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CN118103074A - 用于ccr2表达细胞的细胞毒性靶向嵌合体 - Google Patents

用于ccr2表达细胞的细胞毒性靶向嵌合体 Download PDF

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CN118103074A
CN118103074A CN202280068253.5A CN202280068253A CN118103074A CN 118103074 A CN118103074 A CN 118103074A CN 202280068253 A CN202280068253 A CN 202280068253A CN 118103074 A CN118103074 A CN 118103074A
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amino
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Abstract

本公开内容涉及异双功能分子，被称作细胞毒性靶向嵌合体(CyTaCs)或抗体募集分子(ARM)，其能够同时结合靶细胞表面蛋白以及外源性抗体蛋白。本公开内容还涉及能够与致病细胞表面上的受体结合并诱导受试者中致病细胞耗竭的药剂，所述药剂用于治疗癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染。

Description

用于CCR2表达细胞的细胞毒性靶向嵌合体
本公开内容的领域
本公开内容涉及能够同时结合靶细胞表面蛋白以及外源性抗体蛋白的异双功能分子，其被称作细胞毒性靶向嵌合体(CyTaCs)或抗体募集分子(ARM)。本公开内容还涉及能够结合致病细胞表面上的受体并诱导受试者中致病细胞耗竭的药剂，其用于治疗癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染。
背景
细胞表面蛋白及其配体在一系列炎症性、感染性和自身免疫性疾病以及肿瘤启动、生长和转移中发挥关键作用。基于抗体的治疗剂作为这些适应症的药物候选物具有前景广阔的性能，因为它们对致病细胞表面靶标具有选择性，并且它们能够将免疫监视引导至表达靶标的组织或细胞以诱导致病细胞的耗竭。这样的耗竭机制的例子包括依赖抗体的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)、抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性的细胞毒性(CDC)。但是，基于抗体的治疗剂由于其尺寸、复杂性和基于肽的结构，常常缺乏生物利用度、成本高、热不稳定和制造困难。相反，小分子治疗剂经常提供可负担性、稳定性和口服给药的便利性，但可能存在差的选择性和脱靶效应，同时也缺乏治疗性抗体的免疫控制。
因此，需要用于治疗疾病的改进的靶向致病细胞的治疗方案。在本公开内容中提供了这样的组合物和有关的方法。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了被称为细胞毒性靶向嵌合体(CyTaC)或抗体募集分子(ARM)的异双功能分子，其中所述ARM包含结合细胞上的靶细胞表面蛋白的部分和结合外源性抗体的部分。在另一个方面，所述ARM包含将靶标结合部分连接至抗体结合部分的二价连接基。在另一个方面，所述靶标结合部分是C-C趋化因子受体2型(CCR2)-结合部分。在另一个方面，所述外源性抗体是抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，所述ARM是式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-4烷基或C3-6环烷基；
R2是氢或C1-4烷基；
R3是氢或C1-4烷基；且
L是如本文描述的二价连接基。
在一个方面，本公开内容提供了一种在有此需要的患者中治疗和/或预防疾病或障碍的方法，所述方法包含：给所述患者施用本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开内容提供了一种增加CCR2表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity,ADCC)的方法，所述方法包含：使所述细胞与本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触。
在一个方面，本公开内容提供了一种耗竭CCR2表达细胞的方法，所述方法包含：使所述细胞与本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触。
在一个方面，本公开内容提供了用于用在疗法中的本文中公开的式(I)的化合物。在另一个方面，本公开内容提供了用于用在疗法中的组合，其包含本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开内容提供了用于治疗疾病或障碍的组合，其包含本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开内容提供了本文中公开的式(I)的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疾病或障碍。在另一个方面，本公开内容提供了包含本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段的组合在药物制备中的用途，所述药物用于治疗疾病或障碍。
在一个方面，本公开内容提供了包含本文中公开的式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段的组合。
附图简要描述
图1A-1C：在有如实施例204中描述的抗-可替宁抗体存在下，给药ARM化合物(实施例36的化合物)的MC38荷瘤小鼠(人CCR2敲入C57小鼠)的分析；图1A显示了如实施例204中描述的，在抗-可替宁抗体存在下，用ARM化合物治疗(以不同浓度的ARM和抗体)的荷瘤小鼠的肿瘤体积随时间的变化；图1B显示了在小鼠中给药后不同时间点的ARM化合物的血液药物浓度(参见图1A的图例说明)；图1C显示了通过流式细胞计量术测定的CCR2表达细胞的％耗竭。
图2A-2B：如实施例209中描述的，在耗竭或不耗竭CD4和CD8T细胞的情况下，给药抗-可替宁抗体和ARM化合物(实施例36的化合物)的接种了MC38肿瘤的人CCR2敲入小鼠中的肿瘤生长；图2A显示了在有CD4和CD8 T细胞存在下的肿瘤生长；图2B显示了在耗竭了CD4和CD8 T细胞的情况下的肿瘤生长；结果证实，抗体/ARM化合物的肿瘤生长抑制依赖于CD4和CD8 T细胞的存在。
图3A-3B：小分子ARM化合物与抗-可替宁抗体的替代给药策略，如实施例206中描述的，将抗-可替宁抗体和小分子ARM化合物(实施例1)静脉内共同给药或依次给药；图3A显示了在施用后不同时间点的小分子ARM化合物的血液浓度(每个时间点代表三只试验动物，除了代表6只试验动物的168小时时间点外)；图3B显示了CCR2+表达细胞的耗竭百分比(参见图3A的图例)；结果证实，抗-可替宁抗体和小分子ARM化合物的共同给药与依次给药相比，PK和PD没有变化。
图4：小分子ARM化合物与抗-可替宁抗体的替代给药策略，如实施例206中描述的，将抗-可替宁抗体和小分子ARM化合物(实施例1)依次静脉内施用；显示了抗体和小分子ARM的依次施用的数据，其中在小分子ARM和抗体给药之间有2小时的间隔；结果证实，以2:1摩尔比的ARM与抗体给药足以使抗体饱和。
图5:小分子ARM化合物与抗-可替宁抗体的替代给药策略，如实施例206中描述的，静脉内施用抗-可替宁抗体，并且在小分子ARM:抗体的不同摩尔比给药抗体的2-小时延迟后皮下施用ARM化合物(实施例1)。显示的数据是在施用后不同时间点小分子ARM化合物的血液浓度。
图6A和6B：小分子ARM化合物相对于抗-可替宁抗体的替代给药策略，如实施例206中描述的，静脉内施用抗-可替宁抗体，并且口服施用ARM化合物(实施例36)；图6A显示了在施用后不同时间点小分子ARM化合物的血液浓度；图6B显示了通过流式细胞计量术测定的CCR2表达细胞的耗竭百分比(参见图6A的图例)。
图7A和7B：在实施例208中描述的可替宁“关闭开关(off-switch)”研究；图7A显示了在指定时间点施用(S)-可替宁后小分子ARM化合物的血液浓度；图7B显示了靶标表达细胞的耗竭。
图8A和8B：如实施例205中描述的MDSC耗竭后的离体T细胞扩增；图8A显示了流式细胞计量术数据，证明在有抗-可替宁抗体存在下用ARM化合物(实施例36)处理后CCR2+细胞的耗竭；图8B显示了分裂的CD8+T细胞的百分比；在3个供体样品中的2个中观察到CD8+T细胞扩增，其中观察到CCR2+细胞的强烈耗竭。
图9A和9B：在实施例207中描述的食蟹猴研究；图9A显示了在给药化合物和抗-可替宁抗体后，在血液中检测到的实施例1的化合物的量；图9B显示了通过流式细胞计量术测定的靶标表达细胞的耗竭。
图10A和10B:如实施例204中描述的，在用抗-可替宁抗体和ARM化合物(实施例36的化合物)处理后，小鼠的CD8 T细胞、mMDSC耗竭和存活的分析；图10A表明，与用单独的ARM化合物处理相比，在用ARM化合物+抗体处理后CD8+T细胞的百分比增加而mMDSC的百分比减少；图10B显示了用单独的ARM化合物或在抗-可替宁抗体存在下处理的荷瘤小鼠的存活百分比。
图11A和11B:如实施例210中描述的，来自从健康供体和癌症患者分离的PBMC中CCR2表达细胞的耗竭的CyTOF分析的数据；箭头指示表达CCR2的靶细胞群；图11A显示了来自健康供体的PBMC的耗竭；图11B显示了来自膀胱癌患者的PBMC的耗竭；数据证实，CCR2表达主要限于用于选择性耗竭的目标靶细胞(MDSC)，并且在抗-可替宁抗体+ARM化合物存在的情况下，表达CCR2的靶细胞会被选择性地耗竭(右图)，但在单独的ARM化合物存在下不会(左图)。
图12:与当前抗体技术相比，细胞毒性靶向嵌合体(CyTaCs)技术的示意图。
详细描述
在一个方面，本公开内容提供了式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-4烷基或C3-6环烷基；
R2是氢或C1-4烷基；
R3是氢或C1-4烷基；且
L是式(L-a)、(L-b)、(L-c)、(L-d)、(L-e)、(L-f)、(L-g)、(L-h)、(L-i)、(L-j)、(L-k)、(L-m)、(L-n-i)、(L-n-ii)、(L-n-iii)或(L-n-iv)的二价连接基。
在本公开内容的一个实施方案中，L是式(L-a)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
环A和环B各自独立地是C4-6亚环烷基；
L1a是C3-5直链亚烷基，其中1或2个亚甲基单元被-O-或-NRa-替换；
每个Ra独立地是氢或C1-3烷基；且
L2a是-O-、-NHC(O)-或-CH2-O-；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-a)的环A和环B各自独立地是
在另一个实施方案中，L是式(L-a-i)的二价连接基：
(L-a-i)，或其立体异构体，
其中：
环A是C4-6亚环烷基；
L1a是C3-5直链亚烷基，其中1或2个亚甲基单元被-O-或-NRa-替换；
每个Ra独立地是氢或C1-3烷基；且
L2a是-O-、-NHC(O)-或-CH2-O-；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-a-i)的环A是
在另一个实施方案中，L是式(L-a-ii)的二价连接基：
(L-a-ii)，或其立体异构体，
其中：
L1a是C3-5直链亚烷基，其中1或2个亚甲基单元被-O-或-NRa-替换；
每个Ra独立地是氢或C1-3烷基；
L2a是-O-、-NHC(O)-或-CH2-O-；
p是1或2；且
m是1或2；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自
其中：
j是1、2、3或4；
k是0、1、2或3；
j和k的总和是2、3或4；
q是1或2；
r是1或2；
s是0或1；
q、r和s的总和是2或3；
X1和X2独立地是-O-或NRa；且
每个Ra独立地是氢或C1-3烷基；
其中代表与式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的C(O)基团的共价键，且代表与式(L-a)的环B或与式(L-a-i)或(L-a-ii)的亚环己基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2O-、-(CH2)3O-、-(CH2)4O-、-(CH2)2OCH2-、-(CH2)3OCH2-、-(CH2)2O(CH2)2-、-CH2OCH2-、-CH2O(CH2)2-、-CH2O(CH2)3-、-CH2OCH2O-或-CH2OCH2OCH2-。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2O-、-(CH2)3O-、-(CH2)2OCH2-或-(CH2)3OCH2-。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2NRa-、-(CH2)3NRa-、-(CH2)4NRa-、-(CH2)2NRaCH2-、-(CH2)3NRaCH2-、-(CH2)2NRa(CH2)2-、-CH2NRaCH2-、-CH2NRa(CH2)2-、-CH2NRa(CH2)3-、-CH2NRaCH2NRa-或-CH2NRaCH2NRaCH2-，其中每个Ra独立地是氢或C1-3烷基。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2NRa-、-(CH2)3NRa-、-(CH2)2NRaCH2-或-(CH2)3NRaCH2-，其中Ra是氢或C1-3烷基。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2NH-、-(CH2)3NH-、-(CH2)4NH-、-(CH2)2NHCH2-、-(CH2)3NHCH2-、-(CH2)2NH(CH2)2-、-CH2NHCH2-、-CH2NH(CH2)2-、-CH2NH(CH2)3-、-CH2NHCH2NH-或-CH2NHCH2NHCH2-。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-(CH2)2NH-、-(CH2)3NH-、-(CH2)2NHCH2-或-(CH2)3NHCH2-。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-CH2OCH2NRa-、-CH2NRaCH2O-、-CH2OCH2NRaCH2-、-CH2NRaCH2OCH2-，其中Ra独立地是氢或C1-3烷基。在另一个实施方案中，式(L-a)、(L-a-i)或(L-a-ii)的L1a选自-CH2OCH2NH-、-CH2NHCH2O-、-CH2OCH2NHCH2-、-CH2NHCH2OCH2-。
在另一个实施方案中，L是式(L-a-iii)的二价连接基：
(L-a-iii)，或其立体异构体，
其中：
p是1或2；
m是1或2；且
n是1、2或3；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-a)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-b)的二价连接基：
(L-b)，或其立体异构体，
其中：
环A是C4-6亚环烷基或C7-9桥连二环亚环烷基；
L1b是-CH2-NH-C(O)-、-NHC(O)-或-C(O)NH-；
L2b是C6-12直链亚烷基，其中1、2、3或4个亚甲基单元被-O-、-NR1b-、-C(O)NR1b-或-NR1bC(O)-替换；或
L2b是其中n是1、2、3或4，且代表与L1b的共价键；且
每个R1b独立地是氢或C1-3烷基；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-b)的环A是
在另一个实施方案中，L是式(L-b-i)的二价连接基：
(L-b-i)，或其立体异构体，
其中：
L1b是-CH2-NH-C(O)-、-NHC(O)-或-C(O)NH-；
L2b是C6-12直链亚烷基，其中1、2、3或4个亚甲基单元被-O-、-NR1b-、-C(O)NR1b-或-NR1bC(O)-替换；或
L2b是其中n是1、2、3或4，且代表与L1b的共价键；
每个R1b独立地是氢或C1-3烷基；
p是1或2；且
m是1或2；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-b)或(L-b-i)的L2b选自
其中：
j是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
k是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
j和k的总和是5、6、7、8、9、10或11；
q是1、2、3、4、5、6、7、8或9；
r是1、2、3、4、5、6、7、8或9；
s是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
q、r和s的总和是4、5、6、7、8、9或10；
t是1、2、3、4、5、6或7；
u是1、2、3、4、5、6或7；
v是1、2、3、4、5、6或7；
w是0、1、2、3、4、5或6；
t、u、v和w的总和是3、4、5、6、7、8或9；
a是1、2、3、4或5；
b是1、2、3、4或5；
c是1、2、3、4或5；
d是1、2、3、4或5；
e是0、1、2、3或4；
a、b、c、d和e的总和是4、5、6、7或8；
X1、X2、X3和X4独立地是-O-、-NR1b-、-C(O)NR1b-或-NR1bC(O)-；且
每个R1b独立地是氢或C1-3烷基；
其中代表与式(L-b)或(L-b-i)的L1b的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-b)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-c)的二价连接基：
(L-c)，或其立体异构体，
其中：
L1c是C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
环A是C4-6亚环烷基或C7-9桥连二环亚环烷基；且
L2c是-O-或饱和的C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-c)的环A是
在另一个实施方案中，L是式(L-c-i)的二价连接基：
(L-c-i)，或其立体异构体，
其中：
L1c是C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
L2c是-O-或饱和的C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
p是1或2；且
m是1或2；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-c)或(L-c-i)的L1c选自
其中：
j是1、2、3、4、5、6、7、8或9；
k是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
j和k的总和是1、2、3、4、5、6、7、8或9；
q是1、2、3、4、5、6或7；
r是1、2、3、4、5、6或7；
s是0、1、2、3、4、5或6；
q、r和s的总和是2、3、4、5、6、7或8；
t是1、2、3、4或5；
u是1、2、3、4或5；
v是1、2、3、4或5；
w是0、1、2、3或4；
t、u、v和w的总和是3、4、5、6或7；且
X1、X2和X3独立地是-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-；
其中代表与式(L-c)或(L-c-i)的C(O)基团的共价键，且代表与式(L-c)或(L-c-i)的环的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-c)或(L-c-i)的L2c选自
其中：
j是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
k是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j和k的总和是1、2、3、4、5、6、7、8或9；
q是0、2、3、4、5、6或7；
r是1、2、3、4、5、6、7或8；
s是0、1、2、3、4、5、6或7；
q、r和s的总和是1、2、3、4、5、6、7或8；
t是0、1、2、3、4或5；
u是1、2、3、4、5或6；
v是1、2、3、4、5或6；
w是0、1、2、3、4或5；
t、u、v和w的总和是2、3、4、5、6或7；且
X1、X2和X3独立地是-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-；
其中代表与式(L-c)或(L-c-i)的环的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-c)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-d)的二价连接基：
其中：
L1d是C12-22直链亚烷基，其中1、2、3、4或5个亚甲基单元被-NH-、-O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-NHC(O)-NH-替换；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-d)的L1d选自
其中：
j是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
k是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
j和k的总和是11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21；
q是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19；
r是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19；
s是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18；
q、r和s的总和是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；
t是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17；
u是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17；
v是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17；
w是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16；
t、u、v和w的总和是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19；
a是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
b是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
c是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
d是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
e是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；
a、b、c、d和e的总和是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18；
f是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
g是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
h是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
i是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；
z是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
f、g、h、i、y和z的总和是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17；且
X1、X2、X3、X4和X5独立地是-NH-、-O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-NHC(O)-NH-；
其中代表与式(L-d)的C(O)基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-d)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-e)的二价连接基：
其中：
n是3至50的整数；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-e)的n是3至25、3至10、3至8、3至7、3至5、或3至4。在另一个实施方案中，式(L-e)的n是3、4、5、7、8、22或50。
在另一个实施方案中，L是式(L-f)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
L1f是键；C1-6直链亚烷基，其中0、1或2个亚甲基单元被-O-、-NH-或-C(O)-替换；或-(C3-6亚环烷基)-NHC(O)-；
L2f是键、-NHC(O)-、-C(O)NH-或C1-6直链亚烷基，其中0、1或2个亚甲基单元被-O-替换；且
Z1和Z2中的每个独立地是N或CH；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-f)的L1f选自
其中：
j是1、2、3、4或5；
k是0、1、2、3或4；
j和k的总和是1、2、3、4或5；
q是1、2或3；
r是1、2或3；
s是0、1、2；
q、r和s的总和是2、3或4；且
X1和X2独立地是-O-、-NH-或-C(O)-；或-(C3-6亚环烷基)-NHC(O)-；
其中代表与式(L-f)的C(O)基团的共价键，且代表与式(L-f)的环的共价键。
在另一个实施方案中，式(L-f)的L2f选自
其中：
j是1、2、3、4或5；
k是0、1、2、3或4；
j和k的总和是1、2、3、4或5；
q是1、2或3；
r是1、2或3；
s是0、1、2；且
q、r和s的总和是2、3或4；
其中代表与式(L-f)的环的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-f)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-g)的二价连接基：
其中：
环A是具有1或2个氮环原子的5至6元亚杂芳基；
L1g是键、-CH2-、-NH-或-O-；且
的共价键；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是式(L-g-i)的二价连接基：
其中：
L1g是键、-CH2-、-NH-或-O-；
L2g是其中n是1、2、3、4或5，且代表与L1g的共价键；
Z1、Z2和Z3各自独立地选自N或CH，前提条件是，Z1、Z2和Z3中的一个或两个是N；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-g)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-h)的二价连接基：
，或其立体异构体，
其中：
每个Z1独立地是N或CH；
L1h是键、-C(O)-、-C(O)-NH-或-NHC(O)-；
L2h是C2-10直链亚烷基或其中n是1、2、3或4，且代表与L1h的共价键且代表与L3h的共价键；
L3h是键、-C(O)CH2-、-O-(C3-6亚环烷基)-O-或-C(O)NH(CH2)3OCH2-；
L4h是键、-C(O)-、-CH2C(O)-或-C(O)CH2-；且
m是1、2或3；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-h)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-i)的二价连接基：
其中：
L1i是键、C1-12直链亚烷基或其中n是1、2、3、4或5，且代表与L3i的共价键且代表与NH的共价键；
L2i是键、C1-12直链亚烷基或其中n是1、2、3、4或5，且代表与HN的共价键；且
L3i是键或-C(O)-；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-i)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-j)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
Z1是C、CH或N；
Z2、Z3、Z4和Z5中的每个独立地是CH或N，前提条件是，Z2、Z3、Z4和Z5中的不超过两个是N；
L1j是-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O-；
L2j是C1-6直链亚烷基或其中n是1或2，且代表与L1j的共价键；且
代表单键或双键；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-j)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-k)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
环A是苯基或具有1或2个氮环原子的5或6元亚杂芳基；
Z1和Z2中的每个独立地是CH或N；
L1k是键、-C(O)-、-C(O)NH-或-NHC(O)-；且
L2k是C3-8直链亚烷基或其中n是1、2或3，且代表与L1k的共价键；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-k)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-m)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
Z1是CH或N；
m是1或2；
p是1或2；
的0、1或2个氢原子被F替换；
L1m是键、-C(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2NH-或-NHS(O)2-；且
L2m是C3-6直链亚烷基、C3-6亚环烷基或其中n是1或2，且代表与L1m的共价键；
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是选自以下的式(L-m)的二价连接基：
在另一个实施方案中，L是式(L-n-i)的二价连接基：
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是式(L-n-ii)的二价连接基：
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是式(L-n-iii)的二价连接基：
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，L是式(L-n-iv)的二价连接基：
其中代表与式(I)的NH基团的共价键，且代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
在另一个实施方案中，R1是甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基或叔丁基。在另一个实施方案中，R1是甲基。在另一个实施方案中，R1是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在另一个实施方案中，式(I)的化合物选自在表1中列出的化合物：
表1
定义
如本文和权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a)”和“该/所述(the)”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
如本文和权利要求中所使用的，术语“包含”涵盖“包括”或“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以排它地由X组成，或者可以包括另外的东西，例如X+Y。
术语“基本上由……组成”将特征的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质性影响所要求保护的特征的基本特征的那些。
术语“由……组成”排除任何另外组分的存在。
术语“致病细胞”包括造成或能够造成疾病的细胞子集。致病细胞的例子包括、但不限于致病免疫细胞、癌症或肿瘤细胞和基质细胞。致病细胞还可以是能够造成感染的致病体，诸如病毒或细菌细胞。
术语“致病性免疫细胞”包括造成或能够造成疾病的特定免疫细胞子集。这些细胞子集是常驻细胞，或者被招募到特定位置并分泌细胞因子、趋化因子和其它介质，并有助于疾病的持续和进展，诸如在肿瘤微环境情况下的癌症或在哮喘情况下的肺部慢性炎症。致病性免疫细胞的例子包括、但不限于骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、B调节性细胞(Bregs)、CD8调节性细胞、(CD8regs)和耗竭的T细胞。
术语“药物组合物”表示本发明的化合物和本领域普遍接受的用于将生物活性化合物递送至哺乳动物(例如，人类)的介质的制剂。这样的介质包括其所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
术语“有效量”和“治疗有效量”表示根据本发明的化合物或抗体或其抗原结合部分的量：当施用给有此需要的患者时，所述量足以实现所述化合物对其有用的疾病状态、病症或障碍的治疗。这样的量将足以引发研究人员或临床医师所寻求的组织系统或患者的生物学或医学应答。构成治疗有效量的根据本发明的化合物的量将根据诸如以下因素而变化：化合物及其生物活性、用于施用的组合物、施用时间、施用途径、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、所治疗的疾病状态或障碍的类型及其严重程度、与本发明的化合物组合或同时使用的药物、以及患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食。这样的治疗有效量可以由本领域普通技术人员考虑到他们自己的知识、技术水平和本公开内容常规地确定。
术语“烷基”代表具有指定数目的碳原子的饱和直链或支链烃部分。术语“C1-3烷基”表示含有1、2或3个碳原子的未被取代的烷基部分；示例性的烷基包括甲基、乙基和丙基。
术语“亚烷基”代表具有两个连接点的、具有指定数目的碳原子的饱和直链或支链烃部分。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“C1-3亚烷基”表示具有两个连接点的、含有1、2或3个碳原子的未被取代的烷基部分；示例性的C1-3亚烷基基团包括亚甲基、亚乙基和亚丙基。
术语“烯基”代表具有指定数目的碳原子的不饱和直链或支链烃部分。术语“C2-6烯基”表示含有2、3、4、5或6个碳原子的未被取代的烯基部分；示例性的烯基包括丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基。
术语“亚烯基”代表具有两个连接点的、具有指定数目的碳原子的不饱和直链或支链烃部分。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“C2-6亚烯基”表示具有两个连接点的含有2、3、4、5或6个碳原子的未被取代的烯基部分；示例性的C2-6亚烯基基团包括亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
术语“环烷基”代表具有指定数目的碳原子的饱和环状烃部分。术语“C3-6环烷基”表示含有3、4、5或6个碳原子的未被取代的环烷基部分；示例性的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“亚环烷基”代表具有两个连接点的、具有指定数目的碳原子的饱和环状烃部分。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“C4-6亚环烷基”表示具有两个连接点的、含有4、5或6个碳原子的未被取代的亚环烷基部分。示例性的亚环烷基基团包括环丁烷-1,3-二基、环戊烷-1,3-二基、环己烷-1,3-二基、或环己烷-1,4-二基。
术语“亚环烯基”代表具有两个连接点的、具有指定数目的碳原子的不饱和环状烃部分。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“C3-6亚环烯基”表示具有两个连接点的、含有3、4、5或6个碳原子的未被取代的亚环烯基部分。
术语“亚杂环烷基”表示具有两个连接点的、含有1或2个独立地选自氧、硫或氮原子的杂原子的饱和环状烃部分。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“3-至6-元亚杂环烷基”表示具有两个连接点的、除了1或2个氧、硫或氮原子外还含有2、3、4或5个碳原子的3-至6-元饱和环状部分。适当地，3-至6-元亚杂环烷基基团含有1个氧或氮原子。适当地，这样的基团含有3个碳原子和1个氧或氮原子，诸如氮杂环丁烷二基或氧杂环丁烷二基。适当地，这样的基团含有4或5个碳原子和1个氧或氮原子，诸如四氢呋喃二基、四氢吡喃二基、吡咯烷二基或哌啶二基。
术语“桥连二环亚环烷基”表示具有两个连接点的、具有至少一个桥的饱和二环烃部分。“桥”是无支链的原子链或连接两个桥头的原子或价键，其中“桥头”是环系统的任何骨架原子，其键合到三个或更多个骨架原子(不包括氢)。所述两个连接点可以来自相同的或不同的碳原子。术语“C7-9桥连二环亚环烷基”表示具有两个连接点的、含有7、8或9个碳原子的未被取代的桥连二环亚环烷基部分。
术语“亚芳基”表示具有两个连接点的单环或二环环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳族的。示例性的亚芳基基团包括亚苯基、亚联苯基、亚萘基和亚蒽基。
术语“亚杂芳基”表示具有两个连接点的单环或二环环系统，其中所述系统中的至少一个环是芳族的，并且除碳原子外，还具有1至5个独立地选自氧、硫或氮原子的杂原子。术语“5-至6-元亚杂芳基”表示具有两个连接点的、除了1、2或3个独立地选自氧、硫或氮原子的杂原子外还含有2、3、4或5个碳原子的5-至6-元环状芳族部分。
熟练的技术人员将理解，可以制备根据式(I)的化合物的盐，包括药学上可接受的盐。实际上，在本发明的某些实施方案中，盐(包括根据式(I)的化合物的药学上可接受的盐)可能优于各自的游离的或未成盐的化合物。因此，本发明进一步涉及根据式(I)的化合物的盐，包括药学上可接受的盐。本发明进一步涉及游离的或未成盐的式(I)的化合物。
本领域技术人员容易地制备本发明的化合物的盐，包括药学上可接受的盐。
代表性的药学上可接受的酸加成盐包括、但不限于4-乙酰氨基苯甲酸盐、乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(苯磺酸盐)、苯甲酸盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐(樟脑磺酸盐)、癸酸盐(癸酸盐)、己酸盐(己酸盐)、辛酸盐(辛酸盐)、肉桂酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、二葡萄糖酸盐、2,5-二羟基苯甲酸盐、琥珀酸氢盐(disuccinate)、十二烷基硫酸盐(依托酸盐)、依地酸盐(乙二胺四乙酸盐)、依托酸盐(月桂基硫酸盐)、乙烷-1,2-二磺酸盐(乙二磺酸盐)、乙烷磺酸盐(乙磺酸盐)、甲酸盐、富马酸盐、半乳糖二酸盐(粘酸盐)、龙胆酸盐(2,5-二羟基苯甲酸盐)、葡庚糖酸盐(葡庚糖酸盐)、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、己基间苯二酚盐、马尿酸盐、哈胺(hydrabamine)(N,N′-二(脱氢松香基)-乙二胺)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟基萘甲酸盐、异丁酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(甲磺酸盐)、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘-1,5-二磺酸盐(萘二磺酸盐)、萘-2-磺酸盐(萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、对氨基苯磺酸盐、对氨基水杨酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基乙酸盐、苯基乙基巴比妥酸盐、磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、焦谷氨酸盐、丙酮酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(8-氯茶碱盐)、硫氰酸盐、三乙基碘、三氟乙酸盐、十一烷酸盐、十一烯酸盐和戊酸盐。
代表性的药学上可接受的碱加成盐包括、但不限于铝、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIS，氨丁三醇)、精氨酸、苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)、二苄基乙二胺(N,N′-二苄基乙二胺)、b/s-(2-羟基乙基)胺、铋、钙、氯普鲁卡因、胆碱、克立咪唑(1-对氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基苯并咪唑)、环己基胺、二苄基乙二胺、二乙基胺、二乙基三胺、二甲基胺、二甲基乙醇胺、多巴胺、乙醇胺、乙二胺、L-组氨酸、铁、异喹啉、勒皮啶、锂、赖氨酸、镁、葡甲胺(N-甲基还原葡糖胺)、哌嗪、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、喹啉、钠、锶、叔丁基胺和锌。
根据式(I)的化合物可以含有一个或多个不对称中心(也被称作手性中心)，且因此可以作为各对映异构体、非对映异构体或其它立体异构形式或作为其混合物存在。手性中心，诸如手性碳原子，可以存在于取代基诸如烷基基团中。当在式(I)的化合物或本文所示的任何化学结构中存在手性中心的立体化学时，如果没有具体说明，则所述结构旨在涵盖所有单独的立体异构体及其所有混合物。因此，含有一个或多个手性中心的根据式(I)的化合物可以用作外消旋混合物、对映异构地富集的混合物或对映异构纯的单独立体异构体。
二价基团是具有两个连接点的基团。对于所有二价基团，除非另外指出，否则基团的取向由基团的式或结构的书写方向暗示。
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何组合物和方法可以用于实践或试验本公开内容的方法，但是本文描述了示例性的组合物和方法。还可以组合本文描述的本公开内容的方面和实施方案中的任一个。例如，本文公开的任何从属权利要求或独立权利要求的主题可以被多重组合(例如，每个从属权利要求的一个或多个叙述可以基于它们所依赖的独立权利要求而组合成单个权利要求)。
本文提供的范围包括在所描述的特定范围内的所有值以及关于特定范围的端点的值。
在环境温度和压强下测定本文描述的浓度。例如，这可以是在室温或在工艺流的特定部分中的温度和压强。优选地，在25℃和1巴压强的标准状态下测定浓度。
CCR2靶标和CCR2结合部分
本文中公开的式(I)的化合物是异双功能合成剂，其被设计为使得一个末端与细胞表面CCR2靶标相互作用，而另一末端结合特异性抗体。更具体地，ARM同时结合细胞表面CCR2靶标以及特异性抗体。这种三元复合物将免疫监视引导至表达CCR2的组织/细胞，并将抗体功能机制与小分子的剂量控制结合起来。该机制可能包括依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)或补体依赖性的细胞毒性(CDC)，并且优选包括ADCC。表达相同Fc受体的免疫细胞(其启动对ARM/抗体标记细胞的破坏)也参与内源性抗原的呈递，以实现长期细胞免疫的潜力。
本文中公开的式(I)的化合物包括能够结合在细胞表面上存在的CCR2的CCR2结合部分。在一个实施方案中，所述CCR2在致病细胞上表达。
在另一个实施方案中，所述致病细胞是致病性免疫细胞、肿瘤细胞或癌细胞或基质细胞(包括存在于肿瘤微环境中的基质细胞)。
在另一个实施方案中，所述CCR2靶标存在于选自病毒或细菌细胞的致病体的表面上。表达细胞表面靶标的病毒的例子包括、但不限于流感。
在另一个实施方案中，所述致病性免疫细胞是单核细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)诸如单核细胞MDSC(mMDSC)和多形核MDSC(PMN_MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞(例如，N2嗜中性粒细胞)、巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)、B调节性细胞(Bregs，记忆B细胞)、浆细胞、CD8细胞(例如，CD8调节性细胞(CD8regs)、记忆CD8细胞、效应CD8细胞、初始CD8 T细胞、TEMRA)、耗竭的T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突细胞、自然杀伤(NK细胞)、先天性淋巴样细胞、NK T细胞(NKT)或γδT细胞。
在另一个实施方案中，所述致病性免疫细胞是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)诸如单核细胞MDSC(mMDSC)和多形核MDSC(PMN_MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞(例如，N2嗜中性粒细胞)、巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)、B调节性细胞(Bregs)、CD8调节性细胞(CD8regs)、耗竭的T细胞。
在另一个实施方案中，所述表达CCR2的致病性免疫细胞是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。在另一个实施方案中，所述表达CCR2的致病性免疫细胞选自单核细胞MDSC(mMDSC)和多形核MDSC(PMN_MDSC)。
在另一个实施方案中，所述肿瘤细胞或癌细胞是实体瘤细胞。
在另一个实施方案中，所述肿瘤细胞或癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)细胞、肝细胞癌(HCC)细胞、结肠直肠癌(CRC)细胞、宫颈鳞状细胞癌(CESC)细胞、头和颈鳞状细胞癌(HNSC)细胞、胰腺癌细胞、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞或乳腺癌细胞，优选NSCLC细胞、HCC细胞或CRC细胞。
在另一个实施方案中，所述基质细胞是癌症相关的成纤维细胞(CAF)。
本公开内容也提供了一种药物组合物，其包含如在本文中公开的式(I)的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
抗-可替宁抗体
本公开内容提供了结合可替宁部分的抗体或其抗原结合片段。本文中使用的术语“抗-可替宁抗体或其抗原结合片段”表示与可替宁部分结合的抗体或其抗原结合片段。可替宁具有以下结构：
本文中使用的术语“可替宁部分”表示可替宁或可替宁的类似物。本文描述的式(I)的化合物包含通过连接基连接至CCR2结合部分的可替宁部分。在一个实施方案中，所述可替宁部分具有以下结构：
其中R1是C1-4烷基或C3-6环烷基。在另一个实施方案中，R1是甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基或叔丁基。在另一个实施方案中，R1是甲基。在另一个实施方案中，R1是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用，表示具有免疫球蛋白样结构域的分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，并且包括单克隆的、重组的、多克隆的、嵌合的、人的、人源化的、多特异性抗体，包括双特异性抗体和异源缀合物抗体；单个可变结构域(例如，结构域抗体(DAB))、结合抗原的抗体片段、Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、二硫键连接的scFv、双特异抗体、TANDABS等以及上述任一种的修改版本(关于替代性“抗体”形式的总结，参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology,2005,23(9):1126-1136)。
在本文中互换使用的术语“完全抗体”、“整个抗体”或“完整抗体”表示具有150,000道尔顿的近似分子量的异四聚体糖蛋白。完整抗体由通过共价二硫键连接的两条相同的重链(HC)和两条相同的轻链(LC)组成。这种H2L2结构折叠形成三个功能结构域，包括两个抗原结合片段(称为“Fab”片段)和“Fc”可结晶片段。所述Fab片段由在氨基末端的可变结构域、重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)以及在羧基末端的恒定结构域CH1(重链)和CL(轻链)组成。所述Fc片段由成对的CH2和CH3区域的二聚化形成的两个结构域组成。所述Fc可以通过结合免疫细胞上的受体或通过结合C1q(经典补体途径的第一个组成部分)来引发效应子功能。五类抗体IgM、IgA、IgG、IgE和IgD由不同的重链氨基酸序列定义，它们分别被称为μ、α、γ、ε和δ,每条重链可以与K或λ轻链配对。在血清中的大多数抗体属于IgG类，人IgG有四种同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，其序列主要在其铰链区中不同。
“CDR”被定义为抗体或其抗原结合片段的互补性决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文使用的“CDR”表示所有三个重链CDR、所有三个轻链CDR、所有重链和轻链CDR、或至少两个CDR。
贯穿本说明书，在全长抗原结合序列内(例如在抗体重链序列或抗体轻链序列内)的可变结构域序列和可变结构域区域中的氨基酸残基根据Kabat编号惯例进行编号。类似地，在实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号惯例。关于更多信息，参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。
本领域技术人员显而易见，对于可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基，存在替代性编号惯例。CDR序列也存在替代性编号惯例，例如在Chothia等人,Nature,1989,342:877-883中阐述的那些。抗原结合蛋白的结构和蛋白折叠可能意味着其它残基被认为是CDR序列的一部分并且技术人员将如此理解。
技术人员可用的CDR序列的其它编号惯例包括“AbM”(University of Bath)和“contact”(University College London)方法。
下面表2代表了对每个CDR或结合单元使用每种编号惯例的一种定义。应当指出，某些CDR定义可能根据所使用的各个出版物而变化。
表2
Kabat CDR Chothia CDR AbM CDR Contact CDR
H1 31-35/35A/35B 26-32/33/34 26-35/35A/35B 30-35/35A/35B
H2 50-65 52-56 50-58 47-58
H3 95-102 95-102 95-102 93-101
L1 24-34 24-34 24-34 30-36
L2 50-56 50-56 50-56 46-55
L3 89-97 89-97 89-97 89-96
在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体是人源化的。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体的Fc区被修饰以增加ADCC活性、ADCP活性和/或CDC活性，下文提供了其合适的修饰。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体的Fc区被修饰以增加ADCC活性。
可以应用Fc工程方法来修饰抗体的功能或药代动力学性能。通过在Fc区中产生突变可以改变效应子功能，所述突变增加或减少与C1q或Fcγ受体的结合并分别改变CDC或ADCC活性。还可以对抗体的糖基化模式进行修饰以改变效应子功能。通过产生影响Fc与FcRn(新生儿Fc受体)的结合的突变可以改变抗体的体内半衰期。
本文中使用的术语“效应子功能”表示以下中的一种或多种：抗体介导的效应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)，抗体介导的补体激活，包括补体依赖性的细胞毒性(CDC)、补体依赖性的细胞介导的吞噬作用(CDCP)、抗体依赖性的补体介导的细胞裂解(ADCML)和Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)。
认为抗原结合蛋白或抗体的Fc区与各种Fc受体(FcR)(包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、FcRn、C1q和II型Fc受体)之间的相互作用介导抗原结合蛋白或抗体的效应子功能。显著的生物学效应可以是效应子功能性的结果。通常，介导效应子功能的能力需要抗原结合蛋白或抗体与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白或抗体都会介导每种效应子功能。
可以以多种方式评估效应子功能，所述方式包括例如评价抗体的ADCC效应子功能，所述抗体通过FcγRIII包被至由自然杀伤(NK)细胞介导的靶细胞，或通过FcγRI包被至单核细胞/巨噬细胞，或评价抗体的CDC效应子功能，所述抗体通过C1q包被至由补体级联介导的靶细胞。例如，可以在自然杀伤细胞测定中关于ADCC效应子功能评估本发明的抗体或其抗原结合片段。这样的测定的例子可以参见Shields等人,The Journal ofBiological Chemistry,2001,276:6591-6604；Chappel等人,The Journal of BiologicalChemistry,1993,268:25124-25131；Lazar等人,PNAS,2006,103:4005-4010。
确定CDC功能的测定的例子包括在J Imm Meth,1995,184:29-38中描述的那些。
可以评估突变对效应子功能(例如，FcRn结合、FcγRs和C1q结合、CDC、ADCML、ADCC、ADCP)的影响，例如，如在Grevys等人,J Immunol.,2015,194(11):5497-5508；Tam等人,Antibodies,2017,6(3):12；或Monnet等人,mAbs,2014,6(2):422-436中所述。
贯穿本说明书，在抗体序列或全长抗原结合蛋白序列中的Fc区中的氨基酸残基根据EU索引编号惯例进行编号。
含有特定突变的人IgG1恒定区已经被证实会增强与Fc受体的结合。在某些情况下，这些突变也已经被证实会增强效应子功能，诸如ADCC和CDC，如下所述。本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括以下突变中的任一种。
增强的CDC：Fc工程可以用于增强基于补体的效应子功能。例如(参考IgG1)，K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；和IgG1/IgG3交叉亚类可以增加C1q结合；E345R(Diebolder等人,Science,2014,343:1260-1293)和E345R/E430G/S440Y产生预形成的IgG六聚体(Wang等人,Protein Cell,2018,9(1):63-73)。
增强的ADCC：Fc工程可以用于增强ADCC。例如(参考IgG1)，F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；和S298A/E333A/K334A增加FcγRIIIa结合；S239D/I332E/A330L增加FcγRIIIa结合并减少FcγRIIb结合；G236A/S239D/I332E提高与FcγRIIa的结合，提高FcγRIIa/FcγRIIb结合比(活化/抑制比)，并增强巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用。一种不对称的Fc，其中一条重链含有L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A突变，并且在相对重链中的D270E/K326D/A330M/K334E增加对FcγRIIIa F158(一种较低亲和力等位基因)的亲和力，并且FcγRIIIa V158(一种较高亲和力等位基因)与抑制性FcγRIIb的结合亲和力没有增加(Mimoto等人,mAbs,2013,5(2):229-236)。
增强的ADCP：Fc工程可以用于增强ADCP。例如(参考IgG1)，G236A/S239D/I332E增加FcγRIIa结合并增加FcγRIIIa结合(Richards,J.等人,Mol.Cancer Ther.,2008,7:2517-2527)。
增加的共同衔接：Fc工程可以用于增加与FcR的共同衔接。例如(参考IgG1)，S267E/L328F增加FcγRIIb结合；N325S/L328F增加FcγRIIa结合并减少FcγRIIIa结合(Wang等人,Protein Cell,2018,9(1):63-73))。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含具有改变的糖基化谱的重链恒定区，使得所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如，增强的ADCC、增强的CDC、或同时增强的ADCC和CDC。产生具有改变的糖基化谱的抗体或其抗原结合片段的合适方法的例子描述于WO 2003/011878、WO 2006/014679和EP1229125中。
α1,6最内部岩藻糖残基在IgG1抗体的N297上的Fc聚糖部分上的缺乏会增强对FcγRIIIA的亲和力。因此，去岩藻糖基化的或低岩藻糖基化的单克隆抗体可能具有增加的治疗效果(Shields等人,J Biol Chem.,2002,277(30):26733-40和Monnet等人,mAbs,2014,6(2):422-436)。
在一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含IgG1/IgG3嵌合重链恒定区，使得所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如增强的ADCC或增强的CDC、或增强的ADCC和CDC功能。例如，本发明的嵌合抗体或其抗原结合片段可以包含至少一个来自IgG3的CH2结构域。在一个这样的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个来自IgG3的CH2结构域，或两个CH2结构域可以来自IgG3。在另一个实施方案中，所述嵌合抗体或其抗原结合片段包含IgG1 CH1结构域、IgG3 CH2结构域和IgG3CH3结构域。在另一个实施方案中，所述嵌合抗体或其抗原结合片段包含IgG1 CH1结构域、IgG3 CH2结构域和IgG3 CH3结构域，但是位置435为组氨酸。
在另一个实施方案中，所述嵌合抗体或其抗原结合片段包含IgG1CH1结构域和至少一个来自IgG3的CH2结构域。在一个实施方案中，所述嵌合抗体或其抗原结合片段包含IgG1 CH1结构域和在CH2结构域中的下述残基，其对应于IgG3残基：274Q、276K、296F、300F和339T。在一个实施方案中，所述嵌合抗体或其抗原结合片段也包含在CH3结构域内的356E，其对应于IgG3残基。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段也包含下述残基中的一个或多个，其对应于在CH3结构域内的IgG3残基：358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F。
还提供了生产根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含核酸序列，其编码具有IgG1和IgG3 Fc区氨基酸残基的嵌合Fc区(例如如上所述)；和
b)回收所述抗体或其抗原结合片段。
例如，使用可从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)和Kyowa Hakko Kirin Co.,Ltd获得的COMPLEGENT技术系统，可以执行这样的用于生产具有嵌合重链恒定区的抗体或其抗原结合片段的方法。COMPLEGENT系统包含重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含表达载体，其中编码具有IgG1和IgG3 Fc区氨基酸残基的嵌合Fc区的核酸序列被表达以产生具有增强的CDC活性的抗体或其抗原结合片段，即CDC活性相对于缺乏这样的嵌合Fc区的在其它方面相同的抗体或其抗原结合片段而言有所增加，如WO 2007/011041和US 2007/0148165中所述，它们中的每一篇通过引用并入本文。在一个替代实施方案中，通过将序列特异性突变引入IgG链的Fc区中，可以增加CDC活性。本领域普通技术人员还将认识到其它适当的系统。
本发明也提供了一种生产根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸，任选地其中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经在所述重组宿主细胞中灭活；和
b)回收所述抗体或其抗原结合片段。
例如，使用可从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)得到的POTELLIGENT技术系统，可以执行这样的用于生产抗体或其抗原结合片段的方法，其中缺乏FUT8基因的功能拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的ADCC活性的单克隆抗体，所述活性相对于在具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体有所增加，如在美国专利号7,214,775、美国专利号6,946,292、WO 00/61739和WO 02/31240中所述，它们都通过引用并入本文。本领域普通技术人员还将认识到其它适当的系统。
在一个实施方案中，在其中FUT8基因已经被灭活的宿主细胞中生产所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，在-/-FUT8宿主细胞中生产所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段在Asn297(IgG1)处被去岩藻糖基化。
本领域技术人员显而易见，这样的修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用以进一步增强效应子功能。
在一个这样的实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含重链恒定区，其包含分别在上面描述的突变的和嵌合的重链恒定区。例如，包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域的抗体或其抗原结合片段，且其中所述IgG1 CH2结构域具有在选自239、332和330的位置处的一个或多个突变(例如所述突变可以选自S239D、I332E和A330L)，使得与缺乏所述突变的具有IgG1重链恒定区的等同抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如增强的ADCC或增强的CDC、或增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中，所述IgG1 CH2结构域具有突变S239D和I332E。在另一个实施方案中，所述IgG1CH2结构域具有突变S239D、A330L和I332E。
在一个替代实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含嵌合重链恒定区和改变的糖基化谱，分别在上面描述。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含改变的糖基化谱，使得岩藻糖与甘露糖的比率是0.8:3或更低。在一个这样的实施方案中，所述重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域并且具有改变的糖基化谱，使得岩藻糖与甘露糖的比率是0.8:3或更低，例如其中所述抗体或其抗原结合片段被去岩藻糖基化。与缺乏所述糖基化谱的具有IgG1重链恒定区的等同抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如增强的ADCC或增强的CDC、或增强的ADCC和增强的CDC。
在一个替代实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有至少一个IgG3重链CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定结构域，其中两个IgG CH2结构域根据本文描述的限制发生突变。
在一个方面，提供了一种生产根据本文描述的发明的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含以下步骤：
a)培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含核酸序列，其编码具有IgG1和IgG3 Fc结构域氨基酸残基(例如如上所述)的嵌合Fc结构域；且其中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经在所述重组宿主细胞中灭活；和
b)回收所述抗体或其抗原结合片段。
例如，使用可从BioWa,Inc.(Princeton,NJ)得到的ACCRETAMAB技术系统，可以执行这样的用于生产抗体或其抗原结合片段的方法，所述ACCRETAMAB技术系统组合POTELLIGENT和COMPLEGENT技术系统以产生与在其它方面相同的单克隆抗体(其缺少嵌合Fc结构域且被岩藻糖基化)相比具有增强的ADCC和CDC活性的抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，提供了包含突变的和嵌合的重链恒定区的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有改变的糖基化谱，使得所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如增强的ADCC或增强的CDC、或增强的ADCC和CDC。在一个实施方案中，所述突变选自位置239、332和330，例如S239D、I332E和A330L。在另一个实施方案中，所述重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH1结构域。在一个实施方案中，所述重链恒定区具有改变的糖基化谱，使得岩藻糖与甘露糖的比率是0.8:3或更低，例如所述抗体或其抗原结合片段被去岩藻糖基化，使得与缺少所述突变且缺少所述改变的糖基化谱的等同非嵌合抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能。
在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:1的重链CDR1、具有SEQ ID NO:2的重链CDR2、具有SEQ ID NO:3的重链CDR3、具有SEQ IDNO:4的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:5的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:6的轻链CDR3。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:1的CDR1、具有SEQ ID NO:2的CDR2和具有SEQ ID NO:3的CDR3，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:4的CDR1、具有SEQ ID NO:5的CDR2和具有SEQ ID NO:6的CDR3。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性，其中所述置换是S239D/I332E或S239D/I332E/A330L，其中残基编号是根据EU索引。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性，其中所述置换是S239D/I332E，其中残基编号是根据EU索引。
在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:7的重链可变区(VH)、具有SEQ ID NO:8的轻链可变区(VL)。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:8的轻链可变区(VL)。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性，其中所述置换是S239D/I332E或S239D/I332E/A330L，其中残基编号是根据EU索引。在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加或增强ADCC活性，其中所述置换是S239D/I332E，其中残基编号是根据EU索引。
在另一个实施方案中，所述抗-可替宁抗体具有包含SEQ ID NO:9的重链和包含SEQ ID NO:10的轻链。
本公开内容也提供了一种药物组合物，其包含如在本文中公开的抗-可替宁抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本公开内容也提供了一组组合，其包含如在本文中公开的式(I)的化合物和如本文中公开的抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。式(I)的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段可以存在于同一组合物中或存在于单独的组合物中。在一个实施方案中，组合包含药物组合物，其包含本文中公开的式(I)的化合物和本文公开的抗-可替宁抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，组合包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含本文中公开的式(I)的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述第二药物组合物包含如在本文中公开的抗-可替宁抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
使用说明
式(I)的化合物及其药学上可接受的盐能够同时结合细胞表面表达的CCR2和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段以形成用于治疗和/或预防与CCR2表达细胞相关的疾病或障碍的三元复合物。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的患者中治疗和/或预防疾病或障碍的方法，所述方法包含给所述患者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病或障碍选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染。
在另一个实施方案中，同时施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，从单一组合物同时施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段，包括作为固定剂量组合物或通过在施用之前预混合所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。例如，可以在施用前将所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段预混合约2秒至约30秒、约30秒至约2分钟、约2分钟至约10分钟、约10分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时。在另一个实施方案中，同时施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段从两种单独的组合物。
在另一个实施方案中，依次施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段，无论同时或依次施用，可以通过相同途径施用或可以通过不同途径施用。在一个实施方案中，所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段在相同组合物或单独组合物中静脉内地或皮下地施用。在另一个实施方案中，所述化合物口服施用并且所述抗体或其抗原结合片段静脉内地或皮下地施用。
在另一个实施方案中，以约2:1、约1.8:1、约1.6:1、约1.5:1、约1.4:1、约1.3:1、约1.2:1、约1:1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.8、约1:2、约2:1至约1.5:1、约1.5:1至约1.2:1、约1.2:1至约1:1、约1:1至约1:1.2、约1:1.2至约1:1.5、或约1:1.5至约1:2的化合物与抗体或其抗原结合片段的摩尔比施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段以约2:1、约1.8:1、约1.6:1、约1.5:1、约1.4:1、约1.3:1、约1.2:1、约1:1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.8、约1:2、约2:1至约1.5:1、约1.5:1至约1.2:1、约1.2:1至约1:1、约1:1至约1:1.2、约1:1.2至约1:1.5或约1:1.5至约1:2的化合物与抗体或其抗原结合片段的摩尔比作为组合呈现。
在另一个实施方案中，以0.0001mg/kg至1mg/kg的化合物和0.01mg/kg至100mg/kg的抗体的剂量施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。例如，在另一个实施方案中，以约0.0001mg/kg至约0.0002mg/kg、约0.0002mg/kg至约0.0003mg/kg、约0.0003mg/kg至约0.0004mg/kg、约0.0004mg/kg至约0.0005mg/kg、约0.0005mg/kg至约0.001mg/kg、约0.001mg/kg至约0.002mg/kg、约0.002mg/kg至约0.003mg/kg、约0.003mg/kg至约0.004mg/kg、约0.004mg/kg至约0.005mg/kg、约0.005mg/kg至约0.01mg/kg、约0.01mg/kg至约0.02mg/kg、约0.02mg/kg至约0.03mg/kg、约0.03mg/kg至约0.04mg/kg、约0.04mg/kg至约0.05mg/kg、约0.05mg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、和/或约0.5mg/kg至约1mg/kg的剂量施用所述化合物，并且以约0.01mg/kg至约0.02mg/kg、约0.02mg/kg至约0.03mg/kg、约0.03mg/kg至约0.04mg/kg、约0.04mg/kg至约0.05mg/kg、约0.05mg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约2mg/kg、约2mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约4mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约15mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg至约35mg/kg、约35mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约45mg/kg、约45mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约70mg/kg、约70mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约90mg/kg和/或约90mg/kg至约100mg/kg的剂量施用所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，以0.007mg至70mg的化合物和0.7mg至7000mg的抗体的剂量施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。例如，在另一个实施方案中，以约0.007mg至约0.01mg、约0.01mg至约0.02mg、约0.02mg至约0.03mg、约0.03mg至约0.04mg、约0.04mg至约0.05mg、约0.05mg至约0.1mg、约0.1mg至约0.2mg、约0.2mg至约0.3mg、约0.3mg至约0.4mg、约0.4mg至约0.5mg、约0.5mg至约1mg、约1mg至约2mg、约2mg至约3mg、约3mg至约4mg、约4mg至约5mg、约5mg至约10mg、约10mg至约20mg、约20mg至约30mg、约30mg至约40mg、约40mg至约50mg、约50mg至约60mg和/或约60mg至约70mg的剂量施用所述化合物，并且以约0.7mg至约1mg、约1mg至约2mg、约2mg至约3mg、约3mg至约4mg、约4mg至约5mg、约5mg至约10mg、约10mg至约20mg、约20mg至约30mg、约30mg至约40mg、约40mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约500mg、约500mg至约1000mg、约1000mg至约1500mg、约1500mg至约2000mg、约2000mg至约2500mg、约2500mg至约3000mg、约3000mg至约3500mg、约3500mg至约4000mg、约4000mg至约4500mg、约4500mg至约5000mg、约5000mg至约5500mg、约5500mg至约6000mg、约6000mg至约6500mg和/或约6500mg至约7000mg的剂量施用所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次以如本文描述的摩尔比和/或剂量施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段持续一周至一年的阶段，诸如一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月的阶段。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于用在疗法中的治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段可以用于治疗或预防选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染的疾病或障碍。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于制备药物的治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。所述药物可以用于治疗或预防选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染的疾病或障碍。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍由趋化因子受体2(CCR2)介导和/或与CCR2-阳性的致病细胞相关。在另一个实施方案中，通过免疫组织化学或流式细胞计量术试验CCR的表达，以鉴定CCR-阳性的细胞类型。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是选自非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、结肠直肠癌(CRC)、宫颈鳞状细胞癌(CESC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)、卵巢癌、膀胱癌或乳腺癌的癌症，优选选自NSCLC、HCC或CRC的癌症。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是实体瘤。在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是选自NSCLC、HCC、CRC、CESC、HNSC、胰腺癌、mCRPC、卵巢癌、膀胱癌或乳腺癌的实体瘤，优选选自NSCLC、HCC或CRC的实体瘤。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是PD-1复发性或难治性癌症，诸如PD-1复发性或难治性NSCLC、HCC、CRC、CESC、HNSC、胰腺癌、mCRPC、卵巢癌、膀胱癌或乳腺癌，优选PD-1复发性或难治性NSCLC、HCC或CRC。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是非实体癌症。在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是病毒感染。在另一个实施方案中，所述病毒感染由流感病毒、冠状病毒(例如，COVID-19)或乙型肝炎病毒造成。
在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是细菌感染。在另一个实施方案中，所述细菌感染是慢性细菌感染。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种增加CCR2表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种增加CCR2表达细胞的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种增加CCR2表达细胞的补体依赖性的细胞毒性(CDC)的方法，所述方法包含使所述细胞与有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种使患者适应嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法治疗的方法，所述方法包含给患者施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段与CAR-T细胞疗法联合施用。式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段可以作为调理疗法或联合疗法施用以改善在实体瘤癌症的治疗中的效力。在其它实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段可以作为其它疗法的新辅助治疗施用，所述其它疗法包括、但不限于免疫疗法、外科手术切除术、辐射和/或化学疗法。
在一个实施方案中，本公开内容提供了一种耗竭CCR2表达细胞的方法，所述方法包含使所述细胞与式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
在另一个实施方案中，所述CCR2表达细胞是致病细胞。
在另一个实施方案中，所述致病细胞是致病性免疫细胞、肿瘤细胞或癌细胞或基质细胞。
在另一个实施方案中，所述致病性免疫细胞是单核细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)诸如单核细胞MDSC(mMDSC)和多形核MDSC(PMN_MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞(例如，N2嗜中性粒细胞)、巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)、B调节性细胞(Bregs、记忆B细胞)、浆细胞、CD8细胞(例如，CD8调节性细胞(CD8regs)、记忆CD8细胞、效应CD8细胞、初始CD8 T细胞、TEMRA)、耗竭的T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突细胞、自然杀伤(NK细胞)、先天性淋巴样细胞、NK T细胞(NKT)或γδT细胞。
在另一个实施方案中，所述致病性免疫细胞是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)诸如单核细胞MDSC(mMDSC)和多形核MDSC(PMN_MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞(例如，N2嗜中性粒细胞)、巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)、B调节性细胞(Bregs)、CD8调节性细胞(CD8regs)、耗竭的T细胞。
在另一个实施方案中，所述肿瘤细胞或癌细胞是非小细胞肺癌(NSCLC)细胞、肝细胞癌(HCC)细胞、结肠直肠癌(CRC)细胞、宫颈鳞状细胞癌(CESC)细胞、头和颈鳞状细胞癌(HNSC)细胞、胰腺癌细胞、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞或乳腺癌细胞，优选NSCLC细胞、HCC细胞或CRC细胞。
在另一个实施方案中，所述基质细胞是癌症相关的成纤维细胞(CAF)。
联合疗法
本发明的化合物可以单独使用或与其它治疗剂联合使用。因此，根据本发明的联合疗法包含施用至少一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，以及使用至少一种其它药学活性剂。本发明的化合物和其它药学活性剂可以在单一药物组合物中一起施用或单独施用，且当单独施用时，这可同时发生或以任何顺序依次发生。为了实现希望的组合治疗效果，将选择本发明的化合物和其它药学活性剂的量以及相对的施用时机。应当理解，当本发明的化合物与通常通过吸入、静脉内、口服、鼻内、眼部局部或其它途径施用的一种或多种其它治疗活性剂联合施用时，可以通过相同途径施用所得药物组合物。可替换地，所述组合物的各个组分可以通过不同的途径施用。
在一个实施方案中，本文中公开的化合物和药物组合物与一种或多种另外的治疗剂联合使用，或包括一种或多种另外的治疗剂。在另一个实施方案中，所述另外的治疗剂是检验点抑制剂或免疫调节剂。
在另一个实施方案中，所述检验点抑制剂选自PD-1抑制剂(例如，抗-PD-1抗体，包括、但不限于派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗或dostarlimab)、PD-L1抑制剂(例如，抗-PD-L1抗体，包括、但不限于阿特朱单抗、阿维鲁单抗或度伐单抗)或CTLA-4抑制剂(例如，抗-CTLA-4抗体，包括、但不限于伊匹木单抗或tremilumumab)。
在另一个实施方案中，所述检验点抑制剂选自CD226轴抑制剂，包括、但不限于TIGIT抑制剂(例如，抗-TIGIT抗体)、CD96抑制剂(例如，抗-CD96抗体)和/或PVRIG抑制剂(例如，抗-PVRIG抗体)。
在另一个实施方案中，所述免疫调节剂是ICOS激动剂(例如，抗-ICOS抗体，包括、但不限于feladilimab)、PARP抑制剂(例如，尼拉帕尼、奥拉帕尼)或STING激动剂。
药物组合物、剂量和剂型
为了施用的目的，在某些实施方案中，本文描述的ARM作为原始化学品施用或被配制为药物组合物。本文公开的药物组合物包括ARM和以下的一种或多种：药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。ARM以有效治疗感兴趣的特定疾病、障碍或病症的量存在于所述组合物中。ARM的活性可以由本领域技术人员确定，例如，如下述生物测定中所述。本领域技术人员可以容易地确定适当的浓度和剂量。在某些实施方案中，ARM以约25mg至约500mg的量存在于药物组合物中。在某些实施方案中，ARM以约0.01mg至约300mg的量存在于药物组合物中。在某些实施方案中，ARM以约0.01mg、0.1mg、1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg或约500mg的量存在于药物组合物中。
通过用于服务类似用途的任何被接受的药剂施用模式，进行纯形式或在适当药物组合物中的本发明的化合物或其药学上可接受的盐的施用。通过将本发明的化合物与适当的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备本发明的药物组合物，并在具体实施方案中配制成固体、半固体、液体或气体形式的制品，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球和气雾剂。施用这样的药物组合物的示例性途径包括、但不限于口服、局部、透皮、吸入、胃肠外(例如，肌肉内、皮下、静脉内或真皮内)、舌下、含服、直肠、阴道和鼻内。本发明的药物组合物被配制为使得其中所含的活性成分在向患者施用所述组合物后可生物利用。
将施用给受试者或患者的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单次剂量单位，并且气雾剂形式的本发明的化合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或者是显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia.College of Pharmacy and Science,2000)。在任何情况下，待施用的组合物将含有治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，用于根据本文描述的教导治疗感兴趣的疾病或病症。
通过制药领域中众所周知的方法制备本文公开的药物组合物。例如，在某些实施方案中，通过将本发明的化合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备旨在通过注射施用的药物组合物。在某些实施方案中，添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是这样的化合物：其与本发明的化合物非共价地相互作用，从而促进所述化合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮。传统的抗体治疗剂具有几个缺点，所述缺点通过本文描述的ARM方案得到解决，包括通过调整施用的剂量和剂量频率来管理不利事件的困难，产生针对某些类别药物靶标(例如，GPCR、离子通道和酶)的抗体的挑战，并且每种新抗体都需要新的细胞系来开发，这可以是缓慢的且昂贵的。此外，不同形式的生物制品(例如，双特异性药剂)的制造可能具有挑战性。相比之下，ARM方案提供以下优点：将抗体的药理学与小分子的剂量控制相结合，剂量控制的PK/PD允许暂时细胞耗竭，更简单的多聚化，以及通过抗体结合组分(例如，可替宁半抗原)的给药快速逆转细胞耗竭，这可以将治疗效果与潜在不利事件分开。
实施例
下列实施例举例说明本发明。这些实施例无意限制本发明的范围，而是为熟练的技术人员提供制备和使用本发明的化合物、组合物和方法的指导。虽然描述了本发明的特定实施方案，但是熟练的技术人员将理解，可以做出各种改变和修改。对以与其它制备相似的方式或通过其它制备的一般方法进行的制备的提及，可以涵盖常规参数的变化，诸如时间、温度、后处理条件、试剂量的微小变化等。所有标题化合物的化学名称都使用ChemDraw插件版本16.0.1.13c(90)或ChemDraw桌面版本16.0.1.13(90)生成。
化合物合成
使用常规有机合成方法制备根据式(I)的化合物。在下面在下述一般反应方案中描绘了合适的合成途径。所有起始材料都是商购可得的或由本领域技术人员容易地由商购可得的起始材料制备。
