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CN106432473B - 新颖ctla4-ig免疫粘附素 - Google Patents

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CN106432473B CN201610569505.9A CN201610569505A CN106432473B CN 106432473 B CN106432473 B CN 106432473B CN 201610569505 A CN201610569505 A CN 201610569505A CN 106432473 B CN106432473 B CN 106432473B
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Abstract

本申请涉及靶向CD80和CD86的CTLA4‑Ig免疫粘附素及其用途，尤其是用于治疗目的的用途。

Description

新颖CTLA4-IG免疫粘附素
本申请是2011年2月22日提交的题为“新颖CTLA4-IG免疫粘附素”的国家申请号为201180019721.1(PCT/US2011/025747)的发明专利申请的分案申请。
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年11月10日提交的USSN 61/412,309；2010年5月14日提交的USSN 61/334,806；和2010年2月19日提交的USSN 61/306,311的权益，通过引用全文并入本文。
技术领域
本申请涉及靶向CD80和CD86的CTLA4-Ig免疫粘附素及其用途，尤其是用于治疗目的的用途。
背景技术
T淋巴细胞在对抗原的适应性免疫应答中起关键作用。初次用于试验的T细胞需要两种信号来完全激活它们(Bretscher 1999，Proc Natl Acad Sci USA 96：185-90)。第一信号是抗原特异性的，由T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上的MHC/肽复合体的相互作用来提供。第二信号是由T细胞上的受体与APC上的其配体之间的相互作用提供的共刺激性信号。TCR/MHC相互作用与共刺激性相互作用二者的啮合经由多种胞内途径导致T细胞激活，所述途径包括钙-钙调蛋白和RAS促分裂素激活的蛋白激酶，和随后包括细胞因子诸如IL-2的多种效应化合物的转录因子的激活。这些事件导致T细胞增殖、CD4+辅助T细胞(TH)池的产生、和激活的CD8+细胞毒性T细胞的扩增。共刺激对于完全T细胞激活不仅是关键的，其在TCR/MHC啮合期间不存在导致无反应性和/或凋亡。
虽然多种正向和负向共刺激途径参与T细胞调节，最关键的是T细胞上的CD28与APC上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)之间的共刺激途径。CD28促进T细胞分化为TH1表型细胞并增强B细胞的抗体产生和T细胞的激活。APC诸如树突细胞(DC)和B细胞上表达的B7-1和B7-2，具有重叠但不同的功能。B7-2是组成型地表达的，与TCR/MHC啮合(信号1)一致地在APC上被快速上调。B7-1表达在静止细胞上非常低，但通常在长期T细胞刺激后被诱导。这些差异暗示，尽管B7-2在T细胞激活的起始时可能是重要的，但是B7-1可能在永存免疫应答方面起更大作用。
在T细胞激活后，负向调节受体细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4或CTLA-4，还称为CD152)在T细胞上被上调(Alegre等，2001，Nat Rev Immunol 1：220-8)。CTLA4在结构上与CD28同源，但更紧密地结合B7-1和B7-2配体二者。CLTA4以两种主要方式抑制免疫应答-它与CD28竞争B7配体从而阻断共刺激，它还负向地传递信号来抑制T细胞激活(Krummel和Allison，1995，J Exp Med 182：459-465；Walunas等，1994，Immunity 1：405-413)。最近的研究已经显示，B7-2在免疫突触啮合CD28多于CTLA4，而B7-1连接CTLA4多于CD28(Collins等，2002，Immunity 17：201-210；Jansson等，2005，J Immunol 175：1575-1585)。
由于B7共刺激途径在促进和保持免疫应答方面的关键作用，设计为拮抗它的治疗剂对于治疗自身免疫疾病和病症是有希望的。阿贝西普
Figure BDA0001053204300000021
是一种由CTLA4的胞外结合结构域连接到人类IgG的Fc结构域构成的CTLA4-Ig免疫粘附素。阿贝西普被开发用于抑制B7介导的共刺激(Bluestone等，2006，Immunity 24：233-238)，且被批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)和用于多种其他自身免疫适应症的临床试验。然而，尽管阿贝西普在治疗RA方面显示一些活性，它对其他适应症无效。例如，CTLA4-Ig在针对移植排斥的耐受方面低效得多(Kirk等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：8789-8794；Levisetti等，1997，JImmunol 159：5187-5191)。
阿贝西普的不足的临床表现已经被归因于其天然CTLA4对B7配体、尤其是B7-2(由于B7-2在免疫起始方面推测的重要性)次最佳的亲和性。本发明提供具有改进的B7亲和性和增强的T细胞抑制活性的新颖变体CTLA4-Ig免疫粘附素。这样的新颖免疫粘附素在多种应用中有益处，尤其是用于治疗免疫相关病症，如以下详细讨论的。
发明内容
本发明提供抑制抗原呈递细胞(APC)和T细胞之间的相互作用的新颖CTLA4-Ig免疫粘附素。本发明的CTLA4-Ig免疫粘附素包括以高亲和性结合人类B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的CTLA4部分，并包括可结合一种或多种Fc受体或Fc配体的Ig Fc部分(或Fc区)。
在本发明的一个方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括变体CTLA4蛋白，其中所述变体包括在天然CTLA4蛋白中的至少一种氨基酸修饰，其中所述修饰是选自A29E、A29F、A29H、A29K、A29N、A29Q、A29R、T30E、T30H、T30R、T30V、E31D、E31I、E31M、E31T、E31V、R33E、R33F、R33I、R33L、R33M、R33Q、R33T、R33W、R33Y、T35D、T35E、T35F、T35M、T35V、T35Y、A49D、A49E、A49F、A49T、A49W、A49Y、T51D、T51E、T51H、T51L、T51N、T51Q、T51R、T51S、T51V、M53E、M53F、M53H、M53Q、M53W、M53Y、T59H、T59I、T59L、T59N、T59Q、T59V、T59Y、L61A、L61D、L61E、L61F、L61G、L61H、L61I、L61K、L61M、L61N、L61P、L61Q、L61R、L61S、L61T、L61V、L61W、L61Y、D63E、S64K、S64R、S64Y、K93D、K93E、K93F、K93H、K93N、K93Q、K93R、K93S、K93T、K93V、K93W、K93Y、E95D、E95H、E95L、E95Q、E95Y、M97D、M97F、M97I、M97N、M97V、Y98F、Y98W、Y102F、Y102W、Y103D、Y103E、Y103F、Y103H、Y103N、Y103Q、Y103W、L104F、L104H、L104M、L104V、L104Y、G105D、G105E、1106E和I106Y组成的组的取代，其中所述取代提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的优选方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自A29H、T51N、M53Y、L61E和K93Q组成的组的CTLA4取代，其中所述取代提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的最优选方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自A29H、T51N、L61E和K93Q组成的组的CTLA4取代，其中所述取代提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的其他方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自A29H、A29K、T51N、L61E和Y103Q组成的组的CTLA4取代，其中所述取代提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的其他方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自K93V、L61Q和L104H组成的组的CTLA4取代，其中所述取代提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。
在本发明的另一个方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括变体CTLA4蛋白，其中所述变体包括选自A29H/K93Q、A29H/M53Y、A29H/T51N、T51N/K93Q、T51N/M53Y、A29H/L61E/K93Q、A29H/M53Y/K93Q、A29H/M53Y/L61E、A29H/T51N/L61E、M53Y/L61E/K93Q、T51N/L61E/K93Q、T51N/M53Y/L61E、A29H/M53Y/L61E/K93Q、A29H/T51N/L61E/K93Q、A29H/T51N/M53Y/K93Q、A29H/T51N/M53Y/L61E、T51N/M53Y/L61E/K93Q和A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q组成的组的CTLA4取代的组合，其中所述变体提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的优选方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自T51N/L61E/K93Q和A29H/T51N/L61E/K93Q组成的组的CTLA4取代的组合，其中所述变体提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的其他方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括选自T51N/L61E/K93Q、A29H/T51N/L61E/K93Q、A29H/T51N、T51N/M53Y和T51N/M53Y/L61E组成的组的CTLA4取代的组合，其中所述变体提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。
在本发明的另一个方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括变体CTLA4蛋白，其中所述变体包括在选自35、49、51、53、59、61和95组成的组的CTLA4位置的取代，其中所述变体提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。在本发明的优选方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括变体CLTA4蛋白，其中所述变体包括在选自51和61组成的组的CTLA4位置的取代，其中所述变体提供对B7-1和/或B7-2增强的结合。
在另外的方面，本发明提供包括包含变体人类CTLA4的第一结构域和包含IgG Fc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述第一结构域具有下式：Fx(1-28)-Vb(29)-Fx(30-50)-Vb(51)-Fx(52)-Vb(53)-Fx(54-60)-Vb(61)-Fx(62-92)-Vb(93)-Fx(94-124)[SEQ IDNO：1]，其中Fx(1-28)是序列MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGK(SEQ ID NO：1的位置1-28)；Vb(29)选自A和H组成的组；Fx(30-50)是序列TEVRVTVLRQADSQVTEVCAA(SEQ ID NO：1的位置30-50)；Vb(51)选自T和N组成的组；Fx(52)是Y；Vb(53)选自M和Y组成的组；Fx(54-60)是序列MGNELTF(SEQ ID NO：1的位置54-60)；Vb(61)选自L和E组成的组；Fx(62-92)是序列DDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYIC(SEQ ID NO：1的位置62-92)；Vb(93)选自K和Q组成的组；且Fx(94-124)是序列VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO：1的位置94-124)；其中所述变体包括与SEQ ID NO：6相比的至少一种氨基酸修饰且其中所述变体表现对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增加的结合。
在进一步的方面，本发明提供包括包含变体人类CTLA4的第一结构域和包含IgGFc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述第一结构域具有下式：Fx(1-28)-Vb(29)-Fx(30-50)-Vb(51)-Fx(52)-Vb(53)-Fx(54-60)-Vb(61)-Fx(62-92)-Vb(93)-Fx(94-124)[SEQID NO：2]，其中Fx(1-28)是序列MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGK(SEQ ID NO：2的位置1-28)；Vb(29)是H；Fx(30-50)是序列TEVRVTVLRQADSQVTEVCAA(SEQ ID NO：2的位置30-50)；Vb(51)选自T和N组成的组；Fx(52)是Y；Vb(53)选自M和Y组成的组；Fx(54-60)是序列MGNELTF(SEQ ID NO：2的位置54-60)；Vb(61)选自L和E组成的组；Fx(62-92)是序列DDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYIC(SEQ ID NO：2的位置62-92)；Vb(93)选自K和Q组成的组；且Fx(94-124)是序列VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO：2的位置94-124)；其中所述变体表现对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增加的结合。
在另外的方面，本发明提供包括包含变体人类CTLA4的第一结构域和包含IgG Fc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述第一结构域具有下式：Fx(1-28)-Vb(29)-Fx(30-50)-Vb(51)-Fx(52)-Vb(53)-Fx(54-60)-Vb(61)-Fx(62-92)-Vb(93)-Fx(94-124)[SEQ IDNO：3]，其中Fx(1-28)是序列MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGK(SEQ ID NO：3的位置1-28)；Vb(29)选自A和H组成的组；Fx(30-50)是序列TEVRVTVLRQADSQVTEVCAA(SEQ ID NO：3的位置30-50)；Vb(51)是N；Fx(52)是Y；Vb(53)选自M和Y组成的组；Fx(54-60)是序列MGNELTF(SEQID NO：3的位置54-60)；Vb(61)选自L和E组成的组；Fx(62-92)是序列DDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYIC(SEQ ID NO：3的位置62-92)；Vb(93)选自K和Q组成的组；且Fx(94-124)是序列VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO：3的位置94-124)；其中所述变体表现对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增加的结合。
在进一步的方面，本发明提供包括包含变体人类CTLA4的第一结构域和包含IgGFc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述第一结构域具有下式：Fx(1-28)-Vb(29)-Vb(30)-Vb(31)-Fx(32)-Vb(33)-Fx(34)-Vb(35)-Fx(36-48)-Vb(49)-Fx(50)-Vb(51)-Fx(52)-Vb(53)-Fx(54-58)-Vb(59)-Fx(60)-Vb(61)-Fx(62)-Vb(63)-Vb(64)-Fx(65-92)-Vb(93)-Fx(94)-Vb(95)-Fx(96)-Vb(97)-Vb(98)-Fx(99-101)-Vb(102)-Vb(103)-Vb(104)-Vb(105)-Vb(106)-Fx(107-124)[SEQ ID NO：4]；其中Fx(1-28)是序列MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGK(SEQ ID NO：4的位置1-28)；Vb(29)选自A、E、F、H、K、N、Q和R组成的组；Vb(30)选白T、H和V组成的组；Vb(31)选白E、D、I、M、T和V组成的组；Fx(32)是V；Vb(33)选自R、E、F、I、L、M、Q、T、W和Y组成的组；Fx(34)是V；Vb(35)选自T、D、E、F、M、V和Y组成的组；Fx(36-48)是序列VLRQADSQVTEVC(SEQ ID NO：4的位置36-48)；Vb(49)选自A、D、E、F、T、W和Y组成的组；Fx(50)是A；Vb(51)选自T、D、E、H、L、N、Q、R、S和V组成的组；Fx(52)是Y；Vb(53)选自M、E、F、H、Q、W和Y组成的组；Fx(54-58)是序列MGNELT(SEQ ID NO：4的位置54-58)；Vb(59)选自T、H、I、L、N、Q、V和Y组成的组；Fx(60)是F；Vb(61)选自L、A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组；Fx(62)是D；Vb(63)选自D和E组成的组；Vb(64)选自S、K、R和Y组成的组；Fx(65-92)是序列ICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYIC(SEQ ID NO：3的位置65-92)；Vb(93)选自K、D、E、F、H、N、Q、R、S、T、V、W和Y组成的组；Fx(94)是V；Vb(95)选自E、D、H、L、Q和Y组成的组；Fx(96)是L；Vb(97)选自M、D、F、I、N和V组成的组；Vb(98)选自Y、F和W组成的组；Fx(99-101)是序列PPP；Vb(102)选自Y、F和W组成的组；Vb(103)选自Y、D、E、F、H、N、Q和W组成的组；Vb(104)选自L、F、H、M、V和Y组成的组；Vb(105)选自G、D和E组成的组；Vb(106)选自I、E和Y组成的组；且Fx(107-124)是序列GNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO：4的位置107-124)，其中所述变体包括与SEQ ID NO：6相比的至少一种氨基酸修饰且其中所述变体表现对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增加的结合。
