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TW201919582A - 穩定化之抗體組合物及其製法 - Google Patents

穩定化之抗體組合物及其製法 Download PDF

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TW201919582A
TW201919582A TW107125081A TW107125081A TW201919582A TW 201919582 A TW201919582 A TW 201919582A TW 107125081 A TW107125081 A TW 107125081A TW 107125081 A TW107125081 A TW 107125081A TW 201919582 A TW201919582 A TW 201919582A
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oxygen
less
gas
recombinant protein
antigen
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TW107125081A
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曉林 湯
大衛 路德維格
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
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Abstract

本發明提供包括密封容器之藥品，所述密封容器含有諸如抗原結合蛋白之穩定液體重組蛋白的組合物及包括少於5%氧氣之頂部空間氣體；及其製造方法。因此，本發明提供一種用於控制密封容器中之藥品之頂部空間中的氧含量之方法，所述密封容器包括穩定液體重組蛋白組合物及包括少於21%氧氣之頂部空間氣體。

Description

穩定化之抗體組合物及其製法
本發明係關於液體抗體組合物及藉由最小化及/或控制容器之頂部空間中之氧化氣體的含量來製造此類組合物之方法，在所述容器中在投藥之前填充且儲存組合物。
持續研發包含單特異性及雙特異性抗體之抗體療法以用於治療多種疾病及病狀，包含治療癌症及自體免疫疾病。抗體效能已隨著針對特異性標靶之抗體分子之生產改良而增加。無論儲存在高濃度下用於小體積投藥或較低濃度下用於高效能療法，當填充於液體調配物中且儲存在諸如小瓶之藥品容器中且經由注射器給藥時，抗體分子可能易於發生氧化反應。因為人用藥物註冊技術要求國際協調會(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements For Registration of Pharmaceuticals For Human Use；ICH)強調維持穩定組合物以將由於氧化反應或其他降解過程而引起之生物活性劑之損失減到最少的重要性。根據ICH規格(Q6A及Q6B)，若原料藥不在特定調配物中及新型藥物應用中所建議之特定儲存條件下降解，如經由合適分析方法證明，則降解產物測試可能在法規機構批准後減少或去除。
本領域中已論述使用氮氣或惰性氣體(例如氬氣)置換藥品容器之頂部空間中之“空氣”。EP1174148論述製備濃度為2mg/ml之Fab片段組合物，其中各小瓶之氣體頂部空間在實驗室規模凍乾腔室(亦即不適用於良好作業規範(Good Manufacturing Practices；GMP)標準)中經由 重複循環用氮氣沖洗。EP1174148既未提及氮氣沖洗之後頂部空間氣體之氧濃度，亦未提供將頂部空間中之氧含量控制至預定目標含量之指導，但在加速的穩定性儲存條件(例如40℃下持續1個月)下觀測到高分子量(high molecular weight；HMW)雜質之存在之顯著百分比增加。在若干實例中，處於40℃下1個月之後HMW物種增加超過300%(表1)，而在40℃下儲存三個月產生HMW物種超過14倍之增加(表4)。類似地，US 2016/0129028論述使用氮氣覆疊方法維持多醣之穩定性，且US 2012/0183531論述使用氮氣或惰性氣體還原或置換蛋白質藥品之頂部空間中之氧氣以防止或抑制由於組胺酸緩衝液之氧化作用而引起之黃色形成。醫藥行業需要降低由於氧化作用而引起之藥品降解之發生率或影響的可靠方法。
在第一態樣中，本發明提供包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白(例如抗原結合蛋白或抗體)及包括氣體之頂部空間，其中氣體包括少於5體積%氧氣且重組蛋白儲存在45℃下時穩定至少28天之時段。在此情形下，穩定至少28天係指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過2%。
在一些情況下，氣體包括不超過2體積%氧氣、不超過1體積%氧氣、少於1體積%氧氣、或不超過0.1體積%氧氣。
在某些實施例中，藥品之液體調配物含有濃度在約2mg/ml與200mg/ml之間的重組蛋白(例如抗原結合蛋白)。在一些實施例中，藥品之液體調配物含有濃度在150-200mg/ml之間的重組蛋白(例如抗原結合蛋白)。在一些實施例中，藥品之液體調配物含有濃度小於10mg/ml、小於5mg/ml、或小於2mg/ml之重組蛋白(例如抗原結合蛋白)。
在一些實施例中，藥品含有儲存在45℃下時穩定至少三個月之時段的重組蛋白，其中穩定至少三個月係指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過10%。在一些情況下，重組蛋白之穩定性指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過5%、或高分子量物種之百分比歷經所述時段增加少於1%。
在另一態樣中，本發明提供包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白(例如抗原結合蛋白或抗體)及包括氣體之頂部空間，其中氣體包括少於1體積%氧氣且重組蛋白儲存在5℃下時穩定至少31個月之時段。在此情形下，穩定至少31個月指主要電荷變體物種之百分比歷經所述時段變化不超過10%。
在另一態樣中，本發明提供包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白(例如抗原結合蛋白)及包括氣體之頂部空間，其中氣體包括少於1體積%氧氣。在一些實施例中，氣體包括不超過0.1體積%氧氣。在一些實施例中，重組蛋白以小於5mg/ml之濃度存在於液體調配物中。在一些實施例中，重組蛋白以約2mg/ml之濃度存在於液體調配物中。在一些實施例中，重組蛋白以小於2mg/ml、約1.5mg/ml或約1mg/ml之濃度存在於液體調配物中。
在上文或本文中論述之藥品之各種實施例中，重組蛋白為抗原結合蛋白。在一些情況下，抗原結合蛋白為抗體。在一些情況下，抗體為單特異性抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些情況下，藥品容器為小瓶。在某些實施例中，小瓶包括塞子，諸如橡膠塞，所述塞子包括排氣柱。在一些情況下，藥品經由注射器進一步投與或轉移至注射器或注射裝置。
在另一態樣中，本發明提供在密封容器中製備藥品之方法，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白(例如抗原結合蛋白或抗體)及包括具有減少之氧含量之氣體的頂部空間，所述方法包括：(a)在大氣壓下將含有重組蛋白之液體調配物之一或多個容器裝載至真空腔室中；(b)在0.05巴至0.15巴之第一壓力下抽空腔室；(c)在800毫巴至1000毫巴之第二壓力下用非氧化氣體對腔室充氣；及(d)將一或多個容器密封在密封真空腔室內部，其中所述方法在15-25℃範圍內之溫度下進行，且密封容器包括具有少於5體積%氧氣之頂部空間氣體。
在一些實施例中，所述方法進一步包括在密封一或多個容器之前額外重複步驟(b)及(c)一或多次。
在一些情況下，第一壓力為約0.1巴，及/或第二壓力為0.2 巴至0.1巴或0.1巴至0.12巴。在一些實施例中，腔室中之壓力經由皮冉尼真空計(Pirani vacuum gauge)量測。在一些實施例中，溫度為約19℃。
在其他實施例中，在惰性氣體覆疊之前塞子可能被部分地塞住，隨後在惰性氣體覆疊製程之後完全塞住及密封。在一些情況下，密封容器包括具有少於2體積%氧氣、少於1體積%氧氣、或不超過0.1體積%氧氣之頂部空間氣體。
在一些實施例中，根據在上文或本文中論述之方法製備之藥品中的液體調配物含有濃度為2mg/ml至200mg/ml之重組蛋白。在其他實施例中，根據在上文或本文中論述之方法製備之藥品中的液體調配物含有濃度為150-200mg/ml之重組蛋白。在其他實施例中，根據在上文或本文中論述之方法製備之藥品中的液體調配物含有濃度為小於10mg/ml、小於5mg/ml、或小於2mg/ml之重組蛋白。
在上文或本文中論述之方法之各種實施例中，重組蛋白為抗原結合蛋白或抗體。在一些情況下，抗體為單特異性抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些情況下，用於本發明之方法中之藥品容器為小瓶。在其他實施例中，小瓶包括具有排氣柱之用於凍乾產品的橡膠塞(其在惰性氣體覆疊之前被部分塞住，隨後在惰性氣體覆疊製程之後被完全塞住及密封)。
