TWI311564B

TWI311564B - Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule

Info

Publication number: TWI311564B
Application number: TW090116137A
Authority: TW
Inventors: Cohen Robert; Carr Suzette; Hagerty David; J Peach Robert; Becker Jean-Claude
Original assignee: Bristol Myers Squibb Compan
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2009-07-01
Also published as: LT2003002A; RS50811B; SI21078A; EP3384924A1; AR035037A1; CY2008017I2; LT5063B; ZA200210058B; BG110611A; EE05378B1; CN1318086C; SK287940B6; RU2287340C2; NO20100579L; WO2002002638A3; HRP20030071B1; HUS1000008I1; UY26815A1; BR0112104A; JP2004517806A

Description

1311564 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本申請書係申請公元2000年7月3曰申請之美國臨時專利申請案序號60/215,913之優先權，其全文之内容以併列方式作爲本文之參考。此申請書内遍含多篇參考文獻。此等文獻之揭示均以其全文併列爲本申請書之參考，以更完整地説明與本發明相關之技藝。發明領域本發明係廣泛關於風濕性疾病之領域。特定言之，本發明係關於用以治療風濕性疾病，例如風濕性關節炎之組合物及方法，其係藉由對一個體施用有效量之可溶性CTLA4 突變分子。發明背景目前並無針對風濕性疾病之療法。當然，有些療劑可用以治療其症候。典型地，該等治療劑被長期施用且其治療價値常受其副作用消減。風濕性疾病包括一群疾病，其可影響身體之肌肉-骨骼及連接組織。此等疾病之特徵爲慢性發炎，其通常導致永久性組織破壞，畸形，萎縮及殘障。.風濕性疾病會影響關節，骨骼，軟組織，或脊椎神經（Mathies，H. 1983 Rheuma) 並歸類成發炎性風濕病，退化性風濕病，超關節性風濕病，或膠原病。已知一些風濕性疾病爲自體免疫疾病，其導因於個體之免疫反應變化。風濕性關節炎係一種進展性風濕性疾病，其大約影響發展中國家之2%成年人口（Utsinger，P. D·，等人1985 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（2 )

Rheumatoid Arthritis，第140頁）。此疾病之特徵爲持續的發炎性滑膜炎，其造成軟骨原骨之破壞及骨骼侵蝕，導致周圍關節之構造性畸形。風濕性關節炎之相關徵狀包括關節腫脹，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，及疼痛，特別是屈曲時。具有關節炎進展期之個體會遭受構造性破壞，包括伴隨骨骼侵蚀之關節損壞（於："Principals ’of Internal Medicine, Harrison，13th edition, 1648-1655 頁）。此外，病患可能存在有各種器官性損害之其他臨床徵候，包括皮膚，腎臟，心藏，肺臟，中央神經系統，及眼睛之損害，其係由於與自體免疫過程相關之脈管炎。與風濕性關節炎相關之徵狀包括紅血球沉降速率升高及血清C-反應性蛋白（CRP)及/或可溶性IL-2受體（IL-2r)濃度升高。幾乎所有具有活化風濕性關節炎患者之紅血球沉降速率均升高。血清C-反應性蛋白之濃度亦升高並相關於疾病活性及進展性關節損壞之可能性。此外，可溶性IL-2r，一種活化之T-細胞產物之濃度，亦於具有活化風濕性關節炎患者之血清及滑膜液内升高（參見："Principals of Internal Medicine, Harrison, 13th edition，1650 頁）。咸信風濕性關節炎係一種T-細胞-調節之自體免疫疾病，其涉及Τ-淋巴細胞與抗原-存在性細胞間之抗原-非專一性細’胞内交互作用。大體上，Τ-細胞反應強度之測定係藉由受到Τ-細胞表面分子及其配體間之作用力所引起之共同-刺激性反應（Mueller 等人，1989 Ann. Rev. Immunol. 7:445-480)。重要之共同-刺激信號之提供係由T-細胞表面 -5- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（3 ) 受體，CD28及CTLA4，及其配體）間之交互作用，例如： B7-相關性分子CD80 (即：B7-1)與CD86 (即：B7-2)，於抗原存在性細胞上（Linsley，P.及 Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11:191-212) ° 無共同刺激之T-細胞活化導致無力性T-細胞反應 (Schwartz，R.H. 1992 Cell 71:1065-1068)其中該免疫系統變成對刺激無反應性。因爲風濕性關節炎被認爲是一種T -細胞-調節性免疫系統疾病，一種治療風濕性關節炎之新穎試劑之開發策略係爲鑑別出可阻斷T-淋巴細胞與抗原-存在性細胞間之共同-刺激信號之分子，其藉由阻斷内生性CD28或CTLA4及B7 間之作用。有潛力之分子包括可溶性CTLA4分子，其經修飾可以較野生型CTLA4 (其序列顯示於圖23)或CD28更高之親合力結合於B7。因而阻斷共同-刺激信號。 CD28及CTLA4之可溶型式之構築已可藉由將CD28與 CTLA4之類-可變（V)胞外區域與免疫球蛋白（Ig)之不變區融合而產生CD28Ig與CTLA4Ig。一種CTLA4Ig之核苷酸及胺基酸序列顯示於圖24，該蛋白質起始於+1位置處之甲硫胺酸或-1位置處之丙胺酸並終止於+3 57位置處之離胺酸。 CTLA4Ig可與CD80-陽性及CD86-陽性細胞之結合力更強於 CD28Ig (Linsley，P·，et al·，1994 Immunity 1:793-80)。已發現許多T-細胞相關免疫免疫可藉CTLA4Ig在體外及在體内中止（Linsley，P.等人，1991b，同前，Linsley，P.等人， 1992a Science 257:792-795 ; Linsley，P.等人，1992b J. Exp. -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（5 ) MYPPPY六胜肽特色構造係爲CTLA4及CD28，及CTLA4之 CDR-1-及CDR-3-類似區域内之某些非保守性胺基酸殘基，及可提高CTLA4與CD80之結合親和力之區域所共有者 (Peach，R.J.，等人 1994 J. Exp· Med. 180:2049-2058)。如説明於前之可溶性CTLA4分子，例如：CTLA4Ig， CTLA4突變分子或嵌合性CTLA4/CD28同質突變體，其成爲可治療風濕性疾病之治療性藥物之新穎族群。現今對於風濕性疾病，例如：風濕性關節炎之治療係包括施用非專一性細胞毒性免疫抑制藥物，例如：胺曱喋呤，環磷醯胺，安赛普來（azathioprine)，環孢素A (cyclosporin A)，及腫瘤壞疽.因子-a (TNF 阻斷劑或拮抗劑。此等免疫抑制藥物可抑制個體之整個免疫系統，且長期使用會提高感染之機率。再者，此等藥物僅可減缓風濕性關節炎之進展，其於治療中斷後會繼續加速進展。此外，以此等非專一性藥物延長治療會產生有毒副作用，包括導致某些惡性腫瘤，腎衰竭，骨髓抑制，肺纖維性病變，惡性腫瘤，糖尿病，及肝功能損壞之趨勢。此等藥物亦會於約2~5年後逐漸失去效用（Kelley's Textbook of

Rheumatology，6th Edition, 1001-1022 頁）。或者’非專—性免疫抑制性及抗發炎藥物類之療劑已被用於缓和徵狀^此等藥物係爲劑量依賴性且無法防止疾病之進展。此等藥物包括類固醇化合物，例如：普尼松 (prednisone)及曱基普尼所隆（methyiprednisolone)。類固醇亦具有與其長期使用有關之顯著毒性副作用。（Kelley's -8- 本紙張尺度適财S β家襟準(CNS) a视格(21GX297公爱) 1311564 A7 ____B7 五、發明説明（6 )

