Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

TR201815768T4 - T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları. - Google Patents

T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları. Download PDF

Info

Publication number
TR201815768T4
TR201815768T4 TR2018/15768T TR201815768T TR201815768T4 TR 201815768 T4 TR201815768 T4 TR 201815768T4 TR 2018/15768 T TR2018/15768 T TR 2018/15768T TR 201815768 T TR201815768 T TR 201815768T TR 201815768 T4 TR201815768 T4 TR 201815768T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
cells
bispecific
cell
sequence
igg
Prior art date
Application number
TR2018/15768T
Other languages
English (en)
Inventor
Berthold Hendrik Bakker Alexander
Fokko Van Loo Pieter
Logtenberg Ton
Original Assignee
Merus Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merus Nv filed Critical Merus Nv
Publication of TR201815768T4 publication Critical patent/TR201815768T4/tr

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061Blood cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526CH3 domain
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53Hinge
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71Decreased effector function due to an Fc-modification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, insan IgG bispesifik antikorları sağlar, burada antikorun bir kolu immün efektör hücreler üzerinde bir epitopu bağlarken diğer kol, CLEC12A'yı veya bunun fonksiyonel bir eşdeğerini hedef alır. Bu antikorların MDS, CML veya AML gibi malignitelere karşı farmasötik kullanımları da sağlanır.

Description

TARIFNAME T HÜCRE BAGLAYICILAR OLARAK BISPESIFIK IGG ANTIKORLARI TEKNIK SAHA Bulus, antikor mühendisligi alani ile ilgilidir. Özellikle bu, anormal hücreleri içeren hastaliklarin tedavisine yönelik terapötik (insan) antikorlar alani ile ilgilidir. Daha belirgin olarak bu, tümörlerin tedavisi için bispesifik antikorlar ile BULUSUN ALT YAPISI Laboratuvarlarda bispesifik antikorlar, immün efektör hücrelerin tümör hücrelerine yeniden hedeflenmesi için yaygin sekilde kullanilmistir. Bu durumda bir baglanma alani, bir tümör iliskili antijene (TAA) ve örnegin T hücreleri üzerindeki CD3 gibi efektör hücreler üzerinde bir tetikleme molekülüne karsi ve bir tümör hücresi ile iliskili antijeni hedef alan birinci bispesifik antikorlar kemirgen yapilidir ve hibrit hibridomalar kullanilarak üretilmistir (Liu et al. 1985 Eur.J.lmm. 17:105). Bu hibrit hibridomalarda Ig agir ve hafif zincirlerin tekrar siralanmasi, agir ve hafif zincir yanlis eslemesinden ortaya çikan monospesifik ve fonksiyonel olmayan bispesifik antikorlarin çok daha genis bir havuzu içerisinde bispesifik fonksiyonel antikor moleküllerinin üretimi ile sonuçlanmistir. Bunlarin ikili spesifikligi nedeniyle bu fonksiyonel bispesifik antikorlar, ilgili antijeni gösteren tümör hücrelerin parçalanmasi ile sonuçlanan sitotoksik fonksiyonu tetiklemek ve hücreleri hedef almak üzere mürin ve insan sitotoksik T lenfositlere (CTL) baglanabilmistir. Ancak poliklonal dinlenen indan T hücreleri ile tümör hücre parçalanmasinin CD3XTAA bispesifik IgG aracili indüksiyonu, es- stimülasyonun eklenen ekzojenöz IL-2 veya anti-CD28 mAb ile saglanmamasi 01574-P-0003 durumunda gerçeklestirilememistir. Bu, sadece IL-27nin es-uygulanmasi üzerine dinlenen insan T lenfositleri ile CD19 pozitif REH B-ALL tümör hücre hattinin parçalanmasini indükleyebilen hibrit siçan lgG2b/fare IgGl CD3XCD19 vd., benzer bir siçan IgG2b/fare IgG2a CD3xEpcam inolekülü kullanarak, Epcam- pozitif tümör hücrelerinin bispesifik IgG-indüklü parçalanmasinin, ekzojenöz lL2 ilavesi olmaksizin hem periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) hem de tümör hücreleri içeren karisik hücre kültürlerinde gerçeklestirilemedigini pozitif yardiinci hücreler ile etkilesimi yoluyla bu etkiye neden oldugunu belirtmislerdir. Özellikle güçlü aktivasyon potansiyeli, diger belirtilen kombinasyonlarin (örnegin, fare lgG2a/fare lgGl veya siçan lgG2b/fare lgGl) aksine Fcy reseptör-pozitif yardimci hücreleri sadece baglamayan ayni zamanda bunlari aktive eden hibrit alt sinif kombinasyonu fare IgG2a/siçan IgG2b ile iliskilendirilmistir. Ayrica katumaksomab olarak bilinen, triomAb CD3XEpcam bispesifik antikor olarak adlandirilan bu antikor, klinik olarak gelistirilmistir ve epitel kökenli abdominal tümörlerin geçici tedavisi için Avrupaida tescillenmistir.
Bispesifik antikor belirgin sekilde klinik etkinlik gösterirken bunun kemirgen yapisi, tekrarli dozlama üzerinde anti-ürün immün yanitlarini indükler ve bu nedenle bu formatin yaygin uygulamasini Önler.
Alternatif CD3XTAA formatlarinin, hibrit kemirgen triomAb formati ile iliskili immünoj enisite problemlerini ve üretim sorunlarini çözdügü kesfedilmistir. Bu tür formatlar genellikle tam uzunlukta insan lgG moleküllerinden sapan immünoglobülin benzeri moleküllerdir ve dünya çaginda ag macrogenics.com/Platforms-DART.html adresinde Macrogenics tarafindan gelistirilen Çift-Atiniteli Yeniden-Hedefleme (DARTTM) molekülleri, Micromet.
Bispesifik T Hücre Baglayici (BiTE®) molekülleri, Abbott tarafindan gelistirilen Ikili Degisken Domenli -immünoglobülin (DVD-IgTM) molekülleri ve dünya 01574-P-0003 çaginda ag affimed.com/tandab-recruit adresinde Affimed tarafindan gelistirilen TandAb® RECRUIT molekülleri gibi molekülleri içerir. Bu formatlarin biri için bir CD3XCD19 diabodi kullanilarak CD19-pozitif tümör hücrelerini parçalamak üzere periferik kan lenfositlerinin basarili yeniden hedeflenmesinin, bu noktada anti-CD3 antikor arti insan IL-2 kullanilarak, periferik kan T lenfositlerinin ön aktivasyonunu gerektirdigi gösterilmistir (Kipriyanov et al. 1998 [nt.J.Can.
Blood 95:2098) gibi diger formatlar, dinlenen T hücrelerinin ön aktivasyonunu gerektirmez ve oldukça etkili bir sekilde in vitro antijen pozitif tümör hücre TAAilari hedefleyen BiTE®°lerin kullanildigi ek çalismalar, BiTE® formatinin güçlü etkinliginin, antijen boyutu ile ve özellikle TAA üzerinde epitopun tümör hücre membranina mesafesi ile iliskili oldugunu ortaya çikarmistir (Bluemel et al. etkili olusumu, ayrica küçük boyutlu BiTE® formatina baglandigi düsünülen potansiyellerine yönelik yapisal temeli olusturmak üzere açiklanan (Offner et al. gösterilmistir. Boyutun önemli olmasi halinde bu, intakt lgG gibi daha büyük moleküllerin etkili sitolitik sinapslari olusturmak üzere çok büyük oldugunu belirtir. CD3xCDl9 BiTE®, blinatuinomab, refraktör Hodgkin olmayan lenfoma ve akut lenfatik lösemi hastalarinda dikkate deger klinik etkinlik göstermistir seviyelerde oldukça etkili tümör hücre parçalanmasi göstermesine ragmen bu bispesifik formatin hastalara uygulanmasi, önemli zorluklar ile iliskilidir. Bunlarin küçük boyutu nedeniyle BiTE®,ler, dolasimdan hizli sekilde temizlenmistir ve hastalarin dozlanmasi bu nedenle sürekli infüzyon gerektirir. Dozlama rejimi, 2 aydan daha uzun bir sürede oldugunda bu tedavi, hastalarin yasam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olur.
Dolayisiyla immünojenik olmaksizin ve sadece sinirli yan etkiler ile sürekli infüzyona yönelik gereksinim olmaksizin intravenöz uygulama üzerine uzun 01574-P-0003 dolasimi saglayan yarilanma ömrünü kombine eden anormal hücrelerin ortadan kaldirilinasinda IgG moleküllerini baglayan etkili tam uzunlukta bispesifik T hücreye yönelik bir ihtiyaç hala mevcuttur.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL l: CLEC12A ve ilgili diziler.
SEKIL 2: Çesitli antikorlar ile T-hücre aktivasyonu: monoklonal iki degerlikli CD3 IgG, bispesifik CD3XCLEC12 IgG, bispesifik CD3xizotip kontrol IgG, monoklonal iki degerlikli CLEC12A IgG, monoklonal iki SEKIL 3: CD3XCLEC12A bispesifik IgG ve kontrol antikorlari ile HL60 hücrelerinin spesifik parçalanmasi.
SEKIL 4: CD3XCLEC12A bispesifik lgG ve kontrol antikorlari (E:T oranlari) ile HL60 hücrelerinin spesifik parçalanmasi.
SEKIL 5: Çesitli CLEC12A kollari & sabit CD3 kolundan olusan birkaç CD3XCLEC12A bispesifik lgG molekülü ve kontrol antikorlari ile HL60 hücrelerinin spesifik parçalanmasi.
SEKIL 6: Fc susturma (DMîIkili mutant; TM: üçlü mutant; WTîdogal sus. sifir FC susturma) ile kombinasyon halinde CD3XCLEC12A bispesifik lgG ile HL60 hücrelerinin spesifik parçalanmasi.
SEKIL 7: Fc susturmasi, FcRn baglanmasini etkilemez.
SEKIL 8: T hücre proliferasyonunun CD3XCLEC12A bsAb hedef spesifik indüksiyonu.
SEKIL 9: Saglikli donörlere kiyasla AML hastalarinin CD8+ T hücre kompartimani.
SEKIL 10: Spesifik CD3XCLEC12A DM-Fc, AML hasta T hücreleri ile T hücre aktivasyonu ve HL60 tümör hücre parçalanmasini indüklemistir.
SEKIL ll: Otolog AML hasta T hücreleri ile AML blastlarinin spesifik parçalanmasi.
SEKIL 12: Hasta T hücreleri ile spesifik monosit parçalanmasi. 01574-P-0003 SEKIL 13: FC susturinasi, seyirci hücre sitokin salimini önemli ölçüde ortadan kaldirir.
SEKIL l4A: HPB-ALL hücreleri üzerinde anti-CD3 antikorlarini boyayan SEKIL l4B: Plaka bagli IgG. CF SE ile etiketlenmis T hücreleri, FACS ile . günde okuma FIG 152HL60 sitotoksisite analizi FIG 16: HL60 hücreleri üzerinde anti-CLEC12A antikorlarini boyayan SEKIL 17: HL60 sitotoksisite analizi FIG 18: FACS analizi FIG 19: HL60 sitotoksisite analizi FIG 20: CD3-spesifik ve CLECIZA-spesifik Fab kollarinin VH dizileri. 012 ortak hafif zincirin VL dizisi. CDR dizileri koyu ve alti çizilidir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, AML tedavisi için bir tam insan IgG bispesifik tam uzunlukta antikor ile ilgilidir. Bir antikor kolu, immün efektör hücreler üzerinde bir epitopu baglarken, CD3, diger kol, %90-95 de novo ve durumu kötüye giden AML hastalarinda ifade edilen bir miyeloid hücre spesifik yüzey hedefi olan CLEClZAiyi hedef alir. CLEC12A, AML lösemik kök hücrelerinde ifade edilir ancak normal hematopoetik hücrelerde ifade edilmez. CD33iün aksine CLECIZA, eritroid prekürsörler veya megakaryositlerde ifade edilmez bu nedenle mevcut bulusa ait CD3xCLEC12A bispesifik IgGl antikor, platelet veya kirmizi kan hücre deplesyonunu indüklememelidir. Kemik iligi hücre kolonileri ile deneyler, normal kemik iliginde CLEC12A+ hücrelerinin deplesyonununa palteletlere ve kirmizi kan hücrelerine yol açan miyeloid soylarini etkilemedigini göstermistir.
Tercih edilen bir düzenlemede mevcut bulusa göre bir CD3XCLEC12A bispesifik baglanmasindan ortaya çikan spesifik olmayan immün aktivasyonunu azaltmak 01574-P-0003 amaciyla modifiye edilmis bir FC bölgesi içerir. Önceki teknikteki triomAb bispesifik antikora yönelik açiklanan verilere dayanarak bir tamamen insan IgGl formatinin bir CD3XTAA bispesif'ik lgG”sinin T hücrelerin ön aktivasyonuna yönelik gereksinim olmaksizin dinlenen periferik kan lenfositlerinde litik anti- tümör aktivitesini indükleyebildigi oldukça süphelidir. Ek olarak BiTE® formatina yönelik mevcut veriler, tam uzunlukta bir IgG molekülünün tümör hücreleri ile efektör hücreleri arasinda etkili sitolitik sinapslar olusturmak için çok büyük oldugunu belirtmistir. Sasirtici bir sekilde tam olarak insan bir CD3XCLEC12A bispesifik tam uzunlukta IgG1`in in vitro CLEC12A-pozitif HL60 AML tümör hücrelerinin oldukça etkili T hücre aracili parçalanmasmi indükleyebildigini gösterilmistir. Aslinda etkili parçalamaya, T hücrelerinin önceki aktivasyonuna gerek olmaksizin PBMC”den saflastirilan dinlenen T lenfositler ile aracilik edilmistir. Ek olarak bu litik aktivitenin, analiz ortam içeren insan serumunda gerçeklestirildiginde bu litik aktivitenin asiri insan lgG”si varligindan etkilenmesi nedeniyle HL60 hücrelerinde bulunan FcyR ile etkilesimlere zorunlu olarak bagli olmadigi gösterilmistir. Bu, T hücrelerinin ön aktivasyonuna yönelik gereksinim veya aktif FcyR etkilesimlerine yönelik gereksinim olmaksizin bir tam uzunlukta insan IgGl bispesifik T hücre baglayici antikorun etkili tümör hücre parçalamasi uyguladigi ilk zamandir. Etkili parçalanma, BiTE® molekülleri ile karsilastirildiginda nispeten büyük boyutlu reseptör etkilesimlerini daha fazla azaltmak üzere CD3XCLEC12A bispesifik tümör hücresi parçalanmasi ile sonuçlanmistir. Bir bispesifik insan IgGl T hücre baglayici antikor, bir insan IgG1°in daha az immünojenik olmasi ve dolayisiyla tekrar edilen terapi için uygulanabilmesi nedeniyle hibrit altsinif kombinasyonu fare IgGZa/siçan IgGZb”den faydalanan mevcut IgG7ye göre avantajlara sahiptir.
Ek olarak bir tam uzunlukta bispesifik insan IgGl T hücre baglayici antikor, tam uzunlukta insan IgG1”in dolasimdan hizli bir sekilde temizlenmemesi ve hastalarin dozlanmasinin bu nedenle hastalar için daha faydali olan, sürekli 01574-P-0003 infüzyon gerektirmemesi nedeniyle DARTTM, TandAb® veya BiTE® gibi iinmünoglobülin/benzeri moleküllere göre avantajlara sahiptir.
DÜZENLEMELER Bulus, istemlere göre bir bispesifik IgG antikor saglar, burada söz konusu bispesifik lgG antikor CLEC12A°yi spesifik olarak taniyan bir kol ve CLEC12A°yi ifade eden anormal bir hücreye bu tür hücreleri temin edebilen, iinmün efektör hücreler üzerindeki bir antijeni, CD3, spesifik olarak taniyan ikinci bir kol içerir.
Burada kullanildigi üzere “CLEC12A3yi spesifik olarak tanir” terimi, söz konusu kolun CLEC12A°nin söz konusu antikor çevresinde bulundugu durumda CLEC12A°yi spesifik olarak tanima kapasitene sahip oldugu anlamina gelir.
Benzer sekilde “immün efektör hücreler üzerindeki antijeni spesifik olarak tanir” terimi, söz konusu kolun, söz konusu antijenin söz konusu antikor çevresinde bulundugunda söz konusu antijeni spesifik olarak tanima kapasitesine sahip oldugu anlainina gelir. Bir antikor araciligiyla bu tür antijeni tanima islemine tipik olarak antikorun tamamlayici bölgeleri ve antikorlarin rastgele, spesifik olamayan yapismasina karsilik olarak bu iki yapinin kesinlik (bir kilit ve anahtara benzer bir etkilesim) ile birlikte baglanmasina olanak taniyan hem antijen hem de antikor kolonun spesifik üç boyutlu yapisi aracilik eder. Bir antikor bir antijenin bir epitopunu tipik olarak tanidiginda ve bu tür bir epitop da diger bilesiklerde bulundugunda “CLEC12A'yi spesifik olarak taniyan” ve “immün efektör hücreler üzerindeki bir antijeni spesifik olarak taniyan” mevcut bulusa göre antikorla r da bu tür bilesiklerin ayni türde epitop içermesi halinde diger bilesikleri taniyabilir.
Bu nedenle “CLEC12A7y1 spesifik olarak tanir”, “immün efektör hücreler üzerindeki bir antijeni spesifik olarak tanir” ve “CD39ü spesifik olarak tanir” terimleri, ayni (türde) epitopu içeren diger bilesiklere antikorlarin baglanmasini hariç tutar. Bunun yerine çapraz reaktiviteye olanak taninir. Mevcut bulusa göre bir antikor tipik olarak CLEClZAiyi ve immün efektör hücreler üzerindeki bir 01574-P-0003 antijeni, CD3, asagida daha detayli sekilde açiklandigi üzere en az 1x10-5 Milik bir baglanma afinitesi ile baglayabilir.
