RU2716421C2 - Доставка, применение и применения в терапии систем crispr-cas и композиций для целенаправленного воздействия на нарушения и заболевания с использованием вирусных компонентов - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложена композиция, содержащая один или несколько вирусных векторов, кодирующих систему CRISPR/Cas, для применения в лечении заболевания или расстройства мозга. Указанная система за счет наличия по меньшей мере одного сигнала ядерной локализации (NLS) позволяет осуществлять эффективное редактирование генома эукариотической клетки, в связи с чем она может быть использована для редактирования у млекопитающих генов, ассоциированных с заболеваниями мозга. 19 з.п. ф-лы, 85 ил., 18 табл., 40 пр.

Description

Родственные заявки и включение при помощи ссылки

Заявляется приоритет по предварительным заявкам на патенты США 61/836123, поданной 17 июня 2013 г., 61/847537, поданной 17 июля 2013 г., 61/862355, поданной 5 августа 2013 г., 61/871301, поданной 28 августа 2013 г., 61/915225, поданной 12 декабря 2013 г., 61/979879, поданной 15 апреля 2014 г., и PCT/US2013/074667, поданной 12 декабря 2013 г., относительно которых применительно к США настоящая заявка также является частично продолжающей; и, как может быть разрешено согласно законодательству США, ее эквивалент в США или на национальной фазе может дополнительно заявлять и заявляет приоритет по PCT/US2013/074667 и заявкам, по которым PCT/US2013/074667 заявляет приоритет.

Вышеприведенные заявки, и все документы, цитируемые в них или во время их рассмотрения (''документы, цитируемые в заявке''), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в заявке, и все документы, цитируемые или упомянутые в данном документе (''документы, цитируемые в данном документе''), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в данном документе, вместе с любыми инструкциями изготовителя, описаниями, характеристиками продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутыми в данном документе или в любом документе, включенном с помощью ссылки в данный документ, настоящим включены в данный документ с помощью ссылки и могут быть использованы в практическом осуществлении настоящего изобретения. Более конкретно, все упомянутые документы включены при помощи ссылки в такой же мере, как если бы конкретно и отдельно было указано, что каждый отдельный документ включен при помощи ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к доставке, конструированию, оптимизации и применениям в терапии систем, способов и композиций, используемых для контроля экспрессии генов, включающего целенаправленное воздействие на последовательность, такое как внесение изменений в геном или редактирование гена, связанное с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и их компонентами. В частности, настоящее изобретение относится к аспектам, связанным с доставкой на основе вирусного вектора, генной терапией при помощи доставки на основе вирусного вектора, а также пониманием функции генов и созданием моделей посредством доставки на основе вирусного вектора.

Заявление в отношении финансируемого из федерального бюджета исследования

Настоящее изобретение было разработано при правительственной поддержке в рамках NIH Pioneer Award (1DP1MH100706), выданного Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.

Предпосылки изобретения

Недавние достижения в технологиях секвенирования генома и способах анализа значительно ускорили возможность каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким разнообразием биологических функций и заболеваний. Точные технологии целенаправленного воздействия на геном необходимы для обеспечения систематичного обратного конструирования казуальных генетических изменений путем обеспечения возможности селективного внесения изменений в отдельные генетические элементы, а также для продвижения применений в области синтетической биологии, биотехнологии и медицины. Несмотря на то, что технологии редактирования генома, такие как использование ''дизайнерских'' ферментов с ''цинковыми пальцами'', эффекторов, подобных транскрипционным активаторам (TALE), или хоминг-мегануклеаз, доступны для осуществления внесения изменений в целевой геном, все еще существует необходимость в новых технологиях геномной инженерии, которые являются доступными, простыми в осуществлении, масштабируемыми и пригодными для целенаправленного воздействия на несколько положений в эукариотическом геноме.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение включает разработку и применение системы CRISPR/Cas9 в качестве инструмента для целенаправленного воздействия на последовательность, такого как внесение изменений в геном или генное редактирование генов или геномов, связанных с нарушениями и заболеваниями, с использованием вирусных компонентов.

Система CRISPR-Cas не требует создания специальных белков для целенаправленного воздействия на конкретные последовательности, а скорее один фермент Cas может быть запрограммирован короткой молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени. Добавление системы CRISPR-Cas к спектру технологий секвенирования и способам анализа генома может значительно упростить методику и ускорить возможность каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким спектром биологических функций и заболеваний. Для того, чтобы использовать систему CRISPR-Cas эффективно для редактирования генома без вредных воздействий, важно понимать аспекты конструирования, оптимизации и специфичной относительно типа клетки/ткани/органа доставки этих инструментов для геномной инженерии, которые являются аспектами заявленного изобретения.

Существует актуальная необходимость в альтернативных и функциональных системах и технологиях для целенаправленного воздействия на последовательность нуклеиновой кислоты с широким спектром применений. Аспекты настоящего изобретения удовлетворяют эту необходимость и предусматривают связанные с этим преимущества. Иллюстративный комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде. Направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.

В первом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью в представляющем интерес локусе генома, который может включать

доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, которая может содержать вирусную векторную систему, которая может содержать один или несколько вирусных векторов, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где композиция может содержать:

(А) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, которая может содержать векторную систему, которая может содержать один или несколько векторов, которые могут содержать

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью РНК системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность может содержать

(А) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке,

(b) парную tracr-последовательность и

(c) tracr-последовательность, и

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, который необязательно может содержать по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,

где (А), (b) и (c) расположены в 5'-3' ориентации,

где компоненты I и II находятся в одном и том же или разных векторах системы,

где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью; или

(В) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, которая может содержать векторную систему, которая может содержать один или несколько векторов, которые могут содержать

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с

(А) направляющей последовательностью, способной гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, и

(b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями,

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и

III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью,

где компоненты I, II и III находятся в одном и том же или разных векторах системы,

где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы применения одного или нескольких элементов системы CRISPR-Cas. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению обеспечивает эффективное средство модификации целевого полинуклеотида. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению характеризуется большим разнообразием полезных свойств, включающих модификацию (например, делецию, вставку, транслокацию, инактивацию, активацию) целевого полинуклеотида во множестве типов клеток в различных тканях и органах. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению как таковой имеет широкий спектр применений, например, в редактировании генов или генома, генной терапии, изыскании новых лекарственных средств, скрининге лекарственных средств, диагностике и прогнозировании заболеваний. Предусматриваются применения in vivo, in vitro и ex vivo.

Аспекты настоящего изобретения относятся к ферментам Cas9, обладающим улучшенной специфичностью целенаправленного воздействия в системе CRISPR-Cas9, имеющей направляющие РНК, характеризующиеся оптимальной активностью, имеющим меньшую длину, чем ферменты Cas9 дикого типа, и к кодирующим их молекулам нуклеиновых кислот, и к химерным ферментам Cas9, а также к способам улучшения специфичности целенаправленного воздействия фермента Cas9, или разработки системы CRISPR-Cas9, которые могут включать разработку или получение направляющих РНК, характеризующихся оптимальной активностью, и/или выбора или получения фермента Cas9, имеющего меньшие размер или длину, чем Cas9 дикого типа, при этом упаковка кодирующей его нуклеиновой кислоты в вектор доставки является более совершенной, поскольку в векторе доставки кодирующая его часть является меньшей, чем в случае Cas9 дикого типа, и/или создания химерных ферментов Cas9.

Также представлены применения последовательностей, векторов, ферментов или систем по настоящему изобретению в медицине. Также представлены их применения в редактировании генов или генома. Это относится к постмитотическим тканям или клеткам как in, так и ех vivo.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения фермент Cas9 может содержать одну или несколько мутаций и может применяться в качестве стандартного ДНК-связывающего белка, слитого или не слитого с функциональным доменом. Мутации могут быть мутациями, введенными искусственным образом, или мутациями с приобретением или потерей функции. Мутации могут включать, без ограничения, мутации в одном из каталитических доменов (D10 и Н840) среди каталитических доменов RuvC и HNH, соответственно. Были охарактеризованы дополнительные мутации. В одном аспекте настоящего изобретения домен активации транскрипции может представлять собой VP64. В других аспектах настоящего изобретения домен репрессии транскрипции может представлять собой KRAB или SID4X. Другие аспекты настоящего изобретения относятся к подвергнутому мутации ферменту Cas9, слитому с доменами, которые включают, без ограничения, активатор транскрипции, репрессор транскрипции, рекомбиназу, транспозазу, фактор ремоделирования гистонов, деметилазу, ДНК-метилтрансферазу, криптохром, домен, индуцируемый/регулируемый светом, или домен, индуцируемый/регулируемый химическими веществами.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы создания мутантной tracrRNA и последовательностей прямых повторов или мутантных химерных направляющих последовательностей, обеспечивающих повышение производительности этих РНК в клетках. Аспекты настоящего изобретения также предусматривают отбор указанных последовательностей.

Аспекты настоящего изобретения также предусматривают способы упрощения клонирования и доставки компонентов комплекса CRISPR. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения подходящий промотор, такой как промотор U6, амплифицируют с ДНК-олигонуклеотидом и добавляют к направляющей РНК. Полученным в результате продуктом ПЦР можно затем трансфицировать клетки для управления экспрессией направляющей РНК. Аспекты настоящего изобретения также относятся к направляющей РНК, транскрибированной in vitro или полученной от компании, проводящей синтез, и трансфицируемой напрямую.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы улучшения активности путем применения более активной полимеразы. В предпочтительном варианте осуществления экспрессия направляющих РНК под контролем промотора Т7 управляется экспрессией полимеразы Т7 в клетке. В преимущественном варианте осуществления клетка является эукариотической клеткой. В преимущественном варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой человека. В более предпочтительном варианте осуществления клетка человека является специфичной клеткой пациента.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы снижения токсичности ферментов Cas. В определенных аспектах фермент Cas представляет собой любой Cas9, описанный в данном документе, например, любой встречающийся в природе бактериальный Cas9, а также любые химерные формы, мутантные формы, гомологи или ортологи. В предпочтительном варианте осуществления Cas9 доставляют в клетку в форме мРНК. Это обеспечивает транзиентную экспрессию фермента со снижением, таким образом, токсичности. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также предусматривает способы экспрессии Cas9 под контролем индуцируемого промотора и конструкции, применяемые в них.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы улучшения in vivo применений системы CRISPR-Cas. В предпочтительном варианте осуществления фермент Cas представляет собой Cas9 дикого типа или любой из модифицированных вариантов, описанных в данном документе, в том числе любой встречающийся в природе бактериальный Cas9, а также любые химерные формы, мутантные формы, гомологи или ортологи. Преимущественный аспект настоящего изобретения предусматривает отбор гомологов Cas9, которые легко упаковываются в вирусные векторы для доставки. Ортологи Cas9, как правило, имеют общую структуру, включающую 3-4 домена RuvC и домен HNH. Наиболее близкий к 5'-концу домен RuvC расщепляет некомплементарную нить, а домен HNH расщепляет комплементарную нить. Все обозначения приведены в отношении направляющей последовательности.

Каталитический остаток в 5'-концевом домене RuvC идентифицируют посредством сравнения с целью поиска гомологии представляющего интерес Cas9 и других ортологов Cas9 (из локуса CRISPR типа II S. pyogenes, локуса 1 CRISPR S. thermophilus, локуса 3 CRISPR S. thermophilus и локуса CRISPR типа II Franciscilla novicida), и консервативный остаток Asp (D10) подвергают мутации по типу замены на аланин с превращением Cas9 в фермент, вносящий однонитевой разрыв в комплементарную нить. Аналогично, консервативные остатки His и Asn в доменах HNH подвергают мутации по типу замены на аланин с превращением Cas9 в фермент, вносящий однонитевой разрыв в некомплементарную нить. В некоторых вариантах осуществления можно осуществлять мутации из обеих групп для превращения Cas9 в неразрезающий фермент.

В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR представляет собой фермент CRISPR типа I или III, предпочтительно фермент CRISPR типа II. Этот фермент CRISPR типа II может быть любым ферментом Cas. Предпочтительный фермент Cas может быть идентифицирован как Cas9, поскольку он может относиться к общему классу ферментов, обладающих гомологией с самой большой нуклеазой с несколькими нуклеазными доменами системы CRISPR типа II. В наиболее предпочтительном случае фермент Cas9 получен или происходит из spCas9 или saCas9. Под происходящим заявители подразумевают, что в основе происходящего фермента главным образом лежит фермент дикого типа в том смысле, что он характеризуется высокой степенью гомологии последовательности с этим ферментом, но он был некоторым образом подвергнут мутации (модифицирован), как описано в данном документе.

Следует иметь в виду, что выражения Cas и фермент CRISPR обычно используются в данном документе взаимозаменяемо, если не очевидно иное. Как упоминается выше, большинство нумераций остатков, используемых в данном документе, относятся к ферменту Cas9 из локуса CRISPR типа II Streptococcus pyogenes. Однако следует иметь в виду, что настоящее изобретение включает многие другие Cas9 из других видов микроорганизмов, такие как SpCas9, SaCas9, St1Cas9 и т.д. Дополнительные примеры представлены в данном документе. Специалист в данной области будет способен определить надлежащие соответствующие остатки в ферментах Cas9, отличных от SpCas9, путем сравнения необходимых аминокислотных последовательностей. Таким образом, если конкретное аминокислотное замещение обозначается с помощью нумерации SpCas9, то если из контекста не очевидно, что это не предназначено для применения в отношении других ферментов Cas9, подразумевается, что настоящее раскрытие охватывает соответствующие модификации в других ферментах Cas9. Особенно предпочтительными ферментами Cas9 являются SpCas или SaCas9.

Пример кодон-оптимизированной последовательности, в данном случае оптимизированной для человека (т.е. оптимизированной для экспрессии у человека), представлен в данном документе, см. кодон-оптимизированную последовательность SaCas9 для человека. Хотя это является предпочтительным, следует иметь в виду, что возможны другие примеры, и что для вида-хозяина известна оптимизация кодонов.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы усиления функционирования Cas9 посредством образования химерных белков Cas9. Химерные белки Cas9 - химерные Cas9 - могут быть новыми Cas9, содержащими фрагменты из более чем одного встречающегося в природе Cas9. Эти способы могут включать слияние N-концевых фрагментов одного гомолога Cas9 с С-концевыми фрагментами другого гомолога Cas9. Эти способы также обеспечивают отбор новых свойств, проявляемых химерными белками Cas9.

Следует иметь в виду, что в способах по настоящему изобретению, где организм представляет собой животное или растение, модификация может иметь место ex vivo или in vitro, например, в клеточной культуре, и в ряде случаев не in vivo. В других вариантах осуществления она может иметь место in vivo.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью в представляющем интерес локусе генома, включающий

доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей:

А) - I. полинуклеотидную последовательность РНК системы CRISPR-Cas, необязательно полинуклеотидную последовательность химерной РНК (chiRNA), где полинуклеотидная последовательность может содержать:

(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке,

(b) парную tracr-последовательность и

(c) tracr-последовательность, и

II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,

где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации,

где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК,

или

(В) I. полинуклеотиды, которые могут содержать:

(a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, и

(b) по меньшей мере одну или несколько парных tracr-последовательностей,

II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, и

III. полинуклеотидную последовательность, которая может содержать tracr-последовательность,

где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК.

В некоторых вариантах осуществления, что применимо к любому или ко всем аспектам, предусмотренным в данном документе, предпочтительной является вторая вышеуказанная альтернатива (В). Однако первая альтернатива (А) является особенно предпочтительной. Это применимо ко всем аспектам настоящего изобретения, представляющих два альтернативных подхода с CRISPR.

Следует иметь в виду, что настоящая заявка направлена на доставку на основе вирусного вектора, вне зависимости от того, направлена ли она в орган как таковой, или ткань в нем, или просто на одну или несколько целевых клеток. Целевыми клетками являются клетки, выбранные для доставки системы CRISPR-Cas. Например, в случае доставки в печень такие целевые клетки могут представлять собой гепатоциты, предпочтительно первичные гепатоциты. Целевые клетки печени могут содержаться в позвоночном животном, являющимся пациентом (в том смысле, что животное нуждается в генной терапии под управлением CRISPR) или модельным организмом, или могут находиться в клеточной культуре, органоиде или другой ткани ex vivo, такой как ''печень на чипе'', например, где гепатоциты высевают и выращивают на подложке. Гепатоциты, взятые из нетрансплантированных органов, также являются применимой целевой клеткой. С учетом развития методик 3D-печати, применяемых в биологии, напечатанные ткани находятся в пределах доступности, и целенаправленное воздействие вполне возможно осуществить также и в клетках или тканях печени, напечатанных таким образом для создания органоида или находящихся на чипе. Пояснения в данном документе, касающиеся гепатоцитов, можно равным образом применять к другим клеткам печени и, в действительности, к клеткам других типов в целом, таким как клетки головного мозга или почки, примеры которых предусмотрены в данном документе.

Таким образом, предусмотрен модельный организм, который может содержать клетки печени, такие как гепатоциты, в которые была доставлена система CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Аналогично, также представлена совокупность ех vivo двух или более клеток печени, таких как гепатоциты, в которые была доставлена система CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Такие совокупности могут включать органы печени, органоиды печени, клетки печени, заселяющие подложку ('печень на чипе'). И в этом случае, конечно, предусмотрены не относящиеся к печени альтернативы, такие как головной мозг или почка, и хотя печень является предпочтительной, она представлена в данном документе в качестве примера. Также представлены способы создания таких моделей или совокупностей.

В частности, такие целевые клетки могут экспрессировать или содержать полинуклеотиды, способные к экспрессии фермента Cas. Как обсуждается в данном документе, преимуществом этого является обеспечение готовой модели для исследования функций генов посредством внесения изменений в гены, в том числе нокдауна. Это является особенно применимым при изучении состояний печени, таких как амилоидоз и другие, перечисленные в данном документе, а также более общих состояний, таких как ожирение.

В данном документе также представлены способы исследования функций генов в печени. Они обычно включают доставку системы CRISPR-Cas в целевые клетки, находящиеся in или ex vivo. Однако если клетки уже содержат Cas, экспрессируемый в виде белка или кодируемый полинуклеотидами, уже содержащимися в клетках, тогда необходимо доставить только полинуклеотид CRISPR. Способ может включать извлечение из целевой ткани, органа, органоида, чипа или совокупности клеток и, необязательно, повторное введение обратно в них, как обсуждается в данном документе. Под доставкой, в действительности, подразумевают физическую доставку полинуклеотидов в ядро клетки, а также трансфекцию.

Также предусмотрены способы генной терапии. Например, коррекцию одного или нескольких дефектных генотипов (например, одиночных точечных мутаций) можно осуществить посредством применения системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в клетках печени, обсуждаемых в данном документе (в том числе в моделях). Моногенные состояния, связанные с печенью, являются особенно предпочтительными и проиллюстрированы на примере в данном документе, см. пример 38, в котором мишенью системы CRISPR-Cas9, для которой она была эффективной в индукции фенотипического изменения in vivo, являлся АроВ, ген, участвующий в метаболизме липидов. Также представлены композиции для применения в генной терапии.

Состояния для исследования и генной терапии являются многочисленными и варьируют из-за широкого применения технологии CRIPS-Cas. Подходящие примеры представлены в данном документе, в том числе в таблицах А, В и С. Любой из них можно выбрать, и каждый из них является предпочтительным. Некоторыми особенно предпочтительными, но неограничивающими примерами являются состояния, конкретно приведенные в качестве примера в данном документе, а также любое моногенное состояние и, в частности, муковисцидоз (CFTR).

Хотя предусмотрены различные ферменты Cas, Cas9 является особенно предпочтительным, и заявителями была продемонстрирована особенная эффективность SaCa9 в печени. Tracr-последовательность из Sa также является предпочтительной, если фермент Cas является ферментом SaCas. Подходящим РАМ в данном случае является NNGRR.

Хотя можно применять одну направляющую последовательность, так называемое мультиплексирование с двумя, тремя, четырьмя или более направляющими последовательностями является особенно применимым в исследовании функций генов и создании моделей (с получением нокдауна нескольких генов), а также в генной терапии, когда коррекции подлежат несколько дефектных генотипов (несколько ошибок в одном гене либо, с большей долей вероятности, несколько ошибок, распределенных среди нескольких генов). Альтернативно, мультиплексирование с двумя направляющими последовательностями применимо в подходе с двойной никазой для снижения частоты нецелевых эффектов или попросту для отбора нескольких мишеней в одном гене для обеспечения привлечения Cas. Предпочтительными являются тройные и четверные направляющие последовательности. В данном документе на ген и локус генома ссылаются взаимозаменяемо.

Также применимым в этом отношении является подход с интроном, описанный в данном документе, где направляющая последовательность расположена в интроне Cas.

Предпочтительные средства доставки включают способы, описанные Kanasty ниже, такие как LNP, особенно если доставке подлежит только направляющая последовательность или она подлежит доставке в отдельности. Тем не менее, как правило, предпочтительными являются вирусные векторы, в том числе лентивирусный вектор и вектор на основе AAV. В частности, они являются предпочтительными для доставки в печень, поскольку до сих пор они были успешными. Среди них предпочтительным является AAV и особенно серотип 8, при этом было показано, что AAV2/8 является эффективным.

Некоторые предпочтительные целевые состояние и гены, при условии, что они присутствуют, или состояния печени или почки означают нарушения метаболизма, такие как любое из следующих: амилоидная невропатия (TTR, PALB); амилоидоз (АРОА1, АРР, ААА, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); цирроз (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, ТЕХ292, KIAA1988); муковисцидоз (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); болезни накопления гликогена (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); аденома печени, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), печеночная недостаточность с ранним началом и с неврологическим нарушением (SCOD1, SCO1), недостаточность печеночной липазы (LIPC), гепатобластома, рак и виды эпителиомы (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, ТР53, Р53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, МСН5); заболевание по типу медуллярной кистозной нефропатии (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); фенилкетонурия (РАН, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); поликистоз почек и печени (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Другие предпочтительные мишени включают любой один или несколько из PCSK9; Hmgcr; SERPINA1; АроВ и/или LDL.

Следует иметь в виду, что способы изменения экспрессии в целевой клетке могут не включать изменение в зародышевой линии, которое может быть исключено по моральным соображениям. В действительности, хотя трансфекция стволовых клеток предусмотрена и, безусловно, является предпочтительной в некоторых вариантах осуществления, нестволовые клетки (т.е. постмитотические клетки) являются особенно предпочтительными, в особенности если они могут проявлять некоторую регенерацию или могут быть простимулированы для ее проявления, как наблюдается у гепатоцитов.

CRISPR типа II являются особенно предпочтительными, в частности, для применения у эукариот, как в данном случае, поскольку, в любом случае, печень обнаруживается только у эукариот, в частности, у позвоночных животных.

Применение систем CRISPR-Cas для того, чтобы вызвать фенотипическое изменение, в частности in vivo, является особенным преимуществом.

Если предусмотрены применения в терапии или другая геномная инженерия в целевых клетках, то при необходимости коррекции следует иметь в виду, что после внесения однонитевого разрыва в геномную ДНК-мишень или ее расщепления предпочтительной является последующая коррекция посредством пути HDR. Для нокдауна генов преимущественным является NHEJ, однако для терапии предпочтительной является коррекция посредством пути HDR. В таких случаях предпочтительной является доставка матрицы для репарации. Она наиболее предпочтительно представляет собой ssDNA, хотя также возможно использование РНК посредством ретровирусного вектора, обеспечивающего соответствующую ДНК-матрицу. Специалист в данной области может без труда осуществлять настоящее изобретение на практике на основании изложенных в данном документе идей, вносящих вклад в уровень техники; и в этом отношении упоминается, что специалист в данной области на основании изложенных в данном документе идей, вносящих вклад в уровень техники, может без труда понимать и внедрять соображения, касающиеся длины гомологичных плеч. Упомянуты патентные заявки и публикации, в том числе автора Zhang, включенные в данный документ, в том числе цитируемые в данном документе. Матрицу для репарации предпочтительно доставляют совместно с одним или несколькими элементами системы CRISPR-Cas.

Также представлен способ изменения экспрессии по меньшей мере одного продукта гена в печени, который может включать введение в эукариотическую клетку, содержащую и экспрессирующую молекулу ДНК, имеющую последовательность целевой клетки и кодирующую продукт гена, сконструированной не встречающейся в природе системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и CRISPR-ассоциированных генов (Cas) (CRISPR-Cas), которая может содержать один или несколько векторов, которые могут содержать:

a) первый регуляторный элемент, функционирующий в эукариотической клетке, функционально связанный по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей направляющую РНК системы CRISPR-Cas, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и

b) второй регуляторный элемент, функционирующий в эукариотической клетке, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок Cas9 типа II,

где компоненты (а) и (b) находятся в одном и том же или в разных векторах системы, в результате чего направляющая РНК осуществляет нацеливание на целевую последовательность, а белок Cas9 расщепляет молекулу ДНК, в результате чего экспрессия по меньшей мере одного продукта гена в печени изменяется; и где белок Cas9 и направляющая РНК не встречаются вместе в естественных условиях.

Приведенную далее ссылку на мишени понимают как ссылку на гены или клетки, но, как правило, гены, если не очевидно иное.

Следующее относится в равной степени ко всем аспектам настоящего изобретения. Если в данном документе упоминают печень, это понимают как ссылку на постмитотические клетки в целом, в частности, клетки почки или головного мозга. Целевая последовательность наиболее предпочтительно представляет собой целевую последовательность постмитотической клетки. Постмитотическая клетка может находиться в или происходить из (т.е. источник клетки или тип клетки) какого-либо одного из следующих органов или может представлять собой органоиды или модели ех vivo или совокупности клеток, содержащие клетки

почки, такие как клетки гломерулы;

пищеварительной системы, в том числе желудка, поджелудочной железы, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и/или толстой кишки;

сердца;

легкого;

головного мозга, в частности нейроны, и/или CNS в целом;

глаза, в том числе ткани сетчатки;

уха, в том числе внутреннего уха;

кожи;

мышцы;

кости и/или

печени в целом, хотя она исключена в некоторых вариантах осуществления, поскольку она также является объектом отдельной заявки.

Головной мозг и почка являются особенно предпочтительными. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку головного мозга, такую как нейрон. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку почки.

Предпочтительные клетки почки включают любую одну или несколько из

париетальной клетки гломерулы почки;

подоцита гломерулы почки;

клетки с щеточной каемкой проксимального канальца почки;

клетки тонкого сегмента петли Генле;

клетки толстого восходящего колена;

клетки дистального канальца почки;

клетки собирающего протока почки и

интерстициальных клеток почки.

Предпочтительные примеры целевых клеток представлены в приведенной ниже таблице, в соответствующем разделе, озаглавленном, например, 'почка', или 'печень', или 'кость', или 'ухо', любые из которых являются предпочтительными, а также в таблице В. Предпочтительными являются любая одна или несколько из данных мишеней. Примеры 1 и 18 также направлены на клетки почки (хотя и стволовые клетки, которые не являются постмитотическими клетками), но в них может быть применима идея касательно доставки.

В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления манипуляция вызывает фенотипическое изменение в клетке.

В некоторых вариантах осуществления фенотипическое изменение можно вызывать или поддерживать в клетке in vivo. Клетку либо трансфицируют in vivo, либо извлекают, трансфицируют ех vivo и затем повторно вводят (трансплантируют) обратно тому же или другому хозяину.

Экспрессия фермента CRISPR и необязательно направляющей последовательности может находиться под контролем промотора, специфичного для клетки, например содержащегося в кассете экспрессии, способной экспрессировать фермент и необязательную направляющую последовательность в указанной постмитотической клетке. Другими словами, фермент CRISPR и необязательно направляющая последовательность функционально связан(ы) с указанным промотором, специфичным для целевой клетки.

Целевая клетка может представлять собой постмитотическую клетку. Векторные системы на основе AAV являются особенно предпочтительными, главным образом, когда постмитотическая клетка представляет собой нейрон. Также предпочтительными являются соматические клетки.

Промотор для фермента CRISPR и необязательный промотор для направляющей последовательности могут быть одинаковыми или разными.

Обсуждение в данном документе, в частности следующее, также относится к любому способу, применению или композиции, описанным в данном документе. РНК системы CRISPR-Cas может представлять собой химерную РНК (chiRNA). Система CRISPR-Cas может представлять собой мультиплексную ферментную систему CRISPR, дополнительно содержащую несколько химер и/или несколько направляющих последовательностей для нескольких мишеней и одну tracr-последовательность. Фермент CRISPR может представлять собой нуклеазу, управляющую расщеплением обеих нитей в определенной точке целевой последовательности. Фермент CRISPR может содержать одну или несколько мутаций. Фермент CRISPR может содержать одну или несколько мутаций D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A или D986A. Одна или несколько мутаций могут присутствовать в домене RuvC1 фермента CRISPR. Фермент CRISPR может представлять собой никазу, управляющую расщеплением в определенной точке целевой последовательности. Никаза может представлять собой двойную никазу. Предпочтительными являются по меньшей мере две или более NLS.

Фермент CRISPR может относиться к типу II, предпочтительно представляет собой Cas и наиболее предпочтительно Cas9. Ссылку на Cas или Cas9 (например, в CRISPR-Cas или CRISPR Cas9) следует понимать как ссылку на любой Cas, наиболее предпочтительно Cas9, и, в частности, на Sa- или SpCas9 (охватывающие все мутации, такие как D10A, для обеспечения DSB, функцию никазы или двойной никазы).

Фермент CRISPR может иметь одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где фермент дополнительно содержит функциональный домен. Функциональный домен может представлять собой домен активации транскрипции. Домен активации транскрипции может представлять собой VP64.

Способы могут дополнительно включать сведение к минимуму нецелевых модификаций посредством манипуляции с первой и второй целевыми последовательностями на противоположных нитях ДНК-дуплекса в представляющем интерес локусе генома в клетке, что предусматривает

доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей:

I. полинуклеотидную последовательность химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит:

(a) первую направляющую последовательность, способную гибридизироваться с первой целевой последовательностью,

(b) первую парную tracr-последовательность,

(c) первую tracr-последовательность,

(d) вторую направляющую последовательность, способную гибридизироваться со второй целевой последовательностью,

(e) вторую парную tracr-последовательность и

(f) вторую tracr-последовательность, и

где необязательно между первой tracr-последовательностью и второй направляющей последовательностью находится линкерная последовательность, в результате чего первая направляющая последовательность и вторая направляющая последовательность расположены последовательно; и

II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации, где (а), (b), (с), (d), (е) и (f) расположены в 5'-3' ориентации, где полинуклеотидная последовательность содержит линкерную последовательность между первой tracr-последовательностью и второй направляющей последовательностью, в результате чего первая направляющая последовательность и вторая направляющая последовательность расположены последовательно, и где при транскрипции первая и вторая парные tracr-последовательности гибридизируются с первой и второй tracr-последовательностями, соответственно, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно,

или

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и где компоненты I и II находятся в одном и том же или разных векторах системы, и при транскрипции первая парная tracr-последовательность гибридизируется с первой tracr-последовательностью, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно;

где первый комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) первой направляющей последовательностью, которая гибридизируется с первой целевой последовательностью, и (2) первой парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с первой tracr-последовательностью,

где второй комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) второй направляющей последовательностью, которая гибридизируется со второй целевой последовательностью, и (2) второй парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется со второй tracr-последовательностью,

где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК, и

где первая направляющая последовательность управляет расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность управляет расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, индуцируя двухнитевой разрыв, с модификацией таким образом организма или отличного от человеческого организма путем сведения к минимуму нецелевых модификаций.

В некоторых вариантах осуществления вторая вышеуказанная альтернатива (В) является предпочтительной. Однако первая альтернатива (А) является особенно предпочтительной. Это применимо ко всем аспектам настоящего изобретения, представляющих два альтернативных подхода с CRISPR.

Следует иметь в виду, что настоящая заявка направлена на постмитотические клетки вне зависимости от того, представляют ли они орган как таковой, или ткань в нем, или просто одну или несколько постмитотических клеток, таких как нейроны. Нейроны и клетки почки являются предпочтительными. Постмитотические клетки могут содержаться в позвоночном животном, являющимся пациентом (в том смысле, что животное нуждается в генной терапии под управлением CRISPR) или модельным организмом, или могут находиться в клеточной культуре, органоиде или другой ткани ex vivo, такой как ''печень на чипе'', например, где гепатоциты высевают и выращивают на подложке. Гепатоциты, взятые из нетрансплантированных органов, также являются применимой мишенью. С учетом развития методик 3D-печати, применяемых в биологии, напечатанные ткани находятся в пределах доступности, и целенаправленное воздействие вполне возможно осуществить также и в клетках или тканях печени, напечатанных таким образом для создания органоида или находящихся на чипе. Также предусмотрены отличные от печени альтернативы, в частности, для тканей почки или других постмитотических клеток/тканей.

Таким образом, представлен модельный организм, содержащий постмитотические клетки, такие как нейроны или клетки почки, в которые была доставлена система CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Аналогично, также представлена совокупность ex vivo двух или более постмитотических клеток, таких как нейроны или клетки почки, в которые была доставлена система CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Такие совокупности могут включать постмитотические органы, органоиды, клетки, заселяющие подложку ('почка на чипе'). Также представлены способы создания таких моделей или совокупностей.

В частности, такие постмитотические клетки могут экспрессировать или содержать полинуклеотиды, способные экспрессировать фермент Cas. Как обсуждается в данном документе, преимуществом этого является обеспечение готовой модели для исследования функций генов посредством внесения изменений в гены, в том числе нокдауна. Это является особенно применимым при изучении состояний постмитотических клеток, например, клеток почки или головного мозга, таких как перечисленные в данном документе, а также более общих состояний, таких как ожирение.

В данном документе также представлены способы исследования функций генов постмитотической клетки. Они обычно включают доставку системы CRISPR-Cas в постмитотические клетки, находящиеся in или ех vivo. Однако если клетки уже содержат Cas, экспрессируемый в виде белка или кодируемый полинуклеотидами, уже содержащимися в клетках, тогда необходимо доставить только полинуклеотид CRISPR. Способ может включать извлечение из постмитотической клетки и необязательно повторное введение обратно в нее. Под доставкой, в действительности, подразумевают физическую доставку полинуклеотидов в ядро клетки, а также трансфекцию. Следовательно, доставку также следует понимать как включающую трансфекцию, если не очевидно иное.

Также представлен способ индукции внесения изменений в гены в одной или нескольких животных или растительных клетках, включающий трансдукцию первой популяции клеток системой CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению с изменением, таким образом, генома первой популяции клеток и получением второй популяции клеток. Способ можно осуществлять ех vivo или in vitro, например, в клеточной культуре или в модели ех vivo или in vitro (такой как органоид или 'животная или растительная клетка на чипе'). Альтернативно, способ можно осуществлять in vivo, и в этом случае он может также включать выделение первой популяции клеток из субъекта и трансплантацию второй популяции клеток (обратно) субъекту. Внесение изменений в гены может производиться в отношении одного или нескольких, или двух или более, или трех или более, или четырех или более генов. Внесение изменений в гены может представлять собой ослабление функционирования гена (т.е. активности кодируемого продукта гена). Его можно индуцировать, например, путем изменения генома первой популяции клеток с получением второй популяции клеток, где вторая популяция клеток имеет дефектный генотип, как, например, при моногенном состоянии, которое отсутствует у первой популяции клеток. Для него может требоваться соответствующая матрица для репарации, обсуждаемая в данном документе, для получения дефектной последовательности, или его можно осуществлять посредством индукции DSB. В частности, внесение изменений в гены представляет собой нокдаун генов. В некоторых вариантах осуществления животная или растительная клетка наиболее предпочтительно представляет собой постмитотическую клетку, такую так клетка почки или головного мозга (нейрон) или клетку печени, такую как первичный гепатоцит.

Альтернативно, внесение изменений в гены может представлять собой усиление функционирования гена (т.е. активности кодируемого продукта гена). Его можно индуцировать, например, путем изменения генома первой популяции клеток с получением второй популяции клеток, где первая популяция клеток имеет дефектный генотип, как, например, при моногенном состоянии, которое отсутствует (т.е. подвергнуто коррекции) у второй популяции клеток. Для него может требоваться соответствующая матрица для репарации, обсуждаемая в данном документе, для получения скорректированной последовательности.

Если применяется мультиплексирование, то предусматривается комбинация ослабления функционирования одного или нескольких генов и усиление функционирования одного или нескольких генов. Этого можно достичь путем обеспечения одной или нескольких направляющих последовательностей (в мультиплексе) и соответствующих матриц для репарации, которые можно применять для ослабления функционирования, и в то же время одну или несколько направляющих последовательностей и соответствующих им матриц для репарации можно применять для усиления функционирования.

Также представлен способ исследования функций одного или нескольких генов в одной или нескольких животных или растительных клетках, включающий определение изменений экспрессии одного или нескольких генов в первой популяции животных или растительных клеток, индукцию указанного внесения изменений в гены в указанной первой популяции с получением указанной второй популяции с измененным геномом (или генотипом) и определение изменений экспрессии одного или нескольких генов во второй популяции животных или растительных клеток с исследованием, таким образом, функций одного или нескольких генов. В некоторых вариантах осуществления животная или растительная клетка наиболее предпочтительно представляет собой постмитотическую клетку, такую так клетка почки или головного мозга (нейрон) или клетку печени, такую как первичный гепатоцит.

Также представлена модель и способ создания такой модели. Моделью может являться животное, содержащее животную или растительную клетку (модель in vivo), или она может представлять собой модель ех vivo или in vitro, такую как животный или растительный органоид, или 'животную или растительную клетку на чипе', или совокупность животных или растительных клеток, как, например, на подложке, как описано в данном документе. Животные или растительные клетки любой модели предпочтительно трансфицируют с помощью Cas9. Соответственно, конкретно представлена модель, содержащая одну или несколько животных или растительных клеток, содержащих фермент CRISPR, предпочтительно Cas9, такой как Sa- или SpCas9. Модельные клетки могут быть трансфицированы или трансдуцированы вторым регуляторным элементом, представленным в данном документе, который является вторым регуляторным элементом, функционально связанным с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS). Как описано выше, модель может представлять собой модель in vivo, или она может представлять собой модель ех vivo или in vitro. Такая модель позволяет проводить быстрое исследование функций одного или нескольких генов, поскольку для изменения функций указанного гена необходима доставка только полинуклеотидной последовательности из системы CRISPR-Cas (содержащей одну или несколько направляющих последовательностей, осуществляющих нацеливание на указанные один или несколько генов). Другими словами, способы исследования функций генов в таких моделях могут включать только доставку полинуклеотидной последовательности из системы CRISPR-Cas (содержащей одну или несколько направляющих последовательностей), при этом наличие Cas (фермента CRISPR) в клетке(клетках) модели уже было обеспечено. Также представлены способы создания таких моделей, включающие трансдукцию или трансфекцию одной или нескольких животных или растительных клеток в первой популяции животных или растительных клеток вторым регуляторным элементом, функционально связанным с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), как описано в данном документе, с получением, таким образом, одной или нескольких животных или растительных клеток второй популяции, содержащих или экспрессирующих фермент CRISPR. В некоторых вариантах осуществления животная или растительная клетка наиболее предпочтительно представляет собой постмитотическую клетку, такую так клетка почки или головного мозга (нейрон) или клетку печени, такую как первичный гепатоцит.

Также представлены способы создания моделей с внесенными изменениями в генах, в частности, моделей с нокдауном генов. Эти способы обычно могут включать индукцию внесения изменений в гены в одном или нескольких генах, как описано в данном документе, в первой популяции клеток с получением, таким образом, второй популяции клеток с измененным геномом (или генотипом). Вторую популяцию клеток можно затем высеять на подложку или на чип, например, с получением, таким образом, модели ex vivo или in vitro. Альтернативно, вторая популяция может содержаться в животном in vivo.

Также предусмотрены способы генной терапии. Например, коррекцию одного или нескольких дефектных генотипов (например, одиночных точечных мутаций) можно осуществить посредством применения системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в постмитотических клетках, обсуждаемых в данном документе (в том числе в моделях). Моногенные состояния, связанные с постмитотическими клетками, являются особенно предпочтительными и проиллюстрированы в данном документе, см. пример 36, в котором мишенью системы CRISPR-Cas9, для которой она была эффективной в индукции фенотипического изменения in vivo, являлся АроВ, ген, участвующий в метаболизме липидов. Пример 38 также является наглядным в отношении фенотипических изменений поведения, наблюдаемых in vivo в головном мозге мышей, трансдуцированных системой по настоящему изобретению. Также представлены композиции для применения в генной терапии.

Хотя предусмотрены различные ферменты Cas, Cas9 является особенно предпочтительным, и авторами настоящего изобретения была продемонстрирована особенная эффективность SaCa9 в печени. Tracr-последовательность из Sa также является предпочтительной, если фермент Cas является ферментом SaCas. Подходящим РАМ в данном случае является NNGRR.

Хотя можно применять одну направляющую последовательность, так называемое мультиплексирование с двумя, тремя, четырьмя или более направляющими последовательностями является особенно применимым в исследовании функций генов и создании моделей (с получением нокдауна нескольких генов), а также в генной терапии, когда коррекции подлежат несколько дефектных генотипов (либо несколько ошибок в одном гене, либо, с большей долей вероятности, несколько ошибок, распределенных среди нескольких генов). Альтернативно, мультиплексирование с двумя направляющими последовательностями применимо в подходе с двойной никазой для снижения частоты нецелевых эффектов или попросту для отбора нескольких мишеней в одном гене для обеспечения привлечения Cas. Предпочтительными являются тройные и четверные направляющие последовательности. В данном документе на ген и локус генома ссылаются взаимозаменяемо.

Также применимым в этом отношении является подход с интроном, описанный в данном документе, где направляющая последовательность расположена в интроне Cas.

Предпочтительные средства доставки включают способы, описанные Kanasty ниже, такие как LNP, особенно если доставке подлежит только направляющая последовательность или она подлежит доставке в отдельности. Тем не менее, для печени, как правило, предпочтительными являются вирусные векторы, в том числе лентивирусные и на основе AAV, поскольку до сих пор они были успешными. Среди них предпочтительным является AAV и особенно серотип 8, при этом было показано, что AAV2/8 является эффективным. Некоторые предпочтительные мишени, при условии, что они присутствуют, или состояния почки представляют собой нарушения метаболизма, такие как любое из следующих: амилоидная невропатия (TTR, PALB); амилоидоз (АРОА1, АРР, ААА, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); цирроз (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); муковисцидоз (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); болезни накопления гликогена (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); аденома печени, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), печеночная недостаточность с ранним началом и с неврологическим нарушением (SCOD1, SCO1), недостаточность печеночной липазы (LIPC), гепатобластома, рак и виды эпителиомы (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, ТР53, Р53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, МСН5); заболевание по типу медуллярной кистозной нефропатии (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); фенилкетонурия (РАН, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); поликистоз почек и печени (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Другие предпочтительные мишени включают какую-либо одну или несколько из PCSK9, HMGCR, АРОВ, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, ААТ, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, ОТС, ARH.

Следует иметь в виду, что способы изменения экспрессии в постмитотической клетке не включают изменение в зародышевой линии, которое может быть исключено по моральным соображениям. В действительности, хотя трансфекция стволовых клеток предусмотрена и является безусловно предпочтительной в некоторых вариантах осуществления, нейроны или клетки почки являются особенно предпочтительными, в особенности если они могут проявлять некоторую регенерацию или могут быть стимулированы для ее проявления.

CRISPR типа II являются особенно предпочтительными, в частности, для применения у эукариот, как в данном случае, поскольку, в любом случае, печень обнаруживается только у эукариот, в частности, у позвоночных животных.

Применение систем CRISPR-Cas для того, чтобы вызвать фенотипическое изменение, в частности in vivo, является особенным преимуществом. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали это в настоящей заявке.

Если предусмотрены применения в терапии или другая геномная инженерия в постмитотических клетках, то при необходимости коррекции следует иметь в виду, что после внесения однонитевого разрыва в геномную ДНК-мишень или ее расщепления предпочтительной является последующая коррекция посредством пути HDR. Для нокдауна генов преимущественным является NHEJ, однако для терапии предпочтительной является коррекция посредством пути HDR. В таких случаях предпочтительной является доставка матрицы для репарации. Она наиболее предпочтительно представляет собой ssDNA, хотя также возможно использование РНК посредством ретровирусного вектора, обеспечивающего соответствующую ДНК-матрицу. Специалист в данной области может без труда осуществлять настоящее изобретение на практике на основании изложенных в данном документе идей, вносящих вклад в уровень техники; и в этом отношении упоминается, что специалист в данной области на основании изложенных в данном документе идей, вносящих вклад в уровень техники, может без труда понимать и внедрять соображения, касающиеся длины гомологичных плеч. Упомянуты патентные заявки и публикации, в том числе автора Zhang, включенные в данный документ, в том числе цитируемые в данном документе. Матрицу для репарации предпочтительно доставляют совместно с одним или несколькими элементами системы CRISPR-Cas.

Также представлен способ изменения экспрессии по меньшей мере одного продукта гена постмитотической клетки, включающий введение в эукариотическую клетку печени, например, гепатоцит, содержащую и экспрессирующую молекулу ДНК, имеющую целевую последовательность и кодирующую продукт гена, сконструированной не встречающейся в природе системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и CRISPR-ассоциированных генов (Cas) (CRISPR-Cas), содержащей один или несколько векторов, содержащих:

а) первый регуляторный элемент, функционирующий в эукариотической клетке, функционально связанный по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей направляющую РНК системы CRISPR-Cas, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и

b) второй регуляторный элемент, функционирующий в эукариотической клетке, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок Cas9 типа II,

где компоненты (а) и (b) находятся в одном и том же или в разных векторах системы, в результате чего направляющая РНК осуществляет нацеливание на целевую последовательность, а белок Cas9 расщепляет молекулу ДНК, в результате чего экспрессия по меньшей мере одного продукта гена постмитотической клетки изменяется; и где белок Cas9 и направляющая РНК не встречаются вместе в естественных условиях.

Мишени, на которые ссылаются ниже, понимают как постмитотические клетки-мишени или гены, экспрессируемые иным образом в постмитотической клетке, если не очевидно иное.

Любая или все из полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент CRISPR, направляющей последовательности, парной tracr-последовательности или tracr-последовательности могут представлять собой РНК. Полинуклеотиды, кодирующие последовательность, кодирующую фермент CRISPR, направляющую последовательность, парную tracr-последовательность или tracr-последовательность, могут представлять собой РНК, и их могут доставлять посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.

Следует иметь в виду, что если ссылаются на полинуклеотид, который представляет собой РНК и, как говорят, 'содержит' признак, такой как парная tracr-последовательность, то последовательность РНК содержит данный признак. Если полинуклеотид представляет собой ДНК и, как говорят, содержит признак, такой как парная tracr-последовательность, то последовательность ДНК транскрибируется или может быть транскрибирована в РНК, содержащую признак, о котором идет речь. Если признак представляет собой белок, такой как фермент CRISPR, то упоминаемая последовательность ДНК или РНК транслируется или может быть транслирована (а в случае ДНК сначала транскрибируется).

Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ модификации организма (например, путем модификации постмитотических клеток организма), например, млекопитающего, в том числе человека, или отличного от человека млекопитающего или организма путем манипуляции с целевой последовательностью в представляющем интерес локусе генома, включающий доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей вирусную или плазмидную векторную систему, содержащую один или несколько вирусных или плазмидных векторов, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где композиция содержит: (А) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит (а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность и (с) tracr-последовательность, и II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации (или необязательно по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации, поскольку некоторые варианты осуществления могут не включать NLS), где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации, где компоненты I и II находятся в одном и том же или разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, или (В) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с (а) направляющей последовательностью, способной гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, и (b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями, II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью, где компоненты I, II и III находятся в одном и том же или разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления компоненты I, II и III находятся в одном и том же векторе. В других вариантах осуществления компоненты I и II находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент III находится в другом векторе. В других вариантах осуществления компоненты I и III находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент II находится в другом векторе. В других вариантах осуществления компоненты II и III находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент I находится в другом векторе. В других вариантах осуществления каждый из компонентов I, II и III находится в отдельном векторе. Настоящее изобретение также предусматривает вирусную или плазмидную векторную систему, описанную в данном документе.

Вектор предпочтительно представляет собой вирусный вектор, как, например, векторы на основе лентивируса, или бакуловируса, или, предпочтительно, аденовируса/аденоассоциированного вируса, но известны и предусмотрены другие средства доставки (такие как дрожжевые системы, микропузырьки, генные пушки/средства прикрепления векторов к наночастицам золота). В некоторых вариантах осуществления один или несколько вирусных или плазмидных векторов можно доставлять посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.

Под манипуляцией с целевой последовательностью заявители также подразумевают эпигенетическую манипуляцию с целевой последовательностью. Она может осуществляться в отношении состояния хроматина целевой последовательности, как, например, путем модификации состояния метилирования целевой последовательности (т.е. добавление или устранение метилирования, или паттернов метилирования, или CpG-островков), модификации гистонов, повышения или снижения доступности целевой последовательности, или путем активации укладки в 3D-структуру.

Следует иметь в виду, что если ссылаются на способ модификации организма или млекопитающего, в том числе человека или отличного от человека млекопитающего или организма, путем манипуляции с целевой последовательностью в представляющем интерес локусе генома, тогда его можно использовать в отношении организма (или млекопитающего) в целом или всего лишь одной клетки или популяции клеток из этого организма (если организм является многоклеточным). В случае человека, например, заявители предусматривают, помимо прочего, одну клетку или популяцию клеток, и их можно предпочтительно модифицировать ex vivo и затем вводить обратно. В этом случае может быть необходим биоптат или другой образец ткани или биологической жидкости. Стволовые клетки также являются особенно предпочтительными в этом отношении. Но, разумеется, также предусматриваются варианты осуществления in vivo.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или подавления состояния, вызванного дефектом в целевой последовательности в представляющем интерес локусе генома у субъекта (например, млекопитающего или человека) или отличного от человека субъекта (например, млекопитающего), нуждающегося в этом, включающий модификацию субъекта или отличного от человека субъекта путем манипуляции с целевой последовательностью, и где состояние является чувствительным к лечению или подавлению путем манипуляции с целевой последовательностью, включающий обеспечение лечения, предусматривающего: доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей векторную систему на основе AAV или лентивируса, содержащую один или несколько векторов на основе AAV или лентивируса, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где манипуляцию с целевой последовательностью осуществляют с помощью композиции при ее экспрессии, где композиция содержит: (А) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит (а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность и (с) tracr-последовательность, и II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации (или необязательно по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации, поскольку некоторые варианты осуществления могут не включать NLS), где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации, где компоненты I и II находятся в одном и том же или разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, или (В) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с (а) направляющей последовательностью, способной гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, и (b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями, II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью, где компоненты I, II и III находятся в одном и том же или разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления компоненты I, II и III находятся в одном и том же векторе. В других вариантах осуществления компоненты I и II находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент III находится в другом векторе. В других вариантах осуществления компоненты I и III находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент II находится в другом векторе. В других вариантах осуществления компоненты II и III находятся в одном и том же векторе, тогда как компонент I находится в другом векторе. В других вариантах осуществления каждый из компонентов I, II и III находится в отдельном векторе. Настоящее изобретение также предусматривает вирусную (например, на основе AAV или лентивируса) векторную систему, описанную в данном документе, и она может быть частью векторной системы, описанной в данном документе.

Некоторые способы по настоящему изобретению могут включать индукцию экспрессии. В некоторых способах по настоящему изобретению организм или субъект является эукариотом (в том числе млекопитающим, в том числе человеком), или отличным от человека эукариотом, или отличным от человека животным, или отличным от человека млекопитающим. В некоторых вариантах осуществления организм или субъект является отличным от человека животным и может быть членистоногим, например, насекомым, или может быть нематодой. В некоторых способах по настоящему изобретению организм или субъект является растением. В некоторых способах по настоящему изобретению организм или субъект является млекопитающим или отличным от человека млекопитающим. Отличное от человека млекопитающее может быть, например, грызуном (предпочтительно мышью или крысой), копытным или приматом. В некоторых способах по настоящему изобретению организм или субъект является водорослью, в том числе микроводорослью, или является грибом. В некоторых способах по настоящему изобретению вирусный вектор представляет собой AAV или лентивирус и может быть частью векторной системы, описанной в данном документе. В некоторых способах по настоящему изобретению фермент CRISPR представляет собой Cas9. В некоторых способах по настоящему изобретению экспрессия направляющей последовательности находится под контролем промотора Т7 и управляется экспрессией полимеразы Т7.

Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает способ доставки фермента CRISPR, включающий доставку в клетку мРНК, кодирующей фермент CRISPR. В некоторых из данных способов фермент CRISPR представляет собой Cas9.

Настоящее изобретение также предусматривает способы получения векторных систем по настоящему изобретению, в частности, вирусных векторных систем, описанных в данном документе. Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает способ получения AAV по настоящему изобретению, включающий трансфекцию плазмиды(плазмид), содержащей молекулу(молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующую AAV, или по сути состоящей из нее, в клетки, инфицированные AAV, и обеспечение rep и/или cap AAV, обязательных для репликации и упаковки AAV. В некоторых вариантах осуществления rep и/или cap AAV, обязательные для репликации и упаковки AAV, обеспечивают путем трансфекции клеток плазмидой-помощником(плазмидами-помощниками) или вирусом-помощником(вирусами-помощниками). В некоторых вариантах осуществления вирусом-помощником является поксвирус, аденовирус, герпесвирус или бакуловирус. В некоторых вариантах осуществления поксвирус представляет собой вирус осповакцины. В некоторых вариантах осуществления клетки являются клетками млекопитающих. А в некоторых вариантах осуществления клетки являются клетками насекомых, а вирус-помощник представляет собой бакуловирус. В других вариантах осуществления вирус представляет собой лентивирус.

У растений патогены часто являются специфичными по отношению к хозяину. Например, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici вызывает фузариозный вилт томата, но поражает только томат, а F. oxysporum f. dianthii и Puccinia graminis f. sp. tritici поражают только пшеницу. Растения обладают присущими и индуцированными защитными реакциями, обеспечивающими устойчивость к большинству патогенов. Мутации и события рекомбинации в поколениях растений приводят к генетической изменчивости, которая обуславливает восприимчивость, тем более, что патогены размножаются с большей частотой, чем растения. У растений может наблюдаться устойчивость видов, не относящихся к хозяевам, например, хозяин и патоген являются несовместимыми. Также может наблюдаться горизонтальная устойчивость, например, частичная устойчивость ко всем расам патогена, обычно контролируемая многими генами, и вертикальная устойчивость, например, полная устойчивость к некоторым расам патогена, но не к другим расам, обычно контролируемая несколькими генами. На уровне взаимодействия генов растения и патогены эволюционируют совместно, а генетические изменения одного уравновешивают изменения другого. Соответственно, используя естественную изменчивость, селекционеры комбинируют гены, наиболее полезные для урожайности, качества, однородности, выносливости, устойчивости. Источники генов устойчивости включают нативные или чужеродные сорта, старинные сорта, родственные дикорастущие растения и индуцированные мутации, например, при обработке растительного материала мутагенными средствами. Применяя настоящее изобретение, селекционеры растений получают новый инструмент для индукции мутаций. Соответственно, специалист в данной области может проанализировать геном источников генов устойчивости, а в отношении сортов, имеющих желаемые характеристики или признаки, использовать настоящее изобретение для индукции появления генов устойчивости с большей точностью, чем в случае применявшихся ранее мутагенных средств, и, следовательно, для ускорения и улучшения программ селекции растений.

Настоящее изобретение дополнительно охватывает композицию по настоящему изобретению или ее фермент CRISPR (в том числе, или альтернативно, мРНК, кодирующую фермент CRISPR) для применения в медицине или в терапии. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает композицию согласно настоящему изобретению или ее фермент CRISPR (в том числе, или альтернативно, мРНК, кодирующую фермент CRISPR) для применения в способе согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает применение композиции по настоящему изобретению или ее фермента CRISPR (в том числе, или альтернативно, мРНК, кодирующей фермент CRISPR) в редактировании генов или генома ex vivo. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает применение композиции по настоящему изобретению или ее фермента CRISPR (в том числе, или альтернативно, мРНК, кодирующей фермент CRISPR) в производстве лекарственного препарата для редактирования генов или генома ех vivo или для применения в способе согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает композицию по настоящему изобретению или ее фермент CRISPR (в том числе, или в альтернативном случае, мРНК, кодирующую фермент CRISPR), где целевая последовательность фланкирована на своем 3'-конце РАМ-последовательностью (мотивом, прилегающим к протоспейсеру), содержащей 5'-концевой мотив, особенно если Cas9 получен из (или происходит из) Cas9 S. pyogenes или S. aureus. Например, подходящий РАМ представляет собой 5'-NRG или 5'-NNGRR (где N представляет собой любой нуклеотид) для ферментов SpCas9 или SaCas9 (или происходящих из них ферментов), соответственно, как отмечено ниже.

Следует иметь в виду, что SpCas9 или SaCas9 получены или происходят из Cas9 S. pyogenes или S. aureus. Они, разумеется, могут быть подвергнуты мутации или иным образом изменены по сравнению с диким типом для соответствия предполагаемому применению, описанному в данном документе. Предпочтительными являются мутантная форма или вариант двойной никазы D10A, особенно в комбинации с двумя перекрывающимися направляющими последовательностями, ориентированными как противоположные сайты в разных нитях одной и той же хромосомы.

Аспекты настоящего изобретения охватывают улучшение специфичности опосредованного ферментом CRISPR, например, Cas9, целенаправленного воздействия на гены и снижение вероятности нецелевой модификации ферментом CRISPR, например, Cas9. Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает способ модификации организма или отличного от человеческого организма посредством сведения к минимуму нецелевых модификаций путем манипуляции с первой и второй целевыми последовательностями на противоположных нитях ДНК-дуплекса в представляющем интерес локусе генома в клетке, включающий доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, которая может содержать:

I. первую полинуклеотидную последовательность химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где первая полинуклеотидная последовательность содержит:

(a) первую направляющую последовательность, способную гибридизироваться с первой целевой последовательностью,

(b) первую парную tracr-последовательность и

(c) первую tracr-последовательность,

II. вторую полинуклеотидную последовательность chiRNA системы CRISPR-Cas, где вторая полинуклеотидная последовательность может содержать:

(a) вторую направляющую последовательность, способную гибридизироваться со второй целевой последовательностью,

(b) вторую парную tracr-последовательность и

(с) вторую tracr-последовательность, и

III. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, который может содержать по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации и содержит одну или несколько мутаций, где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации, где при транскрипции первая и вторая парные tracr-последовательности гибридизируются с первой и второй tracr-последовательностями, соответственно, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно, где первый комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) первой направляющей последовательностью, которая гибридизируется с первой целевой последовательностью, и (2) первой парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с первой tracr-последовательностью, где второй комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс со (1) второй направляющей последовательностью, которая гибридизируется со второй целевой последовательностью, и (2) второй парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется со второй tracr-последовательностью, где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК, и где первая направляющая последовательность управляет расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность управляет расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, индуцируя двухнитевой разрыв, с модификацией таким образом организма или отличного от человеческого организма посредством сведения к минимуму нецелевых модификаций.

В некоторых способах по настоящему изобретению любая или все из полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент CRISPR, первой и второй направляющих последовательностей, первой и второй парных tracr-последовательностей или первой и второй tracr-последовательностей представляет собой/представляют собой РНК. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие последовательность, кодирующую фермент CRISPR, первую и вторую направляющие последовательности, первую и вторую парные tracr-последовательности или первую и вторую tracr-последовательности, представляют собой РНК, и их доставляют посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения первая и вторая парные tracr-последовательности обладают 100% идентичностью, и/или первая и вторая tracr-последовательности обладают 100% идентичностью. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержаться в векторной системе, содержащей один или несколько векторов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фермент CRISPR представляет собой фермент Cas9, например, SpCas9. В аспекте настоящего изобретения фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где одна или несколько мутаций выбраны из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и D986A. В особенно предпочтительном варианте осуществления фермент CRISPR имеет мутацию D10A. В предпочтительных вариантах осуществления первый фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций, вследствие которых фермент является ферментом, вносящим однонитевой разрыв в комплементарную нить, а второй фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций, вследствие которых фермент является ферментом, вносящим однонитевой разрыв в некомплементарную нить. Альтернативно, первый фермент может являться ферментом, вносящим однонитевой разрыв в некомплементарную нить, а второй фермент может являться ферментом, вносящим однонитевой разрыв в комплементарную нить.

В предпочтительных способах по настоящему изобретению первая направляющая последовательность, управляющая расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, и вторая направляющая последовательность, управляющая расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, обуславливают возникновение ''липкого'' 5'-конца. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит не более 200 пар оснований, предпочтительно не более 100 пар оснований или более предпочтительно не более 50 пар оснований. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит по меньшей мере 26 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 30 пар оснований или более предпочтительно 34-50 пар оснований. Перекрывание наиболее предпочтительно охватывает от 5 до -1 пары оснований.

Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает способ модификации организма или отличного от человеческого организма посредством сведения к минимуму нецелевых модификаций путем манипуляции с первой и второй целевыми последовательностями на противоположных нитях ДНК-дуплекса в представляющем интерес локусе генома в клетке, включающий доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих:

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с

(а) первой направляющей последовательностью, способной гибридизироваться с первой целевой последовательностью, и

(b) no меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями,

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный со

(a) второй направляющей последовательностью, способной гибридизироваться со второй целевой последовательностью, и

(b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями,

III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и

IV. четвертый регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью,

где компоненты I, II, III и IV находятся в одном и том же или в разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно, где первый комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) первой направляющей последовательностью, которая гибридизируется с первой целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, где второй комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс со (1) второй направляющей последовательностью, которая гибридизируется со второй целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК, и где первая направляющая последовательность управляет расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность управляет расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, индуцируя двухнитевой разрыв, с модификацией таким образом организма или отличного от человеческого организма посредством сведения к минимуму нецелевых модификаций.

Настоящее изобретение также предусматривает векторную систему, описанную в данном документе. Система может содержать один, два, три или четыре различных вектора. Компоненты I, II, III и IV могут, таким образом, находиться в одном, двух, трех или четырех различных векторах, и в данном документе предусмотрены все комбинации возможных местоположений компонентов, например: компоненты I, II, III и IV могут находиться в одном и том же векторе; каждый из компонентов I, II, III и IV может находиться в отдельном векторе; компоненты I, II, III и IV могут находиться в общей сложности в двух или трех различных векторах, при этом предусмотрены все комбинации местоположений, и т.п.

В некоторых способах по настоящему изобретению любая или все из полинуклеотидной последовательности, кодирующей фермент CRISPR, первой и второй направляющих последовательностей, первой и второй парных tracr-последовательностей или первой и второй tracr-последовательностей представляет собой/представляют собой РНК. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения первая и вторая парные tracr-последовательности обладают 100% идентичностью, и/или первая и вторая tracr-последовательности обладают 100% идентичностью. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фермент CRISPR представляет собой фермент Cas9, например, SpCas9. В аспекте настоящего изобретения фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где одна или несколько мутаций выбраны из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и D986A. В особенно предпочтительном варианте осуществления фермент CRISPR имеет мутацию D10A. В предпочтительных вариантах осуществления первый фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций, вследствие которых фермент является ферментом, вносящим однонитевой разрыв в комплементарную нить, а второй фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций, вследствие которых фермент является ферментом, вносящим однонитевой разрыв в некомплементарную нить. Альтернативно, первый фермент может являться ферментом, вносящим однонитевой разрыв в некомплементарную нить, а второй фермент может являться ферментом, вносящим однонитевой разрыв в комплементарную нить. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения один или несколько вирусных векторов доставляют посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.

В предпочтительных способах по настоящему изобретению первая направляющая последовательность, управляющая расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, и вторая направляющая последовательность, управляющая расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, обуславливают возникновение ''липкого'' 5'-конца. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит не более 200 пар оснований, предпочтительно не более 100 пар оснований или более предпочтительно не более 50 пар оснований. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит по меньшей мере 26 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 30 пар оснований или более предпочтительно 34-50 пар оснований.

Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления охватывает способ модификации представляющего интерес локуса генома посредством сведения к минимуму нецелевых модификаций путем введения в клетку, содержащую и экспрессирующую двухнитевую молекулу ДНК, кодирующую представляющий интерес продукт гена, сконструированной не встречающейся в природе системы CRISPR-Cas, содержащей белок Cas, имеющий одну или несколько мутаций, и две направляющие РНК, которые осуществляют нацеливание на первую нить и вторую нить молекулы ДНК, соответственно, при этом направляющие РНК осуществляют нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, а белок Cas вносит однонитевой разрыв в каждую из первой нити и второй нити молекулы ДНК, кодирующей продукт гена, в результате чего экспрессия продукта гена изменяется; и где белок Cas и две направляющие РНК не встречаются вместе в естественных условиях.

В предпочтительных способах по настоящему изобретению белок Cas вносит однонитевой разрыв в каждую из первой нити и второй нити молекулы ДНК, кодирующей продукт гена, что обуславливает возникновение ''липкого'' 5'-конца. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит не более 200 пар оснований, предпочтительно не более 100 пар оснований или более предпочтительно не более 50 пар оснований. В вариантах осуществления настоящего изобретения ''липкий'' 5'-конец содержит по меньшей мере 26 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 30 пар оснований или более предпочтительно 34-50 пар оснований.

Варианты осуществления настоящего изобретения также охватывают направляющие РНК, содержащие направляющую последовательность, слитую с парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью. В аспекте настоящего изобретения белок Cas является кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке, предпочтительно в клетке млекопитающего или клетке человека. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения белок Cas представляет собой белок системы CRISPR-Cas типа II, например, белок Cas9. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas представляет собой белок Cas9, например, SpCas9. В аспектах настоящего изобретения белок Cas имеет одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и D986A. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas имеет мутацию D10A.

Аспекты настоящего изобретения относятся к снижению экспрессии продукта гена, или к дополнительному введению матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или к точному вырезанию вставочной последовательности путем обеспечения повторного отжига и лигирования двух ''липких'' 5'-концов, или к изменению активности или функционирования продукта гена, или к повышению экспрессии продукта гена. В варианте осуществления настоящего изобретения продукт гена представляет собой белок.

Настоящее изобретение также охватывает сконструированную не встречающуюся в природе систему CRISPR-Cas, содержащую белок Cas с одной или несколькими мутациями, и две направляющие РНК, которые осуществляют нацеливание на первую нить и вторую нить, соответственно, двухнитевой молекулы ДНК, кодирующей продукт гена в клетке, при этом направляющие РНК осуществляют нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, а белок Cas вносит однонитевой разрыв в каждую из первой нити и второй нити молекулы ДНК, кодирующей продукт гена, в результате чего экспрессия продукта гена изменяется; и где белок Cas и две направляющие РНК не встречаются вместе в естественных условиях.

В аспектах настоящего изобретения направляющие РНК могут содержать направляющую последовательность, слитую с парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью. В варианте осуществления настоящего изобретения белок Cas представляет собой белок системы CRISPR-Cas типа II. В аспекте настоящего изобретения белок Cas является кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке, предпочтительно в клетке млекопитающего или клетке человека. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения белок Cas представляет собой белок системы CRISPR-Cas типа II, например, белок Cas9. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas представляет собой белок Cas9, например, SpCas9. В аспектах настоящего изобретения белок Cas имеет одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и D986A. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas имеет мутацию D10A.

Аспекты настоящего изобретения относятся к снижению экспрессии продукта гена, или к дополнительному введению матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или к точному вырезанию вставочной последовательности путем обеспечения повторного отжига и лигирования двух ''липких'' 5'-концов, или к изменению активности или функционирования продукта гена, или к повышению экспрессии продукта гена. В варианте осуществления настоящего изобретения продукт гена представляет собой белок.

Настоящее изобретение также охватывает сконструированную не встречающуюся в природе векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих:

а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с каждой из двух направляющих РНК системы CRISPR-Cas, которые осуществляют нацеливание на первую нить и вторую нить, соответственно, двухнитевой молекулы ДНК, кодирующей продукт гена,

b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с белком Cas,

где компоненты (а) и (b) находятся в одном и том же или разных векторах системы, при этом направляющие РНК осуществляют нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, а белок Cas вносит однонитевой разрыв в каждую из первой нити и второй нити молекулы ДНК, кодирующей продукт гена, в результате чего экспрессия продукта гена изменяется; и где белок Cas и две направляющие РНК не встречаются вместе в естественных условиях.

В аспектах настоящего изобретения направляющие РНК могут содержать направляющую последовательность, слитую с парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью. В варианте осуществления настоящего изобретения белок Cas представляет собой белок системы CRISPR-Cas типа II. В аспекте настоящего изобретения белок Cas является кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке, предпочтительно в клетке млекопитающего или клетке человека. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения белок Cas представляет собой белок системы CRISPR-Cas типа II, например, белок Cas9. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas представляет собой белок Cas9, например, SpCas9. В аспектах настоящего изобретения белок Cas имеет одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и D986A. В особенно предпочтительном варианте осуществления белок Cas имеет мутацию D10A.

Аспекты настоящего изобретения относятся к снижению экспрессии продукта гена, или к дополнительному введению матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или к точному вырезанию вставочной последовательности путем обеспечения повторного отжига и лигирования двух ''липких'' 5'-концов, или к изменению активности или функционирования продукта гена, или к повышению экспрессии продукта гена. В варианте осуществления настоящего изобретения продукт гена представляет собой белок. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения векторы системы являются вирусными векторами. В дополнительном варианте осуществления векторы системы доставляют посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления указанного целевого полинуклеотида с модификацией таким образом целевого полинуклеотида, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление включает расщепление одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности указанным ферментом CRISPR. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление приводит к сниженной транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает репарацию указанного расщепленного целевого полинуклеотида при помощи гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, где указанная репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или нескольких нуклеотидов указанного целевого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или нескольким аминокислотным заменам в белке, экспрессируемом с гена, содержащего целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает доставку одного или нескольких векторов в указанную эукариотическую клетку, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности. В некоторых вариантах осуществления указанные векторы доставляют в эукариотическую клетку, находящуюся в субъекте. В некоторых вариантах осуществления указанная модификация имеет место в указанной эукариотической клетке, находящейся в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение указанной эукариотической клетки из субъекта перед указанной модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает возвращение указанной эукариотической клетки и/или клеток, полученных из субъекта, указанному субъекту.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с полинуклеотидом, вследствие чего указанное связывание приводит к повышенной или пониженной экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает доставку одного или нескольких векторов в указанные эукариотические клетки, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения модельной эукариотической клетки, содержащей подвергнутый мутации ген, ответственный за развитие заболевания. В некоторых вариантах осуществления ген, ответственный за развитие заболевания, является любым геном, ассоциированным с повышением риска наличия или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) введение одного или нескольких векторов в эукариотическую клетку, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности; и (b) обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления целевого полинуклеотида в указанном гене, ответственном за развитие заболевания, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, таким образом, получая модельную эукариотическую клетку, содержащую подвергнутый мутации ген, ответственный за развитие заболевания. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление включает расщепление одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности указанным ферментом CRISPR. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление приводит к сниженной транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает репарацию указанного расщепленного целевого полинуклеотида при помощи гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, где указанная репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или нескольких нуклеотидов указанного целевого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или нескольким аминокислотным заменам при экспрессии белка с гена, содержащего целевую последовательность.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ отбора одной или нескольких прокариотических клеток путем введения одной или нескольких мутаций в ген в одной или нескольких прокариотических клетках, при этом способ включает введение одного или нескольких векторов в прокариотическую(прокариотические) клетку(клетки), где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, tracr-последовательности и матрицы редактирования; где матрица редактирования содержит одну или несколько мутаций, которые прекращают расщепление ферментом CRISPR; обеспечение гомологичной рекомбинации матрицы редактирования с целевым полинуклеотидом в отбираемой(отбираемых) клетке(клетках); обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления целевого полинуклеотида в указанном гене, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, где связывание комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом индуцирует гибель клеток, с обеспечением, таким образом, отбора одной или нескольких прокариотических клеток, в которые были введены одна или несколько мутаций. В предпочтительном варианте осуществления фермент CRISPR представляет собой Cas9. В другом аспекте настоящего изобретения отбираемая клетка может представлять собой эукариотическую клетку, такую как постмитотиеская эукариотическая клетка. Аспекты настоящего изобретения обеспечивают возможность отбора конкретных клеток без необходимости наличия маркера отбора или двухстадийного способа, который может включать систему негативного отбора.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевьм полинуклеотидом для осуществления расщепления указанного целевого полинуклеотида с модификацией таким образом целевого полинуклеотида, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. Способ включает повышение или снижение экспрессии целевого полинуклеотида при помощи комплекса CRISPR, который связывается с полинуклеотидом.

При желании для осуществления модификации экспрессии в клетке один или несколько векторов, содержащих tracr-последовательность, направляющую последовательность, связанную с парной tracr-последовательностью, последовательность, кодирующую фермент CRISPR, доставляют в клетку. В некоторых способах один или несколько векторов содержат регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент CRISPR, содержащий последовательность ядерной локализации; и регуляторный элемент, функционально связанный с парной tracr-последовательностью и одним или несколькими сайтами встраивания для встраивания направляющей последовательности выше парной tracr-последовательности. При экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в клетке. Как правило, комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью.

В некоторых способах целевой полинуклеотид можно инактивировать для осуществления модификации экспрессии в клетке. Например, при связывании комплекса CRISPR с целевой последовательностью в клетке целевой полинуклеотид инактивируется, вследствие чего последовательность не транскрибируется, кодируемый белок не продуцируется, или последовательность не функционирует так, как последовательность дикого типа. Например, последовательность, кодирующую белок или микроРНК, можно инактивировать, вследствие чего белок не будет продуцироваться.

В определенных вариантах осуществления фермент CRISPR содержит одну или-несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A или D986A, и/или одна или несколько мутаций находятся в домене RuvC1 или HNH фермента CRISPR или представляют собой другую мутацию, обсуждаемую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где фермент дополнительно содержит функциональный домен. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой домен активации транскрипции, предпочтительно VP64. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой домен репрессии транскрипции, предпочтительно KRAB. В некоторых вариантах осуществления домен репрессии транскрипции представляет собой SID или конкатемеры SID (например, SID4X). В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой домен, участвующий в эпигенетической модификации, вследствие чего обеспечивается фермент, участвующий в эпигенетической модификации. В некоторых вариантах осуществления функциональный домен представляет собой активаторный домен, который может представлять собой активаторный домен Р65.

В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR представляет собой фермент CRISPR типа I или III, но предпочтительно представляет собой фермент CRISPR типа II. Этот фермент CRISPR типа II может быть любым ферментом Cas. Фермент Cas может быть идентифицирован как Cas9, поскольку он может относиться к общему классу ферментов, обладающих гомологией с самой большой нуклеазой с несколькими нуклеазными доменами системы CRISPR типа II. В наиболее предпочтительном случае фермент Cas9 получен или происходит из spCas9 или saCas9. Под происходящим заявители подразумевают, что в основе происходящего фермента главным образом лежит фермент дикого типа в том смысле, что он характеризуется высокой степенью гомологии последовательности с этим ферментом, но он был некоторым образом подвергнут мутации (модифицирован), как описано в данном документе.

Следует иметь в виду, что выражения Cas и фермент CRISPR обычно используются в данном документе взаимозаменяемо, если не очевидно иное. Как упоминается выше, большинство нумераций остатков, используемых в данном документе, относятся к ферменту Cas9 из локуса CRISPR типа II Streptococcus pyogenes. Однако, следует иметь в виду, что настоящее изобретение включает многие другие Cas9 из других видов микроорганизмов, такие как SpCas9, SaCa9, St1Cas9 и т.д.

Пример кодон-оптимизированной последовательности, в данном случае оптимизированной для человека (т.е. оптимизированной для экспрессии у человека), представлен в данном документе, см. кодон-оптимизированную последовательность SaCas9 для человека. Хотя это является предпочтительным, следует иметь в виду, что возможны другие примеры, и что для вида-хозяина известна оптимизация кодонов.

Доставку предпочтительно осуществляют в форме вектора, который может представлять собой вирусный вектор, как, например, векторы на основе лентивируса, или бакуловируса, или, предпочтительно, аденовируса/аденоассоциированного вируса, но известны и предусмотрены другие средства доставки (такие как дрожжевые системы, микропузырьки, генные пушки/средства прикрепления векторов к наночастицам золота). Вектор может означать не только вирусную или дрожжевую систему (например, где представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором и находиться под его контролем (с точки зрения экспрессии, вследствие которой в конечном счете образуется процессированная РНК)), но также и прямую доставку нуклеиновых кислот в клетку-хозяина. Хотя в способах в данном документе вектор может быть вирусным вектором, и он преимущественно представляет собой AAV, можно использовать другие вирусные векторы, обсуждаемые в данном документе, такие как лентивирусы. Например, бакуловирусы можно использовать для экспрессии в клетках насекомых. Эти клетки насекомых могут, в свою очередь, быть применимыми для получения больших количеств дополнительных векторов, таких как векторы на основе AAV или лентивируса, приспособленных для доставки по настоящему изобретению. Также предусматривается способ доставки фермента CRISPR по настоящему изобретению, включающий доставку в клетку мРНК, кодирующей фермент CRISPR. Следует иметь в виду, что в определенных вариантах осуществления фермент CRISPR является усеченным, и/или содержит менее одной тысячи аминокислот или менее четырех тысяч аминокислот, и/или представляет собой нуклеазу или никазу, и/или является кодон-оптимизированным, и/или содержит одну или несколько мутаций, и/или включает химерный фермент CRISPR, и/или предусматривает другие варианты, обсуждаемые в данном документе. Предпочтительными являются векторы на основе AAV и лентивируса.

В определенных вариантах осуществления целевая последовательность на своем 3'-конце фланкирована или расположена перед РАМ, подходящим для фермента CRISPR, обычно Cas и, в частности, Cas9.

Например, подходящий РАМ представляет собой 5'-NRG или 5'-NNGRR для ферментов SpCas9 или SaCas9 (или происходящих из них ферментов), соответственно.

Следует иметь в виду, что SpCas9 или SaCas9 получены или происходят из Cas9 S. pyogenes или S. aureus.

Соответственно, целью настоящего изобретения не является охват в пределах настоящего изобретения любого ранее известного продукта, способа получения продукта или способа применения продукта, так что заявители оставляют за собой право и настоящим раскрывают отказ от прав на любой ранее известный продукт, процесс или способ. Следует дополнительно отметить, что настоящее изобретение не предназначено охватывать в пределах объема настоящего изобретения любой продукт, способ получения продукта или способ применения продукта, который не соответствует письменному описанию и требованиям достаточного раскрытия сути изобретения USPTO (первый пункт § 112 статьи 35 USC) или ЕРО (статья 83 ЕРС), так что заявители оставляют за собой право и настоящим раскрывают отказ от прав на любой ранее описанный продукт, способ получения продукта или способ применения продукта.

Следует отметить, что в данном раскрытии и особенно в формуле изобретения и/или абзацах такие выражения, как ''содержит'', ''содержащийся'', ''содержащий'' и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они могут означать ''включает'', ''включенный'', ''включающий'' и т.п., и что такие выражения, как ''по сути состоящий из'' и ''по сути состоит из'' имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они допускают не указанные прямо элементы, но исключают элементы, которые имеются в известном уровне техники или которые влияют на основные или новые характеристики настоящего изобретения.

Эти и другие варианты осуществления раскрыты или являются очевидными на основании следующего подробного описания и охвачены им.

Краткое описание графических материалов

Новые признаки настоящего изобретения изложены с характерными особенностями в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет доступно благодаря ссылке на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используют принципы настоящего изобретения, и на сопутствующие графические материалы.

На фигуре 1 показана схематическая модель системы CRISPR. Нуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes (желтый) целенаправленно воздействует на геномную ДНК при помощи синтетической направляющей РНК (sgRNA), состоящей из 20-нуклеотидной направляющей последовательности (голубой) и каркаса (красный). Направляющая последовательность образует пары оснований с ДНК-мишенью (голубой) непосредственно выше необходимого мотива 5'-NGG, прилегающего к протоспейсеру (РАМ; пурпурный), и Cas9 опосредует двухнитевой разрыв (DSB) на ~3 п.о. выше РАМ (красный треугольник).

На фигурах 2A-F показана иллюстративная система CRISPR, возможный механизм действия, пример адаптации для экспрессии в эукариотических клетках и результаты тестов, оценивающих ядерную локализацию и активность CRISPR.

На фигурах 3A-D показаны результаты оценки специфичности SpCas9 в отношении иллюстративной мишени.

На фигурах 4A-G показана иллюстративная векторная система и результаты ее применения при управлении гомологичной рекомбинацией в эукариотических клетках.

На фигуре 5 представлена таблица последовательностей протоспейсеров и обобщены результаты определения эффективности модификаций для протоспейсеров-мишеней, сконструированных на основе иллюстративных систем CRISPR S. pyogenes и S. thermophilus с соответствующими РАМ, воздействующих на локусы в геномах человека и мыши. Клетки трансфицировали Cas9 и либо pre-crRNA/tracrRNA, либо химерной РНК и анализировали через 72 часа после трансфекции. Процент вставок/делеций рассчитывали на основе результатов анализа с помощью Surveyor с указанными линиями клеток (N=3 для всех протоспейсеров-мишеней, ошибки представляют собой S.E.M., ''N.D.'' означает ''не выявляется посредством анализа с помощью Surveyor'', и ''N.T.'' означает ''не тестировали в данном исследовании'').

На фигурах 6А-С показано сравнение различных транскриптов tracrRNA для опосредованного Cas9 целенаправленного воздействия на ген.

На фигуре 7 показано схематическое изображение анализа с помощью нуклеазы Surveyor для выявления индуцированных двухцепочечным разрывом микровставок и микроделеций.

На фигурах 8А-В показаны иллюстративные бицистронные векторы экспрессии для экспрессии элементов системы CRISPR в эукариотических клетках.

На фигуре 9А-С показаны гистогораммы расстояний между смежными РАМ (NGG) для локуса 1 S. pyogenes SF370 (фигура 9А) и РАМ (NNAGAAW) для локуса 2 LMD9 S. thermophilus (фигура 9В) в геноме человека и расстояния для каждого РАМ в хромосомах (Chr) (фигура 9С).

На фигурах 10A-D показана иллюстративная система CRISPR как пример адаптации для экспрессии в эукариотических клетках и результаты тестов, оценивающих активность CRISPR.

На фигурах 11А-С показаны иллюстративные манипуляции с системой CRISPR для целенаправленного воздействия на локусы генома в клетках млекопитающего.

На фигурах 12А-В показаны результаты с помощью нозерн-блоттинга процессинга crRNA в клетках млекопитающего.

На фигурах 13А-В показан иллюстративный отбор протоспейсеров в локусах PVALB человека и Th мыши.

На фигуре 14 показаны иллюстративные последовательности протоспейсеров и соответствующих РАМ, являющиеся мишенями для системы CRISPR S. thermophilus, в локусе ЕМХ1 человека.

На фигуре 15 представлена таблица последовательностей для праймеров и зондов, используемых для анализа с помощью Surveyor, RFLP, геномного секвенирования и нозерн-блоттинга.

На фигурах 16А-С показана иллюстративная манипуляция с системой CRISPR с химерными РНК и результаты анализов с помощью SURVEYOR в отношении активности системы в эукариотических клетках.

На фигурах 17А-В показано графическое изображение результатов анализов с помощью SURVEYOR в отношении активности системы CRISPR в эукариотических клетках.

На фигуре 18 показано иллюстративное отображение некоторых целевых сайтов для Cas9 S. pyogenes в геноме человека, полученное с использованием геномного браузера UCSC.

На фигурах 19A-D показано круговое отображение филогенетического анализа, выявляющего пять семейств Cas9, в том числе трех групп больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две малых Cas9 (~1100 аминокислот).

На фигурах 20A-F показано линейное отображение филогенетического анализа, выявляющего пять семейств Cas9, в том числе трех группы больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две малых Cas9 (~1100 аминокислот).

На фигурах 21A-D показано редактирование генома посредством гомологичной рекомбинации, (а) Схематическое изображение никазы SpCas9 с мутацией D10A в каталитическом домене RuvC I. (b) Схематическое представление гомологичной рекомбинации (HR) в локусе ЕМХ1 человека при использовании смысловых или антисмысловых однонитевых олигонуклеотидов в качестве матриц для репарации. Красная стрелка вверху указывает на сайт расщепления для sgRNA; праймеры для ПЦР для генотипирования (таблицы J и K) обозначены стрелками в правой нанели. (с) Последовательность участка, модифицированного с помощью HR. (d) Анализ с помощью SURVEYOR в отношении вставок/делеций в целевом локусе 1 ЕМХ1 (n=3), опосредованных SpCas9 дикого типа (wt) и никазой SpCas9 (D10A). Стрелки указывают положения фрагментов ожидаемого размера.

На фигурах 22А-В показаны структуры одиночных векторов для SpCas9.

На фигуре 23 показана диаграмма, представляющая распределение ортологов Cas9 по длине.

На фигурах 24А-М показаны последовательности, в которых точки мутаций расположены в гене SpCas9.

На фигуре 25А показана карта вектора для целенаправленного воздействия на Rosa26 с условной экспрессией Cas9.

На фигуре 25В показана карта вектора для целенаправленного воздействия на Rosa26 с конститутивной экспрессией Cas9.

На фигуре 26 показано схематическое изображение важных элементов в конструкциях для конститутивной и условной экспрессии Cas9.

На фигуре 27 показаны данные о доставке и экспрессии Cas9 в головном мозге мышей in vivo.

На фигуре 28 показана доставка Cas9 и химерной РНК в виде РНК в клетки. (А) Доставка репортера GFP в виде ДНК или мРНК в клетки Neuro-2A. (В) Доставка Cas9 и химерной РНК, воздействующих на ген Icam2, в виде РНК приводит к разрезанию одного из двух тестируемых спейсеров. (С) Доставка Cas9 и химерной РНК, воздействующих на ген F7, в виде РНК приводит к разрезанию одного из двух тестируемых спейсеров.

На фигуре 29 показано, как репарация двухцепочечного разрыва (DSB) ДНК способствует редактированию генов. В пути склонного к ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ) концы DSB подвергаются обработке посредством эндогенных механизмов репарации ДНК и соединяются вместе, что может приводить к случайным мутациям по типу вставки или делеции (вставки/делеции) в месте соединения. Мутации по типу вставки/делеции, имеющие место в кодирующем участке гена, могут обуславливать сдвиг рамки считывания и появление преждевременного стоп-кодона, что приводит к нокауту гена. Альтернативно, матрицу для репарации в форме плазмиды или однонитевых олигодезоксинуклеотидов (ssODN) можно предоставлять для эффективного использования пути репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR), что обеспечивает высокое качество и точное редактирование.

На фигурах 30А-С показаны предполагаемые результаты HDR в клетках НЕK и HUES9. (а) Плазмиду для целенаправленного воздействия или ssODN (смысловой или антисмысловой) с гомологичными плечами можно использовать для редактирования последовательности в целевом локусе генома, расщепляемом Cas9 (красный треугольник). Для анализа эффективности HDR заявители вводили сайт для HindIII (красный прямоугольник) в целевой локус, который подвергали ПЦР-амплификации с праймерами, отжигаемыми за пределами участка гомологии. При расщеплении продукта ПЦР с помощью HindIII выявляют число случаев обнаружения событий HDR. (b) ssODN, ориентированные в смысловом или антисмысловом (s или а) направлении относительно представляющего интерес локуса, можно использовать в сочетании с Cas9 для достижения эффективного опосредованного HDR редактирования в целевом локусе. С каждой стороны от участка модификации (красная полоска) рекомендуется наличие минимального участка гомологии размером 40 п.о. и предпочтительно 90 п.о. (с) Пример эффекта ssODN в отношении HDR в локусе ЕМХ1 показан с использованием как Cas9 дикого типа, так и никазы Cas9 (D10A). Каждый ssODN содержит гомологичные плечи размером 90 п.о., фланкирующие вставку двух сайтов рестрикции размером 12 п.о.

На фигурах 31А-С показана стратегия репарации для мутации дельтаF508 гена регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе.

На фигурах 32А-В (а) показано схематическое изображение экспансии GAA-повтора в интроне 1 FXN и (b) показано схематическое изображение стратегии, принятой для вырезания участка экспансии GAA с помощью системы CRISPR/Cas.

На фигуре 33 показан скрининг в отношении эффективного опосредованного SpCas9 целенаправленного воздействия на локусы генов Tet1-3 и Dnmt1, 3а и 3b. Анализ с помощью Surveyor в отношении ДНК из трансфицированных клеток N2A демонстрирует эффективное расщепление ДНК путем использования различных gRNA.

На фигуре 34 показана стратегия мультиплексного целенаправленного воздействия на геном с применением 2-векторной системы в системе доставки на основе AAV1/2. gRNA, воздействующая на Tet1-3 и Dnmt1, 3а и 3b, находится под контролем промотора U6. GFP-KASH находится под контролем промотора гена синапсина человека. Сайты рестрикции демонстрируют простую стратегию замены gRNA путем субклонирования. Показан SpCas9, меченный НА, фланкированный двумя сигналами ядерной локализации (NLS). Оба вектора доставляют в головной мозг с помощью вируса AAV1/2 в соотношении 1:1.

На фигуре 35 показано подтверждение функциональных свойств мультиплексного вектора #1 для целенаправленного воздействия на DNMT посредством анализа с помощью Surveyor. Клетки N2A подвергали совместному трансфицированию вектором #1 для целенаправленного воздействия на DNMT (+) и вектором, кодирующим SpCas9, для тестирования опосредованного SpCas9 расщепления локусов генов семейства DNMT. gRNA в отдельности (-) представляет собой отрицательный контроль. Клетки собирали для очистки и последующей обработки ДНК через 48 ч. после трансфекции.

На фигуре 36 показано подтверждение функциональных свойств мультиплексного вектора #2 для целенаправленного воздействия на DNMT посредством анализа с помощью Surveyor. Клетки N2A подвергали совместному трансфицированию вектором #1 для целенаправленного воздействия на DNMT (+) и вектором, кодирующим SpCas9, для тестирования опосредованного SpCas9 расщепления локусов генов семейства DNMT. gRNA отдельно (-) представляет собой отрицательный контроль. Клетки собирали для очистки и последующей обработки ДНК через 48 ч. после трансфекции.

На фигуре 37 показано схематическое представление коротких промоторов и коротких вариантов поли(А), используемых для экспрессии HA-SpCas9 in vivo. Размеры кодирующих участков от L-ITR до R-ITR показаны справа.

На фигуре 38 показано схематическое представление коротких промоторов и коротких вариантов поли(А), используемых для экспрессии HA-SaCas9 in vivo. Размеры кодирующих участков от L-ITR до R-ITR показаны справа.

На фигуре 39 показана экспрессия SpCas9 и SaCas9 в клетках N2A. Иллюстративный вестерн-блот-анализ меченных НА вариантов SpCas9 и SaCas9 под контролем различных коротких промоторов и с короткими поли(А)-последовательностями (spA). Тубулин представляет собой контроль загрузки. mCherry (mCh) представляет собой контроль трансфекции. Через 48 ч. после трансфекции клетки собирали и подвергали дальнейшей обработке для вестерн-блоттинга.

На фигуре 40 показан скрининг в отношении эффективного опосредованного SaCas9 целенаправленного воздействия на локус гена Tet3. Анализ с помощью Surveyor в отношении ДНК из трансфицированных клеток N2A демонстрирует эффективное расщепление ДНК путем применения различных gRNA с последовательностью PUM NNGGGT. Клетки, трансфицированные GFP, и клетки, экспрессирующие только SaCas9, являются контрольными.

На фигуре 41 показана экспрессия HA-SaCas9 в головном мозге мышей. Животным инъецировали в зубчатые извилины вирус, управляющий экспрессией HA-SaCas9 под контролем промотора гена синапсина человека. Животных умерщвляли через 2 недели после хирургической операции. НА-метку выявляли с помощью моноклонального антитела кролика C29F4 (Cell Signaling). Клеточные ядра окрашивали синим цветом с помощью красителя DAPI.

На фигуре 42 показана экспрессия SpCas9 и SaCas9 в первичных кортикальных нейронах в культуре через 7 дней после трансдукции. Иллюстративный вестерн-блот-анализ меченных НА вариантов SpCas9 и SaCas9 под контролем различных промоторов и с последовательностями bgh или короткими поли(А) (spA). Тубулин представляет собой контроль загрузки.

На фигуре 43 показано окрашивание с выявлением живых/мертвых первичных кортикальных нейронов через 7 дней после трансдукции частицами AAV1, несущими SpCas9 с различными промоторами и мультиплексные конструкции gRNA (пример показан на последней панели для DNMT). Нейроны после трансдукции с помощью AAV сравнивали с контрольными нетрансдуцированными нейронами. Красные ядра указывают на мертвые клетки с проницаемой мембраной (второй ряд панелей). Живые клетки отмечены зеленым цветом (третий ряд панелей).

На фигуре 44 показано окрашивание с выявлением живых/мертвых первичных кортикальных нейронов через 7 дней после трансдукции частицами AAV1, несущими SaCas9 с различными промоторами. Красные ядра указывают на мертвые клетки с проницаемой мембраной (второй ряд панелей). Живые клетки отмечены зеленым цветом (третий ряд панелей).

На фигуре 45 показано сравнение морфологических характеристик нейронов после трансдукции вирусом AAV1, несущим SpCas9 и мультиплексы gRNA для локусов генов ТЕТ и DNMT. Нейроны без трансдукции показаны в качестве контроля.

На фигуре 46 показано подтверждение функциональных свойств мультиплексного вектора #1 для целенаправленного воздействия на DNMT посредством анализа с помощью Surveyor в первичных кортикальных нейронах. Клетки подвергали совместной трансдукции вектором #1 для целенаправленного воздействия на DNMT и вирусами с SpCas9 с различными промоторами для тестирования опосредованного SpCas9 расщепления локусов генов семейства DNMT.

На фигуре 47 показана in vivo эффективность расщепления с помощью SpCas9 в головном мозге. Мышам инъецировали вирус AAV1/2, несущий мультиплекс gRNA, осуществляющий нацеливание на локусы генов семейства DNMT, вместе с вирусами с SpCas9 под контролем 2 различных промоторов: Меср2 мыши и Map1b крысы. Через две недели после инъекции ткань головного мозга извлекали и ядра получали и сортировали с помощью FACS на основании экспрессии GFP под управлением промотора гена синапсина из мультиплексной конструкции gRNA. После экстракции gDNA выполняли анализ с помощью Surveyor. + означает GFP-положительные ядра, а - означает контрольные, GFP-отрицательные ядра от того же животного. Числа возле геля означают оцененную эффективность SpCas9.

На фигуре 48 показана очистка меченных GFP-KASH клеточных ядер из нейронов гиппокампа. Внешняя ядерная мембрана (ONM) ядерной мембраны клетки мечена продуктом слияния GFP и белкового трансмембранного домена KASH. Через неделю после стереотаксического хирургического вмешательства и инъекции AAV1/2 в головном мозге наблюдается интенсивная экспрессия GFP. Осуществляли стадию центрифугирования в градиенте плотности для очистки клеточных ядер от интактных клеток головного мозга. Показаны очищенные ядра. Хроматин, окрашенный рубиновым красителем Vybrant® DyeCycle™, показан красным цветом, меченные GFP ядра показаны зеленым цветом. Иллюстративный профиль FACS GFP+ и GFP-клеточных ядер (пурпурный цвет: рубиновый краситель Vybrant® DyeCycle™, зеленый цвет: GFP).

На фигуре 49 показана эффективность расщепления при помощи SpCas9 в головном мозге мышей. Мышам инъецировали вирус AAV1/2, несущий мультиплекс gRNA, осуществляющий нацеливание на локусы генов семейства ТЕТ, вместе с вирусами с SpCas9 под контролем 2 различных промоторов: Меср2 мыши и Map1b крысы. Через три недели после инъекции ткань головного мозга извлекали, ядра получали и сортировали с помощью FACS на основании экспрессии GFP под управлением промотора гена синапсина из мультиплексной конструкции gRNA. После экстракции gDNA выполняли анализ с помощью Surveyor. + означает GFP-положительные ядра, а - означает контрольные, GFP-отрицательные ядра от того же животного. Числа возле геля означают оцененную эффективность SpCas9.

На фигуре 50 показана экспрессия GFP-KASH в кортикальных нейронах в культуре. Нейроны трансдуцировали вирусом AAV1, несущим мультиплексные конструкции gRNA, осуществляющие нацеливание на локусы генов ТЕТ. Локализация самого сильного сигнала возле клеточных ядер обусловлена локализацией домена KASH.

На фигуре 51 показан (в верхней части) перечень расстояний (на которые указывает схема расположения для двух РАМ-последовательностей) между парами направляющих РНК. Только для пар направляющих РНК, удовлетворяющих паттернам 1, 2, 3, 4, проявляются вставки/делеции в случае применения с никазой SpCas9(D10A). (Нижняя часть) Изображения гелей, демонстрирующие, что комбинация SpCas9(D10A) с парами направляющих РНК, удовлетворяющих паттернам 1, 2, 3, 4, приводит к образованию вставок/делеций в целевом сайте.

На фигуре 52 показан перечень последовательностей обратных праймеров для U6, используемых для создания кассет экспрессии U6-направляющая РНК. Каждый праймер необходимо применять в паре с прямым праймером для U6 ''gcactgagggcctatttcccatgattc'' для образования ампликонов, содержащих U6 и требуемую направляющую РНК.

На фигуре 53 показана карта секвенирования генома в локусе Emx1 человека, демонстрирующая местоположения 24 паттернов, перечисленных на фигуре 33.

На фигуре 54 показано (справа) изображение геля, указывающее на образование вставок/делеций в целевом сайте при наличии различных ''липких'' 5'-концов после расщепления никазой Cas9, нацеливаемой различными парами направляющих РНК. (Слева) Таблица, в которой указаны номера дорожек для геля справа и различные параметры, в том числе идентификация применяемых пар направляющих РНК и длина ''липкого'' 5'-конца, имеющегося в наличии после расщепления никазой Cas9.

На фигуре 55 показана карта секвенирования генома в локусе Emx1 человека, демонстрирующая местоположения различных пар направляющих РНК, которые обуславливают картины разделения в геле, показанные на фигуре 54 (справа), и которые дополнительно описаны в примере 35.

На фигурах 56А-K показано целенаправленное воздействие CRISPR-Cas9 на Меср2 в первичных кортикальных нейронах. (А) Векторы экспрессии AAV SpCas9 и sgRNA. Вектор sgRNA содержит последовательность, кодирующую белок слияния GFP-KASH для идентификации трансдуцированных нейронов. (В) Нейроны в культуре подвергают совместной трансдукции векторами Cas9 и sgRNA, демонстрирующими экспрессию меченного НА Cas9 (HA-Cas9) и GFP-KASH. Ядра метили с помощью DAPI. Масштабная метка - 20 мкм. (С) Эффективность совместного инфицирования GFP-KASH⁺ (n=635) и HA-Cas9 (n=659) в первичных кортикальных нейронах. (D) Графическое представление локуса Меср2 мыши, демонстрирующее местоположение целевого сайта Cas9; sgRNA показана синим цветом. Последовательность РАМ отмечена розовым цветом. (Е) Анализ в геле с помощью SURVEYOR™, демонстрирующий модификацию локуса Меср2 в кортикальных нейронах. (F) Вестерн-блот-анализ уровней белка МеСР2 после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 на локус Меср2 и количественная оценка уровней белка МеСР2 (t-критерий, ***р<0,0001, n=7). (G) Снижение сложности дендритного дерева в нейронах после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 на локус Меср2. Масштабная метка - 20 мкм. (Н) Морфология дендритного дерева, оцениваемая по количеству кончиков дендритов и (I) анализ Шолла (t-критерий, ***р<0,0001, n=40). (J) Изменения в морфологии дендритных шипиков в нейронах, подвергнутых целенаправленному воздействию Cas9 и sgRNA для Меср2. Масштабная метка - 10 мкм. (K) Количественная оценка плотности шипиков (t-критерий, ***р<0,0001, n=40).

На фигурах 57A-I показана доставка системы CRISPR-Cas9 и целенаправленное воздействие на Меср2 в головном мозге мыши. (А) Стратегия очистки клеточных ядер из клеток головного мозга мыши, подвергнутых целенаправленному воздействию CRISPR-Cas9. (В) Экспрессия HA-Cas9 и GFP-KASH (sgRNA) в дорсальной части зубчатой извилины (DG) гиппокампа мыши. Масштабная метка - 100 мкм. (С) Количественная оценка клеток, в которых произошло целенаправленное воздействие двухвекторной системы Cas9-CRISPR. (D) Анализ в геле с помощью SURVEYOR™, демонстрирующий модификацию локуса Меср2 через 2 недели после доставки с помощью AAV в DG-область. Отсортированные путем FACS GFP-KASH положительные клетки демонстрируют более высокий уровень модификации локуса Меср2. (Е) Вестерн-блот-анализ экспрессии белка МеСР2 в области головного мозга, подвергнутой целенаправленному воздействию, и количественная оценка уровней белка МеСР2 в дорсальной части DG (t-критерий, **р<0,001, n=4). (F) Фотографии дорсальной части DG-области через 2 недели после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 на локус Меср2. Масштабная метка - 150 мкм. (G) Количественная оценка популяции МеСР2-положительных клеток в области головного мозга, подвергнутой целенаправленному воздействию, по сравнению с контрольным коллатеральных участком (t-критерий, ****р<0,0001, n=290 и 249 клеток, соответственно). (Н) Примеры окраски по Гольджи-Коксу, демонстрирующей морфологию дендритных шипиков гранулярных клеток в дорсальной части DG через одну неделю после доставки CRISPR-Cas9. Масштабная метка - 10 мкм. (I) Количественная оценка плотности дендритных шипиков в дорсальной части DG-области (t-критерий, ***р<0,0001, n=20).

На фигурах 58A-F показано одновременное мультиплексное редактирование генов в головном мозге мыши. (А) Схематическое изображение системы CRISPR-Cas9, разработанной для мультиплексного целенаправленного воздействия на геном. (В) Графическое представление локусов DNMT мыши, подвергнутых целенаправленному воздействию. Направляющие РНК показаны синим цветом. Последовательности РАМ отмечены розовым цветом. (С) Секвенирование нового поколения для определения степени целевой модификации семейства генов DNMT в отсортированных путем FACS ядрах из зубчатой извилины после доставки CRISPR-Cas9. Показаны показатели MLE (оценки максимального правдоподобия). (D) Вестерн-блот-анализ белков Dnmt3a и Dnmt1 после доставки in vivo системы CRISPR-Cas9, целенаправленно воздействующей на гены семейства DNMT (верхняя часть). Количественная оценка посредством вестерн-блот-анализа уровней белков Dnmt3a и Dnmt1 в DG после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 in vivo (нижняя часть; t-критерий, **р<0,001, *р<0,05, Dnmt3a: n=7; Dnmt1: n=5). (E, F) Дефицита контекстного обучения через 8 недель после целенаправленного воздействия на гены DNMT с помощью SPR-Cas9 в DG-области гиппокампа при тестировании в тренировочном (E) и измененном контексте (F) (t-критерий, ***p<0,0001, n=18).

На фигурах 59А-Е показаны клонирование и экспрессия меченного НА SpCas9 (HA-Cas9) при упаковке в AAV. (А) Схематический обзор системы CRISPR/Cas9. Целенаправленное воздействие Cas9, опосредованное одиночной направляющей РНК (sgRNA), приводит к двухнитевому разрыву (DSB) в генном локусе, подвергнутом целенаправленному воздействию. Механизм негомологичного соединения концов (NHEJ) приводит к мутациям по типу вставки/делеции в геномном локусе, подвергнутом целенаправленному воздействию. (В) Схематический обзор различных стратегий клонирования для сведения к минимуму размера кассеты экспрессии Cas9 с помощью короткого промотора Map1b крысы (rMap1b), усеченного варианта промотора Меср2 мыши (sMecp2) и короткого мотива поли(А) (spA). (С) Вестерн-блот-анализ культуры первичных кортикальных нейронов, экспрессирующих Cas9, с помощью различных кассет экспрессии Cas9. (D) Промотор Меср2 управляет экспрессией Cas9 (красный цвет) в нейронах (Map1b, NeuN; стрелки), но не в астроглии (GFAP, указатели стрелок). Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Масштабные метки - 20 мкм. (Е) Клетки окрашивали с помощью набора LIFE/DEAD^® через 7 дней после вирусной доставки. Количественная оценка DAPI⁺ и мертвых (DEAD⁺) клеток. (ITR - инвертированный концевой повтор; НА - гемагглютининовая метка; NLS - сигнал ядерной локализации; spA - синтетический сигнал полиаденилирования; U6 - промотор PolIII; sgRNA - одиночная направляющая РНК; hSyn - промотор гена синапсина 1 человека; GFP - зеленый флуоресцентный белок; KASH - ядерный трансмембранный домен гомологии Klarsicht/ANC1/Syne; bGH pA - сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков).

На фигурах 60А-В показано целенаправленное воздействие на Меср2 в клетках Neuro-2a. (А) Целевые последовательности Меср2 и соответствующие мотивы, прилегающие к протоспейсерам (РАМ). (В) Оценивание 6 sgRNA для Меср2, введенных путем совместной трансфекции с Cas9 в клетки Neuro-2a. Показатели эффективности модификации локусов анализировали через 48 ч. после трансфекции с применением анализа с помощью SURVEYOR™.

На фигуре 61 показана доставка CRISPR-Cas9 в первичных кортикальных нейронах. Иммунофлуоресцентное окрашивание МеСР2 (красный цвет) у культивируемых нейронов через 7 дней после трансдукции AAV-CRISPR (зеленых цвет, GFP-KASH). Показана пониженная иммунофлуоресценция МеСР2 в клетках, трандуцированных AAV-CRISPR, целенаправленно воздействующей на Меср2 (средняя панель). Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Масштабная метка - 20 мкм.

На фигурах 62А-С показано мечение с помощью GFP клеточных ядер, подвергнутых целенаправленному воздействию. (А) Схематический обзор мечения с помощью GFP. Проиллюстрированы улучшенный зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с ядерным трансмембранным доменом KASH, и интеграция GFP-KASH во внешнюю ядерную мембрану. (В) Экспрессия GFP-KASH под управлением промотора гена синапсина человека через 4 недели после вирусной доставки в зубчатую извилину. Окраска гематоксилином/эозином (вверху) не выявила морфологических аномалий. Иммунофлуоресцентный анализ, показывающий нормальную гистоморфологию (NeuN показан красным цветом, средняя панель) в гиппокампе, экспрессирующем GFP-KASH (средняя, зеленый цвет), и отсутствие признаков астроглиоза (GFAP показан красным цветом, нижняя панель). Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Масштабная метка - 200 мкм. (С) При использовании промоторов, специфичных к типу клеток, можно целенаправленно воздействовать GFP-KASH на различные типы клеток. Промотор глиофибриллярного кислого белка (GFAP) управляет экспрессией GFP-KASH (зеленый цвет) в клетках астроглии (красный цвет) в гиппокампе мыши. Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Во врезках показано большее увеличение. Масштабная метка - 50 мкм. (KASH - ядерный трансмембранный домен Klarsicht, ANC1, Syne Homology) (ONM - внешняя ядерная мембрана; INM - внутренняя ядерная мембрана).

На фигурах 63А-В показано мультиплексное целенаправленное воздействие на геном в отношении представителей семейства DNMT in vitro. (А) Целевые последовательности Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b и соответствующие мотивы, прилегающие к протоспейсерам (РАМ). (В) Анализ клеток Neuro-2a с помощью нуклеазы SURVEYOR™ через 48 часов после трансфекции с помощью вектора с Cas9 и 3 х sgRNA для DNMT, целенаправленно воздействующего на локусы Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b. Показано эффективное редактирование генома для всех трех целевых генов.

На фигурах 64А-С показано секвенирование нового поколения для локусов Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b, подвергнутых целенаправленному воздействию. Пример результатов секвенирования подвергнутых мутации локусов Dnmt3a (А), Dnmt1 (В) и Dnmt3b (С) после доставки Cas9 и DNMT 3 х sgRNA в зубчатую извилину мыши in vivo. Зеленый цвет: последовательность дикого типа, красная пунктирная линия: удаленные основания, красные основания: вставка или мутации. Красные указатели стрелок указывают на сайт разрезания CRISPR-Cas9.

На фигуре 65А показано, что направляющая последовательность для целевого сайта 1 индуцировала самое высокое процентное значение количества вставок/делеций в АроВ.

На фигуре 65В показаны результаты анализа в геле с помощью нуклеазы Surveyor в отношении эффективности образования вставок/делеций через 4 недели после инъекции.

На фигуре 66 показано окрашивание масляным красным для выявления фенотипа накопления липидов в печени in vivo после доставки AAV-Cas9-sgRNA. Масштабная метка в каждой квадратной панели представляет 20 микрометров.

На фигуре 67 показано, что оптимальная длина спейсера составляет 21 нуклеотид/пару оснований (п.о.), представлена серыми прямоугольниками, по меньшей мере по сравнению с 20 или 22 парами оснований (представлены черными и белыми прямоугольниками, соответственно) для ряда мишеней в двух различных генах (AAVS1 и ЕМХ1).

На фигуре 68 показано, можно ли направляющую последовательность вставить в интронную последовательность Cas9.

На фигуре 69 показано, что промотор H1 полной длины (серый прямоугольник) все же является более слабым, чем промотор U6 (черный прямоугольник), поскольку U6 демонстрирует повышенное процентное значение количества образующихся вставок/делений для каждой тестируемой мишени.

На фигуре 70 показано, что короткий промотор H1 является более слабым, чем промотор H1 полной длины.

На фигуре 71 показано расстояние между 5'-концами двух направляющих последовательностей в конструкции, измеренное применительно к эффективности расщепления двойной никазой SaCas9 D10A.

На фигуре 72 показана доставка и целенаправленное воздействие системы CRISPR-Cas9 на локус Меср2 в головном мозге мыши. (а) Векторы экспрессии AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность (Меср2). Вектор sgRNA содержит последовательность, кодирующую белок слияния GFP-KASH для идентификации трансдуцированных нейронов. (b) Экспрессия HA-Cas9 и GFP-KASH в дорсальной части зубчатой извилины (DG) гиппокампа мыши. Масштабная метка - 100 мкм. (с) Количественная оценка клеток, в которых произошло эффективное целенаправленное воздействие двухвекторной системы Cas9-CRISPR. (d) Графическое представление локуса Меср2 мыши, демонстрирующее местоположение целевого сайта для Cas9; sgRNA показана синим цветом. Последовательность РАМ отмечена розовым цветом. Иллюстративные паттерны мутаций, выявленные путем секвенирования локуса Меср2, показаны ниже: зеленый цвет - последовательность дикого типа; красная пунктирная линия - удаленные основания; красные основания: вставка или мутации; красный указатель стрелки указывает на сайт разрезания CRISPR-Cas9. (e) Анализ в геле с помощью SURVEYOR™, демонстрирующий модификацию локуса Меср2, через 2 недели после доставки с помощью AAV в DG-область. (f) Вестерн-блот-анализ экспрессии белка МеСР2 в области головного мозга, подвергнутой целенаправленному воздействию, и количественная оценка уровней белка МеСР2 в дорсальной части DG (t-критерий, **р<0,001, n=4 от 3 животных, планки погрешностей: s.e.m.). (g) Изображения дорсальной части DG-области через 2 недели после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 на локус Меср2. Масштабная метка - 150 мкм. (h) Количественная оценка популяции МеСР2-положительных клеток среди всех выявленных клеток (окрашивание DAPI) в области головного мозга, подвергнутой целенаправленному воздействию, по сравнению с контрольным коллатеральным участком (t-критерий, ****р<0,0001, n=290 и 249 клеток от 2 животных, соответственно; планки погрешностей: s.e.m). (ITR - инвертированный концевой повтор; НА - гемагглютининовая метка; NLS - сигнал ядерной локализации; spA - синтетический сигнал полиаденилирования; U6 - промотор PolIII; sgRNA - одиночная направляющая РНК; hSyn - промотор гена синапсина 1 человека; GFP - зеленый флуоресцентный белок; KASH - ядерный трансмембранный домен гомологии Klarsicht/ANCl/Syne; bGH pA - сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков).

На фигуре 73 показан анализ экспрессии генов в нейронах с опосредованном Cas9 нокдауном МеСР2. (а) Стратегия очистки клеточных ядер из клеток головного мозга мыши, подвергнутых целенаправленному воздействию CRISPR-Cas9. (b) Иерархическая кластеризация дифференциально экспрессируемых генов (t-критерий, р<0,01, n=19 групп отсортированных ядер от 8 животных), выявленная путем секвенирования РНК. Относительные уровни экспрессии генов в log2(TPM+1) нормализованы для каждого ряда и отображены на красно-синей цветовой шкале. В каждом столбце представлена группа из 100 ядер нейронов, подвергнутых целенаправленному воздействию, отсортированных путем FACS из выделенной популяции клеток зубчатой извилины контрольных или трансдуцированных sgRNA для Меср2 животных, как указано.

На фигуре 74 показаны клеточно-автономные дефекты в свойствах клеточных реакций нейронов после опосредованного CRISPR нокдауна МеСР2. (а) Рисунок, на котором показана схема эксперимента in vivo, состоящая из зрительной коры мыши и параметра зрительной стимуляции. Показан GFP⁺ нейрон. Масштабная метка - 20 мкм. (b) Рисунок, на котором показана схема регистрации в возбуждающих нейронах в слоях 2/3, которые получают специфический входной сигнал, направленный как на контра-, так и на ипсилатеральный глаз. GFP⁺ клетки с модифицированным геномом показаны зеленым цветом, тогда как немодифицированные клетки показаны серым цветом. Стандартная форма спайка указывает на возбуждающие нейроны с регулярными спайками. (c, d) Средние значения OSI (с) и вызванной FR (d) измеряли в GFP⁺ клетках, экспрессирующих Меср2 и контрольную sgRNA, соответственно (t-критерий, *р<0,05; числа на графике означают количество клеток, в которых проводили регистрацию; n=2-3 животных; планки погрешностей: s.e.m).

На фигуре 75 показано одновременное мультиплексное редактирование генов в головном мозге мыши. (а) Схематическое изображение системы CRISPR-Cas9, предназначенной для мультиплексного целенаправленного воздействия на геном, (b) Графическое представление локусов DNMT мыши, подвергнутых целенаправленному воздействию. Направляющие РНК показаны синим цветом. Последовательности РАМ отмечены розовым цветом. (с) Анализ в геле с помощью SURVEYOR™, демонстрирующий модификацию локусов DNMT в отсортированных путем FACS GFP-KASH-положительных клетках через 4 недели после доставки с помощью AAV в DG-область. (d) Анализ модификации локусов DNMT в отдельных клетках на основе глубокого секвенирования, демонстрирующий совместную встречаемость модификаций в нескольких локусах. (е) Вестерн-блот-анализ белков Dnmt3a и Dnmt1 после доставки in vivo системы CRISPR-Cas9, целенаправленно воздействующей на гены семейства DNMT (верхняя часть). Количественная оценка уровней белков Dnmt3a и Dnmtl в DG посредством вестерн-блот-анализа после целенаправленного воздействия CRISPR-Cas9 in vivo (нижняя часть; t-критерий, **р<0,001, *р<0,05, Dnmt3a: n=7; Dnmt1: n=5 от 5 животных; планки погрешностей: s.e.m). (f) Дефициты контекстного обучения через 8 недель после целенаправленного воздействия на гены DNMT с помощью SpCas9 в DG-области гиппокампа при тестировании в тренировочном и измененном контексте (t-критерий, ***р<0,0001, n=18 животных, 2 независимых эксперимента; планки погрешностей: s.e.m).

На фигуре 76 показаны клонирование и экспрессия меченного НА SpCas9 (НА-SpCas9) при упаковке в AAV. (а) Схематический обзор различных стратегий клонирования для сведения к минимуму размера кассеты экспрессии SpCas9 с помощью короткого промотора Map1b крысы (pMap1b), усеченного варианта промотора Меср2 мыши (рМеср2) и короткого мотива поли(А) (spA). (b) Вестерн-блот-анализ культуры первичных кортикальных нейронов, экспрессирующих HA-SpCas9 с помощью различных кассет экспрессии SpCas9. (с) Промотор Меср2 управляет экспрессией HA-SpCas9 (красный цвет) в нейронах (Map1b, NeuN; стрелки), но не в астроглии (GFAP, указатели стрелок). Показана совместная экспрессия HA-SpCas9 и GFP-KASH (нижняя часть). Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Масштабные метки - 20 мкм. (d) Схематический обзор мечения с помощью GFP. Проиллюстрированы улучшенный зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с ядерным трансмембранным доменом KASH, и интеграция GFP-KASH во внешнюю ядерную мембрану, (е) Расчет эффективности совместного инфицирования, показывающий популяции клеток, экспрессирующих как HA-SpCas9, так и GFP-KASH (n=973 нейрона из 3 культур; планки погрешностей: s.e.m). (f) Клетки окрашивали с помощью набора LIVE/DEAD^® через 7 дней после вирусной доставки. Количественная оценка DAPI⁺ и мертвых (DEAD⁺) клеток (n=518 контрольных ядер DAPI⁺; n=1003 ядра DAPI⁺ с SpCas9/GFP-KASH из 2 культур; планки погрешностей: s.e.m). (ITR - инвертированный концевой повтор; НА - гемагглютининовая метка; NLS - сигнал ядерной локализации; spA - синтетический сигнал полиаденилирования; U6 - промотор PolIII; sgRNA - одиночная направляющая РНК; hSyn - промотор гена синапсина 1 человека; GFP - зеленый флуоресцентный белок; KASH - ядерный трансмембранный домен гомологии Klarsicht/ANCl/Syne; bGH pA - сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков).

На фигуре 77 показано целенаправленное воздействие на Меср2 в клетках Neuro-2а. (а) Целевые последовательности Меср2 и соответствующие мотивы, прилегающие к протоспейсерам (РАМ). (b) Оценивание 6 sgRNA для Меср2, введенных путем совместной трансфекции с SpCas9 в клетки Neuro-2a. Показатели эффективности модификации локусов анализировали через 48 ч. после трансфекции с применением анализа с помощью SURVEYOR™.

На фигуре 78 показано целенаправленное воздействие CRISPR-SpCas9 на Меср2 в первичных кортикальных нейронах, (а) Иммунофлуоресцентное окрашивание МеСР2 (красный цвет) в культивируемых нейронах через 7 дней после трансдукции AAV-CRISPR (зеленый цвет, GFP-KASH). Ядра метили с помощью DAPI (синий цвет). Масштабная метка - 20 мкм. (b) Оценивание целенаправленного воздействия на локус Меср2 с применением SpCas9 или dSpCas9 вместе с sgRNA для Меср2 или контрольной sgRNA (осуществляющей нацеливание на бактериальный ген lacZ) посредством анализа в геле с помощью SURVEYOR™. (с) Количественная оценка МеСР2-положительных ядер в целевой популяции нейронов (GFP⁺). (d) Вестерн-блот-анализ уровней белка МеСР2 после целенаправленного воздействия CRISPR-SpCas9 на локус Меср2 и количественная оценка уровней белка МеСР2 (t-критерий, **р<0,001, n=5 из 3 культур, планки погрешностей: s.e.m).

На фигуре 79 показаны морфологические изменения в дендритном дереве нейронов после опосредованного SpCas9 нокдауна МеСР2 in vitro, (а) Снижение сложности дендритного дерева в нейронах после целенаправленного воздействия CRISPR-SpCas9 на локус Меср2. Масштабная метка - 20 мкм. (b) Изменения в морфологии дендритных шипиков в нейронах, подвергнутых целенаправленному воздействию SpCas9 и sgRNA для Меср2, Масштабная метка - 10 мкм. Морфологические характеристики клеток визуализировали путем совместной трансфекции с конструкцией mCherry. Клетки для морфологического анализа выбирали на основании результата окрашивания Меср2. (c) Морфология дендритного дерева, оцениваемая по количеству кончиков дендритов, и (d) анализ Шолла (t-критерий, ***р<0,0001, n=40 из 2 культур), (е) Количественная оценка плотности шипиков (t-критерий, ***р<0,0001, n=40 из 2 культур, планки погрешностей: s.e.m).

На фигуре 80 показано секвенирование РНК в ядрах нейронов от контрольных животных и животных с опосредованным SpCas9 нокдауном Меср2. На диаграмме размаха представлено количество выявленных генов среди библиотек для секвенирования РНК (19 библиотек для каждого из 100 ядер, отобранных из ядер, трансдуцированных контрольной sgRNA или sgRNA для Меср2; n=4 животных/группа) на квантиль уровня экспрессии. Все гены разделяли на 10 квантилей по их среднему уровню экспрессии в log2(TPM+1), а затем для каждого квантиля подсчитывали количество выявленных генов (log2(TPM+1)>2) в каждом образце. Три показанные целевые последовательности представляют собой SEQ ID NO:__, SEQ ID NO:__ и SEQ ID NO:__ для Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b, соответственно.

На фигуре 81 показано мультиплексное целенаправленное воздействие на геном в отношении представителей семейства DNMT in vitro, (а) Целевые последовательности Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b и соответствующие мотивы, прилегающие к протоспейсерам (РАМ). (b) Анализ клеток Neuro-2a с помощью нуклеазы SURVEYOR™ через 48 часов после трансфекции с помощью вектора с SpCas9 и 3 х sgRNA для DNMT, целенаправленно воздействующего на локусы Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b. Показано эффективное редактирование генома для всех трех генов, подвергнутых целенаправленному воздействию.

На фигуре 82 показано секвенирование нового поколения для локусов Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b, подвергнутых целенаправленному воздействию. Примеры результатов секвенирования подвергнутых мутации локусов Dnmt3a (а), Dnmt1 (b) и Dnmt3b (с) после доставки SpCas9 и 3 х sgRNA для DNMT в зубчатую извилину мыши in vivo. Зеленый цвет: последовательность дикого типа, красная пунктирная линия: удаленные основания, красные основания: вставка или мутации. Красные указатели стрелок указывают на сайт разрезания CRISPR-SpCas9. Полные последовательности, используемые на данной фигуре, приведены как SEQ ID NO:, SEQ ID NO: и SEQ ID NO: для локусов Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b, соответственно. Они представляют собой: SEQ ID NO: (Dnmt3a): ССТ CCG TGT CAG CGA CCC ATG ССА A, SEQ ID NO: (Dnmt1): CCA GCG TCG AAC AGC TCC AGC CCG и SEQ ID NO: (Dnmt3b) AGA GGG TGC CAG CGG GTA TAT GAG G.

Фигуры приведены в данном документе только в целях иллюстрации, и они не обязательно изображены в масштабе.

Подробное описание изобретения

Относительно общей информации о системах CRISPR-Cas: ссылка делается на предварительные заявки на патенты США 61/758468; 61/802174; 61/806375; 61/814263; 61/819803 и 61/828130, поданные 30 января 2013 г.; 15 марта 2013 г.; 28 марта 2013 г.; 20 апреля 2013 г.; 6 мая 2013 г. и 28 мая 2013 г., соответственно. Ссылка также делается на предварительную заявку на патент США 61/836123, поданную 17 июня 2013 г. Ссылка также делается на предварительные заявки на патенты США 61/736527 и 61/748427, поданные 12 декабря 2012 г. и 2 января 2013 г., соответственно. Ссылка также делается на предварительную заявку на патент США 61/791409, поданную 15 марта 2013 г. Ссылка также делается на предварительную заявку на патент США 61/799800, поданную 15 марта 2013 г. Ссылка также делается на предварительные заявки на патенты США 61/835931, 61/835936, 61/836127, 61/836101, 61/836080 и 61/835973, каждая из которых подана 17 июня 2013 г. Ссылка дополнительно делается на предварительные заявки на патенты США 61/862468 и 61/862355, поданные 5 августа 2013 г.; 61/871301, поданную 28 августа 2013 г.; 61/960777, поданную 25 сентября 2013 г., и 61/961980, поданную 28 октября 2013 г. Каждая из данных заявок, и все документы, цитируемые в них или во время их рассмотрения (''документы, цитируемые в заявке''), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в заявке, вместе с любыми инструкциями, описаниями, характеристиками продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутыми в них или в любом документе, упомянутом в них и включенном с помощью ссылки в данный документ, настоящим включены в данный документ с помощью ссылки и могут быть использованы в практическом осуществлении настоящего изобретения. Все документы (например, данные заявки и документы, цитируемые в заявке) включены в данный документ при помощи ссылки в такой же мере, как если бы конкретно и отдельно было указано, что каждый отдельный документ включен при помощи ссылки.

Также относительно общей информации о системах CRISPR-Cas упоминают:

Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N.. Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15; 339(6121): 819-23 (2013);

RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar; 31(3): 233-9 (2013);

One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9; 153(4): 910-8 (2013);

Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. 2013 Aug 22; 500(7463): 472-6. doi: 10.1038/Nature12466. Epub 2013 Aug 23;

Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell Aug 28. pii: S0092-8674(13)01015-5. (2013);

DNA targeting Specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);

Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols Nov; 8(11): 2281-308. (2013);

Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, Т., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Электронная публикация, предшествующая печатной];

Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O. Cell Feb 27. (2014). 156(5): 935-49;

Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014) Apr 20. doi: 10.1038/nbt.2889 и

Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu et al, Cell 157, 1262-1278 (June 5, 2014) (Hsu 2014).

каждый из которых включен в данный документ с помощью ссылки и вкратце обсуждается ниже.

Cong и соавт. сконструировали системы CRISPR/Cas типа II на основе Cas9 Streptococcus thermophilus, а также и Cas9 Streptococcus pyogenes для применения в эукариотических клетках и продемонстрировали, что нуклеазы Cas9 могут быть направлены короткими РНК с индуцированием точного расщепления ДНК в клетках человека и мыши. Их исследование дополнительно показало, что Cas9, превращенный в фермент, вносящий однонитевой разрыв, можно применять для содействия репарации с участием гомологичной рекомбинации в эукариотических клетках с минимальной мутагенной активностью. Дополнительно, их исследование продемонстрировало, что в одной матрице CRISPR могут быть закодированы несколько направляющих последовательностей для обеспечения одновременного редактирования в нескольких сайтах эндогенных локусов генома в геноме млекопитающих, что демонстрирует легкую программируемость и широкое применение технологии нуклеаз, направляемых РНК. Эта возможность применения РНК для программирования специфичного к последовательности расщепления ДНК в клетках определила новый класс инструментов для геномной инженерии. Данные исследования дополнительно показали, что другие локусы CRISPR, вероятно, можно пересадить в клетки млекопитающих, и они могут также опосредовать расщепление генома млекопитающих. Важно отметить, что можно предусмотреть дополнительное улучшение некоторых аспектов системы CRISPR/Cas для повышения ее эффективности и универсальности.

Jiang и соавт. применяли эндонуклеазы Cas9, ассоциированные с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), в комплексе с двойной РНК для введения точных мутаций в геномы Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Подход опирался на расщепление в целевом сайте генома под управлением системы двойная PHK:Cas9 для уничтожения не подвергшихся мутации клеток и устранял необходимость в селектируемых маркерах или системах негативного отбора. В исследовании сообщалось о перепрограммировании специфичности системы двойная PHK:Cas9 путем изменения последовательности короткой РНК CRISPR (crRNA) для внесения одно- или многонуклеотидных изменений, выполняемых с помощью матриц редактирования. Исследование показало, что одновременное использование двух crRNA обеспечивало мультиплексный мутагенез. Кроме того, когда подход применяли в комбинации с рекомбинационной инженерией, у S. pneumoniae практически 100% клеток, извлеченных с помощью описанного подхода, содержали требуемую мутацию, а у Е. coli 65% извлеченных клеток содержали мутацию.

Konermann и соавт. изучали существующую в данной области техники необходимость в гибких и надежных технологиях, позволяющих осуществлять оптическое и химическое модулирование фермента Cas9 CRISPR на основе ДНК-связывающих доменов, а также эффекторов, подобных активаторам транскрипции.

Как обсуждается в настоящем описании, нуклеаза Cas9 из микробной системы CRISPR-Cas целенаправленно воздействует на конкретные локусы генома при помощи направляющей последовательностью размером 20 нт, которая может допускать некоторые ошибки спаривания с ДНК-мишенью и, таким образом, способствует нежелательному нецелевому мутагенезу. Для изучения этого Ran и соавт. описали подход, в котором мутантную никазу Cas9 применяли в сочетании с парными направляющими РНК для введения целевых двухнитевых разрывов. Поскольку отдельные однонитевые разрывы в геноме подвергаются высокоточной репарации, одновременное внесение однонитевых разрывов с помощью соответствующим образом смещенных друг относительно друга направляющих РНК является необходимым для образования двухнитевых разрывов и увеличивает количество специфически распознаваемых оснований для расщепления мишени. Авторы продемонстрировали, что применение парного внесения однонитевых разрывов может снижать нецелевую активность в линиях клеток в 50-1500 раз и облегчать нокаут генов в зиготах мышей без уменьшения эффективности целевого расщепления. Данная гибкая стратегия обеспечивает большое разнообразие применений редактирования генома, требующих высокой специфичности.

Hsu и соавт. охарактеризовали специфичность целенаправленного воздействия SpCas9 в клетках человека, чтобы предоставить информацию для выбора целевых сайтов и избежать нецелевых эффектов. В исследовании оценивали >700 вариантов направляющей РНК и уровней мутаций по типу вставок/делеций, индуцированных SpCas9, в >100 предсказанных нецелевых локусах генома в клетках 293Т и 293FT. Авторы показали, что SpCas9 допускает ошибки спаривания между направляющей РНК и целевой ДНК в различных положениях в зависимости от последовательности с чувствительностью к количеству, положению и распределению ошибок спаривания. Авторы дополнительно показали, что на опосредованное SpCas9 расщепление не влияет метилирование ДНК и что для сведения к минимуму нецелевых модификаций можно подобрать дозу SpCas9 и sgRNA. Дополнительно, для облегчения применений в геномной инженерии млекопитающих авторы сообщили о получении инструментального программного обеспечения на веб-основе для управления выбором и подтверждением целевых последовательностей, а также анализов нецелевых явлений.

Ran и соавт. описали набор инструментов для опосредованного Cas9 редактирования генома посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR) в клетках млекопитающих, а также создания модифицированных линий клеток для последующих функциональных исследований. Для сведения к минимуму нецелевого расщепления авторы дополнительно описали стратегию внесения двойных однонитевых разрывов с помощью мутантной никазы Cas9 с парными направляющими РНК. Протокол, представленный авторами, является полученным экспериментальным путем руководством по выбору целевых сайтов, оцениванию эффективности расщепления и анализу нецелевой активности. Исследования показали, что, начиная с конструирования мишени, модификации генов можно получить в течение всего 1-2 недель, и модифицированные клональные линии клеток можно получить в течение 2-3 недель.

Shalem и соавт. описали новый способ исследования функций генов в полногеномном масштабе. Их исследования показали, что доставка библиотеки CRISPR-Cas9 для нокаута в масштабе генома (GeCKO), целенаправленно воздействующей на 18080 генов, с 64751 уникальной направляющей последовательностью обеспечивала скрининг путем как позитивного, так и негативного отбора в клетках человека. Во-первых, авторы показали применение библиотеки GeCKO для идентификации генов, существенных для жизнеспособности клеток у раковых и плюрипотентных стволовых клеток. Далее, в модели меланомы, авторы провели скрининг в отношении генов, утрата функций которых вовлечена в устойчивость к вемурафенибу, терапевтическому средству, ингибирующему мутантную протеинкиназу BRAF. Их исследования показали, что кандидаты высшего ранга включали ранее подтвержденные гены NF1 и MED12, а также новые хиты NF2, CUL3, TADA2B и TADA1. Авторы наблюдали высокий уровень согласованности между независимыми направляющими РНК, осуществляющими нацеливание на один и тот же ген, и высоким показателем подтверждения хитов и, таким образом, продемонстрировали перспективность скрининга с помощью Cas9 в масштабе генома.

Nishimasu и соавт. сообщали о кристаллической структуре Cas9 Streptococcus pyogenes в комплексе с sgRNA и ее целевой ДНК при разрешающей способности в 2,5 А°. В структуре была выявлена двухлопастная архитектура, образованная лопастью распознавания мишени и нуклеазной лопастью, обеспечивающих размещение гетеродуплекса sgRNA:ДНК в положительно заряженной бороздке на поверхности их соприкосновения. При том, что лопасть распознавания является существенной для связывания sgRNA и ДНК, нуклеазная лопасть содержит нуклеазные домены HNH и RuvC, расположенные надлежащим образом для расщепления комплементарной и некомплементарной нитей целевой ДНК, соответственно. Нуклеазная лопасть также содержит карбоксиконцевой домен, отвечающий за взаимодействие с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (РАМ). Эти структурные анализы с высокой разрешающей способностью и сопутствующие функциональные анализы выявили молекулярный механизм целенаправленного воздействия Cas9, направляемых РНК, на ДНК, проложив таким образом путь для рациональной разработки новых универсальных технологий редактирования генома.

Wu и соавт. производили полногеномное картирование сайтов связывания для каталитически неактивного Cas9 (dCas9) из Streptococcus pyogenes, который вводили с одиночными направляющими РНК (sgRNA) в эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC). Авторы показали, что каждая из четырех тестируемых sgRNA осуществляет нацеливание dCas9 на сайты генома в количестве от нескольких десятков до нескольких тысяч, часто характеризуемых наличием 5-нуклеотидной затравочной области в sgRNA и мотива NGG, прилегающего к протоспейсеру (РАМ). Недоступность хроматина снижает связывание dCas9 с другими сайтами с последовательностями, комплементарными затравочной; таким образом, 70% нецелевых сайтов ассоциированы с генами. Авторы показали, что целенаправленное секвенирование 295 сайтов связывания для dCas9 в mESC, трансфицированных каталитически активным Cas9, выявило мутацию, превышающую фоновые уровни, только в одном сайте. Авторы предложили модель связывания с Cas9 и опосредованного им расщепления с двумя состояниями, в которой последовательность, комплементарная затравочной, запускает связывание, но для расщепления необходимо образование многочисленных пар с целевой ДНК.

Hsu 2014 представляет собой обзорную статью, в которой в общих чертах обсуждается история CRISPR-Cas9 от йогуртной культуры до редактирования генома, в том числе генетический скрининг клеток, которая содержится в информации, данных и полученных результатах в заявках, из которых происходит настоящее описание, поданных до 5 июня 2014 г. Общие идеи Hsu 2014 не включают конкретные модели животных из настоящего описания.

Настоящее изобретение относится к конструированию и оптимизации систем, способов и композиций, применяемых для контроля экспрессии генов, включающего целенаправленное воздействие на последовательность, такое как внесение изменений в геном или редактирование генов, связанное с системой CRISPR-Cas и ее компонентами. В преимущественных вариантах осуществления фермент Cas представляет собой Cas9.

