Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN106029880A - 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法 - Google Patents

核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106029880A
CN106029880A CN201480072798.9A CN201480072798A CN106029880A CN 106029880 A CN106029880 A CN 106029880A CN 201480072798 A CN201480072798 A CN 201480072798A CN 106029880 A CN106029880 A CN 106029880A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
crispr
compositions
target
cas9
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480072798.9A
Other languages
English (en)
Inventor
贝弗利·戴维森
林致宇
埃德加多·罗德里格斯
张锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Iowa Research Foundation UIRF
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Original Assignee
University of Iowa Research Foundation UIRF
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Iowa Research Foundation UIRF, Massachusetts Institute of Technology, Broad Institute Inc filed Critical University of Iowa Research Foundation UIRF
Publication of CN106029880A publication Critical patent/CN106029880A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

本发明提供了用于操纵靶序列的序列和/或活性的系统、方法、和组合物的递送、工程化和优化，以便尤其针对核苷酸重复障碍而使用。提供了递送系统和被靶向作为用于递送的部位的组织或器官，以便尤其针对核苷酸重复障碍而使用。还提供了载体和载体系统、以及用于设计和使用此类载体和载体系统的方法，其中这些载体和载体系统中的一些编码尤其针对核苷酸重复障碍而使用的CRISPR复合物或系统的一种或多种组分。还提供了以下方法：在考虑对于靶标识别的特异性和避免毒性的情况下指导在真核细胞中形成CRISPR复合物或系统以便尤其针对核苷酸重复障碍而使用，以及编辑或修饰在感兴趣基因组座位中的靶位点以改变或改善疾病或病症的状态。

Description

核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法
相关应用和引用参考
本申请要求来自以下的优先权：提交于2013年12月12日的美国临时专利申请序列号61/915,150；及均提交于2014年6月11日的62/010,888及62/010,879。
前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的递送、工程化、优化和治疗应用，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的基因组干扰或基因编辑。本发明涉及用于脑和中枢神经系统(CNS)障碍和疾病的CRISPR-Cas系统和组合物的递送、用途、控制和治疗应用。本发明涉及用于核苷酸重复元件(例如三核苷酸重复、四核苷酸重复、核苷酸扩增元件)障碍和疾病的CRISPR-Cas系统和组合物的递送、用途、控制和治疗应用。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award)(1DP1MH100706)的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。
发明内容
本发明在一方面提供了一种非天然存在的或工程化的自失活CRISPR-Cas组合物，该组合物包含：
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种第一指导序列，该至少一种第一指导序列能够杂交到靶DNA上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的多核苷酸序列，
其中项I和项II包含第一CRISPR-Cas系统，并且其中，
III.该组合物进一步包含
(a)至少一种第二指导序列，该至少一种第二指导序列能够杂交到CRISPR-Cas系统中的序列上或CRISPR-Cas系统的序列上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中项I和项III包含第二CRISPR-Cas系统，
并且所述组合物当转录时包含
第一CRISPR复合物，该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该靶序列上的该第一指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
第二CRISPR复合物，该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到包含或编码该CRISPR-Cas系统的多核苷酸的序列上的该第二指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
其中该第一指导序列引导第一CRISPR复合物与该靶DNA的序列特异性结合，并且
其中该第二指导序列引导第二CRISPR复合物与包含含有或编码该CRISPR-Cas系统的组分的多核苷酸的序列进行序列特异性结合，并且借此可以存在该第一CRISPR-Cas系统经一段时间的降低的活性，并且该CRISPR-Cas组合物可以是自失活的(“SIN CRISPR-Cas组合物”)。
该靶DNA序列可以在细胞内。该细胞可以是真核细胞或原核细胞。该组合物该第一CRISPR-Cas系统和/或第二CRISPR-Cas系统可以例如针对真核细胞进行密码子优化。II可以包括编码一个或多个核定位信号(NLS)。项I可以由第一病毒载体编码，并且项II可以由第二病毒载体编码。该第一和第二病毒载体可以是慢病毒载体或重组AAV。该重组AAV基因组可以包含反向末端重复(iTR)。CRISPR酶的表达可以由AAV基因组中的反向末端重复(iTR)驱动。该第一调节元件可以是III型RNA聚合酶启动子，并且该第二调节元件可以是III型RNA聚合酶启动子。该第一调节元件可以是U6启动子或H1启动子。该第二调节元件可以是遍存表达启动子或细胞类型特异性启动子。可以存在包含FLAG-标签的选择标记。该CRISPR酶可以包含C-末端NLS和N-末端NLS。该组合物可以经由注射递送。该组合物或其部分可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡递送。17.该组合物可以具有第一指导序列，该第一指导序列引导第一CRISPR复合物与该靶DNA序列的序列特异性结合并且改变该细胞中基因组座位的表达。该组合物可以具有其中该第一CRISPR复合物介导结合至或双链或单链DNA断裂，由此编辑该细胞中的基因组座位。19.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该第一和/或第二CRISPR-Cas系统可以是多元CRISPR酶系统，该多元CRISPR酶系统进一步包含多种嵌合体和/或多种多指导序列和单一tracr序列。在该组合物中，该第一CRISPR-Cas系统可以是多元CRISPR酶系统以使得脱靶活性最小化。根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶可以是切口酶。该CRISPR酶可以包括一个或多个突变。该一个或多个突变可以选自D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A。该一个或多个突变可以是在CRISPR酶的RuvC1结构域中。该CRISPR复合物介导基因组工程化，该基因组工程化包括：修饰靶多核苷酸或其表达，敲除基因、增强或增加或减少多核苷酸或基因的表达、或修复突变、或通过插入多核苷酸进行编辑。该CRISPR酶进一步包含功能结构域。该CRISPR酶可以是Cas9。该第二复合物可以结合至用于CRISPR酶表达的序列。该第二指导序列能够杂交至(a)编码RNA的序列或(b)编码CRISPR酶的序列，或(c)非编码序列，该非编码序列包括i)在驱动非编码RNA元件的表达的调节元件内的序列，ii)在驱动CRISPR酶的表达的调节元件内的序列，iii)在CRISPR酶编码序列的ATG翻译起始密码子的100bp内的序列，以及iv)在病毒载体的反向末端重复内的序列。该第二指导序列可以单独表达以实现第一CRISPR-Cas系统的失活。该第二CRISPR复合物诱导CRISPR酶编码序列中的移码，导致蛋白质表达的损失。该第二指导序列靶向iTR，其中表达将导致完整的CRISPR-Cas盒的切除。该第二指导序列可以按阵列形式表达以实现第一CRISPR-Cas9系统的失活。第二指导序列可以按阵列形式表达，并且靶向于调节元件两者，由此从第一CRISPR-Cas系统内切除间插核苷酸，有效地引起其失活。该第二指导序列的表达可以由U6启动子驱动。该第一CRISPR-Cas系统的自我失活限制其在靶向的细胞中的活性和/或表达的持续时间。CRISPR酶的瞬时表达可以正常地在48小时内丧失。本发明还包含含有第一和第二CRISPR复合物的非天然存在的或工程化的组合物。