Burada kullanildigi üzere “antikor” terimi, bir antijen üzerinde bir epitopu baglayan bir veya daha fazla domen içeren, proteinlerin immünoglobülin sinifina ait olan bir proteinli molekülü ifade eder, burada bu tür domenler degisken bir antikor bölgesinden türetilir veya bunun ile dizi homolojisini paylasir. Terapötik kullanima yönelik antikorlar tercihen tedavi edilecek öznenin dogal antikorlarina mümkün oldugunca yakindir (örnegin insan özneler için insan antikorlar). Antikor baglanmasi, spesifiklik ve afinite terimleri bakimindan ifade edilir. Spesifiklik, antijen veya epitopunun baglanma doineni ile spesifik olarak baglandigini belirler.
Afinite, belirli bir antijen veya epitopa baglanma mukavemetine yönelik bir ölçüdür. Spesifik baglanma veya “spesifik olarak tanima”, en az 1x10-5 M, daha çok tercihen lxlO-7 M, daha çok tercihen 1x10-9Miden daha yüksek atiniteler ile baglanma olarak tanimlanir. Tipik olarak terapötik uygulamalara yönelik antikorlar, lxlO-lO Miye kadar veya hatta daha yükse afinitelere sahiptir. Mevcut bulusa ait antikorlar tipik olarak insan lgG alt sinifinin bispesifik tam uzunlukta antikorlaridir. Tercihen mevcut bulusa ait antikorlar, insan IgGl alt sinifina sahiptir.
Mevcut bulusa göre 'tam uzunlukta lgG', bir intakt IgG3nin tüm fonksiyonlarina zorunlu olarak sahip olmayan, esas olarak tam bir IgG içeren sekilde tanimlanir.
Süpheye mahal vermemek adina bir tam uzunlukta lgG, iki agir ve iki hafif zincir içerir. her bir zincir, sabit (C) ve degisken (V) bölgeleri içerir, bunlar CHl, CHZ, CH3, VH ve CL, VL olarak gösterilen domenler halinde parçalanabilir. Bir lgG antikoru, Fab kisminda bulunan degisken bölge domenleri vasitasiyla antijene baglanir ve baglanma isleminden sonra çogunlukla Fc kismi ile olmak üzere sabit domenler yoluyla immün sisteminin hücreleri ve molekülleri ile etkilesim kurabilir. 'Degisken bölge domeni', 'degisken bölge`, 'degisken domen', 'VH/VL çifti', 'VH/VL', 'Fab kismi', 'Fab kolu', 'Fab' veya 'kol' terimleri burada degistirilebilir bir biçimde kullanilir. Mevcut bulusa göre tam uzunlukta 01574-P-0003 antikorlar, istenen karakteristikleri saglayan mutasyonlarin mevcut olabildigi IgG moleküllerini kapsar. Bu tür mutasyonlar, bölgelerin herhangi birinin büyük kismina ait delesyonlar olmamalidir. Ancak bir veya birkaç amino asit kalintisinin dilindigi IgG molekülleri, ortaya çikan IgG molekülünün baglanma karakteristikleri esas olarak degistirilmeksizin` "tam uzunlukta IgG" terimi içerisinde bulunur. Örnegin bu tür IgG molekülleri, tercihen CDR bölgeleri disinda 1 ile 10 arasinda amino asit kalintisinin bir veya daha fazla delesyonuna sahip olabilir, burada silinen amino asitler 1gG°nin baglanma spesifikligi için önemli degildir.
Tam uzunlukta IgG antikorlari, bunlarin uygun yarilanma ömrü ve iinmünoj enisite nedenlerinden dolayi tamamen otolog (insan) moleküllerine yakin olarak kalma gereksiniminden dolayi tercih edilir. Bulusa göre bispesifik lgG antikorlari kullanilir. Tercih edilen bir düzenlemede bispesifik tam uzunlukta dayanarak tercih edilir. Insanlarda herhangi bir immünojenisiteyi önlemek amaciyla bulusa göre bispesifik IgG antikorun bir insan IgGl olmasi tercih edilir. kolon ikinci bir antijene baglandigi anlamina gelir, burada söz konusu birinci ve ikinci antijen ayni degildir. Mevcut bulusa göre söz konusu birinci ve ikinci antijen aslinda iki farkli hücre tüiünde konumlanan iki farkli moleküldür. ifade eder. Endojenöz immün hücrelerin kuvvetlendirilmesi ve aktive edilmesi ile sitotoksisiteye aracilik eden bispesifik antikorlar, sonraki-jenerasyon antikor terapötiklerinin yeni gelistirilen bir sinifidir. Bu, bir molekülde hedef hücreler (diger bir ifadeyle tümör hücreleri) ve efektör hücreler (diger bir ifadeyle T hücreleri, NK hücreleri ve makrofajlar) için antijen baglanma spesifikliklerinin 01574-P-0003 antikorlar saglanir burada bir kol, normal (tümör) hücreleri üzerinde CLEC12A antijenine baglanirken ikinci kol, immün efektör hücreler üzerindeki bir antijene baglanir.
Burada kullanildigi üzere 'CLEC12A' terimi, CD34 negatif veya CD34 düsük ifade eden lösemik kök hücreler (yan popülasyon) dahil akut miyeloid lösemide (AML) lösemik blast hücreleri ve lösemik kök hücreleri üzerinde ifade edilen bir antijen olan, ayrica C-tip lektin benzeri molekül-1 (CLL-l) olarak bilinen C-tip lektin doinen familya 12 üyesi A°ya refere eder (A.B. Bakker et al. Cancer Res özellikle periferik kan ve kemik iligindeki miyeloid hücreler, diger bir ifadeyle granülositler, monositler ve dendritik hücre prekürsörlerin ile kisitlanir. Daha önemli sekilde CLEC12A, hematopoietik kök hücreler üzerinde bulunmaz. Bu ifade profili, CLEC12A°yi AML”de özellikle uygun bir hedef haline getirir.
CLEC12A için alternatif` isimler dendritik hücre iliskili C-tip 1ektin-2 (DCAL-2), miyeloid inhibe edici C-tip lektin-benzeri reseptör (MICL) ve öldürücü hücre lektin-benzeri reseptör alt familya L, üye 1 (KLRLI) içerir (Zhang W. et al.
CLEC12A”nin tam uzunlukta formu, çogu diger izoformda bulunmayan 10 amino asidin ek bir hücre içi gerilmesi dahil 275 amino asit kalintisi içerir ve tam anlamiyla iniyeloid ifade profilini (yüzey ifadesi ve mRNA seviyesi) gösterir.
Burada kullanildigi üzere 'anormal hücreler' terimi, tümör hücrelerini, daha spesifik olarak miyelodisplastik sendromlara (MDS) ve neden olan hücreler gibi Ön-lösemik hücreler ve akut miyeloid lösemi (AML) tümör hücreleri veya kronik 01574-P-0003 miyeloid lösemi (CML) hücreleri gibi lösemik hücreler dahil hematolojik kökenli tüinör hücrelerini içerir.
Burada kullanildigi üzere 'immün efektör hücre' veya 'efektör hücre' terimi, bir hedef hücrenin yasayabilirligini etkilemek üzere aktive edilebilen memeli immün sistemindeki hücrelerin dogal repertuvari içerisindeki bir hücreye refere eder.
Immün efektör hücreler, dogal öldürücü (NK) hücreler, sitotoksik T hücreler dahil T hücreler veya B hücreler gibi lenfoid soylu hücreleri içerir ancak ayrica miyeloid soylu hücreler monositler veya makrofajlar, dendritik hücreler ve nötrofilik granülositler gibi immün efektör hücreler olarak kabul edilebilir. Bu nedenle söz konusu efektör hücre tercihen bir NK hücresi, bir T hücresi, bir B hücresi, bir monosit, bir makrofaj, bir dendritik hücre veya bir nötrofilik granülosittir. Bulusa göre efektör hücrelerin anormal hücrelere temini, iinmün efektör hücrelerin anormal hedef hücrelere yakin çevreye getirildigi anlamina gelir, böylece efektör hücreler bunlara temin edilen anormal hücreleri direkt olarak öldürebilir veya bunlarin ölümünü dolayli sekilde baslatabilir. Spesifik olmayan etkilesimleri önlemek amaciyla bulusa ait bispesifik antikorlarin, vücuttaki diger hücrelere kiyasla bu immün efektör hücreler tarafindan en azindan asiri ifade edilen immün efektör hücreler üzerindeki antijenleri spesifik olarak tanimasi tercih edilir. Immün efektör hücreler üzerinde bulunan hedef antijenler CD3 içerir. Tercihen immün efektör hücreler üzerindeki antijen, T hücreleri üzerinde ifade edilen CD3”tür. Bir immün efektör hücre üzerindeki en çok tercih edilen antijen CD3S zinciridir. Bu antijenin, T hücrelerin anormal hücrelere temininde oldukça etkili oldugu gösterilmistir. Bu nedenle mevcut bulusa göre bir bispesifik IgG antikor tercihen CD3e°ü spesifik olarak taniyan bir kolu içerir.
Dolayisiyla bulus, istemlere göre bir bispesifik tam uzunlukta IgG antikor saglar, burada söz konusu bispesifik antikor, CLEC12A”yi spesifik olarak taniyan bir kol ve CLEClZA”yi ifade eden anormal bir hücreye bu tür hücreleri temin edebilen, immün efektör hücreler üzerindeki bir CD3 antijenini spesifik olarak taniyan ikinci bir kol içerir, burada söz konusu immün efektör hücreler T hücrelerini 01574-P-0003 içerir. Bulus, bulusa göre bir bispesifik IgG antikor saglar burada söz konusu immün efektör hücreler üzerindeki söz konusu antijen CD3”tür, tercihen insan CD3e`tür.
Bulus, istemlere göre bir bispesifik lgG antikor saglar burada her iki kol ortak bir hafif Zincir içerir. Bulusa göre 'ortak hafif zincir' terimi, antikorun baglanma spesifikligini muhafaza ederken ayni olabilen veya bazi amino asit dizi farkliliklarina sahip olan hafif zincirlere refere eder. Örnegin burada kullanildigi üzere ortak hafif zincirler tanimi kapsaminda örnegin konservatif amino asit degisiklikleri, agir zincir ile eslestirildiginde baglanma spesifikligine katkida bulunmayan veya sadece kismen katkida bulunan bölgelerdeki amino asit degisiklikleri ve benzerinin uygulanmasi ve test edilmesi yoluyla ayni olmayan ancak yine de fonksiyonel olarak esdeger olan hafif Zincirlerin hazirlanmasi ve bulunmasi mümkündür. 'Yeniden düzenlenen' teriminin eklenmesi ile veya bu olmaksizin `ortak hafif zincir', 'ortak VL', 'tek hafif zincir', 'tek VL' terimleri, burada degistirilebilir sekilde kullanilir. Mevcut bulus, ortak hafif zincir olarak fonksiyonel antijen baglanma domenleri ile antikorlari olusturmak üzere farkli agir zincirler ile kombine olabilen bir insan hafif zinciri kullanir Tercihen ortak hafif zincir, bir germ hatti dizisidir. `Tercih edilen bir germ hatti dizisi, insan repertuvarinda siklikla kullanilan bir hafif zincir degisken bölgedir ve birçok farkli VH bölgeleri ile eslesmek üzere üstün kabiliyete sahiptir ve iyi termodinamik stabilite, verim ve çözünürlüge sahiptir. En çok tercih edilen bir germ hatti hafif zinciri, 012, tercihen yeniden düzenlenen germ hatti insan kappa hafif zincir IgVicl-39*Ol/IGJK1*01 (imgtorg dünya çapinda agda IMGT veritabanina göre terminoloji) veya bir parçasi veya fonksiyonel bir türevidir.
Yeniden düzenlenen germ hatti insan kappa hafif zincir IgVKl-39*01/IGJK1*01, açiklama boyunca degistirilebilir sekilde kullanilir. Açik bir sekilde teknikte uzman kisiler, ayni olmayan amino asit dizisinin hafif zincirinin fonksiyonel esdegerlerine refere eder. Söz konusu hafif zincirin birçok varyanti mevcuttur 01574-P-0003 burada fonksiyonel baglanma bölgelerinin olusumunu maddesel açidan etkilemeyen mutasyonlar (delesyonlar, sübstitüsyonlar, eklemeler), bulunur. Özellikle tercih edilen bir düzenlemede bulusa göre bir bispesifik lgG antikor saglanir burada CLEC12A°yi spesifik olarak taniyan kol, SGYTFTSY ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR] dizisi ve IINPSGGS ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR2 dizisi ve GTTGDWFD ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR3 dizisini içerir. Bahsedilen CDR dizileri, Örneklerde gösterildigi üzere iyi CLEC12A baglanma özelliklerine sahip olan Fab kolu 43273nin CDR dizileridir. Fab kolu 4327Snin agir zincir dizisi, bu nedenle CLEC12A-spesifik antikor 4327°ye ait VH Sekil 207de gösterilir. Tercih edilen bir düzenlemede bulusa göre bir bispesifik IgG antikor, antikor 4327,ye ait bu VH ile ayni olan degisken bir agir zincir (VH) dizisini içerir. Ayrica bu nedenle bulusa göre bir bispesifik lgG antikor saglanir, burada CLECI2A°yi spesifik olarak taniyan kol, QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA KGTTGDWFDYWGQGTLV TVS dizisi ile ayni olan bir diziden olusan bir VH dizisini içerir. Örneklerde gösterildigi üzere CD3”ü taniyan bir Fab kolonun bir VH dizisi ile birlikte (ve bir ortak hafif zincir ile birlikte), yukarida bahsedilen Vl-I hücrelerinin T hücre aracili parçalanmasini indüklemek için inükemmel kabiliyete sahiptir.
Ayrica tercih edilen bir düzenlemede bulusa göre bir bispesifik IgG antikor saglanir, burada CLEC12Aiyi spesifik olarak taniyan kol, SGYTFTSY ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR] dizisi ve IINPSGGS ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR2 dizisi ve GNYGDEFDY ile ayni olan bir diziden olusan bir agir zincir CDR3 dizisini içerir. Bahsedilen CDR dizileri, Örneklerde gösterildigi üzere iyi CLEC12A baglanma özelliklerine sahip olan antikor 4331°in VH bölgesinin CDR dizileridir. Fab kolu 4331°e ait VH dizisi 01574-P-0003 ayrica Sekil 207de gösterilir. Tercih edilen bir düzenlemede bulusa göre bir bispesifik IgG antikor, Fab kolu 433l”e ait bu VH ile ayni olan bir VH dizisi içerir. Ayrica bu nedenle bulusa göre bir bispesitîk lgG antikor saglanir, burada CLEC12A°yi spesifik olarak taniyan kol EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGNYGDEFDYWGQGTLV TVSS ile ayni olan bir diziden olusan bir VH dizisini içerir. Örneklerde gösterildigi üzere CD3°ü taniyan bir Fab kolonun bir VH dizisi ile birlikte (ve bir ortak hafif zincir ile birlikte) Fab kolu 4331°e ait VH hücrelerinin T hücre aracili parçalanmasini indüklemek için mükemmel kabiliyete sahiptir.
Ayrica tercih edilen bir düzenlemede bulusa göre bir bispesifik lgG antikor saglanir burada ikinci kol, CD3°ü spesifik olarak tanir ve SYGMH dizisinden olusan bir agir zincir CDR] dizisi ve IIWYSGSKKNYADSVKG dizisinden olusan agir zincir CDR2 dizisi ve GTGYNWF DP dizisinden olusan bir agir zincir CDR3 dizisi içerir. Tercihen söz konusu CD3-spesifik kol, QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWV AIIWYSGSKKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGTGYNWFDPWGQGTLV TVSS dizisinden olusan bir VH dizisini içerir.
Bahsedilen CDR dizileri ve VH dizileri, antikor 3896 dizileridir. Bu diziler ayrica Sekil 20”de gösterilir. Bu CD3-spesifik CDR dizileri ve Fab kolu 38965ya ait VH edilir, bunun nedeni bu dizilerin CLEClZA-pozitif AML tümör hücrelerine es zamanli olarak yeterli baglanmaya olanak tanirken CD3 ifade eden immün hücreler için optimal bir afinite ile bispesifik antikoru saglamasidir. Teoriye bagli kalinmak istenmeksizin bir bispesifik antikorun genel etkisinin, antijen 1 için bir kolun atinitesi ve antijen 2 için diger kolun afinitesinin kombine etkisi ile belirlendigi düsünülür. CLEC12A ve immün efektör hücreler üzerindeki bir antijen, CD3, için bir spesifîklige sahip mevcut bulusa ait bir antikor için CD3- 01574-P-0003 pozitif immün hücrelere ve CLEC12A-ifade eden tümör hücrelerine baglanmanin optimize edilmis zamanlamasi, CLEC12A-pozitit` tümör hücrelerinin T hücre aracili parçalanmasini etkili bir sekilde indüklemek amaciyla tercih edilir. Bir CLECIZA/CD3 bispesitîk antikorun atiniteleri arasindaki dengenin son derece önemli oldugu varsayiminda bulunulur. CLEC12A için çok düsük bir afiniteye karsi CD3 için önemli ölçüde yüksek bir atinitenin (diger bir ifadeyle, CD3 için çok yüksek bir atinite), antikorlarin CD3 ifade eden T hücrelerini esas olarak bagladigi bir durum ile sonuçlanacagi düsünülür. Bu tür 'bispesifik antikor-yüklü' T-hücreleri, bunlarin CD3”lerini içsellestirebilir veya bunlar bir CLEC12A-pozitif tümör hücresi ile karsilasmadan önce dolasimdan ayrilarak dokulari isgal edebilir.
Bu, bispesifik antikorun terapötik etkisini azaltir.
