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WO2010114245A2 - 5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법 - Google Patents

5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법 Download PDF

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WO2010114245A2
WO2010114245A2 PCT/KR2010/001760 KR2010001760W WO2010114245A2 WO 2010114245 A2 WO2010114245 A2 WO 2010114245A2 KR 2010001760 W KR2010001760 W KR 2010001760W WO 2010114245 A2 WO2010114245 A2 WO 2010114245A2
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seq
corynebacterium
pdz
microorganism
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김정환
권중근
안태민
황수연
백민지
권나라
윤난영
김주정
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씨제이 제일제당(주)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention cultivates microorganisms of Corynebacterium genus with 5'-inosinic acid productivity and Corynebacterium genus with improved 5'-inosine acid productivity, in which the expression amount of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme is increased than the intrinsic expression amount. It relates to a 5'-inosinic acid production method comprising the step of.
  • 5'-inosinic acid one of the nucleic acid-based substances, is an intermediate of the nucleic acid biosynthetic metabolic system, and plays a physiologically important role in the body of animals and plants, as well as food, medicine and various medical uses. It is used in many ways.
  • 5'-inosinic acid is one of the nucleic acid-based seasonings that have been spotlighted as a seasoning seasoning agent because of its synergistic effect, especially when used together with monosodium glutamic acid (MSG).
  • MSG monosodium glutamic acid
  • a method of preparing 5'-inosinic acid is a method of enzymatically decomposing ribonucleic acid extracted from yeast cells (Japanese Patent Publication No. 1614/1957, etc.), or a method of chemically phosphorylating inosine produced by fermentation (Agri. Biol). Chem., 36, 1511 (1972) and the like, and methods for culturing microorganisms capable of producing 5'-inosinic acid and recovering inosine monophosphate (IMP) accumulated in the medium.
  • IMP inosine monophosphate
  • the most used method is a method of producing 5'-inosinic acid using microorganisms.
  • a strain of the genus Corynebacterium (Corynebacterium) is widely used, for example, a method of producing 5'-inosinic acid by culturing the corynebacterium ammonia genes strain ( Korean Patent Publication No. 2003-0042972 and the like) are known.
  • Korean Patent No. 785248 discloses a microorganism overexpressing the gene purC encoding phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase on the purine biosynthetic pathway, and a method of producing 5'-inosinic acid using the same.
  • Korean Patent No. 785248 discloses a microorganism overexpressing the gene purC encoding phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase on the purine biosynthetic pathway, and a method of producing 5'-inosinic acid using the same.
  • 857379 discloses a strain of Corynebacterium ammonia genes overexpressed with a phosphoribosylaminoimidazole carboxylase gene encoded by purKE and a method of producing IMP at high concentration and high yield using the same. do.
  • the present inventors conducted a study on strains capable of producing 5'-inosine acid with high productivity, and when the activity of the main enzymes involved in the purine biosynthetic pathway was simultaneously increased than the intrinsic activity, the productivity of 5'-inosine acid was improved.
  • the present invention has been completed by finding that it is possible.
  • the present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing 5'-inosine acid using microorganisms of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosine acid productivity.
  • the present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium having 5'-inosinic acid productivity, the expression amount of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme is increased than the intrinsic expression amount.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium of the present invention has an increased expression amount of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme than the intrinsic expression amount, and has an improved 5'-inosinic acid productivity compared to the parent strain.
  • purine biosynthetic enzyme means an enzyme that catalyzes a reaction included in the purine biosynthetic pathway that produces a purine base as a final product, and is a phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase, phosphoribosylglycinamide form Milltransferase, phosphoribosylformylglycineamidine synthetase, phosphoribosylformylglycineamidine synthetase II, phosphoribosylaminoimidazole synthetase, phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, Phosphoribosyl aminoimidazole succinocarboxamide synthetase, inosinoic acid cyclohydrolase, ribophosphate pyrophosphokinase and the like.
  • the purine biosynthesis enzyme is phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase, phosphoribosylglycineamide formyltransferase, phosphoribosylformylglycineamidine synthetase, phosphoribosylpore Milglycineamidine synthetase II, phosphoribosylaminoimidazole synthetase, phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, phosphoribosyl aminoimidazole succinocarboxamide synthetase and inosine acid cyclohydrolase
  • One or more enzymes selected from the group consisting of and a combination consisting of ribophosphate pyrophosphokinase.
  • the gene encoding the purine biosynthetic enzyme with increased expression relative to the intrinsic level is purN, phosphoribosylformylglycine of SEQ ID NO: 36, which is a gene encoding phosphoribosylglycineamide formyltransferase.
  • PurS of SEQ ID NO: 37 gene encoding amidine synthetase, purL of SEQ ID NO: 38, gene encoding phosphoribosylformylglycine amidine synthetase II, phosphoribosylaminoimidazole carboxylase PurKE of SEQ ID NO: 40, the gene encoding phosphoribosyl aminoimidazole succinocarboxamide synthetase, purC of SEQ ID NO: 41, purH of SEQ ID NO: 42, a gene encoding inosine acid cyclohydrolase, and It may be a combination consisting of prs of SEQ ID NO: 43, a gene encoding ribophosphate pyrophosphokinase.
