVm-NH 2 (0, 10, 100 and 1,000 nM) / anti-Cotinine IgG (molar ratio 2: 1) respectively I was.
  • the change in absorbance at 550 nm according to the cytochrome c reduction was measured at 1 minute intervals using a spectrophotometer (spectrophotometer, EL312e; Bio-Tek instruments, Winooski, VT) for 5 minutes.
  • the absorbance value at 0 min was then subtracted from the measured hop absorbance and divided by the extinction coefficient 0.022 ⁇ ⁇ 1 to express it in nanomolar units. The results are shown in FIG.
  • the upper wells of the multiwell chamber are WKYMVm-NH 2 (0, 10 or 100 nM), Cotinine -WKYMVm_NH 2 (0, 10 or 100 nM) and Cotinine -WKYMVm-NH 2 (0, 10 or 100 nM) / term—
  • the fixed filter was treated with 90%, 80% and 70% ethane, and deionized water in that order, dried in air and then dyed with hemaroxylin (Sigma-Aldrich, USA). It was. Stained cells from each well were randomly selected and counted five times in high-power fields (400 ⁇ ). The results are shown in FIG.
  • Cotinine WKYMVm- ⁇ 2 (0.5 mg / kg), and Cotinine-WKYMVm—NH 2 (0.5 mg / kg) / in male wild-type albino ICR mice at 4-6 weeks of age (Institute of Cancer Research Center, ORIENT BIO Inc. Korea).
  • Anti-Cotinine IgG (10 mg / kg) complexes were each diluted in 100 ⁇ PBS and injected into the tail vein.
  • peripheral blood was obtained by orbital plexus at 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, and 24 hours after injection. And 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 after injection in rats injected with the cotinine-WKYMVm-NH 2 / anti-cotinine IgG complex.
  • Peripheral plexus was performed at 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours to obtain peripheral blood. 30 minutes at room temperature for each peripheral blood. After standing, the cells were centrifuged at 800 g for 15 minutes to collect only supernatants, and serum was analyzed using flow cytometry.
  • FPR2 transformed injected RBL-2H3 cells were 1X10 5 gae the common compounds and banung between at 4 ° C 30 min. After washing twice with assay buffer, FTTC-labeled monoclonal anti-human Fc specific IgG (Thermo Fisher Scientific, USA) was diluted 1: 100 in assay buffer and added to each well to 20 at 4 ° C. Reaction for minutes.
  • Each well of a 96-well ELISA plate was coated overnight at 4 ° C using 5 ⁇ cotinine-BSA dissolved in PBS and blocked with PBSB (3% BSA in PBS).
  • the serum obtained above was diluted in PBSB (1:10 to 1: 1000) and then 50 ⁇ was added to each coated well. Then, it was left at room temperature for 1 hour and PBS-T (0.0 tween20 in PBS).
  • Each well was added with an HRP bound sheep anti-human Fc specific IgG (Thermo Fisher Scientific) using ABTS (one-step ABTS solution, Sigma) as substrate and left at room temperature for 30 minutes, followed by 405 Optical density was measured at nm. The results are shown in FIG.
  • Test Example 6 Therapeutic Effect of Cotinine-WKYMVm-N3 ⁇ 4 / Anti-Cotinine IgG Complex in Mouse Sepsis Model
  • mice were divided into 6 groups of 20 animals in each group, and cotinine-WKYMVm-NH 2 (0.4 mg / kg and 0.04 mg / kg) / anti-cotinine IgG (18 mg) for 2 days at 2 hours after 2 hours after CLP.
  • the experimental group injected with the cotinine-WKYMVm-Niy antimycotinine IgG complex showed a survival rate of about 80%. This was relatively improved compared to the survival rate of the cotinine -WKYMVm-N3 ⁇ 4 experimental group (40%), the survival rate of the W YMVm-NH 2 experimental group (45%), and the survival rate of the PBS vehicle control group (20%).
  • the orbital plexus was used to obtain the peripheral blood, which was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, followed by centrifugation at 800 ) for 15 minutes to collect the supernatant, and the serum was collected and analyzed by ELISA. It was.
  • Each well of a 96-well ELISA plate was coated overnight at 4T: using 50 ng of human VEGF dissolved in PBS and blocked with PBSB. Each serum was then diluted 1: 100 in PBSB and then added to each well with 100 nM anti-cotinine IgG. After standing at room temperature for 1 hour and washing with PBS-T, HRP-coupled rabbit anti-human Fc specific IgG (Thermo Fisher Scientific) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Following,
  • the serum half-life of the cotinine-pegatanib / anti-cotinine IgG complex was significantly increased compared to cotinine-pegatannib.
  • the concentration at 0 hours is also large, which means that as soon as cotinine-pegotanib enters the body, it is degraded, whereas the injection of cotinine-pegotanib / anti-cotinine IgG complex causes the rapid breakdown of cotinine-pegotantim. Inhibition was predictable.
  • Test Example 8 Biological Analysis of Cotinine-Aptamer / Anti-Cotinine IgG (8-1) Cotinine-AS1411 / Anti-Cotinine IgG Complex against Nucleolin on the Surface of Cotinine-Aptamer / Anti-Cotinine IgG Cells Combination of
  • Raji Human Bucket Lymphoma, American Type Culture Collection, USA
  • cells were dispensed at 1 ⁇ 10 5 cells per well and the cotinine-AS1411 (1, 10, 50 and 100 nM) / anti-cotinine IgG (100 nM) complexes.
  • Treatment at 50ul / sample at 4 ° C The reaction was then performed for 20 minutes.
  • FITC-labeled monoclonal anti-human Fc specific IgG Dilute 1: 100 in assay buffer, add to each well and react for 15 minutes at 4 ° C.
  • a cotinine-CR026 / anti-cotinine IgG complex prepared using CR026 (ST Pharm. Korea), which is a nonspecific aptamer, and palivizumab (Abbot Laboratories, Kent, a nonspecific antibody, as a control antibody).
  • CR026 ST Pharm. Korea
  • palivizumab Abbot Laboratories, Kent, a nonspecific antibody, as a control antibody.
  • the same procedure was performed using the cotinine-AS1411 / Palivizumab complex prepared in the UK).
  • FITC-labeled monoclonal anti-human Fc specific IgG (Thermo Fisher Scientific) was reacted to cells with background contr, and subsequent reactions were performed in the same manner as above.
  • the cells obtained above were washed twice with assay buffer and then resuspended in PBS,
  • the cotinine-AS1411 / anti-cotinine IgG complex increased the binding strength of the cell surface to nucleoline as the concentration of cotinine-AS1411 increased.
  • no binding to nucleolins was observed for complexes comprising nonspecific aptamers (CR026) or nonspecific antibodies (palivizumab).
  • HepG2 human hepatocellular carcinoma
  • U87MG human glioblastoma
  • NIH3T3 mouse embryonic fibroblast
  • the protein was transferred to Whatman, Germany, followed by 30 at room temperature with TBST (10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, and 0.1% Tween-20) containing 5% skim milk (BD Biosciences Diagnostic Systems, USA). Shake was incubated for a minute, and incubated with cotinine-AS1411 (100 nM) / anti-cotinine IgG (50 nM) complex for 2 hours at room temperature.
  • TBST 10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, and 0.1% Tween-20
  • skim milk BD Biosciences Diagnostic Systems, USA
  • the experimental group of the cotinine-ASWI IOO nM) / nonspecific antibody (palivizumab) (50 nM) complex and the cotinine-CR026 (100 nM) / anti-cotinine IgG (50 nM) complex was used.
  • 1 tng of Raji cell lysate was cotinine-AS1411 (40 nM) / anti-cotinine IgG (20 nM) complex, cotinine CR026 (40 nM) / anti-cotinine IgG (20 nM) complex, and cotinine-AS1411 (40 nM) Left unrotated overnight at 4 ° C with nonspecific antibody (20 nM) complex.
  • Protein A-sepharose beads were added to each sample 40 ⁇ 1 and rotated, left for 2 hours at 4 ° C and then centrifuged at 800 g for 1 minute. The immunoprecipitated pellets were then washed three times with wash buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, and 1% Triton X-100). 4XSDS loading buffer was added and boiled at 95 ° C for 10 minutes to denature the protein, followed by immunoblot (i ⁇ unoblot). Primary anti-nucleoline IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) was added to 0.23 ⁇ 4 TBST as the primary antibody.
  • the mixture was diluted to 1: 100 and left for 2 hours at room temperature.
  • the rabbit anti-mouse IgG attached with HRP as a secondary antibody was diluted 1: 5,000 and added at room temperature.
  • Each well of a 96-well ELISA plate was coated overnight at 4 ° C using 50 ng of human VEGF dissolved in PBS and blocked with PBSB. 100 nM-Cotinine-Pegaptanib / 50 nM anti-Cotinine antibody complex was added to each well coated with 50 ⁇ dilution 10 times after dilution in PBSB. Then, it was left at room temperature for 1 hour and washed with PBS-T. At this time . For comparison, the same experiment was repeated using 100 nM bevacizumab, an antibody against VEGF, instead of the complex.
  • the cotinine-pegatanib / anti-cotinine IgG complex increased binding capacity in a concentration-dependent manner of cotinine-pegatannib at a range of 0.1 to 1,000 pM with respect to VEGF. This was similar to the binding of the anti-VEGF antibody bevacizumab to VEGF in a concentration-dependent manner.
  • Test Example 9 Reaction of Cotinine-Aspiximab / Anti-Cotinine IgG Complex
  • Reactivity to integrin alpha 2bbeta 3 was measured using 0.001 nM-1000 nM of apsiximab and cotinine-apsicsimab.
  • the luM anti-cotinine IgG antibody was used.
  • metal buffer 25 mM Tris-Cl, 137 mM NaCl, ImM MgCl 2 , lml CaCl 2> ImM MnCl 2 and ImMKCl; pH 7.5 l of dissolved 100 ng of integrin alpha 2b beta 3 was added to each well.
  • the wells of a 96-well half-area microtiter plate were then coated with integrin alpha 2bbeta 3 by incubating for 2 hours at 37 ° C.
  • the wells were coated with 150 ⁇ l PBSB (3 in BBS) BSA). Blocking at 37 ° C. for 1 hour.
  • 3 ⁇ 4Siximab / Cotinine, and Absiximab, with or without anti-cotinine antibody, were adjusted to varying concentrations in 3> PBSB, with the final 50 ⁇ 1 applied to each well.
  • the plates were incubated at 37 ° C. for 1 hour and washed three times with PBS (PBST) containing 0.05% Tween 20 and then treated with anti-human Fc-HRP to treat cotinine-apsimab / anti-cotinine IgG antibodies.
  • the complex was detected and treated with anti-human Fab-HRP to detect cotinine-apsiximab and apsiximab, respectively.
  • the cotinine-absiximab / anti-cotinine antibody complex of the present invention maintains the same reactivity with inxgrin alpha 2b beta 3 as apsiximab.
  • Platelet rich plasma was transferred to a new leucine and rotated at 1500 rpm for ⁇ minutes at room temperature. The supernatant was removed and platelets were plated in 1 ml of Tyrode's buffer (137 mM NaCl, 2.7). mM KC1, 2 mM MgCl, 0.5 mM NaH 2 P0 4> 5 mM glucose 10 mM HEPES and 0.2% BSA; pH 7.4).