在另外的方面，本发明提供包含SEQ ID NO：8的免疫粘附素，其中所述免疫粘附素包括与SEQ ID NO：6相比的氨基酸修饰。
在进一步的方面，本发明提供包括包含与SEQ ID NO：6相比的变体CTLA4的第一结构域和包含IgG Fc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述CTLA4变体包括选自T51N、A29H、M53Y、L61E和K93Q组成的组的氨基酸修饰，其中所述变体提供对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增强的结合。
在另外的方面，本发明提供包括包含与SEQ ID NO：6相比的变体CTLA4的第一结构域和包含IgG Fc区的第二结构域的免疫粘附素，其中所述CTLA4变体包括使用SEQ ID NO：6的编号在选自51、53、61和93组成的组的位置的氨基酸修饰，其中所述变体提供对B7-1、B7-2、或B7-1和B7-2二者增强的结合。
在本发明的一个方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括天然Fc区。本发明的优选天然Fc区包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4Fc区。
在本发明的优选方面，CTLA4-Ig免疫粘附素包括变体Fc区。在本发明的优选方面，变体Fc区增强对新生Fc受体FcRn的亲和性。在本发明的最优选方面，变体Fc区延长CTLA4-Ig的体内半衰期。用于增强FcRn亲和性和/或延长体内半衰期的优选变体包括但不限于259I、307Q、308F、311I、311V、378V、378T、426V、428L、434S、436I、436V、250Q、434A、252Y、254T和256E，其中编号是根据EU索引。用于增强FcRn亲和性和/或延长体内半衰期的最优选变体是428L和434S，其中编号是根据EU索引。
本发明提供编码本文所述的新颖CTLA4-Ig免疫粘附素的分离的核酸。本发明提供包含所述核酸的载体，任选地，所述核酸可操作地连接于控制序列。本发明提供包含该载体的宿主细胞、和用于产生和任选地回收免疫粘附素的方法。
本发明提供新颖CTLA4-Ig蛋白。所述新颖CTLA4-Ig蛋白可用在治疗产品中。
本发明提供包含本文所述的CTLA4-Ig蛋白、和生理上或药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
本发明涵盖本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的治疗和诊断用途。本发明的CTLA4-Ig免疫粘附素优选地用于治疗免疫相关病症。在本发明的最优选实施方案中，本文所述的CTLA4-Ig免疫粘附素用于治疗克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、银屑病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、和/或移植排斥。
附图简述
图1.全长人类CTLA4、人类CTLA4的胞外结构域(ECD)、和人类CTLA4的贝拉西普(belatacept)A29Y/L104E变体形式的氨基酸序列。CTLA4的ECD在全长CTLA4序列中以灰色突出。贝拉西普序列中的灰色突出A29Y/L104E取代[SEQ ID NO：5-8]。
图2.示例性Fc区的氨基酸序列。本文的Fc区定义为基于EU编号方案从位置230至C末端(230-447)。灰色突出指示从天然IgG Fc区的修饰[SEQ ID NO：9-15]。
图3.示例性接头的氨基酸序列。接头的编号是基于EU索引，并包含残基216-229，其中216是基于EU编号，四种天然IgG同种型的N末端216E。N末端Q的添加不改变编号(即216E仍是216E)。灰色突出指示从天然IgG接头的修饰[SEQ ID NO：16-23]。
图4.本研究中使用的接头与Fc区的示例性组合的氨基酸序列。灰色突出指示从天然IgG恒定区序列的修饰[SEQ ID NO：24-27]。
图5.本研究中研究的所选CTLA4-Ig免疫粘附素的氨基酸序列[SEQ ID NO：28-30]。
图6.对于以灰色三角代表筛选的所有单取代CTLA4-Ig变体，相对于阿贝西普(abatacept)的倍数(koff)的图。黑色方块代表亲本CTLA4-Ig阿贝西普，黑色空心圆代表贝拉西普。
图7.与阿贝西普和贝拉西普相比，CTLA4-Ig变体的CD80和CD86KD的图。本研究的CTLA4-Ig变体以灰色三角代表。黑色方块代表亲本CTLA4-Ig阿贝西普，黑色空心圆代表贝拉西普。
图8.比较CTLA4-Ig变体HNEQ(A29H/T51N/L61E/K93Q)与阿贝西普和贝拉西普对CD86(上图)和CD80(下图)的结合的Biacore传感图。
图9.示例性变体CTLA4和变体CTLA4-Ig蛋白的氨基酸序列[SEQ ID NO：31-34]。
图10.CTLA4-Ig变体的T细胞抑制活性。利用重组B7-2-Ig使用抗CD3抗体和B7-2通过共连接CD3来激活T细胞。CFSE-标记的T细胞使用流式细胞术监测。
图11.具有延长体内半衰期的Fc变体的示例性CTLA4-Ig变体的氨基酸序列[SEQID NO：35-38]。
图12.CTLA4-Ig蛋白的天然和Fc变体形式在pH 6.0结合人类FcRn的Biacore传感图。LS是指428L/434S变体。
图13.由Biacore确定的CTLA4-Ig蛋白的天然Fc和变体Fc形式的FcRn结合亲和性(pH 6.0)的图。LS是指428L/434S变体。
图14.CTLA4-Ig变体的T细胞抑制活性。利用重组B7-2-Ig使用抗CD3抗体和B7-2通过共连接CD3来激活T细胞。CFSE-标记的T细胞使用流式细胞术监测。
图15.混合淋巴细胞反应中CTLA4-Ig变体的T细胞抑制活性。T细胞被两组实验中同种异体PBMC的混合物激活(一组是供体2336和3070(上图)，一组是供体3070和3995(下图)。激活通过以ELISA测量IL-2的释放来定量。
图16.变体CTLA4-Ig蛋白的体内抑制活性。CTLA4-Ig蛋白抑制人类对破伤风的免疫应答的能力在移植了人类外周血白细胞(PBL)的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中进行。图16所示为第21天对破伤风类毒素的IgG响应，CTLA4-Ig蛋白为1mg/kg，显示在PBL移植后第21天破伤风攻击后以PBS(PBS+TT)、阿贝西普和变体CTLA4(NEQ)-Ig(ab)(具有对B7-1和B7-2增强的亲和性的51N/61E/93Q)处理时抗破伤风抗体(抗TT IgG)的血清水平。运行仅PBS(无破伤风)作为阴性对照。
具体实施方式
综述
本发明涉及具有改进的B7亲和性和增强的T细胞抑制活性的新颖变体CTLA4-Ig免疫粘附素。这样的新颖免疫粘附素在多种应用中有益处，如以下详细讨论的。
CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)，也指CTLA-4，还称为CD152(分化簇152)，是一种在免疫系统中起重要调节作用的蛋白。在人类中，CTLA4蛋白由CTLA4基因编码，其翻译的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，在结构上与一种T细胞共刺激蛋白CD28同源。CTLA4结合抗原呈递细胞(APC)表面上的共刺激性配体B7-1和B7-2。CLTA4以两种主要方式抑制免疫应答-它与CD28竞争结合B7-1和B7-2从而阻断共刺激，它还负向地传递信号来抑制T细胞激活。CTLA4蛋白对本发明尤其重要的区域是胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：2)，其介导与APC上的B7-1和B7-2配体的结合。
由于B7共刺激途径在促进和保持免疫应答方面的关键作用，期望提供设计为拮抗这一途径的治疗剂。因此，本发明提供CTLA4Ig免疫粘附素。
CTLA4-Ig免疫粘附素
本发明提供CTLA4Ig免疫粘附素。″免疫粘附素″是指一种蛋白，其中一种或多种多肽可操作地连接于Fc区。本文使用的免疫粘附素与现有技术中使用的术语″Fc融合体″、″Ig融合体″、″受体Fc融合体″、″Ig嵌合体″、和″受体球蛋白″(有时带破折号)、和″TRAP″同义(Chamow等，1996，Trends Biotechnol 14：52-60；Ashkenazi等，1997，Curr Opin Immunol9：195-200，都通过引用全文并入)。免疫粘附素联合免疫球蛋白的Fc区与融合伴侣，融合伴侣通常可以是对靶蛋白具有特异性的任何蛋白或小分子。如此免疫粘附素具有两个主要部分-靶结合部分和Fc部分。靶结合部分可对实际上任何靶或靶抗原具有特异性。Fc部分可结合一种或多种Fc受体或Fc配体。融合伴侣可被连接于Fc区的任何区域，包括在N-或C末端、或在末端之间的一些残基。尽管实际上任何蛋白或小分子可被连接于Fc来产生Fc融合体，因此实际上靶向任何靶，本发明的免疫粘附素包括CTLA4或CTLA4的变体作为融合伴侣。CTLA4与Ig Fc区的融合体在本文称为CTLA4-Ig或CTLA4-Ig蛋白。
CTLA4变体
本发明的免疫粘附素的靶结合部分或融合伴侣包括蛋白CTLA4。因此本发明的免疫粘附素是针对结合被CTLA4结合的B7-1、B7-2、和已知或未知的任何其他配体或受体。本发明的靶结合部分可包括由人类CTLA4蛋白(SEQ ID NO：1)的全部、任何或部分构成的氨基酸序列。优选地免疫粘附素结合部分包括CTLA4的ECD(SEQ ID NO：2)的全部或部分。如实施例中所述的，免疫粘附素结合优选地是改进对B7-1、B7-2、或B7-1与B7-2二者的结合、和在一些情形中显示优先结合一种或另一种的CTLA4的变体。
CTLA4变体包括在天然CTLA4蛋白中的至少一种氨基酸修饰，所述天然CTLA4蛋白通常是SEQ ID NO：1中描绘的人类CTLA4蛋白，在大多数情形中，由于完整CTLA4蛋白通常不用在本发明的融合蛋白中，变体是在胞外结构域中。在这一实施方案中，在一个或多个以下位置进行一种或多种修饰(如SEQ ID NO：2中编号)：29、30、31、33、35、49、51、53、59、61、63、64、93、95、97、98、102、103、104、105或106。在一些实施方案中，修饰是一种或多种以下取代：A29E、A29F、A29H、A29K、A29N、A29Q、A29R、T30E、T30H、T30R、T30V、F31D、F31I、F31M、F31T、E31V、R33E、R33F、R33I、R33L、R33M、R33Q、R33T、R33W、R33Y、T35D、T35E、T35F、T35M、T35V、T35Y、A49D、A49E、A49F、A49T、A49W、A49Y、T51D、T51E、T51H、T51L、T51N、T51Q、T51R、T51S、T51V、M53E、M53F、M53H、M53Q、M53W、M53Y、T59H、T59I、T59L、T59N、T59Q、T59V、T59Y、L61A、L61D、L61E、L61F、L61G、L61H、L61I、L61K、L61M、L61N、L61P、L61Q、L61R、L61S、L61T、L61V、L61W、L61Y、D63E、S64K、S64R、S64Y、K93D、K93E、K93F、K93H、K93N、K93Q、K93R、K93S、K93T、K93V、K93W、K93Y、E95D、E95H、E95L、E95Q、E95Y、M97D、M97F、M97I、M97N、M97V、Y98F、Y98W、Y102F、Y102W、Y103D、Y103E、Y103F、Y103H、Y103N、Y103Q、Y103W、L104F、L104H、L104M、L104V、L104Y、G105D、G105E、I106E和I106Y。在一些实施方案中，尤其有用的是具有选自A29H、T51N、M53Y、L61E和K93Q的一种或多种取代、具有包括A29H/K93Q、A29H/M53Y、A29H/T51N、T51N/K93Q、T51N/M53Y、A29H/L61E/K93Q、A29H/M53Y/K93Q、A29H/M53Y/L61E、A29H/T51N/L61E、M53Y/L61E/K93Q、T51N/L61E/K93Q、T51N/M53Y/L61E、A29H/M53Y/L61E/K93Q、A29H/T51N/L61E/K93Q、A29H/T51N/M53Y/K93Q、A29H/T51N/M53Y/L61E、T51N/M53Y/L61E/K93Q和A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q的尤其有用的组合的CTLA4变体。
对于本文的位置和取代的所有列表，应理解的是，可进行单独取代的任何和所有可能的组合的组合，且任何单独位置或取代可独立地被可能的列表包括或排除。通常，与野生型或亲本CTLA4(或Fc区)相比，通常本发明的变体在CTLA4区中具有1、2、3、4或5个氨基酸取代，而在一些情形中可使用更多取代，只要保留期望的功能。类似地，如以下所述，Fc结构域也可以这种方式具有取代。
如别处描述的，CTLA4变体通常保留或增强对一种或多种CTLA4配体的结合，诸如增强对B7-1和/或B7-2的结合。
Fc结构域
本发明的免疫粘附素的Fc部分包括抗体的Fc区或Fc区的一部分。抗体是结合特定抗原的免疫球蛋白。在包括人类和小鼠的大多数哺乳动物中，抗体从成对的重链和轻链多肽构建。轻链和重链可变区显示抗体之间显著的序列多样性，并负责结合靶抗原。每条链由单独免疫球蛋白(Ig)结构域构成，因此通用术语免疫球蛋白用于这样的蛋白。
常规天然抗体结构单元通常包括四聚体。每个四聚体通常包括两对相同的多肽链，每对具有一条″轻链″(通常具有约25kDa的分子量)和一条″重链″(通常具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链分为κ和λ轻链。重链分为μδ、γ、α或ε，并分别规定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有多个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有多个亚类，包括但不限于IgAl和IgA2。因此，本文使用的″同种型″是指由其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的类型和亚类的任一种。已知的人类免疫球蛋白同种型是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。这些抗体类型之间的区别特征是其恒定区，而可变区中可存在微妙的差异。
每条轻链和重链由称为可变区和恒定区的两个不同区域构成。IgG重链包括以VH-CH1-CH2-CH3的顺序从N-至C-末端连接的四个免疫球蛋白结构域，分别是指重链可变结构域、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2和重链恒定结构域3(还称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别是指重链可变结构域、恒定γ1结构域、恒定γ2结构域和恒定γ3结构域)。IgG轻链包括以VL-CL的顺序从N-至C-末端连接的两个免疫球蛋白结构域，分别是指轻链可变结构域和轻链恒定结构域。恒定区显示较小的序列多样性，并负责结合大量天然蛋白来引发重要的生化事件。构成抗体的天然生物形式的结构，包括可变区和恒定区，在本文称为″全长抗体″。在包括人类和小鼠的大多数哺乳动物中，IgG同种型的全长抗体是四聚体，由两对相同的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包括免疫球蛋白结构域VL和CL，且每条重链包括免疫球蛋白结构域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。
可变区，通常是抗体的氨基末端部分，包含分子的抗原结合决定簇，从而决定抗体对其靶抗原的特异性。可变区如此命名是因为它是在序列上与同一类型中的其他抗体最不同的。
每条链的羧基末端部分界定主要负责效应功能的恒定区。在IgG亚类的免疫球蛋白中，重链中存在多个免疫球蛋白结构域，称为重链恒定(CH)区。在IgG抗体的背景中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，IgG背景中的″CH″结构域如下：″CH1″是指根据Kabat中EU索引的位置118-220。″CH2″是指根据Kabat中EU索引的位置237-340，且″CH3″是指根据Kabat中EU索引的位置341-447。
重链的另一重要区域是铰链区。本文的″铰链″或″铰链区″或″抗体铰链区″或″免疫球蛋白铰链区″是指包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域结束于EU位置220，IgG CH2结构域开始于残基EU位置237。因此对于IgG，抗体铰链在本文定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据Kabat中EU索引。在一些实施方案中，例如在Fc区的背景中，包括较低铰链，″较低铰链″通常是指位置226或230至236。
对于本发明中讨论的所有恒定区位置，编号是根据Kabat中EU索引(Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，United StatesPublic Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，通过引用全文并入)。抗体领域的技术人员将理解，这些规定由免疫球蛋白序列的特定区域中的非连续编号组成，使得能够标准化地提及免疫球蛋白家族中的保守位置。因此，由EU索引确定的任何指定免疫球蛋白的位置将不必对应其连续序列。
本发明的免疫粘附素是为CTLA4与抗体的Fc区的融合体的蛋白。本文使用的″Fc″或″Fc区″是指包含排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的抗体的恒定区、和在一些情形中部分铰链的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域、和这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的较低铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，人类IgG重链Fc区定义为包括残基230至C末端，其中编号是基于EU编号方案。Fc可以是指分离的这一区域、或Fc多肽背景中的这一区域。本文使用的″Fc多肽″是指包括Fc区的全部或部分的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合体、分离的Fc和Fc片段。