熟练的技术人员将理解，如果本文描述的取代基与本文描述的合成方法不相容，则可以用对所述反应条件稳定的合适保护基团保护所述取代基。可以在反应顺序中的合适点除去保护基团以提供所需的中间体或目标化合物。合适的保护基团以及使用这样的合适的保护基团保护和去保护不同取代基的方法是本领域技术人员众所周知的；其例子可以参见T.Greene和P.Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis(第4版),John Wiley&Sons,NY(2006)。在某些情况下，可以具体选择取代基以在所使用的反应条件下具有反应性。在这些情况下，所述反应条件将所选取代基转化为另一种取代基，后者可用作中间体化合物或者是目标化合物中的所需取代基。
方案1
中间体
中间体1
(1R,2S)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-氧代环己烷-1-甲酸乙酯。
步骤1
8-氧代-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯。
在-78℃向1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-酮(125g,800mmol)在四氢呋喃(THF)(1300mL)中的溶液中加入双(三甲基硅烷基)氨基锂(800mL,800mmol,1M在THF中的溶液)2h。缓慢地加入氰基甲酸乙酯(79g,800mmol)并在-78℃搅拌6h。加入冰冷的水(2L)并将混合物用乙酸乙酯(2X 2000mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液蒸发。通过正相色谱法(硅胶60-120目柱)纯化，用10％乙酸乙酯在己烷中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(95g,403mmol,50.3％收率)。LC/MS:m/z 229.09(M+H)+。
步骤2
(E)-8-(((S)-1-苯基乙基)亚氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯。
向8-氧代-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯(100g,438mmol)在甲苯(1000mL)中的溶液中加入(S)-1-苯基乙胺(62.1mL,482mmol)和三氟甲磺酸镱(III)(1.087g,1.753mmol)，并将混合物使用Dean-Stark分离器回流搅拌3h以除去水。将混合物在减压下浓缩。与己烷(500mL)一起研磨，提供作为黄褐色固体的标题化合物(110g,327mmol,74.6％收率)。LC-MS m/z 332.28(M+H)+。
步骤3
(7R,8S)-8-(((S)-1-苯基乙基)氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯。
在0℃向(E)-8-(((S)-1-苯基乙基)亚氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯(110g,332mmol)在乙腈(550mL)和乙酸(275mL)中的溶液中逐份加入三乙酰氧基硼氢化钠(125g,587mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。将混合物蒸发并将残余物追加二氯甲烷(DCM)(2x 150mL)。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(1000mL)中并用30％氢氧化钠溶液(150mL)中和。将有机相用盐水(700mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液蒸发。通过正相色谱法(硅胶100-200目柱)纯化，用10％乙酸乙酯在石油醚中的溶液洗脱，提供作为黄色树胶状固体的标题化合物(90g,208mmol,62.8％收率)。LC-MS m/z 334.29(M+H)+。
步骤4
(7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-N-((S)-1-苯基乙基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-铵,4-甲基苯磺酸盐。
在0℃向(7R,8S)-8-(((S)-1-苯基乙基)氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯(90g,270mmol)在二氯甲烷(DCM)(900mL)中的溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(51.3g,270mmol)，并将混合物在26℃搅拌16h。将混合物在减压下浓缩，加入乙醚(200mL)，并将混合物搅拌30min。将沉淀物通过过滤进行收集并干燥以提供作为浅黄色固体的标题化合物(100g,197mmol,73.1％收率)。LC-MS m/z 334.35(M-172+H)+。
步骤5
(7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-1,4-二氧杂螺-[4.5]-癸烷-8-铵,4-甲基苯磺酸盐。
在室温向(7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-N-((S)-1-苯基乙基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-铵,4-甲基苯磺酸盐(100g,197mmol)在乙醇(1L)中的溶液中加入10％ Pd/C(30.5g,28.7mmol)，并将混合物在40psi的氢下在高压釜中在40℃搅拌16h。将混合物穿过过滤并将滤液蒸发以提供作为浅黄色树胶状固体的标题化合物(78g,194mmol,98％收率)。LC-MS m/z 230.1(M+H)+。
步骤6
(7R,8S)-8-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(甲硫基)丁酰氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯。
在26℃向(7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-铵,4-甲基苯磺酸盐(78g,194mmol)在乙腈(800mL)中的溶液中加入EDC·HCl(37.2g,194mmol)、HOBt(29.7g,194mmol)和三乙胺(81mL,581mmol)。加入商购可得的(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(甲硫基)丁酸(54.9g,194mmol)并将混合物在26℃搅拌16h。加入冰冷的水(700mL)并将混合物用乙酸乙酯(2x 800mL)萃取。将合并的有机萃取物经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供作为棕色液体的标题化合物(95g,187mmol,96％收率)。LC-MS m/z495.34(M+H)+。
步骤7
((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(((7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基)氨基)-4-氧代丁基)二甲基锍碘化物
在26℃向(7R,8S)-8-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(甲硫基)丁酰氨基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯(95g,192mmol)中加入碘甲烷(120mL,1921mmol)，并将混合物在26℃搅拌24h。将混合物蒸馏以提供粗产物。将粗产物用甲基叔丁基醚(MTBE)(300mL)洗涤以提供作为灰白色固体的标题化合物(115g,181mmol,94％收率)。LC-MS m/z509.2(M)+。
步骤8
(7R,8S)-8-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯。
在氮气气氛下向((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(((7R,8S)-7-(乙氧基羰基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基)氨基)-4-氧代丁基)二甲基锍碘化物(75g,118mmol)在无水DMSO(100mL)中的溶液中历时15min每2-3分钟逐份加入精细粉碎的碳酸铯(42.2g,130mmol)，并将混合物搅拌7h。将混合物过滤并用乙酸乙酯(300mL)洗涤。将乙酸乙酯(1000mL，冷的)和盐水(420mL)加入滤液中，将有机相用盐水(420mL)洗涤2次并在减压下浓缩以提供作为橙色油的标题化合物(39.6g,88.8mmol 75％收率)。LC-MS m/z 447.1(M+H)+。
步骤9
(1R,2S)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-氧代环己烷-1-甲酸乙酯。
将(7R,8S)-8-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸乙酯(47.12g,106mmol)、乙酸乙酯(156mL)、丙酮(255mL)、水(287mL)和浓HCl(13mL)的混合物在氮气气氛下在60℃搅拌3h。将混合物在冰浴中冷却并在冰箱中储存过夜。将混合物在减压下浓缩成悬浮液并用二氯甲烷(DCM)(1x 400mL,1x 150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(80mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物追加二氯甲烷(DCM)(3x 100mL)，在减压下在36℃干燥1h，并在真空下在室温放置2天以提供作为米色蜡状固体的标题化合物(40.0g,94％)。LC-MS m/z 403.3(M+H)+。
中间体2
(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐。
步骤1
(1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己烷-1-甲酸乙酯。
在室温向(1R,2S)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-氧代环己烷-1-甲酸乙酯(中间体1)(28.0g,69.6mmol)和异丙基甲基胺(12.32mL,118mmol)在二氯甲烷(DCM)(270mL)中的混合物中加入异丙醇钛(IV)(30.6mL,104mmol)。将混合物在氮气气氛下在室温搅拌21h。加入5％ Pt/C(4.07g,1.044mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌29h。在7h和16h之后重新填充氢气气球。将混合物穿过过滤并将催化剂用二氯甲烷(DCM)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(80mL)中，放在冰浴中，并加入乙酸乙酯(250mL)和(5g)。将混合物在室温搅拌4h并在室温声处理20min。将混合物穿过用湿的乙酸乙酯(4x 70mL)过滤。将合并的滤液在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x 100mL)以提供作为浅棕色油状泡沫的标题化合物(24.58g,77％)。LC-MS m/z 460.5(M+H)+。
步骤2
(1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己烷甲酸。
将(1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己烷-1-甲酸乙酯(24.58g,53.5mmol)溶解在甲苯(140mL)和二氯甲烷(DCM)(5mL)中并将溶液用2N HCl(2x67mL)萃取。将合并的水性提取物在氮气气氛下置于金属插入物中并在63℃加热22h。将混合物放在冰浴中并加入10N氢氧化钠(32mL)。混合物的最终温度为16℃。将混合物用甲苯(150mL)洗涤，并将水相过滤。将水性乳液(20mL)分离并穿过过滤。将合并的水相在冰浴中冷却，并用浓HCl将pH调至6至7。将混合物用NaCl饱和并用二氯甲烷(DCM)(200mL)萃取。加入浓HCl(0.5mL)并将水相用10％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液(2x 100mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩以提供作为米色泡沫状固体的标题化合物(14.18g,2.74mmol,61％)。LC-MS m/z432.4(M+H)+。
步骤3
((1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
给(1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己烷-1-甲酸(14.18g,32.9mmol)追加二氯甲烷(DCM)(30mL)和甲苯(330mL)(3x)。在氮气气氛下向残余物在无水甲苯(121mL)中的溶液中加入无水叔丁醇(31.0mL,329mmol)和三乙胺(16.0mL,115mmol)，并将混合物在金属插入物中在85℃加热5min。历时14min逐滴加入DPPA(7.79mL,36.1mmol)，并将混合物在氮气气氛下在85℃加热2.75h。将混合物冷却至室温，加入乙酸乙酯(280mL)，并使用冰浴将内部温度调至2至3℃。历时20min时段逐滴加入饱和的NaHCO3(280mL)，并将混合物在室温搅拌2h。将有机相用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物在室温置于真空下2天。加入叔丁醇(100mL)并将混合物在室温声处理20min。加入1N氢氧化钠(80mL)，将混合物在室温搅拌30min，并在减压下浓缩至80mL体积。加入二氯甲烷(DCM)(200mL)和水(40mL)，将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物追加乙酸乙酯(85mL)(2x)。将残余物在乙酸乙酯(30mL)和庚烷(40mL)中搅拌，通过过滤进行收集，并用1:10乙酸乙酯/庚烷溶液洗涤以提供作为白色固体的标题化合物(8.03g,15.02mmol,48.6％)。LC-MS m/z503.5(M+H)+。
步骤4
((1R,2S,5R)-2-((S)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
向((1R,2S,5R)-2-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(4.99g,9.93mmol)在乙醇(70mL)中的溶液中加入20重量％Pd(OH)2/C(0.7g,0.993mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌23h。将混合物在氮气气氛下穿过过滤，并将催化剂用乙醇(3x 10mL)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩并将残余物在室温置于真空下过夜以提供作为白色固体的标题化合物(3.64g,9.38mmol,99％收率)。LC-MS m/z369.4(M+H)+。
步骤5
((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
向((1R,2S,5R)-2-((S)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(异丙基(甲基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(3.64g,9.88mmol)在乙醇(100mL)中的溶液中加入商购可得的4-氯-6-(三氟甲基)喹唑啉(2.30g,9.88mmol)和DIPEA(2.77mL,15.84mmol)，并将混合物在氮气气氛下在金属插入物中在50℃加热3h。将混合物在减压下浓缩，加入二氯甲烷(DCM)(150mL)，并将有机相用水(30mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物通过ISCORf(220g RediSep Rf柱,120mL/min)纯化，用0至75％DCM/DCM在MeOH(含有1％ NH4OH)中的梯度洗脱，并然后用MeOH洗涤柱。将期望的级分合并并在减压下干燥以提供作为白色固体的标题化合物(4.32g,7.57mmol,77％收率)。LC-MS m/z 565.2(M+H)+。
步骤6
(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐。
向((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(3.18g,5.63mmol)在二氯甲烷(DCM)(8mL)中的混合物中加入HCl(7.04mL,28.2mmol)。将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供作为白色固体的标题化合物(3.5g,6.51mmol,116％收率)。LC-MS m/z 465.3(M+H)+。
中间体3
(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮。
步骤1
((S)-1-((7R,8S)-7-乙酰氨基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基)-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯。
在室温向(7R,8S)-8-((S)-3-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-7-甲酸(1.5g,3.58mmol)在甲苯(15mL)中的溶液中加入三乙胺(0.500mL,3.58mmol)。将混合物冷却至-10℃，加入氯甲酸异丁酯(0.471mL,3.58mmol)，并将混合物在0℃至-10℃搅拌30min。加入叠氮化钠(0.419g,6.45mmol)和四丁基溴化铵(0.058g,0.179mmol)在水(3.00mL)中的溶液，并将混合物在0℃至-10℃搅拌2h。加入水(50mL)和甲苯(100mL)并将混合物搅拌10min。将有机相经分子筛(4A)干燥，加入乙酸酐(0.744mL,7.89mmol)和乙酸(0.267mL,4.66mmol)，并将混合物在90℃搅拌4h。将混合物冷却至室温并在减压下浓缩。将残余物与戊烷(20mL)一起研磨以提供作为灰白色固体的标题化合物(0.8g,1.714mmol,47.8％收率)。LC-MS m/z432.2(M+H)+。
步骤2
((S)-1-((1S,2R)-2-乙酰氨基-4-氧代环己基)-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯。
向((S)-1-((7R,8S)-7-乙酰氨基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基)-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯(800mg,1.854mmol)在丙酮(10mL)中的溶液中加入HCl(5mL,5.00mmol)，并将混合物在50℃搅拌2h。将混合物冷却至室温并浓缩。加入水(10mL)并将混合物用二氯甲烷(DCM)(2x 50mL)萃取。将合并的有机萃取物经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。将残余物与乙醚(10mL)一起研磨以提供作为灰白色固体的标题化合物(600mg,1.490mmol,80％收率)。LC-MS m/z388.2(M+H)+。
步骤3
((S)-1-((1S,2R,4R)-2-乙酰氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯。
通过在5-10℃将异丙醇钛(IV)(0.282mL,0.964mmol)加入1MTiCl4在二氯甲烷(DCM)中的溶液(0.964mL,0.964mmol)中预形成TiCl2(i-OPr)2并将混合物搅拌15min。在-20℃将预形成的TiCl2(i-OPr)2加入((S)-1-((1S,2R)-2-乙酰氨基-4-氧代环己基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯(600mg,1.607mmol)和叔丁基胺(0.851mL,8.03mmol)在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的溶液中。将混合物温热至室温并搅拌2h。加入硼烷-二甲基硫复合物(0.153mL,1.607mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。加入二氯甲烷(DCM)(50mL)和水(50mL)并将混合物搅拌10min。将乳液穿过过滤并将水相用二氯甲烷(DCM)(50mL)萃取。将1N HCl(20mL)加入合并的有机萃取物中并将混合物搅拌10min。加入二氯甲烷(DCM)(50mL)并用氢氧化铵溶液将pH调至8至9。将有机相用氯化铵溶液(14％)(2x 25mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液蒸发。通过柱色谱法(中性氧化铝柱)纯化，用2％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(300mg,0.673mmol,41.9％收率)。LC-MSm/z445.48(M+H)+。
步骤4
N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁基氨基)环己基)乙酰胺。
将((S)-1-((1S,2R,4R)-2-乙酰氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-2-氧代吡咯烷-3-基)氨基甲酸苄酯(1.00g,2.249mmol)和10％ Pd/C(100mg,0.094mmol)在甲醇(10mL)中的混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌2h。将混合物穿过过滤，将催化剂用甲醇洗涤，并将合并的滤液在减压下浓缩以提供作为灰白色固体的标题化合物(696.1mg,2.242mmol,100％收率)。LC-MS m/z 311.5(M+H)+。
步骤5
N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-3-((2-氯-6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)环己基)乙酰胺。
将N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁基氨基)环己基)乙酰胺(683mg,2.200mmol)、商购可得的2,4-二氯-6-(三氟甲基)喹唑啉(587mg,2.200mmol)和DIPEA(0.615mL,3.52mmol)在乙醇(20mL)中的混合物在室温搅拌2小时并将混合物在减压下浓缩。加入饱和的NaHCO3并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩以提供作为浅黄色固体的标题化合物(1.128g,2.085mmol,95％收率)。LC-MS m/z 541.5(M+H)+。
步骤6
N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)乙酰胺。
向N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-3-((2-氯-6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)环己基)乙酰胺(4.61g,8.52mmol)在甲醇(150mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(1.360g,1.278mmol)和Cs2CO3(4.16g,12.78mmol)。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌3h。将混合物过滤并将催化剂用甲醇和用二氯甲烷(DCM)洗涤。将合并的滤液浓缩至干燥，将残余物用二氯甲烷(DCM)洗涤，并将合并的滤液浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(4.97g,9.81mmol,115％收率)。LC-MS m/z 507.1(M+H)+。
步骤7
(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮。
将N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)乙酰胺(814mg,1.607mmol)和2M HCl(7231μL,14.46mmol)的混合物在50℃搅拌6天。将混合物用饱和的NaHCO3碱化并在减压下浓缩至干燥。将残余物悬浮于10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液中，在室温搅拌1h，并过滤。将固体用10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗涤，并将合并的滤液浓缩。通过ISCO色谱法(80g RediSep Rf柱,60mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(300mg,0.646mmol,40.2％收率)。LC-MS m/z 465.4(M+H)+。
中间体4
(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
步骤1
((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(中间体2)(368mg,0.685mmol)和商购可得的(1r,4r)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(167mg,0.685mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.573mL,4.11mmol)和HATU(312mg,0.822mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(356mg,0.511mmol,74.6％收率)。LC-MS m/z 690.4(M+H)+。
步骤2
(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷甲酰胺,2盐酸盐。
向((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(355mg,0.515mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入HCl(1.029mL,4.12mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。将混合物浓缩至干燥以提供作为白色固体的标题化合物(340mg,0.513mmol,100％收率)。LC-MS m/z 590.3(M+H+)。
中间体5
(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
步骤1
((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(中间体2，步骤5)(3.022g,5.35mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(9.37mL,37.5mmol)和二氯甲烷(5mL)的混合物在室温搅拌4h，并浓缩至干燥。加入商购可得的(1s,4s)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(1.302g,5.35mmol)、二氯甲烷(DCM)(30.00mL)、三乙胺(3.73mL,26.8mmol)和HATU(2.442g,6.42mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(3.35g,4.86mmol,91％收率)。LC-MS m/z 690.4(M+H)+。
步骤2
(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
将((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(3.35g,4.86mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(7.28mL,29.1mmol)和二氯甲烷(DCM)(3mL)的混合物在室温搅拌4h。将混合物浓缩至干燥以提供作为白色固体的标题化合物(3.5g,5.28mmol,109％收率)。LC-MS m/z 590.2(M+H)+。
使用与关于中间体4和5描述的程序类似的程序制备下述中间体：
中间体9
(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
步骤1
((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮(105mg,0.226mmol)和商购可得的(1r,4r)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(55.0mg,0.226mmol(105mg,0.226mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入三乙胺(0.095mL,0.678mmol)和HATU(103mg,0.271mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(120mg,0.174mmol,77％收率)。LC-MS m/z 690.1(M+H)+。
步骤2
(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
将((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(70mg,0.101mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.2mL,0.800mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.1mL)的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩以提供标题化合物(70mg,0.106mmol,104％收率)。LC-MS m/z 590.0(M+H)+。
使用与关于中间体9描述的程序类似的程序制备下述中间体：
中间体11
(1s,3S)-3-(3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环丁烷甲酰胺,2盐酸盐。
步骤1
(2-(2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(1s,3S)-3-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环丁烷甲酰胺,2盐酸盐(225mg,0.355mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入商购可得的2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酸(98mg,0.355mmol)、三乙胺(0.396mL,2.84mmol)和HATU(162mg,0.426mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(283mg,0.345mmol,97％收率)。LC-MS m/z 821.1(M+H)+。
步骤2
(1s,3S)-3-(3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环丁烷-1-甲酰胺,2盐酸盐。
将(2-(2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(283mg,0.345mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.862mL,3.45mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.2mL)的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩至干燥以提供标题化合物(280mg,0.353mmol,102％收率)。LC-MS m/z 721.5(M+H)+。
中间体12
(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸。
将外消旋的(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(200g)溶解在沸腾的甲醇(4000mL)和乙腈(4000mL)中，并通过手性制备型HPLC(27次进样)(Chiralpak1A 101x 210mm 20μm柱,500mL/min)纯化，用乙腈/甲醇/甲酸(50:50:0.1)洗脱。将期望的级分收集并在减压下浓缩。将对映异构体-E1用乙腈洗涤并在高真空下干燥18h以提供作为白色固体的(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(93.1g)。也将其它对映异构体分离和表征(76g)。对映异构体-E1的分析型手性HPLC：96％ee，在保留时间2.3min(Chiralpak 1A 5μm 4.6x 150mm,1.0ml/min)，用乙腈/甲醇/甲酸(50:50:1)洗脱。对映异构体-E2具有99％ee，在保留时间7.2min。使用VCD分析分配绝对立体化学。
(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(对映异构体-E1)，LC-MSm/z 221.0(M+H)+。
(2R,3R)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(对映异构体-E2，LC-MSm/z 221.0(M+H)+。
中间体13
(2S,3S)-1-乙基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸
将外消旋的1-((2S,3S)-1-乙基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(630mg)溶解在甲醇(20mL)中，并通过手性SFC 80(Chiralpak IG 20mm x 250mm 5μm,50g/min,3mL进样体积)纯化，用40％乙醇洗脱，提供对映异构体-E1(2.8-3.4min)和对映异构体-E2(5.1-7.4min)。将这些期望的级分收集并在减压下干燥。将样品转移至20mL小瓶并在氮气流下在40℃干燥。使用下述方法使用分析型手性SFC确定每种对映异构体的手性纯度：
手性SFC分析型QC方法
仪器：Thar Investigator(1)
柱：Chiralpak IG 4.6x150mm，5μm
共溶剂：30％ EtOH
流速：3g/min
反压：100巴
紫外波长：220nm
温度：35℃
进样体积：5μL
基于SFC-UV数据，样品对映异构体-E1(保留时间2.17min,0.21g)的手性纯度为100％；且对映异构体-E2(保留时间4.47min,0.22g)为100％。
(2S,3S)-1-乙基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(对映异构体-E1)
LC-MS m/z 235.2(M+H)+.RT＝0.26min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.02(t,J＝7.2Hz,3H)2.64-2.84(m,2H)2.86-2.96(m,1H)3.15-3.25(m,1H)3.63(dd,J＝14,7.3Hz,1H)5.08(d,J＝6.1Hz,1H)7.54(dd,J＝7.6,4.9Hz,1H)7.88(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)8.58(td,J＝4.1,1.8Hz,2H)。
(2R,3R)-1-乙基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(对映异构体E-2)
LC-MS m/z 235.2(M+H)+RT＝0.30min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.02(t,J＝7.2Hz,3H)2.6-2.83(m,2H)2.86-2.96(m,1H)3.15-3.25(m,1H)3.63(dd,J＝14,7.2Hz,1H)5.08(d,J＝6.1Hz,1H)7.54(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.88(dt,J＝8.1,2.0Hz,1H)8.54-8.62(m,2H)。
使用与关于中间体13描述的程序类似的程序制备下述中间体：
中间体16
4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
步骤1
4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。
向((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(70mg,0.124mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.6mL)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)中并加入三乙胺(0.060mL,0.434mmol)。加入4-(1-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)环己-3-烯-1-甲酸(45mg,0.146mmol)和HATU(70.7mg,0.186mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物溶解在二甲亚砜(DMSO)(2mL)中并通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，以提供作为灰白色固体的标题化合物(50mg,0.065mmol,52.4％收率)。LC-MS m/z 754.1(M+H)+。
步骤2
4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
向4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(50mg,0.066mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(7.06mg,6.63μmol)。将烧瓶用氢气回填几次，并将混合物在室温搅拌过夜，并在50℃搅拌度过周末。将混合物穿过过滤并将滤液在减压下浓缩，以提供作为白色树胶状固体的反式-和顺式-异构体的混合物(50mg,0.063mmol,95％收率)。LC-MS m/z 758.5(M+H)+。
中间体17
3-乙氧基-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮。
将在THF(1mL)中的商购可得的3,4-二乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(73.3mg,0.431mmol)在-5℃搅拌，加入在THF(2mL)中的(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮(200mg,0.431mmol)，随后逐滴加入DIPEA(0.225mL,1.292mmol)。将混合物温热至室温并温热至室温。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(220mg,0.336mmol,78％收率)。LC-MS m/z 589.1(M+H)+。
中间体18
(2S,3S)-1-环丁基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸
步骤1
(Z)-N-环丁基-1-(吡啶-3-基)甲亚胺。
将烟醛(0.709mL,9.34mmol)和环丁胺(0.833mL,9.34mmol)的混合物在氮气气氛下在100℃搅拌25min。将悬浮液穿过MgSO4垫过滤，并用氘代二氯甲烷(CD2Cl2)洗涤。将产物经氮气干燥以提供标题化合物(0.4517g,2.82mmol,30.2％收率)。1H NMR(400MHz,二氯甲烷-d2)δppm 1.84-1.92(m,2H)2.13-2.25(m,2H)2.31-2.40(m,2H)4.17-4.26(m,1H)7.37(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)8.12(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)8.22(d,J＝1.5Hz,1H)8.63(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.86(d,J＝2.0Hz,1H)。
步骤2
(2S,3S)-1-环丁基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸
将(Z)-N-环丁基-1-(吡啶-3-基)甲亚胺(0.3372g,2.105mmol)和二氢呋喃-2,5-二酮(0.2150g,2.148mmol)在150℃搅拌1小时。加入乙醇并将沉淀物通过过滤进行收集以提供非对映异构体的混合物(0.1649g,0.634mmol,30.1％收率)。将混合物与另外的制品合并并根据下述方法分离。
将外消旋的(2S,3S)-1-环丁基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸和(2R,3R)-1-环丁基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(1.3g)溶解在乙腈/甲醇/甲酸(70:30:0.1)(120mL)中，并通过手性制备型HPLC(Chiralpak 1A 30x 250mm 5μm柱,45mL/min,25mL进样体积)纯化用乙腈/甲醇/甲酸(70:30:0.1)洗脱。将期望的级分收集并在减压下浓缩。收集这些级分并在减压下干燥。使用下述方法使用分析型手性UPLC确定每种异构体的手性纯度：
手性UPLC分析型QC方法
仪器：Acquity UPLC
柱：CHS C18 30x 2.1mm、1.7μm
洗脱溶剂：1-99％的乙腈(含有0.1％甲酸)在水(含有0.1％甲酸)中的梯度
流速：1.3mL/min
反压：100巴
紫外波长：210至350nm
温度：55℃
进样体积：0.55μL
基于手性UPLC-UV数据，对映异构体-E1(3.5min)(保留时间3.5min,500mg)的手性纯度为100％；且对映异构体-E2(保留时间6.5min,450mg)为100％。
对映异构体E1-aD＝+22度(c＝0.2,CH3OH)；LC-MS m/z 261.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝12.87(br s,1H),8.63-8.47(m,2H),7.71(td,J＝2.0,7.8Hz,1H),7.43(dd,J＝4.6,8.1Hz,1H),5.09(d,J＝4.4Hz,1H),4.20-3.98(m,1H),2.95(td,J＝4.8,9.0Hz,1H),2.84-2.72(m,1H),2.52-2.44(m,1H),2.29(quin,J＝10.0Hz,1H),2.02-1.78(m,2H),1.74-1.58(m,1H),1.56-1.38(m,2H)
中间体19
4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-甲酸叔丁酯。
将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(237mg,0.420mmol)和3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(1mL,3.00mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于含有三乙胺(0.205mL,1.469mmol)的二氯甲烷(DCM)(7mL)中。加入1'-(叔丁氧基羰基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酸(144mg,0.462mmol)和HATU(239mg,0.630mmol)，将混合物在室温搅拌1h，并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至pH 10，提供作为灰白色固体的标题化合物(267mg,0.345mmol,82％收率)。LC-MS m/z 759.4(M+H)+。
中间体20
2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
向(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(12.0g,61.5mmol)和2-溴乙酸叔丁酯(23.98g,123mmol)在甲苯(200mL)中的溶液中加入四丁基硫酸氢铵(10.44g,30.7mmol)。将反应混合物剧烈搅拌，缓慢地加入30％氢氧化钠溶液(27.2mL,61.5mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(220g硅胶柱,150mL/min)纯化，用0至40％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(16.48g,53.3mmol,87％收率)。LC-MS m/z 332.0(M+Na)+。
中间体21
2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐。
步骤12-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(7.08g,22.89mmol)在乙醇中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(0.244g,2.289mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填。将混合物在氢气气球气氛下搅拌度过周末并穿过过滤。将滤液浓缩以提供作为蜡的标题化合物(4.8g,22.74mmol,99％收率)。LC-MS m/z176.2(M+H)+。
步骤2
2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(400mg,1.816mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4.0mL)中的溶液中依次加入DIPEA(1.586mL,9.08mmol)、HOBt(278mg,1.816mmol)、HATU(1036mg,2.72mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(460mg,2.180mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将合并的滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(675mg,1.788mmol,98％收率)LC-MS m/z 378.3(M+H)+。
步骤3
2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐。
向2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(675mg,1.788mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入4M HCl在二氧杂环己烷中的溶液(5.0mL,20.00mmol)，将混合物搅拌1h，并浓缩至干燥以得到作为灰白色固体的标题化合物(640mg,1.789mmol,100％收率)。LC-MS m/z 322.1(M+H)+。
中间体22
2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
步骤1
(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸苄酯。
在0℃向2-(2-氨基乙氧基)乙烷-1-醇(3.0g,28.5mmol)和三乙胺(3.98mL,28.5mmol)在二氯甲烷(DCM)(50mL)中的溶液中逐滴加入氯甲酸苄酯(4.87g，28.5mmol)。将混合物在0℃搅拌2h，然后在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(2x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(3x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(120g硅胶柱,80mL/min)纯化，用50至90％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(6.48g,27.1mmol,95％收率)。LC-MS m/z240.3(M+H)+。
步骤23-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸叔丁酯。
向(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸苄酯(6.48g,27.1mmol)和2-溴乙酸叔丁酯(10.57g,54.2mmol)在甲苯(100mL)中的溶液中加入四丁基硫酸氢铵(4.60g,13.54mmol)。将反应混合物剧烈搅拌，缓慢地加入30％氢氧化钠溶液(12.0mL,27.1mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(120g硅胶柱,80mL/min)纯化，用0至40％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(7.25g,20.51mmol,76％收率)。LC-MS m/z 354.2(M+H)+。
步骤32-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸叔丁酯(4.20g,11.88mmol)在乙酸乙酯(40mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(0.126g,1.188mmol)。将反应混合物抽真空，用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌度过周末。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(2.65g,12.08mmol,102％收率)。LC-MS m/z 220.3(M+H)+。
中间体23
(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐(124mg,0.179mmol)和2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酸(49.7mg,0.179mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.200mL,1.432mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。加入HATU(82mg,0.215mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(12gRediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至20％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(90mg,0.124mmol,69.4％收率)。LC-MS m/z 724.4(M+H)+。
中间体24
(1S,4s)-4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)环己烷-1-甲酸，盐酸盐
步骤1
(S)-2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸4'-(叔丁基)4-乙基酯。
将4-溴苯甲酸叔丁酯(0.5g,1.945mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(0.57g,2.034mmol)、碳酸钠(0.824g,7.78mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.225g,0.194mmol)在1,4-二氧杂环己烷(10mL)和水(5.0mL)中的混合物通过真空/氮气回填循环脱气，并在80至90℃搅拌5h。将混合物冷却，倒入水(30mL)中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩。通过ISCO色谱法(80g Redisep Rf柱,60mL/min)纯化，用0至50％乙酸乙酯在庚烷中的溶液(25min)和50％乙酸乙酯在庚烷中的溶液(4min)的阶式梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物。LC-MS m/z 275.5(M+-tBu)+。
步骤24-(4-(乙氧基羰基)环己基)苯甲酸叔丁酯。
将2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4,4'-二甲酸4'-(叔丁基)4-乙基酯(451mg,1.365mmol)和10％ Pd/C(145mg,0.136mmol)在乙醇(10mL)中的混合物抽真空并用氢气回填几次。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌24h，穿过过滤，并将滤液浓缩以提供作为无色粘稠液体的标题化合物(461mg,1.317mmol,97％收率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.25-1.36(m,3H)1.42-1.85(m,14H)2.00(br dd,J＝13.8,3.0Hz,1H)2.11-2.21(m,1H)2.22-2.31(m,1H)2.52-2.68(m,1H)2.73(br d,J＝3.0Hz,1H)4.14-4.25(m,2H)7.24-7.28(m,2H)7.90-7.96(m,2H)。NMR与顺式和反式异构体的混合物(1:2)一致。
步骤3
(1S,4s)-4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)环己烷-1-甲酸乙酯，甲酸盐。
将4-(4-(乙氧基羰基)环己基)苯甲酸叔丁酯(120mg,0.361mmol)和3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(1mL,3mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的混合物在室温搅拌过夜，并在减压下浓缩以提供4-(4-(乙氧基羰基)环己基)苯甲酸。将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(114.3mg,0.202mmol)和3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物溶解在含有三乙胺(0.15mL,1.076mmol)的二氯甲烷(DCM)(5mL)中，加入4-(4-(乙氧基羰基)环己基)苯甲酸，随后加入HATU(148mg,0.389mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为白色固体的标题化合物。LC-MS m/z723.1(M+H)+。(36.9mg,0.047mmol,23.23％收率)。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.28(t,J＝7.0Hz,3H)1.33-1.58(m,7H)1.76(br t,J＝16.1Hz,2H)1.99-2.24(m,6H)2.26-2.46(m,4H)2.53(br s,3H)2.80(br s,3H)3.56-3.69(m,1H)3.78-3.96(m,2H)3.99-4.10(m,1H)4.15(q,J＝7.1Hz,2H)4.38(br s,1H)4.52(br s,1H)4.74-4.82(m,1H)5.50(s,1H)6.91(brd,J＝6.3Hz,2H)7.50(br d,J＝7.8Hz,2H)7.79(br d,J＝8.5Hz,1H)8.07(br d,J＝8.5Hz,1H)8.16(br s,1H)8.36(br s,2H)8.69(s,1H)。
步骤4
(1S,4s)-4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)环己烷-1-甲酸，盐酸盐。
将(1S,4s)-4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)环己烷-1-甲酸乙酯(36.9mg,0.051mmol)和2M HCl(1mL,2.000mmol)的混合物在50至55℃搅拌4h并在减压下浓缩，以提供作为白色固体的标题化合物(39mg,0.050mmol,98％收率)。LC-MS m/z695.5(M+H)+。
中间体25
1-(4-(乙氧基羰基)环己基)哌啶-4-甲酸，三氟乙酸盐。
将三乙胺(1.610ml,11.55mmol)加入哌啶-4-甲酸，三氟乙酸盐(2.96g,12.17mmol)和4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯(1.498ml,9.40mmol)在甲醇(72.3ml)中的溶液中，并将混合物在室温搅拌2min。加入甲基吡啶硼烷(1.106g,10.34mmol)，并将混合物在氮气气氛下放入在50℃预热的铝块中。将反应物在50℃维持1.5h并在室温搅拌过夜。将混合物依次加热至在60℃保持2h，在70℃保持2h，和在75℃保持1h。将混合物浓缩并溶解在二氯甲烷(DCM)中。将有机相用NaHCO3洗涤并将水相用1N HCl酸化。将水性和有机萃取物在减压下浓缩。通过反相HPLC(100g TFA C18柱,75mL/min)纯化，用0至50％乙腈在水中的梯度(含有0.01％ TFA)洗脱，提供作为澄清油的标题化合物(2.26g,2.218mmol,23.59％收率)。LC-MS m/z 284.2(M+H)+。
使用与关于中间体25描述的程序类似的程序制备下述中间体：
中间体28
((1s,4s)-4-氨基环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯。
步骤1
((1s,4s)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯。
向(1s,4s)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)环己烷-1-甲酸(827mg,2.98mmol)、HOBt(548mg,3.58mmol)、EDC(858mg,4.47mmol)和甘氨酸叔丁酯,盐酸盐(500mg,2.98mmol)在二氯甲烷(DCM)(10.0mL)中的溶液中加入DIPEA(2.60mL,14.91mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3，并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40gRedisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(1.16g,2.97mmol,100％收率)。LC-MS m/z 391.3(M+H)+。
步骤2
((1s,4s)-4-氨基环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯。
在氮气气氛下向((1s,4s)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯(1.16g,2.97mmol)在乙酸乙酯(20mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(0.032g,0.297mmol)。将混合物抽真空，用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌度过周末。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(590mg,2.302mmol,77％收率)。LC-MS m/z 257.3(M+H)+。
中间体29
3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-酮，三氟乙酸盐。
向9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(336mg,1.257mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.1mL)中的混合物中加入TFA(1.1mL,14.28mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩以提供标题化合物。LC-MS m/z 168.2(M+H)+。
中间体30
3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(861mg,1.5mmol)、3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(518mg,1.500mmol)和DIPEA(2.62mL,15.00mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入T3P(1.161mL,1.950mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入二氯甲烷(DCM)(10mL)和水(10mL)。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(354mg,0.443mmol,29.5％收率)。LC-MS m/z 792.4(M+H)+。
中间体31
((1R,4r)-4-(2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙基)环己基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(85mg,0.158mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.110mL,0.791mmol)，随后加入2-((反式)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己基)乙酸(48.8mg,0.190mmol)和HATU(90mg,0.237mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(86mg,0.120mmol,76％收率)。LC-MS m/z704.3(M+H)+。
中间体32
1-叠氮基-4-碘丁烷。
步骤14-叠氮基丁烷-1-醇。
将4-氯丁烷-1-醇(9.19mL,92mmol)和叠氮化钠(11.98g,184mmol)在二甲亚砜(DMSO)(65mL)中的混合物在85℃加热过夜，冷却，倒入水(75mL)中，并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩。通过正相柱色谱法(40g RediSep Rf柱,60mL/min)纯化，用10至50％乙酸乙酯在己烷类中的溶液(10柱体积)和50％乙酸乙酯在己烷类中的溶液(5柱体积)的阶式梯度洗脱，提供作为无色液体的标题化合物(9.56g,74.7mmol,81％收率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.64-1.77(m,5H)3.36(t,J＝6.2Hz,2H)3.72(t,J＝6.1Hz,2H)。
步骤2
甲磺酸4-叠氮基丁酯。
在0℃向4-叠氮基丁烷-1-醇(5.9g,51.2mmol)、三乙胺(7.14mL,51.2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(6.26g,51.2mmol)在二氯甲烷(DCM)(40mL)中的混合物中逐滴加入甲磺酰氯(3.99mL,51.2mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1h，倒入冰水(75mL)中，并用二氯甲烷(DCM)(3x 100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩。通过正相柱色谱法(40g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，提供作为浅黄色液体的标题产物。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.69-1.80(m,2H)1.85-1.93(m,2H)3.05(s,3H)3.39(t,J＝6.6Hz,2H)4.30(t,J＝6.2Hz,2H)。
步骤31-叠氮基-4-碘丁烷
向甲磺酸4-叠氮基丁酯(6.545g,33.9mmol)在丙酮(40mL)中的溶液中加入无水碘化钠(10.15g,67.7mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜并用乙醚(150mL)稀释。将沉淀物通过过滤除去，并将滤液在减压下浓缩。将残余物溶解在乙醚(150mL)中。将有机相用饱和的Na2S2O3(100mL)、用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩以提供作为淡棕色油的标题化合物(7.6g,30.4mmol,90％收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.68-1.81(m,2H)1.85-2.02(m,2H)3.24(t,J＝6.8Hz,2H)3.35(t,J＝6.7Hz,2H)。
中间体33
4-(4-(甲氧基羰基)哌啶-1-基)苯甲酸。
步骤1
1-(4-(叔丁氧基羰基)苯基)哌啶-4-甲酸甲酯。
在室温在氮气气氛下将DIPEA(10.68mL,61.2mmol)加入4-氟苯甲酸叔丁酯(4g,20.39mmol)和哌啶-4-甲酸甲酯(3.30mL,24.46mmol)在二甲亚砜(DMSO)(20mL)中的溶液中。将混合物在145℃搅拌16h并冷却至室温。加入水(100mL)并将混合物用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(2x 50mL)、用盐水(1x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱)纯化，用5至20％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(1.4g,4.24mmol,20.80％收率)。LC-MS m/z 320.2(M+H)+。
步骤2
4-(4-(甲氧基羰基)哌啶-1-基)苯甲酸。
在0℃向1-(4-(叔丁氧基羰基)苯基)哌啶-4-甲酸甲酯(500mg,1.565mmol))在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的溶液中加入在1,4二氧杂环己烷中的HCl(1.957mL,7.83mmol)。将混合物在室温搅拌16h并在减压下浓缩。将残余物与乙醚(20mL)一起研磨以提供作为白色固体的标题化合物(0.28g,0.957mmol,61.1％收率)。LC-MS m/z 264.0(M+H)+。
中间体34
4-((1r,4r)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
在氮气气氛下将乙酸(3.37ml)加入4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯(4.68ml,29.4mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(6.57g,35.3mmol)在二氯甲烷(DCM)(49.9ml)中的溶液中，并将混合物搅拌5min。加入三乙酰氧基硼氢化钠(9.60g,45.3mmol)。将混合物在50℃搅拌1h。加入水并将混合物用1M氢氧化钠碱化至pH 8，并用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将它通过EZ-Prep使用275g HpC18 Aq柱在ACN/水中纯化，以提供作为黄色油的标题化合物(1.609g,4.58mmol,15.61％收率)。LC-MS m/z 341.4(M+H)+。
中间体35
4-(1-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)环己-3-烯-1-甲酸。
步骤1
4-(4-(乙氧基羰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。
将4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1.11g,3.35mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(1.0g,3.57mmol)、碳酸钠(1.065g,10.05mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.387g,0.335mmol)在1,4-二氧杂环己烷(12mL)和水(4.0mL)中的混合物通过真空/氮气回填循环脱气，并在微波反应器中在80℃搅拌3h。将混合物冷却，加入水(30mL)，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并将滤液浓缩。将残余物通过正相色谱法(40g ISCO柱,45mL/min)纯化，用0至30％乙酸乙酯在庚烷中的溶液(9CV)和30％乙酸乙酯在庚烷中的溶液(5CV)的阶式梯度洗脱，提供作为蜡样固体的标题化合物(527.2mg,1.493mmol,44.6％收率)。
步骤2
4-(1-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)环己-3-烯-1-甲酸。
将4-(4-(乙氧基羰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(349mg,1.040mmol)和2N氢氧化钠水溶液(1.5mL,3.00mmol)在四氢呋喃(THF)(2mL)和乙醇(2mL)中的混合物在室温搅拌过夜并在减压下浓缩以除去有机溶剂。用1N HCl将pH调至4至5并搅拌1h。将沉淀物通过过滤进行收集，用水洗涤，并在空气流中干燥以提供作为米色固体的标题化合物(305mg,0.992mmol,95％收率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.41(s,9H)1.52-1.63(m,1H)1.92-2.07(m,1H)2.10-2.46(m,7H)3.36-3.48(m,2H)3.91(br s,2H)5.70(br s,1H)5.78(br s,1H)12.19(br s,1H)。
使用与关于中间体35描述的程序类似的程序制备下述中间体：
中间体38
3-(2-(2-(异丙基氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1.00g,4.29mmol)在丙酮(0.373g,6.43mmol)和二氯甲烷(DCM)(20mL)中的溶液中加入2滴乙酸，随后加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.271g,10.72mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(1.20g,4.36mmol,102％收率)。LC-MS m/z 276.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.99(d,J＝6.4Hz,6H)1.40(s,9H)2.42(t,J＝6.4Hz,2H)2.68(t,J＝5.9Hz,2H)2.72-2.81(m,1H)3.46(t,J＝5.6Hz,2H)3.49(s,4H)3.59(t,J＝6.4Hz,2H)5.77(s,1H)。
中间体39
2-(2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酸。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.079mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.25mL)中的溶液中逐滴加入溶解在二氯甲烷中的1,4-二氧杂环己烷-2,6-二酮(10.20mg,0.079mmol)和DIPEA(0.028mL,0.158mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩以提供标题化合物(0.0458mg,0.079mmol,100％收率)。LC-MS m/z 581.0(M+H)+。
中间体40
4-(哌嗪-1-羰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
向哌嗪-1,4-二甲酸1-叔丁基4-(4-硝基苯基)酯(5.2g,14.80mmol)在四氢呋喃(THF)(148ml)中的溶液中加入哌嗪(2.55g,29.6mmol)。将混合物在70℃搅拌16h并在减压下浓缩。通过正相柱色谱法纯化，用10％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱，提供作为淡黄色固体的标题化合物(3.3g,11.06mmol,74.7％收率)。LC-MS m/z 299.1(M+H)+。
中间体41
4-甲基苯磺酸9-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-9-氧代壬酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐(154mg,0.222mmol)在二氯甲烷(DCM)(1ml)中的混合物中加入三乙胺(0.248mL,1.779mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。加入在DCM(1ml)中的9-(甲苯磺酰氧基)壬酸(73.0mg,0.222mmol)和HATU(101mg,0.267mmol)，并将混合物在室温搅拌15min。将混合物在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配，并将水层用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至50％甲醇/二氯甲烷(80:20)在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为淡黄色油的标题化合物(120mg,0.155mmol,69.6％收率)。LC-MS m/z 775.2(M+H)+。
实施例1
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-(4-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己烷醇。
在0℃在氮气气氛下向商购可得的(1r,4r)-环己烷-1,4-二醇(2.4g,20.66mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)中的溶液中加入氢化钠(60％在矿物油中)(0.826g,20.66mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。在0℃加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺(4.29g,16.53mmol)，并将混合物在80℃搅拌6h。加入冰水(50mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3x60mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(50g柱)纯化，用0至20％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物。(2.5g,7.29mmol,35.3％收率)。LC-MS m/z 340.0(M+H)+。
步骤2
(E)-4-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁-2-烯酸甲酯。
在室温在氮气气氛下向(1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己烷醇(2.5g,7.36mmol)在甲苯(30mL)中的溶液中加入乙酸(0.084mL,1.473mmol)、三苯基膦(0.097g,0.368mmol)和丁-2-炔酸甲酯(1.084g,11.05mmol)。将混合物在115℃搅拌16h，冷却至室温，并加入乙酸乙酯(100mL)。将有机相用水(2x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(25g柱)纯化，用0至30％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，提供作为黄色油的标题化合物(1.77g,3.56mmol,48.3％收率)。LC-MS m/z438.0(M+H)+。
步骤34-(((1r,4r)-4-(2-氨基乙氧基)环己基)氧基)丁酸甲酯。
在室温向(E)-4-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁-2-烯酸甲酯(1.7g,3.89mmol)在甲醇(20ML)中的搅拌溶液中加入乙酸(0.445mL,7.77mmol)和10％Pd/C(600mg,0.564mmol)。将得到的反应混合物在氢气气氛下在室温搅拌16h。加入甲醇(50mL)，将混合物穿过过滤，将催化剂用甲醇(3x 20mL)洗涤，并将合并的滤液在减压下浓缩以提供作为无色油的标题化合物(0.9g,3.44mmol,88％收率)。LC-MS m/z260.0(M+H)+。
步骤44-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁酸甲酯。
在氮气气氛下向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(0.75g,3.41mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中的溶液中加入DIPEA(1.190mL,6.81mmol)、HATU(1.942g,5.11mmol)和4-(((1r,4r)-4-(2-氨基乙氧基)环己基)氧基)丁酸甲酯(0.883g,3.41mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。加入水(50mL)，将混合物用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(25g柱)纯化，用5％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为黄色油的标题化合物(750mg,1.397mmol,41.0％收率)。LC-MS m/z 462.0(M+H)+。
步骤5
4-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁酸。
向4-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁酸甲酯(700mg,1.517mmol)在甲醇(5.0mL)和水(5.00mL)中的溶液中加入氢氧化锂(54.5mg,2.275mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。在减压下除去甲醇，用1.5N HCl溶液将pH调至6，并将混合物在减压下浓缩。通过制备型反相HPLC(YMC-Triart C18 ExRS 5μm柱；15mL/min)纯化，用10至50％和100％乙腈在含有甲酸(0.1％)的水中的阶式梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(256mg,0.566mmol,37.3％收率)。LC-MS m/z 448.1(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-(4-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(59.2mg,0.089mmol)和4-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丁酸(40mg,0.089mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.075mL,0.536mmol)和HATU(40.8mg,0.107mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过反相HPLC(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％的含有氢氧化铵(1％)的乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(56.1mg,0.055mmol,61.6％收率)。LC-MS m/z 1019.1(M)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.03(br d,J＝6.4Hz,3H)1.16(br d,J＝6.4Hz,3H)1.20-1.34(m,7H)1.58(q,J＝12.2Hz,2H)1.67-1.89(m,6H)1.88-2.04(m,10H)2.05-2.18(m,2H)2.18-2.26(m,3H)2.28(s,3H)2.31-2.39(m,1H)2.49-2.59(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.76(m,2H)2.77-2.93(m,1H)3.02-3.10(m,1H)3.22-3.31(m,2H)3.34-3.55(m,9H)3.56-3.69(m,2H)4.03(dt,J＝12.7,3.7Hz,1H)4.66(br d,J＝2.4Hz,1H)4.87-5.06(m,1H)5.27(t,J＝8.1Hz,1H)7.53(dd,J＝8.8,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.58(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H)8.59(s,1H)8.81(s,1H)
用与在实施例1中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例16
(2S,3S)-N-(3-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(242mg,1.101mmol)在二氯甲烷(DCM)(10.0mL)中的溶液中加入商购可得的3-氨基丙酸叔丁酯，盐酸盐(200mg,1.101mmol)、HOBt(202mg,1.321mmol)、EDC(317mg,1.651mmol)和DIPEA(0.961mL,5.50mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(370mg,1.065mmol,97％收率)。LC-MS m/z 348.2(M+H)+。
步骤2
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
将3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯(180mg,0.518mmol)、4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)和二氯甲烷(DCM)(2.0mL)的混合物搅拌1h并浓缩。加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、DIPEA(0.452mL,2.59mmol)和HOBt(79mg,0.518mmol)以及商购可得的3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(121mg,0.518mmol)。加入EDC(149mg,0.777mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。将混合物用饱和的NaHCO3稀释并用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(240mg,0.474mmol,91％收率)。LC-MS m/z 507.2(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(3-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(49.5mg,0.098mmol)、4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)和二氯甲烷(DCM)(2.0mL)的混合物搅拌1小时并浓缩。加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.081mmol)、HOBt(12.48mg,0.081mmol)和DIPEA(0.071mL,0.407mmol)。加入EDC(23.43mg,0.122mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(60.3mg,0.056mmol,68.8％收率)。LC-MS m/z 1022.0(M)+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.89(d,J＝6.4Hz,3H)1.04(d,J＝6.9Hz,3H)1.44(br d,J＝13Hz,2H)1.50-1.81(m,9H)1.87-2.12(m,5H)2.14(s,3H)2.22(t,J＝6.9Hz,2H)2.28(t,J＝6.6Hz,2H)2.31-2.47(m,2H)2.49(s,3H)2.55-2.62(m,1H)2.63-2.75(m,1H)2.86-2.95(m,1H)3.09-3.32(m,5H)3.35-3.46(m,6H)3.47-3.60(m,3H)3.70(br s,1H)3.89(br d,J＝11Hz,1H)4.42(br s,1H)4.63(d,J＝5.9Hz,1H)5.03(q,J＝8.3Hz,1H)7.43(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.56-7.75(m,2H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)7.93(t,J＝5.6Hz,1H)8.00-8.15(m,2H)8.47(d,J＝1.5Hz,1H)8.55(dd,J＝4.7,1.7Hz,1H)8.58(s,1H)8.62-8.77(m,2H)8.89(s,1H)。
实施例17
(2S,3S)-N-(4-((3-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤13-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯。
向商购可得的(3-羟基丙基)氨基甲酸苄酯(15.0g,71.7mmol)和丙烯酸叔丁酯(13.78g,108mmol)在四氢呋喃(THF)(200mL)中的溶液中加入KOH(4.02g,71.7mmol)在水(2.67mL)中的溶液，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(300g硅胶柱,200mL/min)纯化，用0至40％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(10.3g,30.5mmol,42.6％收率)。LC-MS m/z 338.1(M+H)+。
步骤23-(3-氨基丙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯(500mg,1.482mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中加入10％ Pd/C,Degussa型(15.77mg,0.148mmol)。将混合物置于减压下，将反应瓶用氢气(3x)回填，并将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(301mg,1.481mmol,100％收率)。LC-MS m/z 204.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.41(s,8H)1.50-1.61(m,2H)2.37-2.43(m,2H)2.56(t,J＝6.8Hz,2H)3.41(t,J＝6.4Hz,2H)3.54(t,J＝6.4Hz,2H)。
步骤33,8-二氧代-1-苯基-2,13-二氧杂-4,9-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
向商购可得的4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(420mg,1.771mmol)、3-(3-氨基丙氧基)丙酸叔丁酯(300mg,1.476mmol)、DIPEA(1.289mL,7.38mmol)、HOBt(271mg,1.771mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的混合物中加入EDC(424mg,2.214mmol)，并将混合物搅拌过夜。将混合物用水稀释并用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(563mg,1.332mmol,90％收率)。LC-MS m/z 423.2(M+H)+。
步骤4
3-(3-(4-氨基丁酰氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,8-二氧代-1-苯基-2,13-二氧杂-4,9-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(560mg,1.325mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液中加入10％ Pd/C,Degussa型(14.10mg,0.133mmol)。将混合物置于减压下，将反应瓶用氢气(3x)回填，并将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(382mg,1.325mmol,100％收率)。LC-MS m/z 289.2(M+H)+。
步骤5
