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ES2401607T3 - Bacteria que puede producir una sustancia de purina y procedimiento para producir una sustancia de purina - Google Patents

Bacteria que puede producir una sustancia de purina y procedimiento para producir una sustancia de purina Download PDF

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ES2401607T3
ES2401607T3 ES07741792T ES07741792T ES2401607T3 ES 2401607 T3 ES2401607 T3 ES 2401607T3 ES 07741792 T ES07741792 T ES 07741792T ES 07741792 T ES07741792 T ES 07741792T ES 2401607 T3 ES2401607 T3 ES 2401607T3
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purine
gene
protein
bacterium
amino acid
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Takayuki Asahara
Kiyoshi Matsuno
Yukiko Mori
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Abstract

Procedimiento para producir una sustancia derivada de purina, que comprende: cultivar una bacteria perteneciente al género Bacillus que presenta una capacidad de producir una sustanciaderivada de purina en un medio para provocar la acumulación de la sustancia derivada de purina en células de labacteria o el medio, y recoger la sustancia derivada de purina a partir de las células o del medio, en el que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa sereduce en comparación con una cepa no modificada mediante la alteración de un gen codificante de fructosabisfosfatasa, o reduciendo la cantidad de expresión del gen codificante de fructosa bisfosfatasa,en el que el gen codificante de fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B)siguientes: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 que incluye sustituciones,deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad defructosa bisfosfatasa, y en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo queconsiste en inosina, xantosina, guanosina y adenosina o un nucleótido de purina seleccionado de entre elgrupo que consiste en ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico.

Description

Bacteria que puede producir una sustancia de purina y procedimiento para producir una sustancia de purina.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir sustancias derivadas de purina, tales como nucleótidos de purina, incluyendo típicamente el ácido 5'-inosínico y el ácido 5'-guanílico, y nucleótidos de purina tales como la inosina y la guanosina, las cuales son sustancias importantes como materias primas para la síntesis de los nucleótidos de purina, utilizando una bacteria perteneciente al género Bacillus utilizada para el procedimiento. Las sustancias derivadas de purina resultan útiles como condimentos, fármacos, materias primas de los mismos, y otros.
Antecedentes de la técnica
Son conocidos procedimientos para producir inosina y guanosina mediante la fermentación utilizando cepas auxotróficas de adenina de bacterias Bacillus y derivados de las mismas dotadas adicionalmente de resistencia a diversos fármacos, tales como análogos de purina (documentos de patente nº 1 a nº 8), y microorganismos de este tipo del género Brevibacterium (documentos de patente nº 9 y nº 10, documento no de patente nº 1), etc.
Dichas cepas mutantes típicamente se obtienen mediante tratamiento de un microorganismo con irradiación ultravioleta o nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina) y selección de un mutante diana utilizando un medio de selección adecuado.
Además, también se han cultivado cepas que producen sustancias derivadas de purina utilizando técnicas de ingeniería genética en bacterias Bacillus (documentos de patente nº 11 a nº 20), en bacterias Brevibacterium (documento de patente nº 21) y bacterias Escherichia (documento de patente nº 22). Específicamente, por ejemplo, se da a conocer un procedimiento para producir eficientemente un compuesto derivado de ácidos nucleicos, tal como hipoxantina, uracilo, guanina y adenina con una bacteria Bacillus en la que se ha interrumpido un gen (purR) codificante del represor del operón de la purina (documento de patente nº 23).
En Bacillus subtilis, el represor del operón de la purina tal como se ha indicado anteriormente es conocido que regula, aparte de los genes del operón de la purina, el gen purA, que participa en la biosíntesis del AMP (documento no de patente nº 2), el gen glyA, que participa en la biosíntesis del ácido formiltetrahidrofólico (documento no de patente nº 3), el gen pbuG, que codifica el transportador de hipoxantina/guanina (documento no de patente nº 4), y otros.
Además, se da a conocer un microorganismo que produce eficientemente inosina derivado al proporcionar auxotrofía de la adenina mediante la interrupción del gen de la succinil-AMP sintasa (purA), además de la interrupción del gen purR y la supresión de la descomposición de la inosina en hipoxantina por la interrupción del gen de la purina nucleósido fosforilasa (deoD), y un procedimiento para producir inosina utilizando el microorganismo (documento de patente nº 8).
La fructosa bisfosfatasa es uno de los enzimas gluconeogénicos, que cataliza la reacción de generación de fructosa6-fosfato a partir de fructosa-1,6-bisfosfato. Se conoce poco sobre la relación entre este enzima y la ruta biosintética de las sustancias derivadas de purinas y no se ha intentado producir una bacteria productora de sustancia derivada de purina mediante la reducción de la actividad de este enzima.
Documento de patente nº 1: publicación de patente japonesa (KOKOKU) nº 38-23099.
Documento de patente nº 2: publicación de patente japonesa nº 54-17033.
Documento de patente nº 3: publicación de patente japonesa nº 55-2956.
Documento de patente nº 4: publicación de patente japonesa nº 55-45199.
Documento de patente nº 5: publicación de patente japonesa nº 57-14160.
Documento de patente nº 6: publicación de patente japonesa nº 57-41915.
Documento de patente nº 7: patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 59-42895.
Documento de patente nº 8: patente japonesa abierta al público nº 2004-242610.
Documento de patente nº 9: publicación de patente japonesa nº 51-5075.
Documento de patente nº 10: publicación de patente japonesa nº 58-17592. Documento de patente nº 11: patente japonesa abierta al público nº 58-158197. 5 Documento de patente nº 12: patente japonesa abierta al público nº 58-175493. Documento de patente nº 13: patente japonesa abierta al público nº 59-28470. Documento de patente nº 14: patente japonesa abierta al público nº 60-156388. 10 Documento de patente nº 15: patente japonesa abierta al público nº 1-27477. Documento de patente nº 16: patente japonesa abierta al público nº 1-174385. 15 Documento de patente nº 17: patente japonesa abierta al público nº 3-58787. Documento de patente nº 18: patente japonesa abierta al público nº 3-164185. Documento de patente nº 19: patente japonesa abierta al público nº 5-84067. 20 Documento de patente nº 20: patente japonesa abierta al público nº 5-192164. Documento de patente nº 21: patente japonesa abierta al público nº 63-248394. 25 Documento de patente nº 22: publicación de patente internacional nº WO99/03988 Documento de patente nº 23: patente US nº 6.284.495. Documento no de patente nº 1: Agric. Biol. Chem. 42:399-405, 1978. 30 Documento no de patente nº 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7455-7459, 1995. Documento no de patente nº 3: J. Bacteriol. 183:6175-6183, 2001. 35 Documento no de patente nº 4: J. Bacteriol. 185:5200-5209, 2003.
Exposición de la invención Objetivos que deben ser alcanzados por la invención
40 Un objetivo de la presente invención es construir una bacteria Bacillus adecuada para la producción mediante fermentación de sustancias derivadas de purinas, tales como nucleósidos purina y/o nucleótidos purina, y proporcionar un procedimiento para producir sustancias derivadas de purina utilizando dicha bacteria.
45 Medios para alcanzar el objetivo
En el contexto de la presente invención se han llevado a cabo diversas investigaciones con el fin de alcanzar el objetivo anteriormente indicado. En consecuencia, se ha descubierto que, al reducir la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa de la ruta de la gluconeogénesis en una bacteria Bacillus, se mejora la capacidad de la bacteria 50 de producir un nucleósido de purina o un nucleótido pura, y han llevado a cabo la presente invención.
De esta manera, la presente memoria da a conocer lo siguiente.
(1) Una bacteria perteneciente al género Bacillus que presenta la capacidad de producir sustancias derivadas de 55 purinas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que se ha reducido la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa.
(2) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en inosina, xantosina, 60 guanosina y adenosina.
(3) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la sustancia derivada de purina es un nucleótido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico. 65
(4)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que se ha reducido la actividad de fructosa bisfosfatasa mediante la interrupción de un gen codificante de la fructosa bisfosfatasa.
(5)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que el gen codificante de la fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una de las proteínas (A) o (B) siguientes:
(A)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1,
(B)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno o varios residuos aminoácidos y presenta actividad de fructosa bisfosfatasa.
(6)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa.
(7)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que se ha modificado adicionalmente de manera que se incremente la cantidad de expresión del operón de purina.
(8)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la cantidad de expresión del operón de purina se incrementa mediante la interrupción del gen purR, que es un gen codificante de un represor del operón de purina.
(9)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que ha sido modificada adicionalmente de manera que se reduzca la actividad de nucleósido de purina fosforilasa.
(10)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que ha sido modificada adicionalmente de manera que se ha reducido la actividad de IMP deshidrogenasa.
(11)
La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que es Bacillus subtilis.
(12)
Un procedimiento para producir una sustancia derivada de purina, que comprende cultivar la bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente en un medio con el fin de provocar la acumulación de una sustancia derivada de purina en células de la bacteria o en el medio, y recoger la sustancia derivada de purina de las células o del medio.
(13)
El procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina o un nucleótido de purina.
(14)
El procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste de inosina, xantosina, guanosina y adenosina.
(15)
El procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, en el que la sustancia derivada de purina es un nucleótido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico.
(16)
Un procedimiento para producir un nucleótido de purina, que comprende producir un nucleósido de purina mediante el procedimiento descrito anteriormente, hacer reaccionar el nucleósido de purina con un donante de fosfatos seleccionado de entre el grupo que consiste de ácido polifosfórico, fosfato de fenilo y fosfato de carbamilo, y un microorganismo que presenta la capacidad de producir un éster de ácido nucleósido-5'-fosfórico o fosfatasa ácida para producir un nucleótido de purina, y recoger el nucleótido de purina.
Mejor modo de poner en práctica la invención
<1> Bacteria Bacillus
(I) Provisión de la capacidad de producir una sustancia derivada de purina.
