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TWI507525B - 具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體 - Google Patents

具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體 Download PDF

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TWI507525B
TWI507525B TW099120735A TW99120735A TWI507525B TW I507525 B TWI507525 B TW I507525B TW 099120735 A TW099120735 A TW 099120735A TW 99120735 A TW99120735 A TW 99120735A TW I507525 B TWI507525 B TW I507525B
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Eric Smith
Douglas Macdonald
Kara Louise Olson
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Regeneron Pharma
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Description

具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體
本發明涉及抗原-結合蛋白或抗體，其具有重鏈的異型二聚體(heterodimers)，亦即2個免疫球蛋白重鏈有至少1個胺基酸是不同的，其容許依據免疫球蛋白重鏈的差異性親和力，以及經修飾或突變的免疫球蛋白重鏈傾向親和力試劑而分離出抗原-結合蛋白。本發明亦涉及抗原-結合蛋白(包括雙專一性抗體)，其帶有對蛋白質A有不同親和力的IgG CH2以及CH3區域而容許透過IgG區域對蛋白質A的差異性結合來快速分離。
抗體是多功能分子，對標的抗原帶有獨特的結合專一性，以及經由抗原-獨立的機制與免疫系統交互作用的能力。一些現今使用於癌症的生物治療劑是針對對抗在標定癌細胞上典型被過度表現之抗原的單株抗體。當此等抗體結合腫瘤細胞時，它們可能觸發抗體-依賴的細胞毒性(CDC)。不幸地，癌細胞通常會發展出壓抑這些正常免疫反應的機制。
近年來，已致力發展具有超過一種抗原結合專一性的似-抗體治療劑，例如雙專一性抗體。至於癌治療，多-專一性形式能夠容許使用，例如一種將分子標定至腫瘤細胞抗原的專一性，另一種專一性觸發對於免疫系統來說並非通常可供運用的反應。也發現到雙專一性抗體作為用於二-構成要素異型二聚受體系統的代用配位子的用途，當雙專一性抗體結合這兩個通常會受它們的天然配位子所活化的構成要素並令它們靠近。
許多形式已在本技藝中發展出來，能夠透過帶有多結合專一性的分子滿足治療機會。理想中，此等分子應該是行為-端正的蛋白質，它們易於製造以及純化，並且帶有有益的活體內性質，例如適於所欲目的之藥物動力學、最小免疫原性，以及若所欲的話，傳統抗體的效應子功能。
製造雙專一性抗體(在單一細胞中表現2種可區別的抗體)最簡單的方法產生多種類，因為個別的重鏈會形成同型-與異型二聚體這兩者，但只有異型二聚體是所欲的。再者，輕鏈以及重鏈可能不適當地配對。下面描述嘗試以不同方法處理這些問題的形式的數個實例。
一種使用於雙專一性T細胞銜接(BiTE)分子的形式(參見，例如Wolf,E. et al.(2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244)是以單鏈可變片段(scFv)單元為基礎。scFv是由抗體的輕鏈與重鏈可變區域經由彈性連接子融合所構成，其通常可以適當地摺疊並且藉此該等區域可以結合同源抗原。BiTE連結2個在單鏈上串聯之具有不同專一性的scFv(參見第1A圖)。這個組態排除了生產出帶有2個相同重鏈可變區域複本的分子。此外，連接子組態被設計成能確保個別輕鏈與重鏈正確配對。
BiTE形式有一些不利之處。首先，scFv單元因為它們傾向聚集而有名。且雖然一般認為scFv連接子的免疫原性是低的，仍無法排除會產生對抗BiTE之抗體的可能性。在BiTE形式中缺乏Fc部分也會使其血清半衰期變得非常短，而這不得不有頻繁地重複投藥或經泵連續灌注的困難處。最後，缺乏Fc亦表示缺乏Fc-媒介的效應子功能，就某些情況來說是有益的。
第二種形式(第1B圖)是小鼠與大鼠單株抗體的雜交種(hybrid)，並仰賴傳統蛋白質A親和力層析法的修飾(參見，例如Lindhofer,H. et al.(1995) J. Immunol. 155:219-225)。在這種形式中，小鼠IgG2a與IgG2b抗體在相同的細胞中一起被製造出來(例如，有如2種融合瘤的四源雜交瘤融合體，或在經工程化的CHO細胞中)。因為各個抗體的輕鏈偏好與它們同源物種的重鏈締合，僅有3種不同類型的抗體可以裝配：2種親代抗體，以及1種具有包含各自的重/輕鏈配對經由它們的Fc部分締合之2個抗體的異型二聚體。所欲的異型二聚體可易於從這個混合物中純化出來，因為它對於蛋白質A的結合性質不同於親代抗體所具有的：大鼠IgG2b不會結合至蛋白質A，而小鼠IgG2a會。結果，小鼠-大鼠異型二聚體結合至蛋白質A但是在要比小鼠IgG2a同型二聚體還高的pH值處洗提出，因此這可以選擇性純化雙專一性異型二聚體。和BiTE形式一樣，這個雜交種形式具有2個單價抗原結合位址。
小鼠/大鼠雜交種的壞處在於因為它是非人類的，可能在患者體內激起免疫反應，而會有有害的副作用(例如“HAMA”或“HARA”反應)，和/或中和治療劑。
第三種形式，意指為“洞中節(knobs-into-holes)”(第1C圖)，已在先前技藝中討論有潛力應用於製造雙專一性抗體(美國專利第7,183,076號)。在這種策略中，2個抗體的Fc部分被工程化讓一者產生突出的“節”，而另一者為互補的“洞”。當在小細胞中製造時，據說重鏈偏好藉由工程化的“節”與工程化的“洞”締合而形成異型二聚體而非同型二聚體。輕鏈-重鏈正確配對的問題是透過選定具有不同專一性但採用相同輕鏈的抗體來解決。
這種形式的缺點在於，“洞中節”策略可能會造成明顯數量的非所欲同型二聚體生成，因而不得不有進一步的純化步驟。這個困難點會因為污染的類型就它們的許多特性來說幾乎等同於所欲類型的事實而更為惡化。經工程化的形式也可能是有潛在免疫性的，因為產生“節”以及“洞”的突變會引入外來序列。
對於能夠將上述的某些或全部缺點降至最低的雙專一性抗體形式仍有需要，特別對於治療性應用。
 摘要
本發明是以下列為基礎：於雙專一性抗原-結合蛋白中至少在某種程度上採用2種至少有1個胺基酸不同的免疫球蛋白CH3重鏈恆定領域序列。該至少1個胺基酸差異會造成增進分離該蛋白質的能力，因為該差異會使CH3領域序列結合至親和力試劑的差異性能力。
在一個方面，提供一種抗原-結合蛋白，其包含有第一與第二多肽，該第一多肽從N-端至C-端含有選擇性地結合第一抗原的第一抗原-結合區域，接而為含有一個選自於IgG1(序列辨識編號：1)、IgG2(序列辨識編號：3)、IgG4(序列辨識編號：5)及其組合之人類IgG的第-CH3區域的恒定區域；以及第二多肽，該第二多肽從N一端至C-端包含有選擇性地結合第二抗原的第二抗原結合區域，接而為含有一個選自於IgG1、IgG2、IgG4及其組合之人類IgG的第二CH3區域的恒定區域，其中該第二CH3區域包含有一個會減低或消除該第二CH3領域結合至蛋白質A的修飾。
在一個具體例中，該第二CH3區域包含有一個H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照EU編號為H435R)。在另一個具體例中，該第二CH3區域進一步包含有一個Y96F修飾(IMGT；按照EU為Y436F)。在特定具體例中，該第二CH3區域是選自於序列辨識編號：2、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：6。
在一個具體例中，該第二CH3區域是源自於一個經修飾的人類IgG1(序列辨識編號：2)，並且進一步包含有一個選自於由下列所構成之群組中的修飾：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)。
在一個具體例中，該第二CH3區域是源自於一個經修飾的人類IgG2(序列辨識編號：4)，並且進一步包含有一個選自於由下列所構成之群組中的修飾：N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392N以及V422I)。
在一個具體例中，該第二CH3區域是源自於一個經修飾的人類IgG4(序列辨識編號：6)，並且進一步包含有一個選自於由下列所構成之群組中的修飾：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。
在一個具體例中，該CH3領域是一個嵌合領域，其包含有2個或多個人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3以及人類IgG4的序列。
在一個具體例中，該CH3領域是源自於人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4，且該抗原-結合蛋白進一步包含有CH1領域以及CH2領域，其中該CH1領域以及該CH2領域是獨立地選自於由下列所構成的群組：人類IgG1 CH1或CH2領域、人類IgG2 CH1或CH2領域，或嵌合人類/人類IgG1/IgG2或嵌合人類/人類IgG1/IgG3或嵌合人類/人類IgG2/IgG3領域或嵌合人類/人類IgG1/IgG4或嵌合IgG3/IgG4或嵌合IgG2/IgG4領域。在一個特定具體例中，嵌合IgG1/IgG2、IgG1/IgG3、IgG2/IgG3、IgG1/IgG4、IgG3/IgG4以及IgG2/IgG4領域在人體中是非免疫性或本質上非免疫性。
在一個具體例中，該抗原-結合蛋白進一步包含有一免疫球蛋白輕鏈。在一個具體例中，該免疫球蛋白輕鏈是選自於人類λ以及人類κ輕鏈。
在一個具體例中，該第一與第二抗原-結合區域各自包含有至少1個CDR，在另一個具體例中，至少2個CDRs，在另一個具體例中，各自包含有3個CDRs。在一個特定具體例中，該等CDRs是源自於免疫球蛋白重鏈。在另一個特定具體例中，該重鏈是人類重鏈。
在一個具體例中，該第一抗原-結合區域包含有第一免疫球蛋白重鏈可變領域，而該第二抗原-結合區域包含有第二免疫球蛋白重鏈可變領域。
在一個具體例中，該第一與第二免疫球蛋白重鏈可變領域獨立地選自於小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、猿以及人類領域。