Полинуклеотидная последовательность CRISPR-Cas обычно именуется в данном документе направляющей или даже направляющей РНК (sgRNA), хотя будет понятно, что данная терминология ранее не являлась обычной. Дополнительно, в данном документе делается ссылка на систему CRISPR-Cas9, хотя следует иметь в виду, что это общая ссылка на любой Cas, при условии что он обладает функцией нуклеазы для индукции DSB, однонитевого разрыва или двойного однонитевого разрыва, хотя Cas9 является предпочтительным, a SaCas9 является особенно предпочтительным.

Некоторые из основных положений данных по печени в настоящем изобретении обобщены ниже и касаются постмитотических клеток в целом, поскольку клетки печени обычно являются постмитотическими.

AAV2/8

Предпочтительная доставка системы CRISPR-Cas осуществляется посредством вирусного вектора. Этот вектор может представлять собой лентивирусный вектор или вектор на основе AAV, как подробно обсуждается в данном документе. В частности, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что AAV является предпочтительным примером вирусного вектора. В рамках этого авторы настоящего изобретения перешли к демонстрации того, что AAV8 и, в частности, AAV2/8 (AAV8, упакованный с помощью ITR AAV2 в качестве упаковочного сигнала) является применимым для доставки в печень, в особенности in vivo.

Фенотипические изменения, наблюдаемые in vivo

Как обсуждается в другом месте в данном документе, авторы настоящего изобретения были способны продемонстрировать in vivo, что фенотипическое изменение можно выявить. Это является значительным шагом вперед, поскольку недостаток, часто сглаживаемый посредством RNAi, заключается в отсутствии наблюдаемого длительного эффекта. В настоящем изобретении впервые можно увидеть фенотипическое изменение в печени. Предпочтительной схемой для его достижения является применяемая в примере 36. Ее важные элементы являются предпочтительными в отдельности или в комбинации, а именно:

SaCas9;

применение химерной направляющей РНК, содержащей направляющую последовательность, tracr-последовательность и парную tracr-последовательность;

что касается tracr-последовательности, tracr Sa является предпочтительной для привлечения SaCas9;

AAV8 или, более предпочтительно, AAV2/8;

для экспериментальных целей Rosa26 является применимым отрицательным контролем;

хотя применение промотора CMV в векторе AAV является целесообразным, особенно эффективным является применение печеночноспецифического промотора (для целенаправленного воздействия на печень), такого как TBG;

мишень или мишени могут находиться в широком диапазоне, поскольку было показано, что CRISPR имеет широкую применимость среди мишеней, так как ее направляющие последовательности успешно доставляются, а ферменты Css9 экспрессируются надлежащим образом. Однако, предпочтительные мишени в печени (для воздействия на которые могут быть предназначены направляющие последовательности), тем не менее, включают одну или несколько из: PCSK9; Hmgcr; SERPINA1; АроВ и/или LDL.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления особенно предпочтительно, чтобы фермент Cas представлял собой SaCas9. Полинуклеотидная последовательность CRISPR-Cas предпочтительно является химерной и предпочтительно включает в себя tracr Sa, где Cas9 представляет собой SaCas9. Можно применять вирусный вектор, который предпочтительно представляет собой AAV2/8. Кроме того, наиболее подходящим является печеночноспецифический промотор, и предпочтительным примером является TBG. Все из этого можно применять в комбинации с получением химерной полинуклеотидной последовательности CRISPR-Cas, включающей в себя tracr Sa, где Cas9 представляет собой SaCas9, а вектор представляет собой AAV2/8, и по меньшей мере Cas9 находится под контролем печеночноспецифического промотора, такого как TBG. Данная система может быть направлена на любую из вышеприведенных мишеней, в частности, АроВ ввиду его важной роли в ожирении.

В недавней статье Yin и Anderson в Nature Biotech (NBT 2884, упоминаемой в данном документе) дополнительно подтверждены фенотипические изменения in vivo, уже продемонстрированные авторами настоящего изобретения.

Дополнительные данные, приведенные авторами настоящего изобретения, в этом случае дают дополнительное подтверждение посредством демонстрации эффективного редактирования в соматической ткани печени in vivo с помощью Cas9. Более того, доставка с помощью AAV2/8 и применение SaCas9 опять-таки демонстрируют применимость данного конкретного подхода in vivo. На предпочтительный АроВ вновь осуществляли целенаправленное воздействие.

В последующих примерах 36 и 37 показаны превосходные in vivo данные об эффективности индукции фенотипического изменения in vivo: в частности, относительно АроВ, гена, участвующего в метаболизме липидов, при этом в примере 38 показана применимость методики к постмитотическим клеткам, среди которых клетки печени являются важным примером. В примере 39 показано, что для целей выявления предпочтительными являются множественные эпитопные метки.

Хотя предпочтительными являются вирусные векторы, в некоторых вариантах осуществления применение пептидов, проникающих в клетку, является жизнеспособной альтернативой и поэтому также является предпочтительным.

В примере 36 показано, что в случае использования систем CRISPR-Cas наблюдаются как генотипические, так и, что особенно важно, фенотипические изменения. Система CRISPR-Cas9, хотя и не только она, являлась эффективной в индукции фенотипического изменения in vivo.

В частности, мишень представляла собой АроВ, ген, участвующий в метаболизме липидов. Обнадеживающим является то, что можно сказать, что АроВ является ''золотым стандартом'' в доставке в печень и широко применяется в мышиных моделях ожирения. В некоторых вариантах осуществления клетка печени является предпочтительной постмитотической клеткой, хотя она может также быть исключена в других вариантах осуществления. В любом случае, настоящее изобретение обеспечивает подтверждение принципа, заключающегося в том, что фенотипическое изменение наблюдается даже in vivo, и это в равной степени применимо к другим постмитотическим клеткам. Так, пример 39 обеспечивает дополнительное подтверждение этого в отдельной ткани, головном мозге, в случае постмитотических нейронов.

Доставку в примере 37 осуществляли посредством внутривенной инъекции. Применяли вектор на основе AAV, а также печеночноспецифический промотор (TBG) для Cas9.

Доставка посредством экспрессии с вирусного вектора, рассматриваемая здесь, является улучшением по сравнению с предложенным Anderson/Yin (NBT 2884) применением гидродинамической доставки в качестве способа доставки, поскольку для гидродинамической доставки требуется инъекция нескольких мл жидкости, что является стрессовым для организма мыши и может быть смертельным. Гидродинамическая доставка лучше всего подходит для доставки плазмидной (''оголенной'') ДНК, тогда как заявители показали, что упаковка направляющей последовательности и последовательности Cas9 в вирусный вектор доставки является предпочтительной с точки зрения значительно возрастающей эффективности. Более того, необходимо вводить лишь относительно небольшие объемы, и это можно выполнить внутривенно (i.v.), что, вероятно, является намного более приемлемым с терапевтической точки зрения.

Особенно обнадеживающим было то, что для гена, являющегося ''золотым стандартом'' в печени, такого как АроВ, наблюдали не только генотипические изменения, но регистрировали также и фенотипические изменения. Предыдущая работа с PCSK9 показала генотипические, но не фенотипические изменения, так что фенотипические изменения, наблюдаемые для АроВ, подтверждают возможность доставки CRISPR в печень и ее способность к осуществлению фенотипического изменения в ней. Ее применяют в сочетании с более приемлемыми с терапевтической точки зрения способами доставки (i.v. по сравнению с гидродинамической доставкой). В связи с этим вирусная доставка системы CRISPR-Cas9 (направляющей последовательности и Cas9), особенно внутривенная, является предпочтительной.

Потенциальные мишени включают, без ограничения, PCSK9, HMGCR, АРОВ, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, ААТ, FAH, HPD, TAT, ATP7B, UGT1A1, ОТС, ARH.

Соответственно, представлены способы индукции фенотипического изменения in vivo, включающие введение системы CRISPR-Cas9 в целевые клетки, например, в печень. В данном документе описаны подходящие пути доставки, но в некоторых вариантах осуществления предпочтительной является i.v. инъекция. Предпочтительными являются вирусные векторы, в особенности на основе AAV, в частности, AAV серотипа 2/8.

Также представлена система CRISPR-Cas9, содержащая одну или несколько направляющих последовательностей, осуществляющих нацеливание на гены, участвующие в метаболизме липидов, например АроВ. Также предусмотрены способы лечения ожирения, включающие введение указанной системы CRISPR-Cas9. Мышиная модель, содержащая в печени один или несколько генов с нокдауном, в частности, генов, участвующих в метаболизме липидов, например, включающих АроВ, является предпочтительной.

Печеночноспецифические промоторы для Cas9 будут очевидными, но могут включать перечисленные в данном документе. Предпочтительным примером является TBG.

Как показано в примере 38, направляющая последовательность может иметь длину 18-23 нуклеотида. Ее длина может составлять 18-22, или 19-22, или 18-21, 20-22, но предпочтительно 22 и наиболее предпочтительно 21 нуклеотид.

Также представлено подтверждение принципа успешной упаковки направляющей последовательности в интрон SaCas9. Соответственно, системы CRISPR-Cas9, где одна или несколько направляющих последовательностей упакованы (помещены или встроены) в интрон Cas9, являются предпочтительными.

Промотор H1 может применяться и может быть предпочтительным в некоторых обстоятельствах.

Дополняя работу Ran (Cell, 154, 21 Aug 2013), исследовали степень перекрывания в подходе с двумя направляющими последовательностями с использованием двойной никазы D10A. Оптимальные результаты демонстрировались от -5 до +1 п.о. (от 5' до 5'). Соответственно, предпочтительным является применение подхода с двумя направляющими последовательностями для сведения к минимуму нецелевых эффектов. Они предпочтительно перекрываются или близки к перекрыванию на своих 5'-концах в различных нитях ДНК в геномной мишени. Перекрывание предпочтительно находится в диапазоне от -5 до +1 п.о. В этих случаях будет понятно, что Cas9 является двойной никазой, такой как предпочтительный вариант D10A.

Для Cas9 предпочтительными являются множественные или повторяющиеся эпитопные метки. В частности, в примере 39 показана тройная эпитопная метка для улучшения выявления. Метка предпочтительно представляет собой повтор, более предпочтительно тройной повтор. НА является предпочтительной эпитопной меткой для Cas9. Тройная эпитопная НА-метка, таким образом, является предпочтительной в некоторых вариантах осуществления.

В примере 39 представлены следующие конкретные положения. В нем представлены:

первая демонстрация успешной опосредованной AAV доставки Cas9 in vivo, a также эффективной модификации генома в постмитотических нейронах;

разработка методики мечения ядер, позволяющей осуществлять простое выделение ядер нейронов из клеток, экспрессирующих Cas9 и sgRNA;

демонстрация путей применения анализа транскриптома нейрона путем секвенирования РНК;

то, как электрофизиологические исследования и другие методики можно объединить с опосредованным Cas9 внесением изменений в геном для определения фенотипических изменений и

демонстрация мультиплексного целенаправленного воздействия и возможности изучения функций генов по поведению грызунов с помощью опосредованного Cas9 редактирования генома.

На основании этого можно увидеть, что пример 39 предусматривает дальнейшее подтверждение концепции в двух основных областях: в понимании и тестировании функций генов, в том числе создании и тестировании моделей; и в генной терапии.

Дополнительный аспект, обсуждаемый в дальнейшем ниже, относится к способу мечения ядер.

Будет понятно, что ссылка на системы CRISPR-Cas9 в данном документе является сокращенной ссылкой на ферменты Cas9, представленные в данном документе, в комбинации с направляющими последовательностями или направляющими последовательностями, применяемыми для нацеливания на одну или несколько геномных последовательностей. Ссылка на направляющую(направляющие) последовательность(последовательности) включает sgRNA, а также химерные полинуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, содержащие направляющие последовательности, способные к гибридизации с целевыми последовательностями в геноме субъекта, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность.

Данные по сути показывают фенотипические изменения, обусловленные нокдауном генов с помощью двух отдельных систем CRISPR-Cas9 согласно настоящему изобретению (направляющей РНК в комбинации с ферментом Cas9), в данном случае для успешного изменения функционирования генов. Выбранной тканью была ткань головного мозга, но результаты обеспечивают подтверждение принципа действия для широкого диапазона постмитотических тканей. Это является важным отличием, поскольку предыдущая работа была сосредоточена на делящихся клетках (т.е. премитотических).

Иными словами, при том, что SpCas9 широко применялся в генной инженерии делящихся клеток, заявители продемонстрировали, что SpCas9 также можно применять для геномной инженерии постмитотических нейронов. Ее осуществляют с высокой эффективностью посредством опосредованного NHEJ образования вставок/делеций для получения нокдаунов, но также предусмотрены применения в терапии, включающие коррекцию посредством механизма HDR (при обеспечении наличия матрицы для репарации). Оба эти направления зависят от успешной доставки и функциональной экспрессии Cas9 и направляющей или направляющих РНК, что показано в данном документе.

Тот факт, что генотипические изменения, индуцируемые системами CRISPR-Cas9, впоследствии приводят к фенотипическому изменению, также важен для обеих вышеуказанных областей (исследования функций генов и генной терапии).

В первой системе CRISPR-Cas9 использовали направляющие последовательности, направленные на (осуществляющие нацеливание на) Меср2. Двухвекторная система CRISPR-Cas9, в которой один вектор содержит направляющую последовательность, а другой содержит Cas9, использовалась успешно, что предоставляло дополнительное подтверждение принципа действия для таких двухвекторных систем. Двухвекторную систему CRISPR-Cas9 успешно доставляли посредством стереотаксической инъекции в два отдельных участка головного мозга, а именно в зубчатую извилину гиппокампа и зрительную кору. В обоих случаях наблюдалось внесение изменений в гены в отношении одного и того же гена, Меср2, что указывало на успешную доставку двухвекторной системы и ее действие в соответствии с ожиданием, с транскрипцией и функциональной активностью фермента Cas9 (в данном случае SpCas9) и успешным привлечением Cas9 к целевой геномной последовательности с помощью направляющих последовательностей.

Опосредованная AAV доставка SpCas9 и sgRNA in vivo обеспечивает быструю и эффективную технологию осуществления внесения точных изменений в геном в интактных нервных цепях. В силу этого применяемым вектором являлся вектор на основе AAV, что дает дополнительное основание для его применения в общем и в двухвекторных системах CRISPR-Cas9 в частности, в особенности в постмитотических клетках и тканях и, в частности, в головном мозге.

Разумеется, будет понятно, что выбор промотора является важным в осуществлении экспрессии системы CRISPR-Cas9, в частности, Cas9 или как направляющей(направляющих) последовательности(последовательностей), так и Cas9. Подходящие примеры специфичности к клетке и стадии жизненного цикла клетки можно определить из литературы. Тем не менее, некоторые неограничивающие примеры включают: TBG, печеночноспецифический промотор, применяемый в данном документе для управления экспрессией SaCas9; промотор H1; усеченный промотор H1; промотор U6. Также, поскольку для направляющих последовательностей не обязательно нужен конкретный промотор, одна или несколько направляющих последовательностей могут быть упакованы аналогичным образом в интрон Cas9.

Вторая применяемая система CRISPR-Cas9 предусматривает мультиплексный подход. Одним из ключевых преимуществ системы SpCas9 является ее способность к облегчению мультиплексного редактирования генома. Эта вторая система успешно целенаправленно воздействовала на три или более генов из одного семейства (в данном случае Dmnt1, 3а и 3b) благодаря включению подходящих направляющих последовательностей и приводила к стабильным нокаутам нескольких генов. Это явление широко применяется для изучения функций не только отдельных генов, но также и целых семейств генов в тканях живых животных. Оно является особенно важным для таких тканей, как головной мозг, где оно не было возможным ранее или могло быть достигнуто лишь спустя долгие годы применения методов классической генетики. Заявители показали, что у нормального животного в постмитотических клетках может иметь место внесение изменений (и даже полный нокдаун) в один или несколько генов. Это, однако, в равной степени можно применять к модельному организму (например, уже несущему мутацию или внесенное изменение в гене или имеющему некоторым образом измененную экспрессию) или трансгенному организму, предоставляя быструю альтернативу существующим способам получения модельных организмов и применения модельных организмов для понимания функций генов. Для осуществления последующих циклов внесения изменений в гены и/или возобновления их действия (восстановление функции гена, например, путем коррекции гена с внесенными изменениями посредством обеспечения наличия, например, матрицы для репарации, такой как ssDNA, подходящей для HDR) в том же организме можно использовать дополнительные направляющие последовательности (и/или целые системы CRISPR-Cas9).

Известно, что при опосредованном SpCas9 целенаправленном воздействии на один или несколько генов, как правило, могут воспроизводиться морфологические, электрофизиологические и поведенческие фенотипы, наблюдаемые при применении классических, более трудоемких генетических мышиных моделей.

Альтернативно нокдауну целых семейств генов или родственных генов, данные, приведенные в данном документе, также предоставляют подтверждение принципа, что в равной степени возможен одновременный нокдаун трех или более неродственных генов. Это применимо ко всем тканям, но особенно убедительно представлено в отношении постмитотических тканей, особенно головного мозга.

Другим применимым аспектом данной работы является то, что она продемонстрировала, что для исследования функций генов можно прибегнуть к комбинированному, или интегрированному, подходу, в котором используют CRISPR для осуществления генотипического изменения, а затем используют классические инструменты, такие как электрофизиологическое исследование (особенно в отношении ткани головного мозга и CNS), снятие биохимических, относящихся к секвенированию, электрофизиологических и/или поведенческих показателей, для установления того, какие фенотипические изменения, если они имеют место, обусловлены генотипическим изменением, индуцированным системой CRISPR-Cas9. Например, в головном мозге он позволяет изучать функции отдельных генов, а также их групп в нервных процессах и их роль в мозговых нарушениях in vivo.

Успешное внесение изменений в гены в данной работе в равной степени применимо для коррекции или восстановления функции гена, т.е. для применения систем CRISPR-Cas9 в генной терапии. В частности, это относится к целенаправленному воздействию в постмитотических клетках, особенно в головном мозге.

В целом, применение систем CRISPR-Cas9 демонстрирует улучшения по сравнению с существующими методиками, такими как применение Zn-пальцев, разработка и получение которых занимает длительное время и которые не могут функционировать в мультиплексе, и shRNA, которые имеют слишком много нецелевых эффектов, тогда как нецелевые эффекты CRISPR можно свести к минимуму путем применения подходов с двойной никазой.

Целенаправленное воздействие в тканях

В работе в данном документе обосновано применение систем CRISPR-Cas9 для целенаправленного воздействия на гены в постмитотических клетках посредством доставки системы CRISPR-Cas9 в соответствующий участок (т.е. в клетки в органах или тканях, представляющих интерес). Предпочтительные ткани находятся в следующих органах:

почке;

пищеварительной системе, в том числе желудке, поджелудочной железе, двенадцатиперстной кишке, подвздошной кишке и/или толстой кишке;

сердце;

легком;

головном мозге, в частности нейроны, и/или ЦНС в целом;

глазу, в том числе ткань сетчатки;

ухе, в том числе внутреннее ухо;

коже;

мышце;

кости и/или

печени в целом.

Будет понятно, что многие из вышеперечисленных органов могут содержать премитотические клетки, но данный аспект настоящего изобретения направлен на постмитотические клетки или ткани в этих органах.

В частности, для заявителей предпочтительным органом является почка или головной мозг. Данные, в частности, демонстрируют доставку в зубчатую извилину гиппокампа и зрительную кору в головном мозге, которые являются предпочтительными тканями, хотя другие ткани, включающие любое одно или несколько из следующего: первичную моторную кору, первичную слуховую кору, первичную соматосенсорную кору, мозжечок, главную обонятельную луковицу, префронтальную кору, эндопириформное ядро, миндалевидное тело, черную субстанцию, полосатое тело, бледный шар, таламус, гипоталамус, парабрахиальное ядро, верхний оливарный комплекс, кохлеарные ядра, ядра сосцевидных тел, также являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления.

Клетки из головного мозга и, в частности, нейроны являются особенно предпочтительными.

Выбор промотора для управления экспрессией системы CRISPR-Cas9, в частности Cas9, является важным, как упоминается выше. При выборе промотора необходимо учитывать стадию клеточного цикла (раннюю/позднюю) и тип клеток, поскольку промоторы будут специфичными к одному или нескольким типам клеток и одной или нескольким стадиям клеточного цикла. Подходящие промоторы могут в некоторых вариантах осуществления включать в себя любой один или несколько из следующих.

В двухвекторной системе CRISPR-Cas9, применяемой для целенаправленного воздействия в головном мозге, в частности, в зубчатой извилине гиппокампа, кассеты экспрессии SpCas9 и sgRNA упакованы в два отдельных вирусных вектора. Cas9, в частности, SpCas9, таким образом, предпочтительно доставляют с помощью аденовирусных векторов, в частности AAV (т.е. в виде AAV-SpCas9). Направляющие последовательности предпочтительно доставляют в виде кассет экспрессии sgRNA с помощью аденовирусных векторов, в частности на основе AAV (т.е. в виде AAV-Sp-направляющая последовательность). Предпочтительным путем для данной ткани (зубчатой извилины гиппокампа) и для головного мозга в целом является стереотаксическая инъекция.

Понимание и тестирование функций генов и создание и применение моделей для этого

Состояния, которые могут быть рассмотрены, включают болезнь Гентингтона, но по сути включают любое состояние, обнаруживаемое в постмитотических клетках, и особенно те, изучение которых in vivo может принести пользу или для которых отсутствует применимая модель.

Как упоминается выше, системы CRISPR-Cas9 можно применять для исследования функций одного или нескольких генов в постмитотических клетках. Это можно осуществлять посредством доставки системы CRISPR-Cas9 в постмитотическую клетку и ее экспрессии в ней, где направляющая(направляющие) последовательность(последовательности) системы CRISPR-Cas9 предназначены для привлечения Cas9 к геномной мишени или мишеням, представляющим интерес. В то же время, если Cas9 уже содержится в постмитотической клетке в форме белка (транскрибированной), то будет достаточно доставить в постмитотическую клетку направляющие последовательности. Если Cas9 уже содержится в постмитотической клетке в форме полинуклеотида (нетранскрибированной), то будет необходима доставка направляющих последовательностей в постмитотическую клетку, а также индукция транскрипции полинуклеотида Cas9. В данном случае может быть преимущественным наличие Cas9 под контролем индуцируемого или репрессируемого промотора, такого как система tet-on/off (тетрациклиновая).

Одним особенно перспективным аспектом является объединение методик CRISPR с фенотипическими анализами для определения фенотипических изменений, если они имеют место, обусловленных внесением изменений в гены, в частности, нокдаунами. Например, в примере 39 показано, чего можно достичь с помощью целенаправленного внесения изменений в геном в сочетании со снятием количественных показателей для обеспечения проникновения в сущность биологических функций конкретных элементов генома. В частности, опосредованное Cas9 редактирование генома в головном мозге in vivo можно также сочетать с электрофизиологической регистрацией для изучения эффекта от внесения изменений в геном в отношении конкретных типов клеток или компонентов нервной цепи. В более широком смысле применение систем CRISPR-Cas9 (для обеспечения опосредованного Cas9 внесения изменений в геном) можно объединять с биохимическим, связанным с секвенированием, электрофизиологическим и поведенческим анализом для изучения функций элемента генома, подвергнутого целенаправленному воздействию.

Таким образом, в одном аспекте представлен способ исследования функций одного или нескольких генов в постмитотической клетке, включающий:

индукцию дефектного генотипа или нокдауна генов, как описано ниже; и

определение изменений в экспрессии одного или нескольких генов в данном состоянии с исследованием, таким образом, функций одного или нескольких генов.

Способ также необязательно может включать

трансплантацию второй популяции клеток субъекту с индукцией, таким образом, состояния, ассоциированного с дефектным генотипом или нокдауном генов. Это может предшествовать этапу определения.

Следующее относится в широком смысле к соответствующим аспектам настоящего изобретения. Клетка может находиться в субъекте, таком как человек, животное или модельный организм, так что функции генов исследуют in vivo. Однако, также предусмотрено, что клетка может находиться ех vivo, например, в клеточной культуре или в модельном органе или органоиде. В некоторых вариантах осуществления способ может включать выделение первой популяции клеток из субъекта, необязательно их культивирование и их трансдукцию одной или несколькими системами CRISPR-Cas9. За этим может следовать необязательное дополнительное культивирование. Затем может происходить трансплантация трансдуцированных клеток обратно субъекту.

Клетка может быть получена из любой ткани или органа, описанных в данном документе. Головной мозг является одним предпочтительным примером, обеспечивающим осуществление указанного способа исследования функций одного или нескольких генов, где постмитотическая клетка является клеткой головного мозга, например, нейроном. В частности, он обеспечивает исследование функций генов, касающихся поведения животного, in vivo. Животное предпочтительно является млекопитающим, например, грызуном. С учетом сложности нервной системы, состоящей из переплетенных сетей разнородных типов клеток, способность к эффективному редактированию генома нейронов in vivo позволяет осуществлять прямое тестирование функций генов в надлежащих типах клеток, погруженных в естественное окружение. Это подтверждается данными заявителей, где нокаутные мыши демонстрировали ухудшение консолидации памяти при тестировании в условиях тренировочного контекста. Результаты заявителей демонстрируют, что опосредованный CRISPR-Cas9 нокаут представителей семейства DNMT в нейронах зубчатой извилины является достаточным для изучения функций генов в поведенческих задачах.

Это показывает универсальность Cas9 в облегчении целенаправленного нокаута генов в головном мозге млекопитающих in vivo для изучения функций генов и, в частности, для анализа нейронных цепей. Введение стабильных нокаутов нескольких генов в головной мозг живых животных будет иметь потенциально многообещающие применения, такие как казуальное исследование полигенных механизмов, лежащих в основе физиологических и невропатологических состояний.

Характерной особенностью данной работы является то, что заявители выбрали промотор Меср2 мыши (235 п.о., рМеср2)7 и минимальный сигнал полиаденилирования (48 п.о., spA) на основании их способности к обеспечению достаточных уровней экспрессии SpCas9 в культивируемых первичных кортикальных нейронах мыши. Ген Меср2 играет важнейшую роль при синдроме Ретта, типе расстройства аутистического спектра. Для целенаправленного воздействия на Меср2 заявители вначале разработали несколько sgRNA, осуществляющих нацеливание на экзон 3 гена Меср2 мыши, и оценивали их эффективность с применением клеток Neuro-2a. Наиболее эффективную sgRNA идентифицировали путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR. Доставку осуществляли посредством стереотаксической инъекции смеси (в соотношении 1:1) векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность высокого титра. Заявители также успешно протестировали возможность мультиплексного редактирования генома в головном мозге; заявители разработали мультиплексный вектор экспрессии sgRNA, состоящий из трех sgRNA в тандеме вместе с GFP-KASH для мечения ядер.

Таким образом, также представлены способы индукции состояний, характеризирующихся одним или несколькими нокдаунами генов в постмитотической клетке. Примеры таких состояний являются многочисленными, но могут включать синдром Ретта, проиллюстрированный на примере. Подходящие промоторы будут очевидными, и промотор Меср2 является наиболее подходящим для синдрома Ретта. Одним из способов выбора промотора для управления экспрессией системы CRISPR-Cas9, в частности, Cas9, является выбор промотора для гена, представляющего интерес.

Таким образом, в одном аспекте представлен способ индукции состояний, характеризующихся одним или несколькими дефектными генами (или генотипами) или нокаутами генов в постмитотической клетке, который может включать:

трансдукцию первой популяции клеток не встречающейся в природе или сконструированной композицией, содержащей векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих

первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит

одну, две, три, четыре или более направляющих последовательностей, способных к гибридизации с тремя или более целевыми последовательностями в геноме субъекта,

парную tracr-последовательность, и

tracr-последовательность, и

второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации,

где компоненты I и II находятся в одном и том же или разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплексов CRISPR с целевой последовательностью,

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью,

где фермент CRISPR изменяет геном клеток первой популяции с получением второй популяции клеток, содержащих один или несколько дефектных генов или генов с нокдауном.

Способ также необязательно может включать

выделение первой популяции клеток из субъекта.

Способ также необязательно может включать

трансплантацию второй популяции клеток субъекту с индукцией, таким образом, пролиферативного состояния.

Она может включать индукцию нефункционального (которое включает частично нефункциональное) состояния генотипа в целевой клетке с получением, таким образом, модели для изучения (в том числе будущего восстановления функционального генотипа).

Системы CRISPR-Cas9 также можно применять для облегчения изучения функций генов в клеточных анализах путем обеспечения целенаправленного нокаута в постмитотических нейронах.

Способы доставки нуклеотидов в нервные клетки хорошо известны и рассматриваются Karra and Dahm в The Journal of Neuroscience (5 May 2010, 30(18): 6171-6177; doi: 10.1523/JNEUROSCI.0183-10.2010). Примеры включают электрические способы трансфекции (такие как электропорация, нуклеофекция и электропорация отдельных клеток); химические способы трансфекции (такие как совместное осаждение фосфатом Са2+ и липофекция); вирусная доставка (как, например, с помощью аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса и вируса простого герпеса) и физические способы трансфекции (такие как микроинъекция и баллистическая трансфекция (применение частиц золота, покрытых ДНК)). Все их можно применять для доставки системы CRISPR-Cas9, но липофекция или вирусные способы, в особенности с применением AAV или лентивируса, являются предпочтительными.

Модели

Представлены модели с нокдауном одного или нескольких генов. Примером может быть модель синдрома Ретта с нокдауном Меср2 на грызунах. В других моделях предусмотрены нокдауны генов семейства Dmnt, в частности, нокдауны Dmnt1, 3а и 3b. В силу этого представлены модели, в которых изучают неврологические состояния. Все, что должно быть сделано - это идентификация целевых генов, представляющих интерес, разработка подходящей(подходящих) направляющей(направляющих) последовательности(последовательностей) и включение их в состав подходящей системы CRISPR-Cas9, а также ее доставка в постмитотическую(постмитотические) клетку(клетки) in vivo либо ex vivo в соответствии с требованиями. Например, представлены модели, которые могут иметь измененную морфологию дендритного дерева и/или плотность шипиков.

Как упоминается выше, представлены также модельные ткани, такие как органоиды или ''печень на чипе'' или их эквиваленты, отличные от печени, такие как ткани уха, почки и головного мозга, например, на чипе или закрепленные на подложке. Предпочтительными являются животные модели и модельные ткани. Они могут быть уже трансформированы с помощью Cas9, так что они содержат Cas9 в форме нуклеотида или белка, как упоминается выше. Их преимущество заключается в том, что Cas9 не нужно доставлять вместе с направляющей(направляющими) последовательностью(последовательностями), и это, в свою очередь, может обеспечивать значительно более высокую степень мультиплексирования направляющих последовательностей, которые следует поместить в векторы доставки. В этом случае применение индуцируемых или репрессируемых систем, таких как tet-on или tet-off, здесь также может быть преимущественным.

Все эти модели можно получить с применением системы CRISPR-Cas9, как описано выше. Ввиду универсальности системы CRISPR-Cas9 диапазон возможных моделей, на человеке, грызунах, млекопитающих либо иных, является весьма разнообразным, и он может быть установлен путем простого выбора соответствующей(соответствующих) направляющей(направляющих) последовательности(последовательностей). Также представлены способы создания таких моделей, которые включают следующее.

Генная терапия

Данные в примере 39 сосредотачивают внимание на внесении изменений в гены, главным образом на нокдауне. Нокдаун генов, вероятно, является лишь небольшой, хотя и важной частью общей совокупности возможных применений систем CRISPR-Cas9 в генной терапии. Как уже было показано в статье Yin and Anderson (Nature Biotech 2884, опубликованной в режиме онлайн 30 марта 2014 г.), функциональный фенотип можно восстановить после коррекции мутации недостаточности при наследственной тирозинемии I типа (HTI), в иных случаях смертельном состоянии, вызываемом мутацией фумарилацетоацетатгидролазы (FАН) (замена G на А в последнем нуклеотиде экзона 8), вызывающей пропуск экзона 8 при сплайсинге и обуславливающей образование усеченного нестабильного белка FAH, что приводит к накоплению токсичных метаболитов. Коррекция мутации А с возвращением к генотипу G дикого типа приводила к восстановлению фенотипа.

В силу этого подходы, принятые в настоящей работе, демонстрируют, что настоящее изобретение, вероятно, может применяться в генной терапии. В частности, подход с двумя векторами, подход с мечением ядер, характерные особенности доставки в головной мозг (форма инъекции, применяемые промоторы и/или вирусные векторы), а также мультиплексирование (применение нескольких направляющих последовательностей для нескольких мишеней в одном и том же либо в разных генах) можно в равной степени применять в коррекционной генной терапии (т.е. где коррекции подвергается дефектный генотип), а также и в проиллюстрированном на примере нокдауне генов. Основным различием между коррекционной генной терапией и нокдауном генов является то, что в целях коррекции дефектного генотипа, как, например, точечной мутации (например, при муковисцидозе, см. ссылку на Schwank et al, Cell Stem Cell 13, 653-658 5 Dec 2013), преимущественным является обеспечение наличия матрицы для репарации для стимуляции механизма HDR, а в идеальном случае также обеспечение наличия подходящей никазы Cas9.

Соответственно, векторы по настоящему изобретению предпочтительно целенаправленно воздействуют на постмитотические клетки. Если направляющая последовательность или направляющие последовательности осуществляют нацеливание на дефектный генотип, то они предпочтительно также представлены вместе с матрицей для репарации, например ssDNA, соответствующей скорректированной последовательности (генотипу, обеспечивающему наличие функционального фенотипа). Матрицы для репарации описаны в данном документе. Cas9 можно предусматривать в том же векторе, что и направляющую последовательность или направляющие последовательности, или в другом векторе. Векторы предпочтительно являются вирусными векторами, более предпочтительно аденовирусными векторами и наиболее предпочтительно векторами на основе AAV. Доставку в клетки предпочтительно осуществляют посредством внутривенной инъекции или посредством стереотаксической инъекции в соответствующих случаях. Выбор промотора также может быть важен, и предпочтительные примеры приведены в данном документе.

Представлены способы лечения генетических заболеваний или состояний, обусловленных или ассоциированных с дефектным генотипом в постмитотических клетках, включающие доставку системы CRISPR-Cas9 в соответствующую клетку. Дефектный генотип может представлять собой генотип, отличный от дикого типа. В частности, одиночные точечные мутации и/или моногенные нарушения особенно подходят для лечения с помощью систем CRISPR-Cas9. Если редактирования или коррекции требуют несколько генов, то для одновременного целенаправленного воздействия на всех них можно применять мультиплексный подход. Альтернативно, могут быть предусмотрены два или более цикла применения различных систем CRISPR-Cas9. Целью коррекции предпочтительно является получение генотипа дикого типа. Он не обязательно должен быть наиболее распространенным генотипом, при условии, что в фенотипе восстанавливается или улучшается функция.

Примером восстановленного фенотипа является восстановление слуха с восстановлением функции VGLUT3 во внутреннем ухе и, следовательно, слуха у мышей (Omar Akil, Rebecca P. Seal, Kevin Burke, Chuansong Wang, Aurash Alemi, Matthew During, Robert H. Edwards, Lawrence R. Lustig. Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally Mediated Gene Therapy, Neuron, 2012; 75 (2): 283 DOI: 10.1016/j.neuron.2012.05.019). Его осуществляли с помощью опосредованной AAV доставки самого VGLUT3, но вполне вероятно, что также можно было применять систему CRISPR-Cas9, предпочтительно также с помощью векторов на основе AAV, для целенаправленного воздействия в клетках внутреннего уха и коррекции нефункционального генотипа VGLUT3 с аналогичными фенотипическими последствиями, а именно восстановлением слуха. В силу этого предпочтительной является доставка системы CRISPR-Cas9 во внутреннее ухо, предпочтительно, с помощью векторов на основе AAV с лечением, таким образом, потери слуха. В связи с этим можно заметить, что предпочтительным является восстановление функций генов в органах чувств, таких как глаз, в том числе сетчатка, нос и ухо (в частности, внутреннее ухо).

Сравнительно недавний обзор, включающий обсуждение нарушений в постмитотических тканях (в глазу, ухе и за их пределами), представлен Kaufmann и соавт. (ЕМВО Mol Med (2013, 5, р. 1642-1661). Это подтверждает применимость AAV в коррекции моногенных нарушений в постмитотических тканях. В нем отмечено, что ''в сочетании с другими характеристиками, такими как низкая воспалительная активность, они продемонстрировали, что обладают превосходным профилем безопасности и поэтому являются весьма привлекательными инструментами для генной терапии in vivo. Так, Glybera® является рекомбинантным AAV для прямой внутримышечной инъекции…''. В данной статье вместе с цитируемыми документами рассматривается генная терапия в сетчатке, центральной нервной системе, печени, скелетной мускулатуре и сердечной мышце в качестве целевых тканей. Также в ней вместе с цитируемыми документами указано, что ''в начальных исследованиях использовали вектор-прототип на основе AAV серотипа 2, ассортимент векторов на основе AAV недавно был расширен с включением дополнительных серотипов и даже сконструированных капсидов''. Статья Kaufmann и документы, цитируемые в статье Kaufmann, настоящим включены в данный документ с помощью ссылки.

Анализ транскриптома путем секвенирования РНК

Комбинация опосредованного SpCas9 внесения изменений в геном и анализа путем секвенирования РНК на популяционном уровне дает возможность охарактеризовать регуляцию транскрипции и предположить, какие гены могут быть важными для конкретных функций или болезненных процессов в рассматриваемых клетках. В частности, клетки являются клетками головного мозга, в частности, нейронами. Быстродействующие методики, такие как применение системы CRISPR-Cas9, являются преимущественными в изучении транскриптома, который по своей природе является изменчивым. В силу этого представлено применение систем CRISPR-Cas9 согласно настоящему изобретению в анализе транскриптома (секвенировании РНК).

Способ мечения ядер

Для облегчения иммунофлуоресцентной идентификации нейронов, экспрессирующих SpCas9, заявители метили SpCas9 эпитопной НА-меткой (полученной из гемагглютинина вируса гриппа человека, обычной эпитопной меткой, широко применяемой в векторах экспрессии).

Заявители упаковывали в вектор AAV-Sp-направляющая последовательность кассету экспрессии U6-sgRNA, а также зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с ядерным трансмембранным доменом KASH, под управлением промотора гена синапсина I человека. Белок слияния GFP-KASH направляет GFP во внешнюю ядерную мембрану и обеспечивает флуоресцентную идентификацию и очистку интактных ядер нейронов, трансдуцированных вектором AAV-Sp-направляющая последовательность.

Соответственно, векторы по настоящему изобретению предпочтительно приспосабливают аналогичным образом. Таким образом, представлены векторы, где Cas9 помечен эпитопной меткой, такой как эпитопная НА-метка. Cas9 может представлять собой любой Cas9, описанный в данном документе, например, Sp или SaCas9, и может представлять собой любой вариант (такой как двойная никаза D10A и т.д.), при условии, что он помечен или может быть помечен соответствующим образом.

Векторы по настоящему изобретению могут также быть приспособлены так, чтобы направляющая РНК была упакована в кассету экспрессии, которая содержит:

репортерный белок и

необязательно подходящий промотор для направляющей РНК, такой как U6;

где репортерный белок слит с ядерным трансмембранным доменом, функционально связанным с подходящим для него промотором.

Репортерный белок предпочтительно представляет собой флуоресцентный белок,

например, один из зеленого, красного или желтого флуоресцентных белков (GFP, RFP, YFP) и т.д.

Примеры ядерных трансмембранных доменов включают KASH-подобные домены, домены Sun2, домены LEM. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ядерный трансмембранный домен представляет собой ядерный трансмембранный домен KASH. Промотор для трансмембранного домена предпочтительно представляет собой промотор гена синапсина I человека; см. также документы, цитируемые в данном документе.

Данный подход с мечением можно применять в рамках одновекторных или двухвекторных систем, но предпочтительно в рамках двухвекторных систем, поскольку в одновекторных системах пространство ограничено, и необходимость в отдельных метках также снижается.

Дополнительно, каждый аспект данной методики мечения можно применять независимо от другого, так что эпитопное мечение Cas9 можно применять в отдельности, или подход с кассетой с репортерным/флуоресцентным белком можно применять в отдельности, или, более предпочтительно, оба их можно применять вместе.

Публикация Kanasty and Anderson (Nature Materials, Vol 12 Nov 2013), изначально поданная 11 марта 2013 г. и опубликованная в режиме онлайн 23 октября 2013 г., является полезным обзором доставки средств для RNAi. Ввиду сходств между средствами для RNAi и направляющими последовательностями CRISPR идеи этого и других источников из уровня техники в отношении RNAi являются информативными относительно механизмов доставки направляющих последовательностей в системе CRISPR-Cas9 от заявителей. Некоторые из описанных методик также подходят для доставки Cas9. В некоторых случаях может быть целесообразной доставка направляющих последовательностей системы CRISPR-Cas9 от заявителей отдельно от Cas9.

Она может быть частью двухвекторной системы доставки, где векторы рассматриваются в самом широком смысле попросту как любые средства доставки, а не как конкретные вирусные векторы. Предусмотрено, что Cas9 можно доставлять с помощью вирусного вектора, и что направляющие последовательности, специфичные к геномным мишеням, доставляют отдельно. Как обсуждается в данном документе, направляющие последовательности можно доставлять с помощью тех же типов векторов, что и в случае Cas9, например, с использованием двухвекторной системы, где Cas9 доставляют в векторе на основе AAV, а направляющую(направляющие) последовательность(последовательности) доставляют в отдельном векторе на основе AAV. Это можно осуществлять практически одновременно (т.е. путем совместной доставки), но это также можно осуществлять в разные моменты времени, разделенные даже несколькими неделями или месяцами. Например, если были доставлены системы CRISPR-Cas9 для первого цикла, но затем впоследствии требуется обеспечение наличия дополнительных направляющих последовательностей, то первоначальный Cas9, который, как следует надеяться, по-прежнему является функциональным в целевых клетках, можно использовать повторно. Если Cas9 находится под контролем индуцируемого промотора, то предпочтительной является индукция транскрипции нового Cas9 в целевых клетках. В то же время, если применяется модель, экспрессирующая Cas9, представленная в данном документе, то необходимой является только доставка направляющей(направляющих) последовательности (последовательностей). Соответственно, если требуется доставка направляющей(направляющих) последовательности(последовательностей) отдельно от Cas9, то их можно доставлять практически таким же образом, как и средство для RNAi.

В силу этого обзор Kanasty является полезным в том, что указывает на ряд известных подходов, являющихся подходящими, сосредотачивая особое внимание на печени, хотя средства доставки, как правило, пригодны для широкого диапазона клеток. Примеры включают следующее:

''липосомную систему доставки, а также siRNA, конъюгированные с липофильными молекулами, которые взаимодействуют с сывороточными липопротеинами и впоследствии проникают в гепатоциты, поглощающие эти липопротеины'';

пегилирование;

конъюгаты, такие как:

динамические поликонъюгаты (DPC, наночастицы размером 10 нм), которые, как было показано, доставляют средства для RNAi с успешным подавлением экспрессии АроВ (что, таким образом, пересекается с работой заявителей по целенаправленному воздействию на АроВ с помощью системы CRISPR-Cas9); и

трехантенные конъюгаты GalNAc

являются ''высокоэффективными в обеих категориях'', в особенности GalNAc;

другие наночастицы, в том числе:

полимерные наночастицы на основе циклодекстрина (CDP), включающие дополнительные компоненты состава, такие как адамантин-PEG (AD-PEG) и адамантин-PEG-трансферрин (AD-PEG-Tf);

липидные наночастицы (LNP), включающие катионные или ионизируемые липиды, экранирующие липиды, холестерин и эндогенные или экзогенные нацеливающие лиганды. Примером эндогенного нацеливающего лиганда является ретинол-связывающий белок (RBP), применимый для нацеливания на звездчатые клетки печени и поджелудочной железы, которые экспрессируют рецептор RBP. Примером экзогенного нацеливающего лиганда является GalNac, который также осуществляет нацеливание на печень посредством асиалогликопротеинового рецептора на поверхности гепатоцитов. В ALN-VSP от Anlylams представлен комбинированный подход;

''фенестрация эндотелия печени позволяет молекулам диаметром 100-200 нм диффундировать из кровотока и получать доступ к гепатоцитам и другим клеткам печени'';

лиганды, такие как GalNAc, подходят для доставки в непаренхимные клетки печени, экспрессирующие маннозный рецептор, и в гепатоциты, где, как было показано, конъюгация подходящей siRNA с лигандом GalNAc обеспечивает успешное подавление экспрессии PCSK9; и

олигонуклеотидные наночастицы (ONP), состоящие из комплементарных фрагментов ДНК, предназначенных для гибридизации в предварительно определенную 3D-структуру. С помощью подходящих последовательностей с ''липкими'' 3'-концами к каждой частице могут быть прикреплены, и даже в определенном положении, 6 нитей siRNA. Гидродинамический диаметр составлял приблизительно 29 нм.

Эти подходы в некоторых вариантах осуществления являются предпочтительными для доставки по меньшей мере направляющих последовательностей системы CRISPR-Cas9. Особенно предпочтительными являются динамические поликонъюгаты или применение эндогенных нацеливающих лигандов, таких как ретинол-связывающий белок, или экзогенных нацеливающих лигандов, таких как GalNac.

В еще одном варианте осуществления редактирование генома, опосредованное CRISPR-Cas9, можно применять для коррекции мутации и/или фенотипа, связанных с заболеванием. Это редактирование генома, опосредованное CRISPR-Cas9, можно применять для коррекции мутации и/или фенотипа, связанных с заболеванием, в печени и/или гепатоцитах, что проиллюстрировано в рукописи Нао Yin и соавт. под названием ''Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype'', опубликованной в Nature Biotechnology, опубликованной в режиме онлайн 30 марта 2014 г.; исправленной в режиме онлайн 31 марта 2014 г., доступной на веб-сайте nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2884, включенной в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. Данная статья относится к опосредованной CRISPR-Cas9 коррекции мутации Fah в гепатоцитах в мышиной модели заболевания человека врожденной тирозинемии. Было показано, что доставка компонентов системы CRISPR-Cas9 с помощью гидродинамической инъекции приводила к исходному уровню экспрессии белка Fah дикого типа в ~1/250 клеток печени. Было дополнительно показано, что размножение Fah-положительных гепатоцитов избавляло от фенотипа потери массы тела.

Преимущество способов по настоящему изобретению заключается в том, что система CRISPR избегает нецелевого связывания и возникающих в результате этого побочных эффектов. Это достигается при применении систем, предусматривающих наличие высокой степени специфичности к последовательности в отношении целевой ДНК.

Cas9

Оптимизацию Cas9 можно применять для улучшения функционирования или для формирования новых функций, можно создавать химерные белки Cas9. Созданные заявителями образцы представлены в примере 6. Химерные белки Cas9 можно получать путем объединения фрагментов от различных гомологов Cas9. Например, в данном документе описаны два иллюстративных химерных белка Cas9 из группы Cas9. Например, заявители слили N-конец St1Cas9 (фрагмент из этого белка выделен жирным шрифтом) с С-концом SpCas9. Преимущество от создания химерных Cas9 включает любое или все из следующего: пониженной токсичности; улучшенной экспрессии в эукариотических клетках; повышенной специфичности; сниженного молекулярного веса белка, например получения меньшего белка за счет объединения наименьших доменов от различных гомологов Cas9; и/или изменения требований к последовательности РАМ.

Cas9 можно использовать в качестве стандартного ДНК-связывающего белка. Например, как показано в примере 7, заявители использовали Cas9 в качестве стандартного ДНК-связывающего белка путем внесения мутации в два каталитических домена (D10 и Н840), ответственных за расщепление обеих нитей ДНК-мишени. С целью повышающей регуляции транскрипции гена в целевом локусе заявители слили домен активации транскрипции (VP64) с Cas9. Известны и другие домены активации транскрипции. Как показано в примере 17, активация транскрипции является возможной. Как также показано в примере 17, репрессия генов (в этом случае гена бета-катенина) возможна при использовании репрессора Cas9 (ДНК-связывающего домена), который связывается с последовательностью целевого гена, тем самым подавляя ее активность.

Cas9 и одну или несколько направляющих РНК можно доставлять при помощи аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса, аденовируса или других типов плазмидных или вирусных векторов, в частности, с применением составов и доз, например, из патентов США №№8454972 (составы, дозы для аденовируса), 8404658 (составы, дозы для AAV) и 5846946 (составы, дозы для ДНК-плазмид) и из клинических испытаний и публикаций относительно клинических испытаний, предусматривающих использование лентивируса, AAV и аденовируса. Например, для AAV путь введения, состав и доза могут быть такими, как в патенте США №8454972 и в клинических испытаниях, предусматривающих использование AAV. Для аденовируса путь введения, состав и доза могут такими, как в патенте США №8404658 и в клинических испытаниях, предусматривающих использование аденовируса. Для доставки с помощью плазмид путь введения, состав и доза могут быть такими, как определено в патенте США №5846946 и в клинических испытаниях, предусматривающих использование плазмид. Дозы могут быть определены в расчете на среднего индивидуума массой 70 кг или экстраполированы на такого индивидуума, и их можно корректировать для пациентов, субъектов, млекопитающих с другой массой и из другого вида. Кратность введения находится в пределах компетенции практикующего врача или ветеринара (например, врача-терапевта, ветеринарного врача) и зависит от обычных факторов, в том числе от возраста, пола, общего состояния здоровья, других состояний пациента или субъекта и конкретных состояний или симптомов, на которые направлено лечение.

Вирусные векторы можно инъецировать в представляющую интерес ткань. В случае модификации генома, специфичной к типу клетки, экспрессия Cas9 может управляться промотором, специфичным к типу клеток. Например, при печеночноспецифической экспрессии может использоваться промотор гена альбумина, а при нейрон-специфической экспрессии может использоваться промотор гена синапсина I.

Трансгенные животные и растения

Также представлены трансгенные животные (модели), и следующее в равной степени относится к модельным тканям и совокупности тканей ex vivo, таким как органоиды, печень на чипе и т.д. Предпочтительные примеры включают животных, содержащих Cas9, в виде полинуклеотидов, кодирующих Cas9, или белка самого по себе. Предпочтительными являются мыши, крысы и кролики. Для получения трансгенных мышей с конструкциями, приведенными в качестве примера в данном документе, можно инъецировать чистую линейную ДНК в пронуклеус зиготы от псевдобеременной самки, например, самки СВ56. Особей-основателей можно затем идентифицировать, генотипировать и подвергать возвратному скрещиванию с мышами СВ57. Затем конструкции можно клонировать и необязательно проверять, например, посредством секвенирования по Сэнгеру. Предусматриваются нокауты, где, например, один или несколько генов в модели подвергают нокауту. Однако, также предусматриваются нокины (отдельно или в комбинации). Была получена иллюстративная мышь, нокинная по Cas9, и это представлено в качестве примера, при этом нокины Cas9 являются предпочтительными. Для создания нокина Cas9 у мышей можно целенаправленно воздействовать теми же конструкциями для конститутивной и условной экспрессии на локус Rosa26, как описано в данном документе (фигуры 25А-В и 26). Способы из публикаций заявок на патенты США №№20120017290 и 20110265198, закрепленные за Sangamo BioSciences, Inc., связанные с целенаправленным воздействием на локус Rosa, можно модифицировать для использования системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления способы из публикации заявки на патент США №20130236946, закрепленной за Cellectis, связанные с целенаправленным воздействием на локус Rosa, можно также модифицировать для использования системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Использование мышей с условной экспрессией Cas9. Заявители показали на клетках 293, что конструкция для условной экспрессии Cas9 может активироваться при совместной экспрессии с Cre. Заявители также показали, что надлежащим образом подвергшиеся целенаправленному воздействию mESC R1 могут иметь активный Cas9 при экспрессии Cre. Поскольку за Cas9 следует последовательность расщепления пептидом Р2А, а затем EGFP, заявители идентифицировали успешную экспрессию путем наблюдения EGFP. Заявители показали активацию Cas9 в mESC. Эта же идея делает использование мышей с условной экспрессией Cas9 столь полезным. Заявители могут скрещивать свою мышь с условной экспрессией Cas9 с мышью, у которой повсеместно экспрессируется Cre (линия АСТВ-Cre), и могут получать мышь, у которой Cas9 экспрессируется в каждой клетке. Для этого потребуется только доставка химерной РНК для индукции редактирования генома у мышиных эмбрионов или взрослых мышей. Что интересно, если мышь с условной экспрессией Cas9 скрестить с мышью, экспрессирующей Cre под контролем тканеспецифического промотора, Cas9 будет лишь в тканях, в которых также экспрессируется Cre. Этот подход можно применять для редактирования генома только в определенных тканях путем доставки химерной РНК в ту же ткань.

Как указано выше, также представлены трансгенные животные, как и трансгенные растения, в частности, сельскохозяйственные культуры и водоросли. Трансгенные растения могут быть полезными при других применениях помимо получения модели заболевания. Они могут включать производство пищи или кормов благодаря биосинтезу, например, белков, углеводов, питательных веществ или витаминов на более высоких уровнях, чем будет наблюдаться в обычных условиях у дикого типа. В этом отношении предпочтительными являются трансгенные растения, в особенности зернобобовые и клубненосные культуры, и животные, в особенности млекопитающие, такие как домашний скот (коровы, овцы, козы и свиньи), но также домашняя птица и съедобные насекомые.

Трансгенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно применимыми в производстве растительных масел или таких видов биотоплива, как, например, спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть сконструированы для синтеза или повышенного синтеза высоких уровней масла или спиртов для применения в масложировой или биотопливной промышленности.

Аденоассоциированный вирус (AAV)

Что касается доставки in vivo, то AAV является преимущественным по сравнению с другими вирусными векторами по двум причинам:

низкая токсичность (она может быть обусловлена способом очистки, не требующим ультрацентрифугирования клеточных частиц, которые могут активировать иммунный ответ);

низкая вероятность появления инсерционного мутагенеза, поскольку он не интегрируется в геном хозяина.

AAV имеет предел упаковки, составляющий 4,5 или 4,75 т.п.о. Это означает, что все из Cas9, а также промотора и терминатора транскрипции должны вместиться в один вирусный вектор. Конструкции, размер которых превышает 4,5 или 4,75 т.п.о., будут обуславливать значительное снижение продуцирования вируса. SpCas9 является довольно большим, размер гена самого по себе превышает 4,1 т.п.о., что осложняет его упаковку в AAV. Следовательно, варианты осуществления настоящего изобретения включают использование более коротких гомологов Cas9. Например:

Эти виды, таким образом, в целом являются предпочтительными видами для получения Cas9. Заявители показали данные о доставке и in vivo экспрессии Cas9 в головном мозге мышей.

Предпочтительными являются два способа упаковки молекул нуклеиновых кислот, кодирующих Cas9, например, ДНК, в вирусные векторы для опосредования модификации генома in vivo.

Для обеспечения опосредованного NHEJ нокаута гена.

Один вирусный вектор:

вектор, содержащий две или более кассеты экспрессии:

промотор-молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Cas9-терминатор;

промотор-gRNA1-терминатор;

промотор-gRNA2-терминатор;

промотор-gRNA(N)-терминатор (до предельного размера вектора).

Два вирусных вектора:

вектор 1, содержащий одну кассету экспрессии для управления экспрессией Cas9:

промотор-молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Cas9-терминатор;

вектор 2, содержащий одну или несколько кассет экспрессии для управления экспрессией одной или нескольких направляющих РНК:

промотор-gRNA1-терминатор;

промотор-gRNA(N)-терминатор (до предельного размера вектора).

Для опосредования репарации с участием гомологичной рекомбинации. В дополнение к подходам с одним и двумя вирусными векторами, описанными выше, используют дополнительный вектор для доставки матрицы для репарации с участием гомологичной рекомбинации.

Промотор, используемый для управления экспрессией молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Cas9, может включать следующее.

ITR AAV может служить в качестве промотора: это является преимущественным для устранения необходимости в дополнительном промоторном элементе (который может занимать пространство в векторе). Освободившееся дополнительное пространство можно задействовать для управления экспрессией дополнительных элементов (gRNA и т.д.). К тому же, активность ITR является относительно более слабой, поэтому их можно использовать для снижения токсичности, обусловленной сверхэкспрессией Cas9.

Для повсеместной экспрессии можно использовать следующие промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, генов тяжелой или легкой цепей ферритина и т.д.

Для экспрессии в головном мозге можно использовать следующие промоторы: гена синапсина I для всех нейронов, гена CaMKII-альфа для возбуждающих нейронов, GAD67, или GAD65, или VGAT для GABA-эргических нейронов и т.д.

Для экспрессии в печени можно использовать промотор гена альбумина.

Для экспрессии в легких можно использовать SP-B.

Для эндотелиальных клеток можно использовать ICAM.

Для гемопоэтических клеток можно использовать промотор гена IFN-бета или CD45.

Для остеобластов можно использовать OG-2.

Промотор, используемый для управления направляющей РНК, может включать следующее:

Промоторы для Pol III, такие как U6 или H1;

использование промотора для Pol II и интронных кассет для экспрессии gRNA.

Что касается AAV, AAV может представлять собой AAV1, AAV2, AAV5 или любую их комбинацию. Можно выбрать AAV из AAV с учетом клеток, подлежащих целенаправленному воздействию, например, можно выбрать AAV серотипов 1, 2, 5, или гибридный капсид AAV1, AAV2, AAV5, или любую их комбинацию для целенаправленного воздействия в головном мозге или нервных клетках; и можно выбрать AAV4 для целенаправленного воздействия в сердечной ткани. AAV8 применим для доставки в печень. Вышеуказанные промоторы и векторы являются предпочтительными по отдельности.

Доставка РНК также является применимым способом доставки in vivo. На фигуре 27 показаны данные о доставке и экспрессии Cas9 в головном мозге мышей in vivo. Возможно доставлять Cas9 и gRNA (и, например, матрицу для HR-репарации) в клетки посредством липосом или наночастиц. Таким образом, доставка фермента CRISPR, такого как Cas9, и/или доставка РНК по настоящему изобретению может осуществляться в форме РНК и посредством микропузырьков, липосом или наночастиц. Например, мРНК Cas9 и gRNA могут быть упакованы в липосомные частицы для доставки in vivo. Реагенты для липосомной трансфекции, такие как Lipofectamine от Life Technologies, и другие реагенты, имеющиеся в продаже, могут эффективно доставлять молекулы РНК в печень.

Повышение эффективности NHEJ или HR также способствует доставке. Предпочтительно, чтобы эффективность NHEJ повышалась посредством совместной экспрессии ферментов для обработки концов, таких как Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. 2011 August; 188(4): 787-797). Предпочтительно, чтобы эффективность HR повышалась путем транзиентного ингибирования компонентов механизма NHEJ, таких как Ku70 и Ku86. Эффективность HR также можно повысить путем совместной экспрессии прокариотических или эукариотических ферментов гомологичной рекомбинации, таких как RecBCD, RecA.

Различные средства доставки описаны в данном документе и дополнительно обсуждаются в данном разделе.

Вирусная доставка: фермент CRISPR, например, Cas9, и/или любую из РНК по настоящему изобретению, например, направляющую РНК, можно доставлять с помощью аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса, аденовируса или других типов вирусных векторов или их комбинаций. Cas9 и одну или несколько направляющих РНК можно упаковать в один или несколько вирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор доставляют в представляющую интерес ткань посредством, например, внутримышечной инъекции, тогда как в других случаях вирусная доставка осуществляется посредством внутривенного, трансдермального, интраназального, перорального, трансмукозального или других способов доставки. Такая доставка может осуществляться в виде однократной дозы или многократных доз. Специалист в данной области понимает, что фактическая дозировка, подлежащая доставке в соответствии с данным документом, может в значительной степени варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как выбранный вектор, целевые клетка, организм или ткань, общее состояние субъекта, подлежащего лечению, степень желаемой трансформации/модификации, путь введения, способ введения, тип желаемой трансформации/модификации и т.п.

Такая доза может дополнительно содержать, например, носитель (воду, солевой раствор, этанол, глицерин, лактозу, сахарозу, фосфат кальция, желатин, декстран, агар, пектин, арахисовое масло, кунжутное масло и т.д.), разбавитель, фармацевтически приемлемый носитель (например, фосфатно-солевой буфер), фармацевтически приемлемый наполнитель и/или другие соединения, известные из уровня техники. Такой дозированный состав может без труда определить специалист в данной области. Доза может дополнительно содержать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей, таких как, например, соль неорганической кислоты, такая как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат и т.д.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Дополнительно, в данном документе также могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства, буферные вещества, поддерживающие рН, гели или гелеобразующие материалы, ароматизаторы, красители, микросферы, полимеры, суспендирующие средства и т.д. В дополнение, также могут присутствовать один или несколько других традиционных фармацевтических ингредиентов, таких как консерванты, увлажнители, суспендирующие средства, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, средства против слеживания, заполнители, хелатообразователи, покрывающие средства, химические стабилизаторы и т.д., особенно если лекарственная форма представляет собой восстанавливаемую форму. Пригодные иллюстративные ингредиенты включают микрокристаллическую целлюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, полисорбат 80, фенилэтиловый спирт, хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол, парахлорфенол, желатин, альбумин и их комбинацию. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991), включенном в данный документ посредством ссылки.

В варианте осуществления в данном документе доставку осуществляют посредством аденовируса, который может находиться в однократной бустерной дозе, содержащей по меньшей мере 1×10⁵ частиц (также называемых единичными частицами, pu) аденовирусного вектора. В варианте осуществления в данном документе доза предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ частиц (например, приблизительно 1×10⁶-1×10¹² частиц), более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ частиц, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ частиц (например, приблизительно 1×10⁸-1×10¹¹ частиц или приблизительно 1×10⁸-1×10¹² частиц), и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁹ частиц (например, приблизительно 1×10⁹-1×10¹⁰ частиц или приблизительно 1×10⁹-1×10¹² частиц) или даже по меньшей мере приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, приблизительно 1×10¹⁰-1×10¹² частиц) аденовирусного вектора. В альтернативном случае доза содержит не более приблизительно 1×10¹⁴ частиц, предпочтительно не более приблизительно 1×10¹³ частиц, еще более предпочтительно не более приблизительно 1×10¹² частиц, еще более предпочтительно не более приблизительно 1×10¹¹ частиц и наиболее предпочтительно не более приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, не более приблизительно 1×10⁹ частиц). Таким образом, доза может включать в себя однократную дозу аденовирусного вектора с, например, приблизительно 1×10⁶ единичных частиц (pu), приблизительно 2×10⁶ pu, приблизительно 4×10⁶ pu, приблизительно 1×10⁷ pu, приблизительно 2×10⁷ pu, приблизительно 4×10⁷ pu, приблизительно 1×10⁸ pu, приблизительно 2×10⁸ pu, приблизительно 4×10⁸ pu, приблизительно 1×10⁹ pu, приблизительно 2×10⁹ pu, приблизительно 4×10⁹ pu, приблизительно 1×10¹⁰ pu, приблизительно 2×10¹⁰ pu, приблизительно 4×10¹⁰ pu, приблизительно 1×10¹¹ pu, приблизительно 2×10¹¹ pu, приблизительно 4×10¹¹ pu, приблизительно 1×10¹² pu, приблизительно 2×10¹² pu или приблизительно 4×10¹² pu аденовирусного вектора. См., например, аденовирусные векторы в патенте США №8454972 В2 Nabel, et. al., выданном 4 июня 2013 г.; включенном в данный документ посредством ссылки, и дозы в столбце 29, строках 36-58 данного патента. В варианте осуществления в данном документе аденовирус доставляют посредством многократных доз.

В варианте осуществления в данном документе доставку осуществляют посредством AAV. Полагают, что терапевтически эффективная доза для доставки AAV человеку in vivo находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 50 мл солевого раствора, содержащего от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁰ функциональных частиц AAV/мл раствора. Дозу можно скорректировать для уравновешивания терапевтической пользы и любых побочных эффектов. В варианте осуществления в данном документе доза AAV, как правило, находится в диапазоне концентраций от приблизительно 1×10⁵ до 1×10⁵ геномов AAV, от приблизительно 1×10⁸ до 1×10²⁰ геномов AAV, от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов или от приблизительно 1×10¹¹ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов AAV. Доза для человека может составлять приблизительно 1×10¹³ геномов AAV. Такие концентрации можно доставлять в растворе носителя, составляющем от приблизительно 0,001 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мл или от приблизительно 10 до приблизительно 25 мл. Другие эффективные дозы может без труда установить специалист в данной области техники посредством стандартных испытаний с построением кривых зависимости ''доза-эффект''. См., например, патент США №8404658 В2 Hajjar et al., выданный 26 марта 2013 г., в столбце 27, строках 45-60.

В варианте осуществления в данном документе доставку осуществляют посредством плазмиды. В таких плазмидных композициях доза должна представлять собой количество плазмид, достаточное для того, чтобы вызвать реакцию. Например, подходящее количество плазмидной ДНК в плазмидных композициях может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг или от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мкг.

Дозы в данном документе определяются в расчете на среднего индивидуума массой 70 кг. Кратность введения находится в пределах компетенции практикующего врача или ветеринара (например, врача-терапевта, ветеринарного врача) или ученого, являющегося специалистом в данной области. Мыши, используемые в эксперименте, имели массу приблизительно 20 г. Дозы, вводимые мыши массой 20 г, можно экстраполировать на индивидуума массой 70 кг.

Лентивирус

Лентивирусы являются сложными ретровирусами, которые обладают способностью инфицировать как митотические, так и постмитотические клетки и экспрессировать в них свои гены. Наиболее широко известным лентивирусом является вирус иммунодефицита человека (HIV), который использует гликопротеины оболочки других вирусов для целенаправленного воздействия на широкий спектр типов клеток.

Лентивирусы можно получить следующим образом. После клонирования pCasES10 (которая содержит каркас лентивирусной плазмиды-переносчика) HEK293FT, прошедшие малое количество пассажей (р=5), высевали во флакон Т-75 до 50% конфлюентности за день до трансфекции в DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и без антибиотиков. Через 20 часов среду заменяли на среду OptiMEM (бессывороточную) и спустя 4 часа проводили трансфекцию. Клетки трансфицировали с помощью 10 мкг лентивирусной плазмиды-переносчика (pCasES10) и следующих упаковывающих плазмид: 5 мкг pMD2.G (псевдотип VSV-g) и 7,5 мкг psPAX2 (gag/pol/rev/tat). Трансфекцию проводили в 4 мл OptiMEM со средством доставки на основе катионного липида (50 мкл Lipofectamine 2000 и 100 мкл реагента Plus). Через 6 часов среду заменяли на DMEM, не содержащую антибиотиков, с 10% фетальной бычьей сывороткой.

Лентивирус можно очистить следующим образом. Вирусосодержащие надосадочные жидкости отбирали через 48 часов. Надосадочные жидкости сперва очищали от дебриса и фильтровали через 0,45 мкм фильтр с низкой степенью связывания белка (PVDF). Затем их центрифугировали на ультрацентрифуге в течение 2 часов при 24000 об./мин. Вирусосодержащие осадки ресуспендировали в 50 мкл DMEM в течение ночи при 4°С. Затем их разделяли на аликвоты и сразу же замораживали при -80°С.

В другом варианте осуществления также предусмотрены минимальные лентивирусные векторы для отличных от приматов организмов на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), особенно для генной терапии глаз (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285, опубликовано в режиме онлайн 21 ноября 2005 г. в Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). В другом варианте осуществления также предусмотрен RetinoStat®, лентивирусный вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей для генной терапии, экспрессирующий ангиостатические белки эндостатин и ангиостатин, который доставляют посредством субретинальной инъекции для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии (см., например, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)), который может быть модифицирован для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления самоинактивирующиеся лентивирусные векторы с siRNA, целенаправленно воздействующими на общий экзон, который имеют tat/rev HIV, сигналом ядрышковой локализации TAR-ловушкой и специфичным к CCR5 рибозимом в виде головки молотка (см., например, DiGiusto et al. (2010) Sci Transi Med 2:36ra43), можно использовать и/или приспосабливать к системам CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Не менее 2,5×10⁶ CD34+ клеток на килограмм массы пациента можно собирать и предварительно стимулировать в течение 16-20 часов в среде X-VIVO 15 (Lonza), содержащей 2 мМ L-глутамина, фактор стволовых клеток (100 нг/мл), лиганд Flt-3 (Flt-3L) (100 нг/мл) и тромбопоэтин (10 нг/мл) (CellGenix), при плотности 2×10⁶ клеток/мл. Предварительно стимулированные клетки можно трансдуцировать лентивирусом при множественности заражения 5 в течение 16-24 часов в колбах с культурой тканей на 75 см², покрытых фибронектином (25 мг/см²) (RetroNectin, Takara Bio Inc.).

Лентивирусные векторы были раскрыты в отношении лечения болезни Паркинсона, см., например, публикацию заявки на патент США №20120295960 и патенты США №№7303910 и 7351585. Лентивирусные векторы также были раскрыты в отношении лечения заболеваний глаз, см., например, публикации заявок на патенты США №№20060281180, 20090007284, US 20110117189; US 20090017543; US 20070054961, US 20100317109. Лентивирусные векторы также были раскрыты в отношении доставки в головной мозг, см., например, публикации заявок на патенты США №№ US 20110293571; US 20110293571, US 20040013648, US 20070025970, US 20090111106 и патент США № US 7259015.

Доставка РНК

Доставка РНК: фермент CRISPR, например Cas9, и/или любую из РНК по настоящему изобретению, например направляющую РНК, также можно доставлять в форме РНК. мРНК Cas9 можно получить с помощью транскрипции in vitro. Например, мРНК Cas9 можно синтезировать с помощью кассеты для ПЦР, содержащей следующие элементы: промотор Т7-последовательность Козак (GCCACC)-Cas9-3'-UTR гена бета-глобина-поли(А)-хвост (цепь из 120 или более адениновых остатков). Кассету можно использовать для транскрипции при помощи полимеразы Т7. Направляющие РНК также можно транскрибировать с помощью транскрипции in vitro с кассеты, содержащей промотор Т7-GG-последовательность направляющей РНК.

Для повышения экспрессии и снижения токсичности фермент CRISPR и/или направляющую РНК можно модифицировать с помощью псевдо-U или 5-метил-С.

Способы доставки мРНК в настоящее время являются особенно перспективными для доставки в печень. В частности, для доставки в печень особенно предпочтительным является AAV8.

Наночастицы

мРНК фермента CRISPR и направляющую РНК можно доставлять одновременно с помощью наночастиц или липидных оболочек.

Например, у Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ (''In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles'' Mol Pharm. 2011 Jun 6; 8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 Apr 1) раскрываются биоразлагаемые наночастицы со структурой ядро/оболочка с ядром из сложного поли-β-аминоэфира (РВАЕ), окруженным фосфолипидной двухслойной оболочкой. Они были разработаны для доставки мРНК in vivo. Чувствительный к рН компонент РВАЕ был выбран для содействия разрушению эндосом, тогда как поверхностный липидный слой был выбран для сведения к минимуму токсичности поликатионного ядра. Они, таким образом, являются предпочтительными для доставки РНК по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления предусмотрены наночастицы на основе самособирающихся биоадгезивных полимеров, которые можно использовать для пероральной доставки пептидов, внутривенной доставки пептидов и интраназальной доставки пептидов, во всех случаях в головной мозг. Также предусмотрены другие варианты осуществления, такие как всасывание при пероральном применении и внутриглазная доставка гидрофобных лекарственных средств. Технология молекулярных оболочек предусматривает сконструированную полимерную оболочку, защищенную и доставляемую в очаг заболевания (см., например, Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74; Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688; Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40; Qu, X., et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 и Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). Предусмотрены дозы, составляющие приблизительно 5 мг/кг, которые в зависимости от целевой ткани будут однократными или многократными дозами.

В одном варианте осуществления наночастицы, которые могут доставлять РНК в раковую клетку для прекращения роста опухоли, разработанные в лаборатории Дэна Андерсона в MIT, можно использовать для систем CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ним. В частности, в лаборатории Андерсона были разработаны полностью автоматизированные, комбинаторные системы для синтеза, очистки, определения характеристик и составления новых биоматериалов и наносоставов. См., например, Alabi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Aug 6;110(32):12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9 и Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93.

Заявка на патент США 20110293703 относится к липидоподобным соединениям, также являющимся особенно применимыми при введении полинуклеотидов, которые можно использовать для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В одном аспекте аминоспиртовые липидоподобные соединения объединяют со средством, подлежащим введению в клетку или субъекту, с образованием микрочастиц, наночастиц, липосом или мицелл. Средство, подлежащее доставке с помощью частиц, липосом или мицелл, может быть в форме газа, жидкости или твердого вещества, и средство может представлять собой полинуклеотид, белок, пептид или малую молекулу. Аминоспиртовые липидоподобные соединения можно объединять с другими аминоспиртовыми липидоподобными соединениями, полимерами (синтетическими или природными), поверхностно-активными веществами, холестерином, углеводами, белками, липидами и т.д. с образованием частиц. Эти частицы можно затем необязательно объединять с фармацевтическим наполнителем с образованием фармацевтической композиции.

В публикации заявки на патент США №0110293703 также представлены способы получения аминоспиртовых липидоподобных соединений. Для образования аминоспиртового липидоподобного соединения по настоящему изобретению обеспечивают реакцию одного или нескольких эквивалентов амина с одним или несколькими эквивалентами соединения с концевыми эпоксидными группами в подходящих условиях. В определенных вариантах осуществления все аминогруппы амина являются полностью прореагировавшими с соединением с концевыми эпоксидными группами с образованием третичных аминов. В других вариантах осуществления не все аминогруппы амина являются полностью прореагировавшими с соединением с концевыми эпоксидными группами с образованием третичных аминов, в результате чего, таким образом, в аминоспиртовом липидоподобном соединении находятся первичные или вторичные аминогруппы. Эти первичные или вторичные аминогруппы оставляют в существующем состоянии или могут вводить в реакцию с другим электрофилом, таким как другое соединение с концевыми эпоксидными группами. Специалисту в данной области следует принять во внимание, что осуществление реакции амина с меньшим, чем избыточное, количеством соединения с концевыми эпоксидными группами приведет к образованию множества различных аминоспиртовых липидоподобных соединений с различным количеством ''хвостов''. Определенные амины могут быть полностью функционализированными с помощью двух ''хвостов'', полученных из эпоксидных соединений, тогда как другие молекулы могут быть не полностью функционализированными с помощью ''хвостов'', полученных из эпоксидных соединений. Например, диамин или полиамин может содержать один, два, три или четыре ''хвоста'', полученных из эпоксидных соединений, у различных аминогрупп молекулы, в результате чего образуются первичные, вторичные и третичные амины. В определенных вариантах осуществления все аминогруппы являются не полностью функционализированными. В определенных вариантах осуществления используют два соединения с концевыми эпоксидными группами одного типа. В других вариантах осуществления используют два или более различных соединений с концевыми эпоксидными группами. Синтез аминоспиртовых липидоподобных соединений осуществляют в присутствии растворителя или без него, и синтез можно осуществлять при более высоких температурах, варьирующих в диапазоне от 30 до 100°С, предпочтительно при приблизительно 50-90°С. Полученные аминоспиртовые липидоподобные соединения можно необязательно очищать. Например, смесь аминоспиртовых липидоподобных соединений можно очищать с получением аминоспиртового липидоподобного соединения с определенным количеством ''хвостов'', полученных из эпоксидных соединений. Или же смесь можно очищать с получением определенного стерео- или региоизомера. Аминоспиртовые липидоподобные соединения можно также алкилировать с помощью алкилгалогенида (например, йодистого метила) или другого алкилирующего средства, и/или их можно ацилировать.

В публикации заявки на патент США №0110293703 также представлены библиотеки аминоспиртовых липидоподобных соединений, полученных согласно способам по настоящему изобретению. Эти аминоспиртовые липидоподобные соединения можно получать и/или подвергать скринингу с применением высокопроизводительных методик, предусматривающих использование дозирующих станций, роботов, планшетов для микротитрования, компьютеров и т.д. В определенных вариантах осуществления аминоспиртовые липидоподобные соединения подвергают скринингу в отношении их способности к трансфекции полинуклеотидов или других средств (например, белков, пептидов, малых молекул) в клетку.

Публикация заявки на патент США №20130302401 относится к классу поли(бета-аминоспиртов) (РВАА), получаемых при помощи комбинаторных методик полимеризации. РВАА по настоящему изобретению можно применять в биотехнологии и биомедицинских применениях в качестве покрытий (таких как пленочные покрытия или многослойные пленки для медицинских инструментов или имплантатов), добавок, материалов, наполнителей, средств против биологического обрастания, средств для формирования микроструктуры и средств для инкапсулирования клеток. В случае применения в качестве поверхностных покрытий эти РВАА вызывают различные уровни воспаления как in vitro, так и in vivo в зависимости от их химических структур. Большое химическое разнообразие этого класса материалов позволяет идентифицировать полимерные покрытия, ингибирующие активацию макрофагов in vitro. Кроме того, эти покрытия уменьшают привлечение воспалительных клеток и уменьшают выраженность фиброза после подкожной имплантации микрочастиц карбоксилированного полистирола. Эти полимеры можно использовать для образования капсул на основе полиэлектролитных комплексов для инкапсулирования клеток. Настоящее изобретение также может иметь много других применений в биологии, таких как получение противомикробных покрытий, доставка ДНК или siRNA и тканевая инженерия с применением стволовых клеток. Идеи, изложенные в публикации заявки на патент США №20130302401, можно применять к системе CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления предусмотрены липидные наночастицы (LNP). В частности, малые интерферирующие РНК, воздействующие на транстиретин, инкапсулированные в липидных наночастицах (см., например, Coelho et al., N Engl J Med 2013; 369:819-29), можно применять в отношении системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Предусмотрены дозы, составляющие от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг на кг массы тела, вводимые внутривенно. Для снижения риска возникновения инфузионных реакций предусмотрены лекарственные препараты, такие как дексаметазон, ацетаминофен, дифенгидрамин или цетиризин и ранитидин. Также предусмотрены многократные дозы в составе пяти доз по приблизительно 0,3 мг на килограмм, принимаемые каждые 4 недели.

Было показано, что LNP являются высокоэффективными в доставке siRNA в печень (см., например, Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470) и, таким образом, предусмотрены для доставки CRISPR-Cas в печень. Может быть предусмотрен режим дозирования с приемом приблизительно четырех доз по 6 мг/кг LNP (или РНК системы CRISPR-Cas) каждые две недели. Tabernero и соавт. продемонстрировали, что после первых 2 циклов введения LNP в дозе 0,7 мг/кг наблюдалась регрессия опухоли, а к концу 6 циклов у пациента достигался частичный ответ с полной регрессией метастазов в лимфатических узлах и значительным уменьшением размеров опухолей в печени. У данного пациента, у которого сохранялась ремиссия и который завершил лечение после получения доз в течение 26 месяцев, полный ответ достигался после приема 40 доз. У двух пациентов с RCC и внепеченочными очагами заболевания, включающими почку, легкое и лимфатические узлы, в которых наблюдалось прогрессирование после предшествующей терапии ингибиторами сигнального пути VEGF, наблюдалось стабильное заболевание во всех очагах в течение примерно 8-12 месяцев, а пациент с PNET и метастазами в печени продолжал участие в расширенном исследовании в течение 18 месяцев (36 доз) при стабильном заболевании.

Однако следует принимать во внимание заряд LNP. Так, объединение катионных липидов с отрицательно заряженными липидами индуцирует образование структур, не являющихся двухслойными, которые содействуют внутриклеточной доставке. Поскольку заряженные LNP быстро выводятся из кровотока после внутривенной инъекции, были разработаны ионизируемые катионные липиды со значениями pKa ниже 7 (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011). Отрицательно заряженные полимеры, такие как олигонуклеотиды siRNA, можно загружать в LNP при низких значениях рН (например, рН 4), где ионизируемые липиды проявляют положительный заряд. Однако, при физиологических значениях рН LNP проявляют низкий поверхностный заряд, совместимый с большими значениями времени пребывания в кровотоке. Основное внимание было сосредоточено на четырех молекулах ионизируемых катионных липидов, а именно 1,2-дилинолеоил-3-диметиламмонийпропане (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N,N-диметиламинопропане (DLinDMA), 1,2-дилинолеилоксикето-N,N-диметил-3-аминопропане (DLinKDMA) и 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолане (DLinKC2-DMA). Было показано, что системы LNP с siRNA, содержащие эти липиды, проявляют существенно отличающиеся свойства сайленсинга генов в гепатоцитах in vivo, при этом их активность изменяется в ряду DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP, при использовании модели сайленсинга гена фактора VII (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011). Могут быть предусмотрены уровни дозы 1 мкг/мл, особенно для состава, содержащего DLinKC2-DMA.

Получение LNP и инкапсулирование CRISPR-Cas можно применять и/или модифицировать согласно Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011. Катионные липиды 1,2-дилинолеоил-3-диметиламмонийпропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилинолеилоксикето-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinK-DMA), 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLinKC2-DMA), (3-о-[2''-(метоксиполиэтиленгликоль 2000)-сукциноил]-1,2-димиристоил-sn-гликоль (PEG-S-DMG) и R-3-[(ω-метоксиполи(этиленгликоль)2000)-карбамоил]-1,2-димиристилоксипропил-3-амин (PEG-C-DOMG) могут быть предоставлены Tekmira Pharmaceuticals (Ванкувер, Канада) или синтезированы. Холестерин можно приобрести у Sigma (Сент-Луис, Миссури). Конкретную РНК CRISPR-Cas можно инкапсулировать в LNP, содержащие DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA и DLinKC2-DMA (катионный липид:DSPC:холестерин: PEG-S-DMG или PEG-C-DOMG в молярном соотношении 40:10:40:10). При необходимости можно включать в состав 0,2% SP-DiOC18 (Invitrogen, Берлингтон, Канада) для определения поглощения клетками, внутриклеточной доставки и биораспределения. Инкапсулирование можно осуществлять путем растворения липидных смесей, содержащих катионный липид:DSPC:холестерин:РЕG-С-DOMG (молярное соотношение 40:10:40:10) в этаноле до конечной концентрации липидов 10 ммоль/л. Этот раствор липидов в этаноле можно добавлять по каплям к 50 ммоль/л цитрата, рН 4,0, с образованием многослойных пузырьков до получения конечной концентрации этанола 30% об./об. Крупные однослойные пузырьки можно формировать после экструзии многослойных пузырьков через два установленных один над другим поликарбонатных фильтра Nuclepore на 80 нм при помощи экструдера (Northern Lipids, Ванкувер, Канада). Инкапсулирование можно осуществлять путем добавления РНК, растворенной при 2 мг/мл в 50 ммоль/л цитрата, рН 4,0, содержащего 30% этанола об./об., по каплям к экструдированным предварительно сформированным крупным однослойным пузырькам и инкубирования при 31°С в течение 30 минут при постоянном перемешивании до конечного весового соотношения РНК/липид 0,06/1 вес./вес. Удаление этанола и нейтрализацию буфера для получения состава проводили путем диализа против фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,4, в течение 16 часов при помощи диализных мембран Spectra/Por 2 из регенерированной целлюлозы. Распределение наночастиц по размеру можно определить посредством динамического рассеяния света с использованием измерителя размера частиц NICOMP 370, режимов объема пузырьков/интенсивности рассеянного света и аппроксимации функцией Гаусса (Nicomp Particle Sizing, Санта-Барбара, Калифорния). Размер частиц для всех трех систем LNP может составлять ~70 нм в диаметре. Эффективность инкапсулирования siRNA можно определить путем удаления свободной siRNA из образцов, отобранных до или после диализа, с помощью колонок VivaPureD MiniH (Sartorius Stedim Biotech). Инкапсулированную РНК можно экстрагировать из элюированных наночастиц и подвергать количественной оценке при 260 нм. Соотношение siRNA и липидов определяли путем измерения содержания холестерина в пузырьках с помощью ферментативного анализа Cholesterol E от Wako Chemicals USA (Ричмонд, Виргиния). Для доставки также можно применять пегилированные липосомы (или LNP).

Получение крупных LNP можно применять и/или приспосабливать согласно Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011. Раствор предварительно приготовленной смеси липидов (общая концентрация липидов 20,4 мг/мл) можно получать в этаноле, содержащем DLinKC2-DMA, DSPC и холестерин в молярном соотношении 50:10:38,5. К предварительно приготовленной смеси липидов можно добавлять ацетат натрия в молярном соотношении 0,75:1 (ацетат натрия:DLinKC2-DMA). Липиды затем можно гидрировать путем объединения смеси с 1,85 объема цитратного буфера (10 ммоль/л, рН 3,0) при энергичном перемешивании, что приводит к самопроизвольному образованию липосом в водном буфере, содержащем 35% этанол. Раствор липосом можно инкубировать при 37°С для обеспечения зависимого от времени увеличения размера частиц. В различные моменты времени в ходе инкубирования можно отбирать аликвоты для изучения изменений размера липосом посредством динамического рассеяния света (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Вустершир, Великобритания). По достижении требуемого размера частиц к смеси липосом можно добавлять водный раствор конъюгатов PEG-липид (исходный раствор = 10 мг/мл PEG-DMG в 35% (об./об.) этаноле) с получением конечной молярной концентрации PEG 3,5% от общего количества липидов. После добавления конъюгатов PEG-липид липосомы будут сохранять свой размер с эффективным подавлением дальнейшего роста. К ''пустым'' липосомам можно затем добавить РНК при соотношении siRNA и общих липидов, составляющем примерно 1:10 (вес:вес), с последующим инкубированием в течение 30 минут при 37°С с образованием нагруженных LNP. Затем смесь можно подвергать диализу в течение ночи в PBS и отфильтровать через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Конструкции сферических нуклеиновых кислот (SNA™) и другие наночастицы (в частности, наночастицы золота) также предусмотрены в качестве средств доставки системы CRISPR/Cas к предполагаемым мишеням. Достоверные данные показывают, что конструкции сферических нуклеиновых кислот (SNA™) от AuraSense Therapeutics на основе наночастиц золота, функционализированных нуклеиновыми кислотами, превосходят альтернативные платформы за счет нескольких следующих ключевых факторов успеха.

Высокая стабильность in vivo. По причине их плотной загрузки большинство молекул-карго (ДНК или siRNA) остаются связанными с конструкциями внутри клеток, что придает нуклеиновым кислотам стабильность и устойчивость к ферментативному расщеплению.

Возможность доставки. Для всех изученных типов клеток (например, нейронов, линий опухолевых клеток и т.д.) конструкции демонстрируют 99% эффективность трансфекции без необходимости в носителях или средствах для трансфекции.

Терапевтическое целенаправленное воздействие. Уникальная аффинность связывания с мишенью и специфичность конструкций обеспечивают превосходную специфичность в отношении совпадающих целевых последовательностей (т.е. с ограниченными нецелевыми эффектами).

Превосходящая эффективность. Конструкции значительно превосходят ведущие традиционные реагенты для трансфекции (Lipofectamine 2000 и Cytofectin).

Низкая токсичность. Конструкции могут проникать в ряд культивируемых клеток, первичных клеток и тканей без видимой токсичности.

Отсутствие значительного иммунного ответа. Конструкции вызывают минимальные изменения глобальной экспрессии генов согласно измерениям в полногеномных микроматричных исследованиях и специфичных в отношении цитокинов анализах белков.

Способность получения заданных химических свойств. Для получения заданных свойств поверхности конструкций можно использовать любое количество отдельных или комбинированных средств (например, белков, пептидов, малых молекул).

Данная платформа для терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот может быть применима к многочисленным болезненным состояниям, включающим воспаление и инфекционное заболевание, рак, кожные нарушения и сердечно-сосудистое заболевание.

Литературные источники, на которые можно ссылаться, включают: Cutler et al.,. J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162. Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al.,. Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638, Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) и Mirkin, et al., Small, doi.org/10.1002/smll.201302143.

Самособирающиеся наночастицы с siRNA могут быть сконструированы с помощью полиэтиленимина (PEI), который является пегилированным, с пептидным лигандом Arg-Gly-Asp (RGD), присоединенным к дистальному концу полиэтиленгликоля (PEG), например, в качестве средства для нацеливания на новообразованные сосуды опухоли, в которых экспрессируются интегрины, и их используют для доставки siRNA, ингибирующих экспрессию рецептора фактора роста эндотелия сосудов-2 (VEGF R2) и, таким образом, ангиогенез опухоли (см., например, Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19). Наноплексы можно получать путем смешивания равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты с получением чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимера) относительно фосфата (нуклеиновой кислоты) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводили к образованию полиплексов, характеризующихся распределением частиц по размеру со средним размером, составляющим приблизительно 100 нм, называемых здесь, таким образом, наноплексами. Для доставки в самособирающихся наночастицах согласно Schiffelers и соавт. предполагается доза, составляющая от приблизительно 100 до 200 мг CRISPR-Cas.

Наноплексы по Bartlett и соавт. (PNAS, September 25, 2007, vol. 104, no. 39) также можно применять в настоящем изобретении. Наноплексы по Bartlett и соавт. получают путем смешивания равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты с получением чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимера) относительно фосфата (нуклеиновой кислоты) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводили к образованию полиплексов, характеризующихся распределением частиц по размеру со средним размером, составляющим приблизительно 100 нм, называемых здесь, таким образом, наноплексами. Конъюгаты DOTA-siRNA no Bartlett и соавт. синтезировали следующим образом. Сложный моно(N-гидроксисукцинимидный эфир) 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (сложный эфир DOTA-NHS) заказывали у Macrocyclics (Даллас, Техас). В микроцентрифужную пробирку добавляли аминомодифицированную смысловую нить РНК со 100-кратным молярным избытком сложного эфира DOTA-NHS в карбонатном буфере (рН 9). Осуществляли реакцию содержимого путем перемешивания в течение 4 ч. при комнатной температуре. Конъюгат DOTA-смысловая нить РНК осаждали этанолом, ресуспендировали в воде и отжигали с немодифицированной антисмысловой нитью с получением конъюгата DOTA-siRNA. Все жидкости предварительно обрабатывали с помощью Chelex-100 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния) для удаления следовых количеств металлических примесей. Tf-нацеленные или ненацеленные наночастицы с siRNA можно получать с помощью поликатионов, содержащих цикло декстрин. Как правило, наночастицы получали в воде при соотношении зарядов 3 (+/-) и концентрации siRNA 0,5 г/литр. Один процент молекул адамантан-PEG на поверхности нацеленных наночастиц модифицировали с помощью Tf (адамантан-PEG-Tf). Наночастицы суспендировали в 5% (вес/об.) глюкозе в качестве раствора-носителя для инъекции.

Davis и соавт. (Nature, Vol 464, 15 April 2010) проводят клиническое испытание siRNA, в котором используют систему доставки на основе нацеленных наночастиц (регистрационный номер клинического испытания NCT00689065). Пациентам с солидными формами рака, трудно поддающимися стандартным методикам лечения, вводят дозы нацеленных наночастиц в дни 1, 3, 8 и 10 21-дневного цикла посредством 30-минутной внутривенной инфузии. Наночастицы состоят из синтетической системы доставки, содержащей: (1) линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), (2) нацеливающий лиганд на основе белка трансферрина человека (TF), представленный на внешней поверхности наночастиц, для контакта с рецепторами TF (TFR) на поверхности раковых клеток, (3) гидрофильный полимер (полиэтиленгликоль (PEG), используемый для обеспечения стабильности наночастиц в биологических жидкостях), и (4) siRNA, предназначенную для снижения экспрессии RRM2 (последовательность, применяемая в клинической практике, ранее была обозначена как siR2B+5). Давно известно, что в злокачественных клетках повышена экспрессия TFR, a RRM2 является общепризнанной мишенью для противоопухолевой терапии. Было показано, что эти наночастицы (клинический вариант обозначен как CALAA-01) хорошо переносятся в исследованиях с использованием многократных доз у отличных от человека приматов. Даже притом, что отдельным пациентам с хроническим миелоидным лейкозом вводили siRNA посредством доставки с помощью липосом, клиническое испытание по Davis и соавт. является первым испытанием с участием человека, в котором проводят системную доставку siRNA с помощью системы целенаправленной доставки и лечат пациентов с солидным раком. Для того, чтобы выяснить, может ли система целенаправленной доставки обеспечивать эффективную доставку функциональных siRNA в опухоли человека, Davis и соавт. исследовали биоптаты от трех пациентов из трех различных групп дозирования; пациентов А, В и С, все из которых имели метастазирующую меланому и получали дозы CALAA-01 с 18, 24 и 30 мг*м^-2 siRNA, соответственно. Аналогичные дозы также могут быть предусмотрены для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Доставку по настоящему изобретению можно осуществлять с помощью наночастиц, содержащих линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), нацеливающий лиганд на основе белка трансферрина человека (TF), представленный на внешней поверхности наночастиц, для контакта с рецепторами TF (TFR) на поверхности раковых клеток, и/или гидрофильный полимер (например, полиэтиленгликоль (PEG), применяемый для обеспечения стабильности наночастиц в биологических жидкостях).

Экзосомы

Экзосомы являются эндогенными нанопузырьками, переносящими РНК и белки, которые могут доставлять короткие интерферирующие РНК (siRNA) в головной мозг мышей. Для снижения иммуногенности Alvarez-Erviti и соавт. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) использовали собственные дендритные клетки для получения экзосом. Нацеливания достигали путем конструирования дендритных клеток, экспрессирующих Lamp2b, мембранный белок экзосом, слитый с нейрон-специфическим пептидом RVG. Очищенные экзосомы нагружали экзогенной siRNA путем электропорации. RVG-нацеленные экзосомы, инъецируемые внутривенно, осуществляли специфическую доставку siRNA для GAPDH в нейроны, микроглию, олигодендроциты в головном мозге, что приводило к нокдауну конкретного гена. Предварительное воздействие RVG-экзосом не ослабляло выраженность нокдауна, и неспецифическое поглощение в других тканях не наблюдалось. Терапевтические возможности опосредованной экзосомами доставки siRNA были продемонстрированы сильно выраженным нокдауном мРНК (60%) и белка (62%) ВАСЕ1, терапевтической мишени при болезни Альцгеймера.

Для получения пула иммунологически инертных экзосом Alvarez-Erviti и соавт. собирали костный мозг у инбредных мышей C57BL/6 с гомогенным гаплотипом главного комплекса гистосовместимости (МНС). Поскольку незрелые дендритные клетки вырабатывают большие количества экзосом, лишенных активаторов Т-клеток, таких как MHC-II и CD86, Alvarez-Erviti и соавт. производили отбор дендритных клеток с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) в течение 7 дней. Экзосомы очищали от культуральной надосадочной жидкости на следующий день с применением общепринятых протоколов ультрацентрифугирования. Вырабатываемые экзосомы были физически гомогенными и характеризовались распределением по размеру с пиком при 80 нм в диаметре, как определяли с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) и электронной микроскопии. Alvarez-Erviti и соавт. получали 6-12 мкг экзосом (измерено на основании концентрации белка) на 10⁶ клеток.

Затем Alvarez-Erviti и соавт. исследовали возможность загрузки модифицированных экзосом экзогенными молекулами-карго с применением протоколов электропорации, приспособленных для применений на наноразмерном уровне. Поскольку электропорация для мембранных частиц в нанометрическом масштабе изучена недостаточно хорошо, для эмпирической оптимизации протокола электропорации использовали неспецифическую меченную Су5 siRNA. Количество инкапсулированной siRNA анализировали после ультрацентрифугирования и лизиса экзосом. Электропорация при 400 В и 125 мкФ приводила к наибольшему удержанию siRNA и применялась для всех последующих экспериментов.

Alvarez-Erviti и соавт. вводили по 150 мкг каждой siRNA для ВАСЕ1, инкапсулированной в 150 мкг RVG-экзосом, нормальным мышам C57BL/6 и сравнивали эффективность нокдауна с таковой в четырех контрольных группах: необработанные мыши, мыши, которым инъецировали только RVG-экзосомы, мыши, которым инъецировали siRNA для ВАСЕ1 в комплексе с реагентом на основе катионных липосом для доставки in vivo, и мыши, которым инъецировали siRNA для ВАСЕ1 в комплексе с RVG-9R, пептидом RVG, конъюгированным с 9 остатками D-аргинина, который электростатически связывается с siRNA. Образцы кортикальной ткани анализировали через 3 дня после введения, и как у обработанных siRNA-RVG-9R, так и у обработанных RVG-экзосомами с siRNA мышей наблюдали значительный нокдаун белка (45%, Р<0,05 и 62%, Р<0,01), обусловленный значительным снижением уровней мРНК ВАСЕ1 (66% [+ или -] 15%, Р<0,001 и 61% [+ или -] 13%, Р<0,01, соответственно). Кроме того, заявители продемонстрировали значительное снижение (55%, Р<0,05) общих уровней [бета]-амилоидного пептида 1-42, основного компонента амилоидных бляшек в патологическом процессе при болезни Альцгеймера у животных, обработанных RVG-экзосомами. Наблюдавшееся снижение было большим, чем снижение уровней β-амилоидного пептида 1-40, демонстрируемое у нормальных мышей после внутрижелудочковой инъекции ингибиторов ВАСЕ1. Alvarez-Erviti и соавт. проводили быструю амплификацию 5'-концов кДНК (RACE) в отношении продукта расщепления ВАСЕ1, что свидетельствовало об опосредованном RNAi нокдауне с помощью siRNA.

Наконец, Alvarez-Erviti и соавт. исследовали, индуцируют ли RVG-экзосомы с siRNA иммунные ответы in vivo, путем определения концентраций IL-6, IP-10, TNFα и IFN-α в сыворотке. После обработки с помощью RVG-экзосом с siRNA для всех цитокинов регистрировали незначительные изменения, подобное таковому при обработке реагентом для трансфекции с siRNA и противоположное siRNA-RVG-9R, который активно стимулировал секрецию IL-6, что подтверждало иммунологическую инертность как особенность обработки экзосомами. С учетом того, что экзосомы инкапсулируют только 20% siRNA, доставка с помощью RVG-экзосом, по-видимому, является более эффективной, чем доставка с помощью RVG-9R, поскольку при использовании в пять раз меньшего количества siRNA без соответствующего уровня стимуляции иммунного ответа достигали сопоставимый нокдаун мРНК и больший нокдаун белка. Данный эксперимент продемонстрировал терапевтические возможности технологии RVG-экзосом, которая потенциально подходит для долговременного сайленсинга генов, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Систему доставки на основе экзосом по Alvarez-Erviti и соавт. можно использовать для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению к терапевтическим мишеням, особенно при нейродегенеративных заболеваниях. В настоящем изобретении может быть предусмотрена доза, составляющая приблизительно 100-1000 мг CRISPR-Cas, инкапсулированных в приблизительно 100-1000 мг RVG-экзосом.

El-Andaloussi и соавт. (Nature Protocols 7, 2112-2126(2012)) раскрывают, как экзосомы, полученные из культивируемых клеток, можно приспособить для доставки siRNA in vitro и in vivo. В данном протоколе впервые описано создание нацеленных экзосом посредством трансфекции вектором экспрессии, содержащим белок экзосом, слитый с пептидным лигандом. Затем El-Andaloussi и соавт. объясняют, как очищать и характеризовать экзосомы из надосадочной жидкости культуры трансфицированных клеток. Затем El-Andaloussi и соавт. подробно описывают важнейшие стадии загрузки siRNA в экзосомы. Наконец, El-Andaloussi и соавт. излагают в общих чертах, как использовать экзосомы для эффективной доставки siRNA в головной мозг мышей in vitro и in vivo. Также приведены примеры предполагаемых результатов, в которых опосредованная экзосомами доставка siRNA оценивается посредством функциональных анализов и визуализации. Выполнение полного протокола занимает ~ 3 недели. Доставку или введение согласно настоящему изобретению можно осуществлять с помощью экзосом, полученных из собственных дендритных клеток.

В другом варианте осуществления предусмотрены экзосомы плазмы по Wahlgren и соавт. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 е130). Экзосомы представляют собой наноразмерные пузырьки (размером 30-90 нм), вырабатываемые многими типами клеток, в том числе дендритными клетками (DC), В-клетками, Т-клетками, тучными клетками, эпителиальными клетками и опухолевыми клетками. Данные пузырьки образуются путем внутреннего почкования поздних эндосом, а затем высвобождаются во внеклеточную среду после слияния с плазматической мембраной. Поскольку экзосомы в естественных условиях переносят РНК между клетками, это свойство может быть полезным в генной терапии.

Экзосомы из плазмы получают путем центрифугирования лейкоцитарной пленки при 900 g в течение 20 мин. для выделения плазмы с последующим сбором надосадочной жидкости культуры клеток, центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. для удаления клеток и при 16500 g в течение 30 мин. с последующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мм. Экзосомы осаждают путем ультрацентрифугирования при 120000 g в течение 70 мин. Введение siRNA в экзосомы посредством химической трансфекции проводят согласно инструкциям производителя в наборе RNAi Human/Mouse Starter Kit (Quiagen, Хильден, Германия). siRNA добавляют к 100 мл PBS в конечной концентрации 2 ммоль/мл. После добавления реагента для трансфекции HiPerFect смесь инкубируют в течение 10 мин. при RT. С целью удаления избытка мицелл экзосомы повторно выделяют при помощи латексных гранул с альдегидными/сульфатными группами. Введение CRISPR-Cas в экзосомы посредством химической трансфекции можно проводить аналогично введению siRNA. Экзосомы можно совместно культивировать с моноцитами и лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых доноров. Таким образом, может быть предусмотрено, чтобы экзосомы, содержащие CRISPR-Cas, можно было вводить в моноциты и лимфоциты и подвергать аутологическому обратному введению в организм человека. Соответственно, доставку или введение согласно настоящему изобретению можно осуществлять с помощью экзосом плазмы.

Липосомы

Доставку или введение согласно настоящему изобретению можно осуществлять с помощью липосом. Липосомы являются сферическими везикулярными структурами, содержащими одно- или многослойный липидный бислой, окружающий внутренние водные компартменты, и относительно непроницаемый внешний липофильный фосфолипидный бислой. Липосомы получили значительное внимание в качестве носителей для доставки лекарственных средств, поскольку они являются биологически совместимыми, нетоксичными, могут доставлять как гидрофильные, так и липофильные молекулы лекарственных средств, защищают свою молекулу-карго от расщепления ферментами плазмы и переносят свой "груз" через биологические мембраны и гематоэнцефалический барьер (ВВВ) (для обзора см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679).

Липосомы можно получать из нескольких различных типов липидов; однако, для создания липосом в качестве носителей лекарственных средств чаще всего применяют фосфолипиды. Хотя образование липосом является самопроизвольным при смешивании липидной пленки с водным раствором, его также можно ускорить путем приложения силы в виде встряхивания посредством применения гомогенизатора, ультразвукового диспергатора или экструзионного аппарата (для обзора см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drag Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679).

К липосомам можно добавлять некоторые другие добавки с целью модификации их структуры и свойств. Например, холестерин либо сфингомиелин можно добавлять к смеси липосом в целях содействия стабилизации структуры липосом и предотвращения утечки внутренних молекул-карго липосом. Дополнительно, липосомы получают из гидрогенизированного яичного фосфатидилхолина или яичного фосфатидилхолина, холестерина и дицетилфосфата, и средние размеры их визикул доводили до приблизительно 50 и 100 нм (для обзора см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679).

Традиционный липосомный состав содержит главным образом природные фосфолипиды и липиды, такие как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DSPC), сфингомиелин, формы яичного фосфатидилхолина и моносиалоганглиозид. Поскольку данный состав состоит только из фосфолипидов, липосомные составы сталкиваются со многими проблемами, одной из которых является нестабильность в плазме. Было предпринято несколько попыток преодоления данных проблем, в частности, посредством манипуляции с липидной мембраной. Одна из этих попыток направлена на манипуляцию с холестерином. Добавление холестерина к традиционным составам уменьшает быстрое высвобождение инкапсулированного биологически активного соединения в плазму, а 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) повышает стабильность (для обзора см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679).

В особенно преимущественном варианте осуществления желательными являются липосомы "троянские кони" (также известные как "молекулярные троянские кони"), и протоколы можно найти на http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long. Эти частицы обеспечивают доставку трансгена в головной мозг в целом после внутрисосудистой инъекции. Без ограничений полагают, что нейтральные липидные частицы с конъюгированными на их поверхности специфичными антителами обеспечивают проникновение через гематоэнцефалический барьер посредством эндоцитоза. Заявитель теоретически допускает использование липосом "троянских коней" для доставки нуклеаз семейства CRISPR в головной мозг посредством внутрисосудистой инъекции, что будет обеспечивать получение животных с трансгенами во всем головном мозге без необходимости в манипуляции с эмбрионами. Может быть предусмотрено приблизительно 1-5 г молекул нуклеиновой кислоты, например, ДНК, РНК, для введения в липосомы in vivo.

В другом варианте осуществления систему CRISPR-Cas можно вводить в липосомы, такие как стабильная частица из нуклеиновой кислоты и липидов (SNALP) (см., например, Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005). Предусматриваются ежедневные внутривенные инъекции приблизительно 1, 3 или 5 мг/кг/день специфичной целенаправленно воздействующей CRISPR-Cas в SNALP. Ежедневное лечение можно осуществлять в течение приблизительно трех дней и затем еженедельно в течение приблизительно пяти недель. В другом варианте осуществления также предусмотрена специфичная CRISPR-Cas, инкапсулированная в SNALP, вводимая посредством внутривенной инъекции в дозах, составляющих приблизительно 1 или 2,5 мг/кг (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006). Состав на основе SNALP может содержать липиды 3-N-[(ω-метоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1, 2-димиристилоксипропиламин (PEG-CDMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinDMA), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и холестерин в молярном процентном соотношении 2:40:10:48 (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006).

В другом варианте осуществления было подтверждено, что стабильные частицы из нуклеиновой кислоты и липидов (SNALP) являются эффективными молекулами для доставки в высоковаскуляризированные опухоли печени, происходящие из HepG2, но не в слабо васкуляризированные опухоли печени, происходящие из НСТ-116 (см., например, Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780). SNALP-липосомы можно получать путем составления D-Lin-DMA и PEG-C-DMA с дистеароилфосфатидилхолином (DSPC), холестерином и siRNA с использованием соотношения липид/siRNA 25:1 и молярного соотношения холестерин/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA 48/40/10/2. Полученные в результате SNALP-липосомы имеют размер приблизительно 80-100 нм.

В еще одном варианте осуществления SNALP может содержать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), дипальмитоилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids, Алабастер, Алабама, США), 3-N-[(ω-метоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристилоксипропиламин и катионный 1,2-дилинолеилокси-3-N,N-диметиламинопропан (см., например, Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905). Может предусматриваться режим дозирования с приемом приблизительно 2 мг/кг общего количества CRISPR-Cas на дозу, вводимую, например, в виде болюсной внутривенной инфузии.

В еще одном варианте осуществления SNALP может содержать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA и 1,2-дилинолеилокси-3-(N,N-диметил)аминопропан (DLinDMA) (см., например, Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)). Составы, используемые для исследований in vivo, могут содержать липиды и РНК в конечном массовом соотношении, составляющем приблизительно 9:1.

Профиль безопасности нанопрепаратов для RNAi был рассмотрен Barros и Gollob из Alnylam Pharmaceuticals (см., например, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737). Стабильная частица из нуклеиновой кислоты и липидов (SNALP) содержит четыре различных липида - ионизируемый липид (DLinDMA), который является катионным при низком рН, нейтральный липид-помощник, холестерин и диффундирующий конъюгат полиэтиленгликоль (PEG)-липид. Частица имеет диаметр примерно 80 нм и является электронейтральной при физиологическом значении рН. Во время составления ионизируемый липид служит для конденсации липида с анионной siRNA в ходе образования частиц. Будучи положительно заряженным в условиях возрастающей кислотности в эндосомах, ионизируемый липид также опосредует слияние SNALP с мембраной эндосомы, обеспечивая высвобождение siRNA в цитоплазму. Конъюгат PEG-липид стабилизирует частицу и уменьшает агрегацию во время составления, а также впоследствии обеспечивает нейтральную гидрофильную внешнюю поверхность, улучшающую фармакокинетические свойства.

К настоящему времени была начата реализация двух программ клинических исследований с применением составов на основе SNALP с siRNA. В Tekmira Pharmaceuticals недавно завершили фазу I однодозового исследования SNALP-ApoB с участием взрослых добровольцев с повышенным уровнем холестерина LDL. АроВ преимущественно экспрессируется в печени и тонкой кишке и является ключевым для сборки и секреции VLDL и LDL.. АроВ также успешно подвергается целенаправленному воздействию с помощью систем CRISPR-Cas заявителей, см. примеры 37-38. Семнадцать субъектов получали однократную дозу SNALP-ApoB (повышение дозы, охватывающее 7 уровней дозирования). Не наблюдалось свидетельств гепатотоксичности (предполагаемой в качестве возможной дозолимитирующей токсичности на основании доклинических исследований). Один (или два) субъекта при наиболее высокой дозе испытывали гриппоподобные симптомы, указывающие на стимуляцию иммунной системы, и было принято решение завершить испытание.

В Alnylam Pharmaceuticals аналогичным образом успешно провели исследование ALN-TTR01, в котором используется технология SNALP, описанная выше, и целенаправленно воздействуют на выработку гепатоцитами как мутантного, так и TTR дикого типа, для лечения опосредованного TTR амилоидоза (ATTR). Были описаны три синдрома при ATTR: семейная амилоидическая полинейропатия (FAP) и семейная амилоидическая кардиомиопатия (FAC) - оба обусловленные аутосомно-доминантными мутациями в TTR; и старческий системный амилоидоз (SSA), обусловленный TTR дикого типа. Недавно завершилась I фаза плацебо-контролируемого испытания с повышением однократной дозы ALN-TTR01 с участием пациентов с ATTR. Введение ALN-TTR01 осуществляли в виде 15-минутной IV инфузии 31 пациенту (исследуемое лекарственное средство для 23 и плацебо для 8) в диапазоне доз 0,01-1,0 мг/кг (из расчета siRNA). Лечение хорошо переносилось без значительного повышения показателей печеночных проб. Инфузионные реакции отмечались у 3 из 23 пациентов при ≥0,4 мг/кг; все они реагировали на замедление скорости инфузии и все они продолжали участие в исследовании. Минимальные и временные повышения уровней цитокинов IL-6, IP-10 и IL-1RA в сыворотке отмечались у двух пациентов при наиболее высокой дозе 1 мг/кг (как предполагалось на основании доклинических исследований и исследований с участием NHP). Снижение уровня TTR в сыворотке, ожидаемый фармакодинамический эффект ALN-TTR01, наблюдалось при 1 мг/кг.

В еще одном варианте осуществления SNALP можно получить путем солюбилизации катионного липида, DSPC, холестерина и конъюгата PEG-липид, которые солюбилизируют в этаноле в молярном соотношении 40:10:40:10, соответственно (см. Semple et al., Nature Biotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177). Смесь липидов добавляли к водному буферу (50 мМ цитрат, рН 4) с перемешиванием до конечной концентрации этанола и липидов 30% (об./об.) и 6,1 мг/мл, соответственно, и ей позволяли уравновешиваться при 22°С в течение 2 мин. перед экструзией. Гидрированные липиды экструдировали через два установленных один над другим фильтра с размером пор 80 нм (Nuclepore) при 22°С при помощи экструдера Lipex (Northern Lipids) до достижения диаметра пузырьков 70-90 нм, определяемого посредством анализа по методу динамического рассеяния света. Для этого обычно требовалось 1-3 прохождения. siRNA (солюбилизированную в водном растворе, содержащем 30% этанол, с 50 мМ цитратом, рН 4) добавляли к предварительно уравновешенным (35°С) пузырькам со скоростью ~5 мл/мин. при перемешивании. После достижения конечного целевого соотношения siRNA/липиды 0,06 (вес/вес) смесь инкубировали в течение дополнительных 30 мин. при 35°С для обеспечения реорганизации пузырьков и инкапсулирования siRNA. Этанол затем удаляли, а внешний буфер заменяли на PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ KН₂РО₄, рН 7,5) путем диализа либо тангенциальной поточной диафильтрации. siRNA инкапсулировали в SNALP посредством регулируемого способа по методу ступенчатого разбавления. Липидные составляющие KC2-SNALP представляли собой DLin-KC2-DMA (катионный липид), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC; Avanti Polar Lipids), синтетический холестерин (Sigma) и PEG-C-DMA, используемые в молярном соотношении 57,1:7,1:34,3:1,4. После образования нагруженных частиц SNALP подвергали диализу против PBS и стерилизации путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм перед применением. Средние значения размера частиц составляли 75-85 нм, и 90-95% siRNA были инкапсулированы в липидных частицах. Конечное, соотношение siRNA/липиды в составах, используемых для тестирования in vivo, составляло ~0,15 (вес/вес). Системы LNP-siRNA, содержащие siRNA для фактора VII, разводили до соответствующих концентраций в стерильном PBS непосредственно перед применением, и составы вводили внутривенно через латеральную хвостовую вену в общем объеме 10 мл/кг. Данный способ можно экстраполировать на систему CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Другие липиды

Другие катионные липиды, такие как аминолипид 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA), можно использовать для инкапсулирования CRISPR-Cas аналогично siRNA (см., например, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529-8533). Может быть предусмотрен предварительно сформированный пузырек со следующим составом липидов: аминолипид, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), холестерин и (R)-2,3-бис(октадецилокси)пропил-1-(метоксиполи(этиленгликоль)2000)пропилкарбамат (конъюгат PEG-липид) в молярном соотношении 40/10/40/10, соответственно, и с соотношением siRNA для FVII/общие липиды, составляющим примерно 0,05 (вес/вес). Для обеспечения узкого распределения частиц по размеру в диапазоне 70-90 нм и низкого коэффициента полидисперсности 0,11±0,04 (n=56) частицы можно экструдировать до трех раз через мембраны с диаметром пор 80 нм перед добавлением РНК CRISPR-Cas. Можно использовать частицы, содержащие высокоактивный аминолипид 16, в которых молярное соотношение четырех липидных компонентов 16, DSPC, холестерина и конъюгата PEG-липид (50/10/38,5/1,5) можно дополнительно оптимизировать для повышения активности in vivo.

Michael S D Kormann и соавт. ("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume: 29, Pages: 154-157 (2011), опубликовано в интернете 09 января 2011 г.) описывают применение липидных оболочек для доставки РНК. Применение липидных оболочек также является предпочтительным в настоящем изобретении.

В другом варианте осуществления липиды можно составлять с системой CRISPR-Cas по настоящему изобретению с образованием липидных наночастиц (LNP). Липиды включают, без ограничения, DLin-KC2-DMA4, С12-200 и совместно действующие липиды дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и PEG-DMG, которые можно составлять с CRISPR-Cas вместо siRNA (см., например, Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3) с помощью процедуры самопроизвольного образования пузырьков. Молярное соотношение компонентов может составлять приблизительно 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA или С12-200/дистеароилфосфатидилхолин/холестерин/РЕО-ВМО). Конечное весовое соотношение липиды : siRNA может составлять ~12:1 и 9:1 в случае липидных наночастиц (LNP) на основе DLin-KC2-DMA и С12-200, соответственно. Составы могут характеризоваться средними диаметрами частиц ~80 нм при >90% эффективности включения. Может быть предусмотрена доза 3 мг/кг.

Tekmira имеет портфель из примерно 95 семейств патентов-аналогов, выданных в США и за границей, которые направлены на различные аспекты LNP и составы на основе LNP (см., например, патенты США №№7982027; 7799565; 8058069; 8283333; 7901708; 7745651; 7803397; 8101741; 8188263; 7915399; 8236943 и 7838658 и европейские патенты №№1766035; 1519714; 1781593 и 1664316), все из которых можно применять в настоящем изобретении и/или приспосабливать к нему.

Систему CRISPR-Cas можно доставлять инкапсулированной в микросферах на основе PLGA, таких как дополнительно описанные в опубликованных заявках на патенты США 20130252281, и 20130245107, и 20130244279 (закрепленные за Moderna Therapeutics), которые относятся к аспектам составления композиций, содержащих модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, которые могут кодировать белок, предшественник белка или частично или полностью процессированную форму белка или предшественника белка. Состав может характеризоваться молярным соотношением 50:10:38,5:1,5-3,0 (катионный липид : фузогенный липид:холестерин : конъюгат PEG-липид). Конъюгат PEG-липид может быть выбран, без ограничения, из PEG-C-DOMG, PEG-DMG. Фузогенный липид может представлять собой DSPC. См. также Schrum et al., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, опубликованную заявку на патент США 20120251618.

Технология Nanomerics преодолевает проблемы, связанные с биологической доступностью, для широкого спектра терапевтических средств, в том числе низкомолекулярных гидрофобных лекарственных средств, пептидов и терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот (плазмид, siRNA, miRNA). Конкретные пути введения, для которых технология продемонстрировала очевидные преимущества, включают пероральный путь, перенос через гематоэнцефалический барьер, доставку в солидные опухоли, а также в глаз. См., например, Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26; Uchegbu and Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 и Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2):523-36.

В публикации заявки на патент США №20050019923 описаны катионные дендримеры для доставки биологически активных молекул, таких как молекулы полинуклеотидов, пептиды и полипептиды и/или фармацевтические средства, в организм млекопитающего. Дендримеры подходят для обеспечения нацеленной доставки биологически активных молекул в, например, печень, селезенку, легкое, почку или сердце. Дендримеры являются синтетическими 3-мерными макромолекулами, получаемыми ступенчатым способом из простых разветвленных мономерных звеньев, природу и количество функциональных групп которых можно легко регулировать и изменять. Дендримеры синтезируют путем повторяющегося присоединения "строительных блоков" в направлении от сердцевины с несколькими функциональными группами (дивергентный подход к синтезу) или к сердцевине с несколькими функциональными группами (конвергентный подход к синтезу), и каждое присоединение 3-мерной оболочки из "строительных блоков" приводит к образованию дендримеров более высокой генерации. Синтез полипропилениминовых дендримеров начинается с диаминобутановой сердцевины, к которой присоединяют удвоенное количество аминогрупп посредством двойного присоединения по Михаэлю ацетонитрила к первичным аминогруппам с последующим гидрированием нитрильных групп. Это обуславливает удвоение количества аминогрупп. Полипропилениминовые дендримеры содержат 100% протонируемых атомов азота и до 64 концевых аминогрупп (генерация 5, DAB 64). Протонируемые группы обычно представляют собой аминогруппы, способные принимать протоны при нейтральном рН. Применение дендримеров в качестве средств для доставки генов в основном ориентировано на использование полиамидоамина и фосфорсодержащих соединений со смесью из амина/амида или N-P(O₂)S в качестве конъюгирующих единиц, соответственно, при этом в работах не сообщалось о применении полипропилениминовых дендримеров более низкой генерации для доставки генов. Полипропилениминовые дендримеры также изучали в качестве рН-чувствительных систем с контролируемым высвобождением для доставки лекарственных средств и для инкапсулирования в них гостевых молекул в случае химической модификации периферических аминокислотных групп. Также изучали цитотоксичность и взаимодействие полипропилениминовых дендримеров с ДНК, а также эффективность трансфекции с помощью DAB 64.

Публикация заявки на патент США №20050019923 основана на наблюдении того, что, в противоположность более ранним сообщениям, катионные дендримеры, такие как полипропилениминовые дендримеры, проявляют надлежащие свойства, такие как специфичное нацеливание и низкая токсичность, для применения в целенаправленной доставке биологически активных молекул, таких как генетический материал. В дополнение, производные катионного дендримера также проявляют подходящие свойства для целенаправленной доставки биологически активных молекул. См. также "Биологически активные полимеры", публикацию заявки на патент США 20080267903, в которой раскрыто следующее: "Показано, что различные полимеры, в том числе катионные полиаминные полимеры и дендримерные полимеры, обладают антипролиферативной активностью и могут, таким образом, быть применимыми для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, таких как неоплазии и опухоли, воспалительные нарушения (в том числе аутоиммунные нарушения), псориаз и атеросклероз. Полимеры можно применять в отдельности в качестве активных средств или в качестве средств доставки других терапевтических средств, таких как молекулы лекарственных средств или нуклеиновые кислоты, для генной терапии. В таких случаях присущая полимерам собственная противоопухолевая активность может дополнять активность средства, подлежащего доставке".

Белки с избыточным зарядом

Белки с избыточным зарядом представляют собой класс сконструированных или встречающихся в природе белков с необычно высоким положительным или отрицательным теоретическим суммарным зарядом. Белки как с избыточным отрицательным, так и с избыточным положительным зарядом проявляют особое свойство устойчивости к термически или химически индуцированной агрегации. Белки с избыточным положительным зарядом также способны проникать в клетки млекопитающих. Ассоциация молекул-карго, таких как плазмидная ДНК, siRNA или другие белки, с этими белками может обеспечивать функциональную доставку данных макромолекул в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo. В лаборатории Дэвида Лю сообщили о создании и определении характеристик белков с избыточным зарядом в 2007 г. (Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).

Невирусная доставка siRNA и плазмидной ДНК в клетки млекопитающих является значимой как в исследованиях, так и в терапевтических применениях (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569). Очищенный белок GFP с зарядом +36 (или другой белок с избыточным положительным зарядом) смешивают с siRNA в подходящей бессывороточной среде и обеспечивают возможность образования ими комплекса перед добавлением к клеткам. Включение сыворотки на этой стадии ингибирует образование комплексов белка с избыточным зарядом с siRNA и снижает эффективность обработки. Было обнаружено, что следующий протокол является эффективным для ряда линий клеток (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116). Однако, в целях оптимизации процедуры для конкретных линий клеток следует проводить предварительные эксперименты с различными дозами белка и siRNA.

(1) За один день до обработки высеять 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки развести очищенный белок GFP с зарядом +36 в бессывороточной среде до конечной концентрации 200 нМ. Добавить siRNA до конечной концентрации 50 нМ. Перемешать на вихревой мешалке и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.

(3) Во время инкубирования аспирировать среду от клеток и промыть один раз с помощью PBS.

(4) После инкубирования GFP с зарядом +36 и siRNA добавить к клеткам комплексы белка с siRNA.

(5) Инкубировать клетки с комплексами при 37°С в течение 4 ч.

(6) После инкубирования аспирировать среду и промыть три раза с помощью 20 ед./мл гепарина в PBS. Инкубировать клетки в сывороточной среде в течение дополнительных 48 ч. или дольше в зависимости от анализа нокдауна.

(7) Анализировать клетки с помощью иммуноблоттинга, количественной ПЦР, фенотипического анализа или другого соответствующего способа.

Было обнаружено, что GFP с зарядом +36 является эффективным реагентом для доставки плазмид в ряд клеток. Поскольку плазмидная ДНК является более крупной молекулой-карго, чем siRNA, то для образования эффективного комплекса с плазмидами требуется пропорционально больше белка GFP с зарядом +36. Для эффективной доставки плазмид заявители разработали вариант GFP с зарядом +36, несущий С-концевую пептидную метку НА2, известный пептид, разрушающий эндосомы, полученный из белка гемагглютинина вируса гриппа. Следующий протокол был эффективным для многих клеток, но, как указано выше, рекомендуется, чтобы дозы плазмидной ДНК и белка с избыточным зарядом были оптимизированы для конкретных линий клеток и применений в доставке.

(1) За один день до обработки высеять 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки разбавить очищенный белок GFP с зарядом р36 в бессывороточной среде до конечной концентрации 2 мМ. Добавить 1 мг плазмидной ДНК. Перемешать на вихревой мешалке и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.

(3) Во время инкубирования аспирировать среду от клеток и промыть один раз с помощью PBS.

(4) После инкубирования GFP с зарядом р36 и плазмидной ДНК осторожно добавить к клеткам комплексы белок-ДНК.

(5) Инкубировать клетки с комплексами при 37°С в течение 4 ч.

(6) После инкубирования аспирировать среду и промыть с помощью PBS. Инкубировать клетки в сывороточной среде и инкубировать в течение дополнительных 24-48 ч.

(7) При необходимости проанализировать доставку плазмид (например, посредством экспрессии генов, обусловленной плазмидами).

См. также, например, McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). Способы использования белков с избыточным зарядом можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

Пептиды, проникающие в клетку

В еще одном варианте осуществления предусмотрены пептиды, проникающие в клетку (СРР), для доставки системы CRISPR-Cas. СРР представляют собой короткие пептиды, содействующие поглощению клетками различных молекул-карго (от наноразмерных частиц до малых химических молекул и крупных фрагментов ДНК). Выражение "молекула-карго", используемое в данном документе, включает, без ограничения, группу, состоящую из терапевтических средств, диагностических зондов, пептидов, нуклеиновых кислот, антисмысловых олигонуклеотидов, плазмид, белков, наночастиц, липосом, хромофоров, малых молекул и радиоактивных материалов. В аспектах настоящего изобретения молекула-карго может также содержать любой компонент системы CRISPR-Cas или всю функциональную систему CRISPR-Cas. В аспектах настоящего изобретения дополнительно представлены способы доставки требуемой молекулы-карго субъекту, включающие: (а) получение комплекса, содержащего пептид, проникающий в клетку, по настоящему изобретению и требуемую молекулу-карго, и (b) пероральное, внутрисуставное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутриартериальное, интраназальное, интрапаренхиматозное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, накожное, ректальное или местное введение комплекса субъекту. Молекула-карго связана с пептидами химической связью посредством ковалентных связей либо посредством нековалентных взаимодействий.

Функцией СРР является доставка молекулы-карго в клетки, при этом процесс, который обычно происходит посредством эндоцитоза приводит к доставке молекулы-карго в эндосомы живых клеток млекопитающих. Пептиды, проникающие в клетку, имеют различные размер, аминокислотные последовательности и заряды, но все СРР имеют одну отличительную характеристику, которая представляет собой способность к перемещению через плазматическую мембрану и содействию доставке различных молекул-карго в цитоплазму или органеллу. Перемещение СРР можно подразделить на три основных механизма поступления: прямое прохождение через мембрану, поступление, опосредованное эндоцитозом, и перемещение посредством образования промежуточной структуры. СРР нашли многочисленные применения в медицине в качестве средств для доставки лекарственных средств при лечении различных заболеваний, в том числе рака, и ингибиторов вирусов, а также контрастных веществ для мечения клеток. Примеры последнего включают действие в качестве носителя GFP, контрастных веществ для MRI или квантовых точек. СРР обладают большим потенциалом в качестве векторов доставки in vitro и in vivo для применения в исследованиях и медицине. СРР обычно имеют такой аминокислотный состав, при котором они характеризуются высокой относительной распространенностью положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, либо имеют последовательности, характеризующиеся чередующимся расположением полярных/заряженных аминокислот и неполярных гидрофобных аминокислот. Эти два типа структур называются поликатионными или амфипатическими, соответственно. Третьим классом СРР являются гидрофобные пептиды, содержащие только неполярные остатки с низким суммарным зарядом или имеющие гидрофобные группы аминокислот, крайне важные для поглощения клетками. Одним из первых обнаруженных СРР был трансактивирующий активатор транскрипции (Tat) вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1), который, как было выявлено, эффективно поглощался из окружающей среды многочисленными типами клеток в культуре. С тех пор количество известных СРР значительно увеличилось, и были созданы низкомолекулярные синтетические аналоги с более эффективными свойствами белковой трансдукции. СРР включают, без ограничения, пенетратин, Tat (48-60), транспортан и (R-AhX-R₄) (Ahx = аминогексаноил).

В патенте США 8372951 представлен СРР, полученный из катионного белка эозинофилов (ЕСР), проявляющий высокую эффективность проникновения в клетку и низкую токсичность. Также представлены аспекты доставки СРР со своей молекулой-карго позвоночному субъекту. Дополнительные аспекты, касающиеся СРР и их возможной доставки, описаны в патентах США 8575305, 8614194 и 8044019.

Эти СРР можно использовать для доставки системы CRISPR-Cas, что также представлено в рукописи "Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA" Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2014 Apr 2. [Электронная публикация, предшествующая печатной], включенной с помощью ссылки во всей своей полноте, где продемонстрировано, что обработка с помощью рекомбинантного белка Cas9 конъюгированного с СРР, и направляющих РНК, образующих комплекс с СРР, приводит к нарушениям функционирования эндогенных генов в линиях клеток человека. В данной статье белок Cas9 был конъюгирован СРР с помощью тиоэфирной связи, тогда как направляющая РНК образовывала комплекс с СРР с образованием конденсированных положительно заряженных наночастиц. Было показано, что одновременная и последовательная обработка клеток человека, в том числе эмбриональных стволовых клеток, дермальных фибробластов, клеток НЕK293Т, клеток HeLa и клеток эмбриональной карциномы, модифицированным Cas9 и направляющей РНК приводила к эффективным нарушениям функционирования генов со сниженной частотой нецелевых мутаций по сравнению с трансфекцией плазмидами.

Имплантируемые устройства

В другом варианте осуществления также предусмотрены имплантируемые устройства для доставки системы CRISPR-Cas. Например, в публикации заявки на патент США 20110195123 раскрыто представленное имплантируемое медицинское устройство, высвобождающее лекарственное средство локально и в течение длительного периода, в том числе несколько типов такого устройства, реализуемые методы лечения и способы имплантации. Устройство содержит полимерный субстрат, такой как матрица, например, применяемый в качестве корпуса устройства, и лекарственные средства, и в некоторых случаях дополнительные трехмерные подложки-носители, такие как металлы или дополнительные полимеры, и материалы для улучшения видимости и визуализации. В основе выбора лекарственного средства лежит преимущество высвобождения лекарственного средства, происходящего локально и в течение длительного периода, где лекарственное средство высвобождается непосредственно во внеклеточный матрикс (ЕСМ) пораженной заболеванием области, как, например, в случае опухоли, воспаления, дегенерации, или в целях симптоматической терапии, или в пораженные гладкомышечные клетки, или для предупреждения. Один вид лекарственных средств представляет собой лекарственные средства для сайленсинга генов на основе РНК-интерференции (RNAi), включающие, без ограничения, siRNA, shRNA или антисмысловые РНК/ДНК, рибозимы и нуклеозидные аналоги. Таким образом, данную систему можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней. Методы имплантации в некоторых вариантах осуществления представляют собой существующие процедуры имплантации, разработанные и применяемые в настоящее время для других видов лечения, в том числе для брахитерапии и пункционной биопсии. В таких случаях размеры нового имплантата, описанного в настоящем изобретении, аналогичны размерам первоначального имплантата. Как правило, в ходе одной процедуры лечения имплантируют несколько устройств.

Как описано в публикации заявки на патент США 20110195123, представлена имплантируемая или вставная система доставки лекарственных средств, в том числе системы, применимые для введения в полость, такую как брюшная полость, и/или для любого другого типа введения, в которой система доставки лекарственных средств не закреплена и не присоединена, содержащая биоустойчивый, и/или разлагаемый, и/или биопоглощаемый полимерный субстрат, который может, например, необязательно представлять собой матрицу. Следует отметить, что выражение "вставка" также включает имплантацию. Система для доставки лекарственных средств преимущественно реализуется как "Loder", что описано в публикации заявки на патент США 20110195123.

Полимер или множество полимеров, содержащие средство и/или множество средств, являются биосовместимыми, обеспечивая высвобождение средства с контролируемой скоростью, где общий объем полимерного субстрата, такого как матрица, например, в некоторых вариантах осуществления необязательно и предпочтительно не превосходит максимальный объем, позволяющий достигнуть терапевтического уровня средства. В качестве неограничивающего примера, такой объем предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 м³ до 1000 мм³, как того требует объем загруженного средства. Loder необязательно может иметь больший размер, например, будучи включенной в состав устройства, размер которого определяется функциональным назначением, например, без ограничения коленного сустава, внутриматочного или шеечного кольца и т.п.

Система доставки лекарственных средств (для доставки композиции) в некоторых вариантах осуществления предназначена для предпочтительного использования разлагаемых полимеров, где основным механизмом высвобождения является объемная эрозия; или же в некоторых вариантах осуществления применяются неразлагаемые или медленно разлагаемые полимеры, где основным механизмом высвобождения является диффузия, а не объемная эрозия, так что их наружная часть функционирует в качестве мембраны, а их внутренняя часть функционирует в качестве депо лекарственного средства, которое практически не подвергается воздействию окружения в течение продолжительного периода (например, от приблизительно недели до приблизительно нескольких месяцев). Также можно необязательно применять комбинации различных полимеров с различными механизмами высвобождения. Градиент концентраций на поверхности предпочтительно эффективно поддерживается постоянным в течение значительного периода в ходе общего периода высвобождения лекарственного средства, и, таким образом, скорость диффузии (называемой "диффузией нулевого порядка") является эффективно постоянной. Под выражением "постоянный" подразумевают скорость диффузии, которая предпочтительно поддерживается выше нижнего порога терапевтической эффективности, но которая, тем не менее, может необязательно характеризоваться начальным всплеском и/или колебаться, например, повышаясь и понижаясь в некоторой степени. Скорость диффузии предпочтительно поддерживается таким образом в течение длительного периода, и до определенного уровня она может считаться постоянной для оптимизации терапевтически эффективного периода, например, эффективного периода сайленсинга.

Система доставки лекарственных средств необязательно и предпочтительно предназначена для защиты нуклеотидного терапевтического средства от деградации, химической по своей природе или обусловленной воздействием ферментов и других факторов в организме субъекта.

Система доставки лекарственных средств, описанная в публикации заявки на патент США 20110195123, необязательно связана с чувствительными и/или активирующими приборами, функционирующими во время и/или после имплантации устройства посредством неинвазивных и/или минимально инвазивных способов активации и/или ускорения/замедления, например, необязательно включающих, без ограничения, способы или устройства с применением термического нагревания и охлаждения, лазерных пучков и ультразвука, в том числе фокусированного ультразвука, и/или RF (радиочастот).

Согласно некоторым вариантам осуществления публикации заявки на патент США 20110195123 участок для локальной доставки может необязательно включать целевые участки, характеризующиеся высокой аномальной пролиферацией клеток и подавлением апоптоза, в том числе опухоли, очаги активного и/или хронического воспаления и инфекции, включающие аутоиммунные болезненные состояния, ткань с дегенеративными изменениями, включающую мышечную и нервную ткань, очаги хронической боли, участки с дегенеративными изменениями, и местоположения переломов костей, и другие местоположения ран, для усиления регенерации ткани, а также поврежденные сердечные, гладкие и поперечно-полосатые мышцы. Участок для локальной доставки также может необязательно включать участки, позволяющие осуществлять профилактические мероприятия, в том числе при беременности, при предупреждении инфекции и старения.

Участок для имплантации композиции, или целевой участок, предпочтительно характеризуется радиусом, площадью и/или объемом, достаточно малыми для целенаправленной локальной доставки. Например, целевой участок необязательно имеет диаметр в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 5 см.

Местоположение целевого участка предпочтительно выбирают для достижения максимальной терапевтической эффективности. Например, композицию системы для доставки лекарственных средств (необязательно вместе с устройством для имплантации, описанным выше) необязательно и предпочтительно имплантируют в опухолевое окружение, или рядом с ним, или в кровеносную сеть, связанную с ним.