抗体的Fc区与多种Fc受体和配体相互作用，赋予一组重要的功能性能力，称为效应功能。对于IgG的Fc区，Fc包括Ig结构域Cγ2和Cγ3以及导向Cγ2的N末端铰链。IgG类的Fc受体的一个重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统的细胞臂之间的交流(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ravetch等，2001，AnnuRev Immunol 19：275-290，都特此通过引用全文并入)。在人类中，这一蛋白家族包括FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65，特此通过引用全文并入)。这些受体通常具有介导结合Fc的胞外结构域、跨膜区、和可以介导细胞内一些信号转导事件的胞内结构域。这些受体在包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞的多种免疫细胞中表达。Fc/FcγR复合体的形成募集这些效应细胞向结合抗原的位置，通常导致细胞中信号转导事件和重要的继发免疫应答诸如释放炎性介质、B细胞激活、内吞、吞噬和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应功能的能力是抗体藉以破坏所靶向细胞的有效机制。其中非特异性细胞毒性细胞表达识别靶细胞上结合的抗体的FcγR和随后导致靶细胞裂解的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等，2000，AnnuRev Immunol 18：739-766；Ravetch等，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290，都特此通过引用全文并入)。其中非特异性细胞毒性细胞表达识别靶细胞上结合的抗体的FcγR和随后导致吞噬靶细胞的细胞介导的反应称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。
不同的IgG亚类对FcγR具有不同亲和性，IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4大致上更好地结合受体(Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65，特此通过引用全文并入)。FcγR以不同亲和性结合IgG Fc区。FcγRIIIa和FcγRIIIb的胞外结构域96％相同，然而FcγRIIIb不具有胞内信号转导结构域。而且，尽管FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合体触发的激活的正向调节物，特征为具有具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的胞内结构域，FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)并因此是抑制性的。因此前者称为激活受体，FcγRIIb称为抑制受体。尽管在亲和性和活性方面的这些差异，但所有FcγR结合Fc上在Cγ2结构域和之前铰链的N末端的同一区域。
Fc上重叠但不同的位置用作补体蛋白C1q的界面。以Fc/FcγR结合介导ADCC的相同方式，Fc/C1q结合介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。Fc上在Cγ2与Cγ3结构域之间的位置介导与新生受体FcRn的相互作用，其结合将内吞的抗体从内涵体再循环回到血流(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等，2000，Annu RevImmunol 18：739-766，都特此通过引用全文并入)。这一过程，连同由于全长分子的大尺寸而防止肾滤过，导致从一周至三周变化的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合也在抗体运输中起关键作用。Fc上FcRn的结合位置也是细菌蛋白A和G结合的位置。被这些蛋白的紧密结合通常用作纯化抗体的手段，通过在蛋白纯化期间采用蛋白A或蛋白G亲和层析。这些区域、补体和FcRn/蛋白A结合区的保真性对于抗体的临床特征和其开发二者是重要的。
Fc区的关键特征是在N297发生的保守的N-连接的糖基化。这一糖类，或有时称为寡糖，对该抗体起关键的结构和功能作用，并是抗体必须使用哺乳动物表达系统产生的主要原因之一。Fc对FcγR和C1q的有效结合需要这一修饰，且N297糖类组成的改变或其消除影响对这些蛋白的结合。
本文公开的实施方案的免疫球蛋白大致上可被属于任何抗体类型的免疫球蛋白基因编码。在某些实施方案中，本文公开的免疫球蛋白包括属于IgG类的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的序列。在替代实施方案中，本文公开的免疫球蛋白包括属于IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM类的抗体的序列。本文公开的免疫球蛋白可包括多于一种蛋白链，例如，可以是为单体或寡聚体，包括同寡聚体或异寡聚体的抗体或Fc融合体。
本文公开的免疫球蛋白大致上可被来自任何生物体的基因编码，所述生物体例如哺乳动物(包括但不限于人类、啮齿类(包括但不限于小鼠和大鼠)、兔类(包括但不限于兔和野兔)、骆驼属(包括但不限于骆驼、羊驼和单峰骆驼)、和非人灵长类，包括但不限于原猴、阔鼻小目(新世界猴)、猕猴类(旧世界猴)、和类人动物总科，包括长臂猿和小型猿类和大型猿类。在最优选的实施方案中，本文公开的免疫球蛋白大致上可以是人类的。
如本领域公知的，人类群体中存在免疫球蛋白多态性。Gm多态性由IGHG1、IGHG2和IGHG3基因决定，其具有编码称为人类IgG1、IgG2和IgG3分子的标志物的G1m、G2m和G3m同种异型的同种异型抗原决定簇的等位基因(γ4链上还未发现Gm同种异型)。标志物可分为″同种异型″和″异同种异型(isoallotype)″。依赖于同种型之间的强序列同源性，这些在不同血清学基础上区分。同种异型是由Ig基因的等位形式规定的抗原决定簇。同种异型代表不同个体的重链或轻链氨基酸序列中的轻微差异。即使单个氨基酸差异可导致同种异型决定簇，虽然在许多情形中存在发生了多个氨基酸取代。同种异型是亚类的等位基因之间的序列差异，抗血清藉以仅识别等位基因差异。异同种异型是一个同种型中的等位基因，其产生与一种或多种其他同种型的非多态性同源区域共用的表位，因此抗血清将与相关的同种异型和相关的同源同种型二者反应(Clark，1997，IgG effector mechanisms，ChemImmunol.65：88-110；Gorman&Clark，1990，Semin Immunol 2(6)：457-66，都特此通过引用全文并入)。
人类免疫球蛋白的等位形式已被充分表征(WHO Review of the notation forthe allotypic and related markers of human immunoglobins.J Immunogen 1976，3：357-362；WHO Review of the notation for the allotypic and related markers ofhuman immunoglobins.1976，Eur.J.Immunol.6，599-601；Loghem E van，1986，Allotypicmarkers，Monogr Allergy 19：40-51，都特此通过引用全文并入)。另外，其他多态性已被表征(Kim等，2001，J.Mol.Evol.54：1-9，特此通过引用全文并入)。目前，已知18种Gm同种异型：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(Lefranc，等，The humanIgG subclasses：molecular analysis of structure，function andregulation.Pergamon，Oxford，pp.43-78(1990)；Lefranc，G.等，1979，Hum.Genet.：50，199-211，都特此通过引用全文并入)。以固定组合遗传的同种异型称为Gm单元型。本文公开的免疫球蛋白大致上可被任何免疫球蛋白基因的任何同种异型、异同种异型或单元型编码。
CTLA4蛋白可经由接头连接丁Fc区。术语″接头″用来表示包含由肽键结合的两个或多个氨基酸残基并用来连接一个或多个抗原结合部分的多肽。这样的接头多肽是本领域公知的(参见例如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。在本文描述的一些实施方案中，多种接头可用于共价连接Fc区于融合伴侣。本文的″接头″还称为″接头序列″、″间隔物″、″连系序列″或其语法同义物。同双功能或异双功能的接头是本领域公知的(参见，1994PierceChemical Company catalog，technical section on cross-linkers，第155-200页，通过引用全文并入)。大量策略可用于共价连接分子在一起。这些包括但不限于蛋白或蛋白结构域的N-和C-末端之间的多肽键合、经由二硫键的键合、和经由化学交联剂的键合。在这一实施方案的一方面，接头是由重组技术或肽合成产生的肽键。接头肽可主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应具有适合连接两个分子的长度，其连接方式是采取彼此相对的正确构象从而保持期望活性。在一个实施方案中，接头长度是从约1至50个氨基酸，优选地长度是约1至30个氨基酸。在一个实施方案中，可使用长度是1至20个氨基酸的接头。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n[SEQ ID NO：39]、(GGGGS)n[SEQ ID NO：40]、和(GGGS)n[SEQ ID NO：41]，其中n是至少1的整数，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和其他柔性接头。可选地，多种非蛋白性聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物，可用作接头，即可用作接头。
本发明的优选的接头包括来自抗体铰链区的序列。可使用来自任何抗体同种型的铰链区序列，包括例如来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的铰链序列。接头序列还可包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列但并非CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可衍生自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头可衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头序列还可衍生自其他蛋白诸如Ig样蛋白(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列、和来自其他蛋白的其他天然序列。
CTLA4-Ig免疫粘附素中的氨基酸修饰
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可包括变体CTLA4、变体Fc区、或变体CTLA4和变体Fc区二者。变体包括相对于亲本CTLA4-Ig蛋白的一种或多种氨基酸修饰，其中氨基酸修饰提供一种或多种优化的特征。本文的″修饰″是指蛋白、多肽、抗体或CTLA4-Ig免疫粘附素的物理、化学或序列特征方面的改变。本文使用的″氨基酸″和″氨基酸同一性″是指在特定的指定位置可以存在的20种天然存在的氨基酸或任何非天然的类似物之一。因此本文使用的″氨基酸″是指天然存在的和合成的氨基酸二者。例如，为了本发明的目的，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。″氨基酸″还包括亚氨酸残基诸如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是以(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸是以(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，可使用非氨基酸的取代基，例如以阻止或延迟体内降解。氨基酸修饰可以是多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。本文的″氨基酸取代″或″取代″是指在亲本多肽序列中的特定位置以另一个氨基酸代替一个氨基酸。本文使用的″氨基酸插入″或″插入″是指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。本文使用的″氨基酸缺失″或″缺失″是指在亲本多肽序列中的特定位置去除氨基酸。
由于至少一种氨基酸修饰，本文公开的变体在氨基酸序列方面不同于其亲本。本文使用的″亲本多肽″、″亲本蛋白″、″前体多肽″或″前体蛋白″是指未修饰的多肽，其随后被修饰以产生变体。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽，即WT或天然蛋白、或天然存在的多肽的变体或工程化的形式。亲本多肽可以是指多肽本身、包括该亲本多肽的组合物、或编码其的氨基酸序列。本文的″野生型″、″WT″或″天然″是指见于自然界的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位变体。包括例如WT CTLA4或WT Fc区蛋白的WT蛋白，具有未被故意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可具有与亲本相比多于一种氨基酸修饰，例如与亲本相比约1至50种氨基酸修饰，例如约1至10种氨基酸修饰、约1至约5种氨基酸修饰等。如此变体的序列与亲本多肽的序列是大致上同源的。例如，本文的变体序列将与亲本序列具有约80％同源性，例如至少约90％同源性、至少约95％同源性、至少约98％同源性、至少约99％同源性等。本文公开的修饰还包括糖形修饰。修饰可利用分子生物学遗传地进行，或可酶促地或化学地进行。
本文公开的变体按照组成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，CTLA4中的取代T5IN是指一种CTLA4变体，其中位置51的苏氨酸被天冬酰胺代替。作为另一个例子，Fc区中的取代N434S是指一种Fc变体，其中位置434的天冬酰胺被丝氨酸代替。同样，M428L/N434S定义具有相对于亲本Fc多肽的取代M428L和N434S的一种Fc变体。WT氨基酸的身份可能未指定，在这种情形中前述变体称为428L/434S。应注意的是，其中提供取代的顺序是随机的，即，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体。对于CTLA4中的修饰，本文的位置编号是按照SEQ ID NO：6中提供的CTLA4胞外区的顺次编号。本文讨论的抗体恒定区和Fc区位置是按照EU索引或EU编号方案编号(Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，United States Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，特此通过引用全文并入)。EU索引或Kabat中的EU索引或EU编号方案是指EU抗体的编号(Edelman等，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63：78-85，特此通过引用全文并入)。
本文的变体的目的是提供一种或多种优化的特征，通常通过改变对靶配体或Fc受体的亲和性。亲和性可相对于亲本蛋白被增强或减少。本文使用的比亲本多肽″更大的亲和性″或″改进的亲和性″或″增强的亲和性″或″更佳亲和性″是指，变体在相同条件下以比亲本多肽显著更高的缔合平衡常数(KA或Ka)或更低的解离平衡常数(KD或Kd)结合配体或受体，所述相同条件例如，结合检验中变体与亲本多肽的量基本上相同。
例如，具有改进的B7-2结合亲和性的CTLA4变体可展示与亲本CTLA4多肽相比在B7-2结合亲和性方面的约1.2、1.5、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍或更多的改进，其中B7-2结合亲和性由本领域技术人员通过例如，本文公开的结合方法包括但不限于BiacoreTM确定。
相应地，本文使用的与亲本多肽相比″减少的亲和性″是指，变体以比亲本多肽显著更低的KA或更高的KD结合配体或受体。更大或减少的亲和性还可相对于亲和性的绝对水平来定义。
本文的免疫粘附素优选地包括变体CTLA4。CTLA4变体可改进对B7-1、B7-2、或B7-1与B7-2二者的结合。CTLA4变体可改进相对于B7-1选择性地结合B7-2。即，变体可增强CTLA4对B7-2的亲和性，但减少对B7-1的亲和性、不影响对B7-1的亲和性、或比对B7-2的亲和性改进少于对B7-1的亲和性改进。可选地，变体可改进相对于B7-2选择性地结合B7-1。
本文的免疫粘附素优选地包括Fc变体。本文公开的Fc变体可被优化以改进或减少对Fc受体或Fc配体的结合。本文使用的″Fc受体″或″Fc配体″是指来自任何生物体的结合抗体的Fc区来形成Fc-配体复合体的分子，优选地多肽。Fc配体包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγRs同源的Fc受体家族。Fc配体可包括未被发现的结合Fc的分子。
在优选的实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素掺入改进FcRn结合的Fc变体。这样的变体可增强CTLA4-Ig免疫粘附素的体内药代动力学特征。增加对FcRn结合和/或改进药代动力学特征的优选的变体包括但不限于在位置259、308、428和434的取代，包括但不限于例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M(2008年12月22日提交的USSN12/341,769，题为″Fc Variants with Altered Binding to FcRn″，通过引用全文并入)。增加Fc对FcRn结合的其他变体包括但不限于：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等2006Journal of Immunology176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等，Journal of Biological Chemistry，2001，276(9)：6591-6604，通过引用全文并入)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等Journal of Immunology，2002，169：5171-5180，Dall′Acqua等，2006，Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524，通过引用全文并入)。用于调整FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等，2010，J Immunol，182：7663-7671。