  • BSA metal buffer 25mMTris—CI, 137mM NaCl, lmMMgCl 2 , lml CaCl 2 , ImM MnCl 2 and ImM KC1; pH 7.5; ) was resuspended at 300 ⁇ l. 50 ⁇ , of the prepared PRP suspension was subjected to FACS analysis. Various concentrations of Apsimab-Cotinine 25 ⁇ 1, and anti-Cotinine antibody or Synagis ® 25 ⁇ 1 were applied for 45 minutes at room temperature in 0.1% BSA layered metal buffer.
  • a secondary antibody anti-human Fc-FITC was applied to 50 ⁇ l of metal buffer supplemented with 0.1% BSA at a concentration of lug / ml and left for 30 minutes at room temperature under dark conditions. The cells obtained were then washed twice with the same buffer and resuspended in 100 u 1 of PBS. Two cell lines were subjected to fluorescence analysis using a FACScan fluorescence activated cell analyzer (BD Biosciences). The result is shown in FIG.
  • the voice is the state or control antibody Registry (Synagis) anti-cotinine antibody was treated with the same concentrations and, as a positive control was used during aepsik Thank (OnM, 5nM and 50 nM) '.
  • the cotinine-absiximab / anti-cotinine antibody complex maintained the same responsiveness as axiximab to platelets and bound as the concentration of cotinine-absiximab or anti-cotinine antibody increased. Also increased. In contrast, FBL-Cotinine treated with anti-Cotinine antibody (lOuM) did not bind to platelets.
  • Test Example 10 Response of Cotinine-Insulin / Anti-Cotinine Antibody Complex (10-1) Specific binding test of MCF-7 and SK-Br-3 cells of the cotinine-insulin / anti-cotinine antibody complex Specifically, SK-Br-3 or MCF-7 cells (insulin receptor positive breast cancer cell line ) (ATCC, USA) (1 10 6 / reaction) was washed three times with FACS buffer (PBS, 1% FBS and 0.02% sodium azide). Cotinine-insulin 25 ⁇ 1 at various concentrations (0-5000 nM), and anti-cotinine antibody ( ⁇ , ⁇ ) or 25 ⁇ 1 of Sinagis ( ⁇ , ⁇ ) were applied in FACS buffer for 45 minutes at room temperature.
  • FACS buffer PBS, 1% FBS and 0.02% sodium azide
  • the cotinine-negative peptide conjugate is cotinine-FBL (SEQ ID NO: 19) conjugate, which is a follicular B lymphocyte binding peptide, and cotinine-A13 conjugate (apelin receptor) binding peptide.
  • Conjugate, and cotinine-F13A conjugate were used. (STPhara, South Korea) The results are shown in B of FIG.
  • the insulin-cotinine / anti-cotinine antibody complex successfully binds to cells expressing the insulin receptor, indicating that the complex maintains the receptor binding ability of insulin.
  • MCF-7 cells expressing insulin receptors were washed with assay medium (DMEM, 1% FBS) and diluted to 1 ⁇ 10 5 / ml. 100 ⁇ of the cell suspension was added to each well in sterile 96-well tissue culture plates and incubated overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator to allow cells to adhere well. 25 ⁇ l Cotinine-insulin, 25 ⁇ l of various concentrations (0, 0.1 and 1 uM) of anti-Cotinine antibody, and 50 ⁇ 1/12 human complement after removal of assay medium from the cells. Well sets containing complement di kit ions were incubated in 37 ° C. and 5% CO 2 incubators to promote complement-mediated cell lysis.
  • assay medium DMEM, 1% FBS
  • the human complement of anti-cotinine antibody allows the cotinine-insulin / anti-cotinine antibody complex of the present invention to act as a cytotoxic agent specific for insulin receptors that overexpress breast cancer cells. It was found to maintain dependency toxicity ability.
  • Test Example 11 VH, VL from the amino acid sequence (US 6,355,245 B1) of an immunoglobulin eculizumab having binding capacity to human complement C5 Using only the sequence, the scFv was combined and placed in the first scFv of the cotinibody (antibody ScFv that binds to cotinine).
  • the vector was transformed into a 293F cell line to express the protein, and then subjected to affinity chromatography using protein A agarose to purify the antibody from the cell culture.
  • Human serum 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 (lane 1, 2, 3, 4)
  • L y being diluted human complement C5 100ng (lanes 5)
  • SDS-PAGE Electrophoresed protein was then conducted to the nitrocel membrane.
  • Human complement C5-cotinibody protein was diluted in 5% skim milk in Tr is—buffered saline solution to 2 ⁇ g / mL and reacted for 4 hours at 4 ° C in contact with the membrane.
  • the membrane was washed with TBS solution containing 0.2% Tween 20, and a 1/1000 dilution of horseradish peroxidase-bound cotinine was reacted with the membrane at room temperature for 2 hours. Thereafter, the membrane was washed with a TBS solution containing 0.2% Tween 20, treated with chemi luminescent material, and then exposed to a film. It was confirmed that human complement C5-cotinibody selectively binds to human complement C5 (FIG. 23).

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Abstract

본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복합체는 생체외 생물학적 분석 방법(in vitro biological assay)에 있어서 분석 도구로 사용될 수 있으며, 접합 물질의 특이적 반응성 및 생물학적 기능과, 항체의 고유 특성인 보체 매개 세포 독성(CDC), 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있다.

Description

접합물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및
이의 용도
발명의 분야 본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다. 배경기술 수많은 펩타이드 및 앱타머 바이오 의약품은 후보 약물 (drug candidate)로서 유망한 특성을 지니고 있으나, 단백질 분해효소 (proteinase), 펩타이드 분해효소 (peptidase) 및 핵산 분해 효소 (nuclease) 등에 의해 몸 안에서 쉽게 분해되거나 또는 신장을 통해 빠르게 배출되기 때문에 수 분 내지 수 시간 정도로 체내 반감기가 짧은 것으로 알려져 있다 (Sato A.K. et al . , Curr Opin Biotechnol, 17， 638-642, 2006). 이러한 불안정성 및 짧은 약효지속시간에 따른 문제점을 해결하기 위하여 일반적으로 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG)을 접합시켜 (Veronese, F.M. &Pasut G. , Drug Discov Today, 10， 1451-1458, 2005), 체내 효소에 의한 분해를 저해하고 신장과 혈관에서의 흡수를 억제하여 혈중 체류시간을 연장하는 기술이 시행되고 있다. 그러나， 이러한 페길화는 시간이 오래 걸리고, 접합 물질에 따라 특정한 최적화 (specific optimization)가 요구될 뿐만 아니라, PEG가 매우 이질적 (heterogenous)으로 접합하기 때문에 다양한 분자 결합체가 생산된다는 문제점이 있다.
신규한 전달 흘랫품 (Novel delivery plat form)으로 사용하기 위한 목적에 비추어 볼 때， 합텐 (hapten)은 동물과 사람에게 반드시 무독해야 하고， 생리적 활성이 없어야 한다는 조건을 만족시켜야 한다. 코티닌 (cotinine)은 니코틴의 주요한 대사산물로서 인류는 오랜 기간 니코틴에 노출되어 왔다. 따라서, 코티닌은 신규한 전달 플랫품에 적용하기에 적합한 합텐이다. 또한 코티닌은 쥐에서의 LD50가 2-4 g/kg 정도로 상대적으로 매우 안전한 물질이며 (Ri ah 0. et al. , Toxicol. Lett. , 109, 21-29, 1999), 하루에 1.8 g씩 4 일간 복용하였을 경우에도 별다른 부작용이 보고되지 않았다 (Bo丽 an, E.R. & Mc, K.H.， Jr., J. Pharmacol. Exp. Ther. , 135, 306-311, 1962). 또한， 포유동물에서 코티닌의 물질대사과정이 잘 밝혀져 있고， 혈청 반감기가 약 16 시간이라는 사실도 잘 알려져 있다 (Benowitz N丄. et al. , 3rd Handb. Exp. Pharmacol. , 29-60, 2009) . 더불어 인간에게 있어 코티닌은 생리적 활성올 나타내지 않으며 3일 동안 최대 160 mg의 코티닌을 흡수할 경우에도 어떠한 생리적 및 행동 변화도 보고된 바 없다 (Hatsukami， D. . et al . , Pharmacol. Biochem. Behav. , 57， 643-650 , 1997) , 한편， 앱타머는 특이적이고 삼차원적인 형태로 폴딩될 수 있어 항체와 유사하게 표적에 고-친화적, 특이적 결합이 가능하므로 다양한 분석과 실험에 사용되어 왔다. 앱타머를 이용한 항체와의 복합체를 제조하는 기존의 방법들은 주로 앱타머를 바이오틴 (biotin) 및 디그옥시게닌 (digoxigenin)에 접합시킴으로써 아비딘 (avidin) 및 항-디그옥시게닌 항체와 복합체를 이루는 방식이었다.
본 발명자들은 코티닌을 합텐으로 이용하여 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제조하였으며， 상기 복합체가 접합 물질의 특이적 반응성 및 생물학적 기능과， 항체의 고유 특성인 보체 매개 세포 독성 (complement -mediated cell cytoxicity, CDC), 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 발명의 요약 따라서， 본 발명의 목적은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체외 생물학적 분석 방법 vitro biological assay)에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것아다 .
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성을 야기하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 생체외 생물학적 분석 방법에 있어서， 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 도면의 간단한설명 본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다. 도 1 은 실시예 2 에서 정제된 항—코티닌 항체에 대해 쿠마시 염색을 수행한 겔 사진이다.
도 2 및 3 은 실시예 (3-1)에서 합성한 코티닌 -WKYMVm-NH2 접합체, 및 실시예 (3-2)에서 합성한 코티닌 -AS1411 및 코티닌-페갑타님 접합체의 구조식을 나타낸 것이다.
도 4 는 시험예 1 에서 수행한 코티닌에 대한 항-코티닌 IgG 항체의 친화성을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5 는 코티닌 - KYMVm-NH2/항—코티닌 IgG복합체의 FPR2 세포 수용체에 대한 특이적 결합력을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 6 내지 8은 각각 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG복합체의 세포 내 칼슘 농도 변화， 초과산화물 발생 정도 및 주화성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9는 코티닌 -WKYMVm-NH2 접합체， 및 코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체의 마우스에서의 체내 반감기를 비교한 그래프 및 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 10은 항—코티닌 IgG의 혈청내 체내 반감기를 나타낸 그래프이다. 도 11 은 코티닌 -WKYMVm-N¾/항—코티닌 IgG복합체의 패혈증 모델에서의 개선된 치료 효율을 보여주는 그래프이다.
도 12 는 마우스에서 코티닌-페갑타닙 접합체， 및 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 IgG복합체의 체내 반감기를 비교한 그래프이다. 도 13 및 도 14 는 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체의 뉴클레올린 세포 수용체에 대한 특이적 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15 는 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 16 은 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 이용한 뉴클레올린의 면역 침강 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 IgG복합체의 VEGF에 대한 결합성을 나타낸 그래프이다.
도 18 은 앱식시맙, 앱식시맙-코티닌 접합체 및 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 IgG 복합체의 인테그린 알파 2b 베타 3 에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 IgG복합체의 혈소판에 대한 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 20 은 코티닌—인슬린 /항-코티닌 항체 복합체의 MCF-7 및 SK-Br-3 세포에 대한 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 21 은 코티닌-인슬린 /항-코티닌 항체 복합체의 보체 의존성 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22 는 접합물질과 코티닌의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 나타내는 것이다.
도 23은 세포배양액으로부터 사람 보체 C5에 대한 ScFv항체를 정제하기 위하여 protein A agarose를 이용한 .affinity chromatography를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 발명의 상세한 설명 이하， 본 발명에 대해서 보다 상세하게 설명한다.