En la presente invención, la expresión "de actividad reducida" comprende un estado en que la actividad es inferior a la actividad en una cepa no modificada, tal como una bacteria Bacillus de tipo salvaje, y un estado en el que la actividad ha sido sustancialmente eliminada.
La bacteria Bacillus indicada en la presente memoria es una bacteria Bacillus que presenta la capacidad de producir una sustancia derivada de purina y que ha sido modificada de manera que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa ha sido reducida.
La expresión "sustancia derivada de purina" se refiere a una sustancia que presenta un esqueleto de purinas, y entre los ejemplos de la misma se incluyen los nucleósidos de purina, los nucleótidos de purina, etc. Entre los nucleósidos
de purina se incluyen inosina, xantosina, guanosina, adenosina y otros, y entre los nucleótidos de purina se incluyen los ésteres de ácido 5'-fosfórico de nucleósidos de purina, denominados en adelante "IMP"), ácido xantílico (xantosín-5'-fosfato, en adelante también denomiada "XMP"), ácido guanílico (guanosín-5'-monofosfato, en adelante denominado "GMP"), ácido adenílico (adenosín-5'-monofosfato, en adelante denominado "AMP"), y otros.
La expresión "capacidad de producir una sustancia derivada de purina" se refiere a la capacidad de la bacteria Bacillus indicada en la presente memoria de producir, secretar o causar la acumulación de una sustancia derivada de purina en las células bacterianas o en un medio en el que se cultiva la bacteria, en grado suficiente para poder recoger la sustancia derivada de purina a partir de las células o del medio. La bacteria Bacillus indicada en la presente memoria puede presentar una capacidad de producir dos o más tipos de las sustancias derivadas de purina anteriormente indicadas.
La bacteria Bacillus que presenta la capacidad de producir una sustancia derivada de purina puede ser una bacteria que presenta inherentemente la capacidad de producir una sustancia derivada de purina, o una bacteria obtenible mediante la modificación de dichas bacterias Bacillus tal como se indica posteriormente utilizando una técnica de mutagénesis o de ADN recombinante de manera que presenten la capacidad de producir una sustancia derivada de purina. Además, puede ser una bacteria Bacillus a la que se proporciona la capacidad de producir una sustancia derivada de purina o en la que se incrementa la capacidad de producir una sustancia derivada de purina mediante la modificación de la bacteria de manera que se reduzca la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa, de la manera descrita posteriormente.
En la presente invención, la expresión "se reduce la actividad enzimática" comprende un estado en el que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa indicada anteriormente o un enzima que descompone una sustancia derivada de purina indicada posteriormente, tal como la inosina monofosfato (IMP) deshidrogenasa o similar, es inferior a la de una cepa no modificada, por ejemplo una cepa de tipo salvaje de la bacteria Bacillus, y un estado en el que la actividad ha sido sustancialmente eliminada. Lo mismo resulta de aplicación a la actividad del represor de operón de purina indicado posteriormente.
Entre los ejemplos de la bacteria Bacillus utilizada para la bacteria Bacillus del presente procedimiento se incluyen Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus pumilus.
Entre los ejemplos de Bacillus subtilis se incluyen Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC nº 6051), Bacillus subtilis PY79 (Plasmid 12:1-9, 1984) y otros, y entre los ejemplos de Bacillus amyloliquefaciens se incluyen Bacillus amyloliquefaciens T (ATCC nº 23842), Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC nº 23845), y otros. Entre los ejemplos de Bacillus pumilus se incluyen Bacillus pumilus Gottheil nº 3218 (ATCC nº 21005, patente US nº 3.616.206), y otros. Estas cepas pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América).
Puede obtenerse una bacteria Bacillus que presenta la capacidad de producir una sustancia derivada de purina proporcionando, por ejemplo, auxotrofía de nucleósido de purina o resistencia a un fármaco tal como un análogo de purina, a dicha bacteria Bacillus tal como se ha indicado anteriormente (publicaciones de patente japonesa nº 3823099, nº 54-17033, nº 55-45199, nº 57-14160, nº 57-41915 y nº 59-42895). Puede obtenerse una bacteria Bacillus que presente auxotrofía o resistencia a fármacos mediante el tratamiento de la bacteria con mutágeno utilizado para la mutagénesis habitual, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o EMS (metanosulfonato de etilo).
Entre los ejemplos de bacterias Bacillus que producen un nucleósido de purina se incluyen los siguientes.
A título de ejemplo específico de cepa productora de inosina perteneciente al género Bacillus, puede utilizarse la cepa Bacillus subtilis KMBS16. Esta cepa se deriva de la cepa conocida Bacillus subtilis trpC2 (168 Marburg), en la que se encuentran interrumpidos el gen purR codificante del represor de operón de purina (purR::spc), el gen purA codificante de la succinil-AMP sintasa (purA:.erm) y el gen deoD codificante de una nucleósido de purina fosforilasa (deoD::kan) (patente japonesa abierta al público nº 2004-242610, documento US 2004/166575A1). También puede utilizarse la cepa Bacillus subtilis AJ3772 (FERM P-2555, patente japonesa abierta al público nº 62-014794) y otros.
Entre los ejemplos de bacterias Bacillus que presentan una capacidad de producir guanosina se incluyen una bacteria Bacillus que presenta una actividad de IMP deshidrogenasa incrementada (patente japonesa abierta al público nº 3-58787), una bacteria Bacillus que se obtiene mediante la introducción de un vector que comprende un gen que proporciona resistencia a análogos de purina o a decoyinina en un mutante auxotrófico para la adenina (publicación de patente japonesa nº 4-28357) y otros.
Entre los ejemplos de bacterias Bacillus que producen un nucleótido de purina se incluyen los siguientes.
A modo de bacteria Bacillus productora de ácido inosínico, se ha informado de cepas productoras de inosina de Bacillus subtilis que presentan actividad de fosfatasa atenuada (Uchida K. et al., Agr. Biol. Chem. 25:804-805, 1961; Fujimoto M., Uchida K., Agr. Biol. Chem. 29:249-259, 1965). Entre los ejemplos de bacterias Bacillus productoras de ácido guanílico se incluyen mutantes de bacterias Bacillus que presentan auxotrofia para la adenina, resistencia a la
decoyinina o al sulfóxido de metionina, y capacidad de producir ácido 5'-guanílico (guanosín-5'-monofosfato, en adelante denominado "GMP") (publicación de patente japonesa nº 56-12438).
Además, puede construirse una bacteria productora de ácido xantílico mediante el procedimiento utilizado para cultivar las bacterias corineformes, incluyendo Corynebacterium ammoniagenes. Por ejemplo, mediante la obtención de una cepa potenciada para la PRPP amidotransferasa (patente japonesa abierta al público nº 8-168383), una cepa resistente a aminoácidos alifáticos (patente japonesa abierta al público nº 4-262790) o una cepa resistente a la deshidroprolina (publicación de patente surcoreana no examinada nº 2003-56490), puede construirse una bacteria productora de ácido xantílico.
Además, un ejemplo de un procedimiento para cultivar bacterias Bacillus que presentan la capacidad de producir una sustancia derivada de purina también incluye el incremento en las células bacterianas de las actividades de los enzimas participantes en la biosíntesis de las purinas que son comunes a la biosíntesis de los nucleósidos de purina y de los nucleótidos de purina, es decir, los enzimas de biosíntesis de las purinas. La actividad del enzima en las células preferentemente se incrementa hasta un nivel superior al de una cepa no modificada de bacteria Bacillus, por ejemplo una bacteria Bacillus de tipo salvaje. La expresión "se incrementa la actividad" comprende, por ejemplo, el caso de que se incremente el número de moléculas de enzima en cada célula, y el caso del incremento de la actividad específica por molécula de enzima, y otros. Por ejemplo, la actividad puede incrementarse mediante el incremento del nivel de expresión del gen del enzima.
Entre los ejemplos de un enzima implicado en la biosíntesis de las purinas se incluyen, por ejemplo, fosforibosil pirofosfato amidotransferasa, fosforibosil pirofosfato sintetasa (PRPP sintetasa [EC: 2.7.6.1]), y otros.
Algunos de los catabolitos producidos mediante el metabolismo de las fuentes de azúcares tales como la glucosa y que fluyen hasta la ruta de las pentosas fosfato se convierten en ribosa-5-fosfato pasando por ribulosa-5-fosfato. A partir de la ribosa-5-fosfato biosintetizada, se produce PRPP, que es un precursor indispensable de las biosíntesis de nucleósido de purina, histidina y triptófano. Específicamente, la ribosa-5-fosfato es convertida en PRPP por la fosforibosil pirofosfato sintetasa. Por lo tanto, puede proporcionarse una capacidad de producir una sustancia derivada de purinas a una bacteria Bacillus mediante modificación, de manera que se incremente la actividad de PRPP sintetasa de la misma.
La expresión "se incrementa la actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa" se refiere a que se incrementa la actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa en comparación con una cepa no modificada, tal como una cepa de tipo salvaje o una cepa parental. La actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa puede medirse mediante, por ejemplo, el procedimiento de Switzer et al. (Methods Enzymol. 51:3-11, 1978) o de Roth et al. (Methods Enzymol. 51:12-17, 1978). Puede producirse una bacteria Bacillus en la que se haya incrementado la actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa mediante, por ejemplo, el incremento de la expresión de un gen codificante de la fosforibosil pirofosfato sintetasa en una bacteria Bacillus según un procedimiento de utilización de un plásmido que contiene el gen, o mediante la integración del gen en un cromosoma, lo que puede llevarse a cabo de la misma manera que en el procedimiento descrito en la patente japonesa abierta al público nº 2004-242610. Aunque el gen prs de SEC ID nº 3 derivado de una bacteria Bacillus (GenBank nº de acceso X16518) puede mencionarse como el gen codificante de la fosforibosil pirofosfato sintetasa utilizable para la presente invención, pueden utilizarse cualesquiera genes derivados de otras bacterias, animales o plantas codificantes de una proteína que presente la actividad de fosforibosil pirofosfato sintetasa.