在另一態樣中，本發明提供控制含有液體醫藥調配物之密封容器之頂部空間中的氧含量之方法，其中所述方法包括：(a)確定密封容器之頂部空間中之所需最終氧含量；(b)經由方程式(I)計算在第一氧氣還原循環之後的最終氧含量%：
其中%O2，起始為第一循環開始時的氧含量%，P真空為在第一氧氣還原循環中所施加之抽空壓力，P充氣為高於P真空但小於1巴之壓力，且%O2，結束為在第一循環結束時的氧含量%；(c)視情況將方程式(I)應用至其他循環，其中%O2，起始為在前一循環結束時之氧含量%，直至達至所需最終氧含量； 及(d)藉由以下在密封容器中製備藥品：(i)藉由以下進行一或多個氧氣還原循環：在P真空下抽空真空腔室中之非密封容器，其中P真空為0.05巴至0.15巴之壓力，及在800毫巴至1000毫巴之充氣壓力下用非氧化氣體對真空腔室中之非密封容器充氣；及(ii)將密封凍乾腔室內部的容器密封。
若藥品之頂部空間中之氧氣%的需求較低(例如低於約2%)，則進行多次氧氣還原循環以便達成氧含量之目標含量。使用相同真空壓力及充氣壓力進行多次氧氣還原循環之後的氧含量%經由等式(II)定義。
其中%O2，起始為第一循環開始時的氧含量%，P真空為在氧氣還原循環中所施加之抽空壓力，P充氣為利用惰性氣體充氣之壓力，且%O2，最終為在多次循環結束時的氧含量%；且n為施加於產品之總氧氣還原循環的數目。因此，獲得小瓶之頂部空間中之最終氧含量所需的氧氣還原循環之數目藉由求解方程式(II)獲得。
在上文或本文中論述之方法之各種實施例中，非氧化氣體選自由以下組成之群：氮氣、氬氣、氦氣、氙氣、氖氣、氪氣及氡氣。在一個實施例中，非氧化氣體為氮氣。在一個實施例中，非氧化氣體為氬氣。
在上文或本文中論述之各種實施例可以與本發明相一致之任何方式組合。其他實施例將自回顧隨後實施方式變得顯而易見。
圖1說明在儲存在5℃下31個月之後，藉由CEX-UPLC獲得之主要電荷變體物種隨雙特異性抗體之液體調配物之氧氣頂部空間含量而變的%變化。
圖2說明使用根據本文所論述之方法之氮氣覆疊儲存在45℃下28天之後，高分子量物種隨雙特異性抗體之液體調配物之氧氣頂部空間含量而變的%增加。
圖3說明使用根據本文所論述之方法之氮氣覆疊儲存在45℃下3個月之後，高分子量物種隨雙特異性抗體之液體調配物之氧氣頂部空間含量而變的%增加。
圖4說明使用根據本文所論述之方法之氬氣覆疊儲存在45℃下3個月之後，高分子量物種隨雙特異性抗體之液體調配物之氧氣頂部空間含量而變的%增加。
在描述本發明之前，應理解，本發明不限於描述之特定方法及實驗條件，因為此類方法及條件可變化。亦應瞭解，本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而並不意欲限制本發明之範疇，因為本發明之範疇將僅由隨附申請專利範圍限制。
除非另外規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之本領域的技術人員通常所理解相同之含義。如本文所用，當參考特定敘述數值使用時，術語「約」意謂值可在敘述值不超過1%之範圍內變化。舉例而言，如本文所用，表述「約100」包含99及101及兩者之間的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然類似或等效於本文所述之方法及材料的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現對較佳方法及材料加以描述。本說明書中提及之所有專利、申請案、非專利公開案均以全文引用的方式併入本文中。
定義
如本文所用之術語「重組蛋白」意欲包含藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有蛋白質，諸如使用轉染至宿主細胞之重組表現載體表現之蛋白質。
術語「抗原結合分子」或「抗原結合蛋白」包含抗體及抗體之抗原結合片段，包含例如單特異性及雙特異性抗體。
如本文所用之術語「抗體」意謂包括特異性結合於特定抗原或與特定抗原相互作用之至少一種互補決定區(complementarity determining region；CDR)的任何抗原結合分子或分子複合體。術語「抗體」包含免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包括四個多肽鏈、藉由二硫鍵互連之兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包括重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包括輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域(CL1)。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明之不同實施例中，抗體(或其抗原結合片段)之FR可與人類生殖系序列一致或可經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可基於兩個或更多個CDR之並列分析定義。
如本文所用，術語「抗體」亦包含完整抗體分子之抗原結合片段。如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及其類似者包含特異性結合抗原以形成複合體之任何天然存在、以酶方式可獲得之合成或基因工程改造多肽或醣蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合之標準技術衍生自例如完整抗體分子，所述技術諸如涉及編碼抗體可變域及視情況存在之恆定域之DNA之操縱及表現的蛋白水解消化或重組基因工程改造技術。此類DNA為已知的及/或易於購自例如商業來源、DNA程式庫(包含例如噬菌體-抗體程式庫)，或可合成。DNA可以化學方式或藉由使用分子生物學技術定序及操縱，例如以將一或多個可變域及/或恆定域配置為適合之組態，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或缺失胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體之高變區(例如經分離互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽之胺基酸殘基組成之最小識別單位。其他經工程改造之分子，諸如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域缺失抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、 四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模塊免疫藥物(small modular immunopharmaceutical；SMIP)及鯊魚可變IgNAR結構域亦涵蓋在如本文所用之表述「抗原結合片段」內。
抗體之抗原結合片段通常將包括至少一個可變域。可變域可為任何尺寸或胺基酸組成且一般將包括與一或多個構架序列相鄰或同框之至少一個CDR。在具有與VL域相關聯之VH域的抗原結合片段中，VH及VL域可以任何適合之配置相對於彼此定位。舉例而言，可變區可為二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。可替代地，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個共價連接至至少一個恆定域之可變域。可發現於本發明之抗體之抗原結合片段內的可變及恆定域之非限制性示例性配置包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在可變域及恆定域之任何組態，包含以上列出之例示性組態中之任一者中，可變域及恆定域可直接彼此連接或可藉由完全或部分鉸鏈區或連接區連接。鉸鏈區可由至少2個(例如5個、10個、15個、20個、40個、60個或更多個)胺基酸組成，所述胺基酸在單個多肽分子中之相鄰可變域及/或恆定域之間產生撓性或半撓性鍵此外，本發明之抗體之抗原結合片段可包括彼此及/或與一或多個單體VH或VL域(例如藉由二硫鍵)非共價締合之上文所列之可變域及恆定域組態中的任一者之均二聚體或雜二聚體(或其他多聚體)。
如同完整抗體分子，抗原結合片段可為單特異性或多特異性的(例如雙特異性的)。抗體之多特異性抗原結合片段將通常包括至少兩個不同可變域，其中各可變域能夠特異性結合於獨立抗原或相同抗原上之不同抗原決定基。任何多特異性抗體型式，包含本文所揭示之例示性雙特異性抗體型式可使用本領域中可用之慣例技術而適用於本發明抗體之抗原結合片段的情況下。
如本文所用之術語「人類抗體」意欲包含具有衍生自人類生 殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。本發明之人類抗體可包含並非由例如CDR且尤其CDR3中之人類生殖系免疫球蛋白序列(例如藉由活體外無規或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)編碼之胺基酸殘基。然而，如本文所用之術語「人類抗體」不意欲包含來源於另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
