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CN104845923B - 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌 - Google Patents

生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生产L‑组氨酸的方法及其专用重组菌。本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6‑磷酸葡萄糖异构酶的表达，且提高所述出发菌中6‑磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组菌。本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L‑组氨酸的发酵产量的方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L‑组氨酸，便于推广应用。

Description

生产L-组氨酸的方法及其专用重组菌
技术领域
本发明涉及氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及生产L-组氨酸的方法及其专用重组菌。
背景技术
L-组氨酸是人和动物的第九种必需氨基酸，参与机体生长发育、抗氧化和免疫调节等重要的生理过程，是重要的药用氨基酸，可用于心脏病、贫血、胃肠溃疡治疗的输液制剂。目前，L-组氨酸生产主要采用以猪（牛）血粉为原料的蛋白质水解提取法，然而，蛋白质水解提取法存在原料成本高且利用率低、提取工艺复杂和环境污染大等缺点，使得L-组氨酸的生产成本高，价格昂贵。微生物发酵法生产L-组氨酸尚未得到大规模的工业化应用。L-组氨酸的生物合成具有与核苷酸合成竞争前体物质、复杂的代谢调控机制以及合成过程中高能量需求等特点，导致其工程菌的产酸水平和转化率相对较低。L-组氨酸生产菌株的选育主要采用多轮传统诱变筛选和在诱变菌株的基础上进行基因工程改造的方法。通过诱变筛选获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用。目前通过系统代谢工程改造构建L-组氨酸工程菌的研究仅有一篇报道。该研究是以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌，通过在hisG基因中引入E271K突变，减弱组氨酸对其反馈抑制调节；敲除组氨酸合成操纵子的转录弱化因子hisL，上调组氨酸合成操纵子的表达；同时敲除purR基因，增加组氨酸合成前体PRPP的合成，构建了一株产L-组氨酸的工程菌。该研究只进行了L-组氨酸终端合成途径的改造，其L-组氨酸的产量仅为4.9g/L，与实现工业化应用存在较大差距。
通过失活糖酵解途径的6-磷酸葡萄糖异构酶，能够将碳代谢流导向戊糖磷酸途径，但会导致菌株的生长和葡萄糖代谢能力的减弱而不利于菌株在发酵生产中的应用。前期的研究结果证实，敲除6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi导致菌株的生长和葡萄糖代谢能力的严重下降，同时L-组氨酸产量也随之下降。另外，还发现单独提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达量，对于L-组氨酸产量提高的效果不佳。
发明内容
本发明的目的是提供生产L-组氨酸的方法及其专用重组菌。
本发明提供的构建重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达，且提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组菌。
上述方法中，所述降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达通过如下A）或B）方式实现：
A）失活所述出发菌染色体的pgi基因；所述失活具体为敲除；
B）将所述出发菌中的pgi基因的调控元件替换为低转录和低表达活性的调控元件实现；
所述提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达通过如下C）或D）方式实现：
C）增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数；
D）将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启动子，且将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子。
上述方法中，所述构建重组菌的方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，且增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数，得到重组菌；
Ⅱ所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启动子、且将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子。
上述方法，
所述敲除为将含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段导入所述出发菌中进行同源重组；
所述增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数为将zwf-opcA基因和prsA-hisGfbr片段通过重组载体导入所述出发菌；
上述重组载体为将zwf-opcA基因和prsA-hisGfbr片段插入表达载体得到的重组载体；所述表达载体可以为IPTG诱导型表达载体pXMJ19或枯茗酸诱导型表达载体pWYE1233；
在本发明的实施例2中，重组载体为pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr，为将zwf-opcA基因（序列2）插入pXMJ19的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入Xba I和Sma I位点间得到的载体。
在本发明的实施例4中，重组载体为pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbr，为将zwf-opcA基因（序列2）插入pWYE1233的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入Xba I和Sma I位点间得到的载体；其中，pWYE1233为将Phom-cymR-Pcum片段（序列8）插入质粒pXMJ19的Nar I和Hind III酶切位点间得到的载体，命名为重组质粒pWYE1233。
所述将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为Peftu启动子为将含有Peftu启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组；
所述将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子为将含有Psod启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组。
上述方法中，
所述含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；基因pgi的核苷酸序列为序列11；
所述zwf-opcA基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述prsA-hisGfbr片段的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述重组载体为将所述zwf-opcA基因和所述prsA-hisGfbr片段插入表达载体得到的载体；
所述Peftu启动子的核苷酸序列为序列表中的序列10自5’末端第635-834位核苷酸；
所述含有Peftu启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列10；
所述含有Psod启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列9。