3-(3-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(240mg,1.090mmol)在二氯甲烷(10.0mL)中的溶液中加入商购可得的3-(3-(4-氨基丁酰氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯(377mg,1.308mmol)、HOBt(200mg,1.308mmol)和EDC(313mg,1.635mmol)。加入DIPEA(0.952mL,5.45mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(480mg,0.978mmol,90％收率)。LC-MS m/z491.1(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(4-((3-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
将3-(3-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯(62.2mg,0.127mmol)、4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)和二氯甲烷(2.0mL)的混合物搅拌1h并浓缩。加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)、DIPEA(0.079mL,0.453mmol)和EDC(26.0mg,0.136mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAC色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(52.8mg,0.050mmol,55.1％收率)。LC-MS m/z 1006.0(M)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.89(d,J＝6.4Hz,3H)1.04(d,J＝6.8Hz,3H)1.36-1.49(m,2H)1.51-1.76(m,13H)1.88-2.12(m,7H)2.14(s,3H)2.27(t,J＝6.4Hz,2H)2.31-2.39(m,1H)2.40-2.49(m,2H)2.56-2.62(m,1H)2.67-2.74(m,1H)2.89(ddd,J＝9.5,7.3,6.1Hz,1H)3.02(quin,J＝6.8Hz,3H)3.23-3.29(m,1H)3.30(s,1H)3.42(br s,1H)3.47-3.58(m,3H)3.71(br s,1H)3.86-3.93(m,1H)4.42(br s,1H)4.65(d,J＝6.4Hz,1H)5.03(q,J＝8.2Hz,1H)7.44(dd,J＝7.6,5.1Hz,1H)7.63(d,J＝6.8Hz,1H)7.68(dt,J＝8.1,1.8Hz,1H)7.72(t,J＝5.4Hz,1H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)7.99(br t,J＝5.6Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.48(d,J＝1.5Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.58(s,1H)8.71(br d,J＝8.3Hz,2H)8.89(s,1H)。
实施例18
N1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N5-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙基)戊二酰胺。
步骤1
N1-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-N5-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)戊二酰胺。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(62mg,0.089mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.1mL,0.717mmol)和商购可得的二氢-2H-吡喃-2,6(3H)-二酮(10.12mg,0.089mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。将溶剂在减压下除去，并加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1.0mL)、商购可得的3,3'-氧基双(丙烷-1-胺),和HATU(43mg,0.113mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。将混合物在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色泡沫状固体的标题化合物(24mg,0.028mmol,31.1％收率)。LC-MS m/z818.3(M+H)+。
步骤2
N1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N5-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙基)戊二酰胺。
向N1-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-N5-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)戊二酰胺(24mg,0.029mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.012mL,0.088mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(9.69mg,0.044mmol)和HATU(13.39mg,0.035mmol)，将混合物在室温搅拌1h，并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(21mg,0.020mmol,68.8％收率)。LC-MS m/z 1020.3(M)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.00(d,J＝6.4Hz,3H)1.16(d,J＝6.4Hz,3H)1.52-2.02(m,19H)2.09-2.40(m,11H)2.53-2.63(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.75(m,2H)2.79-2.89(m,1H)3.05(ddd,J＝9.3,8.1,6.6Hz,1H)3.16-3.37(m,9H)3.39-3.67(m,5H)3.89(br s,1H)4.03(dt,J＝12.2,3.7Hz,1H)4.61(br d,J＝3.4Hz,1H)4.82(d,J＝6.4Hz,1H)5.30(t,J＝8.6Hz,1H)7.51-7.56(m,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝1.5Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.73(s,1H)。
用与在实施例18中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例23
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸叔丁酯。
向商购可得的3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(2g,7.21mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(1.588g,7.21mmol)和三乙胺(3.02mL,21.63mmol)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的混合物中加入HATU(3.29g,8.65mmol)，并将混合物搅拌72h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(120g RediSep Rf柱,80mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(1.91g,3.98mmol,55.2％收率)。LC-MSm/z 480.2(M+H)+。
步骤2
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸，盐酸盐，
在0℃向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸叔丁酯(1.9g,3.96mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入4M HCl(4.95mL,19.81mmol)，将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(1.8g,3.91mmol,99％收率)。LC-MS(m/z)424.2(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(56mg,0.081mmol)和4M HCl(0.142mL,0.568mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物在室温搅拌1h，在冰柜中储存过夜，并在室温搅拌1h。将混合物浓缩至干燥并加入二氯甲烷(DCM)(1mL)。加入1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸，盐酸盐(37.3mg,0.081mmol)、三乙胺(0.091mL,0.649mmol)和HATU(37.0mg,0.097mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C185μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(43.2mg,0.043mmol,53.5％收率)。LC-MS m/z 997.0(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.18(s,9H)1.52-2.09(m,15H)2.21-2.37(m,2H)2.41(t,J＝6.3Hz,2H)2.53-2.63(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.75(m,1H)2.77-2.90(m,1H)3.05(ddd,J＝9.3,8.0,6.5Hz,1H)3.23(br s,1H)3.27-3.32(m,1H)3.34-3.40(m,1H)3.41-3.58(m,12H)3.58-3.65(m,1H)3.68(t,J＝6.4Hz,2H)3.87-3.94(m,1H)4.00(dt,J＝12.5,3.6Hz,1H)4.59(br d,J＝3.0Hz,1H)5.32(t,J＝8.7Hz,1H)7.49-7.54(m,1H)7.79(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H)8.51(d,J＝1.8Hz,1H)8.56(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.73(s,1H)。
用与在实施例23中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例36
(2S,3S)-N-(27-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧杂-2-氮杂二十九烷-29-酸，三氟乙酸盐
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(252mg,1.144mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)的混合物中加入DIPEA(0.600mL,3.43mmol)和2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-1,1,3,3-四甲基异脲鎓四氟硼酸盐(344mg,1.144mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入商购可得的1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸(505mg,1.144mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)中的浆，并将混合物在室温搅拌2h。通过反相色谱法(酸性的柱,47mL/min)纯化，用含有TFA(0.1％)的5至25％乙腈在水中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(865mg,1.142mmol,100％收率)。LC-MS m/z 644.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(27-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26-八氧杂-2-氮杂二十九烷-29-酸，三氟乙酸盐(860mg,1.135mmol)和二氯甲烷(DCM)(2mL)的混合物中加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮(527mg,1.135mmol)、DIPEA(0.793mL,4.54mmol)和HATU(518mg,1.362mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(80g RediSep Rf柱)纯化，用含有氢氧化铵(10％)的0至15％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(800mg,0.734mmol,64.7％收率)。LC-MS m/z 545.9(M/2)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.20(s,9H)1.30(br d,J＝6.4Hz,4H)1.69-1.80(m,2H)1.82-1.93(m,4H)2.26(qd,J＝12.3,5.5Hz,1H)2.47-2.53(m,3H)2.67(s,3H)2.68-2.76(m,1H)2.78-2.95(m,1H)3.02-3.09(m,1H)3.22-3.27(m,1H)3.37(s,12H)3.48-3.59(m,18H)3.68-3.77(m,2H)3.85(ddd,J＝9.5,7.5,5.0Hz,1H)4.02(dt,J＝12.4,3.7Hz,1H)4.64(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.6Hz,2H)5.31(t,J＝8.1Hz,1H)7.51-7.56(m,1H)7.81(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.52(d,J＝1.7Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.7Hz,1H)8.60(s,1H)8.86(d,J＝0.7Hz,1H)。
用与在实施例36中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例44
(2S,3S)-N-(2-(3-((2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(235mg,1.067mmol)和商购可得的3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(202mg,1.067mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的混合物中加入HATU(487mg,1.281mmol)和三乙胺(0.446mL,3.20mmol)，并将混合物在室温搅拌3h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用含有氯化铵(10％)的0至15％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(465mg,1.188mmol,111％收率)。LC-MS m/z 392.3(M+H)+。
步骤2
3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙酸，盐酸盐。
将3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(465mg,1.188mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.782mL,7.13mmol)和二氯甲烷(0.5mL)的混合物在室温搅拌4h。将混合物浓缩至干燥以提供标题化合物(450mg,1.210mmol,102％收率)。LC-MS m/z 336.1(M+H)+。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-5,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
向商购可得的3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(148mg,0.780mmol)和3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙酸，盐酸盐(290mg,0.780mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入EDC(224mg,1.170mmol)、HOBt(179mg,1.170mmol)和DIPEA(0.817mL,4.68mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过反相色谱法(50g C18Aq Gold柱,40mL/min)纯化，用20至55％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(225mg,56.9％)。LC-MS m/z 507.1(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-5,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸，盐酸盐。
将1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-5,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(225mg,0.444mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.666mL,2.66mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.02mL)的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩，以提供标题化合物(225mg,0.462mmol,104％收率)。LC-MS m/z 451.4(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(2-(3-((2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺，
向(1s,3S)-3-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环丁烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(52.1mg,0.082mmol)和1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-5,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸盐酸盐(40mg,0.082mmol)在二氯甲烷中的混合物中加入DIPEA(115μL,0.657mmol)、EDC(23.62mg,0.123mmol)和HOBt(18.87mg,0.123mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％的含有氢氧化铵(1％)的乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(47.8mg,0.048mmol,58.5％收率)。LC-MS m/z 994.6(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.02(d,J＝6.4Hz,3H)1.14(br d,J＝6.4Hz,3H)1.59-1.81(m,3H)1.88-2.02(m,1H)2.10-2.24(m,5H)2.26(s,3H)2.27-2.45(m,6H)2.45-2.63(m,4H)2.66(s,3H)2.68-2.89(m,5H)3.05(ddd,J＝9.3,8.1,6.6Hz,1H)3.26-3.31(m,2H)3.34-3.57(m,7H)3.60-3.70(m,5H)4.02(dt,J＝12.2,3.7Hz,1H)4.11-4.32(m,1H)4.59(br d,J＝2.9Hz,1H)4.82(d,J＝6.8Hz,1H)5.32(t,J＝8.8Hz,1H)7.53(dd,J＝7.3,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.75(s,1H)
用与在实施例44中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例49
(2S,3S)-N-(3-((2-(2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯。
向商购可得的3-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(267mg,1.471mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(324mg,1.471mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的混合物中加入三乙胺(1.025mL,7.36mmol)和HATU(671mg,1.765mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(525mg,1.511mmol,103％收率)。LC-MS m/z348.1(M+H)+。
步骤2
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐。
将3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯(525mg,1.511mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(3.02mL,12.09mmol)和二氯甲烷(0.5mL)的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩，以提供标题化合物(560mg,1.537mmol,102％收率)。LC-MS m/z 292.1(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(3-((2-(2-(3-(((1S,3s)-3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
向(1s,3S)-3-(3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环丁烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(67mg,0.084mmol)和3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐(27.7mg,0.084mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.094mL,0.675mmol)和HATU(38.5mg,0.101mmol)。将混合物在室温搅拌3h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(45.7mg,0.046mmol,54.5％收率)。LC-MS m/z 498.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.03(br d,J＝5.9Hz,3H)1.15(br d,J＝6.4Hz,3H)1.61-1.81(m,3H)1.89-2.04(m,1H)2.08-2.25(m,4H)2.27(s,3H)2.30-2.46(m,5H)2.46-2.65(m,3H)2.64-2.91(m,7H)2.96-3.07(m,1H)3.26-3.31(m,1H)3.35-3.64(m,11H)3.68(br t,J＝6.1Hz,3H)4.03(br d,J＝12.2Hz,1H)4.12-4.35(m,1H)4.60(br s,1H)5.30(t,J＝8.8Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.78(br d,J＝7.8Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(br d,J＝9.3Hz,1H)8.51(s,1H)8.57(d,J＝4.9Hz,1H)8.59(s,1H)8.75(s,1H)。
用与在实施例49中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例52
(2S,3S)-N-(3-(((1R,4S)-4-(4-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
(3-(((1r,4r)-4-羟基环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯。
向商购可得的(1r,4r)-4-氨基环己烷-1-醇(1.2g,10.42mmol)和3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(1.26g,6.66mmol)在二氯甲烷(DCM)(50mL)中的混合物中加入三乙胺(3.71mL,26.6mmol)、EDC(1.532g,7.99mmol)和HOBt(1.530g,9.99mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(900mg,3.14mmol,47.2％收率)。LC-MS m/z 287.2(M+H)+。
步骤2
(E)-4-(((1r,4r)-4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烷酰氨基)环己基)氧基)丁-2-烯酸乙酯。
向(3-(((1r,4r)-4-羟基环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(317mg,1.107mmol)、三苯基膦(29.0mg,0.111mmol)和乙酸(0.056mL,0.978mmol)在甲苯(5ml)中的混合物中加入商购可得的丁-2-炔酸乙酯(0.334mL,2.87mmol)，并将混合物在110℃搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。将产物通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，以提供标题化合物(163mg,0.409mmol,37.0％收率)。LC-MS m/z 399.2(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.22-1.41(m,7H)1.45(s,9H)1.95(br dd,J＝13.4,2.2Hz,2H)2.04-2.15(m,2H)2.34(t,J＝6.8Hz,2H)3.27-3.31(m,2H)3.35-3.39(m,1H)3.66(tt,J＝10.8,3.9Hz,1H)4.15-4.24(m,4H)6.06(dt,J＝15.6,2.2Hz,1H)6.98(dt,J＝15.6,4.2Hz,1H)
Hz,1H)。(在NMR中看到顺式异构体)
步骤3
(E)-4-(((1r,4r)-4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烷酰氨基)环己基)氧基)丁-2-烯酸。
将(E)-4-(((1r,4r)-4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烷酰氨基)环己基)氧基)丁-2-烯酸乙酯(163mg,0.409mmol)和氢氧化钠(0.409mL,2.045mmol)在甲醇(0.4mL)中的混合物在室温搅拌2h。将混合物浓缩，用HCl(0.409mL,2.454mmol)酸化，并用甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液(5％)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(130mg,0.351mmol,86％收率)。LC-MS m/z 371.1(M+H)+。
步骤4
(3-(((1R,4r)-4-(((E)-4-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁-2-烯-1-基)氧基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(125mg,0.189mmol)和(E)-4-(((1r,4r)-4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙烷酰氨基)环己基)氧基)丁-2-烯酸(84mg,0.226mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.158mL,1.132mmol)和HATU(86mg,0.226mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物并用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(125mg,0.133mmol,70.3％收率)。LC-MS m/z942.1(M)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(3-(((1R,4S)-4-(4-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
向(3-(((1R,4r)-4-(((E)-4-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁-2-烯-1-基)氧基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(125mg,0.133mmol)在甲醇(1mL)中的混合物中加入Pd/C(14.12mg,0.013mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌过夜。将混合物过滤并将催化剂用甲醇洗涤。将合并的滤液浓缩至干燥。加入二氯甲烷(DCM)(0.1mL)和4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.332mL,1.327mmol)，将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥。加入二氯甲烷(DCM)(1.000mL)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(29.2mg,0.133mmol)、三乙胺(0.111mL,0.796mmol)和HATU(60.5mg,0.159mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(64mg,0.061mmol,46.1％收率)。LC-MS m/z 524.3(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01(d,J＝6.4Hz,3H)1.16(d,J＝6.4Hz,4H)1.19-1.33(m,4H)1.59-1.71(m,3H)1.71-1.88(m,12H)1.93-2.03(m,3H)2.14-2.26(m,4H)2.27(s,3H)2.29-2.39(m,4H)2.54-2.62(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.76(m,2H)2.80-2.89(m,1H)2.98-3.06(m,1H)3.17-3.25(m,1H)3.35-3.37(m,1H)3.40-3.68(m,9H)3.86-3.94(m,1H)4.03(dt,J＝12.3,3.6Hz,1H)4.62(br d,J＝2.4Hz,1H)4.84-4.87(m,2H)5.30(t,J＝8.8Hz,1H)7.52(dd,J＝8.3,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝8.2,1.8Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.73(s,1H)。
实施例53
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-((3-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)环己基)甲氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
((1r,4r)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲醇。
在0℃向商购可得的((1r,4r)-环己烷-1,4-二基)二甲醇(308mg,2.136mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(5.0mL)中的混合物中加入氢化钠(85mg,2.136mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺(555mg,2.136mmol)，并将混合物在室温搅拌度过周末。将混合物冷却至0℃，加入饱和的NH4Cl，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用水、用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至50％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(197mg,0.536mmol,25.09％收率)。LC-MS m/z368.5(M+H)+。
步骤2
3-(((1S,4r)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丙酸叔丁酯。
向((1r,4r)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲醇(197mg,0.536mmol)、四丁基硫酸氢铵(35mg,0.103mmol)和氢氧化钠(515mg,6.43mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的混合物中加入丙烯酸叔丁酯(0.157mL,1.072mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩至干燥。向残余物中加入乙酸乙酯(3.00mL)和Pd/C(114mg,0.107mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下搅拌16h。加入另外的Pd/C(114mg,0.107mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下搅拌24h。将混合物过滤，将催化剂用甲醇洗涤，并将合并的滤液浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(3.00mL)中的残余物中加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(118mg,0.536mmol)、HATU(245mg,0.643mmol)和三乙胺(0.224mL,1.608mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(212mg,0.410mmol,76％收率)。LC-MSm/z 518.1(M+H)+。
步骤3
3-(((1S,4r)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丙酸，盐酸盐
将3-(((1S,4r)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丙酸叔丁酯(212mg,0.410mmol)、4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.024mL,4.10mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.1mL)的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩至干燥以提供标题化合物(210mg,0.422mmol,103％收率)。LC-MS m/z462.1(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-((3-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)环己基)甲氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
向(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(47.9mg,0.072mmol)和3-(((1S,4r)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丙酸盐酸盐(36mg,0.072mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入DIPEA(0.101mL,0.578mmol)、EDC(20.79mg,0.108mmol)和HOBt(16.60mg,0.108mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP(XSelectTM-CSHC18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(38.1mg,0.037mmol,51.0％收率)。LC-MS m/z 517.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.82-0.98(m,4H)1.02(br d,J＝6.4Hz,3H)1.16(br d,J＝6.4Hz,3H)1.19-1.35(m,2H)1.44-1.65(m,4H)1.67-1.81(m,7H)1.90-2.05(m,5H)2.06-2.26(m,3H)2.28(s,3H)2.33(br s,1H)2.38(t,J＝6.1Hz,2H)2.44-2.60(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.77(m,2H)2.78-2.88(m,1H)3.05(ddd,J＝9.3,8.1,6.6Hz,1H)3.23(dd,J＝16.6,6.4Hz,4H)3.34-3.56(m,6H)3.62-3.69(m,4H)4.02(dt,J＝12.5,3.8Hz,1H)4.66(br d,J＝2.9Hz,1H)4.84-4.88(m,1H)5.27(t,J＝8.1Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.81(s,1H)
用与在实施例53中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例56
N1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N5-(4-((3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酰胺。
步骤1
(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。
向商购可得的(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(346mg,1.986mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(437mg,1.986mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入HATU(906mg,2.383mmol)和三乙胺(0.830mL,5.96mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g RedisepRf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(690mg,1.833mmol,92％收率)。LC-MS m/z 377.2(M+H)+。
步骤2。
(2S,3S)-N-(3-氨基丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐
将(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(690mg,1.833mmol)、4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2.291mL,9.16mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.5mL)的混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(810mg,2.319mmol,127％收率)。LC-MS m/z 277.2(M+H)+
步骤3
(4-((3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯。
向商购可得的4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(152mg,0.750mmol)和(2S,3S)-N-(3-氨基丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺2盐酸盐(262mg,0.750mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入三乙胺(0.627mL,4.50mmol)和HATU(342mg,0.900mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(200mg,0.433mmol,57.8％收率)。LC-MSm/z 462.2(M+H)+。
步骤4。
(2S,3S)-N-(3-(4-氨基丁酰氨基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐
将(4-((3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.433mmol)、4MHCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.542mL,2.167mmol)和二氯甲烷(DCM)(0.3mL)的混合物在室温搅拌5h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(200mg,0.460mmol,106％收率)。LC-MS m/z 362.2(M+H)+。
步骤5
N1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N5-(4-((3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)戊二酰胺。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(53.4mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入商购可得的二氢-2H-吡喃-2,6(3H)-二酮(9.19mg,0.081mmol)和三乙胺(0.079mL,0.564mmol)，并将混合物在室温搅拌1.5h。加入(2S,3S)-N-(3-(4-氨基丁酰氨基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(35mg,0.081mmol)和HATU(36.8mg,0.097mmol)，并将混合物在室温搅拌1.5h。加入三乙胺(50μL,0.357mmol)和HATU(20mg,0.053mmol)，并将混合物搅拌1h。加入另外的(2S,3S)-N-(3-(4-氨基丁酰氨基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(20mg,0.046mmol)，将混合物在室温搅拌过夜，并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(37.7mg,0.036mmol,44.7％收率)。LC-MS m/z 1047.6(M+H)+1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01(d,J＝6.4Hz,3H)1.16(d,J＝6.4Hz,3H)1.58-1.70(m,6H)1.71-1.90(m,11H)1.90-2.02(m,1H)2.14-2.25(m,8H)2.27(s,3H)2.33(br d,J＝13.7Hz,1H)2.53-2.63(m,1H)2.67(s,3H)2.68-2.75(m,2H)2.80-2.88(m,1H)2.97-3.06(m,1H)3.10-3.27(m,7H)3.40-3.48(m,1H)3.50-3.59(m,1H)3.60-3.70(m,1H)3.89(br s,1H)4.03(dt,J＝12.2,3.7Hz,1H)4.61(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.8Hz,1H)5.31(t,J＝8.6Hz,1H)7.54(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.82(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.53(d,J＝1.5Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.73(s,1H)。
实施例57
(2S,3S)-N-(2-(((1S,4R)-4-((4-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)甲基)环己基)甲氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
((1s,4s)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲醇。
在0℃在氮气气氛下向((1s,4s)-环己烷-1,4-二基)二甲醇(4.0g,27.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)中的溶液中加入氢化钠(60％)(1.109g,27.7mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。在0℃加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺(5.76g,22.19mmol)，将混合物温热至室温，并搅拌16h。加入水(100mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3x 60mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM色谱法(50g柱)纯化，用0至20％己烷在乙酸乙酯中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物(1.7g,4.47mmol,16.11％收率)。LC-MS m/z 368(M+H)+。
步骤2
(E)-4-(((1s,4s)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁-2-烯酸甲酯。
在室温在氮气气氛下向((1s,4s)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲醇(1.7g,4.63mmol)在甲苯(20mL)中的溶液中加入乙酸(0.053mL,0.925mmol)、三苯基膦(0.061g,0.231mmol)和商购可得的丁-2-炔酸甲酯(0.681g,6.94mmol)，并将混合物在115℃搅拌16h。将混合物冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)，并将有机相用水(2x 50mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过IsoleraTM色谱法(25g柱)纯化，用0至30％乙酸乙酯在己烷中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物(1.2g,2.397mmol,51.8％收率)。LC-MS m/z 466(M+H)+。
步骤34-(((1s,4s)-4-((2-氨基乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸甲酯。
向(E)-4-(((1s,4s)-4-((2-(二苄基氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁-2-烯酸甲酯(1.2g,2.58mmol)在甲醇(20mL)中的搅拌溶液中加入乙酸(0.295mL,5.15mmol)和10％ Pd/C(0.30g,0.282mmol)，并将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌16h。加入甲醇(50mL)，将混合物穿过过滤，并将合并的滤液在减压下浓缩，以提供作为无色液体的标题化合物(700mg,2.433mmol,94％收率)。LC-MS m/z 288(M+H)+。
步骤4
4-(((1R,4s)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸甲酯。
在氮气气氛下向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(0.650g,2.95mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中的溶液中加入DIPEA(1.031mL,5.90mmol)、HATU(1.683g,4.43mmol)和4-(((1s,4s)-4-((2-氨基乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸甲酯(0.763g,2.66mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。加入水(50mL)并将混合物用乙酸乙酯(3x 30mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过IsoleraTM色谱法(25g柱)纯化，用5％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(800mg,1.225mmol,41.5％收率)。LC-MS m/z490.1(M+H)+。
步骤5
4-(((1R,4s)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸。
将4-(((1R,4s)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸甲酯(800mg,1.634mmol)和氢氧化锂(47.0mg,1.961mmol)在四氢呋喃(THF)(5.0mL)和水(5.00mL)中的混合物在室温搅拌2h，并将混合物在减压下浓缩。使用1.5N HCl将pH调至6并将混合物在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(YMC-Triart C18 ExRS 5μm柱,15mL/min)纯化，用10至50％(12min)和100％(4min)乙腈在含有甲酸(0.1％)的水中的阶式梯度溶剂洗脱。通过Chiral SFC(YMC Cellulose-C柱,3mL/min，进样体积15μL,100巴，35℃)进行第二次纯化，用40％异丙醇的共溶剂洗脱，提供作为无色油的标题化合物(195mg,0.408mmol,24.99％收率)。LC-MS m/z 476.1(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(2-(((1S,4R)-4-((4-(((1R,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)甲基)环己基)甲氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(48.8mg,0.074mmol)和4-(((1R,4s)-4-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)甲基)环己基)甲氧基)丁酸(35mg,0.074mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.062mL,0.442mmol)和HATU(33.6mg,0.088mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(49.5mg,0.047mmol,64.2％收率)。LC-MS m/z 1047.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.02(br d,J＝6.4Hz,3H)1.16(br d,J＝6.4Hz,3H)1.18-1.31(m,3H)1.33-1.79(m,16H)1.79-1.89(m,2H)1.90-2.02(m,5H)2.06-2.18(m,2H)2.19-2.26(m,3H)2.28(s,3H)2.34(br d,J＝14.2Hz,1H)2.44-2.62(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.76(m,2H)2.77-2.89(m,1H)3.02-3.10(m,1H)3.28-3.32(m,2H)3.35-3.54(m,8H)3.57-3.67(m,2H)4.02(dt,J＝12.5,3.8Hz,1H)4.65(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.4Hz,1H)5.28(t,J＝8.1Hz,1H)7.51-7.56(m,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝1.5Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.81(s,1H)。
用与在实施例57中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例63
(2S,3S)-N-(2-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)甘氨酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(150mg,0.681mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中的溶液中加入DIPEA(440mg,3.41mmol)、HOBt(104mg,0.681mmol)、HATU(388mg,1.022mmol)，随后加入甘氨酸叔丁酯，盐酸盐(114mg,0.681mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(230mg,0.690mmol,101％收率)。LC-MS m/z 334.0(M+H)+。
步骤2
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,4-二氧代-8,11-二氧杂-2,5-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯。
将((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)甘氨酸叔丁酯(230mg,0.690mmol)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)的混合物搅拌1h并在减压下浓缩至干燥。将残余物溶解在N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中，加入DIPEA(446mg,3.45mmol)、HOBt(106mg,0.690mmol)和HATU(393mg,1.035mmol)，随后加入商购可得的3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(161mg,0.690mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(260mg,0.528mmol,77％收率)。LC-MS(m/z)493.1(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(2-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,4-二氧代-8,11-二氧杂-2,5-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯(32.1mg,0.065mmol)、4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)和二氯甲烷(DCM)(2.0mL)的混合物搅拌1h，并在减压下浓缩至干燥。加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(40mg,0.054mmol)、HOBt(8.32mg,0.054mmol)和DIPEA(0.047mL,0.272mmol)。加入HATU(31.0mg,0.081mmol)，并将混合物在室温搅拌3h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(25.6mg,0.024mmol,44.4％收率)。LC-MS m/z1008.5(M)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.90(d,J＝6.4Hz,3H)0.98(br s,10H)1.04(d,J＝6.4Hz,3H)1.35-1.82(m,11H)1.90-2.19(m,6H)2.28(t,J＝6.6Hz,1H)2.32-2.39(m,1H)2.40-2.49(m,2H)2.56-2.63(m,1H)2.75(dd,J＝16.4,10.0Hz,1H)3.04(ddd,J＝9.5,7.1,5.9Hz,2H)3.19(q,J＝5.7Hz,2H)3.44(s,3H)3.48-3.60(m,3H)3.68(d,J＝5.9Hz,2H)3.85-3.93(m,1H)4.43(br s,1H)4.69(d,J＝5.9Hz,1H)5.03(q,J＝8.2Hz,1H)7.44(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.65(d,J＝6.8Hz,1H)7.69(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.82-7.98(m,2H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.23(t,J＝5.6Hz,1H)8.50(d,J＝2.0Hz,1H)8.55(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.58(s,1H)8.63-8.69(m,1H)8.71(d,J＝8.3Hz,1H)8.89(s,1H)。
用与在实施例63中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例67
((2S,3S)-N-(1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)环己基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯。
将(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(122mg,0.554mmol)和商购可得的(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(205mg,0.609mmol)的混合物在减压下干燥。加入HATU(253mg,0.665mmol)并将混合物溶解在乙腈(4261μL)中。缓慢地加入DIPEA(387μL,2.216mmol)，将混合物搅拌30min，并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为橙色油的标题化合物(323mg,0.582mmol,105％收率)。LC-MS m/z 539.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(1-氧代-1-(4-氧代环己基)-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(323mg,0.600mmol)、HCl(0.40mL)和二氯甲烷(DCM)(2mL)的混合物在室温搅拌15min，在减压下浓缩，并追加二氯甲烷(DCM)以提供(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(324mg,0.739mmol)。将商购可得的4-氧代环己烷-1-甲酸(105mg,0.739mmol)在减压下干燥，加入TSTU(267mg,0.886mmol)，并将混合物溶解在乙腈(5682μL)中。逐滴加入三乙胺(412μL,2.95mmol)。加入(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(324mg,0.739mmol)，将混合物搅拌30min，并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(x 2)(24g Redisep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(217.9mg,0.306mmol,41.4％收率)。LC-MS m/z 563.1(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.63-2.04(m,2H)2.08-2.21(m,1H)2.37-2.54(m,1H)2.68(s,3H)2.70-2.80(m,1H)2.84-2.94(m,1H)3.01-3.21(m,1H)3.31-3.45(m,13H)3.50-3.69(m,11H)7.58(dd,J＝7.9,4.8Hz,1H)7.85(dt,J＝7.9,1.8Hz,1H)8.08-8.27(m,1H)8.54(d,J＝1.8Hz,1H)8.61(dd,J＝4.8,1.3Hz,1H)。
步骤3
((2S,3S)-N-(1-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)环己基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(188mg,0.349mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(1-氧代-1-(4-氧代环己基)-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(217.9mg,0.387mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(704μL)中声处理(2min)。加入另外的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)以确保固体起始材料溶解。加入三乙酰氧基硼氢化钠(243mg,1.147mmol)并将混合物在50℃搅拌3h。将混合物在减压下浓缩，在二氯甲烷(DCM)和水之间分配，并用1M氢氧化钠碱化。将水层用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。水层含有期望产物，在减压下浓缩，并溶解在甲醇和水(1:1)的混合物(6mL)中。通过MDAP色谱法(XBridgeTM柱)纯化分离异构体，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱。通过MDAP(SunfireTM C18柱)纯化期望的异构体，用乙腈在含有TFA调节剂的水中的溶液洗脱。将期望的级分在减压下浓缩，用1M氢氧化钠碱化，并用二氯甲烷(DCM)萃取以提供作为白色固体的标题化合物(48.5mg,0.048mmol,12.38％收率)。LC-MS m/z 1011.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.09-1.15(m,6H)1.43-1.61(m,2H)1.66-2.01(m,8H)2.05-2.21(m,3H)2.30(s,3H)2.34-2.44(m,1H)2.50-2.60(m,1H)2.63-2.69(m,4H)2.70-2.76(m,1H)2.78-2.89(m,2H)2.99-3.11(m,2H)3.21(dt,J＝12.7,6.3Hz,1H)3.33-3.35(m,3H)3.36-3.41(m,1H)3.48-3.54(m,4H)3.54-3.64(m,12H)3.70-3.81(m,1H)4.02-4.11(m,1H)4.30-4.37(m,1H)4.80-4.86(m,1H)5.02-5.11(m,1H)5.52(s,2H)7.51-7.57(m,1H)7.81(dt,J＝7.9,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.6Hz,1H)8.06(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H)8.51-8.55(m,1H)8.57-8.60(m,1H)8.61-8.63(m,1H)8.63-8.67(m,1H)。
用与在实施例67中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例70
(2S,3S)-N-((S)-1-(4-((4-((1R,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)磺酰基)哌啶-1-基)-1-氧代丙烷-2-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
4-((4-((1r,4r)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
将4-((1s,4s)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(204mg,0.599mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)和TFA(3mL)中，并将混合物在室温搅拌5min。将混合物在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(6072μL)中并加入三乙胺(250μL,1.792mmol)。将混合物冷却至0℃并逐滴加入4-(氯磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(224mg,0.789mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌3h并在减压下浓缩。加入水并将混合物用乙酸乙酯(4x)萃取。将合并的有机萃取物在减压下浓缩。通过正相柱色谱法(24g硅胶)纯化，用0至100％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为白色结晶固体的标题化合物(98.4mg,0.159mmol,20.19％收率)。LC-MS m/z 488.2(M+H)+。
步骤2
(1S,4r)-4-(4-((1-((叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
将4-((4-((1r,4r)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-基)磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(98.4mg,0.202mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(1mL)和TFA(2mL)中，并将混合物在室温搅拌10min。将混合物在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)。将残余物、(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(40mg,0.211mmol)、和HATU(100mg,0.263mmol)的混合物溶解在乙腈(1.626mL)中。逐滴加入三乙胺(0.105mL,0.753mmol)。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩。通过正相柱色谱法(12g硅胶)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(404.8mg,0.558mmol,264％收率)。LC-MS m/z 559.2(M+H)+。
步骤3
(1S,4r)-4-(4-((1-(((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)-L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸。
将TFA(2.0mL)加入(1S,4r)-4-(4-((1-((叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸(404mg,0.761mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的溶液中，并将混合物在室温搅拌5min。将混合物通过减压浓缩，并追加二氯甲烷(DCM)(3x)3次以除去多余的TFA，以提供(1S,4r)-4-(4-((1-(L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸,2三氟乙酸盐(389mg,0.590mmol)。
向2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-1,1,3,3-四甲基异脲鎓四氟硼酸盐(213mg,0.708mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(130mg,0.590mmol)在乙腈(4541μL)中的混合物中加入三乙胺(329μL,2.361mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。加入(1S,4r)-4-(4-((1-(L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸,2三氟乙酸盐(389mg,0.590mmol)。将混合物在减压下浓缩。通过正相柱色谱法(24g柱,35mL/min)纯化，用0至80％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(101mg,0.067mmol,11.36％收率)。LC-MS m/z 633.3(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-((S)-1-(4-((4-((1R,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)磺酰基)哌啶-1-基)-1-氧代丙烷-2-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(108mg,0.192mmol)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.2mL,0.8mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.0mL)中的混合物在室温搅拌30min，将混合物通过减压浓缩，并追加二氯甲烷(DCM)。向残余物和三乙胺(89μL,0.638mmol)在二氯甲烷(DCM)(4314μL)中的混合物中加入(1S,4r)-4-(4-((1-(((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)-L-丙氨酰基)哌啶-4-基)磺酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸(101mg,0.160mmol)和HATU(72.8mg,0.192mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(26.1mg,0.024mmol,14.93％收率)。LC-MS m/z 1079.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.03(br d,J＝6.3Hz,3H)1.15(br d,J＝6.3Hz,3H)1.23-1.37(m,5H)1.50-1.78(m,7H)1.91-2.12(m,9H)2.14-2.20(m,1H)2.27(s,3H)2.30-2.38(m,2H)2.50-2.75(m,11H)2.83-2.91(m,1H)3.07-3.23(m,2H)3.33(dt,J＝3.3,1.6Hz,3H)3.37(br s,2H)3.40-3.55(m,3H)3.61-3.68(m,1H)4.03(dt,J＝12.2,3.7Hz,1H)4.09-4.20(m,1H)4.56(br t,J＝14.7Hz,1H)4.66(br d,J＝3.0Hz,1H)5.25(t,J＝7.8Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H)7.82(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.55-8.58(m,2H)8.60(s,1H)8.81(s,1H)
用与在实施例70中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例72
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(4-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯，三氟乙酸盐。
向3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1001mg,4.29mmol)在二氯甲烷(DCM)(35mL)中的溶液中加入三乙胺(1.495mL,10.73mmol)，随后加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(945mg,4.29mmol)和HATU(1958mg,5.15mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP(方法B)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(都含有0.1％ TFA)洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(2.22g,3.84mmol,89％收率)。LC-MSm/z 436.3(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(4-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.3mL,0.900mmol)加入4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(38mg,0.050mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌1h，并在减压下浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)中并加入三乙胺(0.035mL,0.251mmol)。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.3mL,0.900mmol)加入3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯，三氟乙酸盐(35mg,0.064mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌过夜，并在减压下浓缩。加入上面得到的胺溶液，随后加入HATU(28.6mg,0.075mmol)，将混合物在室温搅拌2h，并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(17.4mg,0.017mmol,33.4％收率)。LC-MS m/z 1019.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.96-1.20(m,11H)1.28-1.38(m,1H)1.41-1.52(m,2H)1.67-2.36(m,18H)2.47-2.57(m,2H)2.59-2.64(m,2H)2.65-2.69(m,4H)2.70-2.78(m,2H)2.80-2.88(m,1H)2.94-3.13(m,2H)3.36-3.42(m,1H)3.45-3.60(m,8H)3.68-3.75(m,2H)3.95-4.08(m,2H)4.48-4.55(m,1H)4.63-4.67(m,1H)4.80-4.83(m,1H)5.19-5.30(m,1H)7.49-7.55(m,1H)7.76-7.82(m,1H)7.89-7.94(m,1H)8.03-8.10(m,1H)8.50-8.53(m,1H)8.55-8.61(m,2H)8.80-8.84(m,1H)。(也分离和表征了反式异构体实施例66)
用与在实施例72中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例74
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,10,16-三氧代-3,6,12-三氧杂-9,15-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(514mg,2.334mmol)在二氯甲烷(DCM)(6mL)中的溶液中加入HOBt(429mg,2.80mmol)和EDC(626mg,3.27mmol)，并将混合物搅拌30分钟。加入3-氨基丙酸叔丁酯(428mg,2.80mmol)和DIPEA(0.815mL,4.67mmol)并将混合物搅拌过夜。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,60mL/min)纯化，用4％(10min)、7％(20min)和10％(30min)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为澄清黄褐色油的标题化合物(279mg,0.763mmol,32.7％收率)。LC-MS m/z 348.1(M+H)+。
步骤2
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.53mL,18.11mmol)和3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯(276mg,0.755mmol)的混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(547mg,0.751mmol,100％收率)。LC-MS m/z 293.0(M+H)+。
步骤3
2-(2-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙烷酰氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
向3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐(540mg,0.741mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液中加入HOBt(136mg,0.890mmol)和EDC(199mg,1.038mmol)，并将混合物搅拌30min。加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(188mg,0.890mmol)和DIPEA(0.259mL,1.483mmol)并将混合物搅拌过夜。加入HOBt(17mg,0.12mmol)、25mg的EDC(25mg,13mmol)和DIPEA(0.05mL,0.29mmol)并将混合物搅拌4h。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机相用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(24gRediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0％(5分钟)、5％(15min)和10％(35min)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为浅橙色蜡的标题化合物(268mg,0.514mmol,69.3％收率)。LC-MS m/z 449.1(M+H)+。
步骤4
2-(2-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙烷酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐。
将2-(2-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙烷酰氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(260mg,0.499mmol)悬浮于1,4-二氧杂环己烷(1mL)中并加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2.99mL,11.96mmol)。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(769mg,0.484mmol,97％收率)。LC-MS m/z393.2(M+H)+。
步骤5
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,11-三氧代-9,15,18-三氧杂-2,6,12-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯。
向2-(2-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙烷酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐(380mg,0.239mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入HOBt(44.0mg,0.287mmol)和EDC(64.2mg,0.335mmol)，并将混合物搅拌30min。加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(61.7mg,0.239mmol)和DIPEA(0.084mL,0.478mmol)，并将混合物搅拌过夜。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥并在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至5％(5min)、5％(10min)、5-10％(25min)和10％(10min)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为澄清黄褐色油的标题化合物(135mg,0.198mmol,83％收率)。LC-MS m/z 594.3(M+H)+。
步骤6
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,11-三氧代-9,15,18-三氧杂-2,6,12-三氮杂二十烷-20-酸，盐酸盐。
将1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,11-三氧代-9,15,18-三氧杂-2,6,12-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯(131mg,0.192mmol)悬浮于1,4-二氧杂环己烷(1mL)中并加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.152mL,4.61mmol)。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(267mg,0.163mmol,85％收率)。LC-MS m/z 538.2(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,10,16-三氧代-3,6,12-三氧杂-9,15-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,11-三氧代-9,15,18-三氧杂-2,6,12-三氮杂二十烷-20-酸，盐酸盐(259mg,0.158mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入HOBt(29.1mg,0.190mmol)和EDC(42.4mg,0.221mmol)，并将混合物搅拌30min。加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.079mmol)和DIPEA(0.055mL,0.316mmol)并将混合物搅拌过夜。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过MDAP(XselectTM CSH Prep C18 5um OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(51mg,0.049mmol,62.3％收率)。LC-MS m/z 984.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.00(d,J＝6.4Hz,3H)1.16(br d,J＝6.4Hz,3H)1.62-1.80(m,2H)1.89-2.02(m,1H)2.05-2.16(m,1H)2.24(s,4H)2.31-2.43(m,3H)2.51-2.62(m,1H)2.65-2.74(m,5H)2.79-2.88(m,1H)2.97-3.05(m,1H)3.35-3.46(m,8H)3.50-3.64(m,6H)3.65-3.71(m,2H)3.72-3.77(m,2H)3.95-3.98(m,2H)4.04-4.12(m,3H)4.71(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.4Hz,1H)5.31(t,J＝8.6Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.04-8.09(m,1H)8.50-8.52(m,1H)8.57(dd,J＝4.9,2.0Hz,1H)8.59(s,1H)8.77-8.81(m,1H)。
用与实施例74在中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例85
(2S,3S)-N-(17-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2S,3S)-N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺.2盐酸盐。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(370mg,1.680mmol)、(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(840mg,2.497mmol)在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的混合物中加入T3P(1.757mL,2.95mmol)。将混合物在室温搅拌2h并用水(10mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以提供作为白色半固体的(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(750mg,1.39mmol,82.7％收率)。LC-MS m/z 539.1(M+H)+。
将用4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液处理过的作为白色半固体的(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯加入上述产物中。将混合物搅拌1h并在减压下浓缩，以提供标题化合物(650mg,1.482mmol,75.6％收率)。LC-MS m/z 439.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(17-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将3-乙氧基-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(60mg,0.102mmol)、(2S,3S)-N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(49.2mg,0.102mmol)和DIPEA(0.036mL,0.204mmol)在甲醇(2mL)中的混合物在密封小瓶中在60℃搅拌18h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH Prep C185um OBD,40mL/min)纯化，用15至65％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(95.3mg,0.088mmol,87％收率)。LC-MS m/z 1025.4(M+H)+。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.00-1.20(m,6H)1.29-1.39(m,1H)1.68-1.92(m,4H)2.29(br s,5H)2.43-2.52(m,1H)2.55-2.77(m,1H)2.57-2.75(m,4H)2.80-2.89(m,2H)3.02-3.09(m,1H)3.36-3.77(m,26H)4.10-4.17(m,1H)4.72(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.4Hz,1H)5.23-5.34(m,1H)7.53(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.50-8.53(m,1H)8.56-8.59(m,2H)8.71-8.81(m,1H)。
