Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2004090604A2 - Mikroskopanordnung - Google Patents

Mikroskopanordnung Download PDF

Info

Publication number
WO2004090604A2
WO2004090604A2 PCT/EP2004/003156 EP2004003156W WO2004090604A2 WO 2004090604 A2 WO2004090604 A2 WO 2004090604A2 EP 2004003156 W EP2004003156 W EP 2004003156W WO 2004090604 A2 WO2004090604 A2 WO 2004090604A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arrangement according
microscope arrangement
sample
beam path
microscope
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/003156
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004090604A3 (de
Inventor
Peter Westphal
Martin KÜHNER
Tobias Neumann
Original Assignee
Carl Zeiss Jena Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena Gmbh filed Critical Carl Zeiss Jena Gmbh
Priority to JP2006504859A priority Critical patent/JP2006522948A/ja
Priority to EP04723174A priority patent/EP1613995A2/de
Priority to US10/552,557 priority patent/US20070058246A1/en
Publication of WO2004090604A2 publication Critical patent/WO2004090604A2/de
Publication of WO2004090604A3 publication Critical patent/WO2004090604A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G02B27/0927—Systems for changing the beam intensity distribution, e.g. Gaussian to top-hat
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/082—Condensers for incident illumination only
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G02B27/0938—Using specific optical elements
    • G02B27/0994—Fibers, light pipes