上述方法中，所述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将细菌染色体上的L-组氨酸合成操纵子的启动子替换为PglyA启动子，且将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突变，得到出发菌；
所述L-组氨酸合成操纵子为hisEG和hisDCB；
所述PglyA启动子的核苷酸序列为序列表中序列4的第863-1052位核苷酸或序列表中序列5的第752-941位核苷酸；
所述点突变为将所述细菌染色体的hisG基因编码的蛋白的第215位天冬酰胺变为赖氨酸、第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸。
上述方法中，所述将细菌染色体上的L-组氨酸合成操纵子的启动子替换为PglyA启动子为将含有hisEG的PglyA启动子的片段和含有hisDCB的PglyA启动子的片段导入细菌中进行同源重组；其中，含有hisEG的PglyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列4；含有hisDCB的PglyA启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列5。
上述方法中，所述将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突变为将序列6所示的核苷酸序列导入所述细菌中进行同源重组，再将序列7所示的核苷酸序列导入中间菌中进行同源重组。
上述方法中，所述细菌为棒杆菌属细菌，所述棒杆菌属细菌具体为谷氨酸棒杆菌。
由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
上述的重组菌在制备L-组氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还提供一种制备L-组氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养上述的重组菌，即得到L-组氨酸。
本发明所述的失活细菌的pgi基因，“失活”指的是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果，包括但是不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。
本发明所用的染色体基因敲除、插入失活、基因敲入、启动子替换和定点突变的方法是通过自杀性载体pK18mobsacB携带改造靶基因的同源臂发生同源重组实现的。
本发明所述的L-组氨酸工程菌，发酵24小时的L-组氨酸生产强度为0.01～1g/L/h，发酵结束时的L-组氨酸产量为0.5～50g/L。
本发明的实验证明，与现有的L-组氨酸工程菌和L-组氨酸发酵生产方法相比，本发明的优点在于：
（1）本发明根据代谢工程原理，首次以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌，采用分子生物学技术，构建了遗传背景清楚的L-组氨酸基因工程菌。
（2）本发明所提供的L-组氨酸工程菌，通过采用敲除pgi基因阻断上游糖酵解途径的同时过表达zwf-opcA基因增强戊糖磷酸途径的代谢能力的组合改造策略，工程菌的生长和葡萄糖消耗能力与野生型菌株相比未见明显减弱，L-组氨酸产量显著提高。
（3）本发明所提供的L-组氨酸工程菌无营养物质缺陷表型，便于工业化控制。
（4）本发明所提供的L-组氨酸工程菌的发酵周期短，易于过程和成本控制。
（5）本发明首次提出了在pgi基因缺失的基础上，同时增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达的组合改造策略，解除了pgi基因缺失导致的菌株生长和葡萄糖代谢的限制，能够最大程度地将中心碳代谢流导向戊糖磷酸途径，同时维持细菌较高的生长代谢和ATP水平，显著提高L-组氨酸的产量，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-组氨酸。
本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-组氨酸的发酵产量的方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-组氨酸，便于推广应用。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1为重组质粒pXMJ19-prsA-hisGfbr的示意图
图2为重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr的示意图
图3为L-组氨酸工程菌CG171表达蛋白的SDS-PAGE图
图4为L-组氨酸工程菌CG171中6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活性测定图
图5为L-组氨酸工程菌CG171的发酵罐发酵过程曲线图
图6为重组质粒pWYE1233的示意图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、L-组氨酸底盘工程菌CG160的获得
一、谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中L-组氨酸合成操纵子启动子替换为强启动子PglyA
根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的hisEG操纵子及其上下游序列和PglyA启动子序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增hisEG操纵子启动子上游同源臂；以P3和P4为引物扩增启动子PglyA；以P5和P6为引物扩增hisEG启动子下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P6为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到1920bp的PCR产物，为含替换启动子PglyA及被替换启动子PhisEG的上下游同源臂的片段（序列4）。
其中，序列4自5’末端第1-862位核苷酸为被替换启动子PhisEG的上游同源臂，序列4自5’末端第863-1052位核苷酸为启动子PglyA，序列4自5’末端第1053-1920位核苷酸为被替换启动子PhisEG的下游同源臂。
将上述1920bp的PCR产物经Xba I和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB（可购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097）连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2132bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和BamH I双酶切鉴定，得到1920bp的为阳性。
将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列4所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为pK18mobsacB-PglyA::PhisEG。
采用相同的方法构建同源重组质粒pK18mobsacB-PglyA::PhisDCB，具体如下：以P7和P8为引物扩增hisDCB操纵子启动子上游同源臂；以P9和P10为引物扩增启动子PglyA；以P11和P12为引物扩增hisDCB的启动子下游同源臂。以P7和P12为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增。得到1694bp的PCR产物，为含替换启动子PglyA及被替换启动子PhisDCB上下游同源臂的长片段（序列5），其中，序列5自5’末端第1-751位核苷酸为被替换启动子PhisDCB的上游同源臂，序列5自5’末端第752-941位核苷酸为启动子PglyA，序列5自5’末端第942-1694位核苷酸为被替换启动子PhisDCB的下游同源臂。
