KR102122546B1

KR102122546B1 - 항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포

Info

Publication number: KR102122546B1
Application number: KR1020180001981A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 김태돈; 이수의; 이수연; 정준호; 김기현
Original assignee: 한국생명공학연구원; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2020-06-15
Also published as: KR20190104920A; KR20180081010A

Abstract

본 발명은 코티닌에 특이적으로 결합하는 항-코티닌 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 자연살해 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코티닌에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포는 코티닌에 접합된 접합 물질에 따라 암의 종류와 관계없이 종양 조직에 효과적으로 이동할 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 자연살해 세포는 효율 높은 항암 효과를 나타내는 유전자 치료법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포{NATURAL KILLER CELL EXPRESSING ANTI-COTININE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SPECIFICALLY BINDING TO COTININE}

본 발명은 코티닌에 특이적으로 결합하는 항-코티닌 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 자연살해 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

수십 년 동안 암을 치료하는 방법들은 꾸준히 변화하고 발전해왔다. 1800년대에서부터 1900년대까지는 외과적인 수술 (Surgery), 화학요법 (Chemotherapy), 그리고 방사선 요법 (Radiation therapy)과 같은 방법들이 주로 이뤄졌지만, 이들에 대한 한계점들이 드러나기 시작했다. 가장 대표적으로 기존 치료 방법들은 암이 전이되지 않는 초기의 경우에만 효과가 있으며, 이미 전이가 진행된 상태라면 외과적인 수술 후에도 재발의 가능성이 높게 나타났다. 또한, 화학요법은 고형암 (Solid tumor)에서는 치료 효과가 낮고, 암세포 이외의 정상세포의 성장도 함께 억제시키는 부작용 (Side effect)을 야기시키는 것이 보고되고 있다. 이와 같은 문제점을 해소하고자 최근 항암 면역 치료에 대한 연구가 활발히 진행 중이며, 이는 환자 스스로가 암세포와 싸울 수 있도록 면역 반응을 증가시키는 것을 말한다.

최근에는 면역세포 요법으로 체내의 면역세포를 꺼내서, 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식에 대한 관심이 높아지고 있다. 이의 대표적인 예로는 종양 침윤 림프구 (Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL), 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor, CAR), T세포 수용체 (T-Cell Receptor, TCR) 기술 등이 있으며, 특히 유전자 재조합 변형을 이용한 인공 수용체인 CAR를 이용한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

키메라 항원 수용체 (CAR: chimeric antigen receptr)는 T 세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계된 인공 수용체이다. 이들은 T 세포를 활성화하고 특이적 면역성을 제공하도록 선택된 항원 특이적 구성요소, 막관통 구성요소, 및 세포 내 구성요소를 포함한다. 키메라 항원 수용체 발현 T 세포는 암 요법을 포함한 다양한 요법에 사용될 수 있다.

그러나 CAR-T와 같은 치료제는 종양에 대해 효과적이지만, 일부 경우에 이들 치료는 건강한 조직에 부분적으로 비특이적인 공격으로 인한 부작용을 일으켜 왔다. 이를 극복하기 위하여 현재는 3세대 CAR-T에 대한 연구가 진행 중이며, 이는 보조자극신호 역할을 하는 신호도메인 2개와 인공수용체 (Additional engineered receptor)가 추가되어 '암세포 항원 인식 능력'이 높아져 정상세포를 공격하는 부작용을 최소화하려는 것을 특징으로 한다. 그럼에도 불구하고 현재의 CAR-T 기술은 암세포에서 발현하는 오직 하나의 단백질만을 인지하도록 제조되어 개별적 치료제 개발에 너무 많은 비용이 소모된다는 한계점과 더불어, CAR-T가 한번 주입되면 독성을 가진 T 세포가 암세포들이 제거된 후에도 그 기능이 지속되어 독성을 초래한다는 점, 표적 단백질을 나타내는 정상 세포가 있는 경우 이에 대해서도 비 특이적 공격을 유발하여 치명적인 부작용을 야기하는데 이를 되돌릴 수가 없다는 점의 문제점이 CAR-T 세포 치료제의 개발을 저해하고 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 새로운 개량 세포 치료제에 대한 연구가 절실히 필요하다.

종래 치료제의 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 본 발명자는 코티닌에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 이용한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포를 제조함으로써, 기존의 CAR-T 치료제가 가지고 있었던 문제점을 해소함과 동시에 범용의 치료제를 손쉽게 개발할 수 있도록 할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 코티닌에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 자연살해 세포를 이용한 세포 치료제 및 이를 이용한 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 키메릭 항원 수용체 (CAR)가 발현된 자연살해 세포 (Natural killer cell)로서, 상기 키메릭 항원 수용체는 1) 항원 결합 도메인, 2) 막통과 도메인, 및 3) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 도메인인 것인, 자연살해 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 자연살해 세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 자연살해 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 자연살해 세포를 포함하는 암의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 코티닌에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포는 코티닌에 접합된 접합 물질에 따라 암의 종류와 관계없이 종양 조직에 효과적으로 이동할 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 자연살해 세포는 효율 높은 항암 효과를 나타내는 유전자 치료법으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 pLVX-AcGFP-C1 벡터를 나타낸 도이다.
도 2는 코티닌 특이적 CAR-NK 세포의 모식도 및 코티닌 접합체의 예시를 나타낸 도이다.
도 3은 코티닌 특이적 NK세포인 Cot-CAR-NK 세포의 작용 모습을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에서 사용된 구체적인 관련 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 항-코티닌 키메릭 항원 수용체의 예시적 모식도 및 이의 발현 시스템을 나타낸 도이다.
도 6은 NK92 세포에서 CAR의 발현을 Flow cytometry 방법으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 AU565 세포에 대한 본 발명의 cotinine-CAR NK92의 세포사멸 효과를 확인한 도이다.
도 8은 다양한 암세포에 대한 Her2 발현정도를 Flow cytometry를 통하여 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 Her2-cotinine 접합체의 유무에 따른 본 발명의 cotinine-CAR NK92의 세포 사멸효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 cotinine-CAR NK92 세포의 Cytokine 분비정도를 ELISA를 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 세포의 CD107a의 발현정도를 flow cytometry로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 Cotinine-CAR NK92의 Endodomain을 통한 Erk의 인산화를 Flow cytometry를 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 cotinine-CAR NK92 세포의 세포사멸 효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 AU565, SK-OV-3, A431 및 A459 세포의 Her2 및 EGFR 발현정도를 Flow cytometry를 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 접합체의 유무에 따른 cotinine-CAR NK92의 세포 사멸효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 cotinine-CAR NK92 및 접합체를 처리함에 따른 암세포의 Cytokine 분비 변화를 ELISA를 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 AU565 세포의 CD107a의 발현정도를 flow cytometry로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 A431 세포의 CD107a의 발현정도를 flow cytometry로 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 하나의 양태는, 키메릭 항원 수용체 (CAR)가 발현된 자연살해 세포 (Natural killer cell)로서, 상기 키메릭 항원 수용체는 1) 항원 결합 도메인, 2) 막통과 도메인, 및 3) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며, 상기 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 도메인인 것인, 자연살해 세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포는 코티닌에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하므로, 코티닌에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.