Definitions

  • the invention relates to a microscope arrangement comprising an illumination source, optical assemblies for generating an illuminating beam path, an objective through which the illuminating beam path is directed onto a sample which is located in the object plane of the objective or in the vicinity thereof, and optical Assemblies for generating an imaging beam path directed onto the receiving surface of a camera.
  • Microscope arrangements in particular for incident light microscopy in connection with radiometric measurements on the surface of biochips, are already known per se. Such arrangements are based essentially on two different functional principles.
  • laser scanning microscopes are known in which only a small area of a few ⁇ m 2 of the sample is illuminated and consequently only the same small area can be evaluated at the moment of illumination.
  • "confocal" scanning methods are used by placing pinhole diaphragms in the microscope beam path.
  • the disadvantage of laser scanning microscopy, particularly in biochip examinations is the risk of bleaching due to the high intensity of the laser radiation focused on the small area under consideration.
  • the choice of the wavelength of the illuminating light is severely restricted.
  • laser scanners require mechanically moving assemblies, such as galvanic scanning devices, which results in a relatively high level of mechanical wear and also high adjustment effort.
  • Another disadvantage is the low quantum efficiency of the detector, which is usually designed as a photomultiplier, which in particular affects illuminating light with wavelengths above 600 nm.
  • Another principle is based on wide field detection.
  • a larger area on the sample is illuminated, and a corresponding section of the sample is imaged on a spatially resolving receiver, for example a CCD camera, by means of a lens and possibly further optics.
  • a spatially resolving receiver for example a CCD camera
  • spectral filters are placed in the illumination or excitation beam path and in the detection or fluorescence beam path, which are permeable to light of the respective wavelength.
  • the quality from image to image within an image sequence which is recorded from a sample surface with one of the previously known microscope arrangements working with a camera, is not sufficiently uniform, so that when a number of camera images are joined together, a tile-like structure results in the overall image.
  • this juxtaposition of images is essential, and the tile-like structure must be avoided with a view to accurate evaluation.
  • Another disadvantage is that the uniformity of the illumination of the object field or the sample section to be imaged is not sufficient for high-precision examinations and that the limited life of the illumination sources or their maintenance and repeated adjustment necessitate a continuous evaluation of changing samples, such as, for example, when measuring biochips high throughput is required.
  • Another source of interference is unwanted reflections in the illumination and imaging beam path.
  • the object of the invention is to further develop a microscope arrangement which works on the principle of wide field detection in such a way that measurement results are achieved with greater accuracy than has been possible in the prior art.
  • a homogenization device for equalizing the intensity of the illuminating light that strikes the sample section to be examined.
  • the homogenization device it is advantageously achieved that the object plane of the microscope arrangement, and thus the section of a sample located in or near the object plane, is homogeneously illuminated and thereby an improved quality of the image of this sample section is achieved, which ultimately results in a higher quantitative measurement accuracy determining intensity values is achieved.
  • illumination sources are halogen lamps, arc lamps, LEDs and lasers into consideration, the light in the visible, in the UV and / or emit in the IR spectral range.
  • the homogenization device is advantageously designed as a light guide which has an irradiation surface facing the illumination source and an emission surface for the illumination light facing the objective.
  • the light guide can be designed as an internally mirrored hollow rod, as a totally reflective, transparent full rod on the inside, as a liquid light guide or in the form of a glass fiber bundle.
  • the light guide consists of a glass fiber bundle, it is advisable to design the emitting surface itself as a light diffusing screen or to arrange a light diffusing screen behind the emitting surface, to depict the light diffusing plate out of focus in the object plane and thus to homogenize the illumination.
  • the optically effective cross section of the light guide can be either circular, square or rectangular.
  • the light guide can be designed such that the irradiation surface, the radiation surface or both of these surfaces are provided with a microlens structure, a large number of round, square, honeycomb or cylindrical microlenses being arranged next to one another on the respective surface and each of these lenses having a lens radius of has approximately 1 00 ⁇ m to 1000 ⁇ m perpendicular to the optical axis of the illuminating beam path.
  • the radiation intensity is homogenized by transmitting the light inside the light guide by reflection and thereby mixing due to the multiple reflections of individual radiation components on the inside of the highly reflective wall. As a result, the radiation intensity, based on the beam cross section, is evened out across the light path in the light guide.
  • the illuminating light is split into a number of partial beams corresponding to the plurality of microlenses as it passes through this structure, as a result of which an even better mixing or homogenization of the intensity distribution is achieved.
  • the microstructure does not have to be present on the radiation and / or radiation surface, as shown by way of example, but it is conceivable and leads to comparably good results if the microlens structure is present on separate optical components and these are arranged upstream of the radiation surface and / or Beam area are subordinate.
  • the radiation surface of the homogenization device is not imaged in the field diaphragm level, but rather is positioned directly in the field diaphragm level or in its immediate vicinity. This enables a reduction in the number of optical assemblies.
  • the optically effective surface of a field diaphragm arranged in the field diaphragm plane is structured in a strip-like or checkerboard-like manner, with transparent and non-transparent partial surfaces alternating in the structure.
  • a shutter for partially blocking the light is arranged directly in front of the field diaphragm.
  • the shutter is preferably controllable and serves to darken selectable areas of the field diaphragm. This ensures, in particular, that an auto focus sensor that may be present is not outshined by scattered excitation light.
  • a field diaphragm structured in this way is produced, for example, by first evaporating the desired stripe-like or checkerboard-like structure as a metal layer on a glass plate and then gluing a second glass plate onto this structure.
  • the two outer surfaces of the glass plates, which are directed towards the air, are preferably anti-reflective.
  • the field diaphragm in the illuminating beam path is followed by a first partially transparent deflecting mirror, from which the major part of the illuminating light passes through an illuminating tube parallelizing the illuminating beam path and subsequently, depending on the application, through a spectral filter for selecting one provided for excitation Spectral component hits a color splitter, for example a dichroic mirror, or a partially transparent mirror and is directed from the splitter surface through the lens onto the sample.
  • a smaller part of the illumination beam path branched off at the partially transparent deflecting mirror arranged in front of the illumination tube can be directed, for example, at a monitor detector, which serves to control the intensity of the illumination light. The output signal of the monitor detector can then be used to readjust or standardize the intensity.
  • the reflected or, in the case of fluorescence microscopy, light emitted again through the objective passes through the color splitter or the partially transparent mirror and a downstream second spectral filter, which is transparent to the emission or reflection light, and then passes through an imaging tube through to the camera.
  • the lighting tube and the imaging tube are advantageously made of identical optical assemblies, as a result of which the production costs can be kept low.
  • This has the advantage that different lenses can be exchanged for each other in a simple manner with little adjustment effort and, depending on the choice, lenses can be used which either allow a high optical resolution of less than 1 ⁇ m or illuminate a large object field with a diameter of up to a few centimeters.
  • At least two lenses which differ with regard to their optical properties, are arranged on an interchangeable device, preferably an objective turret.
  • a detachable compensating glass is arranged upstream of the objective or the objectives, so that measurement is optionally carried out with compensating glass on an air / solid interface on the sample facing the objective or, without compensating glass, through a transparent sample carrier can be.
  • the surface normals of the spectral filters form an angle in the range from 1 ° to 20 °, preferably 5 °, in the illumination and / or in the imaging beam path with the optical axis of the respective beam path.
  • This inclination towards the respective optical axis prevents false light from being evaluated, in particular the inclination of the spectral filter in the illumination tion beam path with regard to an autofocusing device is important, as will be explained in more detail below.
  • the spectral filter in the illumination beam path and the spectral filter in the imaging beam path are designed together with the color splitter as filter cubes.
  • This filter cube can be arranged in a supplementary configuration with at least one further filter cube, which differs from the first filter cube in terms of the filtered wavelengths, in fluorescence microscopy, for example in terms of the excitation and emission wavelengths, on an exchange device, which is designed, for example, as an exchange wheel.
  • a gray filter inclined against the optical axis of the illuminating beam path can be pivoted into the illuminating beam path, the surface normal of the gray filter including an angle in the range from 5 ° to 15 ° with the optical axis of the illuminating beam path.
  • This gray filter serves to attenuate the radiation, the inclination of the filter against the optical axis preventing too much illuminating light from the entrance surface of the gray filter from reflecting back to the illuminating source, thereby preventing inadmissible heating of the illuminating source.
  • An embodiment in which the illumination source is coupled to the other assemblies of the microscope arrangement via a detachable mechanical connection is to be rated as particularly advantageous. Since the illumination source is decoupled from the other optical assemblies used to generate the illumination beam path due to the homogenization device and the uniform intensity distribution achieved with the homogenization device in the illumination beam path is maintained even when the illumination source is changed, the technical basis for the adjustment-free replacement is given different lighting sources against each other.
  • the replaced lighting sources can differ both in terms of the technical equipment (halogen lamp, arc lamp, LED, etc.) and in terms of the wavelengths of the emitted light (VIS, UV, IR).
  • an embodiment option is to arrange the lens on a straight guide in the direction of its optical axis and for this purpose with to couple a motorized actuator.
  • the displaceability of the lens in the direction of the optical axis can be used to change the distance between the sample and the lens and thus for focusing.
  • an autofocusing device which comprises an autofocus sensor, an autofocus actuator and means for coupling an autofocus laser beam into the illumination beam path.
  • the camera can optionally be designed as a CCD or as a CMOS camera.
  • the optical axis of the objective is oriented perpendicular to the direction of gravity.
  • a sample table that is adjustable in the coordinate directions X and / or Y perpendicular to the optical axis of the objective is provided for receiving the sample.
  • the sample table can advantageously be coupled to a piezo drive and / or to a spindle drive.
  • the piezo drive is provided for the adjustment of the sample table in the coordinate direction X
  • the spindle drive for the adjustment of the sample table in the coordinate direction Y, which preferably corresponds to the direction of gravity.
  • sample table can be coupled to a leveling device which serves to adjust the inclination of the sample surface relative to the optical axis of the objective.
  • the sample is arranged on the sample table by means of a sample holder, the sample holder and the sample table being releasably connected to one another.
  • FIG. 2 shows the basic principle of the microscope arrangement according to the invention, in which the homogenization device is designed flexibly as a glass fiber bundle,
  • FIG. 6 shows an embodiment variant of the microscope arrangement according to the invention which is particularly advantageous with regard to autofocusing
  • the drive device for the sample table which can be adjusted in the coordinate directions X and Y perpendicular to the optical axis of the objective, the optical axis of the objective being oriented perpendicular to the direction of gravity,
  • FIG. 8b shows a view in direction A from FIG. 8a of the sample
  • FIG. 9 shows the alignment of a cartridge-like sample, which has a reservoir for a liquid, in the microscope arrangement according to the invention.
  • Fig.l the basic principle of the invention is shown using a microscope arrangement for fluorescence microscopy.
  • an illumination source 1 which, for example, emits light in the visible, in the UV and / or in the IR spectral range.
  • the illumination source 1 comprises a plurality of separately controllable radiation sources which emit light in different wavelength ranges.
  • the illumination source 1 is followed by a gray filter 3, a first optical assembly 4, a homogenization device 5 and a second optical assembly 6.
  • the normal to the light entry surface 7 of the gray filter with the optical axis 2 of the illuminating beam path includes an angle in the range from 5 ° to 15 ° , preferably 5 °, so that the portion of the illuminating light reflected by the light entry surface 7 does not or is reflected back only to a small extent in itself or to the illumination source 1, thereby preventing the illumination source 1 from heating up too much.
  • the gray filter 3 itself serves to attenuate the illuminating radiation and is advantageously arranged on a swivel device, which makes it possible to pivot the gray filter 3 into or out of the illuminating beam path as required.
  • the swivel device is not shown in the drawing.