Además, tras producirse PRPP, que es un precursor indispensable de las biosíntesis de los nucleósidos de purina, de la histidina y del triptófano, parte de la misma es convertida en nucleótidos de purina y nucleósidos de purina por enzimas implicados en la biosíntesis de las purinas. Entre los ejemplos de genes codificantes de dichos enzimas se incluyen los genes del operón de purinas de Bacillus subtilis, específicamente los genes del operón purEKBpurC(orf) QLF-purMNH (J)-purD (Ebbole D.J. y Zalkin H., J. Biol. Chem. 262(17):8274-87, 1987) (en la actualidad, también denominado purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, editor jefe: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, nº de acceso GenBank NC_000964) y los genes del regulón pur de Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, segunda edición, editor jefe: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el incremento de la expresión de dichos genes proporciona o incrementa la capacidad de producir una sustancia derivada de purina. Además, los genes del operón de purina que pueden utilizarse para la presente invención no se encuentran limitados a ellos y también pueden utilizarse genes derivados de otros microorganismos, animales y plantas.
Entre los ejemplos del procedimiento para incrementar el nivel de expresión del operón de purina se incluyen incrementar la expresión de genes del operón de purina en una bacteria Bacillus mediante un procedimiento de utilización de un plásmido que contiene los genes o integrando los genes en un cromosoma o similar.
El segundo procedimiento para incrementar el nivel de expresión del operón de purina incluye sustituir un promotor del operón de purina por uno más fuerte, y sustituir la región -35 o -10 del promotor nativo por una secuencia de consenso.
Por ejemplo, en Bacillus subtilis (cepa de B. subtilis 168 Marburg, ATCC nº 6051), la secuencia -35 del operón de purina es una secuencia de consenso (TTGACA), pero la secuencia -10 es TAAGAT, que es diferente de la secuencia de consenso TATAAT (Ebbole D.J. y H. Zalikn, J. Biol. Chem. 262:8274-8287, 1987). Por lo tanto, mediante la modificación de la secuencia -10 (TAAGAT) por la secuencia de consenso similar TATAAT, TATGAT o TAAAAT, puede incrementarse la actividad transcripcional del operón de purina. Puede sustituirse una secuencia de promotor mediante el mismo procedimiento que el de la sustitución génica, el cual se describe a continuación.
El tercer procedimiento para incrementar el nivel de expresión del operón de purina incluye reducir el nivel de expresión del represor del operón de purina (patente US nº 6.284.495). La expresión "expresión de un represor del operón de purina" incluye tanto la transcripción de un gen del operón de purina como la traducción de un producto de transcripción. Además, la expresión "se reduce el nivel de expresión" incluye el caso de que el nivel de expresión sea inferior al de una cepa no modificada, tal como una bacteria Bacillus de tipo salvaje, y el caso en que la expresión ha sido sustancialmente eliminada.
El nivel de expresión del represor del operón de purina (represor de purina) puede reducirse mediante, por ejemplo, el tratamiento de una bacteria Bacillus con irradiación de rayos ultravioleta o los mutágenos utilizados en el tratamiento habitual de mutagénesis, tal como NTG o EMS, y realizarse la selección de un mutante que muestre un nivel de expresión reducido del represor de purina.
Además, también puede obtenerse una bacteria Bacillus que muestre un nivel de expresión reducida del represor de purina mediante, por ejemplo, además de un tratamiento de mutagénesis, la sustitución de un gen codificante del represor de purina situado en un cromosoma (purR, GenBank nº de acceso NC_000964; la región codificante corresponde a los números de nucleótido 54439 a 55293, SEC ID nº 5) por un gen correspondiente que no funciona con normalidad (en adelante también denominado "gen de tipo interrumpido") mediante recombinación homóloga utilizando una técnica de recombinación génica (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972; Matsuyama S. y Mizushima S., J. Bacteriol. 162:1196-1202, 1985).
Por ejemplo, un gen de tipo interrumpido para un gen normal puede sustituirse por un gen de tipo interrumpido en el cromosoma del huésped de la manera que se indica a continuación. A continuación se explica la interrupción del gen purR. De manera similar, pueden interrumpirse otros genes, tales como purA, deoD, guaB y fbp.
Al introducir en una célula un plásmido o similar que presenta una secuencia homóloga respecto a una secuencia en el cromosoma y que no es capaz de replicarse en células bacterianas de Bacillus, resultando en la recombinación a una determinada frecuencia en el sitio de la secuencia que presenta la homología, se recombina el plásmido entero con el cromosoma. Si posteriormente se produce adicionalmente recombinación en el sitio de la secuencia que presenta homología en el cromosoma, el plásmido resulta extraído del cromosoma. En este momento, dependiendo del sitio en que se produzca la recombinación, puede mantenerse el gen de tipo interrumpido dentro del cromosoma y el gen normal original puede resultar extraído del mismo conjuntamente con el plásmido. Mediante la selección de dicha cepa, resulta posible obtener una cepa en la que el gen purR normal en el cromosoma ha sido sustituido por el gen purR de tipo interrumpido.
Dichas técnicas de interrupción génica basadas en la recombinación homóloga ya están establecidas y entre ellas se incluye un procedimiento que utiliza un ADN lineal, un procedimiento que utiliza un plásmido sensible a la temperatura, y otros. Además, el gen purR también puede interrumpirse mediante la utilización de un plásmido que contiene el gen purR en el que se ha insertado un gen marcador tal como un gen de resistencia a fármacos y que no es capaz de replicarse en la célula bacteriana diana. Es decir, en un transformante que ha sido transformado con dicho plásmido tal como se ha indicado anteriormente, se ha incorporado el gen marcador en el ADN cromosómico, proporcionando resistencia a fármacos. Debido a que el gen marcador se incorpora en el cromosoma a una tasa elevada mediante recombinación homóloga de las secuencias del gen puR en el plásmido que flanquean el gen marcador en el plásmido con el gen purR en el cromosoma, puede seleccionarse eficientemente una cepa con gen purR interrumpido.
El gen purR de tipo interrumpido utilizado para la interrupción génica puede obtenerse mediante, específicamente, la deleción de una región determinada del gen purR mediante digestión con un enzima de restricción y la religación, insertando otro fragmento de ADN (gen marcador, etc.) en el gen purR, o provocando la sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la región codificante, región promotora o similar del gen purR mediante una mutagénesis específica de sitio (Kramer W. y Frits H.J., Methods in Enzymology 154:350-367, 1987) o mediante PCR recombinante (PCR Technology, Stockton Press, 1989) o mediante tratamiento con un agente químico tal como hiposulfito sódico o hidroxilamina (Shortle D. y Nathans D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:2170-2174, 1978), seguido de la selección de una cepa en la que la actividad del represor codificado por el gen purR se haya reducido o en la que la transcripción del gen se haya reducido. Entre estos procedimientos resulta preferente la deleción de una región determinada del gen purR mediante digestión con un enzima de restricción y la religación o inserción de otro fragmento de ADN, en vista de la fiabilidad y estabilidad. La región determinada del gen purR que debe delecionarse puede ser una secuencia 5'terminal, una secuencia interna o una secuencia 3'-terminal del gen purR. Sin embargo, en el caso de que la región
constituya 90% o más, más preferentemente 95% o más, particularmente 97% o más, de la longitud completa del gen purR, se incrementa la certidumbre de la reducción de la actividad de represor. Además, en el caso de que se produzca una mutación por desplazamiento de marco mediante deleción o inserción de nucleótidos en la región codificante del gen purR, resulta preferible provocar la deleción o la inserción de nucleótidos en múltiples sitios y provocar la deleción o la inserción de nucleótidos en el lado del extremo 3', en vista de que se reducirá con seguridad la actividad de represor.
La reducción de la actividad de represor de purina también puede conseguirse, aparte de la interrupción génica anteriormente indicada, mediante la introducción en el gen purR en el cromosoma de una mutación que reduzca la actividad intracelular de represor de purina basándose en un procedimiento convencional de mutagénesis. Por ejemplo, puede conseguirse mediante la introducción de una sustitución de aminoácido (mutación de sentido erróneo), un codón de parada (mutación sin sentido) o una mutación por desplazamiento de marco que añada o delecione uno o dos nucleótidos, o mediante la deleción parcial o total del gen. Además, la actividad del represor también puede reducirse mediante la inserción de un trasposón en el gen purR en el cromosoma.
La reducción de la actividad del represor de purina también puede conseguirse mediante la sustitución de una secuencia de control de la expresión del gen purR, tal como un promotor en el ADN cromosómico, por una más débil. Se define la potencia de un promotor a partir de la frecuencia de actos de inicio de síntesis de ARN. Se describen ejemplos de procedimientos para evaluar la potencia de los promotores y los promotores fuertes en el artículo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev. 1:105-128, 1995), y otros. Además, también resulta posible introducir una sustitución de nucleótido para varios nucleótidos en una región promotora de un gen diana y de esta manera modificar el promotor, debilitándolo, tal como se da a conocer en la publicación de patente internacional nº WO00/18935. Además, es conocido que la sustitución de varios nucleótidos en el espaciador entre el sitio de unión ribosómica (RBS) y el codón de inicio, en particular una secuencia situada inmediatamente cadena arriba del codón de inicio, afecta mucho a la eficiencia de traducción del ARNm. Esta modificación del RBS puede combinarse con una reducción de la transcripción de un gen diana.
Además, puede prepararse un ADN recombinante en el que se introduzca una mutación que inestabilice el ARN mensajero transcrito a partir del gen purR, y transformarse en una bacteria huésped Bacillus.
Las actividades de los enzimas codificados por los genes purA, deoD, guaB y fbp indicados posteriormente también pueden reducirse de la misma manera que anteriormente.