본원에서 "항체''는， 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메릭 (chimeric)항체， 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편， 예컨대， Fab도 포함한다.
본원에서 "키메릭 항체" 는, 항체 가변영역 (variable region) 또는 이의 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region, CDR)이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는， 예를 들어， 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면， 마우스， 토끼， 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역 (constant region)은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
본원에서 "중쇄" 는， 항원에 대한 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열흘 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인인 CHI, CH2 및 CH3 을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본원에서 "경쇄" 는， 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본원에서 "상보성 결정 영역" 은 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본원에서 "접합체" 는， 이형성 분자로서, 폴리머 분자, 친유성 화합물， 탄수화물 부분 또는 유기 유도화 (derivatizing)제와 같은 한 개이상의 비 -폴리펩티드 부분， 특히 폴리머 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드， 전형적으로는 하나의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 추가적으로， 접합체는 하나 이상의 탄수화물 부분에， 특히 N- 또는 0- 글리코실화를 이용하여 부착될 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비 -폴리펩티드 ^분을 직접적으로 서로 공유결합시키거나 연결 다리, 스페이스ᅳ 연결 부분， 또는 부분과 같은 중개부분 또는 부분등을 통하여 서로 간접적으로 공유결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들어，본원에 개시된 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체가 본 정의에 포함된다. 본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공한다 (도 22).
또한， 본 발명은 생체외 생물학적 분석 방법 (/Λ vitro biological assay)에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 생체외 생물학적 분석 방법은 유동 세포 분석법， 웨스턴 블롯 분석법, 면역침강 분석법 및 효소-링크된 면역화학 분석법으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는 코티닌을 합텐으로 이용함으로써 접합 물질 및 항체 고유의 특성을 모두 보유할 수 있다.구체적으로,상기 복합체는 분자의 특이적 반응성 및 기능과， 항체의 특성인 보체 -매개 세포 독성 (CDC), 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 접합 물질올 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성올 야기하는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 복합체는 한 종의 항체와 코티닌으로 이루어지기 때문에， 짧은 서열의 접합 물질을 코티닌에 단순히 접합시킴으로써 제조될 수 있으므로， 고집약적이며 개발이 쉽고 간단한 형태의 전달 플랫품으로 작용할 수 있다. 따라서， 본 발명에 따른 복합체는 코티닌에 접합된 접합 물질에 의해 항원 반웅성 (antigenic reactivity)이 결정되는 신규 항체로서, 분자 고유의 생물학적 또는 화학적 기능을 나타내는 치료 항체로서 사용될 수 있다. 코티닌은 담배 연기의 주 성분인 니코틴의 주요한 대사산물로서, 인간이 오랜 세월 담배 연기에 장시간 노출되어 왔음에도 블구하고 아주 적은 양의 즉각적인 독성만이 현재까지 보고되어 왔기 때문에 상당히 안정한 분자로 알려겨 있다. 코티닌의 이러한 상대적인 비독성 특성은 코티닌이 생체내 ' ra)에서 사용될 이상적인 분자용 접합체가 되도록 만들어 준다. 본 발명에서는 코티닌을 접합 물질과 접합시킴으로써， 상기 접합 물질의 짧은 반감기를 월등히 향상시킬 수 있다. 본 발명에서 접합 물질이라 함은, 특정 치료활성 혹은 결합반응성 등을 나타내는 다양한 생물적， 화학적 물질일 수 있다.
상기 접합 물질은 예를 들어， 펩타이드， 앱타머， 호르몬， 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며， 바람직하게는， WKYMVm- ¾ 펩타이드 (WKYMVm-N¾)， wkymvm-NH2 펩타이드 (wkymvm-NH2)， AS1411 ¾타머， 페갑타닙 (pegaptanib), 앱식시맙 및 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 앱식사맙 (abciximab,
ReoPro)은 혈소판의 표면에서 광범위하게 발현되는 인테그린 알파 2b 베타 3 (integrin alpha2b beta3)에 반웅성을 나타내는 마우스 /인간 키메릭 Fab이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면， 상기 앱식시맙을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-앱식시맙 접합체， 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체 (이하， 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며, 상기 복합체는 인테그린 알파 2b 베타 3 및 혈소판에 대하여 ¾식시맙과 동일한 수준으로 반응성을 유지함을 알 수 있다 (본원 시험예 9， 도 18 및 19 참고). 본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 인슐린은 생체 내에서 탄수화물 및 지방의 물질 대사를 조절하는 데 중요한 호르몬이다. 인슐린은
2종의 폴리펩타이드 체인으로 구성되고, 21개의 아미노산 잔기로 구성되는 A 체인 내에 하나의 세포간 분자 이황화 결합 (intra molecular disulfide bond)ᅳ 및 30개의 아미노산 잔기로 구성되는 B체인에 A체인을 연결하는 2개의 세포내 분자의 이황화 결합 (inter-molecular disulfide bond)을 갖는다 (Ni col DS, Smith, LF. , Nature. 1960 Aug 6, 187:483-5， PubMed PMID: 14426955) . 본 발명의 일 실시양태에 따르면 , 상기 인슐린을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-인슐린 접합체， 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체 (이하， 코티닌-인슐린 /항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며， 상기 복합체가 인슐린 수용체를 발현하는 세포에 대하여 인슐린의 수용체 결합력을 유지함을 알 수 있다 (본원 시험예 10, 도 20 및 21 참고). 본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 WKYMVm-NH2 펩타이드는 항-패혈증 치료학적 펩타이드로서, 포르밀 펩타이드 수용체 (Formyl peptide receptors, FPRs)에 대한 길항제이며， 포식세포 (phagocyte)에서 화학 주성 이동 (chemotactic migration)을 유도하고 단핵세포 (monocyte)와 호중구 (neutrophil)의 초과산화물 (superoxide) 발생을 증가시켜 항생작용을 한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 WKYMVm-NH2 펩타이드를 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌 -WKYMVm-N 접합체 (도 2)， 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체 (이하，코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있다.구체적으로，상기 WKYMVm-NH2펩타이드 (문헌 [BaekSH, etaJ., J Biol Che . , 1996 Apr 5 ;271(14) :8170-5. PubMed PMID: 8626507]； 및 [Kim SD, et al. , J Immunol. 2009 Nov 1， 183(9)： 5511-7. PubMed PMID: 19843937] 참고)는 PEG(mini-PEG)를 링커로 사용하여 코티닌과 결합한다. 이 후， 항-코티닌 항체 (Park S, et al. , Clin Chim Acta. 2010 Sep 6, 411(17-18)： 1238-42. Epub 2010 May 11. PubMed PMID: 20438723)와 복합체를 형성할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 복합체는 유동 세포 분석법 (flow cytometry analysis)에서 포르밀 펩타이드 수용체를 발현하는 세포에 대해 반응성을 나타내며， 이를 통해 WKYMVm-NH2의 결합력이 보존되었음올 알 수 있다 (도 5 참고). 또한， 코티닌 -WKYMVm-NH2 접합체가 세포로부터 칼슘을 성공적으로 방출하는 것으로 보아 코티닌과 접합한 후에도 (YMVtn-N¾의 생물학적 기능은 유지되었음을 알 수 있다 (도 6 내지 8 참고). 뿐만 아니라， 패혈증 마우스 모델에서, 상기 코티닌 - YMVm-NH2/항-코티닌 항체 복합체를 투여한 군은 복용-의존적인 방식 (dose-dependent manner)으로 패혈증으로부터 마우스를 회복시킨 반면， 코티닌 -WKYMVm-N¾ 접합체만을 단독으로 투여한 군에서는 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 상기 복합체 내에서 WKYMVm- ¾ 펩타이드의 생물학적 치료 효능이 유지되었을 뿐만 아니라, 상기 항-코티닌 항체의 생체내 긴 반감기로 인하여 코티닌 - KYMVm-NH2 접합체의 반감기가 연장되었음을 나타낸다 (도 9 참고).
'
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 페갑타닙은 PEG화된 항 -VEGF 앱타머로서 , 혈관신생에 중요한 역할을 하는 VEGF 165에 결합한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면， 상기 페갑타닙의 핵산부분을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌 -페갑타닙의 접합체 (도 3 참고)， 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체 (이하， 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며， 상기 복합체는 생체내 반감기가 상당히 개선됨을 알 수 있다 (시험예 7 참고). 본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 AS1411 앱타머는 G-rich 올리고뉴클레오타이드로 암세포의 표면에 발현하는 뉴클레올린 (nucleolin)에 결합하여 암세포 내로 흡수 (uptake)되어 DNA 복제와 세포 증식 등의 뉴클레을린 의 정상적인 기능을 파괴하는 특징이 있다.
본 발명에서는 상기 앱타머의 5' 에 코티닌을 접합시킴으로써 항체와 안정적인 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면， 상기 AS1411을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌 AS1411의 접합체 (도 3 참고)， 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체 (이하， 코티닌 AS1411/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며， 상기 복합체는 AS1411 앱타머와 마찬가지로 VEGF에 대한 결합력을 유지함을 알 수 있다 (시험예 8 참고). 본 발명에서는 상기 접합 물질이 코티닌과 PEG 링커 (미니 PEG— 12) 또는 아미노 C6 링커로 연결되는 것을 특징으로 한다.
상기 코티닌과 접합 물질의 접합체는 항-코티닌 항체에 결합함으로써 본 발명의 복합체를 형성하는데， 이때 접합체는 항체의 중쇄 또는 경쇄에 결합될 수 있으며， 특히 항-코티닌 항체의 항원결합부위에 결합되는 것이 바람직하다. 한편， 본 발명에서 항-코티닌 항체는 고친화도의 항-코티닌 Fab • 항체 (미국 특허 US 8,008,448 B2 참고)를 IgG 형태로 제조 및 발현한 항체를 사용할 수 있다.
예를 들어， 상기 항-코티닌 항체는 다음과 같은 방식에 따라 제조될 수 있다. 상기 미국 특허 제 US 8,008,448 호에 기재된 방식을 변형하여 제조한 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 각각 발현 백터 (예를 들면， pcDNA3.1)에 삽입한다. 이어, 포유동물 세포에 형질전환시킴으로써 항체 단백질을 발현시킨 다음， 배양액을 통상의 방법으로 정제함으로써 본 발명에 따른 항-코티닌 IgG 항체를 얻을 수 있다.
이때 상기 포유동물 세포로는 포유동물 CHO DG44 세포 (인비트로젠， 미국)을 사용할 수 있고， 정제 방법으로는 배양액을 농축한 다음， 단백질 A 컬럼 (protein A column; Rep li gen, 미국)으로 정제하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 항—코티닌 항체는 상기 항체; Fab, ScFv 및 도메인 항체로부터 선택되는 항체 분절; 및 상기 항체 및 항체 분절을 구성성분으로 포함하고 있는 복합 단백질 (fusion protein)로 이루어진 군으로부터 .선택되는 것을 특징으로 한다. 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는, 1) 접합 물질올 코티닌과 접합시킨 접합체를 제조하는 단계; 2) 항-코티닌 항체를 제조하는 단계; 및 3) 상기에서 제조한 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체 및 항-코티닌 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다.