本發明之抗體在一些實施例中可為重組人類抗體。如本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包含藉由重組手段製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞之重組表現載體表現之抗體(下文進一步描述)；自重組組合人類抗體程式庫分離之抗體(下文進一步描述)；為人類免疫球蛋白基因之轉殖基因之自動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor等人(1992)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20：6287-6295)或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他手段製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然衍生自且關於人類生殖系VH及VL序列，但該等胺基酸序列可為並非活體內天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內之序列。
人類抗體可以與鉸鏈異質性相關之兩種形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包括大致150-160kDa之穩定四鏈構築體，其中二聚體藉由鏈間重鏈二硫鍵固持在一起。在第二形式中，二聚體不經由鏈間二硫鍵連接且形成由共價耦合輕鏈及重鏈組成的約75-80kDa之分子(半抗體)。此等形式極難分離，甚至在親和純化之後亦如此。
第二形式於各種完整IgG同型中之出現頻率係歸因於(但不限於)與抗體之鉸鏈區同型相關之結構差異。人類lgG4鉸鏈之鉸鏈區中之單一胺基酸取代可將第二形式之出現顯著減少(Angal等人(1993)《分子免疫學(Molecular Immunology)》30：105)至通常使用人類lgG1鉸鏈觀測之水準。本發明涵蓋在鉸鏈、CH2或CH3區中具有一或多個突變之抗體， 例如期望產生所述抗體以提高所需抗體形式之產率。
本發明之抗體可為分離抗體。如本文所用之「分離抗體」意謂經鑑別且自其天然環境之至少一種組分分離及/或回收之抗體。舉例而言，自生物體之至少一種組分、或自其中抗體天然存在或天然產生之組織或細胞分離或去除之抗體出於本發明之目的為「分離抗體」。分離抗體亦包含重組細胞內之原位抗體。分離抗體為已經受至少一個純化或分離步驟之抗體。根據某些實施例，分離抗體可基本上不含其他細胞材料及/或化學物質。
本發明亦包含結合特異性抗原之單臂抗體。如本文所用，「單臂抗體」意謂包括單個抗體重鏈及單個抗體輕鏈之抗原結合分子。
術語「抗原決定基」指代與稱為互補位之抗體分子之可變區中的特異性抗原結合位點相互作用之抗原決定子。單一抗原可具有超過一個抗原決定基。因此，不同抗體可結合至抗原上之不同區域且可具有不同生物效果。抗原決定基可為構形或線性的。構形抗原決定基由來自線性多肽鏈之不同區段之空間並列胺基酸產生。線性抗原決定基為由多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基產生之抗原決定基。在某些情況下，抗原決定基可包含抗原上之醣類、磷醯基或磺醯基部分。
當參考核酸或其片段時，術語「大體一致性」或「大體上一致」指示當與經另一核酸(或其互補鏈)之適當核苷酸插入或缺失最佳比對時，在至少約95%，且更佳至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基中存在核苷酸序列一致性，如藉由序列一致性之任何熟知算法，諸如FASTA、BLAST或Gap所量測，如下文所論述。與參考核酸分子具有大體一致性之核酸分子可在某些情況下編碼與藉由參考核酸分子編碼之多肽具有相同或大體類似胺基酸序列之多肽。
如應用於多肽，術語「大體類似性」或「大體上類似」意謂兩個肽序列在諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用默認空位權重最佳比對時，具有至少95%序列一致性，甚至更佳至少98%或99%序列一致性。不一致殘基位置之差異較佳為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有具有相似化學特性(例如電荷或疏水性)之側鏈之 另一胺基酸殘基(R基團)取代的一者。一般而言，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能特性。在其中兩個或超過兩個胺基酸序列彼此間差異為保守性取代的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。進行此調節的手段為本領域的技術人員所熟知。參見例如Pearson(1994)《分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)》24：307-331，其以引用之方式併入本文中。含有具有類似化學特性之側鏈的胺基酸之群之實例包含(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸，及(7)含硫側鏈為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸鹽-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。可替代地，保守性置換為在以引用之方式併入本文中之Gonnet等人(1992)《科學(Science)》256：1443-1445中所揭示的PAM250對數似然性矩陣中具有正值之任何變化。「適度保守」置換為在PAM250對數似然性矩陣中具有非負值之任何變化。
通常使用序列分析軟體來量測多肽之序列相似性，其亦稱為序列一致性。蛋白質分析軟體使用分配於各種取代、缺失及其他修飾，包含保守胺基酸取代之類似性的量度來匹配類似序列。舉例而言，GCG軟體含有諸如Gap及Bestfit之程式，其可在預設參數下使用以測定密切相關之多肽，諸如來自生物體之不同物種的同源多肽之間，或野生型蛋白與其突變蛋白之間的序列同源性或序列一致性。參見例如GCG版本6.1。亦可使用使用預設或推薦參數之FASTA，GCG版本6.1之程式來比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與檢索序列之間的最佳重疊區域之比對及序列一致性百分比(Pearson(2000)見上文)。當比較本發明序列與含有來自不同生物體之大量序列之資料庫時，另一較佳算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，尤其為BLASTP或TBLASTN。參見例如Altschul等人(1990)《分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)》215：403-410及Altschul等人(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25：3389-402，其各 自以引用之方式併入本文中。
包括重組蛋白之藥品及組合物
本發明之藥品包括密封容器(例如小瓶)，在所述密封容器中，頂部空間中之氣體相比於氧化氣體之大氣壓濃度具有降低之氧化氣體(例如氧氣)之濃度。本發明之藥品係基於發明人之發現：一種用於減少藥品容器之頂部空間中之氧化氣體的含量之方法，所述藥品容器含有重組蛋白(例如抗原結合蛋白或抗體)之液體醫藥調配物。相比於標準凍乾技術，液體組合物上方頂部空間氣體之抽空及充氣需要精細控制真空腔室中之壓力以便最少化或消除液體組合物之鼓泡或噴濺，此可導致材料之損失或蒸發，從而可導致活性劑(例如抗體)濃度之變化。材料損失或濃度變化對於其中活性劑以低濃度(例如約2mg/ml)存在之高效能組合物而言尤其難以解決。高濃度調配物之穩定性變化為難以解決的，因為氧化降解產品可產生複雜的純度/雜質圖譜，從而可能引起免疫原性問題。
本發明之藥品在一些實施例中可含有具有少於5體積%氧化氣體(例如氧氣)之頂部空間氣體。藥品容器之頂部空間中之氧化氣體(例如氧氣)的濃度在各種實施例中可小於4.5%、小於4%、小於3.5%、小於3%、小於2.5%、小於2%、或小於1.5%。在一個實施例中，頂部空間中之氧化氣體(例如氧氣)之濃度小於約1%。在一個實施例中，頂部空間中之氧化氣體(例如氧氣)之濃度不超過約0.5%。在一個實施例中，頂部空間中之氧化氣體(例如氧氣)之濃度不超過約0.1%。在各種實施例中，藥品容器之頂部空間中之氧化氣體(例如氧氣)的濃度小於0.9%、小於0.8%、小於0.7%、小於0.6%、小於0.5%、小於0.4%、小於0.3%、小於0.2%、或小於0.1%。在一些情況下，頂部空間氣體中之氧氣濃度為約0.01%至約1.5%。在一些情況下，頂部空間氣體中之氧氣濃度為約0.75%至約1.25%。在一些情況下，頂部空間氣體中之氧氣濃度為約0.05%至約0.15%。
本文所描述之容器可為具有容納所需量之醫藥調配物及頂部空間之足夠體積的小瓶、燒瓶等。容器可由多種合適材料形成，所述材料相對於待含之醫藥調配物展現惰性特徵，且足以不可滲透以防止醫藥調配物之滲漏或環境空氣之滲透。例示性材料包含玻璃(例如聚碳酸酯聚苯 乙烯聚丙烯玻璃)、聚合物(例如塑料、鉑固化聚矽氧管)及金屬(例如不鏽鋼316L)。在一些實施例中，容器為1型玻璃瓶。另外，容器可經組態為可再用組件、或單一用途拋棄性組件，如所需要。具有排氣柱之橡膠塞之多個設計為可用的且適合於與經調適用於本文所描述之方法之凍乾小瓶一起使用。包括一個排氣柱(單個排氣孔)、『兩柱』(兩個排氣點)、『三柱』(三個排氣點)及十字形(四個排氣點)或甚至更多排氣孔之塞子為可商購的。用於凍乾腔室中之小瓶之塞子可被在氣體覆疊/氧氣還原過程期間對外部開放之排氣孔部分塞住，且隨後在一或多個氧氣還原循環之後與容器相連被完全塞住及密封。