在一個具體例中，該第一與第二免疫球蛋白重鏈可變領域獨立地包含有人類CDR、小鼠CDR、大鼠CDR、兔CDR、猴CDR、猿CDR以及人類化CDR。在一個具體例中，該CDR是人類的並且經體細胞突變(somatically mutated)。
在一個具體例中，該第一與第二免疫球蛋白重鏈可變領域包含有人類骨架區域(FR)。在一個具體例中，該人類FR是一個經體細胞突變的人類FR。
在一個具體例中，該第一和/或該第二抗原-結合區域是藉由篩選含有對感興趣之抗原有反應性的抗體可變區域的噬菌體庫而獲得。在另一個具體例中，該第一和/或該第二抗原-結合區域是藉由使用感興趣的抗原免疫諸如小鼠、大鼠、兔、猴或猿的非人類動物，並且鑑定出編碼對感興趣之抗原有專一性的可變區域之抗體可變區域核酸序列而獲得。在一個特定具體例中，該非人類動物包含有一或多種人類免疫球蛋白可變區域基因。在另一個特定具體例中，該一或多個人類免疫球蛋白可變區域基因在非-人類動物體內是存在於染色體外，有如在內源性免疫球蛋白位址的置換，或者有如隨機併入非-人類動物之基因體的轉殖基因。在一個具體例中，該第一和/或第二抗原-結合區域是從融合瘤或四源雜交瘤獲得，在另一個具體例中使用細胞選別而從經免疫的非-人類動物的免疫細胞中篩選出來。
在一個具體例中，該抗原-結合蛋白是雙專一性抗體。在一個具體例中，該雙專一性是完全人類雙專一性抗體並且對各個抗原決定位獨立地具有微莫耳、奈莫耳或皮莫耳範圍的親和力。
在一個具體例中，該抗原-結合蛋白在人類體內是非免疫性的或本質上非免疫性的。在一個特定具體例中，該抗原-結合蛋白缺乏非-天然人類T細胞抗原決定位。在一個具體例中，CH3區域的修飾在人類體內是非免疫性的或本質上非免疫性的。在一個特定具體例中，CH3區域的修飾不會造成非-天然人類T細胞抗原決定位。
在一個具體例中，該抗原-結合蛋白包含有重鏈，其中該重鏈在人類體內是非免疫性的或本質上非免疫性的。在一個具體例中，該重鏈具有一個不含有非-天然T細胞抗原決定位的胺基酸序列。在一個具體例中，該重鏈包含有其蛋白溶解作用(proteolysis)無法形成在人類體內為免疫性之具有約9個胺基酸的胺基酸序列。在一個特定具體例中，該人類是以該抗原-結合蛋白治療的人類。在一個具體例中，該重鏈包含有其蛋白溶解作用無法形成在人類體內為免疫性之具有約13至約17個胺基酸的胺基酸序列。在一個特定具體例中，該人類是以該抗原-結合蛋白治療的人類。
在一個方面，提供如此處所述之包含有CH2和/或CH3修飾的雙專一性結合蛋白，其中該雙專一性結合蛋白包含有專一地辨識B細胞上的抗原的第一結合部分，以及專一地辨識T細胞上的抗原的第二結合部分。
在一個具體例中，該結合蛋白是雙專一性抗體。在一個特定具體例中，該雙專一性抗體包含有人類IgG1重鏈以及人類IgG1ΔAdp重鏈。在一個具體例中，該第一結合部分是專一地辨識CD20的人類重鏈可變領域。在一個具體例中，該第二結合部份是專一地辨識CD3的人類重鏈可變領域。在一個具體例中，該雙專一性抗體在Raji殺滅分析中展現出約2.8-3.2 x 10-12 M或約2.8-3.0 x 10-12 M的EC50，並且在旁觀者細胞殺滅分析中展現出不超過約1-10%或1-5%的旁觀者殺滅(bystander killing)，其中旁觀者細胞不含有CD20抗原決定位。在一個特定具體例中，旁觀者細胞是293細胞。在另一個特定具體例中，在該分析中的旁觀者細胞殺滅是橫跨約10-8 M至約10-14 M的雙專一性抗體濃度來測量。
在一個方面，提供一種用於製造雙專一性抗體的方法，其包含有：取得一編碼第一免疫球蛋白重鏈的核酸序列，該第一免疫球蛋白重鏈包含有辨識第一抗原決定位的第一可變領域，其中該第一免疫球蛋白重鏈包含有IgG1、IgG2或IgG4同型恆定領域，或其嵌合同型恆定領域；取得一編碼第二免疫球蛋白重鏈的核酸序列，該第二免疫球蛋白重鏈包含有辨識第二抗原決定位的第二可變領域，其中該第二免疫球蛋白重鏈包含有IgG1、IgG2或IgG4同型恆定領域，或其嵌合同型恆定領域，該第二免疫球蛋白重鏈在它的CH3領域中含有一個會消除或減低結合至蛋白質A的修飾；取得一編碼免疫球蛋白輕鏈的第三核酸序列，該免疫球蛋白輕鏈與該第一和第二免疫球蛋白重鏈配對；將該第一、第二以及第三核酸序列引入至一哺乳動物細胞中；允許該細胞表現免疫球蛋白，以及使用蛋白質A將該免疫球蛋白分離出來。
在一個具體例中，該細胞是選自於表現病毒核酸序列的CHO、COS、293、HeLa以及視網膜細胞(例如，PERC.6TM 細胞)。
在一個方面，提供一種雙專一性抗原-結合蛋白，其包含有結合一抗原的第一專一性以及活化一受體的第二專一性，其中該雙專一性抗原-結合蛋白包含有含有第一IgG1、IgG2或IgG4 CH3(具有蛋白質A-結合決定位)的第一多肽，以及含有第二IgG1、IgG3或IgG4 CH3(缺少蛋白質A-結合決定位)的第二多肽。
在一個具體例中，活化受體的第二專一性是以莫耳、毫莫耳、微莫耳、奈莫耳或皮莫耳範圍的KD 結合受體。
在一個具體例中，該第二專一性結合一個選自於G-蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、插入素(integrin)以及似鐸受體(toll-like receptor)的受體。
在一個具體例中，該第二專一性接觸受體並且令受體或物理上與其締合的次單位或蛋白質進行絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸的磷酸化；使得核苷酸(例如，cAMP、cADP或cGMP)環化；使得磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol)或其衍生物(例如IP3或PIP3)生成；使得脂質第二傳訊者(例如二醯基甘油、腦醯胺、溶血磷脂酸，一種類花生酸)生成；致使去磷酸化(例如磷酸酶活性)；使得脂質磷酸化而形成第二傳訊者；使得第二傳訊者水解；致使蛋白溶解(proteolysis)；導致氧化還原傳訊；使得蛋白質轉位至細胞胞器(例如至細胞核)；使得受體(與它自己)聚集而形成同型-或(與其他受體)形成異型二聚體；或使得穿膜閘道開啟或關閉。
在一個方面，提供一種用於製造雙專一性抗體的方法，其包含有：從四源雜交瘤中分離出感興趣的雙專一性抗體，其中感興趣的雙專一性抗體包含有第一重鏈(其為IgG1、IgG2或IgG4同型)、具有恆定領域的第二重鏈(其為IgG1、IgG2或IgG4同型)，該恆定領域在它的CH3領域中有一個會消除或減低對結合蛋白質A的修飾，其中感興趣的雙專一性抗體是使用蛋白質A而被分離出來。
在一個方面，提供一種用於製造雙專一性抗體的方法，其包含有下列步驟：從破裂的細胞或抗體混合物中分離出具有差異性修飾IgG1、IgG2或IgG4 CH3領域的雙專一性抗體，其中差異性修飾的CH3領域在人類體內是非免疫性的或實質上非免疫性的，且其中該修飾會造成雙專一性抗體帶有異型二聚體重鏈，其單體對蛋白質A有差異性親和力，以及該雙專一性抗體是使用蛋白質A從破裂的細胞或混合物中分離出來。
在一個具體例中，該雙專一性抗體是使用蛋白質A親和力撐體而分離出來，其中該雙專一性抗體在介於約3.9至約4.4、約4.0至約4.3、約4.1至約4.2的pH處或在約pH 4.2處洗出。
在一個具體例中，該雙專一性抗體是使用蛋白質A親和力撐體以及pH梯度或步驟而分離出來，其中pH梯度或步驟包括離子修飾劑。在一個特定具體例中，該離子修飾劑以約0.5至約1.0莫耳的濃度存在。在一個特定具體例中，該離子修飾劑是鹽類。在一個具體例中，該離子修飾劑是選自於由下列所構成的群組：乙酸的鈹鹽、鋰鹽、鈉鹽以及鉀鹽；碳酸氫鈉與碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀與碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫與氯化鎂；氟化鈉與氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀與硝酸鈣；磷酸鈉與磷酸鉀；以及硫酸鈣與硫酸鎂。在一個特定具體例中，該離子修飾劑是鹼金屬或鹼土金屬的鹵化鹽。在一個特定具體例中，該離子修飾劑是氯化鈉。
除非另有指明或從上下文來說為明顯的，此處所述的任何具體例以及方面可以結合另一者。其他具體例對於那些習於該技藝者而言會因為查閱隨後的說明而變得清楚。
詳細說明
本發明不限於所述的特定方法以及實驗條件，因為此等方法與條件可能會改變。亦應理解的是，此處所使用的術語僅是為了說明特定具體例而已，並非意欲要限制，因為本發明的範圍是由申請專利範圍所界定。
除非另有定義，此處所使用的全部技術性以及科學術語具有與本發明所屬領域中具有通常技藝者一般所理解的相同意思。現在要說明特定的方法以及材料，雖然任何類似或相同於那些此處所述者的方法以及材料可應用於實施或測試本發明。所有提及的公開資料併入作為參考文獻。
術語”抗體”，如此處所使用的，包括免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈。各個重鏈含有1個重鏈可變區域(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區域。重鏈恆定區域含有3個領域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區域(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域含有1個領域，CL。VH與VL區域可進一步分為具有超變異性的區域(命名為互補決定區域(complementarity determining regions,CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDRs以及4個FRs所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；重鏈CDRs可縮寫成HCDR1、HCDR2以及HCDR3；輕鏈CDRs可縮寫成LCDR1、LCDR2以及LCDR3。術語”高親和力”抗體意指一種對其標的具有至少10-9 M、至少10-10 M、至少10-11 M或至少10-12 M的抗體，當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM 或溶液-親和力ELISA)來測量時。
慣用語“抗原-結合蛋白”包括具有至少1個CDR並且能夠選擇性地辨識抗原(亦即，能夠以至少在微莫耳範圍內的KD 結合抗原)的蛋白質。治療性抗原-結合蛋白(例如治療性抗體)通常需要在奈莫耳或皮莫耳範圍內的KD 。“抗原-結合蛋白”亦包括一含有如此處所述之第一與第二CH3領域以及第一蛋白質或配位子辨識領域和第二蛋白質或配位子辨識領域的蛋白質，其中該第一蛋白質或配位子辨識領域和第二蛋白質或配位子辨識領域各自獨立地辨識相同的蛋白質或配位子，或一起辨識相同的蛋白質或配位子，或各自獨立地辨識不同的蛋白質或配位子。此等蛋白質的實例為免疫黏附素(immunoadhesin)，包含有一個融合蛋白(異型-或同型)二聚體，其中該二聚體的多肽是含有受體構成要素或配位子構成要素的融合多肽，其中該配位子構成要素包含有結合受體的胺基酸序列。