用于本发明中的其他Fc修饰包括减少或除去对FcγRs和/或补体蛋白的结合的变体，从而减少或除去Fc介导的效应功能诸如ADCC、ADCP和CDC。这样的变体在本文还称为″敲除变体″或″KO变体″。减少对FcγRs和补体结合的变体可用于减少由Fc区介导的不需要的相互作用和用于调整CTLA4-Ig免疫粘附素的选择性。优选的敲除变体描述在10/2/2008公布的US 2008-0242845A1，题为″Fc Variants with OptimizedProperties″，通过引用明确并入本文。优选的修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325和328的取代、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。优选的取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号是根据EU索引。优选的变体包括236R/328R。变体可在任何IgG同种型或IgG同种型Fc区的背景中使用，包括但不限于人类IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。用于减少FcγR和补体结合并减少Fc介导的效应功能的优选的IgG Fc区是IgG2和IgG4Fc区。杂合同种型也可以是有用的，例如USSN11/256,060中所述的杂合IgG1/IgG2同种型。用于减少FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及通过突变或酶促手段或通过在不糖基化蛋白的生物体诸如细菌中产生来去除在位置297的糖基化。这些和其他修饰综述于Strohl，2009，Currem Opinion in Biotechnology 20：685-691，通过引用全文并入。
改进对FcγRs和/或补体结合的Fc修饰也可用在本文的CTLA4-Ig免疫粘附素中。这样的Fc变体可增强Fc介导的效应功能诸如ADCC、ADCP和/或CDC。用于改进FcγR和补体结合的优选的修饰描述于2/2/2006公布的US 2006-0024298 A1和10/19/2006公布的US2006-0235208 A1，明确地通过引用并入本文。优选的修饰包括在选自由236、239、268、324和332组成的组的位置的取代，其中编号是根据EU索引。优选的取代包括但不限于236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。优选的变体包括但不限于239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。用于增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051和396L。这些和其他修饰综述于Strohl，2009，同上。
在一个实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可掺入增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和性的Fc变体。这样的变体可为本文的CTLA4-Ig免疫粘附素提供与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性。在一个实施方案中，Fc变体提供相对于一种或多种激活性受体对FcγRIIb选择性增强的亲和性。改变对FcγRIIb结合的修饰描述于2008年5月30日提交的USSN 12/156,183，题为″Methods and Compositions forInhibiting CD32b Expressing Cells″，明确地通过引用并入本文。具体地，改进对FcγRIIb结合的Fc变体可包括按照EU索引在选自234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332组成的组的位置的一种或多种修饰。用于增强FcγRIIb亲和性的优选取代包括但不限于234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。更优选地，取代包括但不限于235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强对FcγRIIb结合的优选的Fc变体包括但不限于235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
本文描述的CTLA4-Ig免疫粘附素可掺入任何IgG同种型或IgG同种型Fc区背景，包括但不限于人类IgG1、IgG2、IgG3、和/或IgG4中的Fc修饰。可选择IgG同种型诸如以改变FcγR-和/或补体-介导的效应功能。杂合IgG同种型也可以是有用的。例如，USSN 11/256,060描述了可用于特定发明中的大量杂合IgG1/IgG2恒定区。在本发明的一些实施方案中，CTLA4-Ig免疫粘附素可包括同型修饰的手段，即，亲本IgG中修饰为替代IgG中的氨基酸类型。例如，可通过取代手段构建IgG1/IgG3杂合变体，在两种同种型有区别的位置用来自IgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG1位置。如此可构建包括一种或多种取代手段例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F的杂合变体IgG抗体。在本发明的其他实施方案中，可通过取代手段构建IgG1/IgG2杂合变体，在两种同种型有区别的位置以来自IgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置。如此可构建包括一种或多种取代手段例如一种或多种以下氨基酸取代的杂合变体IgG抗体：233E、234L、235L、-236G(是指在位置236插入甘氨酸)、和327A。
如本领域技术人员将理解的，Fc区中单独和组合变体的公开可独立和任选地联合本文公开的任何CTLA4变体。即，如本文所述的，在所公开的变体组中以任何组合单独地和任选地选择和/或组合CTLA4变体。类似地，适合的Fc结构域变体的以上列表可单独地和任选地以任何方式组合，不仅在Fc区中而且与任何CTLA4变体组合。即，可选择包括大量变体的CTLA4变体例如A29H/T51N/L61E/K93Q，且这些变体可与Fc结构域变体诸如239D/332E和/或428L/434S组合。如此，可能的单独变体的″列表″的公开是指包括列表中任何和所有可能的组合以及与为了相同目的或其他目的的其他变体的列表组合。
糖形修饰
抗体Fc区在重链的恒定区中的保守位置包含糖类。每种抗体同种型具有独特的多种N-连接的糖类结构。除了连接于重链的糖类以外，达30％的人类IgG具有糖基化的Fab区。IgG在CH2结构域的Asn297具有单个N-连接的双触角糖类。对于来自血清的或在杂交瘤或工程化细胞中离体产生的IgG，IgG关于Asn297连接的糖类是混杂的。对于人类IgG，核心寡糖通常由GlcNAc2Man3GlcNAc组成，具有不同数目的外部残基。
本文公开的免疫粘附素的糖类部分将参考用于描述寡糖的常用命名法来描述。使用这一命名法的糖类化学的综述见于Hubbard等1981，Ann.Rev.Biochem.50：555-583。这一命名法包括例如，Man代表甘露糖；GlcNAc代表2-N-乙酰氨基葡萄糖；Gal代表半乳糖；Fuc代表岩藻糖；和Glc代表葡萄糖。唾液酸以缩写符号描述，NeuNAc代表5-N-乙酰基神经氨酸，NeuNGc代表5-羟乙酸基神经氨酸。
术语″糖基化″是指向糖蛋白连接寡糖(包含两个或多个连接在一起的单糖的糖类，例如两个至约十二个单糖连接在一起)。寡糖侧链通常经由N-或O-键合连接于糖蛋白的主链。本文公开存在的免疫粘附素的寡糖通常连接于Fc区的CH2结构域作为N-连接的寡糖。″N-连接的糖基化″是指向糖蛋白链中的天冬酰胺残基连接糖类部分。本领域技术人员将认识到，例如，鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgDCH2结构域的每一种在残基297具有用于N-连接的糖基化的单个位点。
为了本文的目的，″成熟核心糖类结构″是指连接于Fc区的经加工的核心糖类结构，其通常由双触角寡糖典型的以下糖类结构GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2构成。成熟核心糖类结构连接于糖蛋白的Fc区，通常经由N-键合连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。″平分型GlcNAc″是连接于成熟核心糖类结构的α1，4甘露糖的GlcNAc残基。平分型GlcNAc可被α(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)酶促连接于成熟核心糖类结构。CHO细胞通常不表达GnTIII(Stanley等，1984，J.Biol.Chem.261：13370-13378)，但可被工程化以如此(Umana等，1999，Nature Biotech.17：176-180)。
本文描述的是包括修饰的糖形或工程化的糖形的CTLA4-Ig免疫粘附素。本文使用的″修饰的糖形″或″工程化的糖形″是指共价连接于蛋白例如抗体的糖类组成，其中所述糖类组成在化学上不同于亲本蛋白。工程化的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或减少FcγR介导的效应功能。在一个实施方案中，修饰本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素以控制共价连接于Fc区的岩藻糖化的和/或平分型寡糖的水平。
用于产生修饰的糖形的多种方法是本领域公知的(Umana等，1999，NatBiotechnol 17：176-180；Davies等，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields等，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa等，2003，J Biol Chem 278：3466-3473；USSN 12/434,533；都明确地通过引用并入)。这些技术控制共价连接于Fc区的岩藻糖化的和/或平分型寡糖的水平，例如通过在多种工程化或其他方式的生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG，通过调整参与糖基化途径的酶(例如FUT8[α1，6-岩藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII])，通过在已表达IgG后修饰糖类，或通过在作为酶抑制剂的岩藻糖类似物存在下表达抗体。用于修饰本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的糖形的其他方法包括使用糖工程化菌株的酵母(Li等，2006，Nature Biotechnology 24(2)：210-215)、苔藓(Nechansky等，2007，Mol Immunjol44(7)：1826-8)、和植物(Cox等，2006，Nat Biotechnol 24(12)：1591-7)。产生修饰的糖形的具体方法的使用不表示限制实施方案于该方法。而是，本文公开的实施方案包涵具有修饰的糖形的CTLA4-Ig免疫粘附素，而不论如何产生其。
在一个实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素被糖工程化以改变唾液酸化水平。CTLA4-Ig免疫粘附素G分子中较高水平的唾液酸化的Fc葡聚糖可以不利地影响功能性(Scallon等，2007，Mol Immunol.44(7)：1524-34)，且Fc唾液酸化水平的差异可导致更改的抗炎活性(Kaneko等，2006，Science 313：670-673)。由于抗体可能由于Fc核心多糖的唾液酸化而获得抗炎特征，为了更大或减少的Fc唾液酸含量，糖工程化本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可以是有利的。
工程化的糖形通常是指不同的糖类或寡糖；如此例如免疫球蛋白可包括工程化的糖形。可选地，工程化的糖形可以是指包括不同糖类或寡糖的CTLA4-Ig免疫粘附素。在一个实施方案中，本文公开的组合物包括具有Fc区的糖基化CTLA4-Ig免疫粘附素，其中约51-100％的糖基化抗体、例如组合物中的抗体的80-100％、90-100％、95-100％等包括缺少岩藻糖的成熟核心糖类结构。在另一个实施方案中，组合物中的抗体包括缺少岩藻糖的成熟核心糖类结构，另外包括Fc区中的至少一种氨基酸修饰。在替代实施方案中，组合物包括具有Fc区的糖基化CTLA4-Ig免疫粘附素，其中约51-100％的糖基化抗体、80-100％或90-100％的在组合物中的抗体包括缺少唾液酸的成熟核心糖类结构。在另一个实施方案中，组合物中的抗体包括缺少唾液酸的成熟核心糖类结构，另外包括Fc区中的至少一种氨基酸修饰。在又另一个实施方案中，组合物包括具有Fc区的糖基化CTLA4-Ig免疫粘附素，其中约51-100％的糖基化抗体、80-100％或90-100％的在组合物中的抗体包括包含唾液酸的成熟核心糖类结构。在另一个实施方案中，组合物中的抗体包括包含唾液酸的成熟核心糖类结构，另外包括Fc区中的至少一种氨基酸修饰。在另一个实施方案中，工程化的糖形和氨基酸修饰的联合为抗体提供最佳的Fc受体结合特征。
其他修饰
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可包括提供优化特征的一种或多种修饰。所述修饰可以是氨基酸修饰，或可以是酶促或化学地进行的修饰。这样的修饰可能提供CTLA4-Ig免疫粘附素中的一些改进，例如其稳定性、溶解度、功能或临床用途的增强。本文公开了通过联合本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素与另外的修饰可进行的多种改进。
在一个实施方案中，进行修饰以改进本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的生物物理特征，包括但不限于稳定性、溶解度和低聚态。修饰可包括例如，提供CTLA4-Ig免疫粘附素中更有利的分子内相互作用的取代，诸如以提供更大稳定性，或为了更高溶解度以极性氨基酸取代暴露的非极性氨基酸。对本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的其他修饰包括使得能够特异性形成同二聚或同多聚分子的那些。这样的修饰包括但不限于工程化的二硫化物、以及化学修饰或聚集方法。
在进一步的实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素包括去除蛋白水解性降解位点的修饰。这些可包括，例如，减少生产率的蛋白酶位点、以及体内降解施用的蛋白的蛋白酶位点。在一个实施方案中，进行另外的修饰以去除共价降解位点诸如脱酰胺(即，将谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基脱酰胺为对应的谷氨酰和天冬氨酰残基)、氧化和蛋白水解性降解位点。特别有用于去除的脱酰胺位点是具有增强的脱酰胺倾向的那些，包括但不限于天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基，随后是谷氨酸(分别是NG和QG基序)。在这种情形中，任一残基的取代能够显著减少脱酰胺的趋势。常见的氧化位点包括甲硫氨酸和半胱氨酸残基。可被引入或去除的其他共价修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的″-氨基″的甲基化、N末端胺的乙酰化、和任何C末端羧基的酰胺化。另外的修饰还可包括但不限于翻译后修饰，诸如N-连接的或O-连接的糖基化和磷酸化。
修饰可包括改进从常用于产生生物质的宿主或宿主细胞的表达和/或纯化产量的那些。这些包括但不限于多种哺乳动物细胞系(例如CHO)、酵母细胞系、细菌细胞系和植物。另外的修饰包括去除或减少重链形成链间二硫键的能力的修饰。另外的修饰包括去除或减少重链形成链内二硫键的能力的修饰。
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可包括修饰，其包括使用利用包括但不限于Liu&Schultz，2010，Annu Rev Biochem 79：413-444中所述的方法掺入的非天然氨基酸，明确地通过引用并入本文。在一些实施方案中，这些修饰使得能够操作以上讨论的多种功能、生物物理、免疫学或制造特征。在其他实施方案中，这些修饰使得能够为了其他目的的另外的化学修饰。
本文预期其他修饰。例如，CTLA4-Ig免疫粘附素可被连接于多种非蛋白性聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。可进行另外的氨基酸修饰以使得能够特异性或非特异性地化学或翻译后修饰CTLA4-Ig免疫粘附素。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化和糖基化。可用于使得能够聚乙二醇化的特定取代包括但不限于，引入新的半胱氨酸残基或非天然氨基酸，从而有效和特异性偶合化学反应可用于连接PEG或其他聚合部分。引入特定糖基化位点可通过向本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素引入新的N-X-T/S序列来实现。
减少免疫原性的修饰可包括减少衍生自亲本序列的加工的肽对MHC蛋白的结合的修饰。例如，氨基酸修饰将被工程化从而不存在或存在极小量的被预测以高亲和性结合任何普遍的MHC等位基因的免疫表位。鉴定蛋白序列中MHC结合表位的许多方法是本领域已知的，可用于评价本文公开的抗体中的表位。
共价修饰被包括在本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的范围中，且通常但并非总是在翻译后进行。例如，通过将特定氨基酸残基与能够与所选侧链或N-或C末端残基反应的有机衍生剂反应，可将许多类型的共价修饰引入分子。在一些实施方案中，本文公开的免疫球蛋白的共价修饰包括添加一种或多种标记。术语″标记基团″是指任何可检测标记。在一些实施方案中，标记基团经由多种长度的间隔物臂偶合于CTLA4-Ig免疫粘附素以减少可能的空间位阻。用于标记蛋白的多种方法是本领域已知的，可用于产生本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素。
在一个实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素是″融合蛋白″，在本文有时称为″共轭物″。融合伴侣或共轭伴侣可以是蛋白性或非蛋白性的；后者通常利用CTLA4-Ig免疫粘附素上和共轭伴侣上的官能团来产生。共轭物和融合伴侣可以是任何分子，包括小分子化学化合物和多肽。例如，多种共轭物和方法描述于Trail等，1999，Curr.Opin.Immunol.11：584-588，通过引用全文并入。可能的共轭伴侣包括但不限于细胞因子、细胞毒性剂、毒素、放射性同位素、化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其他治疗活性剂。在一些实施方案中，共轭伴侣可以更多地被认为是负载，即，共轭物的目的是将共轭伴侣的递送靶向于CTLA4-Ig免疫粘附素所靶向的细胞，例如癌细胞或免疫细胞。如此，例如，毒素与CTLA4-Ig免疫粘附素的共轭将所述毒素的递送靶向于表达靶抗原的细胞。本领域技术人员将理解，实际上融合体和共轭物的概念和定义是重叠的。融合体或共轭物的指定不意味着将其局限于本文公开的任何具体实施方案。而是，宽松地使用这些术语来表达宽的概念，即本文公开的任何CTLA4-Ig免疫粘附素可遗传地、化学地或以其他方式地连接于一种或多种多肽或分子以提供一些期望的性质。
