JP2015004736A - 透過蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光観察する際に背景光を弱くして、背景が明るくなってしまうことを防ぐことができる透過蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】照明光源１１０と、照明光源１１０からの光を標本Ｓに照射する照射光学系１２０と、標本Ｓの像を結像する結像光学系１３０と、標本Ｓの像を受光する撮像面１４１を備えた撮像手段１４０と、照射光学系１２０内に配置された波長選択素子１２３と、標本Ｓから撮像手段１４０側に配置された吸収フィルタ１３２とを備え、照射光学系１２０と結像光学系１３０は互いに対向して配置され、波長選択素子１２３の面内の少なくとも１箇所において、波長選択素子１２３の面（１２３ａ又は１２３ｂ）の法線Ｎ１が照射光学系１２０の光軸ＡＸ１に対して交差する。
【選択図】図１

Description

本発明は、透過蛍光顕微鏡に関するものである。

従来の顕微鏡を用いた蛍光観察においては、照明光源からの光が対物レンズを経由することなく標本に照射するように照射光学系を構成した蛍光顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１）。

特開２０１１−１１２３９４号公報

従来の透過蛍光観察における励起フィルタは、光軸に対して垂直に設置されており、以下の理由により、蛍光観察する際に背景が明るくなるという問題がある。すなわち、励起光の照射によって標本から蛍光が発生する。標本から発生した蛍光の一部は励起フィルタに到達し、励起フィルタによって反射され、反射された蛍光は励起フィルタの位置（表面）を物点とした光になる。ここで、励起フィルタの位置は対物レンズの合焦位置からずれている。励起フィルタの位置を物点とみなすと励起フィルタから反射した蛍光は像位置では集光せずに広がる。よって、蛍光観察する際に背景が明るくなってしまう。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、蛍光観察する際に背景光を弱くして、背景が明るくなってしまうのを防ぐことを目的としている。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る透過蛍光顕微鏡は、照明光源と、照明光源からの光を標本に照射する照射光学系と、標本の像を結像する結像光学系と、標本の像を受光する撮像面を備えた撮像手段と、照射光学系内に配置された波長選択素子と、標本から撮像手段側に配置された吸収フィルタとを備え、照射光学系と結像光学系は互いに対向して配置され、波長選択素子の面内の少なくとも１箇所において、波長選択素子の面の法線が照射光学系の光軸に対して交差することを特徴としている。

本発明に係る透過蛍光顕微鏡は、蛍光観察する際に背景光を弱くすることができる、という効果を奏する。

第１実施形態に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 第１実施形態の変形例に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 第１実施形態のさらなる変形例に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 第２実施形態に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 第３実施形態に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。 透過蛍光顕微鏡の具体的構成を示す図である。