Textbook of Rheumatology, 6th Edition, 829-833 頁）。因此，目前.對風濕性關節炎之治療之效果受限，有顯著毒性副作用，且不能長期持續使用。據此，頃需要一些療法，其可有效並更有力於治療風濕性疾病，例如：風濕性關節炎，並避免傳統方法及試劑之缺點，其可藉由鎖定自體免疫作用之病理性機制。發明概要本發明提供用以治療免疫系統疾病之組合物及方法，其藉由對個體施用可溶性CTLA4分子，其可結合至B7-陽性細胞上之B7分子，因而抑制内生性B7分子與T-細胞上之 CTLA4及/或CD28結合。使用於本發明方法中之可溶性 CTLA4分子包括CTLA4Ig及可溶性CTLA4突變分子 L104EA29YIg。本發明亦提供用以治療（例如：減少徵狀）風濕性疾病，例如：風濕性關節炎之方法，其藉由對於被診斷出患有風濕性關節炎之個體施用可溶性CTLA4分子，例如： CTLA4Ig及/或可溶性CTLA4突變子L104EA29YIg。該 CTLA4突變分子L104EA29YIg，例如：起始於位置+1處之甲硫胺酸或位置-1處之丙胺酸並終止於位置+357處之離胺酸，如顯示於圖19者爲較佳使用於本發明之方法者。本發明亦提供用以減少與風濕性疾病有關之病理性變化，例如：構造性損害之方法，其係藉由對於被診斷出患有風濕性關節炎之個體施用可溶性CTLA4分子。本發明亦提供一種用以治療免疫系統疾病，例如：風濕 -9- 本紙張尺度適用中,國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（7 ) 性關節炎之醫藥組合物，其含有一種醫藥上可接受之載體及一種生物上有效之試劑，例如：可溶性CTLA4分子。含有可治療免疫系統疾病之醫藥组合物之套組亦涵括於本發明中。於一個具體實施例中，一種套組，其含有一或多種本發明之醫藥組合物係被用以治療免疫系統疾病，例如：風濕性關節炎。舉例言之，該醫藥組合物含有效量之可溶性CTLA4突變分子，其可結合至B7-陽性細胞上之B7 分子，因而可阻斷B7分子與T-細胞上之CTLA4及/或CD28 之結合。再者，該套組可含有一或多種免疫抑制劑，其與本發明之醫藥組合物聯合使用。有效之免疫抑制劑包括，但不限爲：皮質類固醇，非類固醇性抗發炎化合物（例如 :Cox-2抑制劑），環孢素，普尼松，硫峻嗓呤，胺曱噪呤，TNF π阻斷劑或拮抗劑，因芙西美（infliximab)，任何導向發炎性細胞因子之生物性試劑，經氧昆（hydroxychloroquine) ，沙伐索安若普（sulphasalazopryine)，金鹽，依脱那塞 (etanercept)，及安納金拉（anakinra)。本發明亦提供用以降低與風濕性關節炎有關之紅血球沉降速率之方法。此外，本發明提供方法，其係用以降低血清中某些與風濕性關節炎有關之成份之濃度，包括C-反應性蛋白及/或可溶性IL-2r。圖式簡要説明圖1A :患者群之人口統計學數據。人口統計學數據包括性別，種族，及疾病期，如説明於下文之實例3中者。 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（8 ) 圖1B:患者群之人口統計學數據。人口統計學數據包括性別，年齡，.體重，及由患者及醫師評估之疾病活性，如説明於下文之實例3中者。圖1C :患者群之人口統計學數據，如説明於下文之實例 3中者。人口統計學數據包括疾病活性，紅血球沉降速率 (ESR)，生理功能（藉由健康問卷評估之失能），及C-反應性蛋白（CRP)。圖1D :患者群之人口統計學數據，如説明於下文之實例 3中者。人口統計學數據包括關節腫脹，關節觸痛，晨間僵硬，及疼痛。圖1E :患者群之人口統計學數據，如説明於下文之實例 3中者。人口統計學數據包括先前之治療。圖2:於第85天中斷治療之整理，其理由如説明於下文之實例3中者。圖3 A :如説明於下文之實例3中於第85天之ACR反應： ACR-20，-50，及-70反應。圖3B ··如説明於下文之實例3中於第85天之ACR-20反應，包括安慰劑反應：ACR-20反應之信賴限制爲95%。圖3C :如説明於下文之實例3中於第85天之ACR-20反應：於95%信賴區間下之ACR-20反應差距。圖4A :如説明於下文之實例3中於第85天之腫脹及觸痛關節内之基本（20%改善）臨床反應，以患者之百分比計：基本臨床反應，ACR-20。圖4B :如説明於下文之實例3中於第85天之腫脹及觸痛 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（9 ) 關節内之臨床反應（改善百分比），以患者之百分比計：臨床反應之變化，以改善之百分比計。圖5A :如説明於下文之實例3中於第85天之疼痛反應（以 Likert量尺，距基線之平均單位變化），以患者之百分比計：距基線之疼痛分數變化。圖5B :如説明於下文之實例3中於第85天之患者總體疾病變化（β Likert量尺，距基線之平均單位變化），以患者之百分比計、患者總體疾病活性變化。圖5C :如説明於下文之實例3中於第85天之醫師總體疾病變化（以Likert量尺，距基線之平均單位變化），以患者之百分比計：醫師總體疾病活性變化。圖5D :如説明於下文之實例3中於第85天之疼痛（以 Likert量尺，距基線之平均單位變化），以患者之百分比計：距基線之疼痛變化。圖6A :如説明於下文之實例3中於第85天每隔兩單位距基線之患者總體疾病活性變化；疾病活性改善。圖6B :如説明於下文之實例3中於第85天每隔兩單位距基線之醫師總體疾病活性變化；疾病活性改善。圖7A ··如説明於下文之實例3中於第85天之C-反應性蛋白（CRP)濃度下降百分比：距基線之CRP濃度下降百分比。圖7B :如説明於下文之實例3中於第85天之C-反應性蛋白（CRP)濃度下降差距：95%信賴區間下之CRP濃度下降差距百分比。 -12- 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（1〇 ) 圖7C :如説明於下文之實例3中於第85天之C-反應性蛋白（CRP)濃度平均下降値：距基線之 '平均變化。圖8 :如説明於下文之實例3中於第85天之可溶性IL-2受體濃度距基線之平均下降値。圖9A : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對觸痛關節之影響：距基線之差距中點値。圖9B : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對觸痛關節之影響：距基線之差距平均値。圖10A : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對腫脹關節之影響：距基線之差距中點値。圖1 OB : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對腫脹關節之影響：距基線之差距平均値。圖11 : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對距基線之疼痛評估差距之影響。圖12A : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對距基線之患者評估之疾病活性平均差距之影響。圖12B : CTLA4Ig於如説明於下文之實例3中之時間内對距基線之醫師評估之疾病活性平均差距之影響。圖13A : L104EA29YIg於如説明於下文之實例3中之時間内對觸痛關節之影響：距基線之差距中點値。圖13B : L104EA29YIg於如説明於下文之實例3中之時間内對觸痛關節之影響：距基線之差距平均値。圖14A ·· L104EA29YIg於如説明於下文之實例3中之時間内對腫脹關節之影響：距基線之差距中點値。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（12 ) L104EA29YIg (第三 A道）之 SDS膠體（圖 25A);及 CTLA4Ig (圖25B)及L104EA29YIg (圖25C)之分子篩層析。圖26 (左及右圖）：以NMR光譜儀測得之由溶液構造產生之CTLA4胞外Ig之類-Ig V摺疊之帶狀圖。圖26(右圖）顯示 CDR-1 (S25-R33)區及MYPPPY區之展開圖，其指出親和力增強突變，L104及A29之位置及側鏈方位。圖27A & 27B : FACS分析，其顯示如説明於下文之實例 2 中之 L104EA29YIg，L104EIg，及 CTLA4Ig至人類 CD80-或 CD86-轉染之CHO細胞之結合。圖28A & 28B :圖示顯示CD80-陽性及CD86-陽性CHO細胞之增殖之抑制，如説明於下文之實例2中者。圖29A & 29B :圖示顯示L104EA29YIg對一級及二級異刺激性T細胞之增殖之抑制較CTLA4Ig有效，如説明於下文之實例2中者。圖30A-C :圖示顯示L104EA29YIg對於抑制異刺激性人類 T細胞之IL-2 (圖30A)，IL-4 (圖30B)，及加碼（r )-干擾素 (圖30C)之細胞因子生產較CTLA4Ig有效，如説明於下文之實例2中者。圖3 1 ··圖示顯示LI 04EA29YIg對植物性血球凝集素-(PHA) 刺激之猴子T細胞之增殖之抑制較CTLA4Ig有效，如説明於下文之實例2中者。圖32 :圖示顯示L104EA29YIg，L104EIg，及野生型 CTLA4Ig對CD86Ig之平衡結合分析。 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（13 ) 發明之詳細説明定義除非特別指定，否則本申請書内所使用之所有科學性及技術性辭彙均爲此項技藝中之通用涵意。本申請書中所使用之下列字或辭均有特定涵意。本文所使用之π配體”係指一分子，其可專一性辨識並結合另一分子，例如·· CTLA4之一種配體爲Β7分子。本文所使用之"野生型CTLA4"或”非突變性CTLA4"具有天然發生之全長CTLA4胺基酸序列，如顯示於圖23者（亦如説明於美國專利第 5,434，131，5,844,095，5,851,795)，或其部分或衍生物，其可辨識並結合Β7分子，或受Β7阻礙，因而阻斷其結合至CD28及/或CTLA4(例如：内生性 CD28及/或CTLA4)。於特定具體實施例中，野生型CTLA4 之胞外功能區域起始於位置+1處之甲硫胺酸並終止於位置 + 124處之天門冬胺酸，或野生型CTLA4之胞外功能區域起始於位置-1處之丙胺酸並終止於位置+124處之天門冬胺酸。野生型CTLA4係一種細胞表面蛋白質，其具有一個N-端胞外功能區域，一個膜穿透功能區域，及一個C-端細胞質功能區域。該胞外功能區域結合於目標分子，例如·· B7分子。於一細胞内，天然發生之野生型CTLA4蛋白質係轉譯成一種免疫聚胜肽，其包括一段爲於N-端之信號胜肽。未成熟之聚胜肽發生轉譯後加工，其包括切下並移除信號胜肽以產生一種CTLA4切割產物，其具有一新生成之 N-端，其異於未成熟型式之N-端。熟悉此項技藝者了解可 -16- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（14 ) 能發生其他之轉譯後加工，其可由CTLA4切割產物新生成之N-端移除一或多個胺基酸。或者’其信號胜肽可能未完全移除，產逼分子，其開始於通常起始之胺基酸甲硫胺酸之前。因此，成熟之CTLA4蛋白質可能起始於位置+1處之甲硫胺酸或位置-1處之丙胺酸。CTLA4分子之成熟型式包栝胞外功能區域或其任何部分，其可結合於B7。本文所使用之"CTLA4突變分子"係指如圖23所顯示之野生型CTLA4或其任何部分或衍生物，其具有一處突變或多重突變（較佳於野生型CTLA4之胞外功能區域中）。CTLA4 突變分子具有一序列其相似但不相同於野生型CTLA4分子，但仍可結合於B 7。突變可包括以具有保守性（例如：以異白胺酸取代白胺酸）或非保守性（例如：以色胺酸取代甘胺酸）構造或化學特性之胺基酸取代一或多個胺基酸殘基，胺基酸刪除，加入，框架偏移，或截斷。CTLA4突變分子可包括内含或連接於非-CTLA4分子者。突變分子可爲可溶性（即：循環性）或結合於細胞表面者。其他CTLA4 分子包括彼等説明於美國專利申請案序號第09/865,321， 60/214,065 及 60/287,576 號；於美國專利第 6,090,914， 5,844,095 及 5,773,253 號；及如 Peach, R.J.，等人於 JExpMed 180:2049-2058(1994)中所説明者。CTLA4突變分子之製造可藉由合成或重组。 "CTLA4Ig"係一種可溶性融合蛋白，其含有一野生型 CTLA4之胞外功能區域，或其可結合於B7分子之部分，連接於一 Ig尾巴。一特定具體實施例包括野生型CTLA4之胞 -17- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210X297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（15 ) 外功能區域（如顯示於圖23中者），其起始於位置+1處之曱硫胺酸並終止於位置+124處之天門冬胺酸；或起始於位置 -1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸；一個接合胺基酸殘基麩胺醯胺於+125處；及一個免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+357處之離胺酸（可编碼 CTLA4Ig之DNA於1991年5月31日寄存於美國菌種保存中心 (ATCC)，10801 University Blvd., Manasas，VA 20110-2209 ，依布達佩斯條約之規定，並已授與ATCC登錄號碼ATCC 68629 ; Linsley，P_ 等人，1994 Immunity 1:793-80)。 CTLA4Ig-24，一種可表現CTLA4Ig之中國倉鼠卵巢（CHO) 細胞株係於1991年5月3 1曰寄存其ATCC識別號碼爲CRL-10762)。使用於本發明之方法及/或套組中之可溶性 CTLA4Ig分子可包括或不包括一段信號（引導子）胜肽序列。通常，於本發明之方法及/或套組中，該分子不包括一段信號胜肽序列。 "L104EA29YIg"係一種融合蛋白，其係爲一種可溶性 CTLA4突變分子，包含野生型CTLA4之胞外功能區域，其中具有之胺基酸變化爲A29Y (位置29處之丙胺酸以赂胺酸殘基取代）及L104E (位置104處之白胺酸以麩胺酸殘基取代），或其可結合至B7分子之部分，連接於Ig尾部（包含於圖19中；可編碼L104EA29YIg之DNA係於2000年6月20日寄存，其ATCC號碼爲PTA-2104 ;共同申請於美國專利申請案序列第 09/579,927，60/287,576 及 60/214,065 號中，其併列爲本文之參考使用於本發明之方法及/或套组中之可 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（16 ) 溶性L104EA29YIg分子可包含或不包含一段信號（引導子）胜肽序列。通常，於本發明之方法及/或套组中，該分子不包括一段信號胜肽序列。本文所使用之”可溶性"係指任一分子，或其片段或衍生物，並未結合或連接於細胞，即：循環性。例如： CTLA4，B7或CD28可藉由分別於CTLA4，B7或CD28之月包外功能區域上連接免疫球蛋白（Ig)部分而成可溶性。或者，例如CTLA4之分子可藉由移除其膜穿透功能區域而成可溶性。通常，使用於本發明方法中之可溶性分子不包含一段信號胜肽序列。本文所使用之"可溶性CTLA4分子"係指非細胞表面結合性（即：循環性）CTLA4分子或任何可結合B7之CTLA4分子功能性部分，其包括但不限爲：CTLA4Ig融合蛋白（例如： ATCC 68629)，其中CTLA4之胞外功能區域融合於免疫球蛋白（Ig)部分，使該分子成可溶性，或其片段或衍生物；蛋白質，其具有CTLA4之胞外功能區域融合或連接於生物性活化或化學性活化蛋白質之一部份，例如：乳頭狀瘤病毒E7基因產物（CTLA4-E7)，黑色素瘤-相關性抗原p97 (CTLA4-p97)或 HIV env蛋白質（CTLA4-env gpl20)，或其片段或衍生物；混成（嵌合性）融合蛋白，例如：CD28/CTLA4Ig ，或其片段或衍生物；膜穿透功能區域經移除而使蛋白質變成可溶之 CTLA4 分子（Oaks，M.K.等人，2000 Cellular Immunology 201 ： 144-153)，或其片段或衍生物，及可溶性CTLA4突變分子，其具有CTLA4結合活性。使用於本發 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（17 ) 明之方法中之可溶性CTLA4分子可包含或不包含一段信號 (引導子）胜肽.序列。通常，於本發明之方法中，該分子不包括一段信號胜肽序列。本文所使用之"CTLA4之胞外功能區域"係爲CTLA4可辨識並結合CTLA4配體，例如：B7分子之部分。例如：一種 CTLA4之胞夕卜功能區域包含位置+1處之甲硫胺酸至位置 + 124處之天門冬醯胺（圖23)。或者，一種CTLA4之胞外功能區域包含位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬醯胺 (圖23)。該胞外功能區域包括CTLA4之片段或衍生物，其可結合B7分子。如圖23所顯示之CTLA4之胞外功能區域可包括突變，其改變CTLA4分子對B7分子之結合活性。本文所使用之"突變"一辭係指野生型分子之核苷酸或胺基酸序列中之改變，例如：野生型CTLA4胞外功能區域 DNA及/或胺基酸序列之改變。DNA中之突變可改變一個密碼组而導致胺基酸序列中之改變。DNA改變可包括取代，刪除，插入，加入，截段，或蛋白質加工或切割之錯誤。或者，核苷酸序列中之突變可造成胺基酸序列中之靜默突變，如此項技藝中已被熟知者。關於此點，某些核苷酸密碼組可編碼相同之胺基酸。實例包括核苷酸密碼組 CGU，CGG，CGC，及CGA其編碼胺基酸：精胺酸（R);或密碼組GAU，及GAC其编碼胺基酸：天門冬胺酸（D)。因此，蛋白質可藉由一或多種核苷酸分子編碼，其特定核苷酸序列不同，但仍可编碼出具有相同序列之蛋白質分子。胺基酸之密碼序列如下： -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（18 )

胺基酸代號單字母代號密碼组丙胺酸 Ala A GCU, GCC, GCA, GCG 半胱胺酸 Cys C UGU, UGC 天門冬胺酸 Asp D GAU, GAC 麩胺酸 Glu E GAA, GAG 苯丙胺酸 Phe F UUU,UUC 甘胺酸 Gly G GGU, GG€, GGA, GGG 組織胺酸 His_ H CAU, CAC 異白胺酸 He I AUU, AUC, AUA 離胺酸 Lys K AAA, AAG 白胺酸 Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG 曱硫胺酸 Met M AUG 天門冬醯胺 Asn N AAU, AAC 脯胺酸 Pro P CCU, CCC, CCA, CCG 麩胺醯胺 Gin Q CAA, CAG 精胺酸 Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG 絲胺酸 Ser S UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC 羥丁胺酸 Thr T ACU，ACC，ACA，ACG 結胺酸 Val V GUU，GUG，GUA，GUG 色胺酸 Trp W UGG 酪胺酸 Tyr Y UAU’UAC 突變分子可具有一或多個突變。本文所使用之”非-CTLA4蛋白質序列”或"非-CTLA4分子" 係指任意蛋白質分子，其不結合B7且不干擾CTLA4至其標 -21 - 本紙铁尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（19 ) 的物之結合。一個實例包括，但不限爲免疫球蛋白（Ig)不變區或其部分。較佳者，該1&不變區係爲人類或猴子1§不變區，例如：人類C( r)l。包括樞紐，CH2及CH3區域。該 Ig不變區可經突變以降低其效應子（effector)功能（美國專利第 5,637,481 及 6，132,992號）。本文所使用之"片段"或"部份"係指CTLA4分子之任意部份或斷片，較佳爲CTLA4之胞外功能區域或其部份或斷片’其可辨識並結合其標的物，.例如：B7分子。本文所使用之"B7"係指B7家族之分子，包括，但不限於 B7-1(CD80)，B7-2(CD86)及 B7-3，其可辨識並結合 CTLA4 及/或CD28。本文所使用之"B7-陽性細胞"係爲任意細胞，其具有一或多種型式之B7分子表現於細胞表面。本文所使用之"衍生物"係一種分子，其與其母分子共享序列同源性及活性。例如：一種CTLA4之衍生物包括一種可溶性CTLA4分子之衍生物，其胺基酸序列與野生型 CTLA4之胞外功能區域至少有7〇%之相似度，且其可辨識並結合B7，例如：cTLA4Ig或可溶性CTLA4突變分子 L104EA29YIg 〇本文所使用之"阻斷"或"抑制，，受體，信號或分子係指當藉由技藝認可性試驗加以偵測時干擾受體，信號或分子之活性。例如：細胞-調節性免疫反應之阻斷之偵測可藉由測定風濕性疾病相關性徵狀之減輕。阻斷或抑制可爲部分或全邵。 -22- 本紙張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（2〇 ) 本文所使用之"阻斷性B7交互作用"係指干擾B7至其配體之結合’例如：CD28及/或CTLA4 ’因而妨礙T-細胞與B7_ 陽性細胞之交互作用。可阻斷B7交互作用之試劑包括，但不限於，分子，例如：抗體（或其部分或衍生物），其可辨識並結合至任意CTLA4，CD28或B7分子（例如：B7-1， B7-2);分子之可溶型式（或其部分或衍生物）；胜肽片段或其他小分子，其經設計以透過CTLA4/CD28/B7-調節性交互作用來干擾細胞訊號。於一較佳之具體實施例中，該阻斷劑係一種可溶性CTLA4分子，例如：CTLA4Ig (ATCC 68629)或 L104EA29YIg (ATCC PTA-2104)，可溶性 CD28 分子，例如：CD28Ig (ATCC 68628)，可溶性B7分子，例如：B7Ig (ATCC 68627)，抗-B7 單株抗體（例如：ATCC HB-253，ATCCCRL-2223，ATCCCRL-2226，ATCCHB-301，ATCC HB-11341及如Anderson等人説明於美國專利第 6，113,898號中或 Yokochi等人，1982，J. Immun，128(2)823-827之單株抗體），抗-CTLA4單株抗體（例如：ATCC HB-3〇4，及如説明於參考文獻82-83中之單株抗體）及/或抗-CD28單株抗體（例如：ATCC HB 11944及mAb 9.3，如 Hansen (Hansen等人，1980，Immunogenetics 10:247-260)或 Martin (Martin 等人 1984, J.Clin. Immun，4(1):18-22)所説明者）。本文所使用之"免疫系統疾病"係指由T-細胞與B7-陽性細胞之交互作用調節之任何疾病，其包括但不限於自體免疫疾病，接枝相關性病症及免疫激增性疾病。免疫系統疾病 -23- 未纸張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210X297公釐) 1311564 A7

己括接枝對宿王疾病（GVHD)(例如：可能導因於骨髓移植，^柯受性謗發者），與接枝性移植排斥有關之免疫疾 21杈性排斥，及組織或細胞外源-或異種移植，包括固心器言’皮膚’小島’肌肉，肝細胞，神經元。免疫激增性疾病之實例包括，但不限於牛皮癖，τ_細胞淋巴瘤，τ_ 細胞急性淋巴胚細胞性血癌，畢丸血管中心性心細胞淋巴瘤，良性淋巴管炎，狼瘡（紅斑性狼瘡，腎炎狼瘡），淋巴 1·生甲狀腺腫’ ！發性黏液水腫，Graves，症，惡性貧血，自奴免疫萎縮性胃炎’愛迪生氏症，糖尿病⑼如：胰島素依賴型糖尿病，第I型糖尿病，第1:型糖尿病），G〇〇d pasture's症候群，重症肌無力’天皰瘡，Cr〇hnis症，交感性眼炎，自體免疫葡萄膜炎，多重硬化症，自體免疫溶血