El gen purR puede obtenerse a partir de un ADN cromosómico de un microorganismo que presente el operón de purina, mediante PCR con oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia de nucleótidos conocida del gen purR como cebador. El gen purR también puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADN cromosómica de un microorganismo que presente el operón de purina, mediante hibridación utilizando un oligonucleótido preparado basándose en la secuencia de nucleótidos conocida del gen purR a modo de sonda. Se ha informado de la secuencia de nucleótidos del gen purR de la cepa Bacillus subtilis 168 Marburg (GenBank nº de acceso D26185 (la región codificante corresponde a los números de nucleótido 118041 a 118898) o NC_000964 (la región codificante corresponde a los números de nucleótido 54439 a 55296). La secuencia de nucleótidos del gen purR y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen se muestra en SEC ID nº 5 y nº 6 del listado de secuencias (patente japonesa abierta al público nº 2004-242610).
Los cebadores utilizados en la PCR para obtener el gen purR pueden ser cualesquiera de los que permiten amplificar una parte o la longitud completa del gen purR, y entre los ejemplos específicos se incluyen los oligonucléotidos que presentan las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID nº 15 (GAAGTTGATGATCAAAA) y SEC ID nº 16 (ACATATTGTTGACGATAAT).
Entre los ejemplos del gen marcador indicado anteriormente se incluyen genes de resistencia a fármacos tales como el gen de resistencia a la espectinomicina y el gen de resistencia a la canamicina. El gen de resistencia a la espectinomicina de Enterococcus faecalis puede obtenerse mediante la preparación del plásmido pDG1726 a partir de la cepa Escherichia coli ECE101 disponible del Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) y la eliminación del gen de resistencia en forma de un casete del plásmido. El gen de resistencia a la eritromicina de Staphylococcus aureus puede obtenerse mediante la preparación del plásmido pDG646 de la cepa Escherichia coli ECE91 disponible comercialmente del Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) y eliminación del gen de resistencia en forma de un casete del plásmido. El gen de resistencia a la canamicina derivado de Streptococcus faecalis puede obtenerse mediante la preparación del plásmido pDG783 a partir de la cepa Escherichia coli ECE94 disponible comercialmente del Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) y la eliminación del gen de resistencia en forma de un casete del plásmido. Además, el gen de resistencia al cloranfenicol de Staphylococcus aureus puede obtenerse mediante la preparación del plásmido pC194 a partir de la cepa Bacillus subtilis 1E17 disponible comercialmente del Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) y realizando una PCR utilizando ese plásmido como molde para amplificar el plásmido.
Al utilizar un gen de resistencia a fármaco como el gen marcador, puede obtenerse una cepa con interrupción del gen purR mediante la inserción de un gen de resistencia a fármaco en el gen purR en un plásmido en un sitio
apropiado, la transformación de un microorganismo con el plásmido obtenido y la selección de un transformante que se haya convertido en resistente a un fármaco. La interrupción del gen purR en el cromosoma puede confirmarse mediante análisis del gen purR o del gen marcador en el cromosoma utilizando la transferencia southern o la PCR. La incorporación de los genes de resistencia a la espectinomicina, a la eritromicina o a la canamicina anteriormente indicados en un ADN cromosómico puede confirmarse mediante PCR utilizando cebadores que puedan amplificar estos genes.
También es conocido que la expresión del operón de purina se encuentra regulado por el terminador-secuencia antiterminador situados cadena abajo del promotor (en adelante denominado secuencia atenuadora) (Ebbole D.J. y Zalkin H., J. Biol. Chem. 262:8274-8287, 1987; Ebbole D.J. y Zalkin H., J. Biol. Chem. 263:10894-10902, 1988; Ebbole D.J. y Zalkin H., J. Bacteriol. 171:2136-2141, 1989). Por lo tanto, el nivel de expresión del operón de purina puede incrementarse mediante deleción de la secuencia atenuadora. La deleción de la secuencia atenuadora puede llevarse a cabo mediante el mismo procedimiento que el utilizado para la interrupción de purR.
Con el fin de incrementar adicionalmente la transcripción del operón de purina, pueden combinarse los procedimientos descritos anteriormente. Por ejemplo, puede interrumpirse el gen purR, y además, el operón de purina del que se ha delecionado la secuencia atenuadora puede amplificarse utilizando un plásmido o pueden introducirse múltiples copias de dicho operón de purina en un cromosoma.
Las actividades de un enzima que participa en la biosíntesis de las purinas también pueden incrementarse mediante la desensibilización del enzima que participa en la biosíntesis de las purinas a la regulación de la misma, según el procedimiento anteriormente indicado de desensibilización de un enzima a la inhibición por retroalimentación (documento WO 99/03988).
Además, la capacidad de producir sustancias derivadas de purinas también puede incrementarse mediante atenuación de la incorporación de sustancias derivadas de purinas por parte de las células. Por ejemplo, la incorporación de nucleósidos de purina por parte de las células puede atenuarse mediante el bloqueo de una reacción implicada en la incorporación de nucleósidos de purina por parte de las células. Un ejemplo de la reacción implicada en la incorporación de los nucleósidos de purina por parte de las células incluye las reacciones provocadas por las nucleósido permeasas.
Además, al producirse un nucleósido de purina, puede reducirse la actividad de un enzima que descompone el nucleósido de purina con el fin de incrementar la capacidad de producir un nucleósido de purina. Un ejemplo de dicho enzima incluye la purina nucleósido fosforilasa.
Los nucleótidos de purina biosintetizados a partir de PRPP por enzimas participantes en la biosíntesis de las purinas se desfosforilan y convierten de esta manera en un nucleósido de purina. Para provocar eficientemente la acumulación de un nucleósido de purina, resulta preferible reducir la actividad de las purina nucleósido fosforilasas, que degradan adicionalmente los nucleósidos de purina en hipoxantina o similar. Es decir, resulta preferible atenuar
o eliminar la actividad de una purina nucleósido fosforilasa que utilice nucleósidos de purina, tales como la inosina, a modo de sustrato.
Específicamente, la actividad de purina nucleósido fosforilasa puede reducirse mediante la interrupción de los genes deoD y pupG codificantes de la purina nucleósido fosforilasa en las bacterias Bacillus. La bacteria Bacillus utilizada en el presente procedimiento puede modificarse mediante interrupción de cualquiera de los genes deoD y pupG o de ambos. Al igual que los genes deoD y pupG, pueden utilizarse, por ejemplo, aquellos genes derivados de bacterias Bacillus (deoD: GenBank nº de acceso NC_000964 (SEC ID nº 7), pupG: GenBank nº de acceso NC_000964 (SEC ID nº 9) y puede obtenerse una cepa con interrupción génica de la misma manera que la utilización para la interrupción anteriormente indicada del gen purR.
La capacidad de producir una sustancia derivada de purina también puede incrementarse mediante la reducción de la actividad e la succinil-AMP sintasa. Un ejemplo del gen codificante de la succinil-AMP-sintasa incluye el gen purA. Un ejemplo del gen purA incluye, por ejemplo, aquellos que presentan la secuencia de nucleótidos registrada como GenBank nº de acceso NC_000964 (región codificante correspondiente a los números de nucleótido 4153460 a 4155749 de la cadena complementaria, SEC ID nº 11).
La capacidad de producir una sustancia derivada de purina también puede incrementarse mediante la reducción de la actividad de la inosina monofosfato (IMP) deshidrogenasa. Un ejemplo del gen codificante de la IMP deshidrogenasa incluye el gen guaB. Un ejemplo del gen guaB incluye, por ejemplo, aquellos que presentan la secuencia de nucleótidos registrada como GenBank nº de acceso NC_000964 (la región codificante corresponde a los números de nucleótido 15913 a 17376, SEC ID nº 13).
Además, como procedimiento para incrementar la capacidad de producir sustancia derivada de purina, puede contemplarse la amplificación de un gen codificante de una proteína que presenta una actividad de secreción de una sustancia derivada de purina. Un ejemplo de una bacteria en la que dicho gen ha sido amplificado incluye una bacteria Bacillus en la que se ha amplificado el gen rhtA (patente japonesa abierta al público nº 2003-219876).
Los genes purR, deoD, pupG, purA y guaB que deben interrumpirse tal como se ha indicado anteriormente, y el gen prs del que se debe incrementar la expresión, pueden ser ADN variantes que codifican proteínas con las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 6, nº 8, nº 10, nº 12, nº 14, nº 16 y nº 4, las cuales incluyen sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 10 residuos aminoácidos, respectivamente, y que presentan actividad de represor de purina, de purina nucleósido fosforilasa, de succinil-AMP sintasa, de IMP deshidrogenasa o de fosforibosil pirofosfato sintetasa, respectivamente.
Dicho cambio de las secuencias de aminoácidos tal como se ha indicado anteriormente es habitualmente un cambio conservador que mantiene las actividades de las proteínas. Entre los ejemplos de sustitución conservadora de aminoácidos se incluyen la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val.
Entre los ejemplos específicos de otras variantes conservadoras de los genes purR, deoD, pupG, purA, guaB y fbp y del gen prs indicados en la presente memoria se incluyen los ADN que muestran una homología de, por ejemplo, 70% o superior, preferentemente de 80% o superior, más preferentemente de 90% o superior, particularmente preferentemente 95% o superior, respecto a los ADN que presentan las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 5, nº 7, nº 9, nº 11, nº 13, nº 15 y nº 3, respectivamente. Más específicamente, entre los ejemplos de las variantes conservados indicadas en la presente memoria se incluyen los ADN que son capaces de hibridarse con ADN que presentan secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias de nucleótidos SEC ID nº 5, nº 7, nº 9, nº 11, nº 13, nº 15 y nº 3 bajo condiciones restrictivas. Un ejemplo de las condiciones restrictivas incluye condiciones de lavado a 60ºC y concentraciones salines de 1xSSC, SDS al 0,1%, preferentemente 0,1xSSC, SDS al 0,1%, una o más veces, preferentemente dos o tres veces.