CTLA4-Ig免疫粘附素的产生
本文还公开用于产生和实验上检验CTLA4-Ig免疫粘附素的方法。公开的方法不意味着局限实施方案于任何特定的操作应用或原理。而是，提供的方法意味着通常阐述可产生和实验上检验一种或多种CTLA4-Ig免疫粘附素以获得CTLA4-Ig免疫粘附素。用于抗体和蛋白分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法描述于Antibody Engineering，Kontermann&Dubel编著，Springer，Heidelberg，2001；和Hayhurst&Georgiou，2001，CurrOpin Chem Biol 5：683-689；Maynard&Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2：339-76。
在本文公开的一个实施方案中，产生编码CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸，如果需要，随后可将其克隆到宿主细胞中、表达和检验。如此，可制备编码每种蛋白序列的核酸，尤其是DNA。这些实践利用公知方案进行。例如，可用于产生本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的多种方法描述于Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第3版.(Maniatis，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，2001)和Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley&Sons)，都通过引用全文并入。存在多种可用于有效产生编码本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的DNA的技术。这样的方法包括但不限于基因组装方法、基于PCR的方法和使用PCR变化形式的方法、基于连接酶链式反应的方法、混合寡核苷酸方法，诸如合成改组中使用的那些、试错扩增方法和使用具有随机突变的寡核苷酸的方法、经典定点诱变方法、盒式诱变、和其他扩增和基因合成方法。如本领域已知的，存在用于基因组装、诱变、载体亚克隆等等的多种商业上可获得的试剂盒和方法，且这样的商业产品可用于产生编码CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸。
通过在适合诱导或导致蛋白表达的条件下培养转化有包含编码CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸的核酸例如表达载体的宿主细胞，可产生本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素蛋白。适合表达的条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化，本领域技术人员经常规实验容易确定。可使用宽范围的适当的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和植物细胞。例如，可用于产生本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的多种细胞系描述于可从美国典型培养物保藏中心获得的
Figure BDA0001053204300000331
细胞系目录。
在一个实施方案中，在哺乳动物表达系统中表达CTLA4-Ig免疫粘附素，包括其中使用诸如逆转录病毒或腺病毒的病毒将表达构建体导入哺乳动物细胞的系统。可使用任何哺乳动物细胞，例如人类、小鼠、大鼠、仓鼠和灵长类细胞。合适的细胞还包括已知的研究细胞，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3、CHO、BHK、COS、HEK293、PER C.6、HeLa、Sp2/0、NS0细胞及其变体。在一个可选的实施方案中，在细菌细胞中表达文库蛋白质。细菌表达系统是本领域众所周知的，包括大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)和链锁状链球菌(Streptococcuslividans)。在可选的实施方案中，在昆虫细胞(如Sf21/Sf9、Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4)或酵母细胞(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia)等)中生产CTLA4-Ig免疫粘附素。在一个可选的实施方案中，使用无细胞翻译系统在体外表达CTLA4-Ig免疫粘附素。可得到衍生自原核细胞(如大肠杆菌)和真核细胞(如小麦胚芽、兔网织红细胞)的体外翻译系统，并可根据目的蛋白的表达水平和功能特性进行选择。例如，本领域技术人员将领会，体外翻译是某些展示技术所需要的，例如核糖体展示。此外，可通过化学合成方法生产CTLA4-Ig免疫粘附素。还有动物(如牛、绵羊或山羊奶、含胚鸡卵、整个昆虫幼虫等)和植物(如玉米、烟草、浮萍等)的转基因表达系统。
可将编码本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸掺入表达载体以便表达蛋白质。许多表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。构建与宿主细胞类型相容的表达载体。因此可用于产生本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的表达载体包括但不限于那些使蛋白质能在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母以及体外系统中表达的载体。本领域公知，可从市场上或以其他方式获得可用于表达本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的多种表达载体。
表达载体通常包含与控制或调节序列、选择标记、任何融合伴侣和/或附加元件可操作地连接的蛋白质。本文中″可操作地连接″指核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中。一般来说，这些表达载体包括与编码CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸，且通常适合于用于表达蛋白质的宿主细胞。一般而言，转录和翻译调节序列可包括启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。本领域也公知，表达载体通常含有选择基因或标记以容许对含有表达载体的经转化宿主细胞的选择。选择基因是本领域众所周知的且随所使用的宿主细胞而改变。
CTLA4-Ig免疫粘附素可能与融合伴侣可操作地连接，以使所表达的蛋白质的靶向、纯化、筛选、展示等能实现。融合伴侣可经接头序列与CTLA4-Ig免疫粘附素序列连接。接头序列通常包含少量氨基酸，一般少于10个，尽管也可使用更长的接头。一般而言，所选择的接头序列应具有柔性并能抗降解。本领域技术人员将领会，宽范围的序列的任一种可用作接头。例如，常用的接头序列包含氨基酸序列GGGGS[SEQ ID NO：40]。融合伴侣可以是靶向或信号序列，引导CTLA4-Ig免疫粘附素和任何关联融合伴侣到期望的细胞部位或细胞外介质。本领域公知，某些信号序列可将蛋白质靶向分泌到培养基中或位于细胞的内外膜之间的周质空间中。融合伴侣也可以是编码使纯化和/或筛选能实现的肽或蛋白质的序列。这样的融合伴侣包括但不限于多组氨酸标签(His标签)(例如H6和H10或用于固定化金属亲和层析(IMAC)系统(如Ni+2亲和柱)的其他标签)、GST融合物、MBP融合物、Strep标签、细菌酶BirA的BSP生物素化靶序列、以及受抗体靶向的表位标签(例如c-myc标签、flag标签等等)。本领域技术人员将领会，此类标签可用于纯化、筛选或两者。例如，CTLA4-Ig免疫粘附素可使用His标签通过将其固定在Ni+2亲和柱上而纯化，接着在纯化后同样的His标签可用于将抗体固定在Ni+2包被的板上以进行ELISA或其他结合测定(如下所述)。融合伴侣可使利用选择方法筛选CTLA4-Ig免疫粘附素成为可能(参见下文)。能用于多种选择方法的融合伴侣为本领域众所周知。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig免疫粘附素在表达后得到纯化或分离。可以本领域技术人员公知的多种方式分离或纯化蛋白质。纯化在本发明中对于分离异二聚重链物质与同二聚重链物质可以是尤其有用的，如本文所述。标准的纯化方法包括层析技术，包括离子交换、疏水相互作用、亲和、尺寸或凝胶过滤、以及反相，在大气压或高压下使用诸如FPLC和HPLC的系统进行。纯化方法还包括电泳、等电点聚焦、免疫学、沉淀、透析以及层析聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩结合也是有用的。本领域众所周知，许多天然蛋白质结合Fc和抗体，这些蛋白质可用于纯化本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素。例如，细菌蛋白质A和G结合Fc区。同样的，细菌蛋白质L结合某些抗体的Fab区，当然就像抗体的靶抗原。纯化通常能通过特定的融合伴侣来进行。例如，如果使用GST融合物，则CTLA4-Ig免疫粘附素可使用谷胱甘肽树脂进行纯化，如果使用His标签，则可使用Ni+2亲和层析，或如果使用flag标签，则可使用固定化抗flag抗体。关于合适的纯化技术的一般指导，参见例如通过引用全文并入的Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。必需的纯化程度将随CTLA4-Ig免疫粘附素的筛选或用途而改变。在有些情况中无需纯化。例如在一个实施方案中，如果CTLA4-Ig免疫粘附素是分泌的，那么可直接从培养基进行筛选。本领域众所周知，有些选择方法并不涉及蛋白质纯化。
体外实验
CTLA4-Ig免疫粘附素可使用多种体外方法实验上试验，包括但不限于使用结合检验、基于细胞的检验和选择技术的那些方法。在筛选方案中可使用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合伴侣或标记物的使用。上文已讨论了融合伴侣的使用。本文中″标记的″指本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素具有一种或多种附在其上使筛选中的检测成为可能的元素、同位素或化学化合物。一般而言，标记物分成三类：a)免疫标记物，可以是掺入作为融合伴侣的表位，该表位受抗体所识别，b)同位素标记物，可以是放射性或重同位素，以及c)小分子标记物，可包括荧光染料和比色染料，或使其他标记方法实现的分子诸如生物素。标记物可以掺入到化合物中的任何位置，并可在蛋白质表达期间在体外或体内掺入。
在一个实施方案中，在体外检验中筛选CTLA4-Ig免疫粘附素的功能和/或生物物理特性。对于筛选感兴趣的特性而言，体外检验可给予宽的动态范围。与本发明尤其相关地，可试验CTLA4-Ig免疫粘附素对一种或多种抗原的能力。可筛选的特性包括但不限于稳定性、溶解度和对Fc配体，例如FcγR的亲和性。可同时或单独筛选多种特性。根据检验的需要，蛋白质可以是纯化的或未纯化的。在一个实施方案中，筛选是对于CTLA4-Ig免疫粘附素与已知或认为结合CTLA4-Ig免疫粘附素的蛋白质或非蛋白质分子的结合的定性或定量结合检验。在一个实施方案中，筛选是用于测量与靶抗原结合的结合检验。在一个可选的实施方案中，筛选是对于CTLA4-Ig免疫粘附素与Fc配体的结合的检验，包括但不限于FcγR家族、新生受体FcRn、补体蛋白C1q、以及细菌蛋白质A和G。所述Fc配体可来自任何生物体。在一个实施方案中，Fc配体来自人类、小鼠、大鼠、兔和/或猴。可使用本领域公知的多种方法进行结合检验，包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的检验、AlphaScreenTM(放大的发光邻近均质检验)、闪烁邻近检验、ELTSA(酶联免疫吸附检验)、SPR(表面等离子共振，也称为
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)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳以及包括凝胶过滤的层析。这些和其他方法可利用CTLA4-Ig免疫粘附素的某些融合伴侣或标记物。检验可采用多种检测方法，包括但不限于显色的、荧光的、发光的或同位素标记物。
CTLA4-Ig免疫粘附素的生物物理特性，例如稳定性和溶解度，可使用本领域已知的多种方法进行试验。可通过测量折叠和解折叠状态之间的热力学平衡来确定蛋白质稳定性。例如，可使用化学变性剂、加热或pH使本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素解折叠，该转换可使用包括但不限于圆二色谱法、荧光光谱法、吸收光谱法、NMR光谱法、量热法以及蛋白水解法的方法来监测。本领域技术人员将领会，还可使用这些和其他技术来监测折叠和解折叠转换的动力学参数。可使用本领域公知的许多方法，定量或定性确定CTLA4-Ig免疫粘附素的溶解度和总体结构完整性。可用于表征本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的生物物理特性的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、层析诸如尺寸排阻层析、离子交换层析和反相高效液相层析、肽作图、寡糖作图、质谱法、紫外吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析性超速离心法、动态光散射法、蛋白水解法以及交联法、浊度测量法、过滤阻滞测定法(filter retardation assays)、免疫测定法、荧光染料结合测定法、蛋白质染色测定法、显微镜检法以及通过ELISA或其他结合测定法对聚集体的检测。也可使用采用X-射线晶体学技术和NMR光谱法的结构分析。在一个实施方案中，可通过确定在规定的某一段时间后蛋白质溶解的量来测量稳定性和/或溶解度。在该测定法中，蛋白质可以暴露或不暴露于某些极端条件，例如高温、低pH或存在变性剂。因为行使功能通常需要稳定、可溶的和/或适当折叠/结构的蛋白质，前述功能和结合测定法也提供了执行上述测量的方法。例如，可对包含CTLA4-Ig免疫粘附素的溶液测定其结合靶抗原的能力，接着暴露于高温一段或多段规定的时间，然后再次测定与抗原的结合。因为预期解折叠和聚集的蛋白质不能结合抗原，所以保留的活性量提供了对CTLA4-Ig免疫粘附素的稳定性和溶解度的量度。
在一个实施方案中，可使用一种或多种基于细胞的或体外测定法试验CTLA4-Ig免疫粘附素。对于这样的测定法，通常外源添加纯化的或未纯化的CTLA4-Ig免疫粘附素，使得细胞暴露于本文描述的CTLA4-Ig免疫粘附素。这些测定通常但不总是基于CTLA4-Ig免疫粘附素结合靶抗原并介导某些生化事件的能力的生物学，所述生化事件例如效应功能像细胞溶解、吞噬、配体/受体结合抑制、生长和/或增殖的抑制、钙释放和/或信号转导的抑制、凋亡等等。这样的测定法常常包括监测细胞对CTLA4-Ig免疫粘附素的响应，例如细胞存活、细胞死亡、细胞吞噬、细胞溶解、细胞形态的变化、或转录激活诸如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，这样的测定法可测量CTLA4-Ig免疫粘附素引发细胞杀伤，例如ADCC、ADCP和CDC的能力。测量被抗原共啮合介导的细胞杀伤的测定与本发明尤其相关。对于某些测定法，可能需要添加除靶细胞之外的另外的细胞或组分，例如血清补体或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞、T细胞等。这样的另外的细胞可来自任何生物体，例如人类、小鼠、大鼠、兔和猴。交联或单体的抗体可引起表达抗体的靶抗原的某些细胞系凋亡，或它们可通过已添加到测定法中的免疫细胞介导对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或生存力的方法为本领域所公知，包括使用染料、荧光团、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如，半胱天冬酶测定法或膜联蛋白荧光缀合物可能能测量凋亡，放射性底物的摄取或释放(如铬-51释放测定法)或荧光染料诸如alamar蓝的代谢性还原可能能监测细胞生长、增殖或活化。在一个实施方案中，使用了基于DELFIA EuTDA的细胞毒性测定法(PerkinElmer，MA)。或者，可通过测量一种或多种天然胞内蛋白质例如乳酸脱氢酶的释放来监测死亡或损伤的靶细胞。转录激活还可在基于细胞的测定法中用作测定功能的方法。在这种情况中，可通过测定可能被上调或下调的天然基因或蛋白质来监测响应，例如可测量某些白介素的释放，或者可通过萤光素酶或GFP-报道基因构建体读出结果。基于细胞的测定法还可包括细胞响应CTLA4-Ig免疫粘附素存在的形态学改变的测量。用于上述测定法的细胞类型可以是原核或真核的，并可使用本领域公知的多种细胞系。或者，使用经编码CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸转化或转染的细胞进行基于细胞的筛选。
体内实验
可在细胞、组织以及完整生物体实验中表征本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的生物学特性。
如本文所示，一般，本发明的免疫粘附素的变体CTLA4结构域的结合和相关亲和性的检验使用实施例中概述的结合检验进行。如上所述，当变体多肽的KA相对于亲本多肽显著更高或变体多肽的KD相对于亲本多肽显著更低时，亲和性可描述为被增强。当以比例例如，KA(变体多肽)/KA(亲本多肽)或KD(亲本多肽)/KD(变体多肽)的方式表述时，例如，当这些比例的一个和/或两个是约1.2、1.5、2.0、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、100、250、500、1000或更大时，证明了亲和性的显著增加。