Daha elverisli bir hareket modunda CLEClZA-pozitif tümör hücreleri ilk olarak bulusa göre bir veya daha fazla bispesitik antikor ile baglanir, bundan sonra T hücreleri bispesifik antikorun serbest CD3 kolu tarafindan etkilenir ve daha sonra T hücresi aktivasyonu gerçeklesir. Alternatif olarak CD3 pozitif T hücreleri ve CLEClZA-pozitif tümör hücreleri, bispesifik antikor ile esas olarak es zamanli sekilde baglanir. Bu nedenle hem CLEC12A için hem de immün efektör hücreler üzerindeki bir antijen, CD3, için afiniteler tercihen dogru denge elde edilecek sekilde, diger bir ifadeyle ortaya çikan bispesifik antikorlar CLEC12A ve CD35ü esas olarak es zamanli olarak baglayacak sekilde veya bispesifik antikorlar, CLECIZA-pozitif tümör hücrelerini yeterli bir ölçüde baglamak üzere bir egiliine sahip olacak sekilde seçilir veya modüle edilir, bundan sonra T hücre aktivasyonu gerçeklesir ve tümör hücreleri parçalanir. Mevcut bulusa göre CD3 ve CLEC12A için baglanma afiniteleri arasindaki bu tür mükemmel denge tercihen Fab kolu sahip bir VH”nin Fab kollari ait CDR dizilerine (veya bütün VH dizisine) sahip bir VH ile kombine edilerek gerçeklestirilir. Bu tür ortaya çikan bispesitik antikorlar, CD3 ve CLEC12A için baglanma atiniteleri arasinda uygun bir denge gösterir, böylece T hücreleri ve CLEC12A-pozitif AML tümör hücreleri etkili bir sekilde bir araya getirilir ve 01574-P-0003 CLEC12A-pozitif AML tümör hücrelerinin T hücre aracili parçalanmasi optimal olarak indüklenir.
Burada açiklandigi üzere istemlere göre bir bispesifik lgG antikor saglanir burada her iki kol, bir ortak hafif zincir degisken domeni içerir. Özellikle tercih edilen ortak hafif zincir, ayrica 012 olarak adlandirilan insan yeniden düzenlenmis kappa dizisi Sekil 20”de gösterilir. CDR dizileri, koyu ve alti çizilidir. Bu nedenle en azindan 012`nin CDR dizilerini içeren bir ortak hafif zincir içeren bulusa göre bir bispesifik antikor saglanir. Bulusun bir açisi bu nedenle bulusa göre bir bispesifik olan bir diziden olusan bir hafif zincir CDRl dizisi ve AASSLQS ile ayni olan bir diziden olusan bir hafif zincir CDR2 dizisi ve QQSYSTPPT ile ayni olan bir diziden olusan bir hafif zincir CDR3 dizisini içerir. Bulusa göre bir bispesifik lgG antikor, 012 VL zinciri ile ayni olan bir VL dizisini içerir. Ayrica bu nedenle bulusa göre bir bispesifik IgG antikor saglanir, burada birinci ve ikinci kollar, asagidaki ile ayni olan bir diziden olusan bir VL dizisini içerir Tanim yoluyla bulusa göre bir bispesifik tam uzunlukta IgG antikor, iki farkli antijen baglanma alanina sahiptir ancak IgGinin Fc bölgesi ayrica bir PC reseptörü için üçüncü bir baglanma alani içerir. Bir hücrenin hem bir PC reseptörü hem de bispesifik antikorun hedeflerinden birini tasimasi halinde FC reseptörü ve söz konusu hedefin söz konusu hücre yüzeyi içinde çapraz baglanmasi meydana gelebilir, bu istenmeyen etkilere yol açabilir. Tercih edilen bir düzenlemede bulus, bulusa göre bir bispesifik tam uzunlukta IgG antikor saglar burada söz konusu bispesifik IgG antikor, mutasyona ugramis alt mentese ve/veya CH2 domenlerine sahiptir, böylece söz konusu bispesifik lgG antikorun Fc gamma (F cv) reseptörleri ile etkilesimi önemli ölçüde azaltilir. Burada kullanildigi üzere “böylece söz 01574-P-0003 konusu bispesitik lgG antikorun FC gamma reseptörleri ile etkilesimi önemli ölçüde azaltilir” terimi, bu tür FC gamma reseptörlerinin söz konusu antikor çevresinde bulunmasi halinde söz konusu bispesitîk lgG antikorun Fe gamma antikorlari ile etkilesime girme kabiliyetinin azaltildigi anlamina gelir. Dolayisiyla bulusa göre bir antikor bölgesi, tercihen antikorun alt mentese ve/veya CH2 domeni mutasyona ugratilir (tipik olarak bunu kodlayan mutasyona ugramis bir nükleik asit dizisinin ifade edilmesi ile) böylelikle bir PC reseptörü ile etkilesime girme kabiliyeti azaltilir. Fc reseptörü ile etkilesimin esas olarak ortadan kaldirilmasi tercih edilir. Fcy reseptörlerine baglanmaya dahil edilen insan sadece spesifik reseptörlere baglanmayi gelistiren veya es zamanli olarak bir reseptör türüne baglanmayi gelistiren ve diger türe baglanmayi azaltan kalintilara ek olarak birkaç kalintinin, bir veya daha fazla reseptöre baglanmayi ortadan konusu mutasyona ugramis alt mentese ve/veya CH2 domenleri, amino asit pozisyonlari 235 ve/veya 236°da (Kabat°a göre numaralandirma) en az bir sübstitüsyon içerir. Tercihen her iki amino asit pozisyonu 235 ve 236 sübstitüe edilir. Örneklerde bu alanlardaki sübstitüsyonlarin tümör hücreleri üzerinde bulunan FC reseptör ile bispesifik antikor arasindaki etkilesimi esas olarak önleyebildigi gösterilir. Özellikle sübstitüsyonlar L235G ve/veya G236R”nin bu amaç için oldukça uygun oldugu gösterilir. Söz konusu mutasyona ugramis CH2 ve/veya alt mentese domenlerinin sübstitüsyon L235G ve/veya G236R7yi içerdigi, bulusa göre bir bispesifik lgG antikor bu nedenle burada saglanir. Tercihen hem L235G hem de G236R sübstitüe edilir. Alternatif olarak teknikte uzman bir kisi, mutasyonlarini uygulayabilir (Oganesyan et al. Biol. Crystall. 2008(D64)700).
Tercihen bu üç sübstitüsyon bu alternatifte uygulanir.
US usule uygun basvuru No. 13/866,747 ve PCT basvuru 01574-P-0003 tek bir hücreden bispesifik antikorlarin üretilmesine yönelik yöntemler ve yollar açiklanir, böylelikle monospesifik antikorlarin olusumuna göre bispesifik antikorlarin olusumunu uygun gören yollar saglanir. Bu yöntemler ayrica mevcut bulusta uygun sekilde kullanilabilir. Dolayisiyla bulus, tek bir hücreden bulusa göre bir bispesifik tam uzunlukta lgG antikorun üretilmesine yönelik istemlere bir yöntem saglar. Söz konusu birinci ve ikinci nükleik asit molekülleri, ayni vektörü veya gen dagitim aracinin parçasi olabilir ve konakçi hücre genomunun ayni alaninda entegre edilebilir. Alternatif olarak söz konusu birinci ve ikinci nükleik asit inolekülleri söz konusu hücreye ayri olarak saglanir.
Tercih edilen bir düzenleme, tek bir hücreden bulusa göre bir tam uzunlukta bispesifik IgG antikorun üretilmesine yönelik bir yöntem saglar, burada söz konusu bispesifik lgG antikor, bir arayüzü olusturabilen iki CH3 doinenini içerir, söz konusu yöntem asagidakilerin saglanmasini içerir: - a) CLEC12A°yi spesifik olarak taniyan ve bir 1”inci CH3 domenini içeren söz konusu IgG agir zinciri kodlayan bir birinci nükleik asit dizisine ve b) immün efektör hücreler üzerindeki bir antijeni, CD3, spesifik olarak taniyan ve 27inci bir CH3 domenini içeren ikinci bir nükleik asit dizisine sahip bir hücre, burada söz konusu nükleik asit dizileri, söz konusu lsinci ve 2”nci domenlerin tercihen eslestirilmesine yönelik yollar ile saglanir, söz konusu yöntem ayrica söz konusu hücrenin kültürleninesi ve söz konusu iki nükleik asit dizisinin ifadesine olanak taninmasi ve söz konusu bispesifik IgG antikorun kültürden hasat edilmesi adimini içerir. söz konusu hücre ayrica istemlere bir ortak hafif zinciri kodlayan üçüncü bir nükleik asit dizisine sahiptir. Tercih edilen bir ortak hafif zincir, yukarida açiklandigi üzere 012, tercihen yeniden düzenlenmis germ hatti insan kappa hafif zincir IgVK1-39*01/IGJK1*01°dir. Esas olarak sadece bispesifik tam uzunlukta lgG moleküllerini üretmek üzere tercih edilen mutasyonlar, birinci CH3 domeninde amino asit sübstitüsyonlari L351K ve T3661( (Kabafa göre numaralandirma) ve ikinci CH3 domeninde 01574-P-0003 amino asit sübstitüsyonlari L351D ve L368E veya tam tersidir. Ayrica bu nedenle bir bispesifik IgGl antikorun saglanmasina yönelik bir yöntem saglanir, burada söz konusu birinci CH3 domeni, amino asit sübstitüsyonlari L351K ve T366K (Kabatia göre numaralandirma) içerir ve burada söz konusu ikinci Ch3 domeni, amino asit sübstitüsyonlari L351D ve L368E içerir, söz konusu yöntem ayrica söz konusu hücrenin kültürlenmesi ve söz konusu nükleik asit dizilerinin ifadesine olanak taninmasi ve söz konusu bispesifik antikorun kültürden hasat edilmesi adimini içerir. Ayrica bir bispesifik IgG] antikorun üretilmesine yönelik bulusa göre bir yöntemdir, burada söz konusu birinci CH3 domeni, amino asit sübstitüsyonlari L351D ve L368E (KabaFa göre numaralandirma) içerir ve burada söz konusu ikinci CH3 domeni, amino asit sübstitüsyonlari L351K ve T3661( içerir, söz konusu yöntem ayrica söz konusu hücrenin kültürlenmesi ve söz konusu nükleik asit dizilerinin ifadesine olanak taninmasi ve söz konusu bispesifik antikorun kültürden hasat edilmesi adimini içerir. Bu yöntemler ile üretilen antikorlar ayrica mevcut bulusun parçasidir.
Bulus ayrica bulusa göre bir bispesifik IgG antikor ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren farmasötik bir bilesim saglar. Burada kullanildigi üzere bu tür'farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici' herhangi bir veya tüm solventleri, tuzlari, dispersiyon ortami, kaplamalar, antibakteriyel ve antifungal ajanlar, izotonik ve absorpsiyon geciktirici ajanlar ve fizyolojik olarak uyumlu olan benzeri unsurlari içerir. Uygulama yoluna bagli olarak (örnegin intravenöz, subkütanöz, intra-artiküler ve benzeri) aktif bilesik, bilesigi asitlerin hareketinden ve bilesigi inaktif hale getirebilen diger dogal kosullardan korumak üzere bir materyal ile kaplanabilir.
Bulusa göre antikorlar ve farmasötik bilesimler, miyeloid kökenli ön-lösemik hastaliklar ve çesitli lösemilerin ve ayrica B hücreli lenfomalarin tedavisinde kullanim bulur. Bulusa göre tedavi edilebilen hastaliklar, miyeloid lösemiler veya 01574-P-0003 ön-lösemik hastaliklar örnegin AML, MDS ve CML ve Hodgkin lenfoma ve çogu Hodgkin olmayan lenfomalari içerir. Dolayisiyla bulus,` miyelodisplastik sendrom (MDS), kronik miyeloid lösemi (CML) veya tercihen akut miyeloid lösemi (AML) tedavisinde bir farmasötik olarak kullanima yönelik bulusa göre bir bispesifik tam uzunlukta IgG antikor saglar. Ayrica bulusa göre bir bispesifik IgG antikorun miyelodisplastik sendrom (MDS)` kronik miyeloid lösemi (CML) veya tercihen akut miyeloid lösemi (AML) tedavisi veya önlenmesi için bir ilacin hazirlanmasina kullanimi tasarlanir.
Bir hastaya uygulanacak bulusa göre antikorun miktari tipik olarak terapötik pencerededir, yani miktar bir esik kabul edilemez ölçüde yan etkilere yol açan bir esik degeri asmazken terapötik bir etkinin elde edilmesi için yeterli bir miktarinin kullanilmasi ifade edilir. Istenen bir terapötik etkinin elde edilmesi için gereken antikor miktari ne kadar düsük olursa terapötik pencere tipik olarak o kadar büyük olacaktir. Bu nedenle düsük dozajda yeterli terapötik etkileri sunan bulusa göre bir antikor tercih edilir.
Yaklasik olarak her yil 30.000 hastaya, Avrupa ve Birlesik Devletlerde akut miyeloid lösemi (AML) teshisi koyuluyor. Bu hastalarin çogunlugu 60 yaslarinda veya daha yaslidir. Daha yaslilar, AMLideki sonucun major negatif belirleyicisidir ve yogun sekilde tedavi edilen daha yasli AML hastalarinin uzun süreli sag kalimi (5 yil) yaklasik olarak %103dur. Kemoterapinin baslamasi üzerinde remisyon gerçeklestirilen hemen hemen tüin hastalarda hastalik ilerlemesi, 3 yil içinde gözlenir. Mevcut remisyon sonrasi tedavi, AMLili daha yasli hastalarda bulunmasi halinde sinirli deger göstermistir. Bu nedenle rezidüel dirençli löseminin önemli bir yükü kalir ve ilaç dirençli lösemik hücrelerin sag kalan alt popülasyonu hizli bir sekilde nüksetme olusturur. Tamamen farkli etki modlari olan yeni ilaç türlerinin, tam remisyonu indüklemek ve sürdürmek üzere çalismalarda bu kemoterapiye yanit vermeyen AML tümör hücrelerini hedef almasi gerekir. Tam remisyon (CR), oldukça yasli AML hastalarinin %50°sinden fazlasinda ve daha genç hastalarda %80 civarinda yogun birkaç kemoterapi 01574-P-0003 kombinasyonu ile geçeklestirilebilir, yanittaki veya sap kalimdaki ilerlemeler önemli arastirilmasi gereken bir sorun olarak kalmistir. AML”li daha yasli hastalarda 60 randomize klinik denemenin (15.10 hasta) yeni yayinlanan bir ag meta analizinde düzenlenen arastirma asamasindaki indüksiyon rejimlerinin çogu, daunorubisin ve sitarabin ile klasik 3+7 indüksiyon rejimine kiyasla benzer veya hatta daha kötü etkinlik profillerine sahiptir. Bu standart AML tedavisi, yüksek hastalik orani ve hatta ölüm orani ile iliskilidir. CR`de hastalarin çogunlugu, kemoterapi sonrasi geri kalan lösemik kök hücreler nedeniyle kötüye gider.
Ayrica doz yogunlastirma, kabul edilemez toksisite nedeniyle sinirlidir. Tercihen daha az toksisite ile yeni tedavi modellerine yönelik acil bir ihtiyaç, özellikle AML”li oldukça yasli hastalarda ortaya çikar.
Kemoterapiye yanit vermeyen AML tedavisi, hastanin immün sisteminden ve AMLT tümör hücrelerinden alinan T hücrelerinin bir bispesitîk antikor kullanilarak baglanmasi ile gerçeklestirebilmistir. Bu sekilde hastanin immün sistemi güçlendirilir ve AML tümör hücrelerine saldirmak ve bunlari yok etmek üzere yeniden hedef alinir. Mevcut bulus, AML tümör hücre parçalanmasini etkili bir sekilde indükleyen CD3xCLEC12A bispesifik IgG antikorlari saglar.
CD3XCLEC12A bispesifik antikorlar dolayisiyla AML hastalarinin prognozunu gelistirmek amaciyla lösemik kök hücrelerini spesifik olarak yok eden daha az yan etkisi olan hedeflenmis bir terapidir. CLEC12A”nin lösemik kök hücreler (LSC) üzerinde ifade edilmesi ve normal hematopoietik kök hücreler üzerinde ifade edilmemesi nedeniyle bu antijene yönelik terapi (in vitro gösterildigi gibi), normal kök hücreyi ayirirken LSC”yi yok edecektir. Minimal Rezidüel Hastalik (MRD) durumlarinda büyük olasilikla en büyük etkiye sahip olacaktir. Beklenen sonuç, MRD'nin ortadan kaldirilmasi nedeniyle kötüye gitme yüzdesinin düsmesidir. Bu nedenle bu yeni tedavi modelinin AML hastasina yönelik etki, daha iyi bir yasam kalitesi ile iliskili bir sonuç iyilesmesi ile sonuçlanan daha düsük bir kötüye gitme yüzdesi ile daha az toksik bir tedavi olacaktir. Bu tam uzunlukta IgG bispesifik antikorlar, kötüye giden AML hastalarinda klinik olarak degerlendirilir. Klinik etkinlik, amaçlanan yanit kriteri olarak kemik iliginde 01574-P-0003 AML blast azalmasi kullanilarak analiz edilir. AML için etkili bir bispesifik IgG, mevcut durumda kullanilabilir herhangi bir tedavinin bulunmadigi büyük bir hasta segmenti için yeni terapötik bir seçecek saglar. Saglam remisyonlar elde etmek üzere bir yolun saglanmasina ek olarak bu tedavi seçenegi ayrica remisyon boyunca uygulandiginda AML için küratif bir potansiyele sahiptir. ÖRNEKLER Örnek 1: Bir aday CD3xCLEC12 bispesifik lgG1”in üretimi ve fonksiyonel karakterizasyonu Bir iinmün efektör hücrenin bir bispesifik tam uzunlukta IgG ile anormal bir hücreye hedeflenmesi konseptini dogrulamak üzere bir aday CD3XCLEC12A bispesifik lgGl üretilmistir, buna yönelik olarak CD3 ve CLEC12A Fab kollari daha önceden açiklanan antikorlardan türetilmistir. CD3 Fab kolonda 15C3°ten VH bölgesi kullanilmistir ve bu VH, '3056' olarak refere edilir. antikorlardan biri, scFv SC02-3573den VH bölgesi kullanilmistir (buradan sonra olarak bu VH, '3116' olarak refere edilir). CD3 koluna (3056) ait VH`nin nükleotid ve amino asit dizileri ve ayrica aday 3056x3116 olarak refere edilen, bu aday molekülün CLEC12A koluna (3116) ait VHinin nükleotid ve amino asit dizileri, Sekil 20ide saglanir. Ortak VL”nin (huVK1-39; 012) nükleotid ve amino asit dizileri de Sekil 203de saglanir.
