CN109679981A

CN109679981A - 一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用

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Publication number: CN109679981A
Application number: CN201910128290.0A
Authority: CN
Inventors: 肖宇; 王子健; 陈熙; 游文杰; 钱开宇; 王行环
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开了一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用。其制备方法为构建Pcantab 5E质粒载体，将其转化感受态End A⁺细胞，经辅助噬菌体包装后扩增得到甲酰基肽噬菌体。所述甲酰基肽的一级结构通式为：WKYMVM及其他变形；所述甲酰基肽位于噬菌体的PⅢ衣壳蛋白上。本发明甲酰基肽定向进化噬菌体能激活细胞膜上甲酰肽受体2（FPR2），促进成纤维细胞增殖和迁移，以及间充质干细胞向成骨方向分化，在人工血管、智能皮肤和骨修复支架材料等领域具有应用潜力。

Description

一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物学与再生医学的交叉领域，更具体地，涉及一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用。

背景技术

甲酰肽受体2(formyl peptide receptor 2,FPR2)是一种七次跨膜的G蛋白偶联受体，高表达于血管内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞表面，介导创伤修复、募集炎性因子和缺血再灌注损伤等多重生理功能和病理改变(Immunology,2014,142(3):474-483)。FPR2活化后其Giα亚基与Gβγ亚基发生解离，随后磷脂酶C催化4,5二磷酸磷脂酰肌醇生成3,4,5三磷酸肌醇和二酰甘油。二酰甘油具有激活蛋白激酶促使底物蛋白磷酸化的功能，进而引发下游系列反应。研究表明：PI3K、AKT、ERK、JNK、磷脂酶D等均参与FPR2介导的信号传导，在促进细胞增殖、迁移、分化和炎症细胞因子转录表达等方面效果显著(Int J Mol Sci,2013,14(4):7193-7230)。

近年来，随机文库法在筛选甲酰基肽及其类似物领域取得了成功。筛选得到的甲酰基肽WYKMVM能够有效的激活FPR2，且具有良好的亲和性以及特异性。研究表明，甲酰基肽WYKMVM在机体组织再生及功能重建的过程中可发挥募集炎症因子、诱导干细胞定向分化和促进血管形成的作用(中国组织工程研究,2018,22(01):107-112，临床口腔医学杂志,2017,33(12)707-711)。目前，甲酰基肽WYKMVM在大鼠糖尿病皮肤损伤修复中已经取得了优良的应用前景(Wound Repair Regen,2015,23(4):575-582)。

噬菌体展示技术是通过基因工程的方法将外源基因导入噬菌体内，外源基因自主转录翻译成蛋白质并展示于噬菌体的衣壳蛋白上。该蛋白质具有完整且独立的空间构型，从而赋予野生型噬菌体未有的遗传学特征和生物学功能。阿诺德等由于噬菌体展示技术在噬菌体定向改造和进化领域取得的颠覆性成就荣获2018年诺贝尔化学奖(自然杂志,2018,40(06):411-419)。噬菌体展示技术可为化学、材料科学、免疫学等学科领域的瓶颈问题提供全新的解决方案。当前国内对噬菌体展示技术的研究仍处于起步阶段，已发表的研究性论文质量普遍不高，拥有自主知识产权的专利技术严重不足，有待于进一步发展。

采用噬菌体展示技术将甲酰基肽展示于噬菌体PⅢ衣壳蛋白上是实现噬菌体展示技术规模化生产和应用的理想方式之一。定向进化后的噬菌体可单独或与其他高分子材料复合并作为生物材料和纳米材料使用。Wang等将黏附肽RGD展示于M13噬菌体PⅧ衣壳蛋白表面，该噬菌体具有促进骨质血管化的功能，与3D打印支架复合后成功实现了桡骨缺损的快速修复(Advanced materials,2014,26,4961-4966)。在此基础上，我们希望甲酰基肽MYKMVM展示于噬菌体上也能具备良好的生物学功能，并得到推广应用。目前还未见到有关制备甲酰基肽定向进化噬菌体的报道。

发明内容

针对现有技术的以上不足及发展需求，本发明的目的在于提供一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用，该方法为采用M13K07噬菌体为载体展示甲酰基肽，所述甲酰基肽的一级结构通式为：WKYMVM及其他变形；所述甲酰基肽位于噬菌体的PⅢ衣壳蛋白上。本发明甲酰基肽定向进化噬菌体能激活细胞膜上FPR2，促进成纤维细胞增殖和迁移，以及间充质干细胞向成骨方向分化，在人工血管、智能皮肤和骨修复支架材料等领域具有应用潜力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种甲酰基肽定向进化噬菌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将M13K07噬菌体PⅢ展示Pcantab 5E质粒依次采用Not I和Sfi I酶切后电泳，切胶回收得到双酶切质粒载体；

2)设计甲酰基肽编码DNA序列，并在其5’端和3’端分别引入限制性酶酶切位点，合成目的序列,加热退火后得到双链插入片段；所述甲酰基肽的一级结构通式为：WYKMVM及其他变形；