상기 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 상기 키메릭 항원 수용체를 발현하는 NK 세포를 코티닌이 융합된 접합체와 함께 환자에 투여하여 암을 치료할 수 있다.

특히, 본 발명의 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포 (CAR-NK 세포)는 기존의 CAR-T 치료제를 이용한 암 면역치료가 가지고 있는 지속적인 독성에 의한 문제점, 자가면역 질환의 위험, 이종세포 이식에 대한 이식편대숙주질환 (GVHD)의 문제점 및 비표적 독성 문제 등을 반응 개시(on)/중지(off)의 스위치를 통해 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 암세포를 표적할 수 있도록 하여 범용의 치료제로 활용가능한 장점이 있다. 또한 본 발명의 CAR-NK 세포는 동종이식이 가능하기 때문에 환자 자신의 면역세포를 사용하는 CAR-T에 비해 고효율 세포의 premade가 가능하므로, 치료제의 투여시기를 단축하여 치료효능을 증가시킬 뿐만 아니라 개발 및 치료비용의 절감에 따라 다양한 질환에 대한 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 "항체"는, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "키메릭 항체"는, 항체 가변영역 (variable region) 또는 이의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변영역 (constant region)은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.

본원에서 "중쇄"는, 항원에 대한 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.

본원에서 "경쇄"는, 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 구성하는 항원 결합 도메인은 주신호가 전달되는 부위로 세포막 외부에 있으며 특정 항원이 있는 타겟 세포의 세포막 리간드 (수용체에 결합하여 활성화 하는 물질)를 인지하는 부위를 말한다.

본 발명의 막통과 도메인 (Transmembrane domain)은 항원 결합 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 NK 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 항원 결합 도메인이 코티닌에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며 상기 코티닌은 니코틴 대사의 주요 산물로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 물질을 말한다.

[화학식 1]

상기 코티닌은 접합 물질과 접합된 접합체인 것이 바람직하며, 상기 접합 물질은 펩타이드, 앱타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 접합 물질이 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 코티닌이 접합된 접합체는 이형성 분자로서, 폴리머 분자, 친유성 화합물, 탄수화물 부분 또는 유기 유도화 (derivatizing)제와 같은 한 개 이상의 비-폴리펩티드 부분, 특히 폴리머 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드, 전형적으로는 하나의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 추가적으로, 접합체는 하나 이상의 탄수화물 부분에, 특히 N- 또는 O- 글리코실화를 이용하여 부착될 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분을 직접적으로 서로 공유결합 시키거나 연결 다리, 스페이스, 연결 부분, 또는 부분과 같은 중개부분 또는 부분 등을 통하여 서로 간접적으로 공유 결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 개시된 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체가 본 정의에 포함된다.

본 발명에 따른 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는 코티닌을 합텐으로 이용함으로써 접합 물질 및 항체 고유의 특성을 모두 보유할 수 있다. 구체적으로, 상기 복합체는 분자의 특이적 반응성 및 기능과, 항체의 특성인 보체-매개 세포 독성 (CDC), 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 및 긴 생체 내 반감기를 보유할 수 있다.

상기 접합 물질은 예를 들어, 펩타이드, 앱타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 예를 들어, WKYMVm-NH2 펩타이드 (WKYMVm-NH2), wkymvm-NH2 펩타이드 (wkymvm-NH2), AS1411 앱타머, 페갑타닙 (pegaptanib), 앱식시맙 및 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 항체일 수 있으며, 구체적으로 항-Her2 항체 또는 항-EGFR 항체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체 내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 물질로, 항체 또는 항체 단편일 수 있으며, 항체의 단편은 scFv일 수 있다. 상기 코티닌에 결합하는 항체 또는 항체의 단편 서열 중 코티닌-scFv는 예를 들어, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이의 변형, 치환의 결과 상기 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 코티닌-scFV는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 및 이와 적어도 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기서열에 의하여 암호화될 수 있다.