本發明之藥品包含液體醫藥組合物，所述液體醫藥組合物包括本發明之抗原結合分子(例如抗體)。本發明之醫藥組合物係藉由適合之載劑、賦形劑及提供改良之轉移、遞送、耐受性及其類似性質之其他藥劑調配。眾多適當調配物可發現於所有醫藥化學家已知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中。舉例而言，賦形劑可包含穩定劑、緩衝液、張力劑、表面活性劑、有機溶劑、鹽或其組合。在一些實施例中，穩定劑選自由以下組成之群：多元醇、糖、胺基酸、非離子界面活性劑及其組合。在一些實施例中，張力劑選自由以下組成之群：糖、胺基酸、鹽及其組合。在一些實施例中，緩衝液選自由以下組成之群：組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽及其組合。
液體組合物中之抗原結合分子(例如抗體)之濃度可視分子效能及待自藥品容器投與之劑量而變化。在一些情況下，濃度可在約1mg/ml至約200mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約1mg/ml至約10mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約1mg/ml至約5mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約0.1mg/ml至約2mg/ml之範圍內。在各種實施例中，濃度小於約25mg/ml、小於約20mg/ml、小於約15mg/ml、小於約10mg/ml、或小於約5mg/ml。在各種實施例中，液體組合物中之抗原結合分子之濃度不超過約5mg/ml、不超過約4mg/ml、不超過約3mg/ml、不超過約2mg/ml、或不超過約1mg/ml。在一個實施例中，濃度小於約2 mg/ml。在一個實施例中，濃度小於約1mg/ml。
液體組合物中之抗原結合分子(例如抗體)之濃度可視體積及待自藥品容器投與之劑量而變化。在一些情況下，濃度可在約1mg/ml至約200mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約10mg/ml至約200mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約50mg/ml至約100mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約100mg/ml至約150mg/ml之範圍內。在一些情況下，濃度可在約150mg/ml至約200mg/ml之範圍內。在一個實施例中，濃度大於約10mg/ml。在另一實施例中，濃度大於約50mg/ml。在另一實施例中，濃度小於約100mg/ml。在一個實施例中，濃度大於約150mg/ml。
向患者投與之抗原結合分子之劑量可視患者之年齡及身高、目標疾病、病狀、投藥途徑及類似者而變化。較佳劑量通常根據體重或體表面積計算。當本發明之抗原結合分子用於成人患者中之治療目的時，可有利的為通常以約0.01至約20毫克/公斤體重、更佳約0.02至約7毫克/公斤體重、約0.03至約5毫克/公斤體重、或約0.05至約3毫克/公斤體重之單次劑量靜脈內投與本發明之抗原結合分子。視病狀之嚴重程度而定，可調整治療之頻率及持續時間。用於投與抗原結合分子之有效劑量及排程可憑經驗確定；舉例而言，患者進展可藉由週期性評估監測且因此調節劑量。此外，可使用本領域中之熟知方法(例如Mordenti等人，1991，《醫藥研究(Pharmaceut.Res.)》8：1351)進行劑量之種間按比例調整。
本發明之醫藥組合物可用標準針頭及注射器皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆式遞送裝置易於在遞送本發明之醫藥組合物時應用。此類筆式遞送裝置可為可再用的或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置通常利用含有醫藥組合物之可替換套筒。在已投與套筒內之所有醫藥組合物且套筒為空的後，可容易地丟棄空套筒且用含有醫藥組合物之新套筒替換。隨後可再使用筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可替換套筒。實際上，拋棄式筆式遞送裝置用容納在該裝置內之儲集器中的醫藥組合物預填充。一旦清空儲集器之醫藥組合物，即棄去整個裝置。
可注射製劑可包含用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、 滴液輸液等之劑型。此等可注射製劑可藉由公開已知之方法製備。舉例而言，可注射製劑可在習知地用於注射之無菌水性介質中製備。作為用於注射之水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他輔助劑之等滲溶液等，其可與諸如醇(例如乙醇)之適當增溶劑、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。因此製備之注射液可填充於或轉移至適當容器或裝置(例如安瓿、注射器、注射裝置或筆式)。
抗原結合分子之穩定性
本發明之藥品容器之頂部空間中的氧化氣體(例如氧氣)之量之減少有利地影響在容器內之液體組合物中調配之抗原結合分子之穩定性。氧化為包含抗體及雙特異性抗原結合分子之蛋白質療法之主要降解路徑。在活性物質之任何損失對定義時段之儲存之後組合物中殘存之活性劑之量有不成比例地較大影響時，此類降解之影響在低濃度下顯著。此類降解之表現包含高分子量(HMW)物種之增加及電荷變體物種之百分比之變化。HMW物種之數量或百分比變化可使用本領域中已知之標準尺寸排阻層析技術偵測(例如Lu等人，MAbs,5(1)：102-113,2013)。電荷變體物種之數量或百分比變化可使用本領域中已知之標準陽離子交換層析技術偵測(例如Chumsae等人，《色譜雜誌B(Journal of Chromatography B)》,850：285-294,2007)。本發明之藥品中之抗原結合分子的穩定性可藉由量測HMW或電荷變體物種之數量或百分比隨對應於特定儲存條件之時間及溫度參數而變之變化來確定。在一些情況下，儲存條件可與藥品一般將在製造與使用之間維持所處於的彼等條件下相當。在其他情況下，儲存條件可為意欲獲得在較短時間週期中之較長期穩定性之指示的加速條件。
在本發明之組合物之各種實施例中，抗原結合分子(例如抗體)在儲存於45℃下時保持穩定歷經至少28天之時段。在此情形下，穩定性可例如指代HMW物種之百分比歷經所述儲存時段增加不超過約2%。在一些情況下，HMW物種之增加百分比歷經儲存時段不超過約1.5%、或不超過約1%。在一些情況下，抗原結合分子在儲存於45℃下時保持穩定歷經至少三個月之時段。在此等較長儲存條件下，穩定性可例如指代HMW物 種歷經儲存時段增加不超過約10%。在一些情況下，在此等較長儲存條件下之穩定性可指代歷經儲存時段HMW物種增加不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約2%、或不超過約1%。在其他實施例中，抗原結合分子(例如抗體)在儲存於5℃下時保持穩定歷經至少31個月之時段。在此情形下，穩定性可例如指代歷經儲存時段電荷變體物種之百分比變化不超過10%。在一些情況下，儲存時段可為12個月、18個月、24個月、30個月或36個月。
在整個製造特定治療蛋白產品之過程中，某些產品品質屬性可基於其潛在的臨床影響鑑別。相關品質屬性依據其對純度、安全性及/或功效之潛在影響可認為係重要的品質屬性(critical quality attributes；CQA)。高分子量(HMW)物種及電荷變體僅為可在製造過程期間變化之許多產品CQA中之兩種。針對在製造過程期間此等品質屬性之變化監測蛋白質，包含在將產品填充至容器之後及容器儲存期間。藥品對氧化敏感指代產品之CQA變化由於可影響產品之純度、安全性及/或功效之上升的氧化程度而高於或低於所述特定CQA之臨限值。藥品對氧化敏感亦指代產品變化由於提高的氧化程度可影響產品之純度、安全性及/或功效。
在一些情況下，穩定性可指代高於或低於預定臨限值之產品CQA之變化可影響產品之純度、安全性及/或功效。
抗原結合分子之結合特性
如本文所用，在抗原結合分子、抗體、免疫球蛋白、抗體結合片段、或含Fc蛋白與例如預定抗原(諸如細胞表面蛋白或其片段)之結合的情形下之術語「結合」通常指代最小的兩種實體或分子結構之間的相互作用或締合，諸如抗體-抗原相互作用。
舉例而言，當使用抗原作為配位體且抗體、Ig、抗體結合片段或含Fc蛋白作為分析物(抗配位體)藉由例如表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)技術在BIAcore 3000儀器中測定時，結合親和力通常對應於約10-7M或更小、諸如約10-8M或更小、諸如約10-9M或更小之KD值。亦常規地使用基於細胞之結合策略，諸如螢光活化細胞分選(fluorescent-activated cell sorting；FACS)結合分析，且FACS資料與其他 方法，諸如放射性配位體競爭結合及SPR密切相關(Benedict,CA,《免疫法雜誌(J Immunol Methods)》.1997,201(2)：223-31；Geuijen,CA等人《免疫法雜誌》.2005,302(1-2)：68-77)。
因此，本發明之抗體或抗原結合蛋白與親和力對應於比其用於與非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結合之親和力低至少十倍之KD值的預定抗原或細胞表面分子(受體)結合。根據本發明，對應於等於或小於比非特異性抗原低十倍之KD值之KD值的抗體之親和力可認為係不可偵測結合，然而，此類抗體可與第二抗原結合臂成對以用於產生本發明之雙特異性抗體。