  • the gene encoding the purine biosynthesis enzyme with increased expression relative to the intrinsic level is purF of the SEQ ID NO: 35, a gene encoding the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase, phosphoribosylglycinamide form PurN of SEQ ID NO: 36, a gene encoding a wheattransferase, purS of SEQ ID NO: 37, a gene encoding a phosphoribosylformylglycine amidine synthetase, phosphoribosylformylglycine amidine synthetase II PurL of SEQ ID NO: 38, which is a coding gene, purM of SEQ ID NO: 39, which is a gene encoding phosphoribosylaminoimidazole synthetase, purKE of SEQ ID NO: 40, a gene encoding a phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, Pur
  • “increased than the intrinsic expression amount” means that the expression amount of the gene expressed naturally in the microorganism or higher than the expression amount of the gene expressed in the parent strain, the number of genes encoding the enzyme An increase in the number of copies and thus an increase in the amount of expression or an increase in the amount of expression due to mutation of the gene or an increase in the amount of expression by both.
  • the increase in the expression level of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme is introduced into the strain further from the outside or the endogenous gene is amplified to increase the number of copies of the gene or introduced into the transcription or translation control sequence But not limited to the case where the transcriptional or translational efficiency is increased by the modified mutation.
  • Amplification of endogenous genes can be readily accomplished by methods known in the art, such as culturing under appropriate selection pressure and the like.
  • the expression amount of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme may be increased by the gene encoding the purine biosynthetic enzyme is additionally introduced from outside the cell or by the amplification of the endogenous gene encoding the purine biosynthetic enzyme.
  • the introduction from outside of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme comprises two consecutively arranged copies of the corresponding gene. It can be made through transformation with a recombinant vector.
  • the recombinant vectors used for the preparation of the microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity are each a recombinant vector having a cleavage map of FIGS. It may be selected from the group consisting of -2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, and pDZ-2prs.
  • the Corynebacterium genus microorganisms having improved 5'-inosinic acid productivity may be derived from Corynebacterium microorganisms capable of producing 5'-inosinic acid.
  • the microorganisms of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity according to the present invention are Corynebacterium ammonia genes ATCC6872, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Coryne Bacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and strains prepared therefrom.
  • a microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity may include two or more copies of a gene encoding a purine biosynthetic enzyme.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity may be Corynebacterium ammonia genes, more preferably the prs gene, purF, purN, purS, purL, It may be a transformed Corynebacterium ammonia genes in which the intrinsic activity of the combination of one or more genes selected from the group consisting of the purM, purKE, purC and purH genes has been increased to produce high concentrations of 5'-inosinic acid.
  • Corynebacterium spp Microorganisms with improved 5'-inosinic acid productivity are shown in Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 (KCCM-10610) strains producing 5'-inosinic acid, respectively.
  • PurF introduced, in sequence or in combination, with recombinant vectors pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, pDZ-2prs having a cleavage map of 4, 5, 6 and 7
  • One of two copies of the genes purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH and prs replaces the corresponding intrinsic gene by homologous recombination, thereby purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH And prs gene, each of two copies may be a strain inserted into the chromosome.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity is purN, phosphoribosylformylglycine of SEQ ID NO: 36, which is a gene encoding phosphoribosylglycineamide formyltransferase.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having improved 5'-inosinic acid productivity is purF, phosphoribosylglycinamide for SEQ ID NO: 35, which is a gene encoding phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase.
  • PurN of SEQ ID NO: 36 a gene encoding a wheattransferase, purS of SEQ ID NO: 37, a gene encoding a phosphoribosylformylglycine amidine synthetase, phosphoribosylformylglycine amidine synthetase II
  • PurL of SEQ ID NO: 38 which is a coding gene
  • purM of SEQ ID NO: 39 which is a gene encoding phosphoribosylaminoimidazole synthetase
  • purKE of SEQ ID NO: 40 a gene encoding a phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
  • PurC of SEQ ID NO: 41 a gene encoding phosphoribosyl aminoimidazole succinocarboxamide synthetase, inosinoic acid cyclohydrola Corynebacterium, comprising two copies of a gene encoding a purine biosy
  • the present invention is a step of culturing the microorganism of the genus Corynebacterium having 5'-inosinic acid productivity, the expression amount of the gene encoding the purine biosynthetic enzyme is increased than the intrinsic expression amount and recovering the 5'-inosinic acid from the culture medium
  • a method of producing 5'-inosinic acid comprising the step.
  • the medium and other culture conditions used for culturing Corynebacterium microorganisms in the method for producing 5'-inosinic acid of the present invention may be the same as those commonly used in the culture of Corynebacterium microorganisms, Easy to select and adjust
  • the culturing method may be any culturing method known in the art, for example, batch, continuous and fed-batch culturing methods and the like, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having 5'-inosinic acid productivity may be Corynebacterium ammonia genes.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having 5'-inosinic acid productivity may be Corynebacterium ammonia genes CN01-0120 or Corynebacterium ammonia genes CN01-0316 (KCCM 10992P). .