关于CRISPR酶的突变，当该酶不是SpCas9时，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在一个方面，本发明提供了关于本文论述的任何或各个或所有实施例，其中该CRISPR酶包含至少一个或多个、或至少两个或更多个突变，其中该至少一个或多个突变或该至少两个或更多个突变是关于根据SpCas9蛋白的D10、E762、H840、N854、N863、或D986，例如，关于SpCas9的D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A，或根据SaCas9的N580，例如，关于SaCas9的N580A，或Cas9的直向同源物中与Sp或Sa对应的任何一个或多个突变，或该CRISPR酶包含至少一个突变，其中至少关于Sp Cas9的H840或N863A或关于Sa Cas9的N580A是突变的；例如，其中该CRISPR酶包含H840A、或D10A和H840A、或D10A和N863A，根据Sp Cas9蛋白，或Cas9的直向同源物中与Sp蛋白或Sa蛋白对应的任何一个或多个突变。
本发明在一方面提供了一种治疗或抑制以下细胞或组织中的病症的方法，该细胞或组织具有核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核酸重复元件，该核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核酸重复元件产生由需要该方法的受试者或非人类受试者(对该方法有需要)中的细胞内的感兴趣基因组座位缺陷导致的有害病症或疾病病症，该方法包括通过该编辑基因组座位来对该受试者或非人类受试者进行修饰，并且其中该病症对通过编辑该基因组座位进行的治疗或抑制可以是敏感的，该方法包括提供包含以下的治疗：递送本发明的非天然存在的或工程化的组合物。
本发明一方面提供了本发明的组合物在制造药剂中的用途，该药剂用于离体基因或基因组编辑、或用于在一种通过操纵感兴趣基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用、或者在一种治疗或抑制由感兴趣基因组座位中的靶序列的缺陷引起的病症的方法中使用。
在本发明的方法或用途中，项III可以顺序地或在引入项I和项II之后的时间点引入细胞中。
在本发明的用途、组合物或方法中，RNA可以是嵌合RNA(chiRNA)。
本发明提供了前述权利要求中任一项所述的或者如在此披露的SINCRISPR-Cas组合物的用途，用于基因组工程化或用于病症的治疗或用于制备药剂或药物组合物。
本发明还提供了可以是第一CRISPR-Cas系统或第一CRISPR-Cas复合物指导序列的非天然存在的或工程化的RNA，该指导序列能够杂交到第二CRISPR-Cas系统的RNA序列上或用于第二CRISPR-Cas复合物的组分的表达的核酸分子上，以减弱或消除该第二系统或复合物的功能表达，借此该第一和/或第二系统或复合物可以自行失活。
本发明在一方面提供了前述权利要求中任一项所述的或者如在此披露的SINCRISPR-Cas组合物的或者第一和第二CRISPR-Cas复合物的用途，用于基因组工程化或用于病症的治疗或用于制备药剂或药物组合物。该基因组工程化可以包括：修饰靶多核苷酸或其表达，敲除基因、增强或增加或减少多核苷酸或基因的表达、或修复突变、或通过插入多核苷酸进行编辑。
在一方面，本发明提供了一种用于在具有缺陷型核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核苷酸重复元件或核苷酸扩增的细胞中使用的非天然存在的或工程化的组合物，包含：
A.
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种第一指导序列，该至少一种第一指导序列能够杂交到该细胞内的靶DNA上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的多核苷酸序列，
其中项A.I和项A.II包含CRISPR-Cas系统，并且其中所述组合物当转录时包含
CRISPR复合物，该CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
其中该指导序列引导CRISPR复合物与该靶DNA的序列特异性结合，并且介导对该缺陷的影响或修复；
或，
B.
I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种指导序列，该至少一种指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.CRISPR酶，
其中项B.I和项B.II包含该CRISPR复合物。
该细胞可以是真核细胞或原核细胞。该CRISPR-Cas系统可以进行了密码子优化。A.II可以包括编码一个或多个核定位信号(NLS)；或项B.II可以包含一个或多个NLS。项A.I可以由第一病毒载体编码，和/或项A.II可以由第二病毒载体编码。该第一和第二病毒载体可以是慢病毒载体或重组AAV。该重组AAV基因组可以包含反向末端重复(iTR)。CRISPR酶的表达可以由AAV基因组中的反向末端重复(iTR)驱动。该第一调节元件可以是III型RNA聚合酶启动子，并且该第二调节元件可以是III型RNA聚合酶启动子。该第一调节元件可以是U6启动子或H1启动子。该第二调节元件可以是遍存表达启动子或细胞类型特异性启动子。可以存在包含FLAG-标签的选择标记。该CRISPR酶可以包含C-末端NLS和N-末端NLS。该组合物可以经由注射递送。该组合物或其一部分可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、或微囊泡递送。该指导序列可以引导CRISPR复合物与该靶DNA序列的序列特异性结合并且改变该细胞中基因组座位的表达。该CRISPR复合物可以介导结合至或者双链或单链DNA断裂，并且可以任选地存在DNA的插入，借此在该细胞中可以存在基因组座位的编辑。CRISPR-Cas系统可以是多元CRISPR酶系统，其进一步包括多种嵌合体和/或多种多指导序列和单一tracr序列。CRISPR-Cas系统可以是多元CRISPR酶系统以使得脱靶活性最小化。该CRISPR酶可以是切口酶。该CRISPR酶可以包括一个或多个突变。该CRISPR酶包括选自D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A的一个或多个突变。该一个或多个突变可以是在CRISPR酶的RuvC1结构域中。该CRISPR酶进一步包含功能结构域。该CRISPR复合物的组合物可以介导基因组工程化，该基因组工程化包括：修饰靶多核苷酸或其表达，敲除基因、增强或增加或减少多核苷酸或基因的表达、或修复突变、或通过插入多核苷酸进行编辑。该CRISPR酶可以是Cas9。该CRISPR复合物可以介导至少一个双链DNA断裂，由此引起对靶DNA的编辑。该细胞可以是哺乳动物脑或中枢神经组织细胞。该核苷酸重复元件可以选自以下项中的一种或多种：包含CTG、CAG、CGG、CCG、GAA、或TTC的三核苷酸重复；包含CCTG的四核苷酸重复，包含ATTCT或AGAAT的五核苷酸重复；包含GGGGCC的六核苷酸重复；以及包含CCCCGCCCCGCG或CGCGGGGCGGGG的十二核苷酸重复。该缺陷产生了选自以下项中的一种或多种的病症：脆性X(FXS)；脆性X震颤共济失调(FXTAS)；翁韦里希特-伦德伯格氏病(Unverricht-Lundborg disease，EPM1)；脊髓小脑性共济失调12型(SCA12)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；额颞叶痴呆(FTD)；弗里德赖希共济失调；强直性肌营养不良1型(DM1)；强直性肌营养不良2型(DM2)；脊髓小脑性共济失调8型(SCA8)；脊髓小脑性共济失调10型(SCA10)；脊髓小脑性共济失调31型(SCA31)；眼咽肌营养不良(OPMD)；脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)；脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)；脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)；脊髓小脑性共济失调6型(SCA6)；脊髓小脑性共济失调7型(SCA7)；脊髓小脑性共济失调17型(SCA17)；齿状红核-苍白球吕伊斯体萎缩症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy，DRPLA)；脊延髓肌萎缩症(SBMA)；亨廷顿氏病样2型(HDL2)以及亨廷顿氏病(HD)。
本发明在一方面包含一种治疗或抑制具有缺陷型核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核苷酸重复元件或核苷酸扩增的细胞中的病症的方法，该方法包括递送本发明的非天然存在的或工程化的组合物。本发明还包含本发明的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。本发明另外包含本发明的组合物用以治疗疾病或障碍的用途，其中该疾病或障碍包括脑疾病或障碍或者中枢神经系统疾病或障碍。本发明进一步包含本发明的组合物在制造药剂中的用途，该药剂用于离体基因或基因组编辑、或用于在通过操纵感兴趣基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用、或者在治疗或抑制病症的方法中使用。该病症包括脑疾病或障碍或中枢神经系统疾病或障碍。在本发明的任何所述的任何方法、用途或组合物中，该CRISPR-Cas系统RNA可以是嵌合RNA(chiRNA)。另外，在本发明的任何方法、用途或组合物中，可以存在至少一种第二指导序列，该至少一种第二指导序列能够杂交到CRISPR-Cas系统的RNA序列上或用于CRISPR-Cas复合物的组分的表达的核酸分子上，以减弱或消除该系统或复合物的功能表达，借此该系统或复合物可以自行失活；并且该第二指导序列能够杂交到用于表达该CRISPR酶的核酸分子上。