性貧血，自發性血小板減少症，原發性膽管硬化，慢性活動肝夫，結腸潰瘍，Sj〇gren，s症候群，風濕性疾病（例如：風濕性關節炎），多肌炎，，更皮病，及混合性結缔组織疾病β *本文所使用之"風濕性疾病"係指任何疾病，其可影響關即，骨骼，軟組織，或脊椎神經（Mathies，H 1983 Rheuma) 且包括發炎性風濕病’退化性風濕病，關節外風濕病，及膠原病。此外’風濕性疾病包括，但不限於慢性多關節炎，牛皮癖性關節炎，關節黏連性脊椎炎，風濕性關節炎，結節性全動脈炎，系統性紅斑性狼瘡，進展性系統性硬皮病，肱缚動脈周圍炎，尿酸性關節炎，軟骨性石灰沈著症，皮肌炎，肌肉性風濕症，肌炎及肌凝塊。一些風濕 ______- 24 - 本紙银尺度適用中國@豕揉準(CNS) A4規格(210X297公酱) 1311564 A7 B7 五、發明説明（22 ) 性疾病被認爲是自體免疫疾病，其導因於個體之免疫反應改變。本文所使用之"基因療法·•係爲一種治療疾病之方法，其藉由基因操作將一段核酸序列轉移至細胞内，再使該細胞表現由該核酸编碼之任何基因產物。例如：由彼等熟習此項技藝者所熟知者，核酸轉移之進行可藉由非生體内或生體外插人包含所欲核酸之表現載體至細胞内，其可藉由各種方法，包括，例如：磷酸鈣沉澱，二乙胺乙基葡萄聚糖，聚乙二醇（PEG)，電穿孔，直接注射，脂肪感染或病毒感染（Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ; Krieger M Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W.H. Freeman and Co. New York，N.Y·，1993)及 Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993)其各併列爲本文之參考或者，所欲之核酸序列可於各種載體内於生體内轉移至細胞内並藉由各種方法，包括，例如：直接施用該核酸至個體内（Williams等人，1991 PNAS 88:2726-2730)，或將該核酸插入病毒載體内並以該病毒感染個體 (Battleman等人，1993 JNeurosci 13:94-951 ; Carroll等人， 1993 J Cell Biochem 17E:241 ; Lebkowski等人，美國專利第 5,354,678 號；Davision 和 Elliott，Molecular Virology: A Practical approach (IRL Press，New York, 1993))。其他用於生體内轉移之方法包括將核酸包覆至微脂體内，並直接轉移該微脂體，或微脂體合併紅血球凝集性Sendai病毒，至 -25- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（23 ) 個體（美國專利第5,824,655號，其併列爲本文之參考）。經轉染或感染之細胞可表現該核酸所編碼之蛋白質產物，以減輕疾病或疾病之徵狀。爲要使本文所説明之發明更被完全了解，故再進一步説明於下。本發明之组合物及方法本發明提供组合物及方法以治療免疫系統疾病，例如·· 風濕性疾病，其藉由對個體施用有效量之可溶性CTLA4分子，例如：CTLA4Ig及/或L104EA29YIg。有效量之系定義爲可溶性CTLA4分子之量，當其結合至B7-陽性細胞上之 B7分子時，可抑制B7分子與内生性配體，例如：CTLA4及 CD28結合。於一較佳之具體實施例中，該免疫疾病係爲風濕性疾病。風濕性疾病係指任何疾病，其特徵爲⑴身體之肌肉-骨骼性或結缔组織構造之發炎或退化，特別是關節，並包括肌肉，肌腱，軟骨原骨，滑液及纖維组織，（ii)伴隨關節腫脹，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，及/或疼痛，或彼等構造之運動或功能損傷及，於一些事例中，（iii)常伴隨風濕因子及其他發炎替代性標示之血清學證據。風濕性疾病包括，但不限於：風濕性關節炎。風濕性關節炎之徵狀包括關節腫脹，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，及造成身體失能之疼痛。處於關節炎後期之個體會遭遇結構性破壞及使人衰弱之疼痛徵狀。其他器官亦可受自體免疫機制損害。 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（24 ) 組合物本發明提供組合物，其用以治療免疫疾病’例如：風濕性疾病，包含可溶性CTLA4分子。 CTLA4分子，具突變或野生型序列，可藉由刪除CTLA4 膜穿透部分而成爲可溶（Oaks，Μ·Κ_，等人’ 2000 Cellular Immunology 201:144-153) ° 或者，可溶性CTLA4分子，具突變或野生型序列，可爲融合蛋白質，其中該CTLA4分予係融合至非-CTLA4成份，例如：免疫球蛋白（Ig)分子，使其成爲可溶。例如： CTLA4# j $白可包+ CTLA4U5包夕卜功能區g融|至免& 球蛋白之不變功能區’產生CTLA4Ig分子（圖24)(Linsley, P.S.等人，1994 Immunity 1:793-80)。於臨床計畫中，較佳爲該免疫球蛋白區域不引起個體之不良免疫反應。較佳之成份係爲免疫球蛋白不變區，包括人類或猴子免疫球蛋白不變區。適合之免疫球蛋白區域之一實例爲人類C r 1，包含極紐·，CH2及CH3區域，其可調節效應子功能，例如：結合至Fc受體，調節補體-依賴性細胞毒性（CDC)，或調節抗體-依賴性細胞-調節性細胞毒性（ADCC)。該免疫球蛋白成份可於其中具有一或多個突變，（例如：於CH2功能區内，以降低效應子功能，例如：CDC或ADCC)其中該突變調整免疫球蛋白與其配體之結合能力，其藉由提高或降低免疫球蛋白對Fc受體之結合能力。例如：免疫球蛋白内之突變可包括改變其樞紐功能區域内之任意或所有半胱胺酸殘基，例如：以絲胺酸取代 -27- 尺度適用中國A4規格(21()><297公爱) ' 1311564 A7 B7 五、發明説明（25 位於+13〇，+136，及+139位置處之半胱胺酸（圖24)。免疫球蛋白分子亦可包括以絲胺酸取代位於+148位置處之脯胺酸，如圖24所顯示者。再者，免疫球蛋白成份内之突變可包括以苯丙胺酸取代位置+144處之白胺酸，以麩:胺酸取代位置+145處之白胺酸，或以丙胺酸取代位置+147處之甘胺酸。其他可使用於可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突變分子内之非-CTLA4成份包括，但不限爲：p97分子，env gp 120分子，E7分子，及ova分子（Dash, B.等人，1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):1389-97 ; Ikeda，T·，等人，1994 Gene 138(1-2):193-6 ; Falk, Κ·,等人，1993 Cell. Immunol. 150(2): 447-52 ; Fujisaka，K.等人，1994 Virology 204(2):789-93) 〇其他分子亦可（Gerard，C.等人，1994 Neuroscience 62(3):721 ;Byrn，R.等人，1989 63(10):4370 ; Smith，D.等人，1987 Science 238:1704 ; Lasky，L. 1996 Science 233:209)。本發明之可溶性CTLA4分子可包含一段訊號胜肽序列連接於該分子之CTLA4部分之胞外功能區域之N-端。該訊號胜肽可爲可使該分子分泌之任意序列，包括得自致癌素 (oncostatin) M (Malik 等人，（1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853)，或 CD5 (Jones，Ν· H.等人，（1986) Nature 323:346-349)之訊號胜肽，或得自任意胞外蛋白質之訊號胜肽。本發明之可溶性CTLA4分子可包含致癌素Μ訊號胜肽連接於CTLA4之胞外功能區域之Ν-端，及人類免疫球蛋白分 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(21〇><297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（26 ) 子（例如：樞紐，CH2及CH3)連接於CTLA4之胞外功能區域 (野生型或突變型）之C-端。此分子包含致癌素Μ訊號胜肽，其涵括一段胺基酸序列，其係由位置-26處之甲硫胺酸至位置-1處之丙胺酸，CTLA4部分，其涵括一段胺基酸序列，其係由位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，一個位於+125處之連接胺基酸殘基麩胺酸，及免疫球蛋白部分，其涵括一段胺基酸序列，其係由位置+126處之麩胺酸至位置+357處之離胺酸。特別地，本發明之可溶性CTLA4突變分子，包含説明於後之突變性CTLA4序列，係爲融合分子，其包含人類IgC r 1 成份融合至突變之CTLA4片段。於一具體實施例中，包含IgC Γ 1融合至CTLA4片段之可溶性CTLA4突變分子於一胞外功能區域包含一個單一位置突變。CTLA4之胞外功能區域包括位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸（例如：圖23)。CTLA4之胞外部分可包含位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸 (例如：圖23)。單一位置突變之實例包括下列，其中位置 + 104處之白胺酸可改變成其他任意胺基酸： -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐〉 1311564 B7 五、發明説明（27 ) 單一位置突變：密碼組變化 L104EIg 熟胺酸GAG L104SIg 絲胺酸AGT L104TIg 羥丁胺酸ACG L104AIg 丙胺酸GCG LI 04 Wig 色胺酸TGG L104QIg 麩胺醯胺CAG L104KIg 離胺酸AAG L104RIg . 精胺酸CGG L104GIg 甘胺酸GGG 再者，本發明提供具有兩個突變之CTLA4之胞外功能區域，融合至Ig C r 1成份。實餉包括下列，其中位於+1 〇4處之白胺酸改變成其他胺基酸（例如：麩胺酸）且位置+105處之甘胺酸，位置+25處之絲胺酸，位置+32處之羥丁胺酸或位置+29處之丙胺酸改變爲任意其他胺基酸：雙位置突變密碼組變化 L104EG105FIg 苯丙胺酸TTC L104EG105WIg 色胺酸TGG L104EG105LIg 白胺酸CTT L104ES25RIg 精胺酸CGG L104ET32GIg 甘胺酸GGG L104ET32NIg 天門冬醯胺AAT L104EA29YIg 酪胺酸TAT L104EA29LIg 白胺酸TTG L104EA29TIg 羥丁胺酸ACT L104EA29WIg 色胺酸TGG - 30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

A7 B7 1311564 五、發明説明（28 ) 再另者，本發明提供具有兩個突變之CTLA4之胞外功能區域，融合至Ig C r 1成份。實例包括下列，其中位於 + 104處之白胺酸改變成其他胺基酸（例如：麩胺酸）且位置 +29處之丙胺酸改變爲任意其他胺基酸（例如：酪胺酸）且位置+25處之絲胺酸改變爲任意其他胺基酸：