코티닌과 특이적으로 결합할 수 있는 항-코티닌 키메릭 항원 수용체에서, 항원 결합 도메인은 중쇄 가변영역, 링커 서열, 경쇄 가변영역으로 이루어질 수 있다. 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 염기서열에 의해 발현되는 아미노산과 기능적 동등물을 암호화할 수 있는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 경쇄 가변영역은 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 염기서열에 의해 발현되는 아미노산과 기능적 동등물을 암호화할 수 있는 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열과 각각 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2의 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체의 단편은 링커를 추가로 포함할 수 있으며 링커를 통해 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 상호 연결될 수 있다. 링커는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변영역을 연결하여 VH-링커-VL 도메인을 이룰 수 있는 성분이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 항-코티닌 키메릭 항원 수용체의 항원 결합 도메인은 힌지 영역, 스페이서 영역 또는 이들의 조합에 의하여 막 통과 도메인에 연결될 수 있다. 본 발명의 힌지 영역 또는 스페이서 영역은 Myc 에피토프, CD8 힌지 영역 및 Fc로부터 1개 이상 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 Myc 에피토프 및 CD8 힌지영역을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 Myc 에피토프 및 CD8 힌지영역은 연결 도메인 (스페이서)로 기능한다.

본 발명의 CD8 힌지 영역은 서열번호 12 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; Myc 에피토프는 서열번호 13 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다. 따라서 본 발명의 힌지 영역 또는 스페이서 영역은 서열번호 12 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열; 또는 서열번호 13 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, Myc 에피토프를 암호화하는 염기서열은 서열번호 13의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열일 수 있고, 인간 CD8 힌지 영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 12의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열일 수 있다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 막 통과 도메인은 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막 통과 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 일례로, 상기 막 통과 도메인은 CD28의 막 통과 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 16 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 세포 내 신호 전달 도메인은 당분야에 알려진 세포 내 신호전달 도메인을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 DAP10, CD3 제타 (zeta) 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체는 세포 내 신호전달 도메인로 DAP10 및 CD3 zeta를 이용함으로써 NK 세포의 높은 활성으로 암 세포에 대한 사멸효과를 나타낼 수 있다. 이 경우, DAP10은 Co-stimulatory 도메인으로 기능하며, 서열번호 14 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; CD3 제타 (zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 15 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다. 따라서 본 발명의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 14 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열; 또는 서열번호 15 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 도메인 노출을 위한 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 CD8 알파 또는 마우스 경쇄 카파 신호 펩타이드 (Mouse light kappa signal peptid) 일 수 있으며, CD8 알파인 경우, 본 발명의 신호 펩타이드는 서열번호 10 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한 CD8 알파 영역을 암호화하는 염기서열은 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 6의 염기서열일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 기술한 항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 코딩 (암호화) 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 이용하여 키메릭 항원 수용체를 NK 세포에 형질전환 시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 일 예로서, 렌티-바이러스용 벡터 (Clontech사, 632155)를 사용할 수 있고, 구체적으로 본 발명의 실시예에서 사용되는 벡터인 pLVX-AcGFP-C1를 도 1에 나타내었다.

일부 실시양태에서, 상기 자연살해 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.

본 발명에 의한 항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 발현하는 NK 세포의 모식도 및 코티닌 접합체의 모습을 도 2에 나타내었다.

상기와 같이 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 NK 세포는 코티닌을 항원으로 인식하여 코티닌 특이적으로 결합할 수 있으며, 세포 표면에 코티닌 특이적인 키메릭 항원 수용체를 발현할 수 있다. 구체적으로, CAR-NK 세포와 같은 활성, 예컨대 종양 항원과 접촉 및 결찰 시 세포내 신호 전달도메인을 통해 NK 세포의 활성화를 유도하고 종양 특이적 사멸을 유도할 수 있도록 할 수 있다.

본 발명에 따른 코티닌 특이적 NK 세포인 Cot-CAR-NK 세포의 작용 모습을 도 3에 모식도로 나타내었다.

본 발명에 있어, 특히 CAR-NK 세포는 NK (Natural killer) 세포에 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포를 의미한다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지면서, 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체를 포함하여 치료 반응을 on/off 할 수 있는 스위치 기능을 통해 기존의 문제점인 독성 문제를 해결할 뿐만 아니라, 키메릭 항원 수용체와 결합될 수 있는 코티닌과 융합된 접합체의 말단 변형을 통해 범용의 치료제로 사용할 수 있다는 장점 또한 가질 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 코티닌에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 NK 세포는 코티닌에 접합된 접합 물질에 따라 암의 종류와 관계없이 종양 조직에 효과적으로 이동할 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 세포는 높은 특이성으로 우수한 항암 효과를 나타내는 유전자 치료법으로 유용하게 이용될 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 자연살해 세포를 포함하는 세포 치료제, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법이다.

본 발명에 있어 상기 세포는 항암치료 등의 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포는 공여자로부터 올 수 있거나, 환자로부터 얻어진 세포가 될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 병에 걸린 세포의 기능을 대체하는 재생에 사용될 수 있다. 상기 세포는 또한 이종 유전자를 발현하도록 변형되어 생물학 제제가, 예를 들어, 병에 걸린 골수 또는 전이성 침착물과 같은 특정 미세 환경으로 전달될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 코티닌에 접합 물질이 융합된 접합체를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 암을 예방 또는 치료하는 방법은 코티닌에 접합 물질이 융합된 접합체를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 코티닌에 접합된 접합 물질에 따라 표적하는 세포에 특이적으로 결합하여 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 제공된 상기 세포는 코티닌에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 가진 키메릭 항원 수용체를 발현하는 자연살해 세포로, 상기 키메릭 항원 수용체가 예컨대 통상적인 CAR 치료제의 표적 세포에 대한 반응 개시(on)/중지(off)를 코티닌과 융합된 접합체 또는 중간 매개체와 함께 조절할 수 있으므로, 후속 세포 요법, 치료 세포의 활성이 증가 또는 감소될 필요가 있는 상황에서 매우 유익할 수 있는 안전성 스위치를 포함한다. 예를 들어, 키메릭 항원 수용체를 발현하는 NK 세포가 환자에게 제공되는 경우, 어떤 상황에서는, 부작용, 예를 들어 탈표적 (off-target) 독성이 있을 수 있다. 또는, 예를 들어, 치료 세포가 종양 세포, 또는 종양 크기를 감소시키는 작용을 할 수 있고, 더 이상 필요하지 않을 수 있다. 이러한 상황에서는, 코티닌의 조절을 통해 치료 세포가 더 이상 활성화되지 않도록 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 암은 당 분야 알려진 모든 암종을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "단위 용량"은 포유동물을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 개별 단위를 나타내며, 원하는 희석제와 함께 원하는 면역원 자극 효과를 얻도록 계산된 예정된 양의 약학 조성물을 포함한다. 접종물의 단위 용량에 대한 구체적인 내용은 약학 조성물의 고유한 특성 및 달성될 구체적인 면역학적 효과에 의해서 영향을 받으며, 그에 따라 결정된다.