術語「KD」(M)指代特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數，或與抗原結合之抗體或抗體結合片段之解離平衡常數。KD與結合親和力之間存在相反關係，因此KD值愈小，親和力愈高，亦即愈強。因此，術語「較高的親和力」或「較強的親和力」係關於形成相互作用之較高能力且因此較小之KD值，且相反地術語「較低的親和力」或「較弱的親和力」涉及形成相互作用之較低能力且因此較大的KD值。在某些情況下，相比於分子(例如抗體)與另一相互作用搭配物分子(例如抗原Y)之結合親和力，特定分子(例如抗體)與其相互作用搭配物分子(例如抗原X)之較高結合親和力(或KD)可表述為藉由使較大KD值(較低、或較弱親和力)除以較小KD(較高、或較強親和力)確定之結合比，例如視具體情況表述為大5倍或10倍之結合親和力。
術語「kd」(sec-1或1/s)指代特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數，或抗體或抗體結合片段之解離速率常數。該值也稱為koff值。
術語「ka」(M-1×sec-1或1/M)指代特定抗體-抗原相互作用之結合速率常數，或抗體或抗體結合片段之結合速率常數。
術語「KA」(M-1或1/M)指代特定抗體-抗原相互作用之結合平衡常數，或抗體或抗體結合片段之結合平衡常數。結合平衡常數藉由使ka除以kd獲得。
術語「EC50」或「EC50」指代半數最大有效濃度，其包含在指定暴露時間之後誘導基線與最大值之間的半途響應之抗體濃度。EC50本 質上代表其中觀測到其最大效果之50%的抗體濃度。在某些實施例中，EC50值等於提供與表現CD3或腫瘤相關抗原之細胞半最大結合之本發明抗體的濃度，如藉由例如FACS結合分析所測定。因此，用增加的EC50，或半數最大有效濃度值觀測到降低或較弱之結合。
在一個實施例中，降低之結合可定義為能夠實現與半最大量之靶細胞結合之增加的EC50抗體濃度。
在另一實施例中，EC50值代表藉由T細胞細胞毒活性引發靶細胞之半最大耗盡之本發明抗體的濃度。因此，用降低之EC50，或半數最大有效濃度值觀測到增加的細胞毒活性(例如T細胞介導之腫瘤細胞殺滅)。
雙特異性抗原結合分子
本發明之抗原結合分子，例如抗體可為單特異性的、雙特異性的或多特異性的。多特異性抗體可對一種靶多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對超過一種靶多肽具有特異性之抗原結合域。參見例如Tutt等人，1991，《免疫學雜誌(J.Immunol.)》147：60-69；Kufer等人，2004，《生物技術動向(Trends Biotechnol.)》22：238-244。本發明之抗體可連接至其他功能性分子(例如其他肽或蛋白)或與其他功能性分子共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體或抗體片段以產生具有第二或其他結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。
如本文所用，表述「抗原結合分子」意謂包括或由至少一個互補決定區(CDR)組成之蛋白質、多肽或分子複合物，所述互補決定區單獨或與一或多個其他CDR及/或構架區(FR)組合特異性結合於特定抗原。在某些實施例中，抗原結合分子為抗體或抗體片段，如本文中其他地方所定義之彼等術語。
如本文所用，表述「雙特異性抗原結合分子」意謂包括至少第一抗原結合域及第二抗原結合域之蛋白質、多肽或分子複合物。雙特異性抗原結合分子內之各抗原結合結構域包括單獨、或與一或多個其他CDR及/或FR組合特異性結合於特定抗原之至少一個CDR。
在本發明之某些例示性實施例中，雙特異性抗原結合分子為 雙特異性抗體。雙特異性抗體之各抗原結合結構域包括重鏈可變域(HCVR)及輕鏈可變域(LCVR)。在包括第一及第二抗原結合域之雙特異性抗原結合分子(例如雙特異性抗體)的情形下，第一抗原結合域之CDR可以前綴「A1」指定且第二抗原結合域之CDR可以前綴「A2」指定。因此，第一抗原結合域之CDR在本文中可被稱作A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；且第二抗原結合域之CDR在本文中可被稱作A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。
第一抗原結合域及第二抗原結合域可直接地或間接地彼此連接以形成本發明之雙特異性抗原結合分子。可替代地，第一抗原結合域及第二抗原結合域可各自連接以分離多聚化結構域。一個多聚化結構域與另一多聚化結構域之締合促進兩個抗原結合域之間的締合，進而形成雙特異性抗原結合分子。如本文所用，「多聚化結構域」為能夠與相同或相似結構或構成之第二多聚化結構域締合之任何大分子、蛋白質、多肽、肽或胺基酸。舉例而言，多聚化結構域可為包括免疫球蛋白CH3結構域之多肽。多聚化組分之非限制性實例為免疫球蛋白之Fc部分(包括CH2-CH3結構域)，例如選自同型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4以及各同型群組內之任何同種異型之IgG的Fc結構域。
本發明之雙特異性抗原結合分子將通常包括兩個多聚化結構域，例如兩個各自單獨地為分離抗體重鏈之部分之Fc結構域。第一及第二多聚化結構域可具有相同IgG同型，諸如IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。可替代地，第一及第二多聚化結構域可具有不同IgG同型，諸如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些實施例中，多聚化結構域為含有至少一個半胱胺酸殘基之1至約200個胺基酸長之Fc片段或胺基酸序列。在其他實施例中，多聚化結構域為半胱胺酸殘基、或含半胱胺酸短肽。其他多聚化結構域包含肽或多肽，所述肽或多肽包括或由白胺酸拉鏈、螺旋環圈基元、或捲曲螺旋基元組成。
任何雙特異性抗體形式或技術均可用於製備本發明之雙特異性抗原結合分子。舉例而言，具有第一抗原結合特異性之抗體或其片段 可功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如具有第二抗原結合特異性之另一抗體或抗體片段，以產生雙特異性抗原結合分子。可用於本發明之情形下之特定例示性雙特異性型式包含但不限於例如基於scFv或雙功能抗體雙特異性型式、IgG-scFv融合體、雙重可變域(DVD)-lg、四源雜交瘤(Quadroma)、臼包杵、常見輕鏈(例如具有臼包杵之常見輕鏈等)、互換Mab、互換Fab、(SEED)體、白胺酸拉鏈、Duobody、lgG1/lgG2、雙重作用Fab(DAF)-lgG及Mab2雙特異性型式(關於前述型式之綜述，參見例如Klein等人2012,mAbs 4：6,1-11，及其中所引用之參考文獻)。
在本發明之雙特異性抗原結合分子的情形下，多聚化結構域，例如Fc結構域相比於Fc結構域之野生型、天然存在之版本可包括一或多個胺基酸變化(例如插入、缺失或取代)。舉例而言，本發明包含雙特異性抗原結合分子，所述雙特異性抗原結合分子包括Fc結構域中之一或多個修飾，所述修飾產生在Fc與FcRn之間具有經修飾之結合相互作用(例如提高或降低)的經修飾之Fc結構域。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包括CH2或CH3區中之修飾，其中修飾增加酸性環境(例如其中pH值在約5.5至約6.0範圍內之核內體)中之Fc結構域與FcRn之親和力。此類Fc修飾之非限制性實例包含例如以下位置處之修飾：250(例如E或Q)、250及428(例如L或F)、252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)；或以下位置處之修飾：428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)；或位置250及/或428處之修飾；或位置307或308及434處之修飾(例如308F、V308F)。在一個實施例中，修飾包括428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)及308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修飾；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)。
本發明亦包含包括第一CH3結構域及第二Ig CH3結構域之雙特異性抗原結合分子，其中第一及第二Ig CH3結構域彼此差異為至少一個 胺基酸，且其中至少一個胺基酸差異相比於缺乏胺基酸差異之雙特異性抗體降低雙特異性抗體與蛋白A之結合。在一個實施例中，第一Ig CH3結構域結合蛋白A且第二Ig CH3結構域含有減小或消除蛋白A結合之突變，諸如H95R修飾(藉由IMGT外顯子編號；H435R藉由EU編號)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(藉由IMGT；Y436F藉由EU)。參見例如美國專利第8,586,713號。可發現於第二CH3內之其他修飾在IgG1抗體之情形下包含：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(藉由IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I藉EU)；在IgG2抗體之情形下包含：N44S、K52N及V82I(IMGT；N384S、K392N及V422I藉由EU)；及在IgG4抗體之情形下包含：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I(藉由IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I藉由EU)。