  • a plurality of gray filters 3 which are able to attenuate the illuminating light more or less due to different transparency, on a change wheel, so that it is possible, depending on the desired attenuation, to place one of these filters in the illuminating beam path .
  • the exchange device is not shown in the drawing, but its construction is known from the prior art.
  • the homogenization device 5 is designed as a totally reflective, transparent, full-glass rod with a rectangular cross section.
  • the homogenization device 5 has an irradiation surface 8 and a radiation surface 9.
  • the light entering through the irradiation surface 8 into the homogenization device 5 is totally totally reflected on the way through the homogenization device 5, which leads to mixing of individual radiation components and has the result that the illuminating light on the emission surface 9 has a largely uniformly distributed intensity exit.
  • an internally mirrored hollow rod can also be provided, with normal reflection occurring on the mirrored inner surfaces instead of the total reflection.
  • the first optical assembly 4 has the task of focusing the light coming from the illumination source 1 onto the incident surface 8 with as little loss as possible.
  • the second optical assembly 6 serves to image the homogeneously illuminating radiation surface 9 in the field diaphragm plane 10 of the microscope arrangement.
  • a field diaphragm 1 In the field diaphragm level 1 0 there is a field diaphragm 1 1, which enables the object field to be illuminated with high contrast with the aid of transparent and non-transparent surface sections.
  • a shutter 1 2 is arranged immediately in front of the field diaphragm 11, which serves to darken selected areas of the field diaphragm 11 as a function of the control. In this way, the overexposure of the auto focus sensor 32 with too much excitation light reflected from the sample 20 is avoided.
  • the shutter 1 2 is controlled via a rotary motor 1 3, which makes it possible to introduce different shutter settings into the illuminating beam path, as a result of which the overexposure of the autofocus sensor 32 with too much excitation light reflected from the sample 20 can be effectively prevented.
  • a partially transparent deflecting mirror 14 is arranged downstream of the field diaphragm 11, through which a predominant radiation component 2.1 of the illuminating beam path is directed in the direction of an illuminating tube 15.
  • a smaller radiation component 2.2 of the illuminating beam path passes through the partially transparent deflecting mirror 15 and strikes a monitor detector 1 6, which serves to control the intensity of the illuminating light.
  • the monitor detector 1 6 can be connected to a display device for the radiation intensity and / or via an evaluation circuit to an adjusting device for changing the radiation intensity, the radiation intensity of the light coming from the illumination source 1 being able to be influenced, for example, by the operating voltage.
  • the feedback of the signal output of the monitor detector 16 to the illumination source 1 is not shown in the drawing, but can be carried out in a manner known from control engineering.
  • the radiation component 2.1 is parallelized and then strikes a downstream filter cube 1 7.
  • the filter cube 1 7 is provided on the inlet side with a first spectral filter 1 8, which ensures that only illuminating light with wavelengths to the beam splitter 1 9 of the filter cube 1 7, which are provided for excitation of a sample 20.
  • the selected excitation light is deflected in the direction of the sample 20 by the beam splitter 19, which is preferably designed as a partially transparent plate, passes through an objective 21 and is focused on the sample 20 by this.
  • the sample 20 is excited to fluoresce.
  • the fluorescent light coming from the sample 20 is collected by the lens 21 and occurs after passing through the lens
  • the exit surface of the filter cube 1 7 pointing in the direction of a camera 22 is provided with a second spectral filter 23, which only allows the fluorescent light coming from the sample 20 to pass through.
  • the camera 22 there is an imaging tube 24 which images the sample surface onto a spatially resolving receiving surface in the camera 22.
  • the camera 22 is usually one
  • the filter cube 1 7 is designed as a color divider with regard to its overall function. If at least one of the spectral filters 1 8 or 23 is removed and the beam splitter 1 9 is designed as a non-dichroic splitter, this microscope arrangement is also suitable for imaging and measuring reflecting samples.
  • the sample 20 is positioned on a sample table 38 which can be adjusted in the coordinate directions X and Y perpendicular to the optical axis of the objective 21.
  • the optical axis of the objective 21 is oriented perpendicular to the direction of gravity, while the coordinate direction Y is oriented parallel to the direction of gravity.
  • This microscope arrangement creates the prerequisites for high-precision measurements, in particular on biochips, since the sample section to be examined is largely homogeneously illuminated.
  • the homogeneity of the illuminating light is further improved according to the invention if, for example, the radiation surface 8 and / or the radiation surface 9 of the homogenization device 5, as already explained above, are provided with a structure made of microlenses.
  • the homogenization device 5 as an internally totally reflecting transparent full glass rod or as an internally mirrored hollow rod, as shown in Fig.l, is chosen as an example.
  • the homogenization device 5 can also be designed flexibly as an optical fiber bundle 26.
  • an optical beam surface 8 and a radiation surface 9 can be assigned to the glass fiber bundle 26 and these can also be structured with microlenses, as shown above.
  • a light scattering disc (not shown in the drawing) can be present, as a result of which the homogenization of the radiation intensity is further influenced.
  • FIG. 3 essentially shows the structure of the microscope arrangement as in FIGS. 1 and 2, but with the difference that here the homogenization device 5 is formed from two optical elements 27 and 28, which both have a structure of micro-cylindrical lenses on their light entry surface facing the illumination source 1.
  • the longitudinal direction of the microcylinder lenses in both cases is oriented perpendicular to the optical axis 2 of the illumination beam path, although the longitudinal direction of the microcylinder lenses on the optical element 27 is rotated by 90 ° to the longitudinal direction of the microcylinder lenses on the optical element 28.
  • the functional principle of the autofocusing device will first be explained in more detail with reference to FIG. 4, between the filter cube 17 and the lens 21 there is the glass plate 30, from which the laser beam 31 used for focusing is directed through the lens 21 onto the sample 20.
  • the glass plate 30 is preferably non-reflective on the side facing away from the autofocus laser 29.
  • the glass path of the glass plate 30 is taken into account in the overall optical design.
  • the laser radiation 31 is reflected by the surface of the sample 20, passes through the objective 21 again in the opposite direction, passes through the glass plate 30 and is deflected on the beam splitter 19 of the filter cube 17 in the direction of the lighting tube 15, and passes through the lighting tube 15 and the partially transparent deflecting mirror 14 and then hits the auto focus sensor 32, which is usually preceded by an aperture 33.
  • the laser beam 31 has a wavelength which is at least predominantly reflected by the beam splitter 19 of the filter cube 17.
  • the partially transparent deflecting mirror 14 is sufficiently transparent for the wavelength of the laser beam 31 so that a sufficient proportion of the radiation reaches the auto focus sensor 32.
  • the autofocus sensor 32 includes, for example, a spatially resolving receiving surface (position sensitive detector), a four-quadrant photodiode, a CCD receiving line or a flat CCD receiver.
  • the objective 21 is shifted in the direction R shown, the spatial distribution of the laser radiation reflected from the sample surface changes on the receiving surface of the auto focus sensor 32. This is a criterion for the current focus position of the sample 20 relative to the objective 21.
  • the objective 21 is connected to a straight guide 34 which is aligned parallel to the optical axis 2 of the illuminating beam path and which has a drive 37 which can be controlled in a positionally accurate manner (cf. FIG. 5).
  • the signal input of the drive is connected to the signal output of the autofocus sensor 32 via an evaluation and control device (just as the drive is not shown in the drawing).
  • a control loop to be created for this purpose is sufficiently known from the field of control engineering and therefore does not need to be explained in more detail here.
  • the illuminating radiation can also be used to determine the focus position instead of the injected laser beam 31.
  • FIG. This serves to move the lens 21 in dependence on a command in the direction R of the optical axis 2 of the illuminating beam path and to change the distance between the sample 20 and the lens 21 in order to move the focus point of the lens 21 into the desired position relative to the Bring sample 20.
  • the straight guide 34 is shown symbolically in FIG.
  • the objective 21 is firmly connected to a movable part of the straight guide 34.
  • the lens 21 is connected to a drive 37, here embodied for example as a linear drive, via a rocker 35 which can be pivoted about a swivel joint 36.
  • Suitable drive mechanisms can be used as linear drives, such as, for example, motorized spindle drives, piezo actuators, magnetic core / solenoid actuating devices, etc.
  • FIG. 6 shows an embodiment variant of the microscope arrangement according to the invention which is particularly advantageous with regard to autofocusing.
  • the drawing indicates that the surface normal of the spectral filter 1 8 is not aligned parallel to the optical axis of the lighting tube 1 5, but includes an angle ⁇ of, for example, 5 ° with this optical axis.
  • the first spectral filter 1 8 is arranged on a holder, which enables the change in the inclination of its surface normals and thus the influencing of the light reflected on the first spectral filter 1 8.
  • the direction of inclination and the angle ⁇ are then set such that disturbing reflections place a minimal load on the autofocus sensor 32 and an optimal determination of the current focus position is possible.
  • the surface normal of the second spectral filter 23 also forms an angle with the optical axis 42 of the imaging beam path, which is in the range from 1 ° to 20 °, preferably 5 °.
  • the purpose of the inclination of the second spectral filter 23 is to prevent the portion of the imaging light reflected by the receiving surface in the camera 22 from reaching the second spectral filter 23 again and thrown back from there again to the receiving surface, which could result in secondary images or incorrect images ,
  • the second spectral filter 23 can be arranged on a tilting device which enables the tilt angle and the tilt direction to be adjusted, so that here too the tilt angle is adjusted while the microscope device is operating can be found in which disturbing reflections do not or only minimally falsify the received signal of the camera 22.
  • the microscope arrangement according to the invention is further characterized by a particularly advantageous drive device to which the sample table 38 is coupled. This is shown symbolically in Fig. 8.
  • FIG. 8a there is, for example, next to the objective 21, whose optical axis is oriented perpendicular to the direction of gravity, the sample table 38, which can be adjusted in the coordinate directions X and Y perpendicular to the optical axis of the objective 21.
  • the coordinate direction Y coincides with the direction of gravity.
  • Fig. 8b shows a view in direction A (see Fig. 8a), i.e. in the direction of the optical axis onto the sample 20, which can be received, for example, in a sample carrier, not shown.
  • the adjusting device has a spindle drive for changing the position of the sample table 38 in the coordinate direction Y and a piezo drive for changing the position of the sample table 38 in the coordinate direction X.
  • the spindle drive is advantageously coupled to a stepper motor which, like the piezo drive, enables defined electronic control.
  • the piezo drive selected for the adjustment in the coordinate X enables a relatively rapid linear movement, which in the selected exemplary embodiment also accommodates the fact that the sample has a greater extent in the X direction than in the Y direction.
  • Linear piezo drives which operate on the basis of piezoceramic vibrating rods, are known from the art and therefore do not need to be explained in more detail here.
  • the spindle drive and the piezo drive are controlled in such a way that the displacement in the directions X and Y takes place in steps which correspond to the size of the object field of the objective 21. In this way, a large number of individual shots of the
  • FIG. 9 shows how a cartridge-like sample 20, which has a reservoir for a liquid 39, can be measured with the microscope arrangement according to the invention.
  • fluorescent substances to be examined at the glass / liquid interface e.g. fluorescence-labeled DNA or proteins.
  • the focal point of the lens 21 is set exactly to this interface with the aid of the autofocusing device.
  • Air bubbles which frequently form at glass / liquid interfaces, can collect at location 40 above the liquid level perpendicular to the direction of gravity of the optical axis of the objective 21.
  • a leveling device 41 is provided according to the invention, which allows the glass / liquid interface to be aligned exactly perpendicular to the optical axis of the objective 21 by tilting the sample surface against the contact surface of the sample table 38 is and thus the surface normal of the interface to be examined on the sample 20 is aligned parallel to the optical axis of the objective 21.
  • the invention is particularly suitable for fluorescence microscopic applications, but, as already explained, it can also be used without difficulty for reflective surface examinations.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mikroskopanordnung, umfassend eine Beleuchtungsquelle (1), optische Baugruppen zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs, ein Objektiv (21), durch das der Beleuchtungsstrahlengang auf eine Probe (20) gerichtet ist, die sich in der Objektebene des Objektivs (21) oder in deren Nähe befindet, sowie optische Baugruppen zur Erzeugung eines auf die Empfangsfläche einer Kamera (22) gerichteten Abbildungsstrahlengangs. Erfindungsgemäss ist bei einer solchen Mikroskopanordnung eine Homogenisierungseinrichtung (5) zur Vergleichmässigung der Intensität des Beleuchtungslichts vorhanden, das auf den zu untersuchenden Probenabschnitt trifft. Mit der Homogenisierungseinrichtung (5) wird vorteilhaft erreicht, dass die Objektebene der Mikroskopanordnung und damit der sich in der Objektebene oder in deren Nähe befindende Teilabschnitt einer Probe (20) homogen ausgeleuchtet wird und dadurch eine verbesserte Qualität der Abbildung dieses Probenabschnitts erzielt wird, was eine höhere Messgenauigkeit und im Ergebnis dessen eine höhere Reproduzierbarkeit zur Folge hat.