Например, композицию (необязательно вместе с устройством) необязательно имплантируют в поджелудочную железу, предстательную железу, молочную железу, печень или рядом с ними, через сосок, в сосудистую систему и т.д.

Целевое местоположение необязательно выбирают из группы, состоящей из (только в качестве неограничивающих примеров, поскольку любой участок в организме необязательно может подходить для имплантации Loder): 1. участков головного мозга с дегенеративными изменениями, таких как базальные ганглии, белое и серое вещество, при болезни Паркинсона или Альцгеймера; 2. спинного мозга, как в случае бокового амиотрофического склероза (ALS); 3. шейки матки для предупреждения HPV-инфекции; 4. суставов с активным или хроническим воспалением; 5. дермы, как в случае псориаза; 6. участков симпатических и чувствительных нервов для обезболивающего эффекта; 7. участков внутрикостной имплантации; 8. очагов острой и хронической инфекции; 9. интравагинальных участков; 10. внутреннего уха - слуховой системы, лабиринта внутреннего уха, вестибулярной системы; 11. внутритрахеальных участков; 12. внутрисердечных участков; участков коронарных сосудов, эпикардиальных участков; 13. мочевого пузыря; 14. желчевыделительной системы; 15. паренхимной ткани, включающей, без ограничения, почку, печень, селезенку; 16. лимфатических узлов; 17. слюнных желез; 18. десен вокруг зубов; 19. внутрисуставных участков (имплантация в суставы); 20. внутриглазных участков; 21. ткани головного мозга; 22. желудочков головного мозга; 23. полостей, в том числе брюшной полости (например, без ограничения, для лечения рака яичника); 24. внутрипищеводных участков и 25. внутрипрямокишечных участков.

Вставка системы (например, устройства, содержащего композицию) необязательно связана с инъекцией материала в ЕСМ целевого участка и окружение этого участка для воздействия на локальные рН, и/или температуру, и/или другие биологические факторы, влияющие на диффузию лекарственного средства и/или кинетику лекарственного средства в ЕСМ целевого участка и окружении такого участка.

Согласно некоторым вариантам осуществления высвобождение указанного средства необязательно может быть связано с чувствительными и/или активирующими приборами, функционирующими до, и/или во время, и/или после вставки посредством неинвазивных, и/или минимально инвазивных, и/или других способов активации и/или ускорения/замедления, включающих способы или устройства с применением лазерных пучков, излучения, термического нагревания и охлаждения, и ультразвука, в том числе фокусированного ультразвука, и/или RF (радиочастот), а также химических активаторов.

Согласно другим вариантам осуществления в публикации заявки на патент США 20110195123 лекарственное средство предпочтительно включает биологическое лекарственное средство для сайленсинга генов на основе RNAi, например, для лечения случаев локализованного рака молочной железы, поджелудочной железы, головного мозга, почки, мочевого пузыря, легкого и предстательной железы, описанных ниже. Кроме того, многие лекарственные средства, отличные от siRNA, применимы для инкапсулирования в Loder и могут применяться в контексте настоящего изобретения, поскольку такие лекарственные средства могут быть инкапсулированы в субстрат Loder, такой как, например, матрица. Такие лекарственные средства включают одобренные лекарственные средства, доставляемые в настоящее время с помощью способов, отличных от способов по настоящему изобретению, включающие амфотерицин В для лечения грибковой инфекции; антибиотики, как, например, при остеомиелите; обезболивающие средства, такие как наркотические средства; антидегенеративные средства, как, например, при болезни Альцгеймера или Паркинсона, в Loder, имплантируемой вблизи спинного мозга в случае боли в спине. Такую систему можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

Например, для конкретных применений, таких как предупреждение роста или возобновления роста гладкомышечных клеток (поврежденных в ходе процедуры стентирования и вследствие этого склонных к пролиферации), лекарственное средство может необязательно представлять собой siRNA, осуществляющую сайленсинг в гладкомышечных клетках, в том числе сайленсинг H19, или лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из таксола, рапамицина и аналогов рапамицина. В таких случаях Loder предпочтительно представляет собой стент, выделяющий лекарственное средство (DES), с пролонгированным высвобождением при постоянной скорости либо выделенное устройство, которое имплантируют отдельно, совместно со стентом. Все из этого можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

В качестве другого примера конкретного применения, нейро- и миодегенеративные заболевания развиваются в связи с аномальной экспрессией генов. Локальная доставка РНК для сайленсинга может иметь терапевтические свойства, препятствующие такой аномальной экспрессии генов. Локальная доставка антиапоптотических, противовоспалительных и антидегенеративных лекарственных средств, в том числе низкомолекулярных лекарственных средств и макромолекул, может также необязательно быть терапевтической. В таких случаях Loder применяют для пролонгированного высвобождения при постоянной скорости и/или посредством выделенного устройства, которое имплантируют отдельно. Все из этого можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

В качестве еще одного примера конкретного применения психические и когнитивные расстройства лечат с помощью модификаторов генов. Нокдаун гена с помощью РНК для сайленсинга является возможным методом лечения. Применение Loder для локальной доставки нуклеотидных средств в участки центральной нервной системы является возможным методом терапии психических и когнитивных расстройств, в том числе, без ограничения, психоза, биполярных расстройств, невротических расстройств и расстройств поведения. Loder могут также обеспечивать локальную доставку лекарственных средств, в том числе низкомолекулярных лекарственных средств и макромолекул, при имплантации в конкретные участки головного мозга. Все из этого можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

В качестве другого примера конкретного применения сайленсинг генов медиаторов врожденного и/или приобретенного иммунного ответа в локальных участках обеспечивает предупреждение отторжения трансплантированного органа. Локальная доставка РНК для сайленсинга и иммуномодулирующих реагентов с помощью Loder, имплантированной в трансплантированный орган и/или участок имплантации, активирует местное подавление иммунного ответа в отношении трансплантированного органа путем отвлечения иммунных клеток, таких как CD8⁺. Все из этого можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней.

В качестве другого примера конкретного применения факторы роста сосудов, в том числе VEGF, и ангиогенин, и другие, являются существенно важными для неоваскуляризации. Локальная доставка факторов, пептидов, пептидомиметиков или подавление их репрессоров является важным терапевтическим воздействием; сайленсинг репрессоров и локальная доставка факторов, пептидов, макромолекул и низкомолекулярных лекарственных средств, стимулирующих ангиогенез, с помощью Loder являются терапевтическими мерами в отношении заболевания периферических сосудов, системного заболевания сосудов и заболевания сосудов сердца.

Способ вставки, такой как имплантация, необязательно можно еще применять для других типов имплантации в ткань, и/или для вставок, и/или для отбора образцов тканей необязательно без модификаций или, в альтернативном случае, необязательно лишь с незначительными модификациями таких способов. Такие способы необязательно включают, без ограничения, способы брахитерапии, биопсию, эндоскопию с применением ультразвуковых технологий и/или без них, такую как ERCP, стереотаксические способы в отношении ткани головного мозга, лапароскопию, в том числе имплантацию с помощью лапароскопа в суставы, органы брюшной полости, стенку мочевого пузыря и полости тела.

мРНК фермента CRISPR и направляющая РНК

мРНК фермента CRISPR и направляющую РНК можно также доставлять по отдельности. мРНК фермента CRISPR можно доставлять перед направляющей РНК, чтобы предоставить время для экспрессии фермента CRISPR. мРНК фермента CRISPR можно вводить за 1-12 часов (предпочтительно примерно за 2-6 часов) до введения направляющей РНК.

Альтеорнативно, мРНК фермента CRISPR и направляющую РНК можно вводить совместно. Вторую бустерную дозу направляющей РНК можно преимущественно вводить через 1-12 часов (предпочтительно примерно через 2-6 часов) после первого введения мРНК фермента CRISPR + направляющей РНК.

Введение дополнительных доз мРНК фермента CRISPR и/или направляющей РНК может быть применимым для достижения наиболее эффективных уровней модификации генома.

Для сведения к минимуму токсичности и нецелевого эффекта будет важной регуляция концентрации доставляемых мРНК фермента CRISPR и направляющей РНК. Оптимальные концентрации мРНК фермента CRISPR и направляющей РНК можно определить путем тестирования различных концентраций в клеточной или животной модели и применения глубокого секвенирования для анализа степени модификации в возможных нецелевых локусах генома. Например, для направляющей последовательности, нацеливающейся на 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3' в гене ЕМХ1 генома человека, можно применять глубокое секвенирование для определения уровня модификации в следующих двух нецелевых локусах, 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' и 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAА-3'. Для доставки in vivo следует выбрать концентрацию, дающую наиболее высокий уровень целевой модификации при сведении к минимуму уровня нецелевой модификации.

Альтернативно, для сведения к минимуму уровня токсичности и нецелевого эффекта можно доставлять мРНК фермента никазы CRISPR (например, Cas9 S. pyogenes с мутацией D10A) вместе с парой направляющих РНК, которые осуществляют нацеливание на сайт, представляющий интерес. Две направляющие РНК необходимо расположить следующим образом. Направляющие последовательности показаны красным (одинарное подчеркивание) и синим (двойное подчеркивание), соответственно (эти примеры основаны на требованиях к РАМ для Cas9 Streptococcus pyogenes).

Дополнительное исследование системы предоставило заявителям свидетельство наличия "липкого" 5'-конца (см., например, Ran et al., Cell. 2013 Sep 12; 154(6): 1380-9 и предварительную заявку на патент США с регистрационным номером 61/871301, поданную 28 августа 2013 г.). Заявители дополнительно идентифицировали параметры, связанные с эффективным расщеплением мутантной никазой Cas9 в сочетании с двумя направляющими РНК, и эти параметры включают, без ограничения, длину "липкого" 5'-конца. В вариантах осуществления настоящего изобретения "липкий" 5'-конец содержит не более 200 пар оснований, предпочтительно не более 100 пар оснований или более предпочтительно не более 50 пар оснований. В вариантах осуществления настоящего изобретения "липкий" 5'-конец содержит по меньшей мере 26 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 30 пар оснований или более предпочтительно 34-50 пар оснований или 1-34 пары оснований. В других предпочтительных способах по настоящему изобретению первая направляющая последовательность, управляющая расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, и вторая направляющая последовательность, управляющая расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, обуславливают возникновение "тупого" конца или "липкого" 3'-конца. В вариантах осуществления настоящего изобретения "липкий" 3'-конец содержит не более 150, 100 или 25 пар оснований или не менее 15, 10 или 1 пары оснований. В предпочтительных вариантах осуществления "липкий" 3'-конец содержит 1-100 пар оснований.

Аспекты настоящего изобретения относятся к снижению экспрессии продукта гена, или к дополнительному введению матричного полинуклеотида в молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, или к точному вырезанию вставочной последовательности путем обеспечения повторного отжига и лигирования двух "липких" 5'-концов, или к изменению активности или функционирования продукта гена, или к повышению экспрессии продукта гена. В варианте осуществления настоящего изобретения продукт гена представляет собой белок.

Только пары sgRNA, создающие "липкие" 5'-концы, с перекрыванием между направляющими последовательностями, составляющим менее 8 п.о. (смещение превышает -8 п.о.), были способны опосредовать выявляемое образование вставок/делеций. Важно, что каждая направляющая последовательность, применяемая в данных анализах, способна эффективно индуцировать образование вставок/делеций при спаривании с Cas9 дикого типа, что указывает на то, что взаимное расположение пар направляющих последовательностей является наиболее важным параметром для предсказания активности внесения двойных однонитевых разрывов.

Поскольку Cas9n и Cas9H840A вносят однонитевые разрывы в противоположные нити ДНК, замена Cas9n на Cas9H840A с указанной парой sgRNA должна обуславливать инверсию типа "липкого" конца. Например, пара sgRNA, которая с Cas9n будет образовывать "липкий" 5'-конец, теоретически будет образовывать вместо этого соответствующий "липкий" 3'-конец. Таким образом, пары sgRNA, обуславливающие с Cas9n образование "липкого" 3'-конца, можно применять с Cas9H840A для образования "липкого" 5'-конца. Заявители тестировали Cas9H840A с набором пар sgRNA, предназначенных для образования "липких" как 5'-, так и 3'-концов (диапазон смещений от -278 до +58 п.о.), но, вопреки ожиданиям, не могли наблюдать образование вставок/делеций. Может потребоваться дополнительная работа для определения необходимых правил конструирования пар sgRNA для обеспечения внесения двойных однонитевых разрывов с помощью Cas9H840A.

Печень, пропротеинконвертаза субтилизин/кексин 9 (PCSK9)

Данные демонстрируют фенотипическую конверсию.

Пропротеинконвертаза субтилизин/кексин 9 (PCSK9) является представителем семейства сериновых протеаз субтилизинового типа. PCSK9 экспрессируется главным образом в печени и является критически важным для снижения экспрессии рецепторов LDL в гепатоцитах. Уровни LDL-C в плазме значительно повышены у людей с мутациями приобретения функции в PCSK9, вследствие чего их считают имеющими тяжелую гиперхолестеринемию. Таким образом, PCSK9 является привлекательной мишенью для CPJSPR. Целенаправленно воздействующие на PCS9K CRISPR можно составлять в липидных частицах и вводить, например, при приблизительно 15, 45, 90, 150, 250 и 400 мкг/кг внутривенно (см., например, http://www.alnylam.com/capella/wp-content/uploads/2013/08/ALN-PCS02-001-Protocol-Lancet.pdf).

Bailey и соавт. (J Mol Med (Berl). 1999 Jan; 77(1):244-9) раскрывают доставку инсулина посредством генной терапии соматических клеток ex vivo, включающей выделение отличных от В-клеток соматических клеток (например, фибробластов) у пациента с диабетом и генетическое изменение их in vitro для выработки и секреции инсулина. Клетки можно выращивать в культуре и возвращать донору в качестве источника заменителя инсулина. Клетки, модифицированные таким образом, можно оценивать перед имплантацией, а резервные запасы можно подвергать криоконсервации. В случае применения собственных клеток пациента процедура будет избавлена от необходимости в подавлении иммунитета и преодолеет проблему снабжения тканей, избегая при этом повторного разрушения клеток. Для генной терапии соматических клеток ex vivo требуется доступный и устойчивый тип клеток, поддающийся нескольким трансфекциям и подвергаемый регулируемой пролиферации. Особые проблемы, связанные с применением отличных от В-клеток соматических клеток, включают процессинг проинсулина в инсулин и придание чувствительности стимулируемому глюкозой биосинтезу проинсулина и регулируемому высвобождению инсулина. Предварительные исследования с применением фибробластов, гипофизарных клеток, клеток почек (COS) и клеток яичников (СНО) позволяют предположить, что эти проблемы могут быть разрешены и что генная терапия соматических клеток ex vivo предлагает возможный подход к терапии с использованием заменителя инсулина. Систему по Bailey и соавт. можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в печень и/или приспосабливать к ней.

Способы по Sato и соавт. (Nature Biotechnology Volume 26 Number 4 April 2008, Pages 431-442) можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в печень. Sato и соавт. обнаружили, что виды лечения с помощью связанных с витамином А липосом, содержащих siRNA, практически полностью устраняли фиброз печени и продлевали период выживания у крыс со смертельным в иных случаях циррозом печени, индуцированным диметилнитрозамином, в зависимости от дозы и продолжительности. Катионные липосомы (Lipotrust), содержащие O,O'-дитетрадеканоил-N-(а-триметиламмонийацетил)диэтаноламинохлорид (DC-6-14) в качестве катионного липида, холестерин и диолеоилфосфатидилэтаноламин в молярном соотношении 4:3:3 (демонстрировавшие высокую эффективность трансфекции в условиях сывороточной среды для доставки генов in vitro и in vivo), приобретали у Hokkaido System Science. Липосомы изготовляли посредством способа с применением подвергнутых сублимационной сушке "пустых" липосом и получали в концентрации 1 мМ (DC-16-4) путем добавления бидистиллированной воды (DDW) к лиофилизированной смеси липидов при перемешивании на вихревой мешалке перед применением. Для получения связанных с VA липосом 200 нмоль витамина А (ретинол, Sigma), растворенного в DMSO, смешивали с суспензиями липосом (в виде 100 нмоль DC-16-4) путем перемешивания на вихревой мешалке в пробирке на 1,5 мл при 25°С. Для получения связанных с VA липосом, несущих siRNAgp46 (VA-липосома-siRNAgp46), раствор siRNAgp46 (580 пмоль/мл в DDW) добавляли к раствору связанных с ретинолом липосом при перемешивании при 25°С. Соотношение siRNA и DC-16-4 составляло 1:11,5 (моль/моль), а соотношение siRNA и липосом (вес/вес) составляло 1:1. Любой свободный витамин А или siRNA, не поглощенную липосомами, отделяли от липосомных препаратов при помощи системы микроразделения (концентратор VIVASPIN 2, MWCO 30000, PES, VIVASCIENCE). Суспензию липосом добавляли на фильтры и центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин. 3 раза при 25°С. Фракции собирали, и материал, захваченный фильтром, разбавляли в PBS с получением требуемой дозы для применения in vitro или in vivo. Крысам проводили три инъекции по 0,75 мг/кг siRNA через день. Систему по Sato и соавт. можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в печень посредством доставки приблизительно 0,5-1 мг/кг РНК CRISPR-Cas в липосомах, как описано Sato и соавт., людям, и/или приспосабливать к ней.

Способы по Rozema и соавт. (PNAS, August 7, 2007, vol. 104, no. 32) в отношении средства для доставки siRNA в гепатоциты как in vitro, так и in vivo, которое Rozema и соавт. назвали динамическими поликонъюгатами siRNA, можно также применять в настоящем изобретении. Ключевые особенности технологии динамических поликонъюгатов включают применение мембраноактивного полимера, способность к обратимой маскировке активности данного полимера до достижения им кислой среды эндосом и способность к специфичному целенаправленному воздействию этого модифицированного полимера и его молекулы-карго siRNA на гепатоциты in vivo после простой i.v. инъекции под низким давлением. SATA-модифицированные siRNA синтезируют с помощью реакции 5'-аминомодифицированной siRNA с 1 весовым эквивалентом (вес. экв.) реагента N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетата (SATA) (Pierce) и 0,36 вес. экв. NaHCO₃ в воде при 4°С в течение 16 ч. Модифицированные siRNA затем осаждают путем добавления 9 об. этанола и инкубирования при 80°С в течение 2 ч. Осадок ресуспендируют в IX буфере для siRNA (Dharmacon) и оценивают количественно путем измерения поглощения при длине волны 260 нм. PBAVE (30 мг/мл в 5 мМ TAPS, рН 9) модифицируют путем добавления 1,5 вес. % SMPT (Pierce). После инкубирования в течение 1 ч. 0,8 мг SMPT-PBAVE добавляли к 400 мкл изотонического раствора глюкозы, содержащего 5 мМ TAPS (рН 9). К этому раствору добавляли 50 мкг SATA-модифицированной siRNA. Для экспериментов по изучению зависимости "доза-эффект", где [PBAVE] была постоянной, добавляют различные количества siRNA. Смесь затем инкубируют в течение 16 ч. К раствору затем добавляют 5,6 мг свободного основания Hepes, а после этого смесь 3,7 мг CDM-NAG и 1,9 мг CDM-PEG. Раствор затем инкубируют в течение по меньшей мере 1 ч. при комнатной температуре перед инъекцией. CDM-PEG и CDM-NAG синтезируют из хлорангидрида, образующегося посредством применения оксалилхлорида. К хлорангидриду добавляют 1,1 молярного эквивалента полиэтиленгликольмонометилового эфира (средняя молекулярная масса 450) с образованием CDM-PEG или (аминоэтокси)этокси-2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-глюкопиранозида с образованием CDM-NAG. Конечный продукт очищают с помощью обращенно-фазовой HPLC с 0,1% TFA в градиенте вода/ацетонитрил. Мышам доставляли приблизительно 25-50 мкг siRNA. Систему по Rozema и соавт. можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в печень, например, предусматривая дозу от приблизительно 50 до приблизительно 200 мг CRISPR-Cas для доставки человеку.

Кость

Oakes and Lieberman (Clin Orthop Relat Res. 2000 Oct; (379 Suppl): S101-12) обсуждают доставку генов в кость. Путем переноса генов в клетки в конкретном анатомическом участке можно использовать остеоиндуктивные свойства факторов роста в физиологических дозах в течение длительного периода для содействия более значительной реакции заживления. Конкретный анатомический участок, качество кости и мягкотканный футляр влияют на выбор целевых клеток для регионарной генной терапии. Векторы для генной терапии, доставляемые в обрабатываемый участок в остеоиндуктивных носителях, давали многообещающие результаты. Некоторые исследователи показали впечатляющие результаты, применяя регионарную генную терапию в животных моделях ex vivo и in vivo. Такую систему можно применять для доставки системы CRISPR-Cas в кость и/или приспосабливать к ней.

Головной мозг

Варианты доставки в головной мозг включают инкапсулирование фермента CRISPR и направляющей РНК в форме ДНК или РНК в липосомы и конъюгацию с "молекулярными троянскими конями" для доставки через гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Было показано, что "молекулярные троянские кони" являются эффективными для доставки векторов экспрессии B-gal в головной мозг отличных от человека приматов. Этот же подход можно применять для доставки векторов, содержащих фермент CRISPR и направляющую РНК. Например, Xia CF and Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology." Mol Pharm. 2009 May-Jun; 6(3):747-51. doi: 10.1021/mp800194) описывают, что доставка коротких интерферирующих РНК (siRNA) в клетки в культуре и in vivo возможна в случае комбинированного применения моноклонального антитела (mAb), специфичного к рецептору, и авидин-биотиновой технологии. Авторы также сообщают, что, поскольку в случае применения авидин-биотиновой технологии связь между нацеливающим mAb и siRNA является устойчивой, после внутривенного введения целенаправленно воздействующей siRNA наблюдаются эффекты RNAi in vivo в отдаленных участках, таких как головной мозг.

Zhang и соавт. (Mol Ther. 2003 Jan; 7(1):11-8.)) описывают, как экспрессионные плазмиды, кодирующие репортеры, такие как люцифераза, инкапсулировали во внутреннее пространство "искусственного вируса", включающего пегилированную иммунолипосому размером 85 нм, нацеливаемую на головной мозг макака-резуса in vivo с помощью моноклонального антитела (MAb) к рецептору инсулина человека (HIR). MAb к HIR позволяет липосоме, несущей экзогенный ген, подвергаться трансцитозу через гематоэнцефалический барьер и эндоцитозу через плазматическую мембрану нейронов после внутривенной инъекции. Уровень экспрессии гена люциферазы в головном мозге у макака-резуса был в 50 раз выше по сравнению с крысой. Широко распространенная экспрессия гена бета-галактозидазы в нейронах головного мозга приматов была продемонстрирована с помощью как гистохимического анализа, так и конфокальной микроскопии. Авторы указывают, что данный подход позволяет достичь обратимой экспрессии трансгена у взрослых животных в течение 24 часов. Соответственно, применение иммунолипосом является предпочтительным. Их можно использовать в сочетании с антителами для нацеливания на конкретные ткани или белки клеточной поверхности.

Также являются предпочтительными другие средства доставки РНК, как, например, посредством наночастиц (Cho, S., Goldberg, М., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. and Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010) или экзосом (Schroeder, A., Levins, С., Cortez, С., Langer, R., and Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641).

Так, было показано, что экзосомы являются особенно применимыми в доставке siRNA, системы, в некоторой степени сходной с системой CRISPR. Например, Еl-Andaloussi S и соавт. ("Exosome-mediated delivery of siPHK in vitro and in vivo." Nat Protoc. 2012 Dec; 7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.) описывают, как экзосомы, являющиеся перспективными инструментами доставки лекарственных средств через различные биологические барьеры, можно приспособить для доставки siRNA in vitro и in vivo. Данный подход заключается в создании нацеленных экзосом посредством трансфекции вектором экспрессии, содержащим белок экзосом, слитый с пептидным лигандом. Экзосомы затем очищают от надосадочной жидкости с трансфицированными клетками и характеризуют, а затем в экзосомы загружают siRNA. Доставку или введение согласно настоящему изобретению можно осуществлять с помощью экзосом, в частности, без ограничения, в головной мозг.

Витамин Е (α-токоферол) можно конъюгировать с CRISPR-Cas и доставлять в головной мозг вместе с липопротеином высокой плотности (HDL), например, аналогично тому, как это было выполнено Uno и соавт. (HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (June 2011)) для доставки коротких интерферирующих РНК (siRNA) в головной мозг. Мышам проводили инфузию с помощью осмотических мининасосов (модель 1007D; Alzet, Купертино, Калифорния), наполненных фосфатно-солевым буфером (PBS), или свободной Toc-siBACE, или Toc-siBACE/HDL, и соединенных с набором 3 для инфузий в головной мозг (Alzet). Канюлю для инфузий в головной мозг размещали приблизительно на 0,5 мм кзади от брегмы на средней линии для инфузий в дорсальную часть третьего желудочка. Uno и соавт. обнаружили, что всего 3 нмоля Toc-siRNA с HDL в том же способе ICV инфузий могут индуцировать сравнимую степень целевого снижения. Аналогичная доза CRISPR-Cas, конъюгированной с α-токоферолом и вводимой совместно с HDL, нацеливающейся на головной мозг, может предусматриваться в настоящем изобретении для людей, например, может предусматриваться от приблизительно 3 нмоль до приблизительно 3 мкмоль CRISPR-Cas, нацеливающейся на головной мозг.

Zou и соавт. ((HUMAN GENE THERAPY 22:465-475 (April 2011)) описывают способ опосредованной лентивирусами доставки коротких шпилечных РНК, целенаправленно воздействующих на PKCγ, для сайленсинга генов in vivo в спинном мозге крыс. Zou и соавт. вводили приблизительно 10 мкл рекомбинантного лентивируса с титром 1×10⁹ трансдуцирующих единиц (ТЕ)/мл с помощью интратекального катетера.

Аналогичная доза экспрессируемой CRISPR-Cas в лентивирусном векторе, нацеливающемся на головной мозг, может предусматриваться в настоящем изобретении для людей, например, может предусматриваться приблизительно 10-50 мл CRISPR-Cas, нацеливающейся на головной мозг, в лентивирусе с титром 1×10⁹ трансдуцирующих единиц (ТЕ)/мл.

Направленная делеция, терапевтические применения

Направленная делеция генов является предпочтительной. Примеры проиллюстрированы в примере 18. Таким образом, предпочтительными являются гены, вовлеченные в биосинтез холестерина, биосинтез жирных кислот и другие метаболические нарушения, гены, кодирующие неправильно свернутые белки, вовлеченные в амилоидоз и другие заболевания, онкогены, приводящие к трансформации клеток, латентные гены вирусов и гены, приводящие к доминантно-негативным нарушениям среди прочих нарушений. Как проиллюстрировано здесь, заявители отдают предпочтение доставке генов системы CRISPR-Cas в ткань печени, головного мозга, глаза, эпителиальную, кроветворную или иную ткань субъекта или пациента, нуждающегося в этом, страдающего от метаболических нарушений, амилоидоза и заболеваний, связанных с агрегацией белков, трансформации клеток, возникающей в результате генетических мутаций и транслокаций, доминантно-негативных эффектов генных мутаций, латентных вирусных инфекций и других связанных симптомов, с использованием либо вирусных систем доставки, либо систем доставки на основе наночастиц.

Терапевтические применения системы CRISPR-Cas включают применения при глаукоме, амилоидозе и болезни Гентингтона. Они проиллюстрированы в примере 20, и особенности, описанные там, являются предпочтительными по отдельности или в комбинации.

Другой пример заболевания, характеризующегося экспансией полиглутаминовых повторов, которое можно лечить с помощью настоящего изобретения, включает спинально-церебеллярную атаксию типа 1 (SCA1). При внутримозжечковой инъекции векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессирующие короткие шпилечные РНК, существенно улучшают координацию движений, восстанавливают морфологические характеристики мозжечка и устраняют характерные включения атаксина 1 в клетках Пуркинье мышей с SCA1 (см., например, Xia et al., Nature Medicine, Vol. 10, No. 8, Aug. 2004). В частности, предпочтительными являются векторы AAV1 и AAV5, и требуемыми являются титры AAV, составляющие приблизительно 1×10¹² векторных геномов/мл.

В качестве примера можно лечить или предупреждать хроническую инфекцию, вызываемую HIV-1. Для выполнения этой задачи можно создать направляющие РНК CRISPR-Cas, которые осуществляют нацеливание на подавляющее большинство геномов HIV-1 с учетом вариантов штаммов HIV-1 для максимального охвата и эффективности. Можно осуществлять доставку системы CRISPR-Cas с помощью общепринятой, опосредованной аденовирусом или лентивирусом инфекции иммунной системы хозяина. В зависимости от подхода иммунные клетки хозяина могут быть а) выделены, трансдуцированы CRISPR-Cas, подвергнуты отбору и повторно введены хозяину или b) трансдуцированы in vivo путем системной доставки системы CRISPR-Cas. Первый подход обеспечивает возможность получения популяции устойчивых иммунных клеток, тогда как второй, по всей вероятности, целенаправленно воздействует на резервуары латентного вируса в хозяине. Более подробно это обсуждается в разделе "Примеры".

В другом примере публикация заявки на патент США №20130171732, закрепленная за Sangamo Biosciences, Inc., относится к вставке в геном трансгена, действующего против HIV, способы которой можно применять к системе CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления можно целенаправленно воздействовать на ген CXCR4, и систему TALE согласно публикации заявки на патент США №20100291048, закрепленной за Sangamo Biosciences, Inc., можно модифицировать для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Способ согласно публикациям заявок на патенты США №№20130137104 и 20130122591, закрепленным за Sangamo Biosciences, Inc., и публикации заявки на патент США №20100146651, закрепленной за Cellectis, может быть в более общем смысле применимым к экспрессии трансгена, поскольку он включает модификацию локуса гена гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) для повышения частоты модификации гена.

В настоящем изобретении также предусматривается создание клеточной библиотеки нокаутных генов. Каждая клетка может иметь один нокаутный ген. Это проиллюстрировано в примере 23.

Можно получить библиотеку клеток ES, в которой каждая клетка имеет один нокаутный ген, и в полной библиотеке клеток ES все без исключения гены будут нокаутными. Эта библиотека применима для скрининга функции гена в клеточных процессах, а также в заболеваниях. Для получения этой клеточной библиотеки заявители могут интегрировать Cas9, управляемый индуцируемым промотором (например, индуцируемым доксициклином промотором), в клетку ES. Кроме того, можно интегрировать одну направляющую РНК, осуществляющую нацеливание на конкретный ген в клетке ES. Для создания библиотеки клеток ES можно просто смешать клетки ES с библиотекой генов, кодирующих направляющие РНК, которые осуществляют нацеливание на каждый ген в геноме человека. Сначала можно ввести один сайт attB для ВхВ1 в локус AAVS1 в клетках ES человека. Затем можно использовать интегразу В×В1 для облегчения интеграции отдельных генов направляющих РНК в сайт attB для В×В1 в локусе AAVS1. Для облегчения интеграции каждый ген направляющей РНК можно размещать на плазмиде, которая несет один сайт attP. Таким образом, ВхВ1 будет рекомбинировать сайт attB в геноме с сайтом attP на плазмиде, содержащей направляющую РНК. Для создания клеточной библиотеки можно взять библиотеку клеток, имеющих интегрированные одиночные направляющие РНК, и индуцировать экспрессию Cas9. После индукции Cas9 опосредует двухнитевой разрыв в сайтах, определенных направляющей РНК.

Длительное введение белковых терапевтических средств может вызвать нежелательные иммунные ответы на данный белок. Иммуногенность белковых лекарственных средств может объясняться наличием нескольких иммунодоминантных эпитопов для Т-лимфоцитов-помошников (HTL). Путем снижения аффинности связывания этих эпитопов для HTL, содержащихся в данных белках, с МНС можно создавать лекарственные средства с более низкой иммуногенностью (Tangri S, et al. ("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol. 2005 Mar 15; 174(6):3187-96.) В настоящем изобретении иммуногенность фермента CRISPR, в частности, можно снизить, следуя подходу, впервые изложенному Tangri и соавт. в отношении эритропоэтина и впоследствии получившему развитие. Соответственно, для снижения иммуногенности фермента CRISPR (например, Cas9) у вида-хозяина (человека или другого вида) можно применять направленную эволюцию или рациональное проектирование.

В примере 28 заявители применяют 3 направляющие РНК, представляющие интерес, и могут визуализировать эффективное расщепление ДНК in vivo, имеющее место лишь в небольшой субпопуляции клеток. В сущности, здесь заявители показали целенаправленное расщепление in vivo. В частности, это предоставляет подтверждение концепции, заключающейся в том, что у высших организмов, таких как млекопитающие, также можно достичь специфичного целенаправленного воздействия. Это также подчеркивает множественность аспекта в том отношении, что несколько направляющих последовательностей (т.е. для отдельных мишеней) можно использовать одновременно (в смысле совместной доставки). Другими словами, заявители применяли многосторонний подход с несколькими различными последовательностями, осуществляющими нацеливание одновременно, но независимо.

Подходящий пример протокола получения AAV, предпочтительного вектора согласно настоящему изобретению, приведен в примере 34.

Нарушения, связанные с тринуклеотидными повторами, являются предпочтительными состояниями для лечения. Они также проиллюстрированы в данном документе.

Например, в публикации заявки на патент США №20110016540 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов. Нарушения, связанные с экспансией тринуклеотидных повторов, являются комплексными прогрессирующими нарушениями, затрагивающими биологию развития нервной системы и часто нарушающими когнитивные функции, а также сенсомоторные функции.

Белки, связанные с экспансией тринуклеотидных повторов, представляют собой разнородную группу белков, ассоциированных с подверженностью развития нарушения, связанного с экспансией тринуклеотидных повторов, наличием нарушения, связанного с экспансией тринуклеотидных повторов, тяжестью нарушения, связанного с экспансией тринуклеотидных повторов, или любой их комбинацией. Нарушения, связанные с экспансией тринуклеотидных повторов, подразделяют на две категории, определяемые типом повтора. Наиболее распространенным повтором является триплет CAG, который в случае наличия в кодирующем участке гена кодирует аминокислоту глутамин (Q). Таким образом, эти нарушения называются нарушениями, связанными с экспансией полиглутаминовых повторов (поли-Q), и включают следующие заболевания: болезнь Гентингтона (HD); спинобульбарную мышечную атрофию (SBMA); формы спинально-церебеллярной атаксии (SCA типов 1, 2, 3, 6, 7 и 17) и дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию (DRPLA). Остальные нарушения, связанные с экспансией тринуклеотидных повторов, при которых триплет CAG не вовлечен либо триплет CAG находится не в кодирующем участке гена, называются, таким образом, нарушениями, не связанными с экспансией полиглутаминовых повторов. Нарушения, не связанные с экспансией полиглутаминовых повторов, включают синдром ломкой Х-хромосомы (FRAXA); синдром умственной отсталости, сцепленный с ломкой Х-хромосомой (FRAXE); атаксию Фридрейха (FRDA); миотоническую дистрофию (DM) и формы спинально-церебеллярной атаксии (SCA типов 8 и 12).

Белки, ассоциированные с нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, обычно выбирают на основании экспериментального изучения взаимосвязи белка, ассоциированного с нарушением, связанным с экспансией тринуклеотидных повторов, и нарушения, связанного с экспансией тринуклеотидных повторов. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, ассоциированного с нарушением, связанным с экспансией тринуклеотидных повторов, может быть повышенной или пониженной в популяции, имеющей нарушение, связанное с экспансией тринуклеотидных повторов, по сравнению с популяцией, не имеющей нарушения, связанного с экспансией тринуклеотидных повторов. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае белки, ассоциированные с нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, серийного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

Неограничивающие примеры белков, ассоциированных с нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, включают AR (андрогенный рецептор), FMR1 (белок 1, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой), НТТ (гентингтин), DMPK (протеинкиназу, ассоциированную с миотонической дистрофией), FXN (фратаксин), ATXN2 (атаксин 2), ATN1 (атрофии 1), FEN1 (структуроспецифичную флэп-эндонуклеазу 1), TNRC6A (белок, кодируемый геном 6А, содержащим тринуклеотидные повторы), PABPN1 (ядерный поли(А)-связывающий белок 1), JPH3 (юнктофилин 3), MED15 (субъединицу 15 медиаторного комплекса), ATXN1 (атаксин 1), ATXN3 (атаксин 3), ТВР (ТАТА-бокс-связывающий белок), CACNA1A (альфа-1А-субъединицу потенциал-зависимого кальциевого канала P/Q-типа), ATXN80S (белок, синтезируемый с противоположной нити ATXN8 (не кодирующей белок)), PPP2R2B (бета-изоформу регуляторной субъединицы В протеинфосфатазы 2), ATXN7 (атаксин 7), TNRC6B (белок, кодируемый геном 6В, содержащим тринуклеотидные повторы), TNRC6C (белок, кодируемый геном 6С, содержащим тринуклеотидные повторы), CELF3 (CUGBP, член 3 семейства Elav-подобных белков), MAB21L1 (mab-21-подобный белок 1 (С.elegans)), MSH2 (гомолог 2 mutS, ассоциированный с неполипозным колоректальным раком типа 1 (Е. coli)), ТМЕМ185А (трансмембранный белок 185A), SIX5 (белок, кодируемый гомеобоксом 5 SIX), CNPY3 (гомолог Canopy 3 (данио-рерио)), FRAXE (белок, ассоциированный с "редким" ломким сайтом, проявляющимся при недостатке фолиевой кислоты, fra(X)(q28) Е), GNB2 (бета полипептид 2 белка, связывающего гуаниновые нуклеотиды (G-белка)), RPL14 (рибосомный белок L14), ATXN8 (атаксин 8), INSR (инсулиновый рецептор), TTR (транстиретин), ЕР400 (Е1А-связывающий белок р400), GIGYF2 (белок GYF 2, взаимодействующий с GRB10), OGG1 (8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу), STC1 (станниокальцин 1), CNDP1 (карнозиндипептидазу 1 (металлопептидазу семейства М20)), C10orf2 (белок, кодируемый открытой рамкой считывания 2 хромосомы 10), MAML3 (mastermind-подобный белок 3 (Drosophila)), DKC1 (белок 1, ассоциированный с врожденным дискератозом, дискерин), PAXIP1 (белок 1, взаимодействующий с PAX (с доменом активации транскрипции)), CaSK (кальций/кальмодулин-зависимую сериновую протеинкиназу (семейства MAGUK)), МАРТ (белок tau, ассоциированный с микротрубочками), SP1 (фактор транскрипции Sp1), POLG (полимеразу гамма (ДНК-направленную)), AFF2 (член 2 семейства AF4/FMR2), THBS1 (тромбоспондин 1), ТР53 (опухолевый белок р53), ESR1 (эстрогеновый рецептор 1), CGGBP1 (белок 1, связывающий триплетный повтор CGG), АВТ1 (активатор 1 базальной транскрипции), KLK3 (родственную калликреину пептидазу 3), PRNP (белок приона), JUN (онкоген jun), KCNN3 (кальций-активируемый калиевый канал средней/малой проводимости, представитель 3 подсемейства N), ВАХ (ВСL2-ассоциированный белок X), FRAXA (белок, ассоциированный с "редким" ломким сайтом, проявляющимся при недостатке фолиевой кислоты, fra(X)(q27.3) А (макроорхидизм, умственная отсталость)), KBTBD10 (белок 10, содержащий повтор Kelch и домен ВТВ (POZ)), MBNL1 (muscleblind-подобный белок (Drosophila)), RAD51 (гомолог RAD51 (гомолог RecA, Е. coli) (S. cerevisiae)), NCOA3 (коактиватор 3 ядерных рецепторов), ERDA1 (белок с экспансией повторяющихся доменов, CAG/CTG 1), TSC1 (белок 1, ассоциированный с туберозным склерозом), СОМР (олигомерный матриксный белок хряща), GCLC (каталитическую субъединицу глутаматцистеинлигазы), RRAD (Ras-родственный белок, ассоциированный с сахарным диабетом), MSH3 (гомолог 3 mutS (Е. coli)), DRD2 (дофаминовый рецептор D2), CD44 (молекулу CD44 (система групп крови Indian)), CTCF (СССТС-связывающий фактор (белок с "цинковыми пальцами")), CCND1 (циклин D1), CLSPN (гомолог класпина (Xenopus laevis)), MEF2A (энхансерный фактор 2А миоцитов), PTPRU (протеинтирозинфосфатазу рецепторного типа U), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу), TRIM22 (белок 22, содержащий тройной мотив), WT1 (белок 1 опухоли Вильмса), AHR (арил-углеводородный рецептор), GPX1 (глутатионпероксидазу 1), ТРМТ (тиопурин-S-метилтрансферазу), NDP (белок, ассоциированный с болезнью Норри (псевдоглиомой)), ARX (белок, кодируемый гомеобоксом гена, родственного aristaless), MUS81 (гомолог эндонуклеазы MUS81 (S. cerevisiae)), TYR (тирозиназу (глазокожный альбинизм IA)), EGR1 (белок 1 раннего ростового ответа), UNG (урацил-ДНК-гликозилазу), NUMBL (белок, подобный гомологу numb (Drosophila)), FABP2 (белок 2, связывающий жирные кислоты в кишечнике), EN2 (белок, кодируемый гомеобоксом engrailed 2), CRYGC (гамма-С-кристаллин), SRP14 (гомологичный РНК-связывающий белок Alu размером 14 кДа из частицы узнавания сигнала), CRYGB (гамма-В-кристаллин), PDCD1 (белок 1 запрограммированной гибели клеток), НОХА1 (белок, кодируемый гомеобоксом A1), ATXN2L (атаксин-2-подобный белок), PMS2 (PMS2, белок 2, противодействующий повышению уровня постмейотической сегрегации (S. cerevisiae)), GLA (альфа-галактозидазу), CBL (белок, кодируемый последовательностью, трансформирующей с экотропным ретровирусом Cas-Br-M (мышей)), FTH1 (полипептид 1 тяжелой субъединицы ферритина), IL12RB2 (бета-2-субъединицу рецептора интерлейкина 12), ОТХ2 (белок, кодируемый гомеобоксом orthodenticle 2), НОХА5 (белок, кодируемый гомеобоксом А5), POLG2 (вспомогательную гамма-2-субъединицу полимеразы (ДНК-направленной)), DLX2 (белок, кодируемый гомеобоксом distal-less 2), SIRPA (сигнально-регуляторный белок альфа), ОТХ1 (белок, кодируемый гомеобоксом orthodenticle 1), AHRR (репрессор арил-углеводородного рецептора), MANF (мезэнцефальный нейротрофический фактор, происходящий из астроцитов), ТМЕМ158 (трансмембранный белок 158 (ген/псевдоген)) и ENSG00000078687.

Предпочтительные белки, ассоциированные с нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, включают НТТ (гентингтин), AR (андрогенный рецептор), FXN (фратаксин), Atxn3 (атаксин), Atxn1 (атаксин), Atxn2 (атаксин), Atxn7 (атаксин), Atxn10 (атаксин), DMPK (миотонин-протеинкиназу), Atn1 (атрофии 1), СВР (creb-связывающий белок), VLDLR (рецептор липопротеинов очень низкой плотности) и их любую комбинацию.

В соответствии с другим аспектом предусматривается способ генной терапии для лечения субъекта, имеющего мутацию в гене CFTR, который включает введение в клетки субъекта терапевтически эффективного количества частиц с CRISPR-Cas для генной терапии, необязательно посредством биологически совместимого фармацевтического носителя. Целевая ДНК предпочтительно содержит мутацию дельта-Р508. Обычно предпочтительно, чтобы у мутантов восстанавливался дикий тип. В этом случае мутация представляет собой делецию трех нуклеотидов, включающих в себя кодон фенилаланина (F), в положении 508. Соответственно, репарация в данном случае требует повторного введения мутанту недостающего кодона.

Для реализации этой стратегии репарации генов предпочтительно, чтобы векторную систему на основе аденовируса/AAV вводили в клетку-хозяина, в клетки или пациенту. Система предпочтительно содержит Cas9 (или никазу Cas9) и направляющую РНК вместе с векторной системой на основе аденовируса/AAV, содержащей матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, содержащую остаток F508. Ее можно вводить субъекту посредством одного из обсуждаемых ранее способов доставки. Система CRISPR-Cas может направляться химерной направляющей РНК для дельта-508 CFTR. Она целенаправленно воздействует на конкретный сайт локуса генома CFTR, подлежащий внесению однонитевого разрыва или расщеплению. После расщепления матрица для репарации вставляется в сайт расщепления посредством гомологичной рекомбинации, корректирующей делецию, которая приводит к муковисцидозу или вызывает связанные с муковисцидозом симптомы. Данную стратегию для управления доставкой и обеспечения системного введения систем CRISPR с соответствующими направляющими РНК можно использовать для целенаправленного воздействия на генные мутации, чтобы редактировать или проводить иного рода манипуляции с генами, которые вызывают метаболические заболевания и нарушения, заболевания и нарушения печени, почек и заболевания и нарушения, связанные с белками, такие как приведенные в таблице В.

Редактирование генома

Системы CRISPR/Cas9 по настоящему изобретению можно применять для коррекции генетических мутаций, попытки которой с ограниченным успехом ранее предпринимались с применением TALEN и ZFN. Например, в опубликованной заявке Duke University WO 2013163628 А2 "Генетическая коррекция подвергшихся мутации генов" описаны попытки коррекции, например, мутации по типу сдвига рамки считывания, которая вызывает появление преждевременного стоп-кодона и усеченного продукта гена, которую можно скорректировать посредством опосредованного нуклеазами негомологичного соединения концов, как, например, обуславливающей мышечную дистрофию Дюшенна ("DMD"), рецессивное смертельное сцепленное с X-хромосомой нарушение, приводящее к мышечной дегенерации в связи с мутациями гена дистрофина. Большинство мутаций гена дистрофина, вызывающих DMD, представляют собой делеции экзонов, нарушающие рамку считывания и вызывающие преждевременную терминацию трансляции гена дистрофина. Дистрофии представляет собой цитоплазматический белок, обеспечивающий стабильность структуры дистрогликанового комплекса клеточной мембраны, отвечающего за регуляцию целостности и функционирования мышечных клеток. Ген дистрофина или "ген DMD", как взаимозаменяемо используется в данном документе, образован 2,2 миллиона пар оснований в локусе Хр21. Размер первичного транскрипта составляет приблизительно 2400 т.п.о., при этом размер зрелой мРНК составляет приблизительно 14 т.п.о. 79 экзонов кодируют белок, образованный более 3500 аминокислотами. Экзон 51 часто является смежным с положениями делеций, нарушающих рамку считывания, у пациентов с DMD, и в клинических испытаниях на него был направлен пропуск экзона, основанный на применении олигонуклеотидов. Недавно в клиническом испытании с пропуском экзона 51 с помощью соединения этерлипсена сообщали о значительном положительном функциональном эффекте в течение 48 недель со средним количеством дистрофин-положительных волокон 47% по сравнению с исходным уровнем. Мутации в экзоне 51 идеально подходят для устойчивой коррекции посредством редактирования генома на основе NHEJ.

Способы согласно публикации заявки на патент США №20130145487, закрепленной за Cellectis, которые относятся к вариантам мегануклеаз для расщепления целевой последовательности гена дистрофина человека (DMD), также можно модифицировать для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Кровь

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в кровь.

Экзосомы плазмы по Wahlgren и соавт. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130) были описаны ранее и могут быть использованы для доставки системы CRISPR-Cas в кровь.

Система CRISPR-Cas по настоящему изобретению также предусматривается для лечения гемоглобинопатии, таких как формы талассемии и серповидно-клеточная анемия. См., например, публикацию международной заявки на патент WO 2013/126794 в отношении потенциальных мишеней, на которые может целенаправленно воздействовать система CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Публикации заявок на патенты США №№20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 и 20090222937, закрепленные за Cellectis, относятся к вариантам CREI, где по меньшей мере один из двух мономеров I-CreI имеет по меньшей мере две замены, по одной в каждом из двух функциональных субдоменов сердцевинного домена LAGLIDADG, расположенных, соответственно, в положениях 26-40 и 44-77 I-CreI, при этом указанный вариант способен расщеплять целевую последовательность ДНК гена гамма-цепи рецептора интерлейкина-2 человека (IL2RG), также называемого геном общей гамма-цепи рецепторов цитокинов или геном гамма-С. Целевые последовательности, указанные в публикациях заявок на патенты США №№20110225664, 20110091441, 20100229252, 20090271881 и 20090222937, можно использовать для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID) возникает в результате нарушения созревания Т-лимфоцитов, во всех случаях ассоциированного с нарушением функционирования В-лимфоцитов (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Общая заболеваемость по оценкам составляет 1 на 75000 родившихся. Пациенты с нелеченым SCID подвержены множественным инфекциям, вызываемым условно-патогенными микроорганизмами, и живут, как правило, не более одного года. SCID можно лечить путем аллогенного переноса гемопоэтических стволовых клеток от донора-родственника. Степень гистосовместимости с донором может варьировать в широких пределах. В случае аденозиндезаминазной (ADA) недостаточности, одной из форм SCID, пациентов можно лечить с помощью инъекции рекомбинантного фермента аденозиндезаминазы.

Поскольку было показано, что ген ADA у пациентов с SCID является мутантным (Giblett et al., Lancet, 1972, 2, 1067-1069), были идентифицированы некоторые другие гены, вовлеченные в SCID (Cavazzana-Calvo et al, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). Существуют четыре основные причины SCID. (i) Наиболее часто встречающуюся форму SCID, SCID-X1 (SCID, сцепленный с X-хромосомой, или X-SCID), вызывает мутация в гене IL2RG, которая приводит к отсутствию зрелых Т-лимфоцитов и NK-клеток. IL2RG кодирует белок гамма-С (Noguchi, et al., Cell, 1993, 73, 147-157), общий компонент по меньшей мере пяти рецепторных комплексов интерлейкинов. Данные рецепторы активируют несколько мишеней с помощью киназы JAK3 (Macchi et al., Nature, 1995, 377, 65-68), инактивация которой приводит к возникновению того же синдрома, что и инактивация гамма-С. (ii) Мутация в гене ADA приводит к нарушению метаболизма пуринов, вызывающему гибель предшественников лимфоцитов, что, в свою очередь, приводит к кажущемуся отсутствию В-, Т- и NK-клеток. (iii) V(D)J-рекомбинация является существенным этапом созревания иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов (TCR). Мутации в генах, активирующих рекомбинацию, 1 и 2 (RAG1 и RAG2) и Artemis, трех генах, участвующих в этом процессе, приводят к отсутствию зрелых Т- и В-лимфоцитов. (iv) Также сообщали о мутациях в других генах, таких как CD45, участвующих в специфичной передаче сигналов в Т-клетках, хотя они представляют меньшинство случаев (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109).

С тех пор, как были выявлены их генетические основы, различные формы SCID стали модельными для подходов к генной терапии (Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109) по двум основным причинам. Во-первых, как и при всех заболеваниях крови, может быть предусмотрено лечение ex vivo. Можно выделить гемопоэтические стволовые клетки (HSC) из костного мозга и сохранять их свойства плюрипотентности в течение нескольких клеточных делений. Таким образом, их можно обрабатывать in vitro, а затем повторно инъецировать пациенту, где они повторно заселяют костный мозг. Во-вторых, поскольку созревание лимфоцитов у пациентов с SCID ухудшено, подвергнутые коррекции клетки имеют селективное преимущество. Таким образом, небольшое количество подвергнутых коррекции клеток может восстановить функционирование иммунной системы. Эта гипотеза была неоднократно подтверждена (i) частичным восстановлением иммунных функций, связанным с реверсией мутаций у пациентов с SCID (Hirschhorn et al., Nat. Genet, 1996, 13, 290-295; Stephan et al, N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563-1567; Bousso et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274-278; Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697-8702; Nishikomori et al., Blood, 2004, 103, 4565-4572), (ii) коррекцией форм недостаточности SCID-X1 in vitro в гемопоэтических клетках (Candotti et al., Blood, 1996, 87, 3097-3102; Cavazzana-Calvo et al., Blood, 1996, Blood, 88, 3901-3909; Taylor et al., Blood, 1996, 87, 3103-3107; Hacein-Bey et al, Blood, 1998, 92, 4090-4097), (iii) коррекцией форм недостаточности SCID-X1 (Soudais et al., Blood, 2000, 95, 3071-3077; Tsai et al., Blood, 2002, 100, 72-79), JAK-3 (Bunting et al., Nat. Med., 1998, 4, 58-64; Bunting et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353-2364) и RAG2 (Yates et al, Blood, 2002, 100, 3942-3949) в животных моделях in vivo и (iv) результатом клинических испытаний генной терапии (Cavazzana-Calvo et al, Science, 2000, 288, 669-672; Aiuti et al., Nat. Med., 2002; 8, 423-425; Gaspar et al, Lancet, 2004, 364, 2181-2187).

Публикация заявки на патент США №20110182867, закрепленная за Children's Medical Center Corporation и президентом и членами управляющего совета Гарвардского университета, относится к способам модулирования экспрессии фетального гемоглобина (HbF) и ее применениям в гемопоэтических клетках-предшественниках с помощью ингибиторов экспрессии или активности BCL11A, таких как средства для RNAi и антитела. На мишени, раскрытые в публикации заявки на патент США №20110182867, такие как BCL11 А, можно целенаправленно воздействовать с помощью системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению для модулирования экспрессии фетального гемоглобина. См. также Bauer et al. (Science 11 October 2013: Vol. 342 no. 6155 pp. 253-257) и Xu et al. (Science 18 November 2011: Vol. 334 no. 6058 pp. 993-996) в отношении дополнительных мишеней BCL11 А.

Уши

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в одно ухо или оба уха.

Исследователи рассматривают вопрос о том, можно ли применять генную терапию для содействия существующим способам лечения глухоты - а именно, применению кохлеарных имплантатов. Глухоту часто вызывают утрата или повреждение волосковых клеток, которые не могут передавать сигналы слуховым нейронам. В таких случаях можно применять кохлеарные имплантаты для обеспечения реакции на звук и передачи электрических сигналов нервным клеткам. Однако эти нейроны часто дегенерируют и подвергаются ретракции отростков в улитке, поскольку пораженные волосковые клетки высвобождают меньше факторов роста.

В заявке на патент США 20120328580 описана инъекция фармацевтической композиции в ухо (например, путем ушного введения), как, например, в просветы улитки (например, в проток улитки, лестницу преддверия и барабанную лестницу улитки), например, с помощью шприца, например, шприца с однократной дозой. Например, одно или несколько соединений, описанных в данном документе, можно вводить путем интратимпанальной инъекции (например, в среднее ухо) и/или инъекций в наружное, среднее и/или внутреннее ухо. Такие способы регулярно применяются в данной области, например, для введения стероидов и антибиотиков в уши людей. Инъекцию можно осуществлять, например, через круглое окно уха или через капсулу улитки. В данной области известны и другие способы введения во внутреннее ухо (см., например, Salt and Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005).

В другом способе введения фармацевтическую композицию можно вводить in situ с помощью катетера или насоса. Катетер или насос могут, например, направлять фармацевтическую композицию в просветы улитки, или круглое окно уха, и/или просвет толстой кишки. Иллюстративный аппарат для доставки лекарственных средств и способы, подходящие для введения одного или нескольких соединений, описанных в данном документе, в ухо, например, в ухо человека, описаны McKenna и соавт. (публикация заявки на патент США №2006/0030837) и Jacobsen и соавт. (патент США №7206639). В некоторых вариантах осуществления катетер или насос могут быть расположены, например, в ухе (например, в наружном, среднем и/или внутреннем ухе) пациента во время хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления катетер или насос могут быть расположены, например, в ухе (например, в наружном, среднем и/или внутреннем ухе) пациента без необходимости в хирургическом вмешательстве.

Альтернативно или в дополнение, одно или несколько соединений, описанных в данном документе, можно вводить в сочетании с механическим устройством, таким как кохлеарный имплантат или слуховой аппарат, которое носят в наружном ухе. Иллюстративный кохлеарный имплантат, подходящий для применения в настоящем изобретении, описан Edge и соавт. (публикация заявки на патент США №2007/0093878).

В некоторых вариантах осуществления способы введения, описанные выше, можно комбинировать в любом порядке и можно применять одновременно или попеременно.

Альтернативно или в дополнение, настоящее изобретение можно применять согласно любому из способов, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств, например, описанных в справочнике стандартов CDER, версия номер 004 (доступном по адресу fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm).

В целом, способы клеточной терапии, описанные в заявке на патент США 20120328580, можно применять для стимуляции полной или частичной дифференцировки клеток в определенный тип зрелых клеток внутреннего уха (например, в волосковые клетки) или в его направлении in vitro. Клетки, полученные в результате осуществления таких способов, можно затем трансплантировать или имплантировать пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Способы культивирования клеток, необходимые для осуществления на практике этих способов, включающие способы идентификации и отбора подходящих типов клеток, способы стимуляции полной или частичной дифференцировки выбранных клеток, способы идентификации полностью или частично дифференцированных типов клеток и способы имплантации полностью или частично дифференцированных клеток, описаны ниже.

Клетки, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают, без ограничения, клетки, способные к полной или частичной дифференцировке в зрелые клетки внутреннего уха, например, в волосковые клетки (например, внутренние и/или наружные волосковые клетки), при контакте, например, in vitro, с одним или несколькими соединениями, описанными в данном документе. Иллюстративные клетки, способные к дифференцировке в волосковые клетки, включают, без ограничения, стволовые клетки (например, стволовые клетки внутреннего уха, взрослые стволовые клетки, стволовые клетки костномозгового происхождения, эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, стволовые клетки кожи, iPS-клетки и стволовые клетки жировой ткани), клетки-предшественники (например, клетки-предшественники внутреннего уха), поддерживающие клетки (например, клетки Дейтерса, столбовые клетки, внутренние фаланговые клетки, тектальные клетки и клетки Гензена) и/или зародышевые клетки. Применение стволовых клеток для замещения чувствительных клеток внутреннего уха описано Li и соавт. (публикация заявки на патент США №2005/0287127) и Li и соавт. (патент США с регистрационным №11/953797). Применение стволовых клеток костномозгового происхождения для замещения чувствительных клеток внутреннего уха описано Edge и соавт. в PCT/US 2007/084654. iPS-клетки описаны, например, в Takahashi et al., Cell, Volume 131, Issue 5, Pages 861-872 (2007); Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al, Science 318(5858):1917-1920 (2007); Nakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008) и Zaehres and Scholer, Cell 131(5):834-835 (2007).

Такие подходящие клетки можно идентифицировать путем анализа (например, качественного или количественного) наличия одного или нескольких тканеспецифичных генов. Например, экспрессию гена можно выявить путем выявления белкового продукта одного или нескольких тканеспецифичных генов. Методики выявления белков включают окрашивание белков (например, с использованием клеточных экстрактов или цельных клеток) с помощью антител к соответствующему антигену. В данном случае соответствующий антиген является белковым продуктом экспрессии тканеспецифичного гена. Хотя, в принципе, меченым может быть первое антитело (т.е. антитело, связывающее антиген), более распространенным (и улучшающим визуализацию) является применение второго антитела, направленного против первого (например, антитела к IgG). Данное второе антитело конъюгируют с флуорохромами, или соответствующими ферментами для колориметрических реакций, или гранулами золота (для электронной микроскопии), или с системой биотин-авидин, так что можно определить местоположение первичного антитела и, следовательно, антигена.

Молекулы CRISPR-Cas по настоящему изобретению можно доставлять в ухо путем непосредственного нанесения фармацевтической композиции на наружное ухо с применением модифицированных композиций из опубликованной заявки на патент США 20110142917. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию наносят на наружный слуховой проход. Доставка в ухо может также называться внутриушной или ушной доставкой.

В некоторых вариантах осуществления молекулы РНК по настоящему изобретению доставляют в липосомных составах или составах на основе Lipofectin и т.п., и их можно получить с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. Такие способы описаны, например, в патентах США №№5593972, 5589466 и 5580859, включенных в данный документ посредством ссылки.

Были разработаны системы доставки, специально предназначенные для повышения эффективности и улучшения доставки siRNA в клетки млекопитающих (см., например, Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al, J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 и Simeoni et al., NAR 2003, 31,11: 2717-2724), и их можно применять в настоящем изобретении. siRNA недавно успешно применяли для ингибирования экспрессии генов у приматов (см., например, Tolentino et al., Retina 24(4):660), и их также можно применять в настоящем изобретении.

Qi и соавт. раскрывают способы эффективного введения siRNA во внутреннее ухо через неповрежденное круглое окно путем трансфекции с помощью новой технологии доставки протеидов, которую можно применять в отношении системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению (см., например, Qi et al., Gene Therapy (2013), 1-9). В частности, успешным было применение доменов ТАТ, связывающих двухнитевую РНК (ТАТ-DRBD), с помощью которых можно трансфицировать меченную Су3 siRNA в клетки внутреннего уха, в том числе внутренние и наружные волосковые клетки, ампулярный гребешок, пятно эллиптического мешочка и пятно сферического мешочка, посредством проникновения через неповрежденное круглое окно, для доставки двухнитевых siRNA in vivo для лечения различных болезней внутреннего уха и сохранения слуховой функции. Приблизительно 40 мкл 10 мМ РНК может быть предусмотрено в качестве дозы для введения в ухо.

Согласно Rejali и соавт. (Hear Res. 2007 Jun; 228(1-2):180-7) функционирование кохлеарных имплантатов можно улучшить путем надлежащего сохранения нейронов спирального ганглия, которые являются мишенью для электростимуляции имплантатом, и ранее было показано, что нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) повышает выживаемость спирального ганглия в ушах с экспериментально индуцированной глухотой. Rejali и соавт. тестировали модифицированную конструкцию электрода кохлеарного имплантата, имеющего покрытие из клеток-фибробластов, трансдуцированных вирусным вектором со вставкой гена BDNF. Для осуществления данного типа переноса генов ex vivo Rejali и соавт. трансдуцировали фибробласты морской свинки аденовирусом со вставкой кассеты с геном BDNF, и определили, что эти клетки секретируют BDNF, а затем прикрепили клетки, секретирующие BDNF, к электроду кохлеарного имплантата с помощью агарозного геля и имплантировали электрод в барабанную лестницу улитки. Rejali и соавт. определили, что электроды с экспрессией BDNF были способны обеспечивать сохранение значительно большего количества нейронов спирального ганглия в базальных витках улитки через 48 дней после имплантации по сравнению с контрольными электродами и демонстрировали возможность осуществления терапии с применением кохлеарных имплантатов в комбинации с переносом генов ex vivo для повышения выживаемости нейронов спирального ганглия. Такую систему можно применять для доставки системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в ухо.

Mukherjea и соавт. (Antioxidants & Redox Signaling, Volume 13, Number 5, 2010) документально подтверждают, что нокдаун NOX3 с помощью короткой интерферирующей (si) РНК нейтрализовал ототоксичность цисплатина, о чем свидетельствует защита ОНС от повреждения и снижение величин сдвига порогов стволомозговых слуховых вызванных потенциалов (ABR). Крысам вводили различные дозы siNOX3 (0,3, 0,6 и 0,9 мкг), и экспрессию NOX3 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Наименьшая применяемая доза siRNA для NOX3 (0,3 мкг) не демонстрировала какого-либо ингибирования мРНК NOX3 по сравнению с транстимпанальным введением скремблированной siRNA или отсутствием обработки улиток. Введение более высоких доз siRNA для NOX3 (0,6 и 0,9 мкг), однако, снижало экспрессию NOX3 по сравнению с контрольной скремблированной siRNA. Такую систему можно применять для транстимпанального введения системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в дозе от приблизительно 2 мг до приблизительно 4 мг CRISPR-Cas для введения человеку.

Jung и соавт. (Molecular Therapy, vol. 21 no. 4, 834-841 apr. 2013) демонстрируют, что уровни Hes5 в эллиптическом мешочке снижались после внесения siRNA и что количество волосковых клеток в этих эллиптических мешочках было значительно большим, чем после контрольной обработки. Данные позволяют предположить, что технология siRNA может быть применимой для индукции восстановления и регенерации во внутреннем ухе и что сигнальный путь Notch является потенциально применимой мишенью для ингибирования экспрессии конкретного гена. Jung и соавт. инъецировали 8 мкг siRNA для Hes5 в объеме 2 мкл, полученном путем добавления стерильного физиологического раствора к лиофилизированной siRNA, в вестибулярный эпителий уха. Такую систему можно применять для введения системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению в вестибулярный эпителий уха в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг CRISPR-Cas для введения человеку.

Глаза

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в один глаз или оба глаза.

В еще одном аспекте настоящего изобретения систему CRISPR-Cas можно использовать для корректировки офтальмологических дефектов, которые являются результатом нескольких генетических мутаций, дополнительно описанных в Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.

Для введения в глаз особенно предпочтительными являются лентивирусные векторы, в частности, вирусы инфекционной анемии лошадей (EIAV).

В другом варианте осуществления также предусмотрены минимальные лентивирусные векторы для отличных от приматов организмов на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), особенно для генной терапии глаз (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285, опубликовано в режиме онлайн 21 ноября 2005 г. в Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Предусмотрено, что векторы имеют промотор цитомегаловируса (CMV), управляющий экспрессией целевого гена. Также предусмотрена любая из внутрикамерной, субретинальной, внутриглазной и интравитреальной инъекций (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275-285, опубликовано в режиме онлайн 21 ноября 2005 г. в Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Внутриглазные инъекции можно осуществлять с помощью операционного микроскопа. В случае субретинальной и интравитреальной инъекций можно выпятить глаза путем осторожного надавливания пальцами и визуализировать глазное дно с помощью системы контактных линз, состоящей из капли раствора контактной среды на роговице, накрытой покровным стеклом для микропрепаратов. При субретинальных инъекциях наконечник иглы 34 калибра на 10 мм, закрепленной на 5-мкл шприце Hamilton, можно при непосредственной визуализации продвигать через экваториальную область верхней части склеры тангенциально к заднему полюсу глазного яблока, пока в субретинальном пространстве не будет видна апертура иглы. Затем можно инъецировать 2 мкл суспензии вектора, вызывая буллезное верхнее отслоение сетчатки, что, таким образом, подтверждает субретинальное введение вектора. В данном подходе производят самогерметизирующийся разрез склеры, позволяющий суспензии вектора удерживаться в субретинальном пространстве до поглощения ее RPE, обычно в течение 48 ч. после процедуры. Эту процедуру можно повторить в нижнем полушарии, вызывая нижнее отслоение сетчатки. Данная методика обуславливает воздействие суспензии вектора на приблизительно 70% нейросенсорной части сетчатки и RPE. В случае интравитреальных инъекций можно продвигать наконечник иглы через склеру на 1 мм кзади от корнеосклерального лимба и инъецировать 2 мкл суспензии вектора в полость стекловидного тела. В случае внутрикамерных инъекций можно продвигать наконечник иглы через парацентез корнеосклерального лимба в направлении центральной части роговицы и можно инъецировать 2 мкл суспензии вектора. В случае внутрикамерных инъекций можно продвигать наконечник иглы через парацентез корнеосклерального лимба в направлении центральной части роговицы и можно инъецировать 2 мкл суспензии вектора. Эти векторы можно инъецировать в титрах 1,0-1,4×10¹⁰ или 1,0-1,4×10⁹ трансдуцирующих единиц (ТЕ)/мл.

В другом варианте осуществления также предусмотрен RetinoStat®, лентивирусный вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей для генной терапии, экспрессирующий ангиостатические белки эндостатин и ангиостатин, который доставляют посредством субретинальной инъекции для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии (см., например, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)). Такой вектор может быть модифицирован для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Каждый глаз можно обрабатывать любым RetinoStat® в дозе 1,1×10⁵ трансдуцирующих единиц на глаз (ТЕ/глаз) в общем объеме 100 мкл.

В другом варианте осуществления может быть предусмотрен аденовирусный вектор с делецией Е1 и Е4 и частичной делецией Е3 для доставки в глаз. Двадцать восемь пациентов с неоваскулярной возрастной макулодистрофией на поздней стадии (AMD) получали однократную интравитреальную инъекцию аденовирусного вектора с делецией Е1 и Е4 и частичной делецией Е3, экспрессирующего фактор пигментного эпителия человека (AdPEDF.ll) (см., например, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (February 2006)). Исследовали дозы, варьирующие в диапазоне от 10⁶ до 10^9,5 единичных частиц (PU), и не наблюдали серьезных нежелательных явлений, связанных с AdPEDF.ll, и дозолимитирующей токсичности (см., например, Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167-176 (February 2006)). Опосредованный аденовирусными векторами перенос генов в глаза, по-видимому, является действенным подходом для лечения нарушений со стороны органов зрения и может применяться для системы CRISPR-Cas.

В другом варианте осуществления систему sd-rxRNA® от RXi Pharmaceuticals можно применять для доставки CRISPR-Cas в глаз и/или приспосабливать к ней. В этой системе однократное интравитреальное введение 3 мкг sd-rxRNA приводит к специфичному относительно последовательности снижению уровней мРНК PPIB в течение 14 дней. Систему sd-rxRNA® можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению, предусматривая введение человеку дозы CRISPR, составляющей приблизительно 3-20 мг.

Millington-Ward и соавт. (Molecular Therapy, vol. 19 no. 4, 642-649 apr. 2011) описывают векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки супрессора родопсина, функционирующего на основе РНК-интерференции (RNAi), и замещающего гена родопсина с модифицированными кодонами, устойчивого к супрессии в связи с нуклеотидными изменениями в вырожденных положениях в целевом сайте для RNAi. Осуществляли субретинальную инъекцию 6,0×10⁸ vp или 1,8×10¹⁰ vp AAV в глаза согласно Millington-Ward и соавт. Векторы на основе AAV согласно Millington-Ward и соавт. можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению, предусматривая введение человеку дозы, составляющей от приблизительно 2×10¹¹ до приблизительно 6×10¹³ vp.

Dalkara и соавт. (Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)) также обращаются к направленной эволюции in vivo для конструирования вектора на основе AAV, доставляющего варианты дефектных генов дикого типа по всей сетчатке после безвредной инъекции в жидкую часть стекловидного тела глаза. Dalkara описывает дисплейную библиотеку 7-мерных пептидов и библиотеку AAV, сконструированную посредством ДНК-шаффлинга генов cap AAV1, 2, 4, 5, 6, 8 и 9. Упаковывали библиотеки rcAAV и векторы на основе rAAV, экспрессирующие GFP под контролем промотора CAG или Rho, и с помощью количественной ПЦР получали титры геномов, устойчивых к действию дезоксирибонуклеаз. Библиотеки объединяли, и проводили два цикла эволюции, каждый из которых состоял из диверсификации исходной библиотеки с последующими тремя этапами отбора in vivo. На каждом таком этапе мышам Р30 с экспрессией rho-GFP интравитреально инъецировали 2 мл очищенной йодиксанолом и подвергнутой диализу против фосфатно-солевого буфера (PBS) библиотеки с титром геномов приблизительно 1×10¹² vg/мл. Векторы на основе AAV согласно Dalkara и соавт. можно применять для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению, что предусматривает введение человеку дозы, составляющей от приблизительно 1×10¹⁵ до приблизительно 1×10¹⁶ vg/мл.

В другом варианте осуществления можно целенаправленно воздействовать на ген родопсина для лечения пигментного ретинита (RP), где систему согласно публикации заявки на патент США №20120204282, закрепленной за Sangamo Biosciences, Inc., можно модифицировать по образу системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления способы согласно публикации заявки на патент США №20130183282, закрепленной за Cellectis, направленной на способы расщепления целевой последовательности гена родопсина человека, можно также модифицировать для системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Публикация заявки на патент США №20130202678, закрепленная за Academia Sinica, относится к способам лечения форм ретинопатии и офтальмологических нарушений с угрозой потери зрения, относящимся к доставке гена Puf-A (экспрессируемого в ганглиозных и пигментных клетках сетчатки в тканях глаза и проявляющего уникальную антиапоптотическую активность) в субретинальное или интравитреальное пространство глаза. В частности, желаемые мишени представляют собой zgc:193933, prdm1a, spata2, tex10, rbb4, ddx3, zp2.2, Blimp-1 и HtrA2, на все из которых можно целенаправленно воздействовать с помощью системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению.

Wu (Cell Stem Cell, 13:659-62, 2013) разработал направляющую РНК, которая нацеливает Cas9 на местоположение мутации в одной паре оснований, вызывающей формы катаракты у мышей, где он индуцирует расщепление ДНК. Затем с помощью другого аллеля дикого типа или олигонуклеотидов, вводимых в зиготы, механизмы репарации корректируют последовательность поврежденного аллеля и корректируют генетический дефект, вызывающий катаракту, у мутантной мыши.

В публикации заявки на патент США №20120159653 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с макулодистрофией (MD). Макулодистрофия (MD) является основной причиной ухудшения зрения у лиц пожилого возраста, однако также является характерным симптомом детских заболеваний, таких как болезнь Штаргардта, дистрофия глазного дна Сорсби и детские нейродегенеративные заболевания с летальным исходом, при этом начало заболеваний проявляется уже в младенческом возрасте. Макулодистрофия приводит к потере зрения в центре поля зрения (желтом пятне) по причине поражения сетчатки. Существующие в настоящее время животные модели не воспроизводят основные отличительные признаки заболевания, как это наблюдается у людей. У доступных животных моделей, содержащих мутантные гены, кодирующие белки, ассоциированные с MD, также получают крайне изменчивые фенотипы, что делает проблематичными переход к заболеванию человека и разработку способов терапии.

Один аспект публикации заявки на патент США №20120159653 относится к редактированию любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, ассоциированные с MD, что можно распространяться на систему CRISPR-Cas по настоящему изобретению. Белки, ассоциированные с MD, как правило, выбирают, исходя из экспериментально установленной взаимосвязи белка, ассоциированного с MD, с нарушением по типу MD. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, ассоциированного с MD, может быть повышенной или пониженной в популяции с нарушением по типу MD по сравнению с популяцией без нарушения по типу MD. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае, белки, ассоциированные с MD, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, серийного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

В качестве неограничивающего примера белки, ассоциированные с MD, включают, без ограничения, следующие белки: представитель 4 (АВСА4) подсемейства А (АВС1) АТФ-связывающей кассеты, АСНМ1 - белок 1, ассоциированный с ахроматопсией (палочковым монохроматизмом), АроЕ - аполипопротеин Е (АроЕ), C1QTNF5 (CTRP5) -C1q/белок 5, родственный фактору некроза опухолей (C1QTNF5), С2 - компонент 2 системы комплемента (С2), компонент С3 системы комплемента (С3), CCL2 - хемокиновый лиганд 2 (с мотивом С-С) (CCL2), CCR2 - рецептор хемокина 2 (с мотивом С-С) (CCR2), CD36 - кластер дифференцировки 36, CFB - фактор В системы комплемента, CFH - фактор Н системы комплемента (CFH), CFHR1 - белок 1, родственный фактору Н системы комплемента, CFHR3 - белок 3, родственный фактору Н системы комплемента, CNGB3 - бета-3-субъединица ионного канала, регулируемого циклическими нуклеотидами, CP - церулоплазмин (CP), CRP - С-реактивный белок (CRP) CST3 - цистатин С или цистатин 3 (CST3), CTSD - катепсин D (CTSD), CX3CR1 - рецептор хемокина 1 (с мотивом С-Х3-С), ELOVL4 - белок 4, отвечающий за удлинение жирных кислот с очень длинной цепью, ERCC6 - белок эксцизионной репарации, вступающий в перекрестную комплементацию, корректирующий дефицит репарации у грызунов, комплементационная группа 6, FBLN5 - фибулин-5, FBLN5 - фибулин 5, FBLN6 - фибулин 6, FSCN2 - фасцин (FSCN2), HMCN1 - гемицентрин 1, HMCN1 - гемицентрин 1, HTRA1 - сериновая пептидаза HtrA 1 (HTRA1), HTRA1 - сериновая пептидаза HtrA 1, IL-6 - интерлейкин 6, IL-8 - интерлейкин 8, LOC387715 - гипотетический белок, PLEKHA1 - белок, содержащий плекстрин-гомологичный домен, представитель 1 семейства А (PLEKHA1), PROM1 - проминин 1 (PROM1 или CD133), PRPH2 - периферин-2, RPGR - регулятор ГТФазы, ассоциированный с пигментным ретинитом, SERPING1 - ингибитор сериновой пептидазы, представитель 1 клады G (С1-ингибитор), TCOF1 - Treacle, TIMP3 - ингибитор 3 металлопротеиназ (TIMP3), TLR3 - Toll-подобный рецептор 3.

Идентичность белка, ассоциированного с MD, редактирование хромосомной последовательности которого осуществляют, может и будет варьировать. В предпочтительном варианте осуществления белки, ассоциированные с MD, редактирование хромосомных последовательностей которых осуществляют, могут представлять собой белок представитель 4 (АВСА4) подсемейства А (АВС1) АТФ-связывающей кассеты, кодируемый геном ABCR, белок аполипопротеин Е (АРОЕ), кодируемый геном АРОЕ, белок хемокиновый лиганд 2 (с мотивом С-С) (CCL2), кодируемый геном CCL2, белок рецептор хемокина 2 (с мотивом С-С) (CCR2), кодируемый геном CCR2, белок церулоплазмин (CP), кодируемый геном CP, белок катепсин D (CTSD), кодируемый геном CTSD, или белок ингибитор 3 металлопротеиназ (TIMP3), кодируемый геном TIMP3. В иллюстративном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой крысу, и редактируемая хромосомная последовательность, кодирующая белок, ассоциированный с MD, может быть следующей: NM_000350 (АВСА4) для представителя 4 подсемейства А (АВС1) АТФ-связывающей кассеты, NM_138828 (АРОЕ) для аполипопротеина Е АРОЕ, NM_031530 (CCL2) для хемокинового лиганда 2 (с мотивом С-С) CCL2, NM_021866 (CCR2) для рецептора хемокина 2 (с мотивом С-С) CCR2, NM_012532 (CP) для церулоплазмина CP, NM_134334 (CTSD) для катепсина D CTSD, NM_012886 (TIMP3) для ингибитора 3 металлопротеиназ TIMP3. Животное или клетка могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более хромосомных последовательностей с нарушенной структурой, кодирующих белок, ассоциированный с MD, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более интегрированных в хромосомы последовательностей, кодирующих белок с нарушенной структурой, ассоциированный с MD.

Отредактированную или интегрированную хромосомную последовательность можно модифицировать так, чтобы она кодировала измененный белок, ассоциированный с MD. Некоторые мутации в хромосомных последовательностях, связанных с MD, были ассоциированы с MD. Неограничивающие примеры мутаций в хромосомных последовательностях, ассоциированные с MD, включают те, которые могут вызывать MD, в том числе в белке ABCR - Е471K (т.е. глутамат в положении 471 заменен на лизин), R1129L (т.е. аргинин в положении 1129 заменен на лейцин), Т1428М (т.е. треонин в положении 1428 заменен на метионин), R1517S (т.е. аргинин в положении 1517 заменен на серии), I1562T (т.е. изолейцин в положении 1562 заменен на треонин) и G1578R (т.е. глицин в положении 1578 заменен на аргинин); в белке CCR2 - V64I (т.е. валин в положении 192 заменен на изолейцин); в белке CP - G969B (т.е. глицин в положении 969 заменен на аспарагин или аспартат); в белке TIMP3 - S156C (т.е. серии в положении 156 заменен на цистеин), G166C (т.е. глицин в положении 166 заменен на цистеин), G167C (т.е. глицин в положении 167 заменен на цистеин), Y168C (т.е. тирозин в положении 168 заменен на цистеин), S170C (т.е. серии в положении 170 заменен на цистеин), Y172C (т.е. тирозин в положении 172 заменен на цистеин) и S181C (т.е. серии в положении 181 заменен на цистеин). В данной области известны и другие взаимосвязи генных вариантов генов, ассоциированных с MD, и заболевания.

Сердце

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в сердце. Для сердца предпочтительным является тропный к миокарду аденоассоциированный вирус (AAVM), в частности AAVM41, при использовании которого продемонстрирован преимущественный перенос генов в сердце (см., например, Lin-Yanga et al., PNAS, March 10, 2009, vol. 106, no. 10). Введение может быть системным или местным. Для системного введения предусматривается доза, составляющая приблизительно 1-10×10¹⁴ векторных геномов. См. также, например, Eulalio et al. (2012) Nature 492: 376 и Somasuntharam et al. (2013) Biomaterials 34: 7790.

Например, в публикации патентного документа США №20110023139 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с сердечно-сосудистым заболеванием. Сердечнососудистые заболевания, как правило, включают высокое кровяное давление, сердечные приступы, сердечную недостаточность и инсульт, а также TIA. Любую хромосомную последовательность, связанную с сердечно-сосудистым заболеванием, или белок, кодируемый любой хромосомной последовательностью, связанной с сердечнососудистым заболеванием, можно использовать в способах, описанных в настоящем раскрытии. Белки, связанные с сердечно-сосудистым заболеванием, обычно выбирают исходя из экспериментально подтвержденной ассоциации белка, связанного с сердечнососудистым заболеванием, с развитием сердечно-сосудистого заболевания. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, связанного с сердечнососудистым заболеванием, может быть повышенной или пониженной в популяции с сердечно-сосудистым заболеванием по сравнению с популяцией без сердечно-сосудистого заболевания. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае, белки, связанные с сердечно-сосудистым заболеванием, можно идентифицировать путем получения профилей генной экспрессии для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, серийного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

В качестве примера, хромосомная последовательность может содержать без ограничения следующие: IL1B (интерлейкин 1, бета), XDH (ксантиндегидрогеназа), ТР53 (опухолевый белок р53), PTGIS (простагландин 12 (простациклин) синтаза), MB (миоглобин), IL4 (интерлейкин 4), ANGPT1 (ангиопоэтин 1), ABCG8 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство G (WHITE), представитель 8), CTSK (катепсин K), PTGIR (рецептор простагландина 12 (простациклина) (IP)), KCNJ11 (входящий калиевый канал, подсемейство J, представитель 11), INS (инсулин), CRP (С-реактивный белок, родственный пентраксину), PDGFRB (полипептид рецептора тромбоцитарного фактора роста бета), CCNA2 (циклин А2), PDGFB (полипептид тромбоцитарного фактора роста бета (гомолог онкогена вируса саркомы обезьян (v-sis))), KCNJ5 (входящий калиевый канал, подсемейство J, представитель 5), KCNN3 (кальций-активируемый калиевый канал средней/малой проводимости, подсемейство N, представитель 3), CAPN10 (кальпаин 10), PTGES (простагландин Е синтаза), ADRA2B (адренергический, альфа-2В-, рецептор), ABCG5 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство G (WHITE), представитель 5), PRDX2 (пероксиредоксин 2), CAPN5 (кальпаин 5), PARP14 (семейство полимераз поли(АДФ-рибозы), представитель 14), МЕХ3С (гомолог С mex-3 (С. elegans)), АСЕ, ангиотензинпревращающий фермент I (пептидилдипептидаза А) 1), TNF (фактор некроза опухоли (суперсемейство TNF, представитель 2)), IL6 (интерлейкин 6 (интерферон, бета 2)), STN (статин), SERPINE1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада Е (нексин, ингибитор активатора плазминогена типа 1), представитель 1), ALB (альбумин), ADIPOQ (адипонектин, содержащий C1Q и коллагеновый домен), АРОВ (аполипопротеин В (в том числе антиген Ag(x))), АРОЕ (аполипопротеин Е), LEP (лептин), MTHFR (5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза (NADPH)), АРОА1 (аполипопротеин A-I), EDN1 (эндотелии 1), NPPB (предшественник В натрийуретического пептида), NOS3 (синтаза 3 оксида азота (эндотелиальная клетка)), PPARG (рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом), PLAT (активатор плазминогена, ткань), PTGS2 (простагландин-эндопероксидсинтаза 2 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)), СЕТР (транспортный белок сложного эфира холестерина, плазма), AGTR1 (рецептор ангиотензина II, тип 1), HMGCR (редуктаза 3-гидрокси-3-метилглутарилкофермента А), IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомедин С)), SELE (селектин Е), REN (ренин), PPARA (альфа-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), PON1 (параоксоназа 1), KNG1 (кининоген 1), CCL2 (лиганд 2 хемокина (мотив С-С)), LPL (липопротеинлипаза), VWF (фактор фон Виллебранда), F2 (фактор коагуляции II (тромбин)), ICAM1 (внутриклеточная молекула адгезии 1), TGFB1 (трансформирующий фактор роста, бета 1), NPPA (предшественник А натрийуретического пептида), IL10 (интерлейкин 10), ЕРО (эритропоэтин), SOD1 (супероксиддисмутаза 1, растворимая), VCAM1 (молекула адгезии сосудистого эндотелия типа 1), IFNG (интерферон, гамма), LPA (липопротеин, Lp(a)), МРО (миелопероксидаза), ESR1 (эстрогеновый рецептор 1), МАРK1 (митоген-активируемая протеинкиназа 1), HP (гаптоглобин), F3 (фактор коагуляции III (тромбопластин, тканевой фактор)), CST3 (цистатин С), COG2 (компонент олигомерного комплекса Гольджи 2), ММР9 (матриксная металлопептидаза 9 (желатиназа В, 92 кДа желатиназа, 92 кДа коллагеназа типа IV)), SERPINC1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада С (антитромбин), представитель 1), F8 (фактор коагуляции VIII, прокоагулянтный компонент), НМОХ1 (гемоксигеназа (дециклизирующая) 1), АРОС3 (аполипопротеин С-III), IL8 (интерлейкин 8), PROK1 (прокинетицин 1), CBS (цистатион-бета-синтаза), NOS2 (синтаза 2 оксида азота, индуцируемая), TLR4 (толл-подобный рецептор 4), SELP (селектин Р (гранулярный мембранный белок 140 кДа, антиген CD62)), АВСА1 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство А (АВС1), представитель 1), AGT (ангиотензиноген (ингибитор серпиновой пептидазы, клада А, представительн 8)), LDLR (рецептор липопротеинов низкой плотности), GPT (глутамат-пируватная трансаминаза (аланинаминотрансфераза)), VEGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), NR3C2 (ядерный рецептор, подсемейство 3, группа С, представитель 2), IL18 (интерлейкин 18 (интерферон-гамма-индуцирующий фактор)), NOS1 (синтаза 1 оксида азота (нейрональная)), NR3C1 (ядерный рецептор, подсемейство 3, группа С, представитель 1 (глюкокортикоидный рецептор)), FGB (бета-цепь фибриногена), HGF (фактор роста гепатоцитов (гепапоэтин А; рассеивающий фактор)), IL1A (интерлейкин 1, альфа), RETN (резистин), АКТ1 (гомолог 1 онкогена v-akt вируса тимомы мышей), LIPC (липаза, печеночная), HSPD1 (60 кДа белок теплового шока 1 (шаперонин)), МАРК 14 (митоген-активируемая протеинкиназа 14), SPP1 (секретируемый фосфопротеин 1), ITGB3 (интегрин, бета 3 (гликопротеин 111а тромбоцитов, антиген CD61)), CAT (каталаза), UTS2 (уротензин 2), THBD (тромбомодулин), F10 (фактор коагуляции X), CP (церулоплазмин (ферроксидаза)), TNFRSF11B (суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, представитель 11b), EDNRA (рецептор эндотелина типа A), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста (гомолог онкогена вируса эритробластического лейкоза (v-erb-b), птичий)), ММР2 (матриксная металлопептидаза 2 (желатиназа А, 72 кДа желатиназа, 72 кДа коллагеназа типа IV)), PLG (плазминоген), NPY (нейропептид Y), RHOD (гомолог белка семейства генов ras, представитель D), МАРK8 (митоген-активируемая протеинкиназа 8), MYC (гомолог онкогена v-myc вируса миелоцитоматоза (птичий)), FN1 (фибронектин 1), СМА1 (химаза 1, тучная клетка), PLAU (активатор плазминогена, урокиназа), GNB3 (белок, связывающий гуаниновый нуклеотид (G-белок), бета-полипептид 3), ADRB2 (адренергический, бета-2-, рецептор, поверхностный), АРОА5 (аполипопротеин A-V), SOD2 (супероксиддисмутаза 2, митохондриальная), F5 (фактор коагуляции V (проакцелерин, лабильный фактор)), VDR (рецептор витамина D (1,25-дигидроксивитамин D3)), ALOX5 (арахидонат-5-липоксигеназа), HLA-DRB1 (главный комплекс гистосовместимости, класс II, DR-бета 1), PARP1 (полимераза 1 поли(ADP-рибозы)), CD40LG (лиганд CD40), PON2 (параоксоназа 2), AGER (рецептор, специфичный к конечным продуктам усиленного гликозилирования), IRS1 (субстрат 1 инсулинового рецептора), PTGS1 (простагландин-эндопероксидсинтаза 1 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)), ЕСЕ1 (эндотелин-превращающий фермент 1), F7 (фактор коагуляции VII (сывороточный ускоритель превращения протромбина)), URN (антагонист рецептора интерлейкина 1), ЕРНХ2 (эпоксидгидролаза 2, цитоплазматическая), IGFBP1 (белок 1, связывающий инсулиноподобный фактор роста), МАРK 10 (митоген-активируемая протеинкиназа 10), FAS (Fas (суперсемейство рецепторов TNF, представитель 6)), АВСВ1 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство В (MDR/TAP), представитель 1), JUN (онкоген jun), IGFBP3 (белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста), CD 14 (молекула CD 14), PDE5A (фосфодиэстераза 5А, cGMP-специфичная), AGTR2 (рецептор ангиотензина II, тип 2), CD40 (молекула CD40, представитель 5 суперсемейства рецепторов TNF), LCAT (лецитинхолестеринацилтрансфераза), CCR5 (рецептор 5 хемокина (мотив С-С)), ММР1 (матриксная металлопептидаза 1 (интерстициальная коллагеназа)), TIMP1 (ингибитор 1 металлопептидазы TIMP), ADM (адреномедуллин), DYT10 (белок 10, связанный с дистонией), STAT3 (переносчик сигнала и активатор транскрипции 3 (фактор ответа острой фазы)), ММР3 (матриксная металлопептидаза 3 (стромелизин 1, прожелатиназа)), ELN (эластин), USF1 (транскрипционный фактор 1, расположенный выше промотора), CFH (фактор комплемента Н), HSPA4 (70 кДа белок теплового шока 4), ММР12 (матриксная металлопептидаза 12 (эластаза макрофагов)), ММЕ (мембранная металлоэндопептидаза), F2R (рецептор фактора коагуляции II (тромбина)), SELL (селектин L), CTSB (катепсин В), ANXA5 (аннексии А5), ADRB1 (адренергический, бета-1-, рецептор), CYBA (цитохром b-245, альфа-полипетид), FGA (альфа-цепь фибриногена), GGT1 (гамма-глутамилтрансфераза 1), LIPG (липаза, эндотелиальная), HIF1A (фактор 1, индуцируемый гипоксией, альфа-субъединица (транскрипционный фактор с основным доменом типа спираль-петля-спираль)), CXCR4 (рецептор 4 хемокина (мотив С-Х-С)), PROC (белок С (инактиватор факторов коагуляции Va и VIIIa)), SCARB1 (класс В фагоцитарных рецепторов, представитель 1), CD79A (молекула CD79a, иммуноглобулин - ассоциированная альфа), PLTP (белок, переносящий фосфолипиды), ADD1 (аддуцин 1 (альфа)), FGG (гамма-цепь фибриногена), SAA1 (сывороточный амилоид A1), KCNH2 (калиевый потенциалзависимый канал, подсемейство Н (eag-родственный), представитель 2), DPP4 (дипептидилпептидаза 4), G6PD (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), NPR1 (рецептор А натрийуретического пептида/гуанилатциклаза А (рецептор А атрионатрийуретического пептида)), VTN (витронектин), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (гомолог онкогена вируса остеосаркомы мышей FBJ), TLR2 (толл-подобный рецептор 2), PPIG (пептидилпролилизомераза G (циклофилин G)), IL1R1 (рецептор интерлейкина 1, тип I), AR (андрогеновый рецептор), CYP1A1 (цитохром Р450, семейство 1, подсемейство А, полипептид 1), SERPINA1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада А (альфа-1 антипротеиназа, антитрипсин), представитель 1), MTR (5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинметилтрансфераза), RBP4 (белок 4, связывающий ретинол, плазма), АРОА4 (аполипопротеин A-IV), CDKN2A (ингибитор 2А циклин-зависимой киназы (меланома, р16, ингибирует CDK4)), FGF2 (фактор 2 роста фибробластов (основной)), EDNRB (рецептор эндотелина типа В), ITGA2 (интегрин, альфа 2 (CD49B, субъединица альфа 2 рецептора VLA-2)), CABIN 1 (белок 1, связывающий кальциневрин), SHBG (глобулин, связывающий половые гормоны), HMGB1 (группа белков с высокой подвижностью 1), HSP90B2P (90 кДа белок теплового шока бета (Grp94), представитель 2 (псевдоген)), CYP3A4 (цитохром Р450, семейство 3, подсемейство А, полипептид 4), GJA1 (белок межклеточных щелевых контактов, альфа 1, 43 кДа), CAV1 (кавеолин 1, кавеолярный белок, 22 кДа), ESR2 (эстрогеновый рецептор 2 (ER-бета)), LTA (лимфотоксин-альфа (суперсемейство TNF, представитель 1)), GDF15 (фактор 15 роста и дифференцировки), BDNF (нейротрофический фактор головного мозга), CYP2D6 (цитохром Р450, семейство 2, подсемейство D, полипептид 6), NGF (фактор роста нервов (бета-полипептид)), SP1 (транскрипционный фактор Sp1), TGIF1 (гомеобокс 1 TGFB-индуцируемого фактора), SRC (гомолог онкогена v-src вируса саркомы (Schmidt-Ruppin А-2) (птичий)), EGF (эпидермальный фактор роста (бета-урогастрон)), PIK3CG (фосфоинозитид-3-киназа, каталитическая, гамма-полипептид), HLA-A (главный комплекс гистосовместимости, класс I, A), KCNQ1 (калиевый потенциалзависимый канал, подсемейство KQT-подобных белков, представитель 1), CNR1 (каннабиноидный рецептор 1 (головной мозг)), FBN1 (фибриллин 1), СНKА (холинкиназа альфа), BEST1 (бестрофин 1), АРР (белок-предшестенник бета-амилоида (А4)), CTNNB1 (катенин (кадгерин-ассоциированный белок), бета 1, 88 кДа), IL2 (интерлейкин 2), CD36 (молекула CD36 (рецептор тромбоспондина)), PRKAB1 (протеинкиназа, АМР-активируемая, бета 1, некаталитическая субъединица), ТРО (тиреоидная пероксидаза), ALDH7A1 (семейство альдегиддегидрогеназы 7, представитель A1) CX3CR1 (рецептор 1 хемокина (мотив С-Х3-С)), ТН (тирозингидроксилаза), F9 (фактор коагуляции IX), GH1 (гормон роста 1), TF (трансферрин), HFE (гемохроматоз), IL17A (интерлейкин 17А), PTEN (гомолог фосфатазы и тензина), GSTM1 (глутатион-S-трансфераза mu 1), DMD (дистрофии), GATA4 (GATA-связывающий белок 4), F13A1 (фактор коагуляции XIII, полипептид A1), TTR (транстиретин), FABP4 (белок 4, связывающий жирные ксилоты, адипоцитарный), PON3 (параоксоназа 3), АРОС1 (аполипопротеин C-I), INSR (инсулиновый рецептор), TNFRSF1B (суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, представитель 1B), HTR2A (5 гидрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 2А), CSF3 (колониестимулирующий фактор 3 (гранулоцитарный)), CYP2C9 (цитохром Р450, семейство 2, подсемейство С, полипептид 9), TXN (тиоредоксин), CYP11B2 (цитохром Р450, семейство 11, подсемейство В, полипептид 2), РТН (паратиреоидный гормон), CSF2 (колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцитарно-макрофагальный)), KDR (рецептор вставочного домена киназы (рецептор тирозинкиназы III типа)), PLA2G2A (фосфолипаза А2, группа IIA (тромбоциты, синовиальная жидкость)), В2М (бета-2-микроглобулин), THBS1 (тромбоспондин 1), GCG (глюкагон), RHOA (гомолог белка семейства генов ras, представитель A), ALDH2 (семейство альдегиддегидрогеназы 2 (митохондриальная)), TCF7L2 (белок 2, подобный транскрипционному фактору 7 (специфический по отношению к Т-клеткам, HMG-бокс)), BDKRB2 (брадикининовый рецептор В2), NFE2L2 (белок 2, подобный ядерному фактору (эритроидному 2)), NOTCH1 (гомолог Notch 1, ассоциированный с транслокацией (Drosophila)), UGT1A1 (семейство UDP-глюкуронозилтрансферазы 1, полипептид A1), IFNA1 (интерферон, альфа 1), PPARD (рецептор дельта, активируемый пролифератором пероксисом), SIRT1 (сиртуин (гомолог регулятора 2 экспрессии, обеспечивающего сайленсинг) 1 (S. cerevisiae)), GNRH1 (гонадотропин-рилизинг гормон 1 (лютеинизирующий рилизинг-гормон)), РАРРА (ассоциированный с беременностью белок плазмы А, паппализин 1), ARR3 (аррестин 3, ретинальный (Х-аррестин)), NPPC (предшественник С натрийуретического пептида), AHSP (белок, стабилизирующий альфа-гемоглобин), РТK2 (РТК2 тирозиновая протеинкиназа 2), IL13 (интерлейкин 13), MTOR (механистическая мишень рапамицина (серин/треонинкиназа)), ITGB2 (интегрин, бета 2 (субъединица рецептора 3 и 4 компонента комплемента 3)), GSTT1 (глутатион-S-трансфераза тета 1), IL6ST (переносчик сигнала интерлейкина 6 (gp130, рецептор онкостатина М)), СРВ2 (карбоксипептидаза В2 (плазма)), CYP1A2 (цитохром Р450, семейство 1, подсемейство А, полипептид 2), HNF4A (гепатоцитарный ядерный фактор 4, альфа), SLC6A4 (семейство переносчиков растворенных веществ 6 (транспортер нейротрансмиттеров, серотониновый), представитель 4), PLA2G6 (фосфолипаза А2, группа VI (цитозольная, кальций-независимая)), TNFSF11 (суперсемейство фактора некроза опухоли (лиганд), представитель 11), SLC8A1 (семейство переносчиков растворенных веществ 8 (натрий/кальциевый обменник), представитель 1), F2RL1 (белок 1, подобный рецептору фактора коагуляции II (тромбина)), AKR1A1 (семейство 1 альдокеторедуктаз, представитель А1 (альдегидредуктаза)), ALDH9A1 (семейство альдегиддегидрогеназы 9, представитель A1), BGLAP (гамма-карбоксиглутаматный (gla) белок кости), МТТР (микросомальный белок-переносчик триглицеридов), MTRR (редуктаза 5 метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансферазы), SULT1A3 (семейство сульфотрансфераз, цитозольная, 1А, преимущественно воздействующих на фенол, представитель 3), RAGE (антиген опухоли почек), С4В (компонент комплемента 4В (группа крови Chido), P2RY12 (пуринергический рецептор P2Y, связанный с G-белком, 12), RNLS (реналаза, FAD-зависимая аминоксидаза), CREB1 (белок 1, связывающий сАМР-чувствительный элемент), РОМС (проопиомеланокортин), RAC1 (родственный ras субстрат 1 ботулотоксина С3 (семейство rho, малый GTP-связывающий белок Rac1)), LMNA (ламин NC), CD59 (молекула CD59, регуляторный белок комплемента), SCN5A (натриевый канал, потенциалзависимый, тип V, альфа-субъединица), CYP1B1 (цитохром Р450, семейство 1, подсемейство В, полипептид 1), MIF (фактор ингибирования миграции макрофагов (фактор, ингибирующий гликозилирование)), ММР13 (матриксная металлопептидаза 13 (коллагеназа 3)), TIMP2 (ингибитор 2 металлопептидазы TIMP), CYP19A1 (цитохром Р450, семейство 19, подсемейство А, полипептид 1), CYP21A2 (цитохром Р450, семейство 21, подсемейство А, полипептид 2), PTPN22 (тирозиновая протеинфосфатаза, нерецепторного типа 22 (лимфоидная)), MYH14 (миозин, тяжелая цепь 14, отличный от мышечного), MBL2 (лектин, связывающий маннозу (белок С) 2, растворимый (опсонический дефект)), SELPLG (лиганд селектина Р), АОС3 (аминоксидаза, белок 3, содержащий медь (васкулярный адгезивный белок 1)), CTSL1 (катепсин L1), PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), IGF2 (инсулиноподобный фактор роста 2 (соматомедин A)), ITGB1 (интегрин, бета 1 (рецептор фибронектина, бета-полипептид, антиген CD29, включающий MDF2, MSK12)), CAST (кальпастатин), CXCL12 (лиганд 12 хемокина (мотив С-Х-С) (стромальный клеточный фактор 1)), IGHE (константный участок тяжелой эпсилон-цепи иммуноглобулина), KCNE1 (калиевый потенциалзависимый канал, Isk-родственное семейство, представитель 1), TFRC (рецептор трансферрина (р90, CD71)), COL1A1 (коллаген, тип I, альфа 1), COL1A2 (коллаген, тип I, альфа 2), IL2RB (рецептор интерлейкина 2, бета), PLA2G10 (фосфолипаза А2, группа X), ANGPT2 (ангиопоэтин 2), PROCR (рецептор белка С, эндотелиальный (EPCR)), NOX4 (NADPH-оксидаза 4), НАМР (противомикробный пептид гепсидин), PTPN11 (тирозиновая протеинфосфатаза, нерецепторного типа 11), SLC2A1 (семейство 2 переносчиков растворенных веществ (транспортер, обеспечивающий облегченный перенос глюкозы), предствитель 1), IL2RA (рецептор интерлейкина 2, альфа), CCL5 (лиганд 5 хемокина (мотив С-С)), IRF1 (регуляторный фактор 1 интерферона), CFLAR (CASP8 и FADD-подобный регулятор апоптоза), CALCA (полипептид альфа, родственный кальцитонину), EIF4E (эукариотический фактор инициации трансляции 4Е), GSTP1 (глутатион-S-трансфераза пи 1), JAK2 (Janus киназа 2), CYP3A5 (цитохром Р450, семейство 3, подсемейство А, полипептид 5), HSPG2 (гепарансульфат-протеогликан 2), CCL3 (лиганд 3 хемокина (мотив С-С)), MYD88 (белок гена первичного ответа, связанного с дифференцировкой миелоидных клеток (88)), VIP (вазоактивный интестинальный пептид), SOAT1 (стерол-О-ацилтрансфераза 1), ADRBK1 (адренергическая, бета, рецепторная киназа 1), NR4A2 (ядерный рецептор, подсемейство 4, группа А, представитель 2), ММР8 (матриксная металлопептидаза 8 (коллагеназа нейтрофилов)), NPR2 (рецептор В натрийуретического пептида/гуанилатциклаза В (рецептор В атрионатрийуретического пептида)), GCH1 (GTP-циклогидролаза 1), EPRS (глутамилпролил-тРНК-синтетаза), PPARGC1A (гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, коактиватор 1 альфа), F12 (фактор коагуляции XII (фактор Хагемана)), РЕСАМ1 (молекула клеточной адгезии эндотелиальных клеток/тромбоцитов), CCL4 (лиганд 4 хемокина (мотив С-С)), SERPINA3 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада А (альфа-1 антипротеиназа, антитрипсин), представитель 3), CASR (кальций-чувствительный рецептор), GJA5 (белок межклеточных щелевых контактов, альфа 5, 40 кДа), FABP2 (белок 2, связывающий жирные кислоты, кишечный), TTF2 (фактор терминации транскрипции, РНК-полимераза II), PROS1 (белок S (альфа)), CTF1 (кардиотрофин 1), SGCB (саркогликан, бета (43 кДа дистрофин-ассоциированный гликопротеин)), YME1L1 (YME1-подобный белок 1 (S. cerevisiae)), CAMP (противомикробный пептид кателицидин), ZC3H12A (белок 12А СССН-типа, содержащий "цинковые пальцы"), AKR1B1 (семейство 1 альдокеторедуктаз, представитель В1 (альдозоредуктаза)), DES (десмин), ММР7 (матриксная металлопептидаза 7 (матрилизин, маточный)), AHR (арилуглеводородный рецептор), CSF1 (колониестимулирующий фактор 1 (макрофагальный)), HDAC9 (деацетилаза гистонов 9), CTGF (фактор роста соединительной ткани), KCNMA1 (кальций-активируемый калиевый канал большой проводимости, подсемейство М, альфа, представитель 1), UGT1A (семейство UDP-глюкуронозилтрансферазы 1, полипептид А сложного локуса), PRKCA (протеинкиназа С, альфа), СОМТ (катехол-бета-метилтрансфераза), S100B (S100 кальций-связывающий белок В), EGR1 (белок, связанный с ранними стадиями роста 1), PRL (пролактин), IL15 (интерлейкин 15), DRD4 (допаминовый рецептор D4), CAMK2G (кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II гамма), SLC22A2 (семейство 22 переносчиков растворенных веществ (транспортер органических катионов), представитель 2), CCL11 (лиганд 11 хемокина (мотив С-С)), PGF (В321 плацентарный фактор роста), ТНРО (тромбопоэтин), GP6 (гликопротеин VI (тромбоцитарный)), TACR1 (тахикининовый рецептор 1), NTS (нейротензин), FINF1A (HNF1 гомеобокс A), SST (соматостатин), KCND1 (калиевый потенциалзависимый канал, Shal-родственное подсемейство, представитель 1), LOC646627 (ингибитор фосфолипазы), TBXAS1 (тромбоксан А синтаза 1 (тромбоцитарная)), CYP2J2 (цитохром Р450, семейство 2, подсемейство J, полипептид 2), TBXA2R (рецептор тромбоксана А2), ADH1C (алкогольдегидрогеназа 1С (класс I), гамма-полипептид), ALOX12 (арахидонат 12-липоксигеназа), AHSG (альфа-2-НS-гликопротеин), ВНМТ (бетаин-гомоцистеинметилтрансфераза), GJA4 (белок межклеточных щелевых контактов, альфа 4, 37 кДа), SLC25A4 (семейство 25 переносчиков растворенных веществ (митохондриальный переносчик; переносчик адениновых нуклеотидов), представитель 4), ACLY (АТР-цитратлиаза), ALOX5AP (арахидонат-5-липоксигеназа-активирующий белок), NUMA1 (белок 1 ядерного митотического аппарата), CYP27B1 (цитохром Р450, семейство 27, подсемейство В, полипептид 1), CYSLTR2 (цистеиниллейкотриеновый рецептор 2), SOD3 (супероксиддисмутаза 3, внеклеточная), LTC4S (лейкотриен-С4-синтаза), UCN (урокортин), GHRL (препропептид грелин/обестатин), АРОС2 (аполипопротеин С-II), CLEC4A (семейство 4 лектиновых доменов С-типа, представитель A), KBTBD10 (белок 10, содержащий повтор kelch и домен ВТВ (POZ)), TNC (тенасцин С), TYMS (тимидилатсинтетаза), SHC1 (SHC (гомолог 2, содержащий домен Src) трансформирующий белок 1), LRP1 (белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), SOCS3 (супрессор цитокинового сигнала 3), ADH1B (алкогольдегидрогеназа 1В (класс I), бета-полипептид), KLK3 (калликреин-родственная пептидаза 3), HSD11B1 (гидроксистероидная (11-бета) дегидрогеназа 1), VKORC1 (комплекс эпоксидредуктазы и витамина K, субъединица 1), SERPINB2 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада В (овальбумин), представитель 2), TNS1 (тензин 1), RNF19A (белок 19А с доменом ring), EPOR (рецептор эритропоэтина), ITGAM (интегрин, альфа М (субъединица рецептора 3 компонента комплемента 3)), PITX2 (гомеодомен 2, подобный парному), МАРK7 (митоген-активируемая протеинкиназа 7), FCGR3A (Fc-фрагмент IgG, белок 111а с низким сродством, рецептор (CD16а)), LEPR (лептиновый рецептор), ENG 4 (эндоглин), GPX1 (глутатионпероксидаза 1), GOT2 (глутамат-оксалоацетат-трансаминаза 2, митохондриальная (аспартатаминотрансфераза 2)), HRH1 (гистаминовый рецептор H1), NR112 (ядерный рецептор, подсемейство 1, группа I, представитель 2), CRH (кортикотропин-рилизинг-гормон), HTR1A (5-гидрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 1А), VDAC1 (потенциалзависимый анионный канал 1), HPSE (гепараназа), SFTPD (сурфактантный белок D), ТАР2 (транспортер 2, АТР-связывающая кассета, подсемейство В (MDR/TAP)), RNF123 (белок 123 с доменом ring), РТK2В (РТK2В тирозиновая протеинкиназа 2 бета), NTRK2 (нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, тип 2), IL6R (рецептор интерлейкина 6), ACHE (ацетилхолинэстераза (группа крови Yt)), GLP1R (рецептор глюкагон-подобного пептида 1), GHR (рецептор гормона роста), GSR (глутатионредуктаза), NQO1 (NАD(Р)Н-дегидрогеназа, хинон 1), NR5A1 (ядерный рецептор, подсемейство 5, группа А, представитель 1), GJB2 (белок межклеточных щелевых контактов, бета 2, 26 кДа), SLC9A1 (семейство 9 переносчиков растворенных веществ (натрий/водородный обменник), представитель 1), МАОА (моноаминоксидаза А), PCSK9 (пробелок-конвертаза субтилизин/кексин типа 9), FCGR2A (Fc-фрагмент IgG, белок IIа с низким сродством, рецептор (CD32)), SERPINF1 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада F (альфа-2 антиплазмин, фактор из пигментного эпителия), представитель 1), EDN3 (эндотелии 3), DHFR (дигидрофолатредуктаза), GAS6 (белок 6, специфический по отношению к остановке роста), SMPD1 (сфингомиелинфосфодиэстераза 1, кислая лизосомная), UCP2 (разобщающий белок 2 (митохондриальный, переносчик протонов)), TFAP2A (транскрипционный фактор АР-2 альфа (активирующий энхансер-связывающий белок 2 альфа)), С4ВРА (компонент комплемента 4 связывающий белок, альфа), SERPINF2 (ингибитор серпиновой пептидазы, клада F (альфа-2 антиплазмин, фактор из пигментного эпителия), представитель 2), TYMP (тимидинфосфорилаза), ALPP (щелочная фосфатаза, плацентарная (изофермент Regan)), CXCR2 (рецептор 2 хемокина (мотив С-Х-С)), SLC39A3 (семейство 39 переносчиков растворенных веществ (цинковый транспортер), представитель 3), ABCG2 (АТР-связывающая кассета, подсемейство G (WHITE), представитель 2), ADA (аденозиндезаминаза), JAK3 (Janus киназа 3), HSPA1A (70 кДа белок теплового шока 1А), FASN (синтаза жирных кислот), FGF1 (фактор 1 роста фибробластов (кислый)), F11 (фактор коагуляции XI), АТР7А (АТФаза, Cu++-транспортирующая, альфа-полипетид), CR1 (рецептор 1 компонента комплемента (3b/4b) (группа крови Knops)), GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), ROCK1 (Rho-ассоциированная, протеинкиназа 1, содержащая суперспираль), МЕСР2 (метил-СрG-связывающий белок 2 (синдром Ретта)), MYLK (киназа легкой цепи миозина), ВСНЕ (бутирилхолинэстераза), LIPE (липаза, гормон-чувствительная), PRDX5 (пероксиредоксин 5), ADORA1 (рецептор аденозина A1), WRN (синдром Вернера, белок, подобный хеликазе RecQ), CXCR3 (рецептор 3 хемокина (мотив С-Х-С)), CD81 (молекула CD81), SMAD7 (представитель 7 семейства SMAD), LAMC2 (ламинин, гамма 2), МАР3K5 (митоген-активируемая протеинкиназа 5), CHGA (хромогранин А (паратиреоидный секреторный белок 1)), IAPP (островковый амилоидный полипептид), RHO (родопсин), ENPP1 (эктонуклеотидпирофосфатаза/фосфодиэстераза 1), PTHLH (гормон, подобный паратиреоидному гормону), NRG1 (нейрегулин 1), VEGFC (фактор роста эндотелия сосудов С), ENPEP (глутамиламинопептидаза (аминопептидаза А)), СЕВРВ (ССААТ/энхансер-связывающий белок (С/ЕВР), бета), NAGLU (N-ацетилглюкозаминидаза, альфа-), F2RL3 (белок 3, подобный рецептору фактора коагуляции II (тромбина)), CX3CL1 (лиганд 1 хемокина (мотив С-Х3-С)), BDKRB1 (брадикининовый рецептор B1), ADAMTS13 (ADAM металлопептидаза с мотивом тромбоспондина типа 1, 13), ELANE (эластаза, экспрессируемая нейтрофилами), ENPP2 (эктонуклеотидпирофосфатаза/фосфодиэстераза 2), CISH (индуцируемый цитокинами белок, содержащий SH2), GAST (гастрин), MYOC (миоциллин, обеспечивающий индуцируемую чувствительность трабекулярной сети к глюкокортикоидам), АТР1А2 (АТФаза, Na+/K+-транспортирующая, альфа 2 полипептид), NF1 (нейрофибромин 1), GJB1 (белок межклеточных щелевых контактов, бета 1, 32 кДа), MEF2A (энхансерный фактор миоцитов 2А), VCL (винкулин), BMPR2 (рецептор костного морфогенетического белка, тип II (серин/треонинкиназа)), TUBB (тубулин, бета), CDC42 (белок 42 цикла клеточного деления (GTP-связывающий белок, 25 кДа)), KRT18 (кератин 18), HSF1 (транскрипционный фактор 1 теплового шока), MYB (гомолог онкогена v-myb вируса миелобластоза (птичий)), PRKAA2 (протеинкиназа, АМР-активируемая, альфа 2 каталитическая субъединица), ROCK2 (Rho-ассоциированная, протеинкиназа 2, содержащая суперспираль), TFPI (ингибитор пути тканевого фактора (липопротеин-ассоциированный ингибитор коагуляции)), PRKG1 (протеинкиназа, cGMP-зависимая, тип I), ВМР2 (костный морфогенетический белок 2), CTNND1 (катенин (кадгерин-ассоциированный белок), дельта 1), СТН (цистатионаза (цистатион гамма-лиаза)), CTSS (катепсин S), VAV2 (фактор обмена гуаниновых нуклеотидов vav 2), NPY2R (рецептор Y2 нейропептида Y), IGFBP2 (белок 2, связывающий инсулиноподобный фактор роста, 36 кДа), CD28 (молекула CD28), GSTA1 (глутатион-S-трансфераза альфа 1), PPIA (пептидилпролилизомераза А (циклофилин А)), АРОН (аполипопротеин Н (бета-2-гликопротеин I)), S100A8 (S100 кальций-связывающий белок А8), IL11 (интерлейкин 11), ALOX15 (арахидонат-15-липоксигеназа), FBLN1 (фибулин 1), NR1H3 (ядерный рецептор, подсемейство 1, группа Н, представитель 3), SCD (стеароил-СоА-десатураза (дельта-9-десатураза)), GIP (желудочный ингибиторный полипептид), CHGB (хромогранин В (секретогранин 1)), PRKCB (протеинкиназа С, бета), SRD5A1 (стероид-5-альфа-редуктаза, альфа-полипетид 1 (3-оксо-5-альфа-стероид-дельта-4-дегидрогеназа альфа 1)), HSD11B2 (гидроксистероид (11-бета) дегидрогеназа 2), CALCRL (белок, подобный кальцитониновому рецептору), GALNT2 (UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозамин : полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (белок 4, подобный ангиопоэтину), KCNN4 (кальций-активируемый калиевый канал средней/малой проводимости, подсемейство N, представитель 4), PIK3C2A (фосфоинозитид-3-киназа, класс 2, альфа-полипетид), HBEGF (гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста), CYP7A1 (цитохром Р450, семейство 7, подсемейство А, полипептид 1), HLA-DRB5 (главный комплекс гистосовместимости, класс II, DR бета 5), BNIP3 (19 кДа белок 3 аденовируса Е1В, взаимодействующий с BCL2), GCKR (регулятор глюкокиназы (гексокиназы 4)), S100A12 (S100 кальций-связывающий белок А12), PADI4 (пептидиларгининдезиминаза, тип IV), HSPA14 (70 кДа белок 14 теплового шока), CXCR1 (рецептор 1 хемокина (мотив С-Х-С)), H19 (H19, подвергающийся импринтингу, экспрессируемый с материнской хромосомы транскрипт (не кодирующий белок)), KRTAP19-3 (кератин-ассоциированный белок 19-3), IDDM2 (инсулин-зависимый белок 2, связанный с сахарным диабетом), RAC2 (родственный ras субстрат 2 ботулотоксина С3 (семейство rho, малый GTP-связывающий белок Rac2)), RYR1 (рианодиновый рецептор 1 (скелетный)), CLOCK (гомолог clock (мышь)), NGFR (суперсемейство рецепторов фактора роста нервов (TNFR, представитель 16)), DBH (допамин-бета-гидроксилаза (допамин-бета-монооксигеназа)), CHRNA4 (холинергический рецептор, никотиновый, альфа 4), CACNA1C (кальциевый канал, потенциалзависимый, L-тип, субъединица альфа 1С), PRKAG2 (протеинкиназа, АМР-активируемая, некаталитическая субъединица гамма 2), CHAT (холинацетилтрансфераза), PTGDS (21 кДа простагландин-D2-синтаза (головной мозг)), NR1H2 (ядерный рецептор, подсемейство 1, группа Н, представитель 2), ТЕK (тирозинкиназа ТЕK, эндотелиальная), VEGFB (фактор роста эндотелия сосудов В), MEF2C (энхансерный фактор миоцитов 2С), МАРKАРK2 (митоген-активируемая протеинкиназа-активируемая протеинкиназа 2), TNFRSF11A (суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, представитель 11а, активатор NFKB), HSPA9 (70 кДа белок 9 теплового шока (морталин)), CYSLTR1 (цистеиниллейкотриеновый рецептор 1), МАТ1А (метионинаденозилтрансфераза I, альфа), OPRL1 (белок 1, подобный опиатному рецептору), IMPA1 (инозитол(мио)-1(или 4)-монофосфатаза 1), CLCN2 (хлорный канал 2), DLD (дигидролипоамиддегидрогеназа), PSMA6 (субъединица протеасомы (просома, макропаин), тип альфа, 6), PSMB8 (субъединица протеасомы (просома, макропаин), тип бета, 8 (большая мультифункциональная пептидаза 7)), CHI3L1 (белок 1, подобный хитиназе 3 (хрящевой гликопротеин-39)), ALDH1B1 (семейство альдегиддегидрогеназы 1, представитель B1), PARP2 (полимераза 2 поли(АDР-рибозы)), STAR (стероидогенный острый регуляторный белок), LBP (липополисахарид-связывающий белок), АВСС6 (АТФ-связывающая кассета, подсемейство C(CFTR/MRP), представитель 6), RGS2 (регулятор 2 передачи сигнала G-белком, 24 кДа), EFNB2 (эфрин-В2), GJB6 (белок межклеточных щелевых контактов, бета 6, 30 кДа), АРОА2 (аполипопротеин А-II), AMPD1 (аденозинмонофосфатдезаминаза 1), DYSF (дисферлин, белок 2В, связанный с тазово-плечевой мышечной дистрофией (аутосомно-рецессивное наследование)), FDFT1 (фарнезилдифосфатфарнезилтрансфераза 1), EDN2 (эндотелии 2), CCR6 (рецептор 6 хемокина (мотив С-С)), GJB3 (белок межклеточных щелевых контактов, бета 3, 31 кДа), IL1RL1 (белок 1, подобный рецептору интерлейкина 1), ENTPD1 (эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза 1), BBS4 (белок 4, связанный с синдромом Барде-Бидля), CELSR2 (кадгерин, рецептор 2 G-типа с доменами EGF и LAG (гомолог flamingo, Drosophila)), F11R (рецептор F11), RAPGEF3 (фактор обмена гуаниновых нуклеотидов Rap (GEF) 3), HYAL1 (гиалуроноглюкозаминидаза 1), ZNF259 (белок 259, содержащий "цинковые пальцы"), АТОХ1 (гомолог антиоксидантного белка 1 АТХ1 (дрожжи)), ATF6 (активирующий транскрипционный фактор 6), KНK (кетогексокиназа (фруктокиназа)), SAT1 (спермидин/спермин-N1-ацилтрансфераза 1), GGH (гамма-глутамилгидролаза (конъюгаза, фолилполигаммаглутамилгидролаза)), TIMP4 (ингибитор 4 металлопептидазы TIMP), SLC4A4 (семейство 4 переносчиков растворенных веществ, котранспортер бикарбоната натрия, представитель 4), PDE2A (фосфодиэстераза 2А, cGMP-стимулируемая), PDE3B (фосфодиэстераза 3В, cGMP-ингибируемая), FADS1 (десатураза 1 жирных кислот), FADS2 (десатураза 2 жирных кислот), TMSB4X (тимозин бета 4, Х-сцепленный), TXNIP (белок, взаимодействующий с тиоредоксином), LIMS1 (домены 1, подобные антигенам LIM и сенесцентных клеток), RHOB (гомолог белка семейства генов ras, представитель В), LY96 (лимфоцитарный антиген 96), FOXO1 (белок forkhead box O1), PNPLA2 (белок 2, содержащий домен фосфолипазы, подобной пататину), TRH (тиреотропин-рилизинг гормон), GJC1 (белок межклеточных щелевых контактов, гамма 1, 45 кДа), SLC17A5 (семейство 17 переносчиков растворенных веществ (анионный/сахарный транспортер), представитель 5), FTO (белок, ассоциированный с жировой массой и ожирением), GJD2 (белок межклеточных щелевых контактов, дельта 2, 36 кДа), PSRC1 (белок 1 с суперспиралью, богатой пролином/серином), CASP12 (каспаза 12 (ген/псевдоген)), GPBAR1 (G белок-связанный рецептор 1 желчной кислоты), РХK (серин/треонинкиназа, содержащая домен РХ), IL33 (интерлейкин 33), TRIB1 (гомолог 1 белка tribbles (Drosophila)), РВХ4 (гомеобокс 4, связанный с лейкозом с вовлечением В-клеток-предшественников), NUPR1 (ядерный белок, регулятор транскрипции, 1), 15-Sep (15 кДа селенопротеин), CILP2 (хрящевой белок 2 промежуточного слоя), TERC (РНК-компонент теломеразы), GGT2 (гамма-глутамилтрансфераза 2), МТ-СO1 (кодируемая митохондриальным геномом цитохром с-оксидаза I) и UOX (уратоксидаза, псевдоген).

В дополнительном варианте осуществления хромосомная последовательность также может быть выбрана из следующих: Pon1 (параоксоназа 1), LDLR (рецептор LDL), АроЕ (аполипопротеин Е), Аро В-100 (аполипопротеин В-100), АроА (аполипопротеин(а)), ApoA1 (аполипопротеин A1), CBS (цистатион-В-синтаза), гликопротеин IIb/IIb, MTHRF (5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза (NADPH) и их комбинаций. В одном случае хромосомные последовательности и белки, кодируемые хромосомными последовательностями, связанные с сердечно-сосудистым заболеванием, могут быть выбраны из Cacna1C, Sod1, Pten, Ppar(альфа), Аро Е, лептина и их комбинаций.

Почки

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в почку. Стратегии доставки для индукции поглощения клетками терапевтической нуклеиновой кислоты предусматривают использование физических сил или векторных систем, например, доставку с использованием вирусов, липидов, или комплексов, или наноносителей. Исходя из первоначальных применений, имеющих незначительную возможную клиническую значимость, в случае доставки нуклеиновых кислот в клетки почки при помощи гидродинамической системной инъекции с созданием высокого давления, широкий диапазон вирусных и невирусных носителей для генной терапии уже применяется для целенаправленного воздействия на посттранскрипционные события в различных животных моделях заболевания почек in vivo (Csaba Révész and Péter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed.), ISBN: 978-953-307-541-9, InTech, доступно на: http://www.intechopen.com/books/gene-therapy-applications/delivery-methods-to-target-rnas-in-the-kidney). Способы доставки в почку обобщены ниже.

Yuan и соавт. (Am J Physiol Renal Physiol 295: F605-F617, 2008) исследовали, может ли доставка in vivo малых интерферирующих РНК (siRNA), целенаправленно воздействующих на 12/15-липоксигеназный (12/15-LO) путь метаболизма арахидоновой кислоты, приводить к уменьшению повреждения почек и диабетической нефропатии (DN) в модели диабета 1 типа на мышах, которым инъецировали стрептозотоцин. Для достижения большей доступности и экспрессии siRNA в почке in vivo Yuan и соавт. использовали двухнитевые олигонуклеотиды siRNA к 12/15-LO, конъюгированные с холестерином. Приблизительно 400 мкг siRNA вводили мышам путем подкожной инъекции. Способ согласно Yuang и соавт. можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, что предусматривает подкожную инъекцию человеку 1-2 г CRISPR-Cas, конъюгированной с холестерином, для доставки в почки.

Molitoris и соавт. (J Am Soc Nephrol 20: 1754-1764, 2009) использовали клетки проксимальных канальцев (РТС) в качестве участка реабсорбции олигонуклеотидов в почке для тестирования эффективности siRNA, целенаправленно воздействующей на р53, ключевой белок в апоптическом пути, для предупреждения повреждения почки. "Оголенная" синтетическая siRNA к р53, которую вводили путем внутривенной инъекции через 4 ч после ишемического повреждения, обеспечивала максимальную защиту как РТС, так и функции почки. Данные Molitoris и соавт. указывают, что после внутривенного введения следует быстрая доставка siRNA в клетки проксимальных канальцев. Для анализа зависимости эффекта от дозы крысам инъецировали дозы siP53 0,33; 1, 3 или 5 мг/кг, которые предоставляли в одни и те же четыре момента времени, что давало в результате суммарные дозы 1,32; 4, 12 и 20 мг/кг, соответственно. Все протестированные дозы siRNA приводили к эффекту снижения SCr, в день один, причем более высокие дозы являлись эффективными в течение приблизительно пяти дней по сравнению с обработанными PBS контрольными крысами с ишемией. Суммарные дозы 12 и 20 мг/кг обеспечивали наилучший защитный эффект. Способ согласно Molitoris и соавт. можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, что предусматривает введение человеку суммарных доз 12 и 20 мг/кг для доставки в почки.

Thompson и соавт. (Nucleic Acid Therapeutics, Volume 22, Number 4, 2012) сообщили о токсикологических и фармакокинетических свойствах синтетических малых интерферирующих РНК I5NP после внутривенного введения грызунам и приматам, отличным от человека. I5NP разработан так, чтобы действовать посредством пути РНК-интерференции (RNAi) для временного ингибирования экспрессии проапоптического белка р53 и создан для защиты клеток от повреждений, связанных с острой ишемией/реперфузией, как, например, острое повреждение почки, что может возникать при обширной операции на сердце, и отсроченная функция трансплантата, что может возникать после пересадки почки. Дозы 800 мг/кг I5NP для грызунов и 1000 мг/кг I5NP для приматов, отличных от человека, требовались для того, чтобы вызвать нежелательные эффекты, которые у обезьян сводились к непосредственному воздействию на кровь, которое включало бессимптомную активацию комплемента и несколько увеличенное время свертывания крови. У крыс не наблюдали дополнительных нежелательных эффектов при использовании аналога I5NP, предназначенного для крыс, что указывало на то, что эти эффекты, вероятно, представляют собой эффекты, связанные с классом синтетических РНК-дуплексов, а не токсичностью, обусловленной целевой фармакологической активностью I5NP. Взятые вместе, эти данные согласуются с клиническим исследованием внутривенного введения I5NP для сохранения функции почек после повреждения, связанного с острой ишемией/реперфузией. Уровень, при котором не наблюдали нежелательных эффектов (NOAEL) у обезьян, составлял 500 мг/кг. Не наблюдали эффектов в отношении параметров сердечно-сосудистой, дыхательной и нервной системы у обезьян после внутривенного введения при уровнях дозы до 25 мг/кг. Следовательно, аналогичная доза может предусматриваться для внутривенного введения CRISPR-Cas в почки человека.

Shimizu и соавт. (J Am Soc Nephrol 21: 622-633, 2010) разработали систему для целенаправленной доставки siRNA в клубочки при помощи средств на основе полиэтиленгликоля и поли-L-лизина. Диаметр комплекса siRNA/наноноситель составлял от приблизительно 10-20 нм, причем данный размер будет позволять ему проходить через окончатый эндотелий для того, чтобы попасть в мезангий. После интраперитонеальной инъекции флуоресцентно меченых комплексов siRNA/наноноситель, Shimizu и соавт. выявляли siRNA в кровотоке в течение длительного времени. Повторное интраперитонеальное введение комплекса siRNA к митоген-активируемой протеинкиназе 1 (МАРК1)/наноноситель подавляло экспрессию мРНК и белка МАРК1 в клубочках в мышиной модели гломерулонефрита. Для исследования накопления siRNA Су5-меченые siRNA в комплексе с PIC наноносителями (0,5 мл, содержание siRNA 5 нмоль), "оголенные" Су5-меченые siRNA (0,5 мл, 5 нмоль) или Су5-меченые siRNA, инкапсулированные в HVJ-E (0,5 мл, содержание siRNA 5 нмоль), вводили мышам BALB-с. Способ согласно Shimizu и соавт. можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, что предусматривает дозу приблизительно 10-20 мкмоль CRISPR-Cas в комплексе с наноносителями на приблизительно 1-2 литра для интраперитонеального введения человеку и доставки в почки.

Легкие

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в одно легкое или оба легких.

Несмотря на то, что векторы на основе AAV-2 были изначально предложены для доставки CFTR в дыхательные пути при CF, другие серотипы, например, AAV-1, AAV-5, AAV-6 и AAV-9, демонстрировали улучшенную эффективность переноса генов в ряде моделей эпителия легких (см., например, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dec 2009). Как было продемонстрировано, AAV-1 являлся в ~100 раз более эффективным, чем AAV-2 и AAV-5 при трансдукции эпителиальных клеток дыхательных путей человека in vitro, хотя эффективность трансдукции при помощи AAV-1 эпителия воздухоносных путей трахеи мышей in vivo была равной таковой для AAV-5. Другие исследования продемонстрировали, что AAV-5 является в 50 раз более эффективным, чем AAV-2, при доставке генов в эпителий дыхательных путей человека (НАЕ) in vitro и значительно более эффективным в эпителии воздухоносных путей легких мышей in vivo. Также было продемонстрировано, что AAV-6 являлся более эффективным, чем AAV-2, в эпителиальных клетках дыхательных путей человека in vitro и дыхательных путях мышей in vivo. Как было показано, обнаруженный позже изолят, AAV-9, продемонстрировал большую эффективность переноса генов, чем AAV-5, в назальном и альвеолярном эпителии мышей in vivo, причем экспрессию гена выявляли в течение более 9 месяцев, что позволяет предположить, что AAV может обеспечивать длительную экспрессию генов in vivo, являющуюся необходимым свойством для вектора для доставки гена CFTR. Кроме того, было продемонстрировано, что AAV-9 можно повторно вводить в легкие мышей без потери экспрессии CFTR и с минимальными последствиями, связанными с иммунной системой. Культуры НАЕ с CF и без CF можно инокулировать на апикальной поверхности 100 мкл векторов AAV в течение нескольких часов (см., например, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dec 2009). MOI может варьировать от 1×10³ до 4×10⁵ векторных геномов/клетку, в зависимости от концентрации вируса и целей экспериментов. Упомянутые выше векторы предусматриваются для доставки и/или введения согласно настоящему изобретению.

Zamora и соавт. (Am J Respir Crit Care Med Vol 183. pp 531-538, 2011) представили пример применения терапевтического средства на основе РНК-интерференции для лечения инфекционных заболеваний человека, а также рандомизированного исследования противовирусного лекарственного средства у реципиентов трансплантата легкого, инфицированного респираторным синцитиальным вирусом (RSV). Zamora и соавт. провели рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование у реципиентов LTX с инфекцией дыхательных путей RSV. Пациентам давали возможность получать стандартное лечение RSV. ALN-RSV01 в форме аэрозоля (0,6 мг/кг) или плацебо вводили ежедневно в течение 3 дней. Это исследование продемонстрировало, что терапевтическое средство на основе RNAi, целенаправленно воздействующее на RSV, можно вводить без риска реципиентам LTX с инфекцией RSV. Три ежедневные дозы ALN-RSV01 не приводили в результате к какому-либо обострению симптомов в дыхательных путях или нарушению функции легких и не проявляли каких-либо системных провоспалительньгх эффектов, таких как индукция цитокинов или CRP. Фармакокинетические исследования продемонстрировали только низкий уровень временного системного воздействия после ингаляции, что согласуется с данными доклинических исследований на животных, демонстрирующих, что ALN-RSV01, вводимый внутривенно или путем ингаляции, подвергается быстрому клиренсу из кровотока при помощи опосредованного экзонуклеазами расщепления и почечной экскреции. Способ согласно Zamora и соавт. можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению и при этом CRISPR-Cas в форме аэрозоля, например, при дозе 0,6 мг/кг, может предусматриваться в соответствии с настоящим изобретением.

Что касается примера химерной направляющей РНК для CFTR с мутацией дельта-508, см. пример 22, в котором демонстрируется перенос генов или доставка генов системы CRISPR-Cas в дыхательные пути нуждающегося в этом субъекта или пациента, страдающего от муковисцидоза или от связанных с муковисцидозом (CF) симптомов, с использованием частиц аденоассоциированного вируса (AAV). В частности, на примере представлена стратегия репарации для мутации дельта-Р508 при муковисцидозе. Этот тип стратегии может применяться у всех организмов. В особенности, что касается CF, подходящие пациенты могут включать следующих: человек, не относящийся к человеку примат, собака, кошка, корова, лошадь и другие домашние животные. В этом случае заявители использовали систему CRISPR-Cas, содержащую фермент Cas9, для целенаправленного воздействия на дельта-F508 или другие мутации, индуцирующие CFTR.

Подвергающиеся лечению субъекты в данном случае получали фармацевтически эффективное количество векторной системы на основе AAV в форме аэрозоля на легкое, доставляемое эндобронхиально при самостоятельном дыхании. Таким образом, в общем, доставка в форме аэрозоля является предпочтительной для доставки с помощью AAV. Аденовирус или частицу AAV можно использовать для доставки. Подходящие конструкции с генами, каждый из которых функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, можно клонировать в вектор доставки. В этом случае следующие конструкции представлены в качестве примеров: промотор Cbh или EF1a для Cas9, промотор U6 или H1 для химерной направляющей РНК. Предпочтительной схемой является применение химерной направляющей последовательности, нацеливающей на CFTR с мутацией дельта-508, матрицы для репарации мутации дельта-F508 и кодон-оптимизированного фермента Cas9 (предпочтительными Cas9 являются ферменты с нуклеазной или никазной активностью) необязательно с одним или несколькими сигналами или последовательностями ядерной локализации (NLS), например, с двумя (2) NLS. Также предусматриваются конструкции без NLS.