  • the step of culturing the microorganism of the genus Corynebacterium is culturing the strain while controlling the temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acids, vitamins, etc. .
  • Carbohydrates such as glucose and fructose may be used as the carbon source, and various inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium chloride and ammonium sulfate and peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and casein Organic nitrogen sources may be used, such as degradation products, fish or degradation products thereof, degreasing soy cakes or degradation products thereof.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium chloride and ammonium sulfate and peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and casein Organic nitrogen sources may be used, such as degradation products, fish or degradation products thereof, degreasing soy cakes or degradation products thereof.
  • the inorganic compound monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used.
  • vitamins and nutrient-containing bases may be added as necessary.
  • the culturing is carried out under aerobic conditions, for example by shaking culture or aeration stirred culture, preferably at a temperature of 28 to 36 ° C.
  • the pH of the medium is preferably maintained in the range of pH 6 to 8 during the culture. Cultivation can be performed for 4 to 6 days.
  • FIG. 1 shows a vector pDZ vector for intrachromosomal insertion of a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • Figure 2 shows the vector pDZ-2purFM for intrachromosomal insertion of Corynebacterium genus microorganisms.
  • Figure 3 shows the vector pDZ-2purNH for intrachromosomal insertion of Corynebacterium genus microorganisms.
  • Figure 4 shows a vector pDZ-2purSL for intrachromosomal insertion of Corynebacterium genus microorganisms.
  • Figure 5 shows the vector pDZ-2purKE for intrachromosomal insertion of Corynebacterium sp. Microorganisms.
  • Figure 6 shows a vector pDZ-2purC for intrachromosomal insertion of Corynebacterium sp. Microorganisms.
  • Figure 7 shows a vector pDZ-2prs for intrachromosomal insertion of Corynebacterium sp. Microorganisms.
  • the pDZ vector is a vector for chromosomal insertion of a microorganism of the genus Corynebacterium, and was prepared according to the method disclosed in Korean Patent Publication No. 2008-0025355, which is incorporated herein by reference. 1 schematically shows the structure of a pDZ vector.
  • a gene encoding a purine biosynthetic enzyme was inserted into a chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium to prepare a recombinant vector that can be used to increase the number of copies of each gene to two. Transformation and selection of transformants by each recombinant vector was performed as follows:
  • Successful chromosomal insertions of the vector include solid media (X broth 1%, yeast extract 1%, peptone 1%, including X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactosid)), Sodium chloride 0.25%, adenine 1%, guanine 1%, agar 1.5%) was confirmed by the color of the colony. In other words, blue colonies were selected as transformants with vectors inserted into chromosomes.
  • the strain in which the vector was inserted into the chromosome by the first crossover was shaken in the nutrient medium (1% glucose, 1% juicy, 1% yeast extract, 1% peptone, 0.25% sodium chloride, 1% adenine, 1% guanine). After incubation (30 ° C., 8 hours), the solution was diluted from 10 ⁇ 4 to 10 ⁇ 10 , respectively, and plated on a solid medium containing X-gal. By selecting white colonies appearing at a low rate while most colonies are blue, strains from which the vector sequence inserted on the chromosome by the second crossing were removed were selected. The strains selected as above were finally selected through the process of confirming the susceptibility to the antibiotic kanamycin and confirming the genetic structure through PCR.
  • the nutrient medium 1% glucose, 1% juicy, 1% yeast extract, 1% peptone, 0.25% sodium chloride, 1% adenine, 1% guanine.
  • PCR Polymerase Chain Reaction: PCR
  • purFM containing a promoter site Two pairs of genes (purFM-A, purFM-B) were obtained.
  • purFM-A was amplified using SEQ ID NOs: 1 and 2 as primers
  • purFM-B was amplified using SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers.
  • the amplified product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using TOPO Cloning Kit (Invitrogen) to obtain pCR-purFM-A and pCR-purFM-B vectors, respectively.
  • the pCR vector was treated with restriction enzymes (purFM-A: EcoRI + XbaI, purFM-B: XbaI + HindIII) contained at each end of purFM-A and purFM-B, and each purFM was removed from the pCR vector. Gene was isolated.
  • FIG. 2 is a diagram showing a vector pDZ-2purFM for corynebacterium chromosome insertion.
  • the pDZ-2purFM vector was transformed by 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process and one purFM right next to the intrinsic purFM gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total number of copies to two. Subsequently inserted purFM genes are two purFMs It was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 5 and 6, which can amplify the linking sites.
  • a purNH vector including a promoter region was prepared to express both genes simultaneously.
  • purNH-A was amplified using SEQ ID NOs: 7 and 8 as primers
  • purNH-B was amplified using SEQ ID NOs: 8 and 9 as primers.
  • the amplified product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using the TOPO Cloning Kit to obtain pCR-purNH-A and pCR-purNH-B vectors.
  • the pCR vector was treated with restriction enzymes (purNH-A: BamHI + SalI, purNH-B: SalI) contained at each end of purNH-A and purNH-B, and each purNH from the pCR vector. Gene was isolated.
  • FIG. 3 is a diagram showing the vector pDZ-2purNH for Corynebacterium chromosome insertion.