Description

Titel
Mikroskopanordnung
Gebiet der Erfindung Die Erfindung bezieht sich auf eine Mikroskopanordnung, umfassend eine Beleuchtungsquelle, optische Baugruppen zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs, ein Objektiv, durch das der Beleuchtungsstrahlengang auf eine Probe gerichtet ist, die sich in der Objektebene des Objektivs oder in deren Nähe befindet, sowie optische Baugruppen zur Erzeugung eines auf die Empfangsfläche einer Kamera gerichteten Abbildungsstrahlengangs.
Stand der Technik
Mikroskopanordnungen, insbesondere zur Auflichtmikroskopie im Zusammenhang mit radiometrischen Messungen an der Oberfläche von Biochips, sind an sich bereits bekannt. Derartigen Anordnungen liegen im wesentlichen zwei unterschiedliche Funktionsprinzipien zugrunde.
So sind beispielsweise Laserscanningmikroskope bekannt, bei denen lediglich eine kleine Fläche von einigen μm2 der Probe beleuchtet wird und demzufolge im Augenblick der Beleuchtung auch nur dieselbe kleine Fläche auswertbar ist. Um bei der Auswertung Falschlicht zu unterdrücken und die Abbildungsgüte zu erhöhen, werden „konfokale" Scanverfahren angewendet, indem in den Mikroskopstrahlengang Lochblenden gestellt werden. Nachteil der Laserscanningmikroskopie insbesondere bei Biochip-Untersuchungen ist die Gefahr des Ausbleichens aufgrund der hohen Intensität der auf die kleine betrachtete Fläche fokussierten Laserstrahlung. Außerdem ist die Wahl der Wellenlänge des Beleuchtungslichts stark eingeschränkt. Weiterhin erfordern Laserscanner mechanisch bewegte Baugruppen, wie beispielsweise galvanische Scaneinrichtungen, was einen verhältnismäßig hohen mechanischen Verschleiß und auch hohen Justageaufwand zur Folge hat. Nachteilig ist auch die geringe Quanteneffizienz des Detektors, der in der Regel als Fotomultiplier ausgebildet ist, wovon insbesondere Beleuchtungslicht mit Wellenlängen oberhalb von 600 nm betroffen ist.
Ein weiteres Prinzip beruht auf der Weitfeld-Detektion. Dabei wird ein großflächigeres Feld auf der Probe ausgeleuchtet, und mittels eines Objektivs und gegebenenfalls weiterer Optiken wird ein entsprechender Abschnitt der Probe auf einen ortsauflösenden Empfänger, beispielsweise eine CCD-Kamera, abgebildet.
Sofern es sich dabei um fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen handelt, sind in den Beleuchtungs- bzw. Anregungsstrahlengang und in den Detektions- bzw. Fluoreszenzstrahlengang Spektralfilter gestellt, die für Licht der jeweiligen Wellenlänge durchlässig sind.
Nachteiligerweise ist die Qualität von Bild zu Bild innerhalb einer Bildfolge, die mit einer der bisher bekannten, mit einer Kamera arbeitenden Mikroskopanordnungen von einer Probenoberfläche aufgenommen wird, nicht ausreichend gleichmäßig, so daß sich beim Aneinanderfügen mehrerer Kamerabilder eine kachelartige Struktur im Ge- samtbild ergibt. Insbesondere beim Auslesen von Biochips ist dieses Aneinanderfügen von Bildern jedoch unerläßlich, und die kachelartige Struktur ist im Hinblick auf eine genaue Auswertung unbedingt zu vermeiden.
Weiterhin ist nachteilig, daß die Gleichmäßigkeit der Ausleuchtung des Objektfeldes bzw. des abzubildenden Probenabschnittes für hochgenaue Untersuchungen nicht ausreicht und außerdem die begrenzte Lebensdauer der Beleuchtungsquellen bzw. deren Wartung und wiederholt notwendige Justage eine kontinuierliche Bewertung wechselnder Proben, wie dies beispielsweise bei Messungen von Biochips mit hohem Durchsatz erforderlich ist, behindert. Eine weitere Störquelle sind unerwünschte Reflexe im Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang.
Beschreibung der Erfindung
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Mikroskopanordnung, die nach dem Prinzip der Weitfeld-Detektion arbeitet, dahingehend weiterzubilden, daß Meßergebnisse mit höherer Genauigkeit erzielt werden, als dies im bisherigen Stand der Technik möglich ist.
Erfindungsgemäß ist bei einer solchen Mikroskopanordnung eine Homogenisierungseinrichtung zur Vergleichmäßigung der Intensität des Beleuchtungslichts, das auf den zu untersuchenden Probenabschnitt trifft, vorhanden.
Mit der Homogenisierungseinrichtung wird vorteilhaft erreicht, daß die Objektebene der Mikroskopanordnung und damit der sich in der Objektebene oder in deren Nähe befindende Teilabschnitt einer Probe homogen ausgeleuchtet und dadurch eine verbesserte Qualität der Abbildung dieses Probenabschnitts erzielt wird, wodurch im Ergebnis schließlich eine höhere quantitative Meßgenauigkeit zu bestimmender Intensi- tätswerte erzielt wird.
Als Beleuchtungsquellen kommen Halogenlampen, Bogenlampen, LED ' s und Laser in Betracht, die Licht im sichtbaren, im UV- und/oder im IR-Spektralbereich emittieren.
Die Homogenisierungseinrichtung ist vorteilhaft als Lichtleiter ausgebildet, welcher eine der Beleuchtungsquelle zugewandte Einstrahlfläche und eine dem Objektiv zugewandte Abstrahlfläche für das Beleuchtungslicht aufweist. Dabei kann der Lichtleiter als innen verspiegelter Hohlstab, als innen total-reflektierender, transparenter Vollstab, als Flüssigkeitslichtleiter oder auch in Form eines Glasfaserbündels ausgeführt sein.
Besteht der Lichtleiter aus einem Glasfaserbündel, so ist es empfehlenswert, die Abstrahlfläche selbst als Lichtstreuscheibe auszugestalten oder der Abstrahlfläche eine Lichtstreuscheibe nachzuordnen, die Lichtstreuscheibe unscharf in die Objektebene abzubilden und dadurch die Ausleuchtung zu homogenisieren. Der optisch wirksame Querschnitt des Lichtleiters kann entweder kreisrund, quadratisch oder rechteckig ausgeführt sein. Weiterhin kann der Lichtleiter so ausgestaltet sein, daß die Einstrahlfläche, die Abstrahlfläche oder auch beide dieser Flächen mit einer Mikrolinsenstruktur versehen sind, wobei eine Vielzahl runder, quadratischer, wabenförmiger oder zylinderförmiger Mikrolinsen auf der jeweiligen Fläche nebeneinander angeordnet sind und jede dieser Linsen einen Linsenradius von etwa 1 00 μm bis 1000 μm senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs hat.
Die Homogenisierung der Strahlungsintensität erfolgt, indem das Licht innerhalb des Lichtleiters durch Reflexion fortgeleitet wird und dabei aufgrund der Vielfachreflexionen einzelner Strahlungsanteile an der innen hochreflektierenden Wandung eine Durchmischung erfährt. Dadurch wird über den Lichtweg im Lichtleiter hinweg eine Vergleichmäßigung der Strahlungsintensität, auf den Strahlquerschnitt bezogen, erzielt.
Wird zusätzlich noch die Ein- und/oder die Abstrahlfläche mit einer Mikrolinsenstruktur versehen, wird das Beleuchtungslicht beim Durchgang durch diese Struktur in eine der Vielzahl der Mikrolinsen entsprechende Anzahl von Teilstrahlen aufgespaltet, wodurch eine noch bessere Durchmischung bzw. Homogenisierung der Intensitätsverteilung erzielt wird.
Dabei muß die MikroStruktur nicht, wie beispielhaft dargestellt, auf der Ein- und/oder Abstrahlfläche vorhanden sein, sondern es ist denkbar und führt zu vergleichbar guten Ergebnissen, wenn die Mikrolinsenstruktur auf gesonderten optischen Bauelementen vorhanden ist und diese der Einstrahlfläche vorgeordnet und/oder der Abstrahlfläche nachgeordnet sind.
Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, die Homogenisierung durch gekreuzte Mikrozylinderlinsen zu erzielen, wobei zwei im Beleuchtungsstrahlengang aufeinander fol- gende optische Bauelemente mit Mikrozylinderlinsen strukturiert sind, deren Längsrichtungen senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs orientiert sind, wobei jedoch die Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem einen Bauelement mit der Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem anderen Bauelement einen Winkel von 90° einschließt. Um die homogenisierte Beleuchtungsstrahlung für die Abbildung der Probe nutzbar zu machen, sind Mittel zur Abbildung der Abstrahlfläche der Homogenisierungseinrichtung in die Feldblendenebene der Mikroskopanordnung vorgesehen sowie Mittel zur Abbildung der Feldblendenebene in die Objektebene. Damit wird erreicht, daß das an der Abstrahlfläche homogenisiert austretende Beleuchtungslicht mit vergleichmäßigter Intensitätsverteilung in die Objektebene gelangt.
In einer vereinfachten Ausführung wird die Abstrahlfläche der Homogenisierungseinrichtung nicht in die Feldblendenebene abgebildet, sondern direkt in der Feldblenden- ebene bzw. in deren unmittelbarer Nähe positioniert. Hierdurch ist eine Reduzierung der Anzahl an optischen Baugruppen möglich.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß die optisch wirksame Fläche einer in der Feldblendenebene angeordneten Feldblende strei- fenartig oder schachbrettartig strukturiert ist, wobei in der Struktur transparente und intransparente Teilflächen alternieren. In diesem Fall ist unmittelbar vor der Feldblende ein Shutter zur teilweisen Abblockung des Lichts angeordnet. Der Shutter ist vorzugsweise ansteuerbar und dient zur Verdunklung auswählbarer Flächenbereiche der Feldblende. Damit wird insbesondere erreicht, daß ein gegebenenfalls vorhandener Auto- fokussensor nicht von gestreutem Anregungslicht überstrahlt wird.
Eine so strukturierte Feldblende wird beispielsweise erzeugt, indem die gewünschte streifen- oder schachbrettartige Struktur zunächst als Metallschicht auf eine Glasplatte aufgedampft und dann eine zweite Glasplatte auf diese Struktur aufklebt wird. Die bei- den nach außen, zur Luft hin hingerichteten Grenzflächen der Glasplatten werden vorzugsweise entspiegelt.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung ist der Feldblende im Beleuchtungsstrahlengang ein erster teildurchlässiger Um- lenkspiegel nachgeordnet, von dem der überwiegende Teil des Beleuchtungslichts durch einen den Beleuchtungsstrahlengang parallelisierenden Beleuchtungstubus hindurch und nachfolgend je nach Anwendungsfall noch durch ein Spektralfilter zur Auswahl eines zur Anregung vorgesehenen Spektralanteils auf einen Farbteiler, beispielsweise einen dichroitischen Spiegel, oder einen teildurchlässigen Spiegel trifft und von dessen Teilerfläche durch das Objektiv hindurch auf die Probe gelenkt wird. Ein an dem vor dem Beleuchtungstubus angeordneten teiltransparenten Umlenkspiegel abgezweigter geringerer Teil des Beleuchtungsstrahlengangs kann beispielsweise auf einen Monitordetektor gerichtet sein, der zur Kontrolle der Intensität des Beleuchtungslichts dient. Das Ausgangssignal des Monitordetektors kann dann zur Nachrege- lung oder Normierung der Intensität genutzt werden.
Von der Probe tritt das reflektierte oder, im Falle der Fluoreszenzmikroskopie emittierte Licht wieder durch das Objektiv, passiert den Farbteiler bzw. den teildurchlässigen Spiegel sowie ein nachgeordnetes zweites Spektralfilter, das für das Emissions- bzw. Reflexionslicht durchlässig ist, und gelangt anschließend durch einen Abbildungstubus hindurch zu der Kamera.
Vorteilhaft sind der Beleuchtungstubus und der Abbildungstubus aus identischen optischen Baugruppen ausgeführt, wodurch die Herstellungskosten gering gehalten wer- den können. Außerdem ist es so möglich, die Mikroskopanordnung mit einer definierten optischen Schnittstelle zur Kopplung des Objektivs sowohl mit dem Beleuchtungs- als auch mit dem Abbildungstubus zu versehen. Dies hat den Vorteil, daß verschiedene Objektive in einfacher Weise bei geringem Justageaufwand gegeneinander ausgetauscht und je nach Wahl Objektive genutzt werden können, die entweder ein hohe optische Auflösung von kleiner 1 μm ermöglichen oder ein großes Objektfeld mit bis zu einigen Zentimetern Durchmesser ausleuchten.
Zu diesem Zweck sind mindestens zwei Objektive, die sich bezüglich ihrer optischen Eigenschaften unterscheiden, auf einer Wechseleinrichtung, bevorzugt einem Objektiv- revolver, angeordnet.
Außerdem ist vorgesehen, daß dem Objektiv bzw. den Objektiven jeweils ein abnehmbares Ausgleichsglas vorgeordnet ist, wodurch wahlweise mit Ausgleichs-glas auf einer dem Objektiv zugewandten Luft/Festkörper-Grenzfläche an der Probe oder, ohne Aus- gleichsglas, durch einen transparenten Probenträger hindurch gemessen werden kann.
Weiterhin ist vorteilhaft vorgesehen, daß die Flächennormalen der Spektralfilter im Be- leuchtungs- und/oder im Abbildungsstrahlengang mit der optischen Achse des jeweiligen Strahlengangs einen Winkel im Bereich von 1 ° bis 20°, bevorzugt von 5°, einschlie- ßen. Diese Neigung gegen die jeweilige optische Achse verhindert, daß Falschlicht zur Auswertung gelangt, wobei insbesondere die Neigung des Spektralfilters im Beleuch- tungsstrahlengang im Hinblick auf eine Autofokussiereinrichtung von Bedeutung ist, wie weiter unten noch näher erläutert wird.