Для идентификации целевого сайта Cas9 заявители анализировали локус CFTR генома человека и идентифицировали целевой сайт Cas9. Предпочтительно, как правило и в данном случае CF, РАМ может содержать мотив NGG или NNAGAAW.

Соответственно, в случае CF способ по настоящему изобретению предусматривает манипуляцию с целевой последовательностью в представляющем интерес локусе генома, включающую

доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей вирусную векторную систему, содержащую один или несколько вирусных векторов, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где композиция содержит

не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих

I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-CAS, где полинуклеотидная последовательность содержит

(a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью, связанной с CF, в подходящей клетке млекопитающего,

(b) парную tracr-последовательность и

(c) tracr-последовательность, и

II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,

где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации,

где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы,

где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и

где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью. Что касается CF, предпочтительные целевые последовательности ДНК содержат CFTR с мутацией дельта-508. Предпочтительный РАМ описан выше. Предпочтительным ферментом CRISPR является любой Cas (описанный в данном документе, но в особенности описанный в примере 22).

Альтернативы CF включают любое наследственное заболевание, и их примеры хорошо известны. Другим предпочтительным способом или применением согласно настоящему изобретению является коррекция дефектов в генах ЕМР2А и ЕМР2В, которые, как было идентифицировано, ассоциированы с болезнью Лафора.

В некоторых вариантах осуществления "направляющая последовательность" может отличаться от "направляющей РНК". Направляющей последовательностью может называться последовательность, составляющая приблизительно 20 п.о., в пределах направляющей РНК, которая определяет целевой сайт.

В некоторых вариантах осуществления Cas9 представляет собой (или происходит из) SpCas9. В этих вариантах осуществления предпочтительными мутациями являются мутации по любому или всем из положений 10, 762, 840, 854, 863 и/или 986 в SpCas9 или соответствующим положениям в других Cas9 (которые могут быть определены, например, при помощи стандартных инструментов сравнения последовательностей). В частности, любые или все из следующих мутаций являются предпочтительными для SpCas9: D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A и/или D986A; а также предусматривается консервативная замена для любого аминокислотного замещения. То же самое (или консервативные замены по этим мутациям) также является предпочтительным в соответствующих положениях других Cas9. Особенно предпочтительными являются D10 и Н840 в SpCas9. Однако в других Cas9 остатки, соответствующие D10 и Н840 SpCas9, также являются предпочтительными. Преимущественными являются те, которые обеспечивают никазную активность. Эти мутации можно применять согласно всем аспектам настоящего изобретения, не только для лечения CF.

Schwank и соавт. (Cell Stem Cell, 13:653-58, 2013) использовали CRISPR/Cas9 для коррекции дефекта, ассоциированного с муковисцидозом, в стволовых клетках человека. Целью исследователей являлся ген ионного канала, рецептора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR). Делеция в CFTR приводит к неправильной укладке белка у пациентов с муковисцидозом. С использованием культивируемых стволовых клеток кишечника, полученных из образцов клеток от двух детей с муковисцидозом, Schwank и соавт. могли скорректировать дефект с использованием CRISPR вместе с донорной плазмидой, содержащей репаративную последовательность, подлежащую вставке. Исследователи затем вырастили клетки до "органоидов" кишечника или кишок небольшого размера и продемонстрировали, что они нормально функционировали. В этом случае приблизительно половина клональных органоидов подвергалась надлежащей коррекции наследственного материала.

Мышцы

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в мышцу (мышцы).

Bortolanza и соавт. (Molecular Therapy vol. 19 no. 11, 2055-2064 Nov. 2011) продемонстрировали, что системная доставка кассет экспрессии для РНК-интерференции у мышей FRG1 после начала проявления плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии (FSHD) приводила к дозозависимому длительному нокдауну FRG1 без симптомов токсичности. Bortolanza и соавт. обнаружили, что однократная внутривенная инъекция 5×10¹² vg (векторных геномов) rAAV6-sh1FRG1 восстанавливает гистопатологические характеристики мышц и функцию мышц у мышей FRG1. Более подробно, 200 мкл, содержащие 2×10¹² или 5×10¹² vg вектора в физиологическом растворе, инъецировали в хвостовую вену с использованием шприца Terumo с иглой 25-ого калибра. Способ согласно Bortolanza и соавт.можно применять в отношении AAV, экспрессирующего CRISPR-Cas, и инъецировать его человеку в дозе приблизительно 2×10¹⁵ или 2×10¹⁶ vg вектора.

Dumonceaux и соавт. (Molecular Therapy vol. 18 no. 5, 881-887 May 2010) осуществляли ингибирование пути миостатина с применением методики РНК-интерференции, направленной против мРНК рецептора миостатина AcvRIIb (sh-AcvRIIb). Восстановление квази-дистрофина было опосредовано методикой направленного U7 пропуска экзона (U7-DYS). Векторы на основе аденоассоциированных вирусов, несущих либо только конструкцию sh-AcvrIIb, только конструкцию U7-DYS, либо комбинацию обеих конструкций, инъецировали в переднюю большеберцовую (ТА) мышцу мышей mdx с дистрофией. Инъекции осуществляли с использованием 10¹¹ геномов вируса AAV. Способ согласно Dumonceaux и соавт. можно применять в отношении AAV, экспрессирующего CRISPR-Cas, и вводить его человеку путем инъекции, например, при дозе от приблизительно 10¹⁴ до приблизительно 10¹⁵ vg вектора.

Kinouchi и соавт. (Gene Therapy (2008) 15, 1126-1130) сообщили об эффективности доставки siRNA in vivo в скелетные мышцы нормальных или больных мышей посредством образования наночастиц из химически не модифицированной siRNA с ателоколлагеном (ATCOL). ATCOL-опосредованное местное применение siRNA, целенаправленно воздействующей на миостатин, отрицательный регулятор роста скелетных мышц, при введении в скелетные мышцы мышей или внутривенно приводило к существенному увеличению мышечной массы в течение нескольких недель после применения. Эти результаты указывают на то, что ATCOL-опосредованное применение siRNA является мощным инструментом для дальнейшего терапевтического применения для лечения заболеваний, в том числе мышечной атрофии. Mst-siRNA (конечная концентрация, 10 мМ) смешивали с ATCOL (конечная концентрация для местного введения, 0,5%) (AteloGene, Kohken, Токио, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. После анестезии мышей (самцы C57BL/6 в возрасте 20 недель) при помощи нембутала (25 мг/кг, интраперитонеально) комплекс Mst-siRNA/ATCOL инъецировали в жевательные мышцы и двуглавую мышцу бедра. Способ согласно Kinouchi и соавт. можно применять в отношении CRISPR-Cas и вводить ее человеку путем инъекции, например, в дозе от приблизительно 500 до 1000 мл 40 мкМ раствора в мышцу.

Hagstrom и соавт. (Molecular Therapy Vol. 10, No. 2, August 2004) описывали интраваскулярную методику без использования вируса, которая обеспечивает эффективную и воспроизводимую доставку нуклеиновых кислот в мышечные клетки (мышечные волокна) мышц конечности млекопитающих. Методика включает инъекцию "оголенной" плазмидной ДНК или siRNA в вену дистальной части конечности, временно изолированную при помощи жгута или пневматической манжеты. Доставка нуклеиновой кислоты в мышечные волокна обеспечивается ее быстрой инъекцией в объеме, достаточном для обеспечения просачивания раствора нуклеиновой кислоты в мышечную ткань. Высокие уровни экспрессии трансгена в скелетной мышце достигались как у мелких, так и у крупных животных при минимальной токсичности. Также были получены доказательства доставки siRNA в мышцу конечности. Для внутривенной инъекции плазмидной ДНК макаку-резусу трехходовый кран присоединяли к двухшприцевым насосам (Model PHD 2000; Harvard Instruments), в каждый из которых помещали один шприц. Через пять минут после инъекции папаверина инъецировали pDNA (15,5-25,7 мг в 40-100 мл солевого раствора) при скорости 1,7 или 2,0 мл/с. Это можно воспроизводить в увеличенном масштабе для плазмидной ДНК, экспрессирующей CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, с инъекцией человеку от приблизительно 300 до 500 мг в 800-2000 мл солевого раствора. В случае инъекции аденовирусного вектора крысе инъецировали 2×10⁹ инфекционных частиц в 3 мл физиологического солевого раствора (NSS). Это можно воспроизводить в увеличенном масштабе для аденовирусного вектора, экспрессирующего CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, с инъекцией человеку приблизительно 1×10¹³ инфекционных частиц в 10 литрах NSS. В случае siRNA крысе инъецировали в большую подкожную вену 12,5 мкг siRNA, а примату инъецировали в большую подкожную вену 750 мкг siRNA. Это можно воспроизводить в увеличенном масштабе для CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, например, с инъекцией от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг в большую подкожную вену человека.

Кожа

Настоящее изобретение также предусматривает доставку системы CRISPR-Cas в кожу.

Работа Hickerson и соавт. (Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e129) имеет отношение к снабженному приводом устройству с матрицей микроигл для доставки в кожу, предназначенному для самостоятельной (sd) доставки siRNA в кожу человека и мыши. Основной проблемой, связанной с переносом терапевтических средств на основе siRNA для кожи, в клиническую практику, является разработка эффективных систем доставки. Значительные усилия были приложены к созданию ряда методик доставки в кожу при ограниченном успехе. В клиническом исследовании, в котором кожу обрабатывали siRNA, острая боль, связанная с инъекцией при помощи иглы для подкожных инъекций, препятствовала включению дополнительных пациентов в исследование, что придает большое значение потребности в улучшенных, более "удобных для пациента" (т.е. причиняющих слабую боль или не причиняющих ее) средствах доставки. Микроиглы представляют эффективный способ доставки крупных заряженных молекул-карго, включающих siRNA, через первичный барьер, роговой слой, и, как правило, считаются причиняющими меньшую боль, чем обычные иглы для подкожных инъекций. Снабженные приводом устройства "штамповочного типа" с микроиглами, в том числе снабженное приводом устройство с матрицей микроигл (MMNA), используемое Hickerson и соавт., как было продемонстрировано, были безопасными в исследованиях на бесшерстных мышах и причиняли слабую боль или не причиняли боли, о чем свидетельствует (i) широкое применение в косметологии и (ii) ограниченное тестирование, в котором практически все добровольцы считали применение устройства причиняющим намного меньшую боль, чем при вакцинации против гриппа, что позволяет предположить, что доставка siRNA с применением этого устройства будет намного менее болезненной, чем испытываемая в предшествующих клинических исследованиях с применением игл для подкожных инъекций. Устройство MMNA (продаваемое как Triple-М или Tri-M от Bomtech Electronic Со, Сеул, Южная Корея) приспособили для доставки siRNA в кожу мыши и человека. Раствор sd-siRNA (до 300 мкл с 0,1 мг/мл РНК) вводили в камеру одноразового инъекционного картриджа с иглами Tri-M (Bomtech), которые устанавливали на глубину 0,1 мм. Для обработки кожи человека деидентифицированную кожу (полученную непосредственно после хирургических процедур) растягивали вручную и прикалывали к пробковому столу перед обработкой. Все интрадермальные инъекции осуществляли при помощи инсулинового шприца с иглой 28 калибра на 0,5 дюйма. Устройство MMNA и способ согласно Hickerson и соавт. можно применять и/или приспосабливать для доставки CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению, например, в дозе до 300 мкл 0,1 мг/мл CRISPR-Cas, в кожу.

Работа Leachman и соавт. (Molecular Therapy, vol. 18 no. 2, 442-446 Feb. 2010) имеет отношение к клиническому исследованию фазы Ib, направленному на лечение редкого кожного заболевания врожденной пахионихии (PC), аутосомно-доминантного синдрома, которое предусматривает блокирование подошвенной кератодермии, с использованием первого терапевтического средства на основе короткой интерферирующей РНК (siRNA) для кожи. Эта siRNA, под названием TD101, специфично и эффективно целенаправленно воздействует на мРНК мутантного кератина 6а (K6а) N171К, не оказывая влияния на мРНК K6а дикого типа. Схема с повышением дозы представлена ниже:

Вначале 0,1 мл 1,0 мг/мл раствора TD101 или только среды (фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко без кальция или магния) вводили в симметрично расположенные мозоли. Осуществляли введение шести возрастающих объемов дозы без нежелательной реакции на увеличения: 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 мл 1,0 мг/мл раствора TD101 на инъекцию. Так как наиболее высокий запланированный объем (2,0 мл) был хорошо переносим, концентрацию TD101 затем увеличивали каждую неделю от 1 мг/мл до конечной концентрации 8,5 мг/мл. Аналогичные дозы предусматриваются для введения CRISPR-Cas, которая специфично и эффективно целенаправленно воздействует на мРНК мутантного кератина 6а (K6а) N171K.

Zhang и соавт. (PNAS, July 24, 2012, vol. 109, no. 30, 11975-11980) продемонстрировали, что конъюгаты сферических наночастиц с нуклеиновой кислотой (SNA-NC), причем ядра из золота, окружены плотной оболочкой из строго ориентированных, ковалентно иммобилизованных siRNA, свободно проникают практически в 100% кератиноцитов in vitro, в кожу мыши и в эпидермис человека в течение нескольких часов после применения. Zheng и соавт. продемонстрировали, что однократное применение 25 нМ SNA-NC к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) в течение 60 ч демонстрировало эффективный нокдаун гена в коже человека. Аналогичная доза может предусматриваться для CRISPR-Cas, иммобилизованной в SNA-NC для введения в кожу.

Вирусы гепатита

Настоящее изобретение также можно применять для лечения вируса гепатита В (HBV). Однако система CRISPR-Cas должна быть приспособлена для того, чтобы избежать недостатков RNAi, таких как риск перенасыщения эндогенных путей малых РНК, с помощью, например, оптимизации дозы и последовательности (см., например, Grimm et al., Nature vol. 441, 26 May 2006). Например, предусматриваются низкие дозы, такие как приблизительно 1-10×10¹⁴ частиц на человека.

В другом варианте осуществления систему CRISPR-Cas, направленную против HBV, можно вводить в липосомах, таких как стабильная частица из нуклеиновой кислоты и липидов (SNALP) (см., например, Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005). Предусматриваются ежедневные внутривенные инъекции приблизительно 1, 3 или 5 мг/кг/день CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на РНК HBV, в SNALP. Ежедневное лечение можно осуществлять в течение приблизительно трех дней и затем еженедельно в течение приблизительно пяти недель.

В другом варианте осуществления систему согласно Chen и соавт. (Gene Therapy (2007) 14, 11-19) можно применять в системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней. Chen и соавт. использовали двухнитевой псевдотипированный вектор на основе аденоассоциированного вируса 8 (dsAAV2/8) для доставки shRNA. Однократное введение вектора dsAAV2/8 (1×10¹² векторных геномов на мышь), несущего специфичную к HBV shRNA, эффективно подавляло стабильный уровень белка, мРНК и репликационной ДНК HBV в печени трансгенных мышей с HBV, что приводило к снижению нагрузки HBV в кровотоке на вплоть до 2-3 log₁₀. Значительное подавление HBV продолжалось в течение по меньшей мере 120 дней после введения вектора. Терапевтический эффект shRNA зависел от целевой последовательности и не приводил к активации интерферона. В соответствии с настоящим изобретением систему CRISPR-Cas, направленную в отношении HBV, можно клонировать в вектор на основе AAV, например, вектор на основе dsAAV2/8, и вводить человеку, например, в дозе от приблизительно 1×10¹⁵ векторных геномов до приблизительно 1×10¹⁶ векторных геномов на человека.

В другом варианте осуществления способ согласно Wooddell и соавт. (Molecular Therapy vol. 21 no. 5, 973-985 May 2013) можно применять в системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению и/или приспосабливать к ней. Woodell и соавт. продемонстрировали, что простая совместная инъекция целенаправленно воздействующего на гепатоциты, конъюгированного с N-ацетилгалактозамином мелиттин-подобного пептида (NAG-MLP) с тропной к печени конъюгированной с холестерином siRNA (chol-siRNA), целенаправленно воздействующей на фактор коагуляции VII (F7), приводит в результате к эффективному нокдауну F7 у мышей и приматов, отличных от человека, без изменений клинических химических показателей или индукции цитокинов. С использованием временных и трансгенных мышиных моделей инфекции HBV, Wooddell и соавт. продемонстрировали, что однократная совместная инъекция NAG-MLP с активной chol-siRNA, целенаправленно воздействующей на консервативные последовательности HBV, приводила в результате к многократной репрессии вирусной РНК, белков и вирусной ДНК с большой продолжительностью эффекта. Внутривенные совместные инъекции, например, приблизительно 6 мг/кг NAG-MLP и 6 мг/кг специфичной к HBV CRISPR-Cas могут предусматриваться в соответствии с настоящим изобретением. В альтернативном случае приблизительно 3 мг/кг NAG-MLP и 3 мг/кг специфичной к HBV CRISPR-Cas могут доставляться в первый день с последующим введением приблизительно 2-3 мг/кг NAG-MLP и 2-3 мг/кг специфичной к HBV CRISPR-Cas две недели спустя.

Настоящее изобретение также можно применять для лечения вируса гепатита С (HCV). Способы согласно Roelvinki и соавт. (Molecular Therapy vol. 20 no. 9, 1737-1749 Sep 2012) можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas. Например, вектор на основе AAV, такого как AAV8, может быть предполагаемым вектором и может предусматриваться, например, доза от приблизительно 1,25×10¹¹ до 1,25×10¹³ векторных геномов на килограмм массы тела (vg/кг).

В еще одном варианте осуществления редактирование генома, опосредованное CRISPR-Cas9, можно применять для коррекции мутации и/или фенотипа, связанных с заболеванием. Это редактирование генома, опосредованное CRISPR-Cas9, можно применять для коррекции мутации и/или фенотипа, связанных с заболеванием, в печени и/или гепатоцитах, что проиллюстрировано в рукописи Нао Yin и соавт. под названием "Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype", опубликованной в Nature Biotechnology, опубликованной в режиме онлайн 30 марта 2014 г.; исправленной в режиме онлайн 31 марта 2014 г., доступной на веб-сайте nature.com/doifinder/10.1038/nbt.2884, включенной в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. Данная статья относится к опосредованной CRISPR-Cas9 коррекции мутации Fah в гепатоцитах в мышиной модели заболевания человека, врожденной тирозинемии. Было показано, что доставка компонентов системы CRISPR-Cas9 с помощью гидродинамической инъекции приводила к исходному уровню экспрессии белка Fah дикого типа в ~1/250 клеток печени. Было дополнительно показано, что размножение Fah-положительных гепатоцитов избавляло от фенотипа потери массы тела.

Будет очевидно, что организм-хозяин с другими заболеваниями можно лечить подобным образом. Некоторые примеры наследственных заболеваний, вызванных мутациями, приведены в данном документе, но известно их намного больше. Изложенную выше стратегию можно применять для лечения этих заболеваний.

Болезнь Гентингтона (HD)

РНК-интерференция (RNAi) предоставляет терапевтические возможности для лечения этого нарушения посредством уменьшения экспрессии НТТ, гена, приводящего к развитию болезни Гентингтона (см., например, McBride et al., Molecular Therapy vol. 19 no. 12 Dec. 2011, pp. 2152-2162), следовательно, заявитель предполагает, что ее можно использовать с системой CRISPR-Cas и/или приспособить к ней. Систему CRISPR-Cas можно получить с использованием алгоритма для уменьшения возможности нецелевого воздействия антисмысловых последовательностей. Последовательности CRISPR-Cas могут целенаправленно воздействовать на последовательность в экзоне 52 гентингтина мыши, макака-резуса или человека и экспрессироваться вирусным вектором, например, на основе AAV. Животным, в том числе человеку, можно вводить приблизительно три микроинъекции на полушарие (всего шесть инъекций): первую на 1 мм ростральнее передней комиссуры (12 мкл) и две оставшиеся инъекции (12 мкл и 10 мкл, соответственно) на расстоянии 3 и 6 мм каудальнее по отношению к первой инъекции, с 1e12 vg/мл AAV при скорости приблизительно 1 мкл/минуту, при этом иглу оставляли на месте в течение дополнительных 5 минут для обеспечения диффузии вводимого вещества с наконечника иглы.

DiFiglia и соавт. (PNAS, October 23, 2007, vol. 104, no. 43, 17204-17209) наблюдали, что однократное введение в полосатое тело взрослого организма siRNA, целенаправленно воздействующей на Htt, может привести к сайленсингу Htt, ослаблению нейрональной патологии и задержке развития аномального поведенческого фенотипа, наблюдаемого в модели HD на трансгенных мышах, полученной с использованием вируса, с быстрым началом проявления. DiFiglia инъецировал мышам в полосатое тело 2 мкл Су3-меченых cc-siRNA-Htt или неконъюгированных siRNA-Htt при 10 мкМ. Аналогичная доза CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt, может предусматриваться в настоящем изобретении для человека, например, приблизительно 5-10 мл 10 мкМ CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt, можно инъецировать в полосатое тело.

В другом примере Boudreau и соавт. (Molecular Therapy vol. 17 no. 6 June 2009) инъецировали 5 мкл рекомбинантных векторов на основе вируса AAV серотипа 2/1, экспрессирующих htt-специфичный вирус для RNAi (при 4×10¹² вирусных геномов/мл) в полосатое тело. Аналогичная доза CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt, может предусматриваться в настоящем изобретении для человека, например, от приблизительно 10 до 20 мл 4×10¹² вирусных геномов/мл), причем CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующую на Htt, можно инъецировать в полосатое тело.

В другом примере CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующую на НТТ, можно вводить непрерывно (см., например, Yu et al., Cell 150, 895-908, August 31, 2012). Yu и соавт. использовали доставку при помощи осмотических насосов, обеспечивающих скорость 0,25 мл/ч (модель 2004), для доставки 300 мг/день ss-siRNA или фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (Sigma Aldrich) в течение 28 дней, и насосы, выполненные с возможностью доставки 0,5 мкл/ч (модель 2002), использовали для доставки 75 мг/день МОЕ ASO положительного контроля в течение 14 дней. Насосы (Durect Corporation) заполняли ss-siRNA или МОЕ, разведенным стерильным PBS, а затем инкубировали при 37°С в течение 24 или 48 (Model 2004) часов перед имплантацией. Мышей анестезировали 2,5% изофлураном и делали срединный разрез у основания черепа. Используя стереотаксические зонды, имплантировали канюлю в боковой правый желудочек и закрепляли при помощи клея Loctite. Катетер, прикрепленный к осмотическому мининасосу Alzet, прикрепляли к канюле, и насос размещали подкожно между лопатками. Разрез закрывали швами, используя нейлон 5,0. Аналогичная доза CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt, может предусматриваться в настоящем изобретении для человека, например, можно вводить от приблизительно 500 до 1000 г/день CRISPR Cas, целенаправленно воздействующей на Htt.

В другом примере непрерывной инфузии Stiles и соавт. (Experimental Neurology 233 (2012) 463-471) имплантировали интрапаренхиматозный катетер с титановым наконечником иглы в правую скорлупу. Катетер присоединяли к насосу SynchroMed® II (Medtronic Neurological, Миннеаполис, Миннесота), подкожно имплантированному в области живота. После 7 дней инфузии фосфатно-солевого буферного раствора при 6 мкл/день насосы повторно заполняли исследуемым препаратом и программировали на непрерывную доставку в течение 7 дней. От приблизительно 2,3 до 11,52 мг/день siRNA вводили путем инфузии при различных значениях скорости инфузии, составляющих приблизительно 0,1-0,5 мкл/мин. Аналогичная доза CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt, может предусматриваться в настоящем изобретении для человека, например, можно вводить от приблизительно 20 до 200 мг/день CRISPR-Cas, целенаправленно воздействующей на Htt.

В другом примере способы согласно публикации патентного документа США №20130253040, закрепленного за Sangamo, также можно адаптировать, исходя из TALES к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению для лечения болезни Гентингтона.

Нуклеиновые кислоты, аминокислоты и белки

В настоящем изобретении нуклеиновые кислоты используются для связывания целевых последовательностей ДНК. Это является преимущественным, поскольку получать нуклеиновые кислоты намного легче и дешевле, чем белки, и их специфичность можно варьировать в зависимости от длины фрагмента, если необходима гомология. Например, не требуется сложное 3D-определение положений многочисленных доменов.

Выражения "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используют взаимозаменяемо. Они обозначают полимерную форму нуклеотидов любой длины, как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут обладать любой пространственной структурой и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие: кодирующие или некодирующе участки гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные в результате анализа сцепления, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, короткая интерферирующая РНК (siRNA), короткая шпилечная РНК (shRNA), микроРНК (miRNA), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенные ДНК любой последовательности, выделенные РНК любой последовательности, нуклеиновые кислоты-зонды и праймеры. Выражение также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими каркасами из WO 97/03211 и WO 96/39154. Полинуклеотид может содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, как, например, метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. При наличии, модификации в нуклеотидную структуру могут быть внесены до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться отличными от нуклеотидов компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, как, например, путем конъюгации с компонентом для мечения.

Используемое в данном документе выражение "дикий тип" является выражением из данной области, понятным специалисту в данной области, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристики, которые встречаются в природе в отличие от мутантных или вариантных форм.

Используемое в данном документе выражение "вариант" следует понимать как означающее проявление качеств, которые характеризуются паттерном, который отличается от такового, встречающегося в природе.

Выражение "не встречающийся в природе" или "сконструированный" используют взаимозаменяемо, и оно указывает на вмешательство человека. Выражения, в тех случаях, когда они касаются молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере практически не содержат по меньшей мере один отличный компонент, с которым они естественным образом связаны в природе и встречаются в природе.

"Комплементарность" означает способность нуклеиновой кислоты образовывать водородную(водородные) связь(связи) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты при помощи либо традиционного спаривания оснований по Уотсону-Крику, либо других нетрадиционных типов. Процентное значение комплементарности показывает процентное значение остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (к примеру, спаривание оснований по Уотсону-Крику) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (к примеру, при этом 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 будут на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарны). "Точная комплементарность" означает, что все непрерывные остатки последовательности нуклеиновой кислоты будут связаны водородными связями с таким же количеством непрерывных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. Используемое в данном документе выражение "практически комплементарный" означает степень комплементарности, которая составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% в пределах участка из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов, или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибридизируются при жестких условиях.

Используемые в данном документе "жесткие условия" в отношении гибридизации означают условия, при которых нуклеиновая кислота с комплементарностью к целевой последовательности преимущественно гибридизируется с целевой последовательностью и практически не гибридизируется с нецелевыми последовательностями. Жесткие условия,

как правило, являются зависимыми от последовательности и изменяются в зависимости от ряда факторов. В общем, чем длиннее последовательность, тем выше температура, при которой последовательность специфично гибридизируется со своей целевой последовательностью. Неограничивающие примеры жестких условий описаны подробно в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y. Если предполагается полинуклеотидная последовательность, то т акже предусматриваются комплементарные или частично комплементарные последовательности. Они предпочтительно способны гибридизироваться с эталонной последовательностью при очень жестких условиях. Как правило, для доведения до максимума скорости гибридизации, выбирают условия гибридизации относительно низкой жесткости: температура на приблизительно 20-25°С ниже температуры точки плавления (Т_m). Т_m представляет собой температуру, при которой 50% специфичной целевой последовательности гибридизируется с точно комплементарным зондом в растворе при определенной ионной силе и рН. Как правило, если требуется по меньшей мере приблизительно 85% нуклеотидная комплементарность гибридизированных последовательностей, выбирают очень жесткие условия отмывки с температурой на приблизительно 5-15°С ниже, чем Т_m. Если требуется по меньшей мере приблизительно 70% нуклеотидная комплементарность гибридизированных последовательностей, выбирают умеренно жесткие условия отмывки с температурой на приблизительно 15-30°С ниже, чем Т_m. Высоко пермиссивные (очень низкой жесткости) условия отмывки могут характеризоваться температурой, которая вплоть до 50°С ниже Т_m, что допускает высокий уровень ошибочных совпадений между гибридизированными последовательностями. Специалисты в данной области поймут, что другие физические и химические параметры на стадиях гибридизации и отмывки также можно изменять для того, чтобы повлиять на получаемый в результате выявляемый сигнал гибридизации, исходя из конкретного уровня гомологии между целевой последовательностью и последовательностью зонда. Предпочтительные условия высокой жесткости предусматривают инкубирование в 50% формамиде, 5×SSC и 1% SDS при 42°С или инкубирование в 5×SSC и 1% SDS при 65°С с отмывкой в 0,2×SSC и 0,1% SDS при 65°С.

"Гибридизация" означает реакцию, при которой один или несколько полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется посредством образования водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Образование водородных связей может происходить по принципу спаривания оснований по Уотсону-Крику, Хугстиновского связывания или любым другим специфичным к последовательности образом. Комплекс может содержать две нити, образующие дуплексную структуру, три или более нитей, образующих многонитевой комплекс, одиночную самогибридизирующуюся нить или любую их комбинацию. Реакция гибридизации может представлять собой стадию в более обширном способе, таком как начальная стадия ПЦР или расщепление полинуклеотида при помощи фермента. Последовательность, способную гибридизироваться с данной последовательностью, называют "комплементарной последовательностью" для данной последовательности.

Используемое в данном документе выражение "локус генома" или "локус" (форма множественного числа локусы) представляет собой конкретное положение гена или последовательности ДНК на хромосоме. "Ген" относится к фрагментам ДНК или РНК, которые кодируют цепь полипептида или РНК, которые играют функциональную роль в организме, и, следовательно, он представляет собой молекулярную единицу наследственности в живых организмах. Для цели настоящего изобретения может считаться, что гены содержат участки, которые регулируют образование продукта гена, независимо от того, являются ли регуляторные последовательности смежными с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями или нет. Соответственно, ген содержит, но без обязательного ограничения, промоторные последовательности, терминаторы, последовательности регуляции трансляции, например, участки связывания рибосомы и участки внутренней посадки рибосомы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, граничные элементы, точки начала репликации, участки прикрепления к матриксу и регуляторные участки локуса.

Используемое в данном документе выражение "экспрессия локуса генома" или "экспрессия гена" относится к процессу, в ходе которого информация гена используется в синтезе функционального продукта гена. Продукты экспрессии генов часто представляют собой белки, но у генов, не кодирующих белки, например, генов рРНК или генов тРНК, продукт представляет собой функциональную РНК. Процесс экспрессии генов используется всеми известными живыми организмами - эукариотами (в том числе многоклеточными организмами), прокариотами (бактериями и археями) и вирусами - для образования функциональных продуктов, необходимых для выживания. Используемое в данном документе выражение "экспрессия" гена или нуклеиновой кислоты охватывает не только экспрессию генов в клетках, но также транскрипцию и трансляцию нуклеиновой(нуклеиновых) кислоты(кислот) в системах клонирования и в любом другом контексте. Используемое в данном документе выражение "экспрессия" также означает процесс, посредством которого полинуклеотид транскрибируется с ДНК-матрицы (как, например, с образованием мРНК или другого РНК-транскрипта), и/или процесс, при помощи которого транскрибированная мРНК далее транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и закодированные полипептиды можно в совокупности называть "продуктом гена". Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, то экспрессия может включать сплайсинг мРНК в эукариотической клетке.

Выражения "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в данном документе для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его структура может прерываться отличными от аминокислот компонентами. Выражения также охватывают полимер из аминокислот, который был модифицирован; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией, такой как конъюгация с компонентом для мечения. Используемое в данном документе выражение "аминокислота" включает природные и/или отличные от природных или синтетические аминокислоты, в том числе глицин и как D-, так и L-оптические изомеры, и аналоги аминокислот, и пептидомиметики.

Используемое в данном документе выражение "домен" или "домен белка" относится к части последовательности белка, которая может существовать и функционировать независимо от остальной части белковой цепи.

Как описано в аспектах согласно настоящему изобретению, идентичность последовательности относится к гомологии последовательности. Сравнения гомологии можно проводить на глаз или, что делается чаще, с помощью легко доступных программ для сравнения последовательностей. При помощи этих коммерчески доступных компьютерных программ можно рассчитывать процент (%) гомологии между двумя или более последовательностями и также можно рассчитывать идентичность последовательности между двумя или более последовательностями аминокислот или нуклеиновых кислот. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления участок кэпирования dTALE, описанный в данном документе, имеет последовательности, по меньшей мере на 95% идентичные или обладающие идентичностью с участком кэпирования аминокислотных последовательностей, представленных в данном документе.

Значения гомологии последовательности можно получить при помощи любой из ряда компьютерных программ, известных в данной области техники, например, BLAST или FASTA и т.д. Подходящей компьютерной программой для осуществления такого выравнивания является пакет программ GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Примеры другого программного обеспечения, при помощи которого можно осуществлять сравнения последовательностей, включают, без ограничения, пакет программ BLAST (см. Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) и набор инструментов для сравнения GENEWORKS. Как в BLAST, так и в FASTA доступны оффлайн- и онлайн-поиск (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 - 7-60). Однако, предпочтительным является использование программы GCG Bestfit.

Процентное значение (%) гомологии последовательности можно рассчитывать для непрерывных последовательностей, т.е. одну последовательность выравнивают с другой последовательностью и каждую аминокислоту или нуклеотид в одной последовательности непосредственно сравнивают с соответствующей аминокислотой или нуклеотидом в другой последовательности, один остаток за один раз. Это называется выравниванием "без гэпов". Как правило, такие выравнивания без гэпов осуществляют только для относительно малого числа остатков.

Несмотря на то, что этот способ является очень простым и последовательным, при его применении не учитывается то, что, например, в паре последовательностей, которые в остальном являются идентичными, одна вставка или делеция может привести к тому, что следующие за ней аминокислотные остатки не будут учитываться при выравнивании, что, таким образом, потенциально приводит в результате к значительному уменьшению % гомологии при осуществлении глобального выравнивания. Следовательно, большинство способов сравнения последовательностей разработаны для получения оптимальных выравниваний, в которых учитываются возможные вставки и делеции без наложения чрезмерного штрафа на общую гомологию или балл идентичности. Это достигается путем вставки "гэпов" в выравнивание последовательностей в попытке доведения до максимума локальной гомологии или идентичности.

Однако в этих более сложных способах назначаются "штрафы за внесения гэпа" для каждого гэпа, который встречается при выравнивании, таким образом, для одинакового количества идентичных аминокислот выравнивание последовательностей с наименьшим количеством гэпов, что отражает более высокую степень родства между двумя сравниваемыми последовательностями, может привести в результате к более высокому баллу, чем выравнивание с большим количеством гэпов. Как правило, используют "значения аффинного штрафа за внесение гэпа для родственных последовательностей", с использованием которых начисляют относительно высокое значение за существование гэпа и меньший штраф за каждый последующий остаток в гэпе. Это наиболее часто используемая система оценки гэпов. Высокие штрафы за внесение гэпа, конечно, могут привести к оптимизированным выравниваниям с меньшим количеством гэпов. В большинстве программ выравнивания допускается изменение штрафов за внесение гэпа. Однако предпочтительно использовать значения по умолчанию при использовании такого программного обеспечения для сравнений последовательностей. Например, при использовании пакета программ GCG Wisconsin Bestfit штраф за внесение гэпа по умолчанию для аминокислотной последовательности составляет -12 для гэпа и -4 за каждый остаток его продолжения.

Для расчета максимального % гомологии, следовательно, изначально требуется получение оптимального выравнивания с учетом штрафов за внесение гэпа. Подходящая компьютерная программа для осуществления такого выравнивания представляет собой пакет программ GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p 387). Примеры другого программного обеспечения, при помощи которого можно осуществлять сравнения последовательностей, включают, без ограничения, пакет программ BLAST (см. Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed. - Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) и набор инструментов для сравнения GENEWORKS. Как в BLAST, так и в FASTA доступны оффлайн- и онлайн-поиск (см. Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 - 7-60). Однако для некоторых задач предпочтительно использовать программу GCG Bestfit. Новый инструмент под названием BLAST 2 Sequences также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8 и веб-сайт Национального центра биотехнологической информации на веб-сайте Национального института здравоохранения).

Несмотря на то, что конечный % гомологии можно измерять в единицах идентичности, способ выравнивания сам по себе, как правило, не основывается на сравнении пар по типу "все или ничего". Вместо этого, как правило, используется матрица замен со шкалой сходства, с использованием которой назначаются баллы для каждого попарного сравнения на основании химического сходства или эволюционного расстояния. Примером этой матрицы, используемой чаще всего, является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. В программах GCG Wisconsin, как правило, используются общедоступные значения по умолчанию или специальные таблицы сравнения символов, если они предоставляются (дополнительные подробности см. в руководстве пользователя). Для некоторых задач предпочтительным является применение общедоступных значений по умолчанию для пакета программ GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицы по умолчанию, например, BLOSUM62.

В альтернативном случае процентные значения гомологии можно рассчитывать с использованием функции множественного выравнивания в DNASIS™ (Hitachi Software) с применением алгоритма, аналогичного CLUSTAL (Higgins DG & Sharp РМ (1988), Gene 73(1), 237-244). После того, как программное обеспечение предоставит оптимальное выравнивание, возможно рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. Программное обеспечение, как правило, осуществляет это в ходе сравнения последовательностей и выдает численный результат.

Последовательности также могут иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые приводят к молчащему изменению и приводят в результате к функционально эквивалентному веществу. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть сделаны на основании сходства свойств аминокислот (например, полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков), и, следовательно, они являются применимыми для того, чтобы сгруппировать аминокислоты в функциональные группы. Аминокислоты можно сгруппировать на основании свойств только их боковых цепей. Однако также более полезно включить данные о мутациях. Группы аминокислот, полученные таким образом, вероятно, будут консервативными по структурным причинам. Эти группы могут быть описаны в форме диаграммы Венна (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Консервативные замены могут быть сделаны, например, в соответствии с таблицей, представленной ниже, в которой описывается общепринятая группировка аминокислот в форме диаграммы Венна.

Варианты осуществления согласно настоящему изобретению охватывают последовательности (как полинуклеотидные, так и полипептидные), которые могут содержать гомологичную замену (используемые в данном документе как замена, так и замещение означают обмен существующего аминокислотного остатка или нуклеотида на альтернативный остаток или нуклеотид), которая может происходить, т.е., в случае аминокислот, замену на аналогичную, например, основной на основную, кислой на кислую, полярной на полярную и т.д. Также может происходить негомологичная замена, т.е. остатка из одного класса на остаток из другого или, в альтернативном случае, связанная с включением аминокислот, отличных от природных, например, орнитина (далее в данном документе называемого Z), орнитиндиаминомасляной кислоты (далее в данном документе называемой В), норлейцинорнитина (далее в данном документе называемого О), пиридилаланина, тиенилаланина, нафтилаланина и фенилглицина.

Вариантные аминокислотные последовательности могут содержать подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, в том числе алкильные группы, например, метальную, этильную или пропильную группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как глициновые или β-аланиновые остатки. Другая форма вариации, которая включает присутствие одного или нескольких аминокислотных остатков в пептоидной форме, может быть хорошо понятна специалистам в данной области. Для того, чтобы избежать неопределенности, "пептоидная форма" используется для обозначения вариантных аминокислотных остатков, где замещающая группа для α-углерода расположена на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в пептоидной форме известны из уровня техники, например, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371, и Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

Практическое применение настоящего изобретения предусматривает, если не указано иное, традиционные методики иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и технологию рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области. См. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al. eds., (1987)); серия METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL и ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Векторы

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает векторы, которые применяются при конструировании и оптимизации систем CRISPR-Cas.

Как используется в данном документе, "вектор" представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает перенос объекта из одной среды в другую. Он представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в который может быть встроен другой сегмент ДНК для осуществления таким образом репликации встроенного сегмента. Как правило, вектор способен к репликации, если ассоциирован с соответствующими регуляторными элементами. В целом, выражение "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы включают, без ограничения, молекулы нуклеиновых кислот, которые являются однонитевыми, двухнитевыми или частично двухнитевыми; молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат один или несколько свободных концов, не содержат свободных концов (к примеру, кольцевые); молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат ДНК, РНК или и ту, и другую; и другие разновидности полинуклеотидов, известных из уровня техники. Одним типом вектора является "плазмида", которая означает кольцевую петлю двухнитевой ДНК, в которую можно встраивать дополнительные сегменты ДНК, как, например, при помощи стандартных технологий молекулярного клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, где полученные из вируса последовательности ДНК или РНК присутствуют в векторе для упаковки в вирус (к примеру, ретровирусы, ретровирусы с дефектной системой репликации, аденовирусы, аденовирусы с дефектной системой репликации и аденоассоциированные вирусы (AAV)). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусами для трансфекции клетки-хозяина. Определенные векторы способны к саморегулируемой репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (к примеру, бактериальные векторы с бактериальной точкой начала репликации и эписомные векторы для млекопитающих). Другие векторы (к примеру, неэписомные векторы для млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются наряду с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе называют "векторами экспрессии". Общепринятые пригодные в технологиях рекомбинантной ДНК векторы экспрессии часто находятся в форме плазмид.

Рекомбинантные векторы экспрессии могут содержать нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные векторы экспрессии включают один или несколько регуляторных элементов, которые могут быть выбраны с учетом клеток-хозяев, которые предполагается использовать для экспрессии, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, экспрессия которой предполагается. В контексте рекомбинантного вектора экспрессии выражение "функционально связанный" предназначено означать, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторным(регуляторными) элементом(элементами) таким образом, при котором обеспечивается возможность экспрессии нуклеотидной последовательности (к примеру, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор вводят в клетку-хозяина). Что касается способов рекомбинации и клонирования, следует упомянуть заявку на патент США №10/815730, опубликованную 2 сентября 2004 г. как US 2004-0171156 A1, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте.

Аспекты настоящего изобретения относятся к векторам для химерной РНК и Cas9. Бицистронные векторы экспрессии для химерной RNA и Cas9 являются предпочтительными. В общем и конкретно в данном варианте осуществления Cas9 предпочтительно управляется промотором CBh. Химерная РНК предпочтительно может управляться промотором U6. Оптимальным является их сочетание. Химерная направляющая РНК, как правило, состоит из направляющей последовательности (Ns) из 20 п.о., которая может быть соединена с tracr-последовательностью (проходящей от первого "U" в нижней нити к концу транскрипта). В разных указанных положениях tracr-последовательность может быть усечена. Направляющие и tracr-последовательности разделены парной tracr-последовательностью, которая может представлять собой GUUUUAGAGCUA. За ней может следовать показанная последовательность петли GAAA. Обе из них являются предпочтительными примерами. Заявители продемонстрировали Cas9-опосредованные вставки/делеции в локусах ЕМХ1 и PVALB человека посредством анализов с помощью SURVEYOR. ChiRNA показаны путем обозначения их "+n", a crRNA относится к гибридной РНК, в которой направляющие и tracr-последовательности экспрессируются в виде отдельных транскриптов. Во всей данной заявке химерная РНК также может называться одиночной направляющей или синтетической направляющей РНК (sgRNA). Петля предпочтительно представляет собой GAAA, но не ограничивается этой последовательностью, или ее длина действительно составляет только 4 п.о. Действительно, предпочтительные петлеобразующие последовательности для использования в шпилечных структурах имеют длину четыре нуклеотида и наиболее предпочтительно имеют последовательность GAAA. Однако можно использовать более короткие или длинные последовательности петли, а также альтернативные последовательности. Последовательности предпочтительно включают нуклеотидный триплет (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, С или G). Примеры петлеобразующих последовательностей включают СААА и AAAG.

Выражение "регуляторный элемент" предназначено включать промоторы, энхансеры, участки внутренней посадки рибосомы (IRES) и другие контролирующие экспрессию элементы (к примеру, сигналы терминации транскрипции, такие как сигналы полиаденилирования и поли-U-последовательности). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторные элементы включают такие, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и такие, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (к примеру, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Тканеспецифичный промотор может управлять экспрессией преимущественно в представляющей интерес целевой ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, конкретных органах (к примеру, печени, поджелудочной железе) или определенных типах клеток (к примеру, лимфоцитах). Регуляторные элементы также могут управлять экспрессией зависимым от времени образом, как, например, зависимым от клеточного цикла или зависимым от стадии развития образом, который может быть или может не быть также тканеспецифичным или специфичным к типу клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или несколько промоторов pol III (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol III), один или несколько промоторов pol II (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol II), один или несколько промоторов pol I (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol I) или их комбинации. Примеры промоторов pol III включают, без ограничения, промоторы U6 и H1. Примеры промоторов pol II включают, без ограничения, ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор β-актина, промотор глицерофосфаткиназы (PGK) и промотор EF1α. Также выражением "регуляторный элемент" охвачены энхансерные элементы, такие как WPRE; энхансеры CMV; сегмент R-U5' в LTR HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); энхансер SV40 и интронная последовательность между экзонами 2 и 3 β-глобина кролика (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981). Специалистам в данной области будет понятно, что структура вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, подлежащей трансформации, желательный уровень экспрессии и т.п. Вектор можно вводить в клетки-хозяева с получением, таким образом, транскриптов, белков или пептидов, в том числе белков или пептидов слияния, кодируемых нуклеиновыми кислотами, которые описаны в данном документе (к примеру, транскриптов коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), белков, ферментов, их мутантных форм, их слитых белков и т.п.). Что касается регуляторных последовательностей, следует упомянуть заявку на патент США №10/491026, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте. Что касается промоторов, следует упомянуть РСТ публикацию WO 2011/028929 и заявку на патент США №12/511940, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки во их полноте.

Векторы могут быть разработаны для экспрессии транскриптов CRISPR (к примеру, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут экспрессироваться в бактериальных клетках, как, например, Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных векторов экспрессии), клетках дрожжей или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева дополнительно рассматриваются в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). В качестве альтернативы рекомбинантный вектор экспрессии может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например, при помощи регуляторных последовательностей промотора Т7 и полимеразы Т7.

Векторы можно вводить и размножать в прокариоте или прокариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления прокариота используют для амплификации копий вектора, который предполагается вводить в эукариотическую клетку, или в качестве промежуточного вектора при получении вектора, который предполагается вводить в эукариотическую клетку (к примеру, путем амплификации плазмиды как части системы упаковки вирусного вектора). В некоторых вариантах осуществления прокариота используют для амплификации копий вектора и экспрессии одной или нескольких нуклеиновых кислот, как, например, для обеспечения источника одного или нескольких белков для доставки в клетку-хозяина или организм-хозяин. Экспрессию белков в прокариотах наиболее часто осуществляют в Escherichia coli с векторами, содержащими конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией либо белков слияния, либо отличных от белков слияния. Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот к белку, закодированному в них, как, например, к амино-концу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы могут служить для одной или нескольких целей, как, например: (i) для повышения экспрессии рекомбинантного белка; (ii) для повышения растворимости рекомбинантного белка и (iii) для содействия очистке рекомбинантного белка путем функционирования в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в слитые векторы экспрессии сайт протеолитического расщепления вводят в место соединения фрагмента слияния и рекомбинантного белка для облегчения отделения рекомбинантного белка от фрагмента слияния после очистки белка слияния. Такие ферменты и их когнатные распознающие последовательности включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Иллюстративные слитые векторы экспрессии включают pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) и pRIT5 (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которых глутатион-S-трансфераза (GST), мальтоза-связывающий белок Е или белок А, соответственно, слиты с целевым рекомбинантным белком.

Примеры подходящих индуцибельных не являющихся слитыми векторов экспрессии Е. coli включают pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) и pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

В некоторых вариантах осуществления вектор является вектором экспрессии для дрожжей. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerivisae включают pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, Сан-Диего, Калифорния) и picZ (InVitrogen Corp, Сан-Диего, Калифорния).

В некоторых вариантах осуществления вектор управляет экспрессией белка в клетках насекомых при помощи бакуловирусных векторов экспрессии. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (к примеру, клетках SF9), включают группу рАс (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) и группу pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

В некоторых вариантах осуществления вектор способен управлять экспрессией одной или нескольких последовательностей в клетках млекопитающих при помощи вектора экспрессии для млекопитающих. Примеры векторов экспрессии для млекопитающих включают pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) и рМТ2РС (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). При использовании клеток млекопитающих функции контроля вектора экспрессии, как правило, обеспечиваются одним или несколькими регуляторными элементами. Например, широко используемые промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса, вируса обезьян 40 и других, раскрыты в данном документе и известны из уровня техники. Что касается других подходящих систем экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, см., к примеру, главы 16 и 17 в Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные векторы экспрессии для млекопитающих способны управлять экспрессией нуклеиновой кислоты преимущественно в определенном типе клеток (к примеру, тканеспецифичные регуляторные элементы используют для экспрессии нуклеиновой кислоты). Тканеспецифичные регуляторные элементы известны из уровня техники. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифичньгх промоторов включают промотор гена альбумина (печеночноспецифический; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), специфичные к лимфоидной ткани промоторы (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), в частности, промоторы генов Т-клеточных рецепторов (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) и иммуноглобулины (Baneiji, et al, 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), нейрон-специфичные промоторы (к примеру, промотор гена нейрофиламента; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), специфичные к клеткам поджелудочной железы промоторы (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) и специфичные к клеткам молочной железы промоторы (к примеру, промотор гена белка молочной сыворотки; патент США №4873316 и публикация европейской заявки №264166). Регулируемые стадией развития промоторы также охвачены, к примеру, промоторы генов hox мыши (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) и промотор гена α-фетопротеина (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Что касается этих прокариотических и эукариотических векторов, следует упомянуть патент США №6750059, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Другие варианты осуществления согласно настоящему изобретению могут относиться к вирусным векторам, которые упоминаются в заявке на патент США №13/092085, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте. Тканеспецифичные регуляторные элементы известны из уровня техники, и в связи с этим следует упомянуть патент США №7776321, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

Регуляторные элементы

В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент является функционально связанным с одним или несколькими элементами системы CRISPR так, чтобы управлять экспрессией одного или нескольких элементов системы CRISPR. В целом, CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), также известные как SPIDR (прерываемые спейсерами прямые повторы), составляют семейство локусов ДНК, которые, как правило, специфичны для определенного вида бактерий. Локус CRISPR включает определенный класс чередующихся коротких повторов последовательностей (SSR), которые были обнаружены у Е. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; and Nakata et al., J. Bacteriol, 171:3553-3556 [1989]), и ассоциированные гены. Подобные чередующиеся SSR были идентифицированы у Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena и Mycobacterium tuberculosis (см., Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; и Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Локусы CRISPR, как правило, отличаются от других SSR по структуре повторов, которые были названы короткими повторами с регулярными интервалами (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; и Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). В целом, повторы являются короткими элементами, которые встречаются группами, которые регулярно разделены уникальными вставочными последовательностями с практически постоянной длинной (Mojica et al., [2000], выше). Несмотря на то, что последовательности повторов высоко консервативны между штаммами, некоторое количество чередующихся повторов и последовательностей спейсерных участков, как правило, отличаются от штамма к штамму (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Локусы CRISPR были идентифицированы у более чем 40 видов прокариот (см., к примеру, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; и Mojica et al., [2005]), в том числе, без ограничения, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema и Thermotoga.

В целом, "система CRISPR" означает в совокупности транскрипты и другие элементы, участвующие в экспрессии CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов или управлении их активностью, в том числе последовательности, кодирующие ген Cas, tracr-(транс-активируемую CRISPR) последовательность (к примеру, tracrRNA или активную частичную tracrRNA), парную tracr-последовательность (охватывающую "прямой повтор" и tracrRNA-процессированный неполный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также называемую "спейсером" в контексте эндогенной системы CRISPR) или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR. В вариантах осуществления согласно настоящему изобретению выражения направляющая последовательность и направляющая РНК используются взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов системы CRISPR получены из системы CRISPR типа I, типа II или типа III. В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов системы CRISPR получены из определенного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, как, например, Streptococcus pyogenes. В целом, система CRISPR характеризуется элементами, которые способствуют образованию комплекса CRISPR в сайте целевой последовательности (также называемом протоспейсером в контексте эндогенной системы CRISPR). В контексте образования комплекса CRISPR "целевая последовательность" означает последовательность, по отношению к которой направляющая последовательность разработана так, чтобы обладать комплементарностью, где гибридизация между целевой последовательностью и направляющей последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. Целевая последовательность может содержать любой полинуклеотид, как, например, ДНК- или РНК-полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность расположена в ядре или цитоплазме клетки.

В некоторых вариантах осуществления прямые повторы можно идентифицировать in silico посредством поиска повторяющихся мотивов, которые соответствуют любым или всем из следующих критериев:

1. обнаруживаются в окне размером 2 т.п.о. геномной последовательности, фланкирующей CRISPR типа II;

2. имеют протяженность от 20 до 50 п.о. и

3. расположены с интервалами от 20 до 50 п.о.

В некоторых вариантах осуществления можно использовать 2 из этих критериев, например, 1 и 2, 2 и 3 или 1 и 3. В некоторых вариантах осуществления можно использовать все 3 критерия.

В некоторых вариантах осуществления кандидатные tracrRNA можно впоследствии предсказать с использованием последовательностей, которые соответствуют любым или всем из следующих критериев:

1. гомология последовательности с прямыми повторами (поиск мотивов в Geneious с несовпадениями вплоть до 18 п.о.);

2. наличие предсказанного Rho-независимого терминатора транскрипции по направлению транскрипции и

3. стабильная шпилечная вторичная структура между tracrRNA и прямым повтором.

В некоторых вариантах осуществления можно использовать 2 из этих критериев, например, 1 и 2, 2 и 3 или 1 и 3. В некоторых вариантах осуществления можно использовать все 3 критерия.

В некоторых вариантах осуществления химерные конструкции синтетических направляющих РНК (sgRNA) могут включать по меньшей мере 12 п.о. дуплексной структуры между прямым повтором и tracrRNA.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения система CRISPR представляет собой систему CRISPR типа II, и фермент Cas представляет собой Cas9, который катализирует расщепление ДНК. Ферментативная активность Cas9, происходящего из Streptococcus pyogenes, или любого близкородственного Cas9 приводит к образованию двухнитевых разрывов в последовательностях целевого сайта, который гибридизируется с 20 нуклеотидами направляющей последовательности и который содержит последовательность мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ) (примеры включают NGG/NRG или РАМ, который можно определить, как описано в данном документе) после 20 нуклеотидов целевой последовательности. Активность CRISPR посредством Cas9 по отношению к сайт-специфическому распознаванию и расщеплению ДНК определяется направляющей последовательностью, tracr-последовательностью, которая частично гибридизируется с направляющей последовательностью и последовательностью РАМ. Больше аспектов системы CRISPR описаны в Karginov and Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, January 15; 37(1): 7.

Локус CRISPR типа II происходит из Streptococcus pyogenes SF370, который содержит кластер из 4 генов Cas9, Cas1, Cas2 и Csn1, а также 2 некодирующих элемента РНК, tracrRNA и характерный массив повторяющихся последовательностей (прямых повторов), чередующихся с короткими фрагментами неповторяющихся последовательностей (спейсерами, приблизительно 30 п.о. каждый). В данной системе целенаправленный двухнитевой разрыв (DSB) целевой ДНК образуется в ходе четырех последовательных стадий (фигура 2А). Во-первых, две некодирующих РНК, массив pre-crRNA и tracrRNA транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrRNA гибридизируется с прямыми повторами pre-crRNA, которая затем процессируется в зрелые crRNA, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности. В-третьих, комплекс зрелая crRNA : tracrRNA направляет Cas9 к ДНК-мишени, состоящей из протоспейсера и соответствующего РАМ, посредством образования гетеродуплекса между спейсерным участком crRNA и протоспейсерной ДНК. И наконец, Cas9 опосредует расщепление целевой ДНК выше РАМ с образованием DSB внутри протоспейсера (фигура 2А). На фигуре 2В представлена ядерная локализация кодон-оптимизированной Cas9. Для того, чтобы способствовать точной инициации транскрипции, промотор U6, зависимый от РНК-полиМеразы III, выбирали для управления экспрессией tracrRNA (фигура 2С). Подобным образом, конструкцию на основе промотора U6 разработали для экспрессии массива pre-crRNA, состоящего из одного спейсера, фланкированного двумя прямыми повторами (DR, также включены в термин "парные tracr-последовательности"; фигура 2С). Исходный спейсер был сконструирован для нацеливания на целевой сайт размером 33 пары оснований (п.о.) (протоспейсер из 30 п.о., а также последовательность мотива CRISPR (РАМ) из 3 п.о., соответствующую мотиву узнавания NGG у Cas9) в локусе ЕМХ1 человека (фигура 2С), ключевом гене в развитии коры головного мозга.

Как правило, в контексте эндогенной системы CRISPR образование комплекса CRISPR (содержащего направляющую последовательность, гибридизирующуюся с целевой последовательностью и образующую комплекс с одним или несколькими белками Cas) приводит к расщеплению одной или обеих нитей в или около (к примеру, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований) целевой последовательности. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что tracr-последовательность, которая может содержать всю или часть tracr-последовательности дикого типа или состоять из нее (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов tracr-последовательности дикого типа), может также образовывать часть комплекса CRISPR, как, например, путем гибридизации вдоль по меньшей мере части tracr-последовательности со всей или частью парной tracr-последовательности, которая функционально связана с направляющей последовательностью. В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов, управляющих экспрессией одного или нескольких элементов системы CRISPR, вводят в клетку-хозяина, так что экспрессия элементов системы CRISPR управляет образованием комплекса CRISPR в одном или нескольких целевых сайтах. Например, каждое из фермента Cas, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности может быть функционально связано с отдельными регуляторными элементами в отдельных векторах. В качестве альтернативы, два или более элементов, экспрессируемых с одних и тех же или различных регуляторных элементов, можно объединять в одиночном векторе, при этом один или несколько дополнительных векторов обеспечивают любые компоненты системы CRISPR, не включенные в первый вектор. Элементы системы CRISPR, которые объединены в одиночном векторе, могут быть расположены в любой удобной ориентации, как, например, один элемент, расположенный 5' ("выше") относительно или 3' ("ниже") относительно второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной нити кодирующей последовательности второго элемента и направлена в том же или противоположном направлении. В некоторых вариантах осуществления один промотор управляет экспрессией транскрипта, кодирующего фермент CRISPR, и одной или нескольких из направляющей последовательности, парной tracr-последовательности (необязательно функционально связанной с направляющей последовательностью) и tracr-последовательности, встроенных в одну или несколько интронных последовательностей (к примеру, каждая в отдельном интроне, две или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном интроне). В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR, направляющая последовательность, парная tracr-последовательность и tracr-последовательность функционально связаны с одним и тем же промотором и экспрессируются при помощи него.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или несколько сайтов встраивания, как, например, последовательность узнавания для рестрикционной эндонуклеазы (также называемая "сайтом клонирования"). В некоторых вариантах осуществления один или несколько сайтов встраивания (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов встраивания) расположены выше и/или ниже одного или нескольких элементов последовательности одного или нескольких векторов. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит сайт встраивания выше парной tracr-последовательности и необязательно ниже регуляторного элемента, функционально связанного с парной tracr-последовательностью, так что после встраивания направляющей последовательности в сайт встраивания и при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит два или более сайта встраивания, при этом каждый сайт встраивания расположен между двумя парными tracr-последовательностями с тем, чтобы обеспечить возможность встраивания направляющей последовательности в каждый сайт. В таком расположении две или более направляющие последовательности могут содержать две или более копий одиночной направляющей последовательности, две или более различных направляющих последовательностей или их комбинации. В тех случаях, когда применяют несколько различных направляющих последовательностей, может быть использована одиночная экспрессирующая конструкция для целенаправленного воздействия активности CRISPR на несколько различных соответствующих целевых последовательностей в клетке. Например, одиночный вектор может содержать приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более направляющих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таких содержащих направляющие последовательности векторов могут быть предусмотрены и необязательно доставлены в клетку.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, как, например, белок Cas. Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 их гомологи или их модифицированные варианты. В некоторых вариантах осуществления немодифицированный фермент CRISPR, как, например, Cas9, обладает активностью в отношении расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих нитей в определенной точке целевой последовательности, как, например, в пределах целевой последовательности и/или в пределах комплементарной последовательности для целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих нитей в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, который подвергся мутации относительно соответствующего фермента дикого типа, так что у подвергшегося мутации фермента CRISPR отсутствует способность расщеплять одну или обе нити целевого полинуклеотида, содержащего целевую последовательность. Например, замена аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvC I Cas9 из S. pyogenes трансформирует Cas9 из нуклеазы, которая расщепляет обе нити, в никазу (расщепляет одну нить). Другие примеры мутаций, которые превращают Cas9 в никазу, включают, без ограничения, Н840А, N854A и N863A. В качестве дополнительного примера два или более каталитических доменов Cas9 (RuvC I, RuvC II и RuvC III или домен HNH) можно подвергать мутациям с получением мутированного Cas9, у которого практически полностью отсутствует активность в отношении расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления мутацию D10A объединяют с одной или несколькими из мутаций Н840А, N854A или N863A с получением фермента Cas9, у которого практически отсутствует вся активность в отношении расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR рассматривают как такой, у которого практически полностью отсутствует активность в отношении расщепления ДНК, в случаях, когда активность в отношении расщепления ДНК мутантного фермента составляет менее приблизительно 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или меньше по отношению к его немутантной форме. Если фермент не является SpCas9, мутации можно осуществлять по любому или всем остаткам, соответствующим положениям 10, 762, 840, 854, 863 и/или 986 SpCas9 (которые могут быть определены, например, при помощи стандартных инструментов сравнения последовательностей). В частности, любые или все из следующих мутаций являются предпочтительными для SpCas9: D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863А и/или D986A; а также предусматривается консервативная замена для любого аминокислотного замещения. То же самое (или консервативные замены по этим мутациям) также является предпочтительным в соответствующих положениях других Cas9. Особенно предпочтительными являются D10 и Н840 в SpCas9. Однако в других Cas9 остатки, соответствующие SpCas9 D10 и Н840, также являются предпочтительными.

Замену аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvC I в SpCas9 производили с применением методик генной инженерии для превращения нуклеазы в никазу (SpCas9n) (см., например, Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579) так, чтобы геномная ДНК с однонитевым разрывом подвергалась высокоточной репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR). Анализ с помощью Surveyor подтвердил, что SpCas9n не образует вставок/делеций в протоспейсере-мишени ЕМХ1. Совместная экспрессия целенаправленно воздействующей на ЕМХ1 химерной crRNA (также содержащей компонент tracrRNA) с SpCas9 приводила к вставкам/делециям в целевом сайте, тогда как совместная экспрессия с SpCas9n - нет (n=3). Более того, секвенирование 327 ампликонов не обнаружило каких-либо вставок/делеций, индуцированных SpCas9n. Тот же локус выбирали для тестирования опосредованной CRISPR HR при совместной трансфекции клеток НЕК 293FT химерной РНК, целенаправленно воздействующей на ЕМХ1, hSpCas9 или hSpCas9n, а также матрицей для HR для введения пары сайтов рестрикции (для HindIII и NheI) возле протоспейсера.

Предпочтительные ортологи описаны в данном документе. Фермент Cas может быть идентифицирован как Cas9, поскольку он может относиться к общему классу ферментов, обладающих гомологией с самой большой нуклеазой с несколькими доменами нуклеаз системы CRISPR типа II. В наиболее предпочтительном случае фермент Cas9 получен или происходит из spCas9 или saCas9. Под происходящим заявители подразумевают, что в основе происходящего фермента главным образом лежит фермент дикого типа в том смысле, что он характеризуется высокой степенью гомологии последовательности с этим ферментом, но он был некоторым образом подвергнут мутации (модифицирован), как описано в данном документе.

Следует иметь в виду, что выражения Cas и фермент CRISPR обычно используются в данном документе взаимозаменяемо, если не очевидно иное. Как упоминается выше, многие из порядков нумерации остатков, используемых в данном документе, относятся к ферменту Cas9 из локуса CRISPR типа II Streptococcus pyogenes. Однако следует иметь в виду, что настоящее изобретение включает многие другие Cas9 из других видов микроорганизмов, такие как SpCas9, SaCa9, St1Cas9 и т.д.

Оптимизация кодонов

Пример кодон-оптимизированной последовательности, в данном случае оптимизированной для человека (т.е. оптимизированной для экспрессии у человека), представлен в данном документе, см. кодон-оптимизированную последовательность SaCas9 для человека. Хотя это является предпочтительным, следует иметь в виду, что возможны другие примеры и что для вида-хозяина известна оптимизация кодонов.

В некоторых вариантах осуществления кодирующая фермент последовательность, кодирующая фермент CRISPR, является кодон-оптимизированной для экспрессии в определенных клетках, как, например, эукариотических клетках. Эукариотические клетки могут быть клетками определенного организма или полученными из него, как, например, млекопитающего, в том числе, без ограничения, человека, мыши, крысы, кролика, собаки или отличного от человека млекопитающего или примата. В некоторых вариантах осуществления могут исключаться способы модификации генетической идентичности зародышевой линии человека и/или способы модификации генетической идентичности животных, которые, вероятно, могут причинить им страдания без какой-либо значительной медицинской пользы для человека или животных, а также животные, являющиеся результатом таких способов.

В целом, оптимизация кодонов означает способ модификации последовательности нуклеиновой кислоты для повышения экспрессии в представляющих интерес клетках-хозяевах путем замещения по меньшей мере одного кодона (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности кодонами, которые чаще или наиболее часто используют в генах этой клетки-хозяина, с сохранением в то же время нативной аминокислотной последовательности. Разные виды проявляют определенное "предпочтение" в отношении конкретных кодонов определенной аминокислоты. "Предпочтение" кодонов (различия в частоте использования кодонов между организмами) часто взаимосвязано с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, как полагают, зависит, среди прочего, от свойств кодонов, которые транслируются, и доступности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке, как правило, является отражением кодонов, используемых наиболее часто при синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть приспособлены для оптимальной экспрессии генов в данном организме с использованием оптимизации кодонов. Таблицы частоты использования кодонов общедоступны, например, в "Базе данных частот использования кодонов", доступной в интернете по адресу www.kazusa.orjp/codon/ (просмотрена 9 июля 2002 г.), и эти таблицы можно адаптировать различными способами. См. Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов определенной последовательности для экспрессии в определенной клетке-хозяине, как, например, Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания). В некоторых вариантах осуществления один или несколько кодонов (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более или все кодоны) в последовательности, кодирующей фермент CRISPR, соответствуют наиболее часто используемому кодону для определенной аминокислоты.

Последовательности ядерной локализации (NLS)

В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, содержащий одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), как, например, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на амино-конце или рядом с ним, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на карбокси-конце или рядом с ним или их комбинацию (к примеру, одну или несколько NLS на амино-конце и одну или несколько NLS на карбокси-конце). В тех случаях, когда присутствуют несколько NLS, каждая может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS может присутствовать в нескольких копиях и/или в комбинации с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фермент CRISPR содержит не более 6 NLS. В некоторых вариантах осуществления считают, что NLS находится рядом с N- или С-концом в тех случаях, когда самая близкая аминокислота NLS находится в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот вдоль полипетидной цепи от N- или С-конца. Неограничивающие примеры NLS включают последовательность NLS, полученную из: NLS из большого Т-антигена вируса SV40 с аминокислотной последовательностью PKKKRKV; NLS из нуклеоплазмина (к примеру, двойная NLS из нуклеоплазмина с последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK); NLS из с-myc с аминокислотной последовательностью PAAKRVKLD или RQRRNELKRSP; NLS из hRNPA1 М9 с последовательностью NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; последовательность RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV домена IBB из импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP и PPKKARED из Т-белка миомы; последовательность POPKKKPL из р53 человека; последовательность SALIKKKKKMAP из c-abl IV мыши; последовательности DRLRR и PKQKKRK из NS1 вируса гриппа; последовательность RKLKKKIKKL из дельта-антигена вируса гепатита; последовательность REKKKFLKRR из белка Mx1 мыши; последовательность KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK из поли(АДФ-рибоза)-полимеразы человека и последовательность RKCLQAGMNLEARKTKK из рецепторов стероидных гормонов глюкокортикоидов (человека).

В целом, одна или несколько NLS являются достаточно эффективными, чтобы управлять накоплением фермента CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В целом, степень проявления активности ядерной локализации может быть обусловлена количеством NLS в ферменте CRISPR, конкретной(конкретными) используемой(используемыми) NLS или комбинацией этих факторов. Обнаружение накопления в ядре можно выполнять при помощи любой подходящей методики. Например, детектируемый маркер может быть слит с ферментом CRISPR, так что расположение в клетке может быть визуализировано, как, например, в комбинации со средствами для обнаружения расположения ядра (к примеру, окрашивающим средством, специфичным к ядру, таким как DAPI). Ядра клеток также можно выделять из клеток, содержимое которых можно затем анализировать при помощи любого подходящего способа для обнаружения белка, как, например, иммуногистохимического анализа, вестерн-блот анализа или анализа активности фермента. Накопление в ядре также можно определить опосредованно, как, например, при помощи анализа эффекта образования комплекса CRISPR (к примеру, анализа расщепления ДНК или мутации в целевой последовательности или анализа в отношении активности экспрессии генов, измененной под воздействием образования комплекса CRISPR и/или активности фермента CRISPR) по сравнению с контролем, который не подвергали воздействию фермента или комплекса CRISPR или подвергали воздействию фермента CRISPR, у которого отсутствуют одна или несколько NLS.

Направляющая последовательность

Особенно предпочтительные направляющие последовательности имеют длину в диапазоне 20-22 нуклеотидов, как описано в данном документе; см. пример 40.

В целом, направляющая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью с целевой полинуклеотидной последовательностью для гибридизации с целевой последовательностью и управления специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между направляющей последовательностью и ее соответствующей целевой последовательностью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или более чем приблизительно 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание можно определять при помощи любого подходящего алгоритма для выравниваемых последовательностей, неограничивающие примеры которого включают алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Уилера (к примеру, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; доступный на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния), SOAP (доступный на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступный на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину приблизительно или более чем приблизительно 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину менее чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Способность направляющей последовательности управлять специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью можно оценить при помощи любого подходящего анализа. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для образования комплекса CRISPR, в том числе направляющая последовательность, подлежащая тестированию, могут быть доставлены в клетку-хозяина с соответствующей целевой последовательностью, как, например, при помощи трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующей оценкой предпочтительного расщепления в пределах целевой последовательности, как, например, при помощи анализа с помощью Surveyor, как описано в данном документе. Подобным образом, расщепление целевой полинуклеотидной последовательности может быть установлено в пробирке путем обеспечения целевой последовательности, компонентов комплекса CRISPR, в том числе направляющей последовательности, подлежащей тестированию, и контрольной направляющей последовательности, отличной от тестовой направляющей последовательности, и сравнения воздействий тестовой и контрольной направляющей последовательности на связывание или скорость расщепления целевой последовательности. Другие анализы возможны и будут очевидны специалисту в данной области.

Направляющая последовательность может быть выбрана для целенаправленного воздействия на любую целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность является последовательностью в пределах генома клетки. Иллюстративные целевые последовательности включают те, которые являются уникальными в целевом геноме. Например, для Cas9 S. pyogenes уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG, где NNNNNNNNNNNNXGG (N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 S. pyogenes в виде MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG, где NNNNNNNNNNNXGG (N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Для Cas9 CRJSPR1 S. thermophilics уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW, где NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N представляет собой A, G, Т или С; X может быть любым; и W представляет собой А или Т) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus в виде MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW, где NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N представляет собой A, G, Т или С; X может быть любым; и W представляет собой А или Т) характеризуется единичным появлением в геноме. Для Cas9 S. pyogenes уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG, где NNNNNNNNNNNNXGGXG (N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 S. pyogenes в виде ММММММММMNNNNNNNNNNNXGGXG где NNNNNNNNNNNXGGXG (N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. В каждой из этих последовательностей "М" может представлять собой A, G, Т или С и не должен учитываться при идентификации последовательности как уникальной.

В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность выбрана для снижения доли вторичной структуры в направляющей последовательности. В некоторых вариантах осуществления приблизительно или менее приблизительно 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% или меньше нуклеотидов направляющей последовательности участвуют в самокомплементарном спаривании оснований при оптимальном сворачивании. Оптимальное сворачивание можно определить при помощи любого подходящего алгоритма сворачивания полинуклеотида. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером одного такого алгоритма является mFold, который описан Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Другим примером алгоритма сворачивания является доступный в режиме онлайн веб-сервер RNAfold, разработанный в Институте теоретической химии при Венском университете, использующий алгоритм предсказания структуры на основе центроидного метода (см., к примеру, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; и PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

Парная tracr-последовательность

В целом, парная tracr-последовательность включает любую последовательность, которая характеризуется достаточной комплементарностью с tracr-последовательностью для содействия одному или нескольким из следующих: (1) вырезанию направляющей последовательности, фланкированной парными tracr-последовательностями, в клетке, содержащей соответствующую tracr-последовательность; и (2) образованию комплекса CRISPR в целевой последовательности, где комплекс CRISPR содержит парную tracr-последовательность, которая гибридизируется с tracr-последовательностью. В целом, степень комплементарности указана на основании оптимального выравнивания парной tracr-последовательности и tracr-последовательности по длине более короткой из двух последовательностей. Оптимальное выравнивание можно определить при помощи любого подходящего алгоритма выравнивания и можно дополнительно высчитать для вторичных структур, как, например, участка самокомплементарности в пределах tracr-последовательности или парной tracr-последовательности. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между tracr-последовательностью и парной tracr-последовательностью по длине более короткой из двух при оптимальном выравнивании составляет приблизительно или более чем приблизительно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность имеет длину приблизительно или более чем приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность и парная tracr-последовательность содержатся в одиночном транскрипте, так что гибридизация между ними двумя дает транскрипт с вторичной структурой, такой как "шпилька". В одном варианте осуществления настоящего изобретения траснкрипт или транскрибированная полинуклеотидная последовательность характеризуются по меньшей мере двумя или более "шпильками". В предпочтительных вариантах осуществления транскрипт характеризуется двумя, тремя, четырьмя или пятью "шпильками". В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения транскрипт характеризуется не более чем пятью "шпильками". В шпилечной структуре часть последовательности в 5' направлении по отношению к концевому "N" и выше петли соответствует парной tracr-последовательности, а часть последовательности в 3' направлении по отношению к петле соответствует tracr-последовательности. Дополнительными неограничивающими примерами отдельных полинуклеотидов, содержащих направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность, являются следующие (перечисленные от 5' к 3'), где "N" представляет собой основание направляющей последовательности, первый блок букв нижнего регистра представляет собой парную tracr-последовательность, а второй блок букв нижнего регистра представляет собой tracr-последовательность, и конечная поли-Т-последовательность представляет собой терминатор транскрипции:

и

В некоторых вариантах осуществления последовательности (1)-(3) используют в комбинации с Cas9 из CRTSPR1 S. thermophilics. В некоторых вариантах осуществления последовательности (4)-(6) используют в комбинации с Cas9 из S. pyogenes. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность является транскриптом, отдельным от транскрипта, содержащего парную tracr-последовательность.

Матрица для рекомбинации

В некоторых вариантах осуществления также предусмотрена матрица для рекомбинации. Матрица для рекомбинации может быть компонентом другого вектора, который описан в данном документе, может содержаться в отдельном векторе или предусматриваться в качестве отдельного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления матрица для рекомбинации разработана так, чтобы служить в качестве матрицы при гомологичной рекомбинации, как, например, в пределах или рядом с целевой последовательностью, надрезанной или расщепленной ферментом CRISPR, в качестве части комплекса CRISPR. Матричный полинуклеотид может быть любой подходящей длины, как, например, иметь длину приблизительно или более чем приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид комплементарен части полинуклеотида, содержащего целевую последовательность. При оптимальном выравнивании матричный полинуклеотид может перекрываться с одним или несколькими нуклеотидами целевых последовательностей (к примеру, с приблизительно или более чем приблизительно 1, 5, 10, 15, 20 или более нуклеотидами). В некоторых вариантах осуществления при оптимальном выравнивании матричной последовательности и полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, наиболее близкий нуклеотид матричного полинуклеотида находится в пределах приблизительно 1,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от целевой последовательности.

Белок слияния

В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является частью белка слияния, содержащего один или несколько доменов гетерологичного белка (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доменов в дополнение к ферменту CRISPR). Белок слияния, содержащий фермент CRISPR, может содержать любую дополнительную последовательность белка и необязательно линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры доменов белков, которые могут быть слиты с ферментом CRISPR, включают, без ограничения, эпитопные метки, последовательности генов-репортеров и домены белков с одним или несколькими из следующих видов активности: метилазной активности, деметилазной активности, активности в отношении активации транскрипции, активности в отношении репрессии транскрипции, активности фактора освобождения при транскрипции, активности в отношении модификации гистонов, активности в отношении расщепления ДНК и активности в отношении связывания нуклеиновой кислоты. Неограничивающие примеры эпитопных меток включают гистидиновые (His) метки, V5-метки, FLAG-метки, метки гемагглютинина вируса гриппа (НА), Мус-метки, VSV-G-метки и тиоредоксиновые (Trx) метки. Примеры генов-репортеррв включают, без ограничения, гены глутатион-S-трансферазы (GST), пероксидазы хрена (HRP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), бета-галактозидазы, бета-глюкуронидазы, люциферазы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), HcRed, DsRed, голубого флуоресцентного белка (CFP), желтого флуоресцентного белка (YFP) и автофлуоресцирующих белков, в том числе синего флуоресцентного белка (BFP). Фермент CRISPR может быть слит с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, которые связывают молекулу ДНК или связывают другие клеточные молекулы, в том числе, без ограничения, связывающий мальтозу белок (МВР), S-метку, продукты слияния Lex А и ДНК-связывающего домена (DBD), продукты слияния GAL4 и ДНК-связывающего домена и продукты слияния белка BP16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут образовывать часть белка слияния, содержащего фермент CRISPR, описаны в US 20110059502, включенном в данный документ при помощи ссылки. В некоторых вариантах осуществления меченный фермент CRISPR используют для идентификации расположения целевой последовательности.

Индуцируемая система

В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR может образовывать компонент индуцируемой системы. Индуцируемая природа системы будет обеспечивать возможность пространственно-временного контроля редактирования генов или экспрессии генов с использованием определенной формы энергии. Форма энергии может включать, без ограничения, электромагнитное излучение, звуковую энергию, химическую энергию и тепловую энергию. Примеры индуцируемой системы включают индуцируемые тетрациклином промоторы (Tet-On или Tet-Off), двухгибридные системы активации транскрипции с использованием малых молекул (FKBP, ABA и т.д.) или индуцируемые светом системы (фитохром, домены LOV или криптохром). В одном варианте осуществления фермент CRISPR может быть частью индуцируемого светом транскрипционного эффектора (LITE) для управления изменениями транскрипционной активности специфичным к последовательности образом. Компоненты индуцируемой светом системы могут включать фермент CRISPR, чувствительный к свету гетеродимер цитохрома (например, из Arabidopsis thaliana) и домен активации/репрессии транскрипции. Дополнительные примеры индуцируемых ДНК-связывающих белков и способы их применения представлены в US 61/736465 и US 61/721283, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей полноте.

Доставка

В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы, включающие доставку одного или нескольких полинуклеотидов, как, например, одного или нескольких векторов, которые описаны в данном документе, одного или нескольких их транскриптов и/или одного или нескольких белков, транскрибируемых с них, в клетку-хозяина. В некоторых аспектах настоящее изобретение дополнительно предусматривает клетки, полученные при помощи таких способов, и животных, содержащих такие клетки или полученных из них. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR в комбинации с (и необязательно образующий комплекс с) направляющей последовательностью доставляют в клетку. Традиционные способы переноса генов с использованием вирусов и без использования вирусов можно применять для введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих или целевые ткани. Такие способы можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты системы CRISPR, в клетки в культуре или в организме-хозяине. Системы доставки на основе невирусных векторов включают плазмидные ДНК, РНК (к примеру, транскрипт вектора, описанного в данном документе), "оголенную" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту, образующую комплекс со средством доставки, как, например, липосомой. Системы доставки на основе вирусного вектора включают ДНК- и РНК-содержащие вирусы, которые имеют либо эписомальный, либо интегрированный геномы после доставки в клетку. В отношении обзора процедур генной терапии см. Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., в Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Böhm (eds) (1995) и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, микроинъекцию, баллистическую трансфекцию, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, "оголенную" ДНК, искусственные вирионы и повышенное при помощи определенного средства поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №№5049386, 4946787 и 4897355, и реагенты для липофекции реализуют в промышленных масштабах (к примеру, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые подходят для эффективной липофекции с узнаванием рецепторов полинуклеотидов, включают таковые из Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (к примеру, введение in vitro или ex vivo) или целевые ткани (к примеру, введение in vivo).

Получение комплексов липид: нуклеиновая кислота, в том числе нацеливающих липосом, как, например, иммунолипидных комплексов, хорошо известно специалистам в данной области (смотри, к примеру, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патенты США №№4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).

При применении систем на основе РНК- и ДНК-содержащих вирусов для доставки нуклеиновых кислот используют тщательно разработанные способы обеспечения нацеливания вируса на конкретные клетки в организме и перемещения полезных последовательностей вируса в ядро. Вирусные векторы можно вводить непосредственно пациентам (in vivo), или их можно использовать для обработки клеток in vitro, и модифицированные клетки можно необязательно вводить пациентам (ex vivo). Традиционные системы на основе вирусов могут включать ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса и вируса простого герпеса для переноса генов. Интеграция в геном хозяина возможна со способами переноса генов на основе ретровируса, лентивируса и аденоассоциированного вируса, что часто приводит к длительной экспрессии встроенного трансгена. Кроме того, высокие показатели эффективности трансдукции наблюдали у многих различных типов клеток и целевых тканей.

Тропизм ретровирусов может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки с расширением возможной целевой популяции целевых клеток. Лентивирусные векторы являются ретровирусными векторами, которые способны трансдуцировать или инфицировать неделящиеся клетки и, как правило, дают высокие вирусные титры. Выбор системы переноса генов на основе ретровирусов, таким образом, будет зависеть от целевой ткани. Ретровирусные векторы состоят из действующих в цис-положении длинных концевых повторов с упаковывающей способностью до 6-10 т.п.о. чужеродной последовательности. Минимальных действующих в цис-положении LTR достаточно для репликации и упаковки векторов, которые затем используют для интеграции терапевтического гена в целевую клетку с получением постоянной экспрессии трансгена. Широко применяемые ретровирусные векторы включают такие, как основанные на вирусе лейкоза мышей (MuLV), вирусе лейкоза гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (HIV) и их комбинациях (смотри, к примеру, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US 94/05700).

В другом варианте осуществления предусматриваются псевдотипированные ретровирусные векторные частицы на основе оболочки везикуловируса Кокал (см., например, публикацию заявки на патент США №20120164118, закрепленной за Онкологическим исследовательским центром Фреда Хатчинсона). Вирус Кокал относится к роду Vesiculovirus и является возбудителем везикулярного стоматита у млекопитающих. Вирус Кокал изначально был выделен из клещей в Тринидаде (Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964)), и инфекции были идентифицированы в Тринидаде, Бразилии и Аргентине у насекомых, крупного рогатого скота и лошадей. Многие везикуловирусы, которые инфицируют млекопитающих, были выделены у инфицированных в естественных условиях членистоногих, что позволяет предположить, что они являются переносчиками. Антитела к везикуловирусам распространены у людей, живущих в сельской местности, где вирусы являются эндемичными и лабораторными; причем инфекции у человека обычно приводят к гриппоподобным симптомам. Гликопротеин оболочки вируса Кокал обладает идентичностью 71,5% на аминокислотном уровне с VSV-G Индиана, и при этом филогенетическое сравнение генов оболочки везикуловирусов продемонстрировало, что вирус Кокал серологически отличается от штаммов VSV-G Индиана, но является наиболее близкородственным с ними среди везикуловирусов. Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964) и Travassos da Rosa et al., Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984). Псевдотипированные ретровирусные векторные частицы с оболочкой везикуловируса Кокал могут включать, например, лентивирусные, альфаретровирусные, бетаретровирусные, гаммаретровирусные, дельтаретровирусные и эпсилонретровирусные векторные частицы, которые могут содержать ретровирусные белки Gag, Pol и/или один или несколько акцессорных белков и белок оболочки везикуловируса Кокал. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления белки Gag, Pol и акцессорные белки являются лентивирусными и/или гаммаретровирусными.

В применениях, в которых транзиентная экспрессия является предпочтительной, можно применять системы на основе аденовирусов. Аденовирусные векторы способны проявлять очень высокую эффективность трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. С такими векторами были получены высокие титры и уровни экспрессии. Такой вектор можно получать в больших количествах в относительно простой системе.

Векторы на основе аденоассоциированного вируса ("AAV") также можно использовать для трансдукции клеток целевыми нуклеиновыми кислотами, к примеру, при получении in vitro нуклеиновых кислот и пептидов и для процедур генной терапии in vivo и ex vivo (смотри, к примеру, West et al., Virology 160:38-47 (1987); патент США №4797368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Создание рекомбинантных векторов на основе AAV описано в ряде публикаций, в том числе в патенте США №5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Упаковывающие клетки, как правило, используют для получения вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые упаковывают аденовирус, и клетки ψ2 или клетки РА317, которые упаковывают ретровирус. Вирусные векторы, используемые в генной терапии, как правило, создают путем получения линии клеток, которые упаковывают вектор на основе нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Векторы обычно содержат минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в хозяина, при этом другие вирусные последовательности замещены на кассету экспрессии для экспрессии полинуклеотида(полинуклеотидов). Отсутствующие вирусные функции, как правило, обеспечивают в транс-положении при помощи линии пакующих клеток. Например, векторы на основе AAV, применяемые в генной терапии, как правило, имеют только ITR-последовательности из генома AAV, которые необходимы для упаковки и интеграции в геном хозяина. Вирусная ДНК упаковывается в линии клеток, которая содержит плазмиду-помощника, кодирующую другие гены AAV, а именно rep и cap, но без ITR-последовательностей. Линия клеток также может быть инфицирована аденовирусом в качестве вируса-помощника. Вирус-помощник способствует репликации вектора на основе AAV и экспрессии генов AAV из плазмиды-помощника. Плазмида-помощник не упаковывается в значительном количестве в связи с отсутствием ITR-последовательностей. Контаминацию аденовирусом можно снизить, к примеру, при помощи тепловой обработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV.

Соответственно, AAV считается оптимальным кандидатом для применения в качестве трансдуцирующего вектора. Такие трансдуцирующие векторы на основе AAV могут содержать достаточные функции, действующие в цис-положении, для репликации в присутствии функций-помощников в виде аденовируса, или герпесвируса, или поксвируса (например, вируса осповакцины), предоставленных в транс-положении. Рекомбинантный AAV (rAAV) можно использовать для переноса экзогенных генов в клетки различных линий. В этих векторах гены cap и/или rep AAV удалены из вирусного генома и замещены выбранным сегментом ДНК. Современные векторы на основе AAV могут вмещать до 4300 оснований встроенной ДНК.

Существует ряд способов получения rAAV, и настоящее изобретение предусматривает rAAV и способы получения rAAV. Например, плазмидой (плазмидами), содержащими или практически состоящими из необходимой вирусной конструкции, трансфицируют клетки, инфицированные AAV. Кроме того, эти клетки совместно трансфицируют второй или дополнительной плазмидой-помощником с обеспечением генов rep и/или cap AAV, которые являются обязательными для репликации и упаковки рекомбинантной вирусной конструкции. В этих условиях белки rep и/или cap AAV действуют в транс-положении для стимуляции репликации и упаковки конструкции rAAV. Через два-три дня после трансфекции собирают rAAV. Традиционно, rAAV собирают из клеток вместе с аденовирусом. Контаминирующий аденовирус затем инактивируют при помощи тепловой обработки. В настоящем изобретении rAAV преимущественно собирают не из самих клеток, а из надосадочной жидкости культуры клеток. Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предусматривается получение rAAV, и в дополнение к вышеупомянутому, rAAV можно получить при помощи способа, который включает следующее или состоит по сути из: инфицирования восприимчивых клеток с использованием rAAV, содержащим экзогенную ДНК, в том числе ДНК для экспрессии, и вирусом-помощником (например, аденовирусом, герпесвирусом, поксвирусом, например, вирусом осповакцины), где rAAV не содержит функциональный cap и/или rep (и вирус-помощник (например, аденовирус, герпесвирус, поксвирус, например, вирус осповакцины) обеспечивает функцию cap и/или rep, которой лишен rAAV); или инфицирования восприимчивых клеток rAAV, содержащим экзогенную ДНК, в том числе ДНК для экспрессии, где рекомбинантная конструкция не содержит функциональный cap и/или rep, и трансфекции указанных клеток плазмидой, предоставляющей функцию cap и/или rep, которой лишен rAAV; или инфицирования восприимчивых клеток rAAV, содержащим экзогенную ДНК, в том числе ДНК для экспрессии, где рекомбинантная конструкция не содержит функциональный cap и/или rep, где указанные клетки предоставляют функцию cap и/или rep, которой лишена рекомбинантная конструкция; или трансфекции восприимчивых клеток AAV, не содержащим функциональный cap и/или rep, и плазмидами для встраивания экзогенной ДНК в рекомбинантную конструкцию, так что экзогенная ДНК экспрессируется рекомбинантной конструкцией, и для предоставления функций rep и/или cap, причем трансфекция приводит в результате к rAAV, содержащему экзогенную ДНК, в том числе ДНК для экспрессии, который не содержит функциональный cap и/или rep.

rAAV можно получить из AAV, как описано в данном документе, и преимущественно он может представлять собой rAAV1, rAAV2, AAV5 или rAAV, имеющий гибридный капсид, который может предусматривать AAV1, AAV2, AAV5 или любую их комбинацию. Можно выбрать AAV из rAAV с учетом клеток, подлежащих нацеливанию с применением rAAV, например, можно выбрать AAV серотипов 1, 2, 5, или гибридную структуру или капсид AAV1, AAV2, AAV5, или любую их комбинацию для нацеливания на головной мозг или нервные клетки; и при этом можно выбрать AAV4 для нацеливания на сердечную ткань.

Кроме клеток 293, при осуществлении на практике настоящего изобретения можно применять другие клетки, и при этом относительная инфекционность определенных серотипов AAV in vitro по отношению к этим клеткам (смотри Grimm, D. et al, J. Virol. 82:5887-5911 (2008)) представлена ниже.

Настоящее изобретение предусматривает rAAV, который содержит или состоит по сути из экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей систему CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), например, множество кассет, содержащих или состоящих из первой кассеты, содержащей или состоящей по сути из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CRISPR-ассоциированный (Cas) белок (предполагаемые нуклеазные или хеликазные белки), например, Cas9, и термидатора, и две или более, преимущественно до предела упаковки вектора, например, всего (включая первую кассету) пять кассет, содержащих или состоящих по сути из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК (gRNA), и терминатора (например, каждая кассета схематически представлена как промотор-gRNA1-терминатор, промотор-gRNA2-терминатор … промотор-gRNA(N)-терминатор (где N относится к тому количеству, которое можно встроить, находящемуся на верхней границе предела упаковки вектора), или два или более отдельных rAAV, причем каждый содержит одну или несколько кассет системы CRISPR, например, первый rAAV, содержащий первую кассету, содержащую или состоящую по сути из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Cas, например, Cas9, и терминатора, и второй rAAV, содержащий некоторое количество, а именно четыре кассеты, содержащие или состоящие по сути из промотора, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК (gRNA), и терминатора (например, каждая кассета схематически представлена как промотор-gRNA1-терминатор, промотор-gRNA2-терминатор … npoMOTop-gRNA(N)-терминатор (где N относится к количеству того, что можно встроить, находящемуся на верхней границе предела упаковки вектора). Поскольку rAAV представляет собой ДНК-содержащий вирус, молекулы нуклеиновой кислоты в изложенном в данном документе обсуждении в отношении AAV или rAAV преимущественно представляют собой ДНК. В некоторых вариантах осуществления промотор преимущественно представляет собой промотор гена синапсина I человека (hSyn).

Дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в клетки известны специалистам в данной области. См., например, US 20030087817, включенный в данный документ при помощи ссылки. См. также литературный источник Kanasty, также включенный при помощи ссылки и обсуждаемый в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин транзиентно или не транзиентно трансфицирована одним или несколькими векторами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка трансфицирована так, как это в естественных условиях происходит у субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетка, которую трансфицируют получена от субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетка отобрана из клеток, полученных от субъекта, как, например, линии клеток. Широкий спектр линий клеток для культуры тканей известен из уровня техники. Примеры линий клеток включают, без ограничения, С8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, эпителиальные клетки почки обезьяны BS-C-1, эмбриональные фибробласты мыши BALB/ 3Т3, 3Т3 Swiss, 3T3-L1, фетальные фибробласты человека 132-d5; фибробласты мыши 10.1, 293-Т, 3Т3, 721, 9L, А2780, A2780ADR, A2780cis, А172, А20, А253, А431, А-549, ALC, В16, В35, клетки ВСР-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, ВхРС3, С3Н-10Т1/2, С6/36, Cal-27, СНО, СНО-7, CHO-IR, СНО-K1, СНО-K2, СНО-Т, СНО Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, СМТ, СТ26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, ЕМ2, ЕМ3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, Н1299, Н69, НВ54, НВ55, НСА2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, клетки JY, клетки K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, линии клеток OPCN/OPCT, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, клетки Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, линия клеток THP1, U373, U87, U937, VCaP, клетки Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR и их трансгенные варианты. Линии клеток доступны из ряда источников, известных специалистам в данной области (см., к примеру, Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) (Манассас, Вирджиния)). В некоторых вариантах осуществления клетку, трансфицированную одним или несколькими векторами, описанными в данном документе, используют для получения новой линии клеток, содержащей одну или несколько полученных из вектора последовательностей. В некоторых вариантах осуществления клетку, транзиентно трансфицированную компонентами системы CRISPR, как описано в данном документе (как, например, путем транзиентной трансфекции одним или несколькими векторами или трансфекции с использованием РНК), и модифицированную при помощи активности комплекса CRISPR, используют для получения новой линии клеток, содержащей клетки, которые содержат модификацию, но у которых отсутствует любая другая экзогенная последовательность. В некоторых вариантах осуществления клетки, транзиентно или не транзиентно трансфицированные одним или несколькими векторами, описанными в данном документе, или линии клеток, полученные из таких клеток, использовали при оценивании одного или нескольких тестовых соединений.

В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов, описанных в данном документе, используют для получения отличного от человека трансгенного животного или трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления трансгенным животным является млекопитающее, как, например, мышь, крыса или кролик. Способы получения трансгенных животных и растений известны из уровня техники и, как правило, начинаются со способа трансфекции клетки, такого как описанный в данном документе.

В другом варианте осуществления может предусматриваться устройство для доставки жидкости с матрицей игл (см., например, публикацию заявки на патент США №20110230839, закрепленной за Онкологическим исследовательским центром Фреда Хатчинсона), для доставки CRISPR-Cas в плотную ткань. Устройство согласно публикации заявки на патент США №20110230839 для доставки жидкости в плотную ткань может содержать множество игл, расположенных в виде матрицы; множество емкостей, каждая из которых находится в жидкостном соединении с соответствующей одной иглой из множества игл; и множество приводов, функционально связанных с соответствующими емкостями из множества емкостей и выполненных с возможностью регулирования давления жидкости в емкости. В определенных вариантах осуществления каждый из множества приводов может содержать один из множества поршней, причем первая концевая часть каждого из множества поршней находится в соответствующей одной емкости из множества емкостей, и в определенных дополнительных вариантах осуществления поршни из множества поршней функционально связаны вместе по соответствующим вторым концевым частям с обеспечением возможности одновременного нажатия. В определенных других дополнительных вариантах осуществления может предусматриваться управляющий элемент для поршней, сконфигурированный с возможностью выборочного нажатия всех из множества поршней с различной скоростью. В других вариантах осуществления каждый из множества приводов может содержать одну из множества жидкостных поточных линий, имеющих первую и вторую концевые части, причем первая концевая часть каждой из множества жидкостных поточных линий соединена с соответствующей одной емкостью из множества емкостей. В других вариантах осуществления устройство может содержать источник давления жидкости, и при этом каждый из множества приводов предусматривает гидравлическую муфту между источником давления жидкости и соответствующей одной емкостью из множества емкостей. В дополнительных вариантах осуществления источник давления жидкости может предусматривать по меньшей мере одно из следующих: компрессор, вакуумный накопитель, перистальтический насос, основной цилиндр, микрожидкостный насос и клапан. В другом варианте осуществления каждая из множества игл может содержать множество отверстий, распределенных вдоль ее длины.

Модификация мишени

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке, что может происходить in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления способ включает взятие образца или биопсию клетки или популяции клеток от человека, или отличного от человека животного, или растения и модификацию клетки или клеток. Культивирование можно осуществлять на любой стадии ex vivo. Клетку или клетки можно даже повторно вводить отличному от человека животному или в растение. Что касается повторно вводимых клеток, особенно предпочтительно, чтобы эти клетки являлись стволовыми клетками.

В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления указанного целевого полинуклеотида с модификацией таким образом целевого полинуклеотида, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с полинуклеотидом, вследствие чего указанное связывание приводит к повышенной или пониженной экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью. Аналогичные факторы и условия распространяются на способы модификации целевого полинуклеотида, как изложено выше. Фактически, эти варианты отбора образцов, культивирования и повторного введения охватывают аспекты настоящего изобретения.

Действительно, в любом аспекте настоящего изобретения комплекс CRISPR может содержать фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью, где указанная направляющая последовательность может быть связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, может гибридизоваться с tracr-последовательностью. Аналогичные факторы и условия распространяются на способы модификации целевого полинуклеотида, как изложено выше.

Наборы

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие любой один или несколько из элементов, раскрытых в приведенных выше способах и композициях. Элементы могут быть предоставлены отдельно или в комбинациях и могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере, как, например, флаконе, бутыли или пробирке. В некоторых вариантах осуществления набор включает инструкции на одном или нескольких языках, например, на более чем одном языке.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько реагентов для применения в способе, в котором используется один или несколько элементов, описанных в данном документе. Реагенты могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере. Например, набор может предусматривать один или несколько реакционных буферов или буферов для хранения. Реагенты могут быть предоставлены в форме, которая применима в конкретном анализе, или в форме, которая предусматривает добавление одного или нескольких других компонентов перед применением (к примеру, в форме концентрата или лиофилизированной форме). Буфер может быть любым буфером, в том числе, без ограничения, буфером с карбонатом натрия, буфером с бикарбонатом натрия, боратным буфером, Tris-буфером, буфером MOPS, буфером HEPES и их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления буфер является щелочным. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет значение рН от приблизительно 7 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько олигонуклеотидов, соответствующих направляющей последовательности, для встраивания в вектор, чтобы функционально связать направляющую последовательность и регуляторный элемент. В некоторых вариантах осуществления набор содержит матричный полинуклеотид для гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько векторов и/или один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе. Преимущественно набор может предоставлять все элементы системы по настоящему изобретению.

Комплекс CRISPR

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы применения одного или нескольких элементов системы CRISPR. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению обеспечивает эффективное средство модификации целевого полинуклеотида. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению характеризуется большим разнообразием полезных свойств, включающих модификацию (например, делецию, вставку, транслокацию, инактивацию, активацию) целевого полинуклеотида во множестве типов клеток. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению как таковой имеет широкий спектр дрименений, к примеру, в генной терапии, скрининге лекарственных средств, диагностике и прогнозировании заболеваний. Иллюстративный комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде. Направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ расщепления целевого полинуклеотида. Способ предусматривает модификацию целевого полинуклеотида с применением комплекса CRISPR, который связывается с целевым полинуклеотидом и осуществляет расщепление указанного целевого полинуклеотида. Как правило, комплекс CRISPR согласно настоящему изобретению при введении в клетку создает разрыв (например, однонитевой или двухнитевой разрыв) в геномной последовательности. Например, способ можно применять для расщепления гена, ответственного за развитие заболевания, в клетке.

Репарация разрыва, созданного комплексом CRISPR, может осуществляться посредством способа репарации, например, путем склонного к ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ) или высокоточной репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR) (фигура 29). В ходе данного способа репарации в геномную последовательность может быть введен экзогенный матричный полинуклеотид. В некоторых способах способ HDR используют для модификации геномной последовательности. Например, в клетку вводят экзогенный матричный полинуклеотид, содержащий последовательность, подлежащую встраиванию, фланкированную последовательностью, расположенной выше, и последовательностью, расположенной ниже. Последовательности, расположенные выше и ниже, характеризуются сходством последовательности с каждой стороной сайта встраивания в хромосоме.

При необходимости донорный полинуклеотид может представлять собой ДНК, например, плазмидную ДНК, бактериальную искусственную хромосому (ВАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC), вирусный вектор, линейный фрагмент ДНК, ПЦР-фрагмент, "оголенную" нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе со средством доставки, например, липосомой или полоксамером.

Экзогенный матричный полинуклеотид содержит последовательность, подлежащую встраиванию (например, мутантный ген). Последовательность, предназначенная для встраивания, может представлять собой последовательность, эндогенную или экзогенную по отношению к клетке. Примеры последовательности, подлежащей встраиванию, включают полинуклеотиды, кодирующие белок или некодирующую РНК (например, микроРНК). Таким образом, последовательность, предназначенная для встраивания, может быть функционально связанной с соответствующей регуляторной последовательностью или последовательностями. В альтернативном случае последовательность, подлежащая встраиванию, может обеспечивать регуляторную функцию.

Последовательности, расположенные выше и ниже, в экзогенном матричном полинуклеотиде выбирають так, чтобы содействовать рекомбинации между хромосомной последовательностью, представляющей интерес, и донорным полинуклеотидом. Последовательность, расположенная выше, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает сходством последовательности с геномной последовательностью, расположенной выше целевого сайта интеграции. Аналогично, последовательность, расположенная ниже, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает сходством последовательности с хромосомной последовательностью, расположенной ниже целевого сайта интеграции. Последовательности, расположенные выше и ниже в экзогенном матричном полинуклеотиде, могут характеризоваться 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью последовательности с целевой геномной последовательностью. Предпочтительно последовательности, расположенные выше и ниже в экзогенном матричном полинуклеотиде, могут характеризоваться приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с целевой геномной последовательностью. В некоторых способах последовательности, расположенные выше и ниже в экзогенном матричном полинуклеотиде, имеют приблизительно 99% или 100% идентичность последовательности с целевой геномной последовательностью.

Последовательность, расположенная выше или ниже, может содержать от приблизительно 20 п.о. до приблизительно 2500 п.о., например, приблизительно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 или 2500 п.о. В некоторых способах иллюстративная последовательность, расположенная выше или ниже, имеет от приблизительно 200 п.о. до приблизительно 2000 п.о., от приблизительно 600 п.о. до приблизительно 1000 п.о. или, в частности, от приблизительно 700 п.о. до приблизительно 1000 п.о.

В некоторых способах экзогенный матричный полинуклеотид может дополнительно содержать маркер. Такой маркер может облегчать скрининг на предмет целевых интеграции. Примеры подходящих маркеров включают сайты рестрикции, флуоресцентные белки или селектируемые маркеры. Экзогенный матричный полинуклеотид согласно настоящему изобретению можно сконструировать с применением методик рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., 2001 и Ausubel et al., 1996).

В иллюстративном способе модификации целевого полинуклеотида посредством интеграции экзогенного матричного полинуклеотида в геномную последовательность вводят двухнитевой разрыв при помощи комплекса CRISPR, осуществляют репарацию разрыва посредством гомологичной рекомбинации с участием экзогенного матричного полинуклеотида, так что матрица интегрируется в геном. Наличие двухнитевого разрыва обеспечивает интеграцию матрицы.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. Способ включает повышение или снижение экспрессии целевого полинуклеотида при помощи комплекса CRISPR, который связывается с полинуклеотидом.

В некоторых способах целевой полинуклеотид можно инактивировать для осуществления модификации экспрессии в клетке. Например, при связывании комплекса CRISPR с целевой последовательностью в клетке целевой полинуклеотид инактивируется таким образом, что последовательность не транскрибируется, кодируемый белок не продуцируется или последовательность не функционирует так, как последовательность дикого типа. Например, последовательность, кодирующую белок или микроРНК, можно инактивировать таким образом, что белок не будет продуцироваться.

В некоторых способах регуляторную последовательность можно инактивировать таким образом, что она более не функционирует в качестве регуляторной последовательности. Как используется в данном документе, "регуляторная последовательность" относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая оказывает влияние на транскрипцию, трансляцию или доступность последовательности нуклеиновой кислоты. Примеры регуляторной последовательности включают промотор, терминатор транскрипции и энхансер, которые являются регуляторными последовательностями.

Инактивированная целевая последовательность может содержать мутацию по типу делеции (т.е. делецию одного или нескольких нуклеотидов), мутацию по типу вставки (т.е. вставку одного или нескольких нуклеотидов) или нонсенс-мутацию (т.е. замену одного нуклеотида другим нуклеотидом, так что вводится стоп-кодон). В некоторых способах инактивация целевой последовательности приводит в результате к "нокауту" целевой последовательности.

Модели заболеваний

Способ по настоящему изобретению можно применять для создания растения, животного или клетки, которые можно использовать в качестве модели заболевания. Как используется в данном документе, "заболеванием" называют заболевание, нарушение или симптом у субъекта. Например, способ по настоящему изобретению можно использовать для создания животного или клетки, которые содержат модификацию одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, ассоциированных с заболеванием, или растения, животного или клетки, в которых изменены экспрессии одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, ассоциированных с заболеванием. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать последовательность белка, ассоциированного с заболеванием, или может представлять собой регуляторную последовательность, ассоциированную с заболеванием. Соответственно, подразумевается, что в вариантах осуществления настоящего изобретения растение, субъект, пациент, организм или клетка могут относиться к субъекту, отличному от человека, пациенту, организму или клетке. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает растение, животное или клетку, полученных при помощи способов по настоящему изобретению, или их потомство. Потомство может представлять собой клон полученного растения или животного, или его можно получить при помощи полового размножения посредством скрещивания с другими индивидами того же вида для дальнейшей интрогрессии требуемых признаков их потомкам. Клетка может находиться in vivo или ex vivo в случае многоклеточных организмов, в частности, животных или растений. В случае, если клетка находится в культуре, можно получить линию клеток при выполнении соответствующих условий культивирования, и предпочтительно, если клетка соответствующим образом приспособлена для этой цели (например, стволовая клетка). Также предусматриваются линии бактериальных клеток, полученные согласно настоящему изобретению. Следовательно, также предусматриваются линии клеток.

В некоторых способах модель заболевания можно использовать для изучения влияния мутаций на животное или клетку и развитие и/или прогрессирование заболевания с применением показателей, обычно используемых при изучении заболевания. В альтернативном случае такая модель заболевания является применимой для изучения влияния фармацевтически активного соединения на заболевание.

В некоторых способах модель заболевания можно использовать для оценки эффективности потенциальной стратегии генной терапии. Таким образом, ген или полинуклеотид, ассоциированный с заболеванием, можно модифицировать, так что развитие и/или прогрессирование заболевания замедляется или уменьшается. В частности, способ предусматривает модификацию гена или полинуклеотида, ассоциированного с заболеванием, так что продуцируется измененный белок, и в результате у животного или клетки наблюдается измененный ответ. Соответственно, в некоторых способах генетически модифицированное животное можно сравнивать с животным, предрасположенным к развитию заболевания, так что можно оценить эффект осуществления генной терапии.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ получения биологически активного средства, которое модулирует процесс передачи сигнала в клетке, ассоциированный с геном, ответственным за развитие заболевания. Способ предусматривает приведение тестового соединения в контакт с клеткой, содержащей один или несколько векторов, которые управляют экспрессией одного или нескольких из фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности; и обнаружение изменения при считывании, которое свидетельствует об уменьшении или усилении процесса передачи сигнала в клетке, ассоциированного, например, с мутацией в гене, ответственном за развитие заболевания, который содержится в клетке.

Клеточную модель, в том числе органоид или совокупность клеток, как описано в данном документе, или животную модель можно сконструировать в сочетании со способом по настоящему изобретению для скрининга изменения клеточной функции. Такую модель можно использовать для изучения влияния геномной последовательности, модифицированной при помощи комплекса CRISPR согласно настоящему изобретению, на представляющую интерес клеточную функцию. Например, модель клеточной функции можно использовать для исследования воздействия модифицированной геномной последовательности на внутриклеточную передачу сигнала или внеклеточную передачу сигнала. В альтернативном случае, модель клеточной функции можно использовать для исследования воздействий модифицированной геномной последовательности на сенсорную чувствительность. В некоторых таких моделях одна или несколько геномных последовательностей, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, в модели является модифицированной.

Специально было исследовано несколько моделей заболеваний. Они включают гены CHD8, KATNAL2 и SCN2A, связанные с риском развития аутизма de novo; и ген UBE3A, связанный с синдромным аутизмом (синдром Ангельмана). Эти гены и полученные в результате модели аутизма, разумеется, являются предпочтительными, но служат для того, чтобы продемонстрировать широкую применимость настоящего изобретения по отношению к генам и соответствующим моделям.

Измененную экспрессию одной или нескольких геномных последовательностей, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, можно определять при помощи анализа различия по уровням мРНК соответствующих генов между тестируемой модельной клеткой и контрольной клеткой, если их приводят в контакт с кандидатным средством. В альтернативном случае различную экспрессию последовательностей, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, определяют посредством выявления различия по уровню кодируемого полипептида или продукта гена.

Для анализа индуцированного определенным средством изменения уровня мРНК-транскриптов или соответствующих полинуклеотидов, нуклеиновую кислоту, которая содержится в образце, вначале экстрагируют в соответствии со стандартными способами из уровня техники. Например, мРНК можно выделять с использованием различных литических ферментов или химических растворов в соответствии с методиками, изложенными в Sambrook et al. (1989), или экстрагировать при помощи смол, связывающих нуклеиновые кислоты, в соответствии с прилагаемыми инструкциями, предоставленными производителями. мРНК, которая содержалась в экстрагированном образце нуклеиновой кислоты, затем выявляли при помощи методик амплификации или общепринятых гибридизационных анализов (например, с помощью нозерн-блоттинга) в соответствии со способами, широко известными из уровня техники или основанными на способах, проиллюстрированных в данном документе.

Для целей настоящего изобретения амплификация означает любой способ с использованием праймера и полимеразы, способной обеспечивать репликацию целевой последовательности с достаточной точностью. Амплификацию можно осуществлять при помощи природных или рекомбинантных ДНК-полимераз, таких как TaqGold™, ДНК-полимераза Т7, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Е. coli и обратная транскриптаза. Предпочтительным способом амплификации является ПЦР. В частности, выделенную РНК можно подвергать анализу с обратной транскрипцией, который объединен с количественной полимеразной цепной реакцией (RT-PCR) для количественного определения уровня экспрессии последовательности, ассоциированной с биохимическим путем передачи сигнала.

Выявление уровня экспрессии генов можно осуществлять в анализе амплификации в режиме реального времени. В одном аспекте амплифицированные продукты можно непосредственно визуализировать при помощи флуоресцентных ДНК-связывающих средств, в том числе, без ограничения, ДНК-интеркаляторов и средств, связывающихся с бороздкой спирали ДНК. Поскольку количество интеркаляторов, включенных в двухнитевые молекулы ДНК, как правило, является пропорциональным количеству амплифицированных ДНК-продуктов, можно без труда определить количество амплифицированных продуктов путем количественного определения флуоресценции интеркалирующего красителя с применением общепринятых оптических систем из уровня техники. ДНК-связывающий краситель, подходящий для этой задачи, охватывает SYBR зеленый, SYBR синий, DAPI, йодид пропидия, Hoechst, SYBR золотой, бромид этидия, акридины, профлавин, акридиновый оранжевый, акрифлавин, фторкумарин, эллиптицин, дауномицин, хлорохин, дистамицин D, хромомицин, хомидий, митрамицин, комплексы рутений-полипиридил, антрамицин и т.п.

В другом аспекте можно использовать другие флуоресцентные метки, например, зонды, специфичные по отношению к последовательности, в реакции амплификации для обеспечения выявления и количественного определения амплифицированных продуктов. Количественная амплификация с использованием зонда основана на специфичном по отношению к последовательности выявлении требуемого амплифицированного продукта. Используются флуоресцентные зонды, специфичные по отношению к мишени (например, зонды TaqMan®), что приводит в результате к увеличению специфичности и чувствительности. Способы осуществления количественной амплификации с использованием зонда являются общепринятыми в данной области и описаны в патенте США №5210015.

В еще одном аспекте можно осуществлять общепринятые гибридизационные анализы с использованием гибридизационных зондов, которые характеризуются гомологией последовательности с последовательностями, ассоциированными с биохимическим путем передачи сигнала. Как правило, в реакции гибридизации зондам дают возможность образовать стабильные комплексы с последовательностями, ассоциированными с биохимическим путем передачи сигнала, которые содержатся в биологическом образце, полученном от тестируемого субъекта. Специалист в данной области поймет, что если антисмысловая нуклеиновая кислота используется в качестве зонда, то целевые полинуклеотиды, представленные в образце, выбирают так, чтобы они были комплементарными последовательностям антисмысловых нуклеиновых кислот. Напротив, если нуклеотидный зонд является смысловой нуклеиновой кислотой, то целевой полинуклеотид выбирают так, чтобы он был комплементарным последовательностям смысловой нуклеиновой кислоты.

Гибридизацию можно осуществлять в условиях различной жесткости. Подходящие условия гибридизации для осуществления на практике настоящего изобретения являются такими, что обеспечивающее распознавание взаимодействие зонда с последовательностями, ассоциированными с биохимическим путем передачи сигнала, является как достаточно специфичным, так и достаточно стабильным. Условия, которые приводят к увеличению жесткости реакции гибридизации, хорошо известны и опубликованы в уровне техники. См., например (Sambrook, et al., (1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, second edition). Гибридизационный анализ можно осуществлять с использованием зондов, иммобилизованных на любой твердой подложке, в том числе без ограничения нитроцеллюлозной, стеклянной, кремниевой, и ряда ДНК-чипов. Предпочтительный гибридизационный анализ проводят на генных чипах высокой плотности, описанных в патенте США №5445934.

Для удобного выявления комплексов зонд-мишень, образованных в ходе гибридизационного анализа, осуществляют конъюгирование нуклеотидного зонда с детектируемой меткой. Детектируемые метки, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают любую композицию, выявляемую при помощи фотохимических, биохимических, спектроскопических, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Широкий спектр соответствующих детектируемых меток известен из уровня техники, причем он включает флуоресцентные или хемилюминесцентные метки, метки на основе радиоактивных изотопов, ферментные или другие лиганды. В предпочтительных вариантах осуществления, вероятно, предпочтительной будет флуоресцентная метка или ферментная метка, например, дигоксигенин, β-галактозидаза, уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, комплекс авидин/биотин.

Способы выявления, применяемые для выявления или количественного определения интенсивности гибридизации, как правило, будут зависеть от метки, выбранной выше. Например, радиоактивные метки можно выявлять с использованием фотографической пленки или фосфовизуализатора. Можно выявлять флуоресцентные маркеры и проводить количественное определение с использованием фотодетектора для выявления излучаемого света. Ферментные метки, как правило, выявляют посредством снабжения фермента субстратом и измерения количества продукта реакции, образованного при воздействии фермента на субстрат; и, наконец, колориметрические метки выявляют посредством простой визуализации цветной метки.

Индуцированное определенным средством изменение экспрессии последовательностей, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, также можно определять посредством исследования соответствующих продуктов генов. Определение уровня белка, как правило, включает а) приведение белка, содержащегося в биологическом образце, в контакт со средством, которое специфично связывается с белком, ассоциированным с биохимическим путем передачи сигнала; и (b) идентификацию любого комплекса средство:белок, образованного таким образом. В одном аспекте данного варианта осуществления средство, которое специфически связывает белок, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала, представляет собой антитело, предпочтительно моноклональное антитело.

Реакцию осуществляют посредством приведения средства в контакт с образцом белков, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, полученным из тестируемых образцов, при условиях, которые обеспечивают возможность образования комплекса между средством и белками, ассоциированными с биохимическим путем передачи сигнала. Образование комплекса можно выявлять непосредственно или опосредованно в соответствии со стандартными методиками из уровня техники. В способе непосредственного выявления средства снабжают детектируемой меткой и непрореагировавшие средства можно удалять от комплекса; количество оставшейся метки, таким образом, отражает количество образованного комплекса. Для такого способа предпочтительно выбирать метки, которые остаются прикрепленными к средствам даже при жестких условиях отмывки. Предпочтительно, чтобы метка не препятствовала реакции связывания. В альтернативном случае для методики опосредованного выявления можно использовать средство, которое содержит метку, введенную либо химическим, либо ферментативным путем. Желаемая метка, как правило, не препятствует связыванию или стабильности полученного в результате комплекса средство:полипептид. Однако, метка, как правило, разработана так, чтобы она была доступной для эффективного связывания антителом и, следовательно, выработки детектируемого сигнала.

Широкий спектр меток, подходящих для выявления уровней белка, известен из уровня техники. Неограничивающие примеры включают радиоактивные изотопы, ферменты, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, биолюминесцентные соединения и хемилюминесцентные соединения.

Количество комплексов средство:полипептид, образованных в ходе реакции связывания, можно количественно определять при помощи стандартных количественных анализов. Как проиллюстрировано выше, образование комплекса средство:полипептид можно измерить непосредственно по количеству метки, оставшейся в участке связывания. В альтернативном случае белок, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала, тестируют в отношении его способности конкурировать с меченым аналогом за участки связывания на специфическом средстве. В этом конкурентном анализе количество захваченной метки является обратно пропорциональным количеству последовательностей белка, ассоциированного с биохимическим путем передачи сигнала, присутствующих в тестируемом образце.

Ряд методик анализа белка, основанных на общих принципах, изложенных выше, доступен из уровня техники. Они включают, без ограничения, радиоиммунные анализы, ELISA (твердофазные ферментные иммунорадиометрические анализы), "сэндвич"-иммуноанализы, иммунорадиометрические анализы, иммуноанализы in situ (с применением, например, коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток), вестерн-блот анализ, иммунопреципитационные анализы, иммунофлуоресцентные анализы и SDS-PAGE.

Антитела, обеспечивающие специфичное распознавание белков, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, или связывающие их, являются предпочтительными для осуществления вышеупомянутых анализов белка. При необходимости можно использовать антитела, которые обеспечивают распознавание конкретного типа посттрансляционных модификаций (например, модификации, индуцируемые биохимическим путем передачи сигнала). Посттрансляционные модификации включают, без ограничения, гликозилирование, липидизацию, ацетилирование и фосфорилирование. Эти антитела можно приобрести у коммерческих поставщиков. Например, антитела к фосфотирозину, которые обеспечивают специфичное распознавание фосфорилированных по тирозину белков, доступны от ряда поставщиков, включая Invitrogen и Perkin Elmer. Антитела к фосфотирозину являются особенно применимыми при выявлении белков, которые различным образом фосфорилируются по их тирозиновым остаткам в ответ на стресс, связанный с ER. Такие белки включают, без ограничения, эукариотический фактор инициации трансляции 2 альфа (eIF-2α). В альтернативном случае эти антитела можно получить при помощи общепринятых методик поликлональных или моноклональных антител посредством иммунизации животного-хозяина или клетки, продуцирующей антитела, целевым белком, который характеризуется необходимой посттрансляционной модификацией.

При осуществлении заявленного способа на практике может быть необходимо определить профиль экспрессии белка, ассоциированного с биохимическим путем передачи сигнала, в различных тканях организма, в различных типах клеток и/или в различных субклеточных структурах. Данные исследования можно проводить с применением тканеспецифичных, специфичных к определенным клеткам или специфичных к определенным субклеточным структурам антител, способных связываться с белковыми маркерами, которые преимущественно экспрессируются в определенных тканях, типах клеток или субклеточных структурах.

Измененную экспрессию гена, ассоциированного с биохимическим путем передачи сигнала, также можно определять при помощи исследования изменения активности продукта гена по сравнению с контрольной клеткой. Анализ индуцированного определенным средством изменения активности белка, ассоциированного с биохимическим путем передачи сигнала, будет зависеть от биологической активности и/или исследуемого пути передачи сигнала. Например, если белок представляет собой киназу, изменение его способности фосфорилировать субстрат(субстраты) на последующих стадиях можно определять посредством ряда анализов, известных из уровня техники. Типичные анализы включают, без ограничения, иммуноблоттинг и иммунопреципитацию с использованием антител, таких как антитела к фосфотирозину, которые обеспечивают распознавание фосфорилированных белков. Кроме того, активность киназы можно выявлять при помощи высокопроизводительных хемилюминесцентных анализов, например, анализов AlphaScreen™ (доступного от Perkin Elmer) и eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).

Если белок, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала, является частью сигнального каскада, который приводит к колебанию внутриклеточных условий рН, молекулы, чувствительные к рН, например, флуоресцентные рН-чувствительные красители, можно использовать в качестве репортерных молекул. В другом примере, если белок, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала, представляет собой ионный канал, можно отслеживать колебания мембранного потенциала и/или внутриклеточной концентрации ионов. Ряд коммерческих наборов и высокопроизводительных устройств являются особенно подходящими для быстрого и надежного скрининга модуляторов ионных каналов. Типичные инструменты включают FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) и VIPR (Aurora Biosciences). Эти инструменты способны обеспечивать одновременное выявление реакций в более чем 1000 лунках с образцом в микропланшете и обеспечивать измерение в реальном времени и функциональные данные в течение секунды или даже миллисекунды.

При осуществлении на практике любых способов, раскрытых в данном документе, подходящий вектор можно вводить в клетку или эмбрион посредством одного или нескольких способов, известных из уровня техники, в том числе, без ограничения, микроинъекции, электропорации, сонопорации, баллистической трансфекции, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция, трансфекции с помощью катионных липидньгх частиц, липосомной трансфекции, трансфекции при помощи дендримеров, трансфекции посредством теплового шока, трансфекции посредством нуклеофекции, магнитофекции, липофекции, импалефекции, оптической трансфекции, поглощения нуклеиновых кислот, стимулируемого проприетарным средством, и доставки при помощи липосом, иммунолипосом, виросом или искусственных вирионов. В некоторых способах вектор вводят в эмбрион посредством микроинъекции. Можно осуществлять микрринъекцию вектора или векторов в ядро или цитоплазму эмбриона. В некоторых способах вектор или векторы можно вводить в клетку посредством нуклеофекции.

Целевым полинуклеотидом для комплекса CRISPR может быть любой полинуклеотид, эндогенный или экзогенный по отношению к эукариотической клетке. Например, целевым полинуклеотидом может быть полинуклеотид, находящийся в ядре эукариотической клетки. Целевой полинуклеотид может быть последовательностью, кодирующей продукт гена (к примеру, белок), или некодирующей последовательностью (к примеру, регуляторным полинуклеотидом или избыточной ДНК).

Примеры целевых полинуклеотидов включают последовательность, ассоциированную с биохимическим путем передачи сигнала, к примеру, ген или полинуклеотид, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала. Примеры целевых полинуклеотидов включают ассоциированные с заболеваниями гены или полинуклеотиды. "Ассоциированный с заболеванием" ген или полинуклеотид означает любой ген или полинуклеотид, который обеспечивает продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из пораженных заболеванием тканей, по сравнению с тканями или клетками контроля без заболевания. Это может быть ген, который начинает экспрессироваться на аномально высоком уровне; это может быть ген, который начинает экспрессироваться на аномально низком уровне, где измененная экспрессия коррелирует с появлением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированный с заболеванием ген также означает ген, несущий мутацию(мутации) или генетическое изменение, который непосредственно ответственен или находится в неравновесном сцеплении с геном(генами), ответственным(ответственными) за этиологию заболевания. Транскрибированные или транслированные продукты могут быть известными или неизвестными и могут быть на нормальном уровне или на аномальном уровне.

Целевым полинуклеотидом для комплекса CRISPR может быть любой полинуклеотид, эндогенный или экзогенный по отношению к эукариотической клетке. Например, целевым полинуклеотидом может быть полинуклеотид, находящийся в ядре эукариотической клетки. Целевой полинуклеотид может быть последовательностью, кодирующей продукт гена (к примеру, белок), или некодирующей последовательностью (к примеру, регуляторным полинуклеотидом или избыточной ДНК). Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что целевая последовательность должна быть ассоциирована с РАМ (мотивом, прилегающим к протоспейсеру); то есть короткой последовательностью, распознаваемой комплексом CRISPR. Определенные требования в отношении последовательности и длины РАМ различаются в зависимости от применяемого фермента CRISPR, но РАМ, как правило, является последовательностью в 2-5 пар оснований, прилегающей к протоспейсеру (то есть целевой последовательности). Примеры последовательностей РАМ приведены в разделе "Примеры" ниже, и специалист в данной области сможет выявить дополнительные последовательности РАМ для применения с данным ферментом CRISPR.

Целевой полинуклеотид для комплекса CRISPR может включать некоторое количество ассоциированных с заболеваниями генов и полинуклеотидов, а также генов и полинуклеотидов, ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала, которые перечислены в предварительных заявках на патенты США 61/736527 и 61/748427 с общей ссылкой BI-2011/008/WSGR, номер в реестре 44063-701.101, и BI-2011/008/WSGR, номер в реестре 44063-701.102, соответственно, обе из которых озаглавлены "СИСТЕМЫ, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ", поданных 12 декабря 2012 г. и 2 января 2013 г., соответственно, содержания всех из которых включены в данный документ при помощи ссылки во всей их полноте.

Примеры целевых полинуклеотидов включают последовательность, ассоциированную с биохимическим путем передачи сигнала, к примеру, ген или полинуклеотид, ассоциированный с биохимическим путем передачи сигнала. Примеры целевых полинуклеотидов включают ассоциированные с заболеваниями гены или полинуклеотиды. "Ассоциированный с заболеванием" ген или полинуклеотид означает любой ген или полинуклеотид, который обеспечивает продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из пораженных заболеванием тканей, по сравнению с тканями или клетками контроля без заболевания. Это может быть ген, который начинает экспрессироваться на аномально высоком уровне; это может быть ген, который начинает экспрессироваться на аномально низком уровне, где измененная экспрессия коррелирует с появлением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированный с заболеванием ген также означает ген, несущий мутацию(мутации) или генетическое изменение, который непосредственно ответственен или находится в неравновесном сцеплении с геном(генами), ответственным(ответственными) за этиологию заболевания. Транскрибированные или транслированные продукты могут быть известными или неизвестными и могут быть на нормальном уровне или на аномальном уровне.

Примеры ассоциированных с заболеваниями генов и полинуклеотидов перечислены в таблицах А и В. Конкретная информация в отношении заболеваний доступна от Института медицинской генетики Маккьюсика-Натанса при Университете Джонса Хопкинса (Балтимор, Мэриленд) и Национального центра биотехнологической информации Национальной библиотеки медицины (Бетесда, Мэриленд), доступных во всемирной сети Интернет. Примеры ассоциированных с биохимическим путем передачи сигнала генов и полинуклеотидов перечислены в таблице С.

Мутации в этих генах и путях могут приводить к продуцированию несоответствующих белков или белков в несоответствующих количествах, которые воздействуют на функцию. Дополнительные примеры генов, заболеваний и белков, таким образом, включены при помощи ссылки из предварительной заявки на патент США 61/736527, поданной 12 декабря 2012 г. Такие гены, белки и пути могут быть целевым полинуклеотидом комплекса CRISPR.

Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к способам и композициям, связанным с нокаутом генов, амплификацией генов и репарацией конкретных мутаций, ассоциированных с нестабильностью ДНК-повторов и неврологическими нарушениями (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011 - Medical). Как было обнаружено, определенные аспекты последовательностей тандемных повторов ответственны за более чем двадцать заболеваний человека (New insights into repeat instability: role of RNA⋅DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep-Oct; 7(5):551-8). Система CRISPR-Cas может быть приспособлена для коррекции таких дефектов геномной нестабильности.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к использованию системы CRISPR-Cas для коррекции дефектов в генах ЕМР2А и ЕМР2В, которые, как было обнаружено, ассоциированы с болезнью Лафора. Болезнь Лафора представляет собой аутосомно-рецессивное состояние, которое характеризуется прогрессирующей миоклонус-эпилепсией, которая может начинаться в виде эпилептических приступов в подростковом возрасте. Некоторые случаи заболевания могут вызываться мутациями в генах, которые уже были выявлены. Заболевание вызывает приступы, мышечные спазмы, затрудненную ходьбу, слабоумие и, в конечном итоге, смерть. В настоящее время не существует терапии, которая показала эффективность против прогрессировали заболевания. На другие генетические расстройства, ассоциированные с эпилепсией, также можно целенаправленно воздействовать при помощи системы CRISPR-Cas, и лежащая в основе генетика дополнительно описана в Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, edited by Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009).

Способы согласно публикации заявки на патент США №20110158957, закрепленной за Sangamo BioSciences, Inc., связанные с инактивацией генов Т-клеточных рецепторов (TCR), также можно модифицировать для применения с системой CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению. В другом примере способы согласно публикации заявки на патент США №20100311124, закрепленной за Sangamo BioSciences, Inc., и публикации заявки на патент США №20110225664, закрепленной за Cellectis, оба из которых связаны с инактивацией экспрессии гена глутаминсинтетазы, также можно модифицировать для применения с системой CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению.

Некоторые дополнительные аспекты настоящего изобретения касаются коррекции дефектов, ассоциированных с широким спектром наследственных заболеваний, которые дополнительно описаны на веб-сайте Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health) в тематическом подразделе "Наследственные заболевания" ("Genetic Disorders") (веб-сайт по адресу health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Наследственные заболевания головного мозга могут включать, без ограничения, адренолейкодистрофию, агенезию мозолистого тела, синдром Айкарди, синдром Альперса, болезнь Альцгеймера, синдром Барта, болезнь Баттена, CADASIL, мозжечковую дегенерацию, болезнь Фабри, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, болезнь Гентингтона и другие связанные с триплетным повтором нарушения, болезнь Лея, синдром Леша-Найхана, болезнь Менкеса, типы митохондриальной миопатии и кольпоцефалию по критериям NINDS. Такие заболевания дополнительно описаны на вебсайте Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health) в тематическом подразделе "Наследственные заболевания головного мозга" ("Genetic Brain Disorders").

В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть неоплазия. В некоторых вариантах осуществления, где состоянием является неоплазия, гены, на которые целенаправленно воздействуют, являются любыми из перечисленных в таблице А (в данном случае PTEN и так далее). В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть возрастная дегенерация желтого пятна. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть шизофреническое нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с тринуклеотидными повторами нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть синдром ломкой Х-хромосомы. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с секретазой нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с прионами нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть ALS. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть наркомания. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть аутизм. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть болезнь Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть воспаление. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть болезнь Паркинсона.

Например, в публикации заявки на патент США №20110023145 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с расстройствами аутистического спектра (ASD). Расстройства аутистического спектра (ASD) представляют собой группу расстройств, характеризующихся качественным нарушением социального взаимодействия и коммуникации, а также ограниченными повторяющимися и стереотипными паттернами поведения, интересов и видов деятельности. Три расстройства, аутизм, синдром Аспергера (AS) и неспецифическое первазивное расстройство развития (PDD-NOS), относятся к одному и тому же расстройству с различными степенями тяжести, ассоциированными с умственной деятельностью и медицинскими состояниями. ASD преимущественно являются расстройствами, которые предопределены наследственными факторами, с наследуемостью приблизительно 90%.

В публикации заявки на патент США №20110023145 предусматривается редактирование любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, ассоциированные с ASD, что можно применять по отношению к системе CRISPR-Cas согласно настоящему изобретению. Белки, ассоциированные с ASD, как правило, выбирают на основании экспериментально установленной ассоциации белка, ассоциированного с ASD, с возникновением или симптомом ASD. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, связанного с ASD, может быть повышенной или пониженной в популяции с ASD по сравнению с популяцией без ASD. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае белки, ассоциированные с ASD, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, последовательного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

Неограничивающие примеры болезненных состояний или расстройств, которые могут быть ассоциированы с белками, ассоциированными с ASD, включают аутизм, синдром Аспергера (AS), неспецифическое первазивное расстройство развития (PDD-NOS), синдром Ретта, туберозный склероз, фенилкетонурию, синдром Смита-Лемли-Опица и синдром ломкой Х-хромосомы. В качестве неограничивающего примера, белки, ассоциированные с ASD, включают, без ограничения, следующие белки: АТР10С - аминофосфолипид-транспортирующую АТФазу (АТР10С), МЕТ - МЕТ-рецепторную тирозинкиназу, BZRAP1, MGLUR5 (GRM5) - метаботропный глутаматный рецептор 5 (MGLUR5), CDH10 - кадгерин-10, MGLUR6 (GRM6) - метаботропный глутаматный рецептор 6 (MGLUR6), CDH9 - кадгерин-9, NLGN1 - нейролигин-1, CNTN4 - контактин-4, NLGN2 - нейролигин-2, CNTNAP2 - белок 2, подобный контактин-ассоциированному белку (CNTNAP2), SEMA5A - нейролигин-3, DHCR7 - 7-дегидрохолестеринредуктазу (DHCR7), NLGN4X - нейролигин-4 Х-связанный, NLGN4Y - нейролигин-4 Y-связанный, DOC2A - альфа-белок, содержащий двойной С2-подобный домен, DPP6 - белок 6, подобный дипептидиламинопептидазе, NLGN5 - нейролигин-5, EN2 - белок 2, кодируемый гомеобоксом (EN2), NRCAM - молекулу адгезии нейронов (NRCAM), MDGA2, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой X-хромосомой (MDGA2), NRXN1 - нейрексин-1, FMR2 (AFF2) - представитель 2 семейства AF4/FMR2, OR4M2 - рецептор обонятельных луковиц 4М2, FOXP2 - белок, кодируемый Forkhead-боксом Р2 (FOXP2), OR4N4 - рецептор обонятельных луковиц 4N4, FXR1 - аутосомный гомолог 1, связанный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой X-хромосомой (FXR1), OXTR - окситоциновый рецептор (OXTR), FXR2 - аутосомный гомолог 2, связанный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR2), РАН - фенилаланингидроксилазу (РАН), GABRA1 - субъединицу альфа-1 рецептора гамма-аминомасляной кислоты (GABRA1), PTEN - гомолог фосфатазы и тензина (PTEN), GABRA5 - субъединицу альфа-5 рецептора GABAA (гамма-аминомасляной кислоты) (GABRA5), PTPRZ1 - протеиновую тирозинфосфатазу-дзета рецепторного типа (PTPRZ1), GABRB1 - субъединицу бета-1 рецептора гамма-аминомасляной кислоты (GABRB1), RELN - рилин, GABRB3 - субъединицу бета-3 рецептора GABAA (гамма-аминомасляной кислоты) (GABRB3), RPL10 - рибосомальный белок 60S L10, GABRG1 - субъединицу гамма-1 рецептора гамма-аминомасляной кислоты (GABRG1), SEMA5A - семафорин-5А (SEMA5A), HIRIP3 - HIRA-взаимодействующий белок 3, SEZ6L2 - белок 2, подобный гомологу белка 6, связанного с приступами (мышь), НОХА1 - белок, кодируемый гомеобоксом Нох-А1 (НОХА1), SHANK3 - белок 3, содержащий SH3 и несколько повторяющихся доменов анкирина (SHANK3), IL6 - интерлейкин-6, SHBZRAP1 - белок 3, содержащий SH3 и несколько повторяющихся доменов анкирина (SHBZRAP1), LAMB1 - ламинин, субъединицу бета-1 (LAMB1), SLC6A4 - серотониновый транспортер (SERT), MAPK3 - митоген-активируемую протеинкиназу 3, TAS2R1 - вкусовой рецептор типа 2, представитель 1 (TAS2R1), MAZ - Мус-ассоциированный белок с "цинковыми пальцами", TSC1 - белок 1, ассоциированный с туберозным склерозом, MDGA2 - гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок 2, якорная форма 2, содержащий домен МАМ (MDGA2), TSC2 - белок 2, ассоциированный с туберозным склерозом, МЕСР2 - метил-CpG-связывающий белок 2 (МЕСР2), UBE3A - убиквитинпротеинлигазу Е3А (UBE3A), МЕСР2 - метил-CpG-связывающий белок 2 (МЕСР2), WNT2 - сайт интеграции MMTV типа Wingless, представитель 2 семейства (WNT2).