本发明涉及CRISPR-Cas9系统作为用于在人类基因组中对引起疾病的核苷酸重复扩增进行编辑的工具的开发和应用。申请人提供了支持以下的证据：申请人已经设计并测试的序列、质粒和/或病毒载体促进在若干疾病相关基因组座位处的核苷酸重复序列的基因组编辑，这些疾病相关基因组座位包括与CAG三联体重复障碍(即多聚谷氨酰胺疾病)、脆性X和脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)乃至如在此提供的其他核苷酸重复障碍或核苷酸扩增障碍相关的基因组座位。并且，申请人描述了使用腺相关病毒(AAV)作为载体到哺乳动物脑(以及中枢神经系统的其他组织或器官)的CRISPR-Cas9的设计和应用。最终，本发明还披露了用于使Cas9核酸酶自行失活的方法，作为对其在靶向的细胞中表达的持续时间进行限制的手段。
该CRISPR-Cas系统不要求产生针对靶特异性序列的定制蛋白，相反，通过识别特异性DNA靶的短RNA分子可以对单个Cas酶进行程序设计。将该CRISPR-Cas系统添加到基因组测序技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化、优化和细胞类型/组织/器官特异性递送等方面是至关重要的，这些方面是所要求的本发明方面。
对于用于一系列广泛的应用的核酸序列靶向的替代性的稳健的系统和技术存在着迫切需要。本发明的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。示例性CRISPR复合物包括与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。
在一方面，本发明提供了使用CRISPR-Cas系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)各种组织和器官中的多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因治疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。
本发明的方面涉及在具备具有优化活性的指导RNA的CRISPR-Cas9系统中的、具有改进的靶向特异性的、在长度上小于野生型Cas9酶的Cas9酶和编码它的核酸分子、和嵌合的Cas9酶、以及改进Cas9酶的靶特异性或设计CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导RNA和/或选择或制备具有比野生型Cas9更小的尺寸或长度的Cas9酶，由此将编码它的核酸包装到更高级的递送载体(因为在该递送载体中对它的编码少于野生型Cas9)中，和/或产生嵌合Cas9酶。
还提供了本发明的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们在基因或基因组编辑中的用途。
在本发明的另外方面，Cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合的通用DNA结合蛋白。这些突变可以是人工引入的突变或获得性和丢失性功能突变。这些突变可以包括但不限于分别在RuvC和HNH催化结构域中的催化结构域(D10和H840)之一中的突变。已经表征了另外的突变，并且可以将其用于本发明的一种或多种组合物中。在本发明的一个方面，突变的Cas9酶可以融合至蛋白质结构域，例如像转录激活结构域。在一个方面，该转录激活结构域可以是VP64。在本发明的其他方面，该转录阻遏物结构域可以是KRAB或SID4X。本发明的其他方面涉及融合到结构域上的突变的Cas9酶，这些结构域包括但不限于，转录激活剂、阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histoneremodeler)、脱甲基酶、DNA甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。
在一个另外的实施例中，本发明提供了产生突变体tracrRNA和允许增强这些RNA在细胞中的性能的同向重复序列或突变体嵌合指导序列的方法。本发明的方面还提供了所述序列的选择。
本发明的方面还提供了简化CRISPR复合物的组分的克隆和递送的方法。在本发明的优选实施例中，适合的启动子，例如Pol III启动子如U6启动子，与DNA寡核苷酸一起扩增并且添加到指导RNA上。启动子可以因此定位于编码指导RNA的序列上游，例如使其邻接且在编码指导RNA的序列上游。然后所得PCR产物可以转染到细胞中以驱动指导RNA的表达。本发明的方面还涉及体外转录的或从合成公司订购并且直接转染的指导RNA。
在一个方面，本发明提供了通过使用更具活性的聚合酶来提高活性的方法。在一个方面，可以在编码指导RNA的序列上游插入T7启动子，例如使其邻接且在编码指导RNA的序列上游。在一个优选的实施例中，这些指导RNA在T7启动子控制下的表达是由该细胞中的T7聚合酶的表达驱动的。在一个有利的实施例中，该细胞是真核细胞。在一个优选的实施例中，该真核细胞是人类细胞。在一个更优选的实施例中，该人类细胞是一种患者具体细胞，例如，从患者中去除的、可能被修饰和/或扩展成细胞群体或修饰的细胞群体的细胞，例如，用于向患者再给予。
在一个方面，本发明提供了用于降低Cas酶的毒性的方法。在某些方面，该Cas酶是如本文描述的任何Cas9，例如任何天然存在的细菌Cas9以及任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在一个方面，该Cas酶是切口酶。在一个实施例中，该Cas9以核酸分子例如DNA、RNA、mRNA的形式递送到细胞中。这允许该酶的瞬时表达，由此降低毒性。在另一个实施例中，Cas9是在编码且表达Cas9酶的核苷酸构建体中递送至细胞中。在另一个实施例中，本发明还提供了在诱导型启动子的控制下表达Cas9的方法、以及在其中使用的构建体。
在另一方面，本发明提供了用于改进CRISPR-Cas系统的体内应用的方法。在该优选实施例中，该Cas酶是本文描述的野生型Cas9或任何修改版本，包括任何天然存在的细菌Cas9以及任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在一个方面，该Cas酶是切口酶。本发明的一个有利方面提供了易于被包装到病毒载体以便递送的Cas9同源物的选择。Cas9直向同源物典型地共享3-4个RuvC结构域和一个HNH结构域的通用结构。最5'的RuvC结构域切割非互补链，而HNH结构域切割互补链。所有符号都是就指导序列而言的。
在5'RuvC结构域中的催化残基是通过该感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物(来自化脓链球菌II型CRISPR位点、嗜热链球菌CRISPR位点1、嗜热链球菌CRISPR位点3、以及凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR位点)的同源性比较而鉴定的，并且保守性Asp残基(D10)被突变为丙氨酸以将Cas9转化成互补链切口酶。类似地，在HNH结构域中的保守性His和Asn残基被突变为丙氨酸以将Cas9转化为非互补链切口酶。在一些实施例中，这两组突变都可以进行，将Cas9转化为非切割酶。
在一些实施例中，该CRISPR酶是I型或III型CRISPR酶，优选II型CRISPR酶。这种II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。优选的Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9或saCas9。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。
应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶(可替代地称为SpCas9或spCas9)。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如来自或衍生自化脓链球菌的SpCas9、来自或衍生自金黄色葡萄球菌的SaCas9、来自或衍生自嗜热链球菌的St1Cas9等等。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等等。在本文中提供了另外的实例。熟练的技术人员将能够通过比较相关氨基酸序列而确定在除了SpCas9之外的Cas9酶中的适当的相应残基。因此，在特异性氨基酸置换是指使用SpCas9编号的情况下，那么，除非上下文清楚说明，这并不预期是指其他Cas9酶，本披露预期涵盖在其他Cas9酶中的相应修饰。
本文中提供了在这种情形下针对人类进行优化(即，针对在人类中表达进行优化)的密码子优化序列的实例，参见SaCas9人类密码子优化序列。虽然这是优选的，但是应当理解的是，其他实例也是可能的，并且针对除人类之外的宿主物种的密码子优化或针对具体器官(如脑)的密码子优化可以根据本披露和本领域中的知识来实践。
在另外的实施例中，本发明提供了通过产生嵌合Cas9蛋白而增强Cas9的功能的方法。嵌合Cas9蛋白嵌合Cas9可以是含有来自一种以上的天然存在的Cas9的片段的新Cas9。这些方法可包括使一种Cas9同源物的N末端片段与另一种Cas9同源物的C末端片段融合。这些方法还允许选择这些嵌合Cas9蛋白所展示的新特性。
应当理解的是，在本发明的方法中，该修饰可以离体地或在体外例如在细胞培养物中进行，并且在一些情况下不在体内进行。在其他实施例中，可以在体内进行。
在一个方面，本发明提供了一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，该方法包括：
递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
A)-I.CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)tracr配对序列，和
(c)tracr序列，以及
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.对包含一个或多个核定位序列的CRISPR酶进行编码的多核苷酸序列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，
或者
(B)I.包含以下项的多核苷酸：
(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和