구체적인 적용을 위한 유효량은 치료될 질환 또는 병태, 투여될 구체적인 조성물, 피험체의 크기, 및/또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 과도한 실험 없이도 본원에 제시된 특정 조성물의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체 (CAR)가 발현된 자연살해 세포를 포함하는 암의 진단용 조성물 및 암 진단용 키트이다. 본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 (CAR)가 발현된 자연살해 세포를 포함하는 조성물을 개체로부터 분리된 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이다. 상기 조성물 또는 키트는 코티닌에 접합 물질이 융합된 접합체를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 자연살해 세포의 암의 예방 또는 치료 용도이다.

키메릭 항원 수용체, 이를 발현하는 자연살해 세포 및 이의 암 예방 또는 치료 용도에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 벡터 백본

본 발명에 사용한 벡터로는 렌티-바이러스용 벡터 (Clontech사, 632155)를 사용하였으며, 구체적으로 도 1에 나타낸 pLVX-AcGFP-C1을 이용하였다. 실험에 사용하고자 하는 Kozak 서열 (CTCGAG; n.t. 2801-2806)과 AcGFP1 (Aequorea coerulescens green fluorescent protein; n.t. 2807-3604)을 삭제한 후, XhoI을 제한효소로 사용하였다. 구체적인 관련 서열을 도 4에 나타내었다.

실시예 2. 표적 항원 및 코티닌 접합체의 제조

표적항원으로 사용될 소분자 물질인 코티닌 (trans4-cotininecarboxylic acid)의 화학구조는 하기 화학식 1과 같으며, 코티닌은 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.

[화학식 1]

또한, 상기 코티닌과 접합 물질이 융합된 접합체를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

구체적으로, HER2-코티닌 접합체는 항-HER2 항체인 트라스트주맙 (Genentech, 미국)을 사용하여 코티닌과 항-HER2 항체가 접합된 접합체를 제조하였다. 이때, 상기 접합체는 EDC (1-ethyl-3-[3 dimethylaminopropyl]carbodiimide) 연결방법으로 접합시켰다. 먼저, 상기 항-HER2 항체를 PBS에 25 μM 농도가 되도록 용해시켜 준비하였다. 한편, 1 ㎖의 MES 완충액[0.1 M의 MES (2-[morpholino]ethaneusulfonic acid) 및 0.5 M의 염화나트륨, pH 6.0]에 트랜트-4-코티닌카복실산 (trans-4-cotininecarboxylic acid, Sigma-Aldrich)이 5 mM의 농도가 되도록 용해시켜 준비하였다. 여기에 50 mM 농도의 EDC 및 125 mM 농도의 N-하이드록시설포숙시니마이드 (N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS, Thermo Scientific, 미국)를 첨가한 뒤, 이를 상온에서 15분 동안 교반하며 용해시켜 코티닌-NHS 에스터가 생성된 활성용액을 제조하였다. 코티닌-NHS 에스터와 단백질의 아민기 사이의 반응을 유도하기 위해 수산화나트륨 용액을 첨가하여, 상기 활성용액의 pH를 7 이상으로 조절하고 1 ㎖을 취하여, 여기에 코티닌과 접합시킬 항-HER2 항체를 25 μM의 농도로 활성용액과 동량으로 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켜 EDC 연결반응을 통해 생성된 코티닌-HER2 항체 접합체를 수득하였다. 수득한 코티닌-HER2 항체 접합체를 Slide-A-lyzer™ 투석카세트 (Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하여 PBS로 투석시키거나, Amicon　Ultra Centrifugal Filter (EMD Millipore, 미국)을 이용하여 완충액을 PBS로 교환하여 사용하였다.

또한, EGFR-코티닌 접합체는 항-EGFR affibody가 코티닌과 융합된 접합체로서 애니제㈜ (Cotinine-zEGFR:95)로부터 구매하여 사용하였으며, 사용된 항-EGFR affibody의 구체적인 서열은 다음과 같다.

trsn-4-cotininecarboxylic acid-VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (서열번호 30)

실시예 3. 항-코티닌 키메릭 항원 수용체 도출

본 발명의 코티닌에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체의 각 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

(1) 신호 펩타이드 (signal peptide)

Human T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain (GenBank: AK300089.1)을 토대로 XhoI과 XbaI의 제한효소 자리를 각각 포함한 두 종류의 프라이머 (정방향 프라이머: 서열번호 18, 역방향 프라이머: 서열번호 19)를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음 클로닝하였다.

(2) 표적 특이적 인식 도메인 (target specific recognition domain) - scFv

코티닌에 특이적으로 결합할 수 있는 항원결합 도메인으로서, 항-코티닌 키메릭 항체 또는 이의 항체 단편을 도출하고자 하였으며, ScFv의 서열 도출은 한국 등록 특허 제10-1648960호의 ScFv 관련 정보를 참고하였다. 구체적으로, 상기 항원결합 도메인은 서열번호 17로 표시되는 염기서열을 포함하며, VH-링커-VL로 구성하였다.