慣用語“雙專一性抗體”包括能夠選擇性地結合2種或多種抗原決定位的抗體。雙專一性抗體通常含有2個不同的重鏈，其中各個重鏈專一地結合不同的抗原決定位-不論是在2個不同的分子(例如抗原)上或在相同的分子(例如在相同的抗原)上。若雙專一性抗體能夠選擇性地結合2種不同抗原決定位(第一抗原決定位以及第二抗原決定位)，第一重鏈對第一抗原決定位的親和力一般要比第一重鏈對第二抗原決定位的親和力低上至少1到2或3或4個數量級，而且反之亦然。雙專一性抗體所辨識的抗原決定位可以是在相同或不同標的上(例如在相同或不同的蛋白質上)。雙專一性抗體可以藉由，例如，結合辨識相同抗原之不同抗原決定位的重鏈而製得。舉例而言，編碼會辨識相同抗原之不同抗原決定位的重鏈可變序列的核酸序列可以融合至編碼不同重鏈恆定區域的核酸序列，且此等序列可以在表現免疫球蛋白輕鏈的細胞內表現。典型的雙專一性抗體具有2個各自具有3個重鏈CDRs的重鏈，接而為(N-端至C-端)CH1領域、樞紐、CH2領域與CH3領域，以及未賦予抗原-結合專一性但是可以與各個重鏈締合，或可與各個重鏈締合並且可以結合一或多個由重鏈抗原-結合區域所結合的抗原決定位，或可以與各個重鏈締合並且讓重鏈之一或兩者結合至一或兩個抗原決定位的免疫球蛋白輕鏈。
術語”細胞”包括任一種適於表現重組型核酸序列的細胞。細胞包括那些原核生物以及真核生物的細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如大腸桿菌屬、芽孢桿菌、鏈黴菌等等的菌株)、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母菌細胞(例如啤酒酵母菌、裂殖酵母菌、畢赤酵母菌、甲醇畢赤酵母菌等等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如SF-9、SF-21、桿狀病毒-感染的昆蟲細胞、粉斑夜蛾等等)、非-人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，諸如，例如融合瘤或四源雜交瘤(quadromas)。在某些具體例中，該細胞是人類、猴、猿類、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在某些具體例中，該細胞是真核生物的並且是選自於下列細胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎臟(例如HEK293、293 EBNA、MRS 293、MDCK、Hak、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(上皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、賽特利細胞、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞，以及衍生自前述細胞的細胞株。在某些具體例中，該細胞包含有一或多個病毒基因，例如表現病毒基因的視網膜細胞(例如，PER C6TM 細胞)。
慣用語“互補決定區域”或術語“CDR”包括由某個生物的免疫球蛋白基因之核酸序列所編碼的胺基酸序列，它通常(亦即在野生型動物體內)出現在免疫球蛋白分子(例如，抗體或T細胞受體)之輕或重鏈的可變區域之2個骨架區域間。CDR可以由，例如，生殖細胞序列或經重排或未經重排的序列，以及例如由天然或成熟B細胞或T細胞所編碼。在某些情況下(例如就CDR3來說)，CDRs可以由2個或多個並非連續(例如呈現未經重排的核酸序列)但是B細胞核酸序列中為連續的序列所編碼，例如因為剪接或接合序列(例如，V-D-J重組以形成重鏈CDR3)。
慣用語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包括源自於任何生物的免疫球蛋白重鏈恆定區域序列，並且包括重鏈可變領域，除非另有指明。重鏈可變領域包括3個重鏈CDRs以及4個FR區域，除非另有指明。重鏈的片段包括CDRs、CDRs與FRs，及其組合。典型的重鏈在可變領域之後(從N-端至C-端)包括CH1領域、樞紐、CH2領域以及CH3領域。重鏈的功能性片段包括能夠專一地辨識抗原(例如，以微莫耳、奈莫耳或皮莫耳的KD 辨識抗原)的片段，它能夠由細胞所表現並分泌，且含有至少1個CDR。
慣用語“含Fc蛋白質”包括抗體、雙專一性抗體、免疫黏附素以及其他包含有免疫球蛋白CH2與CH3區域的至少一個功能性部分的結合蛋白。“功能性部分”意指可以結合Fc受體(例如，FcγR或FcRN，亦即新生兒Fc受體)，和/或可參與活化補體的CH2以及CH3區域。假若CH2以及CH3區域含有刪除、置換和/或插入或其他會使其無法結合任何Fc受體且無法活化補體的修飾，CH2與CH3是不具有功能性的。
含Fc蛋白質可在免疫球蛋白領域中含有修飾，包括會影響結合蛋白的一或多種效應子功能的修飾(例如影響FcγR結合、FcRN結合以及因而半衰期，和/或CDC活性的修飾)。這樣的修飾包括，但不限於下列修飾及其組合，參照免疫球蛋白恆定區域的EU編號：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438以及439。
舉例而言，且非為限定的，該結合蛋白是一種含Fc蛋白質並且展現出增強的血清半衰期(相較於不帶有所述的修飾(等)的相同含Fc蛋白質)以及在位置250(例如E或Q)；250與428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W 或T)、254(例如S或T)，與256(例如S/R/Q/E/D或T)的修飾；或在位置428和/或433(L/R/SI/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修飾；或在250和/或428的修飾；或在307或308(例如308F、V308F)，以及434的修飾。在另一個實例中，該修飾可以包含有428L(例如M428L)以及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)，以及308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)以及434(例如434Y)修飾；252、254以及256(例如252Y、254T以及256E)修飾；250Q與428L修飾(例如T250Q與M428L)；307和/或308修飾(例如308F和308P)。
慣用語“離子修飾劑”包括會降低蛋白質之間的非專一性(亦即，非親和力)離子交互作用的影響，或破壞離子交互作用的部分(moieties)。“離子修飾劑”包括，例如，第I族以及第II族金屬與乙酸、碳酸氫鹽、碳酸、鹵素(例如，氯化物或氟化物)、硝酸、磷酸或硫酸之離子結合的鹽類。“離子修飾劑”的非限制性例示名單包括乙酸的鈹鹽、鋰鹽、鈉鹽以及鉀鹽；碳酸氫鈉以及碳酸氫鉀；碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀以及碳酸銫；氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫以及氯化鎂；氟化鈉與氟化鉀；硝酸鈉、硝酸鉀與硝酸鈣；磷酸鈉與磷酸鉀；以及硫酸鈣與硫酸鎂。“離子修飾劑”包括那些在加入pH階梯或步驟之後，或在蛋白質A撐體以“離子修飾劑”校正並且施用pH階梯或梯度之後會影響離子交互作用而致使同型二聚體IgG與異型二聚體IgG(例如，野生型人類IgG與相同的IgG但其CH3領域帶有一或多個如此處所述的修飾者)洗出之間的pH單位距離變大的部分。“離子修飾劑”的適當濃度可以在“離子修飾劑”濃度漸增的情況下，透過採用相同的管柱、pH階梯或梯度，直到在特定的pH階梯或pH梯度處達致最大pH距離而決定。
慣用語“輕鏈”包括源自於任何生物的免疫球蛋白輕鏈恆定區域序列，以及包括人類K以及λ輕鏈，除非另有指明。輕鏈可變(VL)領域典型地包括3個輕鏈CDRs以及4個骨架(FR)區域，除非另有指明。一般來說，全長輕鏈包括，從胺基端至羧基端，包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VL領域，以及輕鏈恆定領域。可以與本發明一起使用的輕鏈包括那些例如不會選擇性地被結合抗原-結合蛋白選擇性地結合的第一或第二抗原。適當的輕鏈包括那些可以藉由在現有的抗體庫(濕庫(wet libraries)或在電腦上)中篩選最常被採用的輕鏈而鑑定出，其中輕鏈實質上不會干擾抗原-結合蛋白的抗原-結合領域的親和力或選擇性。適當的輕鏈包括那些可以結合一或兩個被抗原-結合蛋白的抗原-結合區域結合的抗原決定位。
慣用語“微莫耳範圍”意欲表示1-999微莫耳；慣用語“奈莫耳範圍”意欲表示1-999奈莫耳；慣用語“皮莫耳”意欲表示1-999皮莫耳。
慣用語“體細胞突變的(somatically mutated)”包括有關源自於已經經過類型-轉換(class-switching)之B細胞的核酸序列，其中於經類型-轉換之B細胞的免疫球蛋白可變區域(例如重鏈可變領域或包括重鏈CDR或FR序列)的核酸序列不同於類型-轉換之前的B細胞的核酸序列，諸如，例如在未經過類型-轉換的B細胞與已經過類型-轉換的B細胞之間於CDR或骨架核酸序列方面的差異。“體細胞突變的”包括有關源自親和力成熟的B細胞的核酸序列，它是不同於未經過親和力成熟的B細胞之對應序列(亦即，在生殖細胞的染色體中的序列)。慣用語“體細胞突變的”也包括有關在B細胞暴露於感興趣之抗原之後，源自於B細胞的核酸序列，其中該核酸序列不同於B細胞在暴露於感興趣的抗原之前的對應核酸序列。慣用語“體細胞突變的”意指源自於已在對抗原攻毒起反應的動物體內(例如帶有人類免疫球蛋白可變區域核酸序列的小鼠)生成並且因為篩選步驟而在固有地在此一動物體內運作的抗體之序列。
慣用語“可變領域”包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈(如所欲般修飾)的胺基酸序列，其包含有下列胺基酸區域，按照從N-端至C-端的序列(除非另有指明)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“可變領域”包括能夠摺疊成帶有雙β摺疊結構的典型領域(VH或VL)的胺基酸序列，其中β摺疊是透過第一個β摺疊以及第二個β摺疊的殘基之間的雙硫鍵而連結。
帶有經修飾之IgG CH3區域的雙專一性抗體