以下に、本発明のある態様に係る透過蛍光顕微鏡の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下の実施形態によりこの発明が限定されるものではない。すなわち、本発明のある態様として、いくつかの実施形態を説明するが、色々な代替物、変形、等価物を用いることができる。つまり、当業者であれば、本実施形態の内容にいろいろなバリエーションや変更を加えたとしても、その内容も本発明の範囲に属するものである。
従って、本発明の範囲は、以下の説明を参照して決められるものではなく、請求項により決められるべきであり、均等物の全範囲も含まれる。また、実施形態中に記載した特徴はいずれも、好ましいかどうかを問わず、他の特徴と組み合わせてもよい。
まず、本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果について説明する。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、照明光源と、照明光源からの光を標本に照射する照射光学系と、標本の像を結像する結像光学系と、標本の像を受光する撮像面を備えた撮像手段と、照射光学系内に配置された波長選択素子と、標本から撮像手段側に配置された吸収フィルタとを備え、照射光学系と結像光学系は互いに対向して配置され、波長選択素子の面内の少なくとも１箇所において、波長選択素子の面の法線が照射光学系の光軸に対して交差する構成を備えると、波長選択素子で反射された蛍光のうち、標本に直接戻る蛍光強度を減らすことができ、これにより、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、照射光学系がコンデンサレンズを有し、波長選択素子が、コンデンサレンズと照明光源との間に配置されていると、コンデンサレンズを透過する蛍光の光束径は、例えば、コンデンサレンズの開口数又は有効口径によって制限される。ここで、波長選択素子で反射した蛍光のうち、コンデンサレンズの開口数又は有効口径より大きい光束径の蛍光は、コンデンサレンズを通らないため、波長選択素子に到達する蛍光を少なくすることができ、これにより、標本に戻る蛍光強度を減らすことができ、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、以下の条件式（１）を満足すると、波長選択素子によって反射された蛍光が標本の照明範囲の外側に集光されるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができて好ましい。
ｆ×ｔａｎ２θ＞２Ａ （１）
ここで、
ｆはコンデンサレンズの焦点距離（ｍｍ）、
θは照射光学系の光軸に垂直な向きに対する波長選択素子の傾き角（ｄｅｇ）、
Ａは標本上の照明範囲の半径（ｍｍ）
である。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、以下の条件式（２）を満足することが好ましい。θが０より大きく３０度以下であると、波長選択素子から出射する光の波長帯域が、本来の波長帯域からずれることを抑えることができる。ここで、本来の波長帯域とは、θ＝０のときに、波長選択素子から出射した光の波長帯域のことである。さらに、θが０より大きく３０度以下であると、照射光学系の光軸（波長選択素子よりもコンデンサ側の照射光学系の光軸）とコンデンサレンズの光軸のずれを抑えて、照明ムラの発生を防ぐことができる。
０＜θ≦３０ （２）
ここで、
θは照射光学系の光軸に垂直な向きに対する波長選択素子の傾き角（ｄｅｇ）
である。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、以下の条件式（３）を満足すると、波長選択素子を傾けたことによって、波長選択素子の有効口径が足りないために生じる次の（ａ）、（ｂ）を防ぐことができる。
（ａ）例えば、有効口径よりも外側に多層膜がない領域が存在し、更にその外側に波長選択素子を保持する保持部材（枠部材）が存在する場合に、有効口径よりも外側を通過する照明光に対して、励起光の波長帯域以外の波長帯域の光をカットできないこと
（ｂ）例えば、有効口径ぎりぎりに、保持部材が存在する場合に、コンデンサレンズの有効口径を満たすように励起光をコンデンサレンズに入射させることができないこと
φ１≧φ２／ｃｏｓθ （３）
ここで、
φ１は波長選択素子の有効口径（ｍｍ）、
φ２はコンデンサレンズの有効口径（ｍｍ）
である。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、波長選択素子を透明部材の表面に多層膜をコートしたもので構成すると、波長選択素子を薄型にできるため好ましい。
また、波長選択素子を、厚みによって透過率が変化する材料で構成すると、透過率の角度依存性が少なくなるので好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、蛍光の波長帯域における波長選択素子の透過率が１０^−６％以下であると、照明光源から出る光が白色光であっても、波長選択素子を透過する蛍光と同じ波長帯域の光の量を少なく出来るため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができて好ましい。

蛍光波長に対する透過率を１０^−６％以下にするには、例えば、色ガラスフィルタを用いるとよい。色ガラスフィルタの厚みを厚くすることで、蛍光波長に対する透過率より小さくすることができる。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、波長選択素子が、少なくとも結像光学系側の面に非平面を有すると、波長選択素子によって反射された蛍光は、コンデンサレンズに直接戻らないため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。なお、非平面の形状は、標本側に凸面を向けた形状であることが好ましい。
また、以下の条件式（４）を満足すると、波長選択素子で反射された蛍光のうち、標本に直接戻る蛍光強度を減らすことができるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。
ｒ≦２ｄ （４）
ここで、
ｒは波長選択素子の結像光学系側の面の曲率半径、
ｄはコンデンサレンズと波長選択素子の間隔
である。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、照明光源が狭帯域の照明光源であると、照明光源から出る光は、蛍光と同じ波長帯域の光を含まないか、あるいは含んでいたとしてもその量は非常に少ないものになる。このため、波長選択素子を透過する蛍光と同じ波長帯域の光の量を少なく出来るため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができて好ましい。狭帯域の照明光源としては、例えば、単色ＬＥＤや、波長が可変又は選択可能な照明光源を用いることができる。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、照射光学系内であって、結像光学系の合焦位置と共役な位置（標本と共役な位置）に視野絞りを有すると、視野絞りを適切に絞ることで、対物レンズの観察範囲にのみ励起光を照明できるため好ましい。また、観察範囲外からの蛍光放射を低減できるため、波長選択素子で反射する蛍光強度が弱くなり、このため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、照明光源と、照明光源からの光を標本に照射する照射光学系と、標本の像を結像する結像光学系と、標本の像を受光する撮像面を備えた撮像手段と、照射光学系内に配置された波長選択素子と、を備え、照射光学系内であって、結像光学系の合焦位置と共役な位置（標本と共役な位置）に視野絞りを有すると、視野絞りを適切に絞ることにより、対物レンズの観察範囲にのみ励起光を照明できるため好ましい。また、観察範囲外からの蛍光放射を低減できるため、波長選択素子で反射する蛍光強度が弱くなり、このため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。