实施例86
(2S,3S)-N-(6-(4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-基)-6-氧代己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(E)-4-羟基-4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
将4-(4-溴苯基)-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(528.3mg,1.483mmol)、丙烯酸甲酯(1.344mL,14.83mmol)、三乙胺(0.827mL,5.93mmol)、乙酸钯(II)(71mg,0.316mmol)和三苯基膦(160mg,0.610mmol)在乙腈(15mL)中的混合物通过真空和氮气回填循环脱气，并使用微波反应器在100℃加热24h，冷却，穿过过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法(24g ISCO gold柱,35mL/min)纯化，用20至50％(15柱体积)和50％(5柱体积)乙酸乙酯的阶式梯度洗脱，提供作为黄色半固体的标题化合物(324.3mg,0.897mmol,60.5％收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.44(s,9H)1.69(br d,J＝12.3Hz,2H)1.86-1.96(m,2H)2.99(br s,1H)3.22(br s,2H)3.76(s,3H)3.89-4.03(m,2H)6.36(d,J＝16.1Hz,1H)7.41-7.50(m,4H)7.60(d,J＝16.1Hz,1H)。
步骤24-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
向(E)-4-羟基-4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(337mg,0.932mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中加入10％Pd/C(100mg，0.094mmol)。通过真空和氢气回填循环来净化反应。将混合物在室温搅拌2h，过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法(24gISCO gold柱,35mL/min)纯化，用20至50％(15柱体积)和50％(5柱体积)乙酸乙酯的阶式梯度洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(236.3mg,0.666mmol,71.5％收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.49(s,9H)1.61(td,J＝12.8,4.1Hz,2H)1.80(br d,J＝13.7Hz,2H)2.57-2.65(m,3H)2.75-2.83(m,2H)2.92(t,J＝7.9Hz,2H)3.66(s,3H)4.24(brd,J＝12.9Hz,2H)7.13(d,J＝1.3Hz,4H)
步骤33-(4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)丙酸。
向4-(4-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(236mg,0.679mmol)在四氢呋喃(THF)(1.5mL)和乙醇(1.5mL)中的溶液中加入2N氢氧化钠(1.358mL,2.72mmol)。将混合物在室温搅拌1小时，并使用1N HCl将pH调至4至5。将混合物浓缩以除去有机溶剂。将残余物用乙酸乙酯(2x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并浓缩以提供作为白色固体的标题化合物(228.2mg,0.678mmol,100％收率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.51(s,9H)1.59-1.69(m,2H)1.79-1.87(m,2H)2.59-2.68(m,1H)2.68-2.74(m,2H)2.82(td,J＝13.1,2.5Hz,2H)2.97(t,J＝7.9Hz,2H)4.26(br d,J＝13.0Hz,2H)7.17(d,J＝4.3Hz,4H)
步骤4
4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
向((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(80mg,0.142mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)。将混合物在室温搅拌1小时，并在减压下浓缩。将残余物悬浮于含有三乙胺(0.069mL,0.496mmol)的二氯甲烷(DCM)(3mL)中。加入3-(4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)丙酸(55mg,0.165mmol)和HATU(81mg,0.213mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP(XSelectTMCSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用80至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(92.5mg,0.116mmol,82％收率)。LC-MS m/z 780.2(M+H)+。
步骤5
(6-(4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯。
向4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(36.5mg,0.047mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)。将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥。将白色固体残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(3mL)中。加入DIPEA(0.041mL,0.234mmol)，随后加入6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(12.99mg,0.056mmol)和HATU(26.7mg,0.070mmol)。将得到的混合物在室温搅拌0.5h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(30.6mg,0.030mmol,79％收率)。LC-MS m/z 893.3(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(6-(4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-基)-6-氧代己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将(6-(4-(4-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)哌啶-1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(34mg,0.038mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液用3MHCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.25mL,0.750mmol)处理。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于含有三乙胺(0.027mL,0.190mmol)的二氯甲烷(DCM)(3mL)中。加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(10.06mg,0.046mmol)和HATU(21.71mg,0.057mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(30.6mg,0.030mmol,79％收率)。LC-MS m/z995.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.00(br d,J＝6.1Hz,3H)1.13(br d,J＝6.3Hz,3H)1.28-1.39(m,2H)1.45-1.72(m,10H)1.73-1.86(m,2H)1.95-2.17(m,5H)2.24-2.55(m,5H)2.58-2.76(m,8H)2.79-2.88(m,1H)2.93(t,J＝7.0Hz,2H)3.02(ddd,J＝9.4,8.4,6.8Hz,1H)3.13-3.28(m,4H)3.36-3.46(m,2H)3.96-4.10(m,2H)4.57(br d,J＝3.0Hz,1H)4.65(br d,J＝13.9Hz,1H)4.81-4.87(m,1H)5.18(t,J＝8.0Hz,1H)7.02-7.13(m,4H)7.54(dd,J＝7.9,4.8Hz,1H)7.77-7.85(m,1H)7.92(d,J＝8.9Hz,1H)8.08(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H)8.52(d,J＝1.8Hz,1H)8.57-8.62(m,2H)8.84-8.88(m,1H)。
用与在实施例86中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例88
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-4-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氧基)吡啶酰胺。
步骤1
4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氧基)吡啶甲酸乙酯。
将聚合物结合的三苯基膦(1.795mmol)加入(14-羟基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(606mg,1.795mmol)和4-羟基吡啶甲酸乙酯(150mg,0.897mmol)在四氢呋喃(THF)(8973μL)中的悬浮液中。逐滴加入40％偶氮二甲酸二乙酯在甲苯中的溶液(710μL,1.795mmol)，并将混合物回流搅拌20h。加入乙酸乙酯，并将有机相用饱和NH4Cl、用Na2CO3溶液和用盐水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(80g Redisep Rf柱,60mL/min)纯化，用0％(10柱体积)、0至7％(25柱体积)和7％(4柱体积)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(220mg,0.439mmol,48.9％收率)。LC-MS m/z487.2(M+H)+。
步骤2
4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氧基)吡啶甲酸。
将10M氢氧化钠(265μL,2.65mmol)加入4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氧基)吡啶甲酸乙酯(215mg,0.442mmol)在甲醇:四氢呋喃(THF):H2O(2:1:1)的混合物中的溶液中，并在20℃搅拌20h。使用1N HCl将pH调至7。将混合物浓缩，加入二氯甲烷(DCM)，将未溶解的固体通过过滤除去，并将滤液在减压下浓缩，以提供作为澄清无色油的标题化合物(214mg,0.443mmol,100％收率)。LC-MS m/z 459.1(M+H)+。
步骤3
(14-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(815μL,3.26mmol)加入((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(184mg,0.326mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1086μL)中的溶液中，并将混合物加热至45℃搅拌30min。将混合物在减压下浓缩。将残余物和4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氧基)吡啶甲酸(179mg,0.391mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中，依次加入HOAt(48.8mg,0.358mmol)、DIPEA(569μL,3.26mmol)和EDC(63.5μL,0.358mmol)，并将混合物在37℃搅拌20h。将混合物用二氯甲烷(DCM)稀释并用水洗涤，用饱和的NH4Cl、用饱和的Na2CO3和用盐水洗涤。将有机相穿过分相器并在减压下浓缩。通过反相HPLC(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(186mg,0.203mmol,62.4％收率)。LC-MS m/z 905.2(M+H)+。
步骤4
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-4-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氧基)吡啶酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(503μL 2.011mmol)加入到(14-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)吡啶-4-基)氧基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(182mg,0.201mmol)在1,4-二氧杂环己烷(670μL)中的溶液中。加入几滴甲醇，并将混合物在45℃搅拌30min。将混合物在减压下浓缩并加入二氯甲烷(DCM)。将有机相用饱和的Na2CO3和用盐水洗涤。将有机相穿过分相器并将滤液在减压下浓缩。将残余物溶解在0.4mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.4mL)中，并加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(53.1mg,0.241mmol)和HOAt(30.1mg,0.221mmol)。加入EDC(39.2μL,0.221mmol)和DIPEA(211μL,1.207mmol)并将混合物在室温搅拌4h。通过反相HPLC(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(126mg,0.124mmol,61.6％收率)。LC-MS m/z 1007.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.89-1.42(m,6H)1.76(brdd,J＝8.1,4.6Hz,4H)2.26(s,8H)2.65(s,6H)2.98-3.12(m,1H)3.35-3.66(m,18H)3.80(t,J＝4.6Hz,2H)4.18(br d,J＝7.4Hz,3H)4.80(s,2H)5.32(s,1H)7.11(dd,J＝5.6,2.5Hz,1H)7.53(br d,J＝5.1Hz,1H)7.65(d,J＝2.5Hz,1H)7.79(d,J＝8.1Hz,1H)7.93(d,J＝8.6Hz,1H)8.03-8.21(m,1H)8.36-8.68(m,4H)8.84(d,J＝0.8Hz,1H)。
用与在实施例88中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例90
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
步骤1
甲磺酸2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙酯。
在0℃向0.5M 2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇在叔丁基甲基醚中的溶液(10mL,5.00mmol)和三乙胺(2.091mL,15.00mmol)在乙醚(10mL)中的溶液中逐滴加入甲磺酰氯(0.584mL,7.50mmol)。将混合物在0℃搅拌1h并倒入水(30mL)中。将混合物用乙醚(3x 30mL)萃取。将合并的有机萃取物用稀HCl洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩，以提供作为无色液体的标题化合物。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 3.03-3.17(m,3H)3.42(t,J＝4.9Hz,2H)3.65-3.75(m,6H)3.79-3.85(m,2H)4.35-4.47(m,2H)。
步骤2
1'-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
向4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(105mg,0.138mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)。将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥。将得到的白色固体悬浮于乙腈(7.5mL)中。加入甲磺酸2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙酯(44.0mg,0.174mmol)，随后加入碳酸钾(97mg,0.702mmol)。将得到的混合物在85℃搅拌5h，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为浅黄色薄膜的标题化合物(83mg,0.100mmol,72.0％收率)。LC-MS m/z 816.3(M+H)+。
步骤3
1'-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
向1'-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺(83mg,0.102mmol)在甲醇(7mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(10.82mg,10.17μmol)。将混合物通过真空和氢气回填进行净化。将混合物在室温搅拌2h，过滤，并将滤液浓缩以提供作为无色薄膜的标题化合物(66mg,0.082mmol,80％收率)。LC-MS m/z 790.4(M+H)+。
步骤4
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
向1'-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺(66mg,0.084mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的溶液中加入三乙胺(0.035mL,0.251mmol)，随后加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(22.08mg,0.100mmol)和HATU(47.7mg,0.125mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(67.7mg,0.067mmol,80％收率)。LC-MS m/z 992.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.91-1.10(m,3H)1.17(br d,J＝6.3Hz,3H)1.48-1.64(m,2H)1.64-1.84(m,7H)1.89-2.11(m,6H)2.11-2.35(m,10H)2.49-2.66(m,3H)2.66-2.69(m,3H)2.69-2.76(m,2H)2.80-2.92(m,1H)2.92-3.09(m,5H)3.30-3.45(m,4H)3.50-3.72(m,10H)4.04(dt,J＝12.5,3.6Hz,1H)4.66(br d,J＝3.0Hz,1H)4.79-4.89(m,1H)5.30(t,J＝8.4Hz,1H)7.54(dd,J＝8.0,4.9Hz,1H)7.81(dt,J＝8.0,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.6Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H)8.53(d,J＝1.5Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.4Hz,1H)8.60(s,1H)8.77(s,1H)。
用与在实施例90中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例92
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺。
步骤1
4-(4-(乙氧基羰基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
在0℃向1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.0446g,7.45mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)中的搅拌溶液中加入60％氢化钠矿物油分散体(0.328g,8.20mmol)。加入4-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.290g,8.20mmol)并将反应混合物在50℃搅拌过夜，倒入水(100mL)中并搅拌2h。将沉淀物通过过滤进行收集以提供作为灰白色固体的标题化合物(2.35g,6.61mmol,89％收率)。LC-MS m/z 324.1(M+H)+。
步骤2
1-(1-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯，甲酸盐。
向4-(4-(乙氧基羰基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(245mg,0.682mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的搅拌溶液中加入TFA(2mL,26.0mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(3mL)和碳酸钾(321mg,2.321mmol)，随后加入(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(207mg,0.663mmol)，并将混合物在60℃搅拌2h，冷却，并过滤。通过制备型HPLC(Agilent Eclipse Plus C18 5μm柱,47mL/min)纯化，用5至40％乙腈在含有甲酸(0.1％)的水中的梯度洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(260mg,0.493mmol,74.4％收率)。LC-MS m/z 455.2(M+H)+。
步骤3
1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)和1-(1-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯，甲酸盐(260mg,0.519mmol)在DCM(1.5mL)中的混合物在室温搅拌1h并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(3mL)和DIPEA(0.4mL,2.290mmol)中，依次加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(137mg,0.623mmol)和HATU(296mg,0.779mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP纯化，用15至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为浅棕色薄膜的标题化合物(223mg,0.381mmol,73.3％收率)。LC-MS m/z 557.1(M+H)+。
步骤4
1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸。
将1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(223mg,0.401mmol)和2N氢氧化钠水溶液(0.401mL,0.801mmol)在四氢呋喃(THF)(1.500mL)和乙醇(1.5mL)中的混合物在室温搅拌2h，并浓缩以除去有机溶剂。将混合物冷却，使用2N HCl将pH调至4至5，并将混合物在减压下浓缩。加入在二氯甲烷(DCM)中的甲醇(2％)(30mL)并将混合物搅拌，声处理，并过滤。将滤液在减压下浓缩，以提供作为浅黄色薄膜的标题化合物(201mg,0.247mmol,61.7％收率)。LC-MS m/z 529.1(M+H)+。
步骤5
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)和((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.177mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)中。加入三乙胺(0.086mL,0.620mmol)、1-(1-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸(202mg,0.248mmol)和HATU(101mg,0.266mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC(AgilentEclipse Plus C18 5μm柱,47mL/min)纯化，用5至35％乙腈在含有TFA(0.1％)的水中的梯度洗脱。通过MDAP进行第二次纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并使用氨将pH调至10，提供作为白色粉末的标题化合物(59mg,0.059mmol,33.5％收率)。LC-MS m/z 975.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.81-0.90(m,3H)1.04-1.13(m,3H)1.55-1.75(m,3H)1.77-1.97(m,5H)2.04-2.22(m,8H)2.26-2.36(m,1H)2.42-2.47(m,2H)2.48-2.49(m,3H)2.60-2.76(m,3H)2.86-3.00(m,3H)3.11-3.30(m,3H)3.36-3.41(m,2H)3.43-3.55(m,8H)3.95-4.16(m,2H)4.45-4.56(m,1H)4.62-4.72(m,1H)4.99-5.14(m,1H)7.40-7.47(m,1H)7.63-7.71(m,2H)7.86-7.92(m,1H)8.01-8.11(m,3H)8.44-8.49(m,1H)8.52-8.58(m,2H)8.74-8.83(m,1H)8.92-9.03(m,2H)。
用与在实施例92中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例95
N-((1S,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
步骤1
9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(80mg,0.121mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中依次加入三乙胺(0.101mL,0.724mmol)、3-(叔丁氧基羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸(35.9mg,0.121mmol)和HATU(55.1mg,0.145mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(75mg,0.086mmol,71.5％收率)。LC-MS m/z 869.3(M+H)+。
步骤2
N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl(0.170mL,0.681mmol)和9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(74mg,0.085mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物在室温搅拌3h。将混合物浓缩，以提供作为固体的标题化合物(81mg,0.096mmol,113％收率)。LC-MS m/z 769.4(M+H)+。
步骤3
N-((1S,4R)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
向N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐(29mg,0.034mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.029mL,0.207mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(7.59mg,0.034mmol)和HATU(15.72mg,0.041mmol)，并将混合物在室温搅拌5h。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(23.6mg,0.024mmol,70.5％收率)。LC-MS m/z 971.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.95-1.09(m,5H)1.12-1.33(m,6H)1.42-1.88(m,19H)1.91-2.02(m,1H)2.05-2.14(m,1H)2.16-2.37(m,7H)2.53-2.60(m,1H)2.62-2.77(m,5H)2.86-2.97(m,1H)3.23-3.29(m,1H)3.40-3.73(m,6H)3.81-3.87(m,1H)3.95-4.05(m,1H)4.56-4.65(m,1H)4.97-5.02(m,1H)5.25-5.34(m,1H)7.52-7.58(m,1H)7.83-7.88(m,1H)7.89-7.94(m,1H)8.04-8.09(m,1H)8.54-8.56(m,1H)8.57-8.61(m,2H)8.71-8.74(m,1H)。
实施例96
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(4-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(1r,4r)-4-(4-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
将4-((1r,4r)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(246mg,0.721mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(1.4mL)和TFA(1.4mL)中，并在室温搅拌10min。将混合物减压浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)。将残余物、2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酸(200mg,0.721mmol)和HATU(329mg,0.865mmol)溶解在乙腈(5548μL)中。逐滴加入三乙胺(402μL,2.88mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。通过正相色谱法(24g硅胶柱,35mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(403mg,0.758mmol,105％收率)。LC-MS m/z 500.5(M+H)+。
步骤2
(1r,4r)-4-(4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
将(1r,4r)-4-(1-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酰基)哌啶-4-基)环己烷-1-甲酸乙酯(100mg,0.201mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)和TFA(1mL)中，并在室温搅拌10min。将混合物在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)。将残余物、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(40mg,0.182mmol)和TSTU(65.6mg,0.218mmol)溶解在乙腈(1400μL)中。逐滴加入三乙胺(201μL,1.442mmol)并将混合物在室温搅拌30min。通过正相色谱法(12g硅胶柱,30mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(25.5mg,0.024mmol,13.30％收率)。LC-MS m/z602.3(M+H)+。
步骤3
(1r,4r)-4-(4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸。
将(1r,4r)-4-(4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯(25.5mg,0.042mmol)溶解在甲醇(170μL)、水(170μL)和四氢呋喃(THF)(170μL)中，并加入氢氧化锂一水合物(11.17mg,0.266mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在减压下浓缩。使用微量的甲醇将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)中，加入并将混合物通过减压浓缩。通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供标题化合物(13.2mg,0.018mmol,27.0％收率)。LC-MS m/z 574.2(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(4-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(14mg,0.025mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.1mL,0.4mmol)中，并将混合物在室温搅拌15min。将反应物通过减压浓缩并追加二氯甲烷(DCM)。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(670μL)和三乙胺(13.82μL,0.099mmol)中，并将混合物加入(1r,4r)-4-(4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)哌嗪-1-基)环己烷甲酸(14.22mg,0.025mmol)中并搅拌几分钟。加入HATU(12.26mg,0.032mmol)并将混合物在室温搅拌4h。将混合物在减压下浓缩。通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(9.8mg,9.61μmol,38.7％收率)。LC-MS m/z 1020.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.99-1.08(m,3H)1.12-1.20(m,3H)1.26-1.39(m,2H)1.48-1.60(m,2H)1.64-1.80(m,3H)1.92-2.36(m,14H)2.50-2.76(m,13H)2.79-2.90(m,1H)3.03-3.14(m,1H)3.42-3.58(m,12H)3.62-3.67(m,1H)3.69-3.77(m,2H)3.99-4.08(m,1H)4.64-4.68(m,1H)4.81-4.85(m,1H)5.21-5.31(m,1H)7.51-7.57(m,1H)7.77-7.85(m,1H)7.88-7.95(m,1H)8.04-8.11(m,1H)8.50-8.54(m,1H)8.56-8.63(m,2H)8.79-8.87(m,1H)。
实施例97
(2S,3S)-N-(2-(3-(4-((1R,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)环丁基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(1r,4r)-4-(哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯,2三氟乙酸盐。
将4-((1r,4r)-4-(乙氧基羰基)环己基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(220mg,0.646mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(1.40mL)和TFA(1.400mL,18.17mmol)中，并搅拌2min。将混合物在氮气流下在50℃浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)以提供作为深橙色油的标题化合物(364mg,0.606mmol,94％收率)。LC-MS m/z 241.2(M+H)+。
步骤2
(1r,4r)-4-(4-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
将(2-(3-氧代环丁基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(181mg,0.849mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(6528μL)中，并依次加入(1r,4r)-4-(哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯,2三氟乙酸盐(143mg,0.594mmol)和三乙胺(154μL,1.103mmol)。将混合物在室温搅拌2min。加入三乙酰氧基硼氢化钠(180mg,0.849mmol)并将反应物在50℃搅拌1h。通过正相色谱法(24g硅胶柱,35mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为橙色油的标题化合物(193mg,0.362mmol,42.6％收率)。LC-MS m/z 438.3(M+H)+。将该物质与另一批组合以提供标题化合物(256mg,0.486mmol)。
步骤3
(1r,4r)-4-(4-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸。
将(1r,4r)-4-(4-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸乙酯(256mg,0.585mmol)溶解在甲醇(1500μL)、水(1500μL)和四氢呋喃(THF)(1500μL)中，加入氢氧化锂一水合物(98mg,2.340mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在减压下浓缩。通过正相色谱法(12g硅胶柱,30mL/min)纯化，用0至80％含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(183.5mg,0.421mmol,72.0％收率)。LC-MS m/z 410.3(M+H)+。
步骤4
(1S,4r)-4-(4-(3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸。
将(1r,4r)-4-(4-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸(183mg,0.447mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)和TFA(2.0mL)中，并在室温搅拌5min。将混合物在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)(3x)以提供(1r,4r)-4-(4-(3-(2-氨基乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸,2三氟乙酸盐(183mg,0.340mmol)。向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(85mg,0.386mmol)和TSTU(139mg,0.463mmol)在乙腈(2969μL)中的混合物中加入三乙胺(215μL,1.544mmol)，并将混合物在室温搅拌1.5h。加入(1r,4r)-4-(4-(3-(2-氨基乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸,2三氟乙酸盐(183mg,0.340mmol)并将反应物搅拌30min。将反应物在减压下浓缩。使用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，提供标题化合物(29mg,0.049mmol,12.63％收率)。LC-MS m/z 512.12(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(2-(3-(4-((1R,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌嗪-1-基)环丁基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(50mg,0.089mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)和HCl(0.1mL)中，并将混合物在室温搅拌15min。将反应物在减压下浓缩并追加二氯甲烷(DCM)。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(1532μL)中并加入三乙胺(31.6μl,0.227mmol)。将80％的混合物加入(1S,4r)-4-(4-(3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)环丁基)哌嗪-1-基)环己烷-1-甲酸(29mg,0.057mmol)中并在室温搅拌30min。使用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，提供作为白色固体的标题化合物(18.8mg,0.019mmol,33.8％收率)。LC-MS m/z958.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.97-1.08(m,3H)1.10-1.18(m,3H)1.22-1.36(m,2H)1.38-1.60(m,6H)1.66-1.78(m,3H)1.91-2.12(m,7H)2.17-2.38(m,10H)2.48-2.89(m,13H)2.94-3.21(m,4H)3.41-3.58(m,2H)3.61-3.70(m,1H)3.98-4.08(m,1H)4.65-4.69(m,1H)4.81-4.86(m,2H)5.21-5.31(m,1H)7.52-7.58(m,1H)7.78-7.84(m,1H)7.89-7.95(m,1H)8.03-8.11(m,1H)8.50-8.53(m,1H)8.57-8.63(m,2H)8.80-8.86(m,1H)。
实施例98
(2S,3S)-N-(2-(2-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7-二氧代-5,11-二氧杂-2,8-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯。
向2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐(106mg,0.296mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4.0mL)中的溶液中依次加入DIPEA(0.259mL,1.481mmol)、HOBt(45.4mg,0.296mmol)、HATU(169mg,0.444mmol)和3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(81mg,0.356mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(28mg,0.057mmol,19.19％收率)。LC-MS m/z 493.3(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)和1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7-二氧代-5,11-二氧杂-2,8-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯(26.8mg,0.054mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的混合物搅拌1小时并浓缩。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中依次加入(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(40mg,0.054mmol)、HOBt(8.32mg,0.054mmol)、DIPEA(0.047mL,0.272mmol)和HATU(31.0mg,0.081mmol)，并将混合物在室温搅拌3h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(18.6mg,0.018mmol,32.3％收率)。LC-MS m/z1008.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.87-0.93(m,3H)1.01-1.08(m,3H)1.37-1.49(m,2H)1.51-1.77(m,9H)1.89-2.17(m,8H)2.24-2.31(m,2H)2.32-2.39(m,1H)2.41-2.47(m,1H)2.57-2.62(m,1H)2.66-2.77(m,1H)2.91-2.99(m,1H)3.15-3.29(m,5H)3.34-3.38(m,2H)3.40-3.46(m,3H)3.51-3.57(m,3H)3.67-3.74(m,1H)3.80-3.84(m,2H)3.86-3.93(m,1H)4.38-4.48(m,1H)4.63-4.70(m,1H)4.99-5.08(m,1H)7.39-7.47(m,1H)7.58-7.65(m,2H)7.65-7.69(m,1H)7.87-7.92(m,1H)8.04-8.08(m,1H)8.09-8.13(m,1H)8.46-8.49(m,1H)8.53-8.57(m,1H)8.58-8.60(m,1H)8.61-8.67(m,1H)8.68-8.73(m,1H)8.86-8.93(m,1H)。
用与实施例98在中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例102
(2S,3S)-N-(18-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,11,18-三氧代-3,9,15-三氧杂-6,12-二氮杂十八烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(12.0g,61.5mmol)和丙烯酸叔丁酯(11.82g,92mmol)在四氢呋喃(THF)(100mL)中的溶液中加入KOH(5.75g，61.5mmol)在水(3.9mL)中的溶液，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(220g硅胶柱,150mL/min)纯化，用0至40％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(9.75g,30.1mmol,49.0％收率)。LC-MS m/z 346.2(M+H)+。
步骤2
3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1.200g,3.71mmol)在乙酸乙酯(20mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(0.034g,0.323mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填。将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜并穿过过滤。将滤液浓缩至约5.0mL体积以提供3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(10.0mL,40.0mmol)加入到2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(1.00g,3.23mmol)中。将混合物搅拌过夜，并浓缩至干燥以提供2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯，盐酸盐。LC-MS m/z 210.2(M+H)+。通过LCMS确定剩余一些SM。除去溶剂至干燥。
向在二氯甲烷(DCM)(20.00mL)中的2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯，盐酸盐中加入DIPEA(2.82mL,16.16mmol)、HOBt(0.594g,3.88mmol)和上述3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯溶液。加入EDC(0.930g,4.85mmol)，将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(810mg,1.908mmol,59.0％收率)。LC-MS m/z 425.3(M+H)+。
步骤3
3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(250mg,0.589mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(6.27mg,0.059mmol)，并将混合物抽真空并用氢气(3x)回填。将混合物在氢气气球气氛下搅拌度过周末并穿过过滤。将滤液浓缩，以提供作为无色蜡的标题化合物(148mg,0.510mmol,87％收率)。LC-MS m/z 291.3(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,13-三氧代-5,11,17-三氧杂-2,8,14-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯。
向2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐(197mg,0.549mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的溶液中加入DIPEA(0.436mL,2.497mmol)、HOBt(92mg,0.599mmol)、EDC(144mg,0.749mmol)，随后加入3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(145mg,0.499mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(147mg,0.248mmol,49.6％收率)。LC-MS m/z 594.3(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(18-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,11,18-三氧代-3,9,15-三氧杂-6,12-二氮杂十八烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,13-三氧代-5,11,17-三氧杂-2,8,14-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯(53.0mg,0.089mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)。将混合物搅拌1h，并浓缩至干燥。将二氯甲烷(DCM)(2.0mL)加入残余物中，随后加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.074mmol)和HOBt(13.68mg,0.089mmol)和DIPEA(0.065mL,0.372mmol)和EDC(21.40mg,0.112mmol)。将混合物在室温搅拌3h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(54.5mg,0.053mmol,70.7％收率)。LC-MS m/z 984.2(M+H)+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.81-1.10(m,6H)1.54-1.72(m,3H)2.14(s,7H)2.28-2.42(m,3H)2.59-2.78(m,3H)2.88-2.99(m,1H)3.10-3.31(m,9H)3.39-3.69(m,8H)3.82(d,J＝5.4Hz,5H)4.37-4.51(m,1H)4.60-4.75(m,1H)4.93-5.17(m,1H)7.37-7.54(m,1H)7.63-7.73(m,2H)7.75-7.97(m,2H)8.02-8.22(m,2H)8.59(s,4H)8.96(s,2H)。
用与在实施例102中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例104
(2S,3S)-N-(18-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,12,18-三氧代-3,9,16-三氧杂-6,13-二氮杂十八烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
将2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(1.00g,3.23mmol)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(10.0mL,40.0mmol)的混合物搅拌过夜并蒸发。向残余物中依次加入二氯甲烷(DCM)(20.00mL)、DIPEA(2.82mL,16.16mmol)、HOBt(0.594g,3.88mmol)、2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(0.650g,3.71mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液和EDC(0.930g,4.85mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(810mg,1.908mmol,59.0％收率)。LC-MS m/z 425.3(M+H)+。
步骤2
3,9,16-三氧代-1-苯基-2,7,13,20-四氧杂-4,10,17-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯。
将3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(270mg,0.636mmol)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(5.0mL,20.00mmol)的混合物搅拌过夜并浓缩。向残余物中依次加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、DIPEA(0.555mL,3.18mmol)、HOBt(117mg,0.763mmol)、EDC(183mg,0.954mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(134mg,0.763mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(220mg,0.419mmol,65.8％收率)。LC-MS m/z 526.3(M+H)+。
步骤3
1-氨基-5,12-二氧代-3,9,16-三氧杂-6,13-二氮杂十八烷-18-酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,9,16-三氧代-1-苯基-2,7,13,20-四氧杂-4,10,17-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯(220mg,0.419mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(4.45mg,0.042mmol)。将混合物抽真空，用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌4h。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为蜡的标题化合物(146mg,0.373mmol,89％收率)。LC-MS m/z 392.3(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,14-三氧代-5,11,18-三氧杂-2,8,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(99mg,0.448mmol)、HOBt(68.5mg,0.448mmol)、EDC(107mg,0.559mmol)和1-氨基-5,12-二氧代-3,9,16-三氧杂-6,13-二氮杂十八烷-18-酸叔丁酯(146mg,0.373mmol)在二氯甲烷(DCM)(5.0mL)中的溶液中加入DIPEA(0.326mL,1.865mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(220mg,0.371mmol,99％收率)。LC-MS m/z 594.3(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(18-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,12,18-三氧代-3,9,16-三氧杂-6,13-二氮杂十八烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,14-三氧代-5,11,18-三氧杂-2,8,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯(48mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)，将混合物搅拌1h，并浓缩。向残余物中依次加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.074mmol)、HOBt(13.68mg,0.089mmol)、DIPEA(0.065mL,0.372mmol)和EDC(21.40mg,0.112mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(21.4mg,0.021mmol,27.8％收率)。LC-MS m/z 984.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm0.89(d,J＝6.4Hz,3H)1.03(d,J＝6.4Hz,3H)1.53-1.69(m,3H)1.88-2.16(m,8H)2.23-2.36(m,3H)2.41-2.50(m,4H)2.62-2.76(m,1H)2.90-2.97(m,1H)3.15-3.33(m,9H)3.35-3.55(m,9H)3.81(s,2H)3.86-4.00(m,3H)4.48-4.55(m,1H)4.65(d,J＝5.9Hz,1H)5.01(q,J＝7.8Hz,1H)7.41-7.45(m,1H)7.62-7.70(m,2H)7.86-7.92(m,2H)8.04-8.16(m,2H)8.95(s,1H)9.21(br d,J＝7.8Hz,1H)。
用与实施例104在中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例107
(2S,3S)-N-(2-(2-(((1S,4R)-4-((2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(220mg,0.409mmol)和3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(95mg,0.409mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.342mL,2.456mmol)和HATU(187mg,0.491mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(252mg,0.371mmol,91％收率)。LC-MS m/z680.4(M+H)+。
步骤2
3-(2-氨基乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺,2盐酸盐。
向(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(250mg,0.368mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.3mL)中的混合物中加入HCl(0.552mL,2.207mmol)。将混合物在室温搅拌3h并浓缩，提供标题化合物(250mg,0.383mmol,104％收率)。LC-MS m/z 580.2(M+H)+。
步骤3
(1R,4s)-4-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-甲酸叔丁酯
向(1s,4s)-4-氨基环己烷-1-甲酸叔丁酯，盐酸盐(77mg,0.327mmol)和2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸(105mg,0.327mmol)在二氯甲烷(DCM)中的混合物中加入三乙胺(319μL,2.287mmol)和HATU(149mg,0.392mmol)，将混合物在室温搅拌3h，并浓缩。通过ISCO色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(87mg,0.173mmol,53.0％收率)。LC-MS m/z 503.3(M+H)+。
步骤4
(1R,4s)-4-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-甲酸，盐酸盐。
向(1R,4s)-4-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-甲酸叔丁酯(85mg,0.169mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物中加入HCl(0.211mL,0.846mmol)，将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(90mg,0.186mmol,110％收率)。LC-MS m/z 447.2(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(2-(2-(((1S,4R)-4-((2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(1R,4s)-4-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-甲酸，盐酸盐(37mg,0.077mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中依次加入HATU(35.0mg,0.092mmol)、3-(2-氨基乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙酰胺,2盐酸盐(50.0mg,0.077mmol)和三乙胺(0.075mL,0.536mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(42mg,0.042mmol,54.4％收率)作为白色固体。LC-MS m/z 1009.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.04(d,J＝6.4Hz,3H)1.13(d,J＝6.4Hz,3H)1.53-1.81(m,12H)2.05-2.33(m,8H)2.42-2.62(m,4H)2.64-2.66(m,1H)2.69-2.78(m,2H)2.79-2.88(m,1H)3.01-3.10(m,1H)3.22-3.31(m,3H)3.37-3.48(m,6H)3.51-3.73(m,5H)3.76-3.82(m,1H)3.95(s,3H)4.06(dt,J＝12.3,3.6Hz,1H)4.63(br d,J＝3.4Hz,1H)4.78-4.84(m,1H)5.30(t,J＝8.3Hz,1H)7.51(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.52(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,2.0Hz,1H)8.59(s,1H)8.80(s,1H)
用与在实施例107中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例111
(2S,3S)-N-(17-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,11,17-三氧代-3,9,15-三氧杂-6,12-二氮杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7-二氧代-5,11-二氧杂-2,8-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯。
向2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙酸，盐酸盐(320mg,0.894mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4.0mL)中的溶液中依次加入DIPEA(0.781mL,4.47mmol)、HOBt(137mg,0.894mmol)、HATU(510mg,1.342mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(227mg,1.073mmol)，并将混合物搅拌4h。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(295mg,0.616mmol,68.9％收率)。LC-MS m/z 479.4(M+H)+。
步骤2
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,13-三氧代-5,11,17-三氧杂-2,8,14-三氮杂十九烷-19-酸叔丁酯。
将1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7-二氧代-5,11-二氧杂-2,8-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯(130mg,0.272mmol)和4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)的混合物搅拌1h并浓缩。将残余物溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4.0mL)中，并依次加入DIPEA(176mg,1.358mmol)、HOBt(41.6mg,0.272mmol)、HATU(155mg,0.407mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(68.8mg,0.326mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(95mg,0.164mmol,60.3％收率)。LC-MS m/z 580.3(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(17-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5,11,17-三氧代-3,9,15-三氧杂-6,12-二氮杂十七烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,7,13-三氧代-5,11,17-三氧杂-2,8,14-三氮杂十九烷-19-酸叔丁酯(43.1mg,0.074mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)，将混合物搅拌1h，并浓缩。向残余物中依次加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.074mmol)、HOBt(11.40mg,0.074mmol)、DIPEA(0.065mL,0.372mmol)和HATU(42.4mg,0.112mmol)，并将混合物在室温搅拌3h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(49.3mg,0.048mmol,64.9％收率)。LC-MS m/z 970.2(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.89(d,J＝6.4Hz,3H)1.03(d,J＝6.4Hz,3H)1.51-1.75(m,3H)1.80-2.06(m,3H)2.11(s,3H)2.16(br s,1H)2.22-2.36(m,1H)2.41-2.50(m,3H)2.52-2.62(m,3H)2.64-2.81(m,2H)2.83-2.97(m,1H)3.20-3.32(m,6H)3.36-3.57(m,8H)3.83(s,4H)3.86-4.03(m,4H)4.52(br d,J＝4.4Hz,1H)4.65(d,J＝6.4Hz,1H)4.96-5.05(m,1H)7.41-7.46(m,1H)7.68(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.74-7.84(m,2H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.12(br t,J＝5.6Hz,1H)8.47(d,J＝1.5Hz,1H)8.55(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.63(br d,J＝8.3Hz,1H)8.95(s,1H)9.24(br d,J＝8.3Hz,1H)。
实施例112
(2S,3S)-N-(2-(((1S,4S)-4-(3-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺。
在0℃将饱和的NaHCO3加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺，盐酸盐(21g,70.9mmol)(21g,70.9mmol)中，并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供标题化合物(18g,69.3mmol,98％收率)。LC-MS m/z 260.3(M+H)+。
步骤2
(1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己烷-1-醇。
在0℃向(1r,4r)-环己烷-1,4-二醇(2g,17.22mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)中的混合物中加入60％氢化钠(2.4g,60.0mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。将混合物冷却至0℃，加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺(5g,19.25mmol)，并将混合物在80℃搅拌2天。将混合物冷却至室温，倒入冰中，并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用水、用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过反相HPLC(C18 Aq Gold 275g柱,150mL/min)纯化，用40至63％的含有氢氧化铵(1％)的乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(961mg,2.83mmol,16.44％收率)。LC-MS m/z 340.3(M+H)+。
步骤3
3-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸叔丁酯。
向(1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己烷-1-醇(144mg,0.424mmol)、四丁基硫酸氢铵(18.72mg,0.055mmol)和氢氧化钠(339mg,4.24mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的混合物中加入丙烯酸叔丁酯(0.249ml,1.697mmol)，并将混合物在室温搅拌4h。加入水和二氯甲烷(DCM)，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供中间体3-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸叔丁酯。LC-MS m/z 468.2(M+H)+。
将10％ Pd-C(90mg,0.085mmol)加入在乙酸乙酯(3mL)中的3-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸叔丁酯中，并将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物过滤，将催化剂用甲醇洗涤，并将合并的滤液浓缩。LC-MS m/z 288.2(M+H)+。
将残余物置于二氯甲烷(DCM)(2.00mL)中，加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(93mg,0.424mmol)、HATU(194mg,0.509mmol)和三乙胺(0.177ml,1.273mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(170mg,0.347mmol,82％收率)。LC-MS m/z 490.1(M+H)+。
步骤4
3-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸，盐酸盐。
向在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的3-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸叔丁酯(170mg,0.347mmol)中加入4M HCl在二氧杂环己烷中的溶液(0.694mL,2.78mmol)，将混合物在室温搅拌3h，并浓缩，以提供标题化合物(175mg,0.372mmol,107％收率)。LC-MS m/z 434.1(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(2-(((1S,4S)-4-(3-(((1S,4S)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向在二氯甲烷(DCM)中的(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(56.4mg,0.085mmol)和3-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)丙酸，盐酸盐(40mg,0.085mmol)中加入三乙胺(95μL,0.681mmol)和HATU(38.8mg,0.681mmol)，将混合物在室温搅拌2h，并浓缩。通过反相色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％的含有氢氧化铵(1％)的乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(56mg,0.056mmol,65.5％收率)。LC-MS m/z 503.4(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01(d,J＝6.4Hz,3H)1.12-1.28(m,7H)1.66(td,J＝8.9,4.2Hz,3H)1.70-1.83(m,9H)1.83-1.97(m,4H)2.09-2.26(m,3H)2.27(s,3H)2.30-2.42(m,3H)2.52-2.63(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.77(m,2H)2.78-2.89(m,1H)3.01-3.10(m,1H)3.12-3.20(m,1H)3.21-3.31(m,3H)3.34-3.49(m,4H)3.52-3.59(m,1H)3.59-3.72(m,3H)3.86-3.95(m,1H)4.04(dt,J＝12.5,3.8Hz,1H)4.61(br d,J＝2.9Hz,1H)5.32(t,J＝8.8Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.56-8.61(m,2H)8.73(s,1H)
用与在实施例112中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例118
(S)-N-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺,2盐酸盐。
将HCl(0.028mL,0.113mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(90mg,0.124mmol)中，并将混合物在室温搅拌40min。加入二氯甲烷(DCM)(0.5ml)和HCl(0.028mL,0.113mmol)并将混合物在室温搅拌1h。将混合物浓缩，以提供作为固体的标题化合物(100mg,0.144mmol,127％收率)。LC-MS m/z 624.2(M+H)+。
步骤2
(2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基)-L-脯氨酸叔丁酯。
向(2-(2-溴乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(310mg,1.156mmol)和L-脯氨酸叔丁酯(H-Pro-OtBu)(198mg,1.156mmol)在乙腈(8mL)中的混合物中加入碳酸钾(240mg,1.734mmol)。将混合物在80℃搅拌2h，在室温搅拌度过周末，并在80℃搅拌3h。加入水和二氯甲烷(DCM)并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至12％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(300mg,0.837mmol,72.4％收率)。LC-MS m/z 359.3(M+H)+。
步骤3
(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-L-脯氨酸,2盐酸盐
向在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的(2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基)-L-脯氨酸叔丁酯(300mg,0.837mmol)中加入HCl(1.046mL,4.18mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩，以提供作为泡沫的标题化合物(280mg,1.018mmol,122％收率)。LC-MS m/z 203.2(M+H)+。
步骤4
(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-L-脯氨酸。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(106mg,0.481mmol)在DMSO(0.5ml)中的混合物中加入TSTU(145mg,0.481mmol)和三乙胺(0.201mL,1.444mmol)，并将混合物在室温搅拌40min。加入(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-L-脯氨酸,2盐酸盐(159mg,0.578mmol)和三乙胺(0.201mL,1.444mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过ISCOEZ Prep色谱法(C18Aq Gold柱,40mL/min)纯化，用乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(100mg,0.227mmol,47.1％收率)。LC-MS m/z 405.1(M+H)+。
步骤5
(S)-N-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺。
向3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙酰胺,2盐酸盐(52mg,0.075mmol)和(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-L-脯氨酸(30.2mg,0.075mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.052mL,0.373mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。加入HATU(34.1mg,0.090mmol)并将混合物在室温搅拌1h。将混合物通过ISCO色谱法(24gRediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)进行第二次纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(36mg,0.036mmol,47.7％收率)。LC-MS m/z1010.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.94-1.08(m,3H)1.15(br d,J＝6.3Hz,3H)1.57-1.85(m,6H)1.90-2.02(m,1H)2.04-2.19(m,2H)2.20-2.59(m,8H)2.63-2.79(m,7H)2.80-2.92(m,1H)2.96-3.05(m,1H)3.08-3.21(m,2H)3.24-3.33(m,2H)3.34-3.63(m,13H)3.65-3.76(m,2H)3.77-3.86(m,1H)3.98-4.18(m,1H)4.58-4.70(m,1H)4.80-4.85(m,1H)5.31(t,J＝8.1Hz,1H)7.49-7.56(m,1H)7.77-7.85(m,1H)7.92(d,J＝8.9Hz,1H)8.06(d,J＝1.8Hz,1H)8.50-8.54(m,1H)8.55-8.59(m,1H)8.59-8.63(m,1H)8.83(s,1H)。
实施例119
(2S,3S)-N-(20-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-10,20-二氧代-3,6,14,17-四氧杂-9,11-二氮杂二十烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(262mg,1.055mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(232mg,1.055mmol)在二氯甲烷(DCM)(3517μL)中的混合物中加入DIPEA(737μL,4.22mmol)和EDC(196μL,1.108mmol)，将混合物在室温搅拌20h，并在减压下浓缩。通过ISCORf色谱法(24g硅胶柱,35mL/min)纯化，用0％(5柱体积)、0至5％(30柱体积)、5％(4柱体积)甲醇在含有三乙胺(0.1％)的二氯甲烷中的梯度洗脱，提供作为澄清粘性固体的标题化合物(323mg,0.645mmol,61.2％收率)。LC-MS m/z 451.3(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1770μL,7.08mmol)加入(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(319mg,0.708mmol)在1,4-二氧杂环己烷(2360μL)中的溶液中，将混合物在40℃搅拌1h，并在减压下浓缩，以提供作为灰白色粘性固体的标题化合物(306mg,0.651mmol,92％收率)。LC-MS m/z 351.3(M+H)+。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,12-二氧代-5,8,16,19-四氧杂-2,11,13-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯。
将三乙胺(45.4μL,0.326mmol)加入商购可得的3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(38mg,0.163mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(543μL)中的溶液中，并将混合物搅拌10min。加入CDI(26.4mg,0.163mmol)并将混合物搅拌30min。添加(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(69mg,0.163mmol)与三乙胺(23μL,0.18mmol)，并将混合物在室温搅拌20h。通过反相HPLC(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用15至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为澄清粘性固体的标题化合物(54mg,0.080mmol,48.9％收率)。LC-MS m/z 610.3(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,12-二氧代-5,8,16,19-四氧杂-2,11,13-三氮杂二十二烷-22-酸，盐酸盐
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(205μL,0.820mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,12-二氧代-5,8,16,19-四氧杂-2,11,13-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯(50mg,0.082mmol)在1,4-二氧杂环己烷(273μL)中的溶液中，并将混合物在40℃搅拌4h。加入小量乙腈以保持溶液均质。将混合物在减压下浓缩以提供作为灰白色粘性固体的标题化合物(46.6mg,0.071mmol,87％收率)。LC-MS m/z 554.3(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(20-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-10,20-二氧代-3,6,14,17-四氧杂-9,11-二氮杂二十烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
在室温将(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(42mg,0.078mmol)、1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,12-二氧代-5,8,16,19-四氧杂-2,11,13-三氮杂二十二烷-22-酸，盐酸盐(47.5mg,0.080mmol)和HOAt(10.46mg,0.077mmol)的混合物溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)中。加入DIPEA(0.128mL,0.732mmol)和EDC(0.014mL,0.077mmol)并将混合物在室温搅拌3天。通过反相HPLC(Gemini C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用15至45％乙腈在含有氢氧化铵(0.1％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(26.1mg,0.025mmol,33.9％收率)。LC-MS m/z 1000.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.05(br d,J＝6.4Hz,3H)1.14(br d,J＝6.4Hz,3H)1.63-1.79(m,3H)1.92-2.02(m,1H)2.06-2.18(m,1H)2.20-2.38(m,5H)2.46(t,J＝5.6Hz,2H)2.50-2.58(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.77(m,2H)2.81-2.88(m,1H)3.00-3.08(m,1H)3.23-3.29(m,4H)3.37-3.40(m,1H)3.44(t,J＝5.6Hz,3H)3.47-3.53(m,8H)3.55-3.59(m,5H)3.67-3.76(m,2H)3.78-3.86(m,1H)4.06(dt,J＝12.3,3.6Hz,1H)4.64(br d,J＝2.0Hz,1H)4.79-4.85(m,1H)4.79-4.84(m,1H)5.29(t,J＝8.1Hz,1H)7.52(dd,J＝8.1,5.1Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.52(d,J＝2.0Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.60(s,1H)8.83(s,1H)。