La homología de los ADN puede evaluarse mediante una búsqueda de BLAST, una búsqueda de FASTA, el procedimiento de cálculo de Crustal W, y otros.
BLAST (herramienta de búsqueda de alineación local básica) es un algoritmo de búsqueda heurística utilizado por los programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn y tblastx, y los resultados obtenidos por estos programas se consideran significativos, basándose en la utilización del procedimiento estadístico de Karlin, Samuel y Stephen F. Altschul (Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990; Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7, 1993). El procedimiento de búsqueda FASTA fue descrito por W.R. Pearson (Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63-98, 1990). El procedimiento Clustal W fue descrito por Thompson J.D., Higgins D.G. y Gibson T.J. (CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680, 1994).
Además, el ADN utilizado para la preparación de un gen de tipo interrumpido también puede ser una variante conservadora del gen purR, deoD, pupG, purA o guaB.
La incorporación de un gen diana en el ADN cromosómico de la bacteria Bacillus puede llevarse a cabo de la misma manera que para el gen codificante de la fructosa bisfosfatasa descrita posteriormente.
(II) Modificación para reducir la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa
La bacteria Bacillus utilizada en el procedimiento de la presente invención puede obtenerse mediante modificación de una cepa que presenta la capacidad de producir una sustancia derivada de purina tal como las indicadas anteriormente, de manera que se reduzca la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa. El orden de modificación no se encuentra limitado, y tras modificar una bacteria de manera que se reduzca la actividad enzimática de fructosa bisfosfatasa de la misma, puede proporcionarse a la bacteria capacidad productora de nucleótidos de purina.
La fructosa bisfosfatasa es un enzima que cataliza una reacción que genera fructosa-6-fosfato a partir de fructosa1,6-bisfosfato, y esta reacción es una de las reacciones de la ruta de la gluconeogénesis. La "ruta de la gluconeogénesis" se refiere a una ruta en la que el ácido oxalacético intracelular es convertido en ácido fosfoenolpirúvico mediante descarboxilación catalizada por la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (EC: 4.1.1.49) y fosforilación; el ácido fosfoenolpirúvico es convertido en fructosa-1,6-bisfosfato mediante las reacciones inversas de los enzimas glucolíticos; la fructosa-1,6-bisfosfato es convertida además en fructosa-6-fosfato por la fructosa bisfosfatasa (EC: 3.1.3.11) y la glucosa es biosintetizada a partir de la fructosa-6-fosfato por la glucosa-6-fosfato isomerasa y la glucosa-6-fosfatasa (EC: 3.1.3.9).
La actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa puede medirse mediante el procedimiento siguiente. Por ejemplo puede medirse mediante la conversión en NADPH de la fructosa-6-fosfato generada, con la fosfoglucoisomerasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y después midiendo el NADPH.
Dicha modificación en la que se reduce la actividad enzimática de fructosa bisfosfatasa puede conseguirse, por ejemplo, tal como se ha explicado anteriormente para la interrupción del gen purR, sustituyendo un gen correspondiente que no funciona normalmente (por ejemplo un gen de tipo interrumpido obtenido mediante la inserción de un gen marcador tal como un gen de resistencia a fármaco en el gen de la fructosa bisfosfatasa) por el gen de la fructosa bisfosfatasa en el cromosoma, mediante recombinación homóloga. Además, tal como se ha descrito para el gen purR, puede introducirse una mutación para reducir la actividad enzimática intracelular de la fructosa bisfosfatasa en el gen de la fructosa bisfosfatasa en el cromosoma mediante procedimientos convencionales de mutagénesis.
Un ejemplo de fructosa bisfosfatasa de Bacillus subtilis incluye una proteína que consiste de 671 aminoácidos mostrada como SEC ID nº 2, y puede utilizarse un gen codificante de la proteína, preferentemente un gen que presenta la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 1 (gen fbp, números de nucleótido 4127053 a 4129065 del GenBank nº de acceso NC_000964). El gen fbp se localiza aproximadamente en 323º en el cromosoma de Bacillus subtilis.
Entre los ejemplos de ADN codificante de una proteína sustancialmente idéntica a la fructosa bisfosfatasa se incluyen, específicamente, un ADN codificante de una proteína que muestra una homología de 50% o superior, preferentemente de 70% o superior, más preferentemente de 80% o superior, particularmente preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2, y que presenta la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa.
El gen codificante de la fructosa bisfosfatasa también puede ser una variante conservadora del gen fbp, tal como los genes anteriormente indicados. Específicamente, los ejemplos incluyen un ADN codificante de una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2, incluyendo sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de fructosa bisfosfatasa. En la presente memoria se da a conocer un ADN codificante de una proteína que muestra una homología de 50% o superior, preferentemente de 70% o superior, más preferentemente de 80% o superior, particularmente preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2, y que presenta la actividad enzimática de fructosa bisfosfatasa. Más específicamente, entre los ejemplos se incluyen un ADN que es capaz de hibridarse con un ADN que presenta la secuencia de nucleótidos SEC ID nº 1 bajo condiciones restrictivas. Entre las condiciones restrictivas se incluyen condiciones de lavado a 60ºC y concentraciones salinas de 1xSSC, SDS al 0,1%; preferentemente 60ºC, 0,1xSSC, SDS al 0,1%, una o más veces, preferentemente dos o tres veces.
Dicho ADN codificante de una proteína sustancialmente idéntica a la fructosa bisfosfatasa tal como se ha indicado anteriormente puede obtenerse mediante, por ejemplo, la modificación de una secuencia de nucleótidos codificante de dicho enzima, de manera que el residuo aminoácido de una parte específica es sustituido, delecionado, insertado, añadido o invertido mediante mutagénesis específica de sitio. Dicho ADN modificado tal como se ha indicado anteriormente también puede obtenerse mediante un tratamiento de mutagénesis conocido convencionalmente. Entre los ejemplos del tratamiento de mutagénesis se incluyen un tratamiento in vitro del ADN antes del tratamiento de mutagénesis con hidroxilamina, y un tratamiento de un microorganismo tal como la bacteria Escherichia que contiene ADN, previamente al tratamiento de mutagénesis por irradiación con luz ultravioleta o utilizando un mutágeno para el tratamiento convencional de mutagénesis, tal como N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (NTG) o ácido nitroso.
El gen diana puede obtenerse mediante, por ejemplo, el procedimiento de PCR (reacción en cadena de la polimerasa, White T.J. et al., Trends Genet. 5:185-189, 1989) utilizando un ADN cromosómico de una bacteria Bacillus como molde y oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia de nucleótidos del gen diana a modo de cebadores. El ADN cromosómico puede prepararse a partir de una bacteria que sirva como donante de ADN mediante, por ejemplo, el procedimiento de Saito y Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta. 72:619-629, 1963; Text for Bioengineering Experiments, editado por la Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, páginas 97 y 98, Baifukan, 1992) o similar. Los cebadores de PCR pueden prepararse basándose en la secuencia génica conocida de una bacteria Bacillus, o basándose en la información de una región conservada entre genes de otras bacterias de las que se conocen las secuencias.
Entre los ejemplos del vector para incorporar un gen diana en un ADN cromosómico de una bacteria Bacillus se incluyen un vector que presenta un origen de replicación sensible a la temperatura, tal como pHV1248 (Prtit M.-A. et al., J. Bacteriol. 172:6736-6740, 1990), vectores para E. coli tales como pHSG398 (Takara Shuzo) y pBluescript SK(Stratagene), y similares.
Con el fin de ligar un gen objetivo y un vector que porta un marcador que funciona en bacterias Bacillus para preparar un ADN recombinante, el vector se digiere con n enzima de restricción correspondiente al extremo del gen
objetivo. La ligación habitualmente se lleva a cabo mediante la utilización de una ligasa tal como la ADN ligasa de T4.
Para introducir un ADN recombinante preparado tal como se ha indicado anteriormente en una bacteria Bacillus, puede utilizarse cualquiera de los procedimientos de transformación conocidos que se han publicado hasta el momento. Entre los ejemplos se incluye, por ejemplo, un procedimiento para preparar células competentes a partir de células que se encuentran en la fase de crecimiento, seguido de la introducción del ADN en las mismas (Dubunau D. y Davidoff-Abelson R., J. Mol. Biol. 56:209-221, 1971) y un procedimiento de conversión de las células huésped en protoplastos o esferoplastos, los cuales pueden incorporar fácilmente ADN recombinante, seguido de la introducción del ADN recombinante en las células aceptoras de ADN (Chang S. y Choen S.N., Molec. Gen. Genet. 168:111-115, 1979).
<2> Procedimiento para producir una sustancia derivada de purina
La bacteria Bacillus utilizada para el presente procedimiento produce eficientemente una sustancia derivada de purina. Por lo tanto, mediante el cultivo de dicha bacteria Bacillus en un medio apropiado, puede producirse una sustancia derivada de purina, tal como nucleósido de purina y nucleótido de purina y acumularse en células de la bacteria o en el medio.
Respecto al medio utilizado para el presente procedimiento, puede llevarse a cabo el cultivo de una manera convencional utilizando un medio convencional que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales minerales, así como nutrientes traza orgánicos tales como aminoácidos y vitaminas, según resulte necesario. Puede utilizarse un medio sintético o un medio natural. Puede utilizarse cualquier tipo de fuente de carbono y de fuente de nitrógeno con la condición de que puedan ser utilizados por la cepa que debe cultivarse.
A modo de fuente de carbono también pueden utilizarse azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, arabinosa, xilosa, trehalosa, ribosa, hidrolizados de almidón y melazas, y alcoholes tales como glicerol y manitol, y ácidos orgánicos tales como ácido glucónico, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido fumárico y ácido succínico, independientemente o en combinación con otras fuentes de carbono.