在某些實施例中，Fc結構域可為衍生自超過一種免疫球蛋白同型之嵌合、組合Fc序列。舉例而言，嵌合Fc結構域可包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4 CH2區之部分或所有CH2序列，及衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之部分或所有CH3序列。嵌合Fc結構域亦可含有嵌合鉸鏈區。舉例而言，嵌合鉸鏈可包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「上鉸鏈」序列，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「下鉸鏈」序列組合。可包含於本文所闡述之抗原結合分子中之任一者中的嵌合Fc結構域之特定實例自N端至C端包括：[IgG4 CH1]-[IgG4上鉸鏈]-[IgG2下鉸鏈]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可包含於本文所闡述之抗原結合分子中之任一者中的嵌合Fc結構域之另一實例自N端至C端包括：[IgG1 CH1]-[IgG1上鉸鏈]-[IgG2下鉸鏈]-[IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]。可包含於本發明之抗原結合分子中之任一者中的嵌合Fc結構域之此等及其他實例描述於2014年8月28日出版之美國公開案2014/0243504中，所述公開案以其全文引用之方式併入。具有此等通用結構佈置之嵌合Fc結構域及其變體可具有變化的Fc受體結合，其繼而影響Fc效應功能。
pH值依賴性結合
本發明包含具有pH值依賴性結合特徵之抗體及雙特異性抗原結合分子。舉例而言，相比於中性pH值，本發明之抗體在酸性pH值下可展現與抗原降低之結合。可替代地，相比於中性pH值，本發明之抗體在酸性pH值下可展現與抗原增強之結合。表述「酸性pH值」包含小於約6.2、例如約6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小之pH值。如本文所用，表述「中性pH值」意謂約7.0至約7.4之pH值。表述「中性pH值」包含約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4之pH值。
在某些情況下，「相比於中性pH值在酸性pH值下降低之結合」就在酸性pH值下抗體與其抗原結合之KD值與中性pH值下抗體與其抗原結合之KD值的比值而言表述(或反過來)。舉例而言，出於本發明之目的，若抗體或其抗原結合片段展現約3.0或更大之酸性/中性KD比值，則抗體或其抗原結合片段可視為展現「相比於中性pH值，酸性pH值下與MUC16降低之結合」。在某些例示性實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段之酸性/中性KD比值可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0. 25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有pH值依賴性結合特徵之抗體可例如藉由針對相比於中性pH值在酸性pH值下與特定抗原降低(或提高)之結合篩選抗體群體來獲得。另外，在胺基酸水準下抗原結合結構域之修飾可獲得具有pH值依賴性特徵之抗體。舉例而言，藉由用組胺酸殘基取代抗原結合結構域(例如CDR內)之一或多個胺基酸，可獲得相對於中性pH值在酸性pH值下具有降低之抗原結合之抗體。
包括Fc變體之抗體
根據本發明之某些實施例，抗體及雙特異性抗原結合分子包含Fc結構域，所述Fc結構域包括一或多個突變，所述突變例如相比於中性pH值在酸性pH值下提高或降低抗體與FcRn受體之結合。舉例而言，本發明包含在Fc結構域之CH2或CH3區中包括突變之抗體，其中突變提高 酸性環境(例如其中pH值在約5.5至約6.0範圍內之核內體)中之Fc結構域與FcRn之親和力。此類突變可導致當向動物投與時，抗體之血清半衰期增加。此類Fc修飾之非限制性實例包含例如以下位置處之修飾：250(例如E或Q)、250及428(例如L或F)、252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)；或以下位置處之修飾：428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)；或位置250及/或428處之修飾；或位置307或308及434處之修飾(例如308F、V308F)。在一個實施例中，修飾包括428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)及308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修飾；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)。
舉例而言，本發明包含抗體及雙特異性抗原結合分子，其包含Fc結構域，所述Fc結構域包括一或多個選自由以下組成之群之突變對或群組：250Q及248L(例如T250Q及M248L)；252Y、254T及256E(例如M252Y、S254T及T256E)；428L及434S(例如M428L及N434S)；及433K及434F(例如H433K及N434F)。前述Fc結構域突變及本文所揭示之抗體可變域內之其他突變之所有可能的組合涵蓋於本發明範疇內。
抗原結合域之製備及雙特異性分子之建構
對特定抗原具有特異性之抗原結合域可藉由本領域中已知之任何抗體生成技術製備。一旦獲得，對兩種不同抗原具有特異性之兩種不同抗原結合域即可使用慣例方法相對於彼此適當佈置以產生本發明之雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，本發明之多特異性抗原結合分子之個別組分(例如重鏈及輕鏈)中的一或多者衍生自嵌合、人類化或全人類抗體。用於製備此類抗體之方法為本領域中熟知的。舉例而言，本發明之雙特異性抗原結合分子之重鏈及/或輕鏈中的一或多者可使用VELOCIMMUNETM技術製備。使用VELOCIMMUNETM技術(或任何其他人類抗體生成技術)，最初分離具有人類可變區及小鼠恆定區之對特定抗原具有高親和力之嵌合抗體。針對期望特徵(包含親和力、選擇性、抗原 決定基等)表徵及選擇抗體。小鼠恆定區用所需人類恆定區置換以產生可併入到本發明之雙特異性抗原結合分子中之全人類重鏈及/或輕鏈。
經基因工程改造之動物可用於製備人類雙特異性抗原結合分子。舉例而言，可以使用不能重排及表現內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變序列之經基因修飾小鼠，其中小鼠僅表現由可操作地連接於位於內源性小鼠κ基因座處之小鼠κ恆定基因編碼之人類免疫球蛋白序列的一個或兩個人類輕鏈可變結構域。此類經基因修飾小鼠可用於產生包括兩種不同重鏈之全人類雙特異性抗原結合分子，所述重鏈與包括衍生自兩種不同人類輕鏈可變區基因區段中之一者之可變域的一致輕鏈締合。(參見例如US 2011/0195454)。全人類指代包括跨越抗體或抗原結合片段或其免疫球蛋白結構域之各多肽之整個長度的由衍生自人類序列編碼之胺基酸序列之抗體、或抗原結合片段或其免疫球蛋白結構域。在一些實例中，全人類序列衍生自對人類內源性之蛋白質。在其他實例中，全人類蛋白或蛋白質序列包括其中各組分序列衍生自人類序列之嵌合序列。儘管未受任何一個理論限制，但例如相比於任何野生型人類免疫球蛋白區域或結構域，嵌合蛋白或嵌合序列一般經設計以將組分序列之接合點中之免疫原性抗原決定基的產生減到最少。
減少藥品容器之頂部空間中之氧化氣體的方法
本發明之方法藉由將由氧化降解產生之電荷變體及/或集合體減至最少提供具有更佳穩定性及儲存期限之藥品。本發明之方法包含抽空藥品容器之頂部空間中之氣體及隨後用非氧化氣體(例如氮氣或氬氣)對頂部空間充氣以降低氧氣及/或其他氧化氣體，諸如臭氧、過氧化物、氯氣、氟氣、氧化氮、二氧化氮、氧化亞氮或其組合之濃度。方法可在真空腔室(例如凍乾腔室)中進行。在一個實施例中，真空腔室裝備有皮冉尼真空計(熱導真空計)以精確量測且藉此將壓力控制在本文中鑑別之範圍內。在各種實施例中，方法在無菌條件下及/或在滿足用於醫藥藥品生產之良好作業規範(GMP)條件下進行。
本發明之方法可用於在密封容器中製備藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白或抗原結合蛋白(例如抗體或雙特異性抗原 結合分子)。藥品經製備以在藥品容器之頂部空間中含有降低濃度之氧氣及/或其他氧化氣體。在根據本發明之密封容器中製備藥品之方法包含(a)在大氣壓下將含有重組蛋白或抗原結合蛋白(例如抗體)之液體調配物之一或多個容器裝載至真空腔室中；(b)在約0.05巴至約0.15巴之第一壓力下抽空腔室；(c)在約800毫巴至約1000毫巴之第二壓力下用非氧化氣體對腔室充氣；及(d)將一或多個容器密封在密封真空腔室內部。在一些實施例中，在密封容器之前將方法步驟(b)及(c)重複一或多次以進一步降低頂部空間中之氧化氣體之濃度。在各種實施例中，本發明之方法可用於產生在容器頂部空間中具有少於5體積%氧氣(或其他氧化氣體)之藥品。在一些情況下，氧化氣體濃度降低至小於4%、小於3%、小於2%、或小於1%。在一些實施例中，氧化氣體(例如氧氣)濃度不超過0.5%、不超過0.4%、不超過0.3%、不超過0.2%、或不超過0.1%。