ここで、従来の透過蛍光顕微鏡において、白色光（幅広い波長域の光）を発生する照明光源を用いる場合は、励起フィルタにより所望の波長域の励起光を選択的に透過させているが、上記白色光のうちの蛍光と同じ波長の光を励起フィルタで完全に除去することができない。このため、蛍光と同じ波長の光が励起フィルタを透過してしまうことにより、蛍光観察する際に背景が明るくなってしまう。
これに対して、実施形態に係る透過蛍光顕微鏡は、照明光源と、照明光源からの光を標本に照射する照射光学系と、標本の像を結像する結像光学系と、標本の像を受光する撮像面を備えた撮像手段と、照射光学系内に配置された第１波長選択素子と、第２波長選択素子と、を備え、第１波長選択素子は、厚みによって透過率の大きさが変化する材料で構成され、第２波長選択素子は、透明部材の表面に多層膜がコートされていると、蛍光観察する際に背景光が明るくなってしまうことを防ぐことができるため好ましい。また、第２波長選択素子を透明部材の表面に多層膜をコートしたもので構成すると、第２波長選択素子を薄型にできるため好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、第２波長選択素子が、第１波長選択素子よりも光源側に配置されていると、蛍光観察する際に背景光が明るくなってしまうことを防ぐことができるため好ましい。

実施形態に係る透過蛍光顕微鏡において、第１波長選択素子は色ガラスフィルタであり、第２波長選択素子は干渉フィルタであると、励起フィルタの漏れ光を少なくでき、これにより蛍光観察時の背景光を弱くすることができるため好ましい。

（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る透過蛍光顕微鏡１００の構成を示す図である。図１においては、要部の構成について概念的に示している。
透過蛍光顕微鏡１００は、共通する光軸ＡＸ１に沿って順に配置された、照明光源１１０、照射光学系１２０、結像光学系１３０、及び、撮像手段としてのイメージャ１４０と、照射光学系１２０内に配置された波長選択素子としての励起フィルタ１２３とを有する。照射光学系１２０と結像光学系１３０は、共通する光軸ＡＸ１に沿って、互いに対向して配置されている。
なお、以下の各実施形態及び各変形例では、照射光学系はクリティカル照明を行う構成となっているが、ケーラー照明を行う構成であっても良い。

照明光源１１０は、照射光学系１２０へ狭帯域の光を射出する光源であり、白色以外の所定の色の光を射出する。なお、照明光源は、より波長帯域が広い光（例えば、白色光）を出射する光源であっても良い。

照射光学系１２０は、励起フィルタ１２３を有する。励起フィルタ１２３では、透明な平行平面板の表面に多層膜が形成されていてもよい。また、励起フィルタ１２３は、色ガラスフィルタであってもよい。
励起フィルタ１２３は、光軸ＡＸ１に垂直な向きＤ１に対して傾き角θ（ｄｅｇ）だけ傾けられている。

平行平板の励起フィルタ１２３の上面１２３ａ（入射面）又は下面１２３ｂ（射出面）において、その面の法線Ｎ１が照射光学系１２０の光軸ＡＸ１に対して交差している。なお、法線Ｎ１は、励起フィルタ１２３の上面１２３ａ又は下面１２３ｂの少なくとも１箇所において、照射光学系１２０の光軸ＡＸ１に対して交差していればよい。

結像光学系１３０は、照射光学系１２０側から順に配置された、吸収フィルタ１３２、及び対物レンズ１３１を備え、標本Ｓの像を結像する。吸収フィルタ１３２は、標本Ｓからの光のうち、所定の蛍光波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光をカットする。
なお、図１において、照明光源１１０側から、吸収フィルタ１３２、対物レンズ１３１の順に配置しているが、順序を逆にしてもよい。

イメージャ１４０は、例えばＣＣＤ(電荷結合素子)、ＣＭＯＳ(相補型金属酸化膜半導体)であって、結像光学系１３０によって結像された標本Ｓの像を受光する撮像面１４１を備える。

照明光源１１０から射出した光は、励起フィルタ１２３に入射し、励起フィルタ１２３は、入射光のうち、所定の波長帯域の光（励起光）のみを透過させる。励起フィルタ１２３からの射出光は標本Ｓ上に照射される。すなわち、励起フィルタ１２３は干渉フィルタとして機能する。標本Ｓにおいては、励起フィルタ１２３を透過した光によって蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

標本Ｓで発生した蛍光は、吸収フィルタ１３２に入射し、吸収フィルタ１３２に入射した光のうち、蛍光の波長帯域の光のみが透過し、対物レンズ１３１によって撮像面１４１上に集光する。これにより、標本Ｓの像がイメージャ１４０の撮像面１４１に結像される。

透過蛍光顕微鏡１００においては、波長選択素子としての励起フィルタ１２３の面内の少なくとも１箇所において、励起フィルタ１２３の面の法線Ｎ１が照射光学系１２０の光軸ＡＸ１に対して交差する構成を備えているため、標本Ｓから射出して励起フィルタ１２３で反射された蛍光のうち、標本Ｓに直接戻る蛍光強度を減らすことができ、これにより蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