本领域公知，通常在动物中测试药物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪和猴，以测量药物对疾病或疾病模型治疗的功效，或测量药物的药代动力学、毒性及其他特性。所述动物可称为疾病模型。至于本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素，在使用动物模型以评估候选多肽在人类中的功效的潜力时面临特定的挑战-这是因为，至少部分是因为对人类Fc受体的亲和性具有特定影响的CTLA4-Ig免疫粘附素的Fc结构域可能对直向同源动物受体不具类似的亲和性影响的事实。与真实直向同源物的正确分派(assignment)相关的不可避免的不确定性(Mechetina等，2002，Immunogenetics，54：463-468，通过引用全文并入)，以及某些直向同源物仅仅是不存在于动物中的事实能够进一步加剧这些问题。常常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、Rag缺陷型小鼠、SCD小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲进和敲除)。本文的治疗性CTLA4-Ig免疫粘附素可在小鼠品系NZB、NOD、BXSB、MRL/lpr、K/BxN和转基因型(包括敲进和敲除)中测试。这样的小鼠能够发展类似人类器官特异性、系统性自身免疫或炎性疾病病理学诸如系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)的多种自身免疫病症。例如，意在用于自身免疫疾病的本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可在这样的小鼠模型中测试，通过治疗小鼠来确定CTLA4-Ig免疫粘附素减少或抑制疾病病理学发展的能力。由于小鼠与人类Fcγ受体系统的不相容性，一种替代的方法是使用SCID鼠模型，其中给免疫缺陷小鼠移植人类PBL或PBMC(huPBL-SCID、huPBMC-SCID)，提供具有人类效应细胞和Fc受体的半功能性的人类免疫系统。其他生物体，例如哺乳动物，也可用于测试。例如因为猴与人类的遗传相似性，所以它们可以是合适的治疗模型，因此可用于测试本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的功效、毒性、药代动力学或其他特性。对于批准作为药物而言，最终必需在人体中测试本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素，因此当然要考虑这些实验。因此本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可在人体中测试以确定它们的治疗功效、毒性、药代动力学和/或其他临床特性。
在一些实施方案中，可对本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素评估在各种人类疾病的临床相关动物模型中的功效。在许多情况中，相关模型包括特定抗原和受体的各种转基因动物。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig免疫粘附素的测试可包括在灵长类动物(如猿猴模型)中的功效研究以利于评估携带靶抗原的特定靶细胞的耗竭。另外的灵长类动物模型包括但不限于使用恒河猴模型来在自身免疫、移植和癌症的治疗研究中评价CTLA4-Ig免疫粘附素。
进行毒性研究以确定在标准药理学图谱中无法评估的或仅在重复施用该剂后发生的药物相关效应。大多数毒性测试在两种物种(一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物)中进行以确保在新的治疗性实体导入人类之前不忽略任何意外的不利效应。一般而言，这些模型可测量多种毒性，包括基因毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/发育毒性以及致癌性。前述参数包括食物消耗、体重、抗体形成、临床化学的标准测量以及标准器官/组织的宏观和微观检查(如心脏毒性)。另外的测量参数是注射部位创伤和中和抗体的测量，如果有的话。传统上，对裸露的或缀合的单克隆抗体治疗剂评价与正常组织的交叉反应性、免疫原性/抗体产生、放射性标记物质的缀合物或接头毒性和“旁观者”毒性。虽然如此，这样的研究可能必须对特定内容加以个别考虑并遵循ICH S6(上文也标注的生物技术产品的安全研究)设立的指导。同样的，普遍原则在于产品被充分的表征并已被除去杂质/污染物，在开发过程中测试物质是可比较的，并保持符合GLP。
可在多种动物系统中研究本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的药代动力学(PK)，最相关的是非人灵长类动物诸如猕猴和恒河猴。单次或重复静脉内/皮下施用6000倍的剂量范围(0.05-300mg/kg)可使用血浆浓度和清除来评估半衰期(几天到几周)。还可测量稳定状态下的分布容量和系统吸收水平。这样的测量参数的实例通常包括最大实测血浆浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(Tmax)、血浆浓度-时间曲线的时间0到无穷大的面积[AUC(0-inf)]以及表观消除半衰期(T1/2)。另外的测量参数可包括静脉内施用后所获得的浓度-时间数据的区室分析以及生物利用度。
药效学研究可包括但不限于靶向特定细胞或阻断信号转导机制、测量抗原特异性抗体的抑制等。本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可靶向特定的效应细胞群并因此指导药物诱导某些活性以改善效力或增加进入特别有利的生理区室的渗入。可在动物模型或人类中证实这样的药效学效应。
临床用途
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于多种治疗目的。在一个实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素是治疗剂、诊断剂或研究试剂。CTLA4-Ig免疫粘附素可用于为单克隆或多克隆的组合物中。本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于治疗目的。CTLA4-Ig免疫粘附素可施用于患者以治疗病症。
对于本文公开的目的，“患者”包括人类和其他动物，例如其他哺乳动物。因此本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于人类治疗和兽医两种应用。本文公开的术语“治疗”意图包括对疾病或紊乱的治疗性处理，以及预防性或抑制性措施。因此，举例来说，在疾病发作前成功施用CTLA4-Ig免疫粘附素导致对疾病的治疗。作为另一个实例，在疾病临床表现后成功施用优化的CTLA4-Ig免疫粘附素以对抗疾病症状构成对疾病的治疗。“治疗”还涵盖在疾病出现后施用优化的CTLA4-Ig免疫粘附素以根除疾病。在发作后以及在临床症状已经形成后成功施用试剂，有可能消除临床症状并有可能改善疾病，构成对疾病的治疗。那些“需要治疗的”包括已患有疾病或紊乱的哺乳动物，以及易患上疾病或紊乱的那些哺乳动物，包括其中疾病或紊乱有待预防的那些哺乳动物。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素优选地用于治疗免疫相关病症或疾患。免疫相关病症包括但不限于自身免疫疾病、炎性病症、和阻止与排斥供体组织带相关的免疫应答。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于治疗自身免疫疾病。本文的″自身免疫疾病″包括同种异体胰岛移植排斥、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、抗中性白细胞胞质自身抗体(ANCA)、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性荨麻疹、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼氏综合征、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫机能异常综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施(Churg-Strauss)二氏综合征、疤痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、因子VIII缺乏症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴(Guillain-Barre)二氏、古德帕斯丘氏综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、桥本氏甲状腺炎、血友病A、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫瘢(ITP)、IgA神经病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少症、幼年型关节炎、川崎氏病、扁平苔藓(lichen plantus)、红斑狼疮(lupus erthematosis)、梅尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、I型糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎(polychrondritis)、多腺性综合征、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发性无γ球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病性关节炎、Reynauld氏现象、莱特尔氏综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、实体器官移植排斥、僵人综合征、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫瘢、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎病诸如疱疹样皮炎血管炎、白瘢风和韦格纳(Wegner)氏肉芽肿病。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于治疗炎性紊乱。本文的″炎性紊乱″包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性脓毒性关节炎、变应性关节炎、幼年型特发性关节炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性脉管炎、变态反应、哮喘、动脉粥样硬化、由于慢性细菌或病毒感染引起的慢性炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠心病、脑炎、炎性肠病、炎性骨质溶解、与急性和迟发性超敏反应有关的炎症、与肿瘤有关的炎症、外周神经损伤或脱髓鞘性疾病、与组织创伤诸如烧伤和局部缺血有关的炎症、由脑膜炎引起的炎症、多器官损伤综合征、肺纤维化、脓毒症和败血性休克、斯-约(Stevens-Johnson)二氏综合征、未分化的关节化脓、以及未分化的脊椎关节病。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于阻止或遏制接受者排斥供体组织、细胞、移植片或器官移植物带来的免疫应答。移植物相关的疾病或病症包括移植物抗宿主病(GVDH)，诸如与骨髓移植相关的移植物抗宿主病，和排斥器官、组织或细胞移植物移植(例如，组织或细胞同种移植物或异种移植物)导致或相关的免疫病症，包括例如，皮肤、肌肉、神经元、胰岛、器官、肝脏实质细胞等的移植物。关于接受者体内的供体组织、细胞、移植片或实体器官移植物，认为本文公开的本发明的这样的分子(例如，变体CTLA-4ECD多肽或变体CTLA-4-Ig融合蛋白)可有效地阻止接受者中这样的移植物的急性排斥和/或用于长期维持疗法以阻止接受者中这样的移植物的排斥(例如，抑制患有糖尿病的接受者中排斥来自供体的产生胰岛素的胰岛细胞移植物)。
可被本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素治疗的优选的免疫相关病症包括克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、银屑病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、和移植排斥，包括但不限于肾移植、肝脏移植和胰腺移植。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于治疗癌症。本文的″癌症″和″癌性的″是指或描述哺乳动物中通常特征为不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、施旺细胞瘤(schwanoma)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、以及白血病或淋巴恶性肿瘤。
本文的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于治疗传染病。本文的″传染病″包括由诸如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫的病原体引起的疾病。
此外，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可用于预防或治疗另外的状况，包括但不限于心脏状况诸如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎和其他心肌状况；皮肤状况诸如玫瑰斑(rosecea)、痤疮和湿疹；骨和牙状况诸如骨丢失、骨质疏松、佩吉特氏病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、牙周病、不用性骨量减少、骨软化症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、骨转移、骨痛处理、体液恶性高钙血症、牙周再建、脊髓损伤和骨折；代谢状况诸如高歇氏病；内分泌状况诸如库兴氏综合征；以及神经学状况和神经退化状况诸如阿尔茨海默病。
制剂
设想了其中本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素与一种或多种治疗活性剂配制的药用组合物。制备本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的制剂，即将具有所需纯度的所述CTLA4-Ig免疫粘附素与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980，通过引用全文并入)，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度上对接受者是无毒的，且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或CTLA4-Ig免疫粘附素；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；甜味剂和其他芳香剂；填充剂，诸如微晶纤维素、乳糖、玉米和其他淀粉；粘合剂；添加剂；着色剂；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，包含本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的药用组合物可以水溶性形式存在，诸如以药学上可接受的盐存在，其意图包括酸和碱加成盐二者。“药学上可接受的酸加成盐”指那些保留游离碱的生物学效力且在生物学或其他方面没有不良特性，用无机酸和有机酸形成的盐，所述无机酸诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，而所述有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等。“药学上可接受的碱加成盐”包括那些由无机碱衍生的盐，诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。一些实施方案包括铵、钾、钠、钙、和镁盐的至少一种。由药学上可接受的有机无毒碱衍生的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺)的盐。用于体内施用的制剂可以是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤或其他方法来实现。
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素还可配制成免疫脂质体。脂质体是一种小囊泡，包含可用于将治疗剂递送至哺乳动物的不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。可通过本领域公知方法来制备含有CTLA4-Ig免疫粘附素的脂质体。脂质体的成分通常排列成双层结构，类似于生物膜的脂质排列。可通过反相蒸发法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。将脂质体从具有规定孔径的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。
还可将CTLA4-Ig免疫粘附素和其他治疗活性剂包裹于微胶囊(通过包括但不限于凝聚技术、界面聚合(例如使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸酯)微胶囊)的方法制备的微胶囊)、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)以及粗滴乳状液中。这样的技术披露于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编，1980中，通过引用全文并入。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括固相疏水性聚合物的半透性基质，该基质以成型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如
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(其是由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸以及
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(可从Alkermes购得)，其是由掺入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质的期望生物活性分子组成的基于微球体的递送系统。
施用
包含本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的药用组合物的施用，例如以无菌水溶液的形式，可以多种方式进行，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、经皮、局部(如凝胶剂、油膏剂、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、肠胃外、经直肠或眼内。在某些情况中，例如用于处理伤口、炎症等，CTLA4-Ig免疫粘附素可作为溶液或喷雾剂直接应用。本领域公知，药用组合物可根据导入方式而相应进行配制。
在患者可自己施用药用组合物的情况中使用皮下施用。对于皮下施用而言，许多蛋白质治疗剂并不足够有效以允许以最大可接受体积配制治疗有效剂量。通过使用包含精氨酸-HCl、组氨酸和聚山梨醇酯的蛋白质制剂可部分解决该问题。由于例如增加的效力、改善的血清半衰期或增加的溶解度，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可能更便于皮下施用。本领域公知，蛋白质治疗剂常常通过静脉内输注或推注递送。本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素也可使用这样的方法递送。例如，可用0.9％氯化钠作为输注媒介物通过静脉内输注进行施用。