구체적으로，상기 방법은 a)접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 코딩하는 핵산 분자를 백터에 삽입하는 단계; b) 상기 백터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제조하는 것은， 임상단계에서 항—코티닌 항체 생산 시스템을 설정할 때 치료학적 항체를 만들어내는 유용한 방법이 될 수 있다. 새로운 치료학적 항체를 새롭게 (de novo) 개발하는 데에는 상당한 시간이 소요되지만， 본 발명의 복합체 제조방법을 이^하면 임상 단계에서 고속대량 방식으로 빠르고 쉽게 합성될 수 있는 소분자의 형태로 치료학적 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 코티닌과 접합 물질을 접합시키고 나면， 제조된 접합체에 항-코티닌 항체가 결합되어 복합체를 형성한다. 상기 항체의 항원 반응성은 코티닌에 접합된 접합 물질에 의해 생산될 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 복합체는 보체 -매개 세포 독성,항체-의존성 세포 독성， 및 긴 생체내 반감기를 포함하는 상기 항체의 모든 특징들을 유지한다.
접합 분자를 직접적으로 항체와 결합시키는 기존의 분자 -항체 접합체와 비교하여， 본 발명의 복합체는 면역학적 측면에서 추가의 이점올 나타낼 것으로 예상된다.
구체적으로， 기존의 치료학적 분자와 항체의 접합체는 합텐-캐리어 (hapten-carrier)로 이용될 수 있고, 항체에 직접적으로 결합된 분자에 대하여 면역학적 반웅이 즉시 발생될 수 있다. 상기 분자 -항체 접합체가 항원 제시 세포 (antigen presenting cell)에 의해 둘러 싸여지면， 상기 항체는 짧은 펩타이드로 분해될 것이다. 이러한 상황 하에서 수많은 치료학적 분자는 여전히 상기 짧은 펩타이드에 화학적으로 교차-링크될 것이다. 만일 상기 치료학적 분자에 링크된 펩타이드들 중 하나가 특정 丽 C 분자에 높은 친화성을 갖는다면 항원 제시 세포의 세포 표면에 잘 나타날 것이다. 이것은 치료학적 분자에 대한 면역성을 효율적으로 유도시킬 것이다.
하지만， 본원 발명의 복합체의 경우에는 항원 제시 세포에 의해 둘러 싸여지는 경우, 항체가 짧은 펩타이드로 분해되기 때문에 코티닌과 접합 물질의 접합체는 항-코티닌 항체로부터 즉각적으로 분리될 것이다. 이것은 코티닌 접합된 치료학적 분자에 대한 면역원성 반웅의 발달을 어렵게 만들어 장점으로 작용될 수 있다. 이하， 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 실시예 1: 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG유전자 제조
(1-1) 항-코티닌 토끼 scFv로부터 항체 가변영역의 증폭 토끼의 항체 가변영역 (VL및 VH)올 증폭하기 위하여 ,항_코티닌 토끼 scFv 유전자 (미국 특허 계 8，008，448호 참고)를 주형으로 하고 각각 60 pniole의 VL용 정방향 및 역방향 프라이머 (서열번호: 11 및 12)， 및 VH용 정방향 및 역방향 프라이머 (서열번호: 13 및 14)를 사용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하였다
구체적으로， PCR 반웅을 수행하기 위하여 미국 특허 제 8， 008， 448호에서 합성한 cDNA (약 0.5 g) ΙμΙ, 각각 60 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머， 10 ≠ 10 PCR 버퍼， 8 2.5 mM dNTP 흔합물 및 0.5 μί Taq 폴리머라제 (polymerase)를 흔합하고， 여기에 증류수 100 를 첨가하였다. 상기 흔합물을 94°C에서 10분간 변성 (denaturation)시키고， 94°C에서 15초， 56°C에서 30초， 72°C에서 90초의 반응을 30회 반복한 후, 72°C에서 10분간 정치하였다. 상기 과정을 거쳐 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 한 후 QIA퀵 겔 추출키트 (QIAquick gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다. 、
(1-2) 인간의 항체 불변영역의 증폭 인간 경쇄 불변영역 (CK) 및 인간 중쇄 불변영역 (CH1-CH3)의 항체 불변영역 (Constant region)을 증폭하기 위하여， 20 ng의 pComb3XTT 백터 (Barbas et al .,,Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, (1991), 15:88(18)， 7978-7982)를 주형으로 하고 각각 60pmole의 CK용 정방향 및 역방향 프라이머 (서열번호: 15 및 16) 및 CH1-CH3용 정방향 및 역방향 프라이머 (서열변호 : 17및 18)를 사용한 것을 제외하고는， 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 PCR을 수행한 후， 증폭된 DNA를 겔 전기영동 및 정제하였다. (1-3) 경쇄 (light chain)의 증폭 경쇄를 증폭하기 위한 PCR을 수행하기 위하여， 상기 실시예 (1-1) 및 (1-2)에서 제조 및 정제한 토끼의 항체 경쇄 가변영역 (VL) 및 인간의 항체 경쇄 블변영역 (CK)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 경쇄 유전자를 제조하였다. 구체적으로， PCR 반웅을 위하여 각각 100 ng의 VL 및 CK PCR산물， 각각 60 pm 의 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 항체 경쇄의 정방향 및 역방향 프라이머 (서열번호 : 7 및 8)를 사용한 것을 제외하고는， 상기 실시예 (1-1)와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 이후 증폭된 DNA를 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-4) 중쇄 (heavy chain)의 증폭 중쇄를 증폭하기 위한 PCR올 수행하기 위하여， 상기 실시예 (1-1) 및 (1-3)에서 제조 및 정제한 토끼의 항체 중쇄 가변영역 (VH) 및 인간의 항체 중쇄 블변영역 (CH1-CH3)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 중쇄 유전자를 제조하였다.
구체적으로， PCR 반응을 위하여 각각 100 ng의 VH 및 CH1-CH3 PCR산물， 각각 60pm 의 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 항체 중쇄의 정방향 및 역방향 프라이머 (서열번호: 9및 10), 10≠ 10XPCR버퍼， 8 2.5 mM dNTP흔합물 및 0.5 f Taq폴리머라제를 흔합하고， 여기에 증류수 100 ^을 첨가하였다. 상기 흔합물을 941：에서 10분간 변성 (denaturation)시키고， 94°C에서 15초， 56°C에서 30초， 72°C에서 180초의 반응을 20회 반복한후， 72°C에서 10분간 정치하였다. 이후 증폭된 DNA를 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-5) 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 유전자를 포함하는 발현 백터의 제작 상기 실시예 (1-3)에서 제조 및 정제한 경쇄 PCR 산물， 및 상기 실시예 (2-4)에서 제조 및 정제한 중쇄 PCR산물을 각각 제한효소 Hindi II/XbaI (NEB, 미국) 및 제한효소 BamHI/Nhel (NEB, 미국)으로 절단하여， 순수 분리한 다음 발현 백터 (pcDNA3.1) multiple clonining site (MCS)의 부위에 삽입하였다. 실시예 2:항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG발현 및 시험관내 분석을 위한 정제 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG 유전자를 포함하는 발현 백터 DNA로 포유동물 CHO DG44 (invitrogen, 미국) 세포를 형질주입시켰다. 형질주입된 세포를 100 U/ml 페니실린 및 100 g/ml 스트랩토마이신 (GIBC0, 미국)을 포함하는 CDOptiCHO™발현 배지 (GIBC0)에 500 ug/ml G418을 첨가하여 37°C및 135 rpm의 조건으로 배양하였다. 배양액의 상층액을 Labscale TFF 시스템 (Millipore, 미국)으로 농축하고 단백질 A 컬럼 ( Rep li gen Co. , 미국)으로 정제하였다. 정제된 150KDa의 IgG를 쿠마사 염색으로 확인하였으며 (도 1참고), 이후의 -실험 (시험예)에 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이， 레인 1은 사이즈 마커이고， 레인 2는 환원시키지 않은 항-코티닌 IgG (150 KDa)이고， 레인 3은 환원시킨 항-코티닌 IgG로서 경쇄 (25KDa) 및 중쇄 (50 KDa)임올 알 수 있었다. 실시예 3: 코티닌 및 접합 물질의 접합체의 제조 (3-1) 코티닌 및 펩타이드의 접합체 펩타이드로 WKYMVm-NH2 펩타이드 (WKYMVm-NH2,서열번호: 1) '및 wkymvm-NH2 펩타이드 (wkymvm-NH2,서열번호: 2)를 사용하였다. WKYMVm-NH2및 wkymvm-N¾는 고체상 펩타이드 합성 (solid phase peptide synthesis) 방법으로 ASP48S 펩타이드 자동 합성기에서 합성하였다. 이 후 Vydac Everest C18컬럼 (250瞧 X 22 mm, 10 μηι)을 이용하여 역상 HPLC (reverse phase HPLC)로 정제하였고 (> 95% 순도)， LC/MS (Agilent HP1100 series)로 펩타이드의 크기를 확인하였다 (>95% 순도).
한편, 코티닌 및 펩타이드의 접합체로서 코티닌 -WKYMVm— NH2 및 코티닌 -\vkymvm-N¾는， 펩타이드의 마지막 합성과정에서 PEG 링커와 코티닌을 도입하는 것을 제외하고는， 상기의 방법과 동일한 방법으로 수행함으로써 합성하였다.
코티닌 및 펩타이드의 접합체의 제조 방법은 우선 기본적인 펩타이드는
ASP48S 펩타이드 자동합성기를 이용하여 합성 후 C-말단 아미드화 (C-terminal amidation)를 위하여 MBHA 링크 아미드 레진 (link amide Resin)에 첫번째 서열인 Fmoc-m-0H(8당량)와 커플링제 HBTU(8당량) /H0Bt(8당량) /匪(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후， 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이 후 DMF 중 20% 피페리딘을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반웅하여 Finoc을 분해하였다. 상기의 과정을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 NH2-W ( Boc ) -K( Boc ) -Y ( t Bu ) -M-V-m-MBHA 링크 아미드 레진을 만들고 펩타이드가 붙은 레진을 소량 덜어서 절단 칵테일 (cleavage - cocktail, TFA/TIS/¾0=95/2.5/2.5)을 가하여 펩타이드를 레진에서 분리 후, 과량의 디에틸 에테르를 가하여 펩타이드를 침전하였다. 얻어진 소량의 조질 펩타이드를 OT/CAN(1/1)에 녹여서 LC/MS로 합성하고자 하는 펩타이드 (WKYMVm-N¾)의 분자량이 나오는지 확인 후 상기의 과정과 동일하게 Fmoc-미니 PEG12-0H를 커플링하였고 다시 레진을 덜어서 LC/MS로 분자량을 확인하였다. 다시 트랜스 -4-코티닌카복실산 올 상기의 과정과 같이 커플링하고 절단 칵테일 (TFA/TIS/ 0 = 95/2.5/2.5)을 가하여 펩타이드를 레진으로부터 분리 후, 과량의 디에틸 에테르를 가하여 펩타이드를 침전 후 HPLC로 정제 후， LC/MS로 분자량을 확인하고 동결 건조하였다.
상기에서 합성한 WKYMVm-N¾ 및 wkymvm-NH2 펩타이드와， 코티닌-펩타이드 접합체들은 DMS0에 녹인 후 -20°C에서 보관하였다. 이렇게 제조한 코티닌 -WKYMVm-NH2 접합체의 구조를 도 2에 나타내었다. (3-2) 코티닌 및 앱타머의 접합체 앱타머로 AS1411 DNA ¾타머 (5' -dTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' , 서열번호 : 3)， CR026 DNA ¾타머 (5' -dCCTCCTCCTCCnCTCCTCCTCCTCC-3 ' ， 서열번호: 4) 및 페갑타닙 RNA ¾타머 (5， -pCfpGmpGmpArpArpUfpCfpAmpGmpUfpGmpAmp½pUfpGmpCfpUfpUfpAmpUfpA mpCfpAmpUfpCfpCfpGm3' -p-dT-3, 서열번호: 5)를 사용하였다.