また、照明光源１１０を狭帯域の照明光源にすることにより、励起フィルタ１２３の漏れ光を少なく出来るため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

（変形例）
図２は、第１実施形態の変形例に係る透過蛍光顕微鏡２００の構成を示す図である。図２においては、要部の構成について概念的に示しており、第１実施形態の照明光源１１０、結像光学系１３０、及びイメージャ１４０に対応する構成をさらに備える。
ここで、図２において、照射光学系２２０と不図示の結像光学系は、共通する光軸ＡＸ２に沿って、互いに対向して配置されている。

照射光学系２２０は、不図示の照明光源側から標本Ｓ側へ順に配置された、励起フィルタ２２３及びコンデンサレンズ２２４を有する。コンデンサレンズ２２４は、励起フィルタ２２３から入射した平行光を標本Ｓ上に集光させる。なお、図２の励起フィルタ２２３では、透明な平行平面板の表面に多層膜が形成されていてもよい。また、励起フィルタ２２３は、色ガラスフィルタであってもよい。
励起フィルタ２２３は、照射光学系２２０の光軸ＡＸ２に垂直な向きＤ２に対して傾き角θ（ｄｅｇ）だけ傾けられている。

透過蛍光顕微鏡２００においては、ｆ＝２７．６、θ＝１５、Ａ＝５．５であるので、以下の条件式（１）を満足している。
ｆ×ｔａｎ２θ＞２Ａ （１）
ここで、
ｆはコンデンサレンズ２２４の焦点距離（ｍｍ）、
θは照射光学系２２０の光軸ＡＸ２に垂直な向きに対する励起フィルタ２２３の傾き角（ｄｅｇ）、
Ａは標本Ｓ上の照明範囲の半径（ｍｍ）
である。
条件式（１）を満足することにより、励起フィルタ２２３によって反射された蛍光が標本Ｓの照明範囲の外側に集光されるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

また、透過蛍光顕微鏡２００においては、φ１＝２５、φ２＝２２、θ＝１５であるので、以下の条件式（３）を満足している。
φ１≧φ２／ｃｏｓθ （３）
ここで、
φ１は励起フィルタ２２３の有効口径（ｍｍ）、
φ２はコンデンサレンズ２２４の有効口径（ｍｍ）
θは照射光学系２２０の光軸ＡＸ２に垂直な向きに対する励起フィルタ２２３の傾き角（ｄｅｇ）
である。
条件式（３）を満足すると、励起フィルタ２２３を傾けたことによって、励起フィルタ２２３の径が小さいために照明光をカットできない、という事態を防ぐことができる。

図３は、第１実施形態のさらなる変形例に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。図３においては、要部の構成について概念的に示しており、第１実施形態の照明光源１１０、結像光学系１３０、及びイメージャ１４０に対応する構成をさらに備える。
ここで、図３において、照射光学系３２０と不図示の結像光学系は、共通する光軸ＡＸ３に沿って、互いに対向して配置されている。

照射光学系３２０は、不図示の照明光源側から標本Ｓ側へ順に配置された、励起フィルタ３２３及びコンデンサレンズ３２４を有する。コンデンサレンズ３２４は、励起フィルタ３２３から入射した平行光を標本Ｓ上に集光させる。なお、図３の励起フィルタ３２３では、透明なフィルタの表面に多層膜が形成されていてもよい。また、励起フィルタ３２３は、色ガラスフィルタであってもよい。

波長選択素子としての励起フィルタ３２３は、標本Ｓ側の面３２３ａ、すなわち結像光学系側の面が非平面となっている。ここで、波長選択素子は、少なくとも結像光学系側の面が非平面であることが好ましく、照明光源側の面も非平面とすることができる。
励起フィルタ３２３が、少なくとも結像光学系側の面が非平面を有すると、励起フィルタ３２３によって反射された蛍光は、コンデンサレンズ３２４に直接戻らないため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

ここで、励起フィルタ３２３の面３２３ａのうち、光軸上における面の法線は光軸ＡＸ３と一致している。しかしながら、光軸ＡＸ３から離れた点における面の法線は、光軸ＡＸ３と交差している。そのため、標本Ｓから射出して励起フィルタ３２３で反射された蛍光のうち、光軸ＡＸ３から離れた点については、標本Ｓに直接戻る蛍光強度を減らすことができるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。
ここで、透過蛍光顕微鏡３００においては、θ＝１５であるので、以下の条件式（２）をそれぞれ満足している。
０＜θ≦３０ （２）
ここで、
θは照射光学系３２０の光軸ＡＸ３に垂直な向きに対する励起フィルタ３２３の傾き角（ｄｅｇ）
である。
また、非平面３２３ａの形状は、標本Ｓ側に凸面を向けた形状であることが好ましい。