Идентичность белка, ассоциированного с ASD, редактирование хромосомной последовательности которого осуществляют, может и будет варьировать. В предпочтительных вариантах осуществления белки, ассоциированные с ASD, редактирование хромосомной последовательности которых осуществляют, могут представлять собой белок 1, ассоциированный с (периферическим) бензодиазепиновым рецептором (BZRAP1), кодируемый геном BZRAP1, белок-представитель 2 семейства AF4/FMR2 (AFF2), кодируемый геном AFF2 (также называемый MFR2), белок аутосомный гомолог 1, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR1), кодируемый геном FXR1, или белок аутосомный гомолог 2, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR2), кодируемый геном FXR2, гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок, содержащий домен МАМ, якорная форма 2 (MDGA2), кодируемый геном MDGA2, метил-CpG-связывающий белок 2 (МЕСР2), кодируемый геном МЕСР2, метаботропный глутаматный рецептор 5 (MGLUR5), кодируемый геном MGLUR5-1 (также называемый GRM5), белок нейрексин 1, кодируемый геном NRXN1, или белок семафорин-5А (SEMA5A), кодируемый геном SEMA5A. В иллюстративном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой крысу, и редактируемые хромосомные последовательности, кодирующие белок, ассоциированный с ASD, перечислены ниже: BZRAP1 - белок 1, ассоциированный с (периферическим) бензодиазепиновым рецептором (BZRAP1) - ХМ_002727789, ХМ_213427, ХМ_002724533, ХМ_001081125, AFF2 (FMR2) - представитель 2 семейства AF4/FMR2 (AFF2) - ХМ_219832, ХМ_001054673, FXR1 - аутосомный гомолог 1, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR1) - NM_001012179, FXR2 - аутосомный гомолог 2, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR2) - NM_001100647, MDGA2 - гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок, содержащий домен МАМ, якорная форма 2 (MDGA2) - NM_199269, МЕСР2 - метил-CpG-связывающий белок 2 (МЕСР2) - NM_022673, MGLUR5 - метаботропный глутаматный рецептор 5 (GRM5) (MGLUR5) - NM_017012, NRXN1 - нейрексин-1 - NM_021767, SEMA5A - семафорин-5А (SEMA5A) - NM_001107659.

Иллюстративные животные или клетки могут содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, или девять, или более инактивированных хромосомных последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с ASD, и ноль, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, или девять, или более интегрированных в хромосому последовательностей, кодирующих белки, ассоциированные с ASD. Отредактированную или интегрированную хромосомную последовательность можно модифицировать так, чтобы она кодировала измененный белок, ассоциированный с ASD. Неограничивающие примеры мутаций в белках, ассоциированных с ASD, включают мутацию L18Q в нейрексине 1, где лейцин в положении 18 замещен глутамином, мутацию R451C в нейролигине 3, где аргинин в положении 451 замещен цистеином, мутацию R87W в нейролигине 4, где аргинин в положении 87 замещен триптофаном, и мутацию I425V в серотониновом транспортере, где изолейцин в положении 425 замещен валином. Ряд других мутаций и хромосомных перестроек в связанных с ASD хромосомных последовательностях ассоциирован с ASD, и они известны из уровня техники. См., например, Freitag et al. (2010) Eur. Child. Adolesc. Psychiatry 19:169-178, и Bucan et al. (2009) PLoS Genetics 5: e1000536, раскрытие которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Примеры белков, ассоциированных с болезнью Паркинсона, включают, без ограничения, α-синуклеин, DJ-1, LRRK2, PINK1, паркин, UCHL1, синфилин-1 и NURR1.

Примеры связанных с привыканием белков могут включать, например, АВАТ.

Примеры связанных с воспалением белков могут включать, например, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР1), кодируемый геном Ccr2, С-С-рецептор хемокина 5 типа (CCR5), кодируемый геном Ccr5, рецептор IgG IIB (FCGR2b, также называемый CD32), кодируемый геном Fcgr2b, или белок Fc-эпсилон-R1g (FCER1g), кодируемый геном Fcer1g.

Примеры ассоциированных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы белков могут включать, например, IL1B (интерлейкин 1, бета), XDH (ксантиндегидрогеназу), ТР53 (опухолевый белок р53), PTGIS (простагландин-I2(простациклин)-синтазу), MB (миоглобин), IL4 (интерлейкин 4), ANGPT1 (ангиопоэтин 1), ABCG8 (АТФ-связывающую кассету, подсемейство G (WHITE), представитель 8) или CTSK (катепсин K).

Например, в публикации заявки на патент США №20110023153 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с болезнью Альцгеймера. В случае модификации клетки и животных можно дополнительно тестировать с применением известных способов для изучения воздействия целенаправленных мутаций на развитие и/или прогрессирование AD с использованием показателей, обычно применяемых в изучении AD - таких как, без ограничения, обучение и память, тревожность, депрессия, привыкание и сенсомоторные функции, а также анализов, при помощи которых измеряют поведенческие, функциональные, патологические, метаболические и биохимические характеристики.

Настоящее раскрытие предусматривает редактирование любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, ассоциированные с AD. Белки, связанные с AD, обычно выбирают на основании экспериментально подтвержденной ассоциации белка, связанного с AD, с заболеванием AD. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, связанного с AD, может быть повышенной или пониженной в популяции с заболеванием AD по сравнению с популяцией без заболевания AD. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае белки, связанные с AD, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, последовательного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

Примеры ассоциированных с болезнью Альцгеймера белков могут включать, например, белок-рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR), кодируемый геном VLDLR, фермент 1, активирующий убиквитин-подобный модификатор (UBA1), кодируемый геном UBA1, или белок, являющийся каталитической субъединицей NEDD8-активирующего фермента E1 (UBE1C), кодируемый геном UBA3.

В качестве неограничивающего примера, белки, ассоциированные с AD, включают, без ограничения, белки, перечисленные ниже: кодируемый хромосомной последовательностью белок ALAS2, дельта-аминолевулинатсинтазу 2 (ALAS2), АВСА1 - АТФ-связывающий кассетный транспортер (АВСА1), АСЕ - ангиотензин I-превращающий фермент (АСЕ), АРОЕ - предшественник аполипопротеина Е (АРОЕ), АРР - белок-предшественник амилоида (АРР), AQP1 - белок аквапорин 1 (AQP1), BIN1 - Мус-бокс-зависимый взаимодействующий белок 1 или адаптерный белок-интегратор 1 (BIN1), BDNF - нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), BTNL8 - белок 8, подобный бутирофилину (BTNL8), C1ORF49 - белок, кодируемый открытой рамкой считывания 49 хромосомы 1, CDH4 - кадгерин-4, CHRNB2 - нейрональный ацетилхолиновый рецептор, субъединицу бета-2, CKLFSF2 - CKLF-подобный белок 2, содержащий трансмембранный домен MARVEL (CKLFSF2), CLEC4E - лектиновый домен С-типа, семейство 4, представитель е (CLEC4E), CLU - кластериновый белок (также известный как аполипопротеин J) CR1 - эритроцитарный рецептор комплемента 1 (CR1, также известный как CD35, рецептор C3b/C4b и рецептор иммунной адгезии), CR1L - эритроцитарный рецептор комплемента 1 (CR1L), CSF3R - рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора 3 (CSF3R), CST3 - цистатин С или цистатин 3, CYP2C - цитохром Р450 2С, DAPK1 - ассоциированную с клеточной гибелью протеинкиназу 1 (DAPK1), ESR1 - эстрогеновый рецептор 1, FCAR - Fc-фрагмент рецептора для IgA (FCAR, также известный как CD89), FCGR3B - Fc-фрагмент рецептора IIIb для IgG, с низким сродством (FCGR3B или CD16b), FFA2 - рецептор 2 свободных жирных кислот (FFA2), FGA - фибриноген (фактор I), GAB2 - GRB2-ассоциированный связывающий белок 2 (GAB2), GAB2 - GRB2-ассоциированный связывающий белок 2 (GAB2), GALP - галанин-подобный пептид, GAPDHS - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу сперматогенных клеток (GAPDHS), GMPB - GMBP, HP - гаптоглобин (HP), HTR7 - 5-гидрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 7 (сопряженный с аденилатциклазой), IDE - фермент, разрушающий инсулин IF127 IF127, IFI6 - интерферон альфа-индуцируемый белок 6 (IFI6), IFIT2 - интерферон-индуцируемый белок с тетратрикопептидными повторами 2 (IFIT2), IL1RN - антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA), IL8RA - рецептор интерлейкина 8, альфа (IL8RA или CD181), IL8RB - рецептор интерлейкина 8, бета (IL8RB), JAG1 - белок Jagged 1 (JAG1), KCNJ15 - входящий калиевый канал, подсемейство J, представитель 15 (KCNJ15), LRP6 - белок 6, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP6), МАРТ - белок tau, ассоциированный с микротрубочками (МАРТ), MARK4 - киназу 4 МАР/регулирующую сродство к микротрубочкам (MARK4), MPHOSPH1 - фосфобелок 1 М-фазы, MTHFR - 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу, МХ2 - интерферон-индуцируемый GTP - связывающий белок Мx2, NBN - нибрин, также известный как NBN, NCSTN - никастрин, NIACR2 - рецептор 2 ниацина (NIACR2, также известный как GPR109B), NMNAT3 - никотинамиднуклеотидаденилилтрансферазу 3, NTM - нейротримин (или HNT), ORM1 - орозомукоид 1 (ORM1) или альфа-1-кислый гликопротеин 1, P2RY13 - пуринергический рецептор P2Y 13 (P2RY13), PBEF1 - никотинамидфосфорибозилтрансферазу (NAmPRTaзy или Nampt), также известную как колониестимулирующий фактор 1 пре-В-клеток (PBEF1) или висфатин, PCK1 - -фосфоенолпируваткарбоксикиназу, PICALM - фосфатидилинозит-связывающий белок, вовлеченный в формирование клатриновых комплексов (PICALM), PLAU - активатор плазминогена урокиназного типа (PLAU), PLXNC1 - плексин С1 (PLXNC1), PRNP - прионный белок, PSEN1 - белок пресенилин 1 (PSEN1), PSEN2 - белок пресенилин 2 (PSEN2), PTPRA - белок, представляющий собой рецепторную протеинтирозинфосфатазу типа A (PTPRA), RALGPS2 - Ral GEF с доменом РН и SH3-связывающим мотивом 2 (RALGPS2), RGSL2 - белок 2, подобный регулятору передачи сигнала при помощи G-белка (RGSL2), SELENBP1 - селенсвязывающий белок 1 (SELNBP1), SLC25A37 - митоферрин-1, SORL1 - родственный сортилину рецептор L (класс DLR), белок, содержащий повторы A (SORL1), TF - трансферрин, TFAM - митохондриальный транскрипционный фактор A, TNF - фактор некроза опухоли, TNFRSF10C - суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, представитель 10С (TNFRSF10C), TNFSF10 - суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли (TRAIL), представитель 10а (TNFSF10), UBA1 - фермент 1, активирующий убиквитин-подобный модификатор (UBA1), UBA3 - белок, являющийся каталитической субъединицей NEDD8-активирующего фермента E1 (UBE1C), UBB - белок убиквитин В (UBB), UBQLN1 - убиквилин-1, UCHL1 - белок эстеразу карбокси-конца убиквитина L1 (UCHL1), UCHL3 - белок-изофермент L3 гидролазы карбокси-конца убиквитина (UCHL3), VLDLR - белок рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR).

В иллюстративных вариантах осуществления белки, ассоциированные с AD, редактирование хромосомной последовательности которых осуществляют, могут представлять собой белок-рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR), кодируемый геном VLDLR, фермент 1, активирующий убиквитин-подобный модификатор (UBA1), кодируемый геном UBA1, белок, являющийся каталитической субъединицей NEDD8-активирующего фермента E1 (UBE1C), кодируемый геном UBA3, белок аквапорин 1 (AQP1), кодируемый геном AQP1, белок эстеразу карбокси-конца убиквитина L1 (UCHL1), кодируемый геном UCHL1, белок-изофермент L3 гидролазы карбокси-конца убиквитина (UCHL3), кодируемый геном UCHL3, белок убиквитин В (UBB), кодируемый геном UBB, белок tau, ассоциированный с микротрубочками (МАРТ), кодируемый геном МАРТ, белок, представляющий собой рецепторную протеинтирозинфосфатазу типа А (PTPRA), кодируемый геном PTPRA, фосфатидилинозит-связывающий белок, вовлеченный в формирование клатриновых комплексов (PICALM), кодируемый геном PICALM, кластериновый белок (также известный как аполипопротеин J), кодируемый геном CLU, белок пресенилин 1, кодируемый геном PSEN1, белок пресенилин 2, кодируемый геном PSEN2, родственный сортилину рецептор L (класс DLR), белок, содержащий повторы A (SORL1), кодируемый геном SORL1, белок-предшественник амилоида (АРР), кодируемый геном АРР, предшественник аполипопротеина Е (АРОЕ), кодируемый геном АРОЕ, или нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кодируемый геном BDNF. В иллюстративном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой крысу, и редактируемые хромосомные последовательности, кодирующие белок, ассоциированный с AD, являются следующими: АРР - белок-предшественник амилоида (АРР) - NM_019288, AQP1 - белок аквапорин 1 (AQP1) - NM_012778, BDNF - нейротрофический фактор головного мозга - NM_012513, CLU - кластериновый белок (также известный как аполипопротеин J) - NM_053021, МАРТ - белок tau, ассоциированный с микротрубочками (МАРТ) - NM_017212, PICALM - фосфатидилинозит-связывающий белок, вовлеченный в формирование клатриновых комплексов (PICALM) - NM_053554, PSEN1 - белок пресенилин 1 (PSEN1) - NM_019163, PSEN2 - белок пресенилин 2 (PSEN2) - NM_031087, PTPRA - белок, представляющий собой рецепторную протеинтирозинфосфатазу типа A (PTPRA) - NM_012763, SORL1 - родственный сортилину рецептор L (класс DLR), белок, содержащий повторы A (SORL1) - NM_053519, ХМ_001065506, ХМ_217115, UBA1 - фермент 1, активирующий убиквитин-подобный модификатор (UBA1) - NM_001014080, UBA3 - белок, являющийся каталитической субъединицей NEDD8-активирующего фермента E1 (UBE1C) - NM_057205, UBB - белок убиквитин В (UBB) - NM_138895, UCHL1 - белок эстераза карбокси-конца убиквитина L1 (UCHL1) - NM_017237, UCHL3 - белок-изофермент L3 гидролазы карбокси-конца убиквитина (UCHL3) - NM_001110165, VLDLR - белок-рецептор липопротеинов очень низкой плотности (VLDLR) - NM_013155.

Животное или клетка может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более хромосомных последовательностей с нарушенной структурой, кодирующих белок, ассоциированный с AD, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более интегрированных в хромосомы последовательностей, кодирующих белок, ассоциированный с AD.

Отредактированную или интегрированную хромосомную последовательность можно модифицировать так, чтобы она кодировала измененный белок, ассоциированный с AD. Ряд мутаций в хромосомных последовательностях, связанных с AD, были ассоциированы с AD. Например, миссенс-мутация V7171 (т.е. валин в положении 717 заменен изолейцином) в АРР приводит к семейной форме AD. Несколько мутаций в белке пресенилине-1, например, H163R (т.е. гистидин в положении 163 заменен аргинином), А246Е (т.е. аланин в положении 246 заменен глутаматом), L286V (т.е. лейцин в положении 286 заменен валином) и C410Y (т.е. цистеин в положении 410 заменен тирозином), приводят к семейной форме болезни Альцгеймера типа 3. Мутации в белке пресенилине-2, например, N141I (т.е. аспарагин в положении 141 заменен изолейцином), M239V (т.е. метионин в положении 239 заменен валином) и D439A (т.е. аспартат в положении 439 заменен аланином), приводят к семейной форме болезни Альцгеймера типа 4. Другие ассоциации генных вариантов генов, ассоциированных с AD, и заболевания известны из уровня техники. См., например, Waring et al. (2008) Arch. Neurol. 65:329-334, раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Примеры белков, ассоциированных с расстройствами аутистического спектра, могут включать, например, белок 1, ассоциированный с (периферическим) бензодиазепиновым рецептором (BZRAP1), кодируемый геном BZRAP1, белок-представитель 2 семейства AF4/FMR2 (AFF2), кодируемый геном AFF2 (также называемый MFR2), белок аутосомный гомолог 1, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR1), кодируемый геном FXR1, или белок аутосомный гомолог 2, ассоциированный с умственной отсталостью, сцепленной с ломкой Х-хромосомой (FXR2), кодируемый геном FXR2.

Примеры белков, ассоциированных с дегенерацией желтого пятна, могут включать, например, АТФ-связывающую кассету, белок-представитель 4 подсемейства А (АВС1) (АВСА4), кодируемый геном ABCR, белок аполипопротеин Е (АРОЕ), кодируемый геном АРОЕ, или белок хемокиновый лиганд 2 (мотив С-С) (CCL2), кодируемый геном CCL2.

Примеры белков, ассоциированных с шизофренией, могут включать NRG1, ErbB4, CPLX1, ТРН1, ТРН2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B и их комбинации.

Примеры белков, вовлеченных в подавление опухоли, могут включать, например, ATM (мутантный при атаксии-телеангиэктазии), ATR (родственный мутантному при атаксии-телеангиэктазии и Rad3), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), ERBB2 (гомолог 2 онкогена v-erb-b2 вируса эритробластического лейкоза), ERBB3 (гомолог 3 онкогена v-erb-b2 вируса эритробластического лейкоза), ERBB4 (гомолог 4 онкогена v-erb-b2 вируса эритробластического лейкоза), Notch 1, Notch2, Notch 3 или Notch 4.

Примеры белков, ассоциированных с нарушением, связанным с активностью секретазы, могут включать, например, PSENEN (гомолог усилителя 2 пресенилина (С. elegans)), CTSB (катепсин В), PSEN1 (пресенилин 1), АРР (белок-предшественник бета-амилоида (А4)), АРН1В (гомолог В дефектного белка 1 переднего отдела глотки (С. elegans)), PSEN2 (пресенилин 2 (болезнь Альцгеймера 4)) или ВАСЕ1 (фермент 1, расщепляющий АРР по бета-сайту).

Например, в публикации заявки на патент США №20110023146 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с нарушением, связанным с активностью секретазы. Секретазы необходимы для процессинга белков-предшественников с образованием их биологически активных форм. Дефекты различных компонентов секретазных путей связаны со многими нарушениями, в особенности с характерным амилоидогенезом или амилоидными бляшками, например, при болезни Альцгеймера (AD).

Что касается нарушения, связанного с активностью секретазы, белки, ассоциированные с этими нарушениями, представляют собой разнородную группу белков, которые оказывают влияние на восприимчивость ко многим нарушениям, наличие нарушения, тяжесть нарушения или любую их комбинацию. Настоящее раскрытие предусматривает редактирование любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, ассоциированные с нарушением, связанным с активностью секретазы. Белки, ассоциированные с нарушением, связанным с активностью секретазы, как правило, выбирают на основании экспериментально установленной ассоциации белков, родственных секретазе, с развитием нарушения, связанного с активностью секретазы. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, ассоциированного с нарушением, связанным с активностью секретазы, может быть повышенной или пониженной в популяции с нарушением, связанным с активностью секретазы, по сравнению с популяцией без нарушения, связанного с активностью секретазы. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае белок, ассоциированный с нарушением, связанным с активностью секретазы, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, последовательного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

В качестве неограничивающего примера, белки, ассоциированные с нарушением, связанным с активностью секретазы, включают PSENEN (гомолог усилителя пресенилина 2 (С. elegans)), CTSB (катепсин В), PSEN1 (пресенилин 1), АРР (белок-предшественник бета-амилоида (А4)), АРН1В (гомолог В дефектного белка 1 переднего отдела глотки (С. elegans)), PSEN2 (пресенилин 2 (болезнь Альцгеймера 4 типа)), ВАСЕ1 (фермент 1, расщепляющий АРР по бета-сайту), ITM2B (интегральный мембранный белок 2В), CTSD (катепсин D), NOTCH 1 (гомолог Notch 1, ассоциированный с транслокацией (Drosophila)), TNF (фактор некроза опухоли (суперсемейство TNF, представитель 2)), INS (инсулин), DYT10 (белок 10, связанный с дистонией), ADAM17 (ADAM, металлопептидазный домен 17), АРОЕ (аполипопротеин Е), АСЕ (ангиотензин I-превращающий фермент (пептидилдипептидазу А) 1), STN (статин), ТР53 (опухолевый белок р53), IL6 (интерлейкин 6 (интерферон, бета 2)), NGFR (рецептор фактора роста нервов (суперсемейство TNFR, представитель 16)), IL1B (интерлейкин 1, бета), ACHE (ацетилхолинэстеразу (группа крови Yt)), CTNNB1 (катенин (кадгерин-ассоциированный белок), бета 1, 88 кДа), IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомедин С)), IFNG (интерферон, гамма), NRG1 (нейрегулин 1), CASP3 (каспазу 3, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу), MAPK1 (митоген-активируемую протеинкиназу 1), CDH1 (кадгерин 1, тип 1, Е-кадгерин (эпителиальные клетки)), АРВВ1 (белок, связывающий предшественник бета-амилоида (А4), семейство В, представитель 1 (Fe65)), HMGCR (редуктазу 3-гидрокси-3-метилглутарилкофермента A), CREB1 (белок 1, связывающий сАМР-чувствительный элемент), PTGS2 (простагландинэндопероксидсинтазу 2 (простагландин-G/Н-синтазу и циклооксигеназу)), HES1 (белок 1 Hairy and enhancer of split (Drosophila)), CAT (каталазу), TGFB1 (трансформирующий фактор роста, бета 1), ENO2 (енолазу 2 (гамма, нейрональную), ERBB4 (гомолог 4 онкогена v-erb-a вируса эритробластического лейкоза (птичий)), TRAPPC10 (комплекс 10 транспортного белка частиц), МАОВ (моноаминоксидазу В), NGF (фактор роста нервов (бета-полипептид)), ММР12 (матриксную металлопептидазу 12 (эластазу макрофагов)), JAG1 (белок Jagged 1 (синдром Алажиля)), CD40LG (лиганд CD40), PPARG (гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), FGF2 (фактор 2 роста фибробластов (основный)), IL3 (интерлейкин 3 (колониестимулирующий фактор, множественный)), LRP1 (белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), NOTCH4 (гомолог Notch 4 (Drosophila)), MAPK8 (митоген-активируемую протеинкиназу 8), PREP (пролилэндопептидазу), NOTCH3 (гомолог Notch 3 (Drosophila)), PRNP (прионный белок), CTSG (катепсин G), EGF (эпидермальный фактор роста (бета-урогастрон)), REN (ренин), CD44 (молекулу CD44 (система групп крови Indian)), SELP (селектин Р (гранулярный мембранный белок на 140 кДа, антиген CD62)), GHR (рецептор гормона роста), ADCYAP1 (полипептид 1, активирующий аденилатциклазу (гипофиз)), INSR (инсулиновый рецептор), GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), ММР3 (матриксную металлопептидазу 3 (стромелизин 1, прожелатиназу)), MAPK10 (митоген-активируемую протеинкиназу 10), SP1 (транскрипционный фактор Sp1), MYC (гомолог онкогена v-myc вируса миелоцитоматоза (птичий)), CTSE (катепсин Е), PPARA (альфа-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), JUN (онкоген jun), TIMP1 (ингибитор 1 металлопептидазы TIMP), IL5 (интерлейкин 5 (колониестимулирующий фактор, эозинофилы)), IL1A (интерлейкин 1, альфа), ММР9 (матриксную металлопептидазу 9 (желатиназу В, желатиназу на 92 кДа, коллагеназу IV типа на 92 кДа)), HTR4 (5-гидрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 4), HSPG2 (гепарансульфат-протеогликан 2), KRAS (гомолог онкогена v-Ki-ras2 вируса саркомы Кирстена крысы), CYCS (цитохром с, соматические клетки), SMG1 (гомолог SMG1, киназу, родственную фосфатидилинозитол-3-киназе (С. elegans)), IL1R1 (рецептор интерлейкина 1, I типа), PROK1 (прокинетицин 1), MAPK3 (митоген-активируемую протеинкиназу 3), NTRK1 (нейротрофическую тирозинкиназу, рецепторную, тип 1), IL13 (интерлейкин 13), ММЕ (мембранную металлоэндопептидазу), TKT (транскетолазу), CXCR2 (рецептор 2 хемокина (мотив С-Х-С)), IGF1R (рецептор 1 инсулиноподобного фактора роста), RARA (рецептор ретиноевой кислоты, альфа), CREBBP (CREB-связывающий белок), PTGS1 (простагландинэндопероксидсинтазу 1 (простагландин-G/H-синтазу и циклооксигеназу)), GALT (галактозо-1-фосфатуридилтрансферазу), CHRM1 (холинергический рецептор, мускариновый 1), ATXN1 (атаксин 1), PAWR (PRKC, связанный с апоптозом, WT1, регулятор), NOTCH2 (гомолог Notch 2 (Drosophila)), M6PR (рецептор маннозо-6-фосфата (катион-зависимый)), CYP46A1 (цитохром Р450, семейство 46, подсемейство А, полипептид 1), CSNK1 D (казеинкиназу 1, дельта), MAPK14 (митоген-активируемую протеинкиназу 14), PRG2 (протеогликан 2, костный мозг (активатор натуральных клеток-киллеров, главный основный белок гранул эозинофилов)), PRKCA (протеинкиназу С, альфа), L1 САМ (молекулу клеточной адгезии L1), CD40 (молекулу CD40, представителя 5 суперсемейства рецепторов TNF), NR1I2 (ядерный рецептор, подсемейство 1, I группа, представитель 2), JAG2 (белок Jagged 2), CTNND1 (катенин (кадгерин-ассоциированный белок), дельта 1), CDH2 (кадгерин 2, тип 1, N-кадгерин (нейрональный)), СМА1 (химазу 1, тучная клетка), SORT1 (сортилин 1), DLK1 (гомолог Delta-подобного белка 1 (Drosophila)), ТНЕМ4 (представителя 4 суперсемейства тиоэстераз), JUP (плакоглобин адгезионных контактов), CD46 (молекулу CD46, регуляторный белок комплемента), CCL11 (хемокиновый лиганд 11 (мотив С-С)), CAV3 (кавеолин 3), RNASE3 (рибонуклеазу 3, семейство РНКазы А (катионный белок эозинофилов)), HSPA8 (белок 8 теплового шока на 70 кДа), CASP9 (каспазу 9, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу), CYP3A4 (цитохром Р450, семейство 3, подсемейство А, полипептид 4), CCR3 (рецептор 3 хемокина (мотив С-С)), TFAP2A (транскрипционный фактор АР-2 альфа (активирующий энхансер-связывающий белок 2 альфа)), SCP2 (стерол-переносящий белок 2), CDK4 (циклин-зависимую киназу 4), HIF1A (фактор 1, индуцируемый гипоксией, альфа-субъединицу (транскрипционный фактор с основным доменом типа спираль-петля-спираль)), TCF7L2 (белок 2, подобный транскрипционному фактору 7 (специфический по отношению к Т-клеткам, HMG-бокс)), IL1R2 (рецептор интерлейкина 1, II типа), B3GALTL (белок, подобный бета-1,3-галактозилтрансферазе), MDM2 (гомолог Mdm2 белка, связывающего р53 (мышь)), RELA (гомолог А онкогена v-rel вируса ретикулоэндотелиоза (птичий)), CASP7 (каспазу 7, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу), IDE (фермент, разрушающий инсулин), FABP4 (белок 4, связывающий жирные кислоты, адипоцитарный), CASK (кальций/кальмодулин-зависимую сериновую протеинкиназу (семейство MAGUK)), ADCYAP1R1 (рецептор I типа полипептида 1, активирующего аденилатциклазу (гипофиз)), ATF4 (активирующий транскрипционный фактор 4 (tax-чувствительный энхансерный элемент В67)), PDGFA (полипептидный тромбоцитарный фактор роста альфа), С21 или f33 (белок, кодируемый открытой рамкой считывания 33 хромосомы 21), SCG5 (секретогранин V (белок 7В2)), RNF123 (белок 123 с доменом ring), NFKB1 (ядерный фактор 1 энхансера гена полипептидной легкой каппа-цепи иммуноглобулина в В-клетках), ERBB2 (гомолог 2 онкогена v-erb-b2 вируса эритробластического лейкоза, гомолог онкогена, полученный из нейро/глиобластомы (птичий)), CAV1 (кавеолин 1, кавеолярный белок, 22 кДа), ММР7 (матриксную металлопептидазу 7 (матрилизин, маточный)), TGFA (трансформирующий фактор роста, альфа), RXRA (рецептор ретиноида X, альфа), STX1A (синтаксин 1А (головной мозг)), PSMC4 (26S субъединицу протеасомы (просомы, макропаина), АТФазу 4), P2RY2 (пуринергический рецептор P2Y, связанный с G-белком, 2), TNFRSF21 (суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, представитель 21), DLG1 (гомолог 1 discs large (Drosophila)), NUMBL (белок, подобный гомологу numb (Drosophila)), SPN (сиалофорин), PLSCR1 (фосфолипидскрамблазу 1), UBQLN2 (убиквилин 2), UBQLN1 (убиквилин 1), PCSK7 (пропротеинконвертазу субтилизин/кексин типа 7), SPON1 (спондин 1, белок внеклеточного матрикса), SILV (гомолог silver (мышь)), QPCT (глутаминилпептидциклотрансферазу), HESS (белок 5 hairy and enhancer of split (Drosophila)), GCC1 (белок 1, содержащий GRIP и суперспиральный домены) и любую их комбинацию.

Генетически модифицированные животное или клетка может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более хромосомных последовательностей с нарушенной структурой, кодирующих белок, ассоциированный с нарушением, связанным с активностью секретазы, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более интегрированных в хромосомы последовательностей, кодирующих белок с нарушенной структурой, ассоциированный с нарушением, связанным с активностью секретазы.

Примеры белков, ассоциированных с боковым амиотрофическим склерозом, могут включать, например, SOD1 (супероксиддисмутазу 1), ALS2 (белок 2, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом), FUS (белок слияния при саркоме), TARDBP (ДНК-связывающий белок TAR), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов В) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов С) и любую их комбинацию.

Например, в публикации заявки на патент США №20110023144 описывается применение нуклеаз с "цинковыми пальцами" для генетической модификации клеток, животных и белков, ассоциированных с заболеванием боковым амиотрофическим склерозом (ALS). ALS характеризуется постепенной прогрессирующей дегенерацией определенных нервных клеток в коре головного мозга, стволе головного мозга и спинном мозге, связанных с произвольными движениями.

Что касается нарушения, связанного с двигательными нейронами, белки, ассоциированные с этими нарушениями, представляют собой разнородную группу белков, которые оказывают влияние на восприимчивость к развитию нарушения, связанного с двигательными нейронами, наличие нарушения, связанного с двигательными нейронами, тяжесть нарушения, связанного с двигательными нейронами, или любую их комбинацию. Настоящее раскрытие предусматривает редактирование любых хромосомных последовательностей, которые кодируют белки, ассоциированные с заболеванием ALS, специфическим нарушением, связанным с двигательными нейронами. Белки, ассоциированные с ALS, как правило, выбирают на основании экспериментально установленной ассоциации белков, связанных с ALS, с ALS. Например, скорость образования или концентрация в кровотоке белка, ассоциированного с ALS, может быть повышенной или пониженной в популяции с ALS по сравнению с популяцией без ALS. Различия в уровнях белка можно оценить при помощи протеомных методик, в том числе, без ограничения, вестерн-блот-анализа, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и масс-спектрометрии. В альтернативном случае белки, ассоциированные с ALS, можно идентифицировать путем получения профилей экспрессии генов для генов, кодирующих белки, при помощи методик геномного анализа, в том числе, без ограничения, микроматричного анализа ДНК, последовательного анализа экспрессии генов (SAGE) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Q-PCR).

В качестве неограничивающего примера, белки, ассоциированные с ALS, включают, без ограничения, следующие белки: SOD1 - растворимую супероксиддисмутазу 1, ALS3 - белок 3, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом, SETX - сенатаксин, ALS5 - белок 5, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом, FUS - белок слияния при саркоме, ALS7 - белок 7, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом, ALS2 - белок 2, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом, DPP6 - дипептидилпептидазу 6, NEFH - тяжелый полипептид нейрофиламента, PTGS1 - простагландинэндопероксидсинтазу 1, SLC1A2 - семейство 1 переносчиков растворенных веществ (глутаматный транспортер глиальных клеток с высоким сродством), представитель 2, TNFRSF10B - фактор некроза опухоли, суперсемейство рецепторов, представитель 10b, PRPH - периферии, HSP90AA1 - белок теплового шока альфа на 90 кДа (цитозольный), класс А, представитель 1, GRIA2 - рецептор глутамата, ионотропный, AMPA 2, IFNG - интерферон, гамма, S100B - S100, кальций-связывающий белок В, FGF2 - фактор 2 роста фибробластов, АОХ1 - альдегидоксидазу 1, CS - цитратсинтазу, TARDBP - ДНК-связывающий белок TAR, TXN - тиоредоксин, RAPH1 - Ras-ассоциированный белок 1 (RaIGDS/AF-6), содержащий домены плекстриновой гомологии, MAP3K5 - митоген-активируемую протеинкиназу 5, NBEAL1 - белок 1, подобный нейробичину, GPX1 - глутатионпероксидазу 1, ICA1L - белок, подобный аутоантигену островковых клеток на 1,69 кДа, RAC1 - Ras-родственный белок 1, являющийся субстратом ботулинического токсина С3, МАРТ - белок tau, ассоциированный с микротрубочками, ITPR2 - рецептор инозитол-1,4,5-трифосфата, тип 2, ALS2CR4 - кандидатный участок 4 хромосомы для белка 2, ассоциированного с боковым амиотрофическим склерозом (ювенильным), GLS - глутаминазу, ALS2CR8 - кандидатный участок 8 хромосомы для белка 2, связанного с амиотрофическим латеральным склерозом (ювенильным), CNTFR - рецептор для цилиарного нейротрофического фактора, ALS2CR11 - кандидатный участок 11 хромосомы для белка 2, ассоциированного с боковым амиотрофическим склерозом (ювенильным), FOLH1 - фолатгидролазу 1, FAM117B - семейство белков со сходством последовательности с белком 117, представитель В, Р4НВ - пролил-4-гидроксилазу, полипептид бета, CNTF - цилиарный нейротрофический фактор, SQSTM1 - секвестосому 1, STRADB - STE20-родственную киназу, бета-адаптерную, NAIP - семейство NLR, связанный с апоптозом ингибиторный белок, YWHAQ - белок-активатор тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы, полипептид тета, SLC33A1 - семейство 33 переносчиков растворенных веществ (ацетил-СоА-транспортеры), представитель 1, TRAK2 - транспортный белок, кинезин-связывающий 2, FIG 4 - FIG. гомолог FIG4, содержащий домен фосфатазы липидов SAC1, NIF3L1 - белок 1, подобный NGG1-взаимодействующему фактору 3 NIF3, INA - интернексин, нейрональный промежуточный филаментный белок, альфа, PARD3B - гомолог В par-3 (белка 3 при дефектном разделении), СОХ8А - цитохром с-оксидазу, субъединицу VIIIA, CDK15 - циклин-зависимую киназу, HECW1 - убиквитинпротеинлигазу Е3, содержащую домены НЕСТ, С2 и WW, NOS1 - синтазу 1 оксида азота, МЕТ - протоонкоген met, SOD2 - митохондриальную супероксиддисмутазу 2, HSPB1 - белок 1 теплового шока на 27 кДа, NEFL - легкий полипептид нейрофиламента, CTSB - катепсин В, ANG - ангиогенин, рибонуклеазу, семейство РНКазы A, HSPA8 - белок теплового шока 8 на 70 кДа, VAPB - белки В и С, ассоциированные с VAMP (ассоциированным с везикулами мембранным белком), ESR1 - эстрогеновый рецептор 1, SNCA - синуклеин, альфа, HGF - фактор роста гепатоцитов, CAT - каталазу, АСТВ - актин, бета, NEFM - средний полипептид нейрофиламента, ТН - тирозингидроксилазу, BCL2 - белок 2, ассоциированный с В-клеточными CLL/лимфомой, FAS - Fas (суперсемейство рецепторов TNF, представитель 6), CASP3 - каспазу 3, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу, CLU - кластерин, SMN1 - фактор выживания мотонейронов 1, теломерный, G6PD - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, ВАХ BCL2-ассоциированный белок X, HSF1 - транскрипционный фактор 1 белков теплового шока, RNF19A - белок 19А с доменом ring, JUN - онкоген jun, ALS2CR12 - кандидатный участок 12 хромосомы для белка 2, ассоциированного с боковым амиотрофическим склерозом (ювенильным), HSPA5 - белок 5 теплового шока на 70 кДа, MAPK 14 - митоген-активируемую протеинкиназу 14, IL10 - интерлейкин 10, АРЕХ1 - АРЕХ-нуклеазу 1 (полифункциональный фермент репарации ДНК), TXNRD1 - тиоредоксинредуктазу 1, NOS2 - индуцируемую синтазу 2 оксида азота, TIMP1 - TIMP-ингибитор 1 металлопептидаз, CASP9 - каспазу 9, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу, XIAP - Х-сцепленный ингибитор апоптоза, GLG1 - гликопротеин 1 комплекса Гольджи, ЕРО - эритропоэтин, VEGFA - фактор роста эндотелия сосудов A, ELN - эластин, GDNF - нейротрофический фактор, полученный из глиальных клеток, NFE2L2 - белок 2, подобный (эритроидному) ядерному фактору 2, SLC6A3 - представитель 3 семейства 6 переносчиков растворенных веществ (транспортер нейротрансмиттеров, дофаминовый), HSPA4 - белок 4 теплового шока на 70 кДа, АРОЕ - аполипопротеин Е, PSMB8 - субъединицу 8 бета-типа протеасомы (просомы, макропаина), DCTN1 - динактин 1, TIMP3 - TIMP-ингибитор 3 металлопептидаз, KIFAP3 - кинезин-ассоциированный белок 3, SLC1A1 - представитель 1 семейства 1 переносчиков растворенных веществ (глутаматный транспортер нейронов/эпителиальных клеток с высоким сродством, система Xag), SMN2 - фактор выживания мотонейронов 2, центромерный, CCNC - циклин С, МРР4 - пальмитоилированный мембранный белок 4, STUB1 - белок 1, гомологичный STIP1 и содержащий U-бокс, ALS2 - белок-предшественник бета-амилоида (А4), PRDX6 - пероксиредоксин 6, SYP - синаптофизин, CABIN1 - кальциневрин-связывающий белок 1, CASP1 - каспазу 1, связанную с апоптозом цистеиновую пептидазу, GART - фосфорибозилглицинамидформилтрансферазу, фосфорибозилглицинамидсинтетазу, фосфорибозиламиноимидазолсинтетазу, CDK5 - циклин-зависимую киназу 5, ATXN3 - атаксин 3, RTN4 - ретикулон 4, C1QB - компонент комплемента 1, субкомпонент q, цепь В, VEGFC - рецептор фактора роста нервов, НТТ - гентингтин, PARK7 - белок 7, ассоциированный с болезнью Паркинсона, XDH - ксантиндегидрогеназу, GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок, МАР2 - белок 2, ассоциированный с микротрубочками, CYCS - цитохром с, соматические клетки, FCGR3B - Fc-фрагмент рецепторов IIIb для IgG с низким сродством, CCS - медь-содержащий шаперон супероксиддисмутазы, UBL5 - белок 5, подобный убиквитину, ММР9 - матриксную металлопептидазу 9, SLC18A3 - представитель 3 семейства 18 переносчиков растворенных веществ (везикулярный, ацетилхолиновый), TRPM7 - катионный канал транзиентного рецепторного потенциала, подсемейство М, представитель 7, HSPB2 - белок 2 теплового шока на 27 кДа, AKT1 - гомолог 1 онкогена v-akt вируса тимомы мышей, DERL1 - представитель 1 семейства белков с Der1-подобным доменом, CCL2 - хемокиновый лиганд 2 (мотив С--С), NGRN - неугрин, ассоциированный с ростом аксонов, GSR - глутатионредуктазу, ТРРР3 - представитель 3 семейства белков, способствующих полимеризации тубулина, APAF1 - фактор 1, активирующий апоптическую пептидазу, BTBD10 - белок 10, содержащий домен ВТВ (POZ), GLUD1 - глутаматдегидрогеназу 1, CXCR4 - рецептор 4 хемокина (мотив С--Х--С), SLC1A3 - представитель 3 семейства 1 переносчиков растворенных веществ (глутаматный транспортер глиальных клеток с высоким сродством), FLT1 - тирозинкиназу 1, родственную fms, PON1 - параоксоназу 1, AR - андрогенный рецептор, LIF - фактор, ингибирующий лейкоз, ERBB3 - гомолог 3 онкогена v-erb-b2 вируса эритробластического лейкоза, LGALS1 - лектин, галактозид-связывающий растворимый белок 1, CD44 - молекулу CD44, ТР53 - опухолевый белок р53, TLR3 - Toll-подобный рецептор 3, GRIA1 - глутаматный рецептор, ионотропный, AMPA 1, GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, GRIK1 - глутаматный ионотропный каинатный рецептор 1, DES - десмин, CHAT - холинацетилтрансферазу, FLT4 - тирозинкиназу 4, родственную fms, СНМР2В - белок 2В, модифицирующий хроматин, BAG1 - BCL2-ассоциированный атаноген, МТ3 - металлотионеин 3, CHRNA4 - холинергический рецептор, никотиновый, альфа 4, GSS - глутатионсинтетазу, BAK1 - BCL2-гомологичный антагонист/киллер 1, KDR - рецептор с киназным вставочным доменом (рецепторную тирозинкиназу III типа), GSTP1 - глутатион-S-трансферазу пи 1, OGG1 - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу, IL6 - интерлейкин 6 (интерферон, бета 2).

Животное или клетка может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более хромосомных последовательностей с нарушенной структурой, кодирующих белок, ассоциированный с ALS, и ноль, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более интегрированных в хромосомы последовательностей, кодирующих белок с нарушенной структурой, ассоциированный с ALS. Предпочтительные белки, ассоциированные с ALS, включают SOD1 (супероксиддисмутазу 1), ALS2 (белок 2, ассоциированный с боковым амиотрофическим 1 склерозом), FUS (белок слияния при саркоме), TARDBP (ДНК-связывающий белок TAR), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов В) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов С) и любую их комбинацию.

Примеры белков, ассоциированных с прионными болезнями, могут включать SOD1 (супероксиддисмутазу 1), ALS2 (белок 2, ассоциированный с боковым амиотрофическим склерозом), FUS (белок слияния при саркоме), TARDBP (ДНК-связывающий белок TAR), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов В) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов С) и любую их комбинацию.

Примеры белков, связанных с нейродегенеративными состояниями при прионных болезнях, могут включать, например, А2М (альфа-2-макроглобулин), AATF (транскрипционный фактор, противодействующий апоптозу), АСРР (простатоспецифическую кислую фосфатазу), АСТА2 (альфа-актин 2 гладкой мускулатуры аорты), ADAM22 (ADAM с металлопептидазным доменом), ADORA3 (аденозиновый рецептор A3-типа) или ADRA1D (альфа-1D-адренергический рецептор или альфа-1D-адренорецептор).

Примеры белков, ассоциированных с иммунодефицитом, могут включать, например, А2М [альфа-2-макроглобулин]; AANAT [арилалкиламин-N-ацетилтрансферазу]; АВСА1 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 1]; АВСА2 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 2] или АВСА3 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 3].

Примеры белков, ассоциированных с нарушениями, связанными с тринуклеотидными повторами, включают, например, AR (андрогеновый рецептор (androgen receptor)), FMR1 (белок 1, ассоциированный с умственной отсталостью, связанной с ломкой Х-хромосомой (fragile X mental retardation 1)), НТТ (гентигтин (huntingtin)) или DMPK (протеинкиназу, ассоциированную с мышечной дистрофией (dystrophia myotonica-protein kinase)), FXN (фратаксин (frataxin)), ATXN2 (атаксин 2 (ataxin 2)).

Примеры белков, ассоциированных с нарушениями передачи нервных импульсов, включают, например, SST (соматостатин), NOS1 (синтазу оксида азота 1 (нейрональную)), ADRA2A (адренергический альфа-2А-рецептор), ADRA2C (адренергический альфа-2С-рецептор), TACR1 (тахикининовый рецептор 1) или HTR2c (5-гидрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 2С).

Примеры последовательностей, ассоциированных с неврологическим развитием, включают, например, А2ВР1 [атаксин-2-связывающий белок 1], AADAT [аминоадипатаминотрансферазу], AANAT [арилалкиламин-N-ацетилтрансферазу], АВАТ [4-аминобутиратаминотрансферазу], АВСА1 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 1] или АВСА13 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 13].

Дополнительные примеры предпочтительных состояний, которые подлежат лечению с помощью данной системы, включают те, которые могут быть выбраны из синдрома Айкарди-Гутьереса; болезни Александера; синдрома Аллана-Херндона-Дадли; связанных с геном POLG нарушений; альфа-маннозидоза (II и III тип); синдрома Альстрема; синдрома Ангельмана; атаксии-телеангиэктазии; нейронного высоковидного липофусциноза; бета-талассемии; двусторонней атрофии зрительного нерва и (инфантильной) атрофии зрительного нерва 1 типа; ретинобластомы (двусторонней); болезни Канавана; церебро-окуло-фацио-скелетного синдрома 1 [COFS1]; церебротендинального ксантоматоза; синдрома Корнелии де Ланге; связанных с геном МАРТ нарушений; наследственных прионных болезней; синдрома Драве; семейной болезни Альцгеймера с ранним началом; атаксии Фридрейха [FRDA]; синдрома Фринса; фукозидоза; врожденной мышечной дистрофии Фукуямы; галактосиалидоза; болезни Гоше; органической ацидемии; гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза; синдрома прогерии Гетчинсона-Гилфорда; муколипидоза II; инфантильной болезни накопления свободной сиаловой кислоты; ассоциированной с геном PLA2G6 нейродегенерации; синдрома Джервелла-Ланге-Нильсена; узелкового врожденного буллезного эпидермолиза; болезни Гентингтона; болезни Краббе (инфантильной); ассоциированного с митохондриальной ДНК синдрома Ли и NARP; синдрома Леша-Найхана; ассоциированной с геном LIS1 лиссэнцефалии; синдрома Лоу; болезни "кленового сиропа"; синдрома дупликации МЕСР2; связанных с геном АТР7А нарушений обмена меди; связанной с геном LAMA2 мышечной дистрофии; недостаточности арилсульфатазы А; мукополисахаридоза I, II или III типов; связанных с биогенезом пероксисом нарушений, спектра заболеваний по типу синдрома Цельвегера; нарушений по типу нейродегенерации с накоплением железа в головном мозге; недостаточности кислой сфингомиелиназы; болезни Ниманна-Пика С типа; глициновой энцефалопатии; связанных с геном ARX нарушений; нарушений орнитинового цикла; связанного с геном COL1A1/2 несовершенного остеогенеза; синдромов удаления митохондриальной ДНК; связанных с геном PLP1 нарушений; синдрома Перри; синдрома Фелана-МакДермида; болезни накопления гликогена II типа (болезни Помпе) (инфантильной); связанных с геном МАРТ нарушений; связанных с геном МЕСР2 нарушений; эпифизарной точечной хондродисплазии 1 типа костей верхних конечностей или бедренной кости; синдрома Робертса; болезни Сандхоффа; болезни Шиндлера - 1 типа; аденозиндезаминазной недостаточности; синдрома Смита-Лемли-Опитца; спинальной мышечной атрофии; спинально-церебеллярной атаксии с возникновением в младенческом возрасте; недостаточности гексозаминидазы; танатофорной дисплазии 1 типа; связанных с геном коллагена VI типа нарушений; синдрома Ашера I типа; врожденной мышечной дистрофии; синдрома Вольфа-Хиршхорна; недостаточности лизосомной кислой липазы и пигментной ксеродермы.

Как будет понятно, предусматривается, что настоящую систему можно использовать для целенаправленного воздействия на любую представляющую интерес полинуклеотидную последовательность. Некоторые состояния или заболевания, которые можно эффективно лечить с использованием настоящей системы, включены в таблицы выше, и примеры известных на данный момент генов, ассоциированных с такими состояниями, также предоставлены в них. Тем не менее, гены, приведенные в качестве примеров, не являются исчерпывающими.

Например, "StCas9 дикого типа" относится к Cas9 дикого типа из S. thermophilus, при этом последовательность его белка представлена в базе данных SwissProt под номером доступа G3ECR1. Аналогично, Cas9 S. pyogenes включен в SwissProt под номером доступа Q99ZW2.

Возможность применения системы CRISPR-Cas для осуществления эффективного и экономичного редактирования генов и манипуляции с ними обеспечит возможность быстрого выбора и сравнения одиночных и мультиплексных генетических манипуляций для трансформирования таких геномов в отношении увеличенной продукции и улучшенных признаков. В связи с этим делается ссылка на патенты и публикации заявок на патент США: патент США №6603061 - Опосредованный агробактериями способ трансформации растений; патент США №7868149 - Геномные последовательности растений и их применение и US 2009/0100536 - Трансгенные растения с улучшенными агротехническими признаками, все содержания и раскрытия каждого из которых включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме. При осуществлении на практике настоящего изобретения содержание и раскрытие Morrell et al "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 2011 Dec 29;13(2):85-96 также включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Данные примеры совместно со способами, описанными в данном документе, в настоящий момент отражают предпочтительные варианты осуществления, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Изменения в данном документе и другие применения, которые охватываются сущностью настоящего изобретения, как определено объемом формулы изобретения, будут очевидны специалистам в данной области.

Пример 1: Активность комплекса CRISPR в ядре эукариотической клетки

Примером системы CRISPR типа II является локус CRISPR типа II из Streptococcus pyogenes SF370, который содержит кластер из 4 генов Cas9, Cas1, Cas2 и Csn1, а также два некодирующих элемента РНК, tracrRNA и характерный массив повторяющихся последовательностей (прямых повторов), чередующихся с короткими фрагментами неповторяющихся последовательностей (спейсерами, примерно 30 п.о. каждый). В данной системе целенаправленный двухнитевой разрыв (DSB) ДНК образуется в ходе четырех последовательных стадий (фигура 2А). Во-первых, две некодирующих РНК, массив pre-crRNA и tracrRNA, транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrRNA гибридизируется с прямыми повторами pre-crRNA, которая затем процессируется в зрелые crRNA, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности. В-третьих, комплекс зрелая crRNA:tracrRNA направляет Cas9 к ДНК-мишени, состоящей из протоспейсера и соответствующего РАМ, посредством образования гетеродуплекса между спейсерным участком crRNA и протоспейсерной ДНК. И наконец, Cas9 опосредует расщепление целевой ДНК выше РАМ с образованием DSB внутри протоспейсера (фигура 2А). В этом примере описывается иллюстративный способ приспособления этой РНК-программируемой нуклеазной системы к управлению активностью комплекса CRISPR в ядрах эукариотических клеток.

Культура клеток и трансфекция

Линию клеток почки человеческого эмбриона (HEK) 293FT (Life Technologies) поддерживали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (HyClone), 2 мМ GlutaMAX (Life Technologies), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°С с инкубированием при 5% СО₂. Линию мышиных клеток neuro2A (N2A) (АТСС) поддерживали в DMEM, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (HyClone), 2 мМ GlutaMAX (Life Technologies), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°С с 5% СО₂.

Клетки HEK 293FT или N2A высевали в 24-луночные планшеты (Corning) за один день до трансфекции с плотностью 200000 клеток на лунку. Клетки трансфицировали с применением Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя рекомендованному производителем протоколу. Для каждой лунки 24-луночного планшета использовали в общей сложности 800 нг плазмид.

Анализ с помощью Surveyor и секвенирование на предмет наличия модификации генома

Клетки HEK 293FT или N2A трансфицировали плазмидной ДНК, как описано выше. После трансфекции клетки инкубировали при 37°С в течение 72 часов перед экстракцией геномной ДНК. Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора для экстракции ДНК QuickExtract (Epicentre), следуя протоколу производителя. Вкратце, клетки ресуспендировали в растворе QuickExtract и инкубировали при 65°С в течение 15 минут и при 98°С в течение 10 минут. Экстрагированную геномную ДНК подвергали немедленной обработке хранили при -20°С.

Геномный участок, окружающий целевой сайт CRISPR, для каждого гена подвергали ПЦР амплификации и продукты очищали с использованием колонки QiaQuick Spin Column (Qiagen), следуя протоколу производителя. В общей сложности 400 нг очищенных продуктов ПЦР смешивали с 2 мкл 10Х ПЦР-буфера для Taq-полимеразы (Enzymatics) и водой сверхвысокой чистоты до конечного объема 20 мкл и подвергали процессу повторного отжига для обеспечения образования гетеродуплекса: 95°С в течение 10 мин., линейное снижение температуры с 95°С до 85°С со скоростью 2°С/с, с 85°С до 25°С со скоростью 0,25°С/с и с выдерживанием при 25°С в течение 1 минуты. После повторного отжига продукты обрабатывали нуклеазой Surveyor и усилителем S Surveyor (Transgenomics), следуя рекомендованному производителем протоколу, и анализировали в 4-20% полиакриламидных гелях Novex ТВЕ (Life Technologies). Гели окрашивали красителем ДНК SYBR золотым (Life Technologies) в течение 30 минут и визуализировали с помощью системы для визуализации геля Gel Doc (Bio-rad). Количественный анализ основывался на относительных значениях интенсивности полос в качестве меры доли расщепленной ДНК. На фигуре 7 представлена схематическая иллюстрация данного анализа с помощью Surveyor.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для обнаружения гомологичной рекомбинации.

Клетки HEK 293FT и N2A трансфицировали плазмидной ДНК и инкубировали при 37°С в течение 72 часов перед экстракцией геномной ДНК, как описано выше. Целевой геномный участок подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймеров за пределами гомологичных плеч матрицы для гомологичной рекомбинации (HR). Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле и экстрагировали с помощью набора для экстракции из геля MinElute (Qiagen). Очищенные продукты расщепляли с помощью HindIII (Fermentas) и анализировали в 6% полиакриламидном геле Novex ТВЕ (Life Technologies).

Предсказание и анализ вторичной структуры РНК

Предсказание вторичной структуры РНК осуществляли с использованием доступного в режиме онлайн веб-сервера RNAfold, разработанного в Институте теоретической химии при Венском университете, с использованием алгоритма предсказания структуры на основе центроидного метода (см., например, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; и PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

Очистка РНК

Клетки HEK 293FT поддерживали и трансфицировали, как указано выше. Клетки собирали путем трипсинизации с последующим промыванием в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Общую клеточную РНК экстрагировали с помощью реагента TRI (Sigma), следуя протоколу производителя. Общую экстрагированную РНК анализировали количественно с использованием Nanodrop (Thermo Scientific) и нормализовали до одинаковой концентрации.

Анализ экспрессии crRNA и tracrRNA в клетках млекопитающих с помощью нозерн-блоттинга.

РНК смешивали с равными объемами 2Х загрузочного буфера (Ambion), нагревали до 95°С в течение 5 мин., охлаждали на льду в течение 1 мин., а затем загружали в 8% денатурирующие полиакриламидные гели (SequaGel, National Diagnostics) после предварительного прогона геля в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы подвергали электрофорезу в течение 1,5 часа при предельной мощности 40 Вт. После этого РНК переносили на мембрану Hybond N + (GE Healthcare) при силе тока 300 мА в устройстве полусухого переноса (Bio-rad) при комнатной температуре на 1,5 часа. РНК сшивали с мембраной с использованием кнопки "автоматического сшивания" на приборе для автоматического УФ-сшивания Stratagene Stratalinker (Stratagene). Мембрану подвергали предварительной гибридизации в буфере для гибридизации ULTRAhyb-Oligo (Ambion) в течение 30 мин. с вращением при 42°С, а затем добавляли зонды и проводили гибридизацию в течение ночи. Зонды заказывали у IDT и метили [гамма-³²Р] ATP (Perkin Elmer) с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (New England Biolabs). Мембрану промывали один раз предварительно подогретым (42°С) 2×SSC, 0,5% SDS в течение 1 мин. с последующими двумя промываниями по 30 минут при 42°С. Мембрану экспонировали на люминесцентном экране в течение одного часа или в течение ночи при комнатной температуре, а затем сканировали с использованием устройства для формирования изображения на люминесцентном фосфорном покрытии (Typhoon).

Конструирование и оценка бактериальной системы CRISPR

Элементы локуса CRISPR, в том числе tracrRNA, Cas9 и лидерную последовательность, подвергали ПЦР-амплификации из геномной ДНК Streptococcus pyogenes SF370 с фланкирующими гомологичными плечами для сборки по методу Гибсона. Два сайта BsaI типа IIS вводили между двумя прямыми повторами для облегчения простого встраивания спейсеров (фигура 8). Продукты ПЦР клонировали в расщепленный с помощью EcoRV pACYC184 ниже промотора tet с использованием мастер-микса для сборки по методу Гибсона (NEB). Другие эндогенные элементы системы CRISPR пропускали, за исключением последних 50 п.о. Csn2. Олигонуклеотиды (Integrated DNA Technology), кодирующие спейсеры с комплементарными липкими концами, клонировали в расщепленный с помощью BsaI вектор pDC000 (NEB), а затем лигировали с использованием лигазы Т7 (Enzymatics) с получением плазмид pCRISPR. Контрольные плазмиды, содержащие спейсеры с экспрессией РАМ

в клетках млекопитающих (экспрессионные конструкции, проиллюстрированные на фигуре 6А, с функциональностью, которая определена по результатам анализа с помощью Surveyor, показанным на фигуре 6В). Сайты инициации транскрипции обозначены как +1, а также указаны терминатор транскрипции и последовательность, с которой связывается зонд для нозерн-блоттинга. Экспрессию процессированной tracrRNA также подтверждали с помощью нозерн-блоттинга. На фигуре 6С показаны результаты нозерн-блоттинга общей РНК, экстрагированной из 293FT клеток, трансфицированных экспрессионными конструкциями U6, несущими длинную или короткую tracrRNA, а также SpCas9 и DR-EMX1(1)-DR. Результаты на левой и правой панели получены с клетками 293FT, трансфицированными без SpRNase III или с таковой, соответственно. U6 являются показателем для контроля загрузки при блоттинге с snRNA-зондом, нацеленным на U6 человека. Трансфекция экспрессирующей конструкции с короткой tracrRNA приводила к высоким уровням процессированной формы tracrRNA (~75 п.о.). Очень низкие количества длинных tracrRNA обнаруживали при нозерн-блоттинге.

Для того, чтобы способствовать точной инициации транскрипции, промотор U6, зависимый от РНК-полимеразы III, выбирали для управления экспрессией tracrRNA (фигура 2С). Подобным образом, конструкцию на основе промотора U6 разработали для экспрессии массива pre-crRNA, состоящего из одного спейсера, фланкированного двумя прямыми повторами (DR, также включены в термин "парные tracr-последовательности"; фигура 2С). Исходный спейсер был сконструирован для нацеливания на целевой сайт размером 33 пары оснований (п.о.) (протоспейсер из 30 п.о., а также последовательность мотива CRISPR (РАМ) из 3 п.о., соответствующую мотиву узнавания NGG у Cas9) в локусе ЕМХ1 человека (фигура 2С), ключевом гене в развитии коры головного мозга.

Клетки HEK 293FT трансфицировали комбинациями компонентов CRISPR для тестирования того, возможно ли при гетерологичной экспрессии системы CRISPR (SpCas9, SpRNase III, tracrRNA и pre-crRNA) в клетках млекопитающих достичь целенаправленного расщепления хромосом млекопитающего. Поскольку DSB в ядрах млекопитающих подвергаются частичной репарации с помощью пути негомологичного соединения концов (NHEJ), который приводит к образованию вставок/делеций, анализ с помощью Surveyor использовали для выявления возможной активности в отношении расщепления в целевом локусе ЕМХ1 (фигура 7) (см., например, Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247). Совместная трансфекция всех четырех компонентов CRISPR была способна индуцировать расщепление в протоспейсере на уровне до 5,0% (см. фигуру 2D). Совместная трансфекция всех компонентов CRISPR, за исключением SpRNase III, также индуцировала образование вставок/делеций в протоспейсере на уровне до 4,7%, что указывало на то, что могли присутствовать эндогенные РНКазы млекопитающих, которые способствуют созреванию crRNA, такие как, например, родственные ферменты Dicer и Drosha. Удаление любого из трех остальных компонентов устраняло активность системы CRISPR в отношении расщепления генома (фигура 2D). Секвенирование по Сэнгеру ампликонов, содержащих целевой локус, подтверждало активность в отношении расщепления: среди 43 подвергшихся секвенированию клонах было обнаружено 5 мутантных аллелей (11,6%). В подобных экспериментах с использованием ряда направляющих последовательностей процентные значения частоты вставок/делеций составляют вплоть до 29% (см. фигуры 3-6, 10 и 11). Эти результаты определяют трехкомпонентную систему для эффективной опосредованной CRISPR модификации генома в клетках млекопитающих. Для оптимизации эффективности расщепления заявители также тестировали, влияют ли различные изоформы tracrRNA на эффективность расщепления, и обнаружили, что в этой иллюстративной системе только короткая (89 п.о.) форма транскрипта была способна опосредовать расщепление локуса генома ЕМХ1 человека (фигура 6В).

На фигуре 12 представлен дополнительный анализ процессинга crRNA в клетках млекопитающих с помощью нозерн-блоттинга. На фигуре 12А проиллюстрировано схематическое изображение вектора экспрессии для одного спейсера, фланкированного двумя прямыми повторами (DR-EMX1(1)-DR). Спейсер из 30 п.о., осуществляющий нацеливание на протоспейсер 1 локуса ЕМХ1 человека (см. фигуру 6), и последовательности прямых повторов показаны в последовательности внизу фигуры 12А. Линия указывает на участок, обратно комплементарную последовательность для которого использовали для создания зондов для нозерн-блоттинга для выявления crRNA ЕМХ1(1). На фигуре 12В показан нозерн-блоттинг общей РНК, экстрагированной из клеток 293FT, которые трансфицировали экспрессионными конструкциями U6, несущими DR-EMX1(1)-DR. Результаты на левой и правой панели получены с клетками 293FT, трансфицированными без SpRNase III или с таковой, соответственно. DR-EMX1(1)-DR подвергался процессингу в зрелые crRNA только в присутствии SpCas9 и короткой tracrRNA и не зависел от присутствия SpRNase III. Зрелая crRNA, обнаруженная в общей РНК трансфицированных 293FT, имела длину ~33 п.о. и была короче, чем зрелая crRNA из S. pyogenes длиной 39-42 п.о. Эти результаты демонстрируют, что систему CRISPR можно переместить в эукариотические клетки и перепрограммировать для облегчения расщепления эндогенных целевых полинуклеотидов млекопитающих.

На фигуре 2 показана бактериальная система CRISPR, описанная в этом примере. На фигуре 2А проиллюстрировано схематическое изображение локуса 1 CRISPR из Streptococcus pyogenes SF370 и предполагаемый механизм опосредованного CRISPR расщепления ДНК с помощью этой системы. Зрелая crRNA, подвергшаяся процессингу из массива прямых повторов-спейсеров, направляет Cas9 к мишеням в геноме, состоящим из комплементарных протоспейсеров и мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ). При спаривании оснований мишень-спейсер Cas9 опосредует двухнитевой разрыв в целевой ДНК. На фигуре 2В проиллюстрировано конструирование Cas9 (SpCas9) S. pyogenes и РНКазы III (SpRNase III) с сигналами ядерной локализации (NLS) для обеспечения возможности импорта в ядро млекопитающих. На фигуре 2С проиллюстрирована экспрессия SpCas9 и SpRNase III у млекопитающих, управляемая конститутивным промотором EF1a, и массива tracrRNA и pre-crRNA (DR-спейсер-DR), управляемая промотором U6 для РНК-полимеразы 3 для стимуляции точной инициации и терминации транскрипции. Протоспейсер из локуса ЕМХ1 человека с удовлетворительной последовательностью РАМ использовали в качестве спейсера в массиве pre-crRNA. На фигуре 2D проиллюстрирован анализ с помощью нуклеазы Surveyor в отношении опосредованных SpCas9 минорных вставок и делеций. SpCas9 экспрессировался с SpRNase III, tracrRNA и массивом pre-crRNA, несущим целевой спейсер для ЕМХ1, и без таковых. На фигуре 2Е проиллюстрировано схематическое изображение спаривания оснований между целевым локусом и осуществляющей нацеливание на ЕМХ1 crRNA, а также иллюстративная хроматограмма, показывающая микроделецию, расположенную смежно с сайтом расщепления SpCas9. На фигуре 2F проиллюстрированы подвергшиеся мутации аллели, идентифицированные в результате секвенирования 43 клональных ампликонов, показывающие разнообразие микровставок и микроделеций. Пунктирной линией указаны удаленные основания, а невыровненные или несовпадающие основания указывают на вставки или мутации. Масштабная метка = 10 мкм.

Для дальнейшего упрощения трехкомпонентной системы приспосабливали гибридную конструкцию химерная crRNA-tracrRNA, в которой зрелая crRNA (содержащая направляющую последовательность) может быть слита с частичной tracrRNA через структуру по типу стебель-петля для имитации естественного дуплекса crRNA:tracrRNA. Для повышения эффективности совместной доставки создавали бицистронный вектор экспрессии для управления совместной экспрессией химерной РНК и SpCas9 в трансфицированных клетках. Параллельно, бицистронные векторы использовали для экспрессии pre-crRNA (DR-направляющая последовательность-DR) с SpCas9, чтобы индуцировать процессинг в crRNA с участием отдельно экспрессируемой tracrRNA (сравнение на фигуре 11В: верхняя часть и нижняя часть). На фигуре 8 представлены схематические иллюстрации бицистронных векторов экспрессии для массива pre-crRNA (фигура 8А) или химерных crRNA (представлена короткой линией ниже сайта встраивания направляющей последовательности и выше промотора EF1α на фигуре 8В) с hSpCas9, показывающие положение различных элементов и точки встраивания направляющей последовательности. Расширенная последовательность вокруг положения сайта встраивания направляющей последовательности на фигуре 8В также показывает часть последовательности DR (GTTTAGAGCTA, SEQ ID NO:_) и часть последовательности tracrRNA (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT, SEQ ID NO:_). Направляющие последовательности можно встроить между сайтами BbsI с использованием отожженных олигонуклеотидов. Конструкции последовательностей для олигонуклеотидов показаны ниже схематических иллюстраций на фигуре 8 с указанными подходящими адаптерами лигирования. WPRE представляет собой посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков. Эффективность опосредованного химерной РНК расщепления исследовали путем целенаправленного воздействия на тот же локус ЕМХ1, описанный выше. С использованием как анализа с помощью Surveyor, так и секвенирования ампликонов по Сэнгеру заявители подтвердили, что химерная конструкция РНК облегчает расщепление локуса ЕМХ1 человека со степенью модификации примерно 4,7% (фигура 3).

Генерализуемость опосредованного CRISPR расщепления в эукариотических клетках тестировали путем целенаправленного воздействия на дополнительные локусы генома как в клетках человека, так и мыши путем разработки химерных РНК, осуществляющих нацеливание на множество сайтов в ЕМХ1 и PVALB человека, а также на локусы Th мыши. На фигуре 13 проиллюстрирован выбор некоторых дополнительных протоспейсеров, на которые осущестялют нацеливание, в локусах PVALB человека (фигура 13А) и Th мыши (фигура 13В). Приведены схематические изображения локусов генов и положения трех протоспейсеров в последнем экзоне каждого из них. Подчеркнутые последовательности включают последовательности протоспейсера из 30 п.о. и 3 п.о. на 3'-конце, соответствующие последовательностям РАМ. Протоспейсеры на смысловой и антисмысловой нитях указаны выше и ниже последовательностей ДНК, соответственно. Степени модификации 6,3% и 0,75% достигали для локусов PVALB человека и Th мыши, соответственно, что демонстрировало широкую применимость системы CRISPR при модификации различных локусов у нескольких организмов (фигура 5). Хотя при использовании химерных конструкций расщепление выявлялось только с одним из трех спейсеров для каждого локуса, все целевые последовательности расщеплялись с эффективностью получения вставок/делеций, достигающей 27% при использовании схемы с совместно экспрессируемой pre-crRNA (фигуры 6 и 13).

На фигуре 11 представлена дополнительная иллюстрация того, что SpCas9 можно перепрограммировать для целенаправленного воздействия на несколько локусов генома в клетках млекопитающих. На фигуре 11А представлено схематическое изображение локуса ЕМХ1 человека, показывающее положение пяти протоспейсеров, указанных подчеркнутыми последовательностями. На фигуре 11В представлено схематическое изображение комплекса pre-crRNA/trcrRNA, показывающее гибридизацию между участком прямого повтора в pre-crRNA и tracrRNA (вверху), и схематическое изображение химерной конструкции РНК, содержащей направляющую последовательность из 20 п.о., и парную tracr-последовательность, и tracr-последовательность, состоящие из неполного прямого повтора и последовательностей tracrRNA, гибридизированных в шпилечную структуру (внизу). Результаты анализа с помощью a Surveyor со сравнением эффективности опосредованного Cas9 расщепления в пяти протоспейсерах в локусе ЕМХ1 человека проиллюстрированы на фигуре ПС. Целенаправленное воздействие на каждый протоспейсер осуществляли либо с использованием процессированного комплекса pre-crRNA/tracrRNA (crRNA), либо с использованием химерной РНК (chiRNA).

Поскольку вторичная структура РНК может быть важной для межмолекулярных взаимодействий, алгоритм предсказания структуры на основе минимальной свободной энергии и ансамбля взвешенных структур по Больцману использовали для сравнения предполагаемой вторичной структуры всех направляющих последовательностей, используемых в эксперименте с целенаправленным воздействием на геном (см., например, Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). Анализ выявил, что в большинстве случаев эффективные направляющие последовательности в контексте химерной crRNA, по сути, не содержали мотивов вторичной структуры, тогда как неэффективные направляющие последовательности с большей вероятностью образовывали внутренние вторичные структуры, которые могли препятствовать спариванию оснований с ДНК целевого протоспейсера. Следовательно, возможно, что вариабельность во вторичной структуре спейсера может оказывать воздействие на эффективность опосредованной CRISPR интерференции при использовании химерной crRNA.

Дополнительные конструкции векторов для SpCas9 показаны на фигуре 22, на которой показаны отдельные векторы экспрессии, включающие промотор U6, соединенный с сайтом встраивания для направляющего олигонуклеотида, и промотор Cbh, соединенный с кодирующей последовательностью SpCas9. Вектор, показанный на фигуре 22b, включает кодирующую последовательность tracrRNA, соединенную с промотором H1.

При анализе у бактерий все спейсеры способствовали эффективной CRISPR-интерференции (фигура 3С). Эти результаты указывают на то, что могут существовать дополнительные факторы, влияющие на эффективность активности CRISPR в клетках млекопитающих.

Для исследования специфичности опосредованного CRISPR расщепления эффект однонуклеотидных мутаций в направляющей последовательности в отношении расщепления протоспейсера в геноме млекопитающих анализировали с использованием ряда осуществляющих нацеливание на ЕМХ1 химерных crRNA с одиночными точечными мутациями (фигура 3А). На фигуре 3В проиллюстрированы результаты анализа с помощью нуклеазы Surveyor со сравнением эффективности расщепления с помощью Cas9 при спаривании с различными мутантными химерными РНК. Несовпадение одного основания в участке вплоть до 12 п.о. в 5'-направлении от РАМ, по сути, прекращало расщепление генома с помощью SpCas9, тогда как спейсеры с мутациями в более отдаленных положениях в 5'-направлении сохраняли активность в отношении исходного протоспейсера-мишени (фигура 3В). В дополнение к РАМ, SpCas9 характеризуется специфичностью в отношении одного основания в последних 12 п.о. спейсера. Кроме того, CRISPR способна опосредовать расщепление генома столь же эффективно, как и пара нуклеаз TALE (TALEN), целенаправленно воздействующих на тот же протоспейсер ЕМХ1. На фигуре 3С представлено схематическое изображение, показывающее конструкцию TALEN, целенаправленно воздействующих на ЕМХ1, и на фигуре 3D показано изображение геля в анализе с помощью Surveyor, по которому сравнивают эффективность TALEN и Cas9 (n=3).

Установив набор компонентов для достижения опосредованного CRISPR редактирования генов в клетках млекопитающих посредством склонного к ошибкам механизма NHEJ, тестировали способность CRISPR к стимуляции гомологичной рекомбинации (HR), высокоточному пути репарации генов для создания точных редакционных изменений в геноме. SpCas9 дикого типа способен опосредовать сайт-специфические DSB, которые могут репарироваться с помощью как NHEJ, так и HR. Кроме того, замену аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvC I в SpCas9 производили посредством методик генной инженерии для превращения нуклеазы в никазу (SpCas9n; проиллюстрировано на фигуре 4А) (см., например, Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acids Resch, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579) так, чтобы геномная ДНК с однонитевым разрывом подвергалась высокоточной репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR). Анализ с помощью Surveyor подтвердил, что SpCas9n не образует вставок/делеций в протоспейсере-мишени ЕМХ1. Как иллюстрируется на фигуре 4В, совместная экспрессия осуществляющей нацеливание на ЕМХ1 химерной crRNA с SpCas9 дает вставки/делеции в целевом сайте, тогда как совместная экспрессия с SpCas9n - нет (n=3). Более того, секвенирование 327 ампликонов не обнаружило каких-либо вставок/делеций, индуцированных SpCas9n. Тот же локус выбирали для тестирования опосредованной CRISPR HR при совместной трансфекции клеток HEK 293FT химерной РНК, целенаправленно воздействующей на ЕМХ1, hSpCas9 или hSpCas9n, а также матрицей для HR для введения пары сайтов рестрикции (для HindIII и NheI) возле протоспейсера. На фигуре 4С приведена схематическая иллюстрация стратегии HR с относительными положениями точек рекомбинации и последовательностей для отжига праймеров (стрелки). SpCas9 и SpCas9n действительно катализировали интеграцию матрицы для HR в локус ЕМХ1. ПЦР-амплификация целевого участка с последующим рестрикционным расщеплением HindIII выявила продукты расщепления, соответствующие ожидаемым размерам фрагментов (стрелки указывают на результаты анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью гель-электрофореза, показанные на фигуре 4D), причем SpCas9 и SpCas9n опосредуют сходные уровни эффективности HR. Заявители дополнительно подтверждали HR с использованием секвенирования геномных ампликонов по Сэнгеру (фигура 4Е). Эти результаты демонстрировали пригодность CRISPR для облегчения целенаправленного встраивания генов в геном млекопитающего. С учетом специфичности целенаправленного воздействия в 14 п.о. (12 п.о. от спейсера и 2 п.о. от РАМ) SpCas9 дикого типа, доступность никазы может значительно снизить вероятность нецелевых модификаций, поскольку одноцепочечные разрывы не являются субстратами для склонного к ошибкам пути NHEJ.

Экспрессионные конструкции, имитирующие естественную архитектуру локусов CRISPR с собранными в массив спейсерами (фигура 2А), создавали для исследования возможности мультиплексного целенаправленного воздействия на последовательности. При использовании одного массива CRISPR, кодирующего пару спейсеров, осуществляющих нацеливание на ЕМХ1 и PVALB, выявляли эффективное расщепление в обоих локусах (фигура 4F, на которой показаны как схематическая конструкция массива crRNA, так и блот, полученный после анализа расщепления с помощью Surveyor, показывающий эффективное опосредование расщепления). Также исследовали целенаправленную делецию участков генома большего размера посредством одновременных DSB с использованием спейсеров против двух мишеней в ЕМХ1, разделенных 119 п.о., и выявили эффективность делеции 1,6% (3 из 182 ампликонов; фигура 4G). Это демонстрирует, что система CRISPR может опосредовать мультиплексное редактирование в пределах одного генома.

Пример 2. Модификации и альтернативы системы CRISPR

Возможность применения РНК для программирования специфичного к последовательности расщепления ДНК определяет новый класс инструментов для конструирования генома для разнообразных исследовательских и промышленных применений. Несколько аспектов системы CRISPR можно дополнительно улучшить для повышения эффективности и универсальности целенаправленного воздействия с помощью CRISPR. Оптимальная активность Cas9 может зависеть от доступности несвязанного Mg²⁺ на уровнях, которые превышают имеющиеся в ядре млекопитающего (см., например, Jinek et al., 2012, Science, 337:816), и предпочтение в отношении мотива NGG непосредственно ниже протоспейсера ограничивает способность к целенаправленному воздействию в среднем на каждые 12 п.о. в геноме человека (фигура 9, оценка как плюс-, так и минус-нитей в хромосомных последовательностях человека). Некоторые из этих затруднений можно преодолеть путем изучения разнообразия локусов CRISPR в микробном метагеноме (см., например, Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9:467). Другие локусы CRISPR можно переместить в микроокружение клетки млекопитающего с помощью способа, подобного описанному в примере 1. Например, на фигуре 10 иллюстрируется адаптация системы CRISPR типа II из CRISPR 1 Streptococcus thermophilus LMD-9 для гетерологичной экспрессии в клетках млекопитающих, чтобы достичь опосредованного CRISPR редактирования генома. На фигуре 10А приведена схематическая иллюстрация CRISPR 1 из S. thermophilus LMD-9. На фигуре 10В показана конструкция системы экспрессии для системы CRISPR S. thermophilus. Кодоноптимизированный для человека hStCas9 экспрессируется с помощью конститутивного промотора EF1α. Зрелые варианты tracrRNA и crRNA экспрессируются с помощью промотора U6 для стимуляции точной инициации транскрипции. Показаны последовательности из зрелых crRNA и tracrRNA. Одно основание, обозначенное буквой "а" в нижнем регистре в последовательности crRNA, использовали для удаления последовательности поли-U, которая служит в качестве терминатора транскрипции для РНК-полимеразы III. На фигуре 10С приведено схематическое изображение направляющих последовательностей, осуществляющих нацеливание на локус ЕМХ1 человека. На фигуре 10D показаны результаты опосредованного hStCas9 расщепления в целевом локусе с использованием анализа с помощью Surveyor. Направляющие спейсерные РНК 1 и 2 индуцировали 14% и 6,4%, соответственно. Статистический анализ активности в отношении расщепления по биологическим копиям в этих двух протоспейсерных сайтах также приведен на фигуре 5. На фигуре 14 приведено схематическое изображение последовательностей дополнительных протоспейсеров и соответствующих РАМ, являющихся мишенями для системы CRISPR S. thermophilus, в локусе ЕМХ1 человека. Последовательности двух протоспейсеров выделены, и их соответствующие последовательности РАМ, соответствующие мотиву NNAGAAW, обозначены путем подчеркивания в направлении 3' относительно соответствующей выделенной последовательности. Оба протоспейсера-мишени находятся в антисмысловой нити.

Пример 3. Алгоритм выбора образцов целевой последовательности Разработали компьютерную программу для идентификации кандидатных целевых последовательностей для CRISPR на обеих нитях искомой последовательности ДНК на основе требуемой длины направляющей последовательности и мотива последовательности CRISPR (РАМ) для определенного фермента CRISPR. Например, целевые сайты для Cas9 из S. pyogenes с последовательностями РАМ NGG можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-N_x-NGG-3' как на искомой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной искомой. Подобным образом, целевые сайты для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus с последовательностью РАМ NNAGAAW, можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-N_x-NNAGAAW-3' как на искомой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной искомой. Подобным образом, целевые сайты для Cas9 CRISPR3 S. thermophilus с последовательностью РАМ NGGNG можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-N_x-NGGNG-3' как на искомой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной искомой. Значение "х" в N_x может фиксироваться программой или может быть определено пользователем, как, например, 20.

Поскольку несколько случаев присутствия целевого сайта ДНК в геноме могут приводить к неспецифичному редактированию генома, после идентификации всех возможных сайтов программа профильтровывает последовательности, исходя из количества раз их присутствия в соответствующем эталонном геноме. Для тех ферментов CRISPR, для которых специфичность к последовательности определяется "затравочной" последовательностью, такой как составляющая 11-12 п.о. в направлении 5' от последовательности РАМ, в том числе сама последовательность РАМ, стадия фильтрования может основываться на затравочной последовательности. Следовательно, во избежание редактирования в дополнительных локусах генома результаты фильтруют, исходя из числа случаев присутствия последовательности затравка:РАМ в подходящем геноме. Пользователь может иметь возможность выбирать длину затравочной последовательности. Пользователь также может иметь возможность определять число случаев присутствия последовательности затравки:РАМ в геноме для целей прохождения фильтра. По умолчанию установлен скрининг в отношении уникальных последовательностей. Уровень фильтрования изменяют путем изменения как длины затравочной последовательности, так и числа случаев присутсвия последовательности в геноме. В качестве дополнения или альтернативы, программа может обеспечивать последовательность направляющей последовательности, комплементарную сообщенной(сообщенным) целевой(целевым) последовательности(последовательностям), путем обеспечения последовательности, обратно-комплементарной идентифицированной(идентифицированным) целевой(целевым) последовательности(последовательностям). Иллюстративная визуализация некоторых целевых сайтов в геноме человека представлена на фигуре 18.

Дополнительные подробности в отношении способов и алгоритмов для оптимизации выбора последовательности можно найти в заявке на патент США с серийным номером 61/064798 (номер дела у патентного поверенного 44790.11.2022; общая ссылка BI-2012/084); включенной в данный документ при помощи ссылки.

Пример 4. Оценка нескольких химерных гибридов crRNA-tracrRNA

В данном примере описаны результаты, полученные для химерных РНК (chiRNA; содержащие направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность в одном транскрипте), имеющих tracr-последовательности, которые включают фрагменты последовательности tracrRNA дикого типа с разной длиной. На фигуре 16а проиллюстрировано схематическое изображение бицистронного вектора экспрессии для химерной РНК и Cas9. Cas9 управляется промотором CBh, а химерная РНК управляется промотором U6. Химерная направляющая РНК состоит из направляющей последовательности (Ns) из 20 п.о., соединенной с tracr-последовательностью (тянущейся от первого "U" в нижней нити до конца транскрипта), которая усечена в разных указанных положениях. Направляющие и tracr-последовательности разделены парной tracr-последовательностью GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO:_), за которой следует последовательность петли GAAA. Результаты анализов с помощью SURVEYOR в отношении опосредованных Cas9 вставок/делеций в локусах ЕМХ1 и PVALB человека проиллюстрированы на фигурах 16b и 16с, соответственно. Стрелки указывают на ожидаемые фрагменты, полученные с помощью SURVEYOR. ChiRNA показаны путем обозначения их "+n", a crRNA относится к гибридной РНК, в которой направляющие и tracr-последовательности экспрессируются в виде отдельных транскриптов. Количественное определение этих результатов, выполненное в трех повторностях, проиллюстрировано гистограммой на фигурах 17а и 17b, соответствующих фигурам 16b и 16с, соответственно ("N.D." указывает на отсутствие выявленных вставок/делеций). ID протоспейсеров и их соответствующая мишень в геноме, последовательность протоспейсеров, последовательность РАМ и положение в нити приведены в таблице D. Направляющие последовательности разработаны так, чтобы они были комплементарны полной последовательности протоспейсера в случае отдельных транскриптов в гибридной системе или только подчеркнутой части в случае химерных РНК.

Они представлены как SEQ ID NO:_-_, соответственно.

Дополнительные детали для оптимизации направляющих последовательностей можно найти в заявке на патент США с серийным номером 61/836127 (номер дела у патентного поверенного 44790.08.2022; общая ссылка BI-2013/004G); включенной в данный документ при помощи ссылки.

Первоначально целенаправленному воздействию подвергали три сайта в пределах локуса ЕМХ1 в клетках HEK 293FT человека. Эффективность модификации генома с помощью каждой chiRNA оценивали с использованием анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR, который позволяет обнаруживать мутации, возникающие, в результате двухнитевых разрывов (DSB) ДНК и их последующей репарации с помощью пути репарации повреждений ДНК за счет негомологичного соединения концов (NHEJ). В конструкциях, обозначенных chiRNA(+n), указывается, что нуклеотиды в количестве до +n нуклеотида в tracrRNA дикого типа включены в химерную РНК-конструкцию, при этом для n используются значения 48, 54, 67 и 85. Химерные РНК, содержащие более длинные фрагменты tracrRNA дикого типа (chiRNA(+67) и chiRNA(+85)), опосредовали расщепление ДНК во всех трех целевых сайтах ЕМХ1, причем chiRNA(+85), в частности, демонстрировали значительно более высокие уровни расщепления ДНК, чем соответствующие гибриды crRNA/tracrRNA, у которых направляющие и tracr-последовательности экспрессируются в отдельных транскриптах (фигуры 16b и 17а). Два сайта в локусе PVALB, которые не давали обнаруживаемого расщепления с использованием гибридной системы (направляющая последовательность и tracr-последовательность, экспрессируемые в виде отдельных транскриптов), также подвергались целенаправленному воздействию с использованием chiRNA. chiRNA(+67) и chiRNA(+85) были способны опосредовать значительное расщепление в двух протоспейсерах в PVALB (фигуры 16с и 17b).

Для всех пяти мишеней в локусах ЕМХ1 и PVALB наблюдали соответствующее повышение эффективности модификации генома с увеличением длины tracr-последовательности. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что вторичная структура, формируемая 3'-концом tracrRNA, может играть роль в увеличении скорости образования комплекса CRISPR.

Пример 5. Разнообразие Cas9

Система CRISPR-Cas является адаптивным иммунным механизмом в отношении внедряющейся экзогенной ДНК, используемым разнообразными видами из числа бактерий и архей. Система CRISPR-Cas9 типа II состоит из набора генов, кодирующих белки, ответственные за "захват" чужеродной ДНК в локус CRISPR, а также из набора генов, кодирующих "выполнение" механизма расщепления ДНК; они включают ДНК-нуклеазу (Cas9), некодирующую транс-активирующую cr-RNA (tracrRNA) и массив полученных из чужеродной ДНК спейсеров, фланкированных прямыми повторами (crRNA). При созревании под действием Cas9 дуплекс tracRNA и crRNA направляет нуклеазу Cas9 к целевой последовательности ДНК, определенной спейсерными направляющими последовательностями, и опосредует двухнитевые разрывы в ДНК вблизи короткого мотива последовательности в целевой ДНК, необходимого для расщепления и являющегося специфичным для каждой системы CRISPR-Cas. Системы CRISPR-Cas типа II обнаруживаются повсеместно в царстве бактерий и являются очень разнообразными по последовательности и размеру белка Cas9, последовательности прямого повтора tracrRNA и crRNA, организации этих элементов в геноме и требованиям к мотиву для целенаправленного расщепления. Один вид может иметь несколько различных систем CRISPR-Cas.

Заявители оценивали 207 предполагаемых Cas9 из видов бактерий, идентифицированных на основании гомологии последовательности с известными Cas9 и структурами, ортологичными известным субдоменам, в том числе домену эндонуклеазы HNH и доменам эндонуклеазы RuvC [информация от Eugene Koonin и Kira Makarova]. Филогенетический анализ на основе консервативности белковой последовательности в этом наборе выявил пять семейств Cas9, включающих три группы больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две группы небольших Cas9 (~1100 аминокислот) (см. фигуры 19 и 20А-F).

Дополнительные подробности в отношении Cas9 и мутаций в ферменте Cas9 для превращения в никазу или ДНК-связывающий белок и их применение с измененной функциональностью можно найти в заявках на патенты США с серийными номерами 61/836101 и 61/835936 (номера дел у патентного поверенного 44790.09.2022 и 4790.07.2022 и общие ссылки BI-2013/004E и BI-2013/004F, соответственно), включенных в данный документ с помощью ссылки.

Пример 6. Ортологи Cas9

Заявители анализировали ортологи Cas9 для идентификации подходящих последовательностей РАМ и соответствующей химерной направляющей РНК. Наличие расширенного набора РАМ обеспечивает более расширенное целенаправленное воздействие по геному, а также значительно повышает число уникальных целевых сайтов и обеспечивает потенциал для идентификации новых Cas9 с повышенными уровнями специфичности в геноме.

Специфичность ортологов Cas9 можно оценить с помощью тестирования способности каждого Cas9 допускать несовпадения между направляющей РНК и ее ДНК-мишенью. Например, специфичность SpCas9 была охарактеризована с помощью тестирования эффекта мутаций в направляющей РНК в отношении эффективности расщепления. Создавали библиотеки направляющих РНК с одним или несколькими несовпадениями между направляющей последовательностью и целевой ДНК. Исходя из этих данных, целевые сайты для SpCas9 можно выбрать на основе следующих рекомендаций.

Для максимального повышения специфичности SpCas9 в отношении редактирования конкретного гена специалисту следует выбирать целевой сайт в пределах представляющего интерес локуса таким образом, чтобы для возможных "нецелевых" геномных последовательностях соблюдались следующие четыре ограничения. Первое и главное, за ними не должен следовать РАМ с любой из последовательностей 5'-NGG или NAG. Второе, глобальное сходство их последовательности с целевой последовательностью должно быть сведено к минимуму. Третье, максимальное число несовпадений должно находиться в пределах ближайшего к РАМ участка в нецелевом сайте. Наконец, максимальное число несовпадений должны быть последовательными или отделенными друг от друга менее чем четырьмя основаниями.

Подобные способы можно использовать для оценки специфичности других ортологов Cas9 и для установления критериев для выбора специфических целевых сайтов в геномах целевых видов. Как упоминалось ранее, филогенетический анализ на основе консервативности белковой последовательности в этом наборе выявил пять семейств Cas9, включающих три группы больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две группы небольших Cas9 (~1100 аминокислот) (см. фигуры 19 и 20A-F). Дополнительные подробности в отношении ортологов Cas можно найти в заявках на патенты США с серийными номерами 61/836101 и 61/835936 (номера дел у патентного поверенного 44790.09.2022 и 4790.07.2022 и общие ссылки BI-2013/004E и BI-2013/004F, соответственно), включенных в данный документ с помощью ссылки.

Пример 7. Методические улучшения для упрощения клонирования и доставки

Вместо того, чтобы закодировать промотор U6 и направляющую РНК на плазмиде, заявители амплифицировали промотор U6 с олигонуклеотидом ДНК для достройки направляющей РНК. Полученный в результате продукт ПЦР можно трансфицировать в клетки для управления экспрессией направляющей РНК.

Иллюстративная пара праймеров, которая обеспечивает возможность образования продукта ПЦР, состоящего из промотора U6: направляющей РНК, осуществляющих нацеливание на локус Emx1 человека

Прямой праймер: AAACTCTAGAgagggcctatttcccatgattc (SEQ ID NO:_)

Обратный праймер (несущий направляющую РНК, которая подчеркнута): acctctagAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCT TATTTTAACTTGCTATGCTGTTTTGTTTCCAAAACAGCATAGCTCTAAAACCCCTAGTCATTGGAGGTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACaag (SEQ ID NO:_)

Пример 8. Методическое улучшение для улучшения активности

Вместо применения промоторов роl3, в частности, для РНК-полимеразы III (например, промоторов U6 или H1), для экспрессии направляющих РНК в эукариотических клетках заявители обеспечивали экспрессию полимеразы Т7 в эукариотических клетках для управления экспрессией направляющих РНК с использованием промотора Т7.

Один пример этой системы может включать введение трех фрагментов ДНК:

1. вектора экспрессии для Cas9;

2. вектора экспрессии для полимеразы Т7;

3. вектора экспрессии, содержащего направляющую РНК, слитую с промотором Т7.

Пример 9. Методическое улучшение для снижения токсичности Cas9: доставка Cas9 в форме мРНК

Доставка Cas9 в форме мРНК обеспечивает возможность транзиентной экспрессии Cas9 в клетках для снижения токсичности. Например, гуманизированный SpCas9 можно амплифицировать с использованием следующей пары праймеров.

Прямой праймер (для достройки промотора Т7 для транскрипции in vitro): TAATACGACTCACTATAGGAAGTGCGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGG (SEQ ID NO:_)

Обратный праймер (для достройки поли(А)-хвоста):

GGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttcttaCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCG (SEQ ID NO:_)

Заявители трансфицировали мРНК Cas9 в клетки с направляющей РНК в форме кассет РНК или ДНК для управления экспрессией направляющей РНК в эукариотических клетках.

Пример 10. Методическое улучшение для снижения токсичности Cas9: применение индуцируемого промотора

Заявители временно включали экспрессию Cas9, только когда она требовалась для осуществления модификации генома. Примеры индуцируемой системы включают индуцируемые тетрациклином промоторы (Tet-On или Tet-Off), двугибридные системы активации транскрипции с использованием малых молекул (FKBP, ABA и т.д.) или индуцируемые светом системы (фитохром, домены LOV или криптохром).

Пример 11. Улучшение системы Cas9 для применения in vivo

Заявители проводили поиск с использованием метагеномного подхода в отношении Cas9 с малым молекулярным весом. Большинство гомологов Cas9 являются достаточно большими. Например, SpCas9 имеет длину около 1368 а.к., что слишком много для легкой упаковки в вирусные векторы для доставки. График, представляющий распределение длины гомологов Cas9, получали на основе последовательностей, депонированных в GenBank (фигура 23). Некоторые из последовательностей могли быть неверно аннотированы, и, таким образом, точная частота каждой длины не обязательно может быть, достоверной. Тем не менее, она дает некоторое представление о распределении белков Cas9 и указывает на то, что существуют более короткие гомологи Cas9.

С помощью расчетного анализа заявители обнаружили, что у штамма бактерии Campylobacter присутствуют два белка Cas9 с менее чем 1000 аминокислот. Последовательность для одного Cas9 из Campylobacter jejuni представлена ниже. При такой длине CjCas9 может быть легко упакован в AAV, лентивирусы, аденовирусы и другие вирусные векторы для надежной доставки в первичные клетки и in vivo в животных моделях. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют белок Cas9 из S. aureus.

>Cas9 Campylobacter jejuni (CjCas9)

Предполагаемый элемент tracrRNA для данного CjCas9 представляет собой:

Последовательность прямого повтора представляет собой:

Пример химерной направляющей РНК для CjCas9 представляет собой:

Пример 12: Оптимизация Cas9

Для усиленного функционирования или для развития новых функций заявители создали химерные белки Cas9 путем объединения фрагментов от различных гомологов Cas9. Например, два иллюстративных химерных белка Cas9.

Например, заявители слили N-конец St1Cas9 (фрагмент из этого белка выделен жирным шрифтом) с С-концом SpCas9 (фрагмент из этого белка подчеркнут).

>St1(N)Sp(C)Cas9

Выгода от создания химерного Cas9 включает:

снижение токсичности;

улучшение экспрессии в эукариотических клетках;

повышение специфичности;

снижение молекулярного веса белка, делающее белок меньше за счет объединения наименьших доменов от различных гомологов Cas9;

изменение требований к последовательности РАМ.

Пример 13. Использование Cas9 в качестве стандартного ДНК-связывающего белка

Заявители использовали Cas9 в качестве стандартного ДНК-связывающего белка путем внесения мутации в два каталитических домена (D10 и Н840), ответственных за расщепление обеих нитей ДНК-мишени. С целью повышающей регуляции транскрипции гена в целевом локусе заявители слили домен активации транскрипции (VP64) с Cas9. Заявители предположили, что будет важно увидеть явную ядерную локализацию белка слияния Cas9-VP64, поскольку эффективность активации транскрипционным фактором зависит от времени, проведенного у мишени. Таким образом, заявители клонировали набор конструкций Cas9-VP64-GFP, переносили их в клетки 293 и оценивали их локализацию под флуоресцентным микроскопом через 12 часов после трансфекции.

Те же конструкции клонировали в виде 2A-GFP, а не в виде продукта прямого слияния, с целью функционального тестирования конструкций без помех от массового присутствия GFP. Заявители выбрали для целенаправленного воздействия локус Sox2 с трансактиватором Cas9, поскольку он может быть полезен для перепрограммирования клеток, и данный локус уже был валидирован как мишень для опосредованной TALE-TF активации транскрипции. Для локуса Sox2 заявители выбрали восемь мишеней рядом с сайтом инициации транскрипции (TSS). Каждая мишень имела длину 20 п.о. с расположенным рядом мотивом NGG, прилегающим к протоспейсеру (РАМ). Каждую конструкцию Cas9-VP64 совместно трансфицировали с каждой полученной с помощью ПЦР химерной РНК CRISPR (chiRNA) в клетки 293. Через 72 часа после трансфекции активацию транскрипции оценивали с помощью RT-qPCR.

Для дополнительной оптимизации активатора транскрипции заявители подбирали соотношение chiRNA (Sox2.1 и Sox2.5) и Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS), трансфицировали в клетки 293 и количественно определяли с помощью RT-qPCR. Эти результаты указывают на то, что Cas9 можно использовать в качестве стандартного ДНК-связывающего домена для повышающей регуляции транскрипции гена в целевом локусе.

Заявители разработали второе поколение конструкций. (Таблица ниже).

Заявители применяли эти конструкции для оценки активации (конструкции со слитым VP64) и репрессии (только Cas9) транскрипции с помощью RT-qPCR. Заявители оценивали клеточную локализацию каждой конструкции с использованием антитела к His, нуклеазную активность с использованием анализа с помощью нуклеазы Surveyor и аффинность связывания с ДНК с использованием анализа задержки электрофоретического сдвига в геле. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анализ задержки электрофоретической сдвига в геле представляет собой анализ изменения электрофоретической подвижности EMSA.

Пример 14. Мыши, трансгенные по Cas9 и с нокином по Cas9

Для получения мыши, которая экспрессирует нуклеазу Cas9, заявители рассматривали две общих стратегии, трансгенез и нокин. Эти стратегии можно применять для получения любого другого модельного организма, представляющего интерес, например, крысы. Для каждой из общих стратегий заявители получили конститутивно активный Cas9 и Cas9, который экспрессируется при определенных условиях (зависимый от рекомбиназы Cre). Конститутивно активная нуклеаза Cas9 экспрессируется в следующем контексте: pCAG-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGH-поли(A). pCAG представляет собой промотор, NLS представляет собой сигнал ядерной локализации, Р2А представляет собой последовательность расщепления пептидом, EGFP представляет собой улучшенный зеленый флуоресцентный белок, WPRE представляет собой посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков, и bGH-поли(А) представляет собой сигнальную последовательность поли(А) бычьего гормона роста (фигура 25А-В). Экспрессируемый при определенных условиях вариант имел один дополнительный элемент в виде стоп-кассеты, loxP-SV40-поли(А)х3-loxP, после промотора и перед NLS-Cas9-NLS (т.е. pCAG-loxP-SV40-поли(A)x3-loxP-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGH-поли(A)). Важные экспрессионные элементы наглядно представлены на фигуре 26. Конститутивная конструкция должна экспрессироваться во всех типах клеток в ходе развития, тогда как экспрессируемая при определенных условиях конструкция будет обеспечивать возможность экспрессии Cas9 только тогда, когда та же клетка будет экспрессировать рекомбиназу Cre. Этот последний вариант будет обеспечивать возможность тканеспецифичной экспрессии Cas9, когда экспрессия Cre находится под управлением тканеспецифичного промотора. Более того, экспрессию Cas9 можно индуцировать у взрослых мышей путем помещения экспрессии Cre под контроль индуцируемого промотора, такого как система ТЕТ-on или off.

Валидация конструкций Cas9. Каждую плазмиду подвергают функциональной валидации тремя способами: 1) транзиентная трансфекция в клетки 293 с последующим подтверждением экспрессии GFP; 2) транзиентная трансфекция в клетки 293 с последующей иммунофлуоресценцией с использованием антитела, узнающего последовательность Р2А; и 3) транзиентная трансфекция с последующим анализом с помощью нуклеазы Surveyor. Клетки 293 могут представлять собой клетки 293FT или 293Т в зависимости от того, какие клетки представляют интерес. В предпочтительном варианте осуществления клетки представляют собой клетки 293FT. Результаты анализа с помощью Surveyor разделяли по верхнему и нижнему рядам лунок геля для конструкции, экспрессируемой при определенных условиях, и для конститутивной конструкции, соответственно. Каждую из них тестировали в присутствии и в отсутствии химерной РНК, целенаправленно воздействующей на локус hEMX1 (химерная РНК hEMX1.1). Результаты указывают на то, что конструкция может успешно целенаправленно воздействовать на локус hEMX1 только в присутствии химерной РНК (и Cre в случае с экспрессией при определенных условиях). Гели использовали для количественного определения, и результаты представлены в виде средней эффективности разрезания и стандартного отклонения для трех образцов.

Трансгенные по Cas9 мыши. Для получения трансгенных мышей с конструкциями заявители инъецировали чистую линейную ДНК в пронуклеус зиготы от псевдобеременной самки СВ56. Особей-основателей идентифицировали, генотипировали и подвергали возвратному скрещиванию с мышами СВ57. Конструкции успешно клонировали и подтверждали путем секвенирования по Сэнгеру.

Мыши с нокином по Cas9. Для создания нокина по Cas9 у мышей заявители целенаправленно воздействовали теми же конститутивными конструкциями и конструкциями, экспрессируемыми при определенных условиях, на локус Rosa26. Заявители осуществили это путем клонирования каждого из них в целенаправленно воздействующий на Rosa26 вектор со следующими элементами: короткое гомологичное плечо Rosa26 - кассета для конститутивной/условной экспрессии Cas9 - длинное гомологичное плечо pPGK-Neo-Rosa26 - pPGK-DTA. pPGK представляет собой промотор для маркера положительного отбора Neo, который придает устойчивость к неомицину, короткое плечо длиной 1 т.п.о., длинное плечо длиной 4,3 т.п.о. и дифтерийный токсин (DTA), управляемый PGK, для отрицательного отбора.

Две конструкции вводили посредством электропорации в mESC R1, которым обеспечивали возможность роста в течение 2 дней до применения отбора с помощью неомицина. Отдельные колонии, которые выжили к 5-7 дню, собирали и выращивали в отдельных лунках. 5-7 дней спустя колонии собирали, половину из них замораживали, а другую половину использовали для генотипирования. Генотипирование выполняли с помощью геномной ПЦР, когда один праймер отжигали в донорной плазмиде (AttpF), а второй за пределами короткого гомологичного плеча (Rosa26-R). Из 22 колоний, собранных для случаев условной экспрессии, 7 были положительными (слева). Из 27 колоний, собранных для случаев конститутивной экспрессии, не было положительных (справа). Вероятно, что Cas9 приводит к некоторому уровню токсичности в mESC, и по этой причине положительные клоны не присутствовали. Для тестирования этого факта заявители вводили плазмиду для экспрессии Cre в клетках с точным целенаправленным воздействием условно экспрессируемой Cas9 и выявили очень низкую токсичность после большого количества дней в культуре. Уменьшенного числа копий Cas9 в клетках с точным целенаправленным воздействием условно экспрессируемой Cas9 (1-2 копии на клетку) достаточно для обеспечения возможности стабильной экспрессии и относительного отсутствия цитотоксичности. Более того, эти данные указывают на то, что число копий Cas9 определяет токсичность. После электропорации каждая клетка должна получить несколько копий Cas9, и, вероятно, вследствие этого не обнаруживалось положительных колоний в случае конститутивной конструкции Cas9. Это обеспечивает убедительное доказательство того, что использование стратегии условной экспрессии, Cre-зависимой стратегии, должно показать пониженную токсичность. Заявители вводили клетки, подвергнутые точному целенаправленному воздействию, в бластоцисту и имплантировали в самку мыши. Химерных особей идентифицировали и подвергали возвратному скрещиванию. Особей-основателей идентифицировали и генотипировали.

Использование мышей с условной экспрессией Cas9. Заявители показали на клетках 293, что конструкция для условной экспрессии Cas9 может активироваться при совместной экспрессии с Cre. Заявители также показали, что подвергшиеся точному целенаправленному воздействию mESC R1 могут иметь активный Cas9, когда Сге экспрессируется. Поскольку за Cas9 следует последовательность расщепления пептидом Р2А, а затем EGFP, заявители идентифицировали успешную экспрессию путем наблюдения EGFP. Эта же идея делает использование мышей с условной экспрессией Cas9 столь полезным. Заявители могут скрещивать свою мышь с условной экспрессией Cas9 с мышью, у которой повсеместно экспрессируется Cre (линия АСТВ-Cre), и могут получать мышь, у которой Cas9 экспрессируется в каждой клетке. Для этого потребуется только доставка химерной РНК для индукции редактирования генома у мышиных эмбрионов или взрослых мышей. Что интересно, если мышь с условной экспрессией Cas9 скрестить с мышью, экспрессирующей Сге под контролем тканеспецифического промотора, Cas9 будет лишь в тканях, в которых также экспрессируется Cre. Этот подход можно применять для редактирования генома только в определенных тканях путем доставки химерной РНК в ту же ткань.

Пример 15. Разнообразие Cas9 и химерные РНК

Система CRISPR-Cas является адаптивным иммунным механизмом в отношении внедряющейся экзогенной ДНК, используемым разнообразными видами из числа бактерий и архей. Система CRISPR-Cas типа II состоит из набора генов, кодирующих белки, ответственные за "захват" чужеродной ДНК в локус CRISPR, а также из набора генов, кодирующих "выполнение" механизма расщепления ДНК; они включают ДНК-нуклеазу (Cas9), некодирующую транс-активирующую cr-RNA (tracrRNA) и массив полученных из чужеродной ДНК спейсеров, фланкированных прямыми повторами (crRNA). При созревании под действием Cas9 дуплекс tracRNA и crRNA направляет нуклеазу Cas9 к целевой последовательности ДНК, определенной спейсерными направляющими последовательностями, и опосредует двухнитевые разрывы в ДНК вблизи короткого мотива последовательности в целевой ДНК, необходимого для расщепления и являющегося специфичным для каждой системы CRISPR-Cas. Системы CRISPR-Cas типа II обнаруживаются повсеместно в царстве бактерий и являются очень разнообразными по последовательности и размеру белка Cas9, последовательности прямого повтора tracrRNA и crRNA, организации этих элементов в геноме и требованиям к мотиву для целенаправленного расщепления. Один вид может иметь несколько различных систем CRISPR-Cas.

Заявители оценивали 207 предполагаемых Cas9 из видов бактерий, идентифицированных на основании гомологии последовательности с известными Cas9 и структурами, ортологичными известным субдоменам, в том числе домену эндонуклеазы HNH и доменам эндонуклеазы RuvC [информация от Eugene Koonin и Kira Makarova]. Филогенетический анализ на основе консервативности белковой последовательности в этом наборе выявил пять семейств Cas9, включающих три группы больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две группы небольших Cas9 (~1100 аминокислот) (фигуры 19A-D и 20A-F).

Заявители также оптимизировали направляющую РНК для Cas9 с применением способов in vitro.

Пример 16. Мутации Cas9

В этом примере заявители показали, что следующие мутации могут превратить SpCas9 в фермент, вносящий однонитевой разрыв: D10A, Е762А, Н840А, N854A, N863A, D986A.

Заявители представили последовательности, показывающие, где расположены точки мутаций в гене SpCas9 (фигура 24А-М). Заявители также показали, что никазы при этом все еще способны опосредовать гомологичную рекомбинацию. Кроме того, заявители показали, что SpCas9 с этими мутациями (отдельно) не индуцировал двухнитевой разрыв.

Все ортологи Cas9, как правило, имеют общую структуру, включающую 3-4 домена RuvC и домен HNH. Наиболее близкий к 5'-концу домен RuvC расщепляет некомплементарную нить, а домен HNH расщепляет комплементарную нить. Все обозначения приведены в отношении направляющей последовательности.

Каталитический остаток в 5'-концевом домене RuvC идентифицируют посредством сравнения с целью поиска гомологии представляющего интерес Cas9 и других ортологов Cas9 (из локуса CRISPR типа II S. pyogenes, локуса 1 CRISPR S. thermophilus, локуса 3 CRISPR S. thermophilus и локуса CRISPR типа II Franciscilla novicida), и консервативный остаток Asp подвергают мутации по типу замены на аланин с превращением Cas9 в фермент, вносящий однонитевой разрыв в комплементарную нить. Аналогично, консервативные остатки His и Asn в доменах HNH подвергают мутации по типу замены на аланин с превращением Cas9 в фермент, вносящий однонитевой разрыв в некомплементарную нить.

Пример 17: Активация транскрипции Cas9 и репрессор Cas9

Активация транскрипции Cas9

Конструировали и тестировали второе поколение конструкций (таблица 1). Данные конструкции использовали для оценки активации транскрипции (конструкции со слитым VP64) и репрессии (только Cas9) с помощью RT-qPCR. Заявители оценивали клеточную локализацию каждой конструкции с использованием антитела к His, нуклеазную активность с использованием анализа с помощью нуклеазы Surveyor и аффинность связывания с ДНК с использованием анализа задержки электрофоретического сдвига в геле.

Репрессор Cas

Ранее было показано, что dCas9 можно использовать в качестве стандартного ДНК-связывающего домена для репрессии экспрессии гена. Заявители описывают улучшенную конструкцию dCas9, а также продукты слияния dCas9 с репрессорными доменами KRAB и SID4x. Из плазмидной библиотеки, созданной для модуляции транскрипции с использованием Cas9, в таблице 1 с помощью qPCR были функционально охарактеризованы следующие репрессорные плазмиды: pXRP27, pXRP28, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRP51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61 и pXRP62.

Каждую репрессорную плазмиду для dCas9 трансфицировали совместно с двумя направляющими РНК, осуществляющими нацеливание на кодирующую нить гена бета-катенина. РНК выделяли через 72 часа после трансфекции, и экспрессию гена количественно определяли с помощью RT-qPCR. Эндогенным контрольным геном был GAPDH. Две валидированные shRNA использовали в качестве положительных контролей. Отрицательными контролями были определенные плазмиды, трансфицированные без gRNA, они обозначены как "pXRP##-контроль". Плазмиды pXRP28, pXRP29, pXRP48 и pXRP49 могут репрессировать ген бета-катенина при использовании определенной стратегии целенаправленного воздействия. Эти плазмиды соответствуют dCas9 без функционального домена (pXRP28 и pXRP28) и dCas9, слитому с SID4x (pXRP48 и pXRP49).

В дальнейших работах проводятся следующие исследования: повторение вышеуказанного эксперимента, целенаправленное воздействие на различные гены, использование других gRNA для определения оптимального положения для целенаправленного воздействия и мультиплексная репрессия.

Пример 18. Целенаправленная делеция генов, вовлеченных в биосинтез холестерина, биосинтез жирных кислот и другие метаболические нарушения, генов, кодирующих неправильно свернутые белки, вовлеченных в амилоидоз и другие заболевания, онкогенов, приводящих к трансформации клеток, латентных генов вирусов и генов, приводящих к доминантно-негативным нарушениям среди прочих нарушений

Заявители продемонстрировали доставку гена системы CRISPR-Cas в ткань печени, головного мозга, глазную, эпителиальную, кроветворную или иную ткань субъекта или пациента, нуждающегося в этом, страдающего от метаболических нарушений, амилоидоза и заболеваний, связанных с агрегацией белков, трансформации клеток, возникающей в результате генных мутаций и транслокаций, доминантно-негативных эффектов генных мутаций, латентных вирусных инфекций и других связанных симптомов, с использованием либо вирусных систем доставки, либо систем доставки на основе наночастиц.

План исследования. Нуждающиеся в лечении субъекты или пациенты, страдающие от метаболических нарушений, амилоидоза и заболевания, связанного с агрегацией белков, включают, без ограничения, человека, отличного от человека примата, собаку, кошку, корову, лошадь, других домашних животных и родственных млекопитающих. Система CRISPR-Cas направляется химерной направляющей РНК и оказывает целенаправленное воздействие на конкретный сайт в локусах генома человека, которые нужно расщепить. После расщепления и опосредованной негомологичным соединением концов репарации мутация сдвига рамки считывания приводит к нокауту генов.

Заявители выбирали направляющие РНК, осуществляющие нацеливание на гены, вовлеченные в вышеупомянутые нарушения, которые являются специфичными к эндогенным локусам при минимальной нецелевой активности. Две или более направляющих РНК могут быть закодированы в одном массиве CRISPR для индукции одновременных двухнитевых разрывов в ДНК, приводящих к микроделециям в подвергшихся воздействию генах или хромосомных участках.

Идентификация и конструирование генов-мишеней

Для каждого связанного с заболеванием кандидатного гена заявители выбирали представляющие интерес последовательности ДНК, включающие кодирующие белок экзоны, последовательности, включающие и фланкирующие известные сайты доминатно-негативных мутаций, последовательности, включающие и фланкирующие повторяющиеся последовательности, связанные с патологией. Для подходов, в которых используется нокаут генов, ранние кодирующие экзоны, наиболее близкие к старт-кодону, предлагают наилучшие варианты для достижения полного нокаута и сведения к минимуму возможности сохранения усеченными белковыми продуктами частичной функции.

Заявители анализировали представляющие интерес последовательности в отношении всех возможных поддающихся целенаправленному воздействию последовательностей из 20 п.о. в непосредственно близком 5' положении относительно мотива NGG (для системы SpCas9) или NNAGAAW (для системы StlCas9). Заявители выбирали последовательности для уникального направляемого одной РНК распознавания Cas9 в геноме для сведения к минимуму нецелевых эффектов на основе расчетного алгоритма для определения специфичности.

Клонирование направляющих последовательностей в систему доставки

Направляющие последовательности синтезировали в виде двухнитевых олигонуклеотидов из 20-24 п.о. После обработки нуклеотидов 5'-фосфорилированием" и отжига с образованием дуплексов олигонуклеотиды лигируют в подходящий вектор в, зависимости от способа доставки.

Способы доставки на основе вирусов

Векторы на основе AAV (РХ260, 330, 334, 335) были описаны в других местах.

В векторах на основе лентивирусов используется сходная стратегия клонирования путем прямого лигирования направляющих последовательностей в одиночный вектор, несущий каркас из управляемой промотором U6 химерной РНК и управляемую промотором EF1a Cas9 или никазу Cas9.

Получение вируса описано в других местах.

Способы доставки РНК на основе наночастиц

1. Направляющие последовательности синтезировали в виде дуплекса олигонуклеотидов, кодирующих промотор Т7 - направляющую последовательность - химерную РНК. Промотор Т7 добавляли в положении 5' относительно Cas9 с помощью способа ПЦР.

2. РНК управляемой Т7 Cas9 и химерные направляющие РНК транскрибировали in vitro, и мРНК Cas9 подвергали дополнительному кэпированию и присоединению А-хвоста с использованием коммерческих наборов. РНК-продукты очищали согласно инструкциям к наборам.

Способы гидродинамической доставки через хвостовую вену (для мыши)

Направляющие последовательности клонировали в плазмиды на основе AAV, которые описаны выше и в других местах в данной заявке.

Валидация in vitro на линиях клеток

Трансфекция

1. Трансфекция ДНК-плазмидами

Плазмиды, несущие направляющие последовательности, трансфицировали в клетки почки человеческого эмбриона (HEK293T) или человеческие эмбриональные стволовые (hES) клетки, другие подходящие типы клеток с использованием способов на основе липидов, химических средств или электропорации. Для трансфекции клеток HEK293T в 24-луночном формате (~260000 клеток) 500 нг общей ДНК трансфицировали в каждую отдельную лунку с использованием Lipofectamine 2000. Для трансфекции клеток hES в 12-луночном формате 1 мкг общей ДНК трансфицировали в отдельную лунку с использованием Fugene HD.

2. Трансфекция РНК

Описанную выше очищенную РНК использовали для трансфекции в клетки HEK293T. 1-2 мкг РНК можно трансфицировать в ~260000 с использованием Lipofectamine 2000 согласно инструкциям производителя. Доставка РНК Cas9 и химерной РНК показана на фигуре 28.

Анализ образования вставок/делеций in vitro

Клетки собирали через 72 часа после трансфекции и анализировали в отношении образования вставок/делеций в качестве признака двухнитевых разрывов.

Вкратце, геномный участок вокруг целевой последовательности подвергали ПЦР-амплификации (размер ампликона ~400-600 п.о.) с использованием высокоточной полимеразы. Продукты очищали, приводили к равной концентрации и медленно отжигали при температуре от 95°С до 4°С для обеспечения возможности образования гетеродуплексов ДНК. После отжига фермент Cel-I использовали для расщепления гетеродуплексов, и полученные в результате продукты разделяли на полиакриламидном геле, и рассчитывали эффективность образования вставок/делеций.

Подтверждение принципа у животных in vivo

Механизмы доставки

Получение AAV или лентивируса описано в других местах.

Состав на основе наночастиц: РНК примешивали в состав на основе наночастиц.

Гидродинамические инъекции плазмидных ДНК в хвостовую вену мышей проводили с использованием коммерческого набора.

Cas9 и направляющие последовательности доставляли в виде вируса, смеси наночастиц, покрытых РНК, или плазмидных ДНК и инъецировали испытуемым животным. Параллельному набору контрольных животных инъецировали стерильный солевой раствор, Cas9 и GFP или только направляющую последовательность и GFP.

Через три недели после инъекции животных тестировали в отношении ослабления симптомов и умерщвляли. Подходящие системы органов анализировали в отношении образования вставок/делеций. Фенотипические анализы включают уровни HDL, LDL, липидов в крови.

Анализ образования вставок/делеций

ДНК экстрагировали из ткани с использованием коммерческих наборов; анализ вставок/делеций будут выполнять, как описано для демонстрации in vitro.

Терапевтические применения системы CRISPR-Cas являются пригодными для достижения тканеспецифичной и контролируемой по времени целенаправленной делеции в связанных с заболеванием кандидатных генах. Примеры включают гены, вовлеченные в метаболизм холестерина и жирных кислот, амилоидные заболевания, доминантно-негативные заболевания, латентные вирусные инфекции среди прочих нарушений.

Примеры одиночных направляющих РНК для введения целенаправленных вставок/делеций в локус гена

Пример 19. Целенаправленная интеграция или репарация генов, несущих вызывающие заболевания мутации; восстановление недостаточностей ферментов и других связанных заболеваний

План исследования.

Идентификация и конструирование генов-мишеней

Описывается в примере 22

Клонирование направляющих последовательностей и матриц для репарации в систему доставки.

Описывается выше в примере 22

Заявители клонировали матрицы для репарации ДНК с включением гомологичных плечей с аллелем, вызывающим заболевание, а также с матрицей для репарации дикого типа.

Валидация in vitro на линиях клеток

Трансфекция описана выше в примере 22; Cas9, направляющие РНК и матрицы для репарации совместно трансфицировали в подходящие типы клеток.

Анализ in vitro в отношении репарации

Заявители собирали клетки через 72 часа после трансфекции и анализировали в отношении репарации

Вкратце, заявители амплифицировали геномный участок около матрицы для репарации с помощью ПЦР с использованием высокоточной полимеразы. Заявители секвенировали продукты в отношении уменьшенной частоты мутантного аллеля.

Подтверждение принципа у животных in vivo

Механизмы доставки описаны выше в примерах 22 и 34.

Анализ in vivo в отношении репарации

Заявители осуществляли анализ репарации, как описано в демонстрации in vitro.

Терапевтические применения

Система CRISPR-Cas пригодна для достижения тканеспецифичной и контролируемой по времени целенаправленной делеции в связанных с заболеванием кандидатных генах. Примеры включают гены, вовлеченные в метаболизм холестерина и жирных кислот, амилоидные заболевания, доминантно-негативные заболевания, латентные вирусные инфекции среди прочих нарушений.

Пример одной отдельной миссенс-мутации с матрицей для репарации

Пример 20. Терапевтическое применение системы CRISPR-Cas при глаукоме, амилоидозе и болезни Гентингтона

Глаукома. Заявители сконструировали направляющие РНК для осуществления нацеливания на первый экзон гена миоцилина (MYOC). Заявители использовали аденовирусные векторы (Ad5) для упаковки как Cas9, так и направляющей РНК, целенаправленно воздействующих на ген MYOC. Заявители инъецировали аденовирусные векторы в трабекулярную сеть, где находились клетки, вовлеченные в патофизиологию глаукомы. Заявители первоначально тестировали их в мышиных моделях, несущих подвергшийся мутации ген MYOC, чтобы увидеть, будут ли они улучшать остроту зрения и снижать давление в глазах. При терапевтическом применении у людей используется подобная стратегия.

Амилоидоз. Заявители сконструировали направляющие РНК для осуществления нацеливания на первый экзон гена транстиретина (TTR) в печени. Заявители использовали AAV8 для упаковки Cas9, а также направляющей РНК, целенаправленно воздействующих на первый экзон гена TTR. Было показано, что AAV8 характеризуется эффективным целенаправленным воздействием в печени, и его будут вводить внутривенно. Экспрессией Cas9 можно управлять либо с использованием печеночноспецифических промоторов, таких как альбуминовый промотор, либо с использованием конститутивного промотора. Промотор ро13 управляет экспрессией направляющей РНК.

В альтернативном случае заявители использовали гидродинамическую доставку плазмидной ДНК для нокаута гена TTR. Заявители доставляли плазмиду, кодирующую Cas9, и направляющую РНК, осуществляющую нацеливание на экзон 1 в TTR.

В качестве еще одного альтернативного подхода заявители вводили комбинацию РНК (мРНК для Cas9 и направляющую РНК). РНК можно упаковывать при помощи липосом, таких как Invivofectamine от Life Technologies, и доставлять внутривенно. Для снижения индуцированной РНК иммуногенности, повышения уровня экспрессии Cas9 и стабильности направляющей РНК заявители модифицировали мРНК Cas9 с помощью 5'-кэпирования. Заявители также вводили модифицированные нуклеотиды РНК в мРНК Cas9 и направляющую РНК для повышения их стабильности и снижения иммуногенности (например, активации TLR). Для повышения эффективности заявители вводили несколько доз вируса, ДНК или РНК.

Болезнь Гентингтона. Заявители сконструировали направляющую РНК на основе аллель-специфичных мутаций в гене НТТ у пациентов. Например, у пациента, который является гетерозиготным по НТТ с экспансией повтора CAG, заявители идентифицировали нуклеотидные последовательности, уникальные для мутантного аллеля НТТ, и использовали их для конструирования направляющей РНК. Заявители убедились в том, что мутантное основание располагалось в пределах последних 9 п.о. направляющей РНК (которые, по убеждению заявителей, способны проводить различия по отдельным несовпадениям оснований ДНК между целевым сайтом и направляющей РНК).

Заявители упаковывали специфичную к мутантному аллелю НТТ направляющую РНК и Cas9 в AAV9 и доставляли в полосатое тело пациентов с болезнью Гентингтона. Вирус инъецировали в полосатое тело стереотаксически посредством краниотомии. Известно, что AAV9 эффективно трансдуцирует нейроны. Заявители управляют экспрессией Cas9 с использованием нейрон-специфического промотора, такого как промотор гена синапсина I человека.

Пример 21. Терапевтическое применение системы CRISPR-Cas для HIV

Хроническая вирусная инфекция является источником значительной заболеваемости и смертности. Несмотря на то, что для многих из этих вирусов существуют традиционные средства противовирусной терапии, которые эффективно целенаправленно воздействуют на различные аспекты вирусной репликации, используемые в настоящее время терапевтические воздействия обычно являются не излечивающими по своей природе вследствие "латентности вируса". По своей природе латентность вируса характеризуется фазой покоя в жизненном цикле вируса без активного продуцирования вируса. Во время этого периода вирус в основном способен избегать как иммунного надзора, так и традиционных терапевтических средств, что обеспечивает создание долговременных резервуаров вируса в хозяине, из которых последующая повторная активация может давать возможность продолжения размножения и передачи вируса. Ключевой для латентности вируса является возможность стабильного сохранения вирусного генома, осуществляемого за счет латентности эписомы или провируса, которые хранят вирусный геном в цитоплазме или интегрируют его в геном хозяина, соответственно. В отсутствие эффективных вакцинаций, которые будут предотвращать первичную инфекцию, хронические вирусные инфекции, характеризующиеся резервуарами латентного вируса и эпизодами литической активности, могут иметь существенные последствия: вирус папилломы человека (HPV) может приводить к раку шейки матки, вирус гепатита С (HCV) создает предрасположенность к гепатоцеллюлярной карциноме, и вирус иммунодефицита человека в конечном счете разрушает иммунную систему хозяина, приводя в результате к восприимчивости к оппортунистическим инфекциям. Вследствие этого эти инфекции требуют пожизненного применения доступных в настоящее время противовирусных терапевтических средств. Дополнительно осложняет ситуацию высокая частота мутирования многих из этих вирусных геномов, которая приводит к развитию устойчивых штаммов, в отношении которых не существует эффективной терапии.

Система CRISPR-Cas представляет собой бактериальную систему адаптивного иммунитета, способную индуцировать двухнитевые разрывы ДНК (DSB) мультиплексно, специфично к последовательности, и которая была недавно воссоздана в виде систем внутри клетки млекопитающего. Было показано, что нацеливание на ДНК одной или многочисленных направляющих РНК может приводить как к образованию вставок/делеций, так и к удалениям вставочных последовательностей, соответственно. Вследствие этого данная новая технология представляет средства, с помощью которых можно выполнять целенаправленный и мультиплексный мутагенез ДНК в пределах одной клетки с высокой эффективностью и специфичностью. Следовательно, доставка системы CRISPR-Cas, направленной против последовательности вирусной ДНК, может обеспечить возможность целенаправленного разрушения и удаления латентных вирусных геномов даже в отсутствие протекающего продуцирования вируса.

В качестве примера, хроническая инфекция, вызываемая HIV-1, представляет собой проблему для всемирного здравоохранения с инфицированными 33 миллионами людей и 2,6 миллиона случаев инфицирования ежегодно. Применение комбинированной высокоактивной антиретровирусной терапии (HAART), которая одновременно целенаправленно воздействует на различные аспекты репликации вируса, обеспечило возможность в большинстве случаев сдерживать развитие HIV-инфекции до хронической, но не приводящей к смерти болезни. Без лечения прогрессирование HIV в AIDS обычно происходит в течение 9-10 лет, приводя к истощению иммунной системы хозяина и возникновению оппортунистических инфекций, обычно приводящих к смерти вскоре после этого. На фоне латентности вируса прерывание HAART неизменно приводит к вирусной отдаче. Более того, даже временные нарушения при терапии могут привести к отбору устойчивых штаммов HIV, не поддающихся контролю доступными средствами. Кроме того, затраты на HAART-терапию являются существенными: в пределах 10000-150000 долларов США на человека в год. Вследствие этого подходы к лечению, непосредственно целенаправленно воздействующие на геном HIV, а не на процесс вирусной репликации, представляют средства, с помощью которых ликвидация резервуаров латентного вируса может обеспечить возможный метод лечения, позволяющий излечение.

Разработка и доставка целенаправленно воздействующей на HIV-1 системы CRISPR-Cas представляет уникальный подход, отличный от существующих средств целенаправленного мутагенеза ДНК, т.е. ZFN и TALEN, с многочисленными терапевтическими значениями. Целенаправленное разрушение и удаление генома HIV-1 с помощью опосредованного CRISPR DSB и вставок/делеций в сочетании с HAART могут обеспечить возможность одновременного предотвращения активного продуцирования вируса, а также истощения резервуаров латентного вируса в хозяине.

После интеграции в иммунную систему хозяина система CRISPR-Cas обеспечивает возможность создания устойчивой к HIV-1 субпопуляции, которая даже в отсутствие полной ликвидации вируса может обеспечивать возможность поддержания и восстановления иммунной активности у хозяина. Она потенциально может предотвращать первичную инфекцию путем разрушения вирусного генома, предотвращая продуцирование и интеграцию вируса, представляя собой средство "вакцинации". Мультиплексная природа системы CRISPR-Cas обеспечивает возможность целенаправленного воздействия на многие аспекты генома одновременно в пределах отдельных клеток.

Как и при HAART, формирование устойчивости вируса за счет мутагенеза сводится к минимуму из-за необходимости одновременного приобретения нескольких адаптивных мутаций. Многие штаммы HIV-1 могут подвергаться целенаправленному воздействию одновременно, что сводит к минимуму вероятность суперинфекции и предотвращает последующее возникновение новых рекомбинантных штаммов. Опосредуемая нуклеотидами, а не белком специфичность к последовательности у системы CRISPR-Cas обеспечивает возможность быстрого создания терапевтических средств без необходимости существенного изменения механизма доставки.

Для выполнения этой задачи заявители создали направляющие РНК для CRISPR-Cas, которые осуществляли нацеливание на подавляющее большинство геномов HIV-1 с учетом вариантов штаммов HIV-1 для максимального охвата и эффективности. Анализы последовательности в отношении консервативности генома у подтипов и вариантов HIV-1 должны обеспечить возможность целенаправленного воздействия на фланкирующие консервативные участки в геноме с целью удаления вставочных вирусных последовательностей или индукции мутаций со сдвигом рамки считывания, которые могут нарушать функции вирусных генов.

Заявители осуществляли доставку системы CRISPR-Cas с помощью общепринятой опосредованной аденовирусом или лентивирусом инфекции иммунной системы хозяина. В зависимости от подхода иммунные клетки хозяина могут быть а) выделены, трансдуцированы CRISPR-Cas, подвергнуты отбору и повторно введены хозяину, или b) трансдуцированы in vivo путем системной доставки системы CRISPR-Cas. Первый подход обеспечивает возможность получения популяции устойчивых иммунных клеток, тогда как второй, скорее, целенаправленно воздействует на резервуары латентного вируса в хозяине.

Пример 22: Целенаправленная коррекция делъта-F508 или других мутаций при муковисцидозе

Аспект настоящего изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, которая может содержать частицу с CRISPR-Cas для генной терапии и биологически совместимый фармацевтический носитель. В соответствии с другим аспектом способ генной терапии для лечения субъекта, имеющего мутацию в гене CFTR, включает введение терапевтически эффективного количества частицы с CRISPR-Cas для генной терапии в клетки субъекта.

В данном примере демонстрируется перенос генов или доставка генов системы CRISPR-Cas в дыхательные пути нуждающегося в этом субъекта или пациента, страдающего от муковисцидоза или от связанных с муковисцидозом симптомов, с использованием частиц аденоассоциированного вируса (AAV).

План исследования. Нуждающиеся во введении субъекты или пациенты: человек, отличный от человека примат, собака, кошка, корова, лошадь, другие домашние животные, родственные животные. В данном исследовании изучали эффективность переноса генов системы CRISPR-Cas с помощью вектора на основе AAV. Заявители определяли уровни трансгена, достаточные для экспрессии гена, и использовали систему CRISPR-Cas, содержащую фермент Cas9, для целенаправленного воздействия на дельта-F508 или другие индуцирующие CFTR мутации.

Подвергающиеся лечению субъекты получали фармацевтически эффективное количество векторной системы на основе AAV в форме аэрозоля на легкое, доставляемое эндобронхиально при самостоятельном дыхании. Контрольные субъекты получали эквивалентное количество векторной системы на основе псевдотипированного AAV с внутренним контрольным геном. Векторную систему можно доставлять вместе с фармацевтически приемлемым или биологически совместимым фармацевтическим носителем. Через три недели или через подходящий временной интервал после введения вектора подвергающихся лечению субъектов тестировали в отношении ослабления связанных с муковисцидозом симптомов.

Заявители использовали аденовирусную частицу или частицу на основе AAV.

Заявители клонировали следующие конструкции с генами, каждый из которых был функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями (промотор Cbh или EF1a для Cas9, промотор U6 или H1 для химерной направляющей РНК), в один или несколько векторов на основе аденовируса или AAV или в любой другой совместимый вектор: осуществляющая нацеливание на CFTR с мутацией дельта-508 химерная направляющая РНК (фигура 31В), матрица для репарации для мутации дельта-F508 (фигура 31С) и кодон-оптимизированный фермент Cas9 необязательно с одним или несколькими сигналами или последовательностями ядерной локализации (NLS), например, с двумя (2) NLS.

Идентификация целевого сайта для Cas9

Заявители анализировали локус генома CFTR человека и идентифицировали целевой сайт для Cas9 (фигура 31А). (РАМ может содержать мотив NGG или NNAGAAW (SEQ ID NO:_)).

Стратегия репарации гена

Заявители вводили векторную систему на основе аденовируса/AAV, содержащую Cas9 (или никазу Cas9) и направляющую РНК, вместе с векторной системой на основе аденовируса/AAV, содержащей матрицу для репарации путем гомологичной рекомбинации, содержащую остаток F508, субъекту посредством одного из обсуждаемых ранее способов доставки. Система CRISPR-Cas направлялась химерной направляющей РНК к CFTR с мутацией дельта-508 и оказывала целенаправленное воздействие на конкретный сайт в локусе генома CFTR, подлежащий внесению однонитевого разрыва или расщеплению. После расщепления матрица для репарации вставляется в сайт расщепления посредством гомологичной рекомбинации, корректирующей делецию, которая приводит к муковисцидозу или вызывает связанные с муковисцидозом симптомы. Данную стратегию для управления доставкой и обеспечения системного встраивания систем CRISPR с помощью соответствующих направляющих РНК можно использовать для целенаправленного воздействия на генные мутации, чтобы редактировать гены, которые вызывают метаболические заболевания и нарушения, заболевания и нарушения печени, почек и заболевания и нарушения, связанные с белками, такие как приведенные в таблице В, или проводить иного рода манипуляции с ними.

Пример 23. Создание клеточной библиотеки с нокаутными генами

В данном примере продемонстрировано, как создать библиотеку клеток, в которой каждая клетка имеет один нокаутный ген.