A modo de fuente de nitrógeno, se utiliza amonio, sales amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico y acetato amónico, sales de ácido nítrico, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soja, y otros.
A modo de nutrientes orgánicos traza, se utilizan aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, aquellos que contienen dichas sustancias, tales como peptona, casaminoácidos, extracto de levadura y productos de descomposición de las proteínas de la soja y otros. Al utilizar una cepa mutante auxotrófica que requiera un aminoácido o similar para el crecimiento, resulta necesario suplementar el nutriente requerido.
A modo de sales minerales se utilizan sales de ácido fosfórico, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y otros.
Aunque las condiciones de cultivo pueden variar dependiendo del tipo de bacteria Bacillus que debe utilizarse, Bacillus subtilis se cultiva, por ejemplo, como cultivo bajo aireación, mientras que la temperatura de fermentación se mantiene entre 20ºC y 50ºC, y el pH a un valor entre 4 y 9. Al caer el pH durante el cultivo, el medio se neutraliza con un álcali tal como gas amonio. Se acumula un nucleósido de purina en el medio tras un periodo de entre aproximadamente 40 horas y 3 días de cultivo de la manera descrita anteriormente.
Tras completar el cultivo, la inosina acumulada en el medio puede recogerse de una manera convencional. Por ejemplo, puede aislarse mediante precipitación, cromatografía de intercambio iónico y otros.
Además, en el caso de que el microorganismo utilizado para el presente procedimiento no presente un gen codificante de una nucleosidasa o nucleotidasa, el nucleósido o nucleótido correspondiente puede acumularse. Además, en el caso de que se proporcione auxotrofía para la inosina, puede acumularse un precursor o sustancias relevantes implicadas en la ruta de biosíntesis de la misma.
Además, mediante la reacción de inosina o guanosina preparada mediante el procedimiento de la presente invención con purina nucleósido fosforilasa o fosforibosiltransferasa, puede obtenerse ácido 5’-inosínico o ácido 5’guanílico.
Además, también resulta posible fosforilar el nucleósido de purina producido utilizando el microorganismo de la presente invención haciendo que una fosfotransferasa reaccione con el nucleósido de purina, produciendo un nucleótido de purina (éster de ácido 5’-fosfórico del nucleósido) (patente japonesa abierta al público nº 2000295996). Por ejemplo, pueden utilizarse un procedimiento para producir un nucleótido de purina utilizando una bacteria Escherichia en la que se ha introducido un gen codificante de inosina-guanosina quinasa de Escherichia coli (documento WO 91/08286), y un procedimiento para producir un nucleótido de purina utilizando Corynebacterium
ammoniagenes en el que se ha introducido un gen codificante de la inosina-guanosina quinasa de Exiguobacterium acetylicum (documento WO 96/30501).
Además, también resulta posible producir un nucleótido de purina (éster de ácido 5’-fosfórico del nucleósido) haciendo reaccionar el nucleósido de purina producido mediante la utilización del microorganismo indicado en la presente memoria con un donante de fosfatos seleccionado de entre el grupo que consiste de ácido polifosfórico, fosfato de fenilo y fosfato de carbamailo, y un microorganismo que presenta una capacidad de producir un éster de ácido 5’-fosfórico de nucleósido o fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2). Aunque el microorganismo que presenta una capacidad de producir un éster de ácido 5’-fosfórico de nucleósido no se encuentra particularmente limitado con la condición de que se seleccione un microorganismo que presente la capacidad de convertir un nucleósido de purina en un nucleótido de purina, entre los ejemplos se incluye, por ejemplo, el microorganismo dado a conocer en la publicación de patente internacional WO 96/37603.
Además, también puede utilizar Escherichia blattae JCM 1650, Serratia ficaria ATCC 33105, Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC nº 33531), Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC nº 8724), Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC nº 33257), Morganella morganii IFO 3168, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC nº 13048), Chromobacterium fluviatile IAM 13652, Chromobacterium violaceum IFO 12614, Cedecea lapagei JCM 1684, Cedecea davisiae JCM 1685, Cedecea neteri JCM 5909 y otros, dados a conocer en la patente japonesa abierta al público nº 07-231793.
A modo de la fosfatasa ácida, puede utilizarse, por ejemplo, la fosfatasa ácida dada a conocer en la patente japonesa abierta al público nº 2002-000289, y puede utilizarse más preferentemente una fosfatasa ácida la afinidad de la cual para un nucleósido se ha incrementado (patente japonesa abierta al público nº 10-201481), una fosfatasa ácida mutante con una actividad nucleotidasa reducida (documento WO 96/37603), una fosfatasa ácida mutante con una actividad de hidrólisis de éster de ácido fosfórico reducida (patente japonesa abierta al público nº 2001-245676) y otros.
También resulta posible obtener un nucleótido de purina mediante fosforilación química de un nucleósido de purina producido utilizando el microorganismo indicado en la presente memoria (Bulletin of the Chemical Society of Japan 42:3505). Además, también puede utilizarse un procedimiento de obtención de GMP mediante acoplamiento de un microorganismo que presenta la capacidad de producir XMP indicada en la presente memoria y actividad de XMP aminasa, y un procedimiento de obtención de IMP mediante acoplamiento de inosina quinasa (Biosci. Biotech. Biochem. 51:840, 1997; patente japonesa abierta al público nº 63-230094).
La inosina, la guanosina o el nucleósido de purina preparados mediante el procedimiento de la presente invención y utilizados para la preparación anteriormente indicada de nucleótido de purina pueden ser un producto purificado, o un caldo de fermentación de nucleósido de purina, o un producto crudo que contiene un nucleósido de purina.
Ejemplos
A continuación se explica con mayor detalle la presente invención haciendo referencia a ejemplos.
Ejemplo 1
<Construcción de una cepa bacteriana deficiente en los genes pupG y deoD codificantes de purina nucleósido fosforilasas>
Se construyó una cepa deficiente en el gen de la purina nucleósido fosforilasa (deoD) a partir de la cepa recombinante KMBS310 tal como se describe posteriormente. La cepa KMBS310 (solicitud de patente japonesa nº 2005-280186), la cual se deriva de Bacillus subtilis (cepa B. subtilis 168 Marburg, ATCC nº 6051), es deficiente en el gen del represor del operón purina (purR), en el gen succinil-AMP sintasa (purA) y en el gen de la purina nucleósido fosforilasa (pupG) y presenta un gen atenuado de IMP deshidrogenasa (guaB), en la que se ha modificado la región promotora del operón purina y las secuencias SD del gen de la PRPP sintetasa (prs). Se incrementó la expresión del operón de purina y del gen de la PRPP sintetasa mediante modificaciones de la región de promotor y de la secuencia SD, respectivamente.
Se utilizó un ADN genómico preparado a partir de la cepa KMBS16 (purR::spc purA::erm deoD::kan, patente japonesa abierta al público nº 2004-242610) mediante el procedimiento de Fouet y Sonenshein (J. Bacteriol. 172:835-844, 1990) para transformar células competentes de la cepa B. subtilis 168 Marburg preparada mediante el procedimiento de Dubnau y Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol. 56:209-221, 1971) y se obtuvieron colonias cultivadas en una placa de agar LB que contenía 5 !g/ml de canamicina. Se seleccionaron las colonias que no resultaron resistentes a la espectinomicina ni resistentes a la eritromicina, y una cepa de entre las mismas se designó como KMBS5 (deoD::kan).
Se utilizó un ADN genómico preparado a partir de KMBS5 mediante el procedimiento de Fouet y Sonenshein (J. Bacteriol. 172, 835-844, 1990) para transformar células competentes de la cepa KMBS310 Marburg preparada mediante el procedimiento de Dubnau y Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol. 56, 209-221, 1971) y se obtuvieron colonias
cultivadas en una placa de agar LB que contenía 5 !g/ml de canamicina y 20 !g/ml de guanina. Se seleccionaron varias colonias de entre las colonias obtenidas tal como se ha indicado anteriormente y uno de los transformantes, para el que pudo confirmarse que deoD::kan sustituía el gen deoD de tipo salvaje y que todas las mutaciones derivadas de KMBS310 no habían sido sustituidas por secuencias de tipo salvaje, se denominó KMBS321.
Ejemplo 2
<Construcción de cepa bacteriana deficiente en el gen fbp codificante de fructosa bisfosfatasa, cultivo y evaluación de la misma>
(1)
Preparación de cepa deficiente en el gen fbp
Se construyó una cepa deficiente en el gen de la fructosa bisfosfatasa (fbp) a partir de la cepa recombinante KMBS321 anteriormente indicada, tal como se describe posteriormente. La cepa KMBS321, que se deriva de Bacillus subtilis (cepa B. subtilis 168 Marburg, ATCC nº 6051), es deficiente en el gen del represor del operón purina (purR), en el gen de la succinil-AMP sintasa (purA) y en el gen de la purina nucleósido fosforilasa (pupG) y presenta un gen atenuado de la IMP deshidrogenasa (guaB), en la que se habían modificado la región de promotor del operón purina y la secuencia SD del gen de la PRPP sintetasa (prs).
(i)
Amplificación de la región cadena arriba de fbp mediante PCR
Se prepararon cebadores 28-mero y 50-mero que presentaban las secuencias de nucleótidos siguientes basándose en la información de un banco de datos génicos (GenBank nº de acceso NC_000964 y V01277).
TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA (SEC ID nº 17) cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEC ID nº 18, los nucleótidos indicados en letra minúscula corresponden a la región cadena arriba de promotor del gen de la resistencia al cloranfenicol (cat) clonado en pC194) Se llevó a cabo una PCR (98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos, 30 ciclos, sistema PCR de amplificación génica modelo 9600, Perkin-Elmer) utilizando el ADN cromosómico de la cepa
B. subtilis 168 Marburg como molde y los cebadores anteriormente indicados para obtener un fragmento de amplificación que contiene una región 5’-terminal del gen fbp y 1.350 pb de región cadena arriba.