(b)至少一种或多种tracr配对序列，
II.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，以及
III.包含tracr序列的多核苷酸序列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA。
在一个方面，本发明提供了用于递送至细胞或一种或多种包含细胞的组织的非天然存在的或工程化的组合物，所述细胞具有产生不利状态或疾病状态的核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核苷酸重复元件，该组合物包含：
(A)I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种指导序列，该至少一种指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的多核苷酸序列上，该CRISPR酶包含一个或多个核定位序列，
其中该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
或者
(B)I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至包含以下项的多核苷酸：
(a)至少一种指导序列，该至少一种指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，以及
(b)至少一种或多种tracr配对序列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的多核苷酸序列，以及
III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至包含tracr序列的多核苷酸序列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交稻该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA；
其中该CRISPR复合物介导至少一个双链DNA断裂，由此编辑细胞中的靶向的基因组座位。
在用于真核细胞的实施例中，该载体系统包含病毒载体系统，例如AAV载体或AAV载体系统或慢病毒衍生的载体系统或烟草花叶病毒衍生的系统或土壤杆菌Ti或Ri质粒
编码CRISPR酶的多核苷酸序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的任一者或全部可以是RNA、DNA或RNA和DNA的组合。在一个方面，包括编码CRISPR酶的序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的多核苷酸是RNA。在一个方面，包括编码CRISPR酶的序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的多核苷酸是DNA。在一个方面，这些多核苷酸是DNA和RNA的混合物，其中这些多核苷酸(包括对CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列或tracr序列中的一者或多者进行编码的序列)中的一些是DNA，并且这些多核苷酸中的一些是RNA。在一个方面，包括编码CRISPR酶的序列的多核苷酸是DNA，并且指导序列、tracr配对序列或tracr序列是RNA。包括编码CRISPR酶的序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的一种或多种多核苷酸可以是经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。
应当理解的是，在提及多核苷酸的情况下，在该多核苷酸是RNA并且被认为‘包含’例如tracr配对序列的特征的情况下，该RNA序列包括该特征。在该多核苷酸是DNA并且被认为包含如tracr配对序列的特征的情况下，该DNA序列被或者可以被转录成包括该讨论中的特征的RNA。在该特征是蛋白质的情况下，如CRISPR酶，所提及的该DNA或RNA序列被或者可以被翻译(以及在DNA首先被转录的情况下)。另外，在编码CRISPR酶的RNA提供至细胞的情况下，应理解该RNA能够由递送至其中的该细胞翻译。
因此，在某些实施例中，本发明提供了一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物(例如包括人类的哺乳动物或非人类哺乳动物或生物)的方法，该方法包括递送一种包含病毒或质粒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含可操作地编码用于其表达的组合物的一种或多种病毒或质粒载体，其中该组合物包括：(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一个CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一个能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列(或者任选地至少一个或多个核定位序列，因为在一些实施例中可能不涉及NLS)，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统含有一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到(a)能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列、和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，以及III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到tracr序列上，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶。在一些实施例中，组分I、II和III位于相同载体上。在其他实施例中，组分I和II位于相同载体上，而组分III位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I和III位于相同载体上，而组分II位于另一种载体上。在其他实施例中，组分II和III位于相同载体上，而组分I位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I、II和III各自位于不同的载体上。本发明还提供了如本文所述的病毒或质粒载体系统。
优选地，该载体可以是病毒载体，如慢病毒或杆状病毒或优选地腺病毒/腺病毒相关病毒载体，但是其他递送手段也是已知的(如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附接到金纳米粒子上的手段)并且被提供。在一些实施例中，可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪递送一种或多种病毒载体或质粒载体。
通过操纵靶序列，申请人意图改变靶序列，该操纵可以包括靶序列的表观遗传操纵。该表观遗传操纵可以是靶序列的染色质状态的操纵，如借助于修饰靶序列的甲基化状态(即，甲基化或甲基化模式或CpG岛的添加或去除)、组蛋白修饰，从而增加或降低靶序列的可及性，或者借助于促进3D折叠。然而关于核苷酸重复，序列重复的切除是具有首要意义的操纵。
应当理解的是，在提及一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物或哺乳动物(包括人类或非人类哺乳动物或生物)的方法的情况下，这可适用于作为整体的生物(或哺乳动物)或者仅仅是来自这种生物的单个细胞或细胞群。在人类的情况下，例如，申请人特别地设想到单个细胞或细胞群，并且这些细胞可以优选地进行离体修饰，进而重新引入。在这种情况下，活组织检查或其他组织或生物流体样品可以必要的。在这方面，干细胞也是特别优选的。但是，当然还设想了体内实施例。
在某些实施例中，本发明提供了一种治疗或抑制对其有需要的受试者(例如哺乳动物或人类)或非人类受试者(例如，哺乳动物)中感兴趣的基因组座位中的靶序列缺陷所引起的病症的方法，该方法包括通过操纵该靶序列而修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症对于借助于包括提供治疗的靶序列操纵的治疗或抑制是敏感的，该治疗包括：递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统含有一种或多种AAV或慢病毒载体，所述载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一个CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一个能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列(或者任选地至少一个或多个核定位序列，因为在一些实施例中可能不涉及NLS，即，可能有零个NLS，但是有利的是，有大于零个NLS，如一个或多个或有利地两个或更多个NLS，并且因此，本发明包括如下实施例，其中有0、1、2、3、或更多个NLS)，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统含有一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到(a)能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列、和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，以及III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到tracr序列上，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶。在一些实施例中，组分I、II和III位于相同载体上。在其他实施例中，组分I和II位于相同载体上，而组分III位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I和III位于相同载体上，而组分II位于另一种载体上。在其他实施例中，组分II和III位于相同载体上，而组分I位于另一种载体上。在其他实施例中，组分I、II和III各自位于不同的载体上。本发明还提供如在此所述的病毒(例如AAV或慢病毒)载体系统，但其他载体系统在本领域中是已知的并且可以是如在此所述的载体系统的一部分。