Заявители получили библиотеку клеток ES, в которой каждая клетка имеет один нокаутный ген, и в полной библиотеке клеток ES все без исключения гены будут нокаутными. Эта библиотека применима для скрининга функции гена в клеточных процессах, а также в заболеваниях.

Для получения этой клеточной библиотеки заявители интегрировали Cas9, управляемый индуцируемым промотором (например, индуцируемым доксициклином промотором), в клетку ES. Кроме того, заявители интегрировали одиночную направляющую РНК, осуществляющую нацеливание на конкретный ген, в клетку ES. Для создания библиотеки клеток ES заявители просто смешивали ES с библиотекой генов, кодирующих направляющие РНК, которые осуществляют нацеливание на каждый ген в геноме человека. Сначала заявители вводили один сайт attB для ВхВ1 в локус AAVS1 в клетках ES человека. Затем заявители использовали интегразу ВхВ1 для облегчения интеграции отдельных генов направляющих РНК в сайт attB для ВхВ1 в локус AAVS1. Для облегчения интеграции каждый ген направляющей РНК размещался на плазмиде, которая несла один сайт attP. Таким образом, ВхВ1 будет рекомбинировать сайт attB в геноме с сайтом attP на плазмиде, содержащей направляющую РНК.

Для создания клеточной библиотеки заявители брали библиотеку клеток, которые имели одиночные интегрированные направляющие РНК, и индуцировали экспрессию Cas9. После индукции Cas9 опосредует двухнитевой разрыв в сайтах, определенных направляющей РНК. Для подтверждения разнообразия этой клеточной библиотеки заявители выполняли секвенирование всего экзома для того, чтобы убедиться в том, что заявители способны наблюдать мутации в каждом отдельном подвергнутом целенаправленному воздействию гене. Данную клеточную библиотеку можно использовать для ряда применений, включающих скрининг на основе целой библиотеки, или можно отсортировать в отдельные клоны клеток для облегчения быстрого создания клональных линий клеток с нокаутными отдельными генами человека.

Пример 24. Генная инженерия микроводорослей с использованием Cas9

Способы доставки Cas9

Способ 1. Заявители доставляли Cas9 и направляющую РНК с использованием вектора, который экспрессирует Cas9 под контролем конститутивного промотора, такого как промотор Hsp70A-Rbc S2 или бета-2-тубулиновый промотор.

Способ 2. Заявители доставляли Cas9 и полимеразу Т7 с использованием векторов, которые экспрессируют Cas9 и полимеразу Т7 под контролем конститутивного промотора, такого как промотор Hsp70A-Rbc S2 или бета-2-тубулиновый промотор. Направляющая РНК будет доставляться с использованием вектора, содержащего промотор Т7, управляющий экспрессией направляющей РНК.

Способ 3. Заявители доставляли мРНК Cas9 и транскрибировали направляющую РНК в клетках водорослей in vitro. РНК можно транскрибировать in vitro. мРНК Cas9 будет состоять из кодирующего участка для Cas9, а также 3'UTR из Cop1, чтобы обеспечивать стабилизацию мРНК Cas9.

Для гомологичной рекомбинации заявители обеспечивали дополнительную матрицу для репарации с участием гомологичной рекомбинации.

Последовательность для кассеты, управляющей экспрессией Cas9 под контролем бета-2-тубулинового промотора, за которой следует 3' UTR Cop1:

Последовательность для кассеты, управляющей экспрессией полимеразы Т7 под контролем бета-2-тубулинового промотора, за которой следует 3' UTR Cop1:

Последовательность направляющей РНК, управляемая промотором Т7 (промотор Т7, группа N представляет нацеливающую последовательность):

Доставка генов.

Для электропорации будут использоваться штаммы СС-124 и СС-125 Chlamydomonas reinhardtii из Ресурсного центра штаммов хламидомонад. Протокол электропорации соответствует стандартному рекомендованному протоколу для набора GeneArt Chlamydomonas Engineering kit.

Заявители также получали линию Chlamydomonas reinhardtii, которая экспрессирует Cas9 конститутивно. Это можно выполнить при помощи pChlamyl (линеаризованного с использованием PvuI) и отбора в отношении устойчивых к гигромицину колоний. Последовательность для pChlamy1, содержащая Cas9, приведена ниже. В данном пути для достижения нокаута гена необходимо просто доставить РНК в виде направляющей РНК. Для гомологичной рекомбинации заявители доставляли направляющую РНК, а также линеаризованную матрицу для гомологичной рекомбинации.

pChlamy1-Cas9:

Для всех модифицированных клеток Chlamydomonas reinhardtii заявители использовали ПЦР, анализ с помощью нуклеазы SURVEYOR и секвенирование ДНК для подтверждения успешной модификации.

Пример 25. Применение Cas9 для целенаправленного воздействия на разнообразные типы заболеваний

Заболевания, в которые вовлечены мутации в последовательности, кодирующей белок

Целенаправленное воздействие на доминантные нарушения может оказываться путем инактивации доминантно-негативного аллеля. Заявители использовали Cas9 для целенаправленного воздействия на уникальную последовательность доминантно-негативного аллеля и введения мутации посредством NHEJ. Индуцированная NHEJ вставка/делеция может быть способна к введению мутации сдвига рамки считывания в доминантно-негативном аллеле и устранению доминантно-негативного белка. Это может функционировать, если ген является гаплодостаточным (например, в случае вызванной мутацией MYOC глаукомы и болезни Гентингтона).

Целенаправленное воздействие на рецессивные нарушения может оказываться путем репарации связанной с заболеванием мутации в обоих аллелях. Для делящихся клеток заявители использовали Cas9 для введения двухнитевых разрывов около сайта с мутацией и повышения скорости гомологичной рекомбинации с использованием экзогенной матрицы для рекомбинации. Для делящихся клеток этого можно достичь с использованием мультиплексной никазной активности для катализа замены мутантной последовательности в обоих аллелях с помощью опосредованного NHEJ лигирования фрагмента экзогенной ДНК, несущего комплементарные "липкие" концы.

Заявители также применяли Cas9 для введения защитных мутаций (например, инактивации CCR5 для предупреждения HIV-инфекции, инактивации PCSK9 для снижения уровня холестерина или введение А673Т в АРР для снижения вероятности возникновения болезни Альцгеймера).

Заболевания, в которые вовлечены некодирующие последовательности

Заявители применяли Cas9 для разрушения некодирующих последовательностей в промоторном участке, для изменения сайтов связывания транскрипционных факторов и для изменения энхансерных или репрессорных элементов. Например, Cas9 можно использовать для вырезания энхансера EHS1 Klf1 в гемопоэтических стволовых клетках для снижения уровней BCL11a и повторной активации экспрессии гена фетального глобина в дифференцированных эритроцитах.

Заявители также применяли Cas9 для разрушения функциональных мотивов в 5'-или 3'-нетранслируемых участках. Например, для лечения миотонической дистрофии Cas9 можно использовать для удаления экспансий повторов CTG в гене DMPK.

Пример 26. Мультиплексная никаза

Аспекты оптимизации и информация о Cas9, подробно описанные в данной заявке, также можно использовать для создания никаз Cas9. Заявители использовали никазы Cas9 в комбинации с парами направляющих РНК для создания двухнитевых разрывов ДНК с определенными "липкими" концами. Если используют две пары направляющих РНК, представляется возможным вырезание вставочного фрагмента ДНК. Если экзогенный фрагмент ДНК расщепляется двумя парами направляющих РНК с созданием "липких" концов, совместимых с геномной ДНК, то экзогенный фрагмент ДНК можно лигировать в геномную ДНК с заменой вырезаемого фрагмента. Например, это можно использовать для удаления экспансии тринуклеотидных повторов в гене гентингтина (НТТ) для лечения болезни Гентингтона.

Если обеспечивают экзогенную ДНК, которая несет меньшее число повторов CAG, то представляется возможным получение фрагмента ДНК, который несет такие же "липкие" концы и который можно лигировать в геномный локус НТТ, заменяя им вырезаемый фрагмент.

Они представлены как SEQ ID NO:_ - _, соответственно. Лигирование экзогенного фрагмента ДНК в геном не требует механизмов гомологичной рекомбинации, и, таким образом, этот способ можно применять в постмитотических клетках, таких как нейроны.

Пример 27. Доставка системы CRISPR

Cas9 и ее химерную направляющую РНК или комбинацию tracrRNA и crRNA можно доставлять в виде либо ДНК, либо РНК. Доставка и Cas9, и направляющей РНК в виде молекул РНК (нормальной или содержащей модификации оснований или каркаса) можно использовать для уменьшения количества времени, в течение которого белок Cas9 продолжает находиться в клетке. Это может снижать уровень активности в отношении нецелевого расщепления в целевой клетке. Поскольку при доставке Cas9 в виде мРНК требуется время для трансляции в белок, преимущественной может быть доставка направляющей РНК через несколько часов после доставки мРНК Cas9 для обеспечения максимального уровня направляющей РНК, доступной для взаимодействия с белком Cas9.

В ситуациях, когда количество направляющей РНК ограничено, желательным может быть введение Cas9 в виде мРНК, а направляющей РНК в виде кассеты экспрессии ДНК с промотором, управляющим экспрессией направляющей РНК. Таким образом, количество доступной направляющей РНК будет увеличиваться в результате транскрипции.

Для введения Cas9 (ДНК или РНК) и направляющей РНК (ДНК или РНК) в клетку-хозяина можно использовать ряд систем доставки. Они включают применение липосом, вирусных векторов, электропорации, наночастиц, нанопроволок (Shalek et al., Nano Letters, 2012), экзосом. Липосомы "молекулярные троянские кони" (Pardridge et al., Cold Spring Harb Protoc; 2010; doi: 10.1101/pdb.prot5407) можно использовать для доставки Cas9 и направляющей РНК через гематоэнцефалический барьер.

Пример 28. Терапевтические стратегии для нарушений, связанных с тринуклеотидными повторами

Как ранее упоминалось в данной заявке, целевой полинуклеотид комплекса CRISPR может содержать ряд связанных с заболеванием генов и полинуклеотидов, и некоторые из этих связанных с заболеванием генов могут относиться к группе наследственных заболеваний, называемых нарушениями, связанными с тринуклеотидными повторами (также называемых нарушениями, связанными с экспансией тринуклеотидных повторов, нарушениями, связанными с экспансией триплетных повторов, или нарушениями, связанными с реитерацией кодонов).

Эти заболевания вызваны мутациями, при которых число тринуклеотидных повторов в некоторых генах превышает нормальное стабильное пороговое значение, которое обычно может различаться в гене. Обнаружение большего числа нарушений, связанных с экспансией повторов, обеспечило возможность подразделения этих нарушений на ряд категорий на основании лежащих в их основе сходных характеристик. Болезнь Гентингтона (HD) и спиноцеребеллярная атаксия, которые вызваны экспансией повтора CAG в кодирующих белок частях конкретных генов, включены в категорию I. В категорию II включены заболевания или нарушения, связанные с экспансиями, которые, как правило, делают их фенотипически разнообразными и включают экспансии, величина которых обычно является небольшой и которые часто обнаруживаются в экзонах генов.

Категория III включает нарушения или заболевания, которые характеризуются намного большими экспансиями повторов, чем любые нарушения или заболевания из категории I или II, которые обычно имеют место за пределами кодирующих белок участков. Примеры заболеваний или нарушений из категории III включают, без ограничения, синдром ломкой Х-хромосомы, миотоническую дистрофию, две формы спиноцеребеллярной атаксии, ювенильную миоклоническую эпилепсию и атаксию Фридрейха.

Подобные терапевтические стратегии, такие как упоминаемые ниже для атаксии Фридрейха, можно также применять для воздействия на другие нарушения, связанные с тринуклеотидными повторами или с экспансией. Например, другим заболеванием, связанным с триплетными повторами, которое можно лечить с использованием почти идентичной стратегии, является миотоническая дистрофия 1 (DM1) с экспансией мотива CTG в 3' UTR. При атаксии Фридрейха заболевание обусловлено экспансией тринуклеотидов GAA в первом интроне гена фратаксина (FXN). Одной терапевтической стратегией применения CRISPR является вырезание повтора GAA из первого интрона. Как полагают, экспансия повтора GAA воздействует на структуру ДНК и приводит к усилению образования гетерохроматина, что выключает ген фратаксина (фигура 32А).

Преимущества, обеспечивающие конкурентоспособность по сравнению с другими терапевтическими стратегиями, перечислены ниже.

Нокдаун с использованием siRNA в этом случае не доступен, поскольку заболевание обусловлено пониженной экспрессией фратаксина. В настоящее время исследуется генная терапия с использованием вирусов. Векторы на основе HSV-1 использовали для доставки гена фратаксина в животных моделях, и они продемонстрировали терапевтический эффект. Тем не менее, долговременная эффективность доставки фратаксина на основе вируса подвержена нескольким проблемам: во-первых, сложно регулировать экспрессию фратаксина, чтобы она соответствовала естественным уровням у здоровых индивидов, и во-вторых, долговременная сверхэкспрессия фратаксина приводит к гибели клеток.

Нуклеазы можно использовать для вырезания повтора GAA для восстановления здорового генотипа, но стратегии с использованием нуклеазы с "цинковыми пальцами" и TALEN требуют доставки двух пар высокоэффективных нуклеаз, что является сложным в отношении как доставки, так и конструирования нуклеаз (сложно достичь эффективного вырезания геномной ДНК с помощью ZFN или TALEN).

В отличие от приведенных выше стратегий, система CRISPR-Cas имеет явные преимущества. Фермент Cas9 является более эффективным и более мультиплексируемым, под чем подразумевается, что он одновременно может целенаправленно воздействовать на одну или несколько мишеней. На сегодняшний день вырезание геномной ДНК с помощью Cas9 в клетках человека обеспечивается с эффективностью >30%, и эффективность может составлять вплоть до 30%, а также она может быть улучшена в будущем. Кроме того, что касается определенных нарушений, связанных с тринуклеотидными повторами, таких как болезнь Гентингтона (HD), на тринуклеотидные повторы в кодирующем участке можно воздействовать, если существуют различия между двумя аллелями. В частности, если пациент с HD является гетерозиготным по мутантному НТТ, и существуют различия по нуклеотидам, такие как SNP между wt и мутантными аллелями НТТ, то Cas9 можно использовать для специфического целенаправленного воздействия на мутантный аллель НТТ. ZFN или TALEN не будут иметь возможности отличать два аллеля на основании различий по одному основанию.

При заимствовании стратегии применения фермента CRISPR-Cas 9 для воздействия на атаксию Фридрейха заявители сконструировали ряд направляющих РНК, которые осуществляют нацеливание на сайты, фланкирующие экспансию GAA, и выбирали наиболее эффективные и специфичные из них (фигура 32В).

Заявители доставляли комбинацию направляющих РНК, осуществляющих нацеливание на интрон 1 в FXN, вместе с Cas9 для опосредования вырезания участка с экспансией GAA. AAV9 можно использовать для опосредования эффективной доставки Cas9 и в спинной мозг.

Если Alu-элемент, смежный с экспансией GAA, считается важным, могут существовать ограничения по числу сайтов, на которые можно целенаправленно воздействовать, но заявители могут применять стратегии во избежание его разрушения.

Альтернативные стратегии

Вместо того, чтобы модифицировать геном, используя Cas9, заявители могут также непосредственно активировать ген FXN с использованием ДНК-связывающего домена на основе Cas9 (лишенной нуклеазной активности) для целенаправленного воздействия на домен активации транскрипции гена FXN. Возможно, заявители должны учитывать надежность опосредованной Cas9 искусственной активации транскрипции, чтобы обеспечить ее достаточную надежность по сравнению с другими способами (Tremblay et al., Transcription Activator-Like Effector Proteins Induce the Expression of the Frataxin Gene; Human Gene Therapy. August 2012, 23 (8): 883-890.)

Пример 29. Стратегии сведения к минимуму нецелевого расщепления при использовании никазы Cas9

Как упоминалось выше в данной заявке, Cas9 можно подвергнуть мутации для опосредования расщепления одной нити с помощью одной или нескольких из следующих мутаций: D10A, Е762А и Н840А.

Для опосредования нокаута гена с помощью NHEJ заявители использовали никазный вариант Cas9 вместе с двумя направляющими РНК. Нецелевое внесение однонитевых разрывов с помощью каждой отдельной направляющей РНК преимущественно может репарироваться без мутации, двухнитевые разрывы (которые могут привести к мутациям посредством NHEJ) возникают только тогда, когда целевые сайты являются смежными друг с другом. Поскольку двухнитевые разрывы, вводимые путем внесения двойных однонитевых разрывов, не характеризуются наличием "тупых" концов, совместная экспрессия ферментов, осуществляющих процессинг концевых участков, таких как TREX1, будет повышать уровень активности NHEJ.

Следующий перечень мишеней в форме таблицы представлен для генов, вовлеченных в следующие заболевания.

Болезнь Лафора - целенаправленное воздействие на GSY1 или PPP1R3C (PTG) для снижения уровня гликогена в нейронах.

Гиперхолестеринемия - целенаправленное воздействие на PCSK9.

Целевые последовательности приведены попарно (L и R) с различным числом нуклеотидов в спейсере (0-3 п.о.). Каждый спейсер можно использовать сам по себе с Cas9 дикого типа для введения двухнитевого разрыва в целевом локусе.

Альтернативные стратегии для улучшения стабильности направляющей РНК и повышения специфичности

1. Нуклеотиды на 5'-конце направляющей РНК можно соединить посредством тиоэфирных связей, а не фосфоэфирных связей, как в натуральной РНК. Тиоэфирная связь может предотвращать расщепление направляющей РНК эндогенным аппаратом для разрушения РНК.

2. В качестве нуклеотидов в направляющей последовательности (20 п.о. на 5'-конце) направляющей РНК можно использовать мостиковые нуклеиновые кислоты (BNA) в качестве оснований для улучшения специфичности связывания.

Пример 30. CRISPR-Cas для быстрого мультиплексного редактирования генома

Аспекты настоящего изобретения относятся к протоколам и способам, с помощью которых можно тестировать эффективность и специфичность модификации генов в пределах 3-4 дней после конструирования мишени, а клональные линии модифицированных клеток можно получить в пределах 2-3 недель.

Программируемые нуклеазы представляют собой эффективные технологии для опосредования изменения генома с высокой точностью. Направляемую РНК нуклеазу Cas9 из микробной системы адаптивного иммунитета CRISPR можно использовать для облегчения эффективного редактирования генома в эукариотических клетках путем простого определения 20-нуклеотидной нацеливающей последовательности в ее направляющей РНК. Заявители описали набор протоколов для применения Cas9, чтобы облегчить эффективное редактирование генома в клетках млекопитающих и создавать линии клеток для последующих функциональных исследований. Начиная с конструирования мишени, эффективной и специфичной модификации гена можно достичь в пределах 3-4 дней, а клональные линии модифицированных клеток можно получить в пределах 2-3 недель.

Возможность конструирования биологических систем и организмов имеет огромный потенциал для применений в фундаментальной науке, медицине и биотехнологии. Программируемые специфичные к последовательности эндонуклеазы, которые облегчают точное редактирование эндогенных локусов генома, теперь дают возможность систематического исследования генетических элементов и каузальных генетических изменений у широкого спектра видов, в том числе у тех, которые ранее не поддавались обработке генетическими способами. В последние годы возник ряд технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы с "цинковыми пальцами" (ZFN), подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN) и направляемая РНК нуклеазная система CRISPR-Cas. В первых двух технологиях используется традиционная стратегия связывания эндонуклеазных каталитических доменов с модулярными ДНК-связывающими белками для индукции целенаправленных двухнитевых разрывов (DSB) ДНК в конкретных локусах генома. В отличие от этого, Cas9 представляет собой нуклеазу, направляемую небольшими РНК посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с целевой ДНК, представляя систему, которая является простой для конструирования, эффективной и хорошо подходящей для высокопроизводительного и мультиплексного редактирования генов для ряда типов клеток и организмов. В данном документе заявители описали набор протоколов для применения недавно разработанной нуклеазы Cas9, чтобы облегчить эффективное редактирование генома в клетках млекопитающих и создавать линии клеток для последующих функциональных исследований.

Подобно ZFN и TALEN, Cas9 способствует редактированию генома путем стимуляции DSB в целевых локусах генома. При расщеплении Cas9 целевой локус подвергается одному из двух основных путей репарации повреждений ДНК, пути склонного к ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ) или пути высокоточной репарации с участием гомологичной рекомбинации (HDR). Оба пути можно использовать для достижения требуемого результата редактирования.

NHEJ: в отсутствие матрицы для репарации в процессе NHEJ происходит повторное лигирование DSB, которое может оставлять "рубец" в виде мутаций по типу вставок/делеций. Данный способ можно приспособить для достижения нокаута генов, поскольку вставки/делеции, возникающие в пределах кодирующего экзона, могут приводить к мутациям сдвига рамки считывания и появлению преждевременного стоп-кодона. Множественные DSB также можно использовать для опосредования делеций большего размера в геноме.

HDR: репарация с участием гомологичной рекомбинации является альтернативным NHEJ основным путем репарации ДНК. Хотя HDR обычно происходит с более низкими частотами, чем NHEJ, его можно приспособить для создания точных определенных модификаций в целевом локусе в присутствии экзогенно введенной матрицы для репарации. Матрица для репарации может присутствовать либо в виде двухнитевой ДНК, сконструированной подобно общепринятым целенаправленно воздействующим на ДНК конструкциям с гомологичными плечами, фланкирующими последовательность вставки, либо в виде однонитевых олигонуклеотидов ДНК (ssODN). Последние обеспечивают эффективный и простой способ создания небольших редакционных изменений в геноме, таких как введение однонуклеотидных мутаций для анализа каузальных генетических изменений. В отличие от NHEJ, HDR обычно происходит только в делящихся клетках, и ее эффективность варьирует в зависимости от типа и состояния клетки.

Обзор CRISPR: система CRISPR-Cas, напротив, является как минимум двухкомпонентной системой, состоящей из нуклеазы Cas9 и короткой направляющей РНК. Для перенацеливания Cas9 на различные локусы или одновременного редактирования нескольких генов требуется просто клонировать другой олигонуклеотид размером 20 п.о. Хотя специфичность нуклеазы Cas9 подробно еще не освещалась, простое спаривание оснований по Уотсону-Крику в системе CRISPR-Cas, вероятно, является более предсказуемым, нежели у доменов ZFN или TALEN.

CRISPR-Cas типа II (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) представляет собой бактериальную систему адаптивного иммунитета, в которой Cas9 используется для расщепления чужеродных генетических элементов. Cas9 направляется парой некодирующих РНК, вариабельной crRNA и необходимой вспомогательной tracrRNA. crRNA содержит направляющую последовательность из 20 нуклеотидов, определяющую специфичность по расположению целевой ДНК посредством спаривания оснований по Уотсон-Крику. В нативной бактериальной системе несколько crRNA совместно транскрибируются для направления Cas9 на различные мишени. В системе CRISPR-Cas, полученной из Streptococcus pyogenes, целевая ДНК должна находиться непосредственно перед 5'-мотивом NGG/NRG, прилегающим к протоспейсеру (РАМ), который может отличаться в других системах CRISPR.

CRISPR-Cas воспроизводят в клетках млекопитающих посредством гетерологичной экспрессии кодон-оптимизированного для человека Cas9 и необходимых компонентов РНК. Кроме того, crRNA и tracrRNA можно слить для создания химерной синтетической направляющей РНК (sgRNA). Cas9 можно, таким образом, перенаправить на любую представляющую интерес мишень путем изменения направляющей последовательности размером 20 нуклеотидов в sgRNA.

С учетом простоты реализации и способности к мультиплексному действию Cas9 использовали для получения подвергнутых методам генной инженерии эукариотических клеток, несущих специфические мутации, посредством как NHEJ, так и HDR. Кроме того, прямая инъекция sgRNA и мРНК, кодирующей Cas9, в эмбрионы обеспечила возможность быстрого получения трансгенных мышей с несколькими модифицированными аллелями; это дает перспективу для редактирования организмов, которые в ином случае не поддаются обработке генетическими способами.

Методами генной инженерии был разработан мутантный Cas9 с нарушением в одном из своих каталитических доменов для внесения однонитевых разрывов, а не для расщепления в ДНК, что обеспечивает возможность внесения однонитевых разрывов и преимущественной репарации посредством HDR, что потенциально позволяет избежать нежелательных мутации по типу вставок/делеций в результате нецелевых DSB. Кроме того, мутант Cas9 с подвергнутыми мутации обоими расщепляющими ДНК каталитическими остатками был приспособлен для обеспечения возможности регуляции транскрипции у Е. coli, что демонстрирует потенциал функционализации Cas9 для разнообразных применений. Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к конструированию и применению Cas9 для мультиплексного редактирования в клетках человека.

Заявители обеспечили кодон-оптимизированный для человека, фланкированный последовательностями ядерной локализации Cas9 для облегчения редактирования генов эукариот. Заявители описали соображения, которые следует учитывать при конструировании направляющей последовательности из 20 нуклеотидов, протоколы для быстрого конструирования и функциональной валидации sgRNA и, наконец, применение нуклеазы Cas9 для опосредования модификаций генома как на основе NHEJ, так и HDR в линиях клеток почки человеческого эмбриона (HEK-293FT) и стволовых клеток человека (HUES9). Этот протокол можно аналогичным образом применить к другим типам клеток и организмам.

Выбор мишени для sgRNA. существуют два главных соображения, которые необходимо учитывать при выборе направляющей последовательности из 20 нуклеотидов для целенаправленного воздействия на ген: 1) целевая последовательность должна находиться перед РАМ 5'-NGG для Cas9 S. pyogenes и 2) направляющие последовательности следует выбирать со сведением к минимуму нецелевой активности. Заявители обеспечили инструмент конструирования для нацеливания Cas9 в режиме онлайн, в который вводят искомую представляющую интерес последовательность и он идентифицирует подходящие целевые сайты. Для экспериментальной оценки нецелевых модификаций для каждой sgRNA заявители также обеспечили предсказанные путем вычислений нецелевые сайты для каждой предполагаемой мишени, ранжированные согласно проведенному заявителями количественному анализу специфичности в отношении эффектов идентичности, положения и распределения несовпадений при спаривании оснований.

Подробная информация о предсказанных путем вычислений нецелевых сайтах выглядит следующим образом.

Соображения, которые следует учитывать для активностей в отношении нецелевого расщепления. Подобно другим нуклеазам, Cas9 может расщеплять нецелевые ДНК-мишени в геноме с пониженной частотой. Степень, с которой данная направляющая последовательность проявляет нецелевую активность, зависит от комбинации факторов, включающих концентрацию фермента, термодинамические характеристики конкретной используемой направляющей последовательности и распространенность подобных последовательностей в целевом геноме. Для стандартного применения Cas9 важно учитывать пути для сведения к минимуму степени нецелевого расщепления, а также для возможности выявлять наличие нецелевого расщепления.

Сведение к минимуму нецелевой активности. Для применения в линиях клеток заявители рекомендовали следующие две стадии для снижения степени нецелевой модификации генома. Во-первых, при использовании разработанного заявителями онлайн-инструмента выбора мишени для CRISPR возможно путем вычислений оценить вероятность того, что данная направляющая последовательность имеет нецелевые сайты. Эти анализы осуществляют посредством поиска методом полного перебора в геноме в отношении нецелевых последовательностей, которые представляют собой последовательности, подобные направляющей последовательности. Всестороннее экспериментальное исследование эффекта несовпадения оснований между sgRNA и ее целевой ДНК выявило, что допустимость несовпадения является 1) зависимой от положения - 8-14 п.о. на 3'-конце направляющей последовательности несовпадения являются менее допустимыми, чем у оснований на 5'-конце; 2) зависимой от количества - обычно не допускаются более 3 несовпадений; 3) зависимой от направляющей последовательности - в случае некоторых направляющих последовательностях несовпадения являются менее допустимыми, чем в случае других; и 4) зависимой от концентрации - нецелевое расщепление высокочувствительно к количеству трансфицированной ДНК. Разработанный заявителями веб-инструмент для анализа целевых сайтов (доступный на веб-сайте genome-engineering.org/tools) объединяет эти критерии для обеспечения предсказания вероятных нецелевых сайтов в целевом геноме. Во-вторых, заявители рекомендовали подбор количества Cas9 и плазмиды для экспрессии sgRNA для сведения к минимуму нецелевой активности.

Выявление нецелевых активностей. Используя разработанный заявителями веб-инструмент для нацеливания CRISPR, возможно создать перечень наиболее вероятных нецелевых сайтов, а также праймеров, осуществляя анализ данных сайтов с помощью SURVEYOR или секвенирования. Для изогенных клонов, полученных с использованием Cas9, заявители настоятельно рекомендуют секвенирование этих кандидатных нецелевых сайтов для проверки в отношении любых нежелательных мутаций. Стоит отметить, что в сайтах, которые не включены в перечень прогнозируемых кандидатов, могут присутствовать нецелевые модификации, и полногеномное секвенирование следует проводить для полного подтверждения отсутствия нецелевых сайтов. Кроме того, в мультиплексных анализах, в которых несколько DSB индуцируют в одном и том же геноме, могут существовать низкие показатели частоты событий транслокации, и их можно оценить с использованием ряда методик, таких как глубокое секвенирование.

Онлайн-инструмент обеспечивает последовательности для всех олигонуклеотидов и праймеров, необходимых для 1) получения конструкций sgRNA, 2) анализа эффективности целевой модификации и 3) оценки расщепления в возможных нецелевых сайтах. Стоит отметить, что вследствие того, что промотор U6 для РНК-полимеразы III, используемый для экспрессии sgRNA, предпочитает гуаниновый (G) нуклеотид в качестве первого основания в его транскрипте, дополнительный G прикрепляют на 5'-конце sgRNA, если направляющая последовательность из 20 нуклеотидов не начинается с G.

Подходы к конструированию и доставке sgRNA. В зависимости от требуемого применения sgRNA можно доставлять либо в виде 1) ПЦР-ампликонов, содержащих кассету экспрессии, либо в виде 2) экспрессирующих sgRNA плазмид. При доставке sgRNA с использованием ПЦР прикрепляют последовательность специальной sgRNA на обратный праймер для ПЦР, используемый для амплификации матрицы с промотором U6. Полученный в результате ампликон можно совместно трансфицировать с плазмидой, содержащей Cas9 (РХ165). Этот способ является оптимальным для быстрого скрининга нескольких кандидатных sgRNA, поскольку процедуры трансфекции клеток для функционального тестирования можно осуществлять всего лишь спустя часы после получения кодирующих sgRNA праймеров. Поскольку этот простой способ избегает потребности в клонировании с использованием плазмид и подтверждении последовательности, он хорошо подходит для тестирования или совместной трансфекции большого количества sgRNA для создания больших библиотек нокаутных генов или для других чувствительных к масштабу применений. Следует обратить внимание, что кодирующие sgRNA праймеры имеют длину более 100 п.о. по сравнению с олигонуклеотидами длиной ~20 п.о., требующимися для доставки sgRNA с использованием плазмид.

Конструирование плазмид для экспрессии sgRNA также является простым и быстрым, включающим одну стадию клонирования с парой частично комплементарных олигонуклеотидов. После отжига пар олигонуклеотидов полученные в результате направляющие последовательности можно встроить в плазмиду, несущую как Cas9, так и неизменяемый каркас, несущий остальную часть последовательности sgRNA (РХ330). Плазмиды для трансфекции также можно модифицировать для обеспечения возможности получения вируса для доставки in vivo.

Помимо ПЦР и способов доставки с использованием плазмид, как Cas9, так и sgRNA можно вводить в клетки в виде РНК.

Конструирование матрицы для репарации. Традиционно, целенаправленные модификации ДНК требовали применения донорных матриц для репарации на основе плазмид, которые содержат гомологичные плечи, фланкирующие сайт изменения. Гомологичные плечи с каждой стороны могут варьировать по длине, но, как правило, имеют длину более 500 п.о. Этот способ можно применять для создания модификаций большого размера, в том числе вставок репортерных генов, таких как флуоресцентные белки или маркеры устойчивости к антибиотикам. Разработка и конструирование плазмид для целенаправленного воздействия были описаны в других местах в данном документе.

В последнее время однонитевые олигонуклеотиды ДНК (ssODN) использовали вместо плазмид для целенаправленного воздействия в случае коротких модификаций в пределах определенного локуса без клонирования. Для достижения высоких показателей эффективности HDR ssODN содержат фланкирующие последовательности по меньшей мере из 40 п.о. с каждой стороны, которые являются гомологичными целевому участку и которые могут быть ориентированы либо в смысловом, либо в антисмысловом направлении относительно целевого локуса.

Функциональное тестирование

Анализ с помощью нуклеазы SURVEYOR. Заявители выявляли мутации по типу вставок/делеций либо посредством анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR, либо посредством секвенирования ПЦР-ампликона. Разработанный заявителями онлайн-инструмент конструирования для нацеливания CRISPR обеспечивает рекомендованные праймеры для обоих подходов. Тем не менее, праймеры для анализа с помощью SURVEYOR или секвенирования, также можно сконструировать вручную для амплификации представляющего интерес участка из геномной ДНК и во избежание получения неспецифических ампликонов с использованием Primer-BLAST от NCBI. Праймеры для анализа с помощью SURVEYOR должны быть сконструированы для амплификации 300-400 п.о. (для общего ампликона 600-800 п.о.) с каждой стороны мишени Cas9, чтобы обеспечить возможность четкой визуализации полученных после расщепления полос с помощью гель-электрофореза. Чтобы предотвратить избыточное образование димеров праймеров, праймеры для анализа с помощью SURVEYOR должны быть сконструированы таким образом, чтобы они, как правило, имели длину до 25 нуклеотидов с температурами плавления ~60°C. Заявители рекомендуют тестирование каждой пары праймеров-кандидатов в отношении специфических ПЦР-ампликонов, а также в, отношении отсутствия неспецифического расщепления во время процесса расщепления нуклеазой SURVEYOR.

HDR, опосредованная плазмидами или ssODN. HDR можно выявить с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования модифицированного участка. Праймеры для ПЦР для этой цели следует отжигать за пределами участка, охватываемого гомологичными плечами, во избежание ложного выявления остаточной матрицы для репарации (прямой и обратный праймеры для HDR, фигура 30). Для опосредованной ssODN HDR можно использовать праймеры для ПЦР, применяемые в анализе с помощью SURVEYOR.

Выявление вставок/делеций или HDR с помощью секвенирования. Заявители выявляли целенаправленные модификации генома либо с помощью секвенирования по Сэнгеру, либо с помощью глубокого секвенирования нового поколения (NGS). Что касается первого из вышеупомянутых, геномную ДНК из модифицированного участка можно амплифицировать с использованием либо праймеров для анализа с помощью SURVEYOR, либо праймеров для HDR. Ампликоны следует субклонировать в плазмиду, такую как pUC19, для трансформации; отдельные колонии можно подвергнуть секвенированию для выявления клонального генотипа.

Заявители сконструировали используемые при секвенировании нового поколения (NGS) праймеры для более коротких ампликонов, как правило, с размером в диапазоне 100-200 п.о. Для выявления мутаций в результате NHEJ важным является конструирование праймеров по меньшей мере с 10-20 п.о. между праймирующими участками и целевым сайтом Cas9 для обеспечения возможности выявления более длинных вставок/делеций. Заявители обеспечивают рекомендации для двухстадийного способа ПЦР, чтобы прикрепить адаптеры со штрих-кодами для мультиплексного глубокого секвенирования. Заявители рекомендуют платформу Illumina ввиду обычно характерных для нее низких уровней ложноположительных вставок/делеций. Затем можно провести анализ нецелевой активности (описанный ранее) с помощью программ выравнивания ридов, таких как ClustalW, Geneious, или простых скриптов для анализа последовательностей.

Материалы и реагенты

Получение sgRNA

Сверхчистая, не содержащая ДНКаз/РНКаз вода (Life Technologies, кат. №10977-023)

Слитая полимераза Herculase II (Agilent Technologies, кат. №600679)

ВАЖНО. Стандартная Taq-полимераза, котдрая лишена 3'-5' экзонуклеазной корректирующей активности, характеризуется более низкой точностью и может приводить к ошибкам при амплификации. Herculase II представляет собой высокоточную полимеразу (эквивалентную по точности Pfu), которая дает высокий выход продукта ПЦР при минимальной оптимизации. Можно заменить другими высокоточными полимеразами.

Реакционный буфер для Herculase II (5х; Agilent Technologies, включенный с полимеразой)

Раствор смеси dNTP (25 мМ каждого; Enzymatics, кат. №N205L)

MgCl2 (25 мМ; ThermoScientific, кат. №R0971)

Набор для экстракции из геля QIAquick (Qiagen, кат. №28704)

Набор QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, кат. №27106)

Буфер TBE UltraPure (10X; Life Technologies, кат. №15581-028)

Агароза LE SeaKem (Lonza, кат. №50004)

Краситель ДНК SYBR Safe (10000х; Life Technologies, кат. №S33102)

Маркер молекулярного веса ДНК длиной более 1 т.п.н. (Life Technologies, кат. №10787-018)

Загрузочный буфер для ксилолцианолового и оранжевого красителей TrackIt (Life Technologies, кат. №10482-028)

BbsI FastDigest (BpiI) (Fermentas/ThermoScientific, кат. №FD1014)

Буфер Fermentas Tango (Fermentas/ThermoScientific, кат. №BY5)

DL-дитиотреитол (DTT; Fermentas/ThermoScientific, кат. №R0862)

ДНК-лигаза T7 (Enzymatics, кат. №L602L)

Важно: не заменять на используемую чаще лигазу Т4. Лигаза Т7 характеризуется в 1000 раз более высокой активностью на "липких" концах, чем на "тупых" концах, и более высокой общей активностью, чем коммерчески доступные концентрированные лигазы Т4.

2Х буфер для быстрого лигирования Т7 (включен с ДНК-лигазой Т7, Enzymatics, кат. №L602L)

Полинуклеотидкиназа Т4 (New England Biolabs, кат. №M0201S)

Реакционный буфер для ДНК-лигазы Т4 (10Х; New England Biolabs, кат. №B0202S)

Аденозин-5'-трифосфат (10 мМ; New England Biolabs, кат. №P0756S)

АТФ-зависимая ДНКаза PlasmidSafe (Epicentre, кат. №Е3101K)

Химически компетентная Escherichia coli (Е. coli) One Shot Stbl3 (Life Technologies, кат. №C7373-03)

Среда SOC (New England Biolabs, кат. №B9020S)

Среда LB (Sigma, кат. №L3022)

Агаровая среда LB (Sigma, кат. №L2897)

Ампициллин, стерилизованный фильтрованием (100 мг⋅мл^-1; Sigma, кат. №А5354)

Культура клеток млекопитающих

Клетки HEK293FT (Life Technologies, кат. №R700-07)

Минимальная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM, 1X, с высоким содержанием глюкозы; Life Technologies, кат. №10313-039)

Минимальная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM, 1X, с высоким содержанием глюкозы, без фенолового красного; Life Technologies, кат. №31053-028)

Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (DPBS, 1X; Life Technologies, кат. №14190-250)

Фетальная бычья сыворотка, разбавленная и инактивированная нагреванием (Life Technologies, кат. №10438-034)

Среда с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM I (FBS; Life Technologies, кат. №11058-021)

Пенициллин-стрептомицин (100х; Life Technologies, кат. №15140-163)

TrypLE™ Express (1X, без фенолового красного; Life Technologies, кат. №12604-013)

Реагент для трансфекции Lipofectamine 2000 (Life Technologies, кат. №11668027)

Набор Amaxa SF S для трансфекции линий клеток на 4D-Nucleofector® X (32 RCT; Lonza, кат. №V4XC-2032)

Линия клеток HUES 9 (HARVARD STEM CELL SCIENCE)

Матрикс базальной мембраны Geltrex с пониженным содержанием ростовых факторов и не содержащий LDEV (Life Technologies, кат. №А1413201)

Среда mTeSR1 (Stemcell Technologies, кат. №05850)

Раствор для отслоения клеток Accutase (Stemcell Technologies, кат. №07920)

Ингибитор ROCK (Y-27632; Millipore, кат. №SCM075)

Набор Amaxa Р3 S для трансфекции первичных клеток на 4D-Nucleofector® X (32 RCT; Lonza, кат. №V4XP-3032)

Анализ генотипирования

Раствор для экстракции ДНК QuickExtract (Epicentre, кат. №QE09050)

Праймеры для ПЦР для анализа с помощью SURVEYOR, анализа RFLP или секвенирования (см. таблицу праймеров)

Слитая полимераза Herculase II (Agilent Technologies, кат. №600679)

ВАЖНО. Поскольку анализ с помощью Surveyor является чувствительным к несовпадениям по одному основанию, особо важным является использование высокоточной полимеразы. Можно заменить другими высокоточными полимеразами.

Реакционный буфер для Herculase II (5х; Agilent Technologies, включенный с полимеразой)

Раствор смеси dNTP (25 мМ каждого; Enzymatics, кат. №N205L)

Набор для экстракции из геля QIAquick (Qiagen, кат. №28704)

Буфер для Taq (10х; GenScript, кат. №В0005)

Набор для выявления мутаций с помощью SURVEYOR для стандартного гель-электрофореза (Transgenomic, кат. №706025)

Буфер ТВЕ UltraPure (10х; Life Technologies, кат. №15581-028)

Агароза LE SeaKem (Lonza, кат. №50004)

Гели с 4-20% ТВЕ толщиной 1,0 мм, 15 лунок (Life Technologies, кат. №ЕС62255 ВОХ)

Буфер для образца ТВЕ Novex®, с высокой плотностью (5Х; Life Technologies, кат. №LC6678)

Краситель SYBR золотой для окрашивания нуклеиновых кислот в геле (10000Х; Life Technologies, кат. №S-11494)

Маркер молекулярного веса ДНК длиной более 1 т.п.н. (Life Technologies, кат. №10787-018)

Загрузочный буфер для ксилолцианолового и оранжевого красителей TrackIt (Life Technologies, кат. №10482-028)

HindIII FastDigest (Fermentas/ThermoScientific, кат. №FD0504)

Оборудование

Стерильные наконечники с фильтром для пипеток (Corning)

Стандартные микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл (Eppendorf, кат. №0030 125.150)

96-луночные планшеты для ПЦР Axygen (VWR, кат. №PCR-96M2-HSC)

Пробирки для ПЦР Axygen, 8 на стрип (Fischer Scientific, кат. №14-222-250)

Пробирки Falcon, полипропилен, 15 мл (BD Falcon, кат. №352097)

Пробирки Falcon, полипропилен, 50 мл (BD Falcon, кат. №352070)

Круглодонная пробирка с сетчатым фильтром для клеток, 5 мл (BD Falcon, кат. №352235)

Чашки Петри (60 мм×15 мм; BD Biosciences, кат. №351007)

Планшет для культуры тканей (24 лунки; BD Falcon, кат. №353047)

Планшет для культуры тканей (96 лунок, плоскодонный; BD Falcon, кат. №353075)

Чашка для культуры тканей (100 мм; BD Falcon, 353003)

Термоциклер на 96 лунок с программируемой функцией поэтапного изменения температуры Applied Biosystems Veriti, кат. №4375786).

Настольные микроцентрифуги 5424, 5804 (Eppendorf)

Система для гель-электрофореза (базовый источник питания PowerPac, Bio-Rad, кат. №164-5050, и лоток для геля из системы Sub-Cell GT, Bio-Rad, кат. №170-4401)

Мини-ячейка для электрофореза Novex XCell SureLock (Life Technologies, кат. №EI0001)

Цифровая система для визуализации геля (GelDoc EZ, Bio-Rad, кат. №170-8270, и голубой лоток для образца, Bio-Rad, кат. №170-8273)

Прибор для просвечивания голубым светом и очки с оранжевым светофильтром (SafeImager 2.0; Invitrogen, кат. №G6600)

Программное обеспечение для количественной оценки геля (Bio-Rad, ImageLab, включена в GelDoc EZ, или ImageJ с открытым исходным кодом от Национальных институтов здравоохранения, доступная на веб-сайте rsbweb.nih.gov/ij/) с помощью УФ-спектрофотометра (NanoDrop 2000 с, Thermo Scientific)

Приготовление реагентов

Раствор для электрофореза на основе Tris-бората EDTA (ТВЕ). Разбавить буфер ТВЕ в дистиллированной воде до 1X рабочего раствора для заливки агарозных гелей и для применения в качестве буфера для электрофореза. Буфер можно хранить при комнатной температуре (18-22°C) в течение по меньшей мере 1 года.

• АТФ, 10 мМ. Разделить 10 мМ АТФ на аликвоты по 50 мкл и хранить при -20°C до 1 года; избегать повторных циклов замораживания-размораживания.

• DTT, 10 мМ. Приготовить 10 мМ раствор DTT в дистиллированной воде и хранить в аликвотах по 20 мкл при -70°C в течение периода до 2 лет; для каждой реакции использовать новую аликвоту, поскольку DTT легко окисляется.

• Культуральная среда D10. Для культивирования клеток HEK293FT приготовить культуральную среду D10 путем добавления к DMEM 1X GlutaMAX и 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки. Как указано в протоколе, эту среду также дополняют 1X пенициллином-стрептомицином. Среду D10 можно приготовить заранее и хранить при 4°C в течение периода до 1 месяца.

• Культуральная среда mTeSR1. Для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека приготовить среду mTeSR1 путем добавления 5Х добавки (включенной в базовую среду mTeSR1) и 100 мкг/мл нормоцина.

Процедура

Конструирование нацеливающих компонентов и применение онлайн-инструмента • Временные рамки 1 день

1| Ввести последовательность целевой геномной ДНК. Заявители обеспечили онлайн-инструмент конструирования для нацеливания Cas9, который использует искомую представляющую интерес последовательность, идентифицирует и ранжирует подходящие целевые сайты и путем вычислений прогнозирует нецелевые сайты для каждой предполагаемой мишени. В альтернативном случае специалист может в ручном режиме выбирать направляющую последовательность путем идентификации последовательности из 20 п.о. непосредственно выше любого 5'-NGG.

2| Заказать необходимые олигонуклеотиды и праймеры, которые определены с помощью онлайн-инструмента. Если сайт выбирают вручную, олигонуклеотиды и праймеры должны быть сконструированы.

Получение экспрессионной конструкции sgRNA

3| Для создания экспрессионной конструкции sgRNA можно использовать протокол на основе ПЦР либо плазмид.

(А) Посредством ПЦР-амплификации • Временные рамки 2 часа

(i) Заявители готовили разведенную матрицу с U6 для ПЦР. Заявители рекомендуют использовать РХ330 в качестве матрицы для ПЦР, но любую содержащую U6 плазмиду можно подобным образом использовать в качестве матрицы для ПЦР. Заявители разбавляли матрицу с помощью ddH₂O до концентрации10 нг/мкл. Следует обратить внимание, что если в качестве матрицы используется плазмида или кассета, уже содержащая управляемую U6 sgRNA, следует провести экстракцию из геля, чтобы удостовериться в том, что продукт содержит только намеченную sgRNA и не содержит следовую sgRNA, перенесенную с матрицы.

(ii) Заявители готовили разбавленные олигонуклеотиды для ПЦР. Прямой праймер для U6 и обратный праймер для U6-sgRNA разбавляли до конечной концентрации 10 мкМ в ddH₂O (добавляли 10 мкл 100 мкМ праймера к 90 мкл ddH₂O).

(iii) Реакционная смесь для ПЦР с U6-sgRNA. Заявители готовили следующие реакционные смеси для каждого обратного праймера для U6-sgRNA и мастер-микса, если необходимо:

(iv) Заявители проводили ПЦР-реакцию с реакционными смесями из стадии (iii) с использованием следующих условий для циклов:

(v) По завершении реакции заявители прогоняли продукт в геле для подтверждения успешной амплификации, дающей одну полосу. Залить 2% (вес/об.) агарозный гель в 1X буфер ТВЕ с 1X красителем SYBR Safe. Разогнать 5 мкл продукта ПЦР в геле при 15 В⋅см^-1 в течение 20-30 мин. Успешно полученные ампликоны должны давать один-единственный продукт из 370 п.о., а матрица должна быть невидимой. Экстракция из геля ПЦР-ампликона не обязательно является необходимой.

(vi) Заявители очищали продукт ПЦР с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick согласно указаниям производителя. Элюировать ДНК в 35 мкл буфера ЕВ или воды. Очищенные продукты ПЦР можно хранить при 4°C или -20°C.

(В) Клонирование sgRNA в содержащий Cas9 бицистронный вектор экспрессии • Временные рамки 3 дня

(i) Приготовить вставки олигонуклеотидов sgRNA. Заявители ресуспендировали верхнюю и нижнюю нити олигонуклеотидов для каждой конструкции sgRNA в конечной концентрации 100 мкМ. Фосфорилировать и отжечь олигонуклеотиды следующим образом:

Олигонуклеотид 1 (100 мкМ)	1 мкл
Олигонуклеотид 2 (100 мкМ)	1 мкл
Буфер для лигирования Т4, 10Х	1 мкл
PNK Т4	1 мкл
ddH 2 O	6 мкл
Всего	10 мкл

(ii) Отжечь в термоциклере с использованием следующих параметров:

37°C в течение 30 мин.

95°C в течение 5 мин.

Линейно понизить температуру до 25°C со скоростью 5°C в мин.

(iii) Заявители разбавляли фосфорилированные и отожженные олигонуклеотиды 1:200 путем добавления 1 мкл олигонуклеотидов к 199 мкл ddH₂O комнатной температуры.

(iv) Клонировать олигонуклеотид sgRNA в РХ330. Заявители готовили реакционную смесь Golden Gate для каждой sgRNA. Заявители также рекомендуют приготовить не содержащий вставки простой РХ330 в качестве отрицательного контроля.

РХ330 (100нг)	хмкл
Разбавленный дуплекс олигонуклеотидов из стадии (iii)	2 мкл
Буфер Tango, 10Х	2 мкл
DTT, 10 мМ	1 мкл
АТФ, 10 мМ	1 мкл
BbsI FastDigest	1 мкл
Лигаза Т7	0,5 мкл
ddH 2 O	х мкл
Всего	20 мкл

(v) Инкубировать реакционную смесь Golden Gate в общей сложности в течение 1 часа:

Число циклов	Условия
1-6	37°C в течение 5 мин., 21°C в течение 5 мин

(vi) Заявители обрабатывали реакционную смесь Golden Gate экзонуклеазой PlasmidSafe для расщепления любой остаточной линеаризованной ДНК. Эта стадия является необязательной, но очень рекомендуется.

Реакционная смесь Golden Gate из стадии 4	11 мкл
10Х буфер для PlasmidSafe	1,5 мкл
АТФ, 10 мМ	1,5 мкл
Экзонуклеаза PlasmidSafe	1 мкл
Всего	15 мкл

(vii) Заявители инкубировали реакционную смесь с PlasmidSafe при 37°C в течение 30 мин. с последующей инактивацией при 70°C в течение 30 мин. Точка паузы: после завершения реакционную смесь можно заморозить и продолжить позже. Кольцевая ДНК должна быть стабильна в течение по меньшей мере 1 недели.

(viii) Трансформация. Заявители трансформировали плазмиды, обработанные PlasmidSafe, в компетентный штамм Е. coli согласно протоколу, поставляемому с клетками. Заявители рекомендовали Stbl3 для быстрой трансформации. Вкратце, заявители добавляли 5 мкл продукта из стадии (vii) в 20 мкл охлажденных на льду химически компетентных клеток Stbl3. Затем их инкубировали на льду в течение 10 мин., подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 30 с, немедленно возвращали на лед на 2 мин., добавляли 100 мкл среды SOC, и высевали их на чашку со средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, с инкубированием в течение ночи при 37°C.

(ix) День 2. Заявители подвергали планшеты осмотру в отношении роста колоний. Как правило, колонии на планшетах с отрицательным контролем (лигирование только РХ330, расщепленного BbsI, без отожженного олигонуклеотида sgRNA) отсутствуют, и колонии на планшетах для клонирования с РХ330-sgRNA присутствуют в количестве от нескольких десятков до нескольких сотен.

(x) Из каждого планшета заявители отбирали 2-3 колонии для проверки правильности вставки sgRNA. Заявители использовали стерильные наконечники для пипеток, чтобы инокулировать одну колонию в 3 мл культуральной среды LB со 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировали и встряхивали при 37°C в течение ночи.

(xi) День 3. Заявители выделяли плазмидную ДНК из суточных культур с использованием набора QIAprep Spin Miniprep согласно инструкциям производителя.

(xii) Валидация последовательности плазмиды с CRISPR. Заявители подтверждали последовательность в каждой колонии путем секвенирования от промотора U6 с использованием прямого праймера для U6. Необязательно: последовательность используемых праймеров для гена Cas9 приведена в следующей таблице праймеров.

Заявители рассматривали результаты секвенирования в сравнении с последовательностью вектора клонирования РХ330 для проверки того, что направляющая последовательность из 20 п.о. была встроена между промотором U6 и остальной частью каркаса sgRNA. Подробности и последовательность РХ330 в виде карты в формате карты вектора, используемом в GenBank (файл *.gb), можно найти на веб-сайте crispr.genome-engineering, org.

(Необязательное) конструирование ssODN-матрицы • Временные рамки 3 дня с заблаговременным планированием

3| Конструирование и заказ ssODN. Либо смысловой, либо антисмысловой ssODN можно приобрести непосредственно у поставщика. Заявители рекомендовали конструирование гомологичных плеч по меньшей мере из 40 п.о. с каждой стороны и 90 п.о. для оптимальной эффективности HDR. По опыту заявителей антисмысловые олигонуклеотиды характеризуются чуть более высокими значениями эффективности модификации.

4| Заявители ресуспендировали и разводили ультрамеры ssODN до конечной концентрации 10 мкМ. Не объединять и не отжигать смысловые и антисмысловые ssODN. Хранить при -20°C.

5| Для применений с HDR следует учесть, что заявители рекомендуют клонировать sgRNA в плазмиду РХ330.

Функциональная валидация sgRNA: культура клеток и трансфекции • Временные рамки 3-4 дня

Система CRISPR-Cas была использована в ряде линий клеток млекопитающих. Условия могут варьировать для каждой линии клеток. В приведенных ниже протоколах подробно описываются условия трансфекции для клеток HEK239FT. Для трансфекции с опосредованной ssODN HDR следует учесть, что набор Amaxa SF Nucleofector для трансфекции линий клеток использовали для оптимальной доставки ssODN. Это описано в следующем разделе.

7| Поддержание HEK293FT. Клетки поддерживали согласно рекомендациям производителя. Вкратце, заявители культивировали клетки в среде D10 (DMEM GlutaMax, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой), при 37°C и 5% CO₂.

8| Для пассирования заявители удаляли среду и однократно промывали путем осторожного добавления DPBS по боковой стенке сосуда для того, чтобы не сместить клетки. Заявители добавляли 2 мл TrypLE во флакон Т75 и инкубировали в течение 5 мин. при 37°C. Для инактивации добавляли 10 мл теплой среды D10 и переносили в пробирку Falcon на 50 мл. При необходимости заявители диссоциировали клетки путем осторожного ресуспендирования и пересевали в новые флаконы. Заявители, как правило, пассировали клетки каждые 2-3 дня при индексе разведения 1:4 или 1:8, никогда не позволяя клеткам достигать больше 70% конфлюентности. Линии клеток возобновляли после достижения пассажа номер 15.

9| Получение клеток для трансфекции. Заявители высевали хорошо диссоциированные клетки на 24-луночные планшеты в среде D10 без антибиотиков за 16-24 часа до трансфекции при плотности посева 1,3×10⁵ клеток на лунку и высеваемом объеме 500 мкл. При необходимости осуществляют пропорциональное увеличение или уменьшение согласно инструкциям производителя. Не стоит высаживать больше клеток, чем рекомендованная плотность, поскольку это может снизить эффективность трансфекции.

10| В денью трансфекции оптимальным является, чтобы клетки достигли 70-90%) конфлюентности. Клетки можно трансфицировать с помощью реагента Lipofectamine 2000 или набора для трансфекции линий клеток Amaxa SF Nucleofector согласно протоколам производителя.

(A) Для sgRNA, клонированных в РХ330, заявители трансфицировали 500 нг подтвержденной по последовательности плазмиды с CRISPR; при трансфекции более чем одной плазмиды смешать в эквимолярном соотношении и не более чем 500 нг в сумме.

(B) Для sgRNA, амплифицированной с помощью ПЦР, заявители смешивали следующие компоненты:

РХ165 (только Cas9)	200 нг
Ампликон sgRNA (каждой)	40 нг
pUC 19	дополнить общей ДНК до 500 нг

Заявители рекомендовали осуществление трансфекции в трех повторностях согласно методике для надежной количественной оценки и включение контролей трансфекции (например, плазмиды с GFP) для отслеживания эффективности трансфекции. Кроме того, плазмиду для клонирования РХ330 и/или ампликон sgRNA можно трансфицировать отдельно в качестве отрицательного контроля для последующих функциональных анализов.

11| Заявители осторожно добавляли комплекс Lipofectamine к клеткам, поскольку клетки HEK293FT могут легко отделяться от планшета, и это приводит к более низкой эффективности трансфекции.

12| Заявители проверяли клетки через 24 часа после трансфекции в отношении ее эффективности путем оценки доли флуоресцирующих клеток в контроле (например, GFP) трансфекции с использованием флуоресцентного микроскопа. Как правило, трансфицировались более 70% клеток.

13| Заявители дополняли культуральную среду дополнительными 500 мкл теплой среды D10. Добавлять D10 очень медленно по боковой стенке лунки и не использовать холодную среду, поскольку клетки легко могут отделиться.

14| Клетки инкубировали в общей сложности в течение 48-72 часов после трансфекции перед сбором для анализа вставок/делеций. Эффективность образования вставок/делеций заметно не повышалась после 48 часов.

(Необязательная) совместная трансфекция плазмид с CRISPR и ssODN или плазмид для целенаправленного воздействия для HR • Временные рамки 3-4 дня

15| Линеаризованная плазмида для целенаправленного воздействия. Вектор для целенаправленного воздействия линеаризуют, если это возможно, путем однократного разрезания в рестрикционном сайте в каркасе вектора около одного из гомологичных плеч или на удаленном конце любого из гомологичных плеч.

16| Заявители прогоняли небольшое количество линеаризованной плазмиды наряду с неразрезанной плазмидой в 0,8-1% агарозном геле для проверки успешной линеаризации. Линеаризованная плазмида при разделении должна идти дальше сверхспирализованной плазмиды.

17| Заявители очищали линеаризованную плазмиду с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick.

18| Получение клеток для трансфекции. Заявители культивировали HEK293FT во флаконах Т75 или Т225. Планировали получение достаточного количества клеток перед днем трансфекции. Для Amaxa в формате стрипов с кюветами использовали 2×10⁶ клеток на трансфекцию.

19| Подготовка планшетов для трансфекции. Заявители добавляли 1 мл теплой среды D10 в каждую лунку 12-луночного планшета. Планшеты помещали в инкубатор для сохранения среды теплой.

20| Нуклеофекция. Заявители трансфицировали клетки HEK293FT в соответствии с инструкциями производителя к набору Amaxa SF для трансфекции линий клеток на Nucleofector 4D, адаптированными в стадиях, приведенных ниже.

а. Для совместной трансфекции ssODN и CRISPR предварительно смешать следующие ДНК в пробирках для ПЦР:

Плазмида с pCRISPR (Cas9 + sgRNA)	500 нг
ssODN-матрица (10 мкМ)	1 мкл

Для совместной трансфекции плазмиды для целенаправленного воздействия посредством HDR и CRISPR предварительно смешать следующие ДНК в пробирках для ПЦР:

Плазмида с CRISPR (Cas9 + sgRNA)	500 нг
Линеаризованная плазмида для целенаправленного воздействия	500 нг

Что касается контролей для трансфекции, см. предыдущий раздел. Кроме того, заявители рекомендуют трансфицировать ssODN или плазмиду для целенаправленного воздействия в отдельности в качестве отрицательного контроля.

21| Диссоциация на отдельные клетки. Заявители удаляли среду и однократно осторожно промывали при помощи DPBS, следя за тем, чтобы не сместить клетки. 2 мл TrypLE добавляли во флакон Т75 и инкубировали в течение 5 мин. при 37°C. Для инактивации добавляли 10 мл теплой среды D10 и осторожно взбалтывали в пробирке Falcon на 50 мл. Рекомендуется, чтобы клетки осторожно взбалтывали и диссоциировали на отдельные клетки. Большие скопления будут снижать эффективность трансфекции. Заявители отбирали аликвоту на 10 мкл из суспензии и разбавляли в 90 мкл среды D10 для подсчета. Заявители производили подсчет клеток и рассчитывали количество клеток и объем суспензии, необходимый для трансфекции. Заявители, как правило, трансфицировали 2×10⁵ клеток на процедуру с использованием стрипов Nucleocuvette, и при расчетах рекомендуется учесть на 20% больше клеток, чем требуется, чтобы ввести поправку на потерю объема на последующих стадиях отмеривания Amaxa пипеткой. Необходимый объем переносили в новую пробирку Falcon.

23| Заявители производили осаждение центрифугированием в новой пробирке при 200×g в течение 5 мин.

Заявители готовили раствор для трансфекции путем смешивания раствора SF и добавки S1, как рекомендовано Атаха. Для стрипов с кюветами Amaxa требуется всего 20 мкл раствора SF с добавками на трансфекцию. Аналогично, при расчетах заявители рекомендовали учесть объем на 20% больше, чем требуется.

25| Заявители полностью удаляли среду из осажденных на стадии 23 клеток и осторожно ресуспендировали их в подходящем объеме (20 мкл на 2×10⁵ клеток) раствора SF, дополненного S1. Не оставлять клетки в растворе SF в течение продолжительного периода времени.

26| 20 мкл ресуспендированных клеток добавляли пипеткой в каждую предварительно приготовленную на стадии 20 смесь ДНК. Осторожно перемешивали смесь с помощью пипетки и переносили в камеру для стрипов Nucleocuvette. Повторить для каждой процедуры трансфекции.

Клетки подвергали электропорации с использованием системы Nucleofector 4D, рекомендованной Amaxa, СМ-130.

28| Заявители осторожно и медленно добавляли пипеткой 100 мкл теплой среды D10 в каждую камеру для стрипов Nucleocuvette и переносили весь объем в предварительно подогретый планшет из стадии 19. ВАЖНО. Клетки являются очень хрупкими на этой стадии, и резкий отбор пипеткой может вызвать гибель клеток. Инкубировали в течение 24 часов. В этот момент эффективность трансфекции можно оценить, исходя из доли флуоресцирующих клеток в положительном контроле для трансфекции. Эффективности трансфекции при нуклеофекции, как правило, составляет более 70-80%. Заявители медленно добавляли 1 мл теплой среды D10 в каждую лунку без смещения клеток. Инкубировали клетки в общей сложности в течение 72 часов.

Культивирование и трансфекция эмбриональных стволовых клеток человека (HUES 9) • Временные рамки 3-4 дня

Поддержание линии hESC (HUES9). Заявители традиционным образом поддерживали линию клеток HUES9 в условиях отсутствия фидера со средой mTesR1. Заявители готовили среду mTeSR1 путем добавления 5Х добавки, включенной в базовую среду, и 100 мкг/мл нормоцина. Заявители готовили аликвоту на 10 мкл среды mTeSR1, дополненной, кроме того, 10 мкМ ингибитором Rock. Нанесение покрытия на планшет для культуры тканей. Разбавляли холодный GelTrex в холодной DMEM 1:100 и покрывали всю поверхность планшета на 100 мм для культуры тканей.

Помещали планшет в инкубатор по меньшей мере на 30 мин. при 37°C. Размораживали флакон с клетками при 37°C в пробирке Falcon на 15 мл, добавляли 5 мл среды mTeSR1 и осаждали при 200×g в течение 5 мин. Аспирировали покрытие GelTrex и высевали ~1×10⁶ клеток в 10 мл среды mTeSR1, содержащей ингибитор Rock. Сменяли среду на нормальную среду mTeSR1 через 24 часа после трансфекции и "подпитывали" свежей средой ежедневно. Пассирование клеток. Ежедневно "подпитывали" клетки свежей средой mTeSR1 и пассировали перед достижением 70% конфлюентности. Аспирировали среду mTeSR1 и однократно промывали клетки DPBS. Диссоциировали клетки путем добавления 2 мл Accutase и инкубировали при 37°C в течение 3-5 мин. Добавляли 10 мл среды mTeSR1 к отделившимся клеткам, переносили в пробирку Falcon на 15 мл и осторожно ресуспендировали. Повторно высевали на планшеты с покрытием GelTrex в среду mTeSR1 с 10 мкМ ингибитором Rock. Сменяли среду на нормальную среду mTeSR1 через 24 часа после посева.

Трансфекция. Заявители рекомендовали культивирование клеток по меньшей мере в течение 1 недели после размораживания перед трансфекцией с использованием набора Amaxa Р3 для трансфекции первичных клеток на 4-D Nucleofector (Lonza). "Подпитывали" клетки, находящиеся в log-фазе роста, свежей средой за 2 часа до трансфекции. Диссоциировали на отдельные клетки или небольшие кластеры не более чем из 10 клеток при помощи Accutase и осторожного ресуспендирования. Подсчитывали количество клеток, необходимое для нуклеофекции, и осаждали центрифугированием при 200×g в течение 5 мин. Удаляли среду полностью и ресуспендировали в рекомендованном объеме дополненного S1 раствора Р3 для нуклеофекции. Осторожно высевали подвергнутые электропорации клетки в планшеты с покрытием в присутствии 1X ингибитора Rock.

Проверяли успешность трансфекции и "подпитывали" ежедневно стандартной средой mTeSR1, начиная с момента через 24 часа после нуклеофекции. Как правило, заявители наблюдали эффективность трансфекции более 70% при использовании нуклеофекции Amaxa. Сбор ДНК. Через 48-72 часа после трансфекции диссоциировали клетки с использованием Accutase, который инактивировали путем добавления 5-кратного объема mTeSR1. Осаждали клетки центрифугированием при 200×g в течение 5 мин. Осажденные клетки можно подвергнуть непосредственной обработке для экстракции ДНК раствором QuickExtract. Рекомендуется не подвергать клетки механической диссоциации без Accutase. Рекомендуется не осаждать клетки центрифугированием без инактивации Accutase или со скоростью, превышающей рекомендованную; такие действия могут вызвать лизис клеток.

Выделение клональных линий клеток при помощи FACS. Временные рамки • практическое выполнение 2-3 часа; размножение 2-3 недели

Выделение клонов можно осуществлять через 24 часа после трансфекции с помощью FACS или с помощью серийного разведения.

54| Приготовление буфера для FACS. Клетки, для которых не требуется сортировка с использованием флуоресцирующих красителей, можно сортировать в стандартной среде D10, дополненной 1X пенициллином/стрептомицином. Если также требуется сортировка с использованием флуоресцирующих красителей, тогда не содержащую фенола DMEM или DPBS использовали вместо нормальной DMEM. Добавить 1X пенициллина/стрептомицина и фильтровать через фильтр Steriflip на 0,22 мкм.

55| Подготовка 96-луночных планшетов. Заявители добавляли 100 мкл среды D10, дополненной 1X пенициллином/стрептомицином, на лунку и получали такое количество планшетов, которое необходимо для требуемого числа клонов.

56| Получение клеток для FACS. Заявители диссоциировали клетки путем полной аспирации среды и добавления 100 мкл TrypLE на лунку в 24-луночном планшете. Инкубировали в течение 5 мин. и добавляли 400 мкл теплой среды D10.

57| Ресуспендированные клетки переносили в пробирку Falcon на 15 мл и осторожно взбалтывали 20 раз. Рекомендована проверка под микроскопом для того, чтобы удостовериться в диссоциации на отдельные клетки.

58| Осаждали клетки центрифугированием при 200×g в течение 5 минут.

59| Заявители аспирировали среду и ресуспендировали клетки в 200 мкл среды для FACS.

60| Клетки фильтровали через сетчатый фильтр на 35 мкм в пробирки с метками для FACS. Заявители рекомендовали использовать пробирки BD Falcon 12×75 мм с сетчатым фильтром для клеток в крышке. Помещали клетки на лед до сортировки.

611 Заявители сортировали отдельные клетки в 96-луночные планшеты, подготовленные на стадии 55. Заявители рекомендовали, чтобы в одну отдельную предусмотренную лунку в каждом планшете отсортировывали 100 клеток в качестве положительного контроля.

ПРИМЕЧАНИЕ. Остальные клетки можно хранить и использовать для генотипирования на популяционном уровне для измерения общей эффективности модификации.

62| Заявители возвращали клетки в инкубатор и обеспечивали возможность их размножения в течение 2-3 недель. 100 мкл теплой среды D10 добавляли через 5 дней после сортировки. При необходимости заменяли 100 мкл среды каждые 3-5 дней.

63| Колонии подвергали осмотру в отношении "клонального" внешнего вида через 1 неделю после сортировки: округлые колонии, расходящиеся от центральной точки. Помечали лунки, которые были пустыми или могли быть засеяны с образованием двух колоний или нескольких колоний.

64| Когда клетки достигали конфлюентности более 60%, заявители готовили набор планшетов для реплик для пассирования. 100 мкл среды D10 добавляли в каждую лунку в планшетах для реплик. Заявители непосредственно диссоциировали клетки путем интенсивного втягивания в пипетку и выталкивания клеток из пипетки 20 раз. 20% ресуспендированного объема высевали в подготовленные планшеты для реплик для сохранения клональных линий. После этого заменяли среду каждые 2-3 дня и пассировали, соответственно.

65| Остальные 80% клеток использовали для выделения ДНК и генотипирования.

Необязательно: выделение клональных клеточных линий путем разведения. Временные рамки • практическое выполнение 2-3 часа; размножение 2-3 недели

66| Заявители диссоциировали клетки из 24-луночных планшетов, как описано выше. Удостоверялись в диссоциации до отдельных клеток. Сетчатый фильтр для клеток можно использовать для предотвращения образования скоплений клеток.

67| Количество клеток подсчитывали для каждой процедуры. Для каждой процедуры производили серийное разведение в среде D10 до конечной концентрации 0,5 клеток на 100 мкл. Для каждого 96-луночного планшета заявители рекомендовали разведение до конечного количества 60 клеток в 12 мл D10. Для надлежащего клонального разведения рекомендуется точный подсчет клеток. Клетки можно повторно подсчитать на промежуточной стадии последовательного разведения для гарантии точности.

68| Многоканальную пипетку использовали для внесения пипеткой 100 мкл разбавленных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.

ПРИМЕЧАНИЕ. Остальные клетки можно хранить и использовать для генотипирования на популяционном уровне для измерения общей эффективности модификации.

69| Заявители подвергали осмотру колонии в отношении "клонального" внешнего вида через ~1 неделю после посева: округлые колонии, расходящиеся от центральной точки. Помечали лунки, которые могли быть засеяны с образованием двух колоний или нескольких колоний.

70| Заявители возвращали клетки в инкубатор и обеспечивали возможность их размножения в течение 2-3 недель. При необходимости "подпитывали" клетки, как подробно описано в предыдущем разделе.

Анализ с помощью SURVEYOR в отношении эффективности расщепления с помощью CRISPR. Временные рамки • 5-6 часов

Перед анализом эффективности расщепления на трансфицированных клетках заявители рекомендовали провести тестирование каждого нового праймера для анализа с помощью SURVEYOR на образцах отрицательного контроля (нетрансфицированных) посредством стадии расщепления нуклеазой SURVEYOR с использованием протокола, описанного ниже. Изредка даже присутствующие в виде одной полосы чистые продукты ПЦР для анализа с помощью SURVEYOR могут давать полосы в результате неспецифического расщепления нуклеазой SURVEYOR и потенциально создавать помехи для точного анализа вставок/делеций.

71| Сбор клеток для получения ДНК. Диссоциировали клетки и осаждали центрифугированием при 200×g в течение 5 мин. ПРИМЕЧАНИЕ. Планшет для реплик на данной стадии необходим для сохранения трансфицированных линий клеток.

72| Полностью аспирировали надосадочную жидкость.

73| Заявители использовали раствор для экстракции ДНК QuickExtract согласно инструкциям производителя. Заявители, как правило, использовали 50 мкл раствора для каждой лунки в 24-луночном планшете и 10 мкл для 96-луночного планшета.

74| Заявители нормализовали экстрагированную ДНК до конечной концентрации 100-200 нг/мкл при помощи ddH₂O. Точка паузы: экстрагированную ДНК можно хранить при -20°C в течение нескольких месяцев.

75| Схема ПЦР для анализа с помощью SURVEYOR. Мастер-микс из следующих компонентов с использованием праймеров для SURVEYOR, обеспеченный с использованием разработанного заявителями онлайн-инструмента/инструмента на основе компьютерного алгоритма.

76| Заявители добавляли 100-200 нг нормализованной геномной ДНК-матрицы из стадии 74 для каждой реакции.

77| ПЦР-реакцию проводили с использованием следующих условий для циклов при не более 30 циклах амплификации:

78| Заявители прогоняли 2-5 мкл продукта ПЦР в 1% геле для проверки на наличие продукта в виде одной полосы. Хотя данные условия ПЦР были разработаны для работы с большинством пар праймеров для SURVEYOR, для некоторых праймеров может требоваться дополнительная оптимизация путем корректировки концентрации матрицы, концентрации MgCl₂ и/или температуры отжига.

79| Заявители очищали продукты ПЦР-реакций с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick и нормализовали элюентом до 20 нг/мкл. Точка паузы: очищенный продукт ПЦР можно хранить при -20°C.

80| Образование гетеродуплекса ДНК. Реакционную смесь для отжига готовили следующим образом:

ПЦР-буфер с Taq, 10Х	2 мкл
Нормализованная ДНК (20 нг/мкл)	18 мкл
Общий объем	20 мкл

81| Проводили отжиг в реакционной смеси с использованием следующих условий:

82| Расщепление нуклеазой S SURVEYOR. Заявители готовили мастер-микс и добавляли следующие компоненты на льду к отожженным гетеродуплексам из стадии 81 до общего конечного объема 25 мкл.

83| Хорошо перемешивали вихревой мешалкой и осаждали центрифугированием. Инкубировали реакционную смесь при 42°C в течение 1 часа.

84| Необязательно: можно добавить 2 мкл стоп-раствора из набора SURVEYOR. Точка паузы. Расщепленный продукт можно хранить при -20°C для последующего анализа.

85| Визуальная оценка продуктов реакции при анализе SURVEYOR. Продукты расщепления нуклеазой SURVEYOR можно визуально оценивать в 2% агарозном геле. Для лучшей разрешающей способности продукты можно прогнать в градиенте полиакриламидного геля с ТВЕ 4-20%. Заявители загружали 10 мкл продукта с рекомендованным загрузочным буфером и прогоняли в геле согласно инструкциям производителя. Как правило, заявители проводили прогон до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не мигрировал в нижнюю часть геля. В тот же гель включали маркер молекулярного веса ДНК и отрицательные контроли.

86| Заявители окрашивали гель 1X красителем SYBR золотым, разбавленным в ТВЕ. Гель осторожно покачивали в течение 15 мин.

87| Заявители визуализировали гель с использованием системы для количественной визуализации без чрезмерного экспонирования полос. Отрицательные контроли должны иметь только одну полосу, соответствующую размеру продукта ПЦР, но изредка могут характеризоваться полосами неспецифического расщепления продуктов других размеров. Они не будут препятствовать анализу, если они отличаются по размеру от полос целевого расщепления. Сумма размеров полос целевого расщепления, обеспеченная с помощью разработанного заявителями онлайн-инструмента/инструмента на основе компьютерного алгоритма, должна быть равна размеру продукта ПЦР.

88| Оценка интенсивности расщепления. Заявители количественно определяли суммарную интенсивность каждой полосы с использованием ImageJ или другого программного обеспечения для количественного анализа геля.

89| Для каждой дорожки заявители рассчитывали долю расщепленного продукта ПЦР (ƒ_cut) с использованием следующей формулы: ƒ_cut=(b+с)/(а+b+с), где а представляет собой суммарную интенсивность для нерасщепленного продукта ПЦР, a b и с представляют собой значения суммарной интенсивности для каждого продукта расщепления. 90| Эффективность расщепления можно оценить с использованием следующей формулы, основанной на биномиальном распределении вероятности образования дуплексов:

91|

Секвенирование по Сэнгеру для оценки эффективности расщепления с помощью CRISPR. Временные рамки • 3 дня

Начальные стадии идентичны стадиям 71-79 в анализе с помощью SURVEYOR.

Примечание: праймеры для SURVEYOR можно использовать для секвенирования по Сэнгеру, если подходящие сайты рестрикции прикреплены к прямому и обратному праймерам. Для клонирования в рекомендованный каркас pUC19 можно использовать EcoRI для прямого праймера и HindIII для обратного праймера.

92| Расщепление ампликона. Приготовить реакционную смесь для расщепления следующим образом

93| Расщепление каркаса pUC19. Приготовить реакционную смесь для расщепления следующим образом:

94| Заявители очищали продукты реакций расщепления с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick. Точка паузы: очищенный продукт ПЦР можно хранить при -20°C.

95| Заявители лигировали расщепленный каркас pUC19 и ампликоны для секвенирования по Сэнгеру в соотношении вектор: вставка, составляющем 1:3, следующим образом.

96| Трансформация. Заявители трансформировали плазмиды, обработанные PlasmidSafe, в компетентный штамм Е. coli согласно протоколу, поставляемому с клетками. Заявители рекомендовали Stbl3 для быстрой трансформации. Вкратце, 5 мкл продукта из стадии 95 добавляли в 20 мкл охлажденных на льду химически компетентных клеток Stbl3, инкубировали на льду в течение 10 мин., подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 30 с, немедленно возвращали на лед на 2 мин., добавляли 100 мкл среды SOC и высевали на чашку со средой LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Их инкубировали в течение ночи при 37°C.

97| День 2. Заявители подвергали планшеты осмотру в отношении роста колоний. Как правило, колонии на планшетах с отрицательным контролем (лигирование только pUC19, расщепленного EcoRI-HindIII, без вставки ампликона для секвенирования по Сэнгеру) отсутствуют, и колонии на чашках для клонирования с рUС19-ампликоном для секвенирования по Сэнгеру присутствуют в количестве от нескольких десятков до нескольких сотен.

98| День 3. Заявители выделяли плазмидную ДНК из суточных культур с использованием набора QIAprep Spin Miniprep согласно инструкциям производителя.

99| Секвенирование по Сэнгеру. Заявители подтверждали последовательность в каждой колонии путем секвенирования от каркаса pUC19 с использованием прямого праймера для pUC19. Заявители рассматривали результаты секвенирования в сравнении с ожидаемой последовательностью геномной ДНК для проверки присутствия индуцированных Cas9 мутаций в результате NHEJ. % эффективности редактирования = (число модифицированных клонов) / (общее число клонов). Важно отобрать приемлемое число клонов (>24) для получения правильных значений эффективности модификации.

Генотипирование в отношении микроделеций. Временные рамки • практическое выполнение 2-3 дня; размножение 2-3 недели

100| Клетки трансфицировали, как описано выше, парой sgRNA, осуществляющих нацеливание на участок, подлежащий делеции.

101| Через 24 часа после трансфекции клональные линии выделяли с помощью FACS или серийного разведения, как описано выше.

102| Клетки размножали в течение 2-3 недель.

103| Заявители собирали ДНК из клональных линий, как описано выше, с использованием 10 мкл раствора QuickExtract и нормализовали геномную ДНК с помощью ddH₂O до конечной концентрации 50-100 нг/мкл.

104| ПЦР-амплификация модифицированного участка. Реакционную смесь для ПЦР готовили следующим образом.

Примечание: если размер делеции составлял более 1 т.п.о., готовили параллельный набор реакционных смесей для ПЦР с внутренним прямым и внутренним обратным праймерами для скрининга в отношении присутствия аллеля wt.

105| Для скрининга в отношении инверсий реакционную смесь для ПЦР готовили следующим образом:

Примечание: праймеры расположены парами как внешний прямой + внутренний прямой или внешний обратный + внутренний обратный.

106| Заявители добавляли 100-200 нг нормализованной геномной ДНК-матрицы из стадии 103 для каждой реакции.

107| ПЦР-реакцию проводили с использованием следующих условий для циклов.

108| Заявители прогоняли 2-5 мкл продукта ПЦР в 1-2% геле для проверки на наличие продукта. Хотя эти условия ПЦР были разработаны для работы с большинством праймеров, для некоторых праймеров может требоваться дополнительная оптимизация путем корректировки концентрации матрицы, концентрации MgCl₂ и/или температуры гибридизации.

Генотипирование в отношении целенаправленных модификаций посредством HDR. Временные рамки • 2-3 дня, практическое выполнение 2-3 часа

109| Заявители собирали ДНК, как описано выше, с использованием раствора QuickExtract и нормализовали геномную ДНК при помощи ТЕ до конечной концентрации 100-200 нг/мкл.

110| ПЦР-амплификация модифицированного участка. Реакционную смесь для ПЦР готовили следующим образом.

111| Заявители добавляли 100-200 нг геномной ДНК-матрицы из стадии 109 для каждой реакции и выполняли следующую программу.

112| Заявители прогоняли 5 мкл продукта ПЦР в 0,8-1% геле для проверки на наличие продукта в виде одной полосы. Может требоваться дополнительная оптимизация праймеров путем коррекции концентрации матрицы, концентрации MgCl₂ и/или температуры гибридизации.

113| Заявители очищали продукты ПЦР-реакций с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick.

114| В примере с HDR сайт рестрикции для HindIII вводили в ген ЕМХ1. Это выявляют с помощью рестрикционного расщепления ПЦР-ампликона.

i. ДНК расщепляли в течение 10 мин. при 37°C.

ii. Заявители прогоняли 10 мкл расщепленного продукта с загрузочным красителем в градиенте полиакриламидного геля с ТВЕ 4-20% до тех пор, пока полоса ксилолцианола не мигрировала в нижнюю часть геля.

iii. Заявители окрашивали гель 1X красителем SYBR золотым при покачивании в течение 15 мин.

iv. Продукты расщепления визуализировали и количественно определяли, как описано выше в разделе, посвященном анализу с помощью SURVEYOR. Эффективность HDR оценивали с помощью формулы: (b+с)/(а+b+с), где а представляет собой суммарную интенсивность для нерасщепленного продукта ПЦР с HDR, a b и с представляют собой суммарные интенсивности для разрезанных HindIII фрагментов.

115| В альтернативном случае очищенные ПЦР-ампликоны из стадии 113 можно клонировать и генотипировать с использованием секвенирования по Сэнгеру или NGS.

Глубокое секвенирование и анализ нецелевой активности • Временные рамки 1-2 дня

С помощью онлайн-инструмента конструирования для нацеливания CRISPR получали кандидатные нецелевые сайты генома для каждого идентифицированного целевого сайта. Анализ нецелевой активности в этих сайтах можно осуществлять путем анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR, секвенирования по Сэнгеру или глубокого секвенирования нового поколения. С учетом вероятности низких или невыявляемых степеней модификации во многих из этих сайтов заявители рекомендуют глубокое секвенирование с использованием платформы Illumina MiSeq для высокой чувствительности и точности. Протоколы будут изменяться в зависимости от платформы для секвенирования; в данном документе заявители кратко описывают способ ПЦР с перекрывающимися праймерами для прикрепления адаптеров секвенирования.

116| Конструирование праймеров для глубокого секвенирования. Праймеры для секвенирования нового поколения (NGS) конструировали для более коротких ампликонов, как правило, имеющих размер в диапазоне 100-200 п.о. Праймеры можно сконструировать вручную с использованием Primer-Blast от NCBI или создать с помощью онлайн-инструментов конструирования для нацеливания CRISPR (веб-сайт genome-engineering, org/tools).

117| Отбирали геномную ДНК из подвергшихся целенаправленному воздействию Cas9 клеток. Нормализовали полученную с помощью QuickExtract геномную ДНК до 100-200 нг/мкл при помощи ddH2O.

118| ПЦР для получения исходной библиотеки. С использованием праймеров для NGS из стадии 116 проводили ПЦР для получения исходной библиотеки.

119| Добавляли 100-200 нг нормализованной геномной ДНК-матрицы для каждой реакции.

120| ПЦР-реакцию проводили с использованием следующих условий для циклов при не более 20 циклах амплификации:

121| Прогоняли 2-5 мкл продукта ПЦР в 1% геле для проверки на наличие продукта в виде одной полосы. Как и со всеми ПЦР геномной ДНК, может потребоваться дополнительная оптимизация праймеров для NGS путем коррекции концентрации матрицы, концентрации MgCl₂ и/или температуры гибридизации.

122| Очищали продукты ПЦР-реакций с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick и нормализовали элюентом до 20 нг/мкл. Точка паузы: очищенный продукт ПЦР можно хранить при -20°C.

123| Набор для приготовления образцов ДНК Nextera XT. Следуя протоколу производителя, создавали библиотеки, готовые для секвенирования в MiSeq, с уникальными штрих-кодами для каждого образца.

124] Анализ данных секвенирования. Анализ нецелевой активности можно проводить с помощью программ выравнивания ридов, таких как ClustalW, Geneious, или простых скриптов для анализа последовательностей.

Временные рамки

Стадии 1-2. Создание и синтез олигонуклеотидов sgRNA и ssODN: 1-5 дней, изменяются в зависимости от поставщика.

Стадии 3-5. Конструирование плазмиды с CRISPR или кассеты экспрессии для ПЦР: от 2 часов до 3 дней.

Стадии 6-53. Трансфекция в линии клеток: 3 дня (время практического выполнения 1 час).

Стадии 54-70. Необязательное получение клональных линий: 1-3 недели, изменяются в зависимости от типа клеток.

Стадии 71-91. Функциональная валидация NHEJ с помощью SURVEYOR: 5-6 часов.

Стадии 92-124. Генотипирование посредством секвенирования по Сэнгеру или глубокого секвенирования нового поколения: 2-3 дня (время практического выполнения 3-4 часа).

Проблемные ситуации, касающиеся приведенных в данном документе примеров

Обсуждение

Можно легко мультиплексировать CRISPR-Cas, чтобы облегчить одновременную модификацию нескольких генов и опосредовать хромосомные микроделеции с высокими значениями эффективности. Заявители использовали две sgRNA для демонстрации одновременного целенаправленного воздействия на локусы GRIN2B и DYRK1A человека с эффективностью до 68% в клетках HEK293FT. Подобным образом, пару sgRNA можно использовать для опосредования микроделеции, таких как вырезание экзона, которые можно генотипировать с помощью ПЦР на клональном уровне. Стоит учесть, что точное расположение мест соединений экзонов может изменяться. Заявители также продемонстрировали применение ssODN и вектора для целенаправленного воздействия для опосредования HDR как с использованием Cas9 дикого типа, так и мутантной никазы Cas9 в клетках HEK 293FT и HUES9 (фигура 30). Стоит учесть, что заявители не смогли выявить HDR в клетках HUES9 с использованием никазы Cas9, что могло быть обусловлено низкой эффективностью или возможным различием в активности репарации в клетках HUES9. Хотя эти значения являются типичными, существует некоторая изменчивость в эффективности расщепления для данной sgRNA, и в редких случаях определенные sgRNA могут не работать по неизвестным, пока что, причинам. Заявители рекомендуют сконструировать две sgRNA для каждого локуса и тестировать их эффективность у намеченного типа клеток.

Пример 31. NLS

Модулятор транскрипции на основе Cas9. Заявители поставили задачу превратить систему CRISPR Cas9/gRNA в универсальную ДНК-связывающую систему, при помощи которой могут выполняться функции помимо расщепления ДНК. Например, путем слияния функционального(функциональных) домена(доменов) в каталитически неактивном Cas9 заявители придали ему новые функции, такие как активация/репрессия транскрипции, метилирование/деметилирование или модификации хроматина. Для достижения этой цели заявители получили каталитически неактивный мутант Cas9 путем замены двух остатков, необходимых для нуклеазной активности, D10 и Н840, на аланин. Посредством мутации по этим двум остаткам нуклеазная активность Cas9 устраняется при сохранении способности связываться с целевой ДНК. Функциональные домены, на которых заявители решили сфокусироваться для тестирования своей гипотезы, представляли собой активатор транскрипции VP64 и репрессоры транскрипции SID и KRAB.

Ядерная локализация Cas9. Заявители выдвинули гипотезу, что наиболее эффективный модулятор транскрипции на основе Cas9 обязательно должен быть локализован строго в ядре, где он будет оказывать наибольшее влияние на транскрипцию. Более того, любой остаточный Cas9 в цитоплазме может оказывать нежелательные воздействия. Заявители определили, что Cas9 дикого типа не локализуется в ядре без включения нескольких сигналов ядерной локализации (NLS) (хотя система CRISPR может не иметь один или несколько NLS, но преимущественно имеет по меньшей мере один или несколько NLS). Поскольку требовалось несколько последовательностей NLS, пришли к выводу о том, что сложно направить Cas9 в ядро, и любой дополнительный домен, который слит с Cas9, может, нарушать ядерную локализацию. Таким образом, заявители создали четыре слитые конструкции Cas9-VP64-GFP с различными последовательностями NLS (pXRP02- PLenti2-EF1a-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP, pXRP04-pLenti2-EF1a-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-2A-EGFP-NLS, pXRP06- pLenti2-EF1a-NLS-EGFP-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS, pXRP08- pLenti2-EF1a-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(10A,840A)-NLS-VP64-EGFP-NLS). Эти конструкции клонировали в каркас на основе лентивируса с контролем экспрессии промотором EF1a человека. Элемент WPRE также добавляли для более устойчивой экспрессии белка. Каждую конструкцию трансфицировали в клетки HEK 293FT с использованием Lipofectamine 2000 и визуализировали через 24 часа после трансфекции. Наилучшую ядерную локализацию получали, когда белки слияния имели последовательности NLS как на N-, так и С-конце белка слияния. Наиболее выраженная наблюдаемая ядерная локализация наблюдалась у конструкции с четырьмя NLS-элементами.

Для более четкого понимания влияния NLS-элементов на Cas9 заявители создали 16 белков слияния Cas9-GFP путем добавления одной и той же последовательности NLS альфа-импортина либо на N-, либо С-конец в виде тандемных повторов в количестве от нуля до трех. Каждую конструкцию трансфицировали в клетки НЕК 293FT с использованием Lipofectamine 2000 и визуализировали через 24 часа после трансфекции. Примечательно, что количество NLS-элементов не коррелирует прямо со степенью ядерной локализации. Добавление NLS на С-конце оказывало большее влияние на ядерную локализацию, чем добавление на N-конце.

Активатор транскрипции на основе Cas9 Заявители проводили функциональное тестирование белка Cas9-VP64 путем целенаправленного воздействия на локус Sox2 и количественного определения активации транскрипции с помощью RT-qPCR. Восемь целевых сайтов ДНК выбирали для охвата промотора Sox2. Каждую конструкцию трансфицировали в клетки НЕК 293FT с использованием Lipofectamine 2000, и через 72 часа после трансфекции общую РНК экстрагировали из клеток. 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК (qScript Supermix) в 40 мкл реакционной смеси. 2 мкл продукта реакции добавляли в отдельные 20 мкл реакционной смеси для qPCR в анализе TaqMan. Каждый эксперимент осуществляли в трех повторностях из биологических и технических соображений. Ни контрольная RT, ни контрольная матрица не демонстрировали амплификацию. Конструкции, которые не демонстрировали строгую ядерную локализацию, pXRP02 и pXRP04, не приводили к активации. Для конструкции, которая не демонстрировала строгую ядерную локализацию, pXRP08, наблюдали умеренную активацию. Статистически значимую активацию наблюдали в случае направляющих РНК для Sox2.4 и Sox2.5.

Пример 32. Данные, полученные на мышах in vivo

Материалы и реагенты

Слитая полимераза Herculase II (Agilent Technologies, кат. №600679)

10x NEBuffer 4 (NEB, кат. №B7004S)

HF BsaI (NEB, кат. №R3535S)

ДНК-лигаза T7 (Enzymatics, кат. №L602L)

Буфер для FastDigest, 10Х (ThermoScientific, кат. №B64)

NotI FastDigest (ThermoScientific, кат. №FD0594)

Щелочная фосфатаза FastAP (ThermoScientific, кат. №EF0651)

Lipofectamine2000 (Life Technologies, кат. №11668-019)

Трипсин (Life Technologies, кат. №15400054)

Пинцет №4 (Sigma, кат. №Z168777-1EA)

Пинцет №5 (Sigma, кат. №F6521-1EA)

10х сбалансированный солевой раствор Хэнкса (Sigma, кат. №H4641-500ML)

Раствор пенициллина/стрептомицина (Life Technologies, кат. №Р4333)

Neurobasal (Life Technologies, кат. №21103049)

Добавка В27 (Life Technologies, кат. №17504044)

L-глутамин (Life Technologies, кат. №25030081)

Глутамат (Sigma, кат. №RES5063G-A7)

β-меркаптоэтанол (Sigma, кат. №M6250-100ML)

Антитело кролика к НА (Cell Signaling, кат. №3724S)

Набор для визуализации клеток LIVE/DEAD® (Life Technologies, кат. №R37601)

Шприц 30 калибра World Precision Instrument (World Precision Instruments, кат. №NANOFIL)

Стереотаксический аппарат (Kopf Instruments)

UltraMicroPump3 (World Precision Instruments, кат. №UMP3-4

Сахароза (Sigma, кат. №S7903)

Хлорид кальция (Sigma, кат. №C1016)

Ацетат магния (Sigma, кат. №М0631)

Tris-HCl (Sigma, кат. №Т5941)

EDTA (Sigma, кат. №E6758)

NP-40 (Sigma, кат. №NP40)

Фенилметансульфонилфторид (Sigma, кат. №78830)

Хлорид магния (Sigma, кат. №М8266)

Хлорид калия (Sigma, кат №Р9333)

β-глицерофосфат (Sigma, кат. №G9422)

Глицерин (Sigma, кат. №G9012)

Рубиновый краситель Vybrant® DyeCycle™ (Life Technologies, кат. №S4942)

Клеточный сортер с активацией флуоресценции FACSAria (Koch Institute of MIT, Кембридж, США)

Набор DNAeasy для выделения ДНК из крови и тканей (Qiagen, кат. №69504)

Процедура

Конструирование мультиплексов gRNA для применения in vivo в головном мозге

Заявители сконструировали и подвергали ПЦР-амплификации одиночные gRNA, нацеленные на представителей семейств ТЕТ и DNMT мыши (как описано в данном документе). Эффективность нацеливания оценивали на линии клеток N2a (фигура 33). Для получения одновременной модификации нескольких генов in vivo эффективные gRNA мультиплексировали в упаковочном векторе на основе AAV (фигура 34). Для облегчения дальнейшего анализа эффективности системы заявители добавляли к системе кассету экспрессии, состоящую из белка слияния из доменов GFP-KASH под контролем промотора гена синапсина I человека (фигура 34). Данная модификация обеспечивала возможность дополнительного анализа эффективности системы в популяции нейронов (более подробная процедура описана в разделе Сортировка ядер и результаты in vivo).

Все 4 части системы подвергали ПЦР-амплификации, применяя слитую полимеразу Herculase II с использованием следующих праймеров:

1-й прямой праймер для U6:

1-й обратный праймер для gRNA:

2-й прямой праймер для U6:

2-й обратный праймер для gRNA:

3-й прямой праймер для U6:

3-й обратный праймер для gRNA:

Прямой праймер для hSyn_GFP-kash:

Обратный праймер для hSyn_GFP-kash:

представляет собой последовательность, обратно-комплементарную целевой геномной последовательности)

Заявители использовали стратегию Golden Gate для сборки всех частей (молекулярное соотношение 1:1) системы в одностадийной реакции:

1-я U6_gRNA	18нг
2-я U6_gRNA	18 нг
3-я U6_gRNA	18 нг
Syn_GFP-kash	100 нг
10x NEBuffer 4	1,0 мкл
10x BSA	1,0 мкл
АТФ, 10мМ	1,0 мкл
HF BsaI	0,75 мкл
Лигаза Т7	0,25 мкл
ddH2O	10 мкл

Продукт реакции Golden Gate подвергали ПЦР-амплификации с использованием слитой полимеразы Herculase II и следующих праймеров:

Прямой

Обратный

)

Продукт ПЦР клонировали в каркас на основе AAV между последовательностями ITR с использованием сайтов рестрикции для NotI.

Расщепление продукта ПЦР

Буфер для FastDigest, 10Х	3 мкл
NotI FastDigest	1 мкл
ДНК	1 мкг
ddH 2 O	до 30 мкл

Расщепление каркаса на основе AAV

Буфер для FastDigest, 10Х	3 мкл
Noti FastDigest	1 мкл
Щелочная фосфатаза FastAP	1 мкл
Каркас на основе AAV	1 мкг
ddH 2 O	до 30 мкл

Через 20 мин. инкубирования при 37°C образцы очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick. Стандартизированные образцы лигировали при соотношении вектор : вставка 1:3 следующим образом:

Расщепленный pUC19

50 нг

Расщепленная вставка молярное соотношение вектор : вставка 1:3

Лигаза Т7	1 мкл
2Х буфер для быстрого лигирования	5 мкл
ddH 2 O	до 10 мкл

После трансформации бактерий продуктом реакции лигирования заявители подтверждали полученные клоны путем секвенирования по Сэнгеру.

Положительные клоны ДНК тестировали на клетках N2a после совместной трансфекции с конструкцией Cas9 (фигуры 35 и 36).

Создание новых конструкций Cas9 для доставки с помощью AAV

Система доставки на основе AAV, несмотря на ее характерные особенности, имеет ограничение по упаковке: для успешной доставки кассеты экспрессии in vivo она должна иметь размер меньше чем 4,7 т.п.о. Для уменьшения размера кассеты экспрессии SpCas9 и облегчения доставки заявители тестировали несколько изменений: разные промоторы, более короткий сигнал поли(А) и, наконец, меньший вариант Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9) (фигуры 37 и 38). Все тестируемые промоторы ранее тестировались и, как описано в публикациях, являлись активными в нейронах, в том числе Mecp2 мыши (Gray et al., 2011), Map1b крысы и усеченный Map1b крысы (Liu and Fischer, 1996). Ранее было показано, что альтернативная синтетическая последовательность поли(А) также является функциональной (Levitt et al., 1989; Gray et al., 2011). Все клонированные конструкции экспрессировались в клетках N2a после трансфекции с использованием Lipofectamine 2000, и их тестировали при помощи способа вестерн-блоттинга (фигура 39).

Тестирование мультиплексной системы на основе AAV в первичных нейронах

Для подтверждения функциональности разработанной системы в нейронах заявители использовали культуры первичных нейронов in vitro. Нейроны коры головного мозга мыши получали согласно протоколу, опубликованному ранее Banker и Goslin (Banker and Goslin, 1988).

Нервные клетки получали из эмбрионов на 16 день беременности. Эмбрионы извлекали из подвергнутых эвтаназии беременных самок и декапитировали, и головы помещали в охлажденный на льду HBSS. Головной мозг затем извлекали из черепов пинцетом (№4 и №5) и переносили в другую порцию охлажденного на льду HBSS. Дальнейшие стадии осуществляли при помощи стереоскопического микроскопа в чашке Петри, наполненной охлажденным на льду HBSS, и пинцета №5. Полушария отделяли друг от друга и ствола головного мозга и очищали от оболочек головного мозга. Гиппокампы затем очень осторожно вырезали и помещали в коническую пробирку на 15 мл, заполненную охлажденным на льду HBSS. Кору, которая оставалась после вырезания гиппокампа, можно использовать для дальнейшего выделения клеток с помощью аналогичного протокола после удаления остатков ствола мозга и обонятельных луковиц. Выделенные гиппокампы промывали три раза 10 мл охлажденного на льду HBSS и диссоциировали путем 15-минутного инкубирования с трипсином в HBSS (4 мл HBSS с добавлением 10 мкл 2,5% трипсина на гиппокамп) при 37°C. После трипсинизации, чтобы удалить любые следы трипсина, гиппокампы очень осторожно промывали три раза HBSS, предварительно подогретым до 37°C, и диссоциировали в теплом HBSS. Заявители обычно диссоциировали клетки, полученные от 10-12 эмбрионов, в 1 мл HBSS с использованием наконечников для пипеток на 1 мл и разбавляли диссоциированные клетки до 4 мл. Клетки высевали с плотностью 250 клеток/мм² и культивировали при 37°C и 5% CO₂ в течение периода до 3 недель.

HBSS

435 мл Н₂O

50 мл 10х сбалансированного солевого раствора Хэнкса

16,5 мл 0,3 М HEPES, рН 7,3

5 мл раствора пенициллина-стрептомицина

Фильтровать (0,2 мкм) и хранить при 4°C.

Среда для посева нейронов (100 мл)

97 мл Neurobasal

2 мл добавки В27

1 мл раствора пенициллина-стрептомицина

250 мкл глутамина

125 мкл глутамата

Нейроны трансдуцировали концентрированным вирусом AAV1/2 или вирусом AAV1 из профильтрованной среды клеток HEK293FT в период между 4-7 днями в культуре и выдерживали в течение по меньшей мере одной недели в культуре после трансдукции для обеспечения возможности экспрессии доставленных генов.

Управляемая AAV экспрессия системы

Заявители подтверждали экспрессию SpCas9 и SaCas9 в культурах нейронов после доставки с помощью AAV с использованием способа вестерн-блот-анализа (фигура 42). Через одну неделю после трансдукции нейроны собирали в загрузочный буфер NuPage SDS с β-меркаптоэтанолом для денатурации белков при 95°C в течение 5 минут. Образцы разделяли в геле для SDS-PAGE и переносили на мембрану из PVDF для выявления белков с помощью WB. Белки Cas9 выявляли с использованием антитела к НА.

Экспрессию Syn-GFP-Kash из мультиплексной gRNA в AAV подтверждали с использованием флуоресцентной микроскопии (фигура 50).

Токсичность

Для оценки токсичности AAV с системой CRISPR заявители тестировали общие морфологические характеристики нейронов спустя неделю после трансдукции вируса (фигура 45). Кроме того, заявители тестировали потенциальную токсичность сконструированной системы с использованием набора для визуализации клеток LIVE/DEAD®, который позволяет различать живые и мертвые клетки в культуре. Это основано на наличии внутриклеточной эстеразной активности (которая определяется по ферментативному превращению нефлуоресцентного кальцеина AM в интенсивно-зеленый флуоресцирующий кальцеин). С другой стороны, красный не проникающий в клетки компонент набора проникает только в клетки с поврежденными мембранами и связывается с ДНК, вызывая флуоресценцию у мертвых клеток. Оба флуорофора можно легко визуализировать в живых клетках с использованием флуоресцентной микроскопии. Управляемая AAV экспрессия белков Cas9 и мультиплексных конструкций gRNA в первичных нейронах коры головного мозга хорошо переносилась и не была токсичной (фигуры 43 и 44), что указывает на то, что сконструированная система на основе AAV является подходящей для тестов in vivo.

Получение вируса

Концентрированный вирус получали согласно способам, описанным в McClure et al., 2011. Получение вируса в надосадочной жидкости происходило в клетках HEK293FT.

Хирургические операции на головном мозге

Для инъекций вирусного вектора 10-15-недельных самцов мышей C57BL/6N анестезировали смесью кетамин/ксилазин (доза кетамина 100 мг/кг и доза ксилазина 10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Внутрибрюшинно вводимый бупренекс использовали в качестве упреждающего анальгетика (1 мг/кг). Животных обездвиживали в стереотаксическом аппарате Kopf с использованием внутриушных штифтов для позиционирования и зубной планки для сохранения черепа неподвижным. С использованием ручной дрели делали отверстие (1-2 мм) на -3,0 мм позади брегмы и на 3,5 мм латеральнее для инъекции в СА1-участок гиппокампа. При использовании шприца 30 калибра от World Precision Instrument раствор вирусных частиц AAV в общем объеме 1 мкл инъецировали на глубину 2,5 мм. Инъекцию контролировали с помощью насоса для инъекций 'World Precision Instruments UltraMicroPump3' со скоростью потока 0,5 мкл/мин. для предотвращения повреждения ткани. По завершении инъекции иглу для инъекции извлекали медленно со скоростью 0,5 мм/мин. После инъекции кожу закрывали с использованием шовного материала 6-0 Ethilon. Животных гидратировали после операции при помощи 1 мл раствора Рингера с лактатом (подкожно) и содержали в среде с контролируемой температурой (37°C) до достижения ими восстановления активности для передвижения. Через 3 недели после хирургической операции животных подвергали эвтаназии путем глубокой анестезии с последующим удалением ткани для сортировки ядер или перфузией 4% параформальдегидом для иммуногистохимического анализа.

Сортировка ядер и результаты in vivo

Заявители разработали способ специфического генетического мечения ядер нервных клеток, на которые осуществляет нацеливание gRNA, с использованием GFP для сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) в отношении меченых клеточных ядер и последующей обработки ДНК, РНК и ядерных белков. С этой целью разработанный заявителями вектор для мультиплексного целенаправленного воздействия конструировали для экспрессии как белка слияния из GFP и домена KASH белка ядерной мембраны (Starr DA, 2011, Current biology), так и 3 gRNA для нацеливания на конкретные локусы генов, представляющие интерес (фигура 34). GFP-KASH экспрессировали под контролем промотора гена синапсина человека для специфического мечения нейронов. Белок слияния GFP-KASH имел следующие аминокислоты:

Через неделю после опосредованной AAV1/2 доставки в головной мозг наблюдали устойчивую экспрессию GFP-KASH. Для FACS и последующей обработки меченых ядер гиппокампы вырезали через 3 недели после хирургической операции и подвергали обработке для очистки клеточных ядер с использованием стадии центрифугирования в градиенте плотности. С этой целью ткань гомогенизировали в 320 мМ сахарозе, 5 мМ CaCl, 3 мМ Mg(Ac)₂, 10 мМ Tris с pH 7,8, 0,1 мМ EDTA, 0,1% NP40, 0,1 мМ фенилметансульфонилфториде (PMSF), 1 мМ β-меркаптоэтаноле с использованием гомогенизатора Даунса емкостью 2 мл (Sigma). Гомогенат центрифугировали в градиенте от 25% к 29% Optiprep® согласно протоколу производителя в течение 30 мин. при 3500 об./мин. и при 4°C. Осадок ядер ресуспендировали в 340 мМ сахарозе, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 65 мМ глицерофосфате, 5% глицерине, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ β-меркаптоэтаноле, и добавляли рубиновый краситель Vybrant® DyeCycle™ (Life Technologies) для мечения клеточных ядер (обеспечивает испускание в ближней инфракрасной области спектра для ДНК). Меченые и очищенные ядра сортировали с помощью FACS с использованием клеточного сортера с активацией флуоресценции FACSAria и программного обеспечения BDFACS Diva. Отсортированные GFP+ и GFP-ядра в конечном итоге использовали для очистки геномной ДНК с использованием набора DNAeasy для выделения ДНК из крови и тканей (Qiagen) для анализа с помощью Surveyor подвергшихся целенаправленному воздействию участков генома. Этот же подход можно легко использовать для очистки ядерной РНК или белка из подвергшихся целенаправленному воздействию клеток для последующей обработки. Вследствие использования заявителями в данном подходе 2-векторной системы (фигура 34) ожидалось, что эффективное опосредованное Cas9 расщепление ДНК будет происходить только у небольшой субпопуляции клеток в головном мозге (клетки, которые были совместно инфицированы как вектором для мультиплексного целенаправленного воздействия, так и вектором, кодирующим Cas9). Описанный в данном документе способ дает заявителям возможность специфической очистки ДНК, РНК и ядерных белков из популяции клеток, которые экспрессируют 3 gRNA, представляющие интерес, и, следовательно, как полагают, подвергаются опосредованному Cas9 расщеплению ДНК. Применяя этот способ заявители способны визуализировать эффективное расщепление ДНК in vivo, происходящее только в небольшой субпопуляции клеток.

В сущности, здесь заявители показали направленное расщепление in vivo. Кроме того, заявители применяли многосторонний подход с несколькими различными последовательностями, на которые осуществляется нацеливание одновременно, но независимо. Представленную систему можно применять для изучения патологических состояний головного мозга (нокаут гена, например, при болезни Паркинсона), и также она открывает область для дальнейшей разработки инструментов для редактирования генома в головном мозге. Путем замены нуклеазной активности на регуляторы транскрипции генов или эпигенетические регуляторы можно будет ответить на весь спектр научных вопросов о роли регуляции генов и эпигенетических изменений в головном мозге не только при патологических состояниях, но также при таких физиологических процессах, как обучение и формирование памяти. Наконец, представленную технологию можно применять в более сложных системах млекопитающих, таких как приматы, что позволяет преодолеть существующие на данный момент технологические ограничения.

Пример 33. Данные, полученные на модели

Специально были исследованы несколько моделей заболеваний. Они включают гены CHD8, KATNAL2 и SCN2A, связанные с риском развития аутизма de novo; и ген UBE3A, связанный с синдромным аутизмом (синдром Ангельмана). Эти гены и полученные на их основе модели аутизма, конечно, являются предпочтительными, но показывают, что настоящее изобретение можно применять в отношении любого гена, и, таким образом, любая модель является возможной.

Заявители получили эти линии клеток при использовании нуклеазы Cas9 в эмбриональных стволовых клетках человека (hESC). Линии создавали путем транзиентной трансфекции hESC с помощью Cbh-Cas9-2A-EGFP и pU6-sgRNA. Для каждого гена конструировали две sgRNA, наиболее часто осуществляющие нацеливание на одни те же экзоны, в которых у пациентов были недавно описаны нонсенс-мутации (нокаут) по результатам исследований с секвенированием всего экзома пациентов с аутизмом. Плазмиды Cas9-2A-EGFP и pU6 создавали специально для этого проекта.

Пример 34. Система или протокол для получения АAV

В данном документе представлены система или протокол для получения AAV, которые были разработаны для применений в скрининге с высокой пропускной способностью и которые особенно хорошо работают с ним, но они также имеют более широкую применимость в настоящем изобретении. Манипуляция с экспрессией эндогенных генов представляет разнообразные трудности, поскольку величина экспрессии зависит от многих факторов, включающих регуляторные элементы, процессинг мРНК и стабильность транскрипта. Для преодоления этой трудности заявители разработали вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки. AAV имеет геном на основе ssDNA и, следовательно, является менее чувствительным к рекомбинации.

Протокол очистки концентрированного вируса AAV1/2 (серотип AAV1/2, т.е. гибридный или мозаичный капсид AAV из AAV1/AAV2) с использованием гепарина

Среда: D10 + HEPES

Бутыль на 500 мл с DMEM с высоким содержанием глюкозы + Glutamax (GIBCO)

50 мл FBS Hyclone (инактивированной нагреванием) (Thermo Fischer)

5,5 мл раствора HEPES (1 М, GIBCO)

Клетки: HEK293FT с малым числом пассажей (число пассажей <10 на момент получения вируса, произвести размораживание новых клеток 2-4 пассажа для получения вируса, выращивать в течение 3-5 пассажей)

Реагент для трансфекции: полиэтиленимин (PEI) "Мах"

Растворить 50 мг PEI "Мах" в 50 мл стерильной сверхчистой H₂O

Довести pH до 7,1

Фильтровать с использованием фильтра в пластиковом съемном колпачке с размером отверстий 0,22 мкм

Запечатать пробирку и обернуть парафильмом

Заморозить аликвоты до -20°C (для хранения, также можно немедленно использовать)

Культура клеток

Культивировать клетки HEK293FT с малым числом пассажей в D10 + HEPES

Пассировать каждый день в соотношении от 1:2 до 1:2,5

Преимущественно не позволять клеткам достигать конфлюентности более 85%

Для Т75

- Подогреть 10 мл HBSS (-Mg²⁺, -Са²⁺, GIBCO) + 1 мл TrypLE Express (GIBCO) на флакон до 37°C (водяная баня)

Полностью аспирировать среду

- Осторожно добавить 10 мл теплого HBSS (чтобы полностью вымыть среду)

- Добавить 1 мл TrypLE на флакон

- Поместить флакон в инкубатор (37°C) на 1 мин.

- Покачать флакон для отделения клеток

- Добавить 9 мл среды D10 + HEPES (37°C)

- Втягивать в пипетку и выталкивать из пипетки 5 раз для получения суспензии отдельных клеток

- Разделить в соотношении 1:2-1:2,5 (12 мл среды для Т75) (если клетки растут медленнее или они не проявляют оптимальный рост, тогда удалить их и разморозить новую партию)

- Перенести в Т225, как только будет присутствовать достаточное количество клеток (для простоты обращения с большими количествами клеток)

Получение AAV (в масштабе 5*чашек на 15 см на конструкцию)

Высеять 10 миллионов клеток в 21,5 мл среды в чашку на 15 см

Инкубировать в течение 18-22 часов при 37°C

Трансфекция является идеальной при 80% конфлюентности

На планшет

Предварительно подогреть 22 мл среды (D10 + HEPES)

Подготовить пробирку со смесью ДНК (использовать не содержащую эндотоксина ДНК, полученную согласно протоколу для очистки больших количеств ДНК):

5,2 мкг вектора с представляющей интерес плазмидой

4,35 мкг плазмиды на основе AAV серотипа 1

4,35 мкг плазмиды на основе AAV серотипа 2

10,4 мкг плазмиды pDF6 (гены аденовируса-помощника) Перемешать на вихревой мешалке для смешивания

Добавить 434 мкл DMEM (без сыворотки!)

Добавить 130 мкл раствора PEI

Перемешивать на вихревой мешалке 5-10 секунд

Добавить смесь ДНК/DMEM/PEI в предварительно подогретую среду

Быстро перемешать на вихревой мешалке для смешивания

Заменить среду в чашке на 15 см на смесь ДНК/DMEM/PEI

Поместить обратно в инкубатор с температурой 37°C

Инкубировать 48 часов перед сбором (убедиться, что среда не стала слишком кислой)

Сбор вируса

1. Осторожно аспирировать среду из чашек на 15 см (преимущественно не смещая клетки)

2. Добавить 25 мл RT DPBS (Invitrogen) в каждый планшет и осторожно удалить клетки скребком для клеток. Собрать суспензию в пробирки на 50 мл.

3. Осаждать клетки при 800×g в течение 10 минут.

4. Удалить надосадочную жидкость.

Точка паузы: при необходимости заморозить осадок из клеток при -80°C.

5. Ресуспендировать осадок в 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris с pH 8,0, использовать 10 мл на планшет для культуры тканей.

6. Приготовить свежий раствор 10% дезоксихолата натрия в dH₂O. Добавить 1,25 мл этого раствора на планшет для культуры тканей для получения конечной концентрации 0,5%. Добавить нуклеазу Benzonase до конечной концентрации 50 единиц на мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки.

7. Инкубировать при 37°C в течение 1 часа (водяная баня).

8. Удалить клеточный дебрис путем центрифугирования при 3000×g в течение 15 мин. Перенести в новую пробирку на 50 мл и удостовериться, что весь клеточный дебрис был удален для предотвращения блокирования колонок с гепарином.

Очистка AAV1/2 на колонке с гепарином

1. Настроить колонки HiTrap с гепарином с использованием перистальтического насоса таким образом, чтобы поток растворов через колонку составлял 1 мл в минуту. Важно удостовериться, что пузырьки воздуха не попали в колонку с гепарином.

2. Уравновесить колонку 10 мл 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0 с использованием перистальтического насоса.

3. Связывание вируса: внести 50 мл раствора вируса на колонку и обеспечить возможность его прохождения через нее.

4. Стадия промывки 1: колонка с 20 мл 100 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0 (использовать перистальтический насос).

5. Стадия промывки 2: с использованием шприца на 3 мл или 5 мл продолжать промывать колонку 1 мл 200 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0, затем промывать 1 мл 300 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0.

Прекратить промывание

(приготовить шприцы с различными буферами во время протекания раствора вируса сверху в течение 50 мин.).

6. Элюирование. С использованием шприцев на 5 мл и небольшого давления (скорость потока <1 мл/мин) элюировать вирус из колонки путем применения:

1,5 мл 400 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0

3,0 мл 450 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0

1,5 мл 500 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 8,0

Собрать его в центрифужную пробирку на 15 мл.

Концентрирование AAV1/2

1. Стадия концентрирования 1: концентрировать элюированный вирус с использованием центрифужных фильтрующих блоков Amicon Ultra на 15 мл с порогом отсечения по молекулярному весу 100000. Загрузить элюат из колонки в концентратор и центрифугировать при 2000×g в течение 2 мин. (при комнатной температуре). Проверить объем концентрированного вируса - он должен составлять примерно 500 мкл. При необходимости центрифугировать с интервалами 1 мин. до достижения правильного объема.

2. Замена буфера: добавить 1 мл стерильного DPBS в фильтрующий блок, центрифугировать с интервалами 1 мин. до достижения правильного объема (500 мкл).

3. Стадия концентрирования 2: добавить 500 мкл концентрата в фильтрующий блок Amicon Ultra на 0,5 мл и 100K. Центрифугировать при 6000g в течение 2 мин. Проверить объем концентрированного вируса - он должен составлять примерно 100 мкл. При необходимости центрифугировать с интервалами 1 мин. до достижения правильного объема.

4. Извлечение: перевернуть фильтрующий элемент и вставить в новую пробирку для сбора. Центрифугировать при 1000 g в течение 2 мин.

Разделить на аликвоты и заморозить при -80°C.

Как правило, на один участок инъекции требуется 1 мкл, следовательно, рекомендуются небольшие аликвоты (например, 5 мкл) (во избежание замораживания-размораживания вируса).

Определить титр устойчивых к ДНКазе I частиц в GC с использованием qPCR (см отдельный протокол).

Материалы

Amicon Ultra, 0,5 мл, 100K; MILLIPORE; UFC510024

Amicon Ultra, 15 мл, 100K; MILLIPORE; UFC910024

Нуклеаза Benzonase; Sigma-Aldrich, E1014

Картридж с гепарином HiTrap; Sigma-Aldrich; 54836

Дезоксихолат натрия; Sigma-Aldrich; D5670

Протокол получения надосадочной жидкости с AAV1

Среда: D10 + HEPES

Бутыль на 500 мл с DMEM с высоким содержанием глюкозы + Glutamax (Invitrogen)

50 мл FBS Hyclone (инактивированной нагреванием) (Thermo Fischer)

5,5 мл раствора HEPES (1 М, GIBCO)

Клетки: HEK293FT с малым числом пассажей (число пассажей <10 на момент получения вируса)

Произвести размораживание новых клеток 2-4 пассажа для получения вируса, выращивать в течение 2-5 пассажей

Реагент для трансфекции: полиэтиленимин (PEI) "Мах"

Растворить 50 мг PEI "Мах" в 50 мл стерильной сверхчистой H₂O

Довести pH до 7,1

Фильтровать с использованием фильтра в пластиковом съемном колпачке с размером отверстий 0,22 мкм

Запечатать пробирку и обернуть парафильмом

Заморозить аликвоты при -20°C (для хранения, также можно немедленно использовать)

Культура клеток

Культивировать HEK293FT с малым числом пассажей в D10 + HEPES. Пассировать каждый день в соотношении от 1:2 до 1:2,5

Преимущественно позволять клеткам достигать более 85% конфлюентности

Для Т75

- Подогреть 10 мл HBSS (-Mg²⁺, -Са²⁺, GIBCO) + 1 мл TrypLE Express (GIBCO) на флакон до 37°C (водяная баня)

- Полностью аспирировать среду

- Осторожно добавить 10 мл теплого HBSS (чтобы полностью вымыть среду)

- Добавить 1 мл TrypLE на флакон

- Поместить флакон в инкубатор (37°C) на 1 мин.

- Покачать флакон для отделения клеток

- Добавить 9 мл среды D10 + HEPES (37°C)

- Втягивать в пипетку и выталкивать из пипетки 5 раз для получения суспензии отдельных клеток

- Разделить в соотношении 1:2-1:2,5 (12 мл среды для Т75) (если клетки растут медленнее или они не проявляют оптимальный рост, тогда удалить их и разморозить новую партию)

- Перенести в Т225, как только будет присутствовать достаточное количество клеток (для простоты обращения с большими количествами клеток)

Получение AAV (в масштабе одной чашки на 15 см)

Высеять 10 миллионов клеток в 21,5 мл среды в чашку на 15 см

Инкубировать в течение 18-22 часов при 37°C

Трансфекция является идеальной при 80% конфлюентности на планшет

Предварительно подогреть 22 мл среды (D10 + HEPES)

Подготовить пробирку со смесью ДНК (использовать не содержащую эндотоксина ДНК, полученную согласно протоколу для очистки больших количеств ДНК):

5,2 мкг вектора с представляющей интерес плазмидой

8,7 мкг плазмиды на основе AAV серотипа 1

10,4 мкг плазмиды DF6 (гены аденовируса-помощника)

Перемешать на вихревой мешалке для смешивания

Добавить 434 мкл DMEM (без сыворотки!) Добавить 130 мкл раствора PEI

Перемешивать на вихревой мешалке 5-10 секунд

Добавить смесь ДНК/DMEM/PEI в предварительно подогретую среду

Быстро перемешать на вихревой мешалке для смешивания

Заменить среду в чашке на 15 см на смесь ДНК/DMEM/PEI

Поместить обратно в инкубатор с температурой 37°C

Инкубировать 48 часов перед сбором (преимущественным является отслеживание, чтобы удостовериться в том, что среда не становится слишком кислой)

Сбор вируса

Удалить надосадочную жидкость из чашки на 15 см

Фильтровать через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм (низкая степень связывания белка). Разделить на аликвоты и заморозить при -80°C.

Трансдукция (культуры первичных нейронов в 24-луночном формате, 5DIV)

Заменить полную среду Neurobasal в каждой лунке с нейронами, которые подлежат трансдукции, свежей средой Neurobasal (обычно заменяют 400 мкл из 500 мкл в лунке)

Произвести размораживание надосадочной жидкости с AAV в водяной бане с температурой 37°C

Дать уравновеситься в инкубаторе в течение 30 мин.

Добавить 250 мкл надосадочной жидкости с AAV в каждую лунку

Инкубировать 24 часа при 37°C

Удалить среду/надосадочную жидкость и заменить свежей полной средой Neurobasal

Экспрессия становится видимой спустя 48 часов, насыщение в течение около 6-7 дней после инфицирования

Конструкции для плазмиды pAAV с GOI должны иметь размер, не превышающий 4,8 т.п.о., включая обе ITRS.

Пример кодон-оптимизированной для человека последовательности (т.е. являющейся оптимизированной для экспрессии у людей) SaCas9 приведен ниже: (SEQ ID NO:_)

Пример 35. Сведение к минимуму нецелевого расщепления с использованием никазы Cas9 и двух направляющих РНК

Cas9 представляет собой направляемую РНК ДНК-нуклеазу, которая можно нацелить на конкретные положения в геноме с помощью направляющей РНК из 20 п.о. Тем не менее, направляющая последовательность может допускать некоторые несовпадения между направляющей последовательностью и последовательностью ДНК-мишени. Данная гибкость является нежелательной вследствие потенциальной возможности нецелевого расщепления, когда направляющая РНК нацеливает Cas9 на нецелевую последовательность, которая отличается от направляющей последовательности несколькими основаниями. Для всех экспериментальных применений (целенаправленное воздействие на гены, генная инженерия сельскохозяйственных культур, терапевтические применения и т.д.) важно иметь возможность улучшения специфичности опосредованного Cas9 целенаправленного воздействия на гены и снижения вероятности нецелевой модификации с использованием Cas9.

Заявители разработали способ применения мутантной никазы Cas9 в сочетании с двумя направляющими РНК для облегчения целенаправленных двухнитевых разрывов в геноме без нецелевых модификаций. Мутантную никазу Cas9 можно получить из нуклеазы Cas9 путем блокирования ее активности в отношении расщепления для того, чтобы вместо расщепления обеих нитей в ДНК-дуплексе она расщепляла только одну нить. Никазу Cas9 можно получить путем индукции мутаций в одном или нескольких доменах нуклеазы Cas9, например, Ruvc1 или HNH. Данные мутации могут включать, без ограничения, мутации в каталитическом домене Cas9, например, в SpCas9 эти мутации могут находиться в положениях D10 или Н840. Данные мутации могут включать, без ограничения, D10A, Е762А, Н840А, N854А, N863А или D986A в SpCas9, но никазы можно получать путем индукции мутаций в соответствующих положениях у других ферментов CRISPR или ортологов Cas9. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мутантная никаза Cas9 представляет собой никазу SpCas9 с мутацией D10A.

Это работает таким образом, что каждая направляющая РНК в комбинации с никазой Cas9 будет индуцировать целенаправленный однонитевой разрыв в присутствующей в виде дуплекса ДНК-мишени. Поскольку с помощью каждой направляющей РНК обеспечивается внесение однонитевого разрыва в одну нить, окончательный результат представляет собой двухнитевой разрыв. Причина, по которой этот способ устраняет нецелевые мутации, заключается в том, что очень маловероятным является наличие нецелевого сайта, который характеризуется высокими степенями сходства в отношении обеих направляющих последовательностей (20 п.о. + 2 п.о. (РАМ) = 22 п.о. - специфичность в отношении каждой направляющей последовательности, а применение двух направляющих последовательностей означает, что любой нецелевой сайт должен будет иметь гомологичную последовательность около 44 п.о.). Хотя все еще существует вероятность, что отдельные направляющие последовательности могут иметь нецелевые мишени, но в эти нецелевые мишени будет вноситься только однонитевой разрыв, который вряд ли будет репарироваться посредством процесса NHEJ с внесением мутаций. Таким образоем, мультиплексирование внесения однонитевых разрывов в две нити ДНК обеспечивает функциональный метод введения целенаправленных двухнитевых разрывов ДНК без нецелевых мутагенных эффектов.

Заявители проводили эксперименты, включающие совместную трансфекцию клеток HEK293FT плазмидой, кодирующей никазу Cas9(D10A), а также кассетами экспрессии ДНК для одной или нескольких направляющих последовательностей. Заявители трансфицировали клетки с использованием Lipofectamine 2000 и трансфицированные клетки собирали через 48 или 72 часа после трансфекции. Индуцированные внесением двойных однонитевых разрывов NHEJ выявляли с использованием анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR, как описано в данном документе выше (фигуры 51, 52 и 53).

Заявители дополнительно идентифицировали параметры, связанные с эффективным расщеплением мутантной никазой Cas9 в сочетании с двумя направляющими РНК, и эти параметры включают, без ограничения, длину "липкого" 5'-конца. Об эффективном расщеплении сообщается в случае "липкого" 5'-конца, состоящего по меньшей мере из 26 пар оснований. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения "липкий" 5'-конец состоит по меньшей мере из 30 пар оснований и, более предпочтительно, по меньшей мере из 34 пар оснований. Для расщепления могут быть приемлемыми "липкие" концы, состоящие из вплоть до 200 пар оснований, хотя "липкие" 5'-концы, состоящие из менее чем 100 пар оснований, являются предпочтительными, и "липкие" 5'-концы, состоящие из менее чем 50 пар оснований, являются наиболее предпочтительными (фигуры 54 и 55).

Пример 36. Исследование функций генов in vivo в головном мозге млекопитающих с использованием Cas9

Возможность точной манипуляции in vivo с геномом нейронов в головном мозге обеспечивает возможность быстрого анализа функции генов в нормальных и связанных с заболеванием процессах в головном мозге. Заявители показали, что опосредованная AAV доставка микробной эндонуклеазы Cas9 и одиночной направляющей РНК в специфические типы клеток в головном мозге взрослых мышей способствовала одиночному и мультиплексному нокауту генов. В течение двух недель опосредованный Cas9 нокаут метил-CpG-связывающего белка (MeCP2) индуцировал морфологические изменения в подвергшихся целенаправленному воздействию нейронах и мутиплексный нокаут семейства белков ДНК-метилтрансфераз (Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b) изменял поведение мышей при контекстном условном рефлексе в связи с переживанием чувства страха. Вместе с тем, результаты заявителей продемонстрировали потенциал Cas9 в отношении содействия быстрым обратным генетическим исследованиям функций генов в головном мозге и обеспечении привлекательной альтернативы применению требующих больших затрат времени трансгенных животных моделей.

Трансгенные животные модели, несущие ассоциированные с заболеваниями мутации, являются чрезвычайно полезными для изучения нейропсихиатрических болезней, содействуя выяснению генетического и патофизиологического механизма заболевания. В то же время, хотя, как известно, некоторые нейропсихиатрических нарушения ассоциированы с дефектами одиночного гена; большинство когнитивных и психических расстройств, в том числе шизофрения, аутизм и депрессия, ассоциированы с изменением нескольких генов. Создание животных моделей, которые одновременно несут модификации нескольких генов, является особенно трудоемким и требует продолжительной селекции в течение многих поколений. Было показано, что CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 из S. pyogenes (SpCas9) опосредует точное и эффективное расщепление генома в одном или нескольких генах в эукариотических клетках с реплицирующимся геномом. Нуклеазу Cas9 можно направить на расщепление конкретных локусов генома для индуцирования целенаправленных двухнитевых разрывов, приводящих к к мутациям сдвига рамки считывания по типу вставок или делеций (вставок/делеций) (фигура 59А). Заявители стремились к исследованию возможности применения Cas9 для изучения функций индивидуальных генов или их групп в процессах в головном мозге, а также для моделирования моно- и мультигенных нарушений in vivo.

Аденоассоциированные вирусы (AAV) широко применяют для доставки рекомбинантных генов в головной мозг мыши. Заявители сконструировали систему доставки на основе AAV из двух векторов с Cas9 и sgRNA (фигура 56А). Основным ограничением системы на основе AAV является упаковывающий размер кассеты для трансгена (~4,5 т.п.о. без ITR). Размер SpCas9 составляет ~4,2 т.п.о., что составляет менее 0,3 т.п.о. для других генетических элементов, необходимых для эффективной и специфичной к типу клеток экспрессии генов. Заявители идентифицировали, что усеченного варианта промотора Mecp2 мыши (235 п.о., sMecp2) и короткого сигнала полиаденилирования (48 п.о., spA) достаточно для управления устойчивой экспрессией Cas9 в культивируемых кортикальных нейронах мыши (фигура 56В; фигура 59B-D). Для управления экспрессией sgRNA в нейронах заявители применяли второй вектор, кодирующий sgRNA. Кроме того, заявители комбинировали доставку sgRNA с одновременным флуоресцентьгм мечением подвергнутых целенаправленному воздействию клеточных ядер. Слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) с ядерным трансмембранным доменом KASH направляет GFP во внешнюю ядерную мембрану и обеспечивает возможность ранней визуализации клеток, трансдуцированных AAV (фигура 56В).

Прежде всего, заявители тестировали эффективность доставки этой двухвекторной системы доставки Cas9 in vitro с применением первичных кортикальных нейронов мыши и наблюдали более чем 80% эффективность совместной трансдукции (фигура 56С). Важно, что экспрессия Cas9 не оказывала отрицательное влияние на морфологические характеристики и выживаемость трансдуцированных нейронов (фигура 59D, Е). Для тестирования опосредованного Cas9 редактирования генома в первичных нейронах мыши заявители целенаправленно воздействовали на ген Mecp2, играющий важнейшую роль при синдроме Ретта. Как было показано недостаточность МеСР2 ассоциирована с аномалиями дендритного дерева и дефектами морфогенеза шипиков в нейронах, и, как полагают, оба морфологических фенотипа обуславливают неврологические симптомы, наблюдаемые у пациентов с синдромом Ретта.

Для достижения эффективного целенаправленного воздействия на Mecp2, в первую очередь, заявители создали несколько sgRNA для нацеливания на несколько сайтов в пределах экзона 3 локуса Mecp2 мыши (фигура S2A, B) и отобрали наиболее эффективную sgRNA на основании результатов анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR™ на клетках Neuro-2a (фигура 56D, фигура 60). Для оценки эффективности редактирования с помощью двухвекторной системы заявителей в нейронах in vitro заявители трансдуцировали первичные кортикальные нейроны мыши в день 7 in vitro (7DIV) и измеряли частоту вставок/делеций с применением анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR™ через 7 дней после трансдукции (фигура 56Е). Следует отметить, что для культуры нейронов, трансдуцированных с помощью Cas9 и sgRNA, показано почти 80% снижение уровней белка МеСР2 по сравнению с нейронами, трансдуцированными только с помощью Cas9 (фигура 56F; фигура 61). Более того, нейроны, совместно трансдуцированные с помощью Cas9 и sgRNA, также демонстрировали измененные морфологические характеристики дендритного дерева (фигура 56G-I) и плотности шипиков (фигура 69J, K) при сравнении с популяций нейронов, на которые воздействовали только с помощью Cas9.

Затем заявители задали вопрос, могли ли Cas9 опосредовать стабильные модификации генома в определенной субпопуляции клеток в головном мозге живых мышей. Для специфического анализа клеток, трансдуцированных с помощью AAV, заявители разработали способ очистки ядер, меченных GFP-KASH, с применением сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) (фигура 57А, фигура 62). По аналогии с первичными нейронами в культуре заявители производили совместную доставку смеси (соотношение 1:1) с высоким титром векторов на основе AAV1/2, несущих Cas9 и нацеливающую на Mecp2 sgRNA, в зубчатую извилину взрослых мышей (фигура 57В). Заявители наблюдали высокую эффективность совместной трансдукции обоих векторов в гранулярных клетках гиппокапма через 4 недели после вирусной доставки (фигура 57С). Для тестирования эффективности модифицирования генома в локусе Mecp2 in vivo заявители очистили ядра, меченные GFP-KASH, и в отсортированной популяции ядер выявили частоту вставок/делеций на уровне до 34% (фигура 57D). Опосредованное Cas9 разрезание локуса Mecp2 эффективно снижало уровни белка МеСР2 (фигура 57E-G) и снижало плотность шипиков в подвергнутой целенаправленному воздействию популяции нейронов (фигура 57Н, I), что напоминало эффекты, наблюдаемые у мышей с нокаутом по МеСР2. Эти результаты демонстрировали универсальность Cas9 для облегчения целенаправленного нокаута генов в головном мозге млекопитающего in vivo.

Одним из ключевых преимуществ системы Cas9 является ее способность к облегчению мультиплексного редактирования генома. Введение стабильных нокаутов нескольких генов в головном мозге живых животных будет иметь потенциально многообещающие применения, такие как каузальное исследование полигенных механизмов, лежащих в основе физиологических и невропатологических состояний. Для тестирования возможности мультиплексного редактирования генома в головном мозге заявители разработали мультиплексный вектор экспрессии sgRNA, состоящий из трех последовательно расположенных sgRNA вместе с GFP-KASH для мечения ядер (фигура 58А). Заявители выбрали sgRNA, осуществляющие нацеливание на семейство генов ДНК-метилтрансфераз (DNMT), состоящее из Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b. Dnmt1 и 3а экспрессируются в головном мозге взрослых особей, тогда как Dnmt3b эспрессируется, главным образом, во время равния нервной системы. Ранее было показано, что активность DNMT изменяет состояние метилирования ДНК в головном мозге, a Dnmt3a и Dnmt1 необходимы для синаптической пластичности, а также обучения и формирования памяти. Заявители выбрали индивидуальные sgRNA с высокой эффективностью модифицирования и оптимизировали комбинации направляющих последовательностей для высокой степени одновременного расщепления ДНК во всех трех подвергаемых целенаправленному воздействию генах (фигура 58В; фигура 63).