發明人已發展出一種新穎形式，其將共同的輕鏈策略與實施可與人類抗體構成要素一起使用的選擇性蛋白質A純化途徑組合。
先前已注意到(Lindhofer,H. et al.(1995) J. Immunol. 155:219-225)，因為人類IgG3不會結合至蛋白質A，它可能有潛力與任何其他3種人類IgG亞型一起使用在類似於小鼠-大鼠雜交體中所使用的純化策略。但是，雖然所有4種人類IgG亞型的序列是高度同源的，仍不知道IgG1、IgG2以及IgG4的Fc部分有多容易與IgG3形成異型二聚體；即使較不偏好形成的同型二聚體在某些情況下(例如分離自四源雜交瘤)對於所欲的異型二聚體總產率可能會有負面影響。額外的修飾對於補償IgG3的樞紐區域與其他亞型的樞紐區域間的差異可能也是必須的。在某些情況下，因為對於效應子功能的潛在影響性，也不全然偏好需要有全IgG3 Fc存在。
因此，發明人利用蛋白質A結合的偶然單一決定位(fortuitously simple determinant)而設計出一種“最少”形式。已報導(Jendeberg,L. et al.(1997) J. Immunological Meth. 201:25-34)IgG3無法結合蛋白A是因為一個單獨的胺基酸殘基，Arg435(EU編號，按照IMGT為Arg95)而決定，其在其他IgG亞型中的對應位置是由組胺酸殘基所佔據。因此，可以使用His435突變成Arg的IgG1序列來取代IgG3。因此，IgG1中的單一點突變應足以產生能夠順應新純化途徑的不同結合親和力。這個修飾可以意指為IgG1ΔA而表示它無法結合蛋白A(以及，相同地，IgG2ΔA以及IgG4ΔA，或更普遍地，FcΔA)。
然而，具體指明的點突變會透過突變引入新穎的肽序列，而這個突變可能是免疫性的。理論上，點突變可能在第II型MHC分子上並且被呈現給T細胞，且因而引起免疫反應。為了避免這個可能的風險，可以使用雙肽突變，H435R/Y436F(EU編號；按照IMGT為H95R/Y96F)。所生成之鄰近改變處的序列相同於IgG3的(參見第2A圖)，並且因而預期在免疫學上是“看不見的”，因為沒有非-天然短肽可供呈現給T細胞。這個雙重突變體已被報導仍不會結合蛋白A(Jendeberg,L. et al.(1997) J. Immunological Meth. 207:25-34)。最後，該雙肽突變不包括任何會形成Fc二聚體介面的殘基，那麼就不可能會干擾異型二聚體形成。這個雙肽突變被命名為“IgG1ΔAdp”(以及，相同地IgG2ΔAdp、IgG4ΔAdp以及FcΔAdp)。IgG1、IgG2以及IgG4的雙肽修飾的置換在第3圖中表示為IgG1ΔAdp、IgG2ΔAdp以及IgG4ΔAdp被指出，顯示帶有野生型人類IgG CH3領域序列與hIgG3，顯示IMGT外顯子編號以及EU編號。
FcΔAdp修飾不包括任何咸信會形成Fc二聚體介面的殘基，那麼FcΔAdp修飾就不可能會干擾異型二聚體形成。因為FcΔAdp是那麼少，它可能也會被併入其他經遺傳工程化的Fc形式。IgG2ΔAdp以及IgG4ΔAdp在與各個後者相關聯的效應子功能(或缺乏效應子功能)的情況下可能是有利的。
總之，上述雙專一性抗體形式包括2個使用相同輕鏈但具有不同專一性的抗體，其中它們之一者的Fc區域被修飾成FcΔAdp形式(參見第2B圖)。其構形是天然人類抗體的構形，且因此共有它們有利的性質，包括低的聚集傾向、活體內安定性、最低免疫原性、類似於抗體的生物分佈性質、理想的藥物動力學，以及選擇性的效應子功能。提供一種在執行上相對快速並簡易的方法來分離這些雙專一性抗體。
帶有經修飾之小鼠IgG3 CH3區域的雙專一性結合蛋白
發明人已設計出一種易於分離結合蛋白的方法，該結合蛋白包含有一就CH3領域中的一或多個胺基酸而言為異型二聚體的免疫球蛋白重鏈(或其含有具功能性的CH2與CH3片段)。謹慎篩選小鼠IgG CH3領域的修飾並且應用特定分離技術賦予易於分離出結合蛋白的能力，該結合蛋白包含有2個源自於同型二聚體以及不含有該等修飾之異型二聚體的差異性修飾小鼠CH3區域。
在247處有脯胺酸，在252、254以及256處有蘇胺酸，以及在258處有離胺酸的小鼠IgG1僅會微弱地結合蛋白A。但是，在那些位置處有不同殘基(除了IgG2b位置256與258以外)的小鼠IgG2a以及IgG2b，以及小鼠IgG2a與2b會結合至蛋白質A。在用於製造重鏈為異型二聚體的抗體之方法中，差異性修飾2個小鼠IgGs的CH3區域會賦予這樣一個抗體差異性蛋白質A結合特性。這樣，設計出一種差異性蛋白質A分離途徑，其容許易於從任何小鼠IgG同型二聚體中分離出經修飾的異型二聚體，不論它是IgG1的同型二聚體(僅會很微弱地結合至蛋白質A)，或小鼠IgG2a的同型二聚體、小鼠IgG2b的同型二聚體，或IgG2a/IgG2b的異型二聚體。舉例來說，具有2種不同重鏈可變領域但相同同型(例如IgG2a)的雙專一性抗體可以在採用該等重鏈序列的適當表現系統中表現，其中僅有IgG2a CH3區域的一者被修飾成降低或消除蛋白質A結合決定位。這樣，僅有IgG2a CH3區域的一者會對蛋白質A展現實質上的親和力，而任何由未修飾IgG2a以及經修飾IgG2a的二聚體所形成的抗體將易於從經修飾的異型二聚體中分離出來。
在各種具體例中，其中Fc二聚體的一個單獨CH3領域包含有經修飾的CH3區域，而Fc二聚體的其他CH3則缺乏經修飾的CH3區域。小鼠IgGCH3區域被修飾成在特定位置處(EU編號)包含有選自於由下列所構成的群組之特定胺基酸：252T、254T以及256T；252T、254T、256T以及258K；247P、252T、254T、256T以及258K；435R以及436F；252T、254T、256T、435R以及436F；252T、254T、256T、258K、435R以及436F、24tP、252T、254T、256T、258K、435R以及436F，以及435R。在一個特定具體例中，做出一個特定群組的修飾，選自於由下列所構成的群組：M252T、S254T、S256T；M252T、S254T、S256T、I258K；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K；H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；以及H435R。
以同型二聚體小鼠IgG為基礎的結合蛋白可以使用於各種不同的應用中。舉例而言，它們容許用於分離具有小鼠恆定領域的雙專一性抗體的方法，其中該等修飾不會干擾或實質上不會干擾抗體結合至一或多個小鼠Fc受體，而使得該抗體可以參與，例如，ADCC或CDC並且可以結合相同或不同標的上的2個或多個抗原決定位。
在一個方面，一種用以分離包含有第一小鼠IgG CH3領域以及第二小鼠IgG CH3領域的結合蛋白，其中該第一IgG CH3領域(並非第二IgG CH3領域)被修飾而降低或消除該第一小鼠IgG CH3領域而非第二小鼠IgG CH3領域的蛋白質A結合親和力，且其中該結合蛋白包含有會結合第一抗原決定位的第一結合部分以及結合第二抗原決定位的第二結合部分。
在一個具體例中，該修飾不會改變或實質上不會改變結合蛋白對Fc受體的結合親和力。在一個具體例中，該結合蛋白包含有會增高或減低該結合蛋白對Fc受體的親和力的修飾。
在一個具體例中，與缺乏修飾的結合蛋白相較之下，該修飾不會改變或實質上不會改變該結合蛋白在含有天然小鼠FcγR受體和/或天然小鼠FcRn之小鼠體內的血清半衰期。
在一個具體例中，與缺乏修飾的對應結合蛋白相較之下，該修飾不會改變或實質上不會改變該結合蛋白在含有天然小鼠高與低親和力FcγR受體和/或FcRn受體的置換之小鼠體內的血清半衰期。
在一個具體例中，該第一與第二抗原決定位是不同的且在不同的細胞上或者在不同的蛋白質上。在一個具體例中，該第一抗原決定位以及該第二抗原決定位是不同的並且在相同的細胞上或在相同的蛋白質上。
在一個具體例中，Fc受體是選自於高親和力Fc受體、低親和力Fc受體以及FcRn。在一個特定具體例中，該Fc受體是選自於小鼠FcRn、小鼠FcγR、小鼠FcγRIIB、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV及其組合的一或多者。在一個特定具體例中，該Fc受體是選自於人類FcRn、人類FcγR、人類FcγRIIB、人類FcγRIIC、人類FcγRIIIB、人類FcγRIIIA、人類FcγRIIA及其組合的一或多者。
免疫原性
本發明的許多具體例的一個優點是採用修飾(等)而製造出易於根據對蛋白質A的差異性結合來分離還有在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性之雙專一性抗體的能力。這個特點讓此等具體例特別有益於製造雙專一性抗體供人類治療使用，以及製造非免疫性或實質上非免疫性的免疫黏附素(採用人類結合部分，亦即人類受體構成要素和/或人類配位子)。這個特點是與雙專一性抗體具有IgG1、IgG2以及IgG3的H95R/Y96F(IMGT編號)的CH3領域以及那些含有進一步修飾而造成在要被修飾的位置反映出不同IgG同型之野生型序列的CH3領域有關的。因此，雖然該修飾在本質上未被發現到與特定IgG同型有關，經修飾的序列在位置上與不同IgG同型的野生型序列是相同的，且該修飾未預期是免疫性或實質上免疫性的。該修飾也可以是非免疫性的，即便它的序列在位置上與任何天然序列並非是相同的；此等修飾將會同樣是有利的。最少的點突變H95R(IMGT編號)，若為非免疫性，因而會是本發明的適當實施例。
因此，提供就其重鏈恆定領域來說在人類體內為非免疫性或實質上非免疫性的雙專一性抗體，但仍帶有1或多個差異性修飾的重鏈恆定領域，包括就親和力試劑(例如蛋白質A)而言會造成重鏈恆定領.域的差異性親和力之修飾。該等修飾包括那些此處所揭示者。在一個特定具體例中，有關其CH3領域在人類體內為非免疫性或實質上非免疫性，然而帶有差異性修飾之重鏈的雙專一性抗體是包含具有下列修飾之一者的CH3領域的人類IgG1、IgG2或IgG4(或在另一個具體例中，基本上由下列修飾之一者所組成)：H95R，或H95R以及Y96F(IMGT編號)。
關於對人類IgG1、IgG2以及IgG4同型的耐受性未被破壞至任何明顯的程度，該等雙專一性抗體預期是非免疫性或實質上非免疫性的。
特別地，FcΔAdp修飾預期是免疫學上“看不見的”，因為第II型MHC分子的結合溝能容納1個包含有能被T細胞受體的可變環所辨識之主要決定位的9-員，而使得缺乏任何天然9-員次序列的肽似乎無法引起免疫反應。但是，長度超過9-員的肽(通常約13至17員)被第II型MHC所結合，且突起節段可能會影響結合。因此，會消除較長的非天然序列的額外修飾(在FcΔAdp修飾方面)可能會進一步減低有關免疫原性的可能性。一個特定的實例是修飾V422I(EU；按照IMGT編號為V82I)，它在IgG1ΔAdp中將最小非天然肽的長度從14延伸至30個殘基，以及在類似界定的IgG2ΔAdp中至43個殘基。另一個實例是在IgG4ΔAdp中的修飾L455P(EU；按照IMGT編號為L105P)，其將長度從10延伸至14個殘基。