また、透過蛍光顕微鏡３００は、ｒ＝57.25、ｄ＝37.4であるので、以下の条件式（４）をそれぞれ満足している。
ｒ≦２ｄ （４）
ここで、
ｒは励起フィルタ３２３の結像光学系側の面３２３ａの曲率半径、
ｄはコンデンサレンズ３２４と励起フィルタ３２３の間隔
である。

条件式（４）を満足することによる効果について説明する。
標本Ｓで発生した蛍光の一部は、励起フィルタ３２３の標本Ｓ側の面３２３ａで反射される。ここで、励起フィルタ３２３は、標本Ｓ側の面３２３ａの曲率半径をｒとしたときに焦点距離ｆ＝ｒ／２のミラーとして働くため、この面３２３ａで反射された蛍光は、有効径φのコンデンサレンズ３２４の位置で直径φ’となり、直径φ’は以下の式を満足する。
φ’＝φ＋２φｄ／ｒ
ここで、上記条件式（４）を満足すると、２φ≦φ’となるため、標本Ｓの位置に戻る蛍光を２５％以下に低減させることができる。

（第２実施形態）
図４は、第２実施形態に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。図４においては、要部の構成について概念的に示している。
第２実施形態に係る透過蛍光顕微鏡４００においては、照射光学系４２０内であって、結像光学系４３０の合焦位置と共役な位置に視野絞り４２９を配置するとともに、励起フィルタ４２３を照射光学系４２０の光軸ＡＸ４に対して傾斜させていない点が第１実施形態に係る透過蛍光顕微鏡１００と異なる。ここで、視野絞り４２９の位置は、標本Ｓとも共役な位置である。
なお、図４において、照明光源４１０側から、吸収フィルタ４３２、対物レンズ４３１の順に配置しているが、順序を逆にしてもよい。

透過蛍光顕微鏡４００は、照明光源４１０と、照射光学系４２０と、結像光学系４３０と、撮像手段としてのイメージャ４４０と、照射光学系４２０内に配置された波長選択素子としての励起フィルタ４２３とを有する。照射光学系４２０は、照明光源４１０側から順に配置された、視野絞り４２９と、コンデンサレンズ４２４と、波長選択素子としての励起フィルタ４２３とを有し、照明光源４１０からの光を標本Ｓに照射する。結像光学系４３０は、照射光学系４２０側から順に配置された、吸収フィルタ４３２と、対物レンズ４３１とを有し、標本Ｓの像を結像する。照射光学系４２０と結像光学系４３０は、共通する光軸ＡＸ４に沿って、互いに対向して配置されている。
照明光源４１０、励起フィルタ４２３、対物レンズ４３１、吸収フィルタ４３２、及びイメージャ４４０は、第１実施形態の照明光源１１０、励起フィルタ１２３、対物レンズ１３１、吸収フィルタ１３２、及びイメージャ１４０と同様の構成であり、コンデンサレンズ４２４は第１実施形態の変形例のコンデンサレンズ２２４と同様の構成であるため、その詳細な説明は省略する。

図４では、照明光源４１０の発光位置に視野絞り４２９が配置されている。このような配置が困難な場合、照明光源４１０からコンデンサレンズ４２４までの間に、照明光源４１０の像を形成し、この像位置に視野絞り４２９を配置すれば良い。

上述のように、照射光学系４２０内であって、結像光学系４３０の合焦位置と共役な位置に視野絞り４２９を配置したため、視野絞り４２９を適切に絞ることで、対物レンズ４３１の観察範囲にのみ励起光を照明できる。さらに、観察範囲外からの蛍光放射がないため、励起フィルタ４２３で反射する蛍光強度が弱くなり、これにより、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。
なお、その他の構成、作用、効果については、第１実施形態と同様である。

（第３実施形態）
図５は、第３実施形態に係る透過蛍光顕微鏡の構成を示す図である。図５においては、要部の構成について概念的に示している。
第３実施形態に係る透過蛍光顕微鏡５００においては、励起フィルタ５２３と標本Ｓの間に色ガラスフィルタ５２６を配置している点、及び視野絞りがない点が第２実施形態に係る透過蛍光顕微鏡４００と異なる。