  • the pDZ-2purNH vector was transformed by 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process, and one purNH next to the intrinsic purNH gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total number of copies to two. Subsequently inserted purNH genes are two purNH genes. It was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 10 and 11, which can amplify the linking sites.
  • a purSL vector including a promoter region was prepared to simultaneously express the two genes.
  • purSL-A was amplified using SEQ ID NOs: 12 and 13 as primers
  • purSL-B was amplified using SEQ ID NOs: 14 and 15 as primers.
  • the amplified product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using the TOPO Cloning Kit to obtain pCR-purSL-A and pCR-purSL-B vectors.
  • the pCR vector was treated with restriction enzymes (purSL-A: BamHI + SalI, purSL-B: SalI + BamHI) contained in each end of purSL-A and purSL-B, and each purSL was extracted from the pCR vector. Gene was isolated.
  • FIG. 4 is a diagram showing a vector pDZ-2purSL for corynebacterium chromosome insertion.
  • the pDZ-2purSL vector was transformed into 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process, followed by one purSL next to the intrinsic purSL gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total number of copies to two. Subsequently inserted purSL genes are two purSL Final confirmation was carried out by PCR using primers SEQ ID NOs: 16 and 17 capable of amplifying the linking sites.
  • a purKE vector including a promoter region was prepared to simultaneously express the two genes.
  • purKE-A was amplified using SEQ ID NOs: 18 and 19 as primers
  • purKE-B was amplified using SEQ ID NOs: 20 and 21 as primers.
  • the amplification products were cloned into E. coli vector pCR2.1 using the TOPO Cloning Kit to obtain pCR-purKE-A and pCR-purKE-B vectors.
  • the pCR vector is treated with restriction enzymes (purKE-A: BamHI + KpnI, purKE-B: KpnI + XbaI) contained at each end of purKE-A and purKE-B, and each purKE from the pCR vector. Gene was isolated.
  • Fig. 5 shows the vector pDZ-2purKE for corynebacterium chromosome insertion.
  • the pDZ-2purKE vector was transformed into 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process, followed by one purKE next to the intrinsic purKE gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total copy number to two. Subsequently inserted purKE genes are two purKE Final confirmation was carried out by PCR using primers of SEQ ID NOs: 22 and 23, which can amplify the linking sites.
  • Chromosomes of the Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 strain were isolated and subjected to polymerase chain reaction to obtain purC as a template.
  • the polymerase PfuUltra TM Using a high-reliability DNA polymerase, the cycle consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 53 ° C. and 2 minutes polymerization at 72 ° C. was repeated 30 times.
  • purC containing the promoter site Two pairs of genes (purC-A, purC-B) were obtained.
  • purC-A was amplified using SEQ ID NOs: 24 and 25 as primers
  • purC-B was amplified using SEQ ID NOs: 25 and 26 as primers.
  • the amplified product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using the TOPO Cloning Kit to obtain pCR-purC-A and pCR-purC-B vectors.
  • the pCR vector is treated with restriction enzymes (purC-A: BamHI + SalI, purC-B: SalI) contained at each end of purC-A and purC-B, and each purC is removed from the pCR vector. Gene was isolated. Thereafter, the pDZ vector treated with the restriction enzymes BamHI and SalI was cloned through three-piece conjugation to prepare a pDZ-2purC recombinant vector in which two purC genes were finally cloned.
  • Fig. 6 shows the vector pDZ-2purC for corynebacterium chromosome insertion.
  • the pDZ-2purC vector was transformed into a 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process and one purC next to the intrinsic purC gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total number of copies to two. Successively inserted purC genes are two purCs It was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 27 and 28, which can amplify the linking sites.
  • Chromosomes of the Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 strain were isolated and subjected to a polymerase chain reaction to obtain prs as a template.
  • the polymerase PfuUltra TM Using a high-reliability DNA polymerase, the cycle consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 53 ° C. and 2 minutes polymerization at 72 ° C. was repeated 30 times. As a result, the prs containing the promoter site Two pairs of genes (prs-A, prs-B) were obtained.
  • prs-A is amplified using SEQ ID NOs: 29 and 30 as primers
  • prs-B is amplified using SEQ ID NOs: 31 and 32 as primers.
  • the amplified product was cloned into E. coli vector pCR2.1 using the TOPO Cloning Kit to obtain pCR-prs-A and pCR-prs-B vectors.
  • the pCR vector was treated with restriction enzymes (prs-A: BamHI + SpeI, prs-B: SpeI + PstI) contained at each end of prs-A and prs-B, and each prs from the pCR vector. Gene was isolated.
  • FIG. 7 is a diagram showing a vector pDZ-2prs for inserting Corynebacterium chromosome.
  • the pDZ-2prs vector was transformed by 5'-inosinic acid-producing strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 by electroporation, followed by a second crossover process and one prs next to the intrinsic prs gene on the chromosome. Additional strains of genes were obtained to increase the total number of copies to two. Subsequently inserted prs genes are two prs It was finally confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 33 and 34, which can amplify the linking sites.
  • Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 was used as a parent strain, a combination consisting of pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC and pDZ-2prs, and pDZ-2purNH, pDZ-2purSL and pDZ-2purKE, respectively.