实施例120
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(332mg,1.423mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(296mg,1.344mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入HATU(620mg,1.631mmol)和三乙胺(0.595mL,4.27mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g RedisepRf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(600mg，1.378mmol,97％收率)。LC-MS m/z 437.2(M+2H)+。
步骤2
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸，盐酸盐。
将HCl(3mL,12.00mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(600mg,1.378mmol)中，将混合物在室温搅拌4h，并浓缩，以提供标题化合物(580mg,1.395mmol,101％收率)。LC-MS m/z 380.4(M+H)+。
步骤3
(1s,4s)-4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)环己烷-1-甲酸叔丁酯。
向(1s,4s)-4-氨基环己烷-1-甲酸叔丁酯，盐酸盐(69.2mg,0.293mmol)和3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸，盐酸盐(122mg,0.293mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.245mL,1.760mmol)和HATU(134mg,0.352mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。加入饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(12g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(160mg,0.285mmol,97％收率)。LC-MS m/z 561.4(M+H)+。
步骤4
(1s,4s)-4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)环己烷-1-甲酸。
将HCl(0.357mL,1.427mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的(1s,4s)-4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)环己烷-1-甲酸叔丁酯(160mg,0.285mmol)中，将混合物在室温搅拌4h，并浓缩，以提供标题化合物(160mg,0.296mmol,104％收率)。LC-MS m/z 505.4(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(叔丁基氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(叔丁基氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮(38.6mg,0.083mmol)和(1s,4s)-4-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙烷酰氨基)环己烷-1-甲酸，盐酸盐(45mg,0.083mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.070mL,0.499mmol)和HATU(38.0mg,0.100mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(35.7mg,0.038mmol,45.1％收率)。LC-MS m/z 951.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.18(s,8H)1.58-1.69(m,2H)1.71-1.98(m,11H)2.22-2.47(m,4H)2.52-2.63(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.73(m,1H)2.77-2.91(m,1H)3.03-3.11(m,1H)3.15(d,J＝1.5Hz,1H)3.21-3.31(m,2H)3.35-3.39(m,1H)3.41-3.71(m,10H)3.88(br t,J＝4.2Hz,1H)4.01(dt,J＝12.3,3.6Hz,1H)4.58(br d,J＝2.9Hz,1H)4.82(d,J＝6.8Hz,1H)5.32(t,J＝8.6Hz,1H)7.49-7.55(m,1H)7.79(dt,J＝8.2,1.8Hz,1H)7.76-7.81(m,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.73(s,1H)。
实施例121
(2S,3S)-N-(2-(4-(4-(((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)丁氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺。
在氮气气氛下向2-(二苄基氨基)乙烷-1-醇(20g,83mmol)在二氯甲烷(DCM)(180mL)中的溶液中加入三乙胺(23.10mL,166mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。加入4-甲基苯磺酰氯(18.96g,99mmol)并将混合物搅拌16h。加入水(300ml)并将水相用二氯甲烷(DCM)(2x200mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl(50mL)、用水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱,230至400目硅胶)纯化，用0至10％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为无色液体的标题化合物(14.42g,52.1mmol,62.9％收率)。LC-MS m/z 260.0(M+H)+。
步骤2
4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)丁烷-1-醇。
在0℃在氮气气氛下历时15min向丁烷-1,4-二醇(5.5g,61.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)中的溶液中逐份加入在矿物油中的60％氢化钠(2.441g,61.0mmol)，并将混合物搅拌30min。逐滴加入N,N-二苄基-2-氯乙烷-1-胺(14.27g,54.9mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中的溶液，并将混合物在室温搅拌16h。加入冰水(150mL)并将混合物用乙酸乙酯(3x 80mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl(100mL)、用冰水(2x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱,230至400目硅胶)纯化，用20至35％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(4.021g,12.20mmol,19.99％收率)。LC-MS m/z 314.1(M+H)+。
步骤3
(E)-4-(4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)丁氧基)丁-2-烯酸甲酯。
在氮气气氛下在室温向4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)丁烷-1-醇(4.0g,12.76mmol)和丁-2-炔酸甲酯(2.504g,25.5mmol)在甲苯(40mL)中的搅拌溶液中加入三苯基膦(0.335g,1.276mmol)和乙酸(0.292mL,5.10mmol)。将混合物在115℃搅拌20h并在减压下浓缩。将残余物在水(100mL)和乙酸乙酯(50mL)之间分配。将水相用乙酸乙酯(2x 50mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl(50mL)、用水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱,230至400目硅胶)纯化，用0至20％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(4.28g,7.92mmol,62.0％收率)。LC-MS m/z 412.2(M+H)+。
步骤4
4-(4-(2-氨基乙氧基)丁氧基)丁酸甲酯。
在氮气气氛下向(E)-4-(4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)丁氧基)丁-2-烯酸甲酯(4.25g,10.33mmol)在甲醇(30mL)中的搅拌溶液中加入Pd-C(1.5g,1.410mmol)。将混合物用氢气冲刷并在压力气球气氛下搅拌16h。将混合物穿过床过滤并将催化剂用甲醇(3x 40mL)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩，以提供作为无色液体的标题化合物(2.17g,9.27mmol,90％收率)。LC-MS m/z 234.2(M+H)+。
步骤5
4-(4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丁氧基)丁酸甲酯。
在氮气气氛下向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(1.85g,8.40mmol)和HATU(6.39g,16.80mmol)在二氯甲烷(DCM)(30mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(7.34mL,42.0mmol)。将混合物在室温搅拌20min并在0℃加入4-(4-(2-氨基乙氧基)丁氧基)丁酸乙酯(2.156g,9.24mmol)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌16h。加入水(50mL)和二氯甲烷(DCM)(50mL)，并将水相用甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液(10％)(3x 60mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3(50mL)、用水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱,230至400目硅胶)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为棕色液体的标题化合物(4.41g,5.54mmol,65.9％收率)。LC-MS m/z 436.1(M+H)+。
步骤6
4-(4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丁氧基)丁酸。
向在氮气下在0℃搅拌的4-(4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丁氧基)丁酸甲酯(4.4g,10.10mmol)在四氢呋喃(THF)(20mL)中的溶液中在0℃历时5min逐滴加入氢氧化锂单氢化物(0.424g,10.10mmol)在水(20.00mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌16h并在减压下浓缩。将残余物在水(20mL)和乙酸乙酯(30mL)之间分配。将水相用乙酸乙酯(2x 40mL)洗涤并使用6NHCl将pH调至5至6。通过Buchi色谱法(C18 330g 40μm23.5cm x 6.5cm柱,30mL/min)纯化，用15至35％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为黄色液体的标题化合物(1.604g,3.73mmol,36.9％收率)。LC-MS m/z 422.2(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(2-(4-(4-(((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)丁氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(1r,4R)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(53.5mg,0.081mmol)和4-(4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丁氧基)丁酸(34mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.067mL,0.484mmol)和HATU(36.8mg,0.097mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(37.8mg,0.038mmol,47.2％收率)。LC-MS m/z 993.7(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.02(br d,J＝6.4Hz,3H)1.16(br d,J＝6.4Hz,3H)1.19-1.31(m,2H)1.54-1.65(m,6H)1.66-1.78(m,3H)1.79-1.87(m,2H)1.90-2.02(m,5H)2.07-2.17(m,2H)2.19-2.25(m,3H)2.28(s,3H)2.34(br d,J＝14.2Hz,1H)2.48-2.61(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.75(m,3H)2.77-2.89(m,1H)3.05(ddd,J＝9.4,7.9,6.6Hz,1H)3.33(quin,J＝1.7Hz,7H)3.44-3.56(m,4H)3.57-3.68(m,2H)4.03(dt,J＝12.6,3.7Hz,1H)4.65(br d,J＝3.4Hz,1H)4.83(d,J＝6.4Hz,1H)5.28(t,J＝8.1Hz,1H)7.53(dd,J＝7.3,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.81(s,1H)。
用与在实施例121中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例123
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-6-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基)吡啶酰胺。
步骤1
6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氨基)吡啶甲酸甲酯
向(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(1822mg,5.41mmol)和6-氟吡啶甲酸甲酯(800mg,5.16mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(19mL)中的溶液中加入碳酸钾(1425mg,10.31mmol)，并将混合物在100℃搅拌5天。加入乙酸乙酯，并将有机相用水洗涤，用饱和的NH4Cl洗涤，用饱和的NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过ISCORf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0％(5柱体积)、0至5％(25柱体积)、5％(4柱体积)甲醇在二氯甲烷中的梯度洗脱，提供作为澄清无色油的标题化合物(407mg,0.690mmol,13.39％收率)。LC-MS m/z 472.4(M+H)+。
步骤2
6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氨基)吡啶甲酸。
将10M氢氧化钠水溶液(512μL,5.12mmol)加入6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氨基)吡啶甲酸甲酯(402mg,0.853mmol)在甲醇、四氢呋喃(THF)和水(2:1:1)中的溶液中，并将混合物在室温搅拌20h。用1N HCl将pH调至7，将混合物浓缩，并加入二氯甲烷(DCM)。将未溶解的固体通过过滤除去，并用二氯甲烷(DCM)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩，以提供作为橙色树胶状固体的标题化合物(489mg,0.855mmol,100％收率)。LC-MS m/z 458.2(M+H)+。
步骤3
(14-((6-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.768ml,7.07mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(0.1997g,0.354mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1.179ml)中的溶液中，并将混合物在45℃搅拌30min。将混合物在减压下浓缩并将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中。依次加入6-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂十九烷-19-基)氨基)吡啶甲酸(0.194g,0.424mmol)、HOAt(0.053g,0.389mmol)、DIPEA(0.618ml,3.54mmol)、EDC(0.069mL,0.389mmol)，并将混合物在37℃搅拌20h。加入二氯甲烷(DCM)并将有机相用水洗涤，用饱和的NH4Cl洗涤，用饱和的NaHCO3洗涤，和用盐水洗涤。使有机相穿过分相器并在减压下浓缩。将残余物通过反相HPLC(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在含有甲酸(0.1％)的水中的梯度洗脱。将含有期望产物的级分合并并浓缩以除去乙腈，使用饱和NaHCO3将pH调至8，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，穿过分相器，并在减压下浓缩，以提供作为灰白色固体的标题化合物(74mg,0.076mmol,21.52％收率)。LC-MS m/z 904.3(M+H)+。
步骤4
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-6-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基)吡啶酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(186μL,0.742mmol)加入到(14-((6-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(67.1mg,0.074mmol)在1,4-二氧杂环己烷(247μL)中的溶液中。加入几滴甲醇以保持混合物均质。将反应物在45℃搅拌30min并在减压下浓缩。加入二氯甲烷(DCM)并将有机相用饱和NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，穿过分相器，并在减压下浓缩。将残余物溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.4mL)中，依次加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(19.61mg,0.089mmol)、HOAt(11.11mg,0.082mmol)、EDC(14.45μL,0.082mmol)和DIPEA(78μL,0.445mmol)，并将混合物在室温搅拌4h。将混合物通过MDAP色谱法(XSelectTMCSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用5至35％乙腈在含有TFA(0.1％)的水中的梯度洗脱。将含有期望产物的级分合并并浓缩以除去乙腈，使用饱和NaHCO3将pH调至8，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，穿过分相器，并在减压下浓缩，以提供作为灰白色固体的标题化合物(29mg,0.029mmol,38.4％收率)。LC-MS m/z1006.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.86-1.05(m,6H)1.12-1.35(m,3H)1.41(brd,J＝11.0Hz,1H)1.60-1.88(m,4H)2.18(s,1H)2.22-2.30(m,3H)2.34(br d,J＝12.5Hz,2H)2.39-2.55(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.74(m,1H)2.77-2.90(m,2H)2.95-3.11(m,1H)3.22-3.31(m,1H)3.35-3.43(m,2H)3.46-3.69(m,15H)3.72-3.97(m,1H)4.18(dt,J＝12.5,3.5Hz,1H)4.79-4.89(m,2H)4.92(s,1H)5.34(t,J＝8.8Hz,1H)6.69(dd,J＝8.5,0.8Hz,1H)7.29(dd,J＝7.0,0.8Hz,1H)7.47-7.56(m,2H)7.80(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.52(d,J＝2.0Hz,1H)8.54-8.61(m,2H)8.78(s,1H)。
用与在实施例116中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例129
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺。
步骤1(也描述在实施例85的步骤1中)
4-(4-(乙氧基羰基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
在0℃向1H-吡唑-4-甲酸乙酯(1.0446g,7.45mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(30mL)中的搅拌溶液中加入60％氢化钠矿物油分散体(0.328g,8.20mmol)。在氢气产生已经停止以后，加入4-((甲基磺酰基)氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.290g,8.20mmol)并将反应混合物在50℃搅拌过夜，倒入水(100mL)并搅拌2h。将沉淀物通过过滤进行收集以提供作为灰白色固体的标题化合物(2.35g,6.61mmol,89％收率)。LC-MS m/z 324.1(M+H)+。
步骤2
1-(1-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六烷-16-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯，甲酸盐
将TFA(1mL,12.98mmol)缓慢地加入到4-(4-(乙氧基羰基)-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(255mg,0.710mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌1h，并在减压下浓缩。将残余物溶解在DMF(3mL)中，依次加入碳酸钾(490mg,3.55mmol)和(2-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(250mg,0.702mmol)。将混合物在60℃搅拌2h，冷却，并过滤。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(276mg,0.44mmol,62.6％收率)。LC-MS m/z499.5(M+H)+。
步骤3
1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯,2三氟乙酸盐。
将4M HCl在1,4二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)加入到1-(1-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六烷-16-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯，甲酸盐(270mg,0.496mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌1h，并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(3mL)中。依次加入三乙胺(0.242mL,1.735mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(120mg,0.545mmol)和HATU(283mg,0.744mmol)，将混合物在室温搅拌2h，并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C185μm柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有TFA(0.1％))洗脱，提供无色的标题化合物(285mg,0.344mmol,69.4％收率)。LC-MS m/z 499.5(M+H)+。
步骤4
1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸,2甲酸盐。
将2N氢氧化锂(0.860mL,1.719mmol)加入到1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯,2三氟乙酸盐(285mg,0.344mmol)在乙醇(1.5mL)和THF(1.5mL)中的溶液中，并在0℃搅拌1h。将反应物在室温搅拌过夜并浓缩。用1N HCl将pH调至3至4。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用0至25％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(131mg,0.197mmol,57.3％收率)。LC-MS m/z 573.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.69-0.80(m,4H)0.99-1.07(m,4H)1.17(d,J＝9.5Hz,1H)1.40(dt,J＝8.0,1.4Hz,1H)1.61-1.79(m,6H)1.83-1.88(m,2H)1.90-2.05(m,8H)2.12(br d,J＝12.8Hz,2H)2.20-2.23(m,2H)2.93-2.99(m,1H)3.17(d,J＝6.5Hz,1H)5.88(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)6.15(dt,J＝7.9,1.8Hz,1H)6.25(s,1H)6.57(s,1H)6.64(s,1H)6.86(s,1H)6.92(br d,J＝4.3Hz,1H)。
步骤5
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.25mL,1.000mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(57.9mg,0.103mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥，将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(3mL)和三乙胺(0.06mL,0.430mmol)中，并加入1-(1-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲酸,2甲酸盐(65mg,0.098mmol)和HATU(58.5mg,0.154mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(72.4mg,0.070mmol,71.4％收率)。LC-MS m/z 1019.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.95-1.02(m,3H)1.16-1.31(m,3H)1.69-1.94(m,4H)1.99-2.11(m,4H)2.33(s,8H)2.46-2.56(m,1H)2.60-2.75(m,6H)2.76-2.88(m,2H)3.00-3.13(m,3H)3.35-3.72(m,17H)4.10-4.24(m,2H)4.72-4.80(m,1H)4.81-4.85(m,1H)5.25-5.35(m,1H)7.53(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.77-7.82(m,2H)7.88-7.94(m,1H)8.03(s,1H)8.06(br d,J＝1.8Hz,1H)8.51-8.54(m,1H)8.55-8.59(m,2H)8.78-8.84(m,1H)。
实施例130
1-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)-N-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-甲酰胺。
步骤1
(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(2.0g,9.08mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)中的溶液中加入DIPEA(4.76mL,27.2mmol)、EDC(2.61g,13.62mmol)和HOBt(2.086g,13.62mmol)，并将混合物在氮气气氛下在室温搅拌。加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.59mL,10.90mmol)并将混合物在室温搅拌52h。加入水(50mL)并将水相用乙酸乙酯(3x 25mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(2x25mL)洗涤、用盐水(25mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过IsoleraTM色谱法(100g柱,230至400目)纯化，用5至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为灰白色树胶状固体的标题化合物(2.4g,5.06mmol,55.7％收率)。LC-MS m/z451.0(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐
将HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(5.92mL,26.6mmol)加入到(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.4g,5.33mmol)在二氯甲烷(DCM)(24mL)中的溶液中，将混合物在室温搅拌16h，并在减压下浓缩，以提供作为黄色树胶状固体的标题化合物(2g,4.72mmol,89％收率)。LC-MSm/z 351.2(M+H)+。
步骤3
4-(4-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯。
向1-(4-(甲氧基羰基)苯基)哌啶-4-甲酸(600mg,2.279mmol)在二氯甲烷(DCM)(12mL)和N-N-二甲基甲酰胺(DMF)(3mL)中的溶液中依次加入EDC，盐酸盐(655mg,3.42mmol)、HOBt(462mg,3.42mmol)、三乙胺(0.953ml,6.84mmol)和(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(882mg,2.095mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。加入二氯甲烷(DCM)，将有机相用水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过IsoleraTM色谱法(50g柱)纯化，用5％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为黄色树胶状固体的标题化合物(700mg,0.858mmol,41.0％收率)。LC-MS m/z 596.2(M+H)+。
步骤4
4-(4-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸。
在0℃向4-(4-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(700mg,1.175mmol)在四氢呋喃(THF)(7mL)和水(3.5mL)中的溶液中加入氢氧化锂一水合物(148mg,3.53mmol)，将混合物在室温搅拌16h，并在减压下浓缩。将残余物用1.5N HCl(2mL)酸化并浓缩。通过反相HPLC(XSelectTM CSH Prep C18 5μm柱,15mL/min)纯化，用15至100％乙腈在含有乙酸铵(10mM)的水中的梯度洗脱，提供作为浅棕色树胶的标题化合物(435mg,0.740mmol,63.0％收率)。LC-MS m/z 582.3(M+H)+。
步骤5
1-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)苯基)-N-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(37.9mg,0.070mmol)和4-(4-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸(41mg,0.070mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.069mL,0.493mmol)和HATU(32.2mg,0.085mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为固体的标题化合物(34mg,0.033mmol,46.9％收率)。LC-MS m/z 1028.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.95(br d,J＝6.3Hz,3H)1.11-1.29(m,3H)1.64-1.96(m,8H)2.12-2.30(m,2H)2.32(s,3H)2.36-2.55(m,3H)2.65(s,3H)2.67-2.76(m,1H)2.77-2.93(m,4H)3.05(ddd,J＝9.4,8.0,6.7Hz,1H)3.35(s,4H)3.45-3.55(m,6H)3.56-3.68(m,5H)3.92(br dd,J＝8.8,3.8Hz,2H)4.16(br d,J＝12.8Hz,1H)4.78-4.87(m,2H)5.21-5.47(m,1H)6.96(br d,J＝8.5Hz,2H)7.48-7.56(m,1H)7.69(d,J＝8.8Hz,2H)7.79(dt,J＝7.9,1.9Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.52(d,J＝1.8Hz,1H)8.54-8.61(m,2H)8.84(s,1H)。
用与在实施例130中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例136
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(((1S,4R)-4-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(500mg,2.270mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4.0mL)中的溶液中依次加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(498mg,2.270mmol)、HOBt(348mg,2.270mmol)、HATU(1295mg,3.41mmol)和DIPEA(1.983mL,11.35mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将水相用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCORf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色固体的标题化合物(890mg,2.112mmol,93％收率)。LC-MS m/z 422.3(M+H)+。
步骤2
((1R,4s)-4-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(5.0mL,20.00mmol)加入到2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(100mg,0.237mmol)在丙酮(0.50mL)中的溶液中，将混合物搅拌1h，并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中，并依次加入DIPEA(153mg,1.186mmol)、HOBt(43.6mg,0.285mmol)、EDC(68.2mg,0.356mmol)和((1s,4s)-4-氨基环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯(66.9mg,0.261mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCORf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物。LC-MS m/z 422.3(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(((1S,4R)-4-((2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)加入到((1R,4s)-4-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)环己烷-1-羰基)甘氨酸叔丁酯(44mg,0.073mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中，将混合物搅拌1h，并浓缩。向残余物中依次加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(49.0mg,0.073mmol)、HOBt(13.39mg,0.087mmol)、DIPEA(0.064mL,0.364mmol)和EDC(20.96mg,0.109mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(34.5mg,0.033mmol,45.2％收率)。LC-MS m/z 994.8(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm0.92(d,J＝6.4Hz,3H)1.04(d,J＝6.4Hz,3H)1.29-1.71(m,10H)1.85-2.14(m,7H)2.14-2.24(m,1H)2.26-2.38(m,1H)2.39-2.47(m,1H)2.49(s,3H)2.54-2.61(m,1H)2.64-2.75(m,1H)2.90-3.00(m,1H)3.10-3.28(m,3H)3.37-3.43(m,3H)3.44-3.53(m,4H)3.54-3.67(m,3H)3.69-3.79(m,1H)3.79-3.87(m,2H)3.89-4.02(m,1H)4.34-4.48(m,1H)4.64(d,J＝6.4Hz,1H)5.05(d,J＝8.3Hz,1H)7.32-7.39(m,1H)7.36(d,J＝7.3Hz,1H)7.42(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.66(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(s,3H)8.46(d,J＝2.0Hz,1H)8.54(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H)8.59(s,2H)8.66(d,J＝8.3Hz,1H)8.91-8.97(m,1H)。
用与在实施例136中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例138
(2S,3S)-N-(3-(9-((3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2S,3S)-N-(3-羟基丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向3-氨基丙烷-1-醇(239mg,3.18mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(350mg,1.589mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入HATU(725mg,1.907mmol)和三乙胺(0.665mL,4.77mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。将混合物在饱和的NaHCO3/固体NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将有机相用饱和的NaHCO3萃取。将合并的水性提取物过滤并将滤液浓缩。将甲醇加入残余物中，将固体滤出并用甲醇洗涤。将合并的滤液浓缩。通过ISCOEZ Prep色谱法(C18Aq Gold柱,40mL/min)纯化，用0至10％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(200mg,0.721mmol,45.4％收率)。LC-MS m/z 278.1(M+H)+。
步骤2
甲磺酸3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酯
向(2S,3S)-N-(3-羟基丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(347mg,1.251mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.523mL,3.75mmol)和甲磺酰氯(0.194mL,2.502mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。加入三乙胺(0.523mL,3.75mmol)和甲磺酰氯(0.194mL,2.502mmol)并将混合物在室温搅拌1h。加入饱和的NaHCO3并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法纯化，提供作为淡黄色油的标题化合物(350mg,0.985mmol,79％收率)。LC-MS m/z 356.2(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(3-(9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-酮，三氟乙酸盐(116mg,0.412mmol)在乙腈(1mL)中的混合物中加入碳酸钾(228mg,1.650mmol)，并将混合物在室温搅拌20min。加入甲磺酸3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酯(147mg,0.412mmol)并将混合物在80℃搅拌10min。加入另外的甲磺酸3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酯(147mg,0.412mmol)，并将混合物在50℃搅拌4h。加入饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用15至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供标题化合物(42.3mg,0.099mmol,24.05％收率)。LC-MS m/z 427.5(M+H)+。
步骤4
(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(65mg,0.121mmol)和3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(22.88mg,0.121mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.084mL,0.605mmol)和HATU(55.2mg,0.145mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(54mg,0.085mmol,70.2％收率)。LC-MS m/z 636.3(M+H)+。
步骤5
3-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺,2盐酸盐。
将HCl(0.106mL,0.425mmol)、(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(54mg,0.085mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物在室温搅拌1h并浓缩，以提供标题化合物(37.7mg,0.062mmol,73％收率)。LC-MS m/z 536.4(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(3-(9-((3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
将3-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺,2盐酸盐(38mg,0.063mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(3-(9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(30.3mg,0.071mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物在室温搅拌20min。加入三乙酰氧基硼氢化钠(45.1mg,0.213mmol)并将混合物在室温搅拌5h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为固体的标题化合物(46.8mg,0.049mmol,77.7％收率)。LC-MS m/z 947.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.83-1.02(m,2H)1.07(br d,J＝6.3Hz,3H)1.14(br d,J＝6.3Hz,4H)1.19-1.25(m,1H)1.26-1.34(m,2H)1.40(br s,2H)1.46-1.57(m,2H)1.57-1.91(m,8H)2.15-2.24(m,2H)2.25-2.42(m,10H)2.43-2.53(m,3H)2.58(br dd,J＝6.3,2.8Hz,1H)2.65-2.76(m,5H)2.77-2.90(m,2H)2.91-3.11(m,3H)3.12-3.29(m,2H)3.36-3.48(m,1H)3.57-3.78(m,2H)4.09(br s,1H)4.52(br s,1H)5.19-5.42(m,1H)7.54(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.82(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.92(d,J＝8.5Hz,1H)8.08(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H)8.52(d,J＝2.0Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.62(s,1H)8.77(s,1H)。
实施例139
6-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)烟酰胺。
步骤1
(2-(2-(2-(6-溴烟酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向6-溴烟酸(2g,9.90mmol)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的搅拌悬浮液中加入DIPEA(5.19mL,29.7mmol)和HATU(5.65g,14.85mmol)。将溶液在室温搅拌10min，并加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.70g,10.89mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液。将混合物搅拌18h，加入二氯甲烷(DCM)(50mL)和冰冷的水(50mL)。将水相用二氯甲烷(DCM)(50mL)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将残余物通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱)纯化，用80至100％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，以提供浅棕色半固体。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱)进行第二次纯化，用60％乙酸乙酯在石油醚中的溶液洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(3.5g,7.86mmol,79.4％收率)。LC-MS m/z 432.1(M+H)+。
步骤2
(S)-4-(5-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯。
向(2-(2-(2-(6-溴烟酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.630g,1.457mmol)在1,4-二氧杂环己烷(10mL)和水(2mL)中的溶液中加入碳酸钠(0.463g,4.37mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(0.490g,1.749mmol)，并将混合物用氮气脱气10min，并加入四(三苯基膦)钯(0)(0.084g,0.073mmol)，并将混合物在微波反应器中加热至1200℃保持15min。将混合物与相同的反应混合物组合，加入二氯甲烷(DCM)(100mL)和冰冷的水(50mL)。将水相用二氯甲烷(DCM)(50mL)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(100g柱)纯化，用60至70％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为稠无色液体的标题化合物(1.3g1.851mmol,64％收率)。LC-MS m/z506.2(M+H)+。
步骤3
(1r,4r)-4-(5-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
在室温向4-(5-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(1.3g,2.57mmol)在乙醇(30mL)和四氢呋喃(THF)(10mL)中的搅拌溶液中加入Pd-C(0.430g,0.404mmol)。将混合物在氢气气球气氛下搅拌16h并穿过过滤。将催化剂用甲醇在二氯甲烷中的溶液(10％)洗涤，并将合并的滤液在减压下浓缩。通过SFC(OX-H 250mm x3mm 5μm柱,100mL/min)纯化，用60％二氧化碳在甲醇中的溶液洗脱，提供作为无色油的标题化合物(730mg,1.237mmol,48.1％收率)。LC-MS m/z 508.8(M+H)+。
步骤4
(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯,2盐酸盐。
将HCl(0.144mL,4.73mmol)加入到(1r,4r)-4-(5-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯(200mg,0.394mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的溶液中。将混合物搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物与甲基叔丁基醚(2x5mL)一起研磨以提供作为灰白色固体的标题化合物(180mg,0.377mmol,96％收率)。LC-MS m/z 408.3(M+H)+。
步骤5
(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(85mg,0.386mmol)在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的搅拌悬浮液中加入三乙胺(0.215mL,1.544mmol)、EDC(111mg,0.579mmol)和HOBt(89mg,0.579mmol)，并将混合物在室温搅拌10min，逐滴加入(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯,2盐酸盐(171mg,0.358mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液。将该混合物在室温搅拌16h并加入二氯甲烷(DCM)(50mL)和冰水(15mL)。
将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相用盐水(15mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过IsoleraTM色谱法(10g柱)纯化，用0至8％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为稠的白色树胶状液体的标题化合物(100mg,0.159mmol,44.4％收率)。LC-MS m/z 610.40(M+H)+。
步骤6
(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸。
向(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯(100mg,0.164mmol)在四氢呋喃(THF)(5mL)、甲醇(2mL)和水(3mL)中的搅拌溶液中，加入氢氧化锂水合物(20.65mg,0.492mmol)。将混合物在室温搅拌24h并在冷藏室中储存度过周末。在0℃使用1.5M HCl将pH调至7，并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm 19mmx 150mm柱,5mL/min)纯化，用0至40％乙腈在含有乙酸铵(10mM)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色稠的树胶状固体的标题化合物(57mg,0.096mmol,58.4％收率)。LC-MS m/z 582.2(M+H)+。
步骤7
6-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-N-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)烟酰胺。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(43.9mg,0.078mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)和三乙胺(0.05mL,0.359mmol)中，并加入(1r,4r)-4-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)环己烷-1-甲酸(49mg,0.084mmol)和HATU(44.3mg,0.117mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH C18 5μm柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为灰白色固体的标题化合物(33.9mg,0.033mmol,42.0％收率)。LC-MS m/z 1028.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.04(br d,J＝6.0Hz,3H)1.17(br d,J＝6.3Hz,3H)1.61-1.83(m,7H)1.92-2.02(m,2H)2.08-2.16(m,2H)2.20-2.41(m,6H)2.56(dtd,J＝12.3,8.1,8.1,4.0Hz,1H)2.65(s,3H)2.66-2.89(m,4H)2.99-3.13(m,1H)3.37(s,4H)3.44-3.53(m,3H)3.53-3.60(m,5H)3.61-3.72(m,5H)4.05(dt,J＝12.5,3.6Hz,1H)4.69(br d,J＝3.0Hz,1H)4.81(d,J＝6.5Hz,1H)5.30(t,J＝8.0Hz,1H)7.39(d,J＝8.3Hz,1H)7.47-7.53(m,1H)7.78(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.14(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H)8.51(d,J＝2.3Hz,1H)8.55(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.60(s,1H)8.84(s,1H)8.88(dd,J＝2.3,0.8Hz,1H)。
用与在实施例139中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例143
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,16-三氧代-3,9,12-三氧杂-6,15-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(300mg,1.362mmol)在二氯甲烷(DCM)(6mL)中的溶液中加入HATU(622mg,1.635mmol)、DIPEA(0.714mL,4.09mmol)和3-氨基丙酸叔丁酯(250mg,1.635mmol)。将混合物搅拌4h并用饱和NaHCO3洗涤。将水相用二氯甲烷(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至5％(5min)、5％(10min)、5至7％(20min)、7％(10min)和10％(35min)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供标题化合物(424mg,1.013mmol,74.4％收率)。LC-MS m/z 348.2(M+H)+。
步骤2
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(6.08mL,24.31mmol)加入到3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯(424mg,1.013mmol)在1,4-二氧杂环己烷(3mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，提供作为白色树胶的标题化合物(662mg,0.909mmol,90％收率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 2.49-2.58(m,1H)2.69-2.78(m,4H)2.85-2.93(m,1H)3.07(s,1H)3.35-3.53(m,1H)3.69-3.79(m,2H)5.08(d,J＝6.4Hz,1H)8.21(dd,J＝7.8,5.9Hz,1H)8.66(dt,J＝8.1,1.8Hz,1H)8.91-8.95(m,2H)。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯。
向3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸(326mg,0.448mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入HOBt(82mg,0.537mmol)和EDC(120mg,0.627mmol)，并将混合物搅拌30min。加入2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(115mg,0.448mmol)和DIPEA(0.156mL,0.895mmol)。将混合物搅拌过夜，用饱和NaHCO3洗涤，并用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至20％(5min)、20％(5min)、20至35％(15min)、35％(5min)和50％(30min)二氯甲烷(DCM)/甲醇(4:1)在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为澄清黄褐色油的标题化合物(180mg,0.296mmol,66.1％收率)。LC-MS m/z 493.3(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四烷-14-酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.776mL,7.10mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四烷-14-酸叔丁酯(180mg,0.296mmol)在1,4-二氧杂环己烷(2mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(231mg,0.259mmol,87％收率)。LC-MS m/z 437.2(M+H)+。
步骤5
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,14-三氧代-9,12,18-三氧杂-2,6,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5-二氧代-9,12-二氧杂-2,6-二氮杂十四烷-14-酸，盐酸盐(225mg,0.252mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入HOBt(46.3mg,0.303mmol)和EDC(67.7mg,0.353mmol)，并将混合物搅拌30min。加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(63.9mg,0.303mmol)和DIPEA(0.088mL,0.504mmol)并将混合物搅拌过夜。加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(35mg,0.0.20mmol)、HOBt(25mg,0.16mmol)、DIPEA(0.06mL,0.343mmol)和EDC(37mg,0.193mmol)并将混合物搅拌4h。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用饱和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在硅胶上浓缩。通过ISCO色谱法(12gRediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至5％(5min)、5％(10min)、5至10％(25min)和10％(10min)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为浅橙色蜡的标题化合物(123mg,0.186mmol,73.9％收率)。LC-MS m/z 594.0(M+H)+。
步骤6
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,14-三氧代-9,12,18-三氧杂-2,6,15-三氮杂二十烷-20-酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.082mL,4.33mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,14-三氧代-9,12,18-三氧杂-2,6,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯(119mg,0.180mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(235mg,0.164mmol,91％收率)。LC-MS m/z 538.0(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,16-三氧代-3,9,12-三氧杂-6,15-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,5,14-三氧代-9,12,18-三氧杂-2,6,15-三氮杂二十烷-20-酸，盐酸盐(236mg,0.164mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入HOBt(15.11mg,0.099mmol)和EDC(22.07mg,0.115mmol)，并将混合物搅拌30min。加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(52mg,0.082mmol)和DIPEA(0.029mL,0.164mmol)并将混合物搅拌过夜。将混合物用饱和的NaHCO3洗涤并将水相用二氯甲烷(DCM)(3x 20mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在硅胶上浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(54mg,0.054mmol,65.4％收率)。LC-MS m/z 984.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.00(br d,J＝6.4Hz,3H)1.15(br d,J＝6.8Hz,3H)1.60-1.84(m,3H)1.90-2.04(m,1H)2.05-2.15(m,1H)2.15-2.27(m,4H)2.28-2.45(m,3H)2.50-2.61(m,1H)2.66(s,3H)2.67-2.76(m,2H)2.78-2.89(m,1H)2.95-3.06(m,1H)3.34-3.38(m,2H)3.39-3.46(m,3H)3.47-3.57(m,4H)3.58-3.77(m,6H)3.99(s,2H)4.02-4.13(m,3H)4.69(brd,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.4Hz,1H)5.31(t,J＝8.6Hz,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,2.0Hz,1H)8.59(s,1H)8.79(s,1H)。
实施例144
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酰胺,3甲酸盐。
步骤1
(2S,3S)-N-(8-羟基辛基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(522mg,2.370mmol)、8-氨基辛烷-1-醇(516mg,3.56mmol)和HATU(1082mg,2.84mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入DIPEA(1.242mL,7.11mmol)。将混合物在室温搅拌度过周末并在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取并将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至20％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(720mg,2.072mmol,87％收率)。LC-MS m/z 348.2(M+H)+。
步骤2
甲磺酸8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛酯。
向(2S,3S)-N-(8-羟基辛基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(170mg,0.489mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.102mL,0.734mmol)和甲磺酰氯(0.045mL,0.587mmol)。将混合物在室温搅拌2h。加入甲磺酰氯和三乙胺的另一部分。将混合物在室温搅拌1h，加入饱和的NaHCO3，并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为淡黄色油的标题化合物(185mg,0.435mmol,89％收率)。LC-MS m/z 426.4(M+H)+。
步骤3
1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酸叔丁酯。
向哌啶-4-甲酸叔丁酯，盐酸盐(64.1mg,0.289mmol)和甲磺酸8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛酯(123mg,0.289mmol)在乙腈(0.200mL)中的混合物中加入碳酸钾(120mg,0.867mmol)。将混合物在室温搅拌20min，在80℃搅拌过夜，然后在室温搅拌度过周末。将混合物在二氯甲烷(DCM)和水之间分配并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供标题化合物(72mg,0.140mmol,48.4％收率)。LC-MS m/z 515.5(M+H)+。
步骤4
1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酸。
将HCl(0.217mL,0.867mmol)加入1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酸叔丁酯(72mg,0.140mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.2mL)中的溶液中，并将混合物在室温搅拌3h。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C185μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供标题化合物(85mg,0.185mmol,64.1％收率)。LC-MS m/z 459.3(M+H)+。
步骤5
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酰胺,3甲酸盐。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(35.4mg,0.066mmol)和1-(8-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛基)哌啶-4-甲酸,2盐酸盐(35mg,0.066mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.055mL,0.395mmol)和HATU(30.0mg,0.079mmol)。将混合物在室温搅拌1h，并加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.20mL)以实现溶解。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用5至85％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为固体的标题化合物(26.3mg,0.02mmol,37.9％收率)。LC-MS m/z 906.7(M+H)+。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.02-1.37(m,14H)1.51-3.06(m,29H)3.16(br d,J＝17.8Hz,3H)3.41-3.78(m,3H)3.95-4.17(m,1H)4.47-4.72(m,2H)5.12-5.36(m,1H)7.45-7.66(m,1H)7.75-8.20(m,3H)8.44-8.65(m,4H)8.72(s,1H)。
用与在实施例144中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例148
(2S,3S)-N-(6-((1-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶)-4-磺酰氨基)己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(100mg,0.454mmol)、(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(115mg,0.454mmol)和TSTU(164mg,0.545mmol)在乙腈(3493μL)中的溶液中加入三乙胺(253μL,1.816mmol)。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩。将残余物溶解在微量二氯甲烷(DCM)中。加入并将混合物在减压下浓缩。通过正相色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为橙色油的标题化合物(394.8mg,0.604mmol,133％收率)(在NMR中看到溶剂)。LC-MS m/z 419.3(M+H)+。
步骤2
4-(N-(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。
将TFA(3mL,39.2mmol)加入到(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(394.8mg,0.943mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌5min，在减压下浓缩，并与二氯甲烷(DCM)(3x)一起共沸以提供(2S,3S)-N-(6-氨基己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2三氟乙酸盐(394.8mg,0.722mmol)。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(7319μL)中并加入三乙胺(530μL,3.81mmol)。将混合物冷却至0℃并逐滴加入4-(氯磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(270mg,0.951mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌1.5h并在减压下浓缩。加入水并将混合物用乙酸乙酯(5x)萃取。将合并的有机萃取物浓缩。将残余物溶解在微量二氯甲烷(DCM)中。加入并将混合物在减压下浓缩。通过正相色谱法(12g硅胶柱,30mL/min)纯化，用0至100％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为黄色油的标题化合物(342.7mg,0.545mmol,57.3％收率)。LC-MS m/z 566.1(M+H)+。
步骤3
4-(4-(N-(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨磺酰基)哌啶-1-基)环己烷-1-甲酸。
将TFA(3mL,39.2mmol)加入到4-(N-(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨磺酰基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(398mg,0.703mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌10min，并与二氯甲烷(DCM)(3x)一起共沸以提供(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(6-(哌啶-4-磺酰氨基)己基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,三氟乙酸盐。将(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-N-(6-(哌啶-4-磺酰氨基)己基)-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,三氟乙酸盐(204mg,0.352mmol)和4-氧代环己烷-1-甲酸(100mg,0.703mmol)在二氯甲烷(DCM)(5411μL)和三乙胺(147μL,1.055mmol)中的溶液在室温搅拌5min，并加入三乙酰氧基硼氢化钠(447mg,2.110mmol)。将混合物加热至50℃保持2h。加入水并将混合物在减压下浓缩。通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供两种异构体。未为两种异构体指定环己烷环的立体化学。
异构体1(7.3mg,0.011mmol,1.578％收率)。LC-MS m/z 592.3(M+H)+；0.47min保留时间。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.23-1.57(m,12H)1.73-1.88(m,2H)1.89-2.14(m,7H)2.21-2.44(m,4H)2.67(s,3H)2.68-2.75(m,1H)2.77-2.90(m,1H)2.93-3.16(m,7H)3.19-3.31(m,1H)4.81(br s,1H)7.55(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.81(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)8.51(d,J＝1.8Hz,1H)8.59(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)。
异构体2(10.3mg,0.017mmol,2.474％收率)。LC-MS m/z 592.3(M+H)+；0.50min保留时间。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.18-1.61(m,12H)1.66-1.83(m,2H)1.88-2.11(m,4H)2.17-2.39(m,4H)2.46(br s,1H)2.67(s,3H)2.69-2.89(m,5H)2.97-3.29(m,6H)3.47-3.60(m,2H)7.55(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.81(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.59(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H)。
步骤4
(2S,3S)-N-(6-((1-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶)-4-磺酰氨基)己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.2mL,0.8mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(11.79mg,0.021mmol)在二氯甲烷(DCM)中的溶液中。将混合物在室温搅拌30分钟并在减压下浓缩。将混合物追加二氯甲烷(DCM)(1x)。将残余物溶解在含有三乙胺(102μL,0.731mmol)的二氯甲烷(470μL)中。将60％的混合物加入到4-(4-(N-(6-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)己基)氨磺酰基)哌啶-1-基)环己烷-1-甲酸(异构体2)(10.3mg,0.017mmol)和HATU(10mg,0.026mmol)中，并将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩。通过MDAP(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(8.5mg,8.10μmol,46.6％收率)。LC-MS m/z 1038.4(M+H)+。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.91-1.22(m,6H)1.23-1.85(m,20H)1.87-2.46(m,16H)2.51-3.30(m,14H)3.37(s,3H)4.64-4.70(m,1H)4.79-4.86(m,2H)5.27-5.40(m,1H)7.50-7.62(m,1H)7.77-7.85(m,1H)7.88-7.96(m,1H)8.02-8.16(m,1H)8.60(s,3H)8.73-8.82(m,1H)。
用与在实施例148中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例150
(1s,4S)-N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N4-(3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)环己烷-1,4-二甲酰胺。
步骤1
(1s,4s)-4-((苄氧基)羰基)环己烷-1-甲酸。
向在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(3.5ml)中的(1s,4s)-环己烷-1,4-二甲酸(888mg,5.16mmol)中加入碳酸钾(371mg,2.68mmol)，随后加入(溴甲基)苯(0.553ml,4.64mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在乙酸乙酯和水之间分配。将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCOEZPrep色谱法(C18Aq Gold柱,40mL/min)纯化，用乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(400mg,1.525mmol,29.6％收率)。LC-MS m/z 263.1(M+H)+。
步骤2
(1s,4s)-4-((3-(4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸苄酯。
向在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的(1s,4s)-4-((苄氧基)羰基)环己烷-1-甲酸(162mg,0.618mmol)中加入HATU(282mg,0.741mmol)，并将混合物在室温搅拌5min。加入3,3'-(哌嗪-1,4-二基)双(丙烷-1-胺)(192mg,0.958mmol)和三乙胺(258μL,1.853mmol)并将混合物在室温搅拌过夜。将混合物在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配，并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(110mg,0.247mmol,40.1％收率)。LC-MS m/z 445.3(M+H)+。
步骤3
(1s,4s)-4-((3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸苄酯。
向(1s,4s)-4-((3-(4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸苄酯(110mg,0.247mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(54.5mg,0.247mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.8mL)中的混合物中加入HATU(113mg,0.297mmol)和三乙胺(0.103mL,0.742mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(100mg,0.155mmol,62.5％收率)。LC-MS m/z 647.4(M+H)+。
步骤4
(1s,4s)-4-((3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸。
将(1s,4s)-4-((3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸苄酯(100mg,0.155mmol)和Pd-C(16.45mg,0.015mmol)在甲醇(2mL)中的混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌1h并穿过过滤。将滤液浓缩至干燥以提供作为白色固体的标题化合物(85mg,0.153mmol,99％收率)。LC-MS m/z 557.3(M+H)+。
步骤5
(1s,4S)-N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N4-(3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)环己烷-1,4-二甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮，二盐酸盐(33.8mg,0.063mmol)和(1s,4s)-4-((3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸(35mg,0.063mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.053mL,0.377mmol)，随后加入HATU(28.7mg,0.075mmol)。将混合物在室温搅拌3h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(44.2mg,0.044mmol,70.1％收率)。LC-MS m/z 1003.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.90-1.30(m,5H)1.46-2.07(m,16H)2.08-2.93(m,27H)2.93-3.08(m,1H)3.09-3.28(m,4H)3.40-3.78(m,4H)4.00-4.26(m,1H)4.50-4.73(m,1H)5.15-5.38(m,1H)7.46-7.65(m,1H)7.74-7.86(m,1H)7.87-7.97(m,1H)8.01-8.15(m,1H)8.59(s,3H)8.69-8.79(m,1H)。
实施例151
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,13-三氧代-3,9,16-三氧杂-6,12-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3,10-二氧代-1-苯基-2,7,14-三氧杂-4,11-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
向3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(实施例95，步骤1)(1.00g,3.09mmol)中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(10.0mL,40.0mmol)。将混合物搅拌2h，并浓缩至干燥。重复该程序(2x)。向在二氯甲烷(DCM)(15mL)中的残余物中加入DIPEA(2.70mL,15.46mmol)、HOBt(0.568g,3.71mmol)、EDC(0.889g,4.64mmol)，随后加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(0.542g,3.09mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(520mg,1.225mmol,39.6％收率)。LC-MS m/z 425.4(M+H)+。
步骤2
3,10,16-三氧代-1-苯基-2,7,14,20-四氧杂-4,11,17-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯。
向3,10-二氧代-1-苯基-2,7,14-三氧杂-4,11-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(250mg,0.589mmol)中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(5.0mL,20.00mmol)。将混合物搅拌过夜，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入DIPEA(0.514mL,2.94mmol)、HOBt(108mg,0.707mmol)、EDC(169mg,0.883mmol)，随后加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(124mg,0.707mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(48mg,0.081mmol,63.3％收率)。LC-MS m/z526.3(M+H)+。