透過蛍光顕微鏡５００は、照明光源５１０と、照射光学系５２０と、結像光学系５３０と、撮像手段としてのイメージャ５４０と、照射光学系５２０内に配置された波長選択素子としての励起フィルタ５２３とを有する。照射光学系５２０は、照明光源５１０側から順に配置された、コンデンサレンズ５２４と、第２波長選択素子としての励起フィルタ５２３（干渉フィルタ）と、第１波長選択素子としての色ガラスフィルタ５２６とを有し、照明光源５１０からの光を標本Ｓに照射する。結像光学系５３０は、照射光学系５２０側から順に配置された、吸収フィルタ５３２と、対物レンズ５３１とを有し、標本Ｓの像を結像する。照射光学系５２０と結像光学系５３０は、共通する光軸ＡＸ５に沿って、互いに対向して配置されている。
照明光源５１０、励起フィルタ５２３、対物レンズ５３１、吸収フィルタ５３２、及びイメージャ５４０は、第１実施形態の照明光源１１０、励起フィルタ１２３、対物レンズ１３１、吸収フィルタ１３２、及びイメージャ１４０と同様の構成であり、コンデンサレンズ５２４は第１実施形態の変形例のコンデンサレンズ２２４と同様の構成であるため、その詳細な説明は省略する。

励起フィルタ５２３及び色ガラスフィルタ５２６は、所定の波長帯域の光のみを透過させる。ここで、励起フィルタ５２３及び色ガラスフィルタ５２６では、蛍光の波長帯域における透過率が１０^−６％以下である。色ガラスフィルタ５２６は、厚みによって透過率の大きさが変化する材料で構成され、このような透過率を実現するような厚さに調整されている。励起フィルタ５２３は、例えば、透明部材の表面に多層膜をコートした構成である。
蛍光の波長帯域に対する、励起フィルタ５２３及び色ガラスフィルタ５２６による透過率が１０^−６％以下であると、励起フィルタ５２３の漏れ光を少なく出来るため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。
ここで、励起フィルタ５２３と色ガラスフィルタ５２６は、１０^−６％以下の透過率を実現できれば、互いに接合されていてもよいし、離間していてもよい。また、色ガラスフィルタ５２６に代えて、曲率を有するガラスに波長特性を有する多層膜をコートしたものであってもよい。
色ガラスを用いる場合、照明光源側から励起フィルタ、色ガラスの順にしたほうが、照明光源側に出てくる蛍光を色ガラスによって吸収し除去でき、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができるため好ましい。
なお、その他の構成、作用、効果については、第１実施形態、第２実施形態と同様である。

（透過蛍光顕微鏡）
図６を参照して、透過蛍光顕微鏡の構成をより具体的について説明する。図６は、透過蛍光顕微鏡６００の具体的構成を示す図である。図６においては、透過蛍光顕微鏡６００（以下、適宜、顕微鏡６００と言う）の内部構成を概念的に示している。
透過蛍光顕微鏡６００は、本体６０１と、照明光源６１０と、照射光学系（照明光学系）６２０と、結像光学系６３０と、撮像手段としてのイメージャ６４０と、接眼レンズ６５０と、照射光学系６２０内に配置された波長選択素子としての励起フィルタ６２３とを有する。本体６０１は、アーム部６０２、鏡筒６０３、レボルバ６３９、及びステージ６６０を備える。また、照射光学系６２０と結像光学系６３０は、共通する光軸ＡＸ６に沿って、互いに対向して配置されている。

照明光源６１０は、照射光学系６２０へ狭帯域の光を射出する光源であり、本体６０１に固定され、白色以外の所定の色の光を射出する。なお、照明光源は、より波長帯域が広い光（例えば、白色光）を出射する光源であっても良い。
照射光学系６２０は、本体６０１において、照明光源６１０側から順に配置された、コリメータレンズ６２１、ミラー６２２、励起フィルタ６２３、及びコンデンサレンズ６２４を有する。コンデンサレンズ６２４は、励起フィルタ６２３から入射した平行光を標本Ｓ上に集光させる。なお、図６の励起フィルタ６２３では、透明な平行平面板の表面に多層膜が形成されていてもよい。また、励起フィルタ６２３は、色ガラスフィルタであってもよい。

励起フィルタ６２３は、顕微鏡６００の本体６０１に設けられた傾き調整機構６２５によって、照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に垂直な向きＤ６に対して傾き角θ（ｄｅｇ）だけ傾けられている。なお、傾き調整機構６２５は、配置しなくてもよい。

ここで、顕微鏡６００においては、θ＝１５であるので、以下の条件式（２）を満足している。
０＜θ≦３０ （２）
ここで、
θは照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に垂直な向きに対する励起フィルタ６２３の傾き角（ｄｅｇ）
である。

平行平板の励起フィルタ６２３の上面６２３ａ（射出面）又は下面６２３ｂ（入射面）において、その面の法線Ｎ６が照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に対して交差している。なお、法線Ｎ６は、励起フィルタ６２３の上面６２３ａ又は下面６２３ｂの少なくとも１箇所において、照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に対して交差していればよい。