Vorteilhaft ist vorgesehen, daß das Spektralfilter im Beleuchtungsstrahlengang und das Spektralfilter im Abbildungsstrahlengang gemeinsam mit dem Farbteiler als Filterwürfel ausgebildet sind. Dieser Filterwürfel kann in ergänzender Ausgestaltung mit mindestens einem weiteren Filterwürfel, der sich vom ersten Filterwürfel hinsichtlich der gefilterten Wellenlängen, bei der Fluoreszenzmikroskopie zum Beispiel hinsichtlich der Anregungs- und Emissionswellenlängen unterscheidet, auf einer Wechseleinrichtung angeordnet sein, die beispielsweise als Wechselrad ausgebildet ist.
Im Rahmen der Erfindung liegt es weiterhin, daß in den Beleuchtungsstrahlengang ein gegen die optische Achse des Beleuchtungsstrahlengangs geneigtes Graufilter einschwenkbar ist, wobei die Flächennormale des Graufilters mit der optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs einen Winkel im Bereich von 5° bis 1 5° einschließt. Dieses Graufilter dient zur Abschwächung der Strahlung, wobei die Neigung des Filters gegen die optische Achse verhindert, daß von der Eintrittsfläche des Graufilters zuviel Beleuchtungslicht zur Beleuchtungsquelle zurückreflektiert und dadurch eine unzulässige Aufheizung die Beleuchtungsquelle vermieden wird.
Als besonders vorteilhaft ist eine Ausgestaltung zu bewerten, bei der die Beleuchtungsquelle über eine lösbare mechanische Verbindung mit den übrigen Baugruppen der Mikroskopanordnung gekoppelt ist. Da die Beleuchtungsquelle aufgrund der Homogenisierungseinrichtung von den übrigen optischen Baugruppen, die der Erzeugung des Beleuchtungsstrahlengangs dienen, entkoppelt ist und die mit der Homogenisierungseinrichtung erreichte gleichmäßige Intensitätsverteilung im Beleuchtungsstrahlengang auch dann erhalten bleibt, wenn die Beleuchtungsquelle gewechselt wird, ist die technische Grundlage für die justagefreie Auswechslung verschiedener Beleuchtungsquellen gegeneinander gegeben.
Dabei können sich die ausgewechselten Beleuchtungsquellen sowohl hinsichtlich der technischen Ausstattung (Halogenlampe, Bogenlampe, LED usw.) als auch hinsichtlich der Wellenlängen des abgestrahlten Lichts (VIS, UV, IR) unterscheiden.
Weiterhin besteht eine Ausführungsoption darin, das Objektiv auf einer Geradführung in Richtung seiner optischen Achse verschiebbar anzuordnen und zu diesem Zweck mit einer motorisch angetriebenen Stelleinrichtung zu koppeln. Die Verschiebbarkeit des Objektivs in Richtung der optischen Achse ist zur Veränderung des Abstandes zwischen der Probe und dem Objektiv und damit zur Fokussierung nutzbar.
So ist optional eine Autofokussiereinrichtung vorgesehen, die einen Autofokussensor, eine Autofokusaktorik sowie Mittel zur Einkopplung eines Autofokus-Laser-strahls in den Beleuchtungsstrahlengang umfaßt.
Die Kamera kann wahlweise als CCD- oder als CMOS-Kamera ausgebildet sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung ist die optische Achse des Objektivs senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet. Dadurch können sich Luftblasen, die sich häufig an Glas/Flüssigkeits- Grenzflächen kartuschenartiger Proben absetzen, oberhalb des Flüssigkeitspegels sammeln. Sie verfälschen dann nicht mehr die Abbildung, wodurch die Meßgenauigkeit weiterhin erhöht wird.
Zur Aufnahme der Probe ist ein in den Koordinatenrichtungen X und/oder Y senkrecht zur optischen Achse des Objektivs verstellbarer Probentisch vorgesehen. Der Proben- tisch kann vorteilhaft mit einem Piezoantrieb und/oder mit einem Spindelantrieb gekoppelt sein. Bevorzugt ist zur Verstellung des Probentisches in der Koordinatenrichtung X der Piezoantrieb und zur Verstellung des Probentisches in der Koordinatenrichtung Y, die bevorzugt der Schwerkraftrichtung entspricht, der Spindelantrieb vorgesehen.
Außerdem kann der Probentisch mit einer Nivelliereinrichtung gekoppelt sein, die zur Einstellung der Neigung der Probenoberfläche relativ zur optischen Achse des Objektivs dient. Die Probe ist mittels eines Probenhalters auf dem Probentisch angeordnet, wobei der Probenhalter und der Probentisch lösbar miteinander verbunden sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen: Fig.l das Grundprinzip der Erfindung anhand einer Mikroskopanordnung für die Fluoreszenzmikroskopie, wobei die Homogenisierungseinrichtung als Vollglasstab ausgebildet ist,
Fig.2 das Grundprinzip der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung, bei dem die Homogenisierungseinrichtung flexibel als Glasfaserbündel ausgebildet ist,
Fig.3 das Grundprinzip der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung, bei dem die Homogenisierungseinrichtung aus zwei optischen Elementen besteht,
Fig.4 eine in die erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung integrierte Autofokussiereinrichtung,
Fig.5 das Prinzip der Autofokusaktorik innerhalb der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung,
Fig.6 eine besonders im Hinblick auf die Autofokussierung vorteilhafte Ausgestaltungsvariante der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung,
Fig.7 die Neigung der Flächennormalen eines Spektralfilters gegen die optische Achse des Abbildungsstrahlengangs,
Fig.8 die Kopplung des Probentisches der erfindungsgemäße Mikroskopanordnung an eine Antriebseinrichtung,
Fig.8a die Antriebseinrichtung für den Probentisch, der in den Koordinatenrichtungen X und Y senkrecht zur optischen Achse des Objektivs verstellbar ist, wobei die optische Achse des Objektivs senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet ist,
Fig.8b einen Blick in Richtung A aus Fig.8a auf die Probe, Fig.9 die Ausrichtung einer kartuschenartigen Probe, die ein Reservoir für eine Flüssigkeit aufweist, in der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung. x
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In Fig.l ist das Grundprinzip der Erfindung anhand einer Mikroskopanordnung für die Fluoreszenzmikroskopie dargestellt.
Dabei ist eine Beleuchtungsquelle 1 vorgesehen, die beispielsweise Licht im sichtbaren, im UV- und/oder im IR- Spektralbereich emittiert. In besonderen Ausführungen kann die Beleuchtungsquelle 1 mehrere gesondert ansteuerbare Strahlungsquellen umfassen, die Licht in verschiedenen Wellenlängenbereichen emittieren.
Zur Formung eines Beleuchtungsstrahlengangs entlang der optischen Achse 2 sind der Beleuchtungsquelle 1 ein Graufilter 3, eine erste optische Baugruppe 4, eine Homogenisierungseinrichtung 5 und eine zweite optische Baugruppe 6 nachgeordnet.
Wie zeichnerisch angedeutet, schließt die Normale auf die Lichteintrittsfläche 7 des Graufilters mit der optischen Achse 2 des Beleuchtungsstrahlengangs einen Winkel im Bereich von 5° bis 1 5°, bevorzugt von 5° ein, so daß der von der Lichteintrittsfläche 7 reflektierte Anteil des Beleuchtungslichts nicht oder nur in einem geringen Maße in sich bzw. zur Beleuchtungsquelle 1 zurückreflektiert wird, wodurch vermieden wird, daß sich die Beleuchtungsquelle 1 zu sehr aufheizt.
Das Graufilter 3 selbst dient zur Abschwächung der Beleuchtungsstrahlung und ist vorteilhafterweise auf einer Schwenkeinrichtung angeordnet, die es ermöglicht, das Graufilter 3 nach Bedarf in den Beleuchtungsstrahlengang ein- bzw. aus diesem herauszuschwenken. Die Schwenkeinrichtung ist zeichnerisch nicht dargestellt.
Optional kann auch vorgesehen sein, mehrere Graufilter 3, die aufgrund unterschiedlicher Transparenz in der Lage sind, das Beleuchtungslicht mehr oder weniger abzuschwächen, auf einem Wechselrad anzuordnen, so daß es möglich ist, wahlweise je nach gewünschter Abschwächung eines dieser Filter in den Beleuchtungsstrahlengang zu stellen. Die Wechseleinrichtung ist zeichnerisch nicht dargestellt, bezüglich ihrer Bauweise jedoch aus dem Stand der Technik bekannt.
Die Homogenisierungseinrichtung 5 ist in dem Ausführungsbeispiel nach Fig. l als innen total-reflektierender, transparenter Vollglasstab mit rechteckigem Querschnitt ausgeführt.
Die Homogenisierungseinrichtung 5 weist eine Einstrahlfläche 8 und eine Abstrahlfläche 9 auf. Das durch die Einstrahlfläche 8 in die Homogenisierungseinrichtung 5 eintretende Licht wird auf dem Weg durch die Homogenisierungseinrichtung 5 vielfach nach innen total-reflektiert, was zu einer Durchmischung einzelner Strahlungsanteile führt und zum Ergebnis hat, daß das Beleuchtungslicht an der Abstrahlfläche 9 mit weitestgehend gleichmäßig verteilter Intensität austritt. Anstelle des Vollstabes kann auch ein innenverspiegelter Hohlstab vorgesehen sein, wobei statt der Totalreflexion normale Reflexion an den verspiegelten Innenflächen auftritt.
Die erste optische Baugruppe 4 hat die Aufgabe, das von der Beleuchtungsquelle 1 kommende Licht möglichst verlustfrei auf die Einstrahlfläche 8 zu fokussieren. Die zweite optische Baugruppe 6 dient dazu, die homogen leuchtende Abstrahlfläche 9 in die Feldblendenebene 10 der Mikroskopanordnung abzubilden.
In der Feldblendenebene 1 0 befindet sich eine Feldblende 1 1 , die mit Hilfe von transparenten und intransparenten Flächenabschnitten eine Ausleuchtung des Objektfeldes mit hohem Kontrast ermöglicht. Unmittelbar vor der Feldblende 1 1 ist ein Shutter 1 2 angeordnet, der dazu dient, je nach Ansteuerung ausgewählte Teilbereiche der Feld- blende 1 1 zu verdunkeln. Hierdurch wird die Überstrahlung des Autofokussensors 32 mit zu viel von der Probe 20 reflektiertem Anregungslicht vermieden.
Die Ansteuerung des Shutters 1 2 erfolgt über einen Rotationsmotor 1 3, der es ermöglicht, unterschiedliche Shutter-Einstellungen in den Beleuchtungsstrahlen-gang einzu- bringen, wodurch die Überstrahlung des Autofokussensors 32 mit zu viel von der Probe 20 reflektiertem Anregungslicht effektiv verhindert werden kann.
Der Feldblende 1 1 ist ein teiltransparenter Umlenkspiegel 14 nachgeordnet, durch den ein überwiegender Strahlungsanteil 2.1 des Beleuchtungsstrahlengangs in Richtung auf einen Beleuchtungstubus 1 5 gelenkt wird. Ein geringerer Strahlungsanteil 2.2 des Beleuchtungsstrahlengangs tritt durch den teiltransparenten Umlenkspiegel 1 5 hindurch und trifft auf einen Monitordetektor 1 6, der zur Kontrolle der Intensität des Beleuchtungslichts dient.
Der Monitordetektor 1 6 kann mit einer Anzeigeeinrichtung für die Strahlungsintensität und/oder über eine Auswerteschaltung mit einer Nachstelleinrichtung zur Veränderung der Strahlungsintensität verbunden sein, wobei die Strahlungsintensität des von der Beleuchtungsquelle 1 ausgehenden Lichts beispielsweise über die Betriebsspannung beeinflußt werden kann. Die Rückkopplung des Signalausgangs des Monitordetektors 16 zur Beleuchtungsquelle 1 ist zeichnerisch nicht dargestellt, kann jedoch in einer aus der Regelungstechnik bekannten Weise vorgenommen werden. Beim Durchtritt durch den Beleuchtungstubus 1 5 wird der Strahlungsanteil 2.1 paralle- lisiert und trifft dann auf einen nachgeordneten Filterwürfel 1 7. Der Filterwürfel 1 7 ist eintrittsseitig mit einem ersten Spektralfilter 1 8 versehen, das dafür sorgt, daß nur Beleuchtungslicht mit Wellenlängen zum Strahlteiler 1 9 des Filterwürfels 1 7 gelangt, die zur Anregung einer Probe 20 vorgesehen sind.
Das ausgewählte Anregungslicht wird von dem Strahlteiler 1 9, der bevorzugt als teildurchlässige Platte ausgebildet ist, in Richtung auf die Probe 20 umgelenkt, tritt dabei durch ein Objektiv 21 hindurch und wird durch dieses auf die Probe 20 fokussiert.
Die Probe 20 wird zur Fluoreszenz angeregt. Das von der Probe 20 kommende Fluoreszenzlicht wird vom Objektiv 21 gesammelt und tritt nach Passieren des Objektivs
21 durch den Strahlteiler 1 9 des Filterwürfels 1 7 hindurch.
Die in Richtung auf eine Kamera 22 weisende Austrittsfläche des Filterwürfels 1 7 ist mit einem zweiten Spektralfilter 23 versehen, welches nur das von der Probe 20 kommende Fluoreszenzlicht hindurchläßt. Zwischen dem Filterwürfel 1 7 und der Kamera
22 ist ein Abbildungstubus 24 vorhanden, der die Probenoberfläche auf eine ortsauflö- sende Empfangsfläche in der Kamera 22 abbildet. Üblicherweise ist der Kamera 22 eine
Blende 25 vorgeordnet.
Das hier gewählte Ausführungsbeispiel wird für die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Deshalb ist der Filterwürfel 1 7 hinsichtlich seiner Gesamtfunktion als Farbteiler ausgeführt. Wird mindestens eines der Spektralfilter 1 8 bzw. 23 entfernt und der Strahlteiler 1 9 als nicht-dichroitischer Teiler ausgeführt, so ist diese Mikroskopanordnung auch zur Abbildung und Vermessung reflektierender Proben geeignet.
Die Probe 20 ist auf einem Probentisch 38 positioniert, der in den Koordinatenrichtun- gen X und Y senkrecht zur optischen Achse des Objektivs 21 verstellbar ist. Dabei ist die optische Achse des Objektivs 21 senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet, während die Koordinatenrichtung Y parallel zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet ist.
Mit dieser Mikroskopanordnung sind die Voraussetzungen für hochgenaue Messungen insbesondere an Biochips geschaffen, da der zu untersuchende Probenabschnitt wei- testgehend homogen ausgeleuchtet wird. Die Homogenität des Beleuchtungslichts wird erfindungsgemäß noch weiter verbessert, wenn beispielsweise die Einstrahlfläche 8 und/oder die Abstrahlfläche 9 der Homogenisierungseinrichtung 5, wie weiter oben bereits dargelegt, mit einer Struktur aus Mi- krolinsen versehen sind.