Ilgili VH bölgeleri, yeniden düzenlenmis insan IGKVl-39/IGKJ 1 (huVKl-39) hafif zincir ile birlikte bispesifik IgGl üretimine yönelik teknikte bilinen kullanilarak ifade vektörlerine klonlanmistir. huVK1-39°un daha önceden birden fazla agir zincir ile eslesebildigi gösterilmistir, böylelikle çesitli spesifikliklere 01574-P-0003 sahip antikorlar meydana getirilmistir, bu durum bispesifik moleküllerin üretimini hücreleri üzerinde CD3s°e baglanmasi, akis sitometrisi ile gösterilmistir, bu teknikte bilinen standart prosedürlere göre gerçeklestirilmistir (Tablo 1). Hücre- ifade edilen CD38°e baglanma, CD3ö/e veya CD3y/e ile transfekte edilen CHO hücresi kullanilarak dogrulanmistir. Aday 3056x3116 bispesifik IgGliin CLEC12A°ya baglanma, ilgisiz bir IgGl izotip kontrol mAb`nin kontrol olarak alinmasinin yani sira bir CLEC12A ifade yapisi ile transfekte edilen CHO hücreleri; CD3 monospesifik antikor (3056x3056) ve CLECIZA monospesifîk antikor (31 16x31 16) kullanilarak belirlenmistir.
Tablo 1: Akis sitometrisi ile hücre-ifade edilen CD3 ve CLEC12A'ya baglanma lgC HPB-ALL hücreleri' (TLECllA- transfekte edilmis CHO hücrmri' (IDSXCLECIZA lzotip kontrolü ' 4 'L` ) CD3ö/e ve CLECIZASnin hücre disi domeni için aday 3056x3116 bispesifik Kisaca saflastirilmis rekombinant antijenler, serbest amin kimyasi kullanilarak bir CMS sensör çipi yüzeyine kovalent olarak baglanir: antijenler bir kAc tamponunda IOng/mliye seyreltilir ve NHS/EDC ile aktive edilen bir yüzeye 01574-P-0003 baglanir (üreticinin talimatlarina göre). Bispesifik antikorlarda bulunan Fab kollarinin atinitelerini belirlemek üzere bunlar, Hepes tamponlu salin (HBS) (`30ul/dakika) bir akis hizinda (yeniden baglanmayi önlemek üzere) CMS sensor çipinin antijen-bagli yüzeyi üzerinden akar. Akis hücresi (FCl), bir kontrol (baryum) yüzeyi olarak kullanilir ve bu yüzeyden ortaya çikan yanitlar (sensör gram), diger akis hücrelerinde (FC) ölçülen yanitlardan çikartilir. F C2 ve F C3, üç yüzeyin tümünde tek bir kinetik çalismada her iki Fab kolonun afinitelerini ölçebilmek üzere bispesifik antikorun tanidigi iki farkli antijen için kullanilir.
Antikor konsantrasyonu, bir antijen-bagli yüzey üzerinden aktiginda önemli ölçüde degismediginden bispesifik antikorlarin on-oranlari (konsantrasyona bagli) bunlarin tanidigi iki farkli antijen üzerinde es zainanli olarak ölçülür. Farkli bispesilik proteinlerin birlesme ve ayrisma fazlarmin sensörgrami bu sekilde elde edilir. BIA degerlendirme yazilimi ve bir 1:] etkilesim modelini (tek degerlikli etkilesim için) kullanildigi egri uydurma kullanilarak Fab kollarinin afiniteleri belirlenir. bispesifik proteinin sensör çipinin antij en-kapli yüzeyine baglanmasinin tehlikeli oldugu durumda 8diger bir ifadeyle oldukça az protein baglandiginda düsük yanitlar ve/veya oldukça hizli off-oranlari ile sonuçlanma) deney ayari ters çevrilir: bispesifik antikor serbest amin kimyasi kullanilarak sensör çipi yüzeyine kovalent olarak baglanir ve rekombinant saflastirilmis antijen, bu antij ene yönelik Fab kolunun afinitesini ölçmek üzere yüksek (30ul/dakika) bir akis hizinda yüzey üzerinden akar. test edilmistir. Öncelikle T-hücre uyarici kapasite, saglikli donör dinlenen T- hücreleri ile arastirilmistir. Kisaca periferik kan, sürekli bilgilendirme yapildiktan sonra saglikli donörlerden elde edilmistir. T-hücreler, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginlestirmek üzere standart yogunluklu gradyan izolasyonu ile akabinde manyetik boncuklarin kullanildigi negatif seçim (pan T-hücre kiti, Miltenyi Biotec, cat.no.130-091-155) ile izole edilmistir. Bu saflastirma stratejisi kullanilarak T-hücreleri. ön-aktivasyon olasiligini sinirlandirmak üzere 01574-P-0003 daha sonra iki gün 10:] olan bir efektörzhedef hücre oraninda %10 fötal bovin serumu (FBS) veya %10 normal insan serumu (HS) içinde lösemi türevli HL60 hücre hattindan alinan hücreler ile inkübe edilmistir. Sonuçlar, CD4-pozitif veya CBS-pozitif T-hücre popülasyonu içerisinde CD69-pozitif veya CD25-pozitif hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilmistir.
Hem iki degerlikli CD3 IgG hem de CD3XCLEC12A bispesifik IgG, CD4-pozitif ve CBS-pozitif T-hücreleri üzerinde T-hücre aktivasyon markörleri CD69 ve CD25”in yukari regülasyonunu etkili bir sekilde inkübe etmistir (SEKIL 2). HL60 hücreleri üzerindeki Fc reseptörlerini bloke etmeyen FBS varliginda (Liesveld et molekülü CD3Xizotip kontrol lgG”nin T-hücre aktivasyonunu indükledigi gösterilmistir. Bu etki, CD3Xizotip kontrol IgG”nin tek degerlikli Cd3 baglanmasi ile gözlenen T-hücre aktivasyonunun Fc çapraz baglanmaya bagli oldugu bispesifik IgG ile indüklenen T-hücre aktivasyonu, CD69 ve CD253i yukari regüle etme potansiyelinin büyük ölçüde HS varliginda muhafaza edilmesi (SEKIL 2) nedeniyle sadece kismen FC-etkilesimlerine baglidir. Bu, tek degerlikli CD3 baglanmasinin intrinsik potansiyelinin, baglanma molekülü diger Fab kolu ile baglanmayi takiben HL60 hedef hücreleri üzerindeki CLEC12A antijenine köprülendiginde T-hücrelerini aktive etmek için yeterli oldugunu göstermistir. ölçüsünün hedef hücre parçalanmasini indüklemek üzere yeterli olup olmadigini arastirmak üzere bu analizdeki HL60 hücreleri, karboksifloresin diasetat suksimidil ester (CFSE) ile etiketlenmistir ve çesitli efektörzhedef hücre oranlarinda T-hüoreleri ile birlikte kültürlenmistir. Bir, iki veya üç gün sonra sag kalan CFSE-pozitif HL60 hücrelerinin miktari akis sitometrisi ile belirlenmistir. 01574-P-0003 Sonuçlar, PBS ile iliskili spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifadesi olarak ifade edilmistir.
Beklenildigi üzere CD3 monospesifik iki degerlikli IgG, HL60 hücrelerinin dinlenen T-hücre aracili öldürülmesini indüklemistir (SEKIL 3). Sasirtici bir sekilde CD3XCLEC12A bispesifik tek degerlikli IgG ve kontrol CD3Xizotip kontrol ayrica HL60 hücrelerinin dinlenen T-hücre aracili öldürülmesini indüklemistir. Analiz, asiri insan lgG yoklugunda gerçeklestirildiginde, diger bir ifadeyle HL60 hedef hücreleri üzerindeki Fc reseptörleri bloke edilmediginde (FBS kosulu; SEKIL 3) bu etkiler, en baskin durumdadir. Sasirtici durumda asiri insan IgG (%10 HS kosulu) varliginda dahi CD3XCLEC12A bispesiiîk IgG, HL60 parçalanmasinin indüklenmesinin Fcy reseptör etkilesimlerine bagli olmadigini gösteren HL60 hücrelerinin öldürülmesinde oldukça etkilidir. 3. günde ayrica CD3Xizotip kontrol ile indüklenen HL60 parçalanmasi, büyük olasilikla uzamis inkübasyon periyotlari üzerine tam olmayan Fc-gamma reseptör blokaji nedeniyle gözenmistir. HL60 hedef` hücre öldürme, farkli efektörzhedef hücre oranlari ile degiskenlik göstermistir (SEKIL 4).
Sonuç olarak bu örnek, bir CD3XCLEC12A bispesifik molekülünün, T-hücre aracili tümör hücre parçalanmasinin güçlü bir indükleyicisi oldugu gösterir ve anormal hücrelerin etkili öldürülmesine yönelik T hücre baglantisina bir CD3XCLEC12A tam uzunlukta lgGl bispesifik antikorun aracilik edebildigi hipotezini dogrular. Sasirtici bir sekilde CD3XCLEC12A bispesifik lgG ile indüklenen aktivite, Fcy reseptör etkilesimlerine bagli degildir. Nihai klinik bir adaya ulasmak amaciyla CD3XCLEC12A bispesifik tam uzunlukta IgG panelini genisletmek üzere CD3 Fab kollari ve CLEC12A Fab kollari panelleri üretilir.
CD3 ve CLEC12A Fab kollarinin spesifikligi ve fonksiyonelliginin validasyonu, gelen ilgili Fab kullanilarak diger kolun sabitlenmesi ile yapilir. 01574-P-0003 Örnek 2: CD3xCLEC12 bsAb için CD3 Fab kollarinin üretimi ve karakterizasyonu Örnek 1, CD3XCLEC12A bispesifik moleküllerinin, T-hücre aracili tümör hücresi parçalanmasinin güçlü indükleyicileri olabildigini göstermistir. Bu nedenle bu tür bispesifik moleküllerinin daha genis panellerini üretmek üzere CD3 baglayicilarinin ayri panellerinin yani sira CLEC12A baglayicilari üretilmistir.
CD3 baglayicilannin bir panelinin üretimi için CD3e-spesifik VH bölgeleri, çesitli formatlarda CD3:: ile bir insan agir zincir (HC) mini lokusu için ve huVK1-39 adjuvan ile veya bu olniaksizin teknik bilindigi üzere bir tasiyici moleküle (insan lgG-Fc veya bir His-tag gibi) birlesik sekilde kaynastirilabilen izole CD3ö/s veya CD3'y/c, (2) CD3ö/c veya CD3y/s`ü ifade eden hücreler veya (3) CD3ö/z: veya CD3'y/3°ü kodlayan DNA yapisi veya bu stratejilerin bir kombinasyonu. ELISA ve/veya akis sitometrisi ile belirlendigi üzere yeterli bir antijen-spesifik titre gösteren immünize farelerden, F ab faz kütüphanelerinin üretildigi dalaklar ve/veya lenf dügümleri hasat edilmistir. Alternatif olarak VH bölge dizileri, derin dizileme ile dalak ve lenf dügüm materyalinden direkt olarak türetilir (birlikte beklemede olan US provizyonel basvuru 61/ 539,1 16).
Antijen-spesifik Fab kollari, huVK1-39 hafif zincirinin VL bölgesini ve insan VH bölgelerinin bir koleksiyonunu içeren sentetik faj gösterim kütüphanelerinden veya immünize farelerden gelen faj kütüphanelerinden seçilir. Sentetik kütüphanelerin üretimi için, randomize CDR3 primerleri, De Kruif et al. 1995, J kütüphanelerden gelen bakteriyofailar, bir tasiyici moleküle (yukari bakiniz) baglanabilen izole edilmis CD3ö/s proteinine veya HPB-ALL gibi CD3s,ü ifade eden hücrelere veya CD3ö/s veya CD3'y/eii ifade etmek üzere transfekte edilen hücrelere baglanma veya bu stratejilerin bir kombinasyonuna yönelik birçok rauntta seçilir. Baglanmayan fajlar, uzaklastirilir ve baglanma fajlari, bir asidik 01574-P-0003 tampon ile veya seçilen Fab repertuvarini istenen bir spesifiklige yönlendirmek üzere spesifik bir epitopa karsi antikorlar ile, örnegin sinomolgus CD3a°e çapraz reaktif olan antikorlar ile ayristirilir. Bu fajlar daha sonra faj içeren bakteri için seçim basinci altinda büyütülen kompetan bakterilere transfekte edilir. Sag kalan birkaç bakteri kolonisinin toplanmasindan sonra fajlar kurtarilir ve sonraki seçim raunduna sunulur.
Seçim tamamlandiktan sonra geri kalan fajlar, akis sitometrisi ile hücre-ifade edilen antijene ve ELISA ile izole edilmis antijene baglanma için taranir.
Baglanma için pozitif bir kontrol olarak ölçüt CD3 antikorlari, örnegin OKT-3 gibi teknikte gösterilen sekilde kullanilir. Antijen ifade eden hücrelere spesifik baglanma gösteren esas olarak tüm fajlardan alinan nükleotid materyali, VH bölgelerini çogaltmak üzere koloni PCR ve VH bölge dizisini belirlemek üzere dizi PCR°sine sunulur. Ortaya çikan diziler, bunlarin HCDR3”lerinin benzersizligine dayanarak kümelenir. (Sinirli) somatik hiper mutasyonun meydana gelebildigi immünize farelerden türetilen diziler için VH dizileri ayrica benzersiz bir VDJ olasiligina dayanarak gruplandirilir (diger bir ifadeyle farkli kümelerdeki HCDR37ün, <2 amino asit farkliligi içermesi halinde bunlar ayni kümenin parçasi olarak düsünülür ve birlikte gruplandirilir). Her bir kümeden küme basina bir veya birkaç VH bölgesi, huVicl-39 hafif zincir ile baglantili olarak bir IgG monospesifik iki degerlikli format halinde ifade için vektörlere klonlama için seçilir. Izole edilen antijen veya hücre-ifade eden antijene spesifik baglanmaya yönelik VH bölgeleri dogrulanir ve daha sonra bir CD3XCLEC12A bispesifik formatinda ifade için vektörlere klonlanir. Bunlar daha sonra, terapötik potansiyeli olan bir aday seçmek üzere karakterize edilir (bakiniz asagidaki örnekler). 01574-P-0003 Örnek 3: CD3xCLEC12 bsAb için CLEC12 Fab kollarinin üretimi ve karakterizasyonu CD3XCLEC12A bispesifik moleküllerinin, T-hücre aracili tümör hücre parçalanmasini indüklemek üzere potansiyele sahi oldugu Örnek 1`de gösterildigi üzere daha sonra bu tür bispesifik moleküllerin daha genis panellerinin belirlenmesi istenmistir. Örnek 2`de açiklandigi üzere CD3 baglayicilarinin paneline ek olarak ayrica bir CLEC12A baglayici paneli üretilmistir.
Kisaca CLEC12A-spesifik Fab kollari, yeniden düzenlenen insan IGKVl- 39/IGKJl VL bölgesini ve insan VH bölgelerinin bir koleksiyonunu içeren Fab sentetik faj gösterim kütüphanelerinden seçilmistir (De Kruif et al. Biotechnol baglanma için iki rauntta seçilmistir. Bu, bir yüzeye kaplanan bir His-tag (Sino ila 275) hücre disi domeni ile inkübasyon yoluyla yapilmistir. Baglanmayan fajlar uzaklastirilmistir, baglanan fajlar kimyasal olarak ayristirilmistir ve faj içeren bakteriler için seçim basinci altinda büyütülen bakterileri enfekte etmek üzere kullanilmistir. Sag kalan birkaç bakteri kolonisinin toplanmasindan sonra fajlar kurtarilir ve sonraki seçim ve yayilma raunduna sunulur.
Seçim tamamlandiktan sonra geri kalan fajlar, akis sitometrisi ile tümör hatti HL60 üzerinde ifade edilen CLEC12A°ya baglanma için taranmistir. Baglanma için pozitif bir kontrol olarak CD3 ölçüt antikorlari kullanilmistir. CLEC12A ifade eden hücrelere spesifik baglanma gösteren esas olarak tüm fajlardan alinan nükleotid materyali, VH bölgelerini çogaltmak üzere koloni PCR ve VH bölge dizisini belirlemek üzere dizi PCR”sine sunulmustur. Ortaya çikan diziler, bunlarin HCDR3”lerinin benzersizligina dayanarak kümelenmistir. Her bir benzersiz HCDR3 kümesinden Vl-l bölgeleri, yeniden düzenlenen insan lGKVl- 39/IGKJ1 LC ile baglantili olarak IgG monospesifik veya bispesifik formatlarda ifade için vektörlere klonlanmistir. 01574-P-0003 Benzersiz bir HCDR3 dizisi ile seçilen üç CLEC12A baglanma molekülü, asagidaki karakteristiklere sahip IgG formatinda istenen profili göstermistir (Tablo 2 ve veriler gösterilmemistir): CLEC12A°nin izole edilmis hücre disi domenine spesifik baglanma.