在一些實施例中，可預定氧氣(或其他氧化氣體)之最終所需濃度，且可因此調節上文所論述之抽空/充氣過程之循環數目以獲得所需最終濃度。舉例而言，在一個實施例中，控制密封藥品容器之頂部空間中之氧含量的方法包含：(a)確定密封容器之頂部空間中之所需最終氧含量；(b)經由方程式(I)計算在第一氧氣還原循環之後的最終氧含量%：
其中%O2，起始為第一循環開始時的氧含量%，P真空為在第一氧氣還原循環中所施加之抽空壓力，P充氣為高於P真空但小於1巴之壓力，且%O2，結束為在第一循環結束時的氧含量%；(c)視情況將方程式(I)應用至其他循環，其中%O2，起始為在前一循環結束時之氧含量%，直至達至所需最終氧含量；及(d)藉由以下在密封容器中製備藥品：(i)藉由以下進行一或多個氧氣還原循環：在P真空下抽空真空腔室中之非密封容器，其中P真空為0.05巴至0.15巴之壓力，及在800毫巴至1000毫巴之充氣壓力下用非氧化氣體對真空腔室中之非密封容器充氣；及(ii)密封容器。
在各種實施例中，維持壓力高於水之蒸氣壓以避免含有重組蛋白或抗原結合蛋白之液體調配物之蒸發。在各種實施例中，真空腔室之 抽空及/或充氣在約0.02巴至約0.2巴之壓力下進行。在一個實施例中，抽空在約0.1巴之壓力下進行，且充氣在約800毫巴至約1000毫巴之壓力下進行。用於真空腔室之充氣之非氧化氣體可選自例如氮氣、氬氣、氦氣、氙氣、氖氣、氪氣及氡氣。在一個實施例中，非氧化氣體為氮氣。在另一實施例中，非氧化氣體為氬氣。在各種實施例中，方法在約5-45℃範圍內或約10-37℃範圍內之溫度下進行。在各種實施例中，方法在約15-25℃範圍內之溫度下進行。在一些情況下，溫度為約15℃、約16℃、約17℃、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、或約25℃。在一個實施例中，所有循環之溫度均維持在約19℃下。
根據本發明之方法密封在藥品容器內之重組蛋白或抗原結合蛋白組合物可為在上文或本文中論述之各種組合物中之任一者。舉例而言，抗原結合蛋白(例如抗體)之液體組合物可用各種賦形劑調配，所述賦形劑包含緩衝液、張力改性劑、穩定劑、表面活性劑及類似物，且蛋白質可在約0.1mg/ml至約200mg/ml範圍內之濃度下存在。在一些實施例中，抗體或其他抗原結合蛋白之濃度為約1mg/ml至約25mg/ml、1mg/ml至約15mg/ml、或約1mg/ml至約10mg/ml。在一些情況下，濃度小於10mg/ml、小於5mg/ml、小於2mg/ml或小於1mg/ml。
如上所述，在降低容器內頂部空間氣體之氧化氣體含量之後，容器被完全封閉/塞住且最終密封。塞子可由多種材料(例如聚合物、橡膠)製成且展現與容器接合所需之彈性特性(例如足夠的硬度、延展性)。在一些實施例中，塞子由合成橡膠形成。在一些實施例中，塞子由丁基橡膠形成。塞子可包括一或多個排氣孔、或排氣柱。塞子可經調適以形成且保留彈性密封件且在一些實施例中可為適合於習知凍乾程序之塞子。因此，用於凍乾腔室中之小瓶之塞子可被在氣體覆疊/氧氣還原過程期間對外部開放之排氣孔部分塞住，且隨後在一或多個氧氣還原循環之後與容器相連被完全塞住及密封。凍乾系統、閉合蓋及塞子組態之實例提供於FDA指南「非經腸(7/93)凍乾」及Bhambhani與Medi，「用於凍乾應用之容器/封閉件之選擇(Selection of Containers/Closures for Use in Lyophilization Applications：Possibilities and Limitations),」《美國醫藥綜述(American Pharmaceutical Review)》，2010年5月1日，其以全文引用的方式併入本文中。
實例
提出以下實例以便為本領域普通技術人員提供如何製得及使用本發明之方法及組合物之完整揭示內容及描述，且不意欲限制本發明人視作其發明之範疇。已努力確保關於所用數量(例如量、溫度等)的精確度，但應考慮存在一些實驗性誤差及偏差。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實例1：藥品頂部空間中之氧氣減少
在此實例中，裝備有用以量測壓力之皮冉尼真空計及用以控制壓力之針閥之標準GMP凍乾腔室用作真空腔室。液體調配物中之濃度為2mg/ml之雙特異性抗體封裝於裝備有排氣柱橡膠塞之小瓶中，其在兩個循環過程中具有氮氣覆疊以將頂部空間氧氣之存在自約21%降低至約0.25%。
一旦將小瓶置放於腔室中，即抽吸真空(步驟6)以自腔室移除氣體(開始為含有約21%氧氣之空氣)。壓力(100,000μbar)高於水之蒸氣壓以避免蒸發、泡沫形成及可能的飛濺，且用皮冉尼計量測。在一般凍乾條件下，存在對應顯著較低壓力(約150μbar)之真空，因此使用電容壓力計控制壓力。然而，電容壓力計僅在低於約2000μbar之壓力下精確， 且無法用於控制在100,000μbar下之壓力。
在達至100,000μbar壓力之後，將氮氣填充至腔室置換抽成真空之空氣。
重複第二次製程以進一步降低氧含量(下文第2循環步驟3-4)。一旦達至所需氧含量，小瓶即被塞住(下文第2次循環步驟5)。
氧含量方程式：
P=壓力
自上文實例1中所論述之製程之實例計算：
循環1
P 真空 =100毫巴
P 充气 =912毫巴
%O2，起始=21%(從腔室中之空氣開始)
%O 2，结束 =2.3%
循環2
P 真空 =100毫巴
P 充气 =900毫巴
%O2，起始=2%
%O 2，结束 =0.25%
實例2：藥品之穩定性測試
穩定性分析針對具有不同濃度之頂部空間氧氣之使用實例1中所論述的製程製備之各種藥品進行，且針對其中頂部空間氧氣處於或接近大氣壓水準(約21%)之對照比較。在(本文中所提到的)某些情況下，氮氣用製程之充氣部分中之氬氣置換。高分子量(HMW)物種使用尺寸排阻超高效液相層析(SE-UPLC)偵測，且電荷變體物種使用陽離子交換超高效液相層析(CEX-UPLC)偵測。
如圖1中所說明，經由氮氣覆疊將頂部空間氧含量自21%降低至小於1%減少在5℃下儲存31個月之後藉由CEX-UPLC觀測到之雙特異性抗體之降解。在21%氧氣下，主要電荷變體物種之百分比變化為約46.25%，而在<1%氧氣下，百分比變化歷經儲存時段降低至約8.75%。
如圖2中所說明，經由氮氣覆疊將頂部空間氧含量自21%降低至0.1%提高第二雙特異性抗體之穩定性，如藉由在45℃下儲存28天之後HMW物種存在之增加百分比減少所展示。在21%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約8.62%。在15%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約8.53%。在10%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約4.74%。在5%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約1.42%，且在0.1%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約0.24%。
圖3說明在氮氣覆疊製程降低頂部空間氧含量之後，在45℃下儲存三個月之後觀測到之第二雙特異性抗體之HMW物種的存在之增加百分比之減少。在5%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約9.66%。在2%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約7.27%。在1%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約4.54%，且在小於1%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約0.34%氧氣。
圖4說明如圖3中之在45℃下儲存三個月之第二雙特異性抗體之相同頂部空間氧含量，不同之處在於覆疊製程中之氮氣用氬氣置換。在5%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約16.72%。在2%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約13.05%。在1%氧氣下，HMW物種之百分比歷經儲存時段增加約7.68%，但在小於1%氧氣下，HMW 物種歷經儲存時段不存在可偵測增加。
本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制。實際上，根據前述描述，除本文所描述之修改以外，本發明之各種修改對本領域的技術人員而言亦會變得顯而易見。此類修改意欲屬所附申請專利範圍之範疇內。

Claims (47)