  • corynebacterium ammonia genes CN01-0120 containing 2 copies of genes encoding major enzymes involved in the purine biosynthetic pathway (2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2prs) and Corynebacterium ammonia genes CN01-0316 (2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2purFM + 2prs) were obtained.
  • the parent strain Corynebacterium ammonia genes CJIP2401 strain and Corynebacterium ammonia genes prepared in Example 1 were used.
  • CN01-0120 and Corynebacterium ammonia genes CN01-0316 were inoculated and shake cultured at 30 ° C. for 24 hours to use as species culture.
  • 27 ml of the fermentation broth with the composition indicated below was dispensed into a 500 ml shake flask for 10 minutes, sterilized under pressure at 120 ° C. for 10 minutes, and then inoculated with 3 ml of the seed culture solution and incubated for 5 to 6 days. Culture conditions were adjusted to 200 rpm, temperature 32 °C, pH 7.2.
  • composition of the seed medium and fermentation medium is as follows.
  • Species medium glucose 1%, peptone 1%, gravy 1%, yeast extract 1%, sodium chloride 0.25%, adenine 100mg / l, guanine 100mg / l, pH7.2
  • Flask fermentation medium 0.1% sodium glutamate, 1% ammonium chloride, magnesium sulfate 1.2%, calcium chloride 0.01%, iron sulfate 20mg / l, manganese sulfate 20mg / l, zinc sulfate 20mg / l, copper sulfate 5mg / L, cysteine 23 mg / l, alanine 24 mg / l, nicotinic acid 8 mg / l, biotin 45 ⁇ g / l, thiamine hydrochloride 5 mg / l, adenine 30 mg / l, phosphoric acid (85%) 1.9%, glucose 4.2%, 2.4% per raw material.
  • the production amount of 5'-inosinic acid was measured by the method using HPLC, and the accumulation amount of 5'-inosine acid in the culture solution is shown in the following table.
  • Corynebacterium ammonia genes CN01-0316 which has been found to have increased 5'-inosinic acid productivity by increasing the activity of purine biosynthetic enzymes, is a Korean microbial conservation center in Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul under the Treaty of Budapest. of Microorganisms (KCCM) dated 19 February 2009 with accession number KCCM 10992P.

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Abstract

본 발명은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 향상된 5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 5'-이노신산 생산방법에 관한 것이다.

Description

5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법
본 발명은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 및 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 5'-이노신산 생산방법에 관한 것이다.
핵산계 물질 중 하나인 5'-이노신산(5'-inosinic acid)은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서, 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행할 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있다. 5'-이노신산은 특히 모노소디움 글루탐산(MSG)과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중 하나이다.
5'-이노신산을 제조하는 방법으로 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소로 분해하는 방법(일본 특허공고 제1614/ 1957호 등), 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적 방법으로 인산화하는 방법(Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 등) 및 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물을 배양하고 배지에 축적된 이노신 모노포스페이트(IMP)를 회수하는 방법 등이 있다. 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법은 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법이다. 5'-이노신산의 생산을 위해 이용하는 미생물로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주가 널리 이용되고 있으며, 예를 들어 코리네박테리움 암모니아게네스 균주를 배양하여 5'-이노신산을 생산하는 방법(대한민국 특허공개 제2003-0042972호 등) 등이 공지되어 있다.
미생물을 이용한 5'-이노신산의 생산의 수율을 높이기 위해, 5'-이노신산의 생합성 경로 또는 분해 경로와 관련된 효소의 활성이나 발현을 증가시키거나 또는 저하시켜 개량한 균주들이 개발되고 있다. 한국특허 제785248호는 퓨린 생합성 경로 상의 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자 purC가 과발현된 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 생산 방법을 개시한다. 또한, 한국특허 제857379호는 purKE에 의해 암호화되는 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제 유전자가 과발현된 코리네박테리움 암모니아게네스 균주와 이를 이용하여 IMP를 고농도 및 고수율로 생산하는 방법을 개시한다.
그러나, 여전히 보다 높은 수율로 5'-이노신산을 생산할 수 있는 균주의 개발 및 이를 이용한 5'-이노신산 생산방법에 대한 요구가 존재한다.
이에, 본 발명자들은 5'-이노신산을 높은 생산성으로 생산할 수 있는 균주에 대한 연구를 수행하여, 퓨린 생합성 경로에 관여하는 주요 효소의 활성을 동시에 내재적 활성보다 높이는 경우, 5'-이노신산의 생산성이 향상된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 코리네박테리움 속 미생물은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가되어, 모균주 대비 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는다.
본 발명에서, "퓨린 생합성 효소"는 퓨린 염기를 최종 산물로 생성하는 퓨린 생합성 경로에 포함된 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제, 이노신산 시클로히드롤라아제, 리보스포스페이트 피로포스포키나아제 등을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 퓨린 생합성 효소는 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제 및 이노신산 시클로히드롤라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 리보스포스페이트 피로포스포키나아제로 구성된 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 내재적 수준 대비 발현량이 증가된 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 내재적 수준 대비 발현량이 증가된 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 35의 purF, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 39의 purM, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합일 수 있다.