步骤3
18-氨基-7,13-二氧代-3,9,16-三氧杂-6,12-二氮杂十八酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,10,16-三氧代-1-苯基-2,7,14,20-四氧杂-4,11,17-三氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯(180mg,0.342mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(3.64mg,0.034mmol)。将反应混合物抽真空并用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌4h。将混合物穿过过滤，并将滤液浓缩以提供作为蜡的标题化合物(50mg,0.128mmol,37.3％收率)。LC-MS m/z 392.3(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8,14-三氧代-5,12,18-三氧杂-2,9,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(33.8mg,0.153mmol)、HOBt(23.47mg,0.153mmol)、EDC(36.7mg,0.192mmol)和18-氨基-7,13-二氧代-3,9,16-三氧杂-6,12-二氮杂十八酸叔丁酯(50mg,0.128mmol)在二氯甲烷(DCM)(5.0mL)中的溶液中加入DIPEA(0.112mL,0.639mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(48mg,0.081mmol,63.3％收率)。LC-MS m/z 594.3(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,13-三氧代-3,9,16-三氧杂-6,12-二氮杂十八烷-18-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8,14-三氧代-5,12,18-三氧杂-2,9,15-三氮杂二十烷-20-酸叔丁酯(48mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)。将混合物搅拌1h，并浓缩至干燥。向残余物中加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.074mmol)、HOBt(13.68mg,0.089mmol)和DIPEA(0.065mL,0.372mmol)，随后加入EDC(21.40mg,0.112mmol)。将混合物在室温搅拌3h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(16.3mg,0.016mmol,21.14％收率)。LC-MS m/z 984.3(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm0.81-1.10(m,6H)1.49-1.72(m,3H)2.11(s,7H)2.25-2.37(m,3H)2.38-2.48(m,1H)2.63-2.77(m,2H)2.87-3.00(m,1H)3.23(s,7H)3.39-3.45(m,2H)3.54(br d,J＝6.8Hz,5H)3.72-4.16(m,6H)4.65(d,J＝6.4Hz,2H)4.89-5.14(m,1H)7.34-7.54(m,1H)7.60-8.14(m,6H)8.43-8.72(m,4H)8.95(s,1H)9.16-9.33(m,1H)。
用与在实施例151中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例153
(2S,3S)-N-(7-((9-(2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)壬基)氧基)庚基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤17-((9-羟基壬基)氧基)庚烷腈。
在0℃向60％氢化钠/矿物油(1.052g,26.3mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.2ml)中的混合物中加入壬烷-1,9-二醇(3.37g,21.04mmol)。将混合物在0℃搅拌15min并加入在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.3ml)中的7-溴庚烷腈(2g,10.52mmol)。将混合物在0℃搅拌10min，然后在室温搅拌1h。在0℃加入饱和的NH4Cl并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。将水加入残余物中，将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取，并将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(80g Redisep Rf柱,60mL/min)纯化，用0至60％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(900mg,3.34mmol,31.7％收率)。LC-MS m/z 270.2(M+H)+。
步骤29-((7-氨基庚基)氧基)壬-1-醇。
在0℃向7-((9-羟基壬基)氧基)庚烷腈(507mg,1.882mmol)在四氢呋喃(THF)(5mL)中的混合物中加入硼烷四氢呋喃复合物(3.76mL,3.76mmol)。将混合物在0℃搅拌15min并在室温搅拌过夜，冷却至0℃，并加入甲醇直到泡沫产生已经停止。将混合物在室温搅拌10min并在减压下浓缩。将残余物在二氯甲烷(DCM)之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至25％甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(400mg,1.463mmol,78％收率)。LC-MS m/z 274.3(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(7-((9-羟基壬基)氧基)庚基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向9-((7-氨基庚基)氧基)壬-1-醇(200mg,0.732mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(124mg,0.563mmol)和HATU(257mg,0.676mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入DIPEA(0.295mL,1.689mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取并将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至60％甲醇/乙酸乙酯(20/80)在二氯甲烷(DCM)中的溶液，随后用30％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液的阶式梯洗脱，提供作为无色油的标题化合物(265mg,0.557mmol,99％收率)。LC-MS m/z 476.3(M+H)+。
步骤4
2-((9-((7-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)庚基)氧基)壬基)氧基)乙酸，甲酸盐。
向(2S,3S)-N-(7-((9-羟基壬基)氧基)庚基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(130mg,0.273mmol)和2-溴乙酸(38.0mg,0.273mmol)在叔丁醇(1mL)中的混合物中加入叔丁醇钾(123mg,1.093mmol)。将混合物在50℃搅拌4h。加入叔丁醇钾(123mg,1.093mmol)和2-溴乙酸(38.0mg,0.273mmol)，并将混合物在50℃搅拌24h。加入水，将混合物用1N HCl中和，并将混合物用2-丙醇/二氯甲烷(DCM)的混合物萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供标题化合物(11mg,0.019mmol,6.94％收率)。LC-MS m/z 534.3(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(7-((9-(2-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)壬基)氧基)庚基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐(13.14mg,0.019mmol)中加入三乙胺(0.021mL,0.152mmol)。将混合物在室温搅拌30min并加入2-((9-((7-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)庚基)氧基)壬基)氧基)乙酸，甲酸盐(11mg,0.019mmol)和HATU(8.66mg,0.023mmol)。将混合物在室温搅拌4h并在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH PrepC18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为固体的标题化合物(6.5mg,6.63μmol,34.9％收率)。LC-MSm/z 980.6(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01-1.40(m,25H)1.40-1.62(m,8H)1.71-1.87(m,2H)2.02-2.63(m,8H)2.65-2.68(m,3H)2.68-2.74(m,1H)2.75-2.90(m,1H)2.92-3.08(m,1H)3.08-3.24(m,2H)3.37-3.45(m,4H)3.50(br s,3H)3.65(br t,J＝7.5Hz,2H)3.89-4.03(m,2H)4.06-4.18(m,1H)4.46-4.70(m,1H)4.99-5.33(m,1H)7.53(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.9,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.51(d,J＝1.5Hz,1H)8.58(s,2H)8.77(s,1H)。
实施例154
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(8-((2R,3R)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛酰基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
步骤1
(8-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯。
向4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(55mg,0.072mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。将得到的白色固体悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)中，加入DIPEA(0.044mL,0.254mmol)，随后加入8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸(22.55mg,0.087mmol)和HATU(41.3mg,0.109mmol)。将混合物在室温搅拌0.5h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(60.6mg,0.066mmol,91％收率)。LC-MS m/z 900.8(M+H)+。
步骤2
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(8-((2R,3R)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)辛酰基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
向(8-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(60mg,0.067mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)。将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)中，加入三乙胺(0.05mL,0.359mmol)，随后加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(20mg,0.091mmol)和HATU(44mg,0.116mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(60mg,0.059mmol,89％收率)。LC-MS m/z1002.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01(d,J＝6.3Hz,3H)1.12-1.23(m,3H)1.23-1.49(m,10H)1.53-1.78(m,7H)1.84-2.05(m,5H)2.05-2.32(m,9H)2.33-2.41(m,2H)2.51-2.74(m,8H)2.76-2.87(m,1H)2.98-3.24(m,6H)3.37-3.56(m,2H)3.59-3.68(m,1H)3.97-4.07(m,2H)4.52-4.61(m,1H)4.65(br d,J＝3.0Hz,1H)4.79-4.83(m,1H)5.28(t,J＝8.3Hz,1H)7.51-7.55(m,1H)7.79(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝1.8Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.59(s,1H)8.77(s,1H)。
用与在实施例154中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例158
(2S,3S)-N-(6-((4'-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-2',3',4',5'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(6-(4-溴苯氧基)己基)氨基甲酸叔丁酯。
向4-溴苯酚(0.648g,3.75mmol)和(6-溴己基)氨基甲酸叔丁酯(1.05g,3.75mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4mL)中的混合物中加入碳酸钾(1.036g,7.49mmol)。将混合物在室温搅拌度过周末并在60℃搅拌5h。将混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至60％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(1.27g,3.41mmol,91％收率)。LC-MS m/z274.1(M+H)+。
步骤2
4'-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氧基)-2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4-甲酸甲酯。
向(6-(4-溴苯氧基)己基)氨基甲酸叔丁酯(519mg,1.394mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸甲酯(287mg,1.078mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(3mL)中的混合物中加入(6-(4-溴苯氧基)己基)氨基甲酸叔丁酯(519mg,1.394mmol)和磷酸钾(687mg,3.24mmol)。将混合物用氮气净化10min并加入PdCl2(dppf)(39.5mg,0.054mmol)。将混合物在室温搅拌度过周末并穿过过滤。将催化剂用乙酸乙酯洗涤，并将合并的滤液浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法(24g Gold柱)纯化，用0至30％乙酸乙酯/乙醇(3:1)在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(54mg,0.125mmol,11.60％收率)。LC-MS m/z 331.9(M+H)+。
步骤3
4'-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氧基)-2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4-甲酸。
向4'-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氧基)-2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4-甲酸甲酯(58mg,0.134mmol)在甲醇(1mL)中的浆中加入氢氧化钠(0.806mL,0.806mmol)。将混合物在室温搅拌2h，加入另外的四氢呋喃(THF)(0.5mL)，将混合物在室温搅拌过夜，并浓缩。加入水，将混合物用1N HCl(1.5mL)酸化并用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供标题化合物(55mg,0.132mmol,98％收率)。LC-MSm/z 318.1(M+H)+。
步骤4
(6-((4'-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-2',3',4',5'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)己基)氨基甲酸叔丁酯。
向在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(48.3mg,0.090mmol)中加入三乙胺(0.075mL,0.539mmol)、4'-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氧基)-2,3,4,5-四氢-[1,1'-联苯]-4-甲酸(37.5mg,0.090mmol)和HATU(41.0mg,0.108mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(30mg,0.035mmol,38.7％收率)。LC-MS m/z 864.5(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(6-((4'-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-2',3',4',5'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)己基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.061mL,0.243mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(0.05mL)中的(6-((4'-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-2',3',4',5'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)己基)氨基甲酸叔丁酯(30mg,0.035mmol)中。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的残余物中加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(7.65mg,0.035mmol)、三乙胺(0.029mL,0.208mmol)和HATU(15.84mg,0.042mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH PrepC18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(19.4mg,0.020mmol,57.8％收率)。LC-MS m/z 966.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.98-1.11(m,3H)1.17(br t,J＝5.1Hz,3H)1.27-1.39(m,2H)1.48(sxt,J＝7.3Hz,4H)1.65-1.82(m,5H)1.82-2.02(m,2H)2.05-2.39(m,8H)2.40-2.58(m,6H)2.64-2.84(m,6H)2.97-3.03(m,1H)3.09-3.17(m,1H)3.41-3.69(m,4H)3.95(td,J＝6.4,2.0Hz,2H)4.06(br d,J＝11.8Hz,1H)4.55(s,1H)4.64-4.78(m,1H)4.78-4.82(m,2H)5.26(br s,1H)6.00(br s,1H)6.79-6.83(m,2H)7.25(d,J＝8.5Hz,2H)7.49-7.53(m,1H)7.78(dt,J＝7.9,1.8Hz,1H)7.90(dd,J＝8.8,5.8Hz,1H)8.04(ddd,J＝8.8,4.0,2.0Hz,1H)8.49(d,J＝2.3Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.58-8.60(m,1H)8.79(s,1H)。
实施例159
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N10-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)癸烷二酰胺
步骤1
(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(189mg,0.858mmol)和(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(213mg,0.858mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入HATU(391mg,1.029mmol)和DIPEA(0.375mL,2.144mmol)。将混合物在室温搅拌4h。将混合物在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配，将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40gRedisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至60％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅棕色油的标题化合物(178mg,0.395mmol,46.1％收率)。LC-MS m/z 451.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2三氟乙酸盐。
将TFA(0.48mL,6.23mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(0.2mL)中的(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(165mg,0.366mmol)中。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。将残余物在高真空下干燥过夜以提供作为淡黄色油的标题化合物(225mg,0.389mmol,106％收率)。LC-MS m/z351.1(M+H)+。
步骤3
氧杂环十一烷-2,11-二酮。
将癸二酸(100mg,0.494mmol)和乙酸酐(0.233mL,2.469mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(24.72mL)中。将反应物分成两份并在微波反应器中在130℃加热100min。将混合物在室温放置度过周末，合并，并在减压下浓缩。将残余物与庚烷(5x)一起共沸，并将剩余的乙酸酐使用Dean-Stark设备和二氯甲烷(DCM)作为溶剂通过蒸馏除去。将残余物在减压下浓缩，以提供标题化合物(134.7mg,0.344mmol,69.5％收率)。LC-MS m/z 256.1(M+H)+。(使用吡咯烷确定母体质量)。
步骤4
10-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-10-氧代癸酸。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(39mg,0.084mmol)在二氯甲烷(DCM)(840μL)中的溶液中加入三乙胺(58.5μL,0.420mmol)。加入氧杂环十一烷-2,11-二酮(18.56mg,0.101mmol)并将混合物通过减压浓缩。通过正相色谱法(4g硅胶柱,18mL/min)纯化，用10％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为粉红色油的标题化合物(22.8mg,0.033mmol,39.3％收率)。LC-MS m/z 649.2(M+H)+。
步骤5
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N10-(2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)癸烷二酰胺
向10-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-10-氧代癸酸(22mg,0.034mmol)和(2S,3S)-N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2三氟乙酸盐(19.2mg,0.032mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.3mL)中的混合物中加入DIPEA(0.029mL,0.166mmol)和HATU(15.15mg,0.040mmol)。将混合物在室温搅拌20min。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(11.3mg,0.012mmol,34.0％收率)。LC-MS m/z 981.6(M+H)+。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.99-1.10(m,3H)1.10-1.19(m,4H)1.19-1.35(m,8H)1.47-1.60(m,2H)1.60-1.79(m,5H)1.92-2.02(m,1H)2.06-2.35(m,11H)2.50-2.59(m,1H)2.65-2.76(m,5H)2.81-2.88(m,1H)3.06(ddd,J＝9.4,8.1,6.6Hz,1H)3.39-3.68(m,13H)4.05(dt,J＝12.2,3.8Hz,1H)4.66(br d,J＝3.3Hz,1H)4.82-4.89(m,1H)5.26(t,J＝7.9Hz,1H)7.52-7.56(m,1H)7.81(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H)7.92(d,J＝8.9Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H)8.53(d,J＝2.3Hz,1H)8.58(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H)8.60(s,1H)8.83-8.85(m,1H)。
实施例160
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酰胺,3甲酸盐。
步骤1
(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇(2.35g,12.16mmol)在1,4-二氧杂环己烷(15mL)和2M Na2CO3(15mL)中的搅拌混合物中加入二碳酸二叔丁酯(3.25mL,13.98mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入盐水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x 60mL)萃取。将合并的有机萃取物用0.5N HCl(50mL)、用饱和的NaHCO3洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩，以提供作为无色液体的标题化合物(3.638g,11.16mmol,92％收率)。LC-MS m/z 194.1(M+H)+。
步骤2
(3,6,9,12-四氧杂十五碳-14-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.63g,5.56mmol)在四氢呋喃(THF)(20mL)中的搅拌混合物中缓慢地加入叔丁醇钠(0.587g,6.11mmol)。将混合物搅拌30min。加入80％3-溴丙-1-炔在甲苯中的溶液(0.599mL,5.56mmol)并将混合物在室温搅拌过夜，加入盐水并将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用50至100％(10柱体积)和100％(5柱体积)乙酸乙酯在己烷类中的阶式梯度洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(1.16g,3.33mmol,59.8％收率)。LC-MS m/z 232.2(M+H)+。
步骤3
2-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十碳-19-炔-20-基)异烟酸甲酯。
向2-溴异烟酸甲酯(0.477g,2.209mmol)和(3,6,9,12-四氧杂十五碳-14-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(0.61g,1.841mmol)在四氢呋喃(THF)(0.5mL)中的混合物中加入碘化亚铜(I)(0.035g,0.184mmol)和三乙胺(1.5mL,10.76mmol)。将混合物通过抽真空和用氮气回填几次进行脱气。加入双(三苯基膦)二氯化钯(II)(0.129g,0.184mmol)。将混合物在75至77℃加热2h并冷却。通过ISCO色谱法(24gRediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用25至100％(15柱体积)和100％(5柱体积)乙酸乙酯在己烷类中的阶式梯度洗脱，提供作为黄色粘稠液体的标题化合物(0.5987g,1.258mmol,68.3％收率)。LC-MSm/z 573.1(M+H)+。
步骤4
2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酸甲酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(3mL,12.00mmol)加入2-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十碳-19-炔-20-基)异烟酸甲酯(590mg,1.265mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h，浓缩至干燥。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(3mL)中。加入三乙胺(0.881mL,6.32mmol)，随后加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(306mg,1.391mmol)和HATU(601mg,1.581mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。将残余物通过ISCO色谱法(24g RediSepRf柱,35mL/min)纯化，用0至10％(15柱体积)和10％(10柱体积)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，以提供含有2-((Z)-16-氯-1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七-16-烯-17-基)异烟酸甲酯(77％)[LC-MS m/z 605.1(M+H)+]和2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七-16-炔-17-基)异烟酸甲酯(15％)[LC-MS m/z 569.1(M+H)+]的黄色液体。将10％ Pd/C(75mg,0.070mmol)加入液体在甲醇中的溶液(10mL)中。将混合物抽真空并用氢气回填，并在氢气气球气氛下在室温搅拌2h。将混合物过滤并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至10％(15柱体积)和10％(10柱体积)甲醇在二氯甲烷(DCM)中的阶式梯度洗脱，提供作为淡黄色粘稠液体的标题化合物(0.6338g,1.018mmol,81％收率)。LC-MSm/z 573.1(M+H)+。
步骤5
2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酸。
向2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酸甲酯(0.63g,1.100mmol)在四氢呋喃(THF)(1.500mL)和乙醇(1.5mL)中的溶液中加入2N氢氧化钠(1.5mL,3.00mmol)。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩以除去有机溶剂。将残余物冷却并用2N HCl将pH调至4至5。将混合物在减压下浓缩。将残余物悬浮于甲醇/二氯甲烷(DCM)(2％)(30mL)中，搅拌并声处理，并过滤。将滤液在减压下浓缩，以提供作为浅黄色泡沫的标题化合物(0.536g,0.812mmol,74％收率)。LC-MS m/z 559.1(M+H)+。
步骤6
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酰胺,3甲酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)加入((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(80mg,0.142mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)中，加入三乙胺(0.069mL,0.496mmol)、2-(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)异烟酸(130mg,0.197mmol)和HATU(81mg,0.213mmol)。将混合物在室温搅拌并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH PrepC18150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用0至25％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为白色无定形固体的标题化合物(105.7mg,0.104mmol,73.5％收率)。LC-MS m/z 1005.2(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.44(br t,J＝6.5Hz,6H)1.59-1.72(m,2H)2.01-2.25(m,3H)2.25-2.52(m,4H)2.52-2.64(m,3H)2.65-2.68(m,3H)2.68-2.76(m,1H)2.79-2.93(m,4H)2.97-3.23(m,1H)3.23-3.44(m,5H)3.46-3.51(m,4H)3.52-3.64(m,10H)3.72(br s,1H)3.80-3.92(m,1H)3.92-4.04(m,1H)4.12(br s,1H)4.37(br d,J＝11.9Hz,1H)4.58(br s,1H)4.73-4.89(m,2H)7.36(s,1H)7.42(dd,J＝5.2,1.1Hz,1H)7.53(dd,J＝7.9,4.8Hz,1H)7.77-7.84(m,2H)8.02-8.13(m,1H)8.15(s,1H)8.26(br d,J＝4.6Hz,3H)8.53(s,1H)8.58(br d,J＝4.1Hz,1H)8.69(s,1H)。
实施例161
(2S,3S)-N-(4-((8-((5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)辛基)氧基)丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
步骤1
1,8-双(4-氯丁氧基)辛烷。
在0℃在氮气气氛下将氢化钠(8.20g,205.14mmol)加入辛烷-1,8-二醇(10.0g,68.38mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物中，并将混合物搅拌30min。历时10min逐滴加入1-溴-4-氯丁烷(29.31g,10.96mmol)，并将混合物在室温搅拌16h。加入冰(200g)并将混合物用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。将合并的有机萃取物用冰冷的水(2x300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至20％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物(3.8g,11.6mmol,17％收率)。LC-MS m/z 328(M+H)+。观察到1-(4-溴丁氧基)-8-(4-氯丁氧基)辛烷(7.9％)。
步骤2
5-((8-(4-氯丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈。
将氰化钠(0.56g,11.60mmol)加入1,8-双(4-氯丁氧基)辛烷(3.8g,11.60mmol)的混合物中，并将混合物在室温搅拌16h。加入冰冷的水(100mL)并将混合物用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至15％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(1.3g,4.08mmol,35％收率)。LC-MS m/z 318(M+H)+。
步骤3
5-((8-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈。
向5-((8-(4-氯丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈(1.3g,4.08mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(13mL)中的混合物中加入邻苯二甲酰亚胺钾盐(1.13g,6.13mmol)，并将混合物在80℃搅拌16h。加入乙酸乙酯(100mL)，并将混合物用冰冷的水(2x 50mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至20％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物(1.7g,2.83mmol,3.97mmol,97％收率)。LC-MS m/z 429(M+H)+。
步骤4
5-((8-(4-氨基丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈。
将肼一水合物(297mg,5.95mmol)加入5-((8-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈(1.7g,3.96mmol)在乙醇(20mL)中的混合物中，并将混合物在90℃搅拌16h并在减压下浓缩。加入二氯甲烷(DCM)(100mL)，将混合物过滤，并将固体用二氯甲烷(DCM)(50mL)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩，以提供作为无色油的标题化合物(0.9g,3.02mmol,75.9％收率)。LC-MS m/z 299(M+H)+。
步骤5
(4-((8-(4-氰基丁氧基)辛基)氧基)丁基)氨基甲酸叔丁酯。
向5-((8-(4-氨基丁氧基)辛基)氧基)戊烷腈(0.9g,3.01mmol)在四氢呋喃(THF)(20mL)中的混合物中加入三乙胺(0.6g,6.02mmol)，随后加入二碳酸二叔丁酯(0.72g,3.31mmol)，并将混合物在室温搅拌4h。加入冰冷的水(20mL)并将混合物用乙酸乙酯(3x75mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至30％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色树胶的标题化合物(1.13g,2.83mmol,94％收率)。LC-MS m/z 399(M+H)+。
步骤6
2,2-二甲基-4-氧代-3,10,19-三氧杂-5-氮杂二十四烷-24-酸。
将氢氧化钾(0.635g,11.32mmol)加入(4-((8-(4-氰基丁氧基)辛基)氧基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(1.13g,2.83mmol)在乙醇(10mL)和水(10mL)中的混合物中。将混合物在100℃搅拌16h并在减压下浓缩。将残余物冷却至10℃并用1.5N HCl将pH调至4。将沉淀物通过过滤进行收集以提供作为白色固体的标题化合物(1.1g,2.63mmol,94.9％收率)。LC-MSm/z 508(M+H)+。
步骤7
2,2-二甲基-4-氧代-3,10,19-三氧杂-5-氮杂二十四烷-24-酸苄酯。
向2,2-二甲基-4-氧代-3,10,19-三氧杂-5-氮杂二十四烷-24-酸(1.1g,2.63mmol)在二氯甲烷(DCM)(20mL)中的混合物中加入苯基甲醇(569mg,5.26mmol)、EDC.HCl(1.0g,5.26mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和三乙胺(531mg,5.26mmol)，并将混合物在室温搅拌18h。加入冰冷的水(50mL)并将混合物用二氯甲烷(DCM)(2x 70mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至10％乙酸乙酯在石油醚中的梯度洗脱，提供作为浅黄色油的标题化合物(1.3g,2.56mmol,97％收率)。LC-MS m/z 418(M+H)+。
步骤8
5-((8-(4-氨基丁氧基)辛基)氧基)戊酸苄酯，盐酸盐。
在0℃将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(15mL,60mmol)加入到2,2-二甲基-4-氧代-3,10,19-三氧杂-5-氮杂二十四烷-24-酸苄酯(1.3g,2.56mmol)在1,4-二氧杂环己烷(5mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌18h并在减压下浓缩，以提供作为浅黄色油的标题化合物(0.9g,2.03mmol,79％收率)。LC-MS m/z 408(M+H)+。
步骤9
5-((8-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁氧基)辛基)氧基)戊酸苄酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(350mg,1.58mmol)和HATU(1.20g,3.16mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(8mL)和DIPEA(611mg,4.74mmol)中的混合物中加入5-((8-(4-氨基丁氧基)辛基)氧基)戊酸苄酯，盐酸盐(701mg,1.58mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(2mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌16h。加入乙酸乙酯(100mL)并将混合物用冷水(2x 50mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物通过IsoleraTM柱色谱法纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱。通过制备型反相HPLC(SunfireTM C18 19mm x 150mm 5μm柱)进行第二次纯化，用乙腈在水中的溶液洗脱，提供作为棕色油的标题化合物(245mg,0.402mmol,25％收率)LC-MSm/z 610(M+H)+。
步骤10
5-((8-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁氧基)辛基)氧基)戊酸。
向5-((8-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁氧基)辛基)氧基)戊酸苄酯(245mg,0.402mmol)在甲醇(5mL)中的混合物中加入Pd-C(42.8mg,0.040mmol)。将混合物在室温在氢气气球气氛下搅拌40min。将混合物过滤，将催化剂用甲醇洗涤，并将合并的滤液浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(177mg,0.341mmol,85％收率)。LC-MS m/z 520.3(M+H)+。
步骤11
(2S,3S)-N-(4-((8-((5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊基)氧基)辛基)氧基)丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(35mg，0.065mmol)和5-((8-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁氧基)辛基)氧基)戊酸(33.8mg,0.065mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.054mL,0.391mmol)，随后加入HATU(29.7mg,0.078mmol)。将混合物在室温搅拌1.5h。通过ISCO色谱法(40g RediSep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(51.1mg,0.053mmol,81％收率)。LC-MS m/z 967.7(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.04(br d,J＝5.8Hz,3H)1.15(br d,J＝6.0Hz,3H)1.24-1.38(m,9H)1.46-1.62(m,10H)1.67-1.82(m,5H)1.94-2.05(m,1H)2.11-2.36(m,8H)2.51-2.60(m,1H)2.66(s,3H)2.69-2.77(m,2H)2.79-2.88(m,1H)2.97-3.06(m,1H)3.14-3.26(m,2H)3.35-3.48(m,8H)3.54-3.69(m,2H)4.05(dt,J＝12.2,3.5Hz,1H)4.65(br s,1H)4.82(d,J＝6.5Hz,1H)5.28(br t,J＝7.8Hz,1H)7.51-7.56(m,1H)7.80(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.91(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.9,1.6Hz,1H)8.51(d,J＝1.8Hz,1H)8.56-8.61(m,2H)8.82(s,1H)。
实施例162
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酰胺。
步骤1
(2-(2-(2-((5-氯吡嗪-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(5.5g,22.11mmol)在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(5.5mL)中的搅拌溶液中加入2,5-二氯吡嗪(3.6g,24.36mmol)和DIPEA(4.3g,33.2mmol)，并将混合物在120℃搅拌过夜。加入乙酸乙酯(250mL)并将有机相用水(2x 50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过正相色谱法纯化，用40％乙酸乙酯在己烷类中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(3.2g,8.88mmol,40％收率)。LC-MSm/z 361(M+H)+。
步骤2
(叔丁氧基羰基)(5-(5-氯吡嗪-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2-(2-(2-((5-氯吡嗪-2-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1g,2.7716mmol)在四氢呋喃(THF)(50mL)中的搅拌溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(67.6mg,0.5543mmol)和二碳酸二叔丁酯(1.8g,8.3148mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入乙酸乙酯(100mL)。将有机相用水(20mL)洗涤并经Na2SO4干燥。通过正相色谱法纯化，用12％和25％乙酸乙酯在石油醚中的阶式梯度洗脱，提供作为棕色液体的标题化合物(370mg,0.659mmol,23/8％收率)。LC-MS m/z 561(M+H)+。
步骤3
1-(5-((叔丁氧基羰基)(5-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯。
将哌啶-4-甲酸甲酯(573mg,4.0mmol)加入到(叔丁氧基羰基)(5-(5-氯吡嗪-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(750mg,1.336mmol)在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(1.5mL)中的搅拌溶液中，并将混合物在100℃搅拌1.5天。加入乙酸乙酯(75mL)并将有机相用水(25mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过正相色谱法纯化，用35％乙酸乙酯在石油醚中的溶液洗脱，提供标题化合物(440mg,0.659mmol,49.3％收率)。LC-MS m/z 668(M+H)+。
步骤4
1-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16mmol)加入到1-(5-((叔丁氧基羰基)(5-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯)(430mg,0.6439mmol)在1,4-二氧杂环己烷(4mL)中的搅拌溶液中。将混合物在室温搅拌15h并在减压下浓缩，以提供作为黄色固体的标题化合物(336mg,0.832mmol,129％收率)。LC-MS m/z 368(M+H)+。
步骤5
1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯。
向1-(5-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯(140mg,0.6356mmol)在二氯甲烷(DCM)(7mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(192mg,1.902mmol)、EDC.HCL(183mg,0.9535mmol)和HOBt(129mg,0.9535mmol)，并将混合物在室温搅拌15min。加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(233mg,0.6356mmol)并将混合物在室温搅拌16h。加入二氯甲烷(DCM)(20mL)并将有机相用水(4mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。通过正相色谱法纯化，用50％乙酸乙酯在石油醚中的溶液洗脱，提供作为棕色树胶状固体的标题化合物(150mg,0.263mmol,41.4％收率)。LC-MSm/z 570(M+H)+。
步骤6
1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸。
向1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸甲酯(146mg,0.256mmol)在四氢呋喃(THF)(0.5mL)和甲醇(0.500mL)中的混合物中加入氢氧化钠(1.281mL,1.281mmol)。将混合物在室温搅拌1h。通过ISCOEZ Prep色谱法(C18Aq Gold柱,40mL/min)纯化，用0至25％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(75mg,0.135mmol,52.7％收率)。LC-MS m/z 556.4(M+H)+。
步骤7
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(38.7mg,0.072mmol)和1-(5-((2-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)吡嗪-2-基)哌啶-4-甲酸(40mg,0.072mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.060mL,0.432mmol)，并将混合物在室温搅拌5min。加入HATU(32.8mg,0.086mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g RedisepRf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为淡黄色固体的标题化合物(40mg,0.040mmol,55.4％收率)。LC-MSm/z 1002.7(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.02(br d,J＝6.0Hz,3H)1.16(br d,J＝6.3Hz,3H)1.65-1.86(m,5H)1.91-2.02(m,3H)2.11-2.29(m,5H)2.30-2.39(m,2H)2.51-2.61(m,1H)2.64(s,3H)2.68-2.87(m,5H)3.02(ddd,J＝9.3,8.3,6.5Hz,1H)3.38-3.46(m,4H)3.47-3.54(m,3H)3.55-3.69(m,8H)3.95-4.08(m,3H)4.67(br d,J＝2.0Hz,1H)4.81(d,J＝6.5Hz,1H)5.29(t,J＝8.3Hz,1H)7.48-7.53(m,1H)7.61-7.65(m,2H)7.77(dt,J＝7.9,1.9Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.05(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.51(d,J＝2.3Hz,1H)8.55(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.60(s,1H)8.78(s,1H)。
实施例163
(2S,3S)-N-(19-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-6,12,19-三氧代-3,10,16-三氧杂-7,13-二氮杂十九烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2.3mL,9.28mmol)加入到2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸叔丁酯(502mg,1.623mmol)在乙腈(2.5mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩以产生标题化合物，将其不经纯化用于下一步。LC-MSm/z 254.1(M+H)+。
步骤2
3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
在室温在RB烧瓶中将3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(500mg,1.546mmol)和PD-C(181mg,1.701mmol)的混合物悬浮于乙酸乙酯(2577μl)中。将烧瓶在真空下抽真空并通过气球加载氢气。将反应物在室温搅拌2小时。将混合物穿过硅藻土塞过滤并将滤液在真空下浓缩。然后将它溶解在乙腈(2.5mL)中。加入来自步骤1的2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸，随后加入DIPEA(1.6mL,9.28mmol)和HATU(617mg,1.623mmol)。将混合物在室温搅拌20h。加入二氯甲烷(DCM)并将有机相用饱和NH4Cl洗涤，用饱和的NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将粗制物质通过Rf色谱法(24g硅胶柱,35mL/min)纯化，用0至5％含有三乙胺(0.1％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为澄清无色油的标题化合物(320.8mg,0.756mmol,48.9％收率)。LC-MS m/z 425.5(M+H)+。
步骤3
3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.12mL,4.48mmol)加入到3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(254mg,0.784mmol)在乙腈(0.58mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩以产生标题化合物。将它不经纯化用于下一步。LC-MS m/z 268.2(M+H)+。
步骤4
3,10,16-三氧代-1-苯基-2,7,14,20-四氧杂-4,11,17-三氮杂二十三烷-23-酸叔丁酯。
在室温向3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(254mg,0.784mmol)在乙腈(582μl)中的溶液中加入4M的盐酸在二氧杂环己烷中的溶液(1120μl,4.48mmol)。将它在室温搅拌30分钟。将混合物在真空下浓缩至干燥，并将残余物用于下一步。
在室温在RB烧瓶中将3,9-二氧代-1-苯基-2,7,13-三氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(317mg,0.747mmol)和PD-C(79mg,0.747mmol)的混合物悬浮于乙酸乙酯(5816μl)中。将烧瓶在真空下抽真空并通过气球加载氢气。将反应混合物在室温搅拌72小时。将混合物穿过硅藻土塞过滤并将滤液在真空下浓缩至干燥。
向3-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸和3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯悬浮于二氯甲烷(DCM)(582μl)中的溶液中，加入DIEA(783μl,4.48mmol)和HATU(298mg,0.784mmol)。将反应混合物在室温搅拌20小时。将混合物用DCM稀释，并用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并将滤液在真空下浓缩。将残余物直接加载到硅胶塞上，并用在Isco Combi Flash-RF上的快速色谱法纯化，与0％(5cv)-0-5％(30CV)5％(4CV)MeOH/DCM(w/0.1％ TEA)的梯度一起使用24g硅胶柱，流速为35mL/min。将所有含有期望产物的级分合并，并浓缩以产生作为澄清油的标题化合物(144.7mg,0.241mmol,32.3％收率)。LC-MS m/z 540.5(M+H)+。
步骤5
1-氨基-6,12-二氧代-3,10,16-三氧杂-7,13-二氮杂十九烷-19-酸叔丁酯。
在室温将3,10,16-三氧代-1-苯基-2,7,14,20-四氧杂-4,11,17-三氮杂二十三烷-23-酸叔丁酯(137mg,0.254mmol)和Pd-C(27.0mg,0.254mmol)的混合物悬浮于乙酸乙酯(1.5mL)中。将混合物在真空下抽真空并加载氢气。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌20h。将混合物穿过过滤并将滤液在减压下浓缩。LC-MS m/z 406.2(M+H)+。
步骤6
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8,14-三氧代-5,12,18-三氧杂-2,9,15-三氮杂二十一烷-21-酸叔丁酯。
将1-氨基-6,12-二氧代-3,10,16-三氧杂-7,13-二氮杂十九烷-19-酸叔丁酯(81.7mg,0.201mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(44.7mg,0.203mmol)的混合物悬浮于二氯甲烷(DCM)(0.15mL)中，加入DIPEA(133μL,0.762mmol)和HATU(97mg,0.254mmol)，并将混合物在室温搅拌1h。加入二氯甲烷(DCM)并将有机相用饱和的NH4Cl、用饱和的NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至5％含有三乙胺(0.1％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为灰白色粘性固体的标题化合物(93.7mg,0.139mmol,54.7％收率)。LC-MS m/z 608.5(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(19-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-6,12,19-三氧代-3,10,16-三氧杂-7,13-二氮杂十九烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(212μL,0.848mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8,14-三氧代-5,12,18-三氧杂-2,9,15-三氮杂二十一烷-21-酸叔丁酯(90mg,0.148mmol)在乙腈(0.24mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌4小时，并在减压下浓缩至干燥。将残余物和(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(76mg,0.141mmol)悬浮于二氯甲烷(DCM)中，加入DIPEA(148μL,0.848mmol)和HATU(56.5mg,0.148mmol)，并将混合物在室温搅拌20h。加入二氯甲烷(DCM)并将有机相用饱和NaHCO3洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为灰白色固体的标题化合物(51.7mg,0.049mmol,34.8％收率)。LC-MS m/z 998.0(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm d ppm 8.78(s,1H)8.53-8.59(m,2H)8.50(d,J＝1.96Hz,1H)8.04(dd,J＝8.80,1.96Hz,1H)7.89(d,J＝8.80Hz,1H)7.77(dt,J＝8.01,1.86Hz,1H)7.51(dd,J＝7.83,4.89Hz,1H)5.27(br.s.,1H)4.80(d,J＝6.60Hz,1H)4.58(br.s.,1H)4.05(d,J＝10.27Hz,1H)3.92(s,2H)3.34-3.85(m,18H)2.98-3.07(m,1H)2.61-2.87(m,6H)1.60-2.58(m,17H)0.97-1.19(m,6H)。
实施例164
(2S,3S)-N-(14-((2-((4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(370mg,1.680mmol)、(29-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九烷基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g,1.796mmol)和DIPEA(0.587mL,3.36mmol)在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的混合物中加入HATU(767mg,2.016mmol)。将混合物在室温搅拌2h并用水(10mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以提供作为白色半固体的(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(750mg,1.392mmol,61.3％收率)。LC-MS m/z 539.1(M+H)+。将固体在4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液中搅拌1h并在减压下浓缩，以提供标题化合物(650mg,1.482mmol,65.3％收率)。LC-MS m/z 439.2(M+H)+。
步骤2
4-((2-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丁酸。
将3,4-二乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(80mg,0.470mmol)、(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(206mg,0.398mmol)和DIPEA(0.082mL,0.470mmol)在甲醇(2mL)中的混合物在室温搅拌1h。加入4-氨基丁酸(48.5mg,0.470mmol)，将混合物在60℃搅拌过夜，并浓缩。通过MDAP色谱法纯化，提供标题化合物(120mg,0.174mmol,43.7％)。LC-MS m/z 620.3(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(14-((2-((4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(37.5mg,0.069mmol)和4-((2-((1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丁酸(50mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入DIPEA(0.014mL,0.081mmol)，随后加入T3P(0.048mL,0.081mmol)。将混合物在室温搅拌2h并用水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(30mg,0.027mmol,39％收率)。LC-MS m/z 1066.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.97-1.14(m,6H)1.63-1.82(m,3H)1.87-2.23(m,6H)2.25(s,3H)2.28-2.45(m,3H)2.48-2.76(m,5H)2.76-2.88(m,1H)2.98-3.11(m,1H)3.27-3.34(m,3H)3.38-3.44(m,1H)3.45-3.69(m,21H)3.75(br s,1H)4.04(dt,J＝11.9,3.6Hz,1H)4.59(br d,J＝2.9Hz,1H)4.77-4.84(m,2H)5.27(t,J＝8.6Hz,1H)7.52(dd,J＝7.3,4.9Hz,1H)7.80(d,J＝7.6Hz,1H)7.90(d,J＝8.3Hz,1H)8.05(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51-8.64(m,3H)8.76(s,1H)。
实施例165
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N10-(10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)癸烷二酰胺。
步骤1
(10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)氨基甲酸叔丁酯
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(164mg,0.745mmol)和(10-氨基癸基)氨基甲酸叔丁酯(203mg,0.745mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中加入HATU(340mg,0.894mmol)和三乙胺(0.208mL,1.489mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至70％甲醇/二氯甲烷(DCM)(20/80)在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为棕色油的标题化合物(254mg,0.535mmol,71.9％收率)。LC-MS m/z475.3(M+H)+。
步骤2
10-((10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)氨基)-10-氧代癸酸
向(10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)氨基甲酸叔丁酯(76mg,0.160mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.300mL)中的混合物中加入TFA(0.247mL,3.20mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。向残余物中加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(0.3mL)和三乙胺(0.223mL,1.601mmol)。将混合物在室温搅拌5min并加入癸二酸(97mg,0.480mmol)和HATU(73.1mg,0.192mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为固体的标题化合物(26.3mg,0.02mmol,37.9％收率)。LC-MS m/z 559.3(M+H)+。
步骤3
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N10-(10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)癸烷二酰胺。
向在二氯甲烷(DCM)(0.3mL)中的(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐(21.07mg,0.030mmol)中加入三乙胺(0.040mL,0.287mmol)。将混合物在室温搅拌40min。加入在DCM(0.5mL)中的10-((10-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)癸基)氨基)-10-氧代癸酸(17mg,0.030mmol)和HATU(13.88mg,0.037mmol)，并将混合物在室温搅拌2h。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为固体的标题化合物(16.1mg,0.015mmol,50.5％收率)。LC-MS m/z 1005.4(M+H)+。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.92(br d,J＝7.4Hz,2H)1.08-1.36(m,28H)1.35-1.35(m,1H)1.39-1.61(m,8H)1.90(brs,1H)2.00(br s,1H)2.05-2.24(m,8H)2.30(s,1H)2.49(br s,1H)2.56(br d,J＝6.8Hz,1H)2.62(br s,1H)2.65-2.86(m,6H)2.99-3.24(m,6H)3.28(br s,1H)3.56-3.81(m,3H)4.15(br s,1H)4.82(d,J＝6.6Hz,1H)7.54(dd,J＝7.9,4.8Hz,1H)7.81(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H)7.93(d,J＝8.9Hz,1H)8.08(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H)8.51(d,J＝2.0Hz,1H)8.58-8.63(m,2H)8.76(br s,1H)。
用与在实施例165中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例167
3-(3-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酰基)-N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
步骤1
(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
向(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(284mg,1.771mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(390mg,1.771mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入HATU(808mg,2.125mmol)和三乙胺(0.741mL,5.31mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(517mg,1.426mmol,81％收率)。LC-MS m/z 363.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-氨基乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.783mL,7.13mmol)加入(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(517mg,1.426mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(500mg,1.491mmol,105％收率)。LC-MS m/z 263.2(M+H)+。
步骤3
9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯
向(2S,3S)-N-(2-氨基乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(253mg,0.755mmol)和3-(叔丁氧基羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸(224mg,0.755mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.526mL,3.77mmol)和HATU(344mg,0.906mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取并将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(240mg,0.443mmol,58.7％收率)。LC-MS m/z 542.3(M+H)+。
步骤4
N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.554mL,2.215mmol)加入9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(240mg,0.443mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌2小时并浓缩至干燥以提供标题化合物(291mg,0.566mmol,128％收率)。LC-MS m/z 442.5(M+H)+。
步骤5
3-(3-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)-3-氧代丙氧基)丙酸叔丁酯。
向N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐(100mg,0.194mmol)和3-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)丙酸(46mg,0.211mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.147mL,1.054mmol)和HATU(96mg,0.253mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(91mg,0.142mmol,67.3％收率)。LC-MS m/z 642.3(M+H)+。
步骤6
3-(3-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)-3-氧代丙氧基)丙酸，盐酸盐
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.175mL,0.701mmol)加入到3-(3-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)-3-氧代丙氧基)丙酸叔丁酯(90mg,0.140mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.2mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(90mg,0.145mmol,103％收率)。LC-MS m/z 586.3(M+H)+。
步骤7
3-(3-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酰基)-N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
向3-(3-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)-3-氧代丙氧基)丙酸，盐酸盐(45mg,0.072mmol)和(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮(38.9mg,0.072mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.060mL,0.434mmol)和HATU(33.0mg,0.087mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供标题化合物(55mg,0.053mmol,73.7％收率)。LC-MS m/z 1032.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.14(br d,J＝5.8Hz,10H)1.57(br s,11H)1.89-2.17(m,3H)2.28(br s,5H)2.43-2.59(m,5H)2.67(s,5H)2.81-2.92(m,1H)2.95-3.09(m,1H)3.22-3.30(m,3H)3.36-3.72(m,10H)3.76-3.86(m,1H)4.00-4.12(m,1H)4.55-4.73(m,2H)4.86(d,J＝6.0Hz,1H)5.24-5.37(m,1H)7.46-7.59(m,1H)7.77-7.96(m,2H)8.01-8.13(m,1H)8.60(s,3H)8.77-8.94(m,1H)。
实施例168
(2S,3S)-N-(2-((2-((2-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸
在-5℃向在甲醇中的3,4-二乙氧基环丁-3-烯-1,2-二酮(300mg,1.763mmol)中加入在甲醇中的3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(390mg,1.763mmol)和DIPEA(924μL,5.29mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩，以提供标题化合物(600mg,1.633mmol,93％收率)。LC-MS m/z 346.1(M+H)+。
步骤2
3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙烯酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(861mg,1.5mmol)、3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(518mg,1.500mmol)和DIPEA(2.62mL,15.00mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入T3P(1.161mL,1.950mmol)。将混合物在室温搅拌2h。加入二氯甲烷(DCM)(10mL)和水(10mL)。将有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(354mg,0.443mmol,29.5％收率)。LC-MS m/z792.4(M+H)+。
步骤3
(2S,3S)-N-(2-((2-((2-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将3-(2-(2-(2-((2-乙氧基-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)丙酰胺(50mg,0.063mmol)、(2S,3S)-N-(2-氨基乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺(16.56mg,0.063mmol)和DIPEA(0.014mL,0.082mmol)在甲醇(3mL)中的混合物在60℃搅拌20h。将混合物冷却并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为浅棕色固体的标题化合物(30mg,0.028mmol,44.8％收率)。LC-MS m/z 1008.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.04(d,J＝6.4Hz,3H)1.13(br d,J＝6.4Hz,3H)1.59-1.78(m,3H)1.88-2.05(m,2H)2.05-2.25(m,3H)2.27(s,3H)2.28-2.37(m,1H)2.41-2.64(m,4H)2.64-2.71(m,3H)2.74(brs,1H)2.79-2.86(m,1H)2.93-3.05(m,1H)3.15-3.31(m,1H)3.35-3.46(m,3H)3.47-3.75(m,17H)3.78-3.83(m,1H)4.02-4.08(m,1H)4.65(br d,J＝2.9Hz,1H)4.79-4.83(m,1H)5.30(t,J＝8.1Hz,1H)7.50(dd,J＝8.3,4.9Hz,1H)7.78(dt,J＝8.3,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.49(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.58-8.64(m,1H)8.83(s,1H)。
用与在实施例168中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例170
N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
步骤1
9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(80mg,0.121mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入三乙胺(0.101mL,0.724mmol)，随后加入3-(叔丁氧基羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸(35.9mg,0.121mmol)和HATU(55.1mg,0.145mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(75mg,0.086mmol,71.5％收率)。LC-MS m/z 869.3(M+H)+。
LC-MS:N67608-77-A1:m/z 869.3(M+H)+,0.80min(保留时间)。
步骤2
N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.170mL,0.681mmol)加入到9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(74mg,0.085mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌3h并浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(81mg,0.096mmol,113％收率)。LC-MS m/z 769.4(M+H)+。
步骤3
(2-(9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
将N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐(50mg,0.059mmol)、(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(13.31mg,0.059mmol)和碳酸钾(24.62mg,0.178mmol)在乙腈(1mL)中的混合物在室温搅拌度过周末并在80℃搅拌4h。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(4g RediSep Rf柱,18mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(28mg,0.031mmol,51.7％收率)。LC-MS m/z 912.4(M+H)+。
步骤4
N-((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)-3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.038mL,0.153mmol)加入到(2-(9-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(28mg,0.031mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的混合物中。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥。向残余物中加入二氯甲烷(DCM)(0.1mL)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(6.76mg,0.031mmol)、三乙胺(0.021mL,0.153mmol)和HATU(14.01mg,0.037mmol)。将混合物在室温搅拌3h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(19.9mg,0.020mmol,63.9％收率)。LC-MS m/z 1014.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.97-1.08(m,4H)1.12-1.20(m,3H)1.29-1.38(m,2H)1.44-1.87(m,18H)1.90-2.03(m,1H)2.07-2.15(m,1H)2.17-2.33(m,6H)2.41-2.59(m,6H)2.64-2.77(m,5H)2.80-2.89(m,1H)2.98-3.07(m,1H)3.35-3.37(m,1H)3.42-3.58(m,2H)3.60-3.72(m,1H)3.82-3.89(m,1H)3.97-4.05(m,1H)4.56-4.66(m,1H)4.81-4.86(m,1H)5.26-5.34(m,1H)7.51-7.58(m,1H)7.78-7.85(m,1H)7.89-7.95(m,1H)8.03-8.11(m,1H)8.51-8.54(m,1H)8.57-8.62(m,2H)8.71-8.75(m,1H)。
实施例171
(2S,3S)-N-(2-((2-(2-(2-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3,6-二氧代-1-苯基-2,10,13-三氧杂-4,7-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
向2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(240mg,1.094mmol)、((苄氧基)羰基)甘氨酸(252mg,1.204mmol)、HOBt(201mg,1.313mmol)和EDC(315mg,1.642mmol)的溶液中加入DIPEA(0.956mL,5.47mmol)，并将混合物搅拌过夜并加入水。将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(360mg,0.877mmol,80％收率)。LC-MS m/z 411.2(M+H)+。
步骤2