本发明的一些方法可以包括诱导表达。在本发明的一些方法中，该生物或受试者是真核生物，包括例如植物或动物(包括包含人类在内的哺乳动物)或非人类真核生物或非人类动物或非人类哺乳动物。在一些实施例中，该生物或受试者是非人类动物，并且可以是节肢动物例如昆虫，或者可以是线虫。在本发明的一些方法中，该生物或受试者是哺乳动物或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物可以是例如啮齿动物(优选小鼠或大鼠)、有蹄动物、或灵长动物。在本发明的一些方法中，该病毒载体是AAV或慢病毒，并且可以是如本文所述的载体系统的一部分。因此，递送可以通过载体，如病毒载体，例如，重组病毒载体递送系统；并且这种系统可以是AAV或慢病毒或衍生自AAV或慢病毒(例如，重组AAV或慢病毒，该重组AAV或慢病毒表达与该病毒是外源、异源的核苷酸，或表达与该病毒是非同源或天然的核苷酸，这可以使人认为“衍生来源病毒”是亲本病毒)。.在本发明的一些方法中，该病毒载体是慢病毒衍生的载体。在本发明的一些方法中，该病毒载体是用于植物中的农杆菌Ti或Ri质粒。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶是Cas9。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶在催化结构域的一个中包含一个或多个突变。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶是Cas9切口酶。在本发明的一些方法中，该指导序列的表达是在T7启动子控制下并且是由T7聚合酶的表达驱动的。在本发明的一些方法中，该指导序列的表达是在U6启动子控制下。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶在催化结构域的一个中包含一个或多个突变。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶是Cas9切口酶。
在一些实施例中本发明包含一种递送CRISPR酶的方法，该方法包括向细胞递送编码该CRISPR酶的核酸分子，例如质粒或RNA或mRNA。在本发明的这些方法的一些中，该CRISPR酶是Cas9。
本发明还提供了制备本发明的载体系统尤其是如本文所述的病毒载体系统的方法。在一些实施例中，本发明包括一种制备本发明的载体例如AAV或慢病毒的方法，该方法包括将含有编码AAV的一种或多种核酸分子或基本上由其组成的一种或多种质粒转染到可感染AAV的细胞中，并且提供对于AAV的复制和包装必须的AAV rep和/或cap。在一些实施例中，对于AAV的复制和包装必须的AAV rep和/或cap是通过用一种或多种辅助质粒或一种或多种辅助病毒转染这些细胞而提供的。在一些实施例中，该辅助病毒是痘病毒、腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒。在一些实施例中，该痘病毒是牛痘病毒。在一些实施例中，这些细胞是哺乳动物细胞。并且在一些实施例中，这些细胞是昆虫细胞，并且该辅助病毒是杆状病毒。在其他实施例中，该病毒是慢病毒。
本发明进一步包括本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)，其用于在医学或治疗中使用。在一些实施例中，本发明包括根据本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)，其用于在根据本发明的方法中使用。在一些实施例中，本发明提供了本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)在离体基因或基因组编辑中的用途。在某些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)在用于离体基因或基因组编辑中或在根据本发明的方法中使用的药剂的制造中的用途。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶在催化结构域的一个中包含一个或多个突变。在本发明的一些方法中，该CRISPR酶是Cas9切口酶。
在一些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其CRISPR酶(包括或可替代地是编码CRISPR酶的mRNA)，其中该靶序列在其3’端的侧翼为5’-基序(称为原型间隔子邻近基序或PAM)，尤其是在该Cas9是(或衍生自)化脓链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9的情况下。例如，适合的PAM是分别针对SpCas9或SaCas9酶(或衍生的酶)的5'-NRG或5'-NNGRR(其中N是任何核苷酸)，如下文提及的。
应当理解的是，SpCas9或SaCas9是来自或衍生自化脓链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9的那些。
本发明的方面包括提高CRISPR酶例如Cas9介导的基因靶向的特异性，以及降低经由CRISPR酶例如Cas9的脱靶修饰的可能性。在一些实施例中，本发明包括通过借助于操纵在细胞中的感兴趣基因组座位中的DNA双链体的相对链上的第一和第二靶序列而将脱靶修饰降低到最低限度来修饰生物或非人类生物的方法，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
I.一种第一CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该第一多核苷酸序列包含：
(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，
(b)第一tracr配对序列，和
(c)第一tracr序列，
II.第二CRISPR-Cas系统chiRNA多核苷酸序列，其中该第二多核苷酸序列包含：
(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，
(b)第二tracr配对序列，和
(c)第二tracr序列，以及
III.对包含至少一个或多个核定位序列并且包含一个或多个突变的CRISPR酶进行编码的多核苷酸序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该第一和第二tracr配对序列分别杂交到该第一和第二tracr序列上，并且该第一和第二指导序列分别指导第一和第二CRISPR复合物与该第一和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交或可杂交到该第一tracr序列上的第一tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交或可杂交到该第二tracr序列上的第二tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的DNA双链体的另一条链或相对链的切割，从而诱导偏移或双链断裂，由此通过将脱靶修饰降低到最低限度而修饰该生物或非人类生物。在一个方面，DNA中的第一切口和第二切口相对于彼此偏移该双链体的至少一个碱基对。在一个方面，该第一切口和该第二切口相对于彼此偏移而使得所得DNA断裂具有3’突出端。在一个方面，该第一切口和该第二切口相对于彼此偏移而使得所得DNA断裂具有5’突出端。在一个方面，该第一切口和该第二切口相对于彼此定位为使得该突出端是至少1核苷酸(nt)、至少10nt、至少15nt、至少26nt、至少30nt、至少50nt或多于至少50nt。包括所得偏移双切DNA链的本发明的另外方面可以由本领域技术人员理解，并且双切系统的示例性用途提供在此。
在本发明的一些方法中，编码CRISPR酶的多核苷酸序列、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列中的任一者或全部是RNA。在本发明的另外的实施例中，包括编码CRISPR酶的序列、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列的多核苷酸是RNA，并且是经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪递送的。在本发明的某些实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在一些实施例中，这些多核苷酸可以被包含在含有一种或多种载体的载体系统中。在本发明的优选实施例中，该CRISPR酶是一种Cas9酶，例如SpCas9。在本发明的一个方面，该CRISPR酶包含在催化结构域中的一个或多个突变，其中该一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A。在一个高度优选的实施例中，该CRISPR酶具有D10A突变。在优选的实施例中，该第一CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。
在本发明的优选方法中，第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割并且第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。
在一些实施例中，本发明包括通过借助于操纵在细胞中的感兴趣基因组座位中的DNA双链体的相对链上的第一和第二靶序列而将脱靶修饰降低到最低限度来修饰生物或非人类生物的方法，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统,该载体系统包含一种或多种载体,该一种或多种载体包含：
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，和