Bir tümör hücre hatti üzerinde ifade edilen CLEC12A`ya spesifik baglanma.
Insan PBMC üzerinde miyeloid soya spesifik ifade deseninin dogrulanmasi.
Tablo 2: CLEC12A Fab kollarinin karakterizasyonu uzunlugu baglanma'ya hucrelere baglanmau ölçütü ile epitop için rekabet*** 4331 0 [328 1 mo Evet sonuçlar` optik yogunluk olarak verilmistir (arkaplan sinyal izotip kontrolü: 0.127). sonuçlar. ortalama floresan yogunlugu olarak verilmistir (arkaplan sinyal izotip kontrolü: 116). m 20 pglml'de ölçüt IgG'ye karsi. Fab formati ile ELISA'da test edilmistir. Örnek 4: CDSXCLECIZ bsAb için fonksiyonel CLEC12 Fab kolomin seçilmesi Örnek 3”te açiklandigi üzere seçilen CLEC12A Fab kollari daha sonra sabit bir kol olarak yeni bir CD3 Fab kolu ile bispesifik lgG formatinda ifade edilmistir. 01574-P-0003 ayrica huVK1-39 hafif zinciri kullanilir. Bu CD3-spesifik VH aday 3896“ya ait nükleotid ve amino asit dizileri Sekil 20`de gösterilir. Dolayisiyla çesitli bispesifik CD3XCLEC12A molekülleri, ayni tüm 3896 anti-CD3 koluna sahip ancak CLEC12A kolunda farklilasan (CLEC12A ölçüt kolu veya aday CLEC12A Fab CD3XCLEC12A bispesifik molekülleri daha sonra Örnek 1`de açiklanan sekilde bir hedef hücre parçalama analizinde fonksiyonel açidan test edilmistir. Sonuçlari izotip kontrol ile iliskili spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifade edilmistir. Tüm aday CLEC12A Fab kollari, CLEC12A ölçüt Fab kolu kullanildiginda buna benzer veya bundan daha iyi olan kinetikler ile bispesifik formatta HL60 hedef hücrelerin doza bagimli spesifik parçalanmasini göstermistir (SEKIL 5).
Ayrica, 1 log daha yüksek konsantrasyonlar ayni ölçüde spesifik parçalanma için gerekli olmasina ragmen CD3Xizotip kontrol bsAb, bir doza bagimli hedef hücre parçalanmasi göstermistir. HS ilavesi yoluyla asiri insan IgG varliginda ragmen bu tek degerlikli CD3 lgGanin öldürme aktivitesi, büyük olasilikla Fc aracili çapraz baglama ile hala görünürdür. Örnek 77den belirgin olacagi üzere bu hedef spesifik olmayan parçalanma aslinda, CH2 mühendisligi ile Fc reseptör etkilesiminin susturulmasi vasitasiyla tamamen ortadan kaldirilabilir. Örnek 5: AML T hücreleri ve/veya AML tümör hücreleri kullanilarak CD3XCLEC12 ürün adaylarinin etkinligi Örnekler 1 ve 4, saglikli donör dinlenen T hücrelerinin aracilik ettigi HL60 hedef hücre parçalanmasinin indüklenmesinde CD3 Fab kolu 3056 veya 3896 ölçüt Fab kolu 3116 kullanilarak CD3XCLEC12A bispesifik IgG potansiyelini göstermistir. Mevcut örnekte, bir CD3XCLEC12A bispesifik ilacin terapötik uygulamasi için primer belirtilerden biri olan, AML°1i hastalardan türetilen T hücrelerin bir CD3XCLEC12A bispesifik tam uzunlukta IgG ile uyarilma 01574-P-0003 üzerinde tümör hedeflerini öldürmek üzere uyarilip uyarilamadigi arastirilmistir.
Daha sonra hasta türevli T hücrelerin, bir CD3XCLEC12A bispesifik tam uzunlukta IgG ile uyarilma üzerinde otolog AML tümör hücre blastlarini öldürüp öldüremedigi belirlenir.
T-hücreler, Örnek 1`de açiklanan prosedürlere göre AML hastalarinin periferik kanindan izole edilir. Saflastirilmis hasta türevli T hücreleri daha sonra CFSE- etiketli HL60 hücreleri ile inkübe edilir ve Örnek 1°de açiklanan sekilde hücre parçalanmasi için izlenir.
Ek olarak T-hücre aracili hedef hücre parçalanmasinin analizi, ayni hastadan izole edilen AML tümör blastlari ile gerçeklestirilir (Norde et al. Blood 2009 (113)2312). Izole edilen blastlar daha sonra CFSE ile etiketlenir ve Norde Vd.`de açiklanan sitokin karisimi varliginda ve CD3XCLEC12A bispesifik IgG veya kontroller varliginda otolog hasta-türevli T hücreleri ile birlikte kültürlenir. Hedef hücre parçalanmasi, Örnek 1”de açiklanan sekilde izlenir. Örnek 6: CD3XCLEC12A bispesifik IgG ile temastan sonra T hücreleri ile sitokin salimi T-hücre uyarici biyolojikaller kullanilarak T hücrelerinin asiri uyarilmasi, sitokin salim sendromuna yol açabilmesinden dolayi ciddi bir risktir (Suntharalingam et indüklenen T-hücre uyarilma ölçüsünü arastirmak üzere T-hücre sitokinlerinin indüksiyonu, T-hücrelerinin ve F0 reseptör ifade eden hedef hücrelerin bir es kültüründe çalisilmistir.
Kisaca saglikli donör dinlenen T hücreleri, Örnek lide açiklandigi üzere aday veya kontrol IgG varliginda HL60 hedef hücreleri ile birlikte kültürlenmistir. Iki gün sonra üst faz numune 01574-P-0003 olarak alinmistir ve Sitokin üretim seviyeleri, insan Sitokin Human IO-Plex Panel (Invitrogen, cat.n0.LI-IC0001) kullanilarak teknikte bilinen sekilde bir Luminex analizinde belirlenmistir. Bu panel, on majör Thl ve Th2 sitokinini kaplar.
Beklenildigi üzere nionospesif'ik iki degerlikli IgG, güçlü IFNy, TNFOL ve IL-2 üretimini indüklemistir (Tablo 3), bunun esas olarak Sitokin salim sendromunu tahrik ettigi düsünülür. Ek olarak IL-4, IL-6, IL-8 ve IL-10 üretimi, CD3 lgG ile inkübasyon yoluyla arttirilmistir. Bunun aksine CD3XCLEC12A bispesifik lgG sadece IL-8 üretimi CD3 IgG ile benzer bir seviyeye kadar indüklemistir; diger sitokinler, bispesifik lgG tarafindan önemli ölçüde indüklenmemistir. GM-CSF, herhangi bir durumda tespit sinirinin altindadir.
Tablo 3: T hücreleri ile antikor iiidükl'i'i stokin salimi Sitokin CD3 lgG CDJXCLECIZA lgG CD3Xizotip kontrolü Sonuçlar, pg/ml iki donör ± standart sapma cinsinden ortalama sitokin Burada gösterilen veriler, CD3 IgG ile gözlemlenen pro-inflamatuvar sitokinkilerin potansiyel olarak zararli miktarlarini salgilamak üzere T-hücrelerini tetiklemeksizin hedef hücre parçalanmasini yogun sekilde indüklediginden 01574-P-0003 (Örnekler 1 ve 4) farkli CD3XCLEC12A bispesifik IgG molekülleri için uygun terapötik bir profil sunar. Örnek 7: CD3XCLEC12A bsAbinin in vitro etkinligi üzerindeki Fc susturma Örnek 4`te gösterilen CD3Xiz0tip kontrol bsAb ile doza bagimli hedef hücre parçalanmasinin, HL60 hedef hücreleri üzerinde Fc reseptörleri ile bsAb Fc parçasinin etkilesiini nedeniyle oldugu belirtilmistir. Bu tür spesifik olinayan hücre parçalanmasi in vi'vo meydana gelebildiginden hedef hücreleri üzerinde veya NK hücreleri gibi seyirci hücreler üzerinde Fc reseptörleri ile etkilesim yoluyla CHZ/alt mentese bölgesinin mühendisligi, bsAb”nin Fc-aracili aktivitesinin susmasini indüklemek üzere kullanilmistir.
Bunun için iki Fc mutasyon stratejisi, bir 235G 236R ikili mutasyon (DM; DM- incelenmistir. Bir DM-Fc veya bir TM-Fc ile CD3XCLEC12A bsAbs (3056x3116), üretilmistir ve dogal sus PC ile bsAb olarak ayni yogunlukta akis sitometrisi ile CLEC12A ifade eden hücrelere baglanmak üzere dogrulanmistir (veriler gösterilmemistir). Daha sonra bu bsAb”ler ve CD3Xizotip kontrol bsAb°nin dogal sus, DM-Fc ve TM-Fc versiyonlari, HL60 hedef hücre parçalanma analizinde test edilmistir (bakiniz Örnekler 1 ve 4). Sonuçlar, izotip kontrolü ile iliskili spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifade edilmistir.
DM ile veya TM ile FC susturina islemi, CD3XCLEC12A bsAb ile indüklenen HL60 hücre spesifik parçalanmasinin ölçüsü üzerinde sifir veya sadece çok az bir etkiye sahiptir (SEKIL 6). Ancak CD3Xizotip kontrol bsAb için HL60 hücre parçalanmasini indüklemek üzere potansiyel, TM ile veya hatta ayrica DM ile önemli ölçüde azaltilmistir. 01574-P-0003 Bu, CHZ/alt mentese mühendisligi ile Fc susturma isleminin ayrica efektör hücreleri etkili bir sekilde ve spesifik olarak kuvvetlendiren bir bispesifik CD3XCLEC12A IgGl formati olusturularak anormal hücrelerin hedefe spesifik ölmesine katkida bulunur ve normal Fcy reseptör ifade eden yardimci hücrelerin aracilik ettigi potansiyel spesifik olmayan immün aktivasyonunu azaltir. Örnek 8: Fc susturma isleminin FcRn, CD16, CD32, CD64 ve Clq'ya baglanma üzerinde etkisi veya bir TM-Fc ile insan FcRnZye baglanmasi, Bio-Layer Interferometre (BLI, Octet QK, FortéBio) araciligiyla belirlenmistir. Kisaca saflastirilmis CD3XCLEC12A WT Fc lgGl, DM-Fc [gG] veya TM-Fc IgGl, oda sicakliginda içeren 0.1 M fosfat tampon/%0.002Tween20 içinde 50 ug/ml°lik bir konsantrasyonda Protein L biosensors°e (FortéBio, Cat no 18-5085) yakalanmistir. Daha sonra çözünür insan FcRn (Sino Biological Inc, CT009-H08H, oda sicakliginda FcRn-Binding tamponunda 1 ug/ml7lik konsantrasyonda eklenmistir. Octet QK analiz yaziliminin kullanildigi veri analizi, ProtL sensörüne lgG baglanmasina yönelik normallesme üzerine CD3XCLEC12A bsAbinin DM veya TM susturulmus PC ile insan FcRn`ye baglanmasinin dogal sus Fc-kuyrugu olan (SEKIL 7) CD3XCLEC12A bsAb ile karsilastirilabilir oldugunu ve dolayisiyla Fc susturma isleminin FcRn baglanmasini etkilemedigini göstermistir.
Susturulmus FC ile CD3XCLEC12A bsAb°nin CD16, CD32 ve CD64°ya baglanmasi, Bio-Layer Interferometre (BLI, Octet QK, FortéBio) ile belirlenmistir. Kisaca protokol: saflastirilmis CD3XCLEC12A WT Fc IgGl, DM- Pc IgGl veya TM-Fc IgGl, oda sicakliginda 1x Kinetics Tamponu (FortéBio 18- 5032) içinde 50 ug/mFlik bir konsantrasyonda Protein L biosensors”e (FortéBio, Cat no 18-5085) yakalanmistir. Daha sonrasinda rekombinant CD16 (Sino 01574-P-0003 CD64 (Sino Biological Inc, 10256-H08H) protein, oda sicakliginda Kinetics Tamponunda (FortéBio 18-5032) 1.0 ug/mldik konsantrasyonda eklenir. FCR reseptörlerinin bsAbaye baglanmasi, Octet QK analiz yazilimi kullanilarak analiz edilmistir.
CD3XCLEC12A bsAb°nin susturulmus FC ile insan C lq”ya baglanmasi, yakalama ELISA araciligiyla belirlenmistir. Bu amaçla sailastirilmis CD3XCLEC12A WT Fc IgGl, DM-Fc lgGl veya TM-Fc IgGl, 4C`de Nunc- ug/ml°lik bir konsantrasyon araliginda kaplanir. Daha sonrasinda insan Clq (Quidel, A 2.0 tig/mFde eklenir.
Kompleks daha sonra koyun-anti-insan Clq poliklonal lgG (Meridian, K90020C) ve tavsan-anti-koyun HRP konjuge poliklonal lgG (Southern Biotech, 6150-05) kullanilarak görsellestirilir. Daha sonra TMB substrati (BD 51-2606KC/51- 2607KC) kullanilarak baglanma gelistirilir ve OD450, bir Mikro plaka okuyucu (Multiskan EX, Thermo Electron Corporation) kullanilarak miktari belirlenir. Örnek 9: CD3xCLEC12A bispesitîk IgG,nin in vivo etkinliginin degerlendirilmesi Lusiferaz ifade eden HL60 hücrelerinin (HL60(-Luc) hücreleri) kullanildigi hayvan ksenogreft çalismalari, CD3XCLEC12A bispesifik lgGl kullanilarak in vitro bulgulari dogrulamak ve genisletmek üzere gerçeklestirilir. Daha spesifik olarak bu çalismalar, Faz 1 klinik degerlendirme için baslangiç dozunun ayarlanmasinda göz önüne alinacak, etkili dozlarda sabit durum plazma konsantrasyonlarini belirlemek üzere gerçeklestirilir. Bu amaçla NOD/SCID fareleri (veya karsilastirilabilir immün-hasar görmüs fareler), enjeksiyon üzerine iki hafta içerisinde hayvanlarin çogunda subkütanöz HL60 tümörlerinin olusmasi ile sonuçlanan bir miktar yasayabilir HL60(-Luc) hücreleri ile subkütanöz olarak enjekte edilir. HL60(Luc) inokülasyonu ile paralel olarak veya baslangiçtaki tümör alimi üzerine 5x10E6 veya lxlOE7 insan PBMC uygulanir. 01574-P-0003 CD3XCLEC12A bispesitik IgG veya kontrol monospesifik veya kontrol bispesifik seviyesinde intravenöz olarak uygulanir. Tümör boyutlari, baslangiçtaki HL60(Luc) inokülasyondan 1 hafta sonra skorlanmistir. Her bir gruptan tümör boyutlarinin aritmetik ortalamasi (tümör hacimleri olarak veya toplam biyolüminesans olarak gösterilmistir) zamana karsi isaretlenmistir. Örnek 10: Bir faz la/lb çalismasinda bir bispesifik tam uzunlukta lgGl antikor CD3XCLEC12A,nin kullanimi Nihai lider CD3XCLEC12A bispesilik tam uzunlukta IgGl adayi, GMP dereceli materyali üretmek üzere kullanilir ve AML hastalarinda klinik olarak degerlendirilir. Öncelikle ürün adayinin forma] klinik olmayan bir güvenlik analizi, öncelikle insan çalismalarinda güvenli bir baslangiç dozunu belirlemek üzere gerçeklestirilir. Buradan sonra bir açik-etiket, çok-merkezli doz arttirma Fazi la/b denemesi, i.v. uygulama üzerine CD3XCLEC12A bispesifik lgG°nin güvenlik ve tolere edilebilirligini kesfetmek üzere, nükseden ve/veya refraktör AML7de ve yogun tedavi için uygun olmayan hastalarda gerçeklestirilir. Ikinci] son noktalar, farmakokinetik ve farmakodinamik karakterizasyon ve preliminer etkinlik analizi içerir. Tüm yanit oranlari, kemik iliginde AML blast azalmasinin degerlendirilmesi ile degerlendirilir. Faz Iaida maksimum tolere edilen doz (MTD), tekli/çoklu doz arttirma üzerine degerlendirilir. Geçici PK analizinden sonra çalismanin Faz lb parçasi, MTDide bir doz uzatma kohortunu gerektirir veya dozlama sikliginin daha fazla arastirilmasini gerektirir. Örnek 11: CD3XCLEC12A bsAb7nin T hücre proliferasyonunu indükleme kapasitesi AML°li hastalarda T hücre sayisi, tanida AML blastlarinin miktari ile karsilastirildiginda düsüktür. T hücrelerinin, artan bir T hücre sayisi ile sonuçlanan aktivasyon üzerine proliferasyon geçirdigi iyi bilinir. Ek olarak örnek 01574-P-0003 1”de bir CD3XCLEC12A bsAb”nin T hücrelerini aktive edebildigi ve T-hücre aracili tümör hücre parçalanmasini indükleme potansiyeline sahip oldugu gösterilmistir. CD3XCLEC12A bsAb ile tedavi edilen AML hastalarinin, T hücre proliferasyonunun yüksek sayida efektör T hücre ile sonuçlanmasi nedeniyle CD3XCLEC12A bispesifik molekül aracili T hücre aktivasyonu üzerine T hücre alt kümelerinin genislemesinden faydalandigi var sayilmistir. CD3XCLEC12A bsAb`nin in vitro T hücre proliferasyonunu indükledigini göstermek üzere dinlenen T hücreleri saflastirilmistir, karboksifloresin diasetat suksimidil ester (CFSE) ile etiketlenmistir ve CD3XCLEC12A bsAb veya kontrol Abs varliginda otolog CLEC12A+ monositleri ile birlikte kültürlenmistir. Spesifik olmayan Fc gamma aktivasyonu olmaksizin CD3XCLEC12A indüklü T hücre proliferasyonunu spesifik olarak arastirmak üzere Örnekler 7 ve 8`de açiklandigi üzere DM-Fc kuyrugu olan CD3XCLECl2A bsAb kullanilmistir. Kontroller olarak bir CD3xizotip kontrol WT-Fc bsAb, bir CD3xizotip kontrol DM-Fc bsAb, WT-Fc ile bir monoklonal CD3 ve ilgisiz bir izotip kontrol (IgG with WT-FC) dahil edilmistir. Saglikli donör periferik kandan alinan monositler ve T hücreler, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginlestirmek üzere standart yogunluklu gradyan izolasyonu ile akabinde CD14 mikro boncuklar (insan CD14 mikro boncuklar, Miltenyi Biotec, cat.no. 130-050-201) kullanilarak monositlere yönelik bir Cd14 pozitif seçim ve diger lökositlere karsi manyetik boncuklar kullanilarak dokunulmamis T hücrelerinin negatif bir seçimi (pan T-hücre izolasyon kiti, Miltenyi Biotec, cat.no. 130-096-535) ile izole edilmistir. Pan T- hücre izolasyon kiti, T hücrelerinin ön-aktivasyon olasiligini önleyerek dinlenen (dokunulmamis) T hücrelerinin (diger bir ifadeyle antikorlar ile boyanmamis) izolasyonuna olanak tanir.