2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,6-二氧代-1-苯基-2,10,13-三氧杂-4,7-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(360mg,0.877mmol)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(9.33mg,0.088mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌4h。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为蜡的标题化合物(242mg,0.876mmol,100％收率)。LC-MS m/z 277.3(M+H)+。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(-413-yrrolid-3-基)-413-yrrolidine-3-基)-1,4-二氧代-8,11-二氧杂-2,5-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(-413-yrrolid-3-基)吡咯烷-3-甲酸(123mg,0.557mmol)、HOBt(102mg,0.669mmol)、EDC(160mg,0.836mmol)和2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(154mg,0.557mmol)在二氯甲烷(DCM)(5.0mL)中的溶液中加入DIPEA(0.487mL,2.79mmol)。将混合物搅拌过夜并加入饱和的NaHCO3。将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为蜡的标题化合物(130mg,0.272mmol,48.7％收率)。LC-MS m/z 479.4(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(2-((2-(2-(2-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)-413-yrrolidine-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(-413-yrrolid-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-((-414-yrrolid-3-基)-414-yrrolidine-3-基)-1,4-二氧代-8,11-二氧杂-2,5-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯(48mg,0.100mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌1小时，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)-414-yrrolidine-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(66.5mg,0.100mmol)、HOBt(15.36mg,0.100mmol)和DIPEA(0.088mL,0.502mmol)，随后加入EDC(28.8mg,0.150mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并加入饱和的NaHCO3。将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(18.7mg,0.018mmol,17.82％收率)。LC-MS m/z 994.7(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.86-0.92(m,3H)1.02-1.07(m,3H)1.43-1.71(m,11H)1.88-2.07(m,2H)2.09-2.17(m,5H)2.31-2.38(m,1H)2.41-2.48(m,1H)2.56-2.61(m,2H)2.66-2.70(m,1H)2.71-2.79(m,1H)3.00-3.08(m,1H)3.16-3.32(m,3H)3.36-3.58(m,9H)3.66-3.70(m,2H)3.74-3.78(m,1H)3.79-3.83(m,2H)3.84-3.90(m,1H)4.38-4.46(m,1H)4.66-4.71(m,1H)4.99-5.08(m,1H)7.25-7.31(m,1H)7.40-7.46(m,1H)7.67-7.72(m,1H)7.87-7.94(m,2H)8.04-8.10(m,1H)8.20-8.26(m,1H)8.48-8.52(m,1H)8.54-8.56(m,1H)8.57-8.58(m,1H)8.67-8.73(m,2H)8.86-8.90(m,1H)。
实施例172
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯，三氟乙酸盐。
向3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1001mg,4.29mmol)在二氯甲烷(DCM)(35mL)中的溶液中加入三乙胺(1.495mL,10.73mmol)，随后加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(945mg,4.29mmol)和HATU(1958mg,5.15mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x 30mm 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有三氟乙酸(0.1％))洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(2.22g,3.84mmol,89％收率)。LC-MS m/z 436.3(M+H)+。
步骤2
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1'-(3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酰基)-[1,4'-双哌啶]-4-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.5mL,2.000mmol)加入到4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4'-双哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(82mg,0.108mmol)在二氯甲烷(DCM)(1.5mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥。将固体残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(3mL)和三乙胺(0.05mL)中。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.5mL,2.000mmol)加入到3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(56.5mg,0.130mmol)中。将混合物在室温搅拌1h并浓缩。将残余物与乙醚一起研磨并溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)和三乙胺(0.05mL)中。将溶液加入上述胺溶液中，加入HATU(61.6mg,0.162mmol)，将混合物在室温搅拌1h，并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(100.7mg,0.097mmol,90％收率)。LC-MS m/z 1020.2(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.95-1.05(m,3H)1.11-1.18(m,3H)1.27-1.51(m,2H)1.63-1.78(m,5H)1.81-1.98(m,6H)2.10-2.16(m,2H)2.17-2.25(m,3H)2.26-2.28(m,3H)2.30-2.35(m,1H)2.51-2.59(m,3H)2.60-2.65(m,2H)2.66-2.68(m,3H)2.70-2.75(m,2H)2.80-2.89(m,1H)2.97-3.14(m,4H)3.30-3.36(m,2H)3.48-3.58(m,7H)3.59-3.65(m,1H)3.69-3.75(m,2H)3.99-4.08(m,2H)4.50-4.59(m,1H)4.63-4.69(m,1H)4.82-4.85(m,1H)5.25-5.34(m,1H)7.50-7.56(m,1H)7.78-7.83(m,1H)7.89-7.93(m,1H)8.04-8.09(m,1H)8.51-8.54(m,1H)8.57-8.59(m,1H)8.59-8.61(m,1H)8.75-8.80(m,1H)。
实施例173
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N5-(3-(3-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)丙氧基)丙基)戊二酰胺。
步骤1
N1-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-N5-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)戊二酰胺。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(70mg,0.130mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.1mL,0.717mmol)，随后加入二氢-2H-吡喃-2,6(3H)-二酮(15mg,0.131mmol)。将溶液在室温搅拌过夜。加入3,3'-氧基双(丙烷-1-胺)(43mg,0.325mmol)，随后加入HATU(53mg,0.139mmol)。加入二氯甲烷(DCM)(1mL)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1.0mL)以改善溶解度。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色泡沫状固体的标题化合物(44mg,0.060mmol,46.3％收率)。LC-MS m/z 693.5(M+H)+。
步骤2
(4-((3-(3-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)丙氧基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯。
向N1-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-N5-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)戊二酰胺(22mg,0.032mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.013mL,0.095mmol)，随后加入4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(7.74mg,0.038mmol)和HATU(18.11mg,0.048mmol)。加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1.0mL)以改善溶解度。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为无色薄膜的标题化合物(23mg,0.026mmol,81％收率)。LC-MS m/z 878.2(M+H)+。
步骤3
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N5-(3-(3-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁酰氨基)丙氧基)丙基)戊二酰胺。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.2mL,0.600mmol)加入到(4-((3-(3-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)丙氧基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯(23mg,0.026mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)和三乙胺(0.018mL,0.131mmol)中。加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(8.65mg,0.039mmol)和HATU(14.94mg,0.039mmol)。将得到的混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTMCSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(23.9mg,0.024mmol,91％收率)。LC-MS m/z980.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.03(d,J＝6.4Hz,3H)1.13(d,J＝6.4Hz,3H)1.64-1.81(m,9H)1.86-2.06(m,3H)2.09-2.32(m,12H)2.49-2.65(m,1H)2.66(s,3H)2.68-2.78(m,2H)2.77-2.89(m,1H)2.95-3.06(m,1H)3.11-3.30(m,6H)3.36-3.48(m,5H)3.51-3.69(m,2H)4.04(dt,J＝12.0,3.5Hz,1H)4.60(br d,J＝2.9Hz,1H)4.81-4.84(m,1H)5.30(t,J＝8.6Hz,1H)7.49-7.56(m,1H)7.80(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.05(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51(d,J＝1.5Hz,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.77(s,1H)。
实施例175
(2S,3S)-N-(3-(2-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤12-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)乙酸叔丁酯。
向(3-羟基丙基)氨基甲酸苄酯(11.5g,55.0mmol)和2-溴乙酸叔丁酯(21.44g,110mmol)在甲苯(200mL)中的溶液中加入四丁基硫酸氢铵(9.33g,27.5mmol)。将反应混合物剧烈搅拌，缓慢地加入30％氢氧化钠(2.198g,55.0mmol)在水(5.13mL)中的溶液，并将混合物搅拌度过周末。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(220g硅胶柱,150mL/min)纯化，用0至40％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(3.53g,10.92mmol,19.86％收率)。LC-MS m/z 346.1(M+H)+。
步骤2
3,10-二氧代-1-苯基-2,8,14-三氧杂-4,11-二氮杂十七烷-17-酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(10.0mL,40.0mmol)加入到2-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)乙酸叔丁酯(636mg,1.966mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌过夜，并浓缩至干燥。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中，并加入DIPEA(1.430mL,8.19mmol)、HOBt(301mg,1.966mmol)、3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(实施例167，步骤2)(310mg,1.638mmol)，随后加入EDC(471mg,2.457mmol)。将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(572mg,1.304mmol,80％收率)。LC-MS m/z 439.2(M+H)+。
步骤3
3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,10-二氧代-1-苯基-2,8,14-三氧杂-4,11-二氮杂十七烷-17-酸叔丁酯(570mg,1.300mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(13.83mg,0.130mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填。将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜并穿过过滤。将滤液浓缩，以提供作为无色油的标题化合物(380mg,1.248mmol,96％收率)。LC-MS m/z 305.1(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-6,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(220mg,0.999mmol)在二氯甲烷(DCM)(10.0mL)中的溶液中加入3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(365mg,1.199mmol)、HOBt(184mg,1.199mmol)、EDC(287mg,1.498mmol)，随后加入DIPEA(0.872mL,4.99mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(320mg,0.632mmol,63.2％收率)。LC-MS m/z 507.1(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(3-(2-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,8-二氧代-6,12-二氧杂-2,9-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(64.2mg,0.127mmol)在溶剂中的溶液中至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)和DIPEA(0.079mL,0.453mmol)，随后加入EDC(26.0mg,0.136mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(55.1mg,0.051mmol,56.6％收率)。LC-MS m/z 1022.0(M+H)+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm0.90(d,J＝6.4Hz,3H)1.05(d,J＝6.8Hz,3H)1.39-1.52(m,2H)1.52-1.75(m,10H)1.91-2.17(m,7H)2.63-2.75(m,1H)2.87-2.94(m,1H)3.07-3.30(m,5H)3.33-3.45(m,5H)3.49-3.60(m,3H)3.71(br s,1H)3.78(s,2H)3.86-3.93(m,1H)4.43(brd,J＝3.9Hz,1H)4.65(d,J＝6.4Hz,1H)5.03(q,J＝8.2Hz,1H)7.33-7.51(m,1H)7.56-7.64(m,2H)7.68(dt,J＝8.2,2.0Hz,1H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)8.01(t,J＝5.6Hz,1H)8.03-8.08(m,1H)8.47(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.58(s,1H)8.60-8.72(m,2H)8.89(s,1H)。
实施例176
(2S,3S)-N-(4-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3,8-二氧代-1-苯基-2,12,15-三氧杂-4,9-二氮杂十八烷-18-酸叔丁酯。
向4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(300mg,1.264mmol)、3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(295mg,1.264mmol)、DIPEA(0.663mL,3.79mmol)和HOBt(232mg,1.517mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的混合物中加入EDC(364mg,1.897mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(575mg,1.271mmol,100％收率)。LC-MS m/z 453.1(M+H)+。
步骤2
3-(2-(2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,8-二氧代-1-苯基-2,12,15-三氧杂-4,9-二氮杂十八烷-18-酸叔丁酯(575mg,1.271mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(54.1mg,0.508mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填。将混合物在氢气气球气氛下搅拌过夜并穿过过滤。将滤液浓缩，以提供为无色的标题化合物(405mg,1.272mmol,100％收率)。LC-MS m/z 319.0(M+H)+。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,6-二氧代-10,13-二氧杂-2,7-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(280mg,1.271mmol)在二氯甲烷(DCM)(10.0mL)中的溶液中加入3-(2-(2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(405mg,1.271mmol)、HOBt(234mg,1.526mmol)、EDC(366mg,1.907mmol)，随后加入DIPEA(1.110mL,6.36mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(574mg,1.103mmol,87％收率)。LC-MSm/z 521.1(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(4-((2-(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,6-二氧代-10,13-二氧杂-2,7-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(66.0mg,0.127mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌1h，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)和DIPEA(0.079mL,0.453mmol)，随后加入EDC(26.0mg,0.136mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(60.9mg,0.056mmol,61.7％收率)。LC-MS m/z 1036.7(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.90(d,J＝6.4Hz,3H),1.04(d,J＝6.4Hz,3H),1.36-1.49(m,2H),1.49-1.77(m,11H),1.88-1.98(m,1H),1.99-2.05(m,3H),2.07-2.12(m,2H),2.14(s,3H),2.28(t,J＝6.6Hz,2H),2.31-2.40(m,1H),2.40-2.47(m,1H),2.52-2.54(m,4H),2.55-2.62(m,1H),2.66-2.75(m,1H),2.85-2.93(m,1H),3.01(q,J＝6.5Hz,2H),3.16(q,J＝5.9Hz,2H),3.28-3.31(m,1H),3.34-3.39(m,2H),3.41-3.47(m,5H),3.49-3.58(m,3H),3.65-3.76(m,1H),3.84-3.93(m,1H),4.43(brdd,J＝6.8,3.4Hz,1H),4.65(d,J＝5.9Hz,1H),5.03(q,J＝7.8Hz,1H),7.44(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),7.64(d,J＝6.8Hz,1H),7.68(dt,J＝7.9,2.1Hz,1H),7.83(t,J＝6.1Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.96(s,1H),8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.48(d,J＝2.0Hz,1H),8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H),8.59(s,1H),8.62-8.68(m,1H),8.69-8.75(m,1H),8.89(s,1H)。
用与在实施例176中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例179
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N5-((1R,4S)-4-((3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙烷酰氨基)甲基)环己基)戊二酰胺。
步骤1
(((1S,4s)-4-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)环己基)甲基)氨基甲酸叔丁酯。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.5mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(53mg,0.094mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(3mL)和三乙胺(0.052mL,0.375mmol)中。加入二氢-2H-吡喃-2,6(3H)-二酮(10.71mg,0.094mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入(((顺式)-4-氨基环己基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(25.7mg,0.113mmol)，随后加入HATU(53.5mg,0.141mmol)。将得到的混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为棕色泡沫状固体的标题化合物(65mg,0.079mmol,84％收率)。LC-MS m/z 789.3(M+H)+。
步骤2
(2-(3-((((1S,4s)-4-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)环己基)甲基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)加入到(((1S,4s)-4-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)环己基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(64mg,0.081mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(3mL)中。依次加入三乙胺(0.05mL,0.359mmol)、3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(21mg,0.090mmol)和HATU(39.0mg,0.103mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为浅棕色薄膜的标题化合物(65mg,0.068mmol,84％收率)。LC-MS m/z904.3(M+H)+。
步骤3
N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N5-((1R,4S)-4-((3-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)丙烷酰氨基)甲基)环己基)戊二酰胺。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)加入到(2-(3-((((1S,4s)-4-(5-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-5-氧代戊烷酰氨基)环己基)甲基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(65mg,0.072mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)和三乙胺(0.050mL,0.359mmol)中，并加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(19.00mg,0.086mmol)和HATU(41.0mg,0.108mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(55.2mg,0.054mmol,74.8％收率)。LC-MS m/z 1006.8(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.97-1.07(m,3H)1.12(br d,J＝6.4Hz,3H)1.26-1.47(m,3H)1.47-1.66(m,8H)1.66-1.78(m,3H)1.89-2.16(m,4H)2.16-2.32(m,11H)2.35-2.48(m,2H)2.50-2.65(m,1H)2.67(s,3H)2.68-2.76(m,2H)3.02-3.11(m,3H)3.25-3.31(m,1H)3.35-3.50(m,4H)3.56(td,J＝9.3,2.4Hz,1H)3.63-3.70(m,3H)3.80-3.86(m,1H)4.01(dt,J＝12.0,3.8Hz,1H)4.60(br d,J＝2.9Hz,1H)4.83(d,J＝6.8Hz,1H)5.31(t,J＝8.6Hz,1H)7.54(dd,J＝7.3,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝8.3,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.05(dd,J＝9.0,1.7Hz,1H)8.52(d,J＝1.5Hz,1H)8.56-8.59(m,2H)8.77(s,1H)。
用与在实施例179中描述的程序类似的程序制备下述化合物:
实施例181
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,11-三氧代-3,14,17-三氧杂-6,10-二氮杂十九烷-19-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(150mg,0.681mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入N,N'-羰基二咪唑(144mg,0.885mmol)。将混合物在室温搅拌30min。加入3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(159mg,0.681mmol)。将混合物搅拌2h并在硅胶上浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为澄清油的标题化合物(206mg,0.459mmol,67.4％收率)。LC-MS m/z 436.2(M+H)+。
步骤2
3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2.73mL,10.90mmol)加入3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸(105mg,0.208mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌1小时并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用5至35％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色树胶的标题化合物(105mg,0.208mmol,45.7％收率)。LC-MS m/z 380.1(M+H)+。
步骤3
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11-二氧代-5,8-二氧杂-2,12-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
向3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸(105mg,0.208mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入HOBt(38.1mg,0.249mmol)和EDC(55.7mg,0.291mmol)，并将混合物搅拌30min。加入3-氨基丙酸叔丁酯，盐酸盐(47.6mg,0.249mmol)和DIPEA(0.073mL,0.415mmol)，并将混合物搅拌度过周末。将粗产物与从3-(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸(196mg,0.363mmol)开始的类似批合并，然后萃取。将合并的混合物在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水层用二氯甲烷(DCM)(4x 20mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过Rf色谱法(24g硅胶柱,30mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅橙色油的标题化合物(268mg,0.476mmol,83.4％收率)。LC-MS m/z 507.4(M+H)+。
步骤4
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11-二氧代-5,8-二氧杂-2,12-二氮杂十五烷-15-酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2.79mL,11.17mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11-二氧代-5,8-二氧杂-2,12-二氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(262mg,0.465mmol)悬浮于1,4-二氧杂环己烷(1mL)中的悬浮液中。将反应混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(370mg,0.456mmol,98％收率)。(N70851-11-1)作为白色树胶。LC-MS m/z 451.3(M+H)+。
步骤5
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11,15-三氧代-5,8,19-三氧杂-2,12,16-三氮杂二十一烷-21-酸叔丁酯。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11-二氧代-5,8-二氧杂-2,12-二氮杂十五烷-15-酸(365mg,0.486mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中加入HOBt(89mg,0.583mmol)和EDC(130mg,0.681mmol)，并将混合物搅拌30min。加入2-(2-氨基乙氧基)乙酸叔丁酯(123mg,0.583mmol)和DIPEA(0.170mL,0.972mmol)，并将混合物搅拌过夜。将混合物在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水层用二氯甲烷(DCM)(4x20mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过Rf色谱法(24g硅胶柱,30mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅橙色油的标题化合物(210mg,0.318mmol,65.4％收率)。LC-MS m/z 608.2(M+H)+。
步骤6
1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11,15-三氧代-5,8,19-三氧杂-2,12,16-三氮杂二十一烷-21-酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.908mL,7.63mmol)加入到1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11,15-三氧代-5,8,19-三氧杂-2,12,16-三氮杂二十一烷-21-酸叔丁酯(210mg,0.318mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1mL)中的悬浮液中。将混合物在室温搅拌4h并浓缩，以提供作为白色树胶的标题化合物(399mg,0.305mmol,96％收率)。LC-MS m/z 551.2(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(1-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-1,7,11-三氧代-3,14,17-三氧杂-6,10-二氮杂十九烷-19-基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1,11,15-三氧代-5,8,19-三氧杂-2,12,16-三氮杂二十一烷-21-酸，盐酸盐(192mg,0.147mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中加入HOBt(18.02mg,0.118mmol)和EDC(26.3mg,0.137mmol)，并将混合物搅拌30min。加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(62mg,0.098mmol)和DIPEA(0.034mL,0.196mmol)，并将混合物搅拌过夜。将混合物在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水层用二氯甲烷(DCM)(4x 20mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl洗涤，经Na2SO4干燥，并在硅胶上浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(83mg,0.082mmol,84％收率)。LC-MS m/z998.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.00(d,J＝6.4Hz,3H)1.15(d,J＝6.4Hz,3H)1.57-1.84(m,3H)1.94-2.09(m,1H)2.09-2.21(m,2H)2.24(s,3H)2.27-2.43(m,5H)2.50-2.65(m,1H)2.67(s,3H)2.69-2.76(m,2H)2.80-2.88(m,1H)3.03-3.17(m,1H)3.24-3.31(m,2H)3.35-3.47(m,6H)3.50(ddd,J＝6.2,4.8,2.2Hz,2H)3.52-3.58(m,4H)3.60-3.70(m,5H)4.03-4.10(m,3H)4.67(br s,1H)4.80-4.84(m,2H)5.27(t,J＝8.6Hz,1H)7.53(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝8.3,2.0Hz,1H)7.90(d,J＝8.8Hz,1H)8.05(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.51-8.54(m,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.59(s,1H)8.78(s,1H)。
实施例182
(2S,3S)-N-(3-((3-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(253mg,0.382mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(89mg,0.382mmol)、三乙胺(0.266mL,1.909mmol)和HATU(174mg,0.458mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过ISCO色谱法(24gRediSep Rf柱,35mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物((215mg,0.267mmol,70.0％收率)。LC-MS m/z636.3(M+H)+。
步骤2
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯。
向3-氨基丙酸叔丁酯，盐酸盐(267mg,1.471mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(324mg,1.471mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的混合物中加入三乙胺(1.025mL,7.36mmol)和HATU(671mg,1.765mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取并将合并的有机相经Na2SO4干燥洗涤，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(525mg,1.511mmol,103％收率)。LC-MS m/z 348.1(M+H)+。
步骤3
3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐。
将4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(3.02mL,12.09mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸叔丁酯(525mg,1.511mmol)中。将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供标题化合物(560mg,1.537mmol,102％收率)。LC-MS m/z 292.1(M+H)+。
步骤4
(3-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.534mL,2.137mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的(2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(215mg,0.267mmol)中。将混合物在室温搅拌过夜，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的残余物中加入3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(50.5mg,0.267mmol)、HATU(122mg,0.321mmol)和三乙胺(0.298mL,2.137mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(197mg,0.208mmol,78％收率)。LC-MS m/z 876.1(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(3-((3-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.114mL,0.457mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(0.1mL)中的(3-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(50mg,0.057mmol)中。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥。将残余物置于二氯甲烷(DCM)(1mL)中。加入3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙酸，盐酸盐(18.71mg,0.057mmol)、三乙胺(0.064mL,0.457mmol)和HATU(26.0mg,0.068mmol)。将混合物在室温搅拌1h并浓缩混合物。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(40.1mg,0.038mmol,67.0％收率)。LC-MS m/z 1049.9(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.05-1.17(m,3H)1.23(br d,J＝6.4Hz,3H)1.49-1.92(m,10H)2.15-2.30(m,4H)2.31-2.39(m,4H)2.43(br t,J＝6.1Hz,4H)2.52-2.65(m,1H)2.65-2.67(m,3H)2.67-2.73(m,1H)2.79-2.94(m,1H)2.94-3.15(m,2H)3.29-3.35(m,9H)3.49(t,J＝5.6Hz,2H)3.55(br s,1H)3.61-3.73(m,4H)3.89(br t,J＝3.9Hz,1H)4.05-4.13(m,1H)4.49(br s,1H)4.82-4.84(m,1H)5.18(br s,1H)7.52(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.79(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.92(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.50-8.53(m,1H)8.54(s,1H)8.57(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H)8.60(s,1H)8.71(s,1H)。
实施例183
3-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)-N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,3甲酸盐。
步骤1
(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(284mg,1.771mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(390mg,1.771mmol)在二氯甲烷(DCM)(5mL)中的混合物中加入HATU(808mg,2.125mmol)和三乙胺(0.741mL,5.31mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供标题化合物(517mg,1.426mmol,81％收率)。LC-MS m/z 363.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-氨基乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.783mL,7.13mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(517mg,1.426mmol)中。将混合物在室温搅拌3h，并浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(500mg,1.491mmol,105％收率)。LC-MS m/z 263.2(M+H)+。
步骤39-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向3-(叔丁氧基羰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酸(104.5mg,0.351mmol)和(2S,3S)-N-(2-氨基乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(118mg,0.351mmol)在二氯甲烷(DCM)(0.5mL)中的混合物中加入HATU(160mg,0.422mmol)和三乙胺(0.294mL,2.108mmol)。将混合物在室温搅拌2h。通过ISCO色谱法(80g Redisep Rf柱,60mL/min)纯化，用0至15％的含有氢氧化铵(10％)的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为固体的标题化合物(105mg,0.194mmol,55.2％收率)。LC-MS m/z 542.5(M+H)+。
步骤4
N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.247mL,0.988mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(0.2mL)中的9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(107mg,0.198mmol)中。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥以提供作为固体的标题化合物(122mg,0.237mmol,120％收率)。LC-MS m/z 442.2(M+H)+。
步骤5
4-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸叔丁酯。
将N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,2盐酸盐(64mg,0.124mmol)、4-溴丁酸叔丁酯(27.8mg,0.124mmol)和碳酸钾(51.6mg,0.373mmol)在乙腈(1mL)中的混合物在室温搅拌1.5h并在80℃搅拌2h。加入饱和的NaHCO3并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩至干燥以提供标题化合物(57mg,0.098mmol,78％收率)。LC-MS m/z584.4(M+H)+。
步骤6
3-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)-N-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-9-甲酰胺,3甲酸盐。
将4N HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(0.118mL,0.471mmol)加入到在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的4-(9-((2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙基)氨甲酰基)-3-氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸叔丁酯(55mg,0.094mmol)中。将混合物在室温搅拌2h，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的残余物中加入(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50.6mg,0.094mmol)、三乙胺(0.105mL,0.754mmol)和HATU(53.7mg,0.141mmol)。将混合物在室温搅拌3h并在饱和的NaHCO3和二氯甲烷(DCM)之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取并将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过ISCO色谱法(40g Redisep Rf柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供标题化合物(54mg,0.053mmol,56.4％收率)。LC-MS m/z 974.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.97-1.06(m,4H)1.13(br d,J＝6.3Hz,3H)1.22-1.45(m,3H)1.45-1.56(m,6H)1.56-1.68(m,3H)1.68-1.86(m,5H)1.94-2.13(m,3H)2.14-2.40(m,14H)2.57(dtd,J＝12.4,8.2,8.2,4.1Hz,1H)2.66-2.67(m,3H)2.67-2.79(m,2H)2.82-2.90(m,1H)2.98-3.04(m,1H)3.20-3.31(m,4H)3.38-3.51(m,1H)3.56(td,J＝9.1,3.9Hz,1H)3.62-3.69(m,1H)4.06(dt,J＝12.1,3.9Hz,1H)4.65(br d,J＝3.3Hz,1H)4.84-4.88(m,1H)5.22(t,J＝7.9Hz,1H)7.51-7.55(m,1H)7.80(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.92(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H)8.53(d,J＝2.3Hz,1H)8.58(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H)8.60(s,1H)8.83(s,1H)。
用与在实施例183中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例185
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1”-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺。
步骤1
[1,4':1',4”-三哌啶]-1”,4-二甲酸1”苄基4-乙基酯,2三氟乙酸盐。
将[1,4'-双哌啶]-4-甲酸乙酯,2盐酸盐(265mg,0.846mmol)和三乙胺(0.248mL,1.776mmol)在二氯甲烷(DCM)(8mL)中的混合物在室温搅拌15min。加入4-氧代哌啶-1-甲酸苄酯(217mg,0.931mmol)和几滴乙酸。将混合物搅拌30min并缓慢地加入三乙酰氧基硼氢化钠(269mg,1.269mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有三氟乙酸(0.1％))洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(2983mg,0.413mmol,48.8％收率)。LC-MS m/z 458.2(M+H)+。
步骤2
1”-((苄氧基)羰基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酸。
将2M氢氧化锂(0.869mL,1.738mmol)加入到[1,4':1',4”-三哌啶]-1”,4-二甲酸1”-苄基4-乙基酯,2三氟乙酸盐(298mg,0.435mmol)在四氢呋喃(THF)(2mL)和乙醇(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩以除去有机溶剂。用1N HCl将水性残余物的pH调至3并蒸发至干燥。将残余物悬浮于甲醇/二氯甲烷(DCM)(2％)(30mL)中，通过声处理搅拌，并过滤。将滤液在减压下浓缩，以提供含有大量无机盐的作为白色固体的标题化合物。LC-MS m/z430.2(M+H)+。
步骤3
4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-1”-甲酸苄酯,3三氟乙酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1mL,4.00mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(237mg,0.420mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌30min并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(7mL)和三乙胺(0.293mL,2.099mmol)中，加入1”-((苄氧基)羰基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酸(321mg,0.411mmol)和HATU(239mg,0.630mmol)。将混合物在室温搅拌1h，加入水(1mL)并将混合物在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有三氟乙酸(0.1％))洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(313.9mg,0.253mmol,60.2％收率)。LC-MS m/z 876.3(M+H)+。
步骤4
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺,3三氟乙酸盐。
向4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-1”-甲酸苄酯,3三氟乙酸盐(313.9mg,0.258mmol)在甲醇(7mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(27.4mg,0.026mmol)。将混合物抽真空并用氢气回填几次。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌2h，过滤，并将滤液浓缩以提供作为白色泡沫的标题化合物(290mg,0.243mmol,94％收率)。LC-MS m/z 742.2(M+H)+。
步骤5
1”-(4-叠氮基丁基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺。
将N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺,3三氟乙酸盐(90mg,0.083mmol)、1-叠氮基-4-碘丁烷(35mg,0.156mmol)和碳酸钾(57.4mg,0.415mmol)在乙腈(4mL)中的混合物在75℃搅拌2h，冷却，并过滤。将滤液在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为棕色固体的标题化合物(44.2mg,0.051mmol,61.5％收率)。LC-MS m/z 839.4(M+H)+。
步骤6
1”-(4-氨基丁基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺。
向1”-(4-叠氮基丁基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺(44mg,0.052mmol)在甲醇(7mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(5.58mg,5.24μmol)。将烧瓶抽真空并用氢气回填。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌2h并过滤。将滤液浓缩，以提供作为无色薄膜的标题化合物(36.5mg,0.044mmol,83％收率)。LC-MS m/z 813.4(M+H)+。
步骤7
N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-1”-(4-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丁基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺。
向1”-(4-氨基丁基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-[1,4':1',4”-三哌啶]-4-甲酰胺(36.5mg,0.045mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(15mg,0.068mmol)和三乙胺(0.019mL,0.135mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的溶液中加入HATU(30mg,0.079mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(23mg,0.022mmol,50.0％收率)。LC-MS m/z 1015.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.01(br d,J＝6.3Hz,3H)1.17(br d,J＝6.3Hz,3H)1.43-1.64(m,8H)1.64-1.82(m,4H)1.82-2.09(m,10H)2.09-2.36(m,15H)2.49-2.63(m,1H)2.67(s,3H)2.68-2.70(m,1H)2.73(br d,J＝7.6Hz,2H)2.78-2.93(m,1H)2.93-3.09(m,7H)3.10-3.29(m,2H)3.35-3.57(m,3H)3.58-3.69(m,1H)4.04(dt,J＝12.3,3.7Hz,1H)4.66(br d,J＝3.3Hz,1H)4.82-4.88(m,1H)5.30(t,J＝8.5Hz,1H)7.82(dt,J＝8.0,1.8Hz,1H)7.92(d,J＝8.6Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H)8.52(d,J＝1.8Hz,1H)8.57-8.61(m,2H)8.78(s,1H)。
实施例186
步骤6
(2S,3S)-N-(2-(2-((1S,3R)-3-(3-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙烷酰氨基)环丁烷-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(250mg,1.135mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入CDI(244mg,1.476mmol)。将混合物在室温搅拌30min并加入(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(308mg,1.476mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌过夜。加入二氯甲烷(DCM)(45mL)并将有机相用饱和NaHCO3洗涤。将水相用二氯甲烷(DCM)(30mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至15％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为粘性白色泡沫的标题化合物(432mg,1.063mmol,94％收率)。LC-MS m/z407.2(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)加入到(2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(431mg,1.060mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌过夜并在减压下浓缩。将残余物在高真空下干燥以提供作为白色固体的标题化合物(620mg,1.063mmol,100％收率)。LC-MS m/z 307.1(M+H)+。
步骤3
((1R,3s)-3-((2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯。
在室温向(2S,3S)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺2盐酸盐(620mg,1.063mmol)和(1s,3s)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)环丁烷-1-甲酸(289mg,1.275mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液中加入三乙胺(0.740mL,5.31mmol)，随后加入HATU(536mg,1.381mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入二氯甲烷(DCM)(45mL)并将有机相用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将水相用二氯甲烷(DCM)(30mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为白色泡沫的标题化合物(502mg,0.947mmol,89％收率)。LC-MS m/z 504.3(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(2-(2-((1s,3R)-3-氨基环丁烷-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4mL,16.00mmol)加入到((1R,3s)-3-((2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)环丁基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,0.943mmol)在二氯甲烷(DCM)(4mL)中的溶液中。将混合物搅拌6.5h并在减压下浓缩。将残余物在高真空下干燥以提供作为白色固体的标题化合物(815mg,0.941mmol,100％收率)。LC-MS m/z 404.5(M+H)+。
步骤5
3-(3-(((1R,3s)-3-((2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-N-(2-(2-((1s,3R)-3-氨基环丁烷-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2盐酸盐(806mg,0.931mmol)和3-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)丙酸(249mg,1.117mmol)在二氯甲烷(DCM)(6mL)中的溶液中加入三乙胺(0.648mL,4.65mmol)，随后加入HATU(433mg,1.117mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。加入二氯甲烷(DCM)(45mL)并将有机相用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将水相用二氯甲烷(DCM)(30mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为白色泡沫的标题化合物(498mg,0.792mmol,85％收率)。LC-MS m/z 604.5(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(2-(2-((1S,3R)-3-(3-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙烷酰氨基)环丁烷-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(2mL,8.00mmol)加入到3-(3-(((1R,3s)-3-((2-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)环丁基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙酸叔丁酯(78mg,0.123mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩。向残余物中加入二氯甲烷(DCM)(2.0mL)、(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮2盐酸盐(65mg,0.103mmol)和三乙胺(0.072mL,0.514mmol)，随后加入HATU(47.9mg,0.123mmol)。将混合物在室温搅拌2h。加入二氯甲烷(DCM)(45mL)并将有机相用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将水相用二氯甲烷(DCM)(30mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3洗涤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为白色固体的标题化合物(80.2mg,0.080mmol,78％收率)。LC-MS m/z 994.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.04(d,J＝6.11Hz,3H),1.14(d,J＝6.60Hz,3H),1.63-1.80(m,3H),1.88-2.00(m,1H),2.03-2.16(m,3H),2.19-2.60(m,12H),2.64-2.90(m,7H),2.99-3.09(m,1H),3.27-3.31(m,1H),3.36-3.71(m,12H),3.78(dt,J＝9.48,6.14Hz,1H),4.01-4.10(m,1H),4.16-4.28(m,1H),4.58-4.67(m,1H),4.83(d,J＝6.60Hz,1H),5.32(t,J＝8.19Hz,1H),7.54(dd,J＝7.58,4.89Hz,1H),7.80(dt,J＝7.83,1.96Hz,1H),7.91(d,J＝8.80Hz,1H),8.06(dd,J＝8.80,1.71Hz,1H),8.52(d,J＝1.71Hz,1H),8.55-8.63(m,2H),8.82(s,1H)。
用与在实施例186中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例189
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(4-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯，甲酸盐。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(78.5mg,0.139mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。将残余物悬浮于二氯甲烷(DCM)(5mL)和三乙胺(0.068mL,0.487mmol)中，加入4-(1-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)环己-3-烯-1-甲酸(49.4mg,0.161mmol)和HATU(79mg,0.209mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有甲酸(0.1％))洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(105.2mg,0.133mmol,95％收率)。LC-MS m/z 906.7(M+H)+。
步骤2
4-(1-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己-3-烯-1-甲酰胺。
在室温将4-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己-1-烯-1-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(105mg,0.139mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液用TFA(0.5mL,6.49mmol)处理过夜，并浓缩至干燥。将残余物悬浮于乙腈(7.5mL)中。加入碳酸钾(96mg,0.696mmol)，随后加入甲磺酸2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙酯(52.9mg,0.209mmol)。将混合物在85℃搅拌5h，冷却，并过滤。将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为浅黄色薄膜的标题化合物(71.5mg,0.088mmol,63.3％收率)。LC-MS m/z 811.0(M+H)+。
步骤3
(1r,4R)-4-(1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,3三氟乙酸盐。
向4-(1-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己-3-烯-1-甲酰胺(71.5mg,0.088mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(9.38mg,8.82μmol)。将混合物抽真空并用氢气回填几次。将混合物在氢气气球气氛下在室温搅拌24h并穿过过滤。将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 150mm x 30mm 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用5至35％乙腈在水中的梯度(二者都含有三氟乙酸(0.1％))洗脱，提供作为无色薄膜的标题化合物(37.4mg,0.031mmol,35.6％收率)。LC-MS m/z 789.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.81-0.92(m,1H)0.95-1.07(m,1H)1.10(br d,J＝6.8Hz,1H)1.35(br d,J＝6.5Hz,3H)1.44(brd,J＝6.5Hz,3H)1.47-1.65(m,2H)1.76-2.31(m,16H)2.40-2.56(m,1H)2.60-2.68(m,1H)2.80-2.84(m,3H)2.89-3.06(m,3H)3.15(t,J＝5.0Hz,1H)3.21-3.27(m,1H)3.58-3.69(m,4H)3.70-3.80(m,8H)3.80-3.97(m,5H)4.18-4.27(m,1H)4.39(br s,1H)8.03(d,J＝8.8Hz,1H)8.33(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H)8.89(s,1H)9.11(s,1H)。
将反式异构体也分离为无色薄膜(46mg,0.039mmol,43.8％收率)。LC-MS m/z789.4(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(2-(2-(2-(4-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)哌啶-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向(1r,4R)-4-(1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)哌啶-4-基)-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺(34mg,0.043mmol)和(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(24mg,0.109mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的溶液中加入三乙胺(0.050mL,0.359mmol)和HATU(33mg,0.087mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(10.2mg,9.88μmol,22.92％收率)。LC-MS m/z 991.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm0.54-0.79(m,1H)0.81-0.99(m,1H)1.01-1.17(m,1H)1.24-1.52(m,10H)1.57-1.72(m,1H)1.76-1.92(m,5H)1.98-2.27(m,5H)2.36-2.61(m,2H)2.65-2.77(m,6H)2.82-3.07(m,4H)3.35-3.43(m,2H)3.45-3.67(m,8H)3.71-3.96(m,4H)4.12-4.37(m,2H)4.81-4.83(m,1H)4.86-5.01(m,3H)5.51(s,7H)7.54(dd,J＝7.9,4.9Hz,1H)7.80(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H)7.93(d,J＝8.6Hz,1H)8.05-8.15(m,1H)8.36(br s,2H)8.44-8.57(m,1H)8.63(s,1H)8.73(s,1H)。
用与在实施例189中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例191
(2S,3S)-N-(3-(9-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
9-(3-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(2.5g,9.83mmol)在乙腈(20mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(4.07g,29.5mmol)和2-(3-溴丙基)异吲哚啉-1,3-二酮(3.16g,11.79mmol)。将混合物在80℃搅拌8h，冷却至室温，并加入冰冷的水(40mL)。将混合物用乙酸乙酯(2x 50mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法纯化，用80％乙酸乙酯在己烷类中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(2.0g,4.46mmol,45.3％收率)。LC-MS m/z 442.3(M+H)+。
步骤2
9-(3-氨基丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向9-(3-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(2.0g,4.53mmol)在乙醇(10mL)中的搅拌溶液中缓慢地加入水合肼(2.197mL,45.3mmol)。将混合物在25℃搅拌6h，并浓缩以除去乙醇。加入冰冷的水(40mL)并将混合物用二氯甲烷(DCM)(2x 50mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法纯化，用80％乙酸乙酯在己烷类中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(1.5g,4.81mmol,106％收率)。LC-MS m/z 312.3(M+H)+。
步骤3
9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(1.155g,5.24mmol)在吡啶(15mL)中的搅拌溶液中加入EDC(1.371g,7.15mmol)和9-(3-氨基丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(1.5g,4.47mmol)。将混合物在室温搅拌16h。加入冰冷的水(40mL)并将混合物用二氯甲烷(DCM)(2x 50mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过正相色谱法纯化，用10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的溶液洗脱，提供作为浅黄色液体的标题化合物(930mg,1.778mmol,37.3％收率)。LC-MS m/z 514.3(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(3-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,3三氟乙酸盐。
将三氟乙酸(1.125mL,14.60mmol)加入在二氯甲烷(DCM)(1.2mL)中的9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(150mg,0.292mmol)中。将混合物搅拌过夜，并在减压下浓缩，以提供标题化合物(120mg,0.159mmol,54.5％收率)。LC-MS m/z 414.3(M+H)+。
步骤5
4-(9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸甲酯。
将碳酸钾(468mg,3.39mmol)加入4-溴丁酸甲酯(306mg,1.693mmol)和(2S,3S)-N-(3-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,3三氟乙酸盐(700mg,1.693mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中。将混合物在70℃搅拌18h并过滤。将滤液用乙酸乙酯(20mL)洗涤。将合并的液体在减压下蒸发以提供标题化合物(700mg,0.926mmol,54.7％收率)。LC-MS m/z 514.2(M+H)+。
步骤6
4-(9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸。
将氢氧化钠(1.217mL,4.87mmol)加入4-(9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸甲酯(500mg,0.973mmol)在甲醇(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌18h并浓缩。在酸性条件下通过MDAP色谱法纯化，提供标题化合物(100mg,0.200mmol,20.56％收率)。LC-MS m/z 500.2(M+H)+。
步骤7
(2S,3S)-N-(3-(9-(4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-4-氧代丁基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将TFA(0.077mL,1.001mmol)加入((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(67.8mg,0.120mmol)在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌1h，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的残余物中加入4-(9-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)丁酸(50mg,0.100mmol)、HATU(57.1mg,0.150mmol)和DIPEA(0.035mL,0.200mmol)。将得到的混合物在室温搅拌18h。加入二氯甲烷(DCM)(10mL)，将混合物用水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用20至50％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(30mg,0.029mmol,29.5％收率)。LC-MS m/z 946.7(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.05(br d,J＝6.5Hz,3H)1.13(br d,J＝6.3Hz,3H)1.39(br s,8H)1.59-1.88(m,7H)1.91-2.05(m,1H)2.15(br dd,J＝12.5,2.5Hz,1H)2.18-2.42(m,19H)2.57(dtd,J＝12.3,8.1,8.1,4.0Hz,1H)2.66(s,3H)2.69-2.78(m,2H)2.80-2.91(m,1H)2.96-3.06(m,1H)3.11-3.29(m,2H)3.38-3.48(m,1H)3.51-3.60(m,1H)3.61-3.72(m,1H)4.06(dt,J＝12.1,3.7Hz,1H)4.65(br d,J＝3.3Hz,1H)4.83(d,J＝6.8Hz,1H)5.23(t,J＝7.9Hz,1H)7.54(dd,J＝7.7,4.6Hz,1H)7.82(dt,J＝7.9,1.8Hz,1H)7.92(d,J＝8.8Hz,1H)8.07(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H)8.53(d,J＝2.0Hz,1H)8.58(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H)8.61(s,1H)8.83(s,1H)。
实施例192
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
N,N-二苄基-2-(((1r,4r)-4-(乙烯基氧基)环己基)氧基)乙烷-1-胺。
向三氟乙酸钯(II)(0.154g,0.464mmol)和红菲咯啉(bathophenanthroline)(0.154g,0.464mmol)在乙基乙烯基醚(27.5mL,278mmol)中的混合物中加入DIPEA(1.621mL,9.28mmol)和(1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己烷-1-醇(实施例105，步骤2)(3.15g,9.28mmol)。将混合物在75℃搅拌3.5h，冷却至室温，并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(80g RediSep柱,60mL/min)纯化，用0至20％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(2.3956g,6.55mmol,70.6％收率)。LC-MS m/z366.4(M+H)+。
步骤2
2-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙烷-1-醇。
向在四氢呋喃(THF)(50mL)中的N,N-二苄基-2-(((1r,4r)-4-(乙烯基氧基)环己基)氧基)乙烷-1-胺(2.35g,6.43mmol)中加入1M BH3在四氢呋喃(THF)中的溶液(9.64mL,9.64mmol)。将混合物在室温搅拌40min。加入5N氢氧化钠(12.86mL,64.3mmol)和30％过氧化氢(13.13mL,129mmol)并将混合物在室温搅拌23h。将混合物用乙酸乙酯(50mL+2x30mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(30mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep柱,40mL/min)纯化，用0至70％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(2.1723g,4.86mmol,76％收率)。LC-MS m/z 384.4(M+H)+。
步骤3
N,N-二苄基-2-(((1r,4r)-4-(2-(2-(乙烯基氧基)乙氧基)乙氧基)环己基)氧基)乙烷-1-胺。
向三氟乙酸钯(II)(0.081g,0.243mmol)和红菲咯啉(bathophenanthroline)(0.081g,0.243mmol)在乙基乙烯基醚(14.39ml,146mmol)中的混合物中加入DIPEA(0.848ml,4.85mmol)和2-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙烷-1-醇(2.17g,4.85mmol)。将混合物在75℃搅拌4h，冷却至室温，过滤，并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep柱,40mL/min)纯化，用0至30％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(1.9085g,3.79mmol,78％收率)。LC-MS m/z 410.1(M+H)+。
步骤4
2-(2-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙烷-1-醇。
向在四氢呋喃(THF)(40mL)中的N,N-二苄基-2-(((1r,4r)-4-(2-(2-(乙烯基氧基)乙氧基)乙氧基)环己基)氧基)乙烷-1-胺(1.9g,3.78mmol)中加入1M BH3在四氢呋喃(THF)中的溶液(5.66mL,5.66mmol)。将混合物在室温搅拌30min。加入5N氢氧化钠(7.55mL,37.8mmol)和30％过氧化氢(7.71mL,76mmol)，并将混合物在室温搅拌19h。将混合物用乙酸乙酯(50mL+2x 30mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(30mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(40g RediSep柱,40mL/min)纯化，用0至80％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(0.9820g,2.297mmol,60.8％收率)。LC-MS m/z 428.4(M+H)+。
步骤5
3-(2-(2-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向2-(2-(((1r,4r)-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙烷-1-醇(970mg,2.269mmol)在二氯甲烷(DCM)(16mL)中的溶液中加入丙烯酸叔丁酯(0.665mL,4.54mmol)、四丁基硫酸氢铵(77mg,0.227mmol)和5N氢氧化钠(0.181mL,0.907mmol)。将混合物在室温搅拌21h并在减压下浓缩。加入水(0.181mL)和二氯甲烷(DCM)(3mL)，将混合物在室温搅拌23h并在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep柱,30mL/min)纯化，用0至35％(15min)和35至80％(10min)乙酸乙酯在庚烷中的阶式梯度洗脱，提供标题化合物(0.2283g,0.534mmol,23.54％收率)。LC-MS m/z 556.6(M+H)+。