한편， 코티닌 및 앱타머의 접합체로서 코티닌 -AS1411, 코티닌 -CR026 및 코티닌-페갑타닙은， 고체상 을리고펩타이드 합성 (solid phase oligonucleotide synthesis)방법으로 을리고펩타이드 합성기 (oligonucleotide synthesizer)에서 3' 에서 5' 으로 합성한 후， 합성 마지막 과정에서 아미노 C6 링커 (ST Pharm, 한국)를 붙여주었다. 이후 Xbridge Prep C18컬럼 (5 μπι, 10 x 150 mm, Waters Corp. , 미국)를 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피 (reversed-phase high-pressure liquid chromatography)로 정제 (>95% 순도)하였고， MS (mass spectrometry)로 앱타머의 크기를 확인하였다.
상기에서 합성한 코티닌 -AS1411 및 코티닌 -CR026은 증류수에 녹이고， 코티닌 -페갑타닙은 RNA이므로 디에틸 피로카보네이트 (diethyl pyrocarbonate)를 처리한 증류수에 녹인 후 95°C에서 5분간 정치한 후， 상온에서 30분간 천천히 식힌 뒤 -20°C에서 보관하였다. 이렇게 제조한 코티닌 -AS1411 및 코티닌 -페갑타닙의 구조를 도 3에 나타내었다.
(3-3) 코티닌 및 앱식시맙의 접합체 앱식시맙 (Reopro)을 이용하여 코티닌 및 앱식시압의 접합체 (코티닌 -앱식시맙)를 제조하였다.
코티닌 및 앱식시맙의 접합체는 활성 에스테르 방법 (active ester method)을 이용하여 제조하였다. DMF 1ml에 코티닌 0.1 mmol을 넣고 상온에서 녹인 뒤 DMAP 극소량, DCC 0.118隱 ol와 NHS 0.12隱 을 넣고 상온에서 4시간 가량 로테이션 (rotation)하였다. 10000 xg에서 30분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 20mg의 앱식시맙을 카보네이트 버퍼 (carbonate buffer) 2ml에 넣어 녹이고 DMF 1ml을 첨가한 후 상기 상층액을 천천히 넣어주고 3시간 가량 상온에서 로테이션 하였다. 이후 4°C에서 6시간 이상 투석 (dialysis)하고 다시 원심 분리하여 상층액만 얻음으로써 접합체를 제조하였다.
(3-4) 코티닌 및 인슐린의 접합체 인슐린 (서열번호: 6)을 이용하여 코티닌 및 인슐린의 접합체 (코티닌-인슐린)를 제조하였다.
코티닌 및 인슐린의 접합체는 상기 실시예 3-3의 코티닌 및 앱식시맙의 접합체 제조방법과 동일하게 진행하여 제조하였다. 실시예 4: 코티닌과 접합 물질의 접합체 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체의 제조 상기 실시예 1에서 제조한 코티닌과 접합 물질의 접합체와 실시예 2에서 제조한 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체로서 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG복합체를 제조하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 시험예 1: 코티닌에 대한 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG의 친화성 분석 코티닌에 대한 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG의 친화성은， BIAcore
3000 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명기술 (Surface plasmon Resonance, SPR)로 분석하였다.
구체적으로， 10 mM 소듐 아세테이트 완층용액 (pH 4.0)을 5 분꾀 속도로 흘려주면서 아민 커플링 키트 (Biacore AB)와 함께 키트에 내재된 설명서에 따라 CM5 (carboxymethyldextran-modi f ied) 센서 칩 (Biacore AB)에 코티닌 -OVMovalbumin)를 고정시켰다.0.005%트뷘 20 (sigma,미국)을 포함하는 PBS (pH 7.4)에 녹인 항—코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG 항체를 25°C에서 30 분의 속도로 칩에 주입하였다. 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG 항체는 0.15625-10 nM의 농도로 회석되었다.
표면은 1M NaCl/50mM NaOH로 재생하였으며, 분석 소프트웨어 (BIA evaluation software)를 이용하여 운동속도상수 (kon 및 koff)와 평형해리상수
(Kd)를 얻었다. 그 결과를 표 1에 나타내었고 도 4에 그래프를 표시하였다. 도 4에 나타난 바와 같이， 항-코티닌 토끼 /인간 키메릭 IgG 항체의 주입량이 증가할수록 CM5 칩에 고정되어 있는 코티닌에 결합하는 항-코티닌 IgG 항체의 양이 증가함을 알 수 있었다. <표 1>
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시험예 2: 세포 수용체에 대한 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체의 반웅성 실험 코티닌 -WKYMVm-N /항-코티닌 IgG 복합체가 WKYMVm-N¾의 세포수용체인 FPR2에 결합하는지 확인하기 위해 유속세포분석법 (flow cytometry)을 수행하였다.
FPR2 또는 백터 (pcDNA3.1)를 형질주입한 RBL-2H3 세포 (Yoe-Sik Bae et alJ Immunol 2004； 173； 607— 614)를 10% FBS( fetal bovine serum)가 첨가된 RPMI 배지에서 37°C 및 5% C02 조건으로 배양하였다. 이후, 96-웰 플레이트의 각 웰 당 1X105개의 세포를 분주한 후 PBS로 두 번， 분석 버퍼 (assay buffer )(1%FBS 및 PBS 중에 0.02% 아지드 나트륨 포함)로 1번 세척하였다.
FPR2를 형질주입한 RBL-2H3세포의 각 웰에 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌
IgG 복합체를 분석 버퍼에 희석하여 50μ1씩 첨가하고 4°C에서 30분 간 반응시켰다. 이 경우 코티닌 -WKYMVm_N¾는 0， 1， 10 및 100 nM의 4가지 농도에 대하여 실험하였으며 항-코티닌 IgG는 100 nM로 고정하였다.
이때 비교를 위해 백터를 형질주입한 RBL-2H3 세포에 대해서도 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체를 이용하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다.
또 다른 비교군으로 FPR2를 형질주입한 RBL-2H3 세포에 코티닌 -WKYMVm-NH2/비특이적 Ig0 (Pal ivizumab; 시나지스 (Synagis)®； Abbot
Laboratories, 영국)를 상기와 동일한 농도 조건으로 처리한 실험군 1ᅳ 및 WKYMVm-NH2에 대한 음성 펩타이드 (negative peptide)인 wkymvm-NH2을 이용하여
100 nM 코티닌 -wkyravm-NH2/100 nM 항-코티닌 항체를 처리한 실험군 2를 사용하였다. 세포를 분석 버퍼로 두 번 세척한 후 FTTC가 표지된 단일클론 항—인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 50 μ ΐ씩 첨가한 후， 4°C에서 20분 간 반응시켰다. 이어, 세포를 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁 (resuspension)하고， 2% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)(l:l (v/v))로 고정 후 FACSCanto™ II 유속세포분석기 (BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터 분석 소프트웨어 (Treestar, 미국)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체는 FPR2가 형질주입된 RBL-2H3 세포에 특이적으로 결합하며 , 코티닌 -WKYMVM-N¾의 농도가 증가할수록 결합력이 증가하는 것을 알 수 있었다.
반면， 백터가 형질주입된 RBL-2H3세포에는 상기 복합체가 결합하지 않는 것을 확인하였다. 또한 코티닌 -WKYMVm-N¾/비특이적 IgG 복합체 및 코티닌 -wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체 역시 FPR2가 형질주입된 RBL-2H3 세포에 결합하지 않는 것을 확인하였다. 시험예 3:코티닌 WKYMVm-N¾/항체 복합체의 WKYMVM-NH2펩타이드에 대한 기능적 활성 유지 여부 측정 vitro assays)
(3-1) 세포 내 칼슘 (calcium) 농도 변화 세포 내 칼슘 농도 ([Ca2+]i)는 Fura-2/ΑΜ를 이용한 Grynkiewicz의 방법 (문헌 [Grynkiewicz G. et al . , J Biol Chem. 260 p3440-34501985]참조)을 이용하여 측정하였다.
인간 말초 혈액으로부터 덱스트란 침강 (dextran sedimentation), 적혈구 저장성 용해 (hypotonic lysis of erythrocytes), 및 림프구 분리 배지 조성 (lymphocyte separation medium gradient)을 이용하여 중성구를 신선하게 분리하였다. 이후， 여기에 4 mL 신선한 무 -혈청 RPMI 1640에 희석한 3 μΜ Fura-2/ΑΜ을 첨가하고， 37°C에서 50분 동안 지속적으로 교반하며 배양하였다. 무 -혈청 RPMI 1640로 세 번 세척한 후， 1ml무 _Ca2+ Locke용액 (154 mM NaCl， 5.6 mM KC1, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES [pH 7.3], 10 mM글루코스， 및 0.2 mM EGTA)에 2X106개의 세포를 분주하였다.분주한 세포에 WKYMVm-N (1， 2.5， 5， 10및 100 nM), 코티닌 -WKYMVm_NH2 (1， 2.5， 5， 10및 100 ηΜ) , 코티닌 WKYMVm-NH2 (1， 2.5, 5， 10 및 100 nM)/항-코티닌 IgG 복합체 (몰농도 2:1)를 각각 첨가하였다. 이 때 비교군으로 비특이적 펩타이드인 wkymvm-NH2 (100 nM), 코티닌 -wkymvm-N¾ (100 nM)， 코티닌 -wkymvm_NH2 (100 nM)/50 nM항 -코티닌 IgG를 각각 처리한 실험군을 사용하였다.
RF-5301PC 분광형광광도계 (spectrof luorophotometer, Shimadzu
Instruments Inc. , 일본)를 사용하여 340 nm와 380 nm의 두 여기 (excitation) 파장에 대한 500 nm에서의 형광값 (fluorescence)를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때， 세포 내 칼슘 농도의 증가는 380 nm 여기 효율 (excitation efficiency)에 대한 340 nm 여기 효율의 형광값 비의 증가를 나타낸다.
도 6에 나타난 · 바와 같이， WKYMVm-NH2, 코티닌 -WKYMVm-NH2 및 코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 농도 의존성
(concent rat ion-dependencies)이 비슷하였다. 또한， 코티닌 -WKYMVm-N¾ 및 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체는 WKYMVm-NH2와 같이 세포 내 칼슘농도 증가를 강력하게 유도하였다. 반면 , wkymvm-NH2, 코티닌 -wkymvnrNH2및 코티닌 -wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 칼슘의 증가를 나타내지 않았다.
(3-2) 초과산화물 발생 (superoxide generation) 초과산화물 발생은 초과산화물에 의존적인 시토크롬 (cytochrome) c의 환원값을 측정함으로써 측정할 수 있다 (문헌 [Bae et al., Blood, 97， P2854-2862, 2001] 참조).
구체적으로， RPMI 1640 배지에 2X106 개로 분주한 인간 중성구를 50 μΜ 시토크롬 c와 37°C에서 1분간 전배양한 다음， WKYMVm-NH2 (0， 10, 100및 1，000 nM),코티닌 -WKYMVm-N¾ (0, 10, 100및 1,000 nM), 및 코티닌 -WKYMVm-NH2 (0， 10, 100 및 1,000 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)와 각각 반웅시켰다.
이 때 비교군으로 wkymvm-NH2 (0， 10， 100및 1,000 nM),코티닌 -wkymvm-N¾ (0, 10， 100 및 1,000 nM), 및 코티닌 -wkymvm— N (0, 10， 100 및 1，000 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)를 각각 처리한 실험군을 사용하였다.