可使用吸入器或喷雾器以及包含雾化剂的制剂实现肺部投递。例如，可使用可从Aradigm购买的
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可吸入技术或可从Nektar Therapeutics购买的InhanceTM肺部递送系统。而且，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可能便于口服递送。
此外，本领域公知许多递送系统的任一种且可用于施用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素。实例包括但不限于包囊在脂质体、微粒、微球体(如PLA/PGA微球体)等等中。或者，可以使用多孔的、非多孔的或凝胶状物质，包括膜或纤维的植入物。持续释放系统可包含聚合材料或基质，诸如聚酯、水凝胶、聚(乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、乙烯-醋酸乙烯、乳酸-乙醇酸共聚物诸如
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以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。还有可能施用编码本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素的核酸，例如通过逆转录病毒感染、直接注射或包被脂质、细胞表面受体或其他转染剂。在所有情况中，可使用受控释放系统在期望作用部位或其附近释放CTLA4-Ig免疫粘附素。
给药
在一个实施方案中，选择的给药量和施用频率是治疗或预防上有效的。本领域公知，可能必须对于蛋白质降解、系统性相比于局部递送、和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症的严重程度进行调整，并可由本领域技术人员通过常规实验来确定。
制剂中治疗活性CTLA4-Ig免疫粘附素的浓度可从约0.1到100重量％变化。在一个实施方案中，CTLA4-Ig免疫粘附素的浓度在0.003-1.0摩尔的范围内。为了治疗患者，可施用治疗有效剂量的本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素。本文中“治疗有效剂量”指所施用的产生效力的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并将由本领域技术人员使用公知技术来确定。剂量范围可为0.0001-100mg/kg体重或更大，例如0.1、1、10或50mg/kg体重。在一个实施方案中，剂量范围为1-10mg/kg。
在一些实施方案中，仅使用单次剂量的CTLA4-Ig免疫粘附素。在其他实施方案中，施用多剂量的CTLA4-Ig免疫粘附素。施用间的实耗时间可小于1小时、约1小时、约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约2-4天、约4-6天、约1周、约2周或大于2周。
在其他实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素以有节奏(metronomic)的剂量方案施用，或通过连续输注或频繁施用而无延长的休息期。这样的有节奏施用可包括以不变的间隔给药而无休息期。典型的是，这样的方案涵盖长期低剂量或连续输注较长一段时间，例如1-2天、1-2周、1-2月、或直到6个月或更久。使用较低剂量可使副作用及对休息期的需要减到最小。
在一些实施方案中，将本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素和一种或多种其他预防或治疗剂循环施用于患者。循环疗法包括在一个时间施用第一药剂，在第二时间施用第二药剂，任选在另外的时间施用另外的药剂，任选有休息期，以及然后重复该施用顺序一次或多次。循环次数通常为2-10次。循环疗法可减少对一种或多种药剂抗性的发展，可使副作用减到最小，或可改善疗效。
联合疗法
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可与一种或多种其他治疗方案或治疗剂共同施用。另外的治疗方案或治疗剂可用于改进CTLA4-Ig免疫粘附素的效力或安全性。而且，另外的治疗方案或治疗剂可用于治疗相同的疾病或共病(comorbidity)而不改变CTLA4-Ig免疫粘附素的作用。例如，可将本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素与化疗、放疗或两者一起施用于患者。
术语“联合”和“共施用”不限于恰好同时施用所述预防剂或治疗剂。相反，它指以某种顺序和在一定时间间隔内施用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素和其他一种或多种药剂使得它们可共同作用以提供比仅用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素或其他一种或多种药剂增加的益处。在一些实施方案中，本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素和其他一种或多种药剂起累加作用，有时起协同作用。这样的分子适合以对于预期目的有效的量联合存在。熟练的医务人员可凭经验或考虑到药剂的药代动力学和作用模式而确定每种治疗剂的合适剂量以及合适的施用时间安排和方法。
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可与一种或多种其他预防剂或治疗剂联合施用，包括但不限于细胞毒剂、化疗剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞增殖的药剂、血管生成抑制剂、蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、其他抗体、Fc融合体、或CTLA4-Ig免疫粘附素、或其他治疗剂。本发明的疗法可与其他免疫疗法联合。本发明的疗法可与趋化因子或细胞因子的拮抗剂联合，包括但不限于抗体和Fc融合体。
本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素可与其他治疗方案联合。例如，在一个实施方案中，将用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素治疗的患者还可接受放疗。放疗可根据本领域常常采用的和本领域技术人员知道的方案施行。这样的疗法包括但不限于铯、铱、碘或钴照射。放疗可以是全身照射，或可以是局部针对身体特定部位或组织，诸如肺、膀胱或前列腺。任选地，放疗可以作为单剂量或多次连续剂量施用。熟练医务人员可以凭经验确定对本文有用的放疗的合适剂量。根据本发明的另一个实施方案，采用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素和一种或多种其他抗癌疗法离体(ex vivo)处理癌细胞。设想这样的离体处理在骨髓移植和特别是在自体骨髓移植中可能是有用的。例如，用CTLA4-Ig免疫粘附素和一种或多种其他抗癌疗法诸如上文所述处理含癌细胞的细胞或组织，可用于在接受者患者移植之前耗竭或基本上耗竭癌细胞。当然设想了可联合还有一些其他治疗技术诸如外科手术采用本文公开的CTLA4-Ig免疫粘附素。
尽管上文出于举例说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，然而本领域技术人员将领会，可以对细节进行许多改变而不背离如所附权利要求书所描述的本发明。将本文引用的所有参考文献全文并入。
实施例
下文提供了实施例以举例说明本发明。这些实施例并非意图将本发明限制于任何特定的操作应用或原理。
实施例1.增强对B7-1和B7-2结合的工程化的CTLA4-Ig变体
全长人类CTLA4的氨基酸序列提供于图1。负责与B7-1和B7-2相互作用的胞外结构域(ECD)也提供于图1。
CTLA4的免疫粘附素(Fc融合体)能够通过连接ECD(或ECD的某一变体)与IgG的Fc区来构建。天然人类IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的Fc区提供于图2。尽管提供于图2的IgG1Fc包含356D/358L单元型，可使用其他单元型或同种异型形式(例如356E/358M)。本文的Fc区定义为基于EU编号方案，位置230至C末端。阿贝西普是CTLA4连接于包含P238S取代的修饰的IgG1的免疫粘附素(在图2中称为Fc(IgG1-238S))。本发明的CTLA4-Ig免疫粘附素可在位置238包括丝氨酸或脯氨酸(即，CTLA4-Ig免疫粘附素可包括238S或238P)。IgGFc区的其他变体形式也提供于图2，包括在较低铰链区中具有四个IgG1修饰的IgG2Fc区(称为Fc(IgG2-233E/234L/235L/236G)。
CTLA4ECD可经由多种接头连接于Fc区。本研究中使用的接头包括来自人类IgG恒定链的序列，包括CH1结构域的C末端和上方铰链。基于天然IgG同种型的示例性接头序列提供于图3。可使用经修饰的接头。本研究中使用的示例性接头是修饰的IgG接头(例如基于IgG1-或IgG2-的接头)，其中半胱氨酸被丝氨酸代替。除了插入N末端谷氨酰胺以外，阿贝西普使用半胱氨酸向丝氨酸取代的修饰的IgG1接头。这样的接头的实例也提供于图3。
本研究中使用的接头与Fc区的示例性组合的实例提供于图4。这些包括阿贝西普的Fc区，称为Ig(ab)，以及基于IgG2Fc区的两种融合体，称为Ig(G2)和Ig(G2-ELLG)，其包含在较低铰链中构建入IgG2Fc区的四个IgG1修饰(233E/234L/235L/236G)。示例性CTLA4-Ig免疫粘附素提供于图5。这些包括阿贝西普，还称为CTLA4-Ig(ab)、阿贝西普的一种基于IgG2Fc的形式-称为CTLA4-Ig(G2)，以及贝拉西普，它是在CTLA4部分中具有增强对B7-1和B7-2的亲和性的两个取代A29Y和L104E的阿贝西普的变体形式。
为了增强人类CTLA4对人类B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的亲和性，使用基于理性结构的方法设计CTLA4变体。可获得人类CTLA4与人类B7-1(Stamper等，2001，Nature 410：608-611)和B7-2(Schwartz等，2001，Nature 410：604-608)之间的复合体的高分辨率结构。设计的变体文库如下提供：A29K、A29N、A29E、A29W、A29F、A29Y、A29H、A29Q、A29R、T30D、T30V、T30A、T30N、T30E、T30H、T30R、E31I、E31M、E31T、E31V、E31D、R33F、R33T、R33M、R33W、R33I、R33Y、R33L、R33E、R33Q、T35E、T35V、T35M、T35D、T35F、T35Y、A49T、A49F、A49Y、A49W、A49D、A49E、T51V、T51L、T51N、T51H、T51Q、T51E、T51S、T51R、T51D、M53E、M53Q、M53Y、M53W、M53F、M53H、T59V、T59L、T59N、T59Y、T59H、T59Q、T59I、L61D、L61E、L61I、L61A、L61F、L61G、L61H、L61K、L61M、L61N、L61P、L61Q、L61R、L61S、L61T、L61V、L61W、L61Y、D63E、S64K、S64R、S64Y、K93D、K93E、K93F、K93H、K93Q、K93R、K93T、K93V、K93W、K93Y、K93N、K93S、E95D、E95Q、E95Y、E95H、E95L、M97F、M97D、M97N、M97I、M97V、Y98F、Y98W、Y102F、Y102W、Y103F、Y103W、Y103H、Y103D、Y103E、Y103N、Y103Q、L104D、L104E、L104V、L104M、L104Y、L104W、L104F、L104H、G105D、G105E、I106E和I106Y。
商业地合成编码CTLA4蛋白的基因(Blue Heron Biotechnologies，Bothell，WA)，并亚克隆到包含人类IgG恒定区的哺乳动物表达载体pTT5中(Durocher Y等，2002，NucleicAcids Res 30[2]：E9)。在阿贝西普CTLA4-Ig(ab)之上使用
Figure BDA0001053204300000531
定点诱变方法利用定点诱变构建氨基酸修饰(Stratagene，La J0lla CA)。还构建贝拉西普CTLA4(A29Y/L104E)-Ig(ab)作为对照。对所有DNA测序来证实序列的保真性。使用lipo比ctamineTM(Invitrogen，Carlsbad CA)以6-孔板形式的小(3ml)规模将包含CTLA4-Ig基因的质粒转染到293E细胞(Durocher Y，等，2002，Nucleic Acids Res 30[2]：E9；BiotechnologyResearch Institute，National Research Council Canada)，并在FreeStyleTM 293培养基(Invitrogen，Carlsbad CA)中生长。生长5天后，直接从上清液筛选靶向结合的变体蛋白。生长5天后，通过蛋白A亲和性使用MabSelectTM树脂(GE Healthcare)从培养上清液纯化蛋白。
使用表面等离子共振筛选变体CTLA4-Ig Fc融合蛋白对B7-1和B7-2的结合。使用BiacoreTM 3000仪器(Biacore)进行结合测量。以抗His-tag mAb将传感器芯片衍生化，随后分别以100nM和200nM捕获B7-1-Ig或B7-2-Ig(都来自R&D Systems)1.5min。注入在HBS-EP缓冲液(Biacore)中的变体和对照CTLA4-Ig蛋白1min，随后解离2min。通过在注入受体之前将时间和响应调零并通过减去适当的非特异性信号(参考通道的响应和运行缓冲液的注入)来加工数据。使用BIAevaluation软件拟合解离传感图来获得解离率常数(解离率或kd或koff)。三次单独的结合实验的结果提供于表1，还有结合两种抗原的解离率的倍数改进或减少。
表1.CTLA4-Ig变体与B7-1和B7-2结合的解离率(koff)
Figure BDA0001053204300000551
Figure BDA0001053204300000561
Figure BDA0001053204300000571
解离率(koff)以科学E计数法显示，其中E代表乘以10的幂数；倍数B7-1＝结合B7-1的koff(阿贝西普)/koff(变体)；倍数B7-2＝结合B7-2的koff(阿贝西普)/koff(变体)；NB＝未观察到结合。
相对于阿贝西普的倍数(koff)的图显示在图6。如能够从表1和图6观察到的，多种取代显示比阿贝西普亲本蛋白慢的解离(更高结合)。
以较大规模再次表达具有比阿贝西普慢的对B7-1和/或B7-2的解离率的变体并如上所述地纯化。蛋白浓度通过在280nm的吸光度确定。使用一系列浓度的CTLA4-Ig蛋白以BiacoreTM测量对B7-1和B7-2的结合亲和性。将所有变体CTLA4-Ig蛋白标准化到1uM并通过蛋白A结合控制品质。如上产生抗His-芯片，将B7-1和B7-2分别以50nM固定1min和以100nM固定2min。从50nM开始2倍连续稀释CTLA4-Ig蛋白为25、12.5和6.25nM，注入1min，随后解离2min。使用BIAevaluation软件拟合动力学数据于1∶1结合模型(Langmnir)以提供解离率常数(kd或koff)、缔合率常数(ka或kon)、和平衡解离常数(KD或KD)。结合亲和性提供于表2(B7-1)和表3(B7-2)。
表2.CTLA4-Ig变体的B7-1结合亲和性和动力学常数
变体 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M) 倍数K<sub>D</sub>
阿贝西普 2.38E+06 1.84E-03 6.91E-10 1.00
贝拉西普 2.16E+06 7.75E-04 3.59E-10 1.92
A29K 9.18E+06 1.39E-03 1.52E-09 0.45
A29W 1.97E+06 1.42E-03 7.22E-10 0.96
A29Y 3.07E+06 1.26E-03 4.09E-40 1.69
A29H 2.34E+06 1.08E-03 4.62E-10 1.50
T51N 1.05E+06 3.16E-03 1.62E-09 0.43
M53Y 2.64E+06 1.18E-03 4.45E-10 1.55
L61D 3.26E+06 2.04E-03 6.26E-10 1.10
L61E 2.63E+06 1.65E-03 8.25E-10 1.11
L61G 2.76E+06 1.52E-03 5.49E-10 1.26
L61K 2.24E+06 1.85E-03 8.27E-10 0.84
L61N 2.60E+06 2.03E-03 7.82E-10 0.88
K93Q 2.57E+06 8.75E-04 3.40E-10 2.03
K93R 1.16E+06 1.47E-03 1.26E-09 0.55
K93V 1.15E+06 7.54E-04 6.55E-10 1.05
Y103D 2.01E+06 0.0105 5.24E-09 0.13
Y103E 2.45E-06 0.0143 5.85E-09 0.12
Y103N 2.14E+06 0.0188 8.77E-09 0.08
Y103Q 1.83E+06 8.17E-03 4.48E-09 0.15
L104D 5.57E+05 2.11E-03 3.79E-09 0.18
L104E 2.47E+06 8.90E-04 3.60E-10 1.92
L104V 2.54E+06 1.54E-03 6.05E-10 1.14
kon＝结合率；koff＝解离率；KD＝平衡解离常数；倍数KD＝KD(阿贝西普)/KD(变体)
表3.CTLA4-Ig变体的B7-2结合亲和性和动力学常数
变体 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M) 倍数K<sub>D</sub>
阿贝西普 3.64E+06 1.66E-02 4.55E-09 1.00
贝拉西普 3.35E+06 2.18E-03 6.52E-10 6.98
A29K 1.55E+06 3.96E-03 2.55E-09 1.78
A29W 3.28E+06 4.74E-03 1.44E-09 3.16
A29Y 4.45E+06 6.29E-03 1.41E-09 3.23
A29H 3.35E+06 3.42E-03 1.02E-09 4.46
T51N 2.86E+06 5.07E-03 1.77E-09 2.57
M53Y 3.90E+06 1.17E-02 3.01E-09 1.51
L61D 4.51E+06 1.55E-02 3.44E-09 1.32
L61E 4.18E+06 1.30E-02 3.11E-09 1.46
L61G 3.54E+06 2.05E-02 5.79E-09 0.79
L61K 2.63E+06 2.76E-02 1.05E-08 0.43
L61N 3.45E+06 2.01E-02 5.01E-09 0.78
K93Q 3.80E+06 8.43E-03 2.22E-09 2.05
K93R 1.79E+06 1.71E-02 9.55E-09 0.48
K93V 1.68E+06 1.22E-02 7.30E-09 0.62
Y103D 1.11E+06 9.28E-03 8.38E-09 0.54