본 발명에서 "내재적 발현량보다 증가된"은 미생물에서 자연적으로 발현되는 유전자의 발현량 또는 모균주에서 발현되는 유전자의 발현량보다 높은 양으로 발현하는 것을 의미하며, 당해 효소를 코딩하는 유전자의 갯수(카피 수)의 증가 및 그에 따른 발현량 증가 또는 유전자의 돌연변이에 의한 발현량의 증가 또는 이 둘 모두에 의한 발현량의 증가를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량 증가는 당해 유전자가 외부로부터 추가적으로 균주에 도입되거나 또는 내재적 유전자가 증폭되어 유전자의 카피 수가 증가되거나 또는 전사 또는 번역 조절 서열에 도입된 변이에 의해 전사 효율 또는 번역 효율이 증가된 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력하에서 배양하는 방법 등에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자가 세포 외부로부터 추가적으로 도입되거나 또는 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 내재적 유전자가 증폭되어 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서, 내재적 수준 대비 발현량이 증가된 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 상응하는 내재적 유전자 외에 하나 이상의 카피가 외부로부터 도입되어 두개 이상의 카피로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서, 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 외부로부터의 도입은 상응하는 유전자의 연속적으로 배열된 2개의 카피를 포함하는 재조합 벡터에 의한 형질전환을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 제조를 위해 사용된 재조합 벡터는 도입되는 유전자에 따라 각각 도 2 내지 7의 개열지도를 갖는 재조합 벡터, pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, 및 pDZ-2prs로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 생산할 수 있는 코리네박테리움 미생물로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및 이들로부터 제조된 균주로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 두 카피 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있고, 보다 바람직하게는 prs 유전자와, purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC 및 purH 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 조합의 내재적 활성이 5'-이노신산을 고농도로 생산하도록 증가된 것인 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610) 균주에 각각 도 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, pDZ-2prs를 순서대로 또는 조합으로 도입되고, 도입된 purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH 및 prs 유전자의 두 카피 중 하나가 상응하는 내재적 유전자를 상동 재조합에 의하여 치환하여, purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH 및 prs유전자가 각각 2 카피씩 염색체 내에 삽입된 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합의 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 두 카피씩 포함하는, 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있고, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 35의 purF, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 39의 purM, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합의 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 두 카피씩 포함하는, 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있고, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316(KCCM 10992P)일 수 있다.
또한, 본 발명은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 5'-이노신산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 5'-이노신산을 생산하는 방법에서 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 코리네박테리움 속 미생물의 배양에서 통상적으로 사용되는 것과 동일할 수 있고, 당업자가 용이하게 선택하고 조절할 수 있다. 또한, 배양 방법도 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 방법 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316(KCCM 10992P)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계는 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
탄소원으로는 글루코오스, 프럭토오스와 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.
배양은 호기적 조건 하에서, 예를 들면 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 28 내지 36℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 pH 6 내지 8의 범위에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 4 내지 6일 동안 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명에 따른 퓨린 생합성에 관여하는 주요한 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산 생산성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 5'-이노신산을 고농도 및 고수율로 생산할 수 있고, 이에 의해 생산 비용을 절감할 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ 벡터를 나타낸다.
도 2는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purFM을 나타낸다.
도 3는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purNH를 나타낸다.
도 4는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purSL을 나타낸다.
도 5은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purKE를 나타낸다.
도 6은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2purC를 나타낸다.
도 7은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ-2prs를 나타낸다.
실시예 1. 염색체 삽입용 벡터 (pDZ)를 이용한 퓨린 생합성 유전자의 삽입 및 이에 의한 고수율 5'-이노신산 생산 균주의 개발
코리네박테리움 암모니아게네스 균주의 염색체로 외래 유전자를 삽입하기 위해, 해당 유전자를 연속적으로 2 카피 포함하는 pDZ 기반 재조합 벡터를 이용하였다. pDZ 벡터는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 삽입용 벡터로, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 대한민국특허공개 제2008-0025355호에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 도 1은 pDZ 벡터의 구조를 개략적으로 보여준다.
하기의 (1) 내지 (6)에서 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 내에 삽입시켜 각 유전자의 카피 수를 2개로 증가시키기 위해 이용될 수 있는 재조합 벡터를 제작하였다. 각 재조합 벡터에 의한 형질전환 및 형질전환체의 선별은 하기와 같이 수행하였다:
5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401(KCCM-10610)에 원하는 퓨린 생합성 경로 상의 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 pDZ 벡터를 전기천공법(electroporation)으로 형질전환한 후, 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 당해 유전자와 상동성 재조합에 의해 벡터 내의 유전자가 염색체 내로 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지(육즙 1%, 효모엑기스 1%, 펩톤 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 1%, 구아닌 1%, 한천 1.5%)에서 콜로니의 색에 의해 확인하였다. 즉, 청색을 띠는 콜로니를 벡터가 염색체에 삽입된 형질전환체인 것으로 선별하였다. 1차 교차(crossover)에 의해 벡터가 염색체에 삽입된 균주를 영양 배지(포도당 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 펩톤 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 1%, 구아닌 1%)에서 진탕배양(30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 청색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차에 의해 염색체상에 삽입된 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주를 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 PCR을 통한 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 균주로 선정하였다.