3)将所述步骤1)得到的双酶切质粒载体和步骤2)得到的插入片段通过T4DNA连接酶反应得到重组质粒；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒转化感受态End A⁺细胞，铺平板，挑取单克隆，扩增得到阳性菌，提取质粒，测序验证插入片段的完整性；

5)将步骤4)得到的阳性菌与M13K07辅助噬菌体共培养，扩增、分离得到甲酰基肽定向进化噬菌体。

优选地，上述步骤2)中甲酰基肽的核苷酸序列如下：

(1)其正向编码DNA为FPR2-F，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

b、具有SEQ ID NO:2所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有甲酰基肽活性多肽的核苷酸序列；

(2)其反向编码DNA序列为FPR2-R，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；

b、具有SEQ ID NO:3所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有甲酰基肽活性多肽的核苷酸序列。

优选的，所述步骤(4)中感受态End A⁺细胞为TG1、ER2378、JM109中的一种或多种。

优选的，所述步骤(5)中噬菌体扩增和扩增方法为：在2×YT培养基中接种菌种，37℃条件下100-300rpm振荡培养直至菌液OD600达到0.5-2.0之间，加入M13K07辅助噬菌体，继续培养5h以上；将菌液在7000-12000rpm条件下离心10-30min；取上清，采用PEG沉淀法分离噬菌体；加入灭菌超纯水溶解产物，经冷冻干燥后得到甲酰基肽定向进化噬菌体干粉。

第二方面，提供利用上述制备方法制备得到的甲酰基肽定向进化噬菌体。

第三方面，提供上述甲酰基肽定向进化噬菌体在人工血管、智能皮肤和骨修复支架等领域中的应用。

和现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)以噬菌体作为甲酰基肽MYKMVM的生物反应器，成功实现了噬菌体遗传学特征和生物学功能的定向进化；(2)甲酰基肽定向进化噬菌体可促进成纤维细胞增殖和迁移，诱导间充质干细胞向成骨方向分化；(3)甲酰基肽定向进化噬菌体可单独或与其他高分子材料复合，用于制备人工血管、智能皮肤以及骨修复支架；(4)本发明一定程度的拓展了噬菌体基生物活性功能材料的研发和推广应用

附图说明

图1是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体体外细胞毒性实验的结果(图例表示实验分组及不同组的处理方法，其中Blank Control代表未加入噬菌体，Phage代表加入野生型噬菌体，FPR2-Phage代表加入甲酰基肽定向进化噬菌体)。

图2是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体Transwell实验的结果。

图3是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体信号传导机制研究的结果。

图4是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体诱导间充质干细胞向成骨方向分化的结果。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】

将Pcantab 5E质粒载体DNA依次采用Not I和Sfi I限制性内切酶酶切，酶切反应采用的反应体系和反应条件为：

1μg DNA；

1μL限制性内切酶(Not I/Sfi I)；

5μL 10×缓冲液；

补DEPC水至50μL，在37℃或50℃条件下反应2h。

将酶切产物全部行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取目的条带，采用琼脂糖DNA回收试剂盒回收双酶切质粒载体。

设计甲酰基肽MYKMVM编码DNA序列，并在其两端引入限制性酶切位点。采用DNA合成仪合成序列，其正向序列为GGCCCAGCCGGCCTGGAAGTACATGGTCATGGCGGCCGC，反向序列GCGGCCGCCATGACCATGTACTTCCAGGCCGGCTGGGCC,将正向序列与反向序列等比例混合均匀后配制成5μM溶液，经98℃加热5min，4℃退火后得到双链DNA插入片段。

将双酶切质粒载体和插入片段采用T4DNA连接酶连接起来得到重组质粒，连接反应采用的体系和反应条件为：

10ng双酶切质粒载体；

适量插入片段(载体与片段的摩尔比为1:10)；

1μL T4DNA连接酶；

1μL 10×缓冲液；

补DEPC水至10μL，在4℃条件下反应过夜。

将重组质粒转化感受态JM109细胞，并均匀涂布在氨苄青霉素抗性LB固体培养皿上，37℃倒置培养过夜。挑取阳性菌单克隆并转移至氨苄青霉素抗性LB液体培养基中振荡培养过夜。采用质粒DNA小抽提试剂盒提取质粒样品并采用测序法验证插入片段的完整性。测序使用的引物序列为：正向测序引物TGATTA CGCCAA GCT TTGGAG CC，反向测序引物TCTAAA GTT TTG TCG TCT TTC C。

将阳性菌接种于含氨苄青霉素的2×YT培养基中，在200rpm条件下振荡培养直至菌液OD600值达到1.0，加入1μL M13K07辅助噬菌体噬菌体继续培养过夜。将菌液在7000rpm条件下离心10min，取上清加入1/6体积PEG8000/NaCl溶液，4℃静置过夜。在10000rpm条件下离心30min，尽量去上清，加水溶解沉淀，该步骤至少重复2次。所得产物经冷冻干燥后得到甲酰基肽定向进化噬菌体干粉。