結像光学系６３０は、照射光学系６２０側から順に配置された、レボルバ６３９に着脱可能な対物レンズ６３１、吸収フィルタ６３２、レンズ６３８、プリズム６３３、及びレンズ６３４を備え、標本Ｓの像を結像する。吸収フィルタ６３２及びレボルバ６３９は、アーム部６０２に保持されている。吸収フィルタ６３２側からプリズム６３３に入射した光のうち、プリズム６３３を透過した光はイメージャ６４０側へ射出し、プリズム６３３内で反射した光は鏡筒６０３内に配置した接眼レンズ６５０側へ射出する。吸収フィルタ６３２は、標本Ｓからの光のうち、所定の蛍光波長の光のみを透過し、それ以外の波長の光をカットする。なお、吸収フィルタ６３２とプリズム６３３の間に配置されているレンズ６３８は、結像レンズである。また、プリズム６３３に、入射した光を接眼レンズ６５０側に１００％反射する特性を持たせ、このプリズム６３３を光路に対して出し入れするようにしても良い。

イメージャ６４０は、例えばＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）であって、結像光学系６３０によって結像された標本Ｓの像を受光する撮像面６４１を備える。

ステージ６６０は、顕微鏡６００の本体６０１に設けられ、その上に配置された標本ＳをＸＹの２軸方向に移動可能である。このステージ６６０は、不図示の操作ダイヤルを操作することによって、ＸＹの両方向に直交するＺ方向（図６の上下方向）に移動可能である。
標本Ｓが載置されるステージの上面位置（結像光学系６３０の合焦位置）と照明光源６１０の射出位置は共役の関係にある。

顕微鏡６００においては、ｆ＝２７．６、θ＝１５Ａ＝５．５であるので、以下の条件式（１）を満足している。
ｆ×ｔａｎ２θ＞２Ａ （１）
ここで、
ｆはコンデンサレンズ６２４の焦点距離（ｍｍ）、
θは照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に垂直な向きに対する励起フィルタ６２３の傾き角（ｄｅｇ）、
Ａは標本Ｓ上の照明範囲の半径（ｍｍ）
である。

また、顕微鏡６００においては、φ１＝２５、φ２＝２２、θ＝１５であるので、以下の条件式（３）を満足している。
φ１≧φ２／ｃｏｓθ （３）
ここで、
φ１は励起フィルタ６２３の有効口径（ｍｍ）、
φ２はコンデンサレンズ６２４の有効口径（ｍｍ）
である。
なお、有効口径は、励起フィルタ６２３またはコンデンサレンズ６２４における、光の通過する領域の直径を意味する。当該領域が円でない場合は、当該領域に内接する円の直径を意味する。

照明光源６１０から射出した光は、コリメータレンズ６２１で平行光とされ、ミラー６２２で反射されて励起フィルタ６２３に入射する。励起フィルタ６２３では、入射した光のうち、所定の波長帯域の光（励起光）のみを透過させ、励起フィルタ６２３からの射出光はコンデンサレンズ６２４によって標本Ｓ上に集光される。すなわち、励起フィルタ６２３は干渉フィルタとして機能する。標本Ｓにおいては、励起フィルタ６２３を透過した光によって蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

標本Ｓで発生した蛍光は、励起光と共に対物レンズ６３１へ入射し、対物レンズ６３１からの射出光は吸収フィルタ６３２に入射する。吸収フィルタ６３２に入射した光のうち、蛍光の波長帯域の光のみが透過し、レンズ６３８を透過してプリズム６３３に入射する。プリズム６３３に入射した光のうち、プリズム６３３内で反射された光は接眼レンズ６５０に入射し、プリズム６３３を透過した光はレンズ６３４によって撮像面６４１上に集光する。これにより、標本Ｓの像が接眼レンズ６５０を介して観察でき、イメージャ６４０の撮像面６４１に結像される。

顕微鏡６００においては、波長選択素子としての励起フィルタ６２３の面内の少なくとも１箇所において、励起フィルタ６２３の面の法線Ｎ６が照射光学系６２０の光軸ＡＸ６に対して交差する構成を備えているため、標本Ｓから射出して励起フィルタ６２３で反射された蛍光のうち、標本Ｓに直接戻る蛍光強度を減らすことができるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

また、照射光学系６２０がコンデンサレンズ６２４を有し、励起フィルタ６２３が、コンデンサレンズ６２４と照明光源６１０との間に配置されているため、コンデンサレンズ６２４によって、コンデンサレンズ６２４を透過する光束径は制限され、励起フィルタ６２３で反射した蛍光のうち上記光束径より大きい成分は、コンデンサレンズ６２４を通らないため、標本Ｓに戻る蛍光強度を減らすことができ、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

さらにまた、上記条件式（１）を満足することにより、励起フィルタ６２３によって反射された蛍光が標本Ｓの照明範囲の外側に集光されるため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