參位置突變密碼组變化 L104EA29YS25KIg 離胺酸AAA L104EA29YS25KIg 離胺酸AAG L104EA29YS25NIg 天門冬醯胺AAC L104EA29YS25RIg 精胺酸CGG 可溶性CTLA4分子可具有一個連接胺基酸殘基，其位於該分子之CTLA4部分及Ig部分之間。該連接胺基酸可爲任意胺基酸，包括麩胺醯胺。該連接胺基酸可藉由此項技藝中已知之分子或化學合成法導入。本發明提供CTLA4突變分子，其包含一段訊號胜肽序列連接於該突變分子之CTLA4部分之胞外功能區域之N端。該訊號胜肽可爲可使該突變分子分泌之任意序列，包括得自致癌素 M (Malik等人，（1989) Molec. Cell. Biol_ 9:2847-2853)，或 CD5 (Jones，N. H.等人，(1986) Nature 323:346-349)之訊號胜肽，或得自任意胞外蛋白質之訊號胜肽。本發明提供CTLA4突變分子，其於CTLA4之胞外功能區域内包含單一位置突變，例如：L104EIg (如圖1 8中所包括者）或L104SIg，其中L104EIg及L104SIg係於其CTLA4序列内加以突變，使其+104位置處之白胺酸分別爲麩胺酸或絲 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（29 ) 胺酸取代。單一突變分子進一步包括CTLA4部分，其涵括位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，位置 + 125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+357處之離胺酸。該突變分子之免疫球蛋白部分亦可經突變，使位置+130， + 136，及+139處之半胱胺酸爲絲胺酸取代，且位置+148處之脯胺酸爲絲胺酸取代。或者，單一突變之可溶性CTLA4 分子可具有CTLA4部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置 + 124處之天門冬胺酸。本發明提供可溶性CTLA4突變分子，其於CTLA4之胞外功能區域中包含雙位置突變，例如：L104EA29YIg， L104EA29LIg，L104EA29TIg 或 L104EA29WIg，其中位置 + 104處之白胺酸係以麩胺酸取代且位置+29處之丙胺酸分別改變成酪胺酸，白胺酸，羥丁胺酸及色胺酸。 L104EA29YIg ， L104EA29LIg， L104EA29TIg 及時雨 L104EA29WIg之序文起始於位置+1處之甲硫胺酸並終止於位置+357處之離胺酸，加上一段訊號（引導子）序列包含於該序列中，如分別顯示於圖19-22者。雙位置突變分子進一步包括CTLA4部分，其涵括位置+1處之曱硫胺酸至位置 + 124處之天門冬胺酸，位置+125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+357處之離胺酸。該突變分子之免疫球蛋白部分亦可經突變，使位置+130，+136，及+139處之半胱胺酸爲絲胺酸取代，且位置+148處之脯胺酸爲絲胺酸取代。或者，此 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 等突變分子可具有CTLA4部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸。本發明之可溶性CTLA4突變分子於CTLA4之胞外功能區域中包含雙位置突變，例如：L104EG105FIg，L104EG105WIg 及L104EG105LIg，其中位置+104處之白胺酸係以麩胺酸取代且位置+105處之甘胺酸分別爲苯丙胺酸，酪胺酸及白胺酸取代。雙位置突變分子進一步包括CTLA4部分，其涵括位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，位置 + 125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+3 57處之離胺酸。該突變分子之免疫球蛋白部分亦可經突變，使位置+130， + U6，及+Π9處之半胱胺酸爲絲胺酸取代，且位置+148處之脯胺酸爲絲胺酸取代。或者，此等突變分子可具有 CTLA4部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸。本發明提供L104ES25RIg，其係爲包含CTLA4部分之雙突變分子，其涵括位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，位置+125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+357處之離胺酸。具有CTLA4之胞外功能區域之部分係經突變，使得位置+25處之絲胺酸爲精胺酸取代，且位置+1〇4處之白胺酸爲麩胺酸取代。或者，L104ES25RIg可具有CTLA4 部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸s -33 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（31 ) 本發明提供可溶性CTLA4突變分子，其於CTLA4之胞外功能區域中包含雙位置突變，例如：L104ET32GIg及 L104ET32NIg，其中位置+1〇4處之白胺酸爲麩胺酸取代且位置+32處之羥丁胺酸分別爲甘胺酸及天門冬醯胺取代。該雙突變分子進一步包括CTLA4部分，其涵括位置+1處之曱硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，位置+125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置 + 126處之麩胺畛至位置+357處之離胺酸。該突變分子之免疫球蛋白部分亦可經突變，使位置+130，+136，及+139處之半胱胺酸爲絲胺酸取代，且位置+148處之脯胺酸爲絲胺酸取代。或者，此等突變分+可具有CTLA4部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸。本發明提供可溶性CTLA4突變分子，其於CTLA4之胞外功能區域中包含參位置突變，例如·· L104EA29YS25KIg， L104EA29YS25NIg，L104EA29YS25RIg，其中位置 +104處之白胺酸爲麩胺酸取代且位置+29處之丙胺酸改變成酪胺酸且位置+25處之絲胺酸分別改變成離胺酸，天門冬醯胺及精胺酸。該參突變分子進一步包括CTLA4部分，其涵括位置+1處之甲硫胺酸至位置+124處之天門冬胺酸，位置 + 125處之連接胺基酸殘基麩胺醯胺，及免疫球蛋白部分，其涵括位置+126處之麩胺酸至位置+3 57處之離胺酸。該突變分子之免疫球蛋白部分亦可經突變，使位置+130， + 136，及+139處之半胱胺酸爲絲胺酸取代，且位置+148處之脯胺酸爲絲胺酸取代。或者，此等突變分子可具有 ____ -34- 本紙張尺度逋用中國國家操準(CMS) A4规格(210X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（32 ) CTLA4部分，其涵括位置-1處之丙胺酸至位置+124處之天門冬胺酸。本發明之較佳具體實施例爲可溶性CTLA4分子，例如： CTLA4Ig(如顯示於圖24中者，起始於位置+1處之曱硫胺酸並終止於位置+357處之離胺酸）及可溶性CTLA4突變株 L104EA29YIg (如顯示於圖19者，起始於位置+1處之甲硫胺酸並終止於位置+3 57處之離胺酸本發明進一步提供核酸分子，其包含可編碼本發明之可溶性CTLA4分子所對應之胺基酸序列之核苷酸序列。於一具體實施例中，該核酸分子係爲DNA (例如：cDNA)或其混成物。可编碼 CTLA4Ig之DNA (圖24)於1991年5月31曰寄存於美國菌種中心（ATCC)，10801 University Blvd.，Manasas，VA 20110-2209且已授與ATCC登錄號碼ATCC 68629。可编碼 L104EA29YIg之DNA (序列包含於圖19中）於2000年6月19曰寄存於ATCC且已授與ATCC登錄號碼PTA-2104。或者，該核酸分子係爲RNA或其混成物。此外本發明提供載體，其包含本發明之核苷酸序列。表現載體之實例包括，但不限於用於哺乳類宿主細胞之載體 (例如：BPV-1，pHyg，pRSV，pSV2，pTK2(Maniatis)： pIRES(Clontech) ; pRc/CMV2 ， pRc/RSV ，pSFVl(Life Technologies) ; pVPakc 載體，pCMV 載體，pSG5 載體 (Stratagene))，逆轉錄病毒（例如：pFB 載體（Stratagene))， pCDNA-3 (Invitrogen)或其經修飾之型式，腺病毒載體；腺 -相關性病毒載體，棒狀病毒載體，酵母病毒載體（例如： -35- 本纸張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（33 pESC載體（Stratagene)) 〇本發明亦提供宿主載體系統。宿主載體系統包括存於適當宿主細胞内之本發明之載體。適當宿主細胞之實例包括，但不限於原核及眞核細胞。根據本發明之實施，眞核細胞亦爲適當之宿主細胞。眞核細胞之實例包括任何動物細胞，無論爲原始的或不朽化的，酵母（例如： Saccharomvces cerevisiae » Schizosaccharomvces pombe > 及 Pichia pastoris)，及植物細胞。骨_癌，COS及CHO細胞爲可作爲宿主之動物細胞實例。特定之CHO細胞包括，但不限於，DG44 (Chasin 等人，1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556 ; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)， CHO-K1 (ATCC No. CCL-61)，CHO-K1 Tet-On 細胞株 (Clontech)，CHO指定之ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)，CHO純係 13 (GEIMG，Genova, IT)，CHO 純係 B (GEIMG，Genova, IT)，CHO-K1/SF 指定之 ECACC 93061607 (CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)，及 RR-CHOK1 指定之 ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)。示範性植物細胞包括菸草（全植株，細胞培養物，或療合組織），玉米，大豆，及稻米細胞。玉米，大豆，及稻米種子亦可接受。本發明之CTLA4突變分子可呈天然發生之胜肽類分離，或來自任意來源無論是天然，合成，半合成或重組。據此，CTLA4突變胜肽分子可呈夭然發生之蛋白質，來自任意物種，特別是哺乳類，包括牛科，綿羊，豬科，鼠科， -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1311564 A7 B7___ 五、發明説明（34 ) 馬科，及較佳爲人類。或者，CTLA4突變胜肽分子可呈可表現於原核或眞核宿主之重組胜肽類分離，或呈化學合成之胜肽分離。熟習此項技藝者會使用標準分離方法獲得經分離之 CTLA4突變分子。其特性及分離程度視其來源及該經分離分子所欲之用途而定。 CTLA4突變分子及其片段或衍生物之生產可藉由重組方法。據此，编碼野生型CTLA4分子之經分離之核甞酸序列可經操作而導入突變，使得核甞酸序列编碼CTLA4突變胜肽分子。例如：可編碼CTLA4突變分子之核苷酸序列之生成可藉由定位突變法，使用引子及PCR增幅。引子可包括經設計以導入所欲突變之特定序列。或者，引子可經設計以包括隨機化或半隨機化序列以導入隨機突變。標準重组法（Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook, Fritch, and Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press)及PCR技術（美國專利第4,603,102號）可用以生成並分離編碼CTLA4突變胜肽之CTLA4突變核苷酸。本發明包括醫藥組合物，其用以治療免疫系統疾病，其包含醫藥上有效量之可溶性CTLA4分子。於某些具體實施例中，該免疫系統疾病係由CD28/CTLA4/B7交互作用調節。可溶性CTLA4分子較佳爲具有野生型序列之可溶性 CTLA4分子及/或於CTLA4之胞外功能區域内具有—或多個突變之可溶性CTLA4分子。醫藥組合物可包括可溶性 CTLA4蛋白質分子及/或核酸分子，及/或可编碼該分子之 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（35 ) 載體。於較佳之具體實施例中，可溶性CTLA4分子具有如顯示於圖24或19中之CTLA4之胞外功能區域之胺基酸序列 (分別爲CTLA4Ig或L104EA29Y)。再更佳者，可溶性CTLA4 突變分子係爲L104EA29YIg，如揭示於本文者。該组合物可額外包括其他治療劑，包括但不限爲藥物毒素，酵素。抗體，或結合劑。作爲此項技藝之標準實施，故提供將包含本發明之分子之醫藥組合物混合熟習此項技藝者已知之可接受性載體或佐藥。該醫藥組合物較佳爲包括適當之載體及佐藥，其包括任意物質，當其合併本發明之分子（例如：可溶性 CTLA4分子，例如·· CTLA4Ig或L104EA29Y)時，可保留該分子之活性且不與個體之免疫系統反應。此等載體及佐藥包括，但不限於：離子交換劑，銘，硬脂酸銘，卵磷脂，血清蛋白，例如：人類血清白蛋白，緩衝物質，例如：磷酸鹽，甘胺酸，己二烯酸，己二晞酸钾，飽和植物性脂肪酸之部分甘油酸醋混合物，磷酸缓衝之生理鹽水溶液，水，乳化物（例如：油/水乳化物），鹽類或電解質，例如：魚精蛋白硫酸鹽，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，氣化納，鋅鹽，膠態二氧化矽，三矽酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素基底之物質及聚乙二醇。其他載體亦可包括無菌溶液，藥錠，包括披覆錠及膠囊。通常此等載體含有賦形劑，例如：澱粉，牛乳，糖，某種型式之黏土，明膠，硬脂酸或其鹽類，硬脂酸鎂或鈣，滑石粉，植物脂或油，膠類，乙二醇，或其他已知之賦形劑。此等載體亦可包含香料及色 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（36 ) 素添加物或其他成份。包含此等載體之組合物可藉由已被熟知之慣用方法加以調配。此等組合物亦可調配於各種脂肪組合物中，例如：微脂體及各種聚合性組合物中，例如：聚合物微球體。方法本發明提供方法，其用以調節功能性CTLA4-及CD28-陽性細胞與B7-陽性細胞之交互作用。該方法包含以本發明之可溶性CTLA4分子接觸B7-陽性細胞以生成可溶性 CTLA4/B7複合物，該複合物可干内生性CTLA4及/或CD28 分子與B7分子之反應。本發明進一步提供方法以治療免疫系統疾病，例如：風濕性疾病。方法包括施用治療性組合物，其包含本發明之可溶性CTLA4分子，至個體，其用量爲有效於減輕至少一種與免疫系統疾病有關徵狀。此外，本發明可提供用於免疫系統疾病之長期療法，其藉由阻斷T-細胞/B7陽性細胞交互作用，因而藉由共同刺激訊號，例如：B7結合至 CD28而阻斷T-細胞刺激，造成T-細胞無力或耐性之誇發。免疫系統疾病包括，但不限於：自體免疫疾病，免疫激增疾病，及移植相關性病症。移植相關性病症之實例包括接枝對宿主疾病（GVHD)(例如：可能導因於骨髓移植，或耐受性謗發者），與接枝移植排斥有關之免疫疾病，慢性排斥，及組織或細胞外源-或異種移植，包括固態器官，皮膚，小島，肌肉，肝細胞，神經元。免疫激增性疾病之實例包括，但不限於牛皮癬：T-細胞淋巴瘤；T-細胞急性淋 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（37 ) 巴胚細胞性血癌；睪丸血管中心性T-細胞淋巴瘤，良性淋巴管炎；及免疫系統疾病，例如：狼瘡（例如：紅斑性狼瘡，腎炎狼瘡），淋巴性曱狀腺腫，原發性黏液水腫， Graves'症，惡性貧血，自體免疫萎縮性胃炎，愛迪生氏症，糖尿病（例如：胰島素依賴型糖尿病，第I型糖尿病，第II型糖尿病），good pasture's症候群，重症肌無力，天跑瘡，Crohn's症，交感性眼炎，，自體免疫葡萄膜炎，多重硬化症，自體琴疫溶血性貧血，'自發性血小板減少症，原發性膽管硬化，慢性活動肝炎，結腸潰瘍，Sjogren's症候群，風濕性疾病（例如：風濕性關節炎），多肌炎，硬皮病，及混合性結缔組織疾病。本發明之可溶性CTLA4分子顯示出生體内之抑制特性。於T-細胞/B7-陽性細胞交互作用，例如：T-細胞/B-細胞交互作用之狀況下，會發生T-細胞與B7-陽性細胞接觸之結果，導入之CTLA4分子之結合可與B7-陽性細胞，例如：B 細胞反應，其可干擾，即：抑制T-細胞/B7-陽性細胞交互作用，而可調節免疫反應。本發明提供用以下降調節免疫反應之方法。藉由本發明之可溶性CTLA4分子對免疫反應之下降調節可藉由抑制或阻斷已經進展之免疫反應或可涉及預防免疫反應之謗發。本發明之可溶性CTLA4分子可抑制活化之T-細胞之功能，例如：T淋巴球增生及細胞因子分泌，其藉由壓制T細胞反應或藉由於T-細胞中導入特定耐受性，或二者。再者，本發明之可溶性CTLA4分子，其干擾CTLA4/CD28/B7途徑 _-40-_ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1311564 A7 _____ B7 五、發明説明（38 ) 可抑制T-細胞激增及/或細胞因子分泌，且因而造成組織破壞減少及T-.細胞純化或無力。本發明之較佳具體實施例包括使用可溶性CTLA4突變分子L104EA29YIg以調節功能性CTLA4-及CD28-陽性細胞與 B7-陽性細胞之交互作用，以治療免疫系統疾病，例如：風濕性疾病及/或下降調節免疫反應。本發明之 L104EA29YIg係一種可溶性CTLA4突變分子，其至少包含兩個胺基酸改變：位置+1〇4處之白胺酸（L)變爲麩胺酸（E) 及位置+29處之丙胺酸（A)變爲酪胺酸（γ)。L104EA29YIg分子可涵括除了此二兩處特定者外之其他突變。較佳之具體實施例包括用以治療風濕性疾病，例如：風濕性關節炎之方法，其藉由對個體施用有效量之可溶性 CTLA4分子〇施用有效量之治療性組合物，因而可減輕個體之至少一種疾病有關之徵狀，包括減輕：關節腫脹，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，及疼痛，及構造性損害随後減少之身體失能。本發明之方法亦可用以減輕至少一種與風濕性關節炎相關之徵狀，包括減輕紅血球沉降速率，血清 C-反應性蛋白質及/或可溶性IL-2r之濃度。由本發明所提供之徵狀減輕量之測量可使用任何可被接受’用以測量並以文字記錄臨床狀況中之徵狀減輕之準則。用以測量徵狀減輕之可接受性準則可包括基於由美國風濕病學學院所建立之準則之計分（例如：ACR-20)，徵狀減輕之四種測量（於"CDER Guideline for Clinical Evalution of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988)， -41 - 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4规格(210X297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（39 ) 及健康評估問卷（HAQ)(Fries，J. F.等人，1982，J. of Rheumatology. 9:789-793)。關於此等準則之一般説明，可參見"Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis(RA)"，1999年 2 月。