【实施例2】

将实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体与小鼠肺成纤维细胞(L929)共培养，采用MTT实验评价噬菌体的体外细胞毒性。采用RPMI-1640完全培养基培养L929细胞，待其细胞汇合度达到80％左右时使用胰酶将其消化。收集细胞，将细胞接种于96孔组织培养板中，接种密度为每孔1000个细胞。将实验分成三组：FPR2-Phage组中培养基含20ng/mL甲酰基肽定向进化噬菌体；Phage组中培养基含20ng/mL野生型噬菌体；Blank Control组中不含有噬菌体。将细胞至于5％CO₂细胞培养箱中，37℃常规培养。在每隔24h取出1块96孔板，向培养基中加入20μL MTT试剂。继续培养4h后弃去培养基，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)。采用多功能酶标仪检测其在490nm处的吸光度值，经统计分析得到L929细胞的增殖曲线。

图1是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体体外细胞毒性评价试验的结果。如图所见，FPR2-Phage组细胞的吸光度值增长速率显著快于同期Phage组和Blank Control组，其差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明甲酰基肽定向进化噬菌体具有促进成纤维细胞增殖的作用。

【实施例3】

将实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体与L929细胞共培养，采用Transwell实验探究该噬菌体对细胞迁移能力的影响。Transwell实验采用孔径为8μm的小室，下层加入700μL RPMI-1640完全培养基，上层加入100μL PRMI1640无血清培养基。向每个小室上层加入4×10⁵个细胞。实验分组和干预方法同实施例2。常规培养24h后取出小室，经4％多聚甲醛溶液固定30min后小心去除上层细胞，采用0.1％结晶紫溶液对下层细胞进行染色，通风干燥后通过倒置荧光显微镜观察并记录图像。

图2是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体Transwell实验的结果。左上角为工程化噬菌体的实物图，EP管底部少量白色物即为工程化噬菌体沉淀。如图所见，每高倍镜视野下，FPR2-Phage组迁移细胞数目较其他两组明显增多，表明甲酰基肽定向进化噬菌体具有促进组织细胞迁移的功能。

【实施例4】

将实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体与L929细胞共培养，初步探究其信号传导机制。将L929细胞以3×10⁵/孔的密度接种于6孔组织培养板中，实验分组情况和干预措施同实施例2。常规培养2天后收集细胞，采用组织细胞总RNA小提取试剂盒提取细胞RNA，然后使用逆转录试剂盒制备得到cDNA。通过荧光定量PCR检测Ki-67，PI3K，AKT基因的相对表达量。

图3是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体信号传导机制研究的结果。如图所见。FPR2-Phage组细胞内Ki-67,PI3K,AKT等基因的表达水平均显著高于其对照组，统计学差异显著(P<0.05)。PI3K-AKT是目前被广泛研究的经典通路，参与对细胞增殖、迁移、分化和存活等生理过程的调节。Ki-67是细胞周期蛋白的标志物之一，其表达量增高主要见于细胞增殖加快、分裂旺盛等情况。甲酰基肽定向进化噬菌体增强了细胞内关键信号传导通路的活性，从功能层面证实了该噬菌体上甲酰基肽MYKMVM具有正确的空间结构以及激活FPR2受体的能力。

【实施例5】

将实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体与大鼠间充质干细胞(MSCs)共培养，检测MSCs细胞成骨相关基因的表达量。常规培养MSCs细胞并接种至6孔组织培养板中。实验分组及干预方法同实施例2。培养48小时后收集细胞，提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA，并采用荧光定量PCR的方法检测成骨相关基因COLI，COLII和OCN基因的相对表达量。

图4是实施例1获得的甲酰基肽定向进化噬菌体诱导间充质干细胞向成骨方向分化的结果。如图所见，FPR2-Phage组细胞内COLI，COLII和OCN基因的相对表达量较其对照组显著升高(P<0.05)，表明该噬菌体具有促进间充质干细胞向成骨方向分化的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Lys Tyr Met Val Met

1 5

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcccagccg gcctggaagt acatggtcat ggcggccgc 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgcca tgaccatgta cttccaggcc ggctgggcc 39

Claims

1.一种甲酰肽定向进化噬菌体的制备方法,其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中甲酰基肽的核苷酸序列如下：

(1)其正向编码DNA为FPR2-F，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

(2)其反向编码DNA序列为FPR2-R，选自以下序列之一：

a、具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中感受态End A⁺细胞为TG1、ER2378、JM109中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中噬菌体扩增和扩增方法为：在2×YT培养基中接种菌种，37℃条件下100-300rpm振荡培养直至菌液OD600达到0.5-2.0之间，加入M13K07辅助噬菌体，继续培养5h以上；将菌液在7000-12000rpm条件下离心10-30min；取上清，采用PEG沉淀法分离噬菌体；加入灭菌超纯水溶解产物，经冷冻干燥后得到甲酰基肽定向进化噬菌体干粉。

5.权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的甲酰基肽定向进化噬菌体。

6.权利要求5所述的甲酰基肽定向进化噬菌体在人工血管、智能皮肤和骨修复支架中的应用。