藥物動力學
對於蛋白質A的結合位址與對於新生兒Fc受體，FcRN的結合位址重疊，這被認為是賦予免疫球蛋白較長的血清半衰期的原因。在鄰近蛋白質A結合位址處的修飾因而升高此處提出的形式可具有要比IgG1、2以及4所具者還要短的血清半衰期的可能性，假設人類IgG3具有要比其他IgG亞型(約21天)還短的血清半衰期(約7天)。某些影響His435的Fc突變體已顯示不會結合FcRN，並且在小鼠體內具有較短的半衰期。然而，藥物動力學分析已顯示，IgG1ΔA/IgG1異型二聚體的血清半衰期並未明顯不同於IgG1同型二聚體(參見實施例2)。因此，IgG1ΔAdp突變具有消除蛋白質A結合同時仍保留較長的IgG1半衰期的優點。
因此，在一個具體例中，提供一種雙專一性抗原-結合蛋白，其包含有如此處所述的CH3領域的修飾，其中該抗原-結合蛋白展現出等同於在CH3領域缺乏該修飾之相同雙專一性抗原-結合蛋白所具有的藥物動力學圖譜。在一個具體例中，提供一種雙專一性抗體，其包含有IgG1ΔA/IgG1異型二聚體Fc，其中該雙專一性抗體具有要比除了包含有IgG3CH3領域以外均相同，或者除了包含有至少一個IgG3重鏈以外均相同的雙專一性抗體高出約1.5倍、約2倍、約2.5倍或約3倍的血清半衰期。在一個具體例中，提供一種雙專一性抗體，其包含有IgG1ΔA/IgG1異型二聚體Fc，其中該雙專一性抗體展現出與不帶有IgG1ΔA修飾的雙專一性抗體(亦即，IgG1異型二聚體雙專一性抗體)相同的血清半衰期。
免疫球蛋白重鏈
可用於產生帶有所欲特性(例如，所欲的專一性、所欲的親和力、所欲的功能性，例如阻斷、非阻斷、抑制、活化等等)之雙專一性抗體的免疫球蛋白重鏈可變區域可使用本技藝中所熟知的任一種方法產生。於是所欲的重鏈可以藉由將含有可變區域的核酸序列選殖到帶有此處所述之所欲重鏈恆定區域的建構物中而被建構出來。
在一個具體例中，第一重鏈包含有由衍生自第一種動物之成熟B細胞基因體的核酸所編碼的可變區域，該第一種動物已使用第一抗原予以免疫，且該第一重鏈專一地辨識該第一抗原。在一個特定具體例中，該第二重鏈包含有由衍生自第二種動物之成熟B細胞基因體的核酸所編碼的可變區域，該第二種動物已使用第二抗原予以免疫，且該第二重鏈專一地辨識第二抗原。
在一個具體例中，該第一種動物和/或第二種動物是經遺傳修飾的動物，包含有未經重組的人類免疫球蛋白重鏈可變區域。在一個具體例中，該第一種動物和/或第二種動物是經遺傳修飾的動物，包含有未經重組的人類免疫球蛋白重鏈可變區域以及人類免疫球蛋白恆定區域。在一個具體例中，該第一種動物和/或第二種動物是經遺傳修飾的小鼠，包含有未經重組的人類免疫球蛋白重鏈可變區域。
免疫球蛋白重鏈可變區域序列可以藉由任何該技藝中所熟知的其他方法而獲得，例如藉由噬菌體展示，且藉此所得到的序列可以用來製造出要被結合至編碼任何適當重鏈(例如，帶有如此處所述經修飾的CH3領域的重鏈)之核酸的核酸建構物，並且置於一個表現建構物中以及轉移至能夠在適當的輕鏈存在下製造該重鏈的細胞中。
免疫球蛋白輕鏈
包含有2個辨識2個不同抗原決定位(或2個不同抗原)之重鏈的雙專一性抗體是更為容易分離出來的，因為它們可以與相同的輕鏈(亦即，帶有相同的可變與恆定領域的輕鏈)相配對。各種用於生產可與2個具有不同專一性的重鏈相配對，而不會干擾或實質上不會干擾重鏈可變領域與其標的抗原的選擇性和/或親和力之輕鏈的方法在該技藝中為已知的。
在策略中，輕鏈可以透過檢驗所有輕鏈可變領域的慣用統計學、鑑定人類抗體中最常採用的輕鏈，並且將輕鏈與具有不同專一性的2個重鏈配對而篩選出。
在另一個策略中，輕鏈可以藉由觀察噬菌體展示庫(例如包含有人類輕鏈可變區域序列的噬菌體展示庫，例如人類ScFv庫)中的輕鏈序列並且從該庫中選出最常使用的輕鏈可變區域而篩選出。
在另一個策略中，輕鏈可以藉由使用2種重鏈作為探針分析噬菌體展示庫的輕鏈可變序列而篩選出。與重鏈可變序列締合的輕鏈選作為該等重鏈的輕鏈並且容許有關於抗原決定位兩者的結合和/或活化。
在另一個方法中，輕鏈可以藉由將已知的輕鏈與所欲的重鏈組合並且針對結合專一性、親和力和/或活化能力來分析所生成的雙專一性抗體而篩選出。
就任一種用於篩選出輕鏈的策略所遭遇到的困難的程度(例如，輕鏈干擾重鏈之一或兩者與其抗原結合，或輕鏈無法令人滿意地與重鏈之一或兩者締合)，輕鏈可與重鏈的同源輕鏈序列排列，並且在輕鏈中產生更為符合兩個重鏈的同源輕鏈所共有的序列特性的修飾。若免疫原性的變化必須被降至最低，該等修飾較佳地會造成序列出現在已知的人類輕鏈序列中，而使得蛋白溶解過程無法依據該技藝中用以評估免疫原性可能性的參數以及方法(亦即在電腦中以及濕分析法)來產生T細胞抗原決定位。
抗體以及結合蛋白
該等組成物以及方法特別有利於製造人類雙專一性抗體，亦即包含有人類恆定與可變領域的雙專一性抗體。在某些具體例中，人類抗體包括那些具有衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列的重鏈可變與重鏈恆定領域，在某些具體例中是衍生自體細胞突變的人類免疫球蛋白序列(例如在包含有人類免疫球蛋白基因序列的動物體內生成的)。在某些具體例中，人類可變和/或恆定區域可包括並非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼或由於重組和/或剪接所編碼的胺基酸殘基，例如在CDRs中並且特別是在CDR3中。人類抗體並非意欲要包括衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)的生殖細胞的CDR序列已被接枝到人類骨架序列上的抗體。那些抗體被意指為經人類化或嵌合抗體。人類抗體包括那些含有突變(例如活體外藉由隨機或位址-專一性突變誘發而引入)者，但是該等突變在人類體內較佳是非免疫性的。
該等方法以及組成物可用於製造嵌合抗體，較佳地在人類體內為非免疫性的，或具有低免疫原性。嵌合抗體是重鏈可變區域或骨架或CDR或重鏈恆定區域或領域之一是源自於不同物種(例如人類與小鼠，或人類與靈長動物)的抗體。在某些具體例中，嵌合抗體包括具有非-人類來源(例如小鼠)之重鏈可變區域以及人類來源之重鏈恆定區域的抗體。在某些具體例中，嵌合抗體包括具有人類來源之重鏈可變區域以及非-人類來源(例如小鼠)之重鏈恆定區域的抗體。在各種具體例中，小鼠來源的區域與帶有或不帶有體細胞超突變的小鼠免疫球蛋白生殖細胞序列是相同或實質上相同的。嵌合抗體也包括具有與人類免疫球蛋白生殖細胞序列以及非-人類(例如小鼠)重鏈或嵌合人類/非人類重鏈是相同或實質上相同之輕鏈恆定區域的抗體。嵌合抗體包括具有與非-人類(例如小鼠)免疫球蛋白生殖細胞序列以及人類或嵌合非人類/人類重鏈是相同或實質上相同之輕鏈恆定領域的抗體。
在某些具體例中，該等組成物以及方法是用於製造親和力成熟的抗體。在某些具體例中，親和力成熟的抗體在一或多個CDRs中包含有一或多個會造成抗體對其標的抗原具有較高親和力(例如落在奈莫耳或皮莫耳範圍內的KD )(相較於缺乏改變(等)但實質上相同的抗體)的改變。親和力成熟的抗體可以藉由任何該技藝中所熟知的適當方法而製造出，例如藉由CDRs和/或骨架區域的隨機或位址-導向的突變誘發接而為親和力篩選、VH領域洗牌等等。
在某些具體例中，該等抗體為中和抗體。中和抗體包括能夠中和、抑制或預防抗原的生物活性的抗體。中和抗體包括那些在結合抗原之後於活體內以及活體外防止或減低抗原作用於抗原之天然標的之能力。中和抗體的實例包括針對生物學受體的蛋白質配位子之抗體，其防止配位子結合受體，或針對生物學受體的抗體，其防止受體結合其配位子，其中在沒有抗體存在的情況下配位子結合會使受體在細胞內部產生變化。決定一抗體是否為中和抗體通常必須進行功能分析，其中測量抗體對於抗原的生物學活性的影響。
本發明的方法以及組成物也可以有利於有關抗體以及其他結合蛋白的各種應用中。在此提供某些有利應用的簡短說明。
可以製造出對腫瘤抗原以及T細胞抗原具有結合專一性的雙專一性結合蛋白，它會標定細胞上的抗原，例如CD20，並且亦會標定T細胞上的抗原，例如CD3。這樣，雙專一性抗體會標定患者體內感興趣的細胞(例如，淋巴瘤患者體內的B細胞，經由CD20結合)以及患者的T細胞。在各種具體例中，雙專一性抗體被設計成在結合CD3之後會活化T細胞，因而將T細胞活化偶合至特定、選定的腫瘤細胞。
也可以製造出包含有2個在相同細胞表面上各自針對1個結合伴侶(亦即，各自針對不同標的)之結合部分的雙專一性結合蛋白。這個設計特別適於標定相同細胞表面上表現2種標的之特定細胞或細胞類型。雖然標的可能獨自出現在其他細胞上，選定這些結合蛋白的結合部分而使得各個結合部分以相對低的親和力(例如低的微莫耳，或高的奈莫耳-例如在以百計的奈莫耳KD 範圍內，例如500、600、700、800奈莫耳)結合它的標的。這樣，延長的標的結合僅有在2個標的在相同細胞上是接近的情況下是偏好的。
可以製造出包含有2個結合相同標的之結合部分的雙專一性結合蛋白，各個結合部分在相同標的之不同抗原決定位處。這個設計尤其適於使用結合蛋白成功阻斷標的之可能性盡可能達到最高。多重細胞外環，例如穿膜通道或細胞表面受體，可以被相同雙專一性結合分子所標定。
可以製造出包含有2個成群並且活化免疫傳訊的負向調節劑之結合部分的雙專一性結合蛋白而造成免疫壓抑。可以採順式的方式達到壓抑，其中標的是在相同細胞上；可以採反式的方式達到壓抑，其中標的是在不同細胞上。例如可以採順式的方式使用具有抗IgGRIIb結合部分以及FeID1結合部分的雙專一性結合蛋白達到壓抑，而使得IgGRIIb僅在有FeIDI存在的情況下成群，為了下調對FeID1的免疫反應。可以採反式的方式使用具有抗BTLA結合部分以及專一地結合感興趣之組織專一性抗原的結合部分的雙專一性結合蛋白達到壓抑，而使得抑制性BTLA分子僅在有選定之標的組織的情況下發生成群，其可以強力地對付自體免疫疾病。
可以製造出活化多重構成要素受體的雙專一性結合蛋白。在這個設計中，2個針對受體的2個構成要素之結合部分結合，交互連結受體，並且活化源自於該受體的傳訊。這可以使用例如帶有結合IFNAR1的結合部分以及結合INFAR2的結合部分之雙專一性結合蛋白而製造出，其中結合交互連結受體。這樣的一個雙專一性結合蛋白可以提供干擾素治療的替代方案。
可以製造出將結合部分運送通過半通透性障壁(例如血腦障壁)的雙專一性結合蛋白。在這個設計中，一個可以通過特定選擇性屏障之結合部分會結合標的；另一個結合部分以治療活性標定一個分子，其中帶有治療活性的標定分子一般無法越過該屏障。這類的雙專一性結合蛋白是應用於將治療劑帶到治療劑無法到達的組織。一些實例包括標定pIGR受體而將治療劑運送至腸或肺臟，或標定轉運受體而將治療劑運送跨越血腦障壁。
可以製造出將結合部分運送至特定細胞或細胞類型中的雙專一性結合蛋白。在這個設計中，一個結合部分標定易於被內化至細胞中的細胞表面蛋白(例如受體)。另一個結合部分標定細胞內蛋白質，其中結合細胞內蛋白質會造成治療效用。