(3) 연결 도메인 (spacer)

(A) Myc 에피토프

본 발명자가 보유하고 있는 플라스미드 (Anti-cotinine 28Z-1 CAR ORF, cot28z-1)에서 sfiI과 HindIII의 제한효소 자리가 포함된 각각 두 종류의 프라이머 (정방향 프라이머: 서열번호 20, 역방향 프라이머: 서열번호 21)를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음 클로닝하였다.

(B) 인간 CD8 힌지 영역

본 발명자가 보유하고 있는 플라스미드 (Anti-cotinine 28Z-1 CAR ORF, cot28z-1)에서 HindIII 단일 제한효소 자리가 포함된 각각 두 종류의 프라이머 (정방향 프라이머: 서열번호 22, 역방향 프라이머: 서열번호 23)를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음 클로닝하였다.

(4) 막투과 영역

Human CD28 gene의 hinge에서 cytoplasmic region을 막투과 영역으로 사용하였다. 정방향 프라이머 (서열번호 24)에 제한효소 BamH1의 서열을 추가하고, 역방향 프라이머 (서열번호 25)에 제한효소 EcoRI 서열을 추가하여 제작하였다.

Jurkat 세포의 cDNA에 위의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 막투과 영역의 DNA를 얻었다.

(5) 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인

(A) 공동-자극성 도메인 (Co-stimulatory domain)

DAP10을 공동-자극성 도메인으로 사용하였으며, 정방향 프라이머 (서열번호 26)에 제한효소 EcoRI의 서열을 추가하고, 역방향 프라이머 (서열번호 27)에 제한효소 NotI 서열을 추가하여 제작하였다.

primary mature NK 세포의 cDNA에 위의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하여 공동-자극성 도메인을 제작하였다.

(B) NK 세포 활성화 도메인

NK 세포 활성화 도메인으로 CD3 zeta를 이용하였다. 구체적으로 Jurkat 세포의 cDNA에 두 종류의 프라이머 (정방향 프라이머: 서열번호 28, 역방향 프라이머: 서열번호 29)를 이용하여 PCR을 진행하여 활성화 도메인을 제작하였다.

상기 각 도메인을 각각의 제한효소를 이용하여 순차적으로 연결하였고, 각 도메인에 대응하는 구체적인 서열 정보는 다음 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1의 서열을 앞서 설명된 구조에 대응 시키면, 신호 펩타이드는 인간 CD8 알파 영역에 해당하는 서열번호 6으로 나타내었으며, 표적 특이적 인식 도메인 중 중쇄 가변 영역은 서열번호 1로, 링커는 서열번호 3으로, 경쇄 가변영역은 서열번호 2로 나타내었다. 연결 도메인 (스페이서)은 서열번호 7의 Myc 에피토프 또는 서열번호 4의 인간 CD8 힌지 영역으로 나타내었고, 막투과 영역으로 CD28은 서열번호 5로 나타내었다. 하나 이상의 세포내 신호 도메인은 공동 자극성 도메인으로 DAP-10을 서열번호 8에, NK 세포 활성화 도메인으로 CD3 제타를 서열번호 9에 나타내었다.

실시예 4. 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 NK 세포의 제조

상기 실시예 3에 나타낸 항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 도입하고, 이를 이용하여 형질전환된 자연살해 세포를 제조하였으며, 코티닌 특이적 항원결합 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체의 모식도, 그리고 이의 발현시스템의 모식도를 도 5에 나타내었다.

먼저, 상기 실시예 1의 pLVX-AcGFP-C1에서 AcGFP가 제거된 벡터를 기본벡터로 하여 상기 벡터 내 MCS의 XhoI과 XbaI의 제한효소를 이용하여 실시예 3의 항-코티닌 키메릭 항원 수용체 (Cotinine-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하였다.

그 다음, cotinine-CAR를 포함하는 벡터를 viral packaging vector (PMDLg/RRE, RSV/REV, VSVG)와 함께 HEK293T 세포에 형질전환시키고, 그로부터 Cotinine-CAR를 발현하는 Lentivirus를 얻었다. 상기 Lentivirus를 초고속원심분리기를 이용하여 농축시키고, 농축된 Cotinine-CAR를 발현하는 Lentivirus를 HEK293T 또는 Hela 세포에 감염시킨 뒤, cotinine-CAR의 myc 에피토프 양을 Flow cytometry로 확인하여 Infection Unit을 계산히였다. Multiplicity of infection (MOI)가 10이 되도록 NK 세포 수 및 lentivirus의 양을 계산하고, cotinine-CAR를 발현하는 lentivirus를 NK 세포에 spinoculation 방법 (360g, 90min, RT)으로 감염시켰다. 감염된 NK 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 5시간 동안 배양한 후, 신선한 배양배지로 갈아주었다. 3일 후 감염된 NK세포의 선별을 위하여 3 ug/ml 농도의 puromycin을 처리하여 배양을 계속 진행하였다.

대조군으로서 감염되지 않은 NK 세포에도 puromycin을 처리하고, 대조군 세포가 puromycin에 의해 전멸할 때까지 puromycin이 처리된 배양배지를 이용하여 배양을 진행하였다. 대조군 세포가 전멸한 시점에서 감염된 NK 세포를 Puromycin이 없는 배지로 교환하여 증식 또는 확장 시켰다. 상기 선별된 세포의 증식 또는 확장을 위하여 Alpha-MEM 함유 12.5% 우태아 혈청, 12.5% 말혈청, 0.2 mM 이노시톨, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 0.02 mM 폴릭산 및 200 U/ml 재조합 IL-2을 이용한 배지를 이용하여 실험을 수행하였다.

실시예 5. 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 NK 세포에서 CAR의 발현확인

본 발명의 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 상기 실시예 4의 NK 세포에서 CAR의 발현을 Flow cytometry 방법으로 확인하였다.