Die Ausführung der Homogenisierungseinrichtung 5 als innen total-reflektierender transparenter Vollglasstab oder als innen verspiegelter Hohlstab, wie in Fig.l dargestellt, ist beispielhaft gewählt. In einer anderen Ausführungsform, wie in Fig.2 gezeigt, kann die Homogenisierungseinrichtung 5 auch flexibel als Glasfaserbündel 26 ausgeführt sein.
Auch in diesem Fall können dem Glasfaserbündel 26 eine Eiήstrahlfläche 8 und eine Abstrahlfläche 9 zugeordnet und diese ebenfalls wie oben dargestellt mit Mikrolinsen strukturiert sein.
Zusätzlich oder auch anstelle der Abstrahlfläche 9 kann eine Lichtstreuscheibe (zeichnerisch nicht dargestellt) vorhanden sein, wodurch die Homogenisierung der Strahlungsintensität weiter beeinflußt wird.
Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind in Fig.l und Fig.2 für jeweils dieselben Baugruppen auch dieselben Bezugszeichen verwendet worden.
Dies trifft auch für die Fig.3 zu, die im wesentlichen den Aufbau der Mikroskopanord- nung wie in Fig.l und Fig.2 zeigt, jedoch mit dem Unterschied, daß hier die Homogenisierungseinrichtung 5 aus zwei optischen Elementen 27 und 28 gebildet ist, die beide an ihrer der Beleuchtungsquelle 1 zugewandten Lichteintrittsfläche eine Struktur aus Mikrozylinderlinsen aufweisen. Dabei sind die Mikrozylinderlinsen mit ihrer Längsrichtung in beiden Fällen senkrecht zur optischen Achse 2 des Beleuchtungsstrahlengangs ausgerichtet, wobei allerdings die Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem optischen Element 27 zur Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem optischen Element 28 um 90° verdreht sind.
Auch hierdurch wird, wie bereits weiter oben beschrieben, eine Homogenisierung der Intensität des Beleuchtungslichts erzielt und damit die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst. Aus Fig.l , Fig.2 und Fig.3 geht weiterhin hervor, daß die erfindungsgemäße Mikroskopanordnung mit einer Autofokussiereinrichtung ausgestattet ist, die im wesentlichen einen Autofokuslaser 29, eine Glasplatte 30 zur Einkopplung der vom Autofokus- laser 29 ausgehenden Laserstrahlung 31 in den Beleuchtungsstrahlengang, eine Auto- fokusaktorik, die weiter unten anhand Fig.5 näher erläutert wird, sowie einen Autofokussensor 32 umfaßt.
Anhand Fig.4 soll zunächst das Funktionsprinzip der Autofokussiereinrichtung näher erläutert werden. Wie aus Fig.4 ersichtlich ist, befindet sich zwischen dem Filterwürfel 1 7 und dem Objektiv 21 die Glasplatte 30, von welcher der zur Fokussierung genutzte Laserstrahl 31 durch das Objektiv 21 hindurch auf die Probe 20 gelenkt wird. Die Glasplatte 30 ist vorzugsweise auf der dem Autofokuslaser 29 abgewandten Seite entspiegelt. Der Glasweg der Glasplatte 30 wird im Gesamt-Optik-Design rechnerisch berück- sichtigt.
Die Laserstrahlung 31 wird von der Oberfläche der Probe 20 reflektiert, tritt in entgegengesetzter Richtung wieder durch das Objektiv 21 hindurch, passiert die Glasplatte 30 und wird an dem Strahlteiler 19 des Filterwürfels 1 7 in Richtung auf den Beleuch- tungstubus 1 5 umgelenkt, tritt durch den Beleuchtungstubus 1 5 und den teiltransparenten Umlenkspiegel 14 hindurch und trifft danach auf den Autofokussensor 32, dem üblicherweise eine Blende 33 vorgeordnet ist.
Der Laserstrahl 31 besitzt eine Wellenlänge, die von dem Strahlteiler 1 9 des Filterwür- fels 1 7 zumindest überwiegend reflektiert wird. Der teiltransparente Umlenkspiegel 14 ist für die Wellenlänge des Laserstrahls 31 hinreichend transparent, so daß ein ausreichender Strahlungsanteil zum Autofokussensor 32 gelangt. Der Autofokussensor 32 beinhaltet beispielsweise eine ortsauflösende Empfangsfläche (Position Sensitive Detec- tor), eine Vier-Quadranten-Fotodiode, eine CCD-Empfangszeile oder einen flächigen CCD-Empfänger.
Wird das Objektiv 21 in der dargestellten Richtung R verschoben, so ändert sich auf der Empfangsfläche des Autofokussensors 32 die räumliche Verteilung der von der Probenoberfläche reflektierten Laserstrahlung. Dies ist ein Kriterium für die aktuelle Fokusposition der Probe 20 relativ zum Objektiv 21 . Zum Zweck der Verschiebung in Richtung R ist das Objektiv 21 mit einer parallel zur optischen Achse 2 des Beleuchtungsstrahlengangs ausgerichteten Geradführung 34 verbunden, die einen positionsgenau ansteuerbaren Antrieb 37 aufweist (vgl. Fig.5). Dabei ist der Signaleingang des Antriebes über eine Auswerte- und Ansteuereinrich- tung (ebenso wie der Antrieb nicht zeichnerisch dargestellt) mit dem Signalausgang des Autofokussensors 32 verbunden. Ein zu diesem Zweck zu schaffender Regelkreis ist aus dem Gebiet der Regelungstechnik hinreichend bekannt und muß demzufolge hier nicht näher erläutert werden.
Der Vollständigkeit halber sei darauf hingewiesen, daß zur Autofokussierung anstelle des eingekoppelten Laserstrahls 31 prinzipiell auch die Beleuchtungsstrahlung zur Bestimmung der Fokuslage genutzt werden kann.
In Fig.5 ist das Prinzip der Autofokusaktorik dargestellt. Diese dient dazu, das Objektiv 21 in Abhängigkeit von einem Stellbefehl in Richtung R der optischen Achse 2 des Beleuchtungsstrahlengangs zu verschieben und dabei den Abstand zwischen der Probe 20 und dem Objektiv 21 zu verändern, um den Fokuspunkt des Objektivs 21 in die gewünschte Lage relativ zur Probe 20 zu bringen. Die Geradführung 34 ist in Fig.5 symbolisch dargestellt.
Das Objektiv 21 ist dabei mit einem beweglichen Teil der Geradführung 34 fest verbunden. Über eine Wippe 35, die um ein Drehgelenk 36 schwenkbar ist, ist das Objektiv 21 mit einem Antrieb 37, hier beispielsweise als Linearantrieb ausgebildet, verbunden. Als Linearantriebe sind geeignete Antriebsmechanismen einsetzbar, wie bei- spielsweise motorisierte Spindelantriebe, Piezo-Aktuatoren, Magnetkern-/Magnetspul- Stelleinrichtungen u.a.
Wie bereits weiter oben beschrieben, ist der Signalausgang des Autofokussensors 32 in Fig.4 mit einer zeichnerisch nicht dargestellten Auswerte- und Steuereinheit verbun- den, die in Abhängigkeit von der aktuell ermittelten Fokuslage einen Steuerbefehl für den Antrieb 37 generiert. Damit bewirkt das Zusammenspiel von Autofokussensor 32 und Antrieb 37 eine automatisierte Einstellung der optimalen Fokuslage, so daß sich die Probe 20 exakt in der Objektebene befindet und scharf auf die Empfangsfläche der Kamera 22 abgebildet wird. ln Fig.6 ist eine besonders im Hinblick auf die Autofokussierung vorteilhafte Ausgestaltungsvariante der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung dargestellt. Die Zeichnung deutet an, daß die Flächennormale des Spektralfilters 1 8 nicht parallel zur optischen Achse des Beleuchtungstubus 1 5 ausgerichtet ist, sondern mit dieser optischen Achse einen Winkel α von beispielsweise 5° einschließt.
Damit wird erreicht, daß das an der Eintrittsfläche reflektierte Beleuchtungslicht nicht zum Autofokussensor 32 gelangt, so daß eine Übersteuerung des Autofokussensors 32 durch dieses in Bezug auf die Autofokussierung Falschlicht vermieden wird.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung, die zeichnerisch nicht dargestellt ist, ist das erste Spektralfilter 1 8 auf einer Halterung angeordnet, welche die Änderung der Neigung seiner Flächennormalen und damit die Beeinflussung des am ersten Spektralfilter 1 8 reflektierten Lichts ermöglicht. Beim Betreiben der Mikroskopanordnung wer- den die Neigungsrichtung und der Winkel α dann so eingestellt, daß störende Reflexe den Autofokussensor 32 minimal belasten und so eine optimale Ermittlung der aktuellen Fokusposition möglich ist.
Wie in Fig.7 dargestellt kann in ähnlicher Weise vorgesehen sein, daß auch die Flä- chennormale des zweiten Spektralfilters 23 mit der optischen Achse 42 des Abbildungsstrahlengangs einen Winkel einschließt, der im Bereich von 1 ° bis 20°, vorzugsweise bei 5° liegt. Der Zweck der Neigung des zweiten Spektralfilters 23 besteht darin zu verhindern, daß der von der Empfangsfläche in der Kamera 22 reflektierte Anteil des Abbildungslichts wieder zum zweiten Spektralfilter 23 und von dort wiederum zu- rückgeworfen nochmals zur Empfangsfläche gelangt, wodurch Sekundärbilder bzw. Fehlabbildungen entstehen könnten.
Dabei kann wie bereits anhand des ersten Spektralfilters 18 in Fig.6 erläutert, das zweite Spektralfilter 23 auf einer Kippeinrichtung angeordnet sein, welche die Verstel- lung des Neigungswinkels und der Neigungsrichtung ermöglicht, so daß auch hier während des Betriebes der Mikroskopeinrichtung eine Einstellung des Neigungswinkels gefunden werden kann, bei der störende Reflexe das Empfangssignal der Kamera 22 gar nicht oder nur minimal verfälschen. Die erfindungsgemäße Mikroskopanordnung zeichnet sich weiterhin durch eine besonders vorteilhafte Antriebseinrichtung aus, mit welcher der Probentisch 38 gekoppelt ist. Dies ist in Fig.8 symbolisch dargestellt.
In Fig.8a befindet sich beispielsweise neben dem Objektiv 21 , dessen optische Achse senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet ist, der Probentisch 38, der in den Koordinatenrichtungen X und Y senkrecht zur optischen Achse des Objektivs 21 verstellbar ist. Dabei stimmt die Koordinatenrichtung Y mit der Schwerkraftrichtung überein.
Fig.8b zeigt einen Blick in Richtung A (vgl. Fig.8a), d.h. in Richtung der optischen Achse auf die Probe 20, die beispielsweise in einem nicht dargestellten Probenträger aufgenommen sein kann.
In Fig.8b sind die Verstellrichtungen in den Koordinaten Y und X eingezeichnet, in de- nen mittels einer Stelleinrichtung eine definierte Positionsänderung des Probentisches 38 und somit der Probe 20 senkrecht zur optischen Achse des Objektivs 21 erfolgt.
Dabei hat sich bewährt, daß die Versteileinrichtung einen Spindelantrieb zur Positionsänderung des Probentisches 38 in der Koordinatenrichtung Y und einen Piezoantrieb zur Positionsänderung des Probentisches 38 in der Koordinatenrichtung X aufweist. Der Spindelantrieb ist vorteilhaft mit einem Schrittmotor gekoppelt, der ebenso wie der Piezoantrieb eine definierte elektronische Ansteuerung ermöglicht.
Da die Verstellung in der Koordinate Y in Richtung der Schwerkraft erfolgt, muß die auf den Probentisch 38 wirkende Schwerkraft kompensiert werden, wozu ein Spindelantrieb vorteilhaft geeignet ist. Dagegen ermöglicht der für die Verstellung in der Koordinate X gewählte Piezoantrieb eine verhältnismäßig schnelle Linearbewegung, die im gewählten Ausführungsbeispiel auch der Tatsache entgegenkommt, daß die Probe in X- Richtung eine größere Ausdehnung aufweist als in Y-Richtung. Lineare Piezoantriebe, die auf der Basis piezokeramischer Schwingstäbe arbeiten, sind aus der Technik bekannt und müssen deshalb hier nicht näher erläutert werden.
Der Spindelantrieb und der Piezoantrieb werden so angesteuert, daß die Verschiebung in den Richtungen X und Y in Schritten erfolgt, die der Größe des Objektfeldes des Ob- jektivs 21 entsprechen. Auf diese Weise wird eine Vielzahl von Einzelaufnahmen der
Probenoberfläche gewonnen, die in einer Auswerteelektronik gespeichert und zu einem Gesamtbild zusammengesetzt werden, was auch sukzessive nach jeder Einzelaufnahme vorgenommen werden kann.
Anhand Fig.9 ist dargestellt, wie eine kartuschenartige Probe 20, die ein Reservoir für eine Flüssigkeit 39 aufweist, mit der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung vermessen werden kann. Dabei befinden sich an der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche zu untersuchende fluoreszierende Substanzen, z.B. fluoreszenzmarkierte DNA oder Proteine. Der Fokuspunkt des Objektivs 21 wird mit Hilfe der Autofokussiereinrichtung exakt auf diese Grenzfläche eingestellt.
Aufgrund der horizontalen, d.h. senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichteten optischen Achse des Objektivs 21 können sich Luftblasen, die sich häufig an Glas/Flüssigkeits-Grenzflächen bilden, am Ort 40 oberhalb des Flüssigkeitspegels sammeln.
Da kartuschenartige Proben 20 oftmals aus unpräzise hergestellten Kunststoffteilen bestehen, ist erfindungsgemäß eine Nivelliervorrichtung 41 vorgesehen, die es gestattet, die Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche exakt senkrecht zur optischen Achse des Objektivs 21 auszurichten, indem die Probenoberfläche gegen die Auflagefläche des Proben- tisches 38 verkippt wird und damit die Flächennormale der zu untersuchenden Grenzfläche an der Probe 20 parallel zur optischen Achse des Objektiv 21 ausgerichtet wird.
Die Erfindung ist in besonderem Maße für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen geeignet, sie kann, wie bereits dargelegt, ohne weiteres aber auch für reflektive Ober- flächenuntersuchungen verwendet werden.