将上述1694bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1906bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1694bp的为阳性。将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列5所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为pK18mobsacB-PglyA::PhisDCB。
上述所用的引物序列如下：
P1:GCTCTAGAGTATCGGCGTGGAGTTGTC(Xba I)
P2:TAGTGGAGTAGCTTTATTTTGCGACACCTGCC
P3:GTCGCA AAATAAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG
P4:GGTTCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC
P5:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGAACCGAATGAAGACATTTGA
P6:CGCGGATCCCAGGATCTGCTGCTCTGG(BamH I)
P7:CCCAAGCTTCGAGGAAACCGTTGAGGA(Hind III)
P8:TAGTGGAGTAGCTATGGATTTCACCTCTGTGAATG
P9:TCTCCACTTTAGGTAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG
P10:CGATCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC
P11:GAGGTCTTACGCAAAGGAGGATCGCCATGTTGAATGTC
P12:CGCGGATCCGGCAGAGGCATCAGCAAG(BamH I)
P13:ATGTGCTGCAAGGCGATTAA
P14：TATGCTTCCGGCTCGTATGT
P15:TTTTATATATGGGTATCGGCGGTCTATGCT
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-PglyA::PhisEG电转化至谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P15和P6为引物进行PCR扩增鉴定，得到948bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌WT-PglyA::PhisEG。
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-PglyA::PhisDCB电转化至谷氨酸棒杆菌WT-PglyA::PhisEG中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P15和P12为引物进行PCR扩增鉴定，得到833bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌CG158（WT-PglyA::PhisEG-PglyA::PhisDCB）。
经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中的hisEG和hisDCB的启动子均替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子PglyA，将hisE和hisD基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列（AAAGGAGGA），将hisE基因的起始密码子GTG替换为高表达强度的ATG，谷氨酸棒杆菌CG158（WT-PglyA::PhisEG-PglyA::PhisDCB）构建成功。
二、染色体上基因hisG的定点突变获得L-组氨酸底盘工程菌CG160
染色体hisG基因定点突变采用两步替换的方法，以期同时实现该基因的三个定点突变，先将序列表中序列6所示的含氯霉素抗性基因Cmr及hisG基因突变片段上下游同源臂的长片段与CG158同源重组，得到重组菌WT-PglyA::PhisEG-Cmr::hisG-PglyA::PhisDCB；再将序列表中序列7所示的含三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上下游同源臂的长片段与重组菌WT-PglyA::PhisEG-Cmr::hisG-PglyA::PhisDCB同源重组，得到CG160。
具体如下：
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P16和P17为引物PCR扩增hisG基因突变片段的上游同源臂，以P18和P19为引物扩增hisG基因突变片段的下游同源臂；以P20和P21为引物，质粒pXMJ19（购自于Biovector Science Lab,Inc,货号SMD1168H）为模板，扩增氯霉素抗性基因Cmr。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P16和P21为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到1689bp含氯霉素抗性基因Cmr及hisG基因突变片段上下游同源臂的长片段（序列6）。
其中，序列6自5’末端第1-420位核苷酸为hisG基因突变片段上游同源臂，序列6自5’末端第421-1281位核苷酸为氯霉素抗性基因Cmr，序列6自5’末端第1282-1689位核苷酸为hisG基因突变片段下游同源臂。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P62和P63为引物扩增含C645G（第215位天冬酰胺变为赖氨酸）突变位点的hisG基因片段，以P64和P65为引物扩增含A693C和A703G（第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸）突变位点的hisG片段，再以纯化的上述PCR产物为模板，以P62和P65为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到846bp含三个点突变的hisG基因（序列3自5’末端第1007-1852位核苷酸）。以P16和P22为引物PCR扩增hisG基因定点突变的上游同源臂，以P23和P21为引物扩增hisG基因定点突变的下游同源臂；以P24和P25为引物，以上述获得的含三个点突变的hisG基因为模板，扩增含三个点突变的hisG基因末端264bp片段。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P16和P21为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到1092bp含三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上下游同源臂的长片段（序列7）。
其中，序列7自5’末端第1-420位核苷酸为上游同源臂，序列7自5’末端第421-684位核苷酸为三个点突变的hisG基因末端264bp片段，序列7自5’末端第685-1092位核苷酸为下游同源臂。
纯化回收的两个PCR产物分别经BamH I和EcoR I双酶切后，分别与经同样双酶切处理的敲除载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1901bp和1304bp的分别为携带两种重组质粒的阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行BamH I和EcoR I双酶切鉴定，得到1689bp和1092bp的分别为两种重组质粒。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-Cmr::hisG和pK18mobsacB-hisGfbr::Cmr构建成功。
pK18mobsacB-Cmr::hisG为将含氯霉素抗性基因Cmr及hisG基因突变片段上下游同源臂的长片段（序列6）插入到载体pK18mobsacB中得到的重组载体；
pK18mobsacB-hisGfbr::Cmr为将含三个点突变的hisG基因末端264bp片段及其上下游同源臂的长片段（序列7）插入到载体pK18mobsacB中得到的重组载体；