Cotinine-CAR의 Myc 에피토프에 대응하는 Myc 항체 (CTS; 9B11)를 cotinine-CAR를 발현하는 NK 세포에 반응시키고 (4℃, 암소에서 30분), Flow cytometry를 통하여 Myc의 발현을 확인하거나, Her2 항체가 융합되어 있는 코티닌 접합체를 cotinine-CAR를 발현하는 NK 세포에 30분간 4℃에서 반응시킨 후, Her2 항체의 Fc region에 대응하는 Fc (eBioscience; 12-4988-82) 항체를 이차적으로 반응시킨 후 Flow cytometry로 확인하였다. 대조군으로는 CAR를 발현하지 않은 본래의 NK92 세포를 사용하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 본 발명의 NK 세포는 항-코티닌 항체 단편을 발현하고 있음을 확인하였다.

실시예 6. cotinine에 대한 cotinine-CAR NK 세포의 결합 특이성(Specificity) 확인

Cotinine polymer인 cot-SWNT 및 HER2-종양 세포를 이용하여 Cotinine-CAR NK 세포의 cotinine ScFv가 cotinie에 특이적으로 결합하는지의 유무를 확인하였다.

구체적으로, AU565 (인간 유방 암종)를 Calcein-AM (life technologies; C1430)로 염색한 후 cotinine-CAR를 발현하는 NK 세포를 1:1의 비율로 RPMI1640 (10% FBS) 200 ul에 혼합하고, 1 ug/ml 농도의 Her2 항체가 융합된 코티닌 접합체와 cot-SWNT를 농도 별 (0, 0.005, 0.05, 0.5 및 5 mg/ml)로 동시에 처리하여 Her2-cotinine 접합체와 경쟁이 일어나도록 하였다. 또한, Cot-SWNT 단독 효과를 확인하기 위하여 Cot-SWNT (5 mg/ml) 단독 처리 조건을 추가하여 진행하였다. 37℃, 5% CO₂에서 4시간 동안 반응 시킨 후, 상등액 100 ul를 취하여 상등액 내에 존재하는 calcein의 양을 확인하여 각 조건에 따른 Killing effect (세포사멸 효과)를 확인하였다. 대조군으로는 Calcein이 염색된 AU565에 RPMI1640 (10% FBS)만 처리한 군 (spontaneous value)과 2% triton X-100 (maximum value)을 처리한 군을 이용하였으며, killing effect는 아래와 같은 방법으로 계산하였다.

killing effect (%) = (조건에 따른 calcein release value-spontaneous value) / (maximum value-spontaneous value) x 100

그에 따른 killing effect에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, cot-SWNT의 농도가 증가함에 따라 her2를 발현하는 암세포에 대한 cotinine-CAR NK 세포의 killing effect가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 cotinine-CAR NK 세포는 접합체의 접합물질에 따라 표적 세포에 특이적으로 작용함을 확인하였다.

실시예 7. Herceptin(her2)-cotinine 접합체에 의한 cotinine-CAR NK 세포의 세포사멸 효과 확인

실시예 3에서 제조한 항 Her2-코티닌 접합체 및 실시예 4의 cotinine-CAR NK92 세포를 사용하여 상기 접합체가 암세포 표면의 Her2를 인식함으로써 본 발명의 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 NK 세포에 의한 세포사멸 효과를 확인하였다.

먼저, AU565 (인간 유방 암종; RPMI1640 (10% FBS; 200nm HEPEs)), SK-OV-3(인간 난소 암종; RPMI1640 (10% FBS)), SK-BR-3 (인간 유방 암종; DMEM (10% FBS)) 및 K562 (만성 골수성 백혈병; RPMI1640 (10% FBS))의 4개의 세포 주에 항 Her2 항체 (Invtrogen; BMS120FI)를 1 ug/100 ul의 양으로 처리하고, 4℃, 암소에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 세포를 Flow cytometry (BD; FacsCantoII)를 이용하여 각 세포의 Her2 발현 정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, AU565, SK-OV-3 및 SK-BR-3 세포에는 Her2가 발현되나, K562 세포에는 Her2가 발현되지 않는 것을 확인하였다.

그 다음, Her2-cotinine 접합체의 유무에 따른 cotinine-CAR NK 세포의 세포 사멸효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 AU565, SK-OV-3, SK-BR-3 및 K562의 4 개의 세포주에 Calcein-AM을 5 ug/ml의 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO₂, 암소의 조건으로 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상기 세포 주들에 본래의 NK92, AcGFP가 삭제된 pLVX 공벡터를 발현하는 대조군 벡터가 삽입된 NK92 (Puro-92), 및 cotinine-CAR NK92 (cot-10z-92)와 각각 5:1, 1:1, 0.5:1 (Effector cell; NK92, Puro-92, Cot-10z-92): Target cell; AU565, SK-OV-3, SK-BR-3, K562)의 비율로 200 ul RPMI (10% FBS)에 혼합하여 37℃, 5% CO₂조건에서 4시간 동안 반응한 후, 상등액 100 ul를 취하여 상등액 내에 존재하는 calcein의 양을 확인하여 각 조건에 따른 Killing effect를 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, cotinine-CAR NK92 세포는 Her2를 발현하는 AU565, SK-OV-3 및 SK-BR-3 세포에는 세포사멸 활성을 나타내나, Her2가 발현되지 않는 K562 세포에는 활성을 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, Her2-cotinine 접합체는 NK92 및 Puro-92의 세포사멸 효과에 영향을 미치지 않았으나, cotinine-CAR NK92에서는 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 cotinine-CAR NK 세포는 코티닌-접합체에 의해 특이적으로 세포사멸을 유도함을 확인하였다.