(1) purFM 유전자의 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purFM) 제작
코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에서 purF 유전자와 purM 유전자는 근접거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위해 상기 두 유전자 및 프로모터 부위를 포함한 purFM 벡터를 제작하였다.
5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 purFM, 즉, 연속적으로 배열된 purF와 purM을 포함하는 단편을 수득하기 위해 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링(annealing) 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purFM 유전자 두 쌍(purFM-A, purFM-B)을 얻었다. purFM-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purFM-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit(Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 각각 pCR-purFM-A와 pCR-purFM-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purFM-A와 purFM-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purFM-A: EcoRI+XbaI, purFM-B: XbaI+HindIII)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purFM 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 EcoRI과 HindIII가 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합(3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purFM 유전가 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purFM 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purFM을 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2purFM 벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purFM 유전자의 바로 옆에 1개의 purFM 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purFM 유전자는 2개의 purFM 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(2) purNH 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purNH) 제작, purNH 삽입 균주 개발
코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에서 purN 유전자와 purH 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purNH 벡터를 제작하였다.
5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 purNH, 즉, 연속적으로 배열된 purN과 purH를 포함하는 단편을 수득하기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purNH 유전자 두 쌍(purNH-A, purNH-B)을 얻었다. purNH-A는 서열번호 7과 8를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purNH-B는 서열번호 8와 9를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purNH-A와 pCR-purNH-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purNH-A와 purNH-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purNH-A: BamHI+SalI, purNH-B: SalI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purNH 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 BamHI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purNH 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purNH 재조합 벡터를 제작하였다. 도 3은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purNH을 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2purNH 벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purNH 유전자의 바로 옆에 1개의 purNH 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purNH 유전자는 2개의 purNH 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 10과 11의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(3) purSL 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purSL) 제작, purSL 삽입 균주 개발
코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에서 purS 유전자와 purL 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purSL 벡터를 제작하였다.
5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 purSL, 즉, 연속적으로 배열된 purS와 purL을 포함하는 단편을 수득하기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purSL 유전자 두 쌍(purSL-A, purSL-B)을 얻었다. purSL-A는 서열번호 12과 13를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purSL-B는 서열번호 14과 15을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purSL-A와 pCR-purSL-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purSL-A와 purSL-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purSL-A: BamHI+SalI, purSL-B: SalI+BamHI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purSL 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 BamHI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purSL 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purSL 재조합 벡터를 제작하였다. 도 4는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purSL을 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2purSL벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purSL 유전자의 바로 옆에 1개의 purSL 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purSL 유전자는 2개의 purSL 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 16와 17의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(4) purKE 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purKE) 제작, purKE 삽입 균주 개발
코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에서 purK 유전자와 purE 유전자가 근접 거리에 위치하고 있어, 두 유전자를 동시에 발현시키기 위하여 프로모터 부위를 포함한 purKE 벡터를 제작하였다.
5'-이노신산 생산능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 purKE, 즉, 연속적으로 배열된 purK와 purH를 포함하는 단편을 수득하기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purKE 유전자 두 쌍(purKE-A, purKE-B)을 얻었다. purKE-A는 서열번호 18와 19를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purKE-B는 서열번호 20과 21을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purKE-A와 pCR-purKE-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purKE-A와 purKE-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purKE-A: BamHI+KpnI, purKE-B: KpnI+XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purKE 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 BamHI과 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purKE 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purKE 재조합 벡터를 제작하였다. 도 5는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purKE을 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2purKE벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purKE 유전자의 바로 옆에 1개의 purKE 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purKE 유전자는 2개의 purKE 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 22과 23의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(5) purC 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2purC) 제작, purC 삽입 균주 개발
코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 purC를 수득하기 위해 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 purC 유전자 두 쌍(purC-A, purC-B)을 얻었다. purC-A는 서열번호 24과 25을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purC-B는 서열번호 25과 26을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purC-A와 pCR-purC-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 purC-A와 purC-B의 각 말단에 포함된 제한효소(purC-A: BamHI+SalI, purC-B: SalI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purC 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 BamHI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 purC 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2purC 재조합 벡터를 제작하였다. 도 6은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2purC를 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2purC벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 purC 유전자의 바로 옆에 1개의 purC 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 purC 유전자는 2개의 purC 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 27과 28의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(6) prs 유전자 클로닝 및 재조합벡터(pDZ-2prs) 제작, prs 삽입 균주 개발
코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주의 염색체를 분리하고, 이를 주형으로 하여 prs를 수득하기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제를 사용하고, 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 중합 반응으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, 프로모터 부위를 포함한 prs 유전자 두 쌍(prs-A, prs-B)을 얻었다. prs-A는 서열번호 29과 30을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, prs-B는 서열번호 31와 32을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-prs-A와 pCR-prs-B 벡터를 얻었다. 상기 pCR 벡터에 prs-A와 prs-B의 각 말단에 포함된 제한효소(prs-A: BamHI+SpeI, prs-B: SpeI+PstI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 prs 유전자를 분리하였다. 그 후, 제한효소 BamHI과 PstI이 처리된 pDZ 벡터에 3 조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 prs 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2prs 재조합 벡터를 제작하였다. 도 7은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-2prs을 나타내는 도면이다.