  1. 一種包括密封容器之穩定液體藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括氣體之頂部空間，其中所述氣體包括少於5體積%氧氣且所述重組蛋白在儲存於45℃下時穩定至少28天之時段，其中穩定至少28天係指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過2%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的藥品，其中所述氣體包括不超過2體積%氧氣。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的藥品，其中所述氣體包括不超過1體積%氧氣。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的藥品，其中所述氣體包括少於1體積%氧氣。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的藥品，其中所述氣體包括不超過0.1體積%氧氣。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的藥品，其中所述液體調配物含有濃度小於10mg/ml之所述重組蛋白。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的藥品，其中所述重組蛋白之所述濃度小於5mg/ml。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的藥品，其中所述重組蛋白之所述濃度小於2mg/ml。
  9. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的藥品，其中所述液體調配物含有濃度為1mg/ml至200mg/ml之所述重組蛋白。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的藥品，其中所述重組蛋白在儲存於45℃下時穩定至少三個月之時段，其中穩定至少三個月係指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過10%。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的藥品，其中穩定至少三個月係指高分子量物種之百分比歷經所述時段增加不超過5%。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的藥品，其中穩定至少三個月係指高分 子量物種之百分比歷經所述時段增加少於1%。
  13. 一種包括密封容器之穩定液體藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括氣體之頂部空間，其中所述氣體包括少於5體積%氧氣且所述重組蛋白在儲存於45℃下時穩定至少28天之時段，其中穩定係指至少一種產品CQA高於或低於預定臨限值之變化。
  14. 一種包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括氣體之頂部空間，其中所述氣體包括少於1體積%氧氣且抗原結合蛋白在儲存於5℃下時穩定至少31個月之時段，其中穩定至少31個月指代主要電荷變體物種之百分比歷經所述時段變化不超過10%。
  15. 一種包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括氣體之頂部空間，其中所述氣體包括少於1體積%氧氣。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的藥品，其中所述氣體包括不超過0.1體積%氧氣。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所述的藥品，其中所述重組蛋白為抗原結合蛋白。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的藥品，其中所述抗原結合蛋白為單特異性抗體。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的藥品，其中所述抗原結合蛋白為雙特異性抗體。
  20. 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的藥品，其中所述容器為小瓶。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的藥品，其中所述小瓶包括具有一或多個排氣柱之塞子。
  22. 一種在密封容器中製備藥品之方法，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括具有減少之氧含量之氣體的頂部空間，所述方法包括：(a)在大氣壓下將含有所述重組蛋白之所述液體調配物之一或多個 容器裝載至真空腔室中；(b)在0.05巴至0.15巴之第一壓力下抽空所述腔室；(c)在大於所述第一壓力但小於1巴之第二壓力下用非氧化氣體對所述腔室充氣；及(d)密封所述一或多個容器，其中所述方法在5-45℃範圍內之溫度下進行，且所述密封容器包括具有少於5體積%氧氣之頂部空間氣體。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的方法，進一步包括在密封所述一或多個容器之前額外重複步驟(b)及(c)一或多次。
  24. 如申請專利範圍第22項或第23項所述的方法，其中所述第一壓力為約0.1巴。
  25. 如申請專利範圍第22項至第24項中任一項所述的方法，其中所述第二壓力為約800毫巴至約1000毫巴。
  26. 如申請專利範圍第22項至第25項中任一項所述的方法，其中所述溫度在約15-25℃範圍內。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的方法，其中所述溫度為約19℃。
  28. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項所述的方法，其中所述密封容器包括具有少於2體積%氧氣之頂部空間氣體。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的方法，其中所述密封容器包括具有少於1體積%氧氣之頂部空間氣體。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的方法，其中所述密封容器包括具有不超過0.1體積%氧氣之頂部空間氣體。
  31. 如申請專利範圍第22項至第30項中任一項所述的方法，其中所述液體調配物含有濃度為1mg/ml至200mg/ml之所述重組蛋白。
  32. 如申請專利範圍第22項至第30項中任一項所述的方法，其中所述液體調配物含有濃度小於10mg/ml的所述重組蛋白。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的方法，其中所述重組蛋白之所述濃度小於5mg/ml。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的方法，其中所述重組蛋白之所述濃度 小於2mg/ml。
  35. 如申請專利範圍第22項至第34項中任一項所述的方法，其中所述重組蛋白為抗原結合蛋白。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的方法，其中所述抗原結合蛋白為單特異性抗體。
  37. 如申請專利範圍第35項所述的方法，其中所述抗原結合蛋白為雙特異性抗體。
  38. 如申請專利範圍第22項至第37項中任一項所述的方法，其中所述容器為小瓶。
  39. 如申請專利範圍第38項所述的方法，其中所述小瓶包括具有一或多個排氣柱之塞子。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的方法，其中所述一或多個排氣柱在步驟(b)及/或步驟(c)期間部分封閉。
  41. 如申請專利範圍第39項或第40項所述的方法，其中所述一或多個排氣柱在步驟(d)期間完全封閉。
  42. 如申請專利範圍第22項所述的方法，其中所述腔室中之所述壓力經由皮冉尼真空計(Pirani vacuum gauge)量測。
  43. 如申請專利範圍第22項至第42項中任一項所述的方法，其中所述非氧化氣體為氮氣。
  44. 如申請專利範圍第22項至第42項中任一項所述的方法，其中所述非氧化氣體為氬氣。
  45. 如申請專利範圍第22項至第42項中任一項所述的方法，其中所述非氧化氣體選自由以下組成之群：氦氣、氙氣、氖氣、氪氣及氡氣。
  46. 一種控制含有液體醫藥調配物之密封容器之頂部空間中的氧含量之方法，包括：(a)確定所述密封容器之所述頂部空間中之所需最終氧含量；(b)經由方程式(I)計算第一氧氣還原循環之後的最終氧含量%： 其中%O 2，起始為所述第一循環開始時的氧含量%，P 真空為在所述第一氧氣還原循環中所施加之抽空壓力，P 充氣為高於P 真空但小於1巴之壓力，且%O 2，結束為在所述第一循環結束時的氧含量%；(c)視情況將方程式(I)應用至其他循環，其中%O 2，起始為在前一循環結束時之氧含量%，直至達至所述所需最終氧含量；及(d)藉由以下在所述密封容器中製備藥品：(i)藉由以下進行一或多個氧氣還原循環：在P 真空下抽空真空腔室中之非密封容器，其中P 真空為0.05巴至0.15巴之壓力，及在800毫巴至1000毫巴之充氣壓力下用非氧化氣體對所述真空腔室中之所述非密封容器充氣；及(ii)密封所述容器。
  47. 一種包括密封容器之藥品，所述密封容器含有液體調配物中之重組蛋白及包括氣體之頂部空間，其中所述氣體包括受控且預定之氧含量，且其中所述容器包括具有一或多個排氣柱之塞子。
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