시토크름 c 환원에 따른 550 nm에서의 흡광도의 변화를 분광광도계 (spectrophotometer， EL312e; Bio-Tek instruments, Winooski , VT)를 사용하여 1 분 간격으로 5 분간 측정하였다. 0분에서의 흡광도 값을 이후 측정값의 홉광도에서 빼준 뒤 흡광계수 (extinction coefficient)인 0.022 μΜ ηΓ 1로 나눔으로써 나노몰 (nanomole)단위로 나타내었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, WKYMVm-N¾, 코티닌 -WKYMVm-NH2 및 코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 농도—의존도가 비슷했으몌 코티닌 -WKYMVm-NH2 및 코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG복합체는 WKYMVm-NH2와 같이 초과산화물 발생을 강력하게 유도하는 것을 확인하였다. 반면， wkymvm-NH2, 코티닌 -wkymvm-NH2 접합체 및 코티닌 -wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 초과산화물 발생을 나타내지 않았다.
(3-3) 주화성 (chemotaxis) 분석 인간 중성구를 ixiOVml로 RPMI 1640 배지에 분주한 후， 멀티웰 챔버 (multiwall chamber , Neuroprobe, 미국)의 위쪽 웰에 상기 세포 현탁액 25μ1를 첨가하였다 (문헌 [Bae et al . , Blood, 97， ρ2854-2862, 2001] 참조). 멀티웰 챔버의 위쪽 웰은 WKYMVm-NH2 (0， 10또는 100 nM)， 코티닌 -WKYMVm_NH2 (0, 10또는 100 nM)및 코티닌 -WKYMVm-NH2 (0, 10또는 100 nM)/항—코티닌 IgG (몰비 2:1)가 담겨있는 아래쪽 웰과 3μηι 폴리히드로카본 필터 (polyhydrocarbon filter)에 의해 분리되어있다.
이 때 비교군으로 wkymvm-NH2 (0, 10및 100 nM),코티닌 -wkymvm-NH2 (0， 10 및 100 nM)및 코티닌 -wkymvm-NH2 (0， 10및 100 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)를 각각 처리한 실험군을 사용하였다. 37°C에서 90 분간 정치한 후 이동하지 않은 세포를 스크래핑 (scraping)으로 제거하고 난 뒤 , 필터를 통과하여 이동한 세포를 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 밤새 고정하였다. 고정된 필터를 90%, 80% 및 70%의 에탄을, 및 이온제거수를 순서대로 처리하고 난 후 공기중에서 건조시킨 뒤 헤마록실린 (Sigma-Aldrich, 미국)을 이용하여 건조된 필터를 염색하였다. 각 웰로부터의 염색된 세포는 high-power fields (400 x)에서 5번 무작위적으로 선택되어 카운팅되었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이， WKYMVm-N¾, 코티닌 -WKYMVm-NH2 및 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체는 비슷한 농도-의존도를 보이며 중성구의 이동 (migration)을 강력히 촉발하였다. 반면， wkymvm-NH2, 코티닌 wkymvm-N¾ 접합체 및 코티닌 -wkymvm— NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 세포의 이동을 나타내지 않았다. 시험예 4: 코티닌 -WKYMVm-N¾와 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체의 약동학실험
4-6 주령의 수컷 야생형 알비노 ICR 쥐 (Institute of Cancer Research Center, ORIENT BIO Inc. 한국)에게 코티닌 WKYMVm-丽 2 (0.5 mg/kg) , 및 코티닌 -WKYMVm— NH2 (0.5 mg/kg)/항-코티닌 IgG (10 mg/kg) 복합체를 각각 100 μΐ의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였다.
코티닌 -WKYMVm-N¾를 주사한 쥐의 경우 주사 후 0， 0.5， 1， 2， 3， 4， 5， 6, 8， 10, 12, 16, 20 및 24 시간일 때 안와총을 시행하여 말초혈액을 얻고, 코티닌 -WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG복합체를 주사한 쥐의 경우 주사 후 0， 0.5， 1, 2， 3, 4， 5， 6， 8， 10, 12, 16, 20， 24, 48， 72, 96, 120, 144 및 168 시간일 때 안와총을 시행하여 말초혈액올 얻었다. 각 말초혈액올 상온에서 30분. 동안 정치한 후 800 g로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻고 각 혈청을 유속세포분석법을 이용하여 분석하였다.
각각의 혈청을 분석 버퍼 (1% FBS, 및 0.02% 아지드화 나트륨 (NaN3) in
PBS)에 회석한 후 200 nM의 항-코티닌 IgG를 동량으로 첨가하여 혈청 속의 코티닌 -WKYMVm— N¾가 모두 항-코티닌 IgG와 복합체를 형성하도록 하여 측정될 수 있도록 하였다.
FPR2 형질주입한 RBL-2H3 세포 1X105 개를 상기 흔합물과 4°C에서 30분 간 반웅시켰다. 이후 분석 버퍼로 두 번 세척한 뒤， FTTC가 표지된 단일클론 항 -인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 첨가하여 4°C에서 20분 간 반웅시켰다.
세포를 분석 버퍼로 두 번 세척한 후 FITC가 표지된 단일클론 항 인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 50 μΐ씩 첨가한 후 4°C에서 20분 간 반웅시켰다. 세포를 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁하고， 2% 파라포름알데히드 (1:1 (v/v))로 고정 후 FACSCanto™ II 유동세포분석기 (BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터 분석 소프트웨어 (Treestar, 미국)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이， 평균형광강도 (mean fluorescence intensity) 값을 비교하여 볼 때 코티닌 -WKYMVm— N¾/항-코티닌 IgG 복합체를 주사한 쥐의 혈청의 경우 대략 8 시간 동안 그 피크의 절반보다 더 높게 유지되고 16 시간 동안 백그라운드 (background)보다 높게 유지되었다. 반면， 코티닌 -WKYMVm-NH2를 주사한 쥐의 혈청은 1시간이 지나면 백그라운드보다 낮아짐을 알 수 있었다. 시험예 5: 항-코티닌 IgG의 약동학실험
4-6 주령의 수컷 야생형 알비노 ICR 쥐 (ORIENT BIO Inc. 한국)에게 항-코티닌 IgG (10mg/kg)을 100 μΐ의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사 후 0， 1， 3, 6， 12 시간， 및 1， 2， 3， 4, 5, 6, 7， 10, 14， 21， 28 일일 때 안와총을 시행하여 말초혈액올 얻었다. 각 말초혈액을 상온에서 30 분 동안 정치한 후 800 g로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻은 뒤 혈청 내 항-코티닌 IgG의 양을 측정하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 5 ^의 코티닌 -BSA를 이용하여 4°C에서 밤새 코팅하고 PBSB (3% BSA in PBS)로 블로킹하였다. 상기에서 얻은 혈청을 PBSB에 회석 (1:10 내지 1:1000)한 후 코팅된 각 웰에 50 ^씩 첨가하였다. 이어， 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T(0.0 tween20 in PBS)로 세척하였다. 각 웰에 ABTS (one-step ABTS 용액， 시그마)를 기질로 사용하여 HRP가 결합된 양 (sheep) 항 -인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 30분간 방치한 다음， 405 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이， 항-코티닌 IgG의 혈청 내 반감기는 6일 이상임을 알 수 있었다. 시험예 6： 마우스 패혈증 모델에서의 코티닌 -WKYMVm-N¾/항-코티닌 IgG 복합체의 치료 효과
ICR 쥐를 2 cm 복벽 절개 후 맹장을 빼내어 회맹판 (ileocecal valve) 직하방에서 25>의 맹장을 결찰하였으며， 22 게이지 (gauge) 바늘로 한 차례 관통한 후 대변이 복강 내로 나오도톡 처치하였다. 복벽 근육 및 괴부층을 봉합하였다. 샴-수술한 (Sham-operated) 쥐 실험군은 2 cm 복벽 절개 후 맹장을 빼낸 후 아무런 처치도 시행하지 않고 복강 내로 다시 집어넣었다. CLP를 시행한 쥐를 각 그룹당 20마리씩 6 그룹으로 나누고 CLP 후 2 시간 후부터 12시간 간격으로 2일간 코티닌 -WKYMVm-NH2 (0.4mg/kg및 0.04 mg/kg)/항-코티닌 IgG(18 mg/kg 및 1.8 mg/kg) 복합체 실험군， 코티닌 WKY Vm-NH2 (0.4 mg/kg) 실험군， WKYMVm-NH2 단독 (0.2 mg/kg) 실험군, 항-코티닌 IgG(18 mg/kg) 단독 실험군 및 PBS 비히클 대조군 (모두 100 ul를 투여)각각을 꼬리 정맥으로 주입하고 사육시설에 넣어 물과 사료를 주고 10일간 관찰하였다. 이어 생존율을 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이， 코티닌 -WKYMVm-Niy항ᅳ코티닌 IgG 복합체를 주입한 실험군은 80% 가량의 생존율을 나타냈었다. 이는 코티닌 -WKYMVm-N¾ 실험군의 생존율 (40%)， W YMVm-NH2 실험군의 생존율 (45%)， 및 PBS 비히클 대조군의 생존율 (20%)과 비교하여 상대적으로 개선된 것임을 알 수 있었다. 시험예 7:코티닌-페갑타닙 및 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 IgG복합체의 약동학 실험 4-6 주령의 수컷 야생형 ICR 쥐에게 코티닌-페갑타닙 (0.135 mg/kg) 및 코티닌-페갑타닙 (0.135 mg/kg)/항-코티닌 IgG (1 mg/kg) 복합체를 각각 100 μΐ의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였다. 0， 0.5， 1， 1.5 및 2 시간 후 안와총을 시행하여 각각의 말초혈액을 얻고 상온에서 30분 동안 정치한 후 800 ) 8로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻은 뒤 ELISA로 분석하였다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 50 ng의 인간 VEGF를 이용하여 4T：에서 밤새 코팅하고 PBSB로 블로킹하였다. 이후 각각의 혈청을 PBSB에 1:100으로 회석한 후 100 nM의 항-코티닌 IgG와 함께 각 웰에 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T로 세척 후 각 웰에 HRP가 결합된 토끼 (rabbit) 항—인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이어，
3,3' ,5,5'-테트라메틸벤지딘(3，3' ,5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) , Thermo' Fisher Scientific)을 기질로 첨가하고 상온에서 15분 방치한 후 650 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이， 코티닌—페갑타닙 /항-코티닌 IgG 복합체의 혈청 내 반감기가 코티닌 -페갑타닙에 비하여 상당히 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 0 시간에서의 농도 역시 큰데， 이는 코티닌 -페갑타닙은 체내에 들어오자마자 분해 (degradation)되는 반면， 코티닌-페갑타닙 /항—코티닌 IgG 복합체로 주사할 경우 코티닌 -페갑타님의 급격한 분해를 저해하는 것을 예측할 수 있었다. 시험예 8: 코티닌-앱타머 /항-코티닌 IgG의 생물학적 분석 (8-1)코티닌-앱타머 /항-코티닌 IgG세포 표면의 뉴클레올린 (nucleolin)에 대한 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG복합체의 결합
Raji (인간 버킷림프종， American Type Culture Collection, 미국)세포를 각 웰 당 1X105 개의 세포로 분주한 뒤 코티닌 -AS1411 (1， 10， 50 및 100 nM)/항-코티닌 IgG (100 nM) 복합체를 50ul/sample의 양으로 처리하여 4°C에서 20분간 반응시켰다.이후 분석 버퍼 ( FBS,및 0.02%아지드화 나트륨 (NaN3) in PBS)로 두 번 세척한 뒤 FITC가 표지된 단일클론 항 -인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 분석 버퍼에 1:100으로 회석하여 각 웰에 첨가하여 4°C에서 15분간 반응시켰다.