상기 pDZ-2prs 벡터를 5'-이노신산 생산 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 전기천공법에 의해 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 prs 유전자의 바로 옆에 1개의 prs 유전자를 추가로 삽입하여 총 카피 수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 prs 유전자는 2개의 prs 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 33과 34의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
(7) 퓨린 생합성 유전자 강화에 의한 고수율 5'-이노신산 생산 균주 개발
상기 (1) 내지 (6)에서 제작된 pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC 및 pDZ-2prs 벡터의 조합을 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주에 도입하였다. 벡터의 도입 순서는 임의로 선택하였으며, 도입 방법 및 확인은 상기에 기재된 바와 같다.
코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401을 모균주로 이용하고, 각각 pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC와 pDZ-2prs로 구성된 조합 및 pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, pDZ-2purFM과 pDZ-2prs로 구성된 조합에 의한 형질전환을 수행하여 퓨린 생합성 경로에 관여하는 주요 효소를 코딩하는 유전자를 2 카피씩 포함하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120(2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2prs)과 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316(2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2purFM + 2prs)을 수득하였다.
실시예 2. 재조합 코리네박테리움 암모니아게네스의 발효역가 시험
하기에 표시된 조성을 갖는 종배지 3㎖를 지름 18㎜의 시험관에 분주하고 가압 살균한 후, 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주와 상기 실시예 1에서 제작된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120 및 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316을 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 하기에 표시된 조성을 갖는 발효배지 27㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압 살균한 후, 상기 종 배양액 3㎖을 접종하여 5 내지 6일간 배양하였다. 배양 조건은 회전수 200rpm, 온도32℃, pH 7.2로 조절하였다.
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.
종배지 : 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100㎎/ℓ, 구아닌 100㎎/ℓ, pH7.2
플라스크 발효배지 : 글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/ℓ, 황산망간 20㎎/ℓ, 황산아연 20㎎/ℓ, 황산구리 5㎎/ℓ, L-시스테인 23㎎/ℓ, 알라닌 24㎎/ℓ, 니코틴산 8㎎/ℓ, 비오틴 45㎍/ℓ, 티아민염산 5㎎/ℓ, 아데닌 30㎎/ℓ, 인산(85%) 1.9%, 포도당 4.2%, 원당 2.4%.
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5'-이노신산의 생산량을 측정하였으며, 배양액 중의 5'-이노신산의 축적량은 하기의 표에 표시된다.
표 1
균주명 Cell OD(배양 5일후) 생산성(g/l/hr)(배양 5일후)
대조군(CJIP2401) 31.2 0.136
CN01-0120 31.8 0.155
CN01-0316 31.3 0.149
배양액 내 5'-이노신산 축적량을 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주와 비교한 결과, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120과 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316 균주들이 동일한 조건하에서 모균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 CJIP2401 균주 대비 단위 시간당 생산하는 5'-이노신산의 생산성이 10.9 - 11.4% 증가했다는 것을 확인했다.
퓨린 생합성 효소의 활성을 증가시켜, 향상된 5'-이노신산 생산성을 갖는 것으로 확인된, 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316을 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2009년 2월 19일자로 수탁번호 KCCM 10992P로 기탁하였다.
본 명세서에 기재된 서열번호 1 내지 서열번호 43의 서열이 첨부된 서열목록에 표시된다.

Claims (11)

  1. 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 내재적 발현량보다 증가된, 5'-이노신산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물로서, 상기 퓨린 생합성 효소는 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제, 및 이노신산 시클로히드롤라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 리보스포스페이트 피로포스포키나아제로 구성된 조합인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 35의 purF, 포스포리보실글리신아미드 포르밀트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 36의 purN, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 37의 purS, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 신세타아제 II를 코딩하는 유전자인 서열번호 38의 purL, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 39의 purM, 포스포리보실아미노이미다졸 카복실라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 40의 purKE, 포스포리보실 아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 신세타아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 41의 purC, 이노신산 시클로히드롤라아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 42의 purH 및 리보스포스페이트 피로포스포키나아제를 코딩하는 유전자인 서열번호 43의 prs로 구성된 조합인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 발현량은 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자가 세포 외부로부터 추가적으로 도입되거나 또는 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 내재적 유전자가 증폭되어 증가된 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 상응하는 내재적 유전자 외에 하나 이상의 카피가 외부로부터 세포내로 도입되어 두개 이상의 카피로 존재하는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 퓨린 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 세포내로의 도입은 연속적으로 배열된 상응하는 유전자의 두개의 카피를 포함하는 재조합 벡터에 의한 형질전환에 의해 이루어지는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 각각 도 2 내지 7의 개열지도를 갖는 재조합 벡터, pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, 및 pDZ-2prs로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0120인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  10. 제3항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CN01-0316(KCCM 10992P)인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계, 및 상기 배양액으로부터 5'-이노신산을 회수하는 단계를 포함하는, 5'-이노신산을 생산하는 방법.
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