上述所用的引物序列如下：
P16:CGCGGATCCATCTACGTTGCTGGTGGC(BamH I)
P17:ACGGGCAACAGCTGCTGCTCTGGGGTGAC
P18:CAGAGCAGCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT
P19:GGTAGTTAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT
P20:GCGGGGCGTAATTTTAACTACCCCCGAAAAT
P21:CCGGAATTCCGAATGAAATCTGGGACG(EcoR I)
P22:CGAAGCAGGATCTGCTGCTCTGGGGTGAC
P23:CAGAGCAGCAGATCCTGCTTCGCCGCATCCA
P24:GGTAGTTAAAACTAGATGCGGGCGATGCG
P25:CCCGCATCTAGTTTTAACTACCCCCGAAAAT
P26:TCCCAAACAAAGGCTCGC
P27:CAGTCGGCGGTTTGCTAA
P62:ATGTTGAAAATCGCTG
P63:TTACTGCAGTGGCAGCGTCCAGGTTGTCGCGGTCGACCTTGTAATCCAGCAT
P64:ACCTGGACGCTGCCACTGCAGTAACCCCAGGCTTCTCCGGCCCAGCGGTATC
P65:CTAGATGCGGGCGATGCGG
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-Cmr::hisG电转化至谷氨酸棒杆菌CG158中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌。
以P26和P27为引物，对阳性菌进行PCR扩增鉴定，得到1872bp的为重组菌WT-PglyA::PhisEG-Cmr::hisG-PglyA::PhisDCB。
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-hisGfbr::Cmr电转化至上述构建的重组菌WT-PglyA::PhisEG-Cmr::hisG-PglyA::PhisDCB中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。
以P26和P27为引物，对阳性菌落进行PCR扩增鉴定，得到1275bp的为重组菌，命名为谷氨酸棒杆菌CG160（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB）。
经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实成功对谷氨酸棒杆菌CG158的染色体hisG基因的N215K/L231F/T235A点突变，谷氨酸棒杆菌CG160（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB）构建成功。
hisG基因的N215K/L231F/T235A点突变为将hisG基因编码的蛋白的第215位天冬酰胺变为赖氨酸、第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸。
实施例2、含有质粒的高产L-组氨酸的重组菌CG171的构建
一、L-组氨酸初级工程菌CG176的构建
以菌株CG160的基因组DNA为模板，分别以P28/P29和P30/P31为引物PCR扩增prsA基因（992bp）和hisGfbr（860bp）。采用重叠延伸PCR将两基因连接，以扩增的hisGfbr和prsA基因为模板，用P28和P31为引物进行PCR扩增，得到1852bp的PCR产物为prsA-hisGfbr片段（序列3）。
其中，序列3自5’末端第1-992位核苷酸为prsA，序列3自5’末端第993-1852位核苷酸为hisGfbr（含三个点突变的hisG基因）。
将上述PCR产物经Xba I和Sma I双酶切后，与经同样双酶切处理的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pXMJ19连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氯霉素（20μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P32和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2054bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和Sma I双酶切鉴定，得到1852bp的为阳性，命名为重组质粒pXMJ19-prsA-hisGfbr（图1所示）。
pXMJ19-prsA-hisGfbr经进一步序列测定分析，该质粒为将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入质粒pXMJ19的Xba I和Sma I酶切位点间得到的载体。
将质粒pXMJ19-prsA-hisGfbr转化至上述构建的底盘工程菌CG160中，以P32和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2054bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，L-组氨酸工程菌CG176（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB/pXMJ19-prsA-hisGfbr）构建成功。
上述所用的引物序列如下：
P28：GCTCTAGAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTGG(Xba I)
P29：TTGTCCTCCTTTTTAGGCCTCGCCCTCGAA
P30：GGCGAGGCCTAAAAAGGAGGACAATCATGTTGAAAATCGCTG
P31：TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGG(Sma I)
P32：CAATTAATCATCGGCTCGTA
P33：ACCGCTTCTGCGTTCTGATT
二、L-组氨酸初级工程菌CG161和CG172的获得
初级工程菌CG161为将L-组氨酸底盘工程菌CG160中pgi基因敲除获得，具体如下：
首先，根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pgi基因及其上下游序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P34和P35为引物PCR扩增pgi基因上游同源臂；以P36和P37为引物扩增pgi基因下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P34和P37为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到1672bp的含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段（序列1）。
其中，序列1自5’末端第1-834位核苷酸为欲敲除基因pgi的上游同源臂，序列1自5’末端第835-1672位核苷酸为欲敲除基因pgi的下游同源臂。
纯化回收的PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1884bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行BamH I和EcoR I双酶切鉴定，得到1672bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-Δpgi构建成功，为将含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段（序列1）插入载体pK18mobsacB的BamH I和EcoR I酶切位点间得到的载体。
上述所用的引物序列如下：
P34：CGCGGATCCGCTCTTTCGGAGTGACCT(BamH I)
P35：TAAGCAAGCGAGAAAACTCCTTTATTGTCG