CFSE-etiketli saflastirilmis dinlenen T hücreleri daha sonra yedi gün 521 olan bir efektörzhedef hücre oraninda %10 normal insan serumu (HS) ile ortamda saflastirilmis monositler ve bsAb°ler ile inkübe edilmistir. 7. günde T hücre proliferasyonuna yönelik okunan deger olarak CFSE sinyalinin azalmasi, akis 01574-P-0003 sitometrisi ile ölçülmüstür. Sonuçlar, histogramlarda CD3+, CD3+CD4+ veya CD3+CD8+ T hücreleri basina CFSE sinyali olarak ifade edilmistir.
Pozitif kontrol CD3 WT-Fc Ab, T hücre proliferasyonunu indüklerken izotip kontrol lgG With WT-Fc, T hücre proliferasyonunu indüklememistir (Sekil 8).
Beklenildigi üzere CD3xizotip kontrol WT-Fc, T hücre proliferasyonunu indüklememistir ancak iki degerlikli monospesifik anti-CD3 IgG kontrol ile karsilastirildiginda düsük bir ölçüde indüklemistir. Bunun aksine CD3xizotip kontrol DM-Fc bsAb, bunun susturulmus Fc-kuyrugu nedeniyle T hücre proliferasyonunu indüklememistir. CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb ayrica CLEC12A antijeni ile CD3°ün spesifik olarak baglanmasi ile aracilik edilen istenen T hücre proliferasyonunu indüklemistir.
Bu, bir CD3XCLEC12A bsAb,nin sadece daha önce gösterildigi üzere T hücre aracili tümör parçalanmasinin spesifik indüksiyonunu hedeflemedigini ayni zamanda artan sayida T hücresi ile sonuçlanarak spesifik T hücre proliferasyonunu güçlü sekilde indükleyebildigini gösterir. Ek olarak bu ayrica CHZ/alt mentese mühendisligi ile Fc susturma isleminin sadece anormal hücrelerinin hedef-spesifik ölümüne degil ayni zamanda CD3XCLEC12A DM-Fc bsAb IgG ile T hücre proliferasyonunun hedef-spesifik indüksiyonuna katkida bulundugunu gösterir. Örnek 12: AML hastalarindan TEMRA alt kümesinin CD3XCLEC12A indüklü genislemesinin degerlendirilmesi T hücre proliferasyonunun aktivasyonu, CD3xCLEC12 DM-Fc bsAb için gösterildiginde CD3XCLEC12A DM-Fc bsAbanin AML hastalarinda CD8+ sitotoksik T hücre kompartimaninin proliferasyonunu indükleyip indüklemediginin arastirilmasi istenmistir. CD8+ sitotoksik T hücreleri, tümör regresyonuna aracilik eden ana efektörler olarak bilinmektedir (Sluijter et al., 01574-P-0003 merkezi bellek (TCM, CCR7+CD45RA-), efektör bellek (TEM, CCR7-CD45RA-) ve CD45RA+ efektör bellek (TEMRA, CCR7-CD45RA+) hücreleri. Çalismalar, naif ve bellek CD8+ T-hücre alt kümelerinin TCR uyarilmasina yanit olarak prolifere olmak ve farklilasmak için farkli kapasitelere sahip oldugunu gösterir (Geginat et al., 2003). Öncelikle klinik remisyonda AML hastalarinin periferik kanindaki CD8+ kompartimani, saglikli donörlere kiyasla analiz edilmistir. Bu amaçla PBMC”ler, akis sitometrisi araciligiyla CD8+ T hücre alt kümelerini analiz etmek üzere CCR7, CD3, CD4, CDS, CD45RA ve CD45RO antikorlari ile boyanmistir.
Sonuçlar, toplam CD8+ T hücre kompartimaninda bir alt küme yüzdesi olarak ifade edilmistir.
Daha önce açiklanana analog olarak naif CD8+ T hüre alt kümesinin, saglikli bireylerden alinan naif CD8+ T hücre alt kümesine kiyasla AML hastalarindan alinan kanda azaltilirken TEMRA kompartimani (CCR7-CD45RA+), saglikli donörlere kiyasla AML hastalarinda arttirilmistir (Sekil 9).
Daha sonra deneyler, AML hastasi T hücre kompartimaninin hedefe spesifik T hücre proliferasyonunu çalismak üzere gerçeklestirilir. Daha spesifik olarak bu deneyler, CD3XCLEC12A DM-Fc bsAbinin AML hastalarinin naif CD8+ T hücrelerine göre AML hastalarinin efektör T hücre alt kümelerinin (TEM ve TEMRA) T hücre proliferasyonunu ve disa büyümesini arttirip artiramadigini belirlemek üzere gerçeklestirilir.
Bu amaçla klinik remisyonda AML hastalarindan alinan dinlenen T hücreleri, örnek 11'e göre saflastirilmistir. Gün = 07da CD8+ T hücre alt kümelerinin bilesimi, PBMC With CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA ve CD45RO antikorlarinin boyanmasi ile, akabinde akis sitometri analizi ile analiz edilir. Ek olarak dinlenen T hücreleri, CFSE ile etiketlenir veya etiketlenmez (örnek 11°de açiklandigi üzere CFSE etiketleme) ve 7 gün kontrol veya test antikorlari ile 511 01574-P-0003 olan bir E:T oraninda HL60 lösemi hücreleri ile birlikte kültürlenir. CFSE etiketli T hücreleri, T hücre proliferasyoriuriun miktarinin belirlenmesi için kullanilirken etiketlenmemis T hücreleri, prolifere edilen T hücre alt kümelerinin yüzdesini belirlemek üzere kullanilmistir. CFSE-etiketli ve etiketlenmemis T hücreleri, l ug/ml°de WT-Fc ile PBS, izotip kontrol WT-Fc Ab, CD3XCLEC12A DM-Fc bsAb, CD3xizotip kontrol DM-Fc bsAb ve CD3 monoklonal Ab ile inkübe edilir. 7 gün sonra CFSE etiketli T hücre, CD3, CD4 ve CD8 antikorlari ile boyanir ve mutlak T hücre sayisini ve hücre bölünmesi sayisini belirlemek üzere FACS analizine tabi tutulurken etiketlenmemis CFSE T hücreleri, akis sitometrisi araciligiyla prolifere edilen CD8+ T hücre alt kümelerinin bilesimini belirlemek üzere CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA ve CD45RO antikorlari ile boyanir. T hücre proliferasyonu, histogramlarda T hücre alt kümesi basina CFSE sinyali olarak ifade edilir ve dört CD8+ T hücre alt kümesinin boyutu, toplam CD8+ T hücre kompartimani içerisindeki yüzde olarak ifade edilir. Örnek 13: CD3XCLEC12A bsAb1nin AML hasta T hücre aracili tümör hücre parçalanmasini indükleme etkinligi. Örnek l”de bir CD3XCLEC12A bsAbinin saglikli donörlerden alinan dinlenen T hücreleri ile CLEC12A-pozitif HL60 hücrelerinin Öldürülmesini indükleyebildigi gösterilmistir. Daha sonra CD3XCLEC12A bsAbinin AML hastasi T hücrelerinin hedef-spesifik aktivasyonunu indükleme kapasitesi ve HL60 hücrelerinin AML hastasi T hücre aracili ölmesini indükleme kapasitesi arastirilmistir.
T hücreleri, örnek 11°de açiklandigi üzere pan T-hücre izolasyon kiti kullanilarak klinik remisyonda AML hastalarinin (AML FAB siniflandirma AML-Ml/MZ, M4 veya M5) donuk periferik kanindan izole edilmistir. SaIlastirilmis AML hasta türevli dinlenen T hücreleri daha sonra PBS, izotip kontrol WT-Fc Ab, CD3XCLEC12A DM-Fc, CD3xizotip DM-Fc varliginda iki gün 5:] olan bir efektörzhedef hücre oraninda %10 normal HS ve pozitif kontrol CD3 WT-Fc Ab (tüm antikorlar 1 ug/ml”lik konsantrasyondadir) ile desteklenen CSFE etiketli 01574-P-0003 HL60 hücreleri ile inkübe edilmistir. Iki günlük birlikte kültür isleminden sonra T hücre aktivasyonu, CD3, CD4 ve CD25 için akis sitometri analizi ile belirlenmistir. Bu sonuçlar, CD4+ T hücreleri basina CD25+ hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edilmistir. Ek olarak CFSE-pozitif HL60 hücrelerin miktari akis sitometrisi ile belirlenmistir. Sonuçlar, IgG`ye göre spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifade edilmistir.
Bu veriler, saglikli donör ve CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb aracili AML hastasi T hücrelerinin antijene spesifik aktivasyonunun karsilastirilabilir oldugunu gösterir (Sekil 10A). Beklenildigi üzere CD3xizotip kontrol DM-Fc bsAb, ne saglikli donörün T hücre aktivasyonuna ne de AML hasta türevli T hücrelerini indüklememistir. AML hastasi türevli T hücreleri (%68 HL60 hücre parçalanmasi) araciligiyla HL60 hücrelerinin CD3XCLEC12A DM-Fc bsAb aracili parçalanmasinin, saglikli donör T hücrelerinki (%69 HL60 hücre parçalanmasi, Sekil IOB) ile karsilastirilabildigi gösterilmistir. Beklenildigi üzere CD3xizotip kontrol DM-Fc bsAb, ne AML hastasi T hücreleri ile ne de saglik donör T hücreleri ile HL60 hücrelerinin ölmesini indüklememistir. Dolayisiyla CD3XCLEC12A bispesifik molekül, bu T hücrelerinin AML hasta türevli olup olmadigi veya saglikli donörlerden alinip alinmadigina bakilmaksizin T hücre aracili tümör hücre parçalanmasinin güçlü bir indükleyicisidir.
CD3XCLEC12A bsAb”nin AML hasta T hücreleri ile HL60 tümör hücrelerinin güçlü parçalanmasini indükleme kapasitesine sahip oldugu gösterildiginde daha sonra CD3xCLECl2A bsAbanin AML T hücrelerinin spesifik aktivasyonunu hedef alma kapasitesi degerlendirilmistir. Ek olarak CD3xCLEC12A bsAb°nin AML türevli otolog T hücreleri ile primer CLECIZA-pozitif AML blastlarinin parçalanmasini indükleme kapasitesi belirlenmistir. Öncelikle, akis sitometri analizi ile belirlendigi üzere >%70 primer AML blasti içeren tani numunelerinde AML hastalarindan alinan donuk depolanan kemik iligi tavlanmistir, daha önce açiklandigi üzere %10 PCS, lOOng/ml GM-CSF, lOOng/ml G-CSF, SOng/ml IL-3, 25ng/m1 SCF ve 20ng/m1 Flt3L ile desteklenen IMDM ortaminda bir geve (O/N) 01574-P-0003 kültürlenmistir (Norde et al., 2009). O/N kültür isleminden sonra primer AML blastlari, akis sitometrisi araciligiyla CLECIZA, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD33, CD34, CD38, CD45 ve CDll7 yüzey ifadesi için fenotiplenmistir ve CFSE ile etiketlenmistir. Hasta klinik remisyon elde ettiginde toplanan, dinlenen otolog hasta türevli T hücreleri, örnek ll`de açiklandigi üzere pan T-hücre izolasyon kiti kullanilarak periferik kandan izole edilmistir. Daha sonrasinda AML blastlari, iki gün %10 HS olan ortamda 521 olan bir E:T oraninda dinlenen otolog T hücreleri ile birlikte kültürlenmistir. Test edilen kosullar PBS, izotip kontrol Ab WT-Fc, CD3xCLEC12A DM-Fc, CD3Xizotip kontrol DM-Fc ve pozitif kontrol CD3 WT-Fc Ab (tüm antikorlar 1 ug/mlsdedir) içermistir. Iki günlük birlikte kültürleme isleminden sonra T hücre aktivasyonu, CD3, CD4, CD8 ve CD25 için akis sitometri analizi ile belirlenmistir. Bu sonuçlar, CD4+ veya CD8+ AML T hücreleri basina CD25+ hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edilmistir. AML blast parçalanmasi, akis sitometrisi araciligiyla sag kalan CFSEJr/CD45'ÖW ikili pozitif AML blastlarinin miktarinin belirlenmesi ile belirlenmistir. Sonuçlar, lgG°ye göre spesifik blast parçalanmasinin yüzdesi olarak ifade edilmistir.
Bu veriler, CD3XCLEC12A DM-Fc bsAb”nin monoklonal CD3 WT-Fc pozitif kontrol Ab ile karsilastirilabilen AML T hücrelerinin AML blast hedef spesifik aktivasyonunu indükleme kapasitesine sahip oldugunu gösterir (Sekil llA/B). Ek olarak bu veriler, AML hastasi türevli T hücreleri ile otolog AML blastlarinin ölmesini indükleyen CD3xCLEC12A bsAb”nin monoklonal CD3 WT-Fc pozitif kontrol Ab ile indüklenen ölüm kadar güçlü oldugu gösterir (Sekil llC).
Beklenildigi üzere CD3xizotip kontrol DM-Fc Ab ile sifir veya minör AML blast ölümü indüklenmistir, bu, CD3xCLEC12A bsAbsnin aracilik ettigi gözlenen AML blast ölümünün esas larak T hücrelerinin antijene spesifik aktivasyonunun ve CLEC12A+ AML tümör hücrelerinin spesifik parçalanmasinin sonucu oldugu gösterir. Genel olarak bu çalisma, CD3XCLEC12A bsAb*nin AML hastasi T hücreleri ile CLEC12A pozitif tümör hücrelerinin ölümünü etkili bir sekilde indükleyebildigini gösterir. 01574-P-0003 Örnek 14: Spesifik olmayan sitokin salimi üzerinde F c-susturma etkisi Örnekler 7 ve 8°de CHZ/alt mentese mühendisligi (DM-Fe) araciligiyla Fc susturmasi olan CDBXCLEClZA bsAb IgGl formatinin Fcgamma reseptörleri için düsük afinite ile sonuçlandigi ve lösemi türevli HL60 hücre hattinin spesifik olmayan Fc reseptör aracili sitotoksisitesini ortadan kaldirdigi gösterilmistir. Daha sonra DM-Fc susturmasi ile bsAb IgGl formatinin, NK hücreleri gibi F 0 reseptör- pozitif seyirci hücrelerin varliginda spesifik olmayan Fc reseptör aracili sitotoksisiteyi ortadan kaldirip kaldirmadigi arastirilmistir. Bu çalismada otolog saglikli donör türevli dinlenen T hücreleri, NK hücreleri gibi diger Fc reseptör pozitif seyirci dogal efektör hücrelerin varliginda CLECIZA-pozitif monositlere karsi yeniden yönlendirilmistir. Bu airiaçla PBMC, yogunluk gradyan santrifüjasyon yoluyla saglikli donörlerden alinan heparinize periferik kandan izole edilmistir ve l*10^6 hücre/ml olan bir yogunlukta plakalanmistir. PBMC, WT-Fc ile PBS, izotip kontrol Ab, CD3XCLEC12A WT-Fc bsAb, CD3XCLEC12A DM-Fc bsAb, CD3Xizotip kontrol WT-Fc bsAb, CD3Xizotip kontrol DM-Fc bsAb veya CD3 monoklonal Ab varliginda %10 FBSlli ortamda iki gün kültürlenmistir. Iki günlük kültürden sonra sag kalan monositlerin miktari, CDl4 ifadesine bagli olarak akis sitometrisi ile belirlenmistir. Sonuçlar, lgG ile iliskili spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifade edilmistir.