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskopanordnung, umfassend
- eine Beleuchtungsquelle (1 ), optische Baugruppen zur Erzeugung eines Beleuchtungsstrahlengangs und ein Objektiv (21 ), durch das der Beleuchtungsstrahlengang auf eine Probe (20) gerichtet ist, die sich in der Objektebene des Objektivs
(21 ) oder in deren Nähe befindet, sowie - optische Baugruppen zur Erzeugung eines auf die Empfangsfläche einer Kamera
(22) gerichteten Abbildungsstrahlengangs, dadurch gekennzeichnet, daß eine Homogenisierungseinrichtung (5) zur Vergleichmäßigung der Intensität des Beleuchtungslichts, das auf den zu untersuchenden Probenabschnitt trifft, vorhanden ist.
2. Mikroskopanordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Homogenisierungseinrichtung (5) als Lichtleiter ausgebildet ist mit einer der Beleuchtungsquelle (1 ) zugewandten Einstrahlfläche (8) und einer dem Objektiv (21 ) zugewandten Abstrahlfläche (9) für das Beleuchtungslicht.
>. Mikroskopanordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtleiter als innen verspiegelter Hohlstab, als innen total-reflektierender, transparenter Vollstab, als Flüssigkeitslichtleiter oder in Form eines Glasfaserbündels (26) ausgeführt ist.
4. Mikroskopanordnung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der optisch wirksame Querschnitt des Lichtleiters kreisrund, quadratisch oder rechteckig ausgeführt ist.
5. Mikroskopanordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ein- und/oder die Abstrahlfläche (8,9) der Homogenisierungseinrichtung (5) mit einer Mikrolinsenstruktur versehen ist, wobei eine Vielzahl runder, quadratischer, wabenförmiger oder zylinderförmiger Mikrolinsen mit jeweils einem Linienradius von etwa 100 μm bis 1 000 μm nebeneinander angeordnet sind.
Mikroskopanordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß - als Homogenisierungseinrichtung (5) zwei im Beleuchtungsstrahlengang aufeinander folgende, mit Mikrozylinderlinsen strukturierte optische Bauelemente (27,28) vorgesehen sind, wobei
- die Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf beiden Bauelementen (27,28) senkrecht zur optischen Achse (2) des Beleuchtungsstrahlengangs ausgerichtet sind, und wobei
- die Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem einen Bauelement (27) mit der Längsrichtung der Mikrozylinderlinsen auf dem anderen Bauelement (28) einen Winkel von 90° einschließt.
7. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Abbildung der Abstrahlfläche (9) in die Feldblendenebene (1 0) der Mikroskopanordnung sowie Mittel zur Abbildung der Feldblendenebene (10) in die Objektebene vorhanden sind.
3. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optisch wirksame Fläche einer in der Feldblendenebene (10) angeordneten Feldblende (1 1 ) streifenartig oder schachbrettartig strukturiert ist, wobei in der Struktur transparente und intransparente Teilflächen alternieren.
9. Mikroskopanordnung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Feldblende (1 1 ) ein ansteuerbarer Shutter (1 2) vorgeordnet ist, der zur Verdunklung auswählbarer Flächenbereiche der Feldblende (1 1 ) dient.
10. Mikroskopanordnung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß
- der Feldblende (1 1 ) im Beleuchtungsstrahlengang ein teildurchlässiger Umlenkspiegel (14) nachgeordnet ist,
- von dem der überwiegende Teil des Beleuchtungslichts durch einen der Paralleli- sierung des Beleuchtungslichts dienenden Beleuchtungstubus (1 5) und - durch ein erstes Spektralfilter (1 8) zur Auswahl eines zur Anregung vorgesehenen Anteils des Beleuchtungslichts hindurch
- auf einen Farbteiler, bevorzugt einen dichroitischen Spiegel, oder einen teiltransparenten Spiegel trifft und
- von dessen Teilerfläche (1 9) durch das Objektiv (21 ) hindurch auf die Probe (20) gelenkt wird.
1 1 . Mikroskopanordnung nach Anspruch 1 0, dadurch gekennzeichnet, daß
- das von der Probe (20) emittierte Fluoreszenzlicht zurück durch das Objektiv (21 ) tritt,
- die Teilerfläche (19) des Farbteilers oder teiltransparenten Spiegels passiert und - nachfolgend durch ein zweites Spektralfilter (23), das für das Emissionslicht durchlässig ist, und durch
- einen Abbildungstubus (24) hindurch zu der Kamera (22) gelangt.
1 2. Mikroskopanordnung nach Anspruch 1 0 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Beleuchtungstubus (1 5) und der Abbildungstubus (24) aus identischen optischen Baugruppen ausgeführt sind.
1 3. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Objektiv (21 ) ein abnehmbares Ausgleichsglas vorgeord- net ist, wodurch wahlweise mit Ausgleichsglas auf einer dem Objektiv (21 ) zugewandten Luft/Festkörper-Grenzfläche der Probe (20) oder ohne Ausgleichsglas durch einen transparenten Probenträger hindurch gemessen werden kann.
14. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, daß ein durch den teiltransparenten Umlenkspiegel (14) hindurchtretender Anteil des Beleuchtungslichts auf einen Monitordetektor (1 6) gerichtet ist, der zur Kontrolle der Intensität des Beleuchtungslichts dient.
1 5. Mikroskopanordnung nach einem der Ansprüche 1 0 bis 14, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Flächennormalen der Spektralfilter (1 8,23) mit der optischen
Achse (2) des Beleuchtungsstrahlengangs bzw. mit der optischen Achse (42) des Abbildungsstrahlengangs einen Winkel im Bereich von 1 ° bis 20°, vorzugsweise von 5°, einschließen.
1 6. Mikroskopanordnung nach einem der Ansprüche 1 0 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Spektralfilter (1 8) im Beleuchtungsstrahlengang und das Spektralfilter (23) im Abbildungsstrahlengang gemeinsam mit dem Farbteiler bzw. dem teildurchlässigen Spiegel als Filterwürfel (1 7) ausgebildet sind.
1 7. Mikroskopanordnung nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Filterwürfel (1 7) mit mindestens einem weiteren Filterwürfel, der sich von dem er- sten Filterwürfel (1 7) hinsichtlich seiner Auslegung für die Anregungs- und Emissionswellenlängen des Beleuchtungslichts unterscheidet, auf einer Wechseleinrichtung, bevorzugt einem Wechselrad angeordnet ist.
1 8. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Beleuchtungsstrahlengang ein gegen dessen optische Achse (2) geneigtes Graufilter (3) einschwenkbar ist, wobei die Flächennormale auf die Lichteintrittsfläche (7) des Graufilters (3) mit der optischen Achse (2) des Beleuchtungsstrahlengangs einen Winkel im Bereich von 5° bis 1 5° einschließt.
1 9. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsquelle (1 ) über eine lösbare mechanische Verbindung mit den übrigen Baugruppen der Mikroskopanordnung verbunden ist.
20. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv (21 ) auf einer Geradführung (34) parallel zu seiner optischen Achse verschiebbar anordnet und zu diesem Zweck mit einer motorisch angetriebenen Stelleinrichtung gekoppelt ist.
21 . Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv (21 ) mit mindestens einem weiteren Objektiv, das sich bezüglich seiner optischen Eigenschaften vom ersten Objektiv (21 ) unterscheidet, auf einer Wechseleinrichtung, bevorzugt einem Objektivrevolver, be- findet.
22. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
- eine Autofokussiereinrichtung vorgesehen ist, die einen Autofokuslaser (29), ei- nen Autofokussensor (32) und eine Autofokusaktorik umfaßt, sowie
- Mittel zur Einkopplung eines Laserstrahls (31 ) für die Autofokussiereinrichtung in den Beleuchtungsstrahlengang vorhanden sind.
23. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, daß als Kamera (22) eine CCD- oder CMOS-Kamera vorgesehen ist.
24. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Achse des Objektivs (21 ) senkrecht zur Schwerkraftrichtung ausgerichtet ist.
25. Mikroskopanordnung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme der Probe (20) ein in den Koordinatenrichtungen X und/oder Y senkrecht zur optischen Achse des Objektivs (21 ) verstellbarer Probentisch (38) vorgesehen ist, wobei die Koordinatenrichtung Y parallel zur Schwerkraftrichtung verläuft.
26. Mikroskopanordnung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Probentisch (38) mit einem Piezoantrieb und/oder mit einem Spindelantrieb gekoppelt ist, wobei bevorzugt zur Verstellung in Koordinatenrichtung X der Piezoantrieb und in der Koordinatenrichtung Y der Spindelantrieb vorgesehen sind.
27. Mikroskopanordnung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Probentisch (38) mit einer Nivelliereinrichtung (41 ) zur Einstellung der Neigung der Probenoberfläche relativ zur optischen Achse des Objektivs (21 ) gekoppelt ist.
28. Mikroskopanordnung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (20) mittels eines Probenhalters auf dem Probentisch (38) angeordnet ist, wobei Probenhalter und Probentisch (38) lösbar miteinander verbunden sind.
PCT/EP2004/003156 2003-04-11 2004-03-25 Mikroskopanordnung WO2004090604A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006504859A JP2006522948A (ja) 2003-04-11 2004-03-25 顕微鏡配列
EP04723174A EP1613995A2 (de) 2003-04-11 2004-03-25 Mikroskopanordnung
US10/552,557 US20070058246A1 (en) 2003-04-11 2004-03-25 Microscope arrangement