P36：TAAAGGAGTTTTCTCGCTTGCTTATAGGGTC
P37：CCGGAATTCTCGGGAAGCAGTTAGTGAAA(EcoR I)
P38：TTGACGACGCAAGAGCCA
P39：CACCATTACCGATGAGAAAC
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-Δpgi电转化至谷氨酸棒杆菌CG160中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P38和P39为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1759bp的为阳性，命名为CG161（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Δpgi）。
CG161（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Δpgi）经进一步序列测定分析，结果为L-组氨酸底盘工程菌CG160的染色体pgi基因敲除成功，CG161构建成功。
工程菌CG172为质粒pXMJ19-prsA-hisGfbr导入工程菌CG161中得到的重组菌。
三、L-组氨酸高产工程菌CG171的构建
根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的zwf-opcA基因序列设计引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，采用引物P40和P41，PCR扩增2519bp的zwf-opcA片段（序列2）。经Hind III和Xba I双酶切后，先与经同样双酶切处理的表达质粒pXMJ19连接，获得的重组质粒pXMJ19-zwf-opcA，pXMJ19-zwf-opcA再经XbaI和SmaI双酶切，与上述一制备的质粒pXMJ19-prsA-hisGfbr经Xba I和Sma I双酶切获得的1852bp的prsA-hisGfbr片段连接。
zwf-opcA片段，其中，序列2自5’末端第1-1545位核苷酸为zwf基因，序列2自5’末端第1546-2519位核苷酸为opcA基因。
连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氯霉素（20μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P32和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到4573bp的为阳性转化子。对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒分别进行Xba I/SmaI和Hind III/Xba I双酶切鉴定，分别得到1852bp和2533bp的为阳性。
经序列测定验证，重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr（图2所示）构建成功，为将zwf-opcA基因（序列2）插入pXMJ19的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入Xba I和Sma I位点间得到的载体。
P40：CCCAAGCTTAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCCCCT(Hind III)
P41：GCTCTAGATTAGACGGTTTCCAGCTTG(Xba I)
将重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr分别电转化至pgi未缺失的工程菌CG160和pgi缺失的工程菌CG161中。以P32和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到4573bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒。
送去测序，L-组氨酸工程菌CG173（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr）含有质粒重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr，为将重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr转入工程菌CG160得到的菌；
CG171（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Δpgi/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr）含有质粒重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr，为将重组质粒pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisGfbr转入工程菌CG161得到的菌。
进一步验证过表达质粒携带基因在工程菌中的表达情况。制备CG171的细胞裂解液，进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，泳道1和2为CG171的细胞裂解液，泳道3为ATCC13032/pXMJ19（将pXMJ19质粒导入ATCC13032中得到）的细胞裂解液，为对照，表明过表达质粒携带的zwf（57.5kDa）、opcA（34.8kDa）prsA（35.6kDa）和hisGfbr（30.2kDa）基因在工程菌中成功表达。
进一步测定工程菌CG171中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Zwf-opcA）的比酶活性。测定反应体系如下(0.5mL)：100mmol/L Tris-HCl(pH7.8),200mmol/L KCl,1mmol/L NADP,10mmol/LMgCl2,5mmol/L6-磷酸葡萄糖(G6P)，适量的细胞裂解液。30℃，反应5min。通过检测340nm处吸光值的变化反映产物NADPH的生成量。酶活单位（U）定义为每分钟生成1nmol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量。结果如图4所示，与野生型菌株相比，通过质粒过表达zwf-opcA，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的比活性提高了34倍。
实施例3、无质粒L-组氨酸高产重组菌CG324的构建
根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的prsA基因及其上下游序列和Psod启动子序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P48和P49为引物扩增prsA启动子上游同源臂；以P50和P51为引物扩增Psod启动子；以P52和P53为引物扩增prsA启动子下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P48和P53为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增，得到1455bp的PCR产物，为含替换启动子Psod及被替换启动子PprsA的上下游同源臂的片段（序列9）。
其中，序列9自5’末端第1-655位核苷酸为被替换启动子PprsA的上游同源臂，序列9自5’末端第656-847位核苷酸为启动子Psod，序列9自5’末端第848-1455位核苷酸为被替换启动子PprsA的下游同源臂。
将上述1455bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1667bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1455bp的为阳性。
将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列9所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为pK18mobsacB-Psod::PprsA。