(b)至少一种或多种tracr配对序列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至
(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，和
(b)至少一种或多种tracr配对序列，
III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶编码序列，以及
IV.第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接至tracr序列，
其中组分I、II、III和IV位于该系统的相同或不同载体上，在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该第一和第二指导序列分别指导第一和第二CRISPR复合物与该第一和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该第二CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，并且其中该第一指导序列指导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链的断裂，由此通过将脱靶修饰降低到最低限度而修饰该生物或非人类生物。
本发明还提供了如本文所述的载体系统。该系统可以包含一种、二种、三种或四种不同的载体。组分I、II、III和IV因此可以被定位在一种、两种、三种或四种不同的载体上，并且在此设想了针对这些组分的可能位置的所有组合，例如：组分I、II、III和IV可以位于相同载体上；组分I、II、III和IV可以各自位于不同的载体上；组分I、II、III和IV可以位于总计两种或三种不同载体上，其中设想了位置的所有组合，等。
在本发明的一些方法中，编码CRISPR酶的多核苷酸序列、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列中的任一者或全部是RNA。在本发明另外的实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在本发明的优选实施例中，该CRISPR酶是一种Cas9酶，例如SpCas9。在本发明的一个方面，该CRISPR酶包含在催化结构域中的一个或多个突变，其中该一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A。在一个高度优选的实施例中，该CRISPR酶具有D10A突变。在优选的实施例中，该第一CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二CRISPR酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。在本发明的一个另外的实施例中，这些病毒载体的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。
在本发明的优选方法中，该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的DNA双链体的一条链的切割并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链或相对链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。
在一些实施例中，本发明包括一种通过借助于向含有和表达编码感兴趣的基因产物的双链DNA分子的细胞中引入一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统将脱靶修饰降低至最低限度而修饰感兴趣的基因组的方法，该CRISPR-Cas系统包含具有一个或多个突变的Cas蛋白和两个分别靶向该DNA分子的第一链和第二链的指导RNA，由此这些指导RNA靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白使编码该基因产物的DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和这两个指导RNA并不天然地一起存在。
在本发明的优选方法中，该Cas蛋白使编码该基因产物的DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口导致一个5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。
本发明的实施例还包括包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列的指导RNA。在本发明的一个方面，该Cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中表达。如下面更详细的解释，密码子使用甚至可以针对在具体细胞类型(例如，针对脑细胞)中的表达进行优化。在本发明另外的实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白，例如一种Cas9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白，例如SpCas9。在本发明的方面中，该Cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白具有D10A突变。
本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。
本发明还包括一种工程化的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统包含具有一个或多个突变的Cas蛋白和两个分别靶向在细胞中编码基因产物的双链DNA分子的第一链和第二链的指导RNA，由此这些指导RNA靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白使编码该基因产物的DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和这两个指导RNA并不天然地一起存在。
在本发明的方面中，这些指导RNA可包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列。在本发明的一个实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白。在本发明的一个方面，该Cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中表达。在本发明另外的实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR-Cas蛋白，例如一种Cas9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白，例如SpCas9。在本发明的方面中，该Cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A。在一个高度优选的实施例中，该Cas蛋白具有D10A突变。
本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切除的间插序列(例如三核苷酸重复或其他核苷酸扩增元件)的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。
本发明还包括包含一种或多种载体的工程化的、非天然存在的载体系统，所述载体包含：
a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到两个CRISPR-Cas系统指导RNA的每一者上，这两个指导RNA分别靶向编码基因产物的双链DNA分子的第一链和第二链，
b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至Cas蛋白，
其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，由此这些指导RNA靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Cas蛋白使编码该基因产物的DNA分子的第一链和第二链的每一者产生切口，由此改变该基因产物的表达；并且，其中该Cas蛋白和这两个指导RNA并不天然地一起存在。
在本发明的优选实施例中，该系统的这些载体是病毒载体。一个另外的实施例中，该系统的这些载体经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。
在一个方面，本发明提供了修饰在一种真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。在一些实施例中，所述载体被递送到受试者内的真核细胞中。在一些实施例中，所述修饰发生在细胞培养物中的所述真核细胞中。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述修饰之前从受试者中分离所述真核细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括使所述真核细胞和/或从中衍生的细胞返回到所述受试者中。
在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。复合物和靶标的性质可以决定结合是否导致增加或降低的表达。例如，靶标可以是基因产物，其表达导致另一基因产物的下调或降低的表达。降低第一基因产物的表达可以导致第二基因产物的增加(并且当然第一产物的表达降低)。该复合物可以结合至靶标，并且导致改变的蛋白表达，例如修饰形式得以表达。在该情况下，修饰形式的蛋白的表达增加。这些是表达可以增加或降低的一些方式。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。