可藉由本發明治療之對象包括哺乳類對象，包括人類，猴子，黑猩猩，狗，貓，牛，馬，兔，小鼠及大白鼠。本發明提供夺種局部或系統性的方法，以施用可溶性 CTLA4分子。方法包括靜脈内，肌内，腹膜内，口服，吸入及皮下法，及可植入式幫浦，連續注入，基因療法，微脂體，栓劑，局部接觸，小麦，膠囊及注射法。作爲此項技藝中之標準實施，本發明之组合物可以任何醫藥上可接受之型式施用於個體。根據本發明之實施，該方法包括對個體施用本發明之可溶性CTLA4分子以調節CD28-及/或CTLA4-陽性細胞與B7_ 陽性細胞之交互作用。B7-陽性細胞可與接觸有效量之本發明之可溶性CTLA4分子’或其片段或衍生物，因此形成可溶性CTLA4/B7複合物。該複合物可干擾内生性CTLA4 及CD28分子與B7家族分子間之交互作用。可溶性CTLA4分子可以足以阻斷内生性B7分子與其相對應之配體結合之量及時間（例如：時間長度及，或多次）施用於個體内。阻斷内生性B7/配體之結合可因而抑制b7_陽性細胞與CD28-及/或CTLA4-陽性細胞間之交互作用。治療劑之劑量係視許多因素而定，包括但不限於受影響 -42- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（4〇 ) 之組織型式，受治療之自體免疫疾病型式，疾病之嚴重性，個體之健康及對試劑治療之反應。據此，試劑之劑量可視各個體及施用模式而改變。可溶性CTLA4分子之施用量可爲0.1至20.0毫克/公斤患者體重/天，較佳爲界於〇.5至 10.0毫克/公斤/天。本發明亦涵括使用本發明之組合物併同其他醫藥試劑以治療免疫系統疾病。例如：風濕性疾病之治療可以本發明之组合物連同，但不限於：免疫抑制劑，例如：皮質類固醇，環孢素（Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2) : 151-156)，普尼松（prednisone)，安赛普來（azathioprine)，胺甲噪呤（R. Handschumacher，於"Drugs Used for Immunosuppression"第 1264-1276 頁），TNF or 阻斷劑或拮抗劑（New England Journal of Medicine, 340: 253-259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478-486)，或任何其他生物試劑，其鎖定任何發炎細胞因子，非類固醇性抗發炎藥/Cox-2抑制劑，經氣昆（hydroxychloroquine) ，沙伐索安若普（sulphasalazopryine)，金鹽，etanercept，因芙西美（infliximab)，雷帕黴素（rapamycin)，mvcophenolate mofetil，安赛普來，它可利斯莫（tacrolismus)，巴斯西每 (basiliximab)，赛脱生（cytoxan)，干擾素卢-la，干擾素点-lb格拉提拉酶醋酸鹽（glatiramer acetate)，麥脱申環鹽酸 (mitoxantrone hydrochloride)，安納金拉(anakinra)及 /或其他生物製品〇可溶性CTLA4分子（較佳爲L104EA29YIg)亦可與下列一或 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（41 ) 多種試劑併用以調節免疫反應：可溶性gp3 9 (亦稱爲CD40 配體（CD40L)，CD154，T-BAM，TRAP)，可溶性CD29，可溶性CD40，可溶性CD80 (例如：ATCC 68627)，可溶性 CD86，可溶性 CD28 (例如：ATCC 68628)，可溶性 CD56，可溶性Thy-Ι，可溶性CD3，可溶性TCR，可溶性VLA-4，可溶性VCAM-1，可溶性LECAM-1，可溶性ELAM-1，可溶性CD44，可與gp39反應之抗體（例如：ATCC HB-10916， ATCC HB-12055及 ATCC HB-12056)，可與 CD40反應之抗體 (例如：ATCCHB-9110)，可與B7反應之抗體（例如：ATCC HB-253 » ATCC CRL-2223 » ATCC CRL-2226 » ATCC HB-301，ATCC HB-11341等），可與CD28反應之抗體（例如： ATCC HB-11944 或 mAb 9.3，如 Martin 等人所説明者（J_ Immun. 4(1):18-22, 1980)，可與 LFA-1反應之抗體（例如： ATCC HB-9579 及 ATCC TIB-213)，可與 LFA-2 反應之抗體，可與LFA-2反應之抗體，可與IL-1反應之抗體，可與 IL-12反應之抗體，可與IFN-r反應之抗體，可與CD2反應之抗體，可與CD48反應之抗體，可與任意ICAM (例如： ICAM-1 (ATCC CRL-2252)，ICAM-2 及 ICAM-3)，與 CTL44 (即ATCCHB-304)反應之抗體，可與Thy-Ι反應之抗體，可與CD56反應之抗體，可與CD3反應之抗體，可與CD29反應之抗體，可與TCR反應之抗體，可與VLA-4反應之抗體，可與VCAM-1反應之抗體，可與LECAM-1反應之抗體，可與ELAM-1反應之抗體，可與CD44反應之抗體。於某些具體實施例中，單株抗體爲較佳者。於其他具體實施 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 ___ B7 五、發明説明（42 ) 例中，抗體片段爲較佳者。如同熟悉此項技藝者所知者，該組合可包拾本發明之可溶性CTLA4分子及其他免疫抑制劑’可溶性CTLA4分子與其他兩種免疫抑制劑，可溶性 CTLA4分子與其他三種免疫抑制劑等。组合及劑量之最適化之測定可利用此項技藝中已熟知之方法加以測定及最適化0 一些特定組合包括下列：L104EA29YIg與CD80單株抗體 (mAbs) ; L104EA29YIg與 CD86 mAbs ; L104EA29YIg，CD80 mAbs，及 CD86 mAbs ； L104EA29YIg 及 gp39 mAbs ; L104EA29YIg及 CD40 mAbs ; L104EA29YIg 及 CD28 mAbs ; L104EA29YIg，CD80 mAbs，及 CD86 mAbs，及 gp39 mAbs ;L104EA29YIg，CD80 mAbs及 CD86 mAbs，及 CD40 mAbs ;及 LI 04EA29Ylg，抗-LFA1 mAb，及抗-gp39 mAb。gp39 mAb之特定實例爲MR1。其他组合係爲熟習此項技藝者所知曉並了解者。本發明之可溶性CTLA4分子，例如：L104EA29YIg之施用可作爲單一活性成份或併同其他用於免疫調節攝生法中之藥劑或其他抗發炎試劑，例如：用以治療或預防異性或異種移植之急性或慢性排斥或發炎或自體免疫病症，或誘導出耐受性。例如：其可併用鈣稠神經磷酸酶抑制劑，例如：環孢素A或FK506 ;及免疫抑制性大環内酯，例如：雷帕黴素或其衍生物；例如：40-0-(2-羥基）乙基-雷帕黴素，淋巴球導引劑，例如：FT Y720或其類似物，皮質類固醇，鱗醯胺；硫唑嘌呤；胺甲喋呤；利服若邁 -45- 冢纸張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1311564 A7 ___B7 五、發明説明（43 ) (leflunomide)或其類似物；麥所利賓（mizoribine);黴酚酸；Μ紛酸鹽莫法提（mofetil) ; 15 -去氧史波**瓜琳（15-deoxyspergualine)或其類似物，免疫抑制性單株抗體，例如：抗體，其可對抗白血球受體，例如·· MHC，CD2， CD3，CD4，CD lla/CD18，CD7，CD25，CD27 , B7， CD40，CD45，CD58，CD137，ICOS，CD150(SLAM)， 0X40，4-IBB或其配體；其他免疫調節性化合物，例如： CTLA4/CD28_Ig ’或其他黏著分予矜制劑，例如：mAbs或低分子量抑制劑，包括LFA-1拮抗劑，選擇素拮抗劑及 VLA-4拮抗劑。該化合物特別可用以併用可干擾CD40及其配體之化合物，例如：針對CD40之抗體及針對CD40-L之抗體。若本發明之可溶性CTLA4突變分子之施用係連同其他免疫抑制性/免疫調節性或抗發炎性療法，例如：上文所具體指定者，該共同施用之免疫抑制劑，免疫調節劑或抗發炎化合物之劑量當然需視所使用之共同藥物之型式，例如·疋否爲類固醇或環抱素’視所使用之特定藥物，視所治療之情況及其他而定。根據前述，本發明提供如前文指明之再進一方面之方法’其包括，例如：伴隨或先後共同施用治療有效量之本發明之可溶性CTLA4分子’例如：CTLA4Ig及/或 L104EA29YIg ’其呈游離型式或醫藥上可接受鹽之型式，及第二種藥物實體，該第二種藥物實體係爲免疫抑制劑，免疫調節劑或抗發炎藥物，例如上文所指出者。進一步提 -46- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210X297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（44 ) 供者爲治療性组合，例如：套組，例如：用於上述指明之任何方法中者，包含可溶性CTLA4分子，其呈游離型式或醫藥上可接受鹽之型式，其係與至少一種包含免疫抑制劑，免疫調節劑或抗發炎藥物之醫藥組合物伴隨或先後使用。該套組可包含其施用之説明。本發明亦提供用以生產本發明之可溶性CTLA4突變分子之方法。可溶性CTLA4突變分子之表現可於原核細胞或眞核細胞内。原核細胞最常以各種細菌菌株爲代表。細胞可爲革蘭氏陽性或革蘭氏陰性。通常，較佳者爲革蘭氏陰性菌，例如：E. coli。其他微生物菌株亦可使用。可編碼可溶性 CTLA4突變分子之序歹可插入至設計以於原核細胞，例如：E. coli内表現外來序列之載體。此等載體可包括普遍使用之原核性控制序列，其於本文之定義爲包括用於轉譯起始之起動子，視需要具有操縱子，與核糖體結合位置序列在一起，包括普遍使用之起動子，例如：/?-内醯胺酶 (盤尼西林酶）及乳糖（lac)起動子系統（Chang等人，（1977) Nature 198:1056)，色胺酸（trp)起動子系統（Goeddel等人， (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057)及 A 衍生之起動子及 N-基因核糖體結合位置（Shimatake等人，（1981) Nature 292: 128)。此等表現載體亦可包括複製起點及可篩選性標示，例如：/5 -内醯胺酶或新黴素磷酸轉移酶基因，其賦與對抗生素之抗性，故此該載體可於細菌内複製且可於抗生素， -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（45 ) 例如：安比西林（ampicillin)或卡納黴素（kanamycin)存在下生長以便篩選出攜帶該質體之細胞。表現質體可經由各種標準方法導入原核細胞中，包括但不限於：CaCl2-衝擊（Cohen，（1972) Proc. Natl. AcaH Sr.i USA 69:211 0，及 Sambrook等人（編輯），"Molecular Cloninp-A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989))及電穿孔。根據本發明之實施，眞核細胞亦爲適合之宿主。眞核細胞之實例包括任意動物細胞，無論爲原始或不朽化者，酵母（例如：Saccharomvces cerevisiae，Schizosaccharomvces pombe，及Pichia pastoris、，及植物細胞。骨髓癌，COS及 CHO細胞爲可作爲宿主之動物細胞實例。特定之CHO細胞包括，但不限於，DG44 (Chasin 等人，1986 Som. Cell· Molec. Genet. 12:555-556 ; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)，CH0-K1 (ATCC No. CCL-61)，CH0-K1 Tet-On 細胞株（Clontech)，CHO 指定之 ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire，UK)，CHO 純係 13 (GEIMG， Genova，IT)，CHO純係 B (GEIMG，Genova，IT)，CHO-K1/SF 指定之ECACC 93061607 (CAMR，Salisbury, Wiltshire, UK) ，及 RR-CHOK1指定之 ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury， Wiltshire, UK)。示範性植物細胞包括於草（全植株，細胞培養物，或癒合組織），玉米，大豆，及稻米細胞。玉米，大豆，及稻米種子亦可接受。编碼CTLA4突變分子之核酸亦可插入至設計以於眞核宿 -48- 本紙張尺度適用中國國家裸準(CNS) A4规格(210X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（相 ) 主内表現外來序列之載體中。載體之調節性元件可根據特定之眞核細胞來加以改變。用於表現載體内之普遍使用之眞核控制序列包括起動子及可相容於哺乳類細胞之控制序列，例如：CMV起動子 (CDM8載體）及鳥類肉瘤病毒（ASV)(ttLN載體）。其他普遍使用之起動子包括來自猿猴病毒40 (SV40)之早期及晚期起動子（Fiers等人，(\9Ί3λ Nature 273:113)，或其他病毒性起動子，例如彼等衍生自聚合瘤，腺病例2，及牛乳頭淋瘤病毒者。可謗導性起動子，例如：hMTI1 (Karin等人’ Π982) Nature 299:797-802)亦可使用。用以於眞核生物中表現CTLA4突變分子之載體亦可攜帶稱爲強化子區域之序列。此對於基因之最適化表現很重要且已被發現於起動子區域之上游或下游。使用於眞核宿主細胞之表現載體實例包括，但不限爲使用於哺乳類宿主細胞之載體（例如：BPV-1，pHyg， pRSV，pSV2，pTK2(Maniatis) ; pIRES (Clontech); pRc/CMV2，pRc/RSV，pSFVl (Life Technologies) ; pVPakc 載體，pCMV載體，PSG5載體（Stratagene))，逆轉錄病毒 (例如：pFB 載體（Stratagene))，pCDNA-3 (Invitrogen)或其經修飾之型式，腺病毒載體；腺-相關性病毒載體，棒狀病毒載體，酵母病毒載體（例如：pESC載體（Stratagene))。編碼CTLA4突變分子之核酸序列可插入至眞核宿主細胞之基因组内並随宿主基因組之複製而複製。或者，攜帶 CTLA4突變分子之載體可包含複製起點，使之可進行染色 -49- 本紙張尺度適用中國國家棣準(CNS)八4规格(210 X 297公釐) 1311564 A7 B7 __ 五、發明説明（47 ) 體外之複製。爲要於Saccharomvces cerevisiae 1*1表現該核酸序列，可使用來自内生性酵母質體，2 μ環之複製起點。（Broach， (1983) Meth. Enz. 101:307)。或者，可使用來自酵母基因組，可促使進自發性複製之序列（參見，例如：Stinchcomb 等人，（1979) Nature 282:39) ; Tachemper 等人，（1980) Gene 10:157 ;及 Clarke等人，（1983) Meth. Enz. 101:300)。酵母載體之轉錄控制序列包括糖解酵素合成之起動子 (Hess 等人，（1968) J.Adv. Enzvme Reg. 7:149 ; Holland 等人，（1978) Biochemistry 17:4900) 〇此項技藝中已知之其他起動子包括提供於CDM8載磕内之CMV起動子（Toyama及 Okayama, (1990) FEBS 268:217-221) ; 3-攝酸甘油酯激酶之起動子（Hitzeman等人，(Ί980) J. Biol. Chem. 255:2073)，及彼等用於其他糖解性酵素之起動子。其他起動子爲可謗導性，因其可受環境刺激或受細胞之生長培養基所調節。此等可謗導之起動子包括彼等來自熱休克蛋白質，乙醇去氩酶2，異細胞色素C，酸性鱗酸酶，與氮代謝有關之酵素，其麥芽糖及半乳糖利用所需酵素之基因。調節序列亦可置於編碼序列之3'端。此等序列可用以穩定信使RNA。該等終結子係發現於數種酵母衍生性及哺乳類基因之編碼序列後之1未轉譯區域。用於植物及植物細胞之示範性載體包括，但不限於： Agrobacterium几質體，花椰菜鑲嵌病毒（CaMV)，及蕃茄 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（48 ) 金黃鑲嵌病毒（TGMV)。哺乳類細胞宿主系統轉形之一般面向已爲Axel説明（美國專利第4,3 99,216號，1983年8月16曰申請）。哺乳類細胞之轉形可藉由之方法包括，但不限於：於磷酸鈣存在下轉染，顯微注射，電穿孔，或經由病毒載體轉導。將外來DNA序列轉導入植物及酵母基因组之方法包括（1) 機械性方法，例如：將DNA顯微注射入單一細胞或原形物 (protoplast)，於DNA存在時將細'胞與玻璃珠一起振盡，或將DNA披覆之鎢或金球射入細胞或原形物内；（2)經由聚乙二醇處理或通入高電壓之電子脈衝（電穿孔），使細胞膜爲巨分子可通透性而導入DNA ;或（3)使用融合於細胞膜之微脂體（内含cDNA)。一旦表現出本發明之CTLA4突變分子，其可藉由此技藝中已熟知之方法加以收集，例如：細胞溶解（例如：超因波，微脂體及/或清潔劑）且蛋白質回生之進行可藉由標準蛋白質純化方式，例如：親和性層析或離子交換層析，以得到實質性純產物（R. Scope 於"Protein Purification-Principles and Practice"，第三版，Springer-Verlag (1994); Sambrook 等人（編），"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"，第二版，Cold Spring Harbor Press, (1989))。 CTLA4突變分子之表現之偵測可藉由此技藝中已知之方法。例如：該突變分子之偵測可藉由經考馬斯藍（Coomassie blue)染色之SDS-PAGE膠體及使用可結合CTLA4之抗體之免疫墨潰。 -51 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（49 ) 下列實例係用以説明本發明並協助一般熟悉於製造或利用之者。此等實例並不以任何方式來限定本發明之範圍。實例1 下列係提供用以產生本發明之CTLA4分子之編碼核菩酸序列之方法説明。首先構築CTLA4Ig編碼質體，並使之如美國專利第 5,434，131，5,885,579及5,851，795號中所説明者表現出 CTLA4Ig分子 '再由CTLA4Ig编碼序歹'J產生單一位置突變分子（例如：L104EIg)，表現並測試其對各種B7分予之結合動力學。使用該L104EIg核甞酸序列（如包括顯示於圖18 中之序列）作爲模板以產生雙位置CTLA4突變序列（如包括顯示於圖19-22中之序列），其表現成蛋白質並試驗其結合動力學。該雙位置CTLA4突變序列包括：L104EA29YIg， L104EA29LIg，L104EA29TIg及 L104EA29WIg。亦可產生三位置突變。 CTLA4Ig 構築如説明於美國專利第5,434,131，5,844,095及5,851，795號之説明構築編碼含有CTLA4之胞外功能區域及IgC r 1功能區域之CTLA4Ig之基因性構築體，其内容併列爲本文之參考。CTLA4基因之胞外功能區域係藉由PCR，使用相對於已發表序列之合成寡核苷酸加以選殖（Dariavach等人，Εμ[ Journ. Immunol. 18:190卜1905(1988))。由於CTLA4基因内之CTLA4訊號胜肽尚不明確，故將 CTLA4之預測性序歹ij之N端利用重疊性寡核芬酸以兩步驟 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐)