(ii) Amplificación de la región cadena abajo de fbp mediante PCR
Se prepararon cebadores de PCR 50-meros y 27-meros que presentaban las secuencias de nucleótidos siguientes basándose en la información de un banco de datos génicos (GenBank nº de acceso NC_000964 y V01277).
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEC ID nº 19, los nucleótidos indicados en letra minúscula corresponden a una región cadena abajo del gen estructural del gen de resistencia al cloranfenicol (cat) clonado en pC194)
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEC ID nº 20)
Se llevó a cabo una PCR (98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos, 30 ciclos, sistema PCR de amplificación génica modelo 9600, Perkin-Elmer) utilizando el ADN cromosómico de la cepa
B. subtilis 168 Marburg como molde y los cebadores anteriormente indicados con el fin de obtener un fragmento de amplificación que contiene una región 3’-terminal del gen fbp y aproximadamente 1.770 pb de región cadena abajo.
(iii) Amplificación del gen cat mediante PCR
Se prepararon cebadores de PCR 50-meros que presentan las secuencias de nucleótidos siguientes basándose en la información de un banco de datos génicos (GenBank nº de acceso V01277 y NC_000964).
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEC ID nº 21, los nucleótidos indicados con letras minúsculas corresponden a la secuencia de la región 5’-terminal del gen fbp, y se diseñaron de manera que fuesen complementarios a la región 3’-terminal de SEC ID nº 18) cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEC ID nº 22, los nucleótidos indicados en letra minúscula corresponden a la secuencia de la región 3’-terminal del gen fbp, y se diseñaron de manera que fuesen complementarios a la región 3’-terminal de SEC ID nº 19)
Se llevó a cabo una PCR (98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos, 30 ciclos, sistema PCR de amplificación génica modelo 9600, Perkin-Elmer) utilizando plásmido pC194 portador del gen de resistencia al cloranfenicol (cat) como molde y los cebadores anteriormente indicados, con el fin de obtener un fragmento de amplificación de aproximadamente 980 pb que contiene el gen cat.
(iv) Amplificación mediante PCR recombinante de fragmento que comprende la región fbp con inserción del gen cat
Se purificaron los fragmentos de ADN amplificados en (i) a (iii) indicados anteriormente utilizando una columna MicroSpin S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) y después se utilizó una mezcla de los mismos en cantidades apropiadas a modo de moldes, conjuntamente con las secuencias SEC ID nº 17 y nº 20, con el fin de llevar a cabo una PCR (98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 4,5 minutos, 30 ciclos, sistema PCR de amplificación génica modelo 9600, Perkin-Elmer) y obtener de esta manera un fragmento que comprenda la región fbp con inserción del gen cat.
(v)
Preparación de cepa productora de inosina con fbp interrumpido
El fragmento de ADN que comprendía la región fbp en la que se había insertado el gen cat (fbp::cat) obtenido en (iv), se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se extrajo el fragmento diana del gel. El fragmento de ADN purificado tal como se ha indicado anteriormente se utilizó para transformar células competentes de la cepa B. subtilis KMBS321 preparadas mediante el procedimiento de Dubnau y Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol. 56:209-221, 1971) y se obtuvieron colonias cultivadas en una placa de agar LB que contenía 2,5 !g/ml de cloranfenicol y 20 !g/ml de guanina. Se prepararon los ADN cromosómicos a partir de dichas colonias y se identificaron mediante el procedimiento de PCR descrito en (iv) las cepas en las que la región fbp en un cromosoma había sido sustituida por una región fbp con una secuencia interna que había sido sustituida por el gen de resistencia al cloranfenicol (fbp::cat) mediante doble recombinación y una de dichas cepas se denominó TABS133.
(2)
Producción de nucleósido de purina por una cepa productora de inosina deficiente en el gen fbp
La cepa deficiente en el gen fbp TABS133 y una cepa de control KMBS321 se aplicaron, cada una de ellas, uniformemente sobre una placa con medio LB que contenía 20 mg/ml de guanina y se cultivaron durante la noche a 34ºC. Las células correspondientes a 1/8 de la placa se inocularon en 20 ml de un medio de fermentación contenido en un matraz de Sakaguchi de 500 ml de volumen y después se añadieron 50 g/l de carbonato de calcio al medio y las células se cultivaron a 34ºC bajo agitación. Setenta y dos horas después de iniciar el cultivo, se muestreó el medio y se midieron mediante procedimientos conocidos las cantidades de inosina e hipoxantina contenidas en el medio. La cantidad acumulada de inosina observada con la cepa deficiente en gen fbp TABS133 era más alta que la observada con la cepa KMBS321 como cepa de control.
[Composición del medio de fermentación]
Glucosa 30 g/l KH2PO4 1 g/l NH4Cl 32 g/l Mameno (T-N)* 1,35 g/l DL-Metionina 0,4 g/l L-Triptófano 0,02 g/l Adenina 0,1 g/l Guanosina 0,075 g/l MgSO4 0,4 g/l FeSO4 0,01 g/l MnSO4 0,01 g/l Adecanol (antiespumante) 0,5 ml/l (ajustado a un pH de 7,0 con KOH) Carbonato de calcio 50 g/l
* : Hidrolizado de proteínas de soja
Tabla 1
[Explicación del listado de secuencias]
SEC ID nº 1: secuencia de nucleótidos del gen fbp SEC ID nº 2: secuencia de aminoácidos de la fructosa bisfosfatasa SEC ID nº 3: secuencia de nucleótidos del gen prs SEC ID nº 4: secuencia de aminoácidos de la fosforibosil pirofosfato sintetasa SEC ID nº 5: secuencia de nucleótidos del gen purR SEC ID nº 6: secuencia de aminoácidos del represor de purina SEC ID nº 7: secuencia de nucleótidos del gen deoD SEC ID nº 8: secuencia de aminoácidos del producto del gen deoD (purina nucleósido fosforilasa) SEC ID nº 9: secuencia de nucleótidos del gen pupG SEC ID nº 10: secuencia de aminoácidos del producto del gen pupG (purina nucleósido fosforilasa)
SEC ID nº 11: secuencia de nucleótidos del gen purA SEC ID nº 12: secuencia de aminoácidos de la succinil-AMP sintasa SEC ID nº 13: secuencia de nucleótidos del gen guaB SEC ID nº 14: secuencia de aminoácidos de la IMP deshidrogenasa
5 SEC ID nº 15: cebador para la amplificación del gen purR SEC ID nº 16: cebador para la amplificación del gen purR SEC ID nº 17: cebador para la amplificación de la región cadena arriba del gen fbp SEC ID nº 18: cebador para la amplificación de la región cadena arriba del gen fbp SEC ID nº 19: cebador para la amplificación de la región cadena abajo del gen fbp
10 SEC ID nº 20: cebador para la amplificación de la región cadena abajo del gen fbp SEC ID nº 21: cebador para la amplificación del gen cat SEC ID nº 22: cebador para la amplificación del gen cat
Aplicabilidad industrial
15 Mediante la utilización del procedimiento de la presente invención, puede mejorarse la eficiencia de la producción de un nucleósido de purina y/o de un nucleótido de purina.
Listado de secuencias
<110> AjinomotoCo., Inc.
<120> Bacteria que puede producir sustancia de purina y procedimiento de producción de sustancia de purina
25 <130> EPA-64628
<150> JP2006-119315
<151> 2006-04-24
30 <160> 22
<170> Patente en versión 3.3
<210> 1 35 <211> 2013
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220> 40 <221> CDS
<222> (1)..(2013)
<400> 1
<211> 671
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
<210> 3
<211> 954
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(954)
<400> 3
<210> 4
<211> 317
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
<210> 5
<211> 858
<212> ADN 15 <213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(858) 20
<400> 5
<210> 6
<211> 285
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 6
<210> 7 5 <211> 702
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220> 10 <221> CDS
<222> (1)..(702)
<400> 7
<210> 8 5 <211> 233
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 8 10
<210> 9
<211> 816
<212> ADN 5 <213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(816) 10
<400> 9
<210> 10
<211> 271
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 10
5
<210> 11
<211> 1293
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
10
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1293)
15
<400> 11
<210> 12 5 <211> 430
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 12 10
<211> 1542 5 <212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1542)
<400> 13
<210> 14 5 <211> 513
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 14 10
5
<210> 15 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> cebador
<400> 15 gaagttgatg atcaaaa
17
15
<210> 16 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador
5
<400> 16 acatattgtt gacgataat 19
<210> 17 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
15
<220> <223> cebador <400> 17 ttcccttagg gttattttcg tttcaaaa 28
<210> 18 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
25
<220> <223> cebador
<400> 18 cgtttgttga actaatgggt gcttttatga gcatgtgcat gataaggtga
50
<210> 19 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
35
<220> <223> cebador
<400> 19 acagctccag atccatatcc ttctttttta gagagtttgc gggagtatcg
50
45
<210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador
<400> 20 taaaggtttt tcgggataag attgaaa
27
55
<210> 21 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> cebador
<400> 21 tcaccttatc atgcacatgc tcataaaagc acccattagt tcaacaaacg
50
65
<210> 22 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 22 cgatactccc gcaaactctc taaaaaagaa ggatatggat ctggagctgt 50

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para producir una sustancia derivada de purina, que comprende:
    5 cultivar una bacteria perteneciente al género Bacillus que presenta una capacidad de producir una sustancia derivada de purina en un medio para provocar la acumulación de la sustancia derivada de purina en células de la bacteria o el medio, y recoger la sustancia derivada de purina a partir de las células o del medio,
    en el que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa se reduce en comparación con una cepa no modificada mediante la alteración de un gen codificante de fructosa bisfosfatasa, o reduciendo la cantidad de expresión del gen codificante de fructosa bisfosfatasa,
    en el que el gen codificante de fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B) siguientes:
    (A)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2,
    (B)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad de fructosa bisfosfatasa, y
    en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en inosina, xantosina, guanosina y adenosina o un nucleótido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la actividad de fosforibosil pirofosfato sintetasa en comparación con una cepa no modificada mediante el incremento de la expresión de un gen codificante de la fosforibosil pirofosfato sintetasa en la bacteria mediante la utilización de un plásmido que contiene el gen o integrando el gen en el cromosoma de la bacteria, y en el que el gen codificante de fosforibosil pirofosfato sintetasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B) siguientes:
    (A)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 4,
    (B)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 4 que incluye sustituciones,
    35 deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad de fosforibosil pirofosfato sintetasa.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la cantidad de expresión del operón purina en comparación con una cepa no modificada mediante el incremento de la expresión de genes del operón purina en la bacteria mediante un procedimiento de utilización de un plásmido que contiene los genes o integración de los genes en el cromosoma de la bacteria, mediante la sustitución del promotor nativo del operón purina por un promotor más fuerte, mediante la sustitución de la región -35 o -10 del promotor nativo del operón purina por una secuencia de consenso, mediante la interrupción de un gen codificante de un represor de purina, mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen
    45 codificante del represor de purina, o mediante la deleción de la secuencia atenuadora del operón purina, y
    en el que el gen codificante del represor de purina es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:
    (A)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 6,
    (B)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de represor de purina.