在一个方面，本发明提供了产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞的方法。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)向真核细胞中引入一种或多种载体，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列；和(b)允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述疾病基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，由此产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。
在一个方面，本发明提供了用于修饰在一种真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。
在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷酸的表达。
在希望的情况下，为了实施在细胞中的表达的修饰，将包含tracr序列、连接到该tracr配对序列上的指导序列、编码CRISPR酶的序列的一种或多种载体递送到细胞。在一些方法中，该一种或多种载体包括：可操作地连接到编码所述CRISPR酶的酶编码序列上的调节元件，该CRISPR酶包含核定位序列；以及可操作地连接至tracr配对序列的调节元件和用于在该tracr配对序列的上游插入指导序列的一个或多个插入位点。当表达时，该指导序列指导CRISPR复合物与细胞中的一个靶序列的序列特异性结合。典型地，该CRISPR复合物包含与(1)杂交或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交或可杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶。
在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。例如，可以使蛋白质或微小RNA编码序列失活，这样使得该蛋白质或微小RNA不被产生。
在某些实施例中，该CRISPR酶包含一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A和/或该一个或多个突变在该CRISPR酶的RuvC1或HNH结构域中或者为如本文另外论述的突变。在一些实施例中，该CRISPR酶具有一个或多个在催化结构域中的突变，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该酶进一步包含一个功能结构域。因此，在一些实施例中，突变的Cas9酶可以融合至蛋白质结构域或功能域。在一个方面，该功能结构域是转录激活结构域，优选VP64。在一些实施例中，该功能结构域一个转录阻遏结构域，优选KRAB。在一些实施例中，该转录阻遏结构域是SID、或SID的多联体(例如SID4X)。在一些实施例中，该功能结构域是一个表观遗传修饰结构域，从而提供了一种表观遗传修饰酶。在一些实施例中，该功能结构域是一种激活结构域，其可以是P65激活结构域。
在一些实施例中，该CRISPR酶是I型或III型CRISPR酶，但是优选II型CRISPR酶。这种II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。一种Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9或saCas9。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。
应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等等。
本文中提供了在这种情形下针对人类进行优化(即，针对在人类中表达进行优化)的密码子优化序列的实例，参见SaCas9人类密码子优化序列。虽然这是优选的，但是应当理解的是，其他实例也是可能的，并且针对除人类之外的宿主物种的密码子优化或针对具体器官(如脑)的密码子优化可以在本发明的实践中结合本领域的知识根据在此的传授来使用。
优选地，递送是以载体形式进行的，该载体可以是病毒载体，如慢病毒或杆状病毒或优选地腺病毒/腺病毒相关病毒载体，但是其他递送手段也是已知的(如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附接到金纳米粒子上的手段)并且被提供。一种载体可能不仅是指病毒或酵母系统(例如，在感兴趣的核酸可被可操作地连接到一个启动子上并且在其控制下(就表达而言，从而最终提供加工的RNA)的情况下)，而且指导核酸递送到宿主细胞中。虽然在本文的方法中该载体可以是病毒载体并且AAV在这里是有利的，但是可以采用如本文论述的其他病毒载体，如慢病毒。例如，杆状病毒可以用于昆虫细胞中的表达。这些昆虫细胞进而可用于产生大量的其他载体，如适合于本发明递送的AAV或慢病毒载体。还设想了一种递送本发明CRISPR酶的方法，该方法包括向细胞递送编码该CRISPR酶的mRNA。应当理解的是，在某些实施例中，该CRISPR酶被截短，和/或由少于一千个氨基酸或少于四千个氨基酸组成，和/或是一种核酸酶或切口酶，和/或是经密码子优化的，和/或包含一个或多个突变，和/或包含嵌合CRISPR酶，和/或如本文论述的其他选项。AAV和慢病毒载体是优选的。
在某些实施例中，该靶序列在其3’端的侧翼或下游为适合于CRISPR酶(典型地Cas，并且尤其是Cas9)的PAM。
例如，适合的PAM是分别针对SpCas9或SaCas9酶(或衍生的酶)的5′-NRG或5'-NNGRR。对于化脓链球菌Cas9或衍生酶，适合的PAM是5'-NRG。
CRISPR系统的组分的表达优选不是在受试者中全身地进行，而是仅在希望的细胞、组织或感兴趣器官中进行。以此方式，本发明使用了控制表达的三种基本方式，它们可以单独或组合使用。第一，表达可以处于调节元件的控制之下，这些调节元件对于希望的细胞、组织或器官是特异性的。第二，可以使用对于希望的细胞、组织或器官是特异性的递送运载体，例如基于适当特异性细胞表面分子。第三，可以使用局部递送，例如通过递送到希望的细胞、组织或器官中，例如通过注射。
在一方面，本发明提供了非天然存在的或工程化的组合物自失活CRISPR-Cas系统，该系统包含
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
(a)能够杂交到真核细胞基因组中的至少一种第一靶序列上的至少一种第一指导序列，以及
(b)至少一种或多种tracr配对序列，以及
(c)至少一种或多种tracr序列，以及
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含一个、两个或更多个核定位信号(NLS)以及任选地选择标记，
其中该系统进一步包含
(a)至少一种第二指导序列，该至少一种第二指导序列能够杂交到选自以下项中的一个或多个的第二靶序列上：
编码CRISPR II型酶的序列，以及
在非编码CRISPR-Cas构建体内的序列，选自
i)驱动非编码RNA元件的表达的启动子内，
ii)驱动Cas9基因的表达的启动子内，
iii)在Cas9编码序列中的ATG翻译起始密码子的100bp内，以及
iv)在AAV基因组的反向末端重复内；以及
(b)针对该至少一种第二指导序列的至少一种或多种tracr配对序列；
其中当转录时该tracr配对序列杂交到该tracr序列上并且
该第一指导序列杂交到或可杂交到该第一靶序列上，并且引导CRISPR复合物与该第一靶序列的序列特异性结合，
其中该第一CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该第一靶序列上的该第一指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且
其中该第一CRISPR复合物介导结合至或者双链或单链DNA断裂，由此编辑细胞中的基因组座位；并且
该第二指导序列杂交到或可杂交到使CRISPR-Cas系统的一种或多种组分失活的第二靶序列上，借此所有CRISPR复合物变为自失活。
另外，任选地将该第二指导序列与包含第一指导序列的CRISPR-Cas系统同时地或顺序地在引入编码第一CRISPR-Cas复合物的元件之后的时间点引入系统中。
因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留该权利和特此公开放弃任何此类主题的权利。
应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprise)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。可以有利的是，在本发明的实践中符合条款53(c)EPC以及条例28(b)和(c)EPC。此处旨在没有任何承诺。
这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考对说明性实施例进行叙述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1示出当前已知的由核苷酸重复序列的异常扩增引起的疾病(高亮)。核苷酸重复在尺寸(三角形)上不同，并且可以驻留在疾病相关基因的编码区或非编码区中。基于经验和生物信息学分析，申请人已经确定每个座位可以使用在本申请中描述的CRISPR-Cas9途径来靶向。
图2A-B示出人类ATXN1CAG重复的靶向设计和编辑。a)CRISPR-Cas9系统的概述。b)使用CRISPR-Cas9系统去除在ATXN1中的CAG核苷酸重复侧翼的指导序列。显示的是在人类HT1080细胞中CRISPR-Cas9质粒的瞬时表达之后，对应于未编辑(顶部暗色条带)和编辑(下部条带，箭头)的ATXN1的PCR产物(灰色描绘的引物)。如期望的，仅在两种侧翼指导非编码RNA同时表达时观察到对该重复的成功编辑(比较泳道1-5对比泳道6-11)。
图3A-C示出CAG重复由CRISPR-Cas9系统切除。a)编辑的基因组DNA(图3b)被纯化、克隆并且测序，以确认对CAG核苷酸重复的编辑。对超过150个克隆进行测序。该分析示出虽然不同的序列是全部存在的(同种型A-I)，但1个(同种型F)缺乏内源性人类ATXN1CAG重复。b)大多数克隆属于同种型A。c)同种型A产生新基因组座位，其中框内缺失缺少CAG重复缺少。