CD3XCLEC12A bispesifik antikor için sadece DM-Fc bölgesinin varligi ile FC susturma isleininin monositlerin parçalanmasi üzerinde minör bir etkiye sahip oldugu gösterilmistir (Sekil 12). Bunun aksine CD3xizotip kontrol bsAb için, DM-Fc bölgesinin varligi ile Fc susturma islemi monositlerin spesifik olmayan parçalanmasini önemli ölçüde azaltmistir. Dolayisiyla CD3xCLEC12A bsAb7deki Fc susturma isleminin hedefe spesifik öldürmeye ayrica katkida bulundugu sonucuna varilir: CD3xCLEC12A DM-Fc bsAb, T hücrelerinin spesifik olarak kuvvetlendirir ve normal Fcy reseptörü ifade eden yardimci hücrelerin aracilik ettigi spesifik olmayan immün aktivasyonunu azaltir. 01574-P-0003 Daha sonra CD3xCLEC12A bsAb”deki DM mutasyonu yoluyla FC susturma isleminin, yardimci hücreler araciligiyla meydana gelen antikor terapileri ile yaygin klinik bir durum olan, sitokin salim sendromu (CRS) ile iliskili oldugu bilinen, sitokinlerin Fc reseptör aracili salimini ortadan kaldirip kaldirmadigi sorgulanmistir. Bu amaçla Sekil 13°te açiklanan monosit öldürme analizinin üst fazlarindaki sitokin profili, üreticinin talimatlarina göre Luminex platform (Invitrogen, LHCOOOI) için sitokin insan lO-plex paneli kullanilarak analiz edilmistir. Asagidaki insan sitokinlerinin profili, 2. gün üst fazindan ölçülmüstür: GM-CSF, IFN-y, IL-l ß, IL-2, IL-4, IL-S, IL-6, IL-8, IL-10 ve TNF-oi. Gösterilen sonuçlar, pg/ml cinsinden ölçülen sitokin konsantrasyonuna sahiptir. GM-CSF, gösterilmemistir).
Veriler, CD3xCLEC12A ve CD3xizotip kontrol bsAb°nin, WT-Fc kuyrugu ile her ikisinin lL-lß, lL-6, TNF-a, IL-lO, IL-2 ve lFN-y salimini indükledigini gösterir (Sekil 13). Ancak lL-8 için bir istisna olmakla birlikte, DM-Fc kuyrugunu tasidiginda CD3xCLEC12A ve CD3xizotip kontrol bsAb”de bu sitokinlerin sifir veya sadece oldukça düsük seviyeleri bulunmustur. Monositler ana IL-8 kaynagi oldugundan yüksek lL-8 seviyelerinin parçalanmis monositlerden salgilandigi varsayilir ve spesifik FCR aracili bir salimin sonucu degildir. bsAb IgG formatindaki DM mutasyonlari ile Pc susturma isleminin, CRS ile iliskili lL-lb, lL-6, TNF-OL, IL-2 ve IF N-y sitokinlerin Fc reseptör aracili salimini önemli ölçüde ortadan kaldirdigi sonucuna varilir. Genel olarak bu veriler, CHZ/alt mentese bölgesindeki DM mutasyonu ile Fc susturma isleminin, normal Fcy reseptör ifade eden yardimci hücrelerin aracilik ettigi potansiyel spesifik olmayan iminün aktivasyonunun ve inflamatuvar sitokinlerin iliskili salimini azaltilarak CD3xCLEC12A DM-bsAb araciligiyla efektör hücrelerin spesifik kuvvetlenmedi ve etkinliginin arttirilmasina katkida bulundugunu gösterir. 01574-P-0003 Tam uzunlukta iki degerlikli monoklonal anti-CD3 lgG olarak aday 3896”nin membran bagli CD3°e baglanmasi, CD3 ifade eden HPB-ALL hücreleri kullanilarak FACS analizi araciligiyla tam uzunlukta iki degerlikli monoklonal anti-CD3 [gG olarak aday 3056 ile karsilastirilmistir. Ilgisiz bir insan IgGl, bir izotip kontrol IgG olarak çalismistir. Akis sitometrisi, teknikte bilinen standart prosedürlere göre gerçeklestirilmistir. Sekil 14A`da gösterildigi üzere 3896 CD3 lgG, 3056 CD3 IgGade oldugu gibi HPB-ALL hücreleri üzerinde CD3”e doza bagimli sekilde baglanmistir.
Daha senra 3896 CD3 IgG”nin T-hücre proliferasyonunu indükleme kabiliyeti, mürin OKT3 CD3 antikor, 3056 CD3 lgG ve izotip kontrol lgG ile direkt karsilastirma ile test edilmistir. Kisaca antikorlar seri olarak seyreltilmistir ve 96- gözlü plakalarda immobilize edilmistir. Bagli olinayan IgGinin uzaklastirilmasi üzerine CFSE-etiketli T hücreleri eklenmistir ve 37°C°de inkübe edilmistir. 5. günde indüklenen T hücre proliferasyon seviyesi, akis sitometrisi ile analiz edilmistir. Sonuçlar, CFSE ifade seviyesindeki en az iki katlik bir azalmayi gösteren canli T hücrelerinin yüzdesi olarak ifade edilir ve sekil 14B3de gösterilir. lgG ve mürin OKT3”e kiyasla T hücre proliferasyonunun indüklenmesinden daha az güçlü oldugu gösterilmistir. Bu veriler, 3056 CD3 lgG ile karsilastirildiginda 3896 ile indüklendigi üzere T hücre proliferasyonunun azalmis seviyesinin, akis sitometrisi ile analiz edildigi üzere düsük CD3 baglanma kapasitesini yansittigini belirtir. Baglanmadaki bu fark, CD3 ve CLECIZA için baglanma afiniteleri arasinda uygun bir denge gösteren bir bispesifik antikor ile sonuçlanarak, istenen bir afiniteye sahip bir kolun seçilmesine olanak tanir, böylece T hücreleri ve CLEC12A-pozitif AML tümör hücreleri etkili bir sekilde bir araya getirilir ve CLECIZA-pozitif AML tümör hücrelerinin T hücre aracili parçalanmasi optimal olarak indüklenir. 01574-P-0003 Bir CD3XCLEC12A bispesiiik antikor formatta 3056 anti-CD3 kola karsi yeni 3896 anti-CD3 kolonun potansiyelini test etmek üzere örnek 4”ün (aday sitotoksisite analizinde direkt olarak karsilastirilmistir. Sonuçlar, sekil 15ite benzer potansiyele sahip oldugu gözlenmistir. Bu nedenle CLEC12A Fab kolu ayni iken, her iki bispesifik antikorun sadece bunlarin CD3 Fab kollarinda farklilasmasi nedeniyle 3896 CD3 Fab kolonun fonksiyonelliginin, CD3XCLEC12A bispesifik Ab°de 3056 CD3 Fab kolununki ile benzer oldugu sonucuna varilir. Düsük konsantrasyonlarda aday 3896x31169nin aday 3056x3116”dan daha iyi oldugu not edilir. Bu, burada daha önce açiklandigi üzere daha genis terapötik bir pencere saglamasi nedeniyle uygundur. Örnek 31te CLEC12A-spesifik Fab kollarinin bir paneli, faj gösterim kütüphanelerinden seçilmistir. Tüm CLEC12A baglanma molekülleri, huVk1-39 hafif zincirini içerir. Üç CLEC12A baglanma molekülü seçilmistir: Fab 3918, ait VH'nin ve ortak VL°nin (IGKV1-39; 012) nükleotid ve amino asit dizileri Sekil 20`de gösterilir.
Tam uzunlukta CLEC12A antikorlari, HL60 hücreleri ile ifade edilen CLEC12A”ya baglanma için test edilmistir. bagli CLEC12A”ya baglanmasi, CLEC12A ifade eden HL60 hücreleri kullanilarak FACS analizi araciligiyla CLEC12A Ölçütü antikor (3116) ile 01574-P-0003 karsilastirilmistir. Ilgisiz bir insan IgGl, bir izotip kontrol IgG olarak çalismistir.
Akis sitometrisi, teknikte bilinen standart prosedürlere göre gerçeklestirilmistir. benzer bir sekilde CLEC12A5ya baglanmistir. Diger iki antikor, 3918 CLEC12A bagimli iyi bir baglanma göstermistir. Bunlarin CLEC12A`ya baglanmasi, CLEC12A ölçütü antikor ile karsilastirildiginda bir sekilde düsük görünmüstür. bispesitik moleküllerin fonksiyonel olup olinadigi test edilmistir. için teknikte bilinen yöntemler kullanilarak ifade vektörlerine klonlanmistir.
Bu bispesifikler, daha önce açiklanan HL60 sitotoksisite analizinde fonksiyonellik için test edilmistir. Iki saglikli donörden (HDI ve HD2) alinan dinlenen T hücreleri, %10 HS varliginda 48 saat veya 5:1 olan bir E:T oraninda çesitli bispesifik antikor konsantrasyonlari varliginda CFSE etiketli HL60 hücreleri ile birlikte kültürlenmistir. Sag kalan CFSE-pozitif HL60 hücreleri, 2. günde akis sitometrisi ile miktari belirlenmistir. Sekil 17°deki sonuçlar, spesifik parçalanma yüzdesi olarak ifade edilir. Donör 1°den alinan T hücreleri (HD1; Sekil 17 üst panel) ve donör 2>den alinan T hücreleri (HDR2; sekilde 17 alt panel) ile iki ayri deney için tüm bispesifiklerin, yüksek konsantrasyonda inkübe edildiginde 3896XCLEC12A ölçüt bispesifik kadar güçlü oldugu gösterilmistir. 01574-P-0003 Özellikle bispesifik antikorlarin düsük konsantrasyonlarinda 3896x4327 ve oldugu gözlenmistir. Bu nedenle CD3 Fab kolu ayni iken bu bispesitik antikorlarin sadece bunlarin CLEC12A Fab kolunda farklilasmasi nedeniyle 4327 ve 4331 CLECl2A Fab kolunun fonksiyonelliginin, CLEClZA ölçütü Fab koluna kiyasla daha güçlü oldugu sonucuna varilabilir. Teoriye bagli kalinmak baglanma afinitesindeki bir farki yansitabilir veya CD3 ifade eden T hücreleri ile tümör hücrelerinin daha etkili bir çapraz baglanma islemine olanak taniyan farkli bir CLEC12A epitopunu hedef alabilirler. Örnek 2”de CLECl2A ölçütü antikorun Fab parçalarina karsi Fab formati olarak bir epitopa baglanma için rekabet ettigi gösterilmistir. Ancak bununla birlikte 4327 CLECIZA Fab, bu analizde baglanma için CLEC12A ölçütü IgG ile rekabet etmemistir (Tablo 2).
Bu deneyde 4327 CLEClZA lgG°ye ait tam uzunlukta lgG”nin CLECl2A ölçütü antikor ile CLEC12A°ya baglanma için rekabet edip etmedigi test edilmistir.
Kisaca HL60 hücreleri, 20 dakika buz üzerinde 50 ug/mlide primer antikor ile önceden inkübe edilmistir. Daha sonrasinda Oregon Green (OG)-etiketli (Invitrogen, cat.no. A10476) ikinci antikor, l ug/ml°de hücreler arti birinci antikora (OG-etiketli IgG -45 tig/ml ilavesinden sonra birinci antikor konsantrasyonu) eklenmistir. 20 dakika sonra hücreler yikanmistir ve FACS ile analiz edilmistir. lgG”nin CLEC12A7ya baglanma için rekabet ettigi sonucuna varilmistir. Bu, her 01574-P-0003 iki IgG°nin CLECIZA antijeni üzerinde yakindan iliskili bir epitopa baglandigini veya bunlarin, sterik engel nedeniyle her iki IgG”nin es zamanli baglanmasina olanak tanimayan farkli epitoplara baglandigini belirtir.
CLEC12A”ya yeterli baglayicilar ve bir CD3xCLEC12A bispesifik formatinda T hücre aracili ölümün güçlü indükleyicileri oldugu gösterilmistir. Bu zamana kadar bispesifik antikorlar, immünoglobülin agir zincir heterodimerizasyonun gerçeklestirilmesine yönelik bilinen yöntemler kullanilarak elde edilmistir (Gunasekaran et al.).
Birlikte bekleinede olan US ve PCT basvurularda (US usule uygun basvuru NO: hücreden bispesifik antikorlarin üretilmesine yönelik yöntemler ve yollar açiklanmistir, böylelikle monospesifik antikorlarin olusumuna göre bispesifik antikorlarin olusumun tercih eden yollar saglanir. Bu yöntemler ayrica uygun sekilde mevcut bulusta kullanilabilir. Spesifik olarak, esas olarak sadece bispesifik tam uzunlukta IgG moleküllerini üretmek üzere tercih edilen mutasyonlar birinci CH3 domenindeki (the 'KK-varyant' agir zincir) amino asit sübstitüsyonlari L351K ve T366K ve ikinci CH3 domenindeki ('DE-varyant' agir zincir) amino asit sübstitüsyonlari L351D ve L368E veya tam tersidir. DE-varyant ve KK-varyantin tercihen heterodimerleri ('DEKK' bispesiiik moleküller olarak adlandirilir) olusturmak üzere eslestigi birlikte beklemede olan US 13/866,747 ve agir zincirlerin (DEDE homodimerler) veya KK-varyant agir zincirlerin (KKKK homodimerler) homodimerizasyonu, ayni agir zincirler arasinda CH3-CH3 ara yüzündeki yüklü kalintilar arasindaki güçlü repulsiyon nedeniyle güçlü meydana 01574-P-0003 CD3XCLEC12A bispesifik moleküllerin, heterodimerizasyon (Gunasekaran) veya DEKK mutasyonlari için bilinen mutasyonlardan etkilenmedigini göstermek üzere DE-Varyant ve KK- varyant agir Zincirler, CD3XCLEC12A bispesifiklerin olusturulmasina yönelik farkli agir zincirlerin heterodimerizasyonunu tahrik etmek üzere kullanilmistir. Ek olarak CH2 / alt mentese ikili mutasyonlar (L23SG ve G236R; DM), bu DE- ve KK-Varyant agir zincirlere eklenmistir. Bu ortaya çikan bispesifik moleküllerin F c kuyrugu, 'DM DEKK' olarak refere edilir.
+ DM agir zincir içeren ifade vektörlerine klonlanirken 3056 CD3 antikorun VH bölgesi, KK-varyant + DM agir zincir (US usule uygun basvuru NO: 13/866,747 düzenlenmis insan lGKVl-39/lGKJl (huVKl-39) hafif zincir ile birlikte bu ifade vektörleri, konakçi hücre bispesifik antikorlari ifade edecek ve üretecek sekilde bir konakçi hücreye saglanmistir. Ortaya çikan 3056x3116 DM DEKK, sonrasinda daha önceden açiklandigi üzere HL60 sitotoksisite analizinde potansiyel için test edilmistir. Sonuçlar sekil 19”da gösterilir: tüm varyantlarin ala etkili tümör hücresi parçalama kapasitesinde oldugu gösterilmistir ve dolayisiyla DM ve DEKK mutasyonlarinin, tümör hücre parçalanmasini indükleme kapasitesi sürdürülürken CD3XCLEC12A bispesifik antikorun FC bölgesine eklenebildigi sonucuna varilmistir.
REFERANSLAR Blueinel et al. 2010 Cancer lmmunol. lmmunother. 59:] 197 01574-P-0003 Kipriyanov et al. 1998 Int.J.Can. 77:763 Lanzavecchia et al. 1987, Eur.J.lmm. 17:105 Oganesyan et al. Biol. Crystall. 2008(D64)700

Claims (1)

  1. ISTEMLER . Bir bispesitik insan lgG tam uzunlukta antikordur, burada söz konusu bispesifik lgG antikor, CLEClZA'yi spesifik olarak taniyan bir kol ve CD3”ü spesifik olarak taniyan ikinci bir kol içerir ve burada CLEC12A°yi spesifik olarak taniyan kol, QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQ GLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSE DTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGT LVTVSS ile ayni olan bir diziden olusan bir degisken agir zincir dizisi; veya ile ayni olan bir diziden olusan bir degisken agir zincir dizisi içerir, ve burada her iki kol, asagidaki ile ayni olan bir diziden olusan bir degisken hafif zincir dizisi içeren ortak bir haIif zincir içerir . Istem 1`e göre bispesiIik IgG antikordur, burada söz konusu antikor . Istemler 1-2”den herhangi birine göre bispesifik IgG antikordur, burada söz konusu bispesiIik antikor bir insan IgG1°dir. . Istemler 1-3°ten herhangi birine göre bispesifik IgG antikordur, burada CD3*ü spesifik olarak taniyan ikinci kol, SYGMH dizisinden olusan bir agir zincir CDRl dizisini ve llWYSGSKKN YADSVKG dizisinden olusan bir agir zincir CDR2 dizisini ve GTGYNWFDP dizisinden olusan bir agir zincir CDR3 dizisini içerir. . Istem 4`e göre bispesif'ik lgG antikordur, burada CD3°ü spesifik olarak taniyan ikinci kol, asagidaki diziden olusan bir degisken agir zincir dizisi lstemler 1-5iten herhangi birine göre bispesifik lgG antikordur, burada söz konusu bispesifik IgG antikor, söz konusu bispesifik IgG antikorun Fcy reseptörleri ile etkilesimi önemli ölçüde azaltilacak sekilde mutasyona ugramis CH2 ve/veya alt mentese doinenlerine sahiptir. Istem 6"ya göre bispesitik lgG antikordur, burada söz konusu mutasyona ugramis CH2 ve/veya alt mentese domenleri, amino asit pozisyonu 235 ve/veya 236”da (Kabat7a göre numaralandirma) en az bir sübstitüsyon . Istem 6 veya 7”ye göre bispesifik IgG antikordur, burada söz konusu mutasyona ugramis CH2 ve/Veya alt mentese domenleri, sübstitüsyon Istemler 1-8”den herhangi birine göre bir bispesifik IgG antikorun üretilmesine yönelik bir yöntemdir, burada söz konusu bispesifik lgG antikor, bir arayüzü olusturabilen iki CH3 domeni içerir, söz konusu yöntem asagidakilerin saglanmasini içerir: - a) CLEClZASyi spesifik olarak taniyan ve bir 1. CH3 domenini içeren söz konusu IgG agir zinciri kodlayan bir birinci nükleik asit dizisi ve b) CD3”ü spesifik olarak taniyan ve 2. bir CH3 domenini içeren söz konusu lgG agir zinciri kodlayan ikinci bir nükleik asit dizisine sahip bir hücre, burada söz konusu hücre, söz konusu ortak hafif zinciri kodlayan üçüncü bir nükleik asit dizisine sahiptir ve burada söz konusu nükleik asit dizileri, söz konusu 1. ve 2. CH3 domenlerinin tercihli eslesmesine yönelik mutasyonlar ile saglanir, söz konusu yöntem ayrica söz konusu hücrenin kültürlenmesi ve söz konusu nükleik asit dizilerinin ifadesine olanak taninmasi ve söz konusu bispesifik IgG antikorun kültürden hasat edilmesi adimini içerir. 10.Bir bispesifik lgGl antikorun üretilmesine yönelik istem 9”a göre bir yöntemdir, burada söz konusu birinci CH3 domeni amino asit sübstitüsyonlari L351K ve T366K°yi (Kabafa göre numaralandirma) içerir ve burada söz konusu ikinci CH3 domeni, amino asit sübstitüsyonlari L351D ve L368Esyi içerir, söz konusu yöntem ayrica söz konusu hücrenin kültürlenmesi ve söz konusu nükleik asit dizislerinin ifadesine olanak taninmasi ve söz konusu bispesitik antikorun kültürden 11.Bir farmasötik bilesimdir, istemler l-8iden herhangi birine göre bir bispesifik IgG antikor ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici 12.Istemler l-8”den herhangi birine göre bir bispesifik IgG antikordur, miyelodisplastik sendrom (MDS), kronik miyeloid lösemi (CML) veya tercihen akut miyeloid lösemi (AML) tedavisinde bir farmasötik olarak kullanima yöneliktir.