結合吞噬性免疫細胞的表面受體以及傳染性病原體(例如酵母菌或細菌)的表面分子的雙專一性結合蛋白，令傳染性病原體靠近吞噬性免疫細胞而促進病原體的吞噬作用。這樣的一種設計的實例是標定CD64或CD89分子還有病原體的雙專一性抗體。
具有抗體可變區域作為一個結合部分以及一個非-Ig部分做為第二結合部分的雙專一性結合蛋白。抗體可變區域達致標定，而非Ig部分是一種連結至Fc的效應子或毒素。這樣，配位子(例如效應子或毒素)被遞送至抗體可變區域所連結之標的。
具有2個部分各自結合至Ig區域(例如含有CH2以及CH3區域的Ig序列)的雙專一性結合蛋白，而使得任兩個蛋白質部分可以在有Fc的情況下靠近彼此。這種設計的實例包括捕獲，例如同型-或異型二聚體捕獲分子。
核酸
編碼單株抗體的核酸序列可以透過任何該技藝中所熟知的適當方法而獲得。舉例來說，用於獲得單株抗體(以及它們的核酸序列)的適當方法的實例包括透過融合瘤方法(參見，例如Kohler et al.(1975) Nature 256:495-497)或噬菌體抗體庫(參見，例如參見Clackson et al.(1991) Nature 352:624-628)。
在各種具體例中，免疫球蛋白重鏈可變領域是衍生自經遺傳修飾的動物或基因轉殖動物的核酸序列。在某些具體例中，該等區域是衍生自包含有人類免疫球蛋白微小基因座的動物。在某些具體例中，該等區域是衍生自包含有一或多個染色體外核酸(含有一或多個編碼免疫球蛋白序列的核酸)的小鼠。在各種具體例中，該動物可以具有一或多個未經重組的人類免疫球蛋白核酸序列。在某些具體例中，該動物包含有人類輕鏈可變區域核酸序列，在某些具體例中，重與輕鏈可變序列這兩者，以及在某些具體例中更包含有人類恆定區域序列。在一個特定具體例中，該等核酸序列是衍生自小鼠，其中內源性小鼠重鏈可變基因節段以及輕鏈可變基因節段已被置換為人類重鏈可變基因節段以及輕鏈可變基因節段。
在某些具體例中，該等核酸序列是衍生自這樣一種動物的天然B或T細胞。在其他具體例中，該等核酸序列是衍生自已使用感興趣之抗原予以免疫的動物的B或T細胞。
在各種具體例中，該等核酸序列是衍生自藉由使用引子來擴增它們的細胞，包括例如成組的簡併性引子，它們包含有一或多個FR、結合或恆定序列。
在各種具體例中，免疫球蛋白重鏈可變領域是衍生自已使用感興趣之抗原予以免疫的動物的核酸。舉例來說，非-人類基因轉殖或經遺傳修飾的動物使用感興趣之抗原予以免疫(藉由，例如將動物暴露於抗原或帶有該抗原或編碼可表現形式之抗原的核酸的細胞)，容許動物經歷免疫反應，從動物體內分離出免疫細胞(例如B細胞)，選擇性地令該等細胞永生，以及篩選細胞以鑑定與抗原的反應性和/或鑑定和/或分離編碼免疫球蛋白可變區域(當置於有抗體存在的情況下它能夠辨識抗原)的核酸序列。在某些具體例中，細胞為B細胞。在某些具體例中，經免疫的動物的B細胞是用來製造融合瘤，鑑定會表現專一地辨識抗原的抗原決定位之抗體的B細胞並且鑑定和/或分離出編碼會辨識抗原決定位之可變區域胺基酸序列的核酸序列。
在某些具體例中，該等核酸是衍生自人類、非-人類靈長動物(例如，諸如黑猩猩的猿)、猴(例如馬來猴或恆河猴)、齧齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠)、驢、山羊、綿羊等等。
在某些具體例中，重鏈包含有衍生自人類細胞的序列。舉例來說，人類胚細胞在活體外暴露於一抗原並且置於適當的宿主動物(例如SCID小鼠)體內。
在某些具體例中，該等核酸是使用載體而被引入細胞內。載體包括，例如質體、科斯載體(cosmids)、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關的病毒、植物病毒、YACs、BACs、EBV衍生的染色小體。
在某些具體例中，該等核酸存在於表現載體或表現建構物中。在某些具體例中，該表現載體或建構物是一種含有可操作地連結至感興趣之核酸序列的啟動子的載體，而使得感興趣之核酸序列能夠在適當條件下於適當細胞中被表現。表現載體或建構物可包括前導序列、增強子、增強轉錄或轉譯的啟動子要素、轉錄終止序列、剪接序列、轉錄-增強內含子、IRES要素、標記基因、篩選基因、重組酶辨識位址、同源臂、病毒序列、操作子(例如原核操作子)等等。在某些具體例中，表現載體包含有允許可誘發表現的要素，例如可操作地連結至真核啟動子的原核操作子。在某些具體例中，表現是在加入表現誘導劑之後被誘發。在某些具體例中，表現是在移除表現抑制劑之後被誘發。在某些具體例中，表現是藉由溫度改變而被誘發。
在某些具體例中，一或多個重鏈核苷酸序列是在相同的載體上。在某些具體例中，一個重鏈核酸序列以及一個輕鏈核酸序列於此是在相同的載體上。在一個具體例中，2個重鏈核酸序列以及1個輕鏈核酸序列是在相同的載體上。
在某些具體例中，該等核酸是在包含有一或多個源自於病毒之核酸的細胞中表現。在特定具體例中，該病毒是選自於腺病毒、腺-相關病毒、SV-40、E-B病毒、反轉錄病毒、慢病毒、桿狀病毒、冠狀病毒、單純性皰疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、森林病毒、辛德比病毒以及壞死性牛痘。
宿主細胞是可以被轉形而表現感興趣之核酸的細胞。在各種具體例中，轉形包括改變細胞的核酸內含物，而使其含有外源性核酸(例如於自然界中未在細胞內被發現到的核酸，或對應於自然界中未在細胞內被發現的核酸，核酸的一或多個額外複本)。細胞的核酸內含物可以藉由任何該技藝中所熟知的適當方法來改變，例如藉由將核酸併入細胞的基因體或藉由染色體外或基因體外的形式將其置入細胞內。在某些具體例中，可以改變細胞的核酸內含物而使得細胞暫時地表現感興趣的核酸，或可以改變核酸內含物而使得細胞穩定地表現感興趣的核酸。在某些具體例中，當細胞分裂時，在細胞的遺傳內含物方面的改變是遺傳的。
分離雙專一性抗原-結合蛋白
一旦依據此處的資訊而篩選出適當組合的修飾，嘗試使用該技藝中所熟知的方法來分離出雙專一性抗原-結合蛋白。僅只應用已公開的方法不見得在每個情況下都能提供令人滿意的分離。
Lindhofer等人製造出帶有異型二聚體重鏈的雙專一性抗體，一個重鏈結合蛋白A(小鼠IgG)而一個重鏈沒有(大鼠IgG)，並且成功地使用pH階梯梯度(由中性至pH 5.8以洗出同型二聚體且接著從5.8至3.5的pH階梯洗出小鼠/小鼠同型二聚體)從小鼠/小鼠以及大鼠/大鼠二聚體的四源雜交瘤混合物中分離出大鼠/小鼠異型二聚體雙專一性抗體(參見Lindhofer et al.(1995) Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas: Implications for a single-step purification of bispecific antibodies. J. Immunol. 155(1):219-225)。
當應用於將IgG1同型二聚體從具有2個相同但事實上1個IgG1 CH3領域含有H435R/Y436F雙肽修飾的IgG1重鏈的IgG1異型二聚體，Lindhofer的策略失敗了。發明人發現到，在線性pH梯度下，經雙肽修飾的IgG1在約pH 3.9處洗出，而IgG1同型二聚體在約pH 3.7處洗出。這個使用Lindhofer方法的pH差異被視為不足以令人滿意地將異型二聚體從同型二聚體中分離出來。差異可預期是無法再現的。
在採用維持特定pH階梯或梯度所必須之緩衝強度所提供的相對基本離子強度的層析運作時觀察到層析行為的變異。但是藉由加入有機修飾劑(1-丙醇)無法達到令人滿意的分離。取而代之的，有點令人驚訝的，就某些層析運作來說，加入0.5莫耳至1.0莫耳離子修飾劑(例如NaCl)戲劇性地並且出乎意料地提高同型二聚體IgG1以及異型二聚體IgG1的分離。添加離子修飾劑會擴大有關洗提的pH範圍(使用離子修飾劑的情況下1.2 pH單位，但是未使用離子修飾劑的情況下0.2 pH單位)，而使得pH階梯梯度可以成功地分離2個刑事。然而，在其他運作中使用僅約150 mM的NaCl濃度可以達到令人滿意的分離(參見實施例4)。為確保可以達到令人滿意的分離，在一個具體例中，在約0.5至約1.0莫耳離子修飾劑存在下完成分離雙一性抗體。
因此，在一個具體例中，一種用於分離含有異型二聚體IgG，其中一個鏈含有此處所述之修飾的雙專一性抗原-結合蛋白的方法包含有在有離子修飾劑存在下採用pH梯度的步驟。在一個具體例中，離子修飾劑以足以使IgG同型二聚體從蛋白質A撐體以及此處所述之IgG異型二聚體(亦即，帶有CH3修飾(等))洗出的pH差異達到最大的濃度存在。在一個特定具體例中，離子修飾劑以約0.5至約1.0莫耳的濃度存在。在另一個特定具體例中，離子修飾劑以約0.15至約0.5莫耳的濃度存在。
在一個具體例中，離子修飾劑是鹽類。在一個具體例中，離子修飾劑是鹼金屬或鹼土金屬以及鹵素的鹽類。在一個特定具體例中，鹽類是鹼金屬或鹼土金屬的氯鹽，例如NaCl、KCl、LiCl、CaCl2 、MgCl2 。在一個特定具體例中，鹽類以約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0的莫耳濃度存在。
在一個具體例中，pH梯度是從約pH 3.9至約pH 4.5，在另一個具體例中從約pH 4.0至約pH 4.4，以及在另一個具體例中約pH 4.1至約pH 4.3。在一個特定具體例中，該梯度是線性梯度。
在一個具體例中，pH梯度是階段梯度。在一個具體例中，該方法包含有將約pH 3.9、約pH 4.0、約pH 4.1、約pH 4.2、約pH 4.3或約pH 4.4的階梯施用於經校正的蛋白質A管柱(例如在PBS或另一種適當緩衝液或液體中校正)。在一個特定具體例中，該階梯約為pH 4.2。
在一個具體例中，包含有異型二聚體IgG CH3領域的雙專一性抗體以一或多個實質上沒有非異型二聚體IgG的分離部分從蛋白質A撐體中洗提出來。在一個特定具體例中，依據非異型二聚體抗體的重量，洗出的雙專一性抗體部分包含有少於約1%、0.5%或0.1%的總蛋白質。
 實施例
提出下列實施例來說明那些在該技藝中具有通常知識者如何做出以及使用本發明的方法以及組成物，且並非意欲要限定被發明人視為其發明的範疇。已盡力確保有關所用數字(例如數量、溫度等等)的精度，但應會產生某些實驗誤差以及偏差。除非另有指明，部分為以重量計的部分，分子量為平均分子量，溫度為攝氏溫度，而壓力為在大氣下或接近大氣。
實施例1：雙專一性IL-4Ra/IL-6Ra抗原-結合蛋白
發現到人類IgG1同型的2種已知抗體(一者對抗IL-4Ra，而一者對抗IL-6Ra)具有僅4個胺基酸有所差異的輕鏈。共表現實驗顯示，抗IL-4Ra抗體的輕鏈可使用來自於IL-6Ra的輕鏈予以置換並且對IL-4Ra仍保有著高親和力結合，因此使用抗IL-4Ra重鏈以及抗IL-6Ra重鏈與相同的輕鏈製造雙專一性抗體是可行的。因而，IL-6Ra抗體的重鏈被修飾成FcΔAdp形式(亦即，CH3雙肽修飾H95R/Y96F，按照IMGT外顯子標號)。