    55 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se reduzca la actividad de purina nucleósido fosforilasa en comparación con una cepa no modificada mediante la interrupción de un gen codificante de purina nucleósido fosforilasa o mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen codificante de purina nucleósido fosforilasa, y en el que el gen codificante de purina nucleósido fosforilasa es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:
    (A)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 8 o nº 10,
    (B)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 8 o nº 10 que incluye sustituciones,
    deleciones, inserciones, adiciones o inserciones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de 65 purina nucleósido fosforilasa.
  4. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se reduzca la actividad de IMP deshidrogenasa en comparación con una cepa no modificada mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen codificante de la IMP deshidrogenasa, y en el que el gen codificante de la IMP deshidrogenasa es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:
    (A)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 14,
    (B)
    una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 14 que incluye sustituciones,
    deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de 10 IMP deshidrogenasa.
  5. 6.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la bacteria es Bacillus subtilis.
  6. 7.
    Procedimiento para producir un nucleótido de purina, que comprende:
    15 producir un nucleósido de purina mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
    hacer reaccionar el nucleósido de purina con un donante de fosfatos seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido polifosfórico, fosfato de fenilo y fosfato de carbamilo, y un microorganismo que presenta una capacidad 20 de producir un éster de ácido nucleósido-5’-fosfórico o fosfatasa ácida con el fin de producir un nucleótido de purina, y
    recoger el nucleótido de purina.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007125783A1 (ja) * 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
EP2264144A4 (en) * 2008-02-25 2012-11-07 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF 5'-GUANYLIC ACID
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
KR101166027B1 (ko) * 2009-04-01 2012-07-19 씨제이제일제당 (주) 5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법
JP5636648B2 (ja) 2009-08-10 2014-12-10 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
CN103333929B (zh) * 2013-07-05 2016-02-17 宁夏伊品生物科技股份有限公司 用改变fbp酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法
CN103333928B (zh) * 2013-07-05 2015-12-23 宁夏伊品生物科技股份有限公司 用fbp酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产L-色氨酸的方法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN111411134B (zh) * 2019-09-18 2023-05-12 大连民族大学 一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法
CN110863022A (zh) * 2019-09-30 2020-03-06 大连民族大学 嘌呤的发酵生产工艺
CN111254172B (zh) * 2019-12-10 2021-09-07 新疆阜丰生物科技有限公司 一种发酵生产腺苷的方法
KR102185850B1 (ko) * 2020-02-21 2020-12-02 씨제이제일제당 주식회사 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
CN112126666B (zh) * 2020-09-22 2022-04-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 核苷高产菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE686383A (es) 1965-09-04 1967-02-15
JPS515075B1 (es) * 1970-02-05 1976-02-17
JPS5417033B2 (es) * 1973-06-14 1979-06-27
JPS5545199B2 (es) * 1974-03-30 1980-11-17
JPS552956B2 (es) * 1974-03-30 1980-01-23
JPS533271B2 (es) 1975-03-06 1978-02-04
JPS5417033A (en) 1977-07-07 1979-02-08 Canon Inc Fixing roller for zerography
JPS552956A (en) 1978-06-22 1980-01-10 Nec Corp Automatic wiring tester
US4198692A (en) 1978-09-22 1980-04-15 Rockwell International Corporation Self-biased structure for magnetic bubble domain devices
JPS5612438A (en) 1979-07-13 1981-02-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd Drag suction-head for sludge dredging
JPS5714160A (en) 1980-06-27 1982-01-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd Airconditioner
JPS5741915A (en) 1980-08-27 1982-03-09 Makoto Mori Manufacture of knife handle having sealed object inside thereof
JPS5817592A (ja) 1981-07-24 1983-02-01 Hitachi Ltd 磁気バブル拡大器
JPS58158197A (ja) 1982-03-16 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるイノシンの製造法
JPS58175493A (ja) 1982-04-08 1983-10-14 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるグアノシンの製造法
JPS5942895A (ja) 1982-07-27 1984-03-09 Takeda Chem Ind Ltd イノシンおよびグアノシンの製造法
JPS5928470A (ja) 1982-08-11 1984-02-15 Ajinomoto Co Inc バチルス・ズブチリス
JPH0630583B2 (ja) 1984-01-27 1994-04-27 武田薬品工業株式会社 Ｄνａおよびその用途
JPS6214794A (ja) 1985-07-09 1987-01-23 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるグアノシン及び／またはイノシンの製造法
DE3786771T2 (de) 1986-12-26 1993-11-11 Takeda Chemical Industries Ltd Für inaktivierte IMP-Dehydrogenase kodierende DNS.
JPH0669386B2 (ja) 1987-03-18 1994-09-07 協和醗酵工業株式会社 ５′−イノシン酸の製造法
JPS6427477A (en) 1987-04-01 1989-01-30 Takeda Chemical Industries Ltd Dna and use thereof
JP2545078B2 (ja) 1987-04-06 1996-10-16 協和醗酵工業株式会社 核酸関連物質の製造法
EP0393969A3 (en) 1989-04-19 1991-03-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Dna containing imp dehydrogenase gene and its use
TW201793B (es) 1989-08-04 1993-03-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
WO1991008286A1 (en) 1989-12-05 1991-06-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Inosine guanosine kinase
JP2921702B2 (ja) 1990-05-24 1999-07-19 株式会社トプコン レーザ装置
KR920002774A (ko) 1990-07-03 1992-02-28 우메모또 요시마사 Dna 및 그의 용도
JPH05192164A (ja) 1990-07-03 1993-08-03 Takeda Chem Ind Ltd 組換えｄｎａおよびその用途
JP3016883B2 (ja) 1991-02-19 2000-03-06 協和醗酵工業株式会社 発酵法による５’−キサンチル酸の製造法
JPH0584067A (ja) 1991-09-27 1993-04-06 Takeda Chem Ind Ltd 発酵法によるイノシンの製造法
JP3651036B2 (ja) 1993-12-27 2005-05-25 味の素株式会社 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
BR9607745A (pt) 1995-03-24 1998-06-23 Ajinomoto Kk Processo para produzir ácido 5-inosínico ou ácido 5' guanílico transformante dna recombinante proteina e gene
JP3941390B2 (ja) 1995-05-25 2007-07-04 味の素株式会社 変異型酸性フォスファターゼ
JPH0937785A (ja) 1995-05-25 1997-02-10 Ajinomoto Co Inc ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
JPH08168383A (ja) 1995-09-11 1996-07-02 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 核酸関連物質の製造法
JP4304727B2 (ja) 1996-11-21 2009-07-29 味の素株式会社 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
WO1998039344A1 (en) * 1997-03-07 1998-09-11 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel purine inhibitors of fructose-1,6-bisphosphatase
KR100697551B1 (ko) * 1997-07-18 2007-03-21 아지노모토 가부시키가이샤 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
JP4913929B2 (ja) 1998-06-12 2012-04-11 味の素株式会社 核酸系物質の製造法
HU225541B1 (en) 1998-09-25 2007-03-28 Ajinomoto Kk Process for producing l-amino acids by fermentation and amino acid-producing bacterium strains
RU2144564C1 (ru) * 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
JP2000295996A (ja) 1999-02-08 2000-10-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プリンヌクレオチドの製造法
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US7005284B1 (en) * 1999-09-21 2006-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Transaldolase gene
JP4192408B2 (ja) 2000-06-23 2008-12-10 味の素株式会社 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
KR100429925B1 (ko) 2001-12-28 2004-05-03 씨제이 주식회사 5'-크산틸산을 생산하는 미생물
RU2239656C2 (ru) 2002-01-24 2004-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм-продуцент пуриновых нуклеозидов (варианты)
EP2339016B8 (en) * 2002-03-29 2016-01-27 Danisco US Inc. Enhanced production of subtilisins in Bacillus
DE102004001674B4 (de) 2003-01-29 2019-01-24 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien
JP4352716B2 (ja) 2003-02-17 2009-10-28 味の素株式会社 バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法
EP1482055B1 (en) 2003-05-26 2006-03-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon
JP3823099B2 (ja) 2003-06-26 2006-09-20 中日産業株式会社 キャリーカート
JP2005280186A (ja) 2004-03-30 2005-10-13 Canon Chemicals Inc 発泡ゴムローラの製造方法
WO2006033668A2 (en) * 2004-04-09 2006-03-30 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
US7326546B2 (en) * 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
WO2007125783A1 (ja) * 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法

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