裝訂

1311564 A7 B7 五、發明説明（51 ) 密碼組基底之突變：已發展出突變及篩選策略以鑑別突變CTLA4Ig分子，其由CD80及/或CD86分子解離之速率（"離開"速率）較低，即：具有改善之結合能力。於此具體實施例中，突變係發生於CTLA4之胞外功能區域之CDR-1，CDR-2 (亦稱爲C1股）内及/或大約CDR-3之殘基（如説明於美國專利第6,090,914 ’ 5,773,253及5,844,095號中者；於共同申請之美國專利申請案序號60/214,065號中者；及由Peach，R.J.等人J. Exp. Med 1994 180:2049-2058説明者。類CDR-區域涵括各個 CDR區域及於CDR特色構造之上游及/或下游延伸數個胺基酸之延伸物）。此等位置之選蘀係基於嵌合性CD28/CTLA4 融合蛋白之研究（Peach等人，J. Exp. Med. 1994, 180:2049-205 8)，及於一模型上，其可預測何種胺基酸側鏈係可暴露於溶液者，及缺少胺基酸殘基於CD28及CTLA4間之抹些心·置之相同度或同源性。再者，任何所佔有之空間相當接近（5至20埃單位）於確定殘基之殘基係爲本發明涵蓋之部分。爲了合成並篩選對B7分子（例如：CD80，CD86)之親和力改變之可溶性CTLA4突變分子，故採用雙步驟之策略。實驗係先產生位於CTLA4之胞外部分之特定密碼組處之突變庫並再以BlAcore分析篩選之，以鑑別出對B7之反應性改變之突變。Biacore分析系統（Pharmacia, Piscataway，N.J.) 使用表面等離子體激光共振偵測系统，其必需涉及CD80Ig 或CD86Ig與位於偵測器内之葡聚糖披覆性感應器晶片之共 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（52 ) 價結合。該測試分子可再注入含有感應器晶片之槽中並依據分子質量之變化來評估以物理性連接於感應器晶片之葡聚糖側之結合互補蛋白質量；可藉由該偵測系統來測定分子質量之變化。特別地，單一位置突變之核苷酸序列之產生可利用編碼 CTLA4Ig之非突變型（例如：野生型）DNA(美國專利第 5,434，131，5,844,095 ; 5,851,795 ;及 5,885,796 號；ATCC 登錄號碼68629)作爲模板。設計突變性寡核苷酸PCR引子以對特定密碼組加以隨機突變，其藉由使得密碼組之位置 1及2處可爲任何鹼基，但位置3處僅可爲鳥糞嘌呤或胞嘧啶（XXG/T或亦記爲NNG/T)。以此方式，可將編碼胺基酸之特定密碼组隨機突變成20個胺基酸個別之密碼。以此觀點，XXG/T突變可產生32個可能之密碼組，其可编碼個別之20個胺基酸。將含有鄰近於CTLA4Ig之類CDR3環 (MYPPPY)内之編碼突變之PCR產物以Sacl/Xbal水解並次選殖入經相同切割之CTLA4Ig(如包括於圖24者）ttLN表現載體。此方法係用以產生單一位置CTLA4突變分子L104EIg (如包括於圖18者）。爲要於CTLA4Ig之類CDR-1環附近突變，首先藉由PCR引子定向突變於此環之51端導入靜默型Nhel限制位置。以 Nhel/Xbal水解PCR產物並次選殖入經相同切割之CTLA4Ig 或L104EIg表現載體。此方法係用以產生雙位置之CTLA4 突變分子L104EA29YIg (如包括於圖19者）。特別地，可编碼單一位置CTLA4突變分子，L104EIg之核酸分子可作爲 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（53 ) 模板以產生雙位置之CTLA4突變分子，L104EA29YIg。編碼CTLA4突變分子，例如：L104EA29YIg之雙位置突變核甞酸序列（2000年6月19曰寄存於美國菌種保存中心 (ATCC)，10801 University Blvd，Manasas，VA 20110-2209 病授與ATCC登錄號碼PTA-2104)，其可藉由使用L104EIg 作爲模板，重覆上述之突變步驟而產生。此方法係用以產生多種雙位置突變之核芬酸序列，例如彼等編碼CTLA4分子Ll〇4EA29YIg (如包括於圖19所顯示之序列者）， Ll〇4EA29LIg (如包括於圖20所顯示之序列者）， Ll〇4EA29TIg.(如包括於圖21所顯示之序列者），及 LliMEAMWIg (如包括於圖22>斤顯示之序列者）。參位置突變，例如彼等編碼 L104EA29YS25KIg，L104EA29YS25NIg 及L104EA29YS25RIg者亦可產生。可溶性CTLA4分子可表現自核苷酸序列並使用於説明於下文實例3中之第II期臨床研究中。因爲彼等熟習此項技藝者知道，核酸序列之複製，特別是藉由PCR增幅者，可輕易將鹼基改變導入DNA股中。然而，核苷酸改變不必然會轉譯成胺基酸改變，因爲一些密碼組重覆地編碼相同之胺基酸。由原始或野生型序列之任何核苷酸改變，無論是否爲靜默型（即：不造成轉譯出之胺基酸改變），若未明確説明於本文中，則均涵括於本發明之範圍内。實例2 下列實例提供篩選方法之説明，其係用以鑑別表現自實 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公着） 1311564 A7 __B7 五、發明説明（54 ) 例1中説明之構築體之單一及雙位置突變CTLA聚胜肽，其對B7分子之結合親合力較非突變性CTLA4Ig分子高。目前之生體外及生體内研究指出CTLA4Ig本身無法完全阻斷抗原專一性活化之T-細胞之啓動。於以CTLA4Ig及對 CD80或CD86專一之單株抗體來測定對T細胞增生之抑制性之生體外研究中指出抗-CD80單株抗體不會提高CTLA4Ig 之抑制。然而，抗-CD86單株抗體會提高其抑制，此表示 CTLA4Ig對於阻斷CD86之交互作用並非同樣有效。此等資料可支持Linsley等人早先之發現rimmunitv. (1994), 1:793-801)，其顯示抑制CD80-調節之細胞性反應較抑制CD86-調節之反應所需之CTLA4Ig濃度約低100倍。基於此等發現，吾人推測對CD86之親和力較野生型CTLA4高之可溶性 CTLA4Ig分子較可阻斷抗原專一性活化之T_細胞之啓動。爲此目的，可利用一種新穎方法來篩選説明於上述實例 1中之可溶性CTLA4突變分子，以鑑別出於CTLA4之胞外功能區域内之可改善其對CD80及CD86之結合親和力之數種突變β此篩選策略提供一種有效之方法以不需蛋白質純化或定量，直接鑑別”離開”速率顯然較低之突變，因爲" 離開"速率之測定係與濃度無關（O'Shannessy等人，（1993) Anal. Biochem ?1 7-457-46«^。將COS細胞以經各別純化之小量製備之純化質體DNA轉染並繁殖數天。將調整三天之培養基施加於BIAcore生物感應器晶片（Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)，其上披覆有CD80Ig或CD86Ig。以表面等離子體激光共振 -57- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1311564 五、發明説明（55 ) (O’Shannessy，D.J.等人，1997 Anal. Biochem. 212:457-468) 測定突變蛋白質之專一性結合及解離。所有實驗均於25°C 下於BIAcore™或BIAcore™ 2000生物感應器上進行。將配體利用標準之N-乙基(二甲基胺基丙基）碳化二醯亞胺 N-羥基琥珀醯亞胺偶合法（Johnsson, B.等人，（1991) Anal. Biochem. 198:268-277 ; Khilko，S.N.,等人（1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434、固定於研究級NCM5感應器晶片上。篩選方法 _ 以突變之CTLA4Ig瞬間轉染生長於24孔之組織培養盤上之COS細胞。於三天後收集含有分泌之可溶性CTLA4Ig之培養基。使經調整之COS細胞培養基流過經CD86Ig或CD80Ig衍生之BIAcore感應器晶片中（如説明於Greene等人，1996，L Biol· Chem. 271:26762-26771)，並鑑別離開速率較野生型 CTLA4Ig低之突變分子。將對應於所篩選培養基之樣品之 DNA定序並製備更多DNA以進行較大規模之COS細胞瞬間轉染，將培養基經蛋白質A純化後，可由其中製備出 CTLA4Ig突變蛋白質。 BIAcore分析條件及平衡結合數據分析之進行可如説明於 J. Greene等人，1996，J. Biol. Chem. 271:26762-26771 及於美國專利申請案序號第09/579,927及60/214,065中者，其併列爲本文之參考。 BIAcore數據分板於分析前先將感應圖基線正規化至零反應單位（RU)。使 _____-58-_ 本紙張尺度適用中國國家榡竿(CNS) A4规格(210X 297公着） 1311564 A7 B7 五、發明説明（56 ) 樣品流經僞造衍生之流動細胞以測定背景RU値，因爲溶液間之主體折射率差異。平橫解離常數（Kd)係由Req對C之圖計算而得，其中Req爲穩定態反應減去於僞造-衍生之晶片上之反應，且C爲分析物之莫耳濃度。結合曲線之分析係利用市售非線性曲線-配合軟體（Prism, GraphPAD Software) 〇首先將實驗數據套入用於單一配體結合單一受體之模型 (1-位置模型，即：簡單langmuir系統，A+B_AB)，並由方程式 R=Rmax · C/(Kd+C)計算平衡結合常數（Kd=[A] · [B]\ [AB]) 。接著，將數據套入最簡單之配體結合之雙位置模型 (即：對具有兩個無交互作用之獨立結合位置之受體），其可由方程式 R=Rmaxi · C\ (Kdl+C)+ Rmax2 · C\ (Kd2+C)説明。此兩種模型之適合優良度之分析係直觀地藉由比較實驗數據並統計性地藉由平方和之F試驗。選用較簡單之單位置模型爲最佳符合，除非雙位置符合顯著較佳（P< 〇· 1)。結合及解離分析之進行係使用BIA估算2.1軟體 (Pharmacia)。結合速率常數kQn之計算有兩種方式，採用兩個同源之單一位置交互作用及並聯雙位置交互作用。對於單一位置交互作用，kQn値之計算係根據方程式 Rt=Req(l-exp-ks(t-tQ))，其中Rt係爲所給時間，t時之反應； Req係爲穩定態反應；t〇爲開始注射時之時間；及 ks=dR/dt=kQn · Ckcjff，其中C爲分析物之滚度，依序計算單體性結合位置。對於雙位置交互作用，kQn値之計算係根據方程式 ReReqKl-exp-ksW-’+ReqJl-exp-^W。)）。對於每 -59- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 A7 _ B7 五、發明説明（57 ) 個模型，1^η値可由ks對C之圖計算出之斜率（至最大結合之約70%)測得。. 解離數據之分析可根據單一位置（AB=A+B)或雙位置 (AiBj=Ai+Bj)模型，且速率常數（kQff)係計算自最適曲線。使用結合位置模型，除非殘留物大於機械之背景（2-10RU ’依機械），於該狀況中，則使用雙-結合位置模型。利用1^=0.693/1^^之關係式計算受體佔據之半數期。流動細胞計數法：鼠類 mAb L307.4 (抗-CD80)係講自 Becton Dickinson (San Jose，California)及 IT2.2 (抗-B7-0 [亦稱爲 CD86]購自 Pharmingen (San Diego，California)。爲要加以免疫染色，故將CD80-陽性及/或CD86-陽性CHO細胞由其培養容器中移出並培養於含10 mM EDTA之磷酸緩衝化生理鹽水（PBS) 中。先將CHO細胞（ι-ίο X 1〇5)與mAbs或免疫球蛋白融合蛋白質一起培養於含10%牛胎兒血清（FBS)之DMEM中，再洗滌並培養於異硫氰螢光黃結合之山羊抗老鼠或抗人類免疫球蛋白第二步骤試劑（Tago，Burlingame, California)。將細胞進行最後洗務並於FAC Scan上分析（Becton Dickinson)。 SDS-PAGE及分子篩層析 SDS-PAGE係於Tris/甘油4-20%丙醯烯胺膠體（Novex，San Diego, CA)上進行。將分析之膠體以考馬斯藍（Coomassie Blue)染色，並以數位掃描取得濕膠體之影像。使用平衡於含0.02% NAN3之經磷酸緩衝之生理鹽水中之TSK-GEL 0300 8'\\^1^管柱（7.8\ 300毫米，1'〇8〇11338，1\/1〇111邑〇111^>^116, -0〇 « 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（59 ) 蛋白質藉由表面等離予體激光共振（SPR ;如前述説明）進行CD86Ig結合分析。於每個位置突變之主要影響整理於文後之表II中。CDR-1區域（S25-R33)内之一些胺基酸之随機突變顯然不會改變配體之結合。E31及R33及M97-Y102之突變明顯造成配體結合之減少。殘基S25，A29，及T30， K93，L96，Yl〇3，L104，及G105之突變所產生之蛋白質具有慢”接上”及/或慢”離開"速率。此等結果確認先前之發現：CDR-1(S25-R33)區域内之殘基，及接近M97-Y102之殘基會影響配體之結合（Peach等人，（1994) J. Exp. Med·, 180:2049-2058) 〇位置 S25，T30，K93，L96，Y103，及 G105之突變導致鑑別時，一些突變蛋白質對CD86Ig之"離開”速率較低。然而，於此等情況中，慢"離開••速率可由慢"接上"速率調和，使突變蛋白質對CD86Ig之總體親和力似乎相同於由野生型CTLA4Ig所見者。此外，K93之突變導致明顯之聚集，其係爲觀察到動力學變化之原因。經COS細胞轉染後之L104隨機突變及藉由SPR於固定化 CD86Ig上篩選培養基樣品可得到六種培養基樣品，其包含 "離開"速率約較野生型CTLA4Ig慢2倍之突變蛋白質。將此等突變體所相對之cDNA加以定序時，發現每個均含有一個白胺酸至麩胺酸之突變（L104E)。顯然地，將白胺酸104 以天門冬胺酸取代（L104D)並不影響CD86Ig之結合。再於表II所列出之每個位置重覆進行突變，此時使用 L104E作爲PCR模板來替代野生型CTLA4Ig，如上述《再利 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇X 297公釐） 1311564 A7 __B7 五、發明説明（60 ) 用CD86Ig進行SPR分析，其由丙胺酸29之突變鑑別出六種培養基樣品具有"離開"速率約較野生型CTLA4Ig慢4倍之蛋白質。其中兩個最慢者爲酪胺酸取代（L104EA29Y)，兩個爲白胺酸（L104EA29L)，一個爲色胺酸（L104EA29W)，且一個爲經丁胺酸（L104EA29T)。顯然地，當丙安酸29爲野生型CTL A4Ig中唯一之随機突變時，並無慢"離開"速率突變體被鑑別出來。以SDS-PAGE及分子篩層析法诘算經純化之L104E及 L104EA29YIg之相對分子質量及聚集狀態。L104EA29YIg (〜1微克；第3道）及L104EIg (〜1微克；第2道）於還原 (〜50kDa ; + /? ME ;加2-硫醇乙醇）及非還原（〜1 〇〇kDa ; -/?ME)狀況下均顯然地具有與CTLA4Ig (〜1微克，·第1道）相同之電泳移動性（圖25A)。分子篩層析顧示出L104EA29YIg (圖25C)顯然地具有與嵌合性CTLA4Ig相同之移動性（圖 25B)。主要之波峰代表蛋白質雙體，而圖mb中之較快溶離出之次要波峰代表較高分子量之聚集物。但並無 L104EA29YIg 或 L104EIg聚集之證據。大約 5.0%之 CTLA4Ig 表現成較高分子量之聚集物，但並無L104EA29YIg或 LltMEIg聚集之證據。因此，可見於Li〇4EIg及L104EA29YIg之較強CD86Ig結合對於突變诱發之聚集並無貢獻。平衡及動力皋結合分析平衡及動力學結合分析係使用表面等離子體激光共振 (SPR)於經蛋白質 A純化之CTLA4Ig，L104EIg及L104EA29YIg 上進行°其結果顯示於下文之表I内。觀察到之平衡解離 -63- 本紙張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（61 ) 常數（Kd ;表I)係計算自由一段範圍之濃度（5.0-200 nM)所產生之結合曲線。L104EA29YIg對於CD86Ig之結合較強於 L104EIg 或 CTLA4Ig。L104EA29YIg 之 Kd (3.21 nM)較低於 L104EIg (6.06 nM)或 CTLA4Ig (13.9 nM)表示 L104EA29YIg 對CD86Ig之結合親和力較高。L104EA29YIg之Kd (3.66 nM) 較低於 L104EIg (4.47 nM)或 CTLA4Ig (6·51 nM)表示 L104EA29YIg對CD80Ig之結合親和力較高。動力學結合今析顯示CTLA4Ig，L104EIg及L104EA29YIg 結合至CD80之比較性11接上"速率相似，其對CD86Ig之”接上”速率亦如此（表I)。然而，此等分子之"離開"速率並不相當（表 I)。與 CTLA4Ig相較，L104EA29YIg 由 CD80Ig之”離開”速率約慢2倍，且由CD86Ig之"離開”速率約慢4倍。 L104E之”離開"速率介於L104EA29YIg與CTLA4Ig之間。因爲此等突變之導入並未顯著影響"接上"速率，L104EA29YIg 對CD80Ig及CD86Ig之親和力之提高可能主要是因"離開"速率下降。爲要測定L104EA29YIg對CD86Ig及CD80Ig之親和力增加是否係因突變影響每個單體連接成雙體之方式，或是否每個單體内均導入使其親和力提高之構造性變化，故於如前述並根據 Linsley 等人，(1995) J. Biol. Chem. 270:15417-15424 (84)將半胱胺酸120突變成絲胺酸後，製備CTLA4及 L104EA29Y胞外功能區域之單鏈構築體。經純化之蛋白質 CTLA4Xcl20S& L104EA29YXci2OS於藉由 SPR分析其配體結合性質之前，經膠體滲透層析顯示其爲單體性（Linsley等 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（62 ) 人，（1995)，如前述）。結果顯示兩種單體性蛋白質對 CD86Ig之結合親和力約較其個別之雙體低35-80倍（表I)。此可支持先前發表之數據，其確認CTLA4之雙體化係爲高配體結合親和力所必需（Greene等人，（1996) J. Biol. Chem 271:26762-26771) 〇 L104EA29YXC120S對CD80Ig及CD86Ig之結合親和力均較 CTLA4Xcl20S約高2倍。親和力之提高係由於其對兩種配體之解離速率約慢3倍。因此，L104EA29Y之配體結合性較強最可能係由於使親和力提高之構造性變化已導入每個單體鏈中，而非已雙體化之分子内之改變。親和力提高之突變之位置及構造分析 CTLA4之胞外類Igv功能區域之溶液構造最近已藉由 NMR光譜學測出（Metzler等人，（1997) Nature Struct Rir>i 4:527-531)。此可精確得到白胺酸104及丙胺酸29於三度空間構造中之位置（圖26左及右圖）。白胺酸104係位於靠近高度保留性之MYPPPY胺基酸序列處。丙胺酸29係位於靠近CDR-1 (S25-R33)區域之C端處，其佔有空間鄰近 MYPPPY區域。當此二區域間之殘基有顯著之交互作用時，則L104與A29之間顯然無直接之交互作用，雖然其均包含蛋白質内之連續疏水性核心之部分。兩種親和力提高之突變之構造係藉由模擬加以確定。A29Y突變可輕易地發生於CDH-l (S25-R33)區域及MYPPPY區域間之裂縫中。於野生型CTLA4内，L104造成靠近MYPPPY區域之L96及 V94之廣泛疏水性交互作用。麩胺酸突變極不可能採取與 -65- 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇x 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（63 ) L104相似之構形，其理由有二。第一，其構造中並無足夠空間可於不顯著干擾CDR-1 (S25-R33區域）容納較長之麩胺酸側鏈。第二，要於疏水性區域内包埋麩胺酸側鏈之負電荷所需之能量成本大。反之，模擬研究預測麩胺酸側鏈係翻轉至表面，使其電荷可經溶合作用而安定化。此等構形上之改變可輕易由G105提供，其可使該區域内之其他殘基之扭曲度最小。高親和力突變體對CHO細胞表現之CD80或CD86之結合 CTLA4Ig及突變分子結合至經穩定轉染之CD80+及 CD86+CHO細胞之FACS分析（圖27)係如本文之説明來進行。將CD80-陽性及CD86-陽性CHO細胞與濃度提高之 CTLA4Ig，L104EA29YIg，或 L104EIg—起培養，並再洗滌。結合之免疫球蛋白融合蛋白質之偵測係使用異硫氰螢光黃結合之山羊抗人類免疫球蛋白。如圖27中之顯示，將CD80-陽性及CD86-陽性CHO細胞 (1.5 X 105)與所指出濃度之 CTLA4Ig (方形），L104EA29YIg (圓形），或L104EIg (三角形）於23Ό下一起培養2小時，洗滌，並與異硫氰螢光黃結合之山羊抗人類免疫球蛋白抗體一起培養。於FACScan上分析得共有5,000個活細胞結合 (單次測定），並使用PC-LYSYS由數據之柱狀圖中測定平均螢光強度（MFI)。以僅與第二步驟試劑一起培養之細胞所測得之背景螢光度（MFI=7)校正數據。對照之L6 mAb (80微克/毫升）所得之MFI < 3 0。此等結果於四個獨立之實驗均具代表性。 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（64 ) L104EA29YIg，L104EIg，及 CTLA4Ig對經人類 CD80-轉染之CHO細胞之結合性大約相等（圖27A)。L104EA29YIg及 L104EIg對於經人類CD86-穩定轉染之CHO細胞之結合性較 CTLA4Ig爲強（圖 27B)。功能分析: 藉由免疫吸引負篩選來分離人類CD4-陽性T細胞（Linsley 等人，（1992) J. Exp· Med· 176:1595-1604)。將分離出之 CD4-陽性T細胞於定量滚度之抑_劑存在下，以phorbal myristate acetate (PMA)加 CD80-陽性或 CD86-陽性 CHO細胞刺激之。將CD4-陽性T細胞（8-10 X 104/孔）培養於1 nM PMA 中，其可含或不含經照射之CHO細胞刺激劑。增殖反應之測定係藉由於72小時培養之最後7小時間加入1 Ci/孔之 [3H]胞嘧啶。藉由L104EA29YIg及CTLA4Ig進行經PMA加 CD80-陽性CHO，或CD86-陽性CHO刺激之T細胞之抑制。其結果顯示於圖28中》L104EA29YIg對於經CD80-陽性PMA 處理之CHO細胞之增殖之抑制較CTLA4Ig多（圖28A)。 L104EA29YIg對於經CD86-陽性PMA處理之CHO細胞之增殖之抑制亦較CTLA4Ig有效（圖28B)。因此，L104EA29YIg係爲T細胞之CD80-及CD86-調節性共刺激作用之較有效抑制劑0 圖29顯示L104EA29YIg及CTLA4Ig對於上述製備之異性刺激性人類T細胞之抑制，及進一步異性刺激以人類b淋巴胚細胞株（LCL)喚醒之可表現CD80及CD86之PM (T細胞爲 3.0xl〇4/孔且PM爲8.0xl03/孔）。初級之異性刺激進行六 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（65 ) 天，再於測定併入之放射性標示之前，將該細胞以3h-胞 π密途衝擊7小時。如下述進行次級異性刺激。於淋巴細胞分離培養基（LSM) (ICN, Aurora, 0H)上收集經七日之初級異性刺激之T細胞，並靜置24小時。將T細胞再經異性刺激（次級），於定量之 CTLA4Ig或L104EA29YIg存在下，藉由添加與上述相同比例之PM。次激進行3天，再將細胞以放射標示衝擊並如上述收集之。L104EA29YIg對初級異性刺激之T細胞之影響顯示於圖29A。L104EA29YIg對次級異性刺激之T細胞之影響顯示於圖29B。L104EA29YIg2對初級及次級T細胞增殖反應之抑制均較CTLA4Ig爲佳。爲要測定細胞因子生產（圖30)，故設置雙重覆之次級異性刺激平盤。3天之後，使用ELISA套組（Biosource, Camarillo, C A)於製造商之建議條件下分析培養基。發現 L104EA29YIg對於阻斷次級同種異系刺激後之T細胞IL-2， IL-4，及r-IFN細胞因子生產較CTLA4Ig有效（圖30A-C)。 1^104£八29丫1名及（：1^八41呂對於猴子混合性淋巴細胞反應 (MLR)之影響顯示於圖31。將得自兩隻猴子之周圍血液單核細胞（PBMCVS ;每隻猴子各3.5xl04細胞/孔）於淋巴細胞分離培養基（LSM)上純化並與2微克/毫升之植物性血球凝集素（PHA)混合。將該細胞次激3天再於收集前以放射性標示衝擊16小時。L104EA29YIg對於猴子T細胞增殖之抑制優於 CTLA4Ig。 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（66 ) 表I : 平衡及視動力常數係提供於下表（數値爲得自三個不同實驗之平均値土標準差）：固定化蛋白質分析物 k〇n(x 10 ) mV k〇fi(x l〇 ) S-1 Ka nM CD80Ig CTLA4Ig 3.44±0.29 2.21±0.18 6.51+1.08 CD80Ig L104EIg 3.02±0.05 1.35±0.08 4_47±0_36 CD80Ig L104EA29YIg 2.96±0.20 1.08±0.05 3.66±0.41 CD80Ig CTLA4Xci2〇s 12.0±1.0 230±10 195±25 CD80Ig L104EA29YXCi2〇s 8.3±0.26 71±5 85.0±2.5 CD86Ig CTLA4Ig 5.95±0.57 8.16±0.52 13.9±2.27 CD86Ig L104EIg 7.03±0.22 4.26±0_11 6.06±0.05 CD86Ig L104EA29YIg 6.42±0.40 2.06±0.03 3.21±0.23 CD86Ig CTLA4XCi2〇s 16.5±0.5 840±55 511±17 CD86Ig L104EA29YXCi2〇s 11.4±1.6 300±10 267±29