采用相同的方法构建同源重组质粒pK18mobsacB-Peftu::Ptkt，具体如下：以P54和P55为引物扩增tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子启动子上游同源臂；以P56和P57为引物扩增启动子Peftu；以P58和P59为引物扩增tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子启动子下游同源臂。以P54和P59为引物，采用重叠延伸PCR技术（SOE）扩增。得到1512bp的PCR产物，为含替换启动子Petfu及被替换启动子Ptkt上下游同源臂的长片段（序列10），其中，序列10自5’末端第1-634位核苷酸为被替换启动子Ptkt的上游同源臂，序列10自5’末端第635-834位核苷酸为启动子Peftu，序列10自5’末端第835-1512位核苷酸为被替换启动子Ptkt的下游同源臂。
将上述1512bp的PCR产物经Hind III和BamH I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1724bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Hind III和BamH I双酶切鉴定，得到1512bp的为阳性。将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列10所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为pK18mobsacB-Peftu::Ptkt。
上述所用的引物序列如下：
P48:CCCAAGCTTTCCAGCAACCACCTGGAT(Hind III)
P49:AATTGGCAGCTATTAGCCTTCCTGGTTGTG
P50:CAGGAAGGCTAATAGCTGCCAATTATTCCG
P51:TTGTCCTCCTTTGGGTAAAAAATCCTTTCG
P52:GATTTTTTACCCAAAGGAGGACAACCATGACTGCTCACTGGAA
P53:CGCGGATCCCGCCATTGGGGCATCGCC(BamH I)
P54:CCCAAGCTTTCAACGATCACTGCCCAG(Hind III)
P55:GGGTAACGGCCAGTGTGTCTTAGAAAATG
P56:CTAAGACACACTGGCCGTTACCCTGCGAA
P57:TTGTCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTGGACT
P58:GGAGGACATACAAAAGGAGGACAACCTTGACCACCTTGACGCTG
P59:CGCGGATCCAAGCGATCTCAGTGTTGT(BamH I)
P60:TGTGACCCGCTACCCGATAA
P61:CGTTACCCTGCGAATGTC
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-Psod::PprsA电转化至L-组氨酸重组菌CG161中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P60和P53为引物进行PCR扩增鉴定，得到778bp的为重组菌WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Psod::PprsA-Δpgi，命名为CG323。
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-Petfu::Ptkt电转化至谷氨酸棒杆菌CG323中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P61和P59为引物进行PCR扩增鉴定，得到874bp的为重组菌WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Peftu::Ptkt-Psod::PprsA-Δpgi，命名为谷氨酸棒杆菌CG324。
经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将L-组氨酸重组菌CG161中的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子和prsA基因的启动子分别替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子Peftu和Psod，无质粒L-组氨酸重组菌CG324（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Peftu::Ptkt-Psod::PprsA-Δpgi）构建成功。
实施例4、枯茗酸诱导型L-组氨酸高产重组菌CG322的构建
一、枯茗酸诱导表达载体的构建
分别以恶臭假单胞杆菌F1（购自DSMZ公司）的基因组DNA和谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以P42/P43和P44/P45为引物PCR扩增阻遏蛋白基因cymR（635bp）和Phom（130bp）启动子。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以P46和P47为引物PCR扩增含枯茗酸诱导表达操纵区片段的PglyA启动子，命名为枯茗酸诱导型启动子Pcum（158bp）。
采用重叠延伸PCR将上述三个片段连接，以扩增的Phom、cymR和Pcum为模板，用P42和P47为引物进行PCR扩增，得到923bp的PCR产物为Phom-cymR-Pcum片段（序列8）。
其中，序列8自5’末端第1-635位核苷酸为cymR，序列8自5’末端第636-765位核苷酸为Phom，序列8自5’末端第766-923位核苷酸为Pcum（枯茗酸诱导型启动子）。
将上述PCR产物经Nar I和Hind III双酶切后，与经同样双酶切处理的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pXMJ19连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氯霉素（20μg/mL）的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P28和P33为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到923bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Nar I和Hind III双酶切鉴定，得到923bp的为阳性。经进一步序列测定分析，该质粒为将Phom-cymR-Pcum片段（序列8）插入质粒pXMJ19的Nar I和Hind III酶切位点间得到的载体，命名为重组质粒pWYE1233（图6所示）。
上述所用的引物序列如下：
P42:AGTCATGGCGCCGATCGCGAACTTAAAGCGC(Nar I)
P43:GCTTTGTTTCATTTTCCTCCTGTTGGTACCACTAGTACTCAGGT
P44:AACAGGAGGAAAATGAAACAAAGCCGGTGG
P45:CCACGTCTTTTAGAAAAATCAAAAGTTGCC
P46:TCAAAAGTTGCCTAAAAGACGTGGGCACGT
P47:CCCAAGCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTGCGTAAGACCTCACTC(HindIII)
二、枯茗酸诱导型L-组氨酸初级工程菌CG319的构建
将实施例2中获得的1852bp的prsA-hisGfbr片段（序列3），经Xba I和Sma I双酶切后，与经同样双酶切处理的上述构建的枯茗酸诱导型表达质粒pWYE1233连接。重组质粒构建方法同实施例2中一所述的方法，所获得的重组质粒命名为pWYE1233-prsA-hisGfbr。
pWYE1233-prsA-hisGfbr经进一步序列测定分析，该质粒为将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入质粒pWYE1233的Xba I和Sma I酶切位点间得到的载体。