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10317615A DE10317615B4 (de) 2003-04-11 2003-04-11 Fluoreszenzmikroskopanordnung
DE10317615.2 2003-04-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004090604A2 true WO2004090604A2 (de) 2004-10-21
WO2004090604A3 WO2004090604A3 (de) 2004-12-29

Family

ID=33103462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/003156 WO2004090604A2 (de) 2003-04-11 2004-03-25 Mikroskopanordnung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20070058246A1 (de)
EP (1) EP1613995A2 (de)
JP (1) JP2006522948A (de)
DE (1) DE10317615B4 (de)
WO (1) WO2004090604A2 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006057768A3 (en) * 2004-11-24 2006-08-24 Battelle Memorial Institute Optical system for cell imaging
WO2008043469A1 (de) * 2006-10-06 2008-04-17 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Verfahren zur leistungsregelung einer laserdiode oder led
DE102014016850A1 (de) * 2014-11-13 2016-05-19 Carl Zeiss Meditec Ag Optisches System zur Fluoreszenzbeobachtung
EP2075615B1 (de) 2006-10-19 2016-07-20 Olympus Corporation Mikroskop
DE102022125852A1 (de) 2022-10-06 2024-04-11 Karl Storz Se & Co. Kg Medizinische Bildgebungsvorrichtung und Verfahren zur medizinischen Bildgebung

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005045165B4 (de) * 2005-09-21 2008-04-17 Leica Microsystems Cms Gmbh Mikroskop-Fluoreszenz-Filtersystem und umschaltbares Mikroskop zur Erzeugung von Überlagerungsbildern
DE102007027083A1 (de) * 2007-06-12 2008-12-18 Carl Zeiss Sms Gmbh Mikroskopbeleuchtung
DE102009029831A1 (de) * 2009-06-17 2011-01-13 W.O.M. World Of Medicine Ag Vorrichtung und Verfahren für die Mehr-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie zur Gewinnung von Informationen aus biologischem Gewebe
EP2315065B1 (de) * 2009-10-26 2015-05-13 Olympus Corporation Mikroskop
JP5424826B2 (ja) * 2009-11-12 2014-02-26 キヤノン株式会社 測定装置
JP5510956B2 (ja) * 2010-01-07 2014-06-04 パナソニックヘルスケア株式会社 観察ユニット用の制御装置、制御プログラム及び制御方法、並びに観察システム
DE102011018725A1 (de) 2011-04-20 2012-10-25 Carl Zeiss Jena Gmbh Optische Anordnung zur Erfassung der Lumineszenz von Proben
FR3005753B1 (fr) * 2013-05-14 2016-09-16 Cie Ind Des Lasers - Cilas Dispositif optique de reglage de la distribution spatiale d'un faisceau laser.
JP2015004736A (ja) * 2013-06-19 2015-01-08 オリンパス株式会社 透過蛍光顕微鏡
JP6635052B2 (ja) * 2015-02-05 2020-01-22 株式会社ニコン 構造化照明顕微鏡、及び観察方法
US10989661B2 (en) * 2015-05-01 2021-04-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Uniform and scalable light-sheets generated by extended focusing
US10509215B2 (en) * 2016-03-14 2019-12-17 Olympus Corporation Light-field microscope
WO2017180680A1 (en) 2016-04-12 2017-10-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System LIGHT-SHEET MICROSCOPE WITH PARALLELIZED 3D lMAGE ACQUISITION

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4682885A (en) * 1984-05-02 1987-07-28 Canon Kabushiki Kaisha Illumination apparatus
DE19640352A1 (de) * 1995-09-22 1997-03-27 Samsung Aerospace Ind Innenbeleuchtungsvorrichtung und Videomikroskopsystem
EP1164403A1 (de) * 2000-06-17 2001-12-19 Leica Microsystems Heidelberg GmbH Scanmikroskop
US20020030807A1 (en) * 2000-07-27 2002-03-14 Shunji Maeda Defect inspection method and apparatus therefor
DE10130821A1 (de) * 2001-06-26 2003-01-02 Zeiss Carl Jena Gmbh Einrichtung zur flächigen Beleuchtung eines Objektfeldes

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5713364A (en) * 1995-08-01 1998-02-03 Medispectra, Inc. Spectral volume microprobe analysis of materials
US6826422B1 (en) * 1997-01-13 2004-11-30 Medispectra, Inc. Spectral volume microprobe arrays
DE10040898A1 (de) * 2000-08-18 2002-02-28 Zeiss Carl Beleuchtungssystem für die Mikrolithographie
US6583937B1 (en) * 1998-11-30 2003-06-24 Carl-Zeiss Stiftung Illuminating system of a microlithographic projection exposure arrangement
US6898367B2 (en) * 2000-06-17 2005-05-24 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Method and instrument for microscopy
DE10031719A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-10 Leica Microsystems Beleuchtungseinrichtung und Koordinaten-Meßgerät mit einer Beleuchtungseinrichtung

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4682885A (en) * 1984-05-02 1987-07-28 Canon Kabushiki Kaisha Illumination apparatus
DE19640352A1 (de) * 1995-09-22 1997-03-27 Samsung Aerospace Ind Innenbeleuchtungsvorrichtung und Videomikroskopsystem
EP1164403A1 (de) * 2000-06-17 2001-12-19 Leica Microsystems Heidelberg GmbH Scanmikroskop
US20020030807A1 (en) * 2000-07-27 2002-03-14 Shunji Maeda Defect inspection method and apparatus therefor
DE10130821A1 (de) * 2001-06-26 2003-01-02 Zeiss Carl Jena Gmbh Einrichtung zur flächigen Beleuchtung eines Objektfeldes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN Bd. 0162, Nr. 92 (P-1377), 29. Juni 1992 (1992-06-29) & JP 4 077703 A (FUJITSU LTD), 11. März 1992 (1992-03-11) *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006057768A3 (en) * 2004-11-24 2006-08-24 Battelle Memorial Institute Optical system for cell imaging
JP2008522215A (ja) * 2004-11-24 2008-06-26 バッテル メモリアル インスティチュート 細胞撮像用の光学システム
US7397601B2 (en) 2004-11-24 2008-07-08 Laudo John S Optical system for cell imaging
AU2005309950B2 (en) * 2004-11-24 2011-04-21 Battelle Memorial Institute Optical system for cell imaging
US7978405B2 (en) 2004-11-24 2011-07-12 Battelle Memorial Institute Optical system for cell imaging
WO2008043469A1 (de) * 2006-10-06 2008-04-17 Carl Zeiss Microlmaging Gmbh Verfahren zur leistungsregelung einer laserdiode oder led
EP2075615B1 (de) 2006-10-19 2016-07-20 Olympus Corporation Mikroskop
DE102014016850A1 (de) * 2014-11-13 2016-05-19 Carl Zeiss Meditec Ag Optisches System zur Fluoreszenzbeobachtung
DE102014016850B4 (de) * 2014-11-13 2017-02-09 Carl Zeiss Meditec Ag Optisches System zur Fluoreszenzbeobachtung
DE102014016850B9 (de) * 2014-11-13 2017-07-27 Carl Zeiss Meditec Ag Optisches System zur Fluoreszenzbeobachtung
US10054775B2 (en) 2014-11-13 2018-08-21 Carl Zeiss Meditec Ag Optical system for fluorescence observation
DE102022125852A1 (de) 2022-10-06 2024-04-11 Karl Storz Se & Co. Kg Medizinische Bildgebungsvorrichtung und Verfahren zur medizinischen Bildgebung

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004090604A3 (de) 2004-12-29
JP2006522948A (ja) 2006-10-05
DE10317615A1 (de) 2004-11-04
EP1613995A2 (de) 2006-01-11
US20070058246A1 (en) 2007-03-15
DE10317615B4 (de) 2005-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10317615B4 (de) Fluoreszenzmikroskopanordnung
EP2107408B1 (de) Mikroskop mit der Beobachtungsrichtung senkrecht zur Beleuchtungsrichtung
EP2030062B1 (de) Autofokuseinrichtung für die mikroskopie
EP2350726B1 (de) Kombinationsmikroskopie
DE10244431A1 (de) Mikroskopsystem
WO2009065590A1 (de) Laserstrahlbearbeitung
WO2008125204A1 (de) Verfahren und anordnung zum positionieren eines lichtblattes in der fokusebene einer detektionsoptik
WO2015181068A1 (de) Funktionsintegriertes laser-scanning-mikroskop
EP1354234A1 (de) Optisches system und verfahren zum anregen und messen von fluoreszenz an oder in mit fluoreszensfarbstoffen behandelten proben
DE102004016253B4 (de) Rastermikroskop und Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe
WO2005029151A1 (de) Rastermikroskop mit evaneszenter beleuchtung
DE10133017C2 (de) Konfokales Mikroskop
DE10120424B4 (de) Scanmikroskop und Auskoppelelement
DE4331570A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung
WO2016012606A1 (de) Mikroskop und verfahren zum optischen untersuchen und/oder manipulieren einer mikroskopischen probe
EP3992687B1 (de) Mikroskop und verfahren zur lichtfeldmikroskopie mit lichtblattanregung sowie zur konfokalen mikroskopie
EP3987335B1 (de) Verfahren und vorrichtungen zur überprüfung der konfokalität einer scannenden und entscannenden mikroskopbaugruppe
EP2784564A1 (de) Lichtmikroskop und Verfahren zum Untersuchen einer mikroskopischen Probe
DE102006011277A1 (de) Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren
DE102005022125A1 (de) Lichtrastermikroskop mit Autofokusmechanismus
DE10017824B4 (de) Vorrichtung zur parallelen photometrischen Fluoreszenz- oder Lumineszenzanalyse mehrerer voneinander getrennter Probenbereiche auf einem Objekt
EP1617263A1 (de) Lichtrastermikroskop und Verwendung
DE102004029733A1 (de) Rastermikroskop und Verfahren zur Rastermikroskopie
DE102020108117B4 (de) Mikroskop und Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops
DE20221635U1 (de) Optisches System zum Anregen und Messen von Fluoreszenz an oder in mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelten Proben

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004723174

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007058246

Country of ref document: US

Ref document number: 2006504859

Country of ref document: JP

Ref document number: 10552557

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004723174

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10552557

Country of ref document: US