表II 以説明於前文之SPR測定於所列出之CTLA4Ig之位置之突變對於CD86Ig結合之影響。主要之影響係以"+ ”號表示之。突變位置突變之影響無影響明顯之慢”接上"/ 結合減少配體慢"離開”速率 S25 + P26 + G27 + K28 + -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（67 ) 突變位置突變之影響無影響明顯之慢"接上”/ 慢"離開”速率結合減少配體 A29 + T30 + E31 + R33 + K93 + . L96 + M97 + Y98 + P99 + P100 + P101 + Y102 + Y103 + L104 + G105 1106 + G107 + Q111 + Y113 + 1115 + 實例3 + 下文提供之説明係爲第II期臨床研 -70- 究之人類患者，其施本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1311564 A7 B7 五、發明説明（68 ) 用可溶性CTLA4分子L104EA29YIg (亦稱爲LEA29Y或LEA) 或CTLA4以減輕至少一種與風濕性關節炎有關之徵狀，包括關節腫腺，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，及疼痛。使用於此處之CTLA4Ig分子起始於位置+1處之甲硫胺酸（或於位置-1處之丙胺酸）並終止於位置+357處之離胺酸，如圖24 之顯示。编碼一種CTLA4Ig分子之具體實施例之之DNA已寄存爲ATCC 68629。使用於此處之L104EA29YIg分子起始於位置+1處之f硫胺酸（或於位置-1處之丙胺酸）並終止於位置+3 57處之離胺酸，如圖19之顯示。編碼一種 L104EA29YIg分子之具體實施例之之DNA已寄存爲ATCC PTA 2104。此外，下文提供之説明係爲人類患者，其施用 L104EA29YIg或CTLA4Ig以減輕至少一種與風濕性關節炎有關之生物性替代標誌，包括紅血球沉降速率，及血清C-反應性蛋白質及/或IL2受體濃度降低》患者群總共有214位患者參與本研究，包括54位男性及160位女性（圖ΙΑ，1B)。患者於基線處之平均患病期爲3.4(±2.〇)年並至少經一種疾病緩和性抗風濕藥物（DMARD)治療失敗。可使用安定之非類固醇性抗發炎藥物（NSAIDS)或類固醇 (Sl〇毫克/天）且禁止伴隨DMARDS。將患者隨機分成每組 2 5至3 2名患者之治療組別。三十二位患者接受安慰劑，9 2 位接受L104EA29Ylg，且90位接受CTLA4Ig。使患者遵循擬定之規則並於第57天前不中斷接受共4次之靜脈注射， -71 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) A7 B7 1311564 五、發明説明（69 ) 每位均於第1，15，29，及57天各注射一次。所有患者均於第1，15，2.9，43，57，71，及85天進行評估。所施用之劑量包括0.5，2.0，或10.0微克/公斤之L104EA29YIg (分別記爲 LEA.5，LEA2，及 LEA10於圖 1A-1E 中）或 CTLA4Ig (分別記爲 CTLA.5，CTLA2，及 CTLA10 ’ 於圖 1A-1E 中）。對所有個體均監測其接近注射時之不良反應及總體安全性，藉由問卷調查列出可能之不良反應。對病患詢問其可能發生於注射後24小時内之有關之不良反應。此外，鼓勵病患自動提出任何經歷到之不良反應。由醫師例行性地監測來自患者之實驗室樣品之血液化學及血液學方面之異常。第一個終點係爲於第85天時達到ACR 20標準之個體群。試驗材料之貯存 CTLA4Ig及L104EA29YIg係提供於單次使用之玻璃瓶中，其分別含有200毫克/瓶之CTLA4Ig或100毫克/瓶之 L104EA29YIg。於注射之前，將 CTLA4Ig 及 L104EA29YIg 以注射用之無菌水（SWFI)稀釋至最終濃度爲25毫克/毫升。施用計畫所有注射物均於1小時内經靜脈施用（圖1至17)。所有個體均接受至少一種研究藥物之注射。第1組：32位患者，CTLA4Ig或L104EA29YIg配合安慰劑；第2組：26位患者，劑量0.5毫克/公斤之CTLA4Ig ; 第3组：32位患者，劑量2.0毫克/公斤之CTLA4Ig ; -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）裝訂 1311564 A7 B7 五、發明説明（70 ) 第4组：32位患者，劑量10.0毫克/公斤之CTLA4Ig; 第5組：32位患者，劑量0.5毫克/公斤之L104EA29YIg; 第6組：29位患者，劑量2.0毫克/公斤之L104EA29YIg; 第7組：31位患者，劑量10.0毫克/公斤之L104EA29YIg; 臨床監測病患於接受任何注射前先評估其疾病之基點徵狀。基點評估包括：由患者及醫施評估之關節腫脹，關節觸痛，發炎，晨間僵硬，疾病活性及由健康問卷評估（HAQ)(其報告如圖1C中之身體功能計分），及疼痛（圖1A至1D)所評估之失能。此外，基點評估包括紅血球沉降速率（ESR)，及 C-反應性蛋白質（CRP)及可溶性IL-2-受體（IL-2r)之血清濃度（圖1C及1D)。臨床反應研究係根據美國風濕病學學院（ACR)所建立之標準。一個體達到ACR20之標準係指倘若其關節觸痛及腫脹數目有20%改善且於五種被測定之持續徵狀中之三種有 20%改善，例如：病患及醫師總體疾病變化，疼痛，失能，及急性期反應物（F el son, D.T.，等人，1993 Arthritis and Rheumatism 36:729-740 ; Felson，D.T.，等人，1995 Arthritis and Rheumatism 38:1-9)。結果 CTLA4Ig及L104EA29YIg於所有劑量値下均普遍具有良好之耐受性。接近注射時之不良反應於所有劑量之組群間均相似，除了頭痛之外。於經CTLA4Ig治.療之患者中，患者於第85天之頭痛反應呈劑量依賴性地增加，其於〇.5， ______ -73- _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（71 ) 2.0，及10.0毫克/公斤之劑量下，分別爲23%，44%，及 53%，經L104EA29YIg治療之患者中，則爲34%，45%及 61%。反之，31%之施用安慰劑之患者有頭痛之經歷。由於風濕信號及其他不良反應而中斷臨床研究之患者百分比整理於圖2中。接受安慰劑之患者因風濕信號而中斷治療之百分比較高。經CTLA4Ig治療之患者隨劑量之提高而較少中斷治療。極少以L104EA29YIg治療之患者中斷治療。此等結果表示CTLA4Ig具有良好之反向性劑量依賴反應且LI04EA29Ylg療法具有較強之治療反應。以CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰劑治療之患者於第85 天時之ACR-20，-50，及-70整·理於圖3A中。類似地，圖3B 及C説明ACR-20反應，其信賴限制爲95%。該反應顯示其具劑量依賴性，其於1〇毫克/每位患者之公斤體重下具有顯著之反應。關節腫脹及觸痛數目減少之患者百分比與對CTLA4Ig， L104EA29YIg，或安慰劑之治療無反應之患者之比較，顯示於圖4A及4B。該治療反應顯示爲劑量依賴型。較大百分比之患者於兩種產品之2及10毫克/公斤組内顯示出有 20，50，70，及甚至100%之改善。以CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰劑治療而經由患者及醫師平均計分單位評估而有減少疼痛，疾病活性之患者百分比係顯示於圖5A，B，C，及D。以Likert尺規監測之治療反應顯示出其於第8 5天與安慰劑相較_，係劑量依賴性地喜好活性治療組。Likert尺規係一種經認可之語言評分 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 _____B7 五、發明説明（72 ) 尺規，其使用形容辭將徵狀列等（The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740) ° 患者及醫師對於疾病活性之評估，由基點改變至少有2 單位，係因CTLA4Ig，L104EA29YIg或安慰劑之治療之結果，其顯示於圖6A及6B。其反應顯示出具有劑量依賴性，活性藥物之劑量較高，則明顯之改善較多。以CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰劑治療之患者之C-反應性蛋白質（CRP)量之下降百分率顯示於圖7A及7B中。其反應顯示出2及10毫克/公斤活性治療组具有劑量依賴性之顯著下降。此外，圖7B顯示其與安慰劑相較之差異相當顯著，其信賴區間爲95%。圖7C顯示於第85天時，其於血清中之量自基點之變化。以CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰劑治療之患者之血清可溶性IL-2受體係顯示於圖8。可溶性IL-2受體量之降低顯示其爲劑量依賴性。研究時期内，以CTLA4Ig，或安慰劑治療之患者之中間及平均觸痛關節數目係顯示於圖9A及9B。其自基點之變化（例如··觸痛關節之減少）顯示其對2及10毫克/公斤治療組較安慰劑或〇. 5毫克/公斤組重要。研究時期内，以CTLA4Ig，或安慰劑治療之患者之中間及平均腫脹關節數目係顯示於圖1〇A及10B。其自基點之變化（例如：腫脹關節之減少）顯示其對2及1 〇毫克/公斤治 -75- 本紙張尺度適用中國國家棣準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（73 ) 療組較安慰劑或〇· 5毫克/公斤组重要。研究時期内，以CTLA4Ig，或安慰劑治療之患者之平均疼痛評估計分顯示於圖11。其自基點之變化（例如：疼痛之減少）顯示其對2及10毫克/公斤治療組較安慰劑或〇.5毫克/公斤組重要。研究時期内，以CTLA4Ig，或安慰劑治療之患者之經由患者或醫師評估之平均疾病活性評估分數顯示於圖12A及 12B。其自基點之變化（例如：疾病活性之降低）顯示其對2 及10毫克/公斤治療組較安慰劑或〇· 5毫克/公斤組重要。研究時期内，以L104EA29YIg (於圖中記爲LEA)或安慰劑治療之患者之中間及平均觸痛關節數目係顯示於圖13 A 及13B。其自基點之變化（例如：觸痛關節之減少）顯示爲劑量依賴性。研究時期内，以L104EA29YIg (於圖中記爲LEA)或安慰劑治療之患者之中間及平均腫脹關節數目係顯示於圖14A 及14B。其自基點之變化（例如：腫脹關節之減少）顯示其對2及10毫克/公斤治療组較安慰劑或〇. 5毫克/公斤組重要。研究時期内，以L104EA29YIg (於圖中記爲LEA)或安慰劑治療之患者之平均疼痛評估計分顯示於圖15。其自基點之變化（例如：疼痛之減少）顯示爲劑量依賴性。研究時期内，以L104EA29YIg (於圖中記爲LEA)或安慰劑治療之患者之經由患者或醫師評估之平均疾病活性評估分數顯示於圖16A及16B。其自基點之變化（例如：疾病活 -76- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1311564 A7 B7 五、發明説明（74 ) 性之降低）顯示爲劑量依賴性。以CTLA4Ig，L104EA29YIg，或安慰劑治療之患者於第85 天經由HAQ評估之身體障礙之改善百分比顯示於圖17(健康評估問卷（HAQ) ; Fries，J. F·,等人，1982 J. of Rheumatology 9:789-793)。此項參數具有明顯之劑量依賴性。可溶性IL-2r及C-反應性蛋白質量自基點之變化於兩個治療組中均爲劑量依賴型。於治療後，使用0.5，2.0，及 10.0毫克/公斤CTLA4Ig者之可溶性IL-2r量分別爲-2%， -10%，及-22%，且使用 L104EA29YIg 者分別爲-4%， -18%，及-32%，相較於安慰劑之+3%。使用0.5，2.0，及 10.0毫克/公斤CTLA4Ig者之C-反應性蛋白質量分別爲 + 12%，-15%，及-32%，且使用 L104EA29YIg者分別爲 +47%，-33%，及-47%，相較於安慰劑之+20%(圖7A)。實例4 下文提供之説明係爲第Π期臨床研究之人類患者，其施用L104EA29YIg (亦稱爲LEA29Y或LEA)或以減少或預防構造性損害，包括骨骼或關節侵蝕，其使用經認可之照射照相尺規。此等構造性損害之減少或預防係類似經由臨床參數測定之臨床性改善。對一些以CTLA4Ig或L104EA29YIg治療之前之人類患者進行骨骼構造狀態之評估。對此等患者每二至十二週長期施用0.5至20毫克/公斤之CTLA4Ig或Ll04EA29YIg (單獨或合併其他試劑）以維持於研究期間之治療改善性。於事先 _________-77-_ 本纸張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210X297公釐） 1311564 A7 B7五、發明説明（75 ) 設定之區間取得患者手部及腳部之照射圖片：6個月，及再每年，如FDA準則之建議。於6及12個月後，對此等患者進行長期監測以測定是否以CTLA4Ig及L104EA29YIg治療可減少骨骼退化之進展，並再每年監測。患者之監測係以照射法，包括X-光及/或磁共振攝影（MRI)，根據此項技藝中之標準實施法（Larsen，A. K.及M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491 ; Sharp, J. Τ·等人，1985 Arthritis and Rheumatism 28:1326-133 5)。將放射照相資料之結果進行構造性損害預防之評估，包括減緩骨骼侵蚀之進展及軟骨成骨破壞，關節間隙窄化及/或新侵蚀之預防。 -78- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1311564 <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg 60 gtccttgcac tc 72 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：抑瘤素MCTLA4(OMCTLA4)前置引子 <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2Z3>人工序列描述：抑瘤素M CTLA4 (0MCTLA4)反置引子 <400> 5 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42 <210> 6 <211> 1152 <212> DNA <213> L104EIg <400> 6 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag agattctgat ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgcacgg atggacacgg ggcataggca caggagccca tccttgcact cctgtttcca 60 tggtactggc cagcagccga 120 aagccactga ggtccgggtg 180 gtgcggcaac ctacatgatg 240 gcacctccag tggaaatcaa 300 gactctacat ctgcaaggtg 360 acggaaccca gatttatgta 420 aatcttctga caaaactcac 480 1311564 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaocta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcoggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213> L104EIg <400> 7