将质粒pWYE1233-prsA-hisGfbr转化至上述构建的底盘工程菌CG160中，其转化子鉴定方法同实施例2中一所述的方法，L-组氨酸工程菌CG319（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB/pWYE1233-prsA-hisGfbr）构建成功。
三、枯茗酸诱导型L-组氨酸初级工程菌CG320的获得
工程菌CG320为质粒pWYE1233-prsA-hisGfbr导入工程菌CG161中得到的重组菌。
四、枯茗酸诱导型L-组氨酸高产工程菌CG322的构建
将实施例2中获得的2519bp的zwf-opcA片段（序列2）。经Hind III和Xba I双酶切后，先与经同样双酶切处理的表达质粒pWYE1233连接，获得的重组质粒pWYE1233-zwf-opcA再经XbaI和SmaI双酶切，与上述二制备的质粒pWYE1233-prsA-hisGfbrr经Xba I和Sma I双酶切获得的1852bp的prsA-hisGfbr片段连接。重组质粒构建方法同实施例2中三所述的方法，所获得的重组质粒命名为pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbr。
经序列测定验证，重组质粒pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbr构建成功，为将zwf-opcA基因（序列2）插入pWYE1233的Hind III和Xba I位点间，且将prsA-hisGfbr片段（序列3）插入Xba I和Sma I位点间得到的载体。
将过表达质粒pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbr分别电转化至pgi未缺失的工程菌CG160和pgi缺失的工程菌CG161中。L-组氨酸工程菌CG321（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB/pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbr）和CG322（WT-PglyA::PhisEG-hisGfbr-PglyA::PhisDCB-Δpgi/pWYE1233-zwf-opcA-prsA-hisGfbrr）构建成功。
实施例5、L-组氨酸工程菌在生成L-组氨酸中的应用
一、含有质粒的高产L-组氨酸的重组菌发酵
1、含有质粒的高产L-组氨酸工程菌摇瓶发酵
摇瓶发酵采用的发酵培养基具体如下：葡萄糖40，(NH4)2SO420，KH2PO40.5，K2HPO4·3H2O0.5，MgSO4·7H2O0.25，FeSO4·7H2O0.01，MnSO4·H2O0.01，ZnSO4·7H2O0.001，CuSO40.0002，NiCl2·6H2O0.00002，生物素0.0002，pH7.0-7.2，2%CaCO3，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO4·7H2O，以及无机盐离子分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
种子培养基具体如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，生物素50μg，维生素B11mg，安琪酵母粉（FM802）10g/L，安琪蛋白胨（FP318）10g/L。
1）、种子液的获得
将上述实施例二制备的工程菌CG176，CG172，CG173和CG171分别接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度32℃，摇床转速为220r/min，培养时间8h，得到种子液，OD600可为20。
2）、发酵
将种子液按照体积百分含量为3%接种到含有终浓度为10μg/ml氯霉素的发酵培养基（500mL挡板三角瓶装液量为30mL）中，32℃，220r/min，培养72h，并于发酵培养6h时加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行目的基因的诱导表达。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。
收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。
3)、检测L-组氨酸含量
采用高效液相法，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取50μL上述上清液于2mL离心管中，加入200μL NaHCO3水溶液（0.5mol/L，pH9.0）和100μL1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(体积比)，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至25℃，加入650μL KH2PO4水溶液(0.01mol/L，pH7.2±0.05，用NaOH水溶液调整pH，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL。
所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH7.2±0.05，用40g/LKOH水溶液调整pH)，流动相B为55％乙腈水溶液(体积比)，流动相流速为1mL/min，洗脱过程如下表1所示：
表1为洗脱过程
以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。
结果如表2所示。
表2为摇瓶发酵实验中L-组氨酸工程菌CG160，CG176，CG172，CG173和CG171的葡萄糖消耗、最大OD600，比生长速率和L-组氨酸产量
摇瓶发酵实验中，发酵72h，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032未检测到L-组氨酸的积累，底盘菌CG160的L-组氨酸产量为0.03g/L。仅进行L-组氨酸终端代谢途径改造的底盘工程菌CG176的L-组氨酸产量为1.18g/L。在此基础上，单独缺失pgi基因的工程菌CG172的L-组氨酸产量为0.77g/L；单独过表达zwf-opcA的工程菌CG173的L-组氨酸产量为1.50g/L。缺失pgi基因的同时过表达zwf-opcA的工程菌CG171的L-组氨酸产量为2.40g/L，较单独缺失pgi基因的工程菌CG172产量提高了2.1倍，与单独过表达zwf-opcA基因的菌株CG173相比提高了60%，与仅进行L-组氨酸终端代谢途径改造的菌株CG176相比提高了102%。
2、L-组氨酸工程菌CG171发酵罐发酵生产L-组氨酸
种子培养基具体如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，生物素50μg，维生素B11mg，安琪酵母粉（FM802）10g/L，安琪蛋白胨（FP318）10g/L。
发酵采用的发酵培养基具体如下：葡萄糖20g/L，D-葡萄糖酸钠20g/L，硫酸铵20g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4·3H2O0.6g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MnSO4·H2O10mg/L，维生素B10.5mg/L，玉米浆10g/L，甜菜糖蜜10g/L，豆粕水解液15g/L，柠檬酸钠0.5g/L。
1)、种子液的获得
将工程菌CG171接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度32℃，摇床转速为220r/min，培养时间8h，得到种子液，OD600可为20。
2)、发酵
将种子液按照体积百分含量为10%接种到含有终浓度10μg/ml氯霉素的发酵培养基中。
采用的发酵罐为7.5L发酵罐(BioFlo115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加600g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为5-10g/L，同时流加10g/L的安琪酵母粉（FM802）。通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在32℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30%；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。发酵连续进行24h。当OD600=4-5时，加入IPTG（终浓度为1mmol/L）诱导重组质粒携带的基因表达。