Y103E 1.26E+06 8.38E-03 6.64E-09 0.89
Y103N 1.54E+06 0.0143 9.27E-09 0.49
Y103Q 1.53E+06 7.46E-03 4.89E-09 0.93
L104D 8.37E+06 1.75E-02 2.09E-08 0.22
L104E 3.83E+06 6.25E-03 1.59E-09 2.85
L104V 3.47E+06 1.47E-02 4.22E-09 1.08
kon＝结合率；koff＝解离率；KD＝平衡解离常数；倍数KD＝KD(阿贝西普)/KD(变体)
基于单取代筛选的结果，设计组合变体和另外的单取代变体的文库。新的变体列在表4和5。如上所述地构建、表达和纯化变体。如上所述地测量对B7靶的结合，且拟合的动力学速率常数和亲和性提供于表4(B7-1)和表5(B7-2)。
表4.CTLA4-Ig变体的B7-1结合亲和性和动力学常数
Figure BDA0001053204300000591
Figure BDA0001053204300000601
kon＝结合率；koff＝解离率；KD＝平衡解离常数；
倍数KD＝KD(阿贝西普)/KD(变体)；NB＝未检测到结合。
表5.CTLA4-Ig变体的B7-2结合亲和性和动力学常数
Figure BDA0001053204300000611
kon＝结合率；koff＝解离率；KD＝平衡解离常数；
倍数KD＝KD(阿贝西普)/KD(变体)；NB＝未检测到结合。
所有变体与阿贝西普和贝拉西普相比的CD80和CD86KD的图显示在图7。相对于阿贝西普亲本CTLA4-Ig，多种组合变体更紧密地结合B7-1(CD80)和B7-2(CD86)二者，提供对B7-1达3.6倍的结合改进和对B7-2达19.2倍的结合改进。对于B7-2结合最佳的三取代变体是T51N/L61E/K93Q(称为NEQ)，其改进B7-2亲和性从437pM至40pM，且改进B7-1亲和性从59pM至36pM。对于B7-2结合最佳的四取代变体是A29H/T51N/L61E/K93Q(称为HNEQ)，其改进B7-2亲和性从437pM至23pM，且改进B7-1亲和性从59pM至16pM。比较HNEQ变体与阿贝西普和贝拉西普的最高CTLA4-Ig浓度的传感图的图显示在图8。这些CTLA4变体和CTLA4-Ig变体蛋白的氨基酸序列提供于图9。
实施例2.具有更大的体外T细胞抑制活性的工程化的CTLA4-Ig变体
在基于细胞的检验中试验NEQ和HNEQ变体CTLA4-Ig蛋白抑制T细胞增殖的能力。运行阿贝西普、贝拉西普和对B7-1或B7-2无特异性的一种抗RSV IgG1抗体(阴性对照)作为对照。在这一检验中，使用抗CD3抗体OKT3和重组B7-2Fc融合体(R&D Systems)刺激T细胞激活和增殖。在4℃用PBS中的2ug/ml CD86-Fc和0.5ug/ml抗OKT3包被U形组织培养板过夜。用PBS洗涤板三次。人类外周血单核细胞(PBMC)利用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度(AmershamBiosciences，Newark，NJ)从匿名健康志愿者(HemaCare，VanNuys，CA)的白细胞去除术纯化。T细胞使用
Figure BDA0001053204300000621
人类T细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)从PBMC分离并以CSFE(10uM)标记T细胞。以4倍稀释的8种浓度加入CTLA4-Ig蛋白变体和对照，最高浓度为50ug/ml。样品运行双份。向包被的板加入～500,000个T细胞并在37℃培养4天。以CD86-Fc/OKT3包被的孔中的细胞和仅细胞(无包被)进行对照条件。培养4天后，使用FACSCanto2TM分析样品的FITC染色(CSFE)。图10中的数据显示，试验的CTLA4-Ig变体T51N/L61E/K93Q和A29H/T51N/L61E/K93Q优于亲本CTLA4-Ig阿贝西普，这与它们改进的B7-1和B7-2亲和性一致。而且，T51N/L61E/K93Q和A29H/T51N/L61E/K93Q变体二者显示相对于贝拉西普更大的抑制活性，这与它们更大的B7-2亲和性一致。
实施例3.对于延长的体内半衰期，具有对FcRn增强结合的CTLA4-Ig免疫粘附素
将CTLA4-Ig蛋白的Fc区工程化以增强对新生Fc受体FcRn的亲和性，目的是改进体内血清半衰期。改进FcRn结合和可能提供改进的药代动力学特征的Fc变体包括但不限于在位置259、307、308、311、378、426、428、434和436的取代，包括但不限于例如259I、307Q、308F、311I、311V、378V、378T、426V、428L、434S、434H、434F、434Y、434M、436I和436V(12/22/2008提交的USSN12/341,769，明确地通过引用并入本文)。增加Fc对FcRn结合的其他变体包括但不限于：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等2006Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等，Journal of BiologicalChemistry，2001，276(9)：6591-6604，通过引用全文并入)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H和308T/309P/311S(Dall Acqua等Journal ofImmunology，2002，169：5171-5180，Dall′Acqua等，2006，The Journal of BiologicalChemistry 281：23514-23524，通过引用全文并入)。
将提供增强的FcRn亲和性和延长的半衰期的取代M428L和N434S工程化为阿贝西普CTLA4-Ig(ab)、CTLA4-Ig(G2)贝拉西普、CTLA4(HNEQ)和CTLA4(NEQ)变体的Ig(G2-ELLG)形式的Fc区。这些CTLA4-Ig变体蛋白的氨基酸序列提供于图11。
如上所述地构建、表达和纯化CTLA4-Ig变体蛋白。使用BiacoreTM以抗原介导的免疫粘附素捕获/人类FcRn分析物形式使用BiacoreT M3000仪器(BiacoreTM)测量这些变体在pH 6.0对FcRn的亲和性。使用标准胺偶联方法将B7-1和B7-2分别以6500和8400RU的密度固定到CM5芯片上。将配体各自在pH 4.0乙酸盐缓冲液中稀释到200nM。用全强度的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)+N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化表面4min，随后以2ul/min注入B7-1或B7-2Fc融合配体(R&D Systems)持续15min。最后用乙醇胺封闭表面。CTLA4-Ig蛋白的捕获在pH 6.0磷酸盐缓冲液中以20nM(WT IgG1Fc)或10nM(M428L/N434S变体Fc)进行2分钟以分别实现1500或700的RU。然后在所示浓度以浓度500、250和125nM注入人类FcRn分析物溶液，随后在下一循环之前以pH 4.0乙酸盐+500mMNaCl缓冲液再生B7表面。由于B7上存在Fc-融合体，存在直接结合表面的hFcRn高背景，因此将一系列浓度的hFcRn注入未固定(空)表面以人工减去Biaevaluation分析期间的这一背景。减去背景/漂移和轴调零后，使用BIAevaluation软件(BiacoreTM)将传感图全面拟合于1∶1朗缪尔结合模型。
阿贝西普CTLA4-Ig(ab)和Fc工程化形式的CTLA4-Ig(ab-LS)(LS＝428L/434S)结合的代表性传感图显示在图12。阿贝西普CTLA4-Ig(ab)和CTLA4-Ig(G2)以及Fc工程化形式的CTLA4-Ig(ab-LS)和CTLA4-Ig(G2-LS)对FcRn结合的拟合的亲和性于表6中提供并绘制在图13中。结果证实Fc工程化形式的CTLA4-Ig蛋白对FcRn增强的亲和性，从而证实Fc变体形式对较长体内半衰期的潜力。
表6.CTLA4-Ig蛋白在pH 6.0对人类FcRn的结合亲和性
Figure BDA0001053204300000641
实施例4.在混合淋巴细胞反应中具有增强的T细胞抑制活性的CTLA4-Ig免疫粘附 素
选择对FcRn具有增强的结合的CTLA4-Ig变体来试验其T细胞抑制活性。在以上描述的基于细胞的检验中试验CTLA4-Ig蛋白，其中使用抗CD3抗体和B7-2Fc融合体刺激T细胞增殖。图14中的数据显示B7亲和性增强的CTLA4变体(T51N/L61E/K93Q和A29H/T51N/L61E/K93Q)连同FcRn亲和性增强的Fc变体(M428L/N434S)的强效和优良的抑制活性。
进一步测量CTLA4-Ig变体的T细胞抑制活性，通过在混合的淋巴细胞反应(还称为混合的白细胞反应或MLR)中试验它们。MLR是一种用于检验T辅助(TH)细胞增殖和用于产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)群的体外方法。当将同种异体的(不同MHC单元型)淋巴细胞一起培养时，TH细胞群扩大，随后CTL群扩大。MHC/TCR和B7/CD28共刺激途径对于同种异体反应是关键性的。使用白介素-2(IL-2)分泌来监控T细胞激活。在两个独立的实验中，使用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度(Amersham Biosciences，Newark，NJ)从两个不同匿名健康志愿者(HemaCare，VanNuys，CA)的白细胞去除术法纯化不同的两组人类PBMC。PBMC在各具有300ul RPMI 1640/10％FBS的孔中以～1.2×10E6每孔混合。在两个实验之一，混合来自供体2336和3070的PBMC，在另一实验中混合来自供体3070和3995的PBMC。CTLA4-Ig蛋白和抗RSV IgG1阴性对照以10点4×连续稀释来制备，并以所示终浓度添加于混合的PBMC。还运行单独的PBMC(独立地)作为对照。培养板6天。收集上清液，使用IL-2ELISA LegendMaxTM试剂盒(BioLegend)测量IL-2的浓度。检验结果提供于图15。
图15中的数据支持CTLA4-Ig变体的强效抑制活性、以及它们比
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(阿贝西普)的优越性。意外地，NEQ变体优于HNEQ变体，尽管HNEQ变体对B7-1和B7-2二者的亲和性更大(表4和5)。HNEQ变体相对于阿贝西普改进B7-1亲和性3.6倍和改进B7-2亲和性19.2倍，而NEQ变体相对于阿贝西普改进B7-1亲和性1.6倍和改进B7-2亲和性10.8倍。NEQ变体的更大T细胞抑制活性可能反映B7-1和B7-2在免疫应答中的不同生物作用。最近的研究已经证实，B7-2是CD28的主要配体，而B7-1是CTLA4的主要配体，此外B7-2不能向免疫突触募集CTLA-4(Collins等，2002，Immunity 17：201-210；Jansson等，2005，J Immunol 175：1575-1585)。由于内源CTLA4在下调T细胞方面的作用(Alegre等，2001，NatRevImmunol 1：220-8)，以及其在调节性T细胞(Treg)-介导的免疫应答阻遏中的作用(Sakaguchi等，2009，International Immunology 21[10]：1105-1111)，对优先啮合内源CTLA4的B7-1增加的亲和性可抑制天然抑制剂，从而促进T细胞激活。鉴于此，为了治疗目的，B7-2可以是待抑制的更重要配体，且相应地为了优化CTLA4的最佳变体可以是相对于B7-1对B7-2的亲和性的选择性增强。选择性地相对于B7-1改进对B7-2的亲和性的取代包括例如A29H、A29K、T51N、L61E和Y103Q。注意到为了实验目的，试验这一选择性假设可能从提供相反选择性的变体获益，即，相对于B7-2改进对B7-1的结合，包括例如K93V、L61Q和L104H。总体上结果表示，NEQ组合变体T51N/L61E/K93Q是在选择性方面的最佳变体，提供对B7-210.8倍的亲和性增强，但对B7-1仅少量地(1.6倍)更大结合。这一亲和性和选择性特征优于贝拉西普，贝拉西普改进对B7-2的亲和性仅6.5-7倍和对B7-1的亲和性仅2.3倍(表2-5)。
实施例5.新颖CTLA4-Ig免疫粘附素的体内活性
在小鼠中进行体内实验以试验工程化的CTLA4-Ig变体的活性。CTLA4-Ig蛋白抑制对破伤风的人类免疫应答的能力在移植有人类外周血白细胞(PBL)的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中进行。选择SCD小鼠作为这一研究的动物模型，是因为这些小鼠是免疫妥协的，将接受人类PBMC的移植。用于体内研究的CTLA4-Ig蛋白在CHO细胞(BiotechnologyResearch Institute，National Research Council Canada)中表达并如上所述地纯化。
人类外周血单核细胞(PBMC)从通过从随机供体收集的leukopack(Hemacare，VanNuys，CA)获得。通过Ficoll密度梯度离心(Ficoll-PaqueTM Plus，GE Healthcare)纯化PBMC，重悬在RPMI 1640(Mediatech)中并以3×107个细胞的剂量腹膜内(i.p.)注射。注射PBMC前一天，向小鼠i.p.注射100ul抗缺唾液酸基的GM(Wako，Richmond，VA)以耗竭鼠NK细胞。次日，i.p.注射小鼠0.5ml体积的3×107PBMC。共注射大约70只小鼠。注射细胞那天定义为研究第0天。所有动物在同一天被注射PBMC。
注射PBMC后，将小鼠随机分组并称重。在注射PBMC后第7天，经由眼眶后窦/脉络丛(OSP)穿刺从所有小鼠收集血液以确定人类IgG水平(hIgG ELISA，ZeptoMetrix，Buffalo，NY)。在收集血液后的同一天(第7天)，对小鼠i.p.注射1mg/kg试验品或注射PBS作为阴性对照。在整个研究中小鼠继续每3或4天接受注射。使用最近的体重测量结果注射以mg/kg计的试验品。在第9天，对小鼠i.p.注射15μg破伤风类毒素(List Biological Labs，Campbell，CA，目录号191B)或注射PBS。在第21天(抗原接种后12天)，从所有小鼠收集血液以确定人类IgG和抗破伤风IgG。
在PBMC移植后第7和21天利用眼眶后窦/脉络丛(OSP)收集血液样品(25-50u1)(利用局部丙美卡因麻醉剂和吸入剂异氟烷)。将血液样品转移到血清分离管，允许静置30min-1小时以允许血液凝结，然后在离心机中旋转(3500rpm持续30min)。将所得的血清转移到标有研究编号、日期、收集时间点的聚丙烯管中。将血清样品储存在-20℃。使用标准抗破伤风ELISA试剂盒(IBL-America)测量抗破伤风抗体(抗TT IgG)的血清浓度。
图16中的结果证实亲和性增强的NEQ变体CTLA4-Ig免疫粘附素相对于仅PBS+破伤风的活性。而且，数据显示，NEQ变体具有比亲本CTLA4-Ig阿贝西普更强效的抑制活性。这些数据支持本文描述的CTLA4-Ig变体用于治疗免疫相关病症的用途。
本文引用的所有参考文献通过引入明确地全文并入。尽管上文出于举例说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，然而本领域技术人员将领会，可以对细节进行许多改变而不背离如所附权利要求书所描述的本发明。
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Claims (18)

1.一种免疫粘附素，包括包含与SEQ ID NO:6相比的变体CTLA4的第一结构域和包含IgG Fc区或野生型Fc多肽的Fc变体区的第二结构域，其中所述变体CTLA4包括在天然CTLA4中的至少一种氨基酸修饰，其中所述至少一种氨基酸修饰为选自T51N、T51S、A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q、A29H/T51N/M53Y/K93Q、A29H/T51N/M53Y/L61E、T51N/M53Y/L61E/K93Q、A29H/T51N/L61E、T51N/M53Y/L61E、A29H/T51N、T51N/M53Y和T51N/K93Q的取代，其中所述变体CTLA4提供与SEQ ID NO:6相比的对B7-2增强的结合。
2.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/M53Y。
3.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/K93Q。
4.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/L61E/K93Q。
5.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括氨基酸取代的组合T51N/M53Y/L61E/K93Q。
6.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合A29H/T51N。
7.根据权利要求1所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/M53Y/L61E。
8.一种编码权利要求1-7中任一项所述的免疫粘附素的核酸。
9.一种包含权利要求8所述的核酸的宿主细胞。
10.一种制备免疫粘附素的方法，包括在其中产生所述免疫粘附素的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞。
11.一种免疫粘附素，包括包含与SEQ ID NO:6相比的变体CTLA4的第一结构域和包含野生型Fc多肽的Fc变体区的第二结构域，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/L61E/K93Q或A29H/T51N/L61E/K93Q，其中所述Fc变体包括在所述野生型Fc多肽的Fc区中的氨基酸取代M428L和N434S。
12.根据权利要求11所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合T51N/L61E/K93Q。
13.根据权利要求11所述的免疫粘附素，其中所述变体CTLA4包括取代的组合A29H/T51N/L61E/K93Q。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的免疫粘附素在制备用于治疗患有免疫相关病症的患者的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述免疫相关病症选自克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、银屑病、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎和移植排斥。
16.一种编码权利要求11-13中任一项所述的免疫粘附素的核酸。
17.一种包含权利要求16所述的核酸的宿主细胞。
18.一种制备免疫粘附素的方法，包括在其中产生所述免疫粘附素的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞。
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