抗IL-6Ra輕鏈接著與抗IL-4Ra/Fc以及抗IL-6Ra/FcΔAdp重鏈在CHO細胞中一起共表現，且源自於這些細胞的條件培養基被拿來進行蛋白質A層析法。將蛋白質A管柱裝填入含有同型-以及異型二聚體之混合物的細胞上清液之後，使用兩種緩衝物變化組合所產生的pH階梯梯度(A：100 mM檸檬酸鈉、150 mM NaCl，pH 6.0，以及B：100 mM檸檬酸鈉、150 mM NaCl，pH 3.0；參見第4圖)來進行洗提，藉此分別在pH 6.0、pH 4.2以及pH 3.0產生3個相。在第4圖中，IL-4R表示抗-IL-4Ra，而IL-6RΔ表示抗IL-6Ra(IgG1ΔAdp)。所表示的柱部分是分析有關對IL-6Ra以及IL-4Ra蛋白質的結合(參見第5圖)。完成階梯洗提，在pH 4.2處洗提產生1個波峰，並且在pH 3.0處有第2個波峰(第4圖)。一如預期，BIACORETM 分析顯示溢流材料可結合可溶性IL-6Ra，而不是IL-4Ra(第5圖)。對應於pH 4.2波峰的部分可結合數量大致相同的IL-6Ra以及IL-4Ra，與異型二聚體相一致。在pH 3.0處洗出的波峰只能結合IL-4Ra，而不是IL-6Ra，對應於預期的抗-IL-4Ra同型二聚體。這證實異型二聚體雙專一性抗體可以使用蛋白質A層析法在簡單的pH階梯梯度下有效地分離出來。
實施例2：FcΔAdp蛋白質的藥物動力學
為了測試FcΔAdp修飾是否會影響含有異型二聚體Fc/FcΔAdp的分子的藥物動力學，將上述經純化的抗IL-4Ra/抗IL-6Ra同型二聚體形式注入小鼠體內，並且在28天的期間內測量人類免疫球蛋白在血清中的濃度(第6圖；表1)。異型二聚體的血清半衰期約為10天，類似於野生型的。這證實FcΔAdp修飾對血清半衰期沒有任何可偵測到的影響。
實施例3：雙專一性CD20/CD3抗原-結合蛋白
發現已知抗-人類CD20抗體的重鏈當與已知(活化)抗-人類CD3抗體的輕鏈一起共表現時，仍然能夠結合CD20。抗-CD3輕鏈接著與抗-CD20/Fc重鏈、抗-CD3/FcΔAdp或兩種重鏈一起共表現。所生成的同型-與異型二聚體的混合物接著使用於生物分析中以決定殺滅表現CD20之標的細胞的能力(第7圖)。簡言之，以6 x 107 個CD3xCD28珠粒(Invitrogen)活化2 x 107 人類PBMC細胞歷時72小時。接著加入30單位的IL-2(R & D Systems)並且額外培育細胞又24小時。接著將細胞分成濃度為0.5 x 106 /mL並且加入額外的30U IL-2。繼而額外培育細胞又48小時並且使用於生物分析。生物分析當天，2 x 106 /mL表現CD20之標的細胞(Raji)以8 μM鈣黃綠素-AM(Invitrogen)標記歷時30分鐘。將經洗滌之標的細胞以1：10標的：效應子細胞的比例加入至已活化hPBMC細胞(每孔220,000總細胞)(在含有抗體的上清液的指定體積的總體積為200微升中)。細胞培育歷時2小時且收集上清液並定量螢光。藉由計算特定螢光相對於最大螢光的比例來測量細胞毒性。單獨CD20抗體(使用抗-CD3輕鏈)或抗-CD3抗體都無法激起殺滅標的細胞；即使混合兩種試劑也沒有影響。但是，當全部3種構成要素共表現時，觀察到明顯殺滅，表示這個效用是因為異型二聚體雙專一性形式。依據雙專一性抗體在暫時轉染的CHO細胞上清液中的估算數量，有關這個效用的EC50 估算約為15 pM。
實施例4：使用經純化的雙專一性CD20/CD3抗原結合蛋白的細胞殺滅專一性
如實施例3中所述由轉染而來的CHO細胞上清液被進行蛋白質A親和力層析法，就洗提採用階梯梯度。階梯梯度是藉由改變兩種緩衝液的組合而產生(A：20 mM檸檬酸鈉、1 M NaCl，pH 5.2，以及B：20 mM檸檬酸鈉、1 M NaCl，pH 2.7)，藉此分別在pH 5.2、pH 4.2以及pH 2.8處產生3個相。來自於在pH 4.2處洗出的波峰的蛋白質接著使用於如實施例3中所述的細胞殺滅分析。在3 pM的EC50 下觀察到標的細胞殺滅(第8圖)。進行額外的細胞毒性分析，其檢驗所觀察到的殺滅之標的專一性。在這個實驗中，表現CD20(Raji)或沒有CD20(293)的標定標的細胞與活化的PBMCs一起培育。將各個標的細胞類型單獨或與其他類型的未標定標的細胞組合加入分析。在所有情況下，表現CD20之標的細胞以3 pM的EC50 被專一地殺滅，而CD20陰性細胞株沒有被殺滅。
實施例5：差異性修飾hIgG2Fc的蛋白質A分離
差異性修飾的異型二聚體人類IgG2 Fc/ΔAdpFc以及未修飾人類同型二聚體IgG2 Fc/Fc首先藉由結合-以及-洗滌步驟通過蛋白質A管柱A(rProtein A FF，GE)予以增富。為了從IgG2 Fc/Fc進一步分離出hIgG2 Fc/ΔAdpFc，在SMARTTM 系統(GE)中進行階梯梯度洗提如下。溶劑系統是由溶劑A(PBS，1X)、溶劑B(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl，pH 5.5)以及溶劑C(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl，pH 2.5)所構成。洗提始於在前20分鐘使用100% A等強度洗提，接而在20分鐘時快速切換為100% B。繼而在接下來10分鐘期間開始33.5% C以及66.5% B的線性梯度；維持濃度為33.5%的C歷時20分鐘直到第1個波峰(Fc/ΔAdpFc)完全洗出。接著從33.5% C到100% C的線性梯度歷時30分鐘。流速維持著250微升/分且在280 nM藉由UV偵測器偵測層析圖。在pH 4.5處洗出hIgG2 Fc/ΔAdpFc，而在pH 3.5處洗提出hIgG2。
實施例6：差異性修飾hIgG4 Fc的蛋白質A分離
差異性修飾的異型二聚體人類IgG4(Fc/ΔAdpFc)以及未修飾人類同型二聚體IgG2(Fc/Fc)首先藉由結合-以及-洗滌步驟通過蛋白質A管柱A(rProtein A FF，GE)予以增富。為了從hIgG2 Fc/Fc進一步分離出hIgG4 Fc/ΔAdpFc，在SMARTTM 系統(GE)中進行階梯梯度洗提如下。溶劑系統是由溶劑A(PBS，1X)、溶劑B(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl，pH 5.1)以及溶劑C(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl，pH 2.8)所構成。洗提始於在前20分鐘使用100% A等強度洗提，接而在20分鐘時快速切換為100% B。繼而在接下來10分鐘的期間開始50% C以及50% B的線性梯度；維持濃度為50%的C歷時20分鐘，直到第1個波峰(Fc/ΔAdpFc)完全洗出。接著從50% C到100% C的線性梯度歷時30分鐘。流速維持在250微升/分且在280 nM藉由UV偵測器偵測層析圖。在pH 4處洗出hIgG4 Fc/ΔdpFc，而從約pH4至pH 2.8的梯度間洗出同型二聚體。
實施例7：差異性修飾hIgG1 CD3xCD20的蛋白質A分離
在1 mL rProtein AFF(GE Biosciences)管柱上分離差異性修飾異型二聚體抗-hCD3xCD20 IgG1(Fc/ΔAdpFc)以及未修飾同型二聚體抗-hCD20如下。溶劑系統為緩衝液A1(PBS 1X)、緩衝液A2(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl pH 5.1)、緩衝液B(20 mM檸檬酸鈉以及1 M NaCl pH 2.8)。混合樣品被結合並且以PBS與緩衝液A2予以洗滌。使用階梯令pH達到4.2，其洗出雙專一性CD3*xCD20 IgG1(Fc/ΔAdpFc)，接著從pH 4.2至pH 2.8的線性梯度洗出同型二聚體抗-hCD20 IgG1。
實施例8：經修飾CH3s對Fc受體的結合親和力
在BiacoreTM 穩態平衡結合分析中測試具有ΔAdp修飾(H435R以及Y436F，EU編號)的人類IgG1同型雙專一性抗體對於不同人類Fc受體的結合親和力。
簡言之，使用具有胺偶合的抗-五-his mAb(Qiagen)之羧甲基化聚葡萄糖(CM5)晶片來捕獲人類Fc受體的各種建構物。下列his標定的Fc受體胞外領域被結合至不同抗-五-his包覆的CM5晶片表面：FcγRI、FcγRIIA(R131多形)、FcγRIIB與FcγRIIIB(各自在Regeneron製造)；以及FcγRIIA(H131多形)、FcγRIIIA(V176多形)與FcγRIIIA(F176多形)(各自在Regeneron製造)。抗體針對高親和力受體FcγR1胞外領域以3種濃度(25 nM、50 nM以及100 nM)通過表面，並且在介於5毫莫耳至39奈莫耳處針對低親和力FcγR受體胞外領域，且決定締和與解離速率常數(Ka 以及Kd )數值並用來計算有關抗體的平衡解離常數(KD s)。結合研究在室溫下使用HBS-T緩衝液於pH 7.2下進行。針對對照組抗體(貝伐珠單抗)、抗-CD20與抗-CD3Δdp修飾，以及CD20xCD3Δdp雙專一性抗體決定KD s。與未修飾hIgG1同型抗體相較之下，有關抗-CD3Δdp抗體的KD 數值顯示在結合至任何測試的Fc受體方面沒有明顯差異(表2)。
實施例9：雙專一性hIgG1ΔAdp在hFcRn小鼠體內的藥物動力學
在野生型(WT)小鼠以及就小鼠FcRn置換為hFcRn基因而為同型合子的小鼠(hFcRn小鼠)體內決定雙專一性抗-hCD3/hCD20 IgG1ΔAdp抗體及其抗體相關的對照組(抗-hCD3 IgG與抗-hCD3 IgGΔAdp同型二聚體)之藥物動力學廓清。野生型以及hFcRn小鼠是來自於含有背景的C57BL6(75%)與129Sv(25%)之雜交品系。同屬性群含有4個各別為WT或hFcRn小鼠，除了有一隻得到IgG1同型配對的對照組抗體的WT小鼠之同屬性群以外，其中該同屬性群有3隻小鼠。小鼠接受1 mg/kg的同型配對(hIgG1)對照組、抗hCD3xCD20 IgG1ΔAdp雙專一性、抗hCD3 IgG1或抗hCD3 IgG1ΔAdp同型二聚體。所有的測試品是皮下投藥。在0h、6h、1d、2d、3d、4d、7d、10d、14d、21d以及30d收集放血血液。
藉由三明治型ELISA決定人類抗體的血清位準。簡言之，山羊多株抗人類IgG(Fc-專一性)抗體(Jackson ImmunoResearch)以1微克/mL的濃度塗覆在96-孔培養盤中並且在4℃下培育過夜。培養盤在使用BSA予以阻斷之後，將呈6-劑量連續稀釋的血清樣品與呈-12劑量連續稀釋的個別抗體參考標準品加入至培養盤中並且在室溫下培育歷時1小時。在洗滌移除未連結的抗體之後，使用相同的山羊多株抗人類IgG(Fc專一性)抗體(綴合有辣根過氧化酶(HRP))(Jackson ImmunoResearch)偵測捕獲到的人類抗體，並且依據製造商的建議藉由標準比色四甲基聯苯胺(TMB)受質來顯影。在450 nm的吸光度紀錄於培養盤讀取儀且使用樣品培養盤中所產生的參考標準曲線計算血清樣品中的hIgG濃度。