TR2018/15768T 2012-09-27 2013-09-27 T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları. TR201815768T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261706543P 2012-09-27 2012-09-27
US201361834915P 2013-06-14 2013-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201815768T4 true TR201815768T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=49382559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/15768T TR201815768T4 (tr) 2012-09-27 2013-09-27 T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları.

Country Status (27)

Country Link
US (2) US10358492B2 (tr)
EP (2) EP3470431A1 (tr)
JP (2) JP6471095B2 (tr)
KR (1) KR102390177B1 (tr)
CN (2) CN110066338B (tr)
AU (2) AU2013324527B9 (tr)
BR (1) BR112015006824A2 (tr)
CA (1) CA2889681C (tr)
CY (1) CY1120976T1 (tr)
DK (1) DK2900694T3 (tr)
EA (1) EA201590640A1 (tr)
ES (1) ES2692951T3 (tr)
HK (1) HK1211966A1 (tr)
HR (1) HRP20181717T1 (tr)
HU (1) HUE042040T2 (tr)
IL (1) IL237945B (tr)
LT (1) LT2900694T (tr)
MX (1) MX2015003885A (tr)
NZ (1) NZ630563A (tr)
PL (1) PL2900694T3 (tr)
PT (1) PT2900694T (tr)
RS (1) RS57910B1 (tr)
SG (2) SG11201502451QA (tr)
SI (1) SI2900694T1 (tr)
TR (1) TR201815768T4 (tr)
WO (1) WO2014051433A1 (tr)
ZA (1) ZA201502835B (tr)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP1523496B1 (en) 2002-07-18 2011-06-29 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
CA2647846C (en) 2006-03-31 2016-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
PE20081216A1 (es) 2006-09-01 2008-09-04 Therapeutic Human Polyclonals Inc Expresion mejorada de la inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgenicos no humanos
BRPI0817294A2 (pt) 2007-09-26 2015-03-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método de modificação do ponto isoelétrico de anticorpo via substituição de aminoácido em cdr.
SG190726A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP6393255B2 (ja) 2012-04-20 2018-09-19 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ヘテロ二量体のIgG様分子を生産する方法、ヘテロ二量体のIgG様分子、ヘテロ二量体の抗体、組み換え宿主細胞、医薬組成物、宿主細胞を作成する方法、および培養物
TR201815768T4 (tr) * 2012-09-27 2018-11-21 Merus Nv T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları.
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
CA2907429A1 (en) * 2013-07-04 2015-01-08 Rheinisch-Westfaelische Technische Hochschule Aachen A new fusion protein to target and treat acute myloid leukemia cells
BR112016006197B1 (pt) 2013-09-27 2023-04-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para produzir um anticorpo biespecífico de polipeptídeos
EP3786186A1 (en) 2014-02-28 2021-03-03 Merus N.V. Antibodies that bind egfr and erbb3
HUE052506T2 (hu) 2014-02-28 2021-05-28 Merus Nv Antitest, amely megköti az ERBB-2-t és az ERBB-3-at
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
CA2955465A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
EP3693391B1 (en) 2014-09-12 2024-08-21 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
RS60739B1 (sr) 2014-11-17 2020-09-30 Regeneron Pharma Postupci za lečenje tumora upotrebom cd3xcd20 bispecifičnog antitela
PL3221357T3 (pl) * 2014-11-20 2020-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Wspólne łańcuchy lekkie i sposoby zastosowania
DK3789402T3 (da) 2014-11-20 2022-09-19 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler og PD-1-aksebindende antagonister
WO2016130898A2 (en) * 2015-02-13 2016-08-18 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind ctla4
KR102625835B1 (ko) * 2015-03-04 2024-01-17 주식회사유한양행 Cd47에 결합하는 항체 치료제
AU2016242866B2 (en) 2015-03-30 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to FC gamma receptors
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2016205200A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and methods of use
ES2693596T3 (es) * 2015-07-10 2018-12-12 Merus N.V. Anticuerpo que se une a CD3 humano
CN108290951B (zh) * 2015-09-23 2022-04-01 瑞泽恩制药公司 优化抗cd3双特异性抗体和其用途
DK3365373T3 (da) 2015-10-23 2021-04-06 Merus Nv Bindingsmolekyler, der hæmmer cancervækst
CN108347906A (zh) * 2015-10-29 2018-07-31 豪夫迈·罗氏有限公司 具有共同轻链的转基因兔
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
EP3464365A1 (en) * 2016-06-01 2019-04-10 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
WO2018057915A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 The Regents Of The University Of Michigan Engineered lymphocytes
JP2020506971A (ja) 2017-02-08 2020-03-05 ドラゴンフライ セラピューティクス, インコーポレイテッド ナチュラルキラー細胞の活性化のための多重特異性結合タンパク質およびがんを処置するためのその治療的使用
WO2018152518A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Adimab, Llc Proteins binding her2, nkg2d and cd16
US20200231700A1 (en) * 2017-02-20 2020-07-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding gd2, nkg2d and cd16
SG11201908971RA (en) 2017-03-31 2019-10-30 Merus Nv Erbb-2 and erbb3 binding bispecific antibodies for use in the treatment f cells that have an nrg1 fusion gene
WO2018217947A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
MX2019013995A (es) * 2017-05-23 2020-07-29 Dragonfly Therapeutics Inc Una proteína que se une a nkg2d, cd16 y un antígeno asociado a un tumor.
AU2018297061B2 (en) * 2017-07-06 2021-05-06 Merus N.V. Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
EP3649155A1 (en) * 2017-07-06 2020-05-13 Merus N.V. Bispecific anti pd1-anti tim3 antibodies
SG11202000014UA (en) * 2017-07-06 2020-01-30 Merus Nv Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell
SG11202001050PA (en) 2017-08-09 2020-03-30 Merus Nv Antibodies that bind egfr and cmet
JP2020534269A (ja) * 2017-09-14 2020-11-26 ドラゴンフライ セラピューティクス, インコーポレイテッド Nkg2d、cd16、およびc型レクチン様分子−1(cll−1)に結合するタンパク質
US20200317783A1 (en) 2017-10-06 2020-10-08 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific antibody
US11161911B2 (en) 2017-10-23 2021-11-02 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-MUC1 antibodies and their uses
WO2019108065A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Merus N.V. Use of bispecific antibody and il-15 for combination therapy
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
TWI849895B (zh) * 2018-02-09 2024-07-21 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
JP2021519610A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 多価抗体
BR112020025048A2 (pt) 2018-06-13 2021-04-06 Novartis Ag Receptores de antígeno quimérico de bcma e usos dos mesmos
CA3102821A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Cugene Inc. Novel interleukin-15 (1l-15) fusion proteins and uses thereof
WO2020047389A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
CA3114707A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Regents Of The University Of Minnesota Nk engager molecules and methods of use thereof
WO2020086328A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Targeting clptm1l for treatment and prevention of cancer
CN114344461A (zh) * 2018-12-20 2022-04-15 美勒斯公司 用于治疗疾病的CLEC12AxCD3双特异性抗体和方法
MA54643A (fr) 2018-12-31 2021-11-10 Merus Nv Multimères multivalents tronqués
TW202039578A (zh) 2019-03-29 2020-11-01 荷蘭商美勒斯公司 Cd3結合分子
TW202102544A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
SG11202111731WA (en) 2019-05-04 2021-11-29 Inhibrx Inc Clec12a-binding polypeptides and uses thereof
TWI845231B (zh) 2019-07-05 2024-06-11 日商小野藥品工業股份有限公司 以pd-1/cd3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療
CA3149309A1 (en) 2019-07-30 2021-02-04 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific antibody
EP4011918A4 (en) 2019-08-08 2023-08-23 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. DUAL SPECIFIC PROTEIN
KR20220083760A (ko) * 2019-10-17 2022-06-20 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 Clec12a 항체 단편 서열 및 방법
EP4081306A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 Merus N.V. Tgf-beta-rii binding proteins
JP2023524997A (ja) * 2020-05-06 2023-06-14 ドラゴンフライ セラピューティクス, インコーポレイテッド Clec12aを標的とする抗体及びその使用
CN116547302A (zh) 2020-08-05 2023-08-04 蜻蜓疗法股份有限公司 靶向egfr的抗体及其用途
MX2023011710A (es) * 2021-04-26 2023-10-12 Millennium Pharm Inc Anticuerpos miembro a de la familia 12 del dominio de lectina de tipo c (anti-clec12a) y usos de los mismos.
WO2023002390A1 (en) * 2021-07-20 2023-01-26 Abl Bio Inc. Anti-cll-1 antibodies and uses thereof
US20230220106A1 (en) 2021-12-08 2023-07-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
GB202214132D0 (en) * 2022-09-27 2022-11-09 Coding Bio Ltd CLL1 binding molecules

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
FI884924A (fi) 1987-10-28 1989-04-29 Oncogen Humanimmuglobulin som producerats med hybrid-dna-teknik.
US5151504A (en) 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
CA2111858A1 (en) 1991-07-15 1993-02-04 James S. Crowe Production of antibodies
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
JP4213224B2 (ja) * 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック,インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
DK2163640T3 (da) 1999-04-15 2012-03-05 Crucell Holland Bv Rekombinant proteinproduktion i en human celle indeholdende mindst ét E1-protein af adenovirus
DK1808488T3 (da) 2001-07-04 2010-10-18 Chromagenics Bv DNA-sekvenser med anti-repressoraktivitet
EP1510943A4 (en) 2002-05-31 2007-05-09 Celestar Lexico Sciences Inc INTERACTION PREDICTION DEVICE
EP1523496B1 (en) * 2002-07-18 2011-06-29 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP1578947A4 (en) * 2002-12-02 2006-12-06 Abgenix Inc ANTIBODIES AGAINST A2 PHOSPHOLIPASE AND USES
NZ541458A (en) 2003-01-07 2006-04-28 Symphogen As Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
US20100069614A1 (en) * 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
EP1636265A2 (en) * 2003-06-25 2006-03-22 Crucell Holland B.V. Binding molecules for the treatment of myeloid cell malignancies
KR101266716B1 (ko) * 2004-06-03 2013-05-31 노비뮨 에스 에이 항-cd3 항체 및 그의 사용 방법
UA94211C2 (ru) * 2004-06-03 2011-04-26 Новиммюн С.А. Выделенное полностью человеческое моноклональное cd3 антитело
SE527196C2 (sv) 2004-07-08 2006-01-17 Chemel Ab SIRE genomflödesdetektor
EP1789446A2 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
US20060171929A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-03 The University Of Washington Regulation of dendritic cell functions by the DCAL-2 receptor
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
JP2008537941A (ja) * 2005-03-31 2008-10-02 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化特性を有するFc変異体
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
GB2429517B (en) 2005-07-15 2010-10-06 Viridian Concepts Ltd Solar collector devices
SG174779A1 (en) 2005-09-12 2011-10-28 Novimmune Sa Anti-cd3 antibody formulations
US20070198410A1 (en) 2005-10-18 2007-08-23 Labgold Marc R Credit fraud prevention systems and methods
SI1999154T1 (sl) 2006-03-24 2013-01-31 Merck Patent Gmbh Heterodimerne, z genskim inĺ˝eniringom spremenjene proteinske domene
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8290739B2 (en) 2006-10-20 2012-10-16 Amfit, Inc. Method for determining relative mobility of regions of an object
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CA2695374A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
WO2009051974A1 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Nuvelo, Inc. Antibodes to cll-1
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
EP2245571B1 (en) 2008-02-05 2019-04-10 Zymeworks Inc. Methods for determining correlated residues in a protein or other biopolymer using molecular dynamics
PT3456190T (pt) 2008-06-27 2022-02-15 Merus Nv Animal murino transgénico produtor de anticorpo
SG172977A1 (en) 2009-01-26 2011-08-29 Genmab As Methods for producing mixtures of antibodies
TW201544123A (zh) 2009-03-20 2015-12-01 Genentech Inc 抗-her抗體
ES2708124T3 (es) 2009-04-27 2019-04-08 Oncomed Pharm Inc Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas
SI2975051T1 (sl) * 2009-06-26 2021-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zlahka izolirana bispecifična protitelesa z nativnim imunoglobulinskim formatom
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
PL2501817T5 (pl) 2010-02-08 2021-08-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz o wspólnym łańcuchu lekkim
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2012020096A1 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
JP5997154B2 (ja) 2010-08-16 2016-09-28 ノビミューン エスアー 多重特異性多価抗体の生成方法
CA2815266C (en) 2010-11-05 2023-09-05 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
SG10201602371VA (en) 2011-03-25 2016-04-28 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
JP6393255B2 (ja) 2012-04-20 2018-09-19 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ ヘテロ二量体のIgG様分子を生産する方法、ヘテロ二量体のIgG様分子、ヘテロ二量体の抗体、組み換え宿主細胞、医薬組成物、宿主細胞を作成する方法、および培養物
TR201815768T4 (tr) * 2012-09-27 2018-11-21 Merus Nv T hücre bağlayıcılar olarak bispesifik IgG antikorları.
HUE052506T2 (hu) 2014-02-28 2021-05-28 Merus Nv Antitest, amely megköti az ERBB-2-t és az ERBB-3-at
EP3786186A1 (en) 2014-02-28 2021-03-03 Merus N.V. Antibodies that bind egfr and erbb3
ES2693596T3 (es) 2015-07-10 2018-12-12 Merus N.V. Anticuerpo que se une a CD3 humano

Also Published As

Publication number Publication date
JP6471095B2 (ja) 2019-02-20
US20140120096A1 (en) 2014-05-01
EP3470431A1 (en) 2019-04-17
KR102390177B1 (ko) 2022-04-26
DK2900694T3 (en) 2018-11-19
CN110066338A (zh) 2019-07-30
EP2900694A1 (en) 2015-08-05
HRP20181717T1 (hr) 2018-12-28
JP2019068803A (ja) 2019-05-09
AU2013324527B2 (en) 2018-05-24
CN105051066B (zh) 2019-08-06
CA2889681A1 (en) 2014-04-03
SG10201705787VA (en) 2017-08-30
IL237945B (en) 2022-04-01
CY1120976T1 (el) 2020-05-29
BR112015006824A2 (pt) 2017-07-04
HK1211966A1 (en) 2016-06-03
HUE042040T2 (hu) 2019-06-28
AU2018204173A1 (en) 2018-06-28
AU2013324527B9 (en) 2018-07-26
SG11201502451QA (en) 2015-05-28
CA2889681C (en) 2023-04-11
US10358492B2 (en) 2019-07-23
ZA201502835B (en) 2016-01-27
RS57910B1 (sr) 2019-01-31
PL2900694T3 (pl) 2018-12-31
LT2900694T (lt) 2018-11-12
MX2015003885A (es) 2015-07-06
US12060418B2 (en) 2024-08-13
US20190352393A1 (en) 2019-11-21
WO2014051433A1 (en) 2014-04-03
PT2900694T (pt) 2018-11-13
AU2013324527A1 (en) 2015-05-14
CN105051066A (zh) 2015-11-11
CN110066338B (zh) 2024-04-09
ES2692951T3 (es) 2018-12-05
KR20150076178A (ko) 2015-07-06
EA201590640A1 (ru) 2015-11-30
JP2015532278A (ja) 2015-11-09
SI2900694T1 (sl) 2018-12-31
EP2900694B1 (en) 2018-09-12
AU2018204173B2 (en) 2020-05-07
IL237945A0 (en) 2015-05-31
NZ630563A (en) 2017-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018204173B2 (en) Bispecific IgG antibodies as T cell engagers
EP3035965B1 (en) Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd123 and cd3, and uses therof
JP2022546905A (ja) 抗tnfr2抗体およびその使用
US20200062858A1 (en) Trispecific antigen binding proteins
WO2022161425A1 (zh) 抗tnfr2人源化抗体及其用途
JP2024144441A (ja) CLEC12AxCD3二重特異性抗体及び疾患の治療方法
EA040393B1 (ru) БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА КЛАССА IgG В КАЧЕСТВЕ РЕКРУТЕРОВ Т-КЛЕТОК
WO2023161530A1 (en) HUMANIZED CD1a TARGETING MOIETY FOR THE TREATMENT OF CD1A-POSITIVE CANCER
TW202207977A (zh) 包含t細胞重導向治療劑及vla-4黏附路徑抑制劑之組成物
JP2022525261A (ja) ビスタ結合抗体およびその使用
Engelberts CD20 as target for immunotherapy