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 15 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 140 1311564

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 2B0 2B5 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg B40 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

-4- 1311564 <210> 8 <211> 1152 <212> DNA <213> L104EA29YIg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 9 <211> 383 <212> PRT <213> L104EA29YIg <400> 9 Met Gly Val 1 Leu Leu Phe

Ala Val Val 35

Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 5 10 15

Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Val Cys Glu 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 1311564

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser He Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He 260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300

-6 1311564

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 10 <211> 1152 <212> DNA <213>人工序列 <220> <2Z3>人工序列描述·· L104EA29LIg <400> 10 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aattgactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 1311564 <210> 11 <211> 383 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述:L104EA29LIg <400> 11

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Leu Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60

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Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

-11 - 1311564 325 330 335

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gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152

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Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys

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Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 195 200 205 lie Pro lie Asn 210 <210> 18 <211> 1152 <212> DNA <21B> CTLA4Ig <400> 18

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Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110

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<400> Z0

Met Tyr Pro pro pro Tyr -18 -

Claims

申請專利範園或類關之合性 13 1 teMl6137號專利申請案中文申請專利範圍替換本(97年10月) 公告本 1. 一種可溶性CTLA4融合分子之用途，其係用於製備治療患有類風濕性關節炎之個體之醫藥組合物，該可溶性CTLA4融合分子包含CTLA4分子之細胞外區域，其中該CTLA4分子之細胞外區域包含如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸，其係起始於位置27之曱硫胺酸或位置26之丙胺酸，並結束於位置15〇之天冬胺酸，其中s玄個體係至少經一種疾病緩和性抗風濕藥物 (DMARD )治療失敗。 2. 根據申請專利範圍第丨項之用途，其中該〇河八111)為胺曱喋呤（methotrexate)、環磷醯胺（cycl〇ph〇sphamide)、硫唑嘌呤（azathioprine)、環孢素 A (cycl〇sp〇rin A)、腫瘤壞疽因子-ο: (TNF〇〇阻斷劑或拮抗劑。 3. 根據申請專利範圍第丨或2項之用途，其係用於減少風濕性關節炎的症狀。 4 ·根據申請專利範圍第3項之甩途，其中該症狀係選自節腫脹、關節觸痛、發炎、晨間僵硬及疼痛所組成群。 5. 根據申請專利範圍第丨或2項之用途，其中該醫藥組物係用於投予1 〇毫克/公斤個體體重之劑量之可溶 CTL A4融合分子。 6. —種可溶性融合分子之用途，其係用於製備減少或預防患有風濕性疾病之個體結構性損害之醫藥組口物，该可溶性CTLA4融合分子包含CTLA4分子之

A8 B8 C8

1311564 細胞外區域，其中兮r r 丁 LA4刀子之細胞外區域包含如〇:17所示之胺基酸，其係起始於位置27之曱瓜胺酸或位置2 6之丙胺g复，並結束於位置i 5 〇之冬胺酸。 7·根據申請專利範圍第6項之用途，其中該結構骨骼或關節侵蝕。 °為 8 ·根據申請專利範圍第6或7項之用途，其中該醫藥組合物係用於投予介於〇.5及2〇毫克/公斤個體體重間之劑量之可溶性CTLA4融合分子。 9 · 一種第一藥劑及第二藥劑之用途，其係用於製備治療風濕性疾病之醫藥組合物，其中 a) 該第一藥劑為可溶性ctlA4融合分子，其包含 CTLA4分子之細胞外區’其中該CTLA4分子之細胞外區包含如S E Q I D N 0 : 1 7所示之胺基酸，其係起始於位置2 7之曱硫胺酸或位置2 6之丙胺酸，並結束於位置+ 150之天冬胺酸，及 b) 該第二藥劑係選自由皮質類固醇、非類固醇類抗發炎劑、普尼松（prednisone)、硫唾嗓吟、胺甲蝶呤、 T N F α阻斷劑或括抗劑、經氯峻(hydroxychloroquine)、沙伐索安若普（sulphasalazine)、金鹽、安納金拉 (anakinra)、環麟醯胺及來氟米特（leflunomide)所組成之群。 1 〇·根據申請專利範圍第9項之用途，其中該TNFa阻斷劑 -2 - 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐）

裝訂 Φ 1311564 A8 B8

或拮抗劑為因芙 11. 根據 μ _ _ ί ln!iximab)或依脫那塞（eta⑽cept)。物係用於前後^ 項之用途’其中該醫藥組合 12. 根據申請專利4、/予該第-及第-樂劑。 ^ . ^ a圍第6或9項之用途，其中該風濕性疾病係選自類風渴性關P 々結締組織疾病：、v二多肌炎、硬皮病、混合性、 $炎性風濕病、發炎性風濕病、退化 =濕病、關節外風濕病、膠原病、慢性多關節炎、降M ^生關fP炎’關節黏連性脊椎炎、幼年型類風濕關郎炎、結節性全動脈炎、系統性紅斑性狼瘡、進 :後系統性硬皮病、肱縛動脈周圍炎、尿酸性關節人軟骨性石灰沈著症、皮肌炎、肌肉性風濕症、肌炎及肌凝塊。 1 3 .根據中„月專利範圍第6或9項之用途，其中該風濕性疾病為類風濕性關節炎。 1 4 _根據申請專利範圍第1、2、6、7、9及1 0項中任一項之用途，其中該可溶性CTLA4融合分子包含免疫球蛋白恆定區或其部分。 1 5 _根據申請專利範圍第1 4項之用途，其中該可溶性. CTLA4融合分子為cTLA4Ig。 1 6 .根據申清專利範圍第1 5項之用途，其中該可溶性 CTLA4融合分子為如Seq ID N0:19所示之 CTLA4Ig，其係起始於位置27之曱硫胺酸或位置26 之丙胺酸，並結束於位置383之離胺酸。 -3- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱） " ------ A B c D 1311564 六、申請專利範圍 1 7 .根據申請專利範圍第1 5項之用途，其中該可溶性 CTLA4融合分子為CTLA4Ig，其係由ATCC No. 6 8 6 2 9之核酸分子所編碼者。 1 8 · —種用於治療患有類風濕性關節炎之個體之醫藥組合物，其包含有效劑量之可溶性C τ L A 4融合分子，該可溶性CTLA4融合分子包含CTLA4分子之細胞外區域，其中該CTLA4分子之細胞外區域包含如SEq ID Ν Ο : 1 7所示之胺基酸，其係起始於位置2 7之甲硫胺酸或位置26之丙胺酸，並結束於位置15〇之天冬胺酸，其中該個體係至少經一種疾病緩和性抗風濕藥物 (D M A R D )治療失敗。 1 9 .根據申請專利範圍第丨8項之醫藥口初，苴中該 DMARD為胺甲喋呤、環磷醯胺、 ^ 、王示吟、環抱素 A、或腫瘤壞疽因子(TNF α)阻斷劑或梓疒令 2 0 ·根據申請專利範圍第i 8或i 9項之醫 °几劑。两+組合物，於減少類風濕性關節炎的症狀。，、係用 2 1 ·根據申請專利範圍第2 〇項之醫藥組合物，' 係選自關節腫脹、關節觸痛、發炎、其中該症狀所組成之群。晨間僵硬及疼痛 22.根據申s青專利範圍第18或19項之醫雖醫藥組合物係用於投予1 〇毫克/公斤個二°物’其中該可溶性CTLA4融合分子。斤個體體重之劑量之 2 3 . —種用於減少或預防患有風疾病之個體結構性損 -4- 本紙張尺度適用中國國A4规格_ χ 297公爱T 1311564 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍害之醫藥組合物，其包含可溶性CTLA4融合分子，該可溶性CTL A4融合分子包含CTLA4分子之細胞外區域’其中該CTLA4分子之細胞外區域包含如SEq ID Ν Ο · 1 7所示之胺基酸，其係起始於位置2 7之甲硫胺酸或位置26之丙胺酸，並結束於位置15〇之天冬胺酸。 2 4 ·根據申請專利範圍第2 3項之醫藥組合物，其中該結構 ^ 生才貝害為骨路或關節侵姓。 25.根據申請專利範圍第23或24項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於投予介於〇.5及2〇毫克/公斤個體體重間之劑量之可溶性C T L A 4融合分子。 2 6 · —種用於治療風濕性疾病之醫藥組合物，其包含第一藥劑及第二藥劑，其中 a) 該第一藥劑為可溶性CTLA4融合分子，其包含 CTLA4分子之細胞外區，其中該ctla4分子之細胞外區包含如SEq ID NO: 17所示之胺基酸，其係起始於位置27之甲硫胺酸或位置26之丙胺酸，並結束於位置150之天冬胺酸，及 b) 該第二藥劑係選自由皮質類固醇、非類固醇類抗發炎劑、普尼松、硫唑嘌呤、胺曱蝶呤、T n F α阻斷劑或拮抗劑、羥氯ρ奎、沙伐索安若普、金鹽、安納金拉、環磷醯胺及來氟米特所組成之群。 27.根據申請專利範圍第26項之醫藥組合物，其中該TNFa 阻斷劑或拮抗劑為因芙西美或依脫那塞。本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X297公爱：)

裝訂 1311564 圍、申請專利範 28:據申請專利範圍第26或27項之醫藥組合物，其中該劑樂組合物係用於前後或伴隨Μ該第一及第二藥 29·根據中請專利範圍第仏以項之醫藥組合物，其中該風濃性疾病係選自類風濕性關節炎、多肌炎、硬皮病、渡合性結缔組織疾病、發炎性風漏病、發炎性風病、退化性風濕病、關節外風濕病、膠原病 ' 慢性夕關節炎、牛皮癬性關節炎，關節黏連性脊椎炎、幼年型類風濕性關節炎、結節性全動脈炎、系統性紅斑狼瘡進展性系統性硬皮病、肢缚動脈周圍炎酸性關節炎、軟骨性石灰沈著症、皮肌炎、肌肉性風濕症、肌炎及肌凝塊。 3〇·根據申凊專利範圍第23或26項之醫藥組合物，其中該風濕性疾病為類風濕性關節炎。 / •根據申請專利範圍第18、19、23、24、26及27項中任一項之醫藥組合物，其中該可溶性ctla4融合分子包含免疫球蛋白恆定區或其部分。 3 2 .根據申請專利範圍第3 i項之醫藥組合物，其中該可溶性CTLA4融合分子為cTLA4Ig。 33.根據申請專利範圍第32項之醫藥組合物，其中該可溶性CTLA4融合分子為如SEQ ID NO:19所示之 CTLA4Ig，其係起始於位置27之甲硫胺酸或位置μ 之丙胺酸，並結束於位置383之離胺酸。 -6· 本紙依尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(;1〇 X 297公袭） 1311564 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 3 4 .根據申請專利範圍第3 2項之醫藥組合物，其中該可溶性CTLA4融合分子為CTLA4Ig，其係由入1'(：(：1〇· 6 8 6 2 9之核酸分子所編碼者。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)