이 때 비교군으로 비특이적 앱타머인 CR026 (ST Pharm. Korea)를 이용하여 제조한 코티닌 -CR026/항—코티닌 IgG 복합체， 및 대조 항체로서 비특이적 항체인 팔리비주맙 (palivizumab) (Abbot Laboratories, Kent, UK)을 이용하여 제조한 코티닌 -AS1411/팔리비주맙 복합체를 이용하여 상기와 동일한 방식으로 수행하였다.
또한 background contr 로 세포에 FITC가 표지된 단일클론 항 -인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)만 반응시키고 이후의 반응은 상기와 동일한 방식으로 수행하였다.
상기에서 수득된 세포들을 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁하고，
2% 파라포름알데히드 (1:1 (v/v))로 고정하였다. 이후 FACSCanto™ II 유동세포분석기 (BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터분석 소프트웨어 (Treestar,미국)을 이용하여 데이터를 분석하였다.그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이， 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체는 코티닌 -AS1411의 농도가 증가함에 따라 세포 표면의 뉴클레올린에 대한 결합력이 높아졌다. 반면， 비특이적 앱타머 (CR026) 또는 비특이적 항체 (팔리비주맙)를 포함하는 복합체의 경우 뉴클레올린에 대한 결합력이 관찰되지 않았다.
또한， 도 14에 나타난 바와 같이， 인간 간세포 암종 세포 (human hepatocellular carcinoma, HepG2),인간 교모세포종 세포 (human glioblastoma, U87MG) , 및 마우스 배아섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast, NIH3T3) (American Type Culture Collection, 미국)에 대하여 코티닌 -AS1411(50 nM)/ 항-코티닌 IgG(100 nM) 복합체를 처리하여 세포간 뉴클레을린 발현율의 차이를 확인하였다. 그 결과， Raji 세포에 비해 HepG2 및 U87MG세포는 강력한 결합을 나타내는 반면， NIH3T3 세포는 약한 결합을 나타냄을 알 수 있었다. (8-2) 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 이용한 웨스턴블롯
Raji 세포를 PBS로 세 번 세척 후 1 ml의 용해 버퍼 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl , 1% Triton X-100, 0.25 mM 합성 덱스트로스 컴플리트 배지 (synthetic dextrose complete medium) , 1 mM PMSF(phenylmethanesul fonyl fluoride), 1 yg/niL아프로티닌 (aprotinin), 1 ug/mL류펩틴 (leupeptin), 및 1 g/ml 펩스타틴 (pepstatin) A)를 넣고 음속 디스멤브레이터 모델 500(sonic Dismembrator model 500, Thermo Fisher Scientific) 기계를 이용하여 방출 세팅 (output setting) 7의 조건으로 10초씩 세 번 음파처리 (sonication)하였다. 17,000Xg에서 10분간 원심분리한 후 상층액만 모으고 브래드포드 분석 (bradford assay, Bio-Rad, 미국)을 시행하여 농도를 측정하였다.
용해물 50 ug을 4XSDS로딩 버퍼 (50 mM MES, 50 mM Tris-base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 및 50 mM디티오트레이를 (dithiothreitol， pH 7.3)를 넣고 95°C에서 10 분간 끓여 단백질을 변성시킨 뒤 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)하였다. XCel 1 SureLock™ Novex Mini-Cell (Invitrogen)를 사용하여 니트로셀를로오스 막 (Whatman, 독일)으로 단백질을 이동시켰다. 이후 5% 탈지유 (BD Biosciences Diagnostic Systems, 미국)가 포함된 TBST (10 mM Tris, pH 7.5， 150 mM NaCl, 및 0.1% Tween-20)로 상온에서 30 분간 흔들어주며 배양하고， 코티닌 -AS1411(100nM)/항-코티닌 IgG(50 nM) 복합체와 상온에서 2시간 동안 흔들어주며 배양하였다.
이 때 비교를 위하여 블로킹 버퍼에 1:100으로 회석한 쥐 항 -뉴클레올린 IgG (Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 이용하여 상기 실험과 동일한 실험을. 반복하였다.
또한， 비교군으로 코티닌 -ASWI IOO nM)/비특이적 항체 (팔리비주맙 )(50 nM) 복합체와 코티닌 -CR026(100 nM)/항-코티닌 IgG(50 nM) 복합체 실험군을 사용하였다.
막을 TBST로 세 번 세척 후， HRP가 결합된 토끼 항 -인간 IgG (Thermo
Fisher Scientific) 및 HRP가 결합된 항-마우스 IgG (Thermo Fisher
Scientific)를 TBST에 1:5, 000으로 희석하여 첨가하고 상온에서 1시간 동안 흔들어주며 배양하였다. 막을 TBST로 세 번 세척한 후， SuperSignal Pico West 화학발광기질 (cheini luminescent substrate) (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 단백질 밴드를 가시화하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이， 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 처리한 레인 1에서는 lOOkDa의 전체 길이의 뉴클레올린 밴드뿐만이 아니라, 40 kDa 이하에서도 몇 개의 밴드들이 관찰되었다. 이것은 기존 보고에 따르면 뉴클레올린의 자가 분해 활성 (autolytic activity)에 의해 뉴클레을린이 잘려서 생기는 작은 사이즈의 단편들이며， 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체가 전체 길이뿐만 아니라 작은 단편까지 검출할 수 있음을 보여주었다. 반면， 레인 4의 쥐 항 -뉴클레올린 IgG는 전체 길이의 뉴클레올린만 검출 가능하였다. 비교군인 레인 2의 코티닌 -AS141K100 nM)/팔리비주맙 (50 nM) 복합체와 레인 3의 코티닌 -CR026(100 nM)/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 밴드도 보여지지 않았다.
(8-3)코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG복합체를'이용한 뉴클레올린의 면역 침강법 (immunoprecipitat ion) 가능 여부 확인
Raji 세포 용해물 1 tng을 코티닌 -AS1411(40 nM)/항-코티닌 IgG(20 nM) 복합체， 코티닌 CR026(40 nM)/항-코티닌 IgG(20 nM) 복합체， 및 코티닌 -AS1411(40 nM)/비특이적 항체 (20 nM) 복합체와 4°C에서 밤새 로테이션 (rotation)하며 방치하였다.
단백질 A-세파로스 (sepharose) 비드를 각 샘플에 40 μ 1씩 넣어주고 로테이션하며 4°C에서 2시간 동안 방치한 후 800 g로 1분간 원삼분리하였다. 이후， 면역침강된 펠렛을 세척 버퍼 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl , 및 1% Triton X-100)로 세 번 세척하였다. 4XSDS로딩 버퍼를 넣고 95°C에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 뒤 면역블롯 (i睡 unoblot)을 시행하였다. 1차 항체로 마우스 항 -뉴클레올린 IgG(Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 0.2¾ TBST에
1:100으로 희석하여 첨가하여 상온에서 2시간을 방치하였고， 2차 항체로 HRP가 붙어있는 토끼 항-마우스 IgG를 1:5,000으로 희석하여 첨가하여 상온에서
1시간 방치하였다. 막을 세척 후 SuperSignal Pico West 화학발광기질을 첨가하여 블롯을 가시화하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에 나타난 바와 같이， 첫 번째 레인의 코티닌 AS1411/항—코티닌 IgG 복합체로 면역침강한 경우 lOOKDa에서 뉴클레을린의 밴드가 확인된 반면， 두 번째 레인의 코티닌 -CR026/항-코티닌 IgG 복합체， 및 세 번째 레인의 코티닌 -AS1411/비특이적 항체로 면역침강한 경우 밴드가 확인되지 않았다. 이것으로 볼 때， 코티닌 -AS1411/항-코티닌 IgG 복합체가 Raji 세포의 용해물에서 성공적으로 뉴클레올린을 면역 침강했음올 알 수 있었다.
(8-4) VEGF에 대한 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 IgG 복합체의 특이적 결합력 측정
'
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 50 ng의 인간 VEGF를 이용하여 4°C에서 밤새 코팅하고 PBSB로 블로킹하였다. 100 nM코티닌-페갑타닙 /50 nM항-코티닌 항체 복합체를 PBSB에 회석한 후 10배씩 회석하여 코팅된 각 웰에 50 ^씩 첨가하였다. 이어， 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T로 세척하였다. 이 때 . 비교를 위해， VEGF에 대한 항체인 100 nM 베바시주맙 (bevacizumab)을 상기 복합체 대신 이용하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다. _ 이 후， 각 웰에 TMB(Thermo Fisher Scientific)를 기질로 사용하여 HRP가 결합된 토끼 (rabbit) 항 -인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치한 다음， 650nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이， 코티닌-페갑타닙 /항-코티닌 IgG 복합체는 VEGF에 대하여 0.1 내지 1，000 pM 구간에서 코티닌 -페갑타닙의 농도-의존적 방식으로 결합력이 증가하였다. 이는 항 -VEGF항체인 베바시주맙의 농도-의존적 방식의 VEGF에 대한 결합도와 유사하였다. 시험예 9: 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 IgG복합체의 반웅성
(9-1)코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 IgG복합체， 코티닌 -앱식시맙, 및 앱식시맙의 반응성을 확인하기 위한 효소-링크된 면역원성 분석 (Enzyme-linked immunosorbent assay)
0.001 nM~1000 nM 의 앱식시맙 및 코티닌 -앱식시맙을 이용하여 인테그린 알파 2b베타 3에 대한 반응성을 측정하였다. 이때 luM의 항-코티닌 IgG항체를 사용하였다.
구체적으로, 20 μΐ의 금속 버퍼 (25mM Tris-Cl, 137mM NaCl , ImM MgCl2, lml CaCl2> ImM MnCl2및 ImMKCl; pH 7.5 l용해된 100 ng의 인테그린 알파 2b 베타 3 을 각 웰에 첨가한 후 37°C에서 2 시간 동안 배양함으로써 96-웰 절반 (half-area) 마이크로타이터 플레이트의 웰들을 인테그린 알파 2b베타 3로 코팅시켰다. 상기 웰을 150 μ 1 PBSB(PBS중에 3) BSA)로 37°C에서 1시간 동안 블로킹하였다. 항-코티닌 항체를 포함하거나 포함하지 않은 ¾식시맙 /코티닌， 및 앱식시맙을 3> PBSB중에서 다양한 농도로 조절하여 최종 50μ1 을 각 웰에 적용하였다. 상기 플레이트를 37°C에서 1 시간 동안 배양하고 0.05% Tween 20 을 포함하는 PBS (PBST)로 3 회 세척한 후， 항 -인간 Fc-HRP 로 처리하여 코티닌—앱식시맙 /항—코티닌 IgG 항체 복합체를 검출하고， 항 -인간 Fab-HRP 로 처리하여 코티닌-앱식시맙 및 앱식시맙을 각각 검출하였다. 37°C에서 45 분 동안 배양시키고 0.05% PBS-T로 4회 세척한 후， 각 웰을 100μ 1 의 ABTS기질 용액으로 37°C에서 30분 동안 배양하고,흡광도를 405nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18 에서 나타난 바와 같이， 본 발명의 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 항체 복합체는 인테그린 알파 2b 베타 3 에 대해 앱식시맙과 동일한 반응성을 유지함을 알 수 있었다.