在測試的30天期間內，就4種IgG1抗體的血清半衰期來說沒有觀察到顯著差異。特別地，在具有ΔAdp修飾的IgG1抗體以及野生型IgG1抗體之間沒有觀察到顯著差異。有關野生型(mFcRn)小鼠或帶有人類化FcRn(hFcRn)的小鼠，該等抗體之間沒有觀察到差異。一如預期，hFcRn小鼠展現出要比野生型小鼠略快的廓清。結果顯示於表3中。
實施例10：在低鹽緩衝液中的大規模分離
雙專一性CD3xCD20ΔAdp抗體是依據本發明而從大規模培養物中分離出來。簡言之，表現雙專一性抗-hCD3xCD20ΔAdp(在CD3重鏈上修飾)的CHO-K1細胞株培養在11公升的生物反應器中。帶有雙專一性抗體的細胞生長至約8.25 x 106 細胞/mL的密度，生成約250-350 mg抗體/L。相對地，對照組抗-hCD3抗體生成約100-150 mg/L。
在使用10 mM磷酸鈉、0.5 M NaCl，pH 7.2校正的MabSelect SuReTM 樹脂(GE)(20 cm床高，1 cm ID)上分離抗體，將清潔過的細胞培養物裝填至19 g/L，且該管柱以3倍管柱體積的10 mM磷酸鈉、0.5 M NaCl，pH 7.2洗滌，接著為2倍管柱的20 mM磷酸鈉，pH 7.2(無NaCl)洗滌。抗體是使用40 mM乙酸，pH 3.0洗出。
單專一性抗-CD30抗體在pH 3.6處洗出，而雙專一性抗hCD3xCD20Dadp在pH 4.4處洗出。
<110>　再生元醫藥公司
<120>　具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體
<130>　0890P
<140>　待指定
<141>　隨申請檢附
<150>　61/220,687
<151>　2009-06-26
<160>　7
<170>　FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>　1
<211>　107
<212>　PRT
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<212>　PRT
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<400>　7
第1圖例示說明3種雙專一性抗體形式：(A)雙專一性抗體銜接(BiTE)；(B)小鼠-大鼠雜交體；以及(C)具有1個共同輕鏈的洞中節。
第2圖例示說明FcΔAdp修飾：(A)人類IgG1的Fc區域(序列辨識編號：1)以及IgG3的Fc區域(序列辨識編號：3)的排列，顯示框出的FcΔAdp修飾；(B) FcΔAdp雙專一性抗體的概略代表圖。
第3圖例示說明IgG1、IgG2以及IgG4在有或沒有ΔAdp雙肽修飾的情況下與IgG3的人類CH3領域的排列(採用IMGT外顯子編號以及EU編號)。
第4圖顯示用於分離雙專一性抗體的蛋白質A管柱軌跡，顯示採用階梯梯度的洗提圖譜。
第5圖顯示由第4圖中所顯示之層析分離洗出的管柱分離部分的IL4-Ra以及IL-6Ra BIACORETM 結合圖譜。分離部分中的抗體被固定式抗Fc抗體所捕獲，且接著分析可溶性IL-4Ra或IL-6Ra對捕獲抗體的結合。
第6圖顯示FcΔAdp雙專一性抗體(IL-6RΔ/IL4-R)、FcΔAdp同型二聚體(IL-6RΔ/IL-6RΔ)、帶有野生型CH3序列的IgG1抗體(IL4-R/IL4-R)以及對照組單專一性抗體的藥物動力學圖譜。
第7圖例示說明CD20xCD3ΔAdp雙專一性抗體在Raji細胞殺滅分析中的效力。
第8圖例示說明使用CD20xCD3ΔAdp雙專一性抗體的旁觀者細胞(293)殺滅分析。

Claims (24)

  1. 一種雙專一性抗原-結合蛋白，其為對於蛋白質A結合為異型二聚體，其包含：(a)一第一多肽，其從N-端至C-端包含選擇性地結合第一抗原決定位的第一抗原-結合區域、包含選自於IgG1、IgG2以及IgG4之人類IgG的第一CH3區域的免疫球蛋白恒定區域，其中第一CH3區域結合至蛋白質A；以及(b)一第二多肽，其從N-端至C-端包含選擇性地結合第二抗原決定位的第二抗原結合區域、包含選自於IgG1、IgG2以及IgG4之人類IgG的第二CH3區域的免疫球蛋白恒定區域，其中該第二CH3區域包含一個會減低或消除該第二CH3區域結合至蛋白質A的修飾。
  2. 如申請專利範圍第1項的雙專一性蛋白，其中該第一多肽以及該第二多肽是人類IgG重鏈。
  3. 如申請專利範圍第1項的雙專一性蛋白，其進一步包含一免疫球蛋白輕鏈。
  4. 如申請專利範圍第3項的雙專一性蛋白，其中該免疫球蛋白輕鏈是人類免疫球蛋白輕鏈。
  5. 如申請專利範圍第1項的雙專一性蛋白，其中該第一以及第二多肽各自為人類IgG1重鏈。
  6. 如申請專利範圍第1項的雙專一性蛋白，其中該修飾是選自於由下列所構成之群組：按照IMGT外顯子編號系統為(a)H95R，以及(b)H95R與Y96F，或按照EU編號系統為 (a’)H435R，以及(b’)H435R與Y436F。
  7. 如申請專利範圍第6項的雙專一性蛋白，其進一步包含1至5個選自於由下列所構成之群組的修飾：按照IMGT外顯子編號系統為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I，或按照EU編號系統為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I。
  8. 如申請專利範圍第6項的雙專一性蛋白，其中該雙專一性抗體的CH3區域在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性的。
  9. 如申請專利範圍第7項的雙專一性蛋白，其中該雙專一性抗體的CH3區域在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性的。
  10. 一種用於製造雙專一性抗原-結合蛋白的方法，該抗體對於蛋白質A結合為異型二聚體，其包含：(a)培養細胞，該細胞含有：編碼第一免疫球蛋白重鏈的第一核酸序列，該第一免疫球蛋白重鏈包含辨識第一抗原決定位的第一可變領域，其中該第一免疫球蛋白重鏈包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG的第一CH3區域；編碼第二免疫球蛋白重鏈的第二核酸序列，該第二免疫球蛋白重鏈包含辨識第二抗原決定位的第二可變領域，其中該第二免疫球蛋白重鏈包含選自IgG1、IgG2及IgG4之人類IgG的第二CH3區域，且其中相較於第一CH3區域，該第二CH3區域包含一個消除或減低 該第二CH3區域結合至蛋白質A的修飾；編碼免疫球蛋白輕鏈的第三核酸序列，該免疫球蛋白輕鏈與該第一和第二免疫球蛋白重鏈配對；在允許該細胞表現該第一及第二重鏈及該免疫球白輕鏈之條件下，產生一雙專一性抗原-結合蛋白，其中該抗原-結合蛋白對於蛋白質A結合為異型二聚體(heterodimeric)；以及(b)收集包含該雙專一性抗原-結合蛋白之培養基。
  11. 如申請專利範圍第10項的方法，其中該修飾是選自於由下列所構成之群組：按照IMGT外顯子編號系統為(a)H95R，以及(b)H95R與Y96F，或按照EU編號系統為(a’)H435R，以及(b’)H435R與Y436F。
  12. 如申請專利範圍第11項的方法，其進一步包含1至5個選自於由下列所構成之群組的修飾：按照IMGT外顯子編號系統為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I，或按照EU編號系統為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I。
  13. 如申請專利範圍第11項的方法，其中該雙專一性抗體的CH3區域在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性的。
  14. 如申請專利範圍第12項的方法，其中該雙專一性抗體的CH3區域在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性的。
  15. 如申請專利範圍第10項的方法，其中該細胞係選自CHO細胞、COS細胞、293細胞、HeLa細胞、昆蟲細胞以及視網膜細胞。
  16. 如申請專利範圍第15項的方法，其中該細胞係為CHO細胞。
  17. 一種用於製造雙專一性抗原-結合蛋白的方法，該抗體對於蛋白質A結合為異型二聚體，其包含：從破裂的細胞或抗原-結合蛋白混合物中分離出包含具有差異性修飾IgG1、IgG2或IgG4 CH3領域的重鏈恆定區域之雙專一性抗原-結合蛋白，其中該差異性修飾IgG1、IgG2或IgG4 CH3領域係包含結合至蛋白質A的第一CH3區域及包含消除或減低該第二CH3區域結合至蛋白質A的修飾之第二CH3區域，其中該等差異性修飾的CH3領域在人類體內是非免疫性或實質上非免疫性的，且其中該雙專一性抗原-結合蛋白是依據對蛋白質A的親和力而從破裂的細胞或混合物中分離出來。
  18. 如申請專利範圍第17項的方法，其中該重鏈恆定區域的一個單體是人類IgG1，而該重鏈恆定區域的另一個單體是經修飾的人類IgG1，其包含於第二CH3區域內一個選自於由下列所構成之群組的修飾：按照IMGT外顯子編號系統為(a)H95R，以及(b)H95R與Y96F，或按照EU編號系統為(a’)H435R，以及(b’)H435R與Y436F。
  19. 如申請專利範圍第18項的方法，其中該經修飾的人類IgG1進一步包含於第二CH3區域內一個選自於由下列所構成之群組的修飾：按照IMGT外顯子編號系統為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I，或按照EU編號系統為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及 V422I。
  20. 如申請專利範圍第17項的方法，其中該混合物為培養基。
  21. 如申請專利範圍第17項的方法，其中該雙專一性抗原-結合蛋白係在包含蛋白質A的固體撐體上分離出來。
  22. 如申請專利範圍第21項的方法，其中該固體撐體包含蛋白質A親和力管柱，且該雙專一性抗原-結合蛋白是採用pH梯度而被分離出來。
  23. 如申請專利範圍第22項的方法，其中該pH梯度是包含一或多個介於pH 3與pH 5之pH階梯的階梯梯度。
  24. 如申請專利範圍第22項的方法，其中該pH梯度包括離子修飾劑。
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