步骤6
3-(2-(2-(((1r,4r)-4-(2-氨基乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向3-(2-(2-((反式-4-(2-(二苄基氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(850mg,1.529mmol)在甲醇(30mL)中的溶液中加入10％ Pd/C(163mg,0.153mmol)。将混合物在氢气气氛下在室温搅拌4h。将混合物穿过过滤并将滤液在减压下浓缩，以提供标题化合物(0.5599g,1.491mmol,97％收率)。LC-MS m/z 376.4(M+H)+。
步骤7
3-(2-(2-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向在二氯甲烷(DCM)(10mL)中的3-(2-(2-(((1r,4r)-4-(2-氨基乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(550mg,1.465mmol)中加入(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(323mg,1.465mmol)、DIPEA(0.767mL,4.39mmol)和T3P(50重量％在乙酸乙酯中)(1.308mL,2.197mmol)。将混合物在室温搅拌93h。加入饱和的NaHCO3(5滴)并将混合物在减压下浓缩。通过ISCO色谱法(24g RediSep柱,35mL/min)纯化，用0至55％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供标题化合物(0.9152g,1.381mmol,94％收率)。LC-MS m/z 578.5(M+H)+。
步骤8
3-(2-(2-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸，盐酸盐。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(1.717mL,6.87mmol)加入到在1,4-二氧杂环己烷(2mL)中的3-(2-(2-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(0.910g,1.374mmol)中。将混合物在室温搅拌18h并在减压下浓缩，以提供标题化合物(0.8810g,1.085mmol,79％收率)。LC-MS m/z 522.4(M+H)+。
步骤9
(2S,3S)-N-(2-(((1R,4S)-4-(2-(2-(3-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)环己基)氧基)乙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向在二氯甲烷(DCM)(2mL)中的(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(50mg,0.093mmol)中加入3-(2-(2-(((1S,4r)-4-(2-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)乙氧基)环己基)氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸，盐酸盐(76mg,0.093mmol)、DPIEA(0.097mL,0.558mmol)和HATU(53.1mg,0.140mmol)。将混合物在环境温度搅拌18h。加入水(3滴)并将混合物在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供标题化合物(55.4mg,0.057mmol,61.5％收率)。LC-MS m/z 968.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.05(br d,J＝6.4Hz,3H)1.11-1.17(m,3H)1.17-1.33(m,4H)1.64-1.77(m,3H)1.84-2.01(m,5H)2.05-2.17(m,1H)2.21-2.35(m,5H)2.43-2.57(m,3H)2.66(s,3H)2.68-2.77(m,2H)2.80-2.88(m,1H)3.07(ddd,J＝9.5,8.1,6.8Hz,1H)3.20-3.31(m,3H)3.35-3.60(m,14H)3.66-3.76(m,2H)3.81-3.87(m,1H)4.06(dt,J＝12.6,3.5Hz,1H)4.65(br d,J＝3.4Hz,1H)4.83-4.88(m,1H)5.31(t,J＝8.1Hz,1H)7.54(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.81(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.91(d,J＝8.3Hz,1H)8.07(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.52(d,J＝2.0Hz,1H)8.55-8.62(m,2H)8.84(s,1H)。
实施例193
(2S,3S)-N-(3-(3-(4-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)丙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(3-(3-羟基丙氧基)丙基)氨基甲酸苄酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(20.0mL,80mmol)加入到3-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯(实施例17，步骤1)(3.30g,9.78mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌过夜，并浓缩至干燥。在0℃向残余物在四氢呋喃(THF)(10.0mL)中的溶液中缓慢地加入1M BH3在四氢呋喃(THF)中的溶液(24.45mL,24.45mmol)并在室温搅拌1h。加入饱和的NaHCO3并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(80g硅胶柱,60mL/min)纯化，用0至10％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(2.02g,7.56mmol,77％收率)。LC-MS m/z 268.1(M+H)+。
步骤2
(E)-3-氧代-1-苯基-2,8,12-三氧杂-4-氮杂十六碳-14-烯-16-酸乙酯。
向(3-(3-羟基丙氧基)丙基)氨基甲酸苄酯(2.00g,7.48mmol)、三苯基膦(0.392g,1.496mmol)和乙酸(0.343mL,5.99mmol)在甲苯(30mL)中的溶液中加入丁-2-炔酸乙酯(1.304mL,11.22mmol)。将混合物在110℃搅拌过夜并冷却至室温。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(80g硅胶柱,60mL/min)纯化，用0至50％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为浅橙色油的标题化合物(2.82g,7.43mmol,99％收率)。LC-MS m/z 380.1(M+H)+。
步骤3
4-(3-(3-氨基丙氧基)丙氧基)丁酸乙酯。
在氮气气氛下向(E)-3-氧代-1-苯基-2,8,12-三氧杂-4-氮杂十六碳-14-烯-16-酸乙酯(2.82g,7.43mmol)在乙酸乙酯(30.0mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(0.316g,2.97mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填并在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(1.68g,6.79mmol,91％收率)。LC-MS m/z 248.2(M+H)+。
步骤4
4-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丁酸乙酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(300mg,1.362mmol)在二氯甲烷(DCM)(5.0mL)中的溶液中加入4-(3-(3-氨基丙氧基)丙氧基)丁酸乙酯(337mg,1.362mmol)、HOBt(250mg,1.635mmol)和EDC(392mg,2.043mmol)，随后加入DIPEA(0.714mL,4.09mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(530mg,1.179mmol,87％收率)。LC-MS m/z450.1(M+H)+。
步骤5
4-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丁酸。
向4-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丁酸乙酯(530mg,1.179mmol)在甲醇(8.0mL)和水(2.000mL)中的溶液中加入氢氧化锂一水合物(198mg,4.72mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并用1N HCl将pH调至4。在减压下除去甲醇并将残余物用甲醇在二氯甲烷中的溶液(5％)(5x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩以提供作为浅色蜡的标题化合物(495mg,1.174mmol,100％收率)。LC-MS m/z 422.1(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(3-(3-(4-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-4-氧代丁氧基)丙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
向4-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丁酸(45.8mg,0.109mmol)、(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)和DIPEA(0.079mL,0.453mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中加入EDC(26.0mg,0.136mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTMCSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(49.9mg,0.048mmol,52.7％收率)。LC-MS m/z 993.0(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.90(d,J＝6.4Hz,3H)1.05(d,J＝6.8Hz,3H)1.35-1.48(m,2H)1.51-1.78(m,16H)1.85-1.98(m,1H)1.99-2.20(m,10H)2.31-2.40(m,1H)2.44(dd,J＝16.9,7.6Hz,1H)2.53(br s,1H)2.59(brs,1H)2.65-2.73(m,1H)2.85-2.95(m,1H)2.98-3.18(m,2H)3.25-3.29(m,5H)3.34(t,J＝6.6Hz,4H)3.39-3.48(m,1H)3.49-3.61(m,1H)3.70(br s,1H)3.83-3.96(m,1H)4.45(br d,J＝4.9Hz,1H)4.65(d,J＝6.4Hz,1H)5.03(q,J＝7.8Hz,1H)7.44(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H)7.52(d,J＝6.4Hz,1H)7.68(dt,J＝7.8,2.0Hz,1H)7.89(d,J＝8.3Hz,1H)7.94(br t,J＝5.6Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,1.5Hz,1H)8.47(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H)8.59(s,1H)8.63-8.74(m,2H)8.89(s,1H)。
实施例194
(1r,4R)-N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N4-(3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丁氧基)丙基)环己烷-1,4-二甲酰胺。
步骤1
(1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸甲酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2盐酸盐(117mg,0.218mmol)在二氯甲烷(DCM)(3mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.152mL,1.088mmol)，随后加入(1r,4r)-4-(甲氧基羰基)环己烷-1-甲酸(48.6mg,0.261mmol)和HATU(124mg,0.327mmol)。将混合物在室温搅拌2h并在减压下浓缩以除去二氯甲烷(DCM)。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色固体的标题化合物(105mg,0.163mmol,74.7％收率)。LC-MS m/z 905.8(M+H)+。
步骤2
(3-(4-(3-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酰氨基)丙氧基)丁氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。
将2M HCl在水中的溶液(2mL,4.00mmol)加入(1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酸甲酯(100mg,0.158mmol)中。将混合物在60℃搅拌20h并在减压下浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(3mL)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1.5mL)中。依次加入三乙胺(0.110mL,0.790mmol)、(3-(4-(3-氨基丙氧基)丁氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(65mg,0.214mmol)和HATU(90mg,0.237mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在减压下搅拌以除去二氯甲烷(DCM)。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用50至99％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为白色泡沫状固体的标题化合物(51mg,0.055mmol,34.9％收率)。LC-MS m/z 905.8(M+H)+。
步骤3
(1r,4R)-N1-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)-N4-(3-(4-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丁氧基)丙基)环己烷-1,4-二甲酰胺。
将3M HCl在环戊基甲基醚中的溶液(0.5mL,1.500mmol)加入(3-(4-(3-((1R,4r)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己烷-1-甲酰氨基)丙氧基)丁氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(49mg,0.054mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷(DCM)(2mL)中，并加入三乙胺(0.038mL,0.271mmol)、(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(14.31mg,0.065mmol)和HATU(30.9mg,0.081mmol)。将混合物在室温搅拌2h并浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSHPrep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)的水中的梯度洗脱，并用氨将pH调至10，提供作为灰白色固体的标题化合物(50mg,0.047mmol,87％收率)。LC-MS m/z1007.7(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 0.99-1.06(m,3H)1.12-1.19(m,3H)1.48-1.57(m,4H)1.57-1.62(m,4H)1.65-1.78(m,7H)1.81-2.03(m,5H)2.09-2.23(m,4H)2.25-2.28(m,3H)2.30-2.36(m,1H)2.50-2.59(m,1H)2.64-2.68(m,3H)2.71-2.75(m,2H)2.78-2.88(m,1H)2.96-3.06(m,1H)3.19-3.30(m,4H)3.32-3.34(m,2H)3.35-3.40(m,3H)3.42-3.47(m,4H)3.49-3.54(m,1H)3.58-3.69(m,1H)3.98-4.07(m,1H)4.59-4.68(m,1H)4.79-4.85(m,1H)5.25-5.34(m,1H)7.50-7.56(m,1H)7.77-7.83(m,1H)7.88-7.93(m,1H)8.03-8.10(m,1H)8.50-8.53(m,1H)8.56-8.61(m,2H)8.79-8.82(m,1H)。
实施例195
(2S,3S)-N-(24-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-24-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,3三氟乙酸盐。
步骤1
(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(100mg,0.454mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(5230μL)中的溶液中加入HATU(207mg,0.545mmol)和DIPEA(317μL,1.816mmol)，随后加入(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酸叔丁酯(168mg,0.499mmol)。将混合物在室温搅拌并在减压下浓缩。通过MDAP色谱法(XBridgeTM柱)纯化，用乙腈在含有碳酸铵调节剂的水中的溶液洗脱，提供作为黄色油的标题化合物(238.8mg,0.341mmol,75％收率)。LC-MS m/z 539.1(M+H)+。
步骤2
(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2三氟乙酸盐。
将TFA(997μL,12.95mmol)加入(1-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-基)-1-氧代-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(238.8mg,0.443mmol)在二氯甲烷(DCM)(997μL)中的溶液中。将混合物在室温搅拌并与二氯甲烷(DCM)(3x)一起共沸以提供作为黄色油的标题化合物(586mg,0.369mmol,83％收率)。LC-MSm/z 439.2(M+H)+。
步骤3
(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐。
将TFA(1422μL,18.46mmol)加入到((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(695mg,1.231mmol)中。将混合物在室温搅拌1.5h并在减压下浓缩。将残余物在高真空下干燥以提供作为固体的标题化合物(1000mg,1.444mmol,117％收率)。LC-MS m/z 465.2(M+H)+。
步骤4
9-(甲苯磺酰氧基)壬酸。
向9-羟基壬酸(318mg,1.825mmol)在二氯甲烷(DCM)(15mL)中的混合物中加入4-甲基苯磺酰氯(348mg,1.825mmol)、吡啶(0.177mL,2.190mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(22.30mg,0.183mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并在二氯甲烷(DCM)和0.5N HCl之间分配。将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至520％甲醇/二氯甲烷(DCM)(20/80)在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(115mg,0.350mmol,19.19％收率)。LC-MS m/z 329.0(M+H)+。
步骤5
4-甲基苯磺酸9-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-9-氧代壬酯。
向(S)-1-((1S,2R,4R)-2-氨基-4-(异丙基(甲基)氨基)环己基)-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-2-酮,2三氟乙酸盐(154mg,0.222mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物中加入三乙胺(0.248mL,1.779mmol)，并将混合物在室温搅拌30min。加入9-(甲苯磺酰氧基)壬酸(73.0mg,0.222mmol)和HATU(101mg,0.267mmol)在二氯甲烷(DCM)(1mL)中的混合物并将混合物在室温搅拌15min。将混合物在二氯甲烷(DCM)和饱和的NaHCO3之间分配并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过色谱法(12g RediSep Rf柱,30mL/min)纯化，用0至50％甲醇/二氯甲烷(DCM)(80/20)在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为淡黄色油的标题化合物(120mg,0.155mmol,69.6％收率)。LC-MS m/z 775.2(M+H)+。
步骤6
(2S,3S)-N-(24-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-24-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,3三氟乙酸盐。
向4-甲基苯磺酸9-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨基)-9-氧代壬酯(40mg,0.052mmol)和(2S,3S)-N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺,2三氟乙酸盐(34.4mg,0.052mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)中的混合物中加入碳酸钾(49.9mg,0.361mmol)和碘化钾(10.28mg,0.062mmol)。将混合物在室温搅拌1h并在50℃搅拌2h。将混合物在二氯甲烷(DCM)和水之间分配并将水相用二氯甲烷(DCM)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μm OBD柱,40mL/min)纯化，用15至55％乙腈在水中的梯度(二者都含有三氟乙酸(0.1％))洗脱，提供标题化合物(6.4mg,4.62μmol,8.08％收率)。LC-MSm/z 1042.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.20-1.39(m,13H)1.45(d,J＝6.3Hz,3H)1.56(br d,J＝6.6Hz,2H)1.64-1.72(m,2H)2.12-2.27(m,5H)2.43-2.50(m,1H)2.68(s,2H)2.71(s,3H)2.83(s,3H)3.00-3.11(m,3H)3.22-3.32(m,3H)3.39(t,J＝5.3Hz,2H)3.50-3.55(m,2H)3.60-3.69(m,13H)3.72-4.01(m,5H)4.17-4.31(m,1H)4.38(br s,1H)4.94-5.02(m,2H)5.65(t,J＝9.6Hz,1H)7.91-7.95(m,1H)8.02(d,J＝8.9Hz,1H)8.29-8.37(m,2H)8.77-8.82(m,2H)8.91(s,1H)9.05(s,1H)。
用与在实施例195中描述的程序类似的程序制备下述化合物：
实施例197
(2S,3S)-N-(3-(3-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤1
(3-(3-羟基丙氧基)丙基)氨基甲酸苄酯。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(40.0mL,160mmol)加入3-(3-(((苄氧基)羰基)氨基)丙氧基)丙酸叔丁酯(实施例17，步骤1)(5.00g,14.82mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌5h，并浓缩至干燥。将残余物溶解在四氢呋喃(THF)(10.0mL)中，冷却至0℃并缓慢地加入1M BH3在四氢呋喃(THF)中的溶液(44.5mL,44.5mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(80g硅胶柱,60mL/min)纯化，用0至100％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(1.1g,4.11mmol,27.8％收率)。LC-MS m/z 268.1(M+H)+。
步骤23-氧代-1-苯基-2,8,12-三氧杂-4-氮杂十五烷-15-酸叔丁酯。
向(3-(3-羟基丙氧基)丙基)氨基甲酸苄酯(1.10g,4.11mmol)和丙烯酸叔丁酯(0.791g,6.17mmol)在四氢呋喃(THF)(30.0mL)中的溶液中加入60％(重量/重量)的氢氧化钾(0.231g,4.11mmol)在水(0.22mL)中的溶液。将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(80g硅胶柱,60mL/min)纯化，用0至50％乙酸乙酯在庚烷中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(1.55g,3.92mmol,95％收率)。LC-MS m/z396.2(M+H)+。
步骤3
3-(3-(3-氨基丙氧基)丙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3-氧代-1-苯基-2,8,12-三氧杂-4-氮杂十五烷-15-酸叔丁酯(1.55g,3.92mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液中加入10％Pd-C,Degussa型(0.167g,1.568mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填并在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(1.00g,3.83mmol,98％收率)。LC-MS m/z 262.2(M+H)+。
步骤4
3-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(300mg,1.362mmol)在二氯甲烷(DCM)(5.0mL)中的溶液中加入3-(3-(3-氨基丙氧基)丙氧基)丙酸叔丁酯(356mg,1.362mmol)、HOBt(250mg,1.635mmol)、EDC(392mg,2.043mmol)，随后加入DIPEA(0.714mL,4.09mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(532mg,1.148mmol,84％收率)。LC-MS m/z 464.1(M+H)+。
步骤5
(2S,3S)-N-(3-(3-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)丙氧基)丙基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)加入3-(3-(3-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)丙氧基)丙氧基)丙酸叔丁酯(58.8mg,0.127mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌1h，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入顺式-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)和DIPEA(0.079mL,0.453mmol)，随后加入EDC(26.0mg,0.136mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C18 5μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(52.4mg,0.051mmol,56.1％收率)。LC-MS m/z 979.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.89(s,1H),8.69(d,J＝7.8Hz,1H),8.62-8.68(m,1H),8.59(s,1H),8.56(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H),8.47(d,J＝2.0Hz,1H),8.06(dd,J＝8.8,1.5Hz,1H),7.94(t,J＝5.4Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.67(dt,J＝8.1,2.1Hz,1H),7.59(d,J＝6.8Hz,1H),7.44(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H),5.03(q,J＝8.0Hz,1H),4.65(d,J＝6.4Hz,1H),4.43(br d,J＝4.4Hz,1H),3.85-3.96(m,1H),3.67-3.77(m,1H),3.47-3.61(m,3H),3.42(td,J＝8.7,3.7Hz,1H),3.32-3.37(m,3H),3.21-3.29(m,4H),2.99-3.15(m,2H),2.86-2.96(m,1H),2.65-2.75(m,2H),2.59(m,1H),2.53-2.54(m,2H),2.41-2.48(m,1H),2.32-2.40(m,1H),2.26(t,J＝6.6Hz,2H),2.15(s,3H),1.87-2.14(m,5H),1.50-1.78(m,14H),1.37-1.49(m,2H),1.05(d,J＝6.4Hz,3H),0.90(d,J＝6.4Hz,3H)。
实施例198
(2S,3S)-N-(5-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
步骤13,9-二氧代-1-苯基-2,13-二氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯。
向5-(((苄氧基)羰基)氨基)戊酸(494mg,1.966mmol)、3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(实施例167，步骤2)(310mg,1.638mmol)、DIPEA(1.430mL,8.19mmol)和HOBt(301mg,1.966mmol)在二氯甲烷(DCM)(4.0mL)中的混合物中加入EDC(471mg,2.457mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为无色油的标题化合物(588mg,1.392mmol,85％收率)。LC-MS m/z 423.2(M+H)+。
步骤23-(2-(5-氨基戊烷酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
在氮气气氛下向3,9-二氧代-1-苯基-2,13-二氧杂-4,10-二氮杂十六烷-16-酸叔丁酯(585mg,1.385mmol)在乙酸乙酯(5.0mL)中的溶液中加入10％ Pd-C,Degussa型(14.73mg,0.138mmol)。将混合物抽真空并用氢气(3x)回填，并在氢气气球气氛下搅拌过夜。将混合物穿过过滤并将滤液浓缩以提供作为无色油的标题化合物(375mg,1.300mmol,94％收率)。LC-MS m/z 289.2(M+H)+。
步骤3
3-(2-(5-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)戊烷酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯。
向(2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酸(230mg,1.044mmol)在二氯甲烷(DCM)(10.0mL)中的溶液中加入3-(2-(5-氨基戊烷酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(361mg,1.253mmol)、HOBt(192mg,1.253mmol)和EDC(300mg,1.567mmol)，随后加入DIPEA(0.912mL,5.22mmol)，并将混合物搅拌过夜。加入水并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过Rf色谱法(40g硅胶柱,40mL/min)纯化，用0至20％的甲醇在二氯甲烷(DCM)中的梯度洗脱，提供作为浅色蜡的标题化合物(675mg,1.788mmol,98％收率)。LC-MSm/z 378.3(M+H)+。
步骤4
(2S,3S)-N-(5-((2-(3-(((1S,4s)-4-(((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)氨甲酰基)环己基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基)-5-氧代戊基)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰胺。
将4M HCl在1,4-二氧杂环己烷中的溶液(4.0mL,16.00mmol)加入3-(2-(5-((2S,3S)-1-甲基-5-氧代-2-(吡啶-3-基)吡咯烷-3-甲酰氨基)戊烷酰氨基)乙氧基)丙酸叔丁酯(62.2mg,0.127mmol)在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的溶液中。将混合物搅拌1小时，并浓缩至干燥。向在二氯甲烷(DCM)(2.0mL)中的残余物中加入(1s,4S)-4-氨基-N-((1R,2S,5R)-5-(异丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-((6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基)氨基)吡咯烷-1-基)环己基)环己烷-1-甲酰胺,2盐酸盐(60mg,0.091mmol)、HOBt(16.64mg,0.109mmol)和DIPEA(0.079mL,0.453mmol)，随后加入EDC(26.0mg,0.136mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3并将混合物用二氯甲烷(DCM)(3x)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩。通过MDAP色谱法(XSelectTM CSH Prep C185μmOBD柱,40mL/min)纯化，用30至85％乙腈在含有碳酸氢铵(10mM)和氢氧化铵(0.075％)的水中的梯度洗脱，提供作为灰白色固体的标题化合物(47.1mg,0.044mmol,49.1％收率)。LC-MS m/z 1006.6(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.90(d,J＝6.4Hz,3H)1.05(d,J＝6.4Hz,3H)1.26-1.36(m,2H)1.37-1.49(m,4H)1.50-1.64(m,6H)1.64-1.78(m,3H)1.94(br dd,J＝12.2,7.3Hz,1H)2.03(br t,J＝7.1Hz,3H)2.06-2.18(m,6H)2.29(t,J＝6.6Hz,2H)2.32-2.39(m,1H)2.40-2.48(m,1H)2.52(br s,2H)2.59(br s,1H)2.65-2.75(m,1H)2.85-2.94(m,1H)2.95-3.09(m,2H)3.15(q,J＝5.9Hz,2H)3.22-3.30(m,1H)3.33(br d,J＝5.9Hz,3H)3.39-3.47(m,1H)3.49-3.60(m,3H)3.71(br s,1H)3.82-3.99(m,1H)4.36-4.50(m,1H)4.64(d,J＝6.4Hz,1H)5.03(q,J＝7.8Hz,1H)7.44(dd,J＝7.8,5.4Hz,1H)7.62(d,J＝6.4Hz,1H)7.67(dt,J＝7.9,2.1Hz,1H)7.75(t,J＝5.6Hz,1H)7.89(d,J＝8.8Hz,1H)7.95(br t,J＝5.6Hz,1H)8.06(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H)8.47(d,J＝2.0Hz,1H)8.56(dd,J＝4.6,1.7Hz,1H)8.58(s,1H)8.61-8.67(m,1H)8.70(br d,J＝7.8Hz,1H)8.89(s,1H)。
生物学测定
在如下文更详细描述的各种生物学测定中试验了实施例化合物1-198，它们是具有CCR2结合部分的式(I)的化合物。
实施例199:依赖抗体的细胞毒性报告物测定
使用下述四种测定组分进行依赖抗体的细胞毒性报告物测定：(i)靶向CCR2的式(I)的ARM化合物(浓度范围为1pM至10μM)，(ii)具有SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ IDNO:12的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有含有DE突变(S239D/I332E)的人IgG1 Fc结构域的兔可变区)(浓度范围为0.01μg/mL至200μg/mL)；(iii)靶细胞:被工程改造成过表达人CCR2的CHOK1细胞(通常1000-20,000个细胞/孔)，和(iv)报道细胞：被工程改造成表达FcγRIIIa的Jurkat细胞，其具有在NFAT启动子控制下的报道基因萤光素酶(通常3000-75,000个细胞/孔)。在384-孔组织培养物处理过的平板中以20μL的终体积组合试剂。将所有四种测定组分一起温育约12-18小时。此后，将BioGlo检测试剂(Promega)加入孔中以裂解细胞并为萤光素酶报告蛋白提供底物。在微量培养板读数器上测量发光信号，并通过将试验孔的信号除以当不添加式(I)的异二价化合物时获得的信号来计算信号:背景。使用GraphpadPrism软件，特别是非线性回归曲线拟合(Y＝底+(顶-底)/(1+10^((Log EC50-X)*山坡)))，完成EC50计算。
在上述测定中在一个或多个实验运行中试验了本发明的式(I)的ARM化合物的ADCC活性，并且结果显示在下表3中。本发明的式(I)的化合物的效能以pEC50值报告。pEC50值是EC50值的负对数，其中EC50值是以摩尔(M)测量的半数最大有效浓度。对于在超过一个实验运行中试验的化合物，pEC50值以平均值报告。
实施例200:PBMC离体耗竭测定
开发了人PBMC(外周血单个核细胞)单核细胞耗竭流式细胞计量术测定以在384-孔平板形式中筛选化合物。该测定包含了内源性自然杀伤细胞以耗竭内源性靶单核细胞。
为了在人PBMC单核细胞耗竭流式细胞计量术测定中筛选化合物，通过将式(I)的ARM化合物逐行连续稀释四倍到384-孔平板中，由纯DMSO中的1mM储备溶液制成11-点剂量-应答曲线。然后将这些连续稀释的化合物以100nL/孔压印到平底聚丙烯384-孔平板(Greiner Bio-One)中。将50微升30μg/mL的具有SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ ID NO:12的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有含有DE突变(S239D/I332E)的人IgG1 Fc结构域的兔可变区)(其已经在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％ Glutamax(Gibco)和1％丙酮酸钠(Corning)的测定培养基(RPMI 1640(Gibco)中稀释)加入平板的孔中。将平板以500rpm(每分钟转数)离心1分钟，并然后在室温摇动5分钟。将平板在37℃/5％ CO2下温育15分钟。
将冷冻的PBMC细胞(HemaCare BioResearch)解冻并以1,200rpm离心4分钟。将细胞在测定培养基中稀释至2x 106个细胞/mL的细胞密度。将五十微升稀释的细胞添加至平板的孔中。将平板以500rpm离心1分钟，并在37℃/5％ CO2下温育18-24小时。
温育18-24小时以后，将在测定培养基中稀释的2μL的6.25μg人FC阻断剂(BDPharmingen)加入平板的孔中。将平板以500rpm离心1分钟，并然后在室温温育15分钟。将已经在测定培养基中稀释的5微升750nM螺旋NP NIR(Biolegend)加入平板的孔中。然后将含有1/5稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗-CD45抗体(Beckman Coulter)、PC7标记的抗-CD14抗体(Beckman Coulter)和藻红蛋白(PE)抗-CD4抗体(Beckman Coulter)的9微升抗体混合液加入平板的孔中。将平板以500rpm离心1分钟，并在4-8℃温育30分钟。将来自平板的样品在BD FACS Canto II流式细胞计上运行，并使用FlowJo软件分析数据。
在上述测定中在一个或多个实验运行中试验了本发明的式(I)的ARM化合物的耗竭单核细胞的能力，结果显示在下表3中。本发明的化合物的效能以pEC50值报告。pEC50值是EC50值的负对数，其中EC50值是以摩尔(M)测量的半数最大有效浓度。对于在超过一个实验运行中试验的化合物，将pEC50值报告为平均值或测量的单独值。
表3：ADCC报告物测定(实施例199)和PBMC离体耗竭测定(实施例200)的结果
1n.d.＝未测定
实施例201：体内耗竭测定
将含有式(I)的化合物的PBS溶液静脉内给药给人CCR2(hCCR2)敲入小鼠(C57背景)以测量外周血中CCR2表达细胞的耗竭。还分析了来自IV给药的小鼠的外周血以确定式(I)的ARM化合物的PK性能。
储备溶液制备：在DMSO中制备20mg/mL和100mg/mL的式(I)的化合物的储备溶液，分别用于PK/PD和剂量耐受性研究。将储备溶液储存于-20℃直至进一步使用。
制剂制备：在实验当天，将式(I)的化合物的储备溶液从-20℃储存取出并在室温下解冻。如果需要的话，将具有SEQ ID NO:13的重链序列和SEQ ID NO:14的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有小鼠IgG2aFc结构域的兔可变区序列)从-80℃储存取出并在室温下解冻。将抗体小瓶在解冻后立即转移进湿冰中。根据实验要求，将式(I)的化合物进一步稀释在DMSO中。
制剂组成：制剂组成为盐水:DMSO:PBS。根据需要的量添加盐水，并然后添加在DMSO中制备的式(I)的化合物的储备溶液，随后添加在PBS中的抗体。在施用给小鼠之前，将制剂在室温下温育30分钟。使用在最终制剂中1至2％(v/v)的DMSO。
施用给动物：将抗体和式(I)的化合物的溶液制剂注射(弹丸式注射)至受约束的小鼠的右/左侧尾静脉中。给动物给药0.1毫克/千克(mpk)的式(I)的化合物和10mpk的抗-可替宁抗体。
采集血液进行PK：在轻度异氟烷麻醉下，通过眼眶后放血在施用后0.25小时、2小时和4小时的时间点采集血液(50μL/时间点)。
在实验结束时(48小时)的末期放血：在深度异氟烷麻醉下，通过眼眶后放血，从每只小鼠收集大约250μL血液在K2EDTA管中和大约250μL血液在SST(血清分离管)中。在放血后，通过颈椎脱位处死每只小鼠。如下确定在终止时的血液分布：
·对于PK：将50μL的K2EDTA血液转移至另一管进行PK
·流式细胞计量术：将剩余血液(约200μL)用于流式细胞计量术分析。
·对于血清收集：将血清分离管(BD)在4℃、5000rpm离心15分钟。分离出大约100μL血清并在-80℃储存以供进一步使用。
·血液药物浓度：分析在不同时间点(0.25小时、2小时、24和48小时)收集的样品以确定血液药物浓度。
流式细胞计量术分析：
通过流式细胞计量术测定外周血中的CCR2耗竭。简而言之，在研究结束时从所有动物收集外周血并进行处理。使用1X RBC裂解缓冲液裂解血液样品，并将得到的细胞沉淀物在FACS缓冲液(含有5％FBS的HBSS)中洗涤两次。使用来自Biolegend的小鼠FC阻断剂(Trustain，抗-小鼠CD16/32，目录号：101319)对细胞进行Fc阻断，以阻断非特异性结合，然后对免疫标志物(CD45、CD3、CD11b、Ly6C、人CCR2)进行表面染色。在冰中进行表面染色30分钟，并将细胞洗涤两次以除去未结合的抗体。将细胞用7AAD染色以确定生存力并在BDFACSVerse流式细胞计上采集。在实验中包括适当的FMO对照和单色对照，分别用于门控和补偿。
CCR2+单核细胞被门控为CD11b+Ly6C+Hi、中和低群体，并且评价治疗诱导的CD11b+Ly6c+Hi细胞(即具有高CCR2表达的细胞)的减少。确定不同治疗组的CD11b+Ly6c+Hi细胞和CCR2表达的耗竭百分比。结果显示在下表4中，并报告为CCR2表达细胞的耗竭百分比(％)。
血液药物浓度分析：
通过在Syngene开发的基于LC-MS/MS的生物分析方法测定在血液样品中的药物浓度。使用来自美国SCIEX的与Exion UHPLC系统偶联的Q-Trap、API-5500LC-MS/MS系统(采用正极性电喷射电离技术以多反应监测模式运行)对样品进行分析。使用流动相在Milli-Q水中的10mM乙酸铵作为A相并使用0.1％甲酸的乙腈溶液作为B相，在Synergi Polar,75×2.0mm,4μ柱上解析分析物和内标峰。如下进行梯度洗脱：在0.0min用初始组成95％ A相，保持0.2分钟，在1.0分钟之前升至5％，在接下来0.5分钟中保持相同，并在1.6分钟之前回到95％。总运行时间为2分钟。
通过用DMSO连续稀释20mg/mL储备溶液来制备校正曲线和质量控制标准的工作稀释液。全血校正曲线的加标浓度(spiked concentration)范围为1ng/mL至1000ng/mL。在乙腈中制备内标的工作溶液(维拉帕米，25ng/mL)。将10μL研究样品和校正曲线、质量控制和空白全血样品等分到96深孔平板中进行处理。将10μL的Milli-Q水加入所有样品中，并短暂涡旋以引发完全溶血。将10μL的20mM二硫苏糖醇(DTT)加入所有样品中，并在37℃温育30分钟。DTT的添加增强了式(I)的ARM化合物从生物基质中的回收。将300μL工作内标溶液加入除总空白和洗涤样品(其中添加300μL乙腈)之外的所有样品中。将所有样品涡旋混合5分钟，然后在4℃以4000rpm离心10分钟。将上清液转移至负载平板并进样3μL至LC-MS/MS系统进行分析。结果显示在下表4中并报告为给药后48小时的化合物暴露。
表4：体内耗竭测定的结果-CCR2表达细胞的％耗竭和在48小时暴露后式(I)的ARM化合物的PK分析
1n.d.＝未测定
实施例202:通过表面等离子体共振(SPR)测量的抗-可替宁抗体与式(I)的ARM化合物的结合
使用Biacore T200将具有SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ ID NO:12的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有含有DE突变(S239D/I332E)的人IgG1 Fc结构域的兔可变区)捕获在蛋白A传感器芯片(Cytiva)的一个或多个流动池上，同时保留流动池1作为参考。在捕获后，包括3000秒等待步骤，以减少在化合物分析期间的漂移。然后以100μL/min进样式(I)的ARM化合物，结合和解离时间分别为200和2000秒。整个实验在37℃运行，运行缓冲液含有10mMHEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.005％ P20和1％ DMSO。使用3倍5点稀释系列以200nM的最高浓度滴定式(I)的ARM化合物，并运行相应的5次进样缓冲液循环以进行空白扣除。通过从含有抗体的流动池的应答中减去参考流动池的应答并随后减去参考的空白传感图来双重参考数据。在化合物分析后，以30μL/min的流速进样30秒pH 1.5甘氨酸，使表面再生，然后重新捕获抗体。使用Biacore T200控制软件运行实验并使用Biacore T200评价软件进行评价。用1:1动力学结合模型拟合曲线以获得kon(1/Ms)、koff(1/s)、Kd(M)(确定为koff/kon)和停留时间(确定为1/koff(s))。
在上述测定中，在一个或多个实验运行中试验了抗-可替宁抗体与本发明的式(I)的ARM化合物的结合，结果显示在下表5中。将亲和力报告为pKd值。pKd值是Kd值的负对数，其中Kd值是以摩尔(M)为单位的测量的解离常数，如上所述。对于在超过一个实验运行中试验的化合物，将pKd值报告为平均值。
表5：通过SPR测量的抗-可替宁抗体与式(I)的ARM化合物的结合
使用Biacore 8k将具有SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:10的轻链序列(人源化版本)或SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ ID NO:12的轻链序列(兔版本)的抗-可替宁抗体通过Fc结构域捕获至CM5传感器芯片的流动池2上的蛋白A或A/G表面。在本实验中使用的两种抗体具有含有DE突变(S239D/I332E)的人IgG1 Fc结构域。
在抗体捕获后，包括1500秒的等待步骤，以减少结合步骤中的漂移。然后使式(I)的ARM化合物以250nM至4μM的不同最高浓度流过捕获的抗体(最高浓度值参见下表6)。在5次稀释中将最高浓度稀释4倍(包括0nM化合物循环以空白减去数据)。式(I)的ARM化合物的结合和解离时间在实验之间变化如下并示于下表6中：参考1-以20μl/min结合600秒并解离1200秒；参考2-以30μl/min结合240秒并解离300秒；参考3-以30μl/min结合360秒并解离600秒。使用50mM NaOH再生与蛋白A或A/G表面结合的抗-可替宁抗体。使用Biacore8K控制软件在25℃、pH 7.4下使用HBS-EP+缓冲液进行实验，并使用Biacore Insight评价软件进行评价。利用局部Rmax和局部漂移设置，按照软件固有的1:1动力学拟合来拟合曲线。
在上述测定中，在一个或多个实验运行中试验了抗-可替宁抗体与本发明的式(I)的ARM化合物的结合，结果显示在下表6中。将亲和力报告为pKd值。pKd值是Kd值的负对数，其中Kd值是以摩尔(M)为单位的测量的解离常数，如上所述。对于在超过一个实验运行中试验的化合物，将pKd值报告为平均值。
表6:通过SPR测量的抗-可替宁抗体与式(I)的ARM化合物的结合
实施例203：烟碱乙酰胆碱受体拮抗作用测定
使用含有胰蛋白酶的缓冲液洗涤并解离表达人α1烟碱乙酰胆碱(nACh)受体(nAChR)的细胞。然后洗涤细胞并以3-5百万个细胞/mL的密度接种并允许生长3天。然后，将60-80μL细胞加入平板中并与10μM或100μM的最高浓度的式(I)的ARM化合物的剂量应答一起温育。然后通过加入乙酰胆碱(ACh)刺激受体，并通过IONFlux自动化的膜片箝系统监测受体的活化。利用IonFlux Data Analyzer软件执行泄漏扣除并测量(最小)峰值电流幅度。然后将这些数据导出到Excel。
数据处理：(1)从对照、试验物品和对照+试验物品的相应电流幅度值减去在单独陷阱(trap)/图案中仅应用媒介物所记录的电流值。(2)将对照应答计算为总共3次单独ACh(10mM)应用中第3次的平均应答的百分比。在极少数情况下，如果第3次ACh应答因技术误差而变得模糊，则第2次和/或第1次ACh(10mM)应用被视为对照。然后使用在每个试验物品浓度存在下产生的峰值电流幅度来计算与对照应答(单独的10mMACh)相比的％抑制。这些估计值进一步针对媒介物应答进行了校正，并通过时间匹配的对照应答(单独的10mMACh)进行归一化来进行校正。然后将校正过的百分比与GraphPad Prism 6(或随后的版本)中的非线性函数进行拟合以确定IC50。
排除标准：(i)任何具有差记录质量的n，(ii)对照电流幅度<500pA或(iii)显著离群值，通过Grubbs氏试验确定。
在上述测定中，在一个或多个实验运行中试验了本发明的式(I)的ARM化合物对nAChR的拮抗作用，结果显示在下表7中。将本发明的式(I)的化合物的拮抗活性报告为IC50值(半数最大抑制浓度)和在试验的式(I)的化合物的最高浓度下观察到的最大拮抗百分比，如表7所示。对于在超过一个实验运行中试验的化合物，将IC50值报告为平均值。
表7:nAChR拮抗作用测定的结果
实施例204:荷瘤动物的给药和分析
将MC38细胞皮下注射到人CCR2敲入C57小鼠的胁腹中。使用数字游标卡尺测量肿瘤体积，并测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝LX W2/2，其中，L＝长度(mm)；W＝宽度(mm)。将抗-可替宁抗体(含有具有SEQ ID NO:13的重链序列和SEQ ID NO:14的轻链序列的小鼠IgG2a Fc结构域的兔可变区序列)、以及式(I)的ARM化合物(实施例36)在盐水中稀释并静脉内施用以产生试验的最终浓度。以10毫克/千克(mpk)、5mpk、2.5mpk或1.25mpk的浓度试验抗体；并以0.2mpk、0.1mpk、0.05mpk和0.025mpk试验式(I)的化合物。在所试验的抗体/式(I)的化合物的不同浓度下的肿瘤体积显示于图1A中。
基本上如上面实施例201中所述进行从荷瘤小鼠收集的外周血的流式细胞计量术和血液药物浓度分析。对于肿瘤的流式细胞计量术分析，按照无菌技术在层流净化罩中进行肿瘤分离程序。在程序过程中使用的所有解剖工具经过消毒。所述工具在使用期间保存在70％乙醇中。使用二氧化碳窒息对带有皮下肿瘤的小鼠进行人道安乐死，用70％乙醇喷洒，并然后用Betadine擦拭以除去松散的皮毛。用镊子提起肿瘤部位的皮肤并用解剖剪刀剪下以暴露皮下肿瘤。使用小解剖剪刀切割并移除暴露的肿瘤。将肿瘤样品置于充分填充RPMI 1640无血清培养基的50mL falcon管中，并通过流式细胞计量术进行分析。以与外周血样品相同的方式进行用于流式细胞计量术分析的抗体染色。结果表明，与单独的ARM化合物处理相比，在用ARM化合物+抗体处理后，CD8+T细胞的百分比增加，并且单核细胞骨髓来源的抑制细胞(mMDSC)的百分比减少(图10A)。
存活分析—当肿瘤达到>1500mm3或可见肿瘤溃疡形成时，对动物进行人道安乐死。用单独式(I)的化合物治疗或在抗-可替宁抗体存在下治疗的动物的存活百分比显示于图10B中。
实施例205：离体耗竭和T-细胞扩增测定
由GSK血液收集装置提供从健康供体新鲜收集的人血液。将Lymphoprep(15mL)添加至Accuspin管中并在800g离心1分钟。通过添加室温磷酸盐缓冲盐水(PBS)将室温血液(20mL)稀释至35mL的最终体积，并将其分层在15mL离心的Lymphoprep溶液的顶部。将试管在800g离心20分钟。吸出顶层(向下至PBMC界面)。将PBMC界面倒入50mL Falcon管中。添加PBS至50mL的最终体积，并将样品在室温以250g离心10分钟。倒出上清液，并将沉淀物重新悬浮于PBS中，并在室温以300g离心6分钟。倒出上清液，将细胞沉淀物重新悬浮于PBS中，终浓度为100万个细胞/mL。
通过每1mL细胞添加1μL的0.25mM Cell Trace CFSE染料，用CFSE标记细胞，并在37℃温育20分钟。用10mL的RPMI+10％低IgG FBS洗涤细胞。在RPMI+10％低IgG FBS中将细胞重新悬浮至400万个细胞/mL。
在384孔平板中以100μL终体积进行靶细胞的耗竭。添加细胞至终浓度为1x106个细胞/mL。添加抗-可替宁抗体(具有含有DE突变(S239D/I332E)的人IgG1 Fc结构域的兔可变区，其具有SEQ ID NO:11的重链序列和SEQ ID NO:12的轻链序列)至2.5μg/mL的终浓度，并添加实施例36的化合物至大约16nM的终浓度，并以0.25x106珠子/mL的浓度添加CD3/CD28珠子。将样品在37℃温育过夜(约16小时)。
在耗竭步骤之后，对样品进行染色用于流式细胞计量术。将样品转移至96-孔圆底聚丙烯平板。然后，将100μL的稀释的(1:1000)活/死染料加入每个样品中。将平板在室温在黑暗中温育15分钟。然后，添加100μL的HANK氏缓冲液+1％ BSA。将平板以12000rpm离心3分钟，并弃去上清液。将Fc阻滞剂(BD)与Hanks缓冲液+1％ BSA和抗体溶液一起添加。组1:(PerCP-Cy5.5-CD4-目录号560650,CD14-PC7-目录号A22331,CD45-BV421-目录号563879)组2:(PerCP-Cy5.5-CD4-目录号560650,CD45-BV421-目录号563879,PE-CD8-目录号555635)。在冰上进行染色20分钟。将细胞用200μL的HANK氏缓冲液+1％ BSA洗涤，并重新悬浮在100μL的HANK氏缓冲液+1％BSA中。在BD FACS Fortessa上分析样品。通过分析CD45+/CD8+细胞群体中的CFSE染色来计算CD8+T细胞群体的分裂百分比。
结果显示在图8A和8B中。结果表明，在抗-可替宁抗体存在的情况下，在用ARM化合物处理后，CCR2+细胞被耗竭。此外，在3个供体样品中的2个中观察到CD8+T细胞扩增，其中观察到CCR2+细胞的强烈耗竭。
实施例206：小鼠替代性体内给药策略的探究
探索了静脉内给药抗-可替宁抗体和小分子ARM化合物的预混合溶液的替代策略。在人CCR2敲入小鼠(C57背景)和具有SEQ ID NO:13的重链序列和SEQ ID NO:14的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有小鼠IgG2a Fc结构域的兔可变区序列)中进行实验。结果表明，多种替代给药策略可以用于施用抗-可替宁抗体和小分子ARM化合物。
在某些情况下，探索了其中如实施例204的体内实验中所述静脉内施用抗-可替宁抗体并且在自抗体给药后延迟2-小时后皮下施用式(I)的ARM化合物(实施例1)的给药策略。将ARM化合物皮下施用到小鼠肩胛间的松弛皮肤中。使用带有26G针头的BD注射器(1mL)进行皮下施用。将针头插入由拇指和食指所撑起的肩胛间区域的皮下，并注射ARM化合物。根据该给药策略(1:1、2:1、4:1、8:1、8:0)试验了小分子ARM化合物与抗-可替宁抗体的各种摩尔比。根据上述实施例201中描述的方法测定在给药后不同时间点的小分子ARM化合物的血液浓度，结果显示在图5中。
在其它情况下，静脉内施用抗-可替宁抗体(10mpk)，并在短暂延迟后(在抗体施用后<30分钟)通过经口管饲法以不同浓度(2mpk、10mpk、50mpk)施用小分子ARM化合物(实施例36的化合物)。口服给药利用球尖22G不锈钢针头，并且缓慢施用ARM化合物。测量在给药后不同时间点的小分子ARM化合物的血液浓度，并根据上文实施例201中描述的方法通过流式细胞计量术测定CCR2+细胞的耗竭百分比。结果显示在图6A和6B中。
在其它情况下，静脉内施用抗-可替宁抗体，并在延迟30分钟、2小时或24小时后静脉内施用小分子ARM化合物(实施例1)。以10mpk的浓度施用抗体，并以0.2mpk的浓度施用ARM化合物。如实施例201中所述测量在给药后不同时间点的小分子ARM化合物的血液浓度。在某些情况下，使用流式细胞计量术来确定治疗对外周血中CD11B+/Ly6cHi细胞水平的影响，也如实施例201中所述。结果显示在图3A、3B和4中。特别地，图4证实，以2:1的摩尔比给药小分子ARM化合物和抗-可替宁抗体足以使抗-可替宁抗体饱和(显示了抗体和小分子ARM以在小分子ARM和抗体给药之间间隔2小时依次施用的数据)。
实施例207：食蟹猴给药研究-ARM化合物PK的分析和靶标表达细胞的耗竭
具有SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:10的轻链序列的抗-可替宁抗体作为125.86mg/mL储备溶液供给，所述储备溶液在20mM组氨酸、180mM海藻糖、40mM精氨酸、8mM甲硫氨酸、0.05mM EDTA、0.02％ PS80[pH 5.89]中制备并稀释(稀释的试验制剂的pH范围为5.77至5.91)，并以2mL/kg的剂量体积施用给猴。将实施例1的ARM化合物配制为在0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)[pH 7.37]中的2％ Cavitron中的溶液(试验制剂的pH范围为7.26至7.43)，并以2mL/kg的剂量体积施用给猴。治疗组和给药计划如下表8所示，并且在下文中称为组1、2、3和4。
表8:食蟹猴研究的给药方案
在第1天，在第2至4组中的所有猴通过缓慢IV弹丸式注射(使用临时IV导管经由尾静脉和/或隐静脉施用约2分钟)给药实施例1的小分子ARM化合物，然后在大约5分钟后给药抗-可替宁抗体。第1组(对照)猴根据相同的给药方案接受用于抗-可替宁抗体和实施例1的ARM化合物的相应媒介物。在施用每种制剂后，用约2mL无菌盐水冲洗导管。在第8天，仅第2组中的猴使用与第1天相同的方案给药，以确定添加第二剂是否会导致延长的PD应答。
使用基于免疫捕获/蛋白消化的分析方法分析猴血浆样品的抗-可替宁抗体，然后进行LC-MS/MS分析。使用血浆的10μL等分试样，实施例1的LLQ为1.00μg/mL。使用基于蛋白沉淀的分析方法分析食蟹猴血液/水(50/50,v/v)样品中实施例1的化合物的总量，随后进行UHPLC/MS/MS分析。使用猴血液/水(50/50,v/v)的25μL等分试样，在血液中实施例1的化合物的定量下限(LLQ)为1.00ng/mL。
在本研究中用于采集和量化数据的计算机系统包括：用于可替宁抗体的Analystv.1.7.1和Watson v7.6.l，以及用于实施例1的Analystvl.4.2和Watson v7.6.1。
在第1天给药前、和在第1天给药后2小时、24小时和48小时以及第8、15和22天从第1、3和4组中的雄性和雌性猴收集外周血样品到EDTA钾抗凝剂中。在第1天和第8天给药前和在第1天和第8天给药后2小时、24小时和48小时以及在第15天和第22天从第2组中的雄性和雌性猴收集外周血样品到EDTA钾抗凝剂中。在筛选(第-6天)随机化之前，仅从所有猴收集另外的样品用于免疫表型确定。
将全血转移至适当的试管中进行免疫表型确定分析。通过离心将血浆与剩余的全血分离，等分，并然后储存在冰箱中以保持-70℃直至进行细胞因子分析。使用裂解缓冲液(eBioscience,San Diego,CA)裂解红细胞。在洗涤后，通过将细胞用人FC阻断剂(BDBiosciences,San Jose,CA)、小鼠IgG(Millipore Sigma,St.Louis,MO)和纯化的同种型匹配对照(BD Biosciences)以至少2倍过量预温育(在湿冰上至少5分钟)，阻断非特异性的细胞表面结合。将对人细胞表面抗原特异性的(与食蟹猴交叉反应性的)单克隆抗体加入细胞中作为单组，并在湿冰上避光温育约30分钟：
抗体荧光染料克隆同种型供应商
CD3 AF488 SP34-2小鼠lgG1 BD Biosciences
CD4 PE-Cy5 L200小鼠lgG1 BD Biosciences
CDS APC-Cv7 RPA-T8小鼠loG1 8D Biosciences
CD20 88700 2H7小鼠lgG2b BD Biosciences
CD159a APC Z199小鼠lgG2b Beckman Coulter
CD56 BUV805 NCAM16.2小鼠loG2b 8D Biosciences
C069 BUV737 FN50小鼠lgG1 BO Biosciences
C014 BV421 M5E2小鼠laG2a BO Biosciences
C016 BV4BO 3GB小鼠lgG1 BO Biosciences
HLA-OR PE lmmu-357小鼠lgG2a BO Biosciences
C045 BV605 005B-12B3小鼠lgG1 BO Biosciences
将细胞洗涤并在染色缓冲液(BD Biosciences)中培养，然后用FACSDiva 8.0.1版本或9.1版本软件(BD Biosciences)使用FACSymphony A3流式细胞计在同一天进行分析。
根据侧向散射光性能和CD45，从活的单态细胞门控淋巴细胞和单核细胞。将数据表示为淋巴细胞和单核细胞子集的亲代和/或祖代百分比以及绝对数，这通过将流式细胞计数百分比乘以通过血液学测量确定的绝对淋巴细胞和单核细胞计数进行计算。结果显示在图9A和9B中。
实施例208:可替宁关闭开关研究
给人CCR2敲入C57小鼠静脉内给药具有SEQ ID NO:13的重链序列和SEQ ID NO:14的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有小鼠IgG2aFc结构域的兔可变区序列)和静脉内给药实施例36的ARM化合物(与0.1mpk化合物预混合的10mpk抗体)。另外三只动物仅接受盐水媒介物(媒介物对照动物)。在48小时以后，处死媒介物对照动物和来自治疗组的3只动物，并通过心脏穿刺收集血液用于流式细胞计量术分析。其余动物被分成两组：第2组在48小时接受50mpk(S)-可替宁(购自Sigma-Aldrich(目录号:C5923))，并在60小时再次接受，而第1组不接受额外治疗。在抗-可替宁抗体和ARM化合物给药后2、24、48、48.25、50、60、60.25、62、72、96、120、144和168小时收集血液。如实施例201中所述，分析血液中ARM化合物的浓度。在第72、96、120和168小时，从第1组和第2组处死3只动物并通过心脏穿刺收集血液。如实施例201中所述，处理血液并通过流式细胞计量术分析CD45+/CD3-/CD11b+/Ly6Chi细胞的水平。结果显示在图7A和7B中。
实施例209:CD4/CD8 T细胞耗竭研究
通过在人CCR2敲入小鼠的胁腹中皮下注射1.5x106个MC38细胞来启动MC38肿瘤。在5天后，腹膜内注射200μg的抗-CD8(克隆2.43)和200μg的抗-CD4(克隆GK1.5)(对照组接受同种型对照抗体)。另外2天后，将动物随机化并每6天静脉内给药具有SEQ ID NO:13的重链序列和SEQ ID NO:14的轻链序列的抗-可替宁抗体(具有小鼠IgG2a Fc结构域的兔可变区序列)和实施例36的ARM化合物作为预混合溶液。在给药开始时和给药后120小时，对血液样品进行流式细胞计量术以确认CD4/CD8细胞耗竭(数据未显示)。如上文实施例204中所述测量肿瘤体积，且结果显示在图2A和2B中。结果证明，抗体/ARM化合物的肿瘤生长抑制依赖于CD4和CD8 T细胞的存在。
实施例210:来自健康供体与来自癌症患者的PBMC的质谱流式细胞技术(CyTOF)分析
使用质谱流式细胞技术(CyTOF)分析从健康供体和癌症患者分离的PBMC中CCR2表达细胞的耗竭，以确定抗-可替宁抗体和式(I)的ARM化合物的组合是否选择性地耗竭CCR2表达细胞。
CyTOF抗体
金属标记的抗体直接从Fluidigm购买，或者使用抗体缀合试剂盒(Fluidigm)在内部制备。对于内部缀合反应，按照制造商的说明书(Fluidigm)将纯化的抗体在不含BSA的缓冲液中与同位素纯化的金属偶联(Lou X,Angew Chem Int Ed Engl2007；46(32):6111-4)。在缀合后，在NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher)上以280nm的吸光度测量金属标记的抗体的蛋白浓度，并在Candor PBS抗体稳定溶液(Candor Bioscience)中稀释至0.5mg/mL的终浓度。在CyTOF实验中使用的所有抗体、具有相关金属缀合试剂盒的抗体和/或金属标记的二级抗体均列于表9中：
表9:质谱流式细胞技术染色组
质谱流式细胞技术(CyTOF)
使用HP分配器(HP)制备用于PBMC温育的化合物处理平板。首先，获得实施例36的ARM化合物的10μM储备溶液。然后，使用HP分配器，将200nL化合物加入96-孔平板(Corning,3799)的孔中。将等体积的DMSO加入对照孔中。其次，将抗-可替宁抗体(SEQ ID NO:11的重链和SEQ ID NO:12的轻链)在AIM-V培养基(Gibco)中稀释，并将2μL抗体添加至处理孔中或将2μL的AIM-V培养基加入对照孔中。在制备处理平板后，然后将PBMC样品解冻。
将来自健康供体(Hemacare)或癌症患者(Discovery Life Sciences)的冷冻保存的PBMC样品在37℃水浴中解冻。然后将PBMC样品加入8mL温热的AIM-V培养基(Gibco)中，通过离心沉淀并重新悬浮于1mL AIM-V培养基中。在ViCell(Beckman Coulter)上对细胞进行计数。将等数目的PBMC转移至先前制备的96-孔平板中的每个处理孔中，并在37℃温育24小时。
在24小时温育时段后，将蛋白转运抑制剂混合物(500X)(Invitrogen/eBioscience)加入所有孔中，并在37℃温育2小时。然后将样品离心并用MaxPar磷酸盐-缓冲盐水(PBS)(Fluidigm)洗涤两次。然后将细胞与在MaxPar PBS中稀释的生存力试剂(200nM顺铂-198,Fluidigm)在室温温育5分钟，然后在MaxPar细胞染色缓冲液(Fluidigm)中洗涤两次。将得到的细胞沉淀物重新悬浮于MaxPar细胞染色缓冲液中。然后将样品在Human TruStain FcX(BioLegend)中在室温封闭10分钟。紧接着，将细胞用在表9中包括的所有细胞表面标志物在室温染色20分钟。在细胞表面染色后，将样品用MaxPar细胞染色缓冲液洗涤两次。然后将细胞使用eBioscience FoxP3 fix/perm缓冲液(Thermo Fisher)在4℃透化45分钟。将样品通过离心沉淀，并在来自eBioscience FoxP3 fix/perm试剂盒(Thermo Fisher)的fix/perm缓冲液中洗涤两次。将样品重新悬浮在相同FoxP3 fix/perm缓冲液中。然后添加表9中列出的所有细胞内抗体并在室温温育30分钟。在细胞内染色后，然后通过离心沉淀细胞，并在来自eBioscience FoxP3fix/perm试剂盒(Thermo Fisher)的fix/perm缓冲液中洗涤两次。将细胞再次重新悬浮于FoxP3 fix/perm缓冲液中，并然后与二级抗体、抗-生物素和抗-FITC一起在室温温育25分钟。将样品通过离心沉淀，并用MaxPar细胞染色缓冲液洗涤两次。然后将细胞重新悬浮于MaxPar Barcode Perm缓冲液(Fluidigm)中，并然后用MaxPar Barcode Perm缓冲液洗涤两次。为了在CyTOF2采集过程中进行细胞识别，然后将每个样品重新悬浮于在MaxParfix/perm缓冲液(Fluidigm)中稀释的Cell ID DNA Intercalator Ir(Fluidigm)中。最后，为了实现样品汇集，给每个样品赋予来自Cell-ID 20-Plex Pd条码试剂盒(Fluidigm)的独特钯条码。将样品与DNA嵌入剂和钯条码一起在4℃温育至少过夜或直至CyTOF2采集时间。
在CyTOF2采集当天，将所有样品在细胞染色缓冲液中洗涤两次。在第二次洗涤并重新悬浮于残留量的细胞染色缓冲液中后，将所有样品汇集为一个样品，并用2mL MilliQ水(18.2mΩ)洗涤两次。然后将最终样品重新悬浮于1mL MilliQ水(18.2mΩ)中，并通过40μm孔隙率Flowmi Strainer(Bel-Art)进行过滤。然后对汇集的样品在ViCell上进行计数，并在MilliQ水(18.2mΩ)中稀释至400,000个细胞/mL。最后，将1:10比例的EQ珠子(Fluidigm)加入样品中，并能够使用Supersampler(Victorian Airship&Scientific Apparatus)进行CyTOF2(Fluidigm)采集。使用CyTOF软件版本6.0.626采集所有样品。
CyTOF数据分析
使用独立软件CyTOF版本6.7.1014对原始FCS文件进行归一化、串联和去条码。去条码的FCS文件被上传到GSK Cytobank Enterprise(cytobank.org)。从所有样品中除去EQ参考珠信号。然后使用顺铂Pt198和Ir131 DNA嵌入剂门控组合来鉴定活细胞，其中活细胞被定义为顺铂Pt198低和Ir131高。然后用事件长度通道和CD45-89Y染色的组合，将活细胞进一步门控为活单态。活单态(viable singlet)被定义为CD45金属强度大于30且低于60的事件。然后使用在Cytobank中嵌入的viSNE应用程序完成对活单态的无监督聚类。
数据如图11A和11B所示。结果证实，CCR2表达主要限于选择性耗竭目标靶细胞(MDSC)，并且表达CCR2的靶细胞在抗-可替宁抗体+ARM化合物存在下被选择性地耗竭，但在单独的ARM化合物存在下不会。
序列表
重链CDR1氨基酸序列
SEQ ID NO:1
NYWMS
重链CDR2氨基酸序列
SEQ ID NO:2
DIHGNRGFNYHASWAKG
重链CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:3
ADDSGSHDI
轻链CDR1氨基酸序列
SEQ ID NO:4
QSSQSVYSAKLS
轻链CDR2氨基酸序列
SEQ ID NO:5
YGSTLAS
轻链CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:6
QGTFYGPDWYFA
可变重链氨基酸序列
SEQ ID NO:7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIHGNRGFNYHASWAKGRFTVSRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKADDSGSHDIWGQGTLVTVSS
可变轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYSAKLSWYQQKPGKAPKLLIYYGSTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPEDFATYYCQGTFYGPDWYFAFGGGTKVEIK
重链氨基酸序列
SEQ ID NO:9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIHGNRGFNYHASWAKGRFTVSRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKADDSGSHDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:10
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYSAKLSWYQQKPGKAPKLLIYYGSTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISSLQPEDFATYYCQGTFYGPDWYFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链氨基酸序列
SEQ ID NO:11
QQQLVESGGR LVTPGGSLTL TCTASGFSLN NYWMSWVRQA PGKGLEWIGD IHGNRGFNYH ASWAKGRFTV SRTSTTVDLR MTSLTTEDTA IYFCARADDS GSHDIWGPGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTCPPCPA PELLGGPDVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP EEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:12
ELDLTQTPSPVSAAVGDTVTINCQSSQSVYSAKLSWYQQKPGQPPKLLIYYGSTLASGVPSRFKGSGSG TQFSLTISDVQCADAATYYCQGTYYGPDWYFAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链氨基酸序列
SEQ ID NO:13
QQQLVESGGRLVTPGGSLTLTCTASGFSLNNYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIHGNRGFNYHASWAKGRFT VSRTSTTVDLRMTSLTTEDTAIYFCARADDSGSHDIWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:14
ELDLTQTPSPVSAAVGDTVTINCQSSQSVYSAKLSWYQQKPGQPPKLLIYYGSTLASGVPSRFKGSGS GTQFSLTISDVQCADAATYYCQGTYYGPDWYFAFGGGTEVVVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 。

Claims (43)

1.式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
R1是C1-4烷基或C3-6环烷基；
R2是氢或C1-4烷基；
R3是氢或C1-4烷基；
L是式(L-a)、(L-b)、(L-c)、(L-d)、(L-e)、(L-f)、(L-g)、(L-h)、(L-i)、(L-j)、(L-k)、(L-m)、(L-n-i)、(L-n-ii)、(L-n-iii)或(L-n-iv)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中：
环A和环B各自独立地是C4-6亚环烷基；
L1a是C3-5直链亚烷基，其中1或2个亚甲基单元被-O-或-NRa-替换；
每个Ra独立地是氢或C1-3烷基；且
L2a是-O-、-NHC(O)-或-CH2-O-；
或其立体异构体，
其中：
环A是C4-6亚环烷基或C7-9桥连二环亚环烷基；
L1b是-CH2-NH-C(O)-、-NHC(O)-或-C(O)NH-；
L2b是C6-12直链亚烷基，其中1、2、3或4个亚甲基单元被-O-、-NR1b-、-C(O)NR1b-或-NR1bC(O)-替换；或
L2b是其中n是1、2、3或4，且代表与L1b的共价键；且
每个R1b独立地是氢或C1-3烷基；
或其立体异构体，
其中：
L1c是C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
环A是C4-6亚环烷基或C7-9桥连二环亚环烷基；且
L2c是-O-或饱和的C2-10直链亚烷基，其中1、2或3个亚甲基单元被-O-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-替换；
其中：
L1d是C12-22直链亚烷基，其中1、2、3、4或5个亚甲基单元被-NH-、-O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-NHC(O)-NH-替换；
其中n是3至50的整数；
或其立体异构体，
其中：
L1f是键；C1-6直链亚烷基，其中0、1或2个亚甲基单元被-O-、-NH-或-C(O)-替换；或-(C3-6亚环烷基)-NHC(O)-；
L2f是键、-NHC(O)-、-C(O)NH-或C1-6直链亚烷基，其中0、1或2个亚甲基单元被-O-替换；且
Z1和Z2中的每个独立地是N或CH；
其中：
环A是具有1或2个氮环原子的5至6元亚杂芳基；
L1g是键、-CH2-、-NH-或-O-；且
L2g是其中n是1、2、3、4或5，且代表与L1g的共价键；
或其立体异构体，
其中：
每个Z1独立地是N或CH；
L1h是键、-C(O)-、-C(O)-NH-或-NHC(O)-；
L2h是C2-10直链亚烷基或其中n是1、2、3或4，且代表与L1h的共价键且代表与L3h的共价键；
L3h是键、-C(O)CH2-、-O-(C3-6亚环烷基)-O-或-C(O)NH(CH2)3OCH2-；
L4h是键、-C(O)-、-CH2C(O)-或-C(O)CH2-；且
m是1、2或3；
其中：
L1i是键、C1-12直链亚烷基或其中n是1、2、3、4或5，且代表与L3i的共价键且代表与NH的共价键；
L2i是键、C1-12直链亚烷基或其中n是1、2、3、4或5，且代表与HN的共价键；且
L3i是键或-C(O)-；
或其立体异构体，
其中：
Z1是C、CH或N；
Z2、Z3、Z4和Z5中的每个独立地是CH或N，前提条件是，Z2、Z3、Z4和Z5中的不超过两个是N；
L1j是-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O-；
L2j是C1-6直链亚烷基或其中n是1或2，且代表与L1j的共价键；且
代表单键或双键；
或其立体异构体，
其中：
环A是苯基或具有1或2个氮环原子的5或6元亚杂芳基；
Z1和Z2中的每个独立地是CH或N；
L1k是键、-C(O)-、-C(O)NH-或-NHC(O)-；且
L2k是C3-8直链亚烷基或其中n是1、2或3，且代表与L1k的共价键；
或其立体异构体，
其中：
Z1是CH或N；
m是1或2；
p是1或2；
的0、1或2个氢原子被F替换；
L1m是键、-C(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2NH-或-NHS(O)2-；且
L2m是C3-6直链亚烷基、C3-6亚环烷基或其中n是1或2，且代表与L1m的共价键；
其中每个代表与式(I)的NH基团的共价键，且每个代表与式(I)的亚甲基基团的共价键。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-CH3。
3.权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是异丙基且R3是甲基。
4.权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是叔丁基且R3是氢。
5.前述权利要求中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-a-i)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中环A、L1a、L2a、如关于式(L-a)所定义。
6.前述权利要求中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-a-ii)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中L1a、L2a、如关于式(L-a)所定义；p是1或2；且m是1或2。
7.前述权利要求中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-a-iii)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中p是1或2；m是1或2；n是1、2或3；且如关于式(L-a)所定义。
8.权利要求1至6中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-a)的二价连接基：
9.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-b-i)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中L1b、L2b、如关于式(L-b)所定义；p是1或2；且m是1或2。
10.权利要求1至4或9中的任一项所述的化合物，其中L是选自以下的式(L-b)的二价连接基：
11.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-c-i)的二价连接基：
或其立体异构体，
其中L1c、L2c、如关于式(L-c)所定义；p是1或2；且m是1或2。
12.权利要求1至4中的任一项所述的化合物，其中L是选自以下的式(L-c)的二价连接基：
13.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-d)的二价连接基：
14.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-f)的二价连接基：
15.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是式(L-g-i)的二价连接基：
其中L1g、L2g、如关于式(L-g)所定义；Z1、Z2和Z3各自独立地选自N或CH，前提条件是，Z1、Z2和Z3中的一个或两个是N。
16.权利要求1至4或15中的任一项所述的化合物，其中L是选自以下的式(L-g)的二价连接基：
17.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-h)的二价连接基：
18.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-i)的二价连接基：
19.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-j)的二价连接基：
20.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-k)的二价连接基：
21.权利要求1至4中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L是选自以下的式(L-m)的二价连接基：
22.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自在表1中列出的化合物。
23.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
24.在有此需要的患者中治疗和/或预防疾病或障碍的方法，所述方法包含：给所述患者施用治疗有效量的前述权利要求中的任一项所述的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段，其中所述疾病或障碍选自癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染或细菌感染。
25.权利要求24所述的方法，其中所述疾病或障碍由趋化因子受体2(CCR2)介导和/或与CCR2-阳性的致病细胞相关。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述疾病是作为实体瘤的癌症。
27.权利要求24至26中的任一项所述的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、结肠直肠癌(CRC)、宫颈鳞状细胞癌(CESC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSC)、胰腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)、卵巢癌、膀胱癌或乳腺癌。
28.权利要求24至27中的任一项所述的方法，其中同时施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。
29.权利要求24至27中的任一项所述的方法，其中依次施用所述化合物和所述抗体或其抗原结合片段。
30.增加C-C基序趋化因子受体2(CCR2)表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包含：使所述细胞与有效量的权利要求1至23中的任一项所述的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
31.耗竭C-C基序趋化因子受体2(CCR2)表达细胞的方法，所述方法包含：使所述细胞与有效量的权利要求1至23中的任一项所述的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段接触，其中所述化合物的CCR2结合部分结合在所述细胞上表达的CCR2。
32.权利要求30或31所述的方法，其中所述CCR2表达细胞是骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、T调节性细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、B调节性细胞(Bregs)、CD8调节性细胞、(CD8regs)、耗竭的T细胞或癌症相关的成纤维细胞(CAF)。
33.权利要求24至32中的任一项所述的方法，其中所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:1的CDR1、具有SEQ ID NO:2的CDR2和具有SEQ ID NO:3的CDR3，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:4的CDR1、具有SEQ ID NO:5的CDR2和具有SEQ IDNO:6的CDR3。
34.权利要求24至33中的任一项所述的方法，其中所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:8的轻链可变区(VL)。
35.权利要求24至34中的任一项所述的方法，其中所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加ADCC活性。
36.权利要求35所述的方法，其中所述在Fc区中的置换是S239D/I332E，其中残基编号是根据EU索引。
37.权利要求24至36中的任一项所述的方法，其中所述抗-可替宁抗体具有包含SEQ IDNO:9的重链和包含SEQ ID NO:10的轻链。
38.一种组合，其包含权利要求1至23中的任一项所述的化合物和抗-可替宁抗体或其抗原结合片段。
39.权利要求38所述的组合，其中所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:1的CDR1、具有SEQ ID NO:2的CDR2和具有SEQ ID NO:3的CDR3，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:4的CDR1、具有SEQ ID NO:5的CDR2和具有SEQ ID NO:6的CDR3。
40.权利要求38或39所述的组合，其中所述抗-可替宁抗体具有重链和轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO:7的重链可变区(VH)，且所述轻链包含具有SEQ ID NO:8的轻链可变区(VL)。
41.权利要求38至40中的任一项所述的组合，其中所述抗-可替宁抗体属于IgG1同种型，其包含在Fc区中的置换以增加ADCC活性。
42.权利要求38至41中的任一项所述的组合，其中在Fc区中的置换是S239D/I332E，其中残基编号是根据EU索引。
43.权利要求38至42中的任一项所述的组合，其中所述抗-可替宁抗体具有包含SEQ IDNO:9的重链和包含SEQ ID NO:10的轻链。
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