Для тестирования эффективности мультиплексного редактирования генома in vivo заявители производили стереотаксическую доставку смеси с высоким титром векторов на основе AAV, экспрессирующих Cas9 и sgRNA, в дорсальную и вентральную части зубчатой извилины взрослых мышей. Через 4 недели гиппокампы вырезали, и подвергнутые целенаправленному воздействию клеточные ядра сортировали посредством FACS. С помощью глубокого секвенирования заявители наблюдали образование вставок/делеций во всех трех подвергнутых целенаправленному воздействию локусах на высоких уровнях в диапазоне ~20-70% (фигура 58С, фигура 64). Для Dnmt3a и Dnmt1, оба которые экспрессируются в головном мозге взрослых животных, показаны значительно сниженные уровни белка в ткани зубчатой извилины через ~12 недель после вирусной доставки (фигура 58D). Ввиду низкой экспрессии Dnmt3b в головном мозге взрослых животных заявители не смогли выявить белок Dnmt3b в этом анализе.

В предыдущей работе с применением Cas9 было показано, что в локусах генома, которые частично совпадают с sgRNA, может происходит нецелевое образование вставок/делеций. Анализ вставок/делеций в главных предсказанных нецелевых локусах выявил частоту образования вставок/делеций, составляющую 0-1,6%, что демонстрировало высокую специфичность модификации с помощью Cas9 (таблица 2). Наблюдаемый низкий уровень нецелевого воздействия, вероятно, обусловлен относительно слабыми уровнями экспрессии Cas9, происходящей под воздействием промотора sMecp2 и короткого сигнала поли(А).

В предыдущих исследованиях было высказано предположение, что нокдаун Dnmt3a и Dnmt1 может оказывать влияние на формирование гиппокамп-зависимой памяти. В связи с этим заявители проводили тестирование поведения при выработке контекстного условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха для исследования эффекта опосредованного Cas9 тройного нокаута (Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b) на запоминание и консолидацию при формировании памяти. Хотя заявители не наблюдали каких-либо различий между контрольными мышами и мышами с тройным нокаутом в фазе запоминания, нокаутные мыши продемонстрировали ухудшенную консолидацию памяти при тестировании в условиях тренировочного контекста (фигура 58Е, F). Данный эффект устранялся при тестировании мышей в измененном контексте, что демонстрирует ухудшение контекстного обучения в мышиной модели заявителей. Результаты заявителей демонстрируют, что опосредованный CRISPR-Cas9 нокаут представителей семейства DNMT в нейронах зубчатой извилины является достаточным для изучения функций генов в поведенческих задачах.

Вместе с тем, результаты заявителей демонстрируют, что доставка in vivo системы CRISPR-Cas9 представляет собой точную, гибкую и высокоэффективную технологию для разработки моделей заболеваний и манипулирования с поведением мышей посредством мультиплексного редактирования генома. Применение системы Cas9 in vivo, показанное в данном документе, будет иметь широкий спектр применений в фундаментальной науке, а также в биотехнологии и медицине.

ДНК-конструкции. Для выбора мишеней для Cas9 и создания одиночной направляющей РНК (sgRNA) выбирали целевые последовательности размером 20 нт, расположенные перед последовательностью РАМ 5'-NGG. Для сведения к минимуму нецелевых эффектов применяли инструмент для конструирования CRIPSR (доступен на веб-сайте tools.genome-engineering.org). sgRNA подвергали ПЦР-амплификации с применением промотора U6 в качестве матрицы с прямым праймером:

и обратным праймером, содержащим sgRNA с целевым сайтом ДНК размером 20 нт (жирным шрифтом):

Конструкцию EGFP-KASH использовали в качестве матрицы для ПЦР для клонирования кодирующей кассеты в каркас на основе AAV под контроль промотора гена синапсина человека (hSyn). Затем вводили последовательность, кодирующую U6-Mecp2_sgRNA, с применением сайта для МluI. Для стратегии мультиплексного целенаправленного воздействия на гены индивидуальные sgRNA подвергали ПЦР-амплификации, как описано выше. Все три sgRNA лигировали с подвергнутой ПЦР-амплификации кассетой hSyn-GFP-KASH-bGHpA (см. фигуру 58А) путем применения стратегии клонирования Golden Gate. После ПЦР-амплификации продукт лигирования Golden Gate, содержащий 3 sgRNA и hSyn-GFP-KASH-bGHpA, клонировали в каркас на основе AAV. Все полученные конструкции подтверждали путем секвенирования. Чтобы найти оптимальную промоторную последовательность для управления экспрессией Cas9 в нейронах, заявители тестировали последовательности промоторов: hSyn1, усеченного Mecp2 мыши (sMecp2) и усеченного Map1b крысы (rMap1b) (см. фигуру 58А). Для амплификации промоторных участков использовали следующие праймеры: hSyn_F:

. Сборку другого усеченного промотора map1b крысы производили с использованием следующих олигонуклеотидов:

и

. Сборку короткого синтетического сигнала полиаденилирования (spA) (3) производили с использованием следующих олигонуклеотидов:

и

. Для трансфекции нейронов с помощью Lipofectamine^®2000 (Life Technologies) применяли плазмиду, кодирующую красный флуоресцентный белок (mCherry) под контролем промотора EF1α.

Культуры линий клеток и трансфекция. Клетки Neuro-2a (N2a) выращивали в DMEM, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (BSA). Для клеток HEK293FT применяли DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки поддерживали при 37°C в атмосфере с 5% СО₂. Клетки трансфицировали с помощью Lipofectamine^®2000 или реагента полиэтиленимина (PEI) "MAX" (Polysciences) согласно протоколам производителя.

Получение концентрированных векторов на основе AAV. Частицы AAV1/2 с высоким титром получали с использованием плазмид серотипов AAV1 и AAV2 в равном соотношении и плазмиды-помощника pDF6 и очищали на колонке для аффинной хроматографии с гепарином. Титрование вирусных частиц осуществляли с помощью qPCR. Частицы AAV1 в высоким титром получали в организации UNC Vector Core (Университет Северной Каролины в Чапел-Хилле). Частицы AAV1 с низким титром в DMEM получали как описано ранее в S. Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature 500, 472 (Aug 22, 2013). Вкратце, клетки HEK293FT трансфицировали плазмидой с трансгеном, плазмидой серотипа pAAV1 и плазмидой-помощником pDF6 с помощью PEI "МАХ". Культуральную среду собирали через 48 ч. и фильтровали через фильтр из PVDF с диаметром пор 0,45 мкм (Millipore).

Культура первичных кортикальных нейронов. Животных, используемых для получения нейронов для культур тканей, умерщвляли согласно протоколу, одобренному Комитетом по уходу за животными MIT (САС MIT). Первичные культуры получали из головного мозга эмбрионов мышей на 16 день беременности, как описано у G. Banker, К. Goslin, Developments in neuronal cell culture. Nature 336, 185 (Nov 10, 1988). Использовали эмбрионов обоих полов. Клетки высевали в 24-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином (PDL) (BD Biosciences), или на покровные стекла, покрытые ламинином/PDL (VWR). Культуры выращивали при 37°C и 5% СО₂ в среде Neurobasal, дополненной В27, Glutamax (Life Technologies) и смесью пенициллин/стрептомицин.

Для трансдукции AAV кортикальные нейроны в 500 мкл культуральной среды Neurobasal инкубировали до 7 DIV с 300 мкл (совместное инфицирование в соотношении 1:1) кондиционированной среды клеток HEK293FT, содержащей AAV1. Через неделю после трансдукции нейроны собирали для последующей обработки или фиксировали в 4% параформальдегиде для иммунофлуоресцентного окрашивания или морфологического анализа.

Для визуализации морфологических характеристик нейронов клетки на стадии DIV7 трансифицировали вектором экспресии EFlα-mCherry с помощью Lipofectamine^®2000 (Life Technologies) в течение одной недели, как ранее описано у L. Swiech et al., CLIP-170 and IQGAP1 cooperatively regulate dendrite morphology. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 31, 4555 (Mar 23, 2011). Для измерения общей длины дендритов все дендриты отдельных нейронов отслеживали с использованием программного обеспечения ImageJ. Количественная оценка числа первичных дендритов, кончиков дендритов и анализ Шолла проводили на изображениях, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении объектива 40х (микроскоп Zeiss AxioCam Ах10, камера AxioCam MRm). Для определения количества дендритов подсчитывали концы всех неаксональных выпячиваний длиннее 10 мкм. Для анализа Шолла вокруг тела клетки автоматически вычерчивали концентрические круги с шагом диаметра 5 мкм, и число дендритов, пересекающих каждый круг, подсчитывали с помощью программного обеспечения ImageJ с плагином Sholl.

Стереотаксическая инъекция AAV1/2 в головной мозг мыши. CAC MIT одобрил все процедуры с животными, описанные в данном документе. Взрослых (в возрасте 12-16 недель) самцов мышей C57BL/6N анестезировали путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина. Проводили упреждающую анальгезию (бупренекс, 1 мг/кг, i.p.). Краниотомию осуществляли согласно одобренным процедурам и 1 мкл смеси AAV с соотношением 1:1 (1×10¹³ Vg/мл sMecp2-SpCas9; 6×10¹² Vg/мл DNMT 3×sgRNA; 3-5×10¹² Vg/мл (hSyn-GFP-KASH) инъецировали в: дорсальную часть зубчатой извилины (переднезадняя ось: -1,7; медиолатеральная ось: 0,6; дорсовентральная ось: -2,15) и/или вентральную часть зубчатой извилины (переднезадняя ось: -3,52; медиолатеральная ось: 2,65; дорсовентральная ось: -3). Разрез зашивали и в течение трех дней после хирургической операции вводили надлежащие средства для послеоперационного обезболивания (мелоксикам, 1-2 мг/кг).

Очистка клеточных ядер из ткани головного мозга. Весь гиппокамп или зубчатую извилину быстро вырезали в охлажденном на льду DPBS (Life Sciences) и подвергали шоковой заморозке на сухом льду. Ткань осторожно гомогенизировали в 2 мл охлажденного на льду буфера для гомогенизации (НВ) (320 мМ сахарозы, 5 мМ CaCl, 3 мМ Mg(Ac)₂, 10 мМ Tris с pH 7,8, 0,1 мМ EDTA, 0,1% NP40, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ бета-меркаптоэтанола) с помощью гомогенизатора Даунса на 2 мл (Sigma); 25 раз пестиком A, а затем 25 раз пестиком В. Затем добавляли 3 мл НВ до общего объема 5 мл и выдерживали на льду в течение 5 мин. Для градиентного центрифугирования добавляли 5 мл 50% среды с градиентом плотности OptiPrep™ (Sigma), содержащей 5 мМ CaCl, 3 мМ Mg(Ac)₂, 10 мМ Tris с рН 7,8, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ бета-меркаптоэтанола, и перемешивали. Лизат осторожно загружали поверх 10 мл 29% изоосмолярного раствора OptiPrep™ в коническую центрифужную пробирку на 30 мл (Beckman Coulter, ротор SW28). Образцы центрифугировали при 10100×g (7500 об./мин.) в течение 30 мин. при 4°C. Надосад очную жидкость удаляли, и осадок ядер осторожно ресуспендировали в 65 мМ бета-глицерофосфата (pH 7,0), 2 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 340 мМ сахарозы и 5% глицерине. Количество и качество очищенных ядер контролировали с использованием светлопольной микроскопии.

Сортировка клеточных ядер. Очищенные GFP-положительные (GFP⁺) и отрицательные (GFP^-) интактные ядра совместно метили рубиновым красителем Vybrant® DyeCycle™ (1:500, Life Technologies) и сортировали при помощи BD FACSAria III (Koch Institute Flow Cytometry Core, MIT). GFP⁺ и GFP^- ядра собирали в пробирки Eppendorf на 1,5 мл, покрытые 1% BSA и содержащие 400 мкл буфера для ресуспендирования (65 мМ бета-глицерофосфата с рН 7,0, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 340 мМ сахарозы и 5% глицерин). После сортировки все образцы выдерживали на льду и центрифугировали при 10000×g в течение 20 мин. при 4°C. Осажденные ядра хранили при -80°C или непосредственно применяли для последующей обработки.

Экстракция геномной ДНК и анализ с помощью SURVEYOR™. Для функционального тестирования sgRNA клетки N2a при 50-70% конфлюентности совместно трансфицировали одиночной sgRNA, подвергнутой ПЦР-амплификации, и вектором с Cas9. Клетки, трансфицированные только Cas9, служили в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали через 48 ч. после трансфекции, и ДНК экстрагировали с использованием набора DNeasy для выделения ДНК из крови и тканей (Qiagen) согласно протоколу производителя. Для выделения геномной ДНК из трансдуцированных с помощью AAV1 первичных нейронов использовали набор DNeasy для выделения ДНК из крови и тканей через 7 дней после трансдукции с помощью AAV согласно инструкции производителя.

Отсортированные ядра или вырезанные ткани лизировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris, pH 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ EDTA, 0,5 мМ SDS, протеиназа K (PK, 1 мг/мл) и РНКаза А) при 55°C в течение 30 мин. Затем проводили экстракцию смесью фенол-хлороформ с последующим осаждением ДНК этанолом согласно стандартным процедурам. В заключение ДНК ресуспендировали в буфере ТЕ (10 мМ Tris с pH 8,0, 0,1 мМ EDTA) и применяли для последующего анализа. Функциональное тестирование индивидуальных sgRNA проводили путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR™ (Transgenomics) с использованием праймеров для ПЦР, перечисленных в таблице 3. Количественную оценку интенсивности полос проводили как описано ранее у F.A. Ran et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols 8, 2281 (Nov, 2013).

Иммунофлуоресцентное окрашивание.

Культура клеток. Для иммунофлуоресцентного окрашивания первичных нейронов клетки фиксировали через 7 дней после вирусной доставки в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин. при RT. После 3-кратного промывания с помощью PBS клетки блокировали с помощью 5% нормальной сыворотки козы (NGS) (Life Technologies), 5% сыворотки осла (DS) (Sigma) и 0,1% Triton-X100 (Sigma) в PBS в течение 30 мин. при RT. Клетки инкубировали с первичными антителами в 2,5% NGS, 2,5% DS и 0,1% Triton-X100 в течение 1 часа при RT или в течение ночи при 4°C. После 3-кратного промывания с помощью PBST клетки инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при RT. Наконец, монтировали покровные стекла с использованием среды для заключения VECTASHIELD HardSet с DAPI (Vector Laboratories) и производили визуализацию с помощью микроскопа Zeiss AxioCam Ах10 и камеры AxioCam MRm. Фотографии обрабатывали с помощью программного обеспечения Zen 2012 (Zeiss). Количественную оценку проводили путем использования программного обеспечения ImageJ 1.48h и плагина для выявления нейронов.

Мышей умерщвляли через 4-8 недель после вирусной доставки смертельной дозой смеси кетамин/ксилазин и подвергали транскардиальной перфузии с помощью PBS, а затем PFA. Из фиксированной ткани получали срезы с помощью вибротома (Leica, VT1000S). Затем срезы толщиной 30 мкм кипятили в течение 2 мин. в натрий-цитратном буфере (10 мМ дигидрата тринатрий-цитрата, 0,05% Tween20, pH 6,0) и охлаждали при RT в течение 20 мин. Срезы блокировали с помощью 4% нормальной сыворотки козы (NGS) в TBST (137 мМ NaCl, 20 мМ Tris с pH 7,6, 0,2% Tween-20) в течение 1 часа. Прафиновые срезы получали с помощью микротома (Leica RM2125 RTS) с толщиной 8 мкм и окрашивали как описано ранее у А.V. Tzingounis et al., The KCNQ5 potassium channel mediates a component of the afterhyperpolarization current in mouse hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 10232 (Jun 1, 2010).

Срезы инкубировали с первичными антителами, разбавленными в TBST с 4% NGS, в течение ночи при 4°C. После 3 промывок в TBST образцы инкубировали с вторичными антителами. После 3-кратного промывания с помощью TBST срезы заключали с применением среды для заключения VECTASHIELD HardSet с DAPI и визуализировали при помощи конфокального микроскопа (Zeiss LSM 710, Ах10 Imager Z2, программное обеспечение Zen 2012).

Использовали следующие первичные антитела: антитело кролика к Dnmt3a (Santa Cruz, 1:100); антитело кролика к МеСР2 (Millipore, 1:200); антитело мыши к NeuN (Millipore, 1:50-1:400); антитело курицы к GFAP (Abeam, 1:400); антитело мыши к Мар2 (Sigma, 1:500); антитело курицы к GFP (Aves Labs, 1:200-1:400); антитело мыши к НА (Cell Signaling, 1:100). Вторичные антитела: Alexa Fluor®488, 568 или 633 (Life Technologies, 1:500-1:1000).

Окраска по методу Гольджи-Кокса: Окраску по методу Гольджи-Кокса проводили в применением набора FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies). Взрослых самцов мышей через 1-4 недели после инъекции CRISPR-Cas9, целенаправленно воздействующей на локус Mecp2, умерщвляли путем смещения шейных позвонков согласно протоколу САС MIT. Сразу же после вырезания головной мозг обрабатывали согласно протоколу производителя. Морфологию клеток анализировали на полученных с помощью криотома толщиной 100 мкм срезах зубчатой извилины с применением светового микроскопа с объективом 100х (Zeiss Axioplan 2 с автоматическим контролем точной фокусировки, цифровая камера OcraER). Плотность шипиков подсчитывали вручную с применением программного обеспечения MetaMorph4.

Количественная оценка в анализе с использованием LIVE/DEAD®: Контрольные и трансдуцированные первичные нейроны окрашивали путем применения анализа с использованием LIVE/DEAD® (Life Technologies) согласно инструкции производителя. Во избежание интерференции с сигналом GFP, обусловленным экспрессией GFP-KASH, клетки окрашивали только для выявления мертвых (гомодимером этидия) и с помощью DAPI (все клетки). Окрашенные клетки визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, и мертвые, GFP- и DAPI-положительные клетки подсчитывали путем применения программного обеспечения ImageJ 1.48h и плагина для выявления нейронов.

Вестерн-блот-анализ: Трансдуцированные первичные кортикальные нейроны (7 дней после вирусной доставки) и трансдуцированные образцы ткани (4 недели после вирусной доставки) лизировали в 50 мкл охлажденного на льду буфера RIPA (Cell Signaling), содержащего 0,1% SDS и ингибиторы протеаз (Roche, Sigma). Клеточные лизаты подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин. в ультразвуковом аппарате Bioruptor (Diagenode), и концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белков ВСА (Pierce Biotechnology, Inc.). Белковые лизаты растворяли в буфере для образца для SDS-PAGE, разделяли в восстановительных условиях в 4-15% гелях с Tris-HCl (Bio-Rad) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя первичные антитела: антитело кролика к Dnmt3a (Santa Cruz, 1:500), антитело мыши к Dnmt1 (Novus Biologicals, 1:800), антитело кролика к Mecp2 (Millipore, 1:400), антитело кролика к тубулину (Cell Signaling, 1:10000), а затем вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика, конъюгированные с HRP (Sigma-Aldrich, 1:10000). GAPDH непосредственно визуализировали с помощью антитела кролика к GAPDH, соединенного с HRP (Cell Signaling, 1:10000). Тубулин или GAPDH служил в качестве контроля загрузки. Блоты визуализировали с помощью системы ChemiDoc™ MP с программным обеспечением ImageLab 4.1 (BioRad) и количественно определяли с применением программного обеспечения ImageJ 1.48h.

Выработка контекстного условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха с задержкой (DCFC): Через 8 недель после билатеральной доставки 3×sgRNA для Cas9/DNMT в дорсальную и вентральную части зубчатой извилины самцов мышей C57BL/6N в возрасте 12 недель обеспечивали привыкание животных к экспериментатору и комнате для изучения поведения в течение 7 дней. Однопометники, которым инъецировали Cas9/GFP-KASH, служили в качестве контролей. В день 1 анализа DCFC клетки с мышами помещали в изолированный тамбур для предотвращения получения мышами звуковых сигналов до и после тестирования. Отдельных мышей помещали в камеру для изучения FC (Med Associates Inc.) и оставляли на период привыкания длительностью 12 мин. После привыкания мышей помещали обратно в их домашние клетки. На следующий день (тренировочный день) отдельных мышей помещали в камеру и оставляли для привыкания в течение 4 мин. По истечении еще одного интервала длительностью 20 с (до подачи звука) подавали звук (звуковой сигнал) на уровне 85 дБ, 2,8 кГц, в течение 20 с с последующим интервалом задержки длительностью 18 с перед подачей электроболевого раздражения на лапы (0,5 мА, 2 с). После подачи электроболевого раздражения на лапы интервал длительностью 40 с (после подачи звука/электроболевого раздражения) предшествовал следующему идентичному испытанию, начинавшемуся с периода до подачи звука длительностью 20 с. Тренировочное испытание повторяли 6 раз перед тем, как мышей помещали обратно в их домашние клетки. В день 3 (день тестирования) мышей вначале помещали в камеру для выработки контекстного условного рефлекса на 3 мин. Затем мышей подвергали 4х тестовым испытаниям длительностью 100 с, начинавшимся с интервала длительностью 20 с, за которым следовала подача звука длительностью 20 с и интервал после подачи звука длительностью 60 с. Наконец, мышей помещали в камеру выработки условного рефлекса в измененном контексте (сплошной пол в отличие от сетчатого, тетрамерная камера в отличие от гептамерной, аромат ванилина) и тестовое испытание повторяли. Регистрировали замирание, и анализировали вручную в режиме оффлайн и подтверждали с помощью программного обеспечения Noldus EthoVision XT (Noldus Information Technology).

Анализ по методу глубокого секвенирования и выявление вставок/делеций Инструмент для конструирования CRISPR (доступен на веб-сайте crispr.mit.edu/) применяли для обнаружения потенциальных нецелевых мишеней для генов семейства DNMT, на которые целенаправленно воздействовали CRISPR-Cas9 в головном мозге. Подвергнутые целенаправленному воздействию клеточные ядра из зубчатой извилины сортировали путем FACS через 12 недель после вирусной доставки и геномную ДНК очищали, как описано выше. Для каждого гена, представляющего интерес, участок генома, фланкирующий целевой сайт для CRISPR, амплифицировали с помощью способа ПЦР с перекрывающимися праймерами для прикрепления адаптеров Illumina Р5, а также уникальных специфичных для образца штрих-кодов к целевым ампликонам (что касается праймеров для целевых и нецелевых локусов, см. таблицу 4). Очищенные образцы ДНК со штрих-кодами количественно определяли с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Life Technologies) и объединяли в эквимолярном соотношении. Библиотеки для секвенирования затем секвенировали с использованием персонального секвенатора Illumina MiSeq (Life Technologies) при длине ридов 300 п.о.

Риды MiSeq анализировали, как описано ранее в. Вкратце, риды фильтровали по качеству Phred (баллу Q) и выравнивали с применением алгоритма Смита-Ватермана с участком генома, включающим в себя 50 нуклеотидов выше и ниже целевого сайта. Вставки/делеции оценивали в выровненном участке от 5 нуклеотидов выше до 5 нуклеотидов ниже целевого сайта (в общей сложности 30 п.о.). Отрицательные контроли для каждого образца применяли для оценки включения или исключения вставок/делеций как предполагаемых событий разрезания. Заявители рассчитали оценку максимального правдоподобия (MLE) для доли ридов, имеющих целевые участки с истинными вставками/делециями, с использованием частоты появления ошибок на целевой участок на рид из данных об отрицательном контрольном образце. Баллы MLE и показатели разрезания для каждой мишени перечислены в таблице 2.

Статистический анализ: Все эксперименты проводили по меньшей мере в двух независимых биологических повторностях. Статистические вычисления производили с помощью Prism6 (GraphPad) с применением двустороннего t-критерия Стьюдента.

Для дальнейшего определения характеристик CRISPR в головном мозге заявители тестировали эффекты токсичности с применением окраски TUNEL для апоптических клеток и стандартной гистологии (например, окраски гематоксилином). Для тестирования эффективности модификации нескольких локусов более подробным способом заявители затем отсортировавывали GFP-положительные одиночные клетки и анализировали эффективность модификации на клетку с применением секвенирования нового поколения.

Заявители характеризовали эффекты нокдауна Mecp2 в головном мозге с помощью физиологического фенотипа подвергнутых целенаправленному воздействию клеток в коре с применением пэтч-клампа in vivo при использовании двухфотонного микроскопа. Для понимания эффектов нокдауна Mecp2 в головном мозге взрослых особей заявители анализировали транскриптом подвергнутых воздействию клеток in vivo. Интересные гены-кандидаты будут отобраны для последующих исследований.

Для эффективной очистки/визуализации клеток, подвергнутых целенаправленному воздействию с помощью обоих компонентов системы (Cas9 и sgRNA) заявители сконструировали усеченный вариант Cas9, объединенный с усеченным вариантом GFP, который воспроизводится только, когда оба AAV находятся в одной клетке. Наконец, заявители проводили эксперименты, как описано в данном документе для достижения гомологичной рекомбинации в постмитотических нейронах in vitro и in vivo.

Пример 37. Генотипические и фенотипические изменения АроВ, наблюдаемые in vivo в случае применения направляющих последовательностей и SaCas9, доставляемых внутривенно в печень с помощью вектора на основе AAV и печеночноспецифического промотора для Cas9

В этом примере, помимо прочего, представлены следующие положения.

AAV2/8 представляет собой аденовирусный вектор, нацеливающийся на печень.

TBG представляет собой печеночноспецифический промотор и используется здесь для управления экспрессией SaCas9.

U6 используется здесь для управления экспрессией sgRNA (направляющей).

АроВ представляет собой ген, участвующий в метаболизме липидов. Можно сказать, что он является "золотым стандартом" в доставке в печень и широко применяется в мышиных моделях ожирения.

"Мишень 1 - мишень 4" означает, что в АроВ были выбраны 4 мишени, из которых мишени 1 и три (Т1 и Т3) являлись наиболее полезными.

Доставка посредством экспрессии с вирусного вектора, рассматриваемая здесь, является улучшением по сравнению с предложенным Anderson/Yin (NBT 2884) применением гидродинамической доставки в качестве способа доставки, поскольку для гидродинамической доставки требуется инъекция нескольких мл жидкости, что является стрессовым для организма мыши и может быть смертельным. Гидродинамическая доставка хорошо подходит для доставки плазмидной ("оголенной") ДНК, тогда как заявители показали, что упаковка направляющей последовательности и последовательности Cas9 в вирусный вектор доставки является предпочтительной с точки зрения значительно возрастающей эффективности. Более того, необходимо вводить лишь относительно небольшие объемы, и это можно выполнить внутривенно (i.v.), что, вероятно, является намного более приемлемым с терапевтической точки зрения.

Особенно обнадеживающим является то, что для гена, являющегося "золотым стандартом" в печени, такого как АроВ, наблюдали не только генотипические изменения, но регистрировали также и фенотипические изменения. Предыдущая работа с PCSK9 показала генотипические, но не фенотипические изменения, так что фенотипические изменения, наблюдаемые в случае с АроВ, подтверждают возможность доставки CRISPR в печень и ее способность к осуществлению фенотипического изменения в ней. Ее применяют в сочетании с более приемлемыми с терапевтической точки зрения способами доставки (i.v. по сравнению с гидродинамической доставкой). В связи с этим вирусная доставка CRISPR (направляющей последовательности и Cas9), особенно внутривенная, является предпочтительной.

Мишени включают: PCSK9, HMGCR, АРОВ, LDLR, ANGPTL3, F8, F9/FIX, ААТ, FAH, HPD, TAT, АТР7В, UGT1A1, ОТС, ARH.

Материалы и способы

Вирусы и параметры инъекции

Применяемые конструкции:

-AAV2/8 - TBG-SaCas9-U6-sgRNA (Apob - мишень 1 - мишень 4).

Тестирование in vitro: все индуцировали расщепление локуса Apob в клетках Нера при эффективности 10%-15%.

Результаты in vivo:

мыши - 8 недель, C57BL/6 (2 животных для каждого момента времени и 1 животное в качестве контроля дикого типа, которому инъецировали солевой раствор).

Инъекция в хвостовую вену

Объем инъекции: 100 мкл 0,8Е12 vp/мл (vp = вирусная частица)

Доставленные вирусные частицы: общее количество 0,8Е11 vp/животное

Обработка тканей и сбор данных

Обработку тканей и сбор данных проводили следующим образом:

первый момент времени ~1 неделя (8 дней). Второй момент времени ~4 недели.

После перфузии солевым раствором следовало срочное иссечение ткани печени.

(A) Половину печени помещали в условия хранения при -80°C для анализа с помощью Surveyor, qPCR и вестерн-блоттинга белков (X12 пробирок/животное).

(B) Половину печени помещали в криопротектор и подвергали мгновенной заморозке для обработки в криостате. Срезы из замороженной ткани подвергали окраске Н&Е и масляным красным.

Анализы с помощью QuickExtract и Surveyor применяли для выявления и количественной оценки вставок/делеций в 2 образцах печени для каждого животного.

Результаты

Оценка вставок/делеций in vivo

На фигурах показана оценка вставок/делеций in vivo применительно к направляющей последовательности для АроВ (мишеней) в динамике (до 4 недель после инъекции). На фигуре 56А показано, что направляющая последовательность (для мишени) 1 индуцировала самое высокое процентное значение частоты вставок/делеций в АроВ. Для мишеней 2 и 4 был показан небольшой эффект или его отсутствие в том смысле, что в них было обусловлено лишь очень незначительное образование вставок/делеций или его отсутствие, тогда как для мишени 3 была показана некоторая активность. На фигуре 56В показаны результаты анализа в геле с помощью нуклеазы Surveyor в отношении эффективности образования вставок/делеций через 4 недели после инъекции.

Можно видеть, что мишень 1 характеризуется частотой образования вставок/делеций, составляющей почти 9%, что представляет приемлемые уровни в целевом локусе.

Фенотипические изменения, наблюдаемые с 2 из 4 направляющих последовательностей, сконструированных для нацеливания

Фенотипические изменения наблюдались с двумя из трех применяемых направляющих последовательностей (мишени 1 и 3), как видно на фигуре 66, на которой показано окрашивание масляным красным для выявления фенотипа накопления липидов в печени in vivo после доставки AAV-Cas9-sgRNA. Накопление красных пятен масла, показанное на фигуре 66 слева для мишеней 1 и 3, указывает на нарушение функционирования АроВ и сравнивается с контролем справа внизу. Функционирование гена Apob было нарушено в результате индуцированного Cas9 целенаправленного расщепления генома, которое повлекло за собой данное физиологическое/фенотипическое изменение. Для мишени 2 не было показано заметного различия по сравнению с контролем, а мишень 4 не показана. Данное окрашивание масляным красным O представляет собой анализ, в котором жиры в печени визуализируют путем гистологического окрашивания. Данный краситель часто применяют в исследованиях для оценки количества жиров в печени. В клинической практике краситель масляный красный O предназначен главным образом для замороженных срезов биоптатов печени для оценки количества жира в печени при трансплантации печени и других процедурах. Что касается протокола данного аспекта примеров и информации о нем, следует упомянуть: Mehlem et al, "Imaging of neutral lipids by oil red О for analyzing the metabolic status in health and disease", Nature Protocols 8, 1149-1154 (2013); Maczuga et al., "Therapeutic expression of hairpins targeting apolipoprotein В100 induces phenotypic and transcriptome changes in murine liver", Gene Therapy (2014) 21, 60-70; Koornneef et al, "Apolipoprotein В Knockdown by AAV-delivered shRNA Lowers Plasma Cholesterol in Mice", Molecular Therapy (2011) 19 4, 731-740; Tadin-Strapps et al., "siRNA-induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL-cholesterol in a mouse model with human-like serum lipids", Journal of Lipid Research Volume 52, 1084-1097 (2011). Масштабная метка на фигуре 66 представляет собой 20 микронов.

Пример 38. Эксперименты по оптимизации SaCas9

В исследования было включено следующее:

оптимизация длины направляющей последовательности;

тестирование интрона;

промотора H1;

тестирование двойной никазы D10A;

дополнительное тестирование длины/DN.

Тестирование длины направляющей последовательности для SaCas9. Для определения длины направляющей sgRNA: 20 п.о. в сравнении с 21 и 22 п.о., а также эффекта 'G' в начале (на 5'-конце) направляющей последовательности. В данном эксперименте

целевые сайты

A1: AAVS1

E1: ЕМХ1

T1, Т2, …: нумерация целевых сайтов

TGC, GTC, …: состав оснований в положениях нуклеотидов 23, 22, 21 от 5'-конца РАМ

Эксперимент в данном примере проводят следующим образом. 1. Выбирают мишени с помощью NNGRR в качестве РАМ в двух генах, представляющих интерес, AAVS1 и ЕМХ1. 2. Синтезируют олигонуклеотиды, соответствующие мишеням, но варьируют длину части sgRNA, являющейся направляющей последовательностью, от 20 до 21 и до 22. 3. Применяют олигонуклеотиды для создания кассеты экспрессии sgRNA и вводят в линию клеток НЕK 293 FT путем совместной трансфекции с плазмидами, экспрессирующими белок SaCas9. 4. Через 72 часа после трансфекции клетки собирают и затем анализируют посредством анализа с помощью Surveyor для выявления вставок/делеций. 5. Частоту образования вставок/делеций, индуцированных Cas9, затем подсчитывают и настоящим обобщают на фигурах.

На фигуре 67 показано, что оптимальной длиной спейсера является 21 нуклеотид (нт)/пара оснований (п.о.), представленные серыми прямоугольниками, по сравнению по меньшей мере с 20 или 22 парами оснований (представленными черными и белыми прямоугольниками, соответственно) среди ряда мишеней в пределах двух различных генов (AAVS1 и ЕМХ1). Мишени и гены не считаются важными, а лишь иллюстративными. В связи с этим 21 нуклеотид или пара оснований, по-видимому, являются оптимальными для приемлемой длины, особенно в случае или применительно к SaCas9. На фигуре 67 также показано, что нуклеотид G на 5'-конце направляющей/целевой последовательности может быть преимущественным, например, для промотора U6. Оптимальная длина направляющей последовательности может быть специфической для каждого белка Cas9. Например, для SpCas9 оптимальная длина направляющей последовательности может составлять 19-20 нт. Таким образом, данный пример демонстрирует, как можно определить и использовать оптимальную длину направляющей последовательности.

Тестирование интрона

Задачей данного эксперимента являлось тестирование того, можно ли направляющую последовательность встроить в интронную последовательность Cas9.

Применяли следующую конструкцию. Отмечено наличие направляющей РНК (sgRNA) в интроне (между N'- и С'-концевым экзонами Cas9).

CMV-SaCas9(N-конец)-интрон(sgRNA)-SaCas9(C-конец)

Конструкция экспрессировалась в клетках Нера.

Каждый интрон тестировали с 2 различными направляющими последовательностями: sgRNA для Pcsk9 и Hmgcr.

Показано в общей сложности 9 конструкций: три на основе EBV1, три на основе EBV2 и три на основе ADV:

- дорожки 1-3: показан EBV1-152 (на основе EBV, интрон 1 размером 152 п.о. из генома EBV)

- дорожки 4-6: показан EBV2 (на основе EBV, интрон из повтора W генома EBV)

- дорожки 7-9: показан ADV (аденовирусный интрон, происхождение аналогично описанному в Kiani et al., "CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells", Nature Methods doi: 10.1038/nmeth.2969, опубликовано в режиме онлайн 5 мая 2014 г., и Nissim et al, "Multiplexed and Programmable Regulation of Gene Networks with an Integrated RNA and CRISPR/Cas Toolkit in Human Cells", Volume 54, Issue 4, p. 698-710, 22 мая 2014 г.; DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2014.04.022).

В каждой группе конструирования три конструкции соответствуют трем различным сайтам встраивания sgRNA в интроне.

Конструкция 3 на основе ADV

Результаты показаны на фигуре 68. Данные результаты обеспечивают подтверждение принципа, что успешная упаковка направляющей последовательности в интрон SaCas9 является определенно возможной. sgRNA, несущую направляющую последовательность, встраивают в синтетический интрон, происходящий из аденовируса, и затем эту полную кассету интрон-sgRNA встраивают в ген SaCas9. Интроны можно встраивать в любом месте в гене SaCas9 без значительного нарушения нормальной экспрессии белка SaCas9. Несколько интронов с sgRNA можно встраивать в различные положения в гене SaCas9. Размещение является гибким, а данный широкий подход является преимущественным и включает следующие два пути:

Сведение размера к минимуму позволяет снизить общее количество п.о. или нуклеотидов в конструкции.

Мультиплексирование позволяет достичь более высоких степеней мультиплексирования (совместная доставка нескольких направляющих последовательностей), поскольку вопрос 'пространства' здесь также всегда является проблемным. Поскольку для направляющих последовательностей не обязательно нужен специфический промотор, одна или несколько направляющих последовательностей могут быть упакованы аналогичным образом в интрон Cas9.

В вышеприведенном тексте используется форма единственного/множественного числа, поскольку, как обсуждается выше, в Cas9 может быть введен ряд синтетических интронов. Может быть преимущественным встраивание sgRNA в положение, близкое к 5'-концу интрона, но находящееся на расстоянии по меньшей мере 5-15 п.о. от него, а также перед точкой ветвления интрона. Некоторую часть спейсерной последовательности в интроне между 5'-концевым донорным сайтом сплайсинга и точкой ветвления в середине интрона можно удалить, если специалист в данной области захочет это сделать. То, что это было достигнуто с Cas9, в частности, с SaCas9, может быть неожиданным, в том числе потому, что структура sgRNA различается между Sa и Sp.

На данный момент ADV является предпочтительным, но данный подход имеет широкую применимость среди ряда вирусов и Cas9 (Sa, Sp и т.д.).

Тестирования промотора H1

Задачей данного эксперимента являлось исследование промоторов, альтернативных промотору U6.

А) H1 полной длины

Получали следующие конструкции:

CMV-SaCas9 с исходным промотором H1, управляющим одной sgRNA (Pcsk9-мишень 201 либо Hmgcr-новая мишень 5)

Как можно видеть на фигуре 69, промотор H1 полной длины (серый прямоугольник) все же является более слабым, чем промотор U6 (черный прямоугольник), поскольку U6 демонстрирует повышенное процентное значение частоты образования вставок/делеций для каждой тестируемой мишени.

В) Тестирование двойного промотора H1 (короткого Hl)

Получали следующие конструкции:

TBG-SaCas9 с двумя короткими промоторами H1, управляющими двумя sgRNA (Pcsk9-мишень 201 и Hmgcr-новая мишень 5), при этом двойной короткий промотор H1 применяется в одинаковой ориентации и в противоположных ориентациях.

Как можно видеть на фигуре 70, короткий промотор H1 является более слабым, чем промотор H1 полной длины.

Тестирование никазы SaCas9 (с использованием мутанта D10A)

В данном эксперименте рассматривали расстояние между 5'-концами двух направляющих последовательностей в конструкции и затем измеряли его применительно к эффективности расщепления двойной никазой SaCas9 D10A. Мишени относились к гену ААТ1 человека. Эти тестирования проводили с направляющими последовательностями размером 20 п.о. +G, клонированными в плазмиды.

Оптимальные результаты демонстрировались от -5 до +1 п.о. (от 5' до 5'), смотри фигуру 71.

Пример 39. Исследование функций генов in vivo в головном мозге млекопитающих с использованием CRISPR-Cas9

В данной работе представлены следующие основные положения:

первая демонстрация успешной опосредованной AAV доставки Cas9 in vivo, а также эффективной модификации генома в постмитотических нейронах;

разработка методики мечения ядер, позволяющей осуществлять простое выделение ядер нейронов из клеток, экспрессирующих Cas9 и sgRNA;

демонстрация применения анализа транскриптома нейрона путем секвенирования РНК;

объединение электрофизиологических исследований с опосредованным Cas9 внесением изменений в геном; и,

а также демонстрация мультиплексного целенаправленного воздействия и возможности изучения функций генов, в отношении поведения грызунов с помощью опосредованного Cas9 редактирования генома.

Трансгенные животные модели, несущие ассоциированные с заболеваниями мутации, являются чрезвычайно полезными для изучения неврологических нарушений, содействуя выяснению генетического и патофизиологического механизма заболевания¹. Однако создание животных моделей, несущих одиночные или множественные генные модификации, является особенно трудоемким и требует продолжительной селекции в течение многих поколений. Поэтому для облегчения быстрого анализа функций генов в нормальных и связанных с заболеваниями процессах в головном мозге заявителям потребовалась возможность осуществления точных и эффективных манипуляций с геномом нейронов in vivo. Было показано, что CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) опосредует точное и эффективное расщепление генома в одном или нескольких генах в эукариотических клетках с реплицирующимся геномом, что приводит к мутациям сдвига рамки считывания по типу вставок или делеций (вставок/делеций)^{2, 3}. В данной работе авторы настоящего изобретения объединили опосредованное Cas9 внесение изменений в геном со регистрацией биохимических, относящихся к секвенированию, электрофизиологических и поведенческих показателей для изучения функций отдельных генов, а также их групп в нервных процессах и их роли в мозговых нарушениях in vivo.

Обсуждение

Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) широко применяются для доставки рекомбинантных генов в головной мозг мыши⁴. Основным ограничением системы AAV является ее небольшая емкость упаковки, не превосходящая примерно 4,5 т.п.о. без ITR⁵, что ограничивает количество генетического материала, которое можно упаковать в одиночный вектор. Поскольку размер SpCas9⁶ уже составляет 4,2 т.п.о., что оставляет менее 0,3 т.п.о. для других генетических элементов в одиночном векторе на основе AAV, заявители разработали двухвекторную систему, в которой кассеты экспрессии SpCas9 (AAV-SpCas9) и sgRNA (AAV-Sp-направляющая последовательность) упакованы в двух отдельных вирусных векторах (фигура 72). При конструировании вектора AAV-SpCas9 заявители сравнивали различные короткие нейрон-специфичные промоторы, а также сигналы полиаденилирования для оптимизации экспрессии SpCas9. Для получения конечной конструкции, разработанной заявителями, заявители выбрали промотор Mecp2 мыши (235 и.о., рMecp2)⁷ и минимальный сигнал полиаденилирования (48 п.о., spA)⁸ на основании их способности к обеспечению достаточных уровней экспрессии SpCas9 в культивируемых первичных кортикальных нейронах мыши (фигура 76-с). Для облегчения иммунофлуоресцентной идентификации нейронов, экспрессирующих SpCas9, заявители метили SpCas9 эпитопной НА-меткой. Заявители упаковывали в вектор AAV-Sp-направляющая последовательность кассету экспрессии U6-sgRNA, а также зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с ядерным трансмембранным доменом KASH⁹, под управлением промотора гена синапсина I человека (фигура 72а). Белок слияния GFP-KASH направляет GFP во внешнюю ядерную мембрану (фигура 76с, d) и обеспечивает флуоресцентную идентификацию и очистку интактных ядер нейронов, трансдуцированных вектором AAV-Sp-направляющая последовательность.

Для тестирования эффективности доставки двухвекторной системой доставки, разработанной заявителями, заявители вначале трансдуцировали культивируемые первичные кортикальные нейроны мыши in vitro и наблюдали устойчивую экспрессию при помощи векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность (фигура 76с) с более чем 80% эффективностью совместной трансдукции (фигура 76е). Важно, что в сравнении с нетрансдуцированными нейронами экспрессия SpCas9 не оказывала отрицательное влияние на морфологические характеристики и выживаемость трансдуцированных нейронов (фигура 76с, f).

Создав эффективную систему доставки, затем заявители стремились протестировать опосредованное SpCas9 редактирование генома в первичных нейронах мыши. Хотя SpCas9 применялся для достижения эффективных модификаций генома в разнообразных типах делящихся клеток, оставалось неясно, можно ли применять SpCas9 для осуществления эффективного редактирования генома в постмитотических нейронах. Для первоначального тестирования, разработанного заявителями, заявители целенаправленно воздействовали на ген Mecp2, играющий важнейшую роль при синдроме Ретта¹⁰, типе расстройства аутистического спектра. Белок МеСР2 повсеместно экспрессируется в нейронах во всем головном мозге, но практически отсутствует в глиальных клетках^{11, 12}, и было показано, что его недостаточность ассоциирована с тяжелыми морфологическим и электрофизиологическим фенотипами в нейронах, оба из которых, как полагают, вносят вклад в неврологические симптомы, наблюдаемые у пациентов с синдромом Ретта^13-16. Для целенаправленного воздействия на Mecp2 вначале заявители разработали несколько sgRNA, осуществляющих нацеливание на экзон 3 гена Mecp2 мыши (фигура 77а), и оценивали их эффективность с применением клеток Neuro-2а. Наиболее эффективную sgRNA идентифицировали путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR (фигура 77b). Заявители выбрали наиболее эффективную sgRNA (Mecp2, мишень 5) для последующих экспериментов по нацеливанию на Mecp2 in vitro и in vivo.

Для оценки эффективности редактирования двухвекторной системой, разработанной заявителями, в нейронах заявители трансдуцировали первичные кортикальные нейроны мыши на 7 день in vitro (7 DIV, фигура 78а) и измеряли частоту вставок/делеций путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR через 7 дней после трансдукции (фигура 78b). Следует отметить, что в культуре нейронов, совместно трансдуцированных векторами AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность, нацеливающимися на Mecp2, продемонстрировано снижение уровней белка МеСР2 по сравнению с контрольными нейронами, составляющее до 80% (фигура 78с, d). Одно возможное объяснение наблюдаемого несоответствия между относительно низкой частотой вставок/делеций (~14%) и сильным истощением запасов белка (~80%) может заключаться в том, что связывание SpCas9 с целевым сайтом попросту может препятствовать транскрипции, что было показано для Е. coli^{17, 18}_ENREF_15. Заявители исследовали данную вероятность с использованием мутантного SpCas9 с инактивированными каталитическими доменами как RuvC, так и HNH^{19, 20} (D10A и Н840А, dSpCas9). Совместная экспрессия dSpCas9 и sgRNA, осуществляющей нацеливание на Mecp2, не снижала уровни белка МеСР2 (фигура 78а, d), что позволяет предположить, что наблюдаемое понижение уровня МеСР2 в присутствии активного SpCas9 обусловлено наличием модификации в локусе Mecp2. Другое возможное объяснение несоответствия между низким уровнем выявляемых вставок/делеций и высоким уровнем истощения запасов белка может быть обусловлено недооценкой истинной частоты вставок/делеций в анализе с помощью нуклеазы SURVEYOR - ранее было показано, что точность выявления с помощью SURVEYOR является чувствительной к составу последовательности вставки/делеции.²¹

Ранее было показано, что мутация потери функции МеСР2 ассоциирована с аномалиями дендритного дерева и дефектами морфогенеза шипиков в нейронах^{14, 16}. Эти фенотипы недостаточности МеСР2 также воспроизводились в нейронах, дифференцированных из iPS-клеток с МеСР-KО¹⁵. Поэтому заявители исследовали, может ли опосредованное SpCas9 истощение запасов МеСР2 в нейронах аналогичным образом воспроизводить морфологические фенотипы синдрома Ретта. В действительности нейроны, в которых совместно экспрессировались SpCas9 и sgRNA, осуществляющая нацеливание на Mecp2, проявляли измененную морфологию дендритного дерева и плотность шипиков по сравнению с контрольными нейронами (фигура 79). Эти результаты демонстрируют, что SpCas9 также можно применять для облегчения изучения функций генов в клеточных анализах путем обеспечения целенаправленного нокаута в постмитотических нейронах.

С учетом сложности нервной системы, состоящей из разветвленных сетей разнородных типов клеток, способность к эффективному редактированию генома нейронов in vivo позволит осуществлять прямое тестирование функций генов в надлежащих типах клеток, погруженных в естественный контекст. В связи с этим заявители производили стереотаксическую инъекцию смеси (в соотношении 1:1) векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность с высоким титром в зубчатую извилину гиппокампа взрослых мышей. Заявители наблюдали высокую эффективность совместной трансдукции обоих векторов (более 80%) в гранулярных клетках гиппокампа через 4 недели после инъекции вируса (фигура 72b, с), приводившей к модификациям генома в локусе Mecp2 (Фигура 72d). Путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR заявители выявили ~13% частоту вставок/делеций в пункциях головного мозга, полученных из инъецированных участков головного мозга (фигура 72е). Аналогично результатам, полученным заявителями для культивируемых первичных нейронов, опосредованное SpCas9 разрезание локуса Mecp2 эффективно снижало уровни белка МеСР2 более чем на 60% (фигура 72f). Дополнительно, количество МеСР2-положительных ядер в зубчатой извилине уменьшалось более чем на 75% в случае инъекции векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность по сравнению с AAV-SpCas9 в отдельности (фигура 72g-h). Эти результаты позволяют предположить, что SpCas9 можно применять для непосредственного внесения изменений в конкретные гены в неизмененном биологическом контексте.

Целенаправленное внесение изменений в геном можно сочетать с регистрацией количественных показателей для обеспечения проникновения в сущность биологических функций конкретных элементов генома. Для облегчения анализа клеток, трансдуцированных векторами AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность, заявители разработали способ очистки ядер, меченных GFP-KASH, с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) (фигура 73а). Отсортированные ядра можно непосредственно применять для очистки ядерной ДНК и РНК для последующего биохимического анализа или секвенирования. При помощи секвенирования по Сэнгеру заявители обнаружили, что 13 из 14 отдельных GFP-положительных ядер содержали мутацию по типу вставки/делеции в целевом сайте для sgRNA.

В дополнение к секвенированию геномной ДНК, очищенные GFP-положительные ядра также можно применять для анализа путем секвенирования РНК для изучения транскрипционных последствий истощения запасов МеСР2 (фигура 73b и фигура 80). Для тестирования эффекта нокаута Mecp2 в отношении транскрипции в нейронах зубчатой извилины заявители подготовили библиотеки для секвенирования РНК с использованием очищенных с помощью FACS GFP⁺ ядер от животных, получавших AAV-SpCas9, а также либо контрольную sgRNA, сконструированную для нацеливания на бактериальный ген lacZ, а не на геном мыши, либо sgRNA, осуществляющую нацеливание на Mecp2. Все sgRNA были оптимизированы для сведения к минимуму показателя их нецелевой активности (инструмент для конструирования CRISPR: http://tools.genome-engineering.org)². Заявители смогли обнаружить гены, дифференциально экспрессируемые (фигура 70b) у контрольных и экспрессирующих sgRNA для Mecp2 ядер (p<0,01). Заявители идентифицировали несколько интересных кандидатов среди генов, экспрессия которых была понижена в ядрах, экспрессирующих sgRNA для Mecp2: Нрса, Olfm1 и Ncdn, о которых ранее сообщалось, что они играют важные роли в формах поведения при обучении^22-24; и Cplx2, который, как было показано, вовлечен в высвобождение из синаптических пузырьков и связан с частотой спайковых разрядов нейронов^{25, 26}. Данные результаты демонстрируют, что комбинация опосредованного SpCas9 внесения изменений в геном и анализа путем секвенирования РНК на популяционном уровне дает возможность охарактеризовать регуляцию транскрипции в нейронах и предположить, какие гены могут быть важными для конкретных функций или болезненных процессов в нейронах.

Опосредованное SpCas9 редактирование генома в головном мозге in vivo можно также сочетать с электрофизиологической регистрацией для изучения эффекта от внесения изменений в геном в отношении конкретных типов клеток или компонентов нервной цепи. Для изучения функционального эффекта истощения запасов МеСР2 в отношении физиологических характеристик нейронов заявители производили стереотаксическую совместную доставку векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность, нацеливающихся на Mecp2, в поверхностный слой первичной зрительной коры (V1) самцов мышей. V1 была выбрана по той причине, что кортикальные возбуждающие нейроны поверхностного слоя являются более доступными для двухфотонной визуализации и целевой регистрации потенциалов на основе использования двухфотонной визуализации. Через две недели после доставки SpCas9 мышей подвергали околоклеточной регистрации потенциалов на основе использования двухфотонной визуализации (фигура 74) для сравнения электрофизиологической реакции KASH-GFP⁺ нейронов и соседних GFP^- нейронов в слоях 2/3 V1 мыши (фигура 72а-с). Заявители измеряли реакции нейронов на 18 решеток, смещающихся с шагом в 20 градусов, и рассчитывали частоту вызванных спайковых разрядов (FR) и индекс ориентационной избирательности (OSI) клеток путем векторного усреднения реакции. Как FR, так и OSI были значительно снижены у возбуждающих GFP⁺ нейронов с нокаутом МеСР2 по сравнению с соседними возбуждающими GFP^- нейронами (фигура 73d-e). Для сравнения, экспрессия контрольной sgRNA вместе с SpCas9 не оказывала какого-либо эффекта на FR и OSI по сравнению с соседними неинфицированными нейронами (фигура 73d-e). Эти результаты показывают, что опосредованное SpCas9 истощение запасов МеСР2 в зрелых кортикальных нейронах V1 изменяет свойства зрительных реакций возбуждающих нейронов in vivo в течение двух недель, и дополнительно демонстрируют универсальность SpCas9 в облегчении целенаправленного нокаута генов в головном мозге млекопитающих in vivo для изучения функций генов и анализа нейронных цепей.

Одним из ключевых преимуществ системы SpCas9 является ее способность к содействию мультиплексному редактированию генома². Введение стабильных нокаутов нескольких генов в головном мозге живых животных будет иметь потенциально многообещающие применения, такие как каузальное исследование полигенных механизмов, лежащих в основе физиологических и невропатологических состояний. Для тестирования возможности мультиплексного редактирования генома в головном мозге заявители разработали мультиплексный вектор экспрессии sgRNA, состоящий из трех последовательно расположенных sgRNA вместе с GFP-KASH для мечения ядер (фигура 74а). Заявители выбрали sgRNA, осуществляющие нацеливание на семейство генов ДНК-метилтрансфераз (DNMT), состоящее из Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b. Dnmt1 и 3а характеризуются высоким уровнем экспрессии в головном мозге взрослых животных, и ранее было показано, что активность DNMT изменяет состояние метилирования ДНК и что как Dnmt3a, так и Dnmt1 необходимы для синаптической пластичности, а также обучения и формирования памяти²⁷. Заявители сконструировали индивидуальные sgRNA, направленные на Dnmt3a и Dnmt1, с высокой эффективностью модификации. Во избежание любых возможных компенсаторных эффектов со стороны Dnmt3b заявители решили также дополнительно целенаправленно воздействовать на этот ген, даже несмотря на то, что он экспрессируется главным образом во время развития нервной системы ²⁷. Наконец, заявители выбрали индивидуальные sgRNA для высокоэффективного одновременного расщепления ДНК во всех трех генах, которые подвеграют целенаправленному воздействию (фигура 75b и фигура 81).

Для тестирования эффективности мультиплексного редактирования генома in vivo заявители производили стереотаксическую доставку смеси векторов AAV-SpCas9 и AAV-Sp-направляющая последовательность с высоким титром в дорсальную и вентральную части зубчатой извилины взрослых самцов мышей. Через 4 недели гиппокампы вырезали, и подвергнутые целенаправленному воздействию клеточные ядра сортировали посредством FACS. Заявители выявили ~19% (Dnmt3a), 18% (Dnmt1) и 4% (Dnmt3b) частоту вставок/делеций в группе отсортированных ядер путем использования анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR (фигура 75с) и секвенирования (фигура 82). Целенаправленное воздействие на несколько локусов ставит вопрос об эффективной частоте множественных нокаутов в отдельных клетках. Путем использования сортировки отдельных ядер в комбинации с целенаправленным секвенированием заявители количественно определяли одновременное целенаправленное воздействие на несколько локусов DNMT в индивидуальных ядрах нейронов (фигура 75d). Среди ядер нейронов, несущих модификацию по меньшей мере в одном локусе Dnmt, более чем 70% ядер содержали вставки/делеции как в Dnmt3a, так и в Dnmtl (~40% содержали вставки/делеции во всех 3 локусах и ~30% в обоих локусах Dnmt3a и Dnmt1). Эти результаты согласуются с уровнями истощения запасов белков Dnmt3a и Dnmt1 в зубчатой извилине (фигура 75е). Ввиду низкой экспрессии Dnmt3b в головном мозге взрослых животных заявители не смогли выявить белок Dnmt3b.

Недавние исследования с SpCas9 показали, что, хотя каждое основание в последовательности sgRNA из 20 нт вносит вклад в общую специфичность, в локусах генома, частично совпадающих с sgRNA, может быть происходить образование нецелевых двухнитевых разрывов и вставок/делеций^{28, 29}. Для оценки частоты нецелевых модификаций заявители путем вычислений определили перечень целевых сайтов генома с высокой степенью сходства² и количественно определили частоту модификаций с помощью ценаправленного глубокого секвенирования. Анализ вставок/делеций в главных предсказанных нецелевых локусах выявил частоту образования вставок/делеций, составляющую 0-1,6%, что демонстрировало специфичность модификации с помощью SpCas9 (дополнительная таблица 1). Для повышения специфичности опосредованного SpCas9 редактирования генома in vivo в будущих исследованиях можно применять стратегии сведения к минимуму нецелевых эффектов, такие как внесение двойных однонитевых разрывов^{30, 31} и применение усеченных sgRNA²⁸.

Ранее было показано, что нокдаун Dnmt3a и Dnmt1 влияет на формирование гиппокамп-зависимой памяти²⁷. В связи с этим заявители проводили тестирование поведения при выработке контекстного условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха для исследования эффекта опосредованного SpCas9 тройного нокаута (Dnmt3a, Dnmt1 и Dnmt3b) на запоминание и консолидацию памяти. Хотя заявители не наблюдали каких-либо различий между контрольными мышами и мышами с тройным нокаутом в фазе запоминания, нокаутные мыши продемонстрировали ухудшенную консолидацию памяти при тестировании в условиях тренировочного контекста (фигура 75f). Данный эффект устранялся при тестировании мышей в измененном контексте. Результаты заявителей демонстрируют, что опосредованный CRISPR-Cas9 нокаут представителей семейства DNMT в нейронах зубчатой извилины является достаточным для изучения функций генов в поведенческих задачах.

В совокупности результаты завителей демонстрируют, что опосредованная AAV доставка SpCas9 и sgRNA in vivo обеспечивает быструю и эффективную технологию осуществления внесения точных изменений в геном в интактных нервных цепях. При том, что SpCas9 широко применялся в генной инженерии делящихся клеток, заявители продемонстрировали, что SpCas9 также можно применять для геномной инженерии постмитотических нейронов с высокой эффективностью посредством опосредованного NHEJ образования вставок/делеций. Опосредованное SpCas9 внесение изменений в геном можно объединять с биохимическим, секвенирующим, электрофизиологическим и поведенческим анализом для изучения функций элемента генома, который подвергают целенаправленному воздействию. Заявители продемонстрировали, что при опосредованном SpCas9 целенаправленном воздействии на один или несколько генов, как правило, могут воспроизводиться морфологические, электрофизиологические и поведенческие фенотипы, наблюдаемые при применении классических, более трудоемких генетических мышиных моделей. В настоящем исследовании использовали Cas9 Streptococcus pyogenes, который не только требует применения векторов на основе AAV, но также и ограничивает размер промоторных элементов, которые можно применять для осуществления целенаправленного воздействия, специфичного к типу клеток. С учетом разнообразия ортологов Cas9, некоторые из которых являются значительно более короткими, чем SpCas9^{2, 32, 33}, может быть возможным конструирование одиночных векторов на основе AAV, экспрессирующих как Cas9, так и sgRNA, как описано в данном документе.

ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Nestler, E.J. & Hyman, S.E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nat Neurosci 13, 1161-1169 (2010).

2. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013).

3. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).

4. Burger, C., Nash, K. & Mandel, R.J. Recombinant adeno-associated viral vectors in the nervous system. Hum Gene Ther 16, 781-791 (2005).

5. Wu, Z., Yang, H. & Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. MolTher 18, 80-86 (2010).

6. Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).

7. Gray, S.J. et al. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum Gene Ther 22, 1143-1153 (2011).

8. Levitt, N., Briggs, D., Gil, A. & Proudfoot, N.J. Definition of an efficient synthetic poly(A) site. Genes Dev 3, 1019-1025 (1989).

9. Ostlund, C. et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci 122, 4099-4108 (2009).

10. Chahrour, M. & Zoghbi, H.Y. The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron 56, 422-437 (2007).

11. Kishi, N. & Macklis, J.D. MECP2 is progressively expressed in post-migratory neurons and is involved in neuronal maturation rather than cell fate decisions. Molecular and cellular neurosciences 27, 306-321 (2004).

12. Skene, P.J. et al. Neuronal MeCP2 is expressed at near histone-octamer levels and globally alters the chromatin state. Molecular cell 37, 457-468 (2010).

13. Chen, R.Z., Akbarian, S., Tudor, M. & Jaenisch, R. Deficiency of methyl-CpG binding protein-2 in CNS neurons results in a Rett-like phenotype in mice. Nat Genet 27, 327-331 (2001).

14. Zhou, Z. et al. Brain-specific phosphorylation of MeCP2 regulates activity-dependent Bdnf transcription, dendritic growth, and spine maturation. Neuron 52, 255-269 (2006).

15. Li, Y. et al. Global transcriptional and translational repression in human-embryonic-stem-cell-derived Rett syndrome neurons. Cell Stem Cell 13, 446-458 (2013).

16. Nguyen, M.V. et al. MeCP2 is critical for maintaining mature neuronal networks and global brain anatomy during late stages of postnatal brain development and in the mature adult brain. J Neurosci 32, 10021-10034 (2012).

17. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013).

18. Qi, L.S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).

19. Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011).

20. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).

21. Qiu, P. et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. BioTechniques 36, 702-707 (2004).

22. Kobayashi, M. et al. Hippocalcin-deficient mice display a defect in cAMP response element-binding protein activation associated with impaired spatial and associative memory. Neuroscience 133, 471-484 (2005).

23. Dateki, M. et al. Neurochondrin negatively regulates CaMKII phosphorylation, and nervous system-specific gene disruption results in epileptic seizure. The Journal of biological chemistry 280, 20503-20508 (2005).

24. Nakaya, N. et al. Deletion in the N-terminal half of olfactomedin 1 modifies its interaction with synaptic proteins and causes brain dystrophy and abnormal behavior in mice. Experimental neurology 250, 205-218 (2013).

25. Reim, K. et al. Complexins regulate a late step in Ca2+-dependent neurotransmitter release. Cell 104, 71-81 (2001).

26. Edwardson, J.M. et al. Expression of mutant huntingtin blocks exocytosis in PC12 cells by depletion of complexin II. The Journal of biological chemistry 278, 30849-30853 (2003).

27. Feng, J. et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nat Neurosci 13, 423-430 (2010).

28. Fu, Y. et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology 31, 822-826 (2013).

29. Hsu, P.D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827-832 (2013).

30. Ran, F.A. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 154, 1380-1389 (2013).

31. Mali, P. et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature biotechnology 31, 833-838 (2013).

32. Esvelt, K.M. & Wang, H.H. Genome-scale engineering for systems and synthetic biology. Molecular systems biology 9, 641 (2013).

33. Li, W., Teng, F., Li, T. & Zhou, Q. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol 31, 684-686 (2013).

Способы

ДНК-конструкции

Для выбора мишеней для SpCas9 и создания одиночной направляющей РНК (sgRNA) выбирали целевые последовательности размером 20 нт, расположенные перед последовательностью РАМ 5'-NGG. Для сведения к минимуму нецелевых эффектов применяли инструмент для конструирования CRIPSR (http://tools.genome-engineering.org). sgRNA подвергали ПЦР-амплификации с применением промотора U6 в качестве матрицы с прямым праймером:

и обратным праймером, содержащим sgRNA с целевым сайтом ДНК размером 20 нт (жирным шрифтом):

Контрольную последовательность sgRNA сконструировали для нацеливания на ген lacZ E.coli:

целевая последовательность:

Конструкция EGFP-KASH¹ была щедрым подарком от профессора Worman (Колумбийский университет, г. Нью-Йорк) и использовалась в качестве матрицы для ПЦР для клонирования кодирующей кассеты в каркас на основе AAV под контроль промотора гена синапсина человека (hSyn). Затем вводили последовательность, кодирующую U6-Mecp2sgRNA, с применением сайта для MluI. Для стратегии мультиплексного целенаправленного воздействия на гены индивидуальные sgRNA подвергали ПЦР-амплификации, как описано выше. Все три sgRNA лигировали с подвергнутой ПЦР-амплификации кассетой hSyn-GFP-KASH-bGHpA (см. фигуру 4А) путем применения стратегии клонирования Golden Gate. После ПЦР-амплификации продукт лигирования Golden Gate, содержащий 3 sgRNA и hSyn-GFP-KASH-bGHpA, клонировали в каркас на основе AAV. Все полученные конструкции подтверждали путем секвенирования. Чтобы найти оптимальную промоторную последовательность для управления экспрессией SpCas9 в нейронах, заявители тестировали последовательности промоторов: hSyn1, усеченного Mecp2 мыши (рMecp2) и усеченного Map1b крысы (pMap1b) (см. дополнительную фигуру 1А). Для амплификации промоторных участков использовали следующие праймеры:

Сборку другого усеченного промотора map1b крысы производили с использованием следующих олигонуклеотидов:

и

Сборку короткого синтетического сигнала полиаденилирования (spA)³ производили с использованием следующих олигонуклеотидов:

и

SpCas9 и его мутантный вариант D10A (dSpCas9) были описаны ранее^{4, 5}. Для трансфекции нейронов с помощью Lipofectamine^®2000 (Life Technologies) применяли плазмиду, кодирующую красный флуоресцентный белок (mCherry) под контролем промотора EF1α.

Культуры линий клеток и трансфекции

Клетки Neuro-2a (N2a) выращивали в DMEM, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (BSA). Для клеток HEK293FT применяли DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки поддерживали при 37°C в атмосфере с 5% CO₂. Клетки трансфицировали с помощью Lipofectamine^®2000 или реагента полиэтиленимина (PEI) "MAX" (Polysciences) согласно протоколам производителя.

Получение концентрированных векторов на основе AAV

Частицы AAV1/2 с высоким титром получали с использованием плазмид серотипов AAV1 и AAV2 в одинаковых соотношениях и плазмиды-помощника pDF6 и очищали на колонке для аффинной хроматографии с гепарином⁶. Титрование вирусных частиц осуществляли с помощью qPCR. Частицы AAV1 с высоким титром получали в организации UNC Vector Core (Университет Северной Каролины в Чэпел-Хилле). Частицы AAV1 с низким титром в DMEM получали, как описано ранее⁷. Вкратце, клетки HEK293FT трансфицировали плазмидой с трансгеном, плазмидой серотипа pAAV1 и плазмидой-помощником pDF6 с помощью PEI "МАХ". Культуральную среду собирали через 48 ч. и фильтровали через фильтр из PVDF с диаметром пор 0,45 мкм (Millipore).

Культура первичных кортикальных нейронов

Животных, используемых для получения нейронов для культур тканей, умерщвляли согласно протоколу, одобренному Комитетом по содержанию и использованию животных MIT (САС MIT). Первичные культуры получали из головного мозга эмбрионов мышей на 16 день беременности⁸. Использовали эмбрионов обоих полов. Клетки высевали в 24-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином (PDL) (BD Biosciences), или на покровные стекла, покрытые ламинином/PDL (VWR). Культуры выращивали при 37°C и 5% СО₂ в среде Neurobasal, дополненной В27, Glutamax (Life Technologies) и смесью пенициллин/стрептомицин.

Для трансдукции AAV кортикальные нейроны в 500 мкл культуральной среды Neurobasal инкубировали до 7 DIV с 300 мкл (совместное инфицирование в соотношении 1:1) кондиционированной среды клеток HEK293FT, содержащей AAV1⁷. Через неделю после трансдукции нейроны собирали для последующей обработки или фиксировали в 4% параформальдегиде для иммунофлуоресцентного окрашивания или морфологического анализа.

Для визуализации морфологических характеристик нейронов клетки в DIV7 трансфицировали вектором экспрессии EF1α-mCherry с помощью Lipofectamine^®2000 (Life Technologies) в течение недели, как описано ранее⁹. Для измерения общей длины дендритов все дендриты отдельных нейронов отслеживали с использованием программного обеспечения ImageJ. Количественная оценка числа первичных дендритов, кончиков дендритов и анализ Шолла¹⁰ проводили на фотографиях, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении объектива 40х (микроскоп Zeiss AxioCam Ах10, камера AxioCam MRm). Для определения количества дендритов подсчитывали концы всех неаксональных выпячиваний, имеющих длину более 10 мкм. Для анализа Шолла вокруг тела клетки автоматически вычерчивали концентрические круги с шагом диаметра 5 мкм, и число дендритов, пересекающих каждый круг, подсчитывали с помощью программного обеспечения ImageJ с плагином Sholl.

Стереотаксическая инъекция AAV1/2 в головной мозг мыши

САС MIT одобрил все процедуры с животными, описанные в данном документе. Взрослых (в возрасте 12-16 недель) самцов мышей C57BL/6N анестезировали путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина. Проводили упреждающую анальгезию (бупренекс, 1 мг/кг, i.p.). Краниотомию проводили согласно одобренным процедурам, и 1 мкл смеси AAV 1:1 (1×10¹³ vg/мл sMecp2-SpCas9; 6×10¹² vg/мл 3×sgRNA для DNMT; 3-5×10¹² vg/мл hSyn-GFP-KASH) инъецировали в: дорсальную часть зубчатой извилины (переднезадняя ось: -1,7; медиолатеральная ось: 0,6; дорсовентральная ось: -2,15) и/или вентральную часть зубчатой извилины (переднезадняя ось: -3,52; медиолатеральная ось: 2,65; дорсовентральная ось: -3). Для электрофизиологических экспериментов по регистрации потенциалов in vivo (фигура 74) координаты инъекции вируса были следующими: на 3 мм латеральнее (от брегмы) и на 1 мм кпереди от теменно-затылочного шва. Череп истончали с помощью дрели Dremel, периодически охлаждаемой солевым раствором, а остающуюся твердую мозговую оболочку прокалывали стеклянной микропипеткой, заполненной вирусом, суспендированным в минеральном масле. Производили несколько инъекций (3-4) в соседние участки на глубину 200-250 мкм. В каждый участок инъецировали смесь вирусов в объеме 150-200 нл при скорости 75 нл/мин. После каждой инъекции пипетку удерживали на месте в течение 3-5 минут до извлечения для предотвращения вытекания. Разрез зашивали и в течение трех дней после хирургической операции вводили надлежащие средства для послеоперационного обезболивания (мелоксикам, 1-2 мг/кг).

Целевая регистрация потенциалов по методу локальной фиксации при неплотном контакте на основе использования двухфотонной визуализации in vivo

Через две недели после инъекции вируса мышей использовали для электрофизиологических экспериментов. Мышей анестезировали 2% изофлураном и поддерживали в таком состоянии с помощью 0,8% изофлурана. Кожу срезали, производили очистку с помощью Sugi, и к черепу прикрепляли металлическую головную пластину с помощью клея и стоматологической акриловой смолы, и производили краниотомию на участке 2 мм×2 мм над первичной зрительной корой (VI). Открытую область затем покрывали тонким слоем 1,5% агарозы в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF; 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 0,01 мМ EDTA, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы; pH 7,4). Температуру тела животных поддерживали в ходе эксперимента на уровне 37,5°C с помощью греющей пластины.

Боросиликатные пипетки (WPI) вытягивали с использованием лазерного устройства для вытягивания пипеток Sutter Р-2000 (Sutter Instruments). Диаметр кончика составлял около 1 мкм, при этом сопротивление составляло 3-5 МОм. Регистрацию потенциалов осуществляли с использованием специального программного обеспечения (Network Prism, Sur lab), написанного на Matlab (MathWorks), управляющего усилителем MultiClamp 700B (Axon). Стеклянный пипеточный электрод вводили в головной мозг под углом 20-35°, и шариковый заземляющий электрод из Ag/AgCl (Warner Instruments) помещали в тот же раствор, что и головной мозг и объектив. Для флуоресцентной визуализации пипетки заполняли Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). Пипетку вначале направляли на участок инъекции с помощью линзы с увеличением 10х, а затем направляли на отдельные GFP⁺ клетки с помощью линзы с увеличением 25х посредством визуализации с одновременным поглощением двух фотонов при 770 нм. Близость к клетке выявляли по отклонениям сопротивления, наблюдаемым при фиксации напряжения во время быстро изменяющегося во времени управляющего импульса напряжения в 5 мВ. Как только сопротивление возрастало на 5-10 МОм, усилитель переключали в режим фиксации тока, и спайки регистрировали при нулевом подаваемом токе с фильтром Бесселя в 4 кГц и фильтром АС в 300 Гц. Головной мозг, в который инъецировали вирус, после этого перфузировали, и проводили иммуногистохимический анализ.

Зрительная стимуляция и анализ данных целевой регистрации потенциалов по методу локальной фиксации при неплотном контакте на основе использования двухфотонной визуализации in vivo

Для оценки ориентационной избирательности и настройки нейронов с отредактированным геномом заявители показывали ориентированные решетки с помощью специального программного обеспечения PsychToolbox-3, написанного на Matlab. Решетки оптимизировали для изучения ответных реакций клеток и показывали путем пошагового смещения ориентации от 0 до 360 градусов с шагом в 20 градусов, при этом каждому показу решетки предшествовали 4 секунды "выключенного состояния" с последующими 4 секундами "включенного состояния", ввиду чего общая продолжительность показа составляла 144 секунды.

Данные получали непосредственно в Matlab и сохраняли в виде файлов.mat. Выявление спайков проводили посредством стандартного анализа, в котором использовали определенные вручную пороговые значения, за котором следовало сравнение формы спайка с эталоном для дополнительного подтверждения. Каждый спайк был отмечен и отображен на экране в графическом интерфейсе пользователя, после чего его вручную анализировал экспериментатор на наличие ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Время формирования спайков в ответ на каждый раздражитель затем разделяли на группы периодов во "включенном состоянии" или в "выключенном состоянии", исходя из их временных рамок относительно зрительной стимуляции, и из количества спайков во "включенном состоянии" для каждого раздражителя вычитали количество спайков в "выключенном состоянии", наблюдаемых в течение равного периода времени. Для ориентационных экспериментов количество спайков на раздражитель=(количество спайков во "включенном состоянии") - (количество спайков в "выключенном состоянии"), поскольку периоды "включенного состояния" и "выключенного состояния" имели одинаковую длительность.

Для каждой клетки, представляющей интерес, способы применяли для сбора данных о реакции на каждый ориентированный раздражитель (от 0 до 360 градусов с шагом в 20 градусов). Эти данные о реакции затем преобразовывали в "настроечную кривую" зависимости реакции от ориентации для каждого испытания. Индекс ориентационной избирательности (ОSI) рассчитывали путем векторного усреднения для предпочтительной ориентации согласно следующей формуле:

Получение ткани и очистка клеточных ядер

Весь гиппокамп или зубчатую извилину быстро вырезали в охлажденном на льду DPBS (Life Sciences) и подвергали шоковой заморозке на сухом льду. Для очистки клеточных ядер ткань осторожно гомогенизировали в 2 мл охлажденного на льду буфера для гомогенизации (НВ) (320 мМ сахарозы, 5 мМ CaCl, 3 мМ Mg(Ac)₂, 10 мМ Tris с pH 7,8, 0,1 мМ EDTA, 0,1% NP40, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ бета-меркаптоэтанола) с помощью гомогенизатора Даунса на 2 мл (Sigma); 25 раз пестиком А, а затем 25 раз пестиком В. Затем добавляли 3 мл НВ до общего объема 5 мл и выдерживали на льду в течение 5 мин. Для градиентного центрифугирования добавляли 5 мл 50% среды с градиентом плотности OptiPrep™ (Sigma), содержащей 5 мМ CaCl, 3 мМ Mg(Ac)₂, 10 мМ Tris с pH 7,8, 0,1 мМ PMSF, 1 мМ бета-меркаптоэтанола, и перемешивали. Лизат осторожно загружали поверх 10 мл 29% изоосмолярного раствора OptiPrep™ в коническую центрифужную пробирку на 30 мл (Beckman Coulter, ротор SW28). Образцы центрифугировали при 10100×g (7500 об./мин.) в течение 30 мин. при 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, и осадок ядер осторожно ресуспендировали в 65 мМ бета-глицерофосфата (pH 7,0), 2 мМ MgCl₂,, 25 мМ KCl, 340 мМ сахарозы и 5% глицерине. Количество и качество очищенных ядер контролировали с использованием светлопольной микроскопии.

Сортировка клеточных ядер

Очищенные GFP-положительные (GFP⁺) и отрицательные (GFP^-) интактные ядра совместно метили рубиновым красителем Vybrant® DyeCycle™ (1:500, Life Technologies) и сортировали при помощи BD FACSAria III (Koch Institute Flow Cytometry Core, MIT). GFP⁺ и GFP^- ядра собирали в пробирки Eppendorf на 1,5 мл, покрытые 1% BSA и содержащие 400 мкл буфера для ресуспендирования (65 мМ бета-глицерофосфата с рН 7,0, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 340 мМ сахарозы и 5% глицерин). После сортировки все образцы выдерживали на льду и центрифугировали при 10000×g в течение 20 мин. при 4°C. Осажденные ядра хранили при -80°C или непосредственно применяли для последующей обработки.

Экстракция геномной ДНК и анализ с помощью SURVEYOR™

Для функционального тестирования sgRNA клетки N2a при 50-70% конфлюентности совместно трансфицировали одиночной sgRNA, подвергнутой ПЦР-амплификации, и вектором с SpCas9. Клетки, трансфицированные только SpCas9 служили в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали через 48 ч. поел трансфекции, и ДНК экстрагировали с использованием набора DNeasy для выделени ДНК из крови и тканей (Qiagen) согласно протоколу производителя. Для выделения геномной ДНК из трансдуцированных с помощью AAV1 первичных нейронов использовали набор DNeasy для выделения ДНК из крови и тканей через 7 дней поел трансдукции с помощью AAV согласно инструкции производителя.

Отсортированные ядра или вырезанные ткани лизировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris, рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ EDTA, 0,5 мМ SDS, протеиназа K (РК, 1 мг/мл) и РНКаза А) при 55°C в течение 30 мин. Затем проводили экстракцию смесью хлороформ-фенол с последующим осаждением ДНК этанолом согласно стандартным процедурам. В заключение ДНК ресуспендировали в буфере ТЕ (10 мМ Tris с pH 8,0, 0,1 мМ EDTA) и применяли для последующего анализа. Функциональное тестирование отдельных sgRN проводили путем применения анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR™ (Transgenomics) с использованием праймеров для ПЦР, перечисленных в дополнительной) таблице 2. Количественную оценку интенсивности полос проводили, как описано ранее¹¹.

Получение и секвенирование библиотеки РНК

Через две недели после билатеральной вирусной доставки SpCas9 с направляющей последовательностью, целенаправленно воздействующих на Mecp2 (4 животных), или SpCas9 с gRNA, целенаправленно воздействующих на lacZ (4 животных), зубчатую извилину быстро вырезали в охлажденном на льду DPBS (Life Sciences) и немедленно переносили в раствор RNAlater (Ambion). Через 24 часа при 4°C ткань переносили в условия -80°C. Группы из 100 подвергнутых цленаправленному воздействию ядер нейронов сортировали путем FACS в 10 мкл буфера TCL, дополненного 1% 2 меркаптоэтанолом (Qiagen). После центрифугирования образцы сразу же замораживали при -80°C. РНК очищали с помощью гранул SPRI AMPure RNAclean ХР (Beckman Coulter Genomics) согласно инструкциям производителя и трижды промывали 80% этанолом пропуская заключительное элюирование. Гранулы с захваченной РНК высушивали на воздухе и сразу обрабатывали для синтеза кДНК. Образцы без ядер применяли в качестве отрицательных контролей. Для каждого животного использовали три отобранные группы всего 24 отобранные группы, получение библиотек кДНК проводили согласно протоколу SMART-seq2¹², лишь заменяя фермент обратную транскриптазу 0,1 мкл фермента Maxima Н Minus (200 ед./мкл, Thermo Scientific) и пропорционально уменьшая объем реакционной смеси для ПЦР до 25 мкл. Реакцию тагментации и заключительную ПЦР-амплификацию проводили с использованием набора для получения образцов ДНК Nextera XT (Illumina) со следующими модификациями. Объемы всех реакционных смесей пропорционально уменьшали в 4 раза, и библиотеки объединяли после стадии ПЦР-амплификации путем взятия 2,5 мкл каждого образца. Объединенные библиотеки очищали и отбирали по размеру с использованием двух циклов очистки в 0,7 объема гранул SPRI AMPure ХР (Beckman Coulter Genomics). Образцы загружали на высокочувствительный ДНК-чип (Agilent) для проверки качества библиотеки, при этом количественную оценку производили с помощью набора для высокочувствительного анализа ДНК Qubit (Invitrogen). Объединенные библиотеки разбавляли до конечной концентрации 4 нМ и 12 пмоль и секвенировали с помощью Illumina MiSeq с использованием ридов со спаренными концами размером 75 п.о.

Анализ данных из библиотек РНК

Индекс Bowtie2 создавали на основе UCSC mm9 для генома мыши и известного генного транскриптома¹³, и риды со спаренными концами выравнивали непосредственно с этим индексом с помощью Bowtie2 с использованием параметров командной строки -q -- phred33-quals -n 2 -е 99999999 -1 25 -I 1 -X 1000 -a -m 200 -р 4 --chunkmbs 512. Затем выравнивания, созданные в Bowtie2, анализировали с помощью RSEM v1.27 с параметрами по умолчанию для оценки уровней экспрессии. Оценочные значения уровней экспрессии генов по RSEM (tau) умножали на 1000000 для получения оценочных значений количества транскриптов на миллион (ТРМ) для каждого гена, и оценочные значения ТРМ преобразовывали в логарифмическое пространство, путем взятия log2 (ТРМ+1). Гены считали выявленными, если их преобразованный уровень экспрессии был равен или превосходил 2 (по шкале log2(TPM+1)). Библиотеку отсеивали, если в ней было выявлено менее 8000 генов. На основании этого критерия 4 библиотеки были отсеяны и исключены из последующего анализа. Для обнаружения генов, дифференциально экспрессируемых у контрольных животных и животных, экспрессирующих sgRNA для Mecp2, применяли t-критерий Стьюдента (Matlab V2013b) и перекрестную проверку для 20 отрезков случайной перестановки, где в каждом отрезке от каждого животного случайным образом выбирали одну библиотеку для исключения (эти результаты в общей сложности для 12 библиотек всякий раз применяли для вычисления t-критерия). Определение t-критерия проводили для всех генов, которые имели средний уровень экспрессии выше квантиля 0,9 (обычно около 5 log2(TPM+1)) для каждого образца. Затем выбирали гены со значимыми результатами (p<0,01) в более чем одной трети отрезков перестановки. Уровни экспрессии этих генов в log2(TPM+1) для всех образцов кластеризовали с использованием иерархической кластеризации (Matlab V2013b).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Культура клеток. Для иммунофлуоресцентного окрашивания первичных нейронов клетки фиксировали через 7 дней после вирусной доставки в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин. при RT. После 3-кратного промывания с помощью PBS клетки блокировали с помощью 5% нормальной сыворотки козы (NGS) (Life Technologies), 5% сыворотки осла (DS) (Sigma) и 0,1% Triton-X100 (Sigma) в PBS в течение 30 мин. при RT. Клетки инкубировали с первичными антителами в 2,5% NGS, 2,5% DS и 0,1% Triton-X100 в течение 1 часа при RT или в течение ночи при 4°C. После 3-кратного промывания с помощью PBST клетки инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при RT. Наконец, монтировали покровные стекла с использованием среды для заключения VECTASHIELD HardSet с DAPI (Vector Laboratories) и производили визуализацию с помощью микроскопа Zeiss AxioCam Ах10 и камеры AxioCam MRm. Фотографии обрабатывали с помощью программного обеспечения Zen 2012 (Zeiss). Количественную оценку проводили путем использования программного обеспечения ImageJ 1.48h и плагина для выявления нейронов.

Мышей умерщвляли через 4 недели после вирусной доставки смертельной дозой смеси кетамин/ксилазин и подвергали транскардиальной перфузии с помощью PBS, а затем PFA. Из фиксированной ткани получали срезы с помощью вибротома (Leica, VT1000S). Затем срезы толщиной 30 мкм кипятили в течение 2 мин. в натрий-цитратном буфере (10 мМ дигидрата тринатрий-цитрата, 0,05% Tween20, pH 6,0) и охлаждали при RT в течение 20 мин. Срезы блокировали с помощью 4% нормальной сыворотки козы (NGS) в TBST (137 мМ NaCl, 20 мМ Tris с рН 7,6, 0,2% Tween-20) в течение 1 часа. Парафиновые срезы получали с помощью микротома (Leica RM2125 RTS) с толщиной 8 мкм и окрашивали, как описано ранее¹⁴.

Срезы инкубировали с первичными антителами, разбавленными в TBST с 4% NGS, в течение ночи при 4°C. После 3 промывок в TBST образцы инкубировали с вторичными антителами. После 3-кратного промывания с помощью TBST срезы заключали с применением среды для заключения VECTASHIELD HardSet с DAPI и визуализировали при помощи конфокального микроскопа (Zeiss LSM 710, Ах10 Imager Z2, программное обеспечение Zen 2012).

Использовали следующие первичные антитела: антитело кролика к Dnmt3a (Santa Cruz, 1:100); антитело кролика к МеСР2 (Millipore, 1:200); антитело мыши к NeuN (Millipore, 1:50-1:400); антитело курицы к GFAP (Abсam, 1:400); антитело мыши к Мар2 (Sigma, 1:500); антитело курицы к GFP (Aves Labs, 1:200-1:400); антитело мыши к НА (Cell Signaling, 1:100). Вторичные антитела: Alexa Fluor®488, 568 или 633 (Life Technologies, 1:500-1:1000).

Количественная оценка в анализе с использованием LIVE/DEAD®

Контрольные и транcдуцированные первичные нейроны окрашивали путем применения анализа с использованием LIVE/DEAD® (Life Technologies) согласно инструкции производителя. Во избежание интерференции с сигналом GFP, обусловленным экспрессией GFP-KASH, клетки окрашивали только для выявления мертвых (гомодимером этидия) и с помощью DAPI (все клетки). Окрашенные клетки фотографировали с помощью флуоресцентной микроскопии, и мертвые, GFP- и DAPI-положительные клетки подсчитывали путем применения программного обеспечения ImageJ 1.48h и плагина для выявления нейронов.

Вестерн-блот анализ

Транcдуцированные первичные кортикальные нейроны (24 лунки, 7 дней после вирусной доставки) и транедуцированные образцы ткани (4 недели после вирусной доставки) лизировали в 50 мкл охлажденного на льду буфера RIPA (Cell Signaling), содержащего 0,1% SDS и ингибиторы протеаз (Roche, Sigma). Клеточные лизаты подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин. в ультразвуковом аппарате Bioruptor (Diagenode), и концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белков ВСА (Pierce Biotechnology, Inc.). Белковые лизаты растворяли в буфере для образца для SDS-PAGE, разделяли в восстановительных условиях в 4-15% гелях с Tris-HCl (Bio-Rad) и анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя первичные антитела: антитело кролика к Dnmt3a (Santa Cruz, 1:500), антитело мыши к Dnmtl (Novus Biologicals, 1:800), антитело кролика к Mecp2 (Millipore, 1:400), антитело кролика к тубулину (Cell Signaling, 1:10000), а затем вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика, конъюгированные с HRP (Sigma- Aldrich, 1:10000). GAPDH непосредственно визуализировали с помощью антитела кролика к GAPDH, соединенного с HRP (Cell Signaling, 1:10000). Тубулин или GAPDH служил в качестве контроля загрузки. Блоты визуализировали с помощью системы ChemiDoc™ MP с программным обеспечением ImageLab 4.1 (BioRad) и количественно определяли с применением программного обеспечения ImageJ 1.48h.

Выработка контекстного условного рефлекса в связи с переживанием чувства страха с задержкой (DCFC)

Через 8 недель после билатеральной доставки 3×sgRNA для SpCas9/DNMT в дорсальную и вентральную части зубчатой извилины самцов мышей C57BL/6N в возрасте 12 недель обеспечивали привыкание животных к экспериментатору и комнате для изучения поведения в течение 7 дней. Однопометники, которым инъецировали SpCas9/GFP-KASH, служили в качестве контролей. В день 1 анализа DCFC клетки с мышами помещали в изолированный тамбур для предотвращения получения мышами звуковых сигналов до и после тестирования. Отдельных мышей помещали в камеру для изучения FC (Med Associates Inc.), и оставляли на период привыкания длительностью 12 мин. После привыкания мышей помещали обратно в их домашние клетки. На следующий день (тренировочный день) отдельных мышей помещали в камеру и оставляли для привыкания в течение 4 мин. По истечении еще одного интервала длительностью 20 с (до подачи звука) подавали звук (звуковой сигнал) на уровне 85 дБ, 2,8 кГц, в течение 20 с с последующим интервалом задержки длительностью 18 с перед подачей электроболевого раздражения на лапы (0,5 мА, 2 с). После подачи электроболевого раздражения на лапы интервал длительностью 40 с (после подачи звука/электроболевого раздражения) предшествовал следующему идентичному испытанию, начинавшемуся с периода до подачи звука длительностью 20 с. Тренировочное испытание повторяли 6 раз перед тем, как мышей помещали обратно в их домашние клетки. В день 3 (день тестирования) мышей вначале помещали в камеру для выработки контекстного условного рефлекса на 3 мин. Затем мышей подвергали 4х тестовым испытаниям длительностью 100 с, начинавшимся с интервала длительностью 20 с, за которым следовала подача звука длительностью 20 с и интервал после подачи звука длительностью 60 с. Наконец, мышей помещали в камеру выработки условного рефлекса в измененном контексте (сплошной пол в отличие от сетчатого, тетрамерная камера в отличие от гептамерной, аромат ванилина) и тестовое испытание повторяли. Регистрировали замирание, и анализ проводили вслепую и вручную в режиме оффлайн и подтверждали с помощью программного обеспечения Noldus EthoVision XT (Noldus Information Technology).

Анализ по методу глубокого секвенирования и выявление вставок/делеций

Для обнаружения возможных нецелевых эффектов в генах семейства DNMT, на которые в головном мозге целенаправленно воздействовали с помощью CRISPR-SpCas9, применяли инструмент для конструирования CRISPR (http://crispr.mit.edu/). Подвергнутые целенаправленному воздействию клеточные ядра из зубчатой извилины сортировали путем FACS через 12 недель после вирусной доставки и геномную ДНК очищали, как описано выше. Для каждого гена, представляющего интерес, участок генома, фланкирующий целевой сайт для CRISPR, амплифицировали с помощью способа ПЦР с перекрывающимися праймерами для прикрепления адаптеров Illumina Р5, а также уникальных специфичных для образца штрих-кодов к целевым ампликонам (что касается праймеров для целевых и нецелевых локусов, см. дополнительную таблицу 3)¹⁵. Очищенные образцы ДНК со штрих-кодами количественно определяли с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Life Technologies) и объединяли в эквимолярном соотношении. Библиотеки для секвенирования затем секвенировали с использованием персонального секвенатора Illumina MiSeq (Life Technologies) при длине ридов 300 п.о.

Риды MiSeq анализировали, как описано ранее в¹⁵. Вкратце, риды фильтровали по качеству Phred (баллу Q) и выравнивали с применением алгоритма Смита-Ватермана с участком генома, включающим 50 нуклеотидов выше и ниже целевого сайта. Вставки/делеции оценивали в выровненном участке от 5 нуклеотидов выше до 5 нуклеотидов ниже целевого сайта (в общей сложности 30 п.о.). Отрицательные контроли для каждого образца применяли для оценки включения или исключения вставок/делеций как предполагаемых событий разрезания. Заявители рассчитали оценку максимального правдоподобия (MLE) для доли ридов, имеющих целевые участки с истинными вставками/делециями, с использованием частоты появления ошибок на целевой участок на рид из данных об отрицательном контрольном образце. Баллы MLE и показатели разрезания для каждой мишени перечислены в дополнительной таблице 1.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили по меньшей мере в двух независимых биологических повторностях. Статистические вычисления производили с помощью Prism6 (GraphPad) с применением двустороннего t-критерия Стьюдента.

Дополнительная таблица 1. Анализ нецелевых эффектов при целенаправленном воздействии на DNMT

Дополнительная таблица 2. Праймеры для ПЦР, применяемые в анализе с помощью SURVEYOR

Дополнительная таблица 3. Праймеры, применяемые для амплификации целевых и нецелевых локусов генома

ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Ostlund, С. et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci 122, 4099-4108 (2009).

2. Gray, S.J. et al. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum Gene Ther 22, 1143-1153 (2011).

3. Levitt, N., Briggs, D., Gil, A. & Proudfoot, N.J. Definition of an efficient synthetic poly(A) site. Genes Dev 3, 1019-1025 (1989).

4. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).

5. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013).

6. McClure, C., Cole, K.L., Wulff, P., Klugmann, M. & Murray, A.J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp, e3348 (2011).

7. Konermann, S. et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature 500, 472-476 (2013).

8. Banker, G. & Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature 336, 185-186 (1988).

9. Swiech, L. et al. CLIP-170 and IQGAP1 cooperatively regulate dendrite morphology. JNeurosci 31, 4555-4568 (2011).

10. Sholl, D.A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. JAnat 87, 387-406 (1953).

11. Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols 8, 2281-2308 (2013).

12. Picelli, S. et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature methods 10, 1096-1098 (2013).

13. Fujita, P.A. et al. The UCSC Genome Browser database: update 2011. Nucleic acids research 39, D876-882 (2011).

14. Tzingounis, A.V. et al. The KCNQ5 potassium channel mediates a component of the afterhyperpolarization current in mouse hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 10232-10237 (2010).

15. Hsu, P.D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827-832 (2013).

16. Qiu, P. et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. BioTechniques 36, 702-707 (2004).

Пример 40. Дополнительное исследование методики мечения ядер

Данный пример 38 относится к эпитопному мечению Cas9. Вкратце, заявители обнаружили, что тройная эпитопная метка (в особенности 3хНА) усиливает детектирующий сигнал.

Материалы и способы

Культура клеток и трансфекция

Линию клеток почки человеческого эмбриона (HEK) 293FT (Life Technologies) или линию клеток мыши Hepal-6 (Sigma-Aldrich) поддерживали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 2 мМ GlutaMAX (Life Technologies), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°C с инкубированием при 5% CO₂.

Клетки высевали в 24-луночные планшеты (Corning) при плотности 120000 клеток/лунку за 24 часа до трансфекции. Клетки трансфицировали с применением Lipofectamine 2000 (Life Technologies) при конфлюентности 80-90%, следуя рекомендованному производителем протоколу. В общей сложности трансфицировали 500 нг плазмиды с Cas9 и 100 нг продукта ПЦР U6-sgRNA.

Анализ с помощью нуклеазы SURVEYOR на наличие модификации генома

Клетки 293FT и HUES62 трансфицировали с помощью ДНК, как описано выше. Клетки инкубировали при 37°C в течение 72 часов после трансфекции перед экстракцией геномной ДНК. Геномную ДНК экстрагировали с помощью раствора для экстракции ДНК QuickExtract (Epicentre), следуя протоколу производителя. Вкратце, осажденные клетки ресуспендировали в растворе QuickExtract и инкубировали при 65°C в течение 15 минут, 68°C в течение 15 минут и 98°C в течение 10 минут.

Участок генома, фланкирующий целевой сайт для CRISPR, для каждого гена подвергали ПЦР-амплификации, и продукты очищали с использованием центрифужной колонки QiaQuick (Qiagen), следуя протоколу производителя. В общей сложности 400 нг очищенных продуктов ПЦР смешивали с 2 микролитрами 10Х ПЦР-буфера для ДНК-полимеразы Taq (Enzymatics) и водой сверхвысокой чистоты до конечного объема 20 микролитров и подвергали процессу повторного отжига для обеспечения образования гетеродуплекса: 95°C в течение 10 мин., линейное снижение температуры с 95°C до 85°C со скоростью -2°C/с, с 85°C до 25°C со скоростью -0,25°C/с и с выдерживанием при 25°C в течение 1 минуты. После повторного отжига продукты обрабатывали нуклеазой SURVEYOR и усилителем S SURVEYOR (Transgenomics), следуя рекомендованному производителем протоколу, и анализировали в 4-20% полиакриламидных гелях Novex ТВЕ (Life Technologies). Гели окрашивали красителем ДНК SYBR золотым (Life Technologies) в течение 30 мин. и визуализировали с помощью системы для визуализации геля Gel Doc (Bio-rad). Количественный анализ основывался на относительных интенсивностях полос. Процентное значение частоты вставок/делеций определяли по формуле 100×(1-(1-(b+с)/(а+b+с))^1/2), где а представляет собой суммарную интенсивность для нерасщепленного продукта ПЦР, a b и с представляют собой значения суммарной интенсивности для каждого продукта расщепления.

Вестерн-блот-анализ

Клетки HEK 293FT трансфицировали и лизировали в 1X буфере RIPA (Sigma-Aldrich), дополненном ингибитором протеаз (Roche). Лизаты загружали в 4-12% гели Bolt Bis-Tris Plus (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали в солевом растворе с Tris-буфером, содержащем 0,1% Tween-20 и 5% блокирующего средства (G-Biosciences). Мембраны исследовали с помощью антитела кролика к FLAG (1:5000, Abсam), антитела к GAPDH, конъюгированного с HRP (1:5000, Cell Signaling Technology), и антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированного с HRP (1:1000), и визуализировали с помощью системы Gel Doc XR+ (Bio-Rad).

ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ

R.Е. Amir et at., Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature genetics 23, 185 (Oct, 1999).

Banker G, Goslin K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 1988 Nov 10; 336 (6195): 185-6.

Bedell, V.M. et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature 491, 114-U133 (2012).

Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu Rev Genet 45, 273-297 (2011).

Bobis-Wozowicz, S., Osiak, A., Rahman, S.H. & Cathomen, T. Targeted genome editing in pluripotent stem cells using zinc-finger nucleases. Methods 53, 339-346 (2011).

Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509-1512 (2009).

Bogenhagen, D.F. & Brown, D.D. Nucleotide sequences in Xenopus 5S DNA required for transcription termination. Cell 24, 261-270 (1981).

Bultmann, S. et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res 40, 5368-5377 (2012).

C. Burger, K. Nash, R. J. Mandel, Recombinant adeno-associated viral vectors in the nervous system. Human gene therapy 16, 781 (Jul, 2005).

Carlson, D.F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 17382-17387 (2012).

M. Chahrour, H. Y. Zoghbi, The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron 56, 422 (Nov 8, 2007).

Chen, F.Q. et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods 8, 753-U796 (2011).

R.Z. Chen, S. Akbarian, M. Tudor, R. Jaenisch, Deficiency of methyl-CpG binding protein-2 in CNS neurons results in a Rett-like phenotype in mice. Nature genetics 27, 327 (Mar, 2001).

Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M. & Kim, J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013).

Christian, M. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186, 757-761 (2010).

Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR-Cas systems. Science 339, 819-823 (2013).

Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).

Deveau, H., Garneau, J.E. & Moineau, S. CRISPR-Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annu Rev Microbiol 64, 475-493 (2010).

Ding, Q. et al. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models. Cell Stem Cell 12, 238-251 (2013).

J. Feng et al., Dnmtl and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature neuroscience 13, 423 (Apr, 2010).

Y. Fu et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology 31, 822 (Sep, 2013).

Garneau, J.E. et al. The CRISPR-Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 468, 67-71 (2010).

Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 109, E2579-2586 (2012).

Geurts, A.M. et al. Knockout Rats via Embryo Microinjection of Zinc-Finger Nucleases. Science 325, 433-433 (2009).

Gray SJ, Foti SB, Schwartz JW, Bachaboina L, Taylor-Blake B, Coleman J, Ehlers MD, Zylka MJ, McCown TJ, Samulski RJ. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum Gene Ther. 2011 Sep; 22 (9): 1143-53. doi: 10.1089/hum.2010.245.

Guschin, D.Y. et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol 649, 247-256 (2010).

Hasty, P., Rivera-Perez, J. & Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol Cell Biol 11, 5586-5591 (1991).

Horvath, P. & Barrangou, R. CRISPR-Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, 167-170 (2010).

P.D. Hsu et al, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827 (Sep, 2013).

Hsu, P.D. & Zhang, F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies. ACS Chem Neurosci 3, 603-610 (2012).

Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013).

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013).

Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).

Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013).

Kaplitt, M.G., et al., Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial. Lancet. 2007 Jun 23; 369 (9579): 2097-105.

S. Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature 500, 472 (Aug 22, 2013).

Levitt N. Briggs D. Gil A. Proudfoot N.J. Definition of an efficient synthetic poly(A) site. Genes Dev. 1989; 3: 1019-1025.

Y. Li et al., Global transcriptional and translational repression in human-embryonic-stem-cell-derived Rett syndrome neurons. Cell stem cell 13, 446 (Oct 3, 2013).

Liu D, Fischer I. Two alternative promoters direct neuron-specific expression of the rat microtubule-associated protein lB gene. JNeurosci. 1996 Aug 15; 16 (16): 5026-36.

Lopes, V.S., etc al., Retinal gene therapy with a large MYO7A cDNA using adeno-assocaited virus. Gene Ther, 2013 Jan 24. doi: 10.1038/gt 2013.3. [Электронная публикация, предшествующая печатной]

Mahfouz, М.М. et al. De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011).

Makarova, K.S. et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 9, 467-477 (2011).

Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).

S.A. McCarroll, S.E. Hyman, Progress in the genetics of polygenic brain disorders: significant new challenges for neurobiology. Neuron 80, 578 (Oct 30, 2013).

McClure C, Cole KL, Wulff P, Klugmann M, Murray AJ. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp.2011 Nov 27; (57):e3348. doi: 10.3791/3348.

Michaelis, L.M., Maud "Die kinetik der invertinwirkung.". Biochem. z (1913).

Miller, J.C. et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol 25, 778-785 (2007).

Miller, J.C. et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011).

Moscou, M.J. & Bogdanove, A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326, 1501 (2009). Porteus, M.H. & Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science 300, 763 (2003).

Mussolino, C. et al. A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. Nucleic acids research 39, 9283-9293 (2011).

Nathwani, A.C., et al., Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med. 2011 Dec 22; 365 (25): 2357-65. doi: 10.1056/NEJMoa1108046. Электронная публикация 10 декабря 2011 года.

М.V. Nguyen et al., МеСР2 is critical for maintaining mature neuronal networks and global brain anatomy during late stages of postnatal brain development and in the mature adult brain. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 32, 10021 (Jul 18, 2012).

Oliveira, T.Y. et al. Translocation capture sequencing: a method for high throughput mapping of chromosomal rearrangements. J Immunol Methods 375, 176-181 (2012).

C. Ostlund et al., Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of cell science 122, 4099 (Nov 15, 2009).

Perez, E.E. et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4(+) T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 26, 808-816 (2008).

Qi, L.S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).

F.A. Ran et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols 8, 2281 (Nov, 2013).

REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)

Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012).

Saleh-Gohari, N. & Helleday, T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells. Nucleic Acids Res 32, 3683-3688 (2004).

Sander, J.D. et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA). Nat Methods 8, 67-69 (2011).

Sanjana, N.E. et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc 7, 171-192 (2012).

Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011).

M. Shahbazian et al, Mice with truncated MeCP2 recapitulate many Rett syndrome features and display hyperacetylation of histone H3. Neuron 35, 243 (Jul 18, 2002).

Shen, B. et al. Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. Cell Res 23, 720-723 (2013).

D.A. Sholl, Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. Journal of anatomy 87, 387 (Oct, 1953).

Smithies, O., Gregg, R.G., Boggs, S.S., Koralewski, M.A. & Kucherlapati, R.S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature 317, 230-234 (1985).

Soldner, F. et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell 146, 318-331 (2011).

L. Swiech et al., CLIP-170 and IQGAP1 cooperatively regulate dendrite morphology. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 31, 4555 (Mar 23, 2011).

Takasu, Y. et al. Targeted mutagenesis in the silkworm Bombyx mori using zinc finger nuclease mRNA injection. Insect Biochem Molec 40, 759-765 (2010).

Tangri S, et al., Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity, J Immunol. 2005 Mar 15; 174 (6): 3187-96.

Thomas, K.R., Folger, K.R. & Capecchi, M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell 44, 419-428 (1986).

Tuschl, T. Expanding small RNA interference. Nat Biotechnol 20, 446-448 (2002).

A.V. Tzingounis et al., The KCNQ5 potassium channel mediates a component of the afterhyperpolarization current in mouse hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 10232 (Jun 1, 2010).

Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, M.C., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet 11, 636-646 (2010).

Valton, J. et al. Overcoming transcription activator-like effector (TALE) DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J Biol Chem 287, 38427-38432 (2012).

Wang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR-Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153, 910-918 (2013).

Watanabe, T. et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nat Commun 3 (2012).

Wilson, E.B. Probable inference, the law of succession, and statistical inference. J Am Stat Assoc 22, 209-212 (1927).

Wood, A.J. et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science 333, 307 (2011).

Wu, S., Ying, G.X., Wu, Q. & Capecchi, M.R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nat Protoc 3, 1056-1076 (2008).

Z. Wu, H. Yang, P. Colosi, Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 80 (Jan, 2010).

Zhang, F. et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011).

Z. Zhou et al, Brain-specific phosphorylation of MeCP2 regulates activity-dependent Bdnf transcription, dendritic growth, and spine maturation. Neuron 52, 255 (Oct 19, 2006).

Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в данном документе, для специалиста в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь будут очевидны для специалиста в данной области без отступления от сути настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты вариантов осуществления настоящего изобретения, раскрытые в данном документе, можно применять при практическом осуществлении настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИНСТИТУТ БРОУДА, ИНК.

МАССАЧУСЕТСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

<120> ДОСТАВКА И ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМ CRISPR-CAS, ВЕКТОРОВ И КОМПОЗИЦИЙ

ДЛЯ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ И ТЕРАПИИ В ПЕЧЕНИ

<130> 44790.99.2052

<140> PCT/US2014/041804

<141> 2014-06-10

<150> 61/979,733

<151> 2014-04-15

<150> 61/915,383

<151> 2013-12-12

<150> PCT/US2013/074667

<151> 2013-12-12

<150> 61/871,301

<151> 2013-08-28

<150> 61/862,355

<151> 2013-08-05

<150> 61/847,537

<151> 2013-07-17

<150> 61/836,123

<151> 2013-06-17

<160> 926

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 1

gcactgaggg cctatttccc atgattc 27

<210> 2

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 2

cctccgtgtc agcgacccat gccaa 25

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 3

ccagcgtcga acagctccag cccg 24

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 4

agagggtgcc agcgggtata tgagg 25

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

gagtccgagc agaagaagaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gagtcctagc aggagaagaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

gagtctaagc agaagaagaa 20

<210> 8

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(44)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (47)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 8

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnggnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 9

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(14)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (17)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 9

nnnnnnnnnn nnnnccnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 10

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(43)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (46)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 10

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnggnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 11

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(15)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (18)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 11

nnnnnnnnnn nnnnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 12

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(42)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (45)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 12

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 13

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(15)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (18)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 13

nnnnnnnnnn nnnnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 14

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(41)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (44)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 14

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 15

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(17)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (20)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 15

nnnnnnnnnn nnnnnnnccn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 16

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(40)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (43)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 16

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 17

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(18)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (21)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 17

nnnnnnnnnn nnnnnnnncc nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 18

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(39)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (42)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 18

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnnng gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 19

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(19)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (22)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 19

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc cnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 20

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 20

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 21

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 21

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 22

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(37)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (40)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 22

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnnggn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 23

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(21)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (24)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 23

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 24

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(36)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (39)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 24

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnnggnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 25

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(22)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (25)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 25

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 26

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 26

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnnggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 27

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(23)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (26)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 27

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnccnnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 28

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(34)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (37)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 28

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnnggnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 29

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(24)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (27)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 29

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnccnnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 30

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(33)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (36)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 30

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnnggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 31

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(25)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (28)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 31

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccnnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 32

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(32)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (35)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 32

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nnggnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 33

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(26)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (29)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 33

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnccnn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 34

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(31)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (34)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 34

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn nggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 35

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(27)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (30)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 35

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnccn nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 36

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(30)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (33)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 36

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnnn ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 37

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(28)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (31)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 37

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnncc nnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 38

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(29)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (32)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 38

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnnng gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 39

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(29)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (32)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 39

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc cnnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 40

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(28)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (31)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 40

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 41

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(30)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (33)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 41

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 42

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(27)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (30)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 42

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnnggn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 43

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(31)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (34)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 43

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccnnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 44

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(26)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (29)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 44

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnnggnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 45

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(32)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (35)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 45

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccnnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 46

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(25)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (28)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 46

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnnggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 47

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(33)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (36)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 47

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnccnnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 48

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(24)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (27)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 48

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnnggnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 49

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(34)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (37)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 49

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnccnngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 50

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(23)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (26)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 50

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ccnggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 51

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(38)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (41)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 51

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccngg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 52

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(21)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (26)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 52

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 53

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (40)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 53

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccggn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 54

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(23)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (26)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 54

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 55

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(33)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 55

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnggccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 56

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(22)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (26)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 56

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncggnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 57

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(32)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (35)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 57

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 58

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(31)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (34)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 58

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 59

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(30)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (33)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 59

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggnnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 60

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(29)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (32)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 60

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng gnnnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 61

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(28)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (31)..(35)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (38)..(60)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 61

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg nnnnnccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

<210> 62

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

пептидный мотив семейства ‘LAGLIDADG’”

<400> 62

Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly

1 5

<210> 63

<211> 12

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 63

guuuuagagc ua 12

<210> 64

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Вирус обезьян 40

<400> 64

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 65

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

двойная последовательность NLS из нуклеоплазмина”

<400> 65

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 66

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

последовательность NLS из C-myc”

<400> 66

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 67

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

последовательность NLS из C-myc”

<400> 67

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 68

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 68

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 69

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

последовательность домена IBB из импортина-альфа”

<400> 69

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 70

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

последовательность из T-белка миомы”

<400> 70

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание неизвестной последовательности:

последовательность из T-белка миомы”

<400> 71

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 72

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 73

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 73

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 74

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа

<400> 74

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 75

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гриппа

<400> 75

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 76

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Вирус гепатита дельта

<400> 76

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 77

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 77

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 78

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 78

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 79

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 79

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 80

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t или g

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (21)..(22)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 80

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27

<210> 81

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(12)

<223> a, c, t или g

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (13)..(14)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 81

nnnnnnnnnn nnnnagaaw 19

<210> 82

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t или g

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (21)..(22)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 82

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27

<210> 83

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(11)

<223> a, c, t или g

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (12)..(13)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 83

nnnnnnnnnn nnnagaaw 18

<210> 84

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 84

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcaagatt tagaaataaa tcttgcagaa 60

gctacaaaga taaggcttca tgccgaaatc aacaccctgt cattttatgg cagggtgttt 120

tcgttattta atttttt 137

<210> 85

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 85

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag 60

gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttcgt tatttaattt 120

ttt 123

<210> 86

<211> 110

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 86

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag 60

gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttttt 110

<210> 87

<211> 102

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 87

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102

<210> 88

<211> 88

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 88

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt gttttttt 88

<210> 89

<211> 76

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 89

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcatt tttttt 76

<210> 90

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 90

gttttagagc ta 12

<210> 91

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 91

tagcaagtta aaataaggct agtccgtttt t 31

<210> 92

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(22)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 92

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27

<210> 93

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 93

ggacatcgat gtcacctcca atgactaggg tgg 33

<210> 94

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 94

cattggaggt gacatcgatg tcctccccat tgg 33

<210> 95

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 95

ggaagggcct gagtccgagc agaagaagaa ggg 33

<210> 96

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 96

ggtggcgaga ggggccgaga ttgggtgttc agg 33

<210> 97

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 97

atgcaggagg gtggcgagag gggccgagat tgg 33

<210> 98

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 98

aaactctaga gagggcctat ttcccatgat tc 32

<210> 99

<211> 153

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 99

acctctagaa aaaaagcacc gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct 60

tattttaact tgctatgctg ttttgtttcc aaaacagcat agctctaaaa cccctagtca 120

ttggaggtga cggtgtttcg tcctttccac aag 153

<210> 100

<211> 52

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 100

taatacgact cactatagga agtgcgccac catggcccca aagaagaagc gg 52

<210> 101

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 101

ggtttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcttact ttttcttttt tgcctggccg 60

<210> 102

<211> 984

<212> БЕЛОК

<213> Campylobacter jejuni

<400> 102

Met Ala Arg Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Ile Ser Ser Ile Gly Trp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Glu Asn Asp Glu Leu Lys Asp Cys Gly Val Arg Ile Phe

20 25 30

Thr Lys Val Glu Asn Pro Lys Thr Gly Glu Ser Leu Ala Leu Pro Arg

35 40 45

Arg Leu Ala Arg Ser Ala Arg Lys Arg Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg

50 55 60

Leu Asn His Leu Lys His Leu Ile Ala Asn Glu Phe Lys Leu Asn Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Gly

85 90 95

Ser Leu Ile Ser Pro Tyr Glu Leu Arg Phe Arg Ala Leu Asn Glu Leu

100 105 110

Leu Ser Lys Gln Asp Phe Ala Arg Val Ile Leu His Ile Ala Lys Arg

115 120 125

Arg Gly Tyr Asp Asp Ile Lys Asn Ser Asp Asp Lys Glu Lys Gly Ala

130 135 140

Ile Leu Lys Ala Ile Lys Gln Asn Glu Glu Lys Leu Ala Asn Tyr Gln

145 150 155 160

Ser Val Gly Glu Tyr Leu Tyr Lys Glu Tyr Phe Gln Lys Phe Lys Glu

165 170 175

Asn Ser Lys Glu Phe Thr Asn Val Arg Asn Lys Lys Glu Ser Tyr Glu

180 185 190

Arg Cys Ile Ala Gln Ser Phe Leu Lys Asp Glu Leu Lys Leu Ile Phe

195 200 205

Lys Lys Gln Arg Glu Phe Gly Phe Ser Phe Ser Lys Lys Phe Glu Glu

210 215 220

Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr Lys Arg Ala Leu Lys Asp Phe Ser

225 230 235 240

His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Asp Glu Lys Arg Ala Pro

245 250 255

Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met Phe Val Ala Leu Thr Arg Ile Ile

260 265 270

Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn Thr Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Lys

275 280 285

Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn Glu Val Leu Lys Asn Gly Thr Leu

290 295 300

Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Glu

305 310 315 320

Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr Phe Ile Glu Phe Lys Lys Tyr Lys

325 330 335

Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu His Asn Leu Ser Gln Asp Asp Leu

340 345 350

Asn Glu Ile Ala Lys Asp Ile Thr Leu Ile Lys Asp Glu Ile Lys Leu

355 360 365

Lys Lys Ala Leu Ala Lys Tyr Asp Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asp Ser

370 375 380

Leu Ser Lys Leu Glu Phe Lys Asp His Leu Asn Ile Ser Phe Lys Ala

385 390 395 400

Leu Lys Leu Val Thr Pro Leu Met Leu Glu Gly Lys Lys Tyr Asp Glu

405 410 415

Ala Cys Asn Glu Leu Asn Leu Lys Val Ala Ile Asn Glu Asp Lys Lys

420 425 430

Asp Phe Leu Pro Ala Phe Asn Glu Thr Tyr Tyr Lys Asp Glu Val Thr

435 440 445

Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ile Lys Glu Tyr Arg Lys Val Leu Asn

450 455 460

Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Lys Val His Lys Ile Asn Ile Glu Leu

465 470 475 480

Ala Arg Glu Val Gly Lys Asn His Ser Gln Arg Ala Lys Ile Glu Lys

485 490 495

Glu Gln Asn Glu Asn Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Ala Glu Leu Glu Cys

500 505 510

Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Asn Ser Lys Asn Ile Leu Lys Leu Arg

515 520 525

Leu Phe Lys Glu Gln Lys Glu Phe Cys Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Ile

530 535 540

Lys Ile Ser Asp Leu Gln Asp Glu Lys Met Leu Glu Ile Asp His Ile

545 550 555 560

Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp Asp Ser Tyr Met Asn Lys Val Leu

565 570 575

Val Phe Thr Lys Gln Asn Gln Glu Lys Leu Asn Gln Thr Pro Phe Glu

580 585 590

Ala Phe Gly Asn Asp Ser Ala Lys Trp Gln Lys Ile Glu Val Leu Ala

595 600 605

Lys Asn Leu Pro Thr Lys Lys Gln Lys Arg Ile Leu Asp Lys Asn Tyr

610 615 620

Lys Asp Lys Glu Gln Lys Asn Phe Lys Asp Arg Asn Leu Asn Asp Thr

625 630 635 640

Arg Tyr Ile Ala Arg Leu Val Leu Asn Tyr Thr Lys Asp Tyr Leu Asp

645 650 655

Phe Leu Pro Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr Lys Leu Asn Asp Thr Gln

660 665 670

Lys Gly Ser Lys Val His Val Glu Ala Lys Ser Gly Met Leu Thr Ser

675 680 685

Ala Leu Arg His Thr Trp Gly Phe Ser Ala Lys Asp Arg Asn Asn His

690 695 700

Leu His His Ala Ile Asp Ala Val Ile Ile Ala Tyr Ala Asn Asn Ser

705 710 715 720

Ile Val Lys Ala Phe Ser Asp Phe Lys Lys Glu Gln Glu Ser Asn Ser

725 730 735

Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Tyr Lys Asn Lys

740 745 750

Arg Lys Phe Phe Glu Pro Phe Ser Gly Phe Arg Gln Lys Val Leu Asp

755 760 765

Lys Ile Asp Glu Ile Phe Val Ser Lys Pro Glu Arg Lys Lys Pro Ser

770 775 780

Gly Ala Leu His Glu Glu Thr Phe Arg Lys Glu Glu Glu Phe Tyr Gln

785 790 795 800

Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Gly Val Leu Lys Ala Leu Glu Leu Gly Lys

805 810 815

Ile Arg Lys Val Asn Gly Lys Ile Val Lys Asn Gly Asp Met Phe Arg

820 825 830

Val Asp Ile Phe Lys His Lys Lys Thr Asn Lys Phe Tyr Ala Val Pro

835 840 845

Ile Tyr Thr Met Asp Phe Ala Leu Lys Val Leu Pro Asn Lys Ala Val

850 855 860

Ala Arg Ser Lys Lys Gly Glu Ile Lys Asp Trp Ile Leu Met Asp Glu

865 870 875 880

Asn Tyr Glu Phe Cys Phe Ser Leu Tyr Lys Asp Ser Leu Ile Leu Ile

885 890 895

Gln Thr Lys Asp Met Gln Glu Pro Glu Phe Val Tyr Tyr Asn Ala Phe

900 905 910

Thr Ser Ser Thr Val Ser Leu Ile Val Ser Lys His Asp Asn Lys Phe

915 920 925

Glu Thr Leu Ser Lys Asn Gln Lys Ile Leu Phe Lys Asn Ala Asn Glu

930 935 940

Lys Glu Val Ile Ala Lys Ser Ile Gly Ile Gln Asn Leu Lys Val Phe

945 950 955 960

Glu Lys Tyr Ile Val Ser Ala Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala Glu Phe

965 970 975

Arg Gln Arg Glu Asp Phe Lys Lys

980

<210> 103

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 103

tataatctca taagaaattt aaaaagggac taaaataaag agtttgcggg actctgcggg 60

gttacaatcc cctaaaaccg cttttaaaat t 91

<210> 104

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 104

attttaccat aaagaaattt aaaaagggac taaaac 36

<210> 105

<211> 95

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 105

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagucc cgaaagggac uaaaauaaag aguuugcggg 60

acucugcggg guuacaaucc ccuaaaaccg cuuuu 95

<210> 106

<211> 1115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид”

<400> 106

Met Ser Asp Leu Val Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Gly Ser Val Gly

1 5 10 15

Val Gly Ile Leu Asn Lys Val Thr Gly Glu Ile Ile His Lys Asn Ser

20 25 30

Arg Ile Phe Pro Ala Ala Gln Ala Glu Asn Asn Leu Val Arg Arg Thr

35 40 45

Asn Arg Gln Gly Arg Arg Leu Ala Arg Arg Lys Lys His Arg Arg Val

50 55 60

Arg Leu Asn Arg Leu Phe Glu Glu Ser Gly Leu Ile Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Lys Ile Ser Ile Asn Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Arg Val Lys Gly Leu

85 90 95

Thr Asp Glu Leu Ser Asn Glu Glu Leu Phe Ile Ala Leu Lys Asn Met

100 105 110

Val Lys His Arg Gly Ile Ser Tyr Leu Asp Asp Ala Ser Asp Asp Gly

115 120 125

Asn Ser Ser Val Gly Asp Tyr Ala Gln Ile Val Lys Glu Asn Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Glu Thr Lys Thr Pro Gly Gln Ile Gln Leu Glu Arg Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Gln Leu Arg Gly Asp Phe Thr Val Glu Lys Asp Gly Lys

165 170 175

Lys His Arg Leu Ile Asn Val Phe Pro Thr Ser Ala Tyr Arg Ser Glu

180 185 190

Ala Leu Arg Ile Leu Gln Thr Gln Gln Glu Phe Asn Pro Gln Ile Thr

195 200 205

Asp Glu Phe Ile Asn Arg Tyr Leu Glu Ile Leu Thr Gly Lys Arg Lys

210 215 220

Tyr Tyr His Gly Pro Gly Asn Glu Lys Ser Arg Thr Asp Tyr Gly Arg

225 230 235 240

Tyr Arg Thr Ser Gly Glu Thr Leu Asp Asn Ile Phe Gly Ile Leu Ile

245 250 255

Gly Lys Cys Thr Phe Tyr Pro Asp Glu Phe Arg Ala Ala Lys Ala Ser

260 265 270

Tyr Thr Ala Gln Glu Phe Asn Leu Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Thr

275 280 285

Val Pro Thr Glu Thr Lys Lys Leu Ser Lys Glu Gln Lys Asn Gln Ile

290 295 300

Ile Asn Tyr Val Lys Asn Glu Lys Ala Met Gly Pro Ala Lys Leu Phe

305 310 315 320

Lys Tyr Ile Ala Lys Leu Leu Ser Cys Asp Val Ala Asp Ile Lys Gly

325 330 335

Tyr Arg Ile Asp Lys Ser Gly Lys Ala Glu Ile His Thr Phe Glu Ala

340 345 350

Tyr Arg Lys Met Lys Thr Leu Glu Thr Leu Asp Ile Glu Gln Met Asp

355 360 365

Arg Glu Thr Leu Asp Lys Leu Ala Tyr Val Leu Thr Leu Asn Thr Glu

370 375 380

Arg Glu Gly Ile Gln Glu Ala Leu Glu His Glu Phe Ala Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Ser Gln Lys Gln Val Asp Glu Leu Val Gln Phe Arg Lys Ala Asn

405 410 415

Ser Ser Ile Phe Gly Lys Gly Trp His Asn Phe Ser Val Lys Leu Met

420 425 430

Met Glu Leu Ile Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Ser Glu Glu Gln Met Thr

435 440 445

Ile Leu Thr Arg Leu Gly Lys Gln Lys Thr Thr Ser Ser Ser Asn Lys

450 455 460

Thr Lys Tyr Ile Asp Glu Lys Leu Leu Thr Glu Glu Ile Tyr Asn Pro

465 470 475 480

Val Val Ala Lys Ser Val Arg Gln Ala Ile Lys Ile Val Asn Ala Ala

485 490 495

Ile Lys Glu Tyr Gly Asp Phe Asp Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg

500 505 510

Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met

515 520 525

Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys

530 535 540

Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu

545 550 555 560

Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp

565 570 575

Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser

580 585 590

Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp

595 600 605

Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys

610 615 620

Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr

625 630 635 640

Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser

645 650 655

Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg

660 665 670

Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr

675 680 685

Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr

690 695 700

Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr

705 710 715 720

Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu

725 730 735

Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu

740 745 750

Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met

755 760 765

Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe

770 775 780

Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

785 790 795 800

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

805 810 815

Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys

820 825 830

Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln

835 840 845

Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp

850 855 860

Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly

865 870 875 880

Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val

885 890 895

Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly

900 905 910

Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe

915 920 925

Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys

930 935 940

Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met

945 950 955 960

Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro

965 970 975

Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu

980 985 990

Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln

995 1000 1005

His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe

1010 1015 1020

Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu

1025 1030 1035

Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala

1040 1045 1050

Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro

1055 1060 1065

Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr

1070 1075 1080

Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser

1085 1090 1095

Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly

1100 1105 1110

Gly Asp

1115

<210> 107

<211> 1374

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид”

<400> 107

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Thr Asn

755 760 765

Glu Asp Asp Glu Lys Lys Ala Ile Gln Lys Ile Gln Lys Ala Asn Lys

770 775 780

Asp Glu Lys Asp Ala Ala Met Leu Lys Ala Ala Asn Gln Tyr Asn Gly

785 790 795 800

Lys Ala Glu Leu Pro His Ser Val Phe His Gly His Lys Gln Leu Ala

805 810 815

Thr Lys Ile Arg Leu Trp His Gln Gln Gly Glu Arg Cys Leu Tyr Thr

820 825 830

Gly Lys Thr Ile Ser Ile His Asp Leu Ile Asn Asn Ser Asn Gln Phe

835 840 845

Glu Val Asp His Ile Leu Pro Leu Ser Ile Thr Phe Asp Asp Ser Leu

850 855 860

Ala Asn Lys Val Leu Val Tyr Ala Thr Ala Asn Gln Glu Lys Gly Gln

865 870 875 880

Arg Thr Pro Tyr Gln Ala Leu Asp Ser Met Asp Asp Ala Trp Ser Phe

885 890 895

Arg Glu Leu Lys Ala Phe Val Arg Glu Ser Lys Thr Leu Ser Asn Lys

900 905 910

Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Thr Glu Glu Asp Ile Ser Lys Phe Asp Val

915 920 925

Arg Lys Lys Phe Ile Glu Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Ser

930 935 940

Arg Val Val Leu Asn Ala Leu Gln Glu His Phe Arg Ala His Lys Ile

945 950 955 960

Asp Thr Lys Val Ser Val Val Arg Gly Gln Phe Thr Ser Gln Leu Arg

965 970 975

Arg His Trp Gly Ile Glu Lys Thr Arg Asp Thr Tyr His His His Ala

980 985 990

Val Asp Ala Leu Ile Ile Ala Ala Ser Ser Gln Leu Asn Leu Trp Lys

995 1000 1005

Lys Gln Lys Asn Thr Leu Val Ser Tyr Ser Glu Asp Gln Leu Leu

1010 1015 1020

Asp Ile Glu Thr Gly Glu Leu Ile Ser Asp Asp Glu Tyr Lys Glu

1025 1030 1035

Ser Val Phe Lys Ala Pro Tyr Gln His Phe Val Asp Thr Leu Lys

1040 1045 1050

Ser Lys Glu Phe Glu Asp Ser Ile Leu Phe Ser Tyr Gln Val Asp

1055 1060 1065

Ser Lys Phe Asn Arg Lys Ile Ser Asp Ala Thr Ile Tyr Ala Thr

1070 1075 1080

Arg Gln Ala Lys Val Gly Lys Asp Lys Ala Asp Glu Thr Tyr Val

1085 1090 1095

Leu Gly Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Thr Gln Asp Gly Tyr Asp Ala

1100 1105 1110

Phe Met Lys Ile Tyr Lys Lys Asp Lys Ser Lys Phe Leu Met Tyr

1115 1120 1125

Arg His Asp Pro Gln Thr Phe Glu Lys Val Ile Glu Pro Ile Leu

1130 1135 1140

Glu Asn Tyr Pro Asn Lys Gln Ile Asn Glu Lys Gly Lys Glu Val

1145 1150 1155

Pro Cys Asn Pro Phe Leu Lys Tyr Lys Glu Glu His Gly Tyr Ile

1160 1165 1170

Arg Lys Tyr Ser Lys Lys Gly Asn Gly Pro Glu Ile Lys Ser Leu

1175 1180 1185

Lys Tyr Tyr Asp Ser Lys Leu Gly Asn His Ile Asp Ile Thr Pro

1190 1195 1200

Lys Asp Ser Asn Asn Lys Val Val Leu Gln Ser Val Ser Pro Trp

1205 1210 1215

Arg Ala Asp Val Tyr Phe Asn Lys Thr Thr Gly Lys Tyr Glu Ile

1220 1225 1230

Leu Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Leu Gln Phe Glu Lys Gly Thr Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Lys Ile Ser Gln Glu Lys Tyr Asn Asp Ile Lys Lys Lys

1250 1255 1260

Glu Gly Val Asp Ser Asp Ser Glu Phe Lys Phe Thr Leu Tyr Lys

1265 1270 1275

Asn Asp Leu Leu Leu Val Lys Asp Thr Glu Thr Lys Glu Gln Gln

1280 1285 1290

Leu Phe Arg Phe Leu Ser Arg Thr Met Pro Lys Gln Lys His Tyr

1295 1300 1305

Val Glu Leu Lys Pro Tyr Asp Lys Gln Lys Phe Glu Gly Gly Glu

1310 1315 1320

Ala Leu Ile Lys Val Leu Gly Asn Val Ala Asn Ser Gly Gln Cys

1325 1330 1335

Lys Lys Gly Leu Gly Lys Ser Asn Ile Ser Ile Tyr Lys Val Arg

1340 1345 1350

Thr Asp Val Leu Gly Asn Gln His Ile Ile Lys Asn Glu Gly Asp

1355 1360 1365

Lys Pro Lys Leu Asp Phe

1370

<210> 108

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид”

<400> 108

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 109

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид”

<400> 109

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

<210> 110

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид”

<400> 110

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 111

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 111

gccaaattgg acgaccctcg cgg 23

<210> 112

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 112

cgaggagacc cccgtttcgg tgg 23

<210> 113

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 113

cccgccgccg ccgtggctcg agg 23

<210> 114

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 114

tgagctctac gagatccaca agg 23

<210> 115

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 115

ctcaaaattc ataccggttg tgg 23

<210> 116

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 116

cgttaaacaa caaccggact tgg 23

<210> 117

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 117

ttcaccccgc ggcgctgaat ggg 23

<210> 118

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 118

accactacca gtccgtccac agg 23

<210> 119

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 119

agcctttctg aacacatgca cgg 23

<210> 120

<211> 39

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 120

cctgccatca atgtggccat gcatgtgttc agaaaggct 39

<210> 121

<211> 39

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 121

cctgccatca atgtggccgt gcatgtgttc agaaaggct 39

<210> 122

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 122

cactgcttaa gcctcgctcg agg 23

<210> 123

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 123

tcaccagcaa tattcgctcg agg 23

<210> 124

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 124

caccagcaat attccgctcg agg 23

<210> 125

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 125

tagcaacaga catacgctcg agg 23

<210> 126

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 126

gggcagtagt aatacgctcg agg 23

<210> 127

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 127

ccaattccca tacattattg tac 23

<210> 128

<211> 4677

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 128

tctttcttgc gctatgacac ttccagcaaa aggtagggcg ggctgcgaga cggcttcccg 60

gcgctgcatg caacaccgat gatgcttcga ccccccgaag ctccttcggg gctgcatggg 120

cgctccgatg ccgctccagg gcgagcgctg tttaaatagc caggcccccg attgcaaaga 180

cattatagcg agctaccaaa gccatattca aacacctaga tcactaccac ttctacacag 240

gccactcgag cttgtgatcg cactccgcta agggggcgcc tcttcctctt cgtttcagtc 300

acaacccgca aacatgtacc catacgatgt tccagattac gcttcgccga agaaaaagcg 360

caaggtcgaa gcgtccgaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt 420

gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg 480

caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg 540

cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa 600

gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag 660

cttcttccac agactggaag agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca 720

ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta 780

ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct 840

ggccctggcc cacatgatca agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc 900

cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt 960

cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact 1020

gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg 1080

cctgttcggc aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt 1140

cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga 1200

caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct 1260

gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc 1320

cctgagcgcc tctatgatca agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa 1380

agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa 1440

gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat 1500

caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga 1560

ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct 1620

gggagagctg cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa 1680

ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc 1740

caggggaaac agcagattcg cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg 1800

gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac 1860

caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga 1920

gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa 1980

gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa 2040

ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga 2100

ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga 2160

tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct 2220

ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct 2280

gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata 2340

caccggctgg ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg 2400

caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct 2460

gatccacgac gacagcctga cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca 2520

gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg 2580

catcctgcag acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc 2640

cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa 2700

cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct 2760

gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct 2820

gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta 2880

cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt 2940

gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt 3000

gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa 3060

gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt 3120

catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga 3180

ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat 3240

caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg 3300

cgagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc 3360

cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta 3420

cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta 3480

cttcttctac agcaacatca tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga 3540

gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa 3600

gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa 3660

aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag 3720

cgataagctg atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag 3780

ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa 3840

actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa 3900

gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat 3960

caagctgcct aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc 4020

tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct 4080

gtacctggcc agccactatg agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca 4140

gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt 4200

ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa 4260

gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac 4320

caatctggga gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta 4380

caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta 4440

cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacagc cccaagaaga agagaaaggt 4500

ggaggccagc taaggatccg gcaagactgg ccccgcttgg caacgcaaca gtgagcccct 4560

ccctagtgtg tttggggatg tgactatgta ttcgtgtgtt ggccaacggg tcaacccgaa 4620

cagattgata cccgccttgg catttcctgt cagaatgtaa cgtcagttga tggtact 4677

<210> 129

<211> 3150

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 129

tctttcttgc gctatgacac ttccagcaaa aggtagggcg ggctgcgaga cggcttcccg 60

gcgctgcatg caacaccgat gatgcttcga ccccccgaag ctccttcggg gctgcatggg 120

cgctccgatg ccgctccagg gcgagcgctg tttaaatagc caggcccccg attgcaaaga 180

cattatagcg agctaccaaa gccatattca aacacctaga tcactaccac ttctacacag 240

gccactcgag cttgtgatcg cactccgcta agggggcgcc tcttcctctt cgtttcagtc 300

acaacccgca aacatgccta agaagaagag gaaggttaac acgattaaca tcgctaagaa 360

cgacttctct gacatcgaac tggctgctat cccgttcaac actctggctg accattacgg 420

tgagcgttta gctcgcgaac agttggccct tgagcatgag tcttacgaga tgggtgaagc 480

acgcttccgc aagatgtttg agcgtcaact taaagctggt gaggttgcgg ataacgctgc 540

cgccaagcct ctcatcacta ccctactccc taagatgatt gcacgcatca acgactggtt 600

tgaggaagtg aaagctaagc gcggcaagcg cccgacagcc ttccagttcc tgcaagaaat 660

caagccggaa gccgtagcgt acatcaccat taagaccact ctggcttgcc taaccagtgc 720

tgacaataca accgttcagg ctgtagcaag cgcaatcggt cgggccattg aggacgaggc 780

tcgcttcggt cgtatccgtg accttgaagc taagcacttc aagaaaaacg ttgaggaaca 840

actcaacaag cgcgtagggc acgtctacaa gaaagcattt atgcaagttg tcgaggctga 900

catgctctct aagggtctac tcggtggcga ggcgtggtct tcgtggcata aggaagactc 960

tattcatgta ggagtacgct gcatcgagat gctcattgag tcaaccggaa tggttagctt 1020

acaccgccaa aatgctggcg tagtaggtca agactctgag actatcgaac tcgcacctga 1080

atacgctgag gctatcgcaa cccgtgcagg tgcgctggct ggcatctctc cgatgttcca 1140

accttgcgta gttcctccta agccgtggac tggcattact ggtggtggct attgggctaa 1200

cggtcgtcgt cctctggcgc tggtgcgtac tcacagtaag aaagcactga tgcgctacga 1260

agacgtttac atgcctgagg tgtacaaagc gattaacatt gcgcaaaaca ccgcatggaa 1320

aatcaacaag aaagtcctag cggtcgccaa cgtaatcacc aagtggaagc attgtccggt 1380

cgaggacatc cctgcgattg agcgtgaaga actcccgatg aaaccggaag acatcgacat 1440

gaatcctgag gctctcaccg cgtggaaacg tgctgccgct gctgtgtacc gcaaggacaa 1500

ggctcgcaag tctcgccgta tcagccttga gttcatgctt gagcaagcca ataagtttgc 1560

taaccataag gccatctggt tcccttacaa catggactgg cgcggtcgtg tttacgctgt 1620

gtcaatgttc aacccgcaag gtaacgatat gaccaaagga ctgcttacgc tggcgaaagg 1680

taaaccaatc ggtaaggaag gttactactg gctgaaaatc cacggtgcaa actgtgcggg 1740

tgtcgacaag gttccgttcc ctgagcgcat caagttcatt gaggaaaacc acgagaacat 1800

catggcttgc gctaagtctc cactggagaa cacttggtgg gctgagcaag attctccgtt 1860

ctgcttcctt gcgttctgct ttgagtacgc tggggtacag caccacggcc tgagctataa 1920

ctgctccctt ccgctggcgt ttgacgggtc ttgctctggc atccagcact tctccgcgat 1980

gctccgagat gaggtaggtg gtcgcgcggt taacttgctt cctagtgaaa ccgttcagga 2040

catctacggg attgttgcta agaaagtcaa cgagattcta caagcagacg caatcaatgg 2100

gaccgataac gaagtagtta ccgtgaccga tgagaacact ggtgaaatct ctgagaaagt 2160

caagctgggc actaaggcac tggctggtca atggctggct tacggtgtta ctcgcagtgt 2220

gactaagcgt tcagtcatga cgctggctta cgggtccaaa gagttcggct tccgtcaaca 2280

agtgctggaa gataccattc agccagctat tgattccggc aagggtctga tgttcactca 2340

gccgaatcag gctgctggat acatggctaa gctgatttgg gaatctgtga gcgtgacggt 2400

ggtagctgcg gttgaagcaa tgaactggct taagtctgct gctaagctgc tggctgctga 2460

ggtcaaagat aagaagactg gagagattct tcgcaagcgt tgcgctgtgc attgggtaac 2520

tcctgatggt ttccctgtgt ggcaggaata caagaagcct attcagacgc gcttgaacct 2580

gatgttcctc ggtcagttcc gcttacagcc taccattaac accaacaaag atagcgagat 2640

tgatgcacac aaacaggagt ctggtatcgc tcctaacttt gtacacagcc aagacggtag 2700

ccaccttcgt aagactgtag tgtgggcaca cgagaagtac ggaatcgaat cttttgcact 2760

gattcacgac tccttcggta cgattccggc tgacgctgcg aacctgttca aagcagtgcg 2820

cgaaactatg gttgacacat atgagtcttg tgatgtactg gctgatttct acgaccagtt 2880

cgctgaccag ttgcacgagt ctcaattgga caaaatgcca gcacttccgg ctaaaggtaa 2940

cttgaacctc cgtgacatct tagagtcgga cttcgcgttc gcgtaaggat ccggcaagac 3000

tggccccgct tggcaacgca acagtgagcc cctccctagt gtgtttgggg atgtgactat 3060

gtattcgtgt gttggccaac gggtcaaccc gaacagattg atacccgcct tggcatttcc 3120

tgtcagaatg taacgtcagt tgatggtact 3150

<210> 130

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (23)..(42)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 130

gaaattaata cgactcacta tannnnnnnn nnnnnnnnnn nngttttaga gctagaaata 60

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 120

ttttt 125

<210> 131

<211> 8452

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 131

tgcggtattt cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 60

ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagattat caaaaaggat 120

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 180

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 240

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 300

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 360

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 420

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 480

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 540

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 600

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 660

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 720

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 780

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 840

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 900

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 960

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 1020

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 1080

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 1140

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 1200

gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 1260

ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 1320

aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 1380

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gttgccagtg gcgataagtc 1440

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 1500

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 1560

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 1620

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 1680

ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 1740

atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 1800

cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 1860

ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 1920

gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcggt cgctgaggct tgacatgatt ggtgcgtatg 1980

tttgtatgaa gctacaggac tgatttggcg ggctatgagg gcgggggaag ctctggaagg 2040

gccgcgatgg ggcgcgcggc gtccagaagg cgccatacgg cccgctggcg gcacccatcc 2100

ggtataaaag cccgcgaccc cgaacggtga cctccacttt cagcgacaaa cgagcactta 2160

tacatacgcg actattctgc cgctatacat aaccactcag ctagcttaag atcccatcaa 2220

gcttgcatgc cgggcgcgcc agaaggagcg cagccaaacc aggatgatgt ttgatggggt 2280

atttgagcac ttgcaaccct tatccggaag ccccctggcc cacaaaggct aggcgccaat 2340

gcaagcagtt cgcatgcagc ccctggagcg gtgccctcct gataaaccgg ccagggggcc 2400

tatgttcttt acttttttac aagagaagtc actcaacatc ttaaaatggc caggtgagtc 2460

gacgagcaag cccggcggat caggcagcgt gcttgcagat ttgacttgca acgcccgcat 2520

tgtgtcgacg aaggcttttg gctcctctgt cgctgtctca agcagcatct aaccctgcgt 2580

cgccgtttcc atttgcagga gattcgaggt accatgtacc catacgatgt tccagattac 2640

gcttcgccga agaaaaagcg caaggtcgaa gcgtccgaca agaagtacag catcggcctg 2700

gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc 2760

aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga 2820

gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga 2880

agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag 2940

atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag agtccttcct ggtggaagag 3000

gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac 3060

gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc 3120

gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca agttccgggg ccacttcctg 3180

atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg 3240

cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag 3300

gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg 3360

cccggcgaga agaagaatgg cctgttcggc aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc 3420

cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac 3480

acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg 3540

tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac 3600

accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca agagatacga cgagcaccac 3660

caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag 3720

attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg agccagccag 3780

gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg 3840

ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc 3900

atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt 3960

tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc 4020

tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg cctggatgac cagaaagagc 4080

gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag 4140

agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc 4200

aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac 4260

gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg 4320

gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc 4380

aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc 4440

tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt cctggacaat 4500

gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga 4560

gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag 4620

cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc 4680

atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc 4740

aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga cctttaaaga ggacatccag 4800

aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc 4860

agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa 4920

gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc 4980

acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa 5040

gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag 5100

aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac 5160

atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac 5220

gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac 5280

gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc 5340

aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc 5400

gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag 5460

cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg 5520

atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat 5580

ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcctacctg 5640

aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg 5700

tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc 5760

ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca tgaacttttt caagaccgag 5820

attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc 5880

ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg 5940

ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct 6000

atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag 6060

aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg 6120

gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg 6180

gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa 6240

gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc 6300

cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc 6360

tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg agaagctgaa gggctccccc 6420

gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct ggacgagatc 6480

atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa 6540

gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc 6600

atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc 6660

accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac 6720

cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacagc 6780

cccaagaaga agagaaaggt ggaggccagc taacatatga ttcgaatgtc tttcttgcgc 6840

tatgacactt ccagcaaaag gtagggcggg ctgcgagacg gcttcccggc gctgcatgca 6900

acaccgatga tgcttcgacc ccccgaagct ccttcggggc tgcatgggcg ctccgatgcc 6960

gctccagggc gagcgctgtt taaatagcca ggcccccgat tgcaaagaca ttatagcgag 7020

ctaccaaagc catattcaaa cacctagatc actaccactt ctacacaggc cactcgagct 7080

tgtgatcgca ctccgctaag ggggcgcctc ttcctcttcg tttcagtcac aacccgcaaa 7140

catgacacaa gaatccctgt tacttctcga ccgtattgat tcggatgatt cctacgcgag 7200

cctgcggaac gaccaggaat tctgggaggt gagtcgacga gcaagcccgg cggatcaggc 7260

agcgtgcttg cagatttgac ttgcaacgcc cgcattgtgt cgacgaaggc ttttggctcc 7320

tctgtcgctg tctcaagcag catctaaccc tgcgtcgccg tttccatttg cagccgctgg 7380

cccgccgagc cctggaggag ctcgggctgc cggtgccgcc ggtgctgcgg gtgcccggcg 7440

agagcaccaa ccccgtactg gtcggcgagc ccggcccggt gatcaagctg ttcggcgagc 7500

actggtgcgg tccggagagc ctcgcgtcgg agtcggaggc gtacgcggtc ctggcggacg 7560

ccccggtgcc ggtgccccgc ctcctcggcc gcggcgagct gcggcccggc accggagcct 7620

ggccgtggcc ctacctggtg atgagccgga tgaccggcac cacctggcgg tccgcgatgg 7680

acggcacgac cgaccggaac gcgctgctcg ccctggcccg cgaactcggc cgggtgctcg 7740

gccggctgca cagggtgccg ctgaccggga acaccgtgct caccccccat tccgaggtct 7800

tcccggaact gctgcgggaa cgccgcgcgg cgaccgtcga ggaccaccgc gggtggggct 7860

acctctcgcc ccggctgctg gaccgcctgg aggactggct gccggacgtg gacacgctgc 7920

tggccggccg cgaaccccgg ttcgtccacg gcgacctgca cgggaccaac atcttcgtgg 7980

acctggccgc gaccgaggtc accgggatcg tcgacttcac cgacgtctat gcgggagact 8040

cccgctacag cctggtgcaa ctgcatctca acgccttccg gggcgaccgc gagatcctgg 8100

ccgcgctgct cgacggggcg cagtggaagc ggaccgagga cttcgcccgc gaactgctcg 8160

ccttcacctt cctgcacgac ttcgaggtgt tcgaggagac cccgctggat ctctccggct 8220

tcaccgatcc ggaggaactg gcgcagttcc tctgggggcc gccggacacc gcccccggcg 8280

cctgataagg atccggcaag actggccccg cttggcaacg caacagtgag cccctcccta 8340

gtgtgtttgg ggatgtgact atgtattcgt gtgttggcca acgggtcaac ccgaacagat 8400

tgatacccgc cttggcattt cctgtcagaa tgtaacgtca gttgatggta ct 8452

<210> 132

<211> 27

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 132

ccgtgccggg cggggagacc gccatgg 27

<210> 133

<211> 22

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 133

ggcccggctg tggctgagga gc 22

<210> 134

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 134

cggtctcccg cccggcacgg 20

<210> 135

<211> 26

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 135

gctcctcagc cacagccggg ccgggt 26

<210> 136

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 136

cgaccctgga aa 12

<210> 137

<211> 14

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 137

ccccgccgcc accc 14

<210> 138

<211> 18

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 138

tttccagggt cgccatgg 18

<210> 139

<211> 10

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 139

ggcggcgggg 10

<210> 140

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 140

acccttgtta gccacctccc 20

<210> 141

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 141

gaacgcagtg ctcttcgaag 20

<210> 142

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 142

ctcacgccct gctccgtgta 20

<210> 143

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 143

ggcgacaact acttcctggt 20

<210> 144

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 144

ctcacgccct gctccgtgta 20

<210> 145

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 145

gggcgacaac tacttcctgg 20

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 146

cctcttcagg gccggggtgg 20

<210> 147

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 147

gaggacccag gtggaactgc 20

<210> 148

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 148

tcagctccag gcggtcctgg 20

<210> 149

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 149

agcagcagca gcagtggcag 20

<210> 150

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 150

tgggcaccgt cagctccagg 20

<210> 151

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 151

cagcagtggc agcggccacc 20

<210> 152

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 152

acctctcccc tggccctcat 20

<210> 153

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 153

ccaggaccgc ctggagctga 20

<210> 154

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 154

ccgtcagctc caggcggtcc 20

<210> 155

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 155

agcagcagca gcagtggcag 20

<210> 156

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 156

atgtgccaag caaagcctca 20

<210> 157

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 157

ttcggtcatg cccgtggatg 20

<210> 158

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 158

gtcgttgaaa ttcatcgtac 20

<210> 159

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 159

accacctgtg aagagtttcc 20

<210> 160

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 160

cgtcgttgaa attcatcgta 20

<210> 161

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 161

accacctgtg aagagtttcc 20

<210> 162

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 162

gaacgcagtg cttttcgagg 20

<210> 163

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 163

acccttgttg gccacctccc 20

<210> 164

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 164

ggtgacaact actatctggt 20

<210> 165

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 165

ctcacaccct gctccgtgta 20

<210> 166

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 166

gggtgacaac tactatctgg 20

<210> 167

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 167

ctcacaccct gctccgtgta 20

<210> 168

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 168

cgagaacgca gtgcttttcg 20

<210> 169

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 169

acccttgttg gccacctccc 20

<210> 170

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 170

atgagccaag caaatcctca 20

<210> 171

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 171

ttccgtcatg cccgtggaca 20

<210> 172

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 172

cttcgttgaa aaccattgta 20

<210> 173

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 173

ccacctctga agagtttcct 20

<210> 174

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 174

cttcgttgaa aaccattgta 20

<210> 175

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 175

accacctctg aagagtttcc 20

<210> 176

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 176

cttccactca ctctgcgatt 20

<210> 177

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 177

accatgtctc agtgtcaagc 20

<210> 178

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 178

ggcggcaaca gcggcaacag 20

<210> 179

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 179

actgctctgc gtggctgcgg 20

<210> 180

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 180

ccgcagccac gcagagcagt 20

<210> 181

<211> 20

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 181

gcacctctcc tcgccccgat 20

<210> 182

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 182

gagggcctat ttcccatgat tcc 23

<210> 183

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (84)..(102)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 183

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacnnnnnnn nnnnnnnnnn nnccggtgtt tcgtcctttc 120

cacaag 126

<210> 184

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (6)..(24)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 184

caccgnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 185

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (5)..(23)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 185

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnc 24

<210> 186

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 186

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacccctagt cattggaggt gaccggtgtt tcgtcctttc 120

cacaag 126

<210> 187

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 187

caccgtcacc tccaatgact aggg 24

<210> 188

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 188

aaacccctag tcattggagg tgac 24

<210> 189

<211> 192

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 189

cagaagaaga agggctccca tcacatcaac cggtggcgca ttgccacgaa gcaggccaat 60

ggggaggaca tcgatgtcac ctccaatgac aagcttgcta gcggtgggca accacaaacc 120

cacgagggca gagtgctgct tgctgctggc caggcccctg cgtgggccca agctggactc 180

tggccactcc ct 192

<210> 190

<211> 192

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 190

agggagtggc cagagtccag cttgggccca cgcaggggcc tggccagcag caagcagcac 60

tctgccctcg tgggtttgtg gttgcccacc gctagcaagc ttgtcattgg aggtgacatc 120

gatgtcctcc ccattggcct gcttcgtggc aatgcgccac cggttgatgt gatgggagcc 180

cttcttcttc tg 192

<210> 191

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 191

ccatcccctt ctgtgaatgt 20

<210> 192

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 192

ggagattgga gacacggaga 20

<210> 193

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 193

ggctccctgg gttcaaagta 20

<210> 194

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 194

agaggggtct ggatgtcgta a 21

<210> 195

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 195

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 196

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 196

gagggtctcg tccttgcggc cgcgctagcg agggcctatt tcccatgatt c 51

<210> 197

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (95)..(114)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 197

ctcggtctcg gtaaaaaagc accgactcgg tgccactttt tcaagttgat aacggactag 60

ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnggtgtt 120

tcgtcctttc cac 133

<210> 198

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 198

gagggtctct ttaccggtga gggcctattt cccatgattc c 41

<210> 199

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (95)..(114)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 199

ctcggtctcc tcaaaaaagc accgactcgg tgccactttt tcaagttgat aacggactag 60

ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnggtgtt 120

tcgtcctttc cac 133

<210> 200

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 200

gagggtctct ttgagctcga gggcctattt cccatgattc 40

<210> 201

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (96)..(115)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 201

ctcggtctcg cgtaaaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta 60

gccttatttt aacttgctat ttctagctct aaaacnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnggtgt 120

ttcgtccttt cca 133

<210> 202

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 202

gagggtctct tacgcgtgtg tctagac 27

<210> 203

<211> 98

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 203

ctcggtctca aggacaggga agggagcagt ggttcacgcc tgtaatccca gcaatttggg 60

aggccaaggt gggtagatca cctgagatta ggagttgc 98

<210> 204

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 204

cctgtccttg cggccgcgct agcgagggcc 30

<210> 205

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 205

cacgcggccg caaggacagg gaagggagca g 31

<210> 206

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид”

<400> 206

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser

225 230 235 240

Gly Leu Arg Ser Arg Glu Glu Glu Glu Glu Thr Asp Ser Arg Met Pro

245 250 255

His Leu Asp Ser Pro Gly Ser Ser Gln Pro Arg Arg Ser Phe Leu Ser

260 265 270

Arg Val Ile Arg Ala Ala Leu Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu

275 280 285

Leu Leu Leu Ala Cys Leu Leu Pro Ala Ser Glu Asp Asp Tyr Ser Cys

290 295 300

Thr Gln Ala Asn Asn Phe Ala Arg Ser Phe Tyr Pro Met Leu Arg Tyr

305 310 315 320

Thr Asn Gly Pro Pro Pro Thr

325

<210> 207

<211> 3243

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 207

accggtgcca ccatgtaccc atacgatgtt ccagattacg cttcgccgaa gaaaaagcgc 60

aaggtcgaag cgtccatgaa aaggaactac attctggggc tggacatcgg gattacaagc 120

gtggggtatg ggattattga ctatgaaaca agggacgtga tcgacgcagg cgtcagactg 180

ttcaaggagg ccaacgtgga aaacaatgag ggacggagaa gcaagagggg agccaggcgc 240

ctgaaacgac ggagaaggca cagaatccag agggtgaaga aactgctgtt cgattacaac 300

ctgctgaccg accattctga gctgagtgga attaatcctt atgaagccag ggtgaaaggc 360

ctgagtcaga agctgtcaga ggaagagttt tccgcagctc tgctgcacct ggctaagcgc 420

cgaggagtgc ataacgtcaa tgaggtggaa gaggacaccg gcaacgagct gtctacaaag 480

gaacagatct cacgcaatag caaagctctg gaagagaagt atgtcgcaga gctgcagctg 540

gaacggctga agaaagatgg cgaggtgaga gggtcaatta ataggttcaa gacaagcgac 600

tacgtcaaag aagccaagca gctgctgaaa gtgcagaagg cttaccacca gctggatcag 660

agcttcatcg atacttatat cgacctgctg gagactcgga gaacctacta tgagggacca 720

ggagaaggga gccccttcgg atggaaagac atcaaggaat ggtacgagat gctgatggga 780

cattgcacct attttccaga agagctgaga agcgtcaagt acgcttataa cgcagatctg 840

tacaacgccc tgaatgacct gaacaacctg gtcatcacca gggatgaaaa cgagaaactg 900

gaatactatg agaagttcca gatcatcgaa aacgtgttta agcagaagaa aaagcctaca 960

ctgaaacaga ttgctaagga gatcctggtc aacgaagagg acatcaaggg ctaccgggtg 1020

acaagcactg gaaaaccaga gttcaccaat ctgaaagtgt atcacgatat taaggacatc 1080

acagcacgga aagaaatcat tgagaacgcc gaactgctgg atcagattgc taagatcctg 1140

actatctacc agagctccga ggacatccag gaagagctga ctaacctgaa cagcgagctg 1200

acccaggaag agatcgaaca gattagtaat ctgaaggggt acaccggaac acacaacctg 1260

tccctgaaag ctatcaatct gattctggat gagctgtggc atacaaacga caatcagatt 1320

gcaatcttta accggctgaa gctggtccca aaaaaggtgg acctgagtca gcagaaagag 1380

atcccaacca cactggtgga cgatttcatt ctgtcacccg tggtcaagcg gagcttcatc 1440

cagagcatca aagtgatcaa cgccatcatc aagaagtacg gcctgcccaa tgatatcatt 1500

atcgagctgg ctagggagaa gaacagcaag gacgcacaga agatgatcaa tgagatgcag 1560

aaacgaaacc ggcagaccaa tgaacgcatt gaagagatta tccgaactac cgggaaagag 1620

aacgcaaagt acctgattga aaaaatcaag ctgcacgata tgcaggaggg aaagtgtctg 1680

tattctctgg aggccatccc cctggaggac ctgctgaaca atccattcaa ctacgaggtc 1740

gatcatatta tccccagaag cgtgtccttc gacaattcct ttaacaacaa ggtgctggtc 1800

aagcaggaag agaactctaa aaagggcaat aggactcctt tccagtacct gtctagttca 1860

gattccaaga tctcttacga aacctttaaa aagcacattc tgaatctggc caaaggaaag 1920

ggccgcatca gcaagaccaa aaaggagtac ctgctggaag agcgggacat caacagattc 1980

tccgtccaga aggattttat taaccggaat ctggtggaca caagatacgc tactcgcggc 2040

ctgatgaatc tgctgcgatc ctatttccgg gtgaacaatc tggatgtgaa agtcaagtcc 2100

atcaacggcg ggttcacatc ttttctgagg cgcaaatgga agtttaaaaa ggagcgcaac 2160

aaagggtaca agcaccatgc cgaagatgct ctgattatcg caaatgccga cttcatcttt 2220

aaggagtgga aaaagctgga caaagccaag aaagtgatgg agaaccagat gttcgaagag 2280

aagcaggccg aatctatgcc cgaaatcgag acagaacagg agtacaagga gattttcatc 2340

actcctcacc agatcaagca tatcaaggat ttcaaggact acaagtactc tcaccgggtg 2400

gataaaaagc ccaacagaga gctgatcaat gacaccctgt atagtacaag aaaagacgat 2460

aaggggaata ccctgattgt gaacaatctg aacggactgt acgacaaaga taatgacaag 2520

ctgaaaaagc tgatcaacaa aagtcccgag aagctgctga tgtaccacca tgatcctcag 2580

acatatcaga aactgaagct gattatggag cagtacggcg acgagaagaa cccactgtat 2640

aagtactatg aagagactgg gaactacctg accaagtata gcaaaaagga taatggcccc 2700

gtgatcaaga agatcaagta ctatgggaac aagctgaatg cccatctgga catcacagac 2760

gattacccta acagtcgcaa caaggtggtc aagctgtcac tgaagccata cagattcgat 2820

gtctatctgg acaacggcgt gtataaattt gtgactgtca agaatctgga tgtcatcaaa 2880

aaggagaact actatgaagt gaatagcaag tgctacgaag aggctaaaaa gctgaaaaag 2940

attagcaacc aggcagagtt catcgcctcc ttttacaaca acgacctgat taagatcaat 3000

ggcgaactgt atagggtcat cggggtgaac aatgatctgc tgaaccgcat tgaagtgaat 3060

atgattgaca tcacttaccg agagtatctg gaaaacatga atgataagcg cccccctcga 3120

attatcaaaa caattgcctc taagactcag agtatcaaaa agtactcaac cgacattctg 3180

ggaaacctgt atgaggtgaa gagcaaaaag caccctcaga ttatcaaaaa gggctaagaa 3240

ttc 3243

<210> 208

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 208

gcugcggauu gcggccgucu cucgauuugc uacucu 36

<210> 209

<211> 123

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 209

uagcaaaucg agaggcgguc gcuuuucgca agcaaauuga ccccuugugc gggcucggca 60

ucccaagguc agcugccggu uauuaucgaa aaggcccacc gcaagcagcg cgugggccuu 120

uuu 123

<210> 210

<211> 122

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 210

gcugcggauu gcgggaaauc gcuuuucgca agcaaauuga ccccuugugc gggcucggca 60

ucccaagguc agcugccggu uauuaucgaa aaggcccacc gcaagcagcg cgugggccuu 120

uu 122

<210> 211

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 211

acugggguuc aguucucaaa aacccugaua gacuuc 36

<210> 212

<211> 106

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 212

agucacuaac uuaauuaaau agaacugaac cucaguaagc auuggcucgu uuccaauguu 60

gauugcuccg ccggugcucc uuauuuuuaa gggcgccggc uuucuu 106

<210> 213

<211> 96

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 213

acugggguuc aggaaacuga accucaguaa gcauuggcuc guuuccaaug uugauugcuc 60

cgccggugcu ccuuauuuuu aagggcgccg gcuuuu 96

<210> 214

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 214

guuuuuguac ucucaagauu uaaguaaccg uaaaac 36

<210> 215

<211> 90

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 215

cuugcacggu uacuuaaauc uugcugagcc uacaaagaua aggcuuuaug ccgaauucaa 60

gcaccccaug uuuugacaug aggugcuuuu 90

<210> 216

<211> 81

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 216

guuuuuguac ucgaaagagc cuacaaagau aaggcuuuau gccgaauuca agcaccccau 60

guuuugacau gaggugcuuu u 81

<210> 217

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 217

guuguagcuc ccauucucau uucgcagugc uacaau 36

<210> 218

<211> 139

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 218

auugucgcac ugcgaaauga gaaccguugc uacaauaagg ccgucugaaa agaugugccg 60

caacgcucug ccccuuaaag cuucugcuuu aaggggcauc guuuauuucg guuaaaaaug 120

ccgucugaaa ccgguuuuu 139

<210> 219

<211> 162

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 219

guuguagcuc ccauucucga aagagaaccg uugcuacaau aaggccgucu gaaaagaugu 60

gccgcaacgc ucugccccuu aaagcuucug cuuuaagggg caucguuuau uucgguuaaa 120

aaugccgucu gaaaccgguu uuuagguuuc agacggcauu uu 162

<210> 220

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 220

guuuuaguac ucuguaauuu uagguaugag guagac 36

<210> 221

<211> 85

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 221

auuguacuua uaccuaaaau uacagaaucu acuaaaacaa ggcaaaaugc cguguuuauc 60

ucgucaacuu guuggcgaga uuuuu 85

<210> 222

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 222

guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaaugccgug uuuaucucgu 60

caacuuguug gcgagauuuu 80

<210> 223

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 223

guuuuagucu cuuuuuaaau uucuuuauga uaaaau 36

<210> 224

<211> 124

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 224

aauucuugcu aaagaaauuu aaaaagagac uaaaauaagu gguuuuuggu cauccacgca 60

ggguuacaau cccuuuaaaa ccauuaaaau ucaaauaaac uagguuguau caacuuaguu 120

uuuu 124

<210> 225

<211> 114

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 225

guuuuagucu cugaaaagag acuaaaauaa gugguuuuug gucauccacg caggguuaca 60

aucccuuuaa aaccauuaaa auucaaauaa acuagguugu aucaacuuag uuuu 114

<210> 226

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 226

guuuuagagc uaugcuguuu ugaauggucc caaaac 36

<210> 227

<211> 87

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 227

guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gcuuuuu 87

<210> 228

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 228

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu 80

<210> 229

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 229

guuuuuguac ucucaagauu uaaguaacug uacaac 36

<210> 230

<211> 89

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 230

cuuacacagu uacuuaaauc uugcagaagc uacaaagaua aggcuucaug ccgaaaucaa 60

cacccuguca uuuuauggca ggguguuuu 89

<210> 231

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 231

guuuuuguac ucgaaagaag cuacaaagau aaggcuucau gccgaaauca acacccuguc 60

auuuuauggc aggguguuuu 80

<210> 232

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 232

taatcactat ggatcttcta taccatt 27

<210> 233

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 233

tcttgtagga ggagagactt cagcatg 27

<210> 234

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 234

ggtgcaagcc gaacagatga tggacag 27

<210> 235

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 235

tatcctaaag ttcttattta aggtttg 27

<210> 236

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 236

ttaatttatg aaaatctcgt aggtgaa 27

<210> 237

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 237

atgccccatt cacatcagta cagtgac 27

<210> 238

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 238

gtgttgagta acatatacct gtttgta 27

<210> 239

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 239

taactaacca ggtaagttca tggagta 27

<210> 240

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 240

aatgatacaa acattaggat atgaata 27

<210> 241

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 241

atgtcaaatg atacaaacat taggata 27

<210> 242

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 242

ggtcactgta ctgatgtgaa tggggca 27

<210> 243

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 243

cggtcactgt actgatgtga atggggc 27

<210> 244

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 244

tgtcaaatga tacaaacatt aggatat 27

<210> 245

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 245

aacctcactt atcttcttgt aggagga 27

<210> 246

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 246

ccaggtaagt tcatggagta tcagaaa 27

<210> 247

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 247

taacatatac ctgtttgtag ttagaaa 27

<210> 248

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 248

tcacctccaa tgactagggt gggcaac 27

<210> 249

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 249

tgacggtgca agccgaacag atgatggaca g 31

<210> 250

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 250

acctggtggg cgacgtgctg gggagtc 27

<210> 251

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 251

atggagcagt ctcagtcttc gggcacc 27

<210> 252

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 252

gaatgaaaat gacggtgcaa gccgaacaga t 31

<210> 253

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 253

ttaatggtat agaagatcca tagtgat 27

<210> 254

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 254

tgtcacctcc aatgactagg gtgggca 27

<210> 255

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 255

ccatggagca gtctcagtct tcgggca 27

<210> 256

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 256

gcaccagcat cggcacagtg gtgggca 27

<210> 257

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 257

cgacggtcac tgtactgatg tgaatggggc a 31

<210> 258

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 258

ccgagcagaa gaagaagggc tcccatc 27

<210> 259

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 259

attttaatca ctatggatct tctataccat t 31

<210> 260

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 260

ccaaaactcg aattcaacct ggtcata 27

<210> 261

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 261

tgcagcacag tttcttcaag gagcata 27

<210> 262

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 262

gttcttaatt tatgaaaatc tcgtaggtga a 31

<210> 263

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 263

gagtccgagc agaagaagaa gggctcc 27

<210> 264

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 264

tgacggtgca agccgaacag atgatggaca g 31

<210> 265

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 265

atcagaaaag aaagaacagc tggagtc 27

<210> 266

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 266

gcaacaacaa gatctgtggc tggaatt 27

<210> 267

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 267

tgttcccaca ataacttccc aggggtg 27

<210> 268

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 268

tgagtaacat atacctgttt gtagttagaa a 31

<210> 269

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 269

caaccacaaa cccacgaggg cagagtg 27

<210> 270

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 270

tagggttagg ggccccaggc cggggtc 27

<210> 271

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 271

cctctaacta accaggtaag ttcatggagt a 31

<210> 272

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 272

taagagagta ggctggtaga tggagtt 27

<210> 273

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 273

gagtaggctg gtagatggag ttgggtt 27

<210> 274

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 274

gttgaagatg aagcccagag cggagtg 27

<210> 275

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 275

tggatgccca ggatgggggt gagagta 27

<210> 276

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 276

aaagaaagag catgttaaaa taggata 27

<210> 277

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 277

tcagacatga gatcacagat gcgggtg 27

<210> 278

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 278

gatgcgggtg atgatgctct ttgggtc 27

<210> 279

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 279

tcatggctac cagttccacc cggggta 27

<210> 280

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 280

cccgggtgga actggtagcc atgaatg 27

<210> 281

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 281

cttccgacga ggtggccatc aaggatt 27

<210> 282

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 282

caccatctct ccgtggtacc ccgggtg 27

<210> 283

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 283

atctcttaga taccagcatc cagggtg 27

<210> 284

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 284

tcaatctccc gatgggcacc ctggatg 27

<210> 285

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 285

gcccatcggg agattgaggg cagggtc 27

<210> 286

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 286

acttcaacag cgtgccggag gaggatg 27

<210> 287

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 287

ccgctgacca cacctgccag gtgggtg 27

<210> 288

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 288

tggcaggtgt ggtcagcggc cgggatg 27

<210> 289

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 289

atcagaaaag aaagaacagc tggagtc 27

<210> 290

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 290

gcaacaacaa gatctgtggc tggaatt 27

<210> 291

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 291

tgttcccaca ataacttccc aggggtg 27

<210> 292

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 292

gaggaccgcc ctgggcctgg gagaat 26

<210> 293

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 293

cacgagggga agagggggca agggat 26

<210> 294

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 294

cgcccatctt ctagaaagac tggagt 26

<210> 295

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 295

agtctttcta gaagatgggc gggagt 26

<210> 296

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 296

gtgtgggcgt tgtcctgcag gggaat 26

<210> 297

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 297

taggggcaaa taggaaaatg gaggat 26

<210> 298

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 298

caaataggaa aatggaggat aggagt 26

<210> 299

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 299

aatggaggat aggagtcatc tggggt 26

<210> 300

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 300

tcctcatgga aatctccgag gcggat 26

<210> 301

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 301

aggagataaa gacatgtcac ccgagt 26

<210> 302

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 302

ctaagcagga gagtataaac tcgggt 26

<210> 303

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 303

ctgtagtagg atctaagcag gagagt 26

<210> 304

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 304

cactgtattt catactgtag taggat 26

<210> 305

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 305

ctgcagaagg agcgggagaa atggat 26

<210> 306

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 306

gagtgttgca atacctttct gggagt 26

<210> 307

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 307

cctggacacc ccgttctcct gtggat 26

<210> 308

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 308

acagcatgtt tgctgcctcc agggat 26

<210> 309

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 309

gtggtcccag ctcggggaca caggat 26

<210> 310

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 310

cggttaatgt ggctctggtt ctgggt 26

<210> 311

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 311

tgtccctagt ggccccactg tggggt 26

<210> 312

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 312

tccttcctag tctcctgata ttgggt 26

<210> 313

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 313

cctgaagtgg acataggggc ccgggt 26

<210> 314

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 314

gagagatggc tccaggaaat gggggt 26

<210> 315

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 315

ttgcttacga tggagccaga gaggat 26

<210> 316

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 316

gagccacatt aaccggccct gggaat 26

<210> 317

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 317

cacagtgggg ccactaggga caggat 26

<210> 318

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 318

gactaggaag gaggaggcct aaggat 26

<210> 319

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 319

gaatctgcct aacaggaggt gggggt 26

<210> 320

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 320

tgggggtgtg tcaccagata aggaat 26

<210> 321

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 321

ccctgccaag ctctccctcc caggat 26

<210> 322

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 322

ctgggaggga gagcttggca gggggt 26

<210> 323

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 323

cagggggtgg gagggaaggg ggggat 26

<210> 324

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 324

ggtggctaaa gccagggaga cggggt 26

<210> 325

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 325

tagggttagg ggccccaggc cggggt 26

<210> 326

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 326

atgggaagac tgaggctaca tagggt 26

<210> 327

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 327

catcaggctc tcagctcagc ctgagt 26

<210> 328

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 328

gtggctgctc tgggggcctc ctgagt 26

<210> 329

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 329

gaagctggag gaggaagggc ctgagt 26

<210> 330

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 330

tcgatgtcac ctccaatgac tagggt 26

<210> 331

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 331

gcaagcagca ctctgccctc gtgggt 26

<210> 332

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 332

caaccacaaa cccacgaggg cagagt 26

<210> 333

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 333

aagcctggcc agggagtggc cagagt 26

<210> 334

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 334

gcctccccaa agcctggcca gggagt 26

<210> 335

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 335

ggccaggctt tggggaggcc tggagt 26

<210> 336

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 336

caggctgagc tgagagcctg atggga 26

<210> 337

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 337

ctcaacactc aggctgagct gagagc 26

<210> 338

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 338

gcctcaacac tcaggctgag ctgaga 26

<210> 339

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 339

ctggggcctc aacactcagg ctgagc 26

<210> 340

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 340

gaggccccca gagcagccac tggggc 26

<210> 341

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 341

ggaggccccc agagcagcca ctgggg 26

<210> 342

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 342

tgagaaactc aggaggcccc cagagc 26

<210> 343

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 343

ggggcacaga tgagaaactc aggagg 26

<210> 344

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 344

aggggcacag atgagaaact caggag 26

<210> 345

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 345

agggagggag gggcacagat gagaaa 26

<210> 346

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 346

ccagggaggg aggggcacag atgaga 26

<210> 347

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 347

ttcacctggg ccagggaggg aggggc 26

<210> 348

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 348

cttcacctgg gccagggagg gagggg 26

<210> 349

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 349

accttcacct gggccaggga gggagg 26

<210> 350

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 350

caccttcacc tgggccaggg agggag 26

<210> 351

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 351

accacacctt cacctgggcc agggag 26

<210> 352

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 352

acaccttcac ctgggccagg gaggga 26

<210> 353

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 353

ccacaccttc acctgggcca gggagg 26

<210> 354

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 354

aaccacacct tcacctgggc caggga 26

<210> 355

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 355

ttctggaacc acaccttcac ctgggc 26

<210> 356

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 356

tgtactttgt cctccggttc tggaac 26

<210> 357

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 357

ttgtactttg tcctccggtt ctggaa 26

<210> 358

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 358

gggagccctt cttcttctgc tcggac 26

<210> 359

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 359

gcgccaccgg ttgatgtgat gggagc 26

<210> 360

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 360

tgcgccaccg gttgatgtga tgggag 26

<210> 361

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 361

atgcgccacc ggttgatgtg atggga 26

<210> 362

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 362

ctctcagctc agcctgagtg ttgagg 26

<210> 363

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 363

ttgaggcccc agtggctgct ctgggg 26

<210> 364

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 364

tgaggcccca gtggctgctc tggggg 26

<210> 365

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 365

gaggccccag tggctgctct gggggc 26

<210> 366

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 366

cccctccctc cctggcccag gtgaag 26

<210> 367

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 367

cccaggtgaa ggtgtggttc cagaac 26

<210> 368

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 368

gtgaaggtgt ggttccagaa ccggag 26

<210> 369

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 369

tgaaggtgtg gttccagaac cggagg 26

<210> 370

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 370

aaggtgtggt tccagaaccg gaggac 26

<210> 371

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 371

ggaggacaaa gtacaaacgg cagaag 26

<210> 372

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 372

caaagtacaa acggcagaag ctggag 26

<210> 373

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 373

aaagtacaaa cggcagaagc tggagg 26

<210> 374

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 374

agtacaaacg gcagaagctg gaggag 26

<210> 375

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 375

gtacaaacgg cagaagctgg aggagg 26

<210> 376

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 376

acaaacggca gaagctggag gaggaa 26

<210> 377

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 377

caaacggcag aagctggagg aggaag 26

<210> 378

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 378

acggcagaag ctggaggagg aagggc 26

<210> 379

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 379

ggaggaggaa gggcctgagt ccgagc 26

<210> 380

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 380

aggaagggcc tgagtccgag cagaag 26

<210> 381

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 381

aagggcctga gtccgagcag aagaag 26

<210> 382

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 382

ggcctgagtc cgagcagaag aagaag 26

<210> 383

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 383

ctgagtccga gcagaagaag aagggc 26

<210> 384

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 384

tcaaccggtg gcgcattgcc acgaag 26

<210> 385

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 385

ggccactccc tggccaggct ttgggg 26

<210> 386

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 386

gccactccct ggccaggctt tgggga 26

<210> 387

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 387

ccactccctg gccaggcttt ggggag 26

<210> 388

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 388

cactccctgg ccaggctttg gggagg 26

<210> 389

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 389

tggccaggct ttggggaggc ctggag 26

<210> 390

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 390

ggcctcccca aagcctggcc agggag 26

<210> 391

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 391

aggcctcccc aaagcctggc caggga 26

<210> 392

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 392

tgtcacctcc aatgactagg gtgggc 26

<210> 393

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 393

gtgggcaacc acaaacccac gagggc 26

<210> 394

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 394

tggttgccca ccctagtcat tggagg 26

<210> 395

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 395

gtggttgccc accctagtca ttggag 26

<210> 396

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 396

ggcctggagt catggcccca cagggc 26

<210> 397

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 397

gagtcatggc cccacagggc ttgaag 26

<210> 398

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 398

gccccgggct tcaagccctg tggggc 26

<210> 399

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 399

ggccccgggc ttcaagccct gtgggg 26

<210> 400

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 400

cattgccacg aagcaggcca atgggg 26

<210> 401

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 401

attgccacga agcaggccaa tgggga 26

<210> 402

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 402

ttgccacgaa gcaggccaat ggggag 26

<210> 403

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 403

tgccacgaag caggccaatg gggagg 26

<210> 404

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 404

ccacgaagca ggccaatggg gaggac 26

<210> 405

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 405

gggtgggcaa ccacaaaccc acgagg 26

<210> 406

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 406

gctgctggcc aggcccctgc gtgggc 26

<210> 407

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 407

gagtccagct tgggcccacg cagggg 26

<210> 408

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 408

tagggttagg ggccccaggc cgggg 25

<210> 409

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 409

cactgtgtcc tcttcctgcc 20

<210> 410

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 410

atgagaaact caggaggccc 20

<210> 411

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 411

tagggttagg gtccccaggt ttgaa 25

<210> 412

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 412

aggtttctgc ccatcctttc 20

<210> 413

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 413

gcccaggaaa tcctaaaggt 20

<210> 414

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 414

gagggttagg gcccccaggc aggga 25

<210> 415

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 415

cctaccagca ggaaaggaca 20

<210> 416

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 416

catcgtaacc gaaaggtcca 20

<210> 417

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 417

taaggttctg ggccccaggc aagaa 25

<210> 418

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 418

cagtgactca cagggtcagg 20

<210> 419

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 419

ggcgttccta tttcacaagc 20

<210> 420

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 420

aagagctagg ggccccaggc ctgag 25

<210> 421

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 421

aaaagggggt ggactagagc 20

<210> 422

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 422

caccaggcct gagagagaag 20

<210> 423

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 423

tatgtttcgg ggccccaggc cggaa 25

<210> 424

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 424

caccttctgc attctgccta 20

<210> 425

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 425

tccagaccct caaagaccac 20

<210> 426

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 426

gaggggaagg ggccccaggc tggag 25

<210> 427

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 427

gcaaagacgg aaagagaagc 20

<210> 428

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 428

cagagccttc agaaattctc c 21

<210> 429

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 429

taggggcagg ggcaccaggc gggga 25

<210> 430

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 430

ccgtcttgct gtgtgaccta 20

<210> 431

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 431

atacggacgc tctgatcctg 20

<210> 432

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 432

ccgggtgagt ggccccaggc ctggg 25

<210> 433

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 433

cgacgtgaag gagaaattcg 20

<210> 434

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 434

gccagtcgga acactctga 19

<210> 435

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 435

gagggtgagt ggccccaggg cagaa 25

<210> 436

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 436

aacctggagt gggatgacag 20

<210> 437

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 437

ccacagggac tctgaggaga 20

<210> 438

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 438

caggtttagg ggctccagga ctggg 25

<210> 439

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 439

tctgtcctct gggagctgac 20

<210> 440

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 440

gctttgcaga caccatctca 20

<210> 441

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 441

tgggtttagg ggccacaggt gggag 25

<210> 442

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 442

gggctctggc ttctgagag 19

<210> 443

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 443

ctgggtgctc tctacgtggt 20

<210> 444

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 444

tggggtcagg ggacccaggg tgggg 25

<210> 445

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 445

ggggagtgtt ttccttccat 20

<210> 446

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 446

gccagggctc acagttattg 20

<210> 447

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 447

tagggttagg ggcctgcagc caggg 25

<210> 448

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 448

cagtcctatg ctcgggagag 20

<210> 449

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 449

gggaactgta gcctgtggag 20

<210> 450

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 450

tggggtgagg ggccccggcc aggag 25

<210> 451

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 451

cagaggcttc aggaggaagg 20

<210> 452

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 452

tggggatatg caacccttag 20

<210> 453

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 453

gaggattagg gtcaccaggc atgag 25

<210> 454

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 454

ctggcagggg aagtcaaata 20

<210> 455

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 455

attccgtctg tctggaatgc 20

<210> 456

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 456

tggggccagg ggccgcaggc agggg 25

<210> 457

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 457

cccgttctct ctccttcctc 20

<210> 458

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 458

tgcaccaagt agcagaggtg 20

<210> 459

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 459

acgggttagg ggacacaggc ctgag 25

<210> 460

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 460

cctctctgag cccagtgttc 20

<210> 461

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 461

tcttgttctc cacccctcag 20

<210> 462

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 462

gaggggcagg gggcccaggc tgggg 25

<210> 463

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 463

gtctgctggg attctgggta 20

<210> 464

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 464

cagctttgtg gctctggaat 20

<210> 465

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 465

gagcgttggg ggccccagga cagga 25

<210> 466

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 466

ctcgtgagca acgggactat 20

<210> 467

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 467

gtggaaacac ggtgctcttt 20

<210> 468

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 468

tagagttagg agacccagga atgag 25

<210> 469

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 469

caaccaagat caggcaacaa 20

<210> 470

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 470

aacttggtaa gtgcccagca 20

<210> 471

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 471

tggggagggg ggccccaggc agggg 25

<210> 472

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 472

ggcctctgaa ataacgttgg 20

<210> 473

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 473

ccctgctttc ttcactccag 20

<210> 474

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 474

aagggttagg ggcccaaagg tagag 25

<210> 475

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 475

ggaccctggg aacattttgt 20

<210> 476

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 476

aaagggcaga ggaaagaagg 20

<210> 477

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 477

gaggctgagt ggccccaggc ctgag 25

<210> 478

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 478

cccagtttga ggacagtggt 20

<210> 479

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 479

gggcttaggg actcaggaga 20

<210> 480

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 480

tcgggtgtgg ggctccaggc ccggg 25

<210> 481

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 481

caagagaggg aggatgcaag 20

<210> 482

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 482

gctgctgagg gatggagtt 19

<210> 483

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 483

gagggtgagt ggccccagga ctggg 25

<210> 484

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 484

cacagactca ggccatctca 20

<210> 485

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 485

gcagtgaaag aaggctagat cc 22

<210> 486

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 486

tagtgttagg agctccaggg aaggg 25

<210> 487

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 487

cctacagcca ttggacccta 20

<210> 488

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 488

cgaagggctc aaacatcttc 20

<210> 489

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 489

tagggtcagg ggctcaaggg atggg 25

<210> 490

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 490

gtcagtgctg acacctcacc 20

<210> 491

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 491

agtgcctcct cttcccactc 20

<210> 492

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 492

cagggatagc agccccaggc agggg 25

<210> 493

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 493

tgctagggtg gggaaattct 20

<210> 494

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 494

aaatccagca gagcagcaat 20

<210> 495

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 495

taggggtagg ggggccatgc agggg 25

<210> 496

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 496

acagaaggta agggggaagg 20

<210> 497

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 497

tctctctctg ctgcacctca 20

<210> 498

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 498

tgggggtagg ggtcccagga gagag 25

<210> 499

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 499

atacctgggg gaactgctct 20

<210> 500

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 500

gtaggccacc ttgacctctg 20

<210> 501

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 501

caggcttggg ggccccaggt agggg 25

<210> 502

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 502

tctgagaaca ccaggaagca 20

<210> 503

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 503

tcttggcctc ctcacatagg 20

<210> 504

<211> 3174

<212> ДНК

<213> Parvibaculum lavamentivorans

<400> 504

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccatggaga ggattttcgg ctttgacatc ggcacaacaa gtatcggatt cagcgtgatt 120

gattacagta gcacccagtc cgcaggcaac atccagaggc tgggcgtgcg cattttccct 180

gaggcaaggg acccagatgg gacccccctg aaccagcagc ggagacagaa acgcatgatg 240

aggcgccagc tgcgacggag aaggattcgc cgaaaggcac tgaatgagac actgcacgaa 300

gccggctttc tgccagctta cgggtctgca gattggcccg tggtcatggc cgacgagcct 360

tatgaactgc ggagaagggg actggaggaa ggcctgagtg cttacgagtt cggacgggca 420

atctatcatc tggcccagca ccggcatttt aaaggcagag aactggagga atccgataca 480

cccgaccctg atgtggacga tgagaaggaa gccgctaacg agagagcagc cactctgaag 540

gccctgaaaa atgaacagac cacactggga gcatggctgg cccgccgacc cccttctgac 600

cgcaagcgag gaatccacgc ccataggaac gtggtcgctg aggagttcga gcgcctgtgg 660

gaagtgcagt ccaagtttca ccccgctctg aaatctgagg aaatgcgggc aagaatcagt 720

gatacaattt tcgcccagag gcctgtgttt tggcgcaaga acactctggg agagtgcaga 780

ttcatgcctg gcgaaccact gtgtcccaag gggtcctggc tgtctcagca gcggagaatg 840

ctggagaaac tgaacaatct ggctatcgca ggcgggaatg ctaggccact ggatgcagag 900

gaacgcgacg ccattctgag taagctgcag cagcaggcca gcatgtcctg gccaggcgtg 960

cggtcagctc tgaaggcact gtacaaacag agaggcgagc ccggggctga aaagagcctg 1020

aaattcaacc tggagctggg aggcgaatcc aagctgctgg gaaatgccct ggaggctaaa 1080

ctggcagata tgtttggccc tgactggcca gctcaccccc gaaagcagga gatccggcac 1140

gcagtgcatg aacggctgtg ggctgcagat tacggcgaga cacccgacaa gaaaagagtc 1200

atcattctgt ccgagaagga tcgaaaagct catcgggaag ccgctgcaaa ctctttcgtg 1260

gcagactttg gaattactgg cgagcaggca gctcagctgc aggccctgaa gctgccaacc 1320

ggctgggaac cttatagcat cccagcactg aacctgttcc tggccgagct ggaaaagggg 1380

gagaggtttg gagccctggt gaatggacct gattgggaag gctggaggcg cacaaacttc 1440

ccccaccgca atcagcctac tggggagatc ctggacaagc tgccaagtcc cgcctcaaaa 1500

gaggaaaggg aacgcattag ccagctgcgc aacccaaccg tggtccgaac acagaatgag 1560

ctgagaaagg tggtcaacaa tctgatcggg ctgtatggaa aacccgatcg aatccggatt 1620

gaagtgggcc gggacgtcgg gaagtccaaa agagaaaggg aggaaatcca gtctggcatt 1680

cgacggaacg agaagcagag aaagaaagcc actgaagatc tgatcaaaaa cggaattgct 1740

aatcctagcc gggacgatgt ggagaagtgg atcctgtgga aagagggcca ggaaagatgc 1800

ccatacaccg gcgaccagat tggcttcaat gccctgttta gagaaggcag atatgaggtg 1860

gaacacatct ggcctcgctc tcgaagtttt gataacagcc caaggaataa gacactgtgt 1920

cgcaaagacg tgaacatcga gaagggaaat aggatgcctt tcgaggcatt tggccatgac 1980

gaagatcggt ggagcgccat ccagattaga ctgcagggca tggtgtcagc caaaggggga 2040

actgggatga gccccggaaa ggtcaaacgc ttcctggcta agaccatgcc tgaggatttt 2100

gcagcccggc agctgaacga cacaagatac gctgcaaagc agatcctggc ccagctgaaa 2160

aggctgtggc cagacatggg acctgaggct ccagtgaagg tcgaagcagt gactggacag 2220

gtcaccgccc agctgcgcaa actgtggact ctgaacaata ttctggctga cgatggggag 2280

aaaaccagag cagatcacag gcaccatgcc atcgacgctc tgacagtggc ctgcactcat 2340

cctggaatga ccaacaagct gagcaggtat tggcagctgc gcgacgatcc acgagcagag 2400

aagccagctc tgactccacc ctgggatacc atccgcgccg acgctgagaa agccgtgtct 2460

gaaattgtgg tcagtcaccg ggtgagaaag aaagtcagcg gcccactgca taaggagact 2520

acctacggcg atacagggac tgacattaag accaaatccg gcacatatag acagttcgtg 2580

accaggaaga aaatcgagtc actgagcaag ggggagctgg atgaaattcg cgacccccga 2640

atcaaagaaa ttgtggcagc tcacgtcgca ggacgaggag gcgaccccaa gaaggccttc 2700

cctccatacc cctgtgtgtc tcccggaggc cctgagatcc ggaaggtcag actgaccagt 2760

aaacagcagc tgaacctgat ggcccagaca gggaatggat acgctgacct gggctccaac 2820

caccatatcg caatctaccg gctgcccgat gggaaggccg acttcgagat tgtgtcactg 2880

tttgatgcta gcagaaggct ggcacagaga aatccaatcg tgcagaggac acgagcagac 2940

ggagccagct tcgtcatgtc cctggcagcc ggagaggcca tcatgattcc cgaaggctca 3000

aagaaaggga tctggattgt gcagggagtc tgggcaagcg gacaggtggt cctggagagg 3060

gacaccgatg ctgaccactc tacaactacc cgccctatgc caaaccccat cctgaaggac 3120

gatgccaaga aagtgagtat cgatcctatt ggccgagtcc ggccatcaaa tgac 3174

<210> 505

<211> 3315

<212> ДНК

<213> Corynebacter diphtheria

<400> 505

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccatgaagt accatgtcgg aatcgatgtc ggaacctttt ctgtggggct ggctgctatt 120

gaagtggatg acgctggaat gcctattaag accctgagtc tggtgtcaca cattcatgac 180

tcaggactgg atcctgacga gatcaagagc gctgtgacca ggctggcaag ctccggaatc 240

gcccggagaa caaggcgcct gtaccgacgg aagagaaggc gcctgcagca gctggataag 300

ttcatccaga ggcagggctg gccagtgatc gagctggaag attacagcga ccccctgtat 360

ccttggaagg tgcgcgccga actggccgct tcttatattg ctgacgagaa ggaacggggg 420

gagaaactga gtgtggctct gagacacatc gcaaggcatc gcggatggag gaacccttac 480

gccaaggtgt ctagtctgta tctgccagat ggcccctcag acgccttcaa ggctattagg 540

gaggaaatca aacgcgctag cggccagcct gtgccagaga ctgcaaccgt cgggcagatg 600

gtgaccctgt gcgaactggg cacactgaag ctgcgaggag agggaggagt gctgagtgca 660

cggctgcagc agtcagatta cgcccgcgag atccaggaaa tttgtcgaat gcaggagatc 720

ggccaggaac tgtatcgcaa gatcattgac gtggtgttcg cagccgagtc cccaaagggc 780

tctgcctcaa gccgggtggg gaaagatcct ctgcagccag gaaagaacag agcactgaaa 840

gccagcgacg cttttcagcg ataccggatt gctgcactga tcggcaatct gagagtcagg 900

gtggatgggg agaagaggat tctgagcgtg gaggagaaga acctggtgtt cgaccacctg 960

gtgaatctga ctccaaagaa agagcccgaa tgggtgacca tcgccgaaat tctgggcatc 1020

gatcgcgggc agctgatcgg aacagctact atgaccgacg atggagagcg agcaggagcc 1080

cgacccccta cacacgatac taacagaagt attgtgaaca gccggatcgc accactggtc 1140

gactggtgga aaacagctag cgcactggag cagcacgcca tggtgaaggc actgtccaac 1200

gccgaagtcg acgattttga ttctcccgag ggagcaaaag tgcaggcatt ctttgccgat 1260

ctggacgatg acgtccacgc caagctggac agcctgcatc tgcctgtggg acgagcagct 1320

tactccgagg acactctggt cagactgacc cgacggatgc tgagtgatgg ggtggacctg 1380

tataccgccc ggctgcagga gttcggaatt gaacctagct ggaccccacc cacaccaaga 1440

atcggagagc ctgtcggcaa tccagccgtc gaccgggtgc tgaaaacagt gagcagatgg 1500

ctggaatccg caacaaagac ttggggcgcc ccagagaggg tcatcattga gcacgtgcgc 1560

gaaggcttcg tcactgagaa acgcgctcga gaaatggatg gggacatgag aaggcgcgca 1620

gcccggaacg ccaagctgtt tcaggagatg caggaaaagc tgaatgtgca gggcaaaccc 1680

agtcgagccg atctgtggag ataccagtca gtgcagagac agaactgcca gtgtgcctat 1740

tgcgggtccc caattacctt ttctaatagt gaaatggacc acatcgtgcc cagagcaggg 1800

cagggatcca ccaacacaag ggagaatctg gtcgccgtgt gccatcgctg taaccagtct 1860

aagggcaata cacccttcgc tatttgggca aaaaacactt ctatcgaagg ggtcagtgtg 1920

aaggaggccg tggaacggac cagacattgg gtcactgata ccggcatgag aagcactgac 1980

ttcaagaagt tcaccaaggc tgtggtcgag cggtttcaga gagcaacaat ggatgaggaa 2040

atcgacgcca gaagcatgga atccgtcgcc tggatggcta atgagctgag gagccgcgtg 2100

gctcagcact tcgcatccca tggaaccaca gtcagggtgt accgaggcag cctgacagca 2160

gaggctcgac gggcatctgg gatcagtgga aagctgaaat tctttgatgg cgtggggaag 2220

tccaggctgg atagaaggca ccatgctatt gacgctgcag tgatcgcatt cacctctgac 2280

tatgtggccg aaacactggc tgtccgctca aacctgaaac agagccaggc ccaccgacag 2340

gaggctcctc agtggagaga gttcaccggc aaggatgcag agcatcgagc agcttggaga 2400

gtgtggtgcc agaagatgga aaaactgagc gccctgctga ccgaggacct gcgagatgac 2460

cgggtggtcg tgatgtctaa cgtgcgactg cggctgggaa atggcagtgc ccacaaggaa 2520

accattggca aactgtcaaa ggtgaaactg tcctctcagc tgtcagtcag cgatatcgac 2580

aaagcaagtt cagaggccct gtggtgtgct ctgaccagag agcccggatt cgatcctaag 2640

gaaggcctgc ccgctaaccc tgagagacac atcagggtga atgggacaca tgtctacgcc 2700

ggggacaata ttggactgtt tccagtgtca gcaggaagca tcgcactgag gggaggatac 2760

gcagagctgg gcagctcctt ccaccatgct cgcgtgtata aaattacttc cggcaagaaa 2820

cccgcatttg ccatgctgag ggtgtacacc atcgatctgc tgccttatcg caaccaggac 2880

ctgtttagcg tggaactgaa gccacagaca atgtccatga ggcaggctga gaagaaactg 2940

cgcgacgctc tggcaactgg gaatgcagaa tatctgggat ggctggtcgt ggatgacgag 3000

ctggtcgtgg atacatctaa gattgccact gaccaggtca aagcagtgga ggccgaactg 3060

gggactatcc gccgatggcg ggtggatgga ttcttttccc cctctaaact gagactgagg 3120

cctctgcaga tgtccaagga ggggatcaag aaagagtccg ctcccgaact gtctaaaatc 3180

attgacagac caggatggct gcccgccgtg aacaagctgt tctctgatgg aaatgtcacc 3240

gtcgtgcgga gagactctct gggacgcgtg cgactggaga gtacagccca cctgcctgtc 3300

acttggaagg tgcag 3315

<210> 506

<211> 3453

<212> ДНК

<213> Streptococcus pasteurianus

<400> 506

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccatgacta acggcaagat tctggggctg gacattggca tcgcaagcgt gggggtgggg 120

attattgagg caaaaactgg aaaggtggtg catgccaatt cccggctgtt ctctgccgct 180

aacgctgaga acaatgcaga acggagaggg tttaggggat ctaggcgcct gaatcgacgg 240

aagaaacacc gcgtgaagcg agtccgggat ctgttcgaga aatacggaat cgtcaccgac 300

tttcgcaacc tgaatctgaa cccttatgag ctgcgagtga agggcctgac cgaacagctg 360

aaaaacgagg aactgttcgc agccctgaga acaatctcta agagaagggg gattagttac 420

ctggacgatg ccgaggacga tagtaccgga tcaacagact atgctaagag catcgatgag 480

aatcgccgac tgctgaaaaa caagacacca ggccagattc agctggagag gctggaaaag 540

tacggccagc tgcgcgggaa tttcaccgtc tatgacgaga acggggaagc ccatcgcctg 600

atcaatgtgt ttagtacatc agattacgag aaagaagcac ggaagatcct ggagacacag 660

gccgactaca acaagaaaat cacagctgag ttcattgacg attatgtgga aatcctgacc 720

cagaaacgaa agtactatca cggccccggg aacgaaaaga gccggactga ctacggacgg 780

ttccggaccg atgggaccac actggagaat attttcggaa tcctgattgg caagtgcaac 840

ttttaccctg atgaatatcg agcaagcaag gccagctaca ccgcacagga gtataatttc 900

ctgaacgacc tgaacaatct gaaggtgagc accgaaacag ggaagctgtc aacagagcag 960

aaagaaagcc tggtggagtt tgccaagaat actgctaccc tgggacccgc taaactgctg 1020

aaggagatcg caaaaattct ggactgtaag gtggatgaga tcaaaggata cagagaggac 1080

gataaaggca agccagatct gcataccttc gagccctata ggaaactgaa gtttaatctg 1140

gaaagcatca acattgacga tctgtcccgc gaagtgatcg acaagctggc tgatattctg 1200

actctgaaca ccgagagaga aggaatcgag gacgcaatta agaggaatct gccaaaccag 1260

ttcacagagg aacagatcag cgagatcatc aaggtgcgga agagccagtc cactgctttc 1320

aataagggct ggcactcttt tagtgcaaaa ctgatgaacg agctgatccc cgaactgtac 1380

gccacctccg acgagcagat gacaattctg actcggctgg aaaaattcaa ggtcaataag 1440

aaaagctcca aaaacacaaa gactatcgac gagaaggaag tcactgatga gatctacaat 1500

cctgtggtcg ccaagagcgt gagacagacc atcaaaatca ttaacgctgc agtcaagaaa 1560

tatggcgact tcgataagat cgtgattgaa atgccacggg ataaaaatgc tgacgatgag 1620

aagaagttca tcgacaagag aaataaggag aacaagaagg aaaaggacga tgccctgaaa 1680

agggccgctt acctgtataa ttctagtgac aagctgcccg atgaggtgtt ccacggcaac 1740

aagcagctgg aaaccaaaat ccgactgtgg tatcagcagg gggagcggtg cctgtatagt 1800

ggaaagccca tctcaattca ggagctggtg cataactcta acaatttcga aatcgatcac 1860

attctgcctc tgtcactgag ctttgacgat agtctggcca ataaggtgct ggtctacgct 1920

tggacaaacc aggagaaagg ccagaaaacc ccttatcagg tcatcgactc catggatgca 1980

gcctggtctt tcagggagat gaaggactac gtgctgaaac agaagggact gggcaagaaa 2040

aagcgcgact atctgctgac taccgagaac atcgataaga ttgaagtgaa gaagaagttc 2100

atcgagagga atctggtgga tactcgctac gcatctcgag tggtcctgaa ctctctgcag 2160

agtgccctga gagagctggg gaaagacact aaggtgtctg tggtcagggg acagttcacc 2220

agtcagctgc ggagaaaatg gaagatcgat aagagccgcg agacatacca ccatcacgca 2280

gtggacgccc tgatcattgc tgcatcaagc cagctgaaac tgtgggagaa gcaggacaat 2340

cccatgtttg tggattatgg caagaaccag gtggtcgaca aacagactgg ggagatcctg 2400

tccgtgtctg acgatgagta caaggaactg gtgttccagc ccccttatca gggctttgtg 2460

aataccatct cctctaaagg gttcgaggac gaaattctgt ttagctacca ggtggattcc 2520

aaatataacc ggaaggtcag tgacgcaacc atctactcaa caagaaaagc caagattggc 2580

aaggataaga aagaggaaac ctacgtgctg ggaaaaatca aggacatcta ctcccagaat 2640

ggcttcgata ccttcatcaa gaagtacaac aaagataaga ctcagttcct gatgtatcag 2700

aaggactctc tgacatggga gaacgtgatc gaagtcattc tgagggacta cccaacaact 2760

aagaaaagcg aggacggcaa aaatgatgtg aagtgcaacc cctttgagga atacaggcgc 2820

gagaatgggc tgatctgtaa gtattccaag aaagggaaag gaactcccat caagagcctg 2880

aagtactatg acaagaaact ggggaactgc atcgatatta ccccagagga atcacgcaat 2940

aaggtcatcc tgcagagcat taacccttgg cgagccgacg tgtacttcaa tccagagaca 3000

ctgaagtacg aactgatggg cctgaaatat tcagatctga gctttgaaaa gggcactggg 3060

aactaccata tcagccagga gaaatatgac gctatcaaag agaaggaagg aattggcaag 3120

aaatccgagt tcaagtttac actgtaccgc aacgacctga tcctgatcaa ggatatcgcc 3180

agtggcgagc aggaaatcta cagattcctg tcaagaacta tgcccaatgt gaaccactac 3240

gtcgagctga agccttacga caaggaaaag ttcgataacg tgcaggagct ggtcgaagca 3300

ctgggagagg cagataaagt gggacgatgt atcaaaggac tgaataagcc aaacatcagc 3360

atctacaagg tgagaaccga cgtcctggga aacaaatatt tcgtgaagaa aaagggcgac 3420

aaacccaagc tggattttaa gaacaacaag aag 3453

<210> 507

<211> 3309

<212> ДНК

<213> Neisseria cinerea

<400> 507

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccatggctg ccttcaaacc taatcctatg aactacatcc tgggcctgga cattggaatc 120

gcttctgtcg ggtgggctat cgtggaaatc gacgaggaag agaaccctat cagactgatt 180

gatctgggag tcagagtgtt tgaaagggca gaggtgccaa agaccggcga ctccctggcc 240

gctgcacgga gactggctcg gtctgtcagg cgcctgacac gacggagagc acacaggctg 300

ctgcgagcta ggcgcctgct gaagagagag ggcgtgctgc aggccgctga cttcgatgaa 360

aacggcctga tcaagagcct gcccaatact ccttggcagc tgagagcagc cgctctggac 420

aggaagctga ccccactgga gtggtctgcc gtgctgctgc acctgatcaa gcatcgcggc 480

tacctgagtc agcgaaaaaa tgaaggggag acagcagata aggagctggg agcactgctg 540

aaaggagtgg ccgacaacac tcatgctctg cagaccggcg attttaggac acccgctgag 600

ctggcactga ataagttcga aaaagagagt ggacacattc gaaaccagcg gggcgactat 660

tcacatacct tcaaccgcaa ggatctgcag gccgagctga atctgctgtt tgaaaagcag 720

aaagagttcg ggaatcccca cgtgtccgac gggctgaaag aaggaatcga gacactgctg 780

atgactcaga ggcctgcact gtctggcgat gccgtgcaga agatgctggg gcattgcacc 840

tttgaaccaa cagagcccaa ggcagccaaa aacacctaca cagccgagag gttcgtgtgg 900

ctgacaaagc tgaacaatct gcgcatcctg gaacagggca gtgagcggcc cctgactgac 960

accgaaagag ccacactgat ggatgagcct tacaggaagt ctaaactgac ttatgcccag 1020

gctcgcaagc tgctggacct ggacgatact gccttcttta agggcctgag gtacgggaaa 1080

gataatgcag aagccagcac cctgatggag atgaaggcct atcacgctat ctcccgcgcc 1140

ctggaaaaag agggcctgaa ggacaagaaa tctcccctga acctgagtcc tgaactgcag 1200

gatgagattg ggaccgcttt tagcctgttc aagactgacg aggatatcac cggacgcctg 1260

aaagaccgag tgcagcccga aattctggag gcactgctga agcacatcag ttttgataaa 1320

ttcgtgcaga tttcactgaa ggccctgcga cggatcgtcc ctctgatgga gcagggcaat 1380

cggtacgacg aggcctgcac cgagatctac ggagatcatt atggcaagaa aaacacagaa 1440

gagaaaatct atctgccccc tattcctgcc gacgagatcc ggaatccagt ggtcctgaga 1500

gctctgtcac aggcaagaaa agtgatcaac ggagtggtca gaaggtacgg cagccctgct 1560

aggatccaca ttgaaaccgc acgcgaagtg ggaaagtcct ttaaagaccg caaggaaatc 1620

gagaagcgac aggaagagaa tagaaaagat agggaaaagt ctgctgcaaa attcagggag 1680

tactttccaa acttcgtggg cgaacccaag agtaaagaca tcctgaagct gcgcctgtac 1740

gagcagcagc acgggaagtg tctgtatagc ggaaaagaaa ttaacctggg ccggctgaat 1800

gaaaagggct atgtggagat cgatcatgca ctgccctttt ccagaacatg ggacgattct 1860

ttcaacaata aggtcctggc tctggggagc gagaaccaga acaagggaaa tcagactcct 1920

tacgaatatt tcaacgggaa ggacaatagc cgagaatggc aggagtttaa agcccgcgtg 1980

gagacaagcc ggttcccacg aagcaagaaa cagcggattc tgctgcagaa gtttgacgaa 2040

gatggattca aagagagaaa cctgaatgac acccggtaca tcaacagatt tctgtgccag 2100

ttcgtggctg atcacatgct gctgaccgga aagggcaaac gccgagtctt tgcaagcaac 2160

ggccagatca caaatctgct gaggggcttc tgggggctgc ggaaggtgag agccgagaat 2220

gaccgccacc atgcactgga tgccgtggtc gtggcttgtt ccactattgc aatgcagcag 2280

aagatcacca ggtttgtgcg ctataaagag atgaacgcct tcgacggaaa gacaattgat 2340

aaagaaactg gcgaggtgct gcaccagaag gcacattttc ctcagccatg ggagttcttc 2400

gcccaggaag tgatgatccg ggtctttggg aagcctgacg gaaaaccaga gttcgaagag 2460

gccgataccc cagaaaagct gcggacactg ctggctgaaa aactgagctc cagacccgag 2520

gcagtgcaca agtacgtcac ccccctgttc attagcaggg cccctaatcg caaaatgtcc 2580

gggcagggac atatggagac tgtgaaatca gctaagcggc tggacgaagg catcagcgtg 2640

ctgagagtcc cactgaccca gctgaagctg aaagatctgg agaagatggt gaaccgggaa 2700

agagagccca agctgtatga agctctgaaa gcaagactgg aggcccacaa ggacgatcca 2760

gctaaagcat ttgccgagcc cttctacaaa tatgacaagg ccggcaatcg gacacagcag 2820

gtgaaggctg tcagagtgga gcaggtccag aaaactgggg tctgggtgca caaccataat 2880

ggaattgccg acaacgctac aatcgtccgg gtggatgtgt tcgagaaagg cgggaagtac 2940

tatctggtgc ctatctactc ctggcaggtc gccaagggaa tcctgccaga tagagctgtc 3000

gtgcagggca aagacgaaga ggattggact gtgatggacg attctttcga gtttaagttc 3060

gtcctgtacg caaacgacct gatcaagctg acagccaaga aaaatgaatt tctggggtat 3120

ttcgtgtcac tgaacagggc aactggagcc atcgatattc gcacacatga cactgatagc 3180

accaagggaa aaaacggcat ctttcagtct gtgggcgtca agaccgccct gagtttccag 3240

aaatatcaga ttgacgaact ggggaaggag atccgaccct gtcggctgaa gaaacgacca 3300

cccgtgcgg 3309

<210> 508

<211> 3252

<212> ДНК

<213> Staphylococcus aureus

<400> 508

atgaaaagga actacattct ggggctggac atcgggatta caagcgtggg gtatgggatt 60

attgactatg aaacaaggga cgtgatcgac gcaggcgtca gactgttcaa ggaggccaac 120

gtggaaaaca atgagggacg gagaagcaag aggggagcca ggcgcctgaa acgacggaga 180

aggcacagaa tccagagggt gaagaaactg ctgttcgatt acaacctgct gaccgaccat 240

tctgagctga gtggaattaa tccttatgaa gccagggtga aaggcctgag tcagaagctg 300

tcagaggaag agttttccgc agctctgctg cacctggcta agcgccgagg agtgcataac 360

gtcaatgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcta caaaggaaca gatctcacgc 420

aatagcaaag ctctggaaga gaagtatgtc gcagagctgc agctggaacg gctgaagaaa 480

gatggcgagg tgagagggtc aattaatagg ttcaagacaa gcgactacgt caaagaagcc 540

aagcagctgc tgaaagtgca gaaggcttac caccagctgg atcagagctt catcgatact 600

tatatcgacc tgctggagac tcggagaacc tactatgagg gaccaggaga agggagcccc 660

ttcggatgga aagacatcaa ggaatggtac gagatgctga tgggacattg cacctatttt 720

ccagaagagc tgagaagcgt caagtacgct tataacgcag atctgtacaa cgccctgaat 780

gacctgaaca acctggtcat caccagggat gaaaacgaga aactggaata ctatgagaag 840

ttccagatca tcgaaaacgt gtttaagcag aagaaaaagc ctacactgaa acagattgct 900

aaggagatcc tggtcaacga agaggacatc aagggctacc gggtgacaag cactggaaaa 960

ccagagttca ccaatctgaa agtgtatcac gatattaagg acatcacagc acggaaagaa 1020

atcattgaga acgccgaact gctggatcag attgctaaga tcctgactat ctaccagagc 1080

tccgaggaca tccaggaaga gctgactaac ctgaacagcg agctgaccca ggaagagatc 1140

gaacagatta gtaatctgaa ggggtacacc ggaacacaca acctgtccct gaaagctatc 1200

aatctgattc tggatgagct gtggcataca aacgacaatc agattgcaat ctttaaccgg 1260

ctgaagctgg tcccaaaaaa ggtggacctg agtcagcaga aagagatccc aaccacactg 1320

gtggacgatt tcattctgtc acccgtggtc aagcggagct tcatccagag catcaaagtg 1380

atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaatgata tcattatcga gctggctagg 1440

gagaagaaca gcaaggacgc acagaagatg atcaatgaga tgcagaaacg aaaccggcag 1500

accaatgaac gcattgaaga gattatccga actaccggga aagagaacgc aaagtacctg 1560

attgaaaaaa tcaagctgca cgatatgcag gagggaaagt gtctgtattc tctggaggcc 1620

atccccctgg aggacctgct gaacaatcca ttcaactacg aggtcgatca tattatcccc 1680

agaagcgtgt ccttcgacaa ttcctttaac aacaaggtgc tggtcaagca ggaagagaac 1740

tctaaaaagg gcaataggac tcctttccag tacctgtcta gttcagattc caagatctct 1800

tacgaaacct ttaaaaagca cattctgaat ctggccaaag gaaagggccg catcagcaag 1860

accaaaaagg agtacctgct ggaagagcgg gacatcaaca gattctccgt ccagaaggat 1920

tttattaacc ggaatctggt ggacacaaga tacgctactc gcggcctgat gaatctgctg 1980

cgatcctatt tccgggtgaa caatctggat gtgaaagtca agtccatcaa cggcgggttc 2040

acatcttttc tgaggcgcaa atggaagttt aaaaaggagc gcaacaaagg gtacaagcac 2100

catgccgaag atgctctgat tatcgcaaat gccgacttca tctttaagga gtggaaaaag 2160

ctggacaaag ccaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aagagaagca ggccgaatct 2220

atgcccgaaa tcgagacaga acaggagtac aaggagattt tcatcactcc tcaccagatc 2280

aagcatatca aggatttcaa ggactacaag tactctcacc gggtggataa aaagcccaac 2340

agagagctga tcaatgacac cctgtatagt acaagaaaag acgataaggg gaataccctg 2400

attgtgaaca atctgaacgg actgtacgac aaagataatg acaagctgaa aaagctgatc 2460

aacaaaagtc ccgagaagct gctgatgtac caccatgatc ctcagacata tcagaaactg 2520

aagctgatta tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tgtataagta ctatgaagag 2580

actgggaact acctgaccaa gtatagcaaa aaggataatg gccccgtgat caagaagatc 2640

aagtactatg ggaacaagct gaatgcccat ctggacatca cagacgatta ccctaacagt 2700

cgcaacaagg tggtcaagct gtcactgaag ccatacagat tcgatgtcta tctggacaac 2760

ggcgtgtata aatttgtgac tgtcaagaat ctggatgtca tcaaaaagga gaactactat 2820

gaagtgaata gcaagtgcta cgaagaggct aaaaagctga aaaagattag caaccaggca 2880

gagttcatcg cctcctttta caacaacgac ctgattaaga tcaatggcga actgtatagg 2940

gtcatcgggg tgaacaatga tctgctgaac cgcattgaag tgaatatgat tgacatcact 3000

taccgagagt atctggaaaa catgaatgat aagcgccccc ctcgaattat caaaacaatt 3060

gcctctaaga ctcagagtat caaaaagtac tcaaccgaca ttctgggaaa cctgtatgag 3120

gtgaagagca aaaagcaccc tcagattatc aaaaagggca gcggaggcaa gcgtcctgct 3180

gctactaaga aagctggtca agctaagaaa aagaaaggat cctacccata cgatgttcca 3240

gattacgctt aa 3252

<210> 509

<211> 3072

<212> ДНК

<213> Campylobacter lari

<400> 509

atgtacccat acgatgttcc agattacgct tcgccgaaga aaaagcgcaa ggtcgaagcg 60

tccatgagga ttctggggtt tgacattggc attaacagca tcgggtgggc ttttgtggag 120

aacgacgaac tgaaggactg cggagtgcgg atcttcacaa aggccgagaa cccaaaaaat 180

aaggaaagcc tggcactgcc ccggagaaat gcacgcagct ccaggcgccg actgaaacgg 240

agaaaggccc ggctgatcgc tattaagaga atcctggcca aagagctgaa gctgaactac 300

aaggactatg tcgcagctga tggagagctg ccaaaggcct acgaaggatc cctggcatct 360

gtgtacgagc tgcggtataa ggccctgaca cagaacctgg aaactaaaga tctggccaga 420

gtgatcctgc acattgctaa gcataggggg tacatgaaca agaacgagaa gaaatcaaac 480

gacgctaaga aaggaaagat cctgagcgct ctgaaaaaca atgcactgaa gctggagaac 540

taccagagcg tgggcgaata cttctacaag gagttctttc agaaatacaa gaaaaacaca 600

aagaacttca tcaagatccg caacactaag gataattaca acaattgcgt gctgtctagt 660

gacctggaaa aagagctgaa gctgatcctg gaaaaacaga aggagttcgg ctacaactac 720

tctgaagatt tcatcaacga gattctgaag gtcgccttct ttcagcggcc cctgaaggac 780

ttcagtcacc tggtgggggc ctgcactttc tttgaggaag agaaaagggc ctgtaagaac 840

agctactctg cctgggagtt tgtggctctg accaagatca ttaacgagat caagagcctg 900

gagaagatca gcggcgaaat tgtgccaacc cagacaatca acgaggtcct gaatctgatc 960

ctggacaagg ggtctatcac ctacaagaaa ttcagaagtt gtatcaatct gcatgagagt 1020

atcagcttca agagcctgaa gtatgataaa gaaaacgccg agaatgctaa actgatcgac 1080

ttccgcaagc tggtggagtt taagaaagcc ctgggagtcc acagcctgtc ccggcaggaa 1140

ctggatcaga tctccactca tatcaccctg attaaggaca acgtgaagct gaaaaccgtc 1200

ctggagaaat acaacctgag taatgaacag atcaacaatc tgctggaaat tgagttcaac 1260

gattatatca acctgagctt caaggccctg ggaatgattc tgccactgat gcgcgagggc 1320

aaacgatacg acgaggcctg cgagatcgcc aatctgaaac ctaagaccgt ggacgagaag 1380

aaagatttcc tgccagcatt ttgtgattcc attttcgccc acgagctgtc taaccccgtg 1440

gtcaataggg ctatcagcga ataccgcaag gtgctgaacg cactgctgaa gaaatatgga 1500

aaggtccaca aaattcatct ggagctggct cgcgacgtgg gcctgtccaa gaaagcacga 1560

gagaagatcg aaaaagagca gaaggaaaac caggccgtga atgcatgggc cctgaaggaa 1620

tgcgagaata ttggcctgaa ggccagcgca aagaacatcc tgaaactgaa gctgtggaaa 1680

gaacagaagg agatctgtat ctactccgga aataagatct ctattgagca cctgaaagat 1740

gaaaaggccc tggaggtgga ccatatctac ccctattcta ggagtttcga cgattctttt 1800

atcaacaaag tgctggtgtt caccaaggaa aatcaggaga aactgaacaa gacacctttc 1860

gaggcctttg gcaagaatat tgaaaaatgg agcaagatcc agaccctggc tcagaacctg 1920

ccatacaaga aaaagaataa gattctggac gagaacttca aagataagca gcaggaggac 1980

tttatctctc gaaatctgaa cgacacccgg tatatcgcta cactgattgc aaaatacaca 2040

aaggagtatc tgaacttcct gctgctgagc gaaaatgaga acgccaatct gaagagtggc 2100

gaaaaagggt caaagatcca cgtgcagact attagcggga tgctgacctc cgtcctgagg 2160

cacacatggg ggtttgacaa aaaggatcgc aacaatcatc tgcaccatgc actggatgcc 2220

atcattgtgg cctacagtac aaattcaatc attaaggctt tcagcgattt ccggaaaaac 2280

caggagctgc tgaaggccag attctacgct aaagaactga cttccgataa ctataaacat 2340

caggtcaagt tctttgagcc tttcaagagt tttagagaaa aaatcctgtc aaagatcgac 2400

gagattttcg tgtccaaacc acctcgaaag cgagctaggc gcgcactgca caaggatacc 2460

tttcattctg agaacaagat cattgacaag tgcagctaca actccaagga aggcctgcag 2520

attgccctga gctgtggaag agtgaggaaa atcggcacta agtatgtcga gaatgatacc 2580

atcgtgaggg tcgacatttt caaaaagcag aacaagtttt acgctatccc aatctacgca 2640

atggattttg ccctggggat cctgcccaat aagatcgtga ttactggaaa agataagaac 2700

aataacccca aacagtggca gaccattgac gaatcatacg agttctgctt tagcctgtat 2760

aagaatgacc tgatcctgct gcagaaaaag aacatgcagg aacctgagtt cgcctactat 2820

aacgattttt caatcagcac atcaagcatt tgtgtggaga aacacgacaa caagttcgaa 2880

aatctgacta gcaaccagaa gctgctgttt tccaatgcaa aagagggctc tgtgaaggtc 2940

gaaagtctgg ggatccagaa cctgaaagtg ttcgagaagt acatcattac ccccctggga 3000

gataaaatta aggctgactt tcagcctcga gaaaacatca gcctgaaaac cagtaaaaag 3060

tatggcctga gg 3072

<210> 510

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 510

ggagctggtc tgttggagaa 20

<210> 511

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 511

tcccaatcca taatcccacg tt 22

<210> 512

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 512

gcatactcgc atggctacct 20

<210> 513

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 513

ctccctgcag ccccttttta 20

<210> 514

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 514

tgtaatcagg agccgttggg 20

<210> 515

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 515

actgacgctt ctaagccacc 20

<210> 516

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 516

aagtggcaag caccgtgtta 20

<210> 517

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 517

agcgttcaaa caaggaccca 20

<210> 518

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 518

atgagccgtc taatgcgtgg 20

<210> 519

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 519

agtactcacc cacagacccg 20

<210> 520

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 520

caggcgtcca gtacccacac 20

<210> 521

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 521

atcaccccaa ccccaaagca 20

<210> 522

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 522

ccccttacct ctctagtctg tgc 23

<210> 523

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 523

ctcaggttct gggagagggt ag 22

<210> 524

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 524

cttgctctcc caaagtcgct 20

<210> 525

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 525

ccaatgctct gtctaggggt 20

<210> 526

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 526

cgcacgcgta attcgaacgc tgacgtcatc 30

<210> 527

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (92)..(110)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 527

cacacgcgta aaaaagcacc gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct 60

tattttaact tgctatttct agctctaaaa cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cggtgtttcg 120

tcctttccac 130

<210> 528

<211> 23

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 528

tgcgaatacg cccacgcgat ggg 23

<210> 529

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 529

gtgtctagac tgcagagggc cctg 24

<210> 530

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 530

gtgtcgtgcc tgagagcgca gtcgagaa 28

<210> 531

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 531

gagaagctta gctgaatggg gtccgcctc 29

<210> 532

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 532

ctcaccggtg cgcgcaaccg atgccgggac c 31

<210> 533

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 533

gagaagcttg gcgaaatgat ttgctgcaga tg 32

<210> 534

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 534

ctcaccggtg cgcgcgtcgc ctccccctcc gc 32

<210> 535

<211> 134

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 535

agcttcgcgc cgggaggagg ggggacgcag tgggcggagc ggagacagca ccttcggaga 60

taatcctttc tcctgccgca gagcagagga gcggcgggag aggaacactt ctcccaggct 120

ttagcagagc cgga 134

<210> 536

<211> 134

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 536

ccggtccggc tctgctaaag cctgggagaa gtgttcctct cccgccgctc ctctgctctg 60

cggcaggaga aaggattatc tccgaaggtg ctgtctccgc tccgcccact gcgtcccccc 120

tcctcccggc gcga 134

<210> 537

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 537

aattcaataa aagatcttta ttttcattag atctgtgtgt tggttttttg tgtgc 55

<210> 538

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 538

ggccgcacac aaaaaaccaa cacacagatc taatgaaaat aaagatcttt tattg 55

<210> 539

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 539

ggagctggag ctgttcacgt tgg 23

<210> 540

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 540

cgggcagcag atgttcgcgt agg 23

<210> 541

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 541

agggcttgag atgttcgggc tgg 23

<210> 542

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 542

ccggctgggg ctgtcctcgc tag 23

<210> 543

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 543

cggggtgcag ctgctcacgc cag 23

<210> 544

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 544

ctggcgggag ctggtcgcgt gag 23

<210> 545

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 545

tgagcatggg ccgctggcgg tgg 23

<210> 546

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 546

atggcatagg ccgctgacag agg 23

<210> 547

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 547

ttggcatggt gagctggcgg ggg 23

<210> 548

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 548

tgggcagggg tctctgaggg cag 23

<210> 549

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 549

ttggcatggg tctcttacca agg 23

<210> 550

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 550

acatggttcc agtgggtatg tag 23

<210> 551

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 551

ggaggtgggc agcgggtatg tag 23

<210> 552

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 552

agaaggtccc cgcgggcatg gag 23

<210> 553

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 553

ggagggaacc agccggtatg ggg 23

<210> 554

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 554

agagagtggc agtgggtaag cag 23

<210> 555

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 555

agaggtggcc agcgggcagg aag 23

<210> 556

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 556

tgagggggcc agctgggatg cag 23

<210> 557

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 557

ggtctcatgt gtggcactca 20

<210> 558

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 558

atccctcctc agagggtcag c 21

<210> 559

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 559

ttcgggcata gcatggtctt cc 22

<210> 560

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 560

gttctgagcc gcacagtttg g 21

<210> 561

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 561

tgtccaacct tcaggcaagg 20

<210> 562

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 562

tacctcatgc acagctagca cc 22

<210> 563

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 563

gttctatttc agagggctga tccc 24

<210> 564

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 564

ggataagaag ggacaataca gg 22

<210> 565

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 565

gccggggtct cgttcagagc t 21

<210> 566

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 566

cctgtctctc tgtcctaggg ctcc 24

<210> 567

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 567

cccacaggaa acaatgaagg gagac 25

<210> 568

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 568

ccctgacacc agctgttcag cac 23

<210> 569

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 569

gagcaggcag agccgagcaa g 21

<210> 570

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 570

gggtcttgtt gtgagtaggg tgtg 24

<210> 571

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 571

cctggaatac tatttccacg ccg 23

<210> 572

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 572

gcagcacact ccaccctcac at 22

<210> 573

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 573

cggcgtcacg tgacctgagt aac 23

<210> 574

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 574

gtgtctgcct cgctctgctg c 21

<210> 575

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 575

ctatctgaaa tccaccacct tagacgc 27

<210> 576

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 576

gcctgagggg gccagaggt 19

<210> 577

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 577

gggactcccc gggtggtg 18

<210> 578

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 578

gaccctgtgt ttcaagtctc tctg 24

<210> 579

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 579

ggccatccag tacattcaat acg 23

<210> 580

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 580

gcagaagccg tgactcacag ca 22

<210> 581

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 581

cttgtgcttg tgattctgtc cttactgc 28

<210> 582

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 582

cgagaagtcg atgcagacac ttcaa 25

<210> 583

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 583

gctgaagact ggcgagcaca gct 23

<210> 584

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 584

gacctgaatg ttgtggctga gagtcc 26

<210> 585

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 585

ccctcacgtt cctgtccagc aa 22

<210> 586

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 586

ctaccgcctg cggacatggt 20

<210> 587

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 587

ccgtttgctg atgtagtagg ggtcc 25

<210> 588

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 588

catccttcgt gtctgaggac tggtc 25

<210> 589

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 589

ctctgggtga ccacacacga tgc 23

<210> 590

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 590

ggagagcgtc cgccaggag 19

<210> 591

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 591

gaagctctct taactactgt tc 22

<210> 592

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 592

caggccctag cagcgagcag 20

<210> 593

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 593

ggaaggggct ttcctccgag c 21

<210> 594

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 594

gctccgaccc tgctctccca 20

<210> 595

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 595

cctgttcatc aggctcgtag ccc 23

<210> 596

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 596

cgattgctgg cttgccttga g 21

<210> 597

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 597

ggttcgcgtc cgcccgcgtg at 22

<210> 598

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 598

gagaggtggt cctgtcgcct atg 23

<210> 599

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 599

cccagcaggt cacagctgac atc 23

<210> 600

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 600

agcacagtat gtattctata aaataatacg ac 32

<210> 601

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 601

gtgggagggg acagagacca tg 22

<210> 602

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 602

ccttacctgt tcctcttcct tatccagc 28

<210> 603

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 603

atacccagtc cacatccctg cc 22

<210> 604

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 604

cctctgcatc tccctcagga agtatt 26

<210> 605

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 605

gcctcctgtc cccaggtccc 20

<210> 606

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический праймер”

<400> 606

cactaggctt gggctgccct ct 22

<210> 607

<211> 102

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 607

gttttagagc tatgctgttt tgaatggtcc caaaacggaa gggcctgagt ccgagcagaa 60

gaagaagttt tagagctatg ctgttttgaa tggtcccaaa ac 102

<210> 608

<211> 100

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 608

cggaggacaa agtacaaacg gcagaagctg gaggaggaag ggcctgagtc cgagcagaag 60

aagaagggct cccatcacat caaccggtgg cgcattgcca 100

<210> 609

<211> 50

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 609

agctggagga ggaagggcct gagtccgagc agaagaagaa gggctcccac 50

<210> 610

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 610

gaguccgagc agaagaagaa guuuuagagc 30

<210> 611

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 611

agctggagga ggaagggcct gagtccgagc agaagagaag ggctcccat 49

<210> 612

<211> 53

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 612

ctggaggagg aagggcctga gtccgagcag aagaagaagg gctcccatca cat 53

<210> 613

<211> 52

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 613

ctggaggagg aagggcctga gtccgagcag aagagaaggg ctcccatcac at 52

<210> 614

<211> 54

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 614

ctggaggagg aagggcctga gtccgagcag aagaaagaag ggctcccatc acat 54

<210> 615

<211> 50

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 615

ctggaggagg aagggcctga gtccgagcag aagaagggct cccatcacat 50

<210> 616

<211> 47

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 616

ctggaggagg aagggcctga gcccgagcag aagggctccc atcacat 47

<210> 617

<211> 48

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 617

ctggaggagg aagggcctga gtccgagcag aagaagaagg gctcccat 48

<210> 618

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 618

gaguccgagc agaagaagau 20

<210> 619

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 619

gaguccgagc agaagaagua 20

<210> 620

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 620

gaguccgagc agaagaacaa 20

<210> 621

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 621

gaguccgagc agaagaugaa 20

<210> 622

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 622

gaguccgagc agaaguagaa 20

<210> 623

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 623

gaguccgagc agaugaagaa 20

<210> 624

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 624

gaguccgagc acaagaagaa 20

<210> 625

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 625

gaguccgagg agaagaagaa 20

<210> 626

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 626

gaguccgugc agaagaagaa 20

<210> 627

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 627

gagucggagc agaagaagaa 20

<210> 628

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 628

gagaccgagc agaagaagaa 20

<210> 629

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 629

aatgacaagc ttgctagcgg tggg 24

<210> 630

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 630

aaaacggaag ggcctgagtc cgagcagaag aagaagttt 39

<210> 631

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 631

aaacaggggc cgagattggg tgttcagggc agaggtttt 39

<210> 632

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 632

aaaacggaag ggcctgagtc cgagcagaag aagaagtt 38

<210> 633

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 633

aacggaggga ggggcacaga tgagaaactc agggttttag 40

<210> 634

<211> 38

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 634

agcccttctt cttctgctcg gactcaggcc cttcctcc 38

<210> 635

<211> 40

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 635

cagggaggga ggggcacaga tgagaaactc aggaggcccc 40

<210> 636

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 636

ggcaatgcgc caccggttga tgtgatggga gcccttctag gaggccccca gagcagccac 60

tggggcctca acactcaggc 80

<210> 637

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 637

catcgatgtc ctccccattg gcctgcttcg tgg 33

<210> 638

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 638

ttcgtggcaa tgcgccaccg gttgatgtga tgg 33

<210> 639

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 639

tcgtggcaat gcgccaccgg ttgatgtgat ggg 33

<210> 640

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 640

tccagcttct gccgtttgta ctttgtcctc cgg 33

<210> 641

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 641

ggagggaggg gcacagatga gaaactcagg agg 33

<210> 642

<211> 33

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 642

aggggccgag attgggtgtt cagggcagag agg 33

<210> 643

<211> 33

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 643

caagcactga gtgccattag ctaaatgcat agg 33

<210> 644

<211> 33

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 644

aatgcatagg gtaccaccca caggtgccag ggg 33

<210> 645

<211> 33

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 645

acacacatgg gaaagcctct gggccaggaa agg 33

<210> 646

<211> 37

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 646

ggaggaggta gtatacagaa acacagagaa gtagaat 37

<210> 647

<211> 37

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 647

agaatgtaga ggagtcacag aaactcagca ctagaaa 37

<210> 648

<211> 98

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 648

ggacgaaaca ccggaaccat tcaaaacagc atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 60

tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttt 98

<210> 649

<211> 186

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 649

ggacgaaaca ccggtagtat taagtattgt tttatggctg ataaatttct ttgaatttct 60

ccttgattat ttgttataaa agttataaaa taatcttgtt ggaaccattc aaaacagcat 120

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 180

tttttt 186

<210> 650

<211> 95

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 650

gggttttaga gctatgctgt tttgaatggt cccaaaacgg gtcttcgaga agacgtttta 60

gagctatgct gttttgaatg gtcccaaaac ttttt 95

<210> 651

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (5)..(34)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 651

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngt 36

<210> 652

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (7)..(36)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 652

taaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 653

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 653

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 60

ttaaaataag gctagtccgt tttt 84

<210> 654

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(19)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 654

nnnnnnnnnn nnnnnnnnng uuauuguacu cucaagauuu auuuuu 46

<210> 655

<211> 91

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 655

guuacuuaaa ucuugcagaa gcuacaaaga uaaggcuuca ugccgaaauc aacacccugu 60

cauuuuaugg caggguguuu ucguuauuua a 91

<210> 656

<211> 70

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 656

ttttctagtg ctgagtttct gtgactcctc tacattctac ttctctgtgt ttctgtatac 60

tacctcctcc 70

<210> 657

<211> 122

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 657

ggaggaaggg cctgagtccg agcagaagaa gaagggctcc catcacatca accggtggcg 60

cattgccacg aagcaggcca atggggagga catcgatgtc acctccaatg actagggtgg 120

gc 122

<210> 658

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(32)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 658

acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnguuuuaga gcuaugcu 48

<210> 659

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 659

agcauagcaa guuaaaauaa ggctaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60

gugcuuu 67

<210> 660

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 660

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cg 62

<210> 661

<211> 73

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 661

tgaatggtcc caaaacggaa gggcctgagt ccgagcagaa gaagaagttt tagagctatg 60

ctgttttgaa tgg 73

<210> 662

<211> 69

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 662

ctggtcttcc acctctctgc cctgaacacc caatctcggc ccctctcgcc accctcctgc 60

atttctgtt 69

<210> 663

<211> 138

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 663

acccaagcac tgagtgccat tagctaaatg catagggtac cacccacagg tgccaggggc 60

ctttcccaaa gttcccagcc ccttctccaa cctttcctgg cccagaggct ttcccatgtg 120

tgtggctgga ccctttga 138

<210> 664

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 664

aaaaccaccc ttctctctgg c 21

<210> 665

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 665

ggagattgga gacacggaga g 21

<210> 666

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 666

ctggaaagcc aatgcctgac 20

<210> 667

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 667

ggcagcaaac tccttgtcct 20

<210> 668

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 668

gtgctttgca gaggcctacc 20

<210> 669

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 669

cctggagcgc atgcagtagt 20

<210> 670

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 670

accttctgtg tttccaccat tc 22

<210> 671

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 671

ttggggagtg cacagacttc 20

<210> 672

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 672

tagctctaaa acttcttctt ctgctcggac 30

<210> 673

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 673

ctagccttat tttaacttgc tatgctgttt 30

<210> 674

<211> 99

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 674

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 99

<210> 675

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 675

tagcgggtaa gc 12

<210> 676

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 676

tcggtgacat gt 12

<210> 677

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 677

actccccgta gg 12

<210> 678

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 678

actgcgtgtt aa 12

<210> 679

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 679

acgtcgcctg at 12

<210> 680

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 680

taggtcgacc ag 12

<210> 681

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 681

ggcgttaatg at 12

<210> 682

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 682

tgtcgcatgt ta 12

<210> 683

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 683

atggaaacgc at 12

<210> 684

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 684

gccgaattcc tc 12

<210> 685

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 685

gcatggtacg ga 12

<210> 686

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 686

cggtactctt ac 12

<210> 687

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 687

gcctgtgccg ta 12

<210> 688

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 688

tacggtaagt cg 12

<210> 689

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 689

cacgaaatta cc 12

<210> 690

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 690

aaccaagata cg 12

<210> 691

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 691

gagtcgatac gc 12

<210> 692

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 692

gtctcacgat cg 12

<210> 693

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 693

tcgtcgggtg ca 12

<210> 694

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 694

actccgtagt ga 12

<210> 695

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 695

caggacgtcc gt 12

<210> 696

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 696

tcgtatccct ac 12

<210> 697

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 697

tttcaaggcc gg 12

<210> 698

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 698

cgccggtgga at 12

<210> 699

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 699

gaacccgtcc ta 12

<210> 700

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 700

gattcatcag cg 12

<210> 701

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 701

acaccggtct tc 12

<210> 702

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 702

atcgtgccct aa 12

<210> 703

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 703

gcgtcaatgt tc 12

<210> 704

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 704

ctccgtatct cg 12

<210> 705

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 705

ccgattcctt cg 12

<210> 706

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 706

tgcgcctcca gt 12

<210> 707

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 707

taacgtcgga gc 12

<210> 708

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 708

aaggtcgccc at 12

<210> 709

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 709

gtcggggact at 12

<210> 710

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 710

ttcgagcgat tt 12

<210> 711

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 711

tgagtcgtcg ag 12

<210> 712

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 712

tttacgcaga gg 12

<210> 713

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 713

aggaagtatc gc 12

<210> 714

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 714

actcgatacc at 12

<210> 715

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 715

cgctacatag ca 12

<210> 716

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 716

ttcataaccg gc 12

<210> 717

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 717

ccaaacggtt aa 12

<210> 718

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 718

cgattccttc gt 12

<210> 719

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 719

cgtcatgaat aa 12

<210> 720

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 720

agtggcgatg ac 12

<210> 721

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 721

cccctacggc ac 12

<210> 722

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 722

gccaacccgc ac 12

<210> 723

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 723

tgggacaccg gt 12

<210> 724

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 724

ttgactgcgg cg 12

<210> 725

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 725

actatgcgta gg 12

<210> 726

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 726

tcacccaaag cg 12

<210> 727

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 727

gcaggacgtc cg 12

<210> 728

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 728

acaccgaaaa cg 12

<210> 729

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 729

cggtgtattg ag 12

<210> 730

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 730

cacgaggtat gc 12

<210> 731

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 731

taaagcgacc cg 12

<210> 732

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 732

cttagtcggc ca 12

<210> 733

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 733

cgaaaacgtg gc 12

<210> 734

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 734

cgtgccctga ac 12

<210> 735

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 735

tttaccatcg aa 12

<210> 736

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 736

cgtagccatg tt 12

<210> 737

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 737

cccaaacggt ta 12

<210> 738

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 738

gcgttatcag aa 12

<210> 739

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 739

tcgatggtaa ac 12

<210> 740

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 740

cgactttttg ca 12

<210> 741

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 741

tcgacgactc ac 12

<210> 742

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 742

acgcgtcaga ta 12

<210> 743

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 743

cgtacggcac ag 12

<210> 744

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 744

ctatgccgtg ca 12

<210> 745

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 745

cgcgtcagat at 12

<210> 746

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 746

aagatcggta gc 12

<210> 747

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 747

cttcgcaagg ag 12

<210> 748

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 748

gtcgtggact ac 12

<210> 749

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 749

ggtcgtcatc aa 12

<210> 750

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 750

gttaacagcg tg 12

<210> 751

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 751

tagctaaccg tt 12

<210> 752

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 752

agtaaaggcg ct 12

<210> 753

<211> 12

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 753

ggtaatttcg tg 12

<210> 754

<211> 15

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 754

cagaagaaga agggc 15

<210> 755

<211> 51

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 755

ccaatgggga ggacatcgat gtcacctcca atgactaggg tggtgggcaa c 51

<210> 756

<211> 15

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 756

ctctggccac tccct 15

<210> 757

<211> 52

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 757

acatcgatgt cacctccaat gacaagcttg ctagcggtgg gcaaccacaa ac 52

<210> 758

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (6)..(25)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 758

caccgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

<210> 759

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (5)..(24)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 759

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnc 25

<210> 760

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 760

aacaccgggt cttcgagaag acctgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaat 54

<210> 761

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 761

caaaacgggt cttcgagaag acgttttaga gctatgctgt tttgaatggt ccca 54

<210> 762

<211> 4104

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КДп

<222> (1)..(4104)

<400> 762

atg gac aag aag tac agc atc ggc ctg gac atc ggc acc aac tct gtg 48

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

ggc tgg gcc gtg atc acc gac gag tac aag gtg ccc agc aag aaa ttc 96

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

aag gtg ctg ggc aac acc gac cgg cac agc atc aag aag aac ctg atc 144

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

gga gcc ctg ctg ttc gac agc ggc gaa aca gcc gag gcc acc cgg ctg 192

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

aag aga acc gcc aga aga aga tac acc aga cgg aag aac cgg atc tgc 240

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

tat ctg caa gag atc ttc agc aac gag atg gcc aag gtg gac gac agc 288

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

ttc ttc cac aga ctg gaa gag tcc ttc ctg gtg gaa gag gat aag aag 336

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

cac gag cgg cac ccc atc ttc ggc aac atc gtg gac gag gtg gcc tac 384

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

cac gag aag tac ccc acc atc tac cac ctg aga aag aaa ctg gtg gac 432

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

agc acc gac aag gcc gac ctg cgg ctg atc tat ctg gcc ctg gcc cac 480

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

atg atc aag ttc cgg ggc cac ttc ctg atc gag ggc gac ctg aac ccc 528

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

gac aac agc gac gtg gac aag ctg ttc atc cag ctg gtg cag acc tac 576

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

aac cag ctg ttc gag gaa aac ccc atc aac gcc agc ggc gtg gac gcc 624

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

aag gcc atc ctg tct gcc aga ctg agc aag agc aga cgg ctg gaa aat 672

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

ctg atc gcc cag ctg ccc ggc gag aag aag aat ggc ctg ttc ggc aac 720

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

ctg att gcc ctg agc ctg ggc ctg acc ccc aac ttc aag agc aac ttc 768

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

gac ctg gcc gag gat gcc aaa ctg cag ctg agc aag gac acc tac gac 816

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

gac gac ctg gac aac ctg ctg gcc cag atc ggc gac cag tac gcc gac 864

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

ctg ttt ctg gcc gcc aag aac ctg tcc gac gcc atc ctg ctg agc gac 912

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

atc ctg aga gtg aac acc gag atc acc aag gcc ccc ctg agc gcc tct 960

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

atg atc aag aga tac gac gag cac cac cag gac ctg acc ctg ctg aaa 1008

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

gct ctc gtg cgg cag cag ctg cct gag aag tac aaa gag att ttc ttc 1056

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

gac cag agc aag aac ggc tac gcc ggc tac att gac ggc gga gcc agc 1104

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

cag gaa gag ttc tac aag ttc atc aag ccc atc ctg gaa aag atg gac 1152

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

ggc acc gag gaa ctg ctc gtg aag ctg aac aga gag gac ctg ctg cgg 1200

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

aag cag cgg acc ttc gac aac ggc agc atc ccc cac cag atc cac ctg 1248

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

gga gag ctg cac gcc att ctg cgg cgg cag gaa gat ttt tac cca ttc 1296

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

ctg aag gac aac cgg gaa aag atc gag aag atc ctg acc ttc cgc atc 1344

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

ccc tac tac gtg ggc cct ctg gcc agg gga aac agc aga ttc gcc tgg 1392

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

atg acc aga aag agc gag gaa acc atc acc ccc tgg aac ttc gag gaa 1440

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

gtg gtg gac aag ggc gct tcc gcc cag agc ttc atc gag cgg atg acc 1488

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

aac ttc gat aag aac ctg ccc aac gag aag gtg ctg ccc aag cac agc 1536

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

ctg ctg tac gag tac ttc acc gtg tat aac gag ctg acc aaa gtg aaa 1584

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

tac gtg acc gag gga atg aga aag ccc gcc ttc ctg agc ggc gag cag 1632

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

aaa aag gcc atc gtg gac ctg ctg ttc aag acc aac cgg aaa gtg acc 1680

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

gtg aag cag ctg aaa gag gac tac ttc aag aaa atc gag tgc ttc gac 1728

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

tcc gtg gaa atc tcc ggc gtg gaa gat cgg ttc aac gcc tcc ctg ggc 1776

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

aca tac cac gat ctg ctg aaa att atc aag gac aag gac ttc ctg gac 1824

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

aat gag gaa aac gag gac att ctg gaa gat atc gtg ctg acc ctg aca 1872

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

ctg ttt gag gac aga gag atg atc gag gaa cgg ctg aaa acc tat gcc 1920

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

cac ctg ttc gac gac aaa gtg atg aag cag ctg aag cgg cgg aga tac 1968

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

acc ggc tgg ggc agg ctg agc cgg aag ctg atc aac ggc atc cgg gac 2016

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

aag cag tcc ggc aag aca atc ctg gat ttc ctg aag tcc gac ggc ttc 2064

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

gcc aac aga aac ttc atg cag ctg atc cac gac gac agc ctg acc ttt 2112

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

aaa gag gac atc cag aaa gcc cag gtg tcc ggc cag ggc gat agc ctg 2160

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

cac gag cac att gcc aat ctg gcc ggc agc ccc gcc att aag aag ggc 2208

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

atc ctg cag aca gtg aag gtg gtg gac gag ctc gtg aaa gtg atg ggc 2256

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

cgg cac aag ccc gag aac atc gtg atc gcc atg gcc aga gag aac cag 2304

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Ala Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

acc acc cag aag gga cag aag aac agc cgc gag aga atg aag cgg atc 2352

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

gaa gag ggc atc aaa gag ctg ggc agc cag atc ctg aaa gaa cac ccc 2400

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

gtg gaa aac acc cag ctg cag aac gag aag ctg tac ctg tac tac ctg 2448

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

cag aat ggg cgg gat atg tac gtg gac cag gaa ctg gac atc aac cgg 2496

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

ctg tcc gac tac gat gtg gac gcc atc gtg cct cag agc ttt ctg aag 2544

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

gac gac tcc atc gac gcc aag gtg ctg acc aga agc gac aag gcc cgg 2592

Asp Asp Ser Ile Asp Ala Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg

850 855 860

ggc aag agc gac aac gtg ccc tcc gaa gag gtc gtg aag aag atg aag 2640

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

aac tac tgg cgg cag ctg ctg aac gcc aag ctg att acc cag aga aag 2688

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

ttc gac aat ctg acc aag gcc gag aga ggc ggc ctg agc gaa ctg gat 2736

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

aag gcc ggc ttc atc aag aga cag ctg gtg gaa acc cgg cag atc aca 2784

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

aag cac gtg gca cag atc ctg gac tcc cgg atg aac act aag tac gac 2832

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

gag aat gac aag ctg atc cgg gaa gtg aaa gtg atc acc ctg aag tcc 2880

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

aag ctg gtg tcc gat ttc cgg aag gat ttc cag ttt tac aaa gtg cgc 2928

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

gag atc aac aac tac cac cac gcc cac gcc gcc tac ctg aac gcc gtc 2976

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

gtg gga acc gcc ctg atc aaa aag tac cct aag ctg gaa agc gag ttc 3024

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

gtg tac ggc gac tac aag gtg tac gac gtg cgg aag atg atc gcc 3069

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

aag agc gag cag gaa atc ggc aag gct acc gcc aag tac ttc ttc 3114

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

tac agc aac atc atg aac ttt ttc aag acc gag att acc ctg gcc 3159

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

aac ggc gag atc cgg aag cgg cct ctg atc gag aca aac ggc gaa 3204

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

acc ggg gag atc gtg tgg gat aag ggc cgg gat ttt gcc acc gtg 3249

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

cgg aaa gtg ctg agc atg ccc caa gtg aat atc gtg aaa aag acc 3294

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

gag gtg cag aca ggc ggc ttc agc aaa gag tct atc ctg ccc aag 3339

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

agg aac agc gat aag ctg atc gcc aga aag aag gac tgg gac cct 3384

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

aag aag tac ggc ggc ttc gac agc ccc acc gtg gcc tat tct gtg 3429

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

ctg gtg gtg gcc aaa gtg gaa aag ggc aag tcc aag aaa ctg aag 3474

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

agt gtg aaa gag ctg ctg ggg atc acc atc atg gaa aga agc agc 3519

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

ttc gag aag aat ccc atc gac ttt ctg gaa gcc aag ggc tac aaa 3564

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

gaa gtg aaa aag gac ctg atc atc aag ctg cct aag tac tcc ctg 3609

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

ttc gag ctg gaa aac ggc cgg aag aga atg ctg gcc tct gcc ggc 3654

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

gaa ctg cag aag gga aac gaa ctg gcc ctg ccc tcc aaa tat gtg 3699

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

aac ttc ctg tac ctg gcc agc cac tat gag aag ctg aag ggc tcc 3744

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

ccc gag gat aat gag cag aaa cag ctg ttt gtg gaa cag cac aag 3789

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

cac tac ctg gac gag atc atc gag cag atc agc gag ttc tcc aag 3834

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

aga gtg atc ctg gcc gac gct aat ctg gac aaa gtg ctg tcc gcc 3879

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

tac aac aag cac cgg gat aag ccc atc aga gag cag gcc gag aat 3924

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

atc atc cac ctg ttt acc ctg acc aat ctg gga gcc cct gcc gcc 3969

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

ttc aag tac ttt gac acc acc atc gac cgg aag agg tac acc agc 4014

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

acc aaa gag gtg ctg gac gcc acc ctg atc cac cag agc atc acc 4059

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

ggc ctg tac gag aca cgg atc gac ctg tct cag ctg gga ggc gac 4104

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 763

<211> 1368

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 763

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Ala Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Ala Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Ala Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Ala Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 764

<211> 57

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КДп

<222> (1)..(57)

<400> 764

ggc acc att aaa gaa aat atc att ggt gtt tcc tat gat gaa tat aga 48

Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Arg

1 5 10 15

tac aga agc 57

Tyr Arg Ser

<210> 765

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 765

Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Tyr Arg Ser

<210> 766

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> КДп

<222> (1)..(48)

<400> 766

att aaa gaa aat atc att ggc ttt gtt tcc tat gat gaa tat aga tac 48

Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Phe Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 767

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид”

<400> 767

Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Phe Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 768

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(48)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 768

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg 50

<210> 769

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(44)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 769

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngg 46

<210> 770

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(40)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 770

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gg 42

<210> 771

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(36)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 771

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngg 38

<210> 772

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(32)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 772

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngg 34

<210> 773

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(28)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 773

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngg 30

<210> 774

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(24)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 774

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngg 26

<210> 775

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(20)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 775

ccnnnnnnnn nnnnnnnnnn gg 22

<210> 776

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(16)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 776

ccnnnnnnnn nnnnnngg 18

<210> 777

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(14)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 777

ccnnnnnnnn nnnngg 16

<210> 778

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(13)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 778

ccnnnnnnnn nnngg 15

<210> 779

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(12)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 779

ccnnnnnnnn nngg 14

<210> 780

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(11)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 780

ccnnnnnnnn ngg 13

<210> 781

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(10)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 781

ccnnnnnnnn gg 12

<210> 782

<211> 11

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(9)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 782

ccnnnnnnng g 11

<210> 783

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(8)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 783

ccnnnnnngg 10

<210> 784

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (3)..(10)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 784

ggnnnnnnnn cc 12

<210> 785

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 785

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcacatc aaccggtggc gcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 786

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 786

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcacatc aaccggtggc gcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 787

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 787

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaggaca aagtacaaac ggcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 788

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 788

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaggaca aagtacaaac ggcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 789

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 789

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgtggcgc attgccacga agcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 790

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 790

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccgagggc agagtgctgc ttgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 791

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 791

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgagtccg agcagaagaa gaaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 792

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 792

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaggaca aagtacaaac ggcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 793

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 793

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacagcagaa gaagaagggc tccggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 794

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 794

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcacatc aaccggtggc gcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 795

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 795

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacccctggc ccaggtgaag gtgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 796

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 796

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactccctcc ctggcccagg tgaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 797

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 797

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaaccgg aggacaaagt acaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 798

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 798

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacaggtgaa ggtgtggttc cagggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 799

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 799

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacggtgaag gtgtggttcc agaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 800

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 800

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaaccgg aggacaaagt acaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 801

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 801

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacccctggc ccaggtgaag gtgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 802

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 802

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacaggtgaa ggtgtggttc cagggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 803

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 803

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaggaca aagtacaaac ggcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 804

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 804

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgggaggg aggggcacag atgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 805

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 805

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccaccttc acctgggcca gggggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 806

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 806

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacaccctag tcattggagg tgaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 807

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 807

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccagagca gccactgggg cctggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 808

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 808

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccaccttc acctgggcca gggggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 809

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 809

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacccccatt ggcctgcttc gtgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 810

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 810

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacattggcc tgcttcgtgg caaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 811

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 811

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcctcct ccagcttctg ccgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 812

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 812

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccctccag cttctgccgt ttgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 813

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 813

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacattggcc tgcttcgtgg caaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 814

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 814

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgcagcaa gcagcactct gccggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 815

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 815

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacttcttct tctgctcgga ctcggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 816

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 816

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacaccggag gacaaagtac aaaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 817

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 817

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcttctt ctgctcggac tcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 818

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 818

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgttgatg tgatgggagc cctggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 819

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 819

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgggccag ggagggaggg gcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 820

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 820

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgggaggg aggggcacag atgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 821

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 821

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacccggttc tggaaccaca cctggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 822

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 822

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcacctg ggccagggag ggaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 823

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 823

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aactcacctg ggccagggag ggaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 824

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 824

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgttctgg aaccacacct tcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 825

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 825

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgggaggg aggggcacag atgggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 826

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 826

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgggccag ggagggaggg gcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 827

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 827

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgttctgg aaccacacct tcaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 828

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 828

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacaggtgaa ggtgtggttc cagggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 829

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 829

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgaaccgg aggacaaagt acaggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 830

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 830

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aaccaaaccc acgagggcag agtggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 831

<211> 125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 831

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60

cttgctattt ctagctctaa aacgagtttc tcatctgtgc cccggtgttt cgtcctttcc 120

acaag 125

<210> 832

<211> 684

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> КДп

<222> (1)..(123)

<220>

<221> КДп

<222> (127)..(159)

<220>

<221> КДп

<222> (163)..(399)

<220>

<221> КДп

<222> (403)..(684)

<400> 832

aaa acc acc ctt ctc tct ggc cca ctg tgt cct ctt cct gcc ctg cca 48

Lys Thr Thr Leu Leu Ser Gly Pro Leu Cys Pro Leu Pro Ala Leu Pro

1 5 10 15

tcc cct tct gtg aat gtt aga ccc atg gga gca gct ggt cag agg gga 96

Ser Pro Ser Val Asn Val Arg Pro Met Gly Ala Ala Gly Gln Arg Gly

20 25 30

ccc cgg cct ggg gcc cct aac cct atg tag cct cag tct tcc cat cag 144

Pro Arg Pro Gly Ala Pro Asn Pro Met Pro Gln Ser Ser His Gln

35 40 45

gct ctc agc tca gcc tga gtg ttg agg ccc cag tgg ctg ctc tgg ggg 192

Ala Leu Ser Ser Ala Val Leu Arg Pro Gln Trp Leu Leu Trp Gly

50 55 60

cct cct gag ttt ctc atc tgt gcc cct ccc tcc ctg gcc cag gtg aag 240

Pro Pro Glu Phe Leu Ile Cys Ala Pro Pro Ser Leu Ala Gln Val Lys

65 70 75

gtg tgg ttc cag aac cgg agg aca aag tac aaa cgg cag aag ctg gag 288

Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Thr Lys Tyr Lys Arg Gln Lys Leu Glu

80 85 90

gag gaa ggg cct gag tcc gag cag aag aag aag ggc tcc cat cac atc 336

Glu Glu Gly Pro Glu Ser Glu Gln Lys Lys Lys Gly Ser His His Ile

95 100 105 110

aac cgg tgg cgc att gcc acg aag cag gcc aat ggg gag gac atc gat 384

Asn Arg Trp Arg Ile Ala Thr Lys Gln Ala Asn Gly Glu Asp Ile Asp

115 120 125

gtc acc tcc aat gac tag ggt ggg caa cca caa acc cac gag ggc aga 432

Val Thr Ser Asn Asp Gly Gly Gln Pro Gln Thr His Glu Gly Arg

130 135 140

gtg ctg ctt gct gct ggc cag gcc cct gcg tgg gcc caa gct gga ctc 480

Val Leu Leu Ala Ala Gly Gln Ala Pro Ala Trp Ala Gln Ala Gly Leu

145 150 155

tgg cca ctc cct ggc cag gct ttg ggg agg cct gga gtc atg gcc cca 528

Trp Pro Leu Pro Gly Gln Ala Leu Gly Arg Pro Gly Val Met Ala Pro

160 165 170

cag ggc ttg aag ccc ggg gcc gcc att gac aga ggg aca agc aat ggg 576

Gln Gly Leu Lys Pro Gly Ala Ala Ile Asp Arg Gly Thr Ser Asn Gly

175 180 185

ctg gct gag gcc tgg gac cac ttg gcc ttc tcc tcg gag agc ctg cct 624

Leu Ala Glu Ala Trp Asp His Leu Ala Phe Ser Ser Glu Ser Leu Pro

190 195 200 205

gcc tgg gcg ggc ccg ccc gcc acc gca gcc tcc cag ctg ctc tcc gtg 672

Ala Trp Ala Gly Pro Pro Ala Thr Ala Ala Ser Gln Leu Leu Ser Val

210 215 220

tct cca atc tcc 684

Ser Pro Ile Ser

225

<210> 833

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 833

Lys Thr Thr Leu Leu Ser Gly Pro Leu Cys Pro Leu Pro Ala Leu Pro

1 5 10 15

Ser Pro Ser Val Asn Val Arg Pro Met Gly Ala Ala Gly Gln Arg Gly

20 25 30

Pro Arg Pro Gly Ala Pro Asn Pro Met

35 40

<210> 834

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 834

Pro Gln Ser Ser His Gln Ala Leu Ser Ser Ala

1 5 10

<210> 835

<211> 79

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 835

Val Leu Arg Pro Gln Trp Leu Leu Trp Gly Pro Pro Glu Phe Leu Ile

1 5 10 15

Cys Ala Pro Pro Ser Leu Ala Gln Val Lys Val Trp Phe Gln Asn Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Tyr Lys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Glu Gly Pro Glu Ser

35 40 45

Glu Gln Lys Lys Lys Gly Ser His His Ile Asn Arg Trp Arg Ile Ala

50 55 60

Thr Lys Gln Ala Asn Gly Glu Asp Ile Asp Val Thr Ser Asn Asp

65 70 75

<210> 836

<211> 94

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 836

Gly Gly Gln Pro Gln Thr His Glu Gly Arg Val Leu Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gln Ala Pro Ala Trp Ala Gln Ala Gly Leu Trp Pro Leu Pro Gly Gln

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Pro Gly Val Met Ala Pro Gln Gly Leu Lys Pro Gly

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Gly Thr Ser Asn Gly Leu Ala Glu Ala Trp Asp

50 55 60

His Leu Ala Phe Ser Ser Glu Ser Leu Pro Ala Trp Ala Gly Pro Pro

65 70 75 80

Ala Thr Ala Ala Ser Gln Leu Leu Ser Val Ser Pro Ile Ser

85 90

<210> 837

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (21)..(27)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 837

gggactcaac caagtcattc nnnnnnn 27

<210> 838

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 838

gggacucaac caagucauuc 20

<210> 839

<211> 157

<212> РНК

<213> Staphylococcus aureus

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(30)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 839

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuguaauuu uagguaugag 60

guagacgaaa auuguacuua uaccuaaaau uacagaaucu acuaaaacaa ggcaaaaugc 120

cguguuuauc ucgucaacuu guuggcgaga uuuuuuu 157

<210> 840

<211> 34

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 840

cggccgctga ccacacctgc caggtgggtg ccgt 34

<210> 841

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 841

ccgcugacca caccugccag 20

<210> 842

<211> 34

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 842

ggccaccgca gccacgcaga gcagtgggtg ccca 34

<210> 843

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 843

caccgcagcc acgcagagca 20

<210> 844

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 844

ccggccgctg accacacctc aggtgggtgc c 31

<210> 845

<211> 32

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 845

cggccgctga ccacacctgc caggtgggtg cc 32

<210> 846

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 846

cggccgctga ccacacctgc tcaggtgggt gcc 33

<210> 847

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 847

cggccgctga ccacacctgc aggtgggtgc c 31

<210> 848

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 848

cggccgctga ccacacatgc caggtgggtg cc 32

<210> 849

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 849

cggccgctga ccacacctca ggtgggtgcc 30

<210> 850

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 850

cggccgctga ccacacctgc ggtgggtgcc 30

<210> 851

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 851

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcugcggauu gcggccgucu cucgauuu 48

<210> 852

<211> 95

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 852

aaaucgagag gcggucgcuu uucgcaagca aauugacccc uugugcgggc ucggcauccc 60

aaggucagcu gccgguuauu aucgaaaagg cccac 95

<210> 853

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 853

gugggccuuu uuu 13

<210> 854

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 854

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuuguac ucucaagauu uaaguaa 47

<210> 855

<211> 81

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 855

uuacuuaaau cuugcugagc cuacaaagau aaggcuuuau gccgaauuca agcaccccau 60

guuuugacau gaggugcuuu u 81

<210> 856

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 856

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuguaauuu uagguaug 48

<210> 857

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 857

uauaccuaaa auuacagaau cuacuaaaac aaggcaaaau gccguguuua ucucgucaac 60

uuguuggcga gauuuuu 77

<210> 858

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 858

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ugaaugguc 49

<210> 859

<211> 82

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 859

aaccauucaa aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag 60

uggcaccgag ucggugcuuu uu 82

<210> 860

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn acugggguuc aguucucaaa aacccugaua gacuu 55

<210> 861

<211> 103

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 861

agucacuaac uuaauuaaau agaacugaac cucaguaagc auuggcucgu uuccaauguu 60

gauugcuccg ccggugcucc uuauuuuuaa gggcgccggc uuu 103

<210> 862

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 862

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuguagcuc ccauucucau uucgcagugc 50

<210> 863

<211> 99

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 863

gcacugcgaa augagaaccg uugcuacaau aaggccgucu gaaaagaugu gccgcaacgc 60

ucugccccuu aaagcuucug cuuuaagggg caucguuuu 99

<210> 864

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(20)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 864

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagucu cuuuuuaaau uucuuuauga 50

<210> 865

<211> 116

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 865

ugcuaaagaa auuuaaaaag agacuaaaau aagugguuuu uggucaucca cgcaggguua 60

caaucccuuu aaaaccauua aaauucaaau aaacuagguu guaucaacuu aguuuu 116

<210> 866

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (1)..(19)

<223> a, c, u, g, неизвестное или другое

<400> 866

nnnnnnnnnn nnnnnnnnng uuuuuguacu cucaagauuu aaguaa 46

<210> 867

<211> 90

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 867

uuacuuaaau cuugcagaag cuacaaagau aaggcuucau gccgaaauca acacccuguc 60

auuuuauggc aggguguuuu cguuauuuaa 90

<210> 868

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (21)..(27)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 868

gggactcaac caagtcattc nnnnnnngta gtaa 34

<210> 869

<211> 440

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 869

tgggaagatg gaagcagcca ggtggaggtg tatctcttag ataccagcat ccagggtgcc 60

catcgggaga ttgagggcag ggtcaccatc accgacttca acagcgtgcc ggaggaggat 120

gggacacgct tccacagaca ggtgagtgtg actctcactt catctcagag gtgggtgaag 180

gtgggcagag gtaccacccc tggagcatta tgtcagtact gccatcattg gggtgctatg 240

tcagtctgtc cacaccctct cacgtgatcc ccgtgttgat tgatcaggcg agcaagtgtg 300

acagccacgg cacccacctg gcaggtgtgg tcagcggccg ggatgctggt gtggccaagg 360

gcaccagcct gcacagcctg cgtgtgctca actgtcaagg gaagggcaca gtcagcggca 420

ccctcatagg tgagtgactc 440

<210> 870

<211> 30

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 870

ccaccattct gcagagccag cagaggcagg 30

<210> 871

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 871

ccauucugca gagccagcag 20

<210> 872

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 872

ccattctgca gagccagcag agg 23

<210> 873

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 873

ccattctgca gagccagagg cagg 24

<210> 874

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 874

ccattctgca gagcccagag g 21

<210> 875

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 875

ccattctgca gagccagaga gg 22

<210> 876

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 876

ccattctgca gagcagagg 19

<210> 877

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 877

ccattctgca gagccccaga gg 22

<210> 878

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 878

ccattctgca gagccaggag gcagg 25

<210> 879

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (18)..(61)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 879

ccattctgca gagccagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

ncagagg 67

<210> 880

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (18)..(52)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 880

ccattctgca gagccagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagg 55

<210> 881

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 881

ccattctgca gagccagaag agg 23

<210> 882

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 882

ccattctgca gagccagcac agagg 25

<210> 883

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 883

ccattctgca gagccacaga gg 22

<210> 884

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 884

ccattctgca gagccagtca gagg 24

<210> 885

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 885

uuggcauggg ucgcugacgg 20

<210> 886

<211> 30

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 886

ccagcctccg tcagcgaccc atgccaagac 30

<210> 887

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 887

cgggcuggag cuguucgcgc 20

<210> 888

<211> 30

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 888

gatgccagcg cgaacagctc cagcccgagt 30

<210> 889

<211> 30

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 889

agaagagggt gccagcgggt atgaggagtg 30

<210> 890

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 890

agagggugcc agcggguaug 20

<210> 891

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 891

ctgggagagg gagcccctcc agg 23

<210> 892

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 892

aaaggtggga gacacctcct tgg 23

<210> 893

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 893

tccaaccttc aggcaaggtg ggg 23

<210> 894

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 894

aggaagtctg gccgatctgc tgg 23

<210> 895

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 895

ctctgaggcc ctggagatcc tgg 23

<210> 896

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 896

ttggcatggg tcgctgacgg agg 23

<210> 897

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 897

cgggctggag ctgttcgcgc tgg 23

<210> 898

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 898

agagggtgcc agcgggtatg agg 23

<210> 899

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 899

cctccgtcag cgacccatgc caa 23

<210> 900

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 900

cctccgatca gcgacccatg ccaa 24

<210> 901

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 901

cctccgttca gcgacccatg ccaa 24

<210> 902

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 902

cctccgctca gcgacccatg ccaa 24

<210> 903

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 903

cctcctcagc gacccatgcc aa 22

<210> 904

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 904

cctccgcagc gacccatgcc aa 22

<210> 905

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 905

cctctcagcg acccatgcca a 21

<210> 906

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 906

cctccgcgac ccatgccaa 19

<210> 907

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 907

cctcagcgac ccatgccaa 19

<210> 908

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 908

ctcagcgacc catgccaa 18

<210> 909

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 909

ccagcgcgaa cagctccagc ccg 23

<210> 910

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 910

ccagcgccga acagctccag cccg 24

<210> 911

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 911

ccagcgaaca gctccagccc g 21

<210> 912

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 912

ccagcggaca gctccagccc g 21

<210> 913

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 913

ccagaacagc tccagcccg 19

<210> 914

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 914

ccagcgagct ccagcccg 18

<210> 915

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 915

ccagcgcaca gctccagccc g 21

<210> 916

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 916

ccagcgctcc agcccg 16

<210> 917

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 917

agagggtgcc agcgggttat gagg 24

<210> 918

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 918

agagggtgcc agcgggtaat gagg 24

<210> 919

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (18)..(36)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 919

agagggtgcc agcgggtnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 36

<210> 920

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 920

agagggtgcc agtatgagg 19

<210> 921

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 921

agagggtgcc agcgggtgag g 21

<210> 922

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 922

agagggtgcc agcgagg 17

<210> 923

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид”

<400> 923

agagggtgcc agcggggagg 20

<210> 924

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид”

<400> 924

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

<210> 925

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> / примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетическая 6xHis-метка”

<400> 925

His His His His His His

1 5

<210> 926

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=“Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид”

<220>

<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК

<222> (2)..(2)

<223> Ahx

<400> 926

Arg Xaa Arg Arg Arg Arg

1 5

<---

Claims (31)

1. Композиция, содержащая один или несколько вирусных векторов, кодирующих систему CRISPR-Cas, где система CRISPR-Cas содержит Cas9, который содержит по меньшей мере один сигнал ядерной локализации, направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью, экспрессируемой в клетке мозга и ассоциированной с геном, вовлеченным в заболевание или расстройство мозга, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность, для применения в лечении данного заболевания или расстройства мозга путем модификации клеток мозга организма in vivo, при условии, что указанное применение не включает модификацию клеток зародышевой линии человека,

где либо направляющая последовательность, парная tracr-последовательность и tracr-последовательность соединены вместе от 5' до 3' в единый полинуклеотид, либо направляющая последовательность и парная tracr-последовательность соединены вместе от 5' до 3' в первый полинуклеотид, а tracr-последовательность содержится во втором полинуклеотиде.

2. Композиция по п.1, в которой экспрессия продукта гена изменяется системой CRISPR-Cas в мозге, вызывая тем самым фенотипическое изменение.

3. Композиция по п.1, где указанное применение включает доставку указанной композиции в клетки мозга в организме.

4. Композиция по п.1 для лечения или подавления состояния, вызванного дефектом в указанной целевой последовательности, экспрессируемой в мозге.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где указанное применение включает введение в клетки мозга в организме одного или нескольких вирусных векторов, включающих

(а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и последовательность tracr, и

(б) второй регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей Cas9, содержащей по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации,

где компоненты а) и б) расположены на одинаковых или разных векторах.

6. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная композиция содержит:

(а) полинуклеотидную последовательность, содержащую от 5' к 3' направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность, и

(б) полинуклеотидную последовательность, кодирующую Cas9 и по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации,

где парная tracr-последовательность способна гибридизоваться с tracr-последовательностью, где направляющая последовательность способна направлять специфичное для последовательности связывание комплекса CRISPR, содержащего Cas9, с целевой последовательностью, и где полинуклеотидная последовательность, кодирующая Cas9, представляет собой ДНК или РНК.

7. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная композиция содержит:

(а) полинуклеотидную последовательность, содержащую направляющую последовательность и парную tracr-последовательность,

(б) полинуклеотидную последовательность, кодирующую Cas9 и по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации, и

(в) полинуклеотидную последовательность, содержащую tracr-последовательность,

где парная tracr-последовательность способна гибридизоваться с tracr-последовательностью, где направляющая последовательность способна направлять специфичное для последовательности связывание комплекса CRISPR, содержащего Cas9, с целевой последовательностью, и где полинуклеотидная последовательность, кодирующая Cas9, представляет собой ДНК или РНК.

8. Композиция по любому из пп.1-4, где экспрессия двух или более продуктов нейрональных генов изменена.

9. Композиция по любому из пп.1-4, в которой направляющая последовательность слита с парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью.

10. Композиция по любому из пп.1-4, в которой полинуклеотидная последовательность, кодирующая Cas9, оптимизирована по кодонам для экспрессии в организме.

11. Композиция по любому из пп.1-4, где организм представляет собой млекопитающее.

12. Композиция по любому из пп.1-4, в которой целевая последовательность фланкирована на своем 3'-конце или замыкается 5'-NRG, и где Cas9 представляет собой Cas9 из S. pyogenes или S. aureus.

13. Композиция по любому из пп.1-4, в которой один или несколько вирусных векторов представляет собой AAV или лентивирусный вектор, предпочтительно AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 или их комбинацию.

14. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что а) и б) расположены на одном вирусном векторе.

15. Композиция по п.14, в которой указанный вирусный вектор представляет собой вектор AAV, а указанный Cas9 представляет собой Cas9 из S. aureus.

16. Композиция по любому из пп.1-4, где вирусные векторы доставляют посредством стереотаксической инъекции.

17. Композиция по любому из пп.1-4, в которой полинуклеотидная последовательность, кодирующая Cas9, функционально связана со специфическим для мозга промотором.

18. Композиция по любому из пп.1-4, в которой полинуклеотидная последовательность, кодирующая Cas9, функционально связана с промотором, выбранным из группы, состоящей из CamkII, Parvalbumin, vGAT, DR1, DR2, GFAP и Arc.

19. Композиция по любому из пп.1-4, в которой клетка мозга представляет собой нейронную клетку.

20. Композиция по любому из пп.1-4, в которой указанное применение представляет собой коррекцию одного или нескольких дефектных генотипов в клетках мозга.

Images