上記条件式（２）を満足することにより、θが３０度以下であるため、透過波長の波長帯域のシフトを抑えることができ、照射光学系６２０の光軸ＡＸ６とコンデンサレンズ６２４の光軸のずれを小さくして、照明ムラを抑えることができる。

上記条件式（３）を満足すると、励起フィルタ６２３を傾けたことによって、励起フィルタ６２３の径が足りないために、照明光をカットできない、ということを防ぐことができる。

照明光源６１０を狭帯域の照明光源にすることにより、励起フィルタ６２３の漏れ光を少なく出来るため、蛍光観察する際の背景光を弱くすることができる。

なお、図６において、照明光源６１０側から対物レンズ６３１と吸収フィルタ６３２の順に配置しているが、順序を逆にしてもよい。

以上のように、本発明に係る透過蛍光顕微鏡は、励起フィルタを用いた透過蛍光顕微鏡の背景光の低減に有用である。

１００、２００、３００、４００、５００、６００ 透過蛍光顕微鏡
１１０、４１０、５１０、６１０ 照明光源
１２０、２２０、３２０、４２０、５２０、６２０ 照射光学系
１２３、２２３、３２３、４２３、６２３ 励起フィルタ（波長選択素子）
１３０、４３０、５３０、６３０ 結像光学系
１３２、４３２、５３２、６３２ 吸収フィルタ
１４０、４４０、５４０、６４０ イメージャ（撮像手段）
２２４、３２４、４２４、５２４、６２４ コンデンサレンズ
４２９ 視野絞り
５２３ 励起フィルタ（第２波長選択素子）
５２６ 色ガラスフィルタ（第１波長選択素子）
ＡＸ１、ＡＸ２、ＡＸ３、ＡＸ４、ＡＸ５、ＡＸ６ 光軸
Ｎ１、Ｎ６ 法線
Ｓ 標本

Claims (12)

1. 照明光源と、
   前記照明光源からの光を標本に照射する照射光学系と、
   前記標本の像を結像する結像光学系と、
   前記標本の像を受光する撮像面を備えた撮像手段と、
   前記照射光学系内に配置された波長選択素子と、
   前記標本から前記撮像手段側に配置された吸収フィルタと
   を備え、
   前記照射光学系と前記結像光学系は互いに対向して配置され、
   前記波長選択素子の面内の少なくとも１箇所において、前記波長選択素子の面の法線が前記照射光学系の光軸に対して交差することを特徴とする透過蛍光顕微鏡。
2. 前記照射光学系はコンデンサレンズを有し、前記波長選択素子は、前記コンデンサレンズと前記照明光源との間に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の透過蛍光顕微鏡。
3. 以下の条件式（１）を満足することを特徴とする請求項２に記載の透過蛍光顕微鏡。
   ｆ×ｔａｎ２θ＞２Ａ （１）
   ここで、
   ｆは前記コンデンサレンズの焦点距離（ｍｍ）、
   θは前記照射光学系の光軸に垂直な向きに対する前記波長選択素子の傾き角（ｄｅｇ）、
   Ａは前記標本上の照明範囲の半径（ｍｍ）
   である。
4. 以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項２に記載の透過蛍光顕微鏡。
   ０＜θ≦３０ （２）
   ここで、
   θは前記照射光学系の光軸に垂直な向きに対する前記波長選択素子の傾き角（ｄｅｇ）
   である。
5. 以下の条件式（３）を満足することを特徴とする請求項４に記載の透過蛍光顕微鏡。
   φ１≧φ２／ｃｏｓθ （３）
   ここで、
   φ１は前記波長選択素子の有効口径（ｍｍ）、
   φ２は前記コンデンサレンズの有効口径（ｍｍ）
   である。
6. 前記波長選択素子は、透明部材の表面に多層膜をコートしたものであることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の透過蛍光顕微鏡。
7. 前記波長選択素子は、厚みによって透過率の大きさが変化する材料で構成されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の透過蛍光顕微鏡。
8. 蛍光の波長帯域における前記波長選択素子の透過率が１０^−６％以下であることを特徴とする請求項６または請求項７に記載の透過蛍光顕微鏡。
9. 前記波長選択素子は、少なくとも前記結像光学系側の面が非平面を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の透過蛍光顕微鏡。
10. 以下の条件式（４）を満足することを特徴とする請求項９に記載の透過蛍光顕微鏡。
    ｒ≦２ｄ （４）
    ここで、
    ｒは前記波長選択素子の前記結像光学系側の面の曲率半径、
    ｄは前記コンデンサレンズと前記波長選択素子の間隔
    である。
11. 前記照明光源は、狭帯域の照明光源であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の透過蛍光顕微鏡。
12. 前記照射光学系内であって、前記結像光学系の合焦位置と共役な位置に視野絞りを有することを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の透過蛍光顕微鏡。

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