(9-2) 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 항체 복합체의 인간 혈소판에 대한 특이적 결합 시험
0， 5및 50nM의 코티닌 -앱식시맙을 0， O.luM및 luM의 항-코티닌 항체로 활성화된 인간 혈소판에 처리한 후，항 -인간 Fc-FTTC (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 1:75로 회석 후 혈소판에 처리하고 20분간 배양하였다. 이어 수득된 세포를 상기 시험예 8과 동일한 방식으로 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 구체적으로， 1.5 ml 혈액을 0.84 ml 의 산-구연산 -덱스트로스 (ACD) 및 10 mM의 EDTA를 포함하는 5ml베스큐테이너 (vacutainer)튜브에 모았다. 상기 혈액을 원심분리 튜브로 이동시킨 후 상온에서 250 로 10 분 동안 회전시켰다. 혈소판 풍부 혈장 (platelet rich plasma, PRP)을 새로운 류브로 이동시킨 후 상온에서 1500 rpm으로 ίθ분 동안 회전시켰다.상층액을 제거하고， 혈소판을 1ml의 티로드 버퍼 (Tyrode's buffer; 137 mM NaCl , 2.7 mM KC1, 2 mM MgCl, 0.5 mM NaH2P04> 5 mM 글루코스 10 mM HEPES 및 0.2% BSA; pH 7.4)로 세척하였다. 1500 rpm 으로 7 분 '동안 원심분리한 후 상층액올 쩨거하고， 펠렛을 0.1%BSA로 보충된 금속 버퍼 (25mMTris— CI, 137mM NaCl , lmMMgCl2, lml CaCl2, ImM MnCl2 및 ImM KC1； pH 7.5) 300 μ 1 에서 재현탁하였다. 제조된 PRP 현탁액 50 μΐ 를 FACS 분석에 적용하였다. 다양한 농도의 앱식시맙-코티닌 25μ 1, 및 항-코티닌 항체 또는 시나지스 (Synagis®) 25 μ 1를 0.1% BSA보층된 금속 버퍼 중에서 실온에서 45 분 동안 적용시켰다. 동일한 버퍼로 2 회 세척한 후， 0.1% BSA로 보충된 금속 버퍼 50μ1 에 lug/ml 농도로 2 차 항체 항 -인간 Fc-FITC를 적용하여 암 조건 하에서 실온에서 30분 동안 방치하였다. 이어， 수득한 세포를 동일한 버퍼로 2 회 세척하고 100 u 1 의 PBS 로 재현탁하였다. 두가지의 세포주를 FACScan 형광 활성화 세포 분석기 (BD Biosciences)를 이용하여 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 19 에 나타내었다.
이때， 음성 항체 대조군으로는 시나지스 (Synagis)를 항-코티닌 항체와 동일한 농도로 처리하였고， 양성 대조군으로는 앱식시맙 (OnM, 5nM및 50 nM)을 ' 사용하였다.
도 19 에 나타난 바와 같이， 코티닌-앱식시맙 /항-코티닌 항체 복합체는 혈소판에 대해 앱식시맙과 동일한 반웅성을 유지하였으며， 코티닌-앱식시맙 또는 항-코티닌 항체의 농도가 증가함에 따라 결합도 역시 증가함을 알 수 있었다. 반면， 항-코티닌 항체 (lOuM) 처리된 FBL-코티닌은 혈소판에 결합하지 않았다. 시험예 10: 코티닌-인슐린 /항-코티닌 항체 복합체의 반웅성 (10-1) 코티닌-인슐린 /항-코티닌 항체 복합체의 MCF-7 및 SK-Br-3 세포에 대한 특이적 결합 시험 구체적으로， SK-Br-3 또는 MCF-7 세포 (인슐린 수용체 양성 유방암 세포주) (ATCC, 미국) (1 106/반응)를 FACS버퍼 (PBS, 1% FBS및 0.02%아지드 나트륨)로 3회 세척하였다. 다양한 농도 (0~5000nM)의 코티닌—인슐린 25μ1, 및 항-코티닌 항체 (Ι,ΟΟΟηΜ) 또는 시나지스 (Ι,ΟΟΟηΜ) 25μ1를 FACS 버퍼 중에서 실온에서 45분 동안 적용시켰다. 이때 시나지스는 음성 항체 대조군으로 사용하였다. FACS버퍼로 2회 세척한 후에， FACS버퍼 50 μΐ 중에서 2차 항체인 항 -인간 Fc-FITC lug/ml를 적용하여 암 조건 하에서 실은에서 30분 동안 방치하였다. 이어 세포들을 FACS 버퍼로 2회 세척하고, PBS 100 μ 1 중에서 재현탁하였다. 두 가지의 세포주를 FACScan 형광 활성화 세포 분석기 (BD Biosciences)를 이용하여 유동 세포 분석법으로 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 20의 A에 나타내었다.
한편, 5000nM의 코티닌-인슐린 /항-코티닌 항체 복합체, 및 코티닌 -음성 펩타이드 /항 코티닌 항체 복합체를 이용하여 상기와 동일한 방식으로 항 -인간 Fc-FITC를 이용하여 배양한 후 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 이때 코티닌 -음성 펩타이드 접합체로는 난포 B림포사이트 (follicular B lymphocyte) 결합 펩타이드인 코티닌 -FBL (서열번호: 19) 접합체， 아페린 수용체 (apelin receptor) 결합 펩타이드인 코티닌 -A13 (서열번호: 20) 접합체， 및 코티닌 -F13A 접합체 (서열번호: 21)를 이용하였다. (STPhara, 한국) 그 결과를 도 20의 B에 나타내었다.
도 20에서 나타난 바와 같이， 인슐린-코티닌 /항-코티닌 항체 복합체는 인슐린 수용체를 발현하는 세포들에 대해 성공적으로 결합하는 것으로 보아， 상기 복합체가 인술린의 수용체 결합력을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
(10-2) 코티닌-인슐린 /항-코티닌 항체 복합체의 인간보체 의존성 독성 (CDC) 분석 보체 의존성 독성 분석을 수행하기 위하여， 코티닌-인슬린 /항-코티닌 항체 복합체를 세포 가시 인디케이터 (cell viability indicator)인 WST— l(Takara)를 이용하여 시험하였다.
구체적으로， 인슐린 수용체를 발현하는 MCF— 7 세포 (ATCC, 미국)를 분석 배지 (DMEM, 1% FBS)로 세척하고， 1 x 105 /ml로 희석하였다. 상기 세포 현탁액 100 μΐ를 멸균 96-웰 조직 배양 플레이트 중에서 각 웰에 투입하고， 5% C02 배양기에서 37°C로 밤새 배양하여 세포들이 잘 부착되게 하였다. 상기 세포로부터 분석 배지를 제거하고 난 후에 25μ1 코티닌-인슐린， 25μ1의 다양한 농도 (0， 0.1 및 1 uM)의 항-코티닌 항체， 및 50 μΐ 1/12 인간 보층. 회석제 (complement di kit ion)를 포함하는 웰 세트를 37°C 및 5% C02 배양기에서 배양하여 인간보체 -매개 세포 용해 (complement -mediated cell lysis)를 촉진시켰다. 밤새 배양한 후, ΙΟμΙ of WST-1 (Takara)를 각 웰에 첨가하고, 37°C에서 3시간 동안 추가로 배양하고 나서， 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 1% 트리톤 X-100 및 배지를 인간혈청과 함께 고-대조군 (high-control) 및 저-대조군 (low-control) 세포에 각각 적용시켰다. 또한， 코티닌—인슐린 /항-코티닌 항체 복합체를 인간혈청과 함께 세포 없이 웰에 적용시킨 것을 보완 대조군 (supplement control)으로 하였다. 각각의 분석을 3회씩 수행하였고 그 결과를 도 21에 나타내었다. 고-대조군은 1% 트리톤 X-100에 의해 세포가 100% 사멸한 경우를 의미하며， 저-대조군은 보체에 의한 세포사면이 유도되지 않은 경우를 의미하며， 버퍼 대조군 (bf control)은 다른 조건과 상관없이 버퍼에 의한 결과값의 차이가 있는지 확인하기 위한 경우를 의미한다.
도 21에 나타난 바와 같이， 본 발명의 코티닌-인술린 /항-코티닌 항체 복합체는 유방암 세포를 과발현시키는 인슐린 수용체에 대해 특이적인 세포 독성제 (cytotoxic agent)로서 작용하게 하는 항—코티닌 항체의 인간보체 의존성 독성 능력을 유지시킴을 알 수 있었다. 시험예 11 사람 보체 C5 (com lement component C5) 에 결합력을 가지는 이뮤노글로불린 eculizumab 의 아미노산 서열 (US 6,355,245 B1)로부터 VH, VL 서열만을 이용하여 scFv를 조합하고 이를 cotinibody (코티닌에 결합하는 항체 ScFv)의 첫 번째 scFv에 위치하도록 하였다. 이 백터를 293F 세포주에 형질전환시켜 단백질을 발현시킨 후， 세포배양액으로부터 항체를 정제하기 위하여 protein A agarose 를 이용한 affinity chromatography를 시행하였다. 사람 혈청을 1/10, 1/20， 1/40， 1/80 (레인 1, 2， 3, 4)희석한 것 20yL와 정제된 사람 보체 C5 100ng (레인 5)을 SDS-PAGE 시행하고， 전기 영동한 단백질을 니트로샐를로스 멤브레인에 전도시켰다. 사람 보체 C5-cotinibody 단백질을 2 μ g/mL 되도록 5% skim milk in Tr is—buffered saline 용액에 희석한 후 멤브레인에 접촉한 상태로 4°C, 16시간 동안 반웅시켰다. 멤브레인은 0.2% Tween 20이 함유된 TBS용액으로 세척하고， horseradish peroxidase가 결합된 코티닌을 1/1000 희석한 용액을 상온에서 2시간 동안 멤브레인과 반응시켰다. 이 후 멤브레인을 0.2% Tween 20 이 함유된 TBS 용액으로 세척하고， chemi luminescent 물질을 처리한 후 필름에 감광하였다. 사람 보체 C5-cotinibody가 선택적으로 사람 보체 C5 에 결합함을 확인하였다 (도 23). 본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만， 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.

Claims

특허청구의 범위
1. 코티닌과 접합 물질의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체.
2. 제 1 항에 있어서,
상기 접합 물질이 펩타이드， ¾타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
3. 제 1 항에 있어서，
상기 접합 물질이 WKYMVm-N¾ 펩타이드， AS1411 앱타머， 페갑타닙， 앱식시맙 및 인슬린으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체 .
4. 제 1 항에 있어서，
상기 접합 물질이 코티닌과 PEG 링커 또는 아미노 C6 링커로 연결되는 것을 특징으로 하는 복합체 .
5. 제 1 항에 있어서，
상기 접합체가 항-코티닌 항체의 항원 결합부위에 결합된 것을 특징으로 하는 복합체 .
6. 제 1 항에 있어서，
상기 항-코티닌 항체가 상기 항체; Fab, ScFv 및 도메인 항체로부터 선택되는 항체 분절; 및 상기 항체 및 항체 분절을 구성성분으로 포함하고 있는 복합 단백질 (fusion protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체 .
7. 생체외 생물학적 분석 방법 (//? vitro biological assay)에 있어서， 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서，
상기 생체외 생물학적 분석 방법이 유동 세포 분석법， 웨스턴 블롯 분석법， 면역침강 분석법 및 효소-링크된 면역화학 분석법으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기 ( vivo half-life)를 증가시키는 방법 .
10. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성 (complement -mediated cell cytoxicity, CDC)을 야기하는 방법.
11. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)을 야기하는 방법.
12. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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