收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。
3)、检测L-组氨酸含量
按照上述1的3）的方法检上清液中的L-组氨酸含量，结果如图5所示，可以看出，发酵24h，工程菌的L-组氨酸产量为5.9g/L，生产强度为0.25g/L/h。
二、无质粒L-组氨酸高产重组菌发酵
工程菌CG323、CG324种子液的获得和摇瓶发酵方法同上述一中所述，不同的是发酵过程中不需要加入氯霉素和诱导剂IPTG。
L-组氨酸含量检测同上述一所述。
以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。
摇瓶发酵实验中，发酵72h，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032未检测到L-组氨酸的积累，单独缺失pgi基因构建的工程菌CG323的L-组氨酸产量为0.65g/L，在此基础上同时提高zwf-opcA的表达量构建的工程菌CG324的L-组氨酸产量为1.86g/L。
三、枯茗酸诱导型L-组氨酸工程菌摇瓶发酵
L-组氨酸工程菌CG319，CG320，CG321和CG322种子液的获得和摇瓶发酵方法同上述一中所述，不同的是于发酵培养6h时加入终浓度为0.5mmol/L的枯茗酸（异丙基苯甲酸）进行目的基因的诱导表达。
L-组氨酸含量检测同上述一所述。
以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。
结果如表3所示。
表3为摇瓶发酵实验中L-组氨酸工程菌CG319，CG320，CG321和CG322的葡萄糖消耗、最大OD600，比生长速率和L-组氨酸产量
摇瓶发酵实验中，发酵72h，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032未检测到L-组氨酸的积累，仅进行L-组氨酸终端代谢途径改造的底盘工程菌CG319的L-组氨酸产量为1.03g/L。在此基础上，单独缺失pgi基因的工程菌CG320的L-组氨酸产量为0.72g/L；单独过表达zwf-opcA的工程菌CG321的L-组氨酸产量为1.38g/L。缺失pgi基因的同时过表达zwf-opcA的工程菌CG322的L-组氨酸产量为2.11g/L，较单独缺失pgi基因的工程菌CG320产量提高了1.9倍，与单独过表达zwf-opcA基因的菌株CG321相比提高了53%，与仅进行L-组氨酸终端代谢途径改造的菌株CG319相比提高了105%。

Claims (10)

1.一种构建生产L-组氨酸重组菌的方法，包括如下步骤：降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达，且提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达，得到重组菌；
所述降低出发菌中6-磷酸葡萄糖异构酶的表达通过如下A）或B）方式实现：
A）失活所述出发菌染色体的pgi基因；所述失活具体为敲除；
B）将所述出发菌中的pgi基因的调控元件替换为低转录和低表达活性的调控元件实现；
所述提高所述出发菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和PRPP合成酶的表达通过如下C）或D）方式实现：
C）增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数；
D）将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为P eftu 启动子，且将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子；所述出发菌为棒杆菌属细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述构建重组菌的方法为如下Ⅰ或Ⅱ：
Ⅰ所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，且增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数，得到重组菌；
Ⅱ所示的方法为敲除所述出发菌染色体的pgi基因，将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为P eftu 启动子、且将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述敲除为将含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段导入所述出发菌中进行同源重组；
所述增加所述出发菌中zwf-opcA基因和prsA基因的拷贝数为将zwf-opcA基因和prsA-hisG fbr 片段通过重组载体导入所述出发菌；
所述将所述出发菌染色体上的tkt-tal-zwf-opcA-devB操纵子的启动子替换为P eftu 启动子为将含有P eftu 启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组；
所述将所述出发菌染色体上的prsA基因的启动子替换为Psod启动子为将含有Psod启动子的片段导入所述出发菌中进行同源重组。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述含欲敲除基因pgi的上下游同源臂的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述zwf-opcA基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述prsA-hisG fbr 片段的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述重组载体为将所述zwf-opcA基因和所述prsA-hisG fbr 片段插入表达载体得到的载体；
所述P eftu 启动子的核苷酸序列为序列表中的序列10自5’末端第635-834位核苷酸；
所述含有P eftu 启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列10；
所述含有P sod 启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列9。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将细菌染色体上的l-组氨酸合成操纵子的启动子替换为 P glyA 启动子，且将所述细菌染色体上的hisG基因进行点突变，得到出发菌；
所述l-组氨酸合成操纵子为hisEG和hisDCB；
所述P glyA 启动子的核苷酸序列为序列表中序列4的第863-1052位核苷酸或序列表中序列5的第752-941位核苷酸；
所述点突变为将所述细菌染色体的hisG基因编码的蛋白的第215位天冬酰胺变为赖氨酸、第231位亮氨酸变为苯丙氨酸和第235位苏氨酸变为丙氨酸。
6.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述将细菌染色体上的l-组氨酸合成操纵子的启动子替换为 P glyA 启动子为将含有hisEG的P glyA 启动子的片段和含有hisDCB的P glyA 启动子的片段导入细菌中进行同源重组；
所述含有hisEG的P glyA 启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述含有hisDCB的P glyA 启动子的片段的核苷酸序列为序列表中的序列5。
8.由权利要求1-7中任一所述方法构建的重组菌。
9.权利要求8所述的重组菌在制备l-组氨酸中的应用。
10.一种制备l-组氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求8所述的重组菌，即得到L-组氨酸。
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