실시예 8. cotinine-CAR NK 세포의 세포활성 확인

NK 세포의 cytokine 및 granule을 분비를 확인함으로써 NK 세포의 활성을 확인하였다. 구체적으로 cytokine의 분비는 본래의 NK92와 PURO-92, cot-10z-92를 각각 AU565와 1:1로 RPMI1640 (10 % FBS)에 혼합하고, 코티닌 접합체를 넣어 37℃, 5% CO₂조건에서 6시간 동안 반응 시킨 후 상등액을 모아 상등액 내에 존재하는 cytokine인 IFN-r 및 TNF-a를 ELISA를 통해 확인하였고, 본래의 NK92와 PURO-NK92, cot-10z-92 단독의 cytokine 분비량을 대조군으로 사용하였으며 그 결과를 도 10에 나타내었다.

또한, CD107a의 발현은 본래의 NK92와 PURO-92, co-10z-92를 AU565와 각각 1:1의 비율로 RPMI1640 (10% FBS)에 혼합하고, 코티닌 접합체와 CA107a 항체(BD;555801)를 함께 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포에서 NK92 세포를 선별할 수 있도록 CD56 항체를 이용하여 염색한 후, Flow cytometry를 이용하여 본래의 NK92와 PURO-NK92, cot-10z-92의 CD107a발현정도를 비교하였다. 본래의 NK92와 PURO-92, Cot-10z-92의 기본 CD107a발현 정도와 AU565와 혼합하된 코티닌 접합체가 없는 상태에서의 CD107a의 발현정도를 대조군으로 사용하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, NK 세포의 Cytokine 및 granule의 분비는 cotinine-CAR NK 세포와 her2-cotinine 접합체가 있는 경우에만 암세포에 대하여 반응하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. Her2 - cotinine 접합체에 의한 cotinine -CAR NK 세포의 signal 변화

Cotinine-CAR NK 세포가 활성을 나타낼 때 변화하는 signal을 측정하여 NK 세포의 활성을 확인하였다. 구체적으로, Cotinine-CAR NK92의 Endodomain을 통한 signal로 Erk의 인산화를 Flow cytometry를 통하여 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 세포내 Erk의 인산화는 cotinine-CAR NK92 세포가 단독으로 있을 때 (with out; 대조군)는 증가하지 않으나, 암세포가 있을 때 her2-cotinine 접합체에 의해서 (with her2-cot; her2-cot 처리군) cotinine-CAR NK92 세포의 Erk 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10. cotinine-CAR NK 세포에 대한 Herceptin(her2)-cotinine 접합체의 특이성 확인

Cotininie-CAR NK 세포의 Her2-cotinine 접합체에 대한 특이성을 확인하기 위하여 접합체에 따른 세포사멸 효과를 확인하였다.

먼저 Her2-cotinine 접합체의 대조군으로서 호흡기세포융합바이러스 (RSV)-cotinine 접합체를 이용하였다. 상기 RSV-cotinine 접합체는 상기 실시예 2의 코티닌 접합체의 제조방법에서 코티닌과 융합될 항체로서 항-RSV 항체 (Palivizumab, Synagisㄾ, AstraZeneca, UK)을 이용한 점을 제외하고 실시예　2와　동일한 방법으로 제조하였다.

그 다음, cotinine-CAR-NK92 세포와 calcein이 염색된 AU565를 각각 5:1, 1:1 및 0.5:1의 비율로 RPMI1640 (10 % FBS)에 혼합하고 AU565 세포에 발현되는 항원인 Her2에 대한 her2-cotinine 접합체와 발현되지 않는 호흡기세포융합바이러스의 항체 (RSV; Palivizumab; Synagisㄾ, AstraZeneca, UK)-cotinine 접합체를 각각 1 ug/ml의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응한 후 cotinine-CAR NK92세포의 세포 사멸효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, Cotininie-CAR NK 세포는 Her2-cotinine 접합체에 특이적으로 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 11. Herceptin(her2)-cotinine 접합체 및 EGFR(affibody)-cotinine 접합체에 의한 cotinine-CAR NK 세포의 세포사멸 효과 확인

실시예 3에서 제조한 항 Her2-코티닌 접합체 및 항 EGFR-코티닌 접합체와 함께 실시예 4의 cotinine-CAR NK92 세포를 사용하여 상기 코티닌 접합체가 암세포 표면의 Her2 또는 EGFR을 인식함으로써 본 발명의 항-코티닌 키메릭 항원 수용체가 도입된 NK 세포에 의한 세포사멸 효과를 확인하였다.

먼저, AU565 (인간 유방 암종), SK-OV-3 (인간 난소 암종), A431 (인간 피부 암종; DMEM (10 % FBS)) 및 A549 (인간 폐 암종; RPMI1640 (10 % FBS))의 4 개의 세포주에 항 Her2 항체 및 항 EGFR항체 (BD;563577)를 1 ul/100 ul의 양으로 처리하고, 4℃, 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 각 세포의 her2 및 EGFR의 발현정도를 Flow cytometry를 통하여 확인하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 4개의 세포의 Her2 및 EGFR 발현정도는 각 세포에 따라 상이함을 확인하였다.

그 다음, 상기 4개의 각 암세포에 대하여 her2-cotinine 접합체 또는 EGFR-cotinine 접합체의 유무에 따른 cotinine-CAR NK92의 세포 사멸효과를 Calcein-AM법을 통하여 확인하였다. 구체적으로 AU565, SK-OV-3, A431 및 A549 세포를 각각 calcein으로 염색한 후, Cot-10z-92 세포와 5:1, 1:1 및 0.5:1 (cot-10z-92: 암 세포)의 비율로 RPMI1640 (10 % FBS) 200 ul에 혼합하고, 각 조건에 따라 cot-10z-92와 암세포 종만 반응시키거나, her2-cotinine 접합체 (1 ug/ml) 또는 EGFR-cotinine 접합체 (100 ng/ml)를 함께 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켰다. 각 조건에서 세포사멸효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, cotinine-CAR NK92 세포는 표적 항원인 Her2 또는 EGFR 발현정도에 의존하여 세포사멸 효과를 나타내며, 이는 본 발명의 cotinine-CAR NK 세포의 세포사멸 효과는 cotinine 접합체의 종류에 의존적임을 확인하였다.

실시예 12. EGFR-cotinine 접합체에 의한 cotinine-CAR NK 세포의 세포활성 확인

Her2 또는 EGFR을 발현하는 암세포에 대하여 her2-cotinine 접합체 또는 EGFR-cotinine 접합체에 의한 활성의 변화를 cytokine과 granule 분비를 통하여 확인하였다.

구체적으로, AU565 또는 A431 세포와 cot-10z-92를 1:1의 비율로 RPMI1640 (10 % FBS)에 혼합하고, her2-cotinine 접합체 또는 EGFR-cotinine 접합체를 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 6시간 동안 반응시킨 후, 상등액 내에 cytokine (IFN-r 및 TNF-a)의 분비 변화를 ELISA를 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

또한 granule의 분비는 CD107a의 발현정도로 확인하였으며, 구체적으로 본래의 NK92와 PURO-92, Cot-10z-92를 각각 AU565 또는 A431 세포와 1:1의 비율로 혼합하고, her2-cotinine 접합체 또는 EGFR-cotinine 접합체를 함께 처리하고, CD107a 항체를 함께 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시켰으며, 반응 후 NK92 세포를 선별할 수 있도록 CD56 항체로 염색을 진행 한 후 Flow Cytometry를 통하여 확인하였다. AU565 및 A431 세포에 대한 결과를 각각 도 17 및 도 18에 나타내었다.

도 16 내지 도 18에 나타낸 바와 같이, Cotinine-CAR NK 세포의 활성은 항원에 대한 항체-cotinine 접합체에 의해서 증가하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> NATURAL KILLER CELL EXPRESSING ANTI-COTININE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SPECIFICALLY BINDING TO COTININE <130> P17-196-REA-KRI <150> KR 10-2017-0001976 <151> 2017-01-05 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy variant chain <400> 1 gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaattgcc agtccagtca gagtccttat agtaacgagt ggttatcctg gtatcagcag 120 aaaccagggc aggctcccaa agtcctaatt tctaggatat ccactctggc atctggggtc 180 tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat aagcgacctg 240 gagtgtggcg acgctgccac ttatttctgt gcaggcggtt ataattttgg tttgtttcct 300 ttcggcggag ggaccgagct ggagatccta 330 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light variant chain <400> 2 agatcttccc agtcggtgaa ggagtccgag ggtcgcctgg tcacgcctgg aggatccctg 60 acactcacct gcacagtctc tggaatcgac ctcagtaggg actggatgaa ctgggtccgc 120 caggctccag gggaggggct ggaatggatc ggagccattg gtagaagtgg agacacatac 180 tacgcgacct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgag gacggtgact 240 ctaacagtca ccgatctgca gcgctcagac acggccacct atttctgtgc cagaattcct 300 tattttggtt ggaataatgg tgacatctgg ggcccaggca ccctggtcac catctcttca 360 360 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 tcctctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggggtggtt cctct 45 <210> 4 <211> 203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8 hinge region <400> 4 ggggtcaccg tctcttcagc gctgagcaac tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg 60 gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 120 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcat gccggccagc ggcggggggc 180 gcagtgcaca cgagggggct gga 203 <210> 5 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 <400> 5 gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg 60 gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 120 attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta 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140 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asp Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Arg Thr Val Thr Leu Thr Val 195 200 205 Thr Asp Leu Gln Arg Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ile 210 215 220 Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Ile Ser Ser 245 <210> 12 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8 hinge region <400> 12 Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser 1 5 10 15 His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 20 25 30 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 35 40 45 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 50 55 60 Arg Gly Leu 65 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc epitope <400> 13 Glu Gln Lys Leu 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Claims

키메릭 항원 수용체 (CAR)가 발현된 자연살해 세포 (Natural killer cell)로서,
상기 키메릭 항원 수용체는 1) 항원 결합 도메인, 2) 막통과 도메인, 및 3) 세포내 신호 전달 도메인을 포함하며,
상기 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 도메인인 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 코티닌에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편인 것인, 자연살해 세포.
제2항에 있어서, 상기 항체의 단편은 scFv인 것인, 자연살해 세포.
제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 1의 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 2의 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제2항에 있어서, 항체 또는 항체의 단편은 링커를 추가로 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제6항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 3의 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 힌지 영역, 스페이서 영역 또는 이들의 조합에 의하여 막통과 도메인에 연결되는 것인, 자연살해 세포.
제8항에 있어서, 상기 힌지 영역, 스페이서 영역 또는 이들의 조합은 Myc 에피토프, CD8 힌지영역 및 Fc로부터 1개 이상 선택된 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 막통과 도메인은 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질의 막통과 도메인을 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제10항에 있어서, 상기 막통과 도메인은 CD28의 막통과 도메인을 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 DAP10, CD3 제타 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 신호 펩타이드를 포함하는 것인, 자연살해 세포.
제13항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 CD8α 또는 마우스 경쇄 카파 신호 펩타이드 (Mouse light kappa signal peptid)인 것인, 자연살해 세포.
제1항에 있어서, 상기 코티닌은 접합물질과 접합된 복합체 형태인 것인, 자연살해 세포.
제15항에 있어서, 상기 접합 물질은 펩타이드, 앱타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 자연살해 세포.
제1항의 자연살해 세포를 포함하는 세포 치료제.
제1항의 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 자연살해 세포를 개체로부터 분리된 표본과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.