图4A-B示出人类FMR1CGG重复的靶向设计和编辑；第二实例。a)在FMR1中的CGG核苷酸重复侧翼的指导序列。不像ATXN1中的CAG重复，在FMR1中的CGG重复处于5’非翻译区(5’UTR)。b)对FMR1的成功的编辑，如通过对应于未编辑(顶部暗色条带)和编辑(下部条带，箭头)的人类FMR1 5’UTR/外显子-1区的PCR产物(引物描绘为灰色)证实的。为此，将CRISPR-Cas9质粒瞬时转染到HT1080细胞中。
图5示出CGG重复由CRISPR-Cas9系统切除，如通过对FMR1 5’UTR/外显子-1区的直接测序证实的。a)对编辑的基因组DNA(示于图4b中)进行测序，以确认对FMR1CGG重复的适当编辑。序列比对分析示出当与野生型序列比较时，在超过100个测序克隆中CGG重复序列不存在。
图6A-C示出用于将CRISPR-Cas9系统递送到哺乳动物脑中的腺相关病毒载体的设计。a)针对体内CRISPR-Cas9介导的基因组编辑来改造AAV载体。将包含N-末端和C-末端核定位结构域以及N末端Flag的SpCas9克隆进AAV穿梭质粒中。因为SpCas9cDNA的尺寸大并且希望获得体内低水平的SpCas9核酸酶表达，申请人省略了启动子的使用。取而代之，SpCas9的表达是通过AAV反向末端重复(iTR)序列的基础转录活性驱动的。将指导RNA(gcRNA)和反式激活性RNA(tracrRNA)克隆进不同的AAV穿梭质粒中，并且分别置于两种不同的III型RNA聚合酶启动子即U6和H1启动子的调节之下。报告基因(作为实例示出的EGFP)或任何其他序列可以克隆在非编码表达盒的下游。b)在此系统中，非编码CRISPR组分是作为由U6启动子驱动的嵌合体阵列表达的。c)使用在6a中描述的AAV以靶向ATXN1质粒，该质粒携带30个CAG核苷酸重复(正常范围)或80个CAG重复(疾病范围)。仅在两种AAV质粒(iTR-SpCas9和AAVPS2/AAVPS5)的存在下观察到正常的或扩增的CAG重复的切除。此结果证实了AAV-iTR-SpCas9载体可以产生充足的SpCas9以介导有效的基因编辑。
图7A-B示出自失活AAV-CRISPR-Cas9系统。a)SIN-CC9概念的图解。申请人设计了共表达靶向于感兴趣基因组序列的sgRNA(以灰色/黑色示出)和靶向于邻近工程化的ATG起始位点的SpCas9序列的“自失活”sgRNA(以红色/黑色示出)的质粒。在U6启动子区中的调节序列还可以用sgRNA(以蓝色/黑色示出)来靶向。如显示的U6驱动的sgRNA是以阵列形式设计，使得多种sgRNA序列可以同时释放。当首次递送到靶组织/细胞(左细胞)中，sgRNA开始累积，同时在细胞核中的Cas9水平上升。Cas9将与全部sgRNA复合，以介导CRISPR-Cas9质粒的基因组编辑和自我失活。b)左图：在瞬时共表达SpCas9与靶向ATXN1CAG重复区的sgRNA或靶向ATXN1CAG重复区的sgRNA(SpCas9+gATXN1)和刚好在SpCas9起始密码子下游的序列(SpCas9+gATXN1/gCas9)之后的Western印迹分析。SpCas9的瞬时表达通常在转染后持续至少48小时。相比之下，在抗-SpCas9sgRNA的存在下，SpCas9的瞬时表达在转染后48小时前丢失。右图：使用了跨ATXN1CAG重复区的引物的PCR产物，示出在SpCas9表达损失之前CAG重复的成功切除。
图8A-B示出CRISPR-Cas9介导的等位基因特异性靶向的概念。
图9A-B示出在从ATXN1座位内切除CAG重复之后脊髓小脑共济失调蛋白(Ataxin)-1表达的损失。图9a示出在对转染了所指示质粒的HT1080细胞进行5天选择后，跨人类ATXN1座位的PCR。在用嘌呤霉素选择后，>90％的细胞群体包含缺乏CAG重复的经编辑的ATXN1座位，并且箭头示出较短的座位。在图9b中，ATXN1表达的定量PCR分析揭示ATXN1mRNA的稳态水平的显著降低。对两种不同的细胞系进行分析，并且观察到类似结果。y轴示出相对于对照(水平1.0)的转录物水平。
图10A-C示出靶向在DMPK座位中的扩增的CTG重复。指导序列被设计为处于DMPK的3’非翻译区(3’UTR)中的CTG核苷酸重复区的侧翼。在图10a中的PCR产物指示对HT1080细胞中的DMPK座位的成功编辑，对比了未编辑的(顶部箭头)和编辑的(底部箭头)。图10b示出来自DM1患者活组织检查的原代皮肤成纤维细胞。在引入靶向DMPK座位的CRISPR-Cas9质粒之后，图10c示出CTG扩增被有效切除。
图11A-C示出用于将CRISPR-Cas9系统递送到哺乳动物组织中的AAV载体。这些载体展示在图11a中，使用包含N-末端核定位结构域以及N-末端HA-标签的SaCas9核酸酶，克隆进AAV穿梭质粒中，并且置于CMV启动子的控制之下。Cas9介导的基因编辑所需要的非编码RNA元件还被包含于相同的AAV包装基因组内。这允许共递送第二AAV载体(实例提供CMV-EGFP)，该第二AAV载体可以充当转导标记或每当需要HR时的模板供体。图11b示出来自将载体成功递送至小鼠的结果，如EGFP标记的表达所指示的。图11c示出抗-CTG SaCas9的递送导致CTG重复从HSALR转基因座位的有效切除，但在接受单独的AAV9-EGFP病毒或采用对照指导物(打乱的序列)表达SaCas9的AAV9的小鼠中未观察到编辑。
图12示出合成的表达构建体，其包含ATXN2mRNA的前342个核苷酸(从ATG起始位点)，这些核苷酸在框内融合至EGFP(G等位基因)或mCherry(C等位基因)的N-末端。在实例37中描述的实验结果指示使用CRISPR-Cas9进行的C等位基因的等位基因特异性靶向导致mCherry(C等位基因)的损失，但是在培养的细胞中没有EGFP(G等位基因)表达。
图13描绘了自失活CRISPR-Cas9系统的一个方面；参见实例3、4。
图14描绘了用于对于ATXN1座位而言是特异性的嵌合串联阵列转录物的示例性自失活CRISPR-Cas9系统。在U6aPS1和CMVaPS1指导物使CRISPR-Cas9系统失活时，ATXN1aPS9指导物编辑ATXN1座位；参见实例3、4。
图15A-C示出串联指导RNA尤其在第一位置中被有效加工。串联指导RNA尤其在第一位置中被有效加工((A)显示了编码在第一或第二位置中的EMX1.3或EMX63的串联指导RNA支架的示意图，其中以红色示出Emx1.3Northern探针的位置。(B)检查细胞中的串联sgRNA的加工的Northern印迹分析。(C)检查靶向两个基因组座位DYRK1A和GRIN2B的独立sgRNA活性的SURVEYOR测定。两个小图中的左边三个泳道是靶向第一位置中的DYRK1A和第二位置中的GRIN2B的tsgRNA。相反地，右边三个泳道是靶向第一位置中的GRIN2B并且然后靶向第二位置中的DYRK1A的tsgRNA。
图16A-C示出tsgRNA支架配对的优化。tsgRNA支架配对的优化((A)在Cas9-T2A-GFP表达质粒中具有使用支架A靶向Grin2B的第一间隔子和使用支架B靶向Cas9自身的第二间隔子的串联支架设计的示意图。(B)单一U6指导物对照显示GFP阴性细胞百分比的增加以及阳性部分平均荧光强度的降低。(C)串联支架配对和通过流式细胞术得到的后续分析结果的12x12矩阵)。
图17描绘不同支架之间的串联对改进第二间隔子活性。在不同支架之间的串联对改进第二间隔子活性(在先前研究中使用的sgRNA支架与sp85支架的序列比对)。
图18A-E提供了在多聚谷氨酰胺疾病小鼠模型中体内CRISPR/Cas9基因组编辑效力以及治疗益处的证据。
本文的这些图仅仅是出于说明性的目的，并且不一定是按比例绘制的。
具体实施方式
就关于CRISPR-Cas系统、其组分以及这样的组分的递送(包括方法、材料、递送运载体、载体、粒子、病毒载体、腺病毒、AAV、慢病毒及其制备和使用，包括关于量和配制品，全部在本发明的实践中都是有用的)的一般信息而言，参考：美国专利号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418和8,895,308；美国专利公开US 2014-0310830(美国申请序列号14/105,031)、US 2014-0287938 A1(美国申请序列号14/213,991)、US 2014-0273234 A1(美国申请序列号14/293,674)、US 2014-0273232 A1(美国申请序列号14/290,575)、US 2014-0273231(美国申请序列号14/259,420)、US 2014-0256046 A1(美国申请序列号14/226,274)、US 2014-0248702 A1(美国申请序列号14/258,458)、US 2014-0242700 A1(美国申请序列号14/222,930)、US 2014-0242699 A1(美国申请序列号14/183,512)、US 2014-0242664 A1(美国申请序列号14/104,990)、US 2014-0234972 A1(美国申请序列号14/183,471)、US 2014-0227787 A1(美国申请序列号14/256,912)、US 2014-0189896 A1(美国申请序列号14/105,035)、US 2014-0186958(美国申请序列号14/105,017)、US 2014-0186919 A1(美国申请序列号14/104,977)、US 2014-0186843A1(美国申请序列号14/104,900)、US 2014-0179770 A1(美国申请序列号14/104,837)和US2014-0179006 A1(美国申请序列号14/183,486)、US 2014-0170753(美国申请序列号14/183,429)；欧洲专利申请EP 2 771 468(EP 13818570.7)、EP 2 764 103(EP 13824232.6)和EP 2 784 162(EP 14170383.5)；以及PCT专利公开WO 2014/093661(PCT/US 2013/074743)、WO 2014/093694(PCT/US 2013/074790)、WO 2014/093595(PCT/US 2013/074611)、WO 2014/093718(PCT/US 2013/074825)、WO 2014/093709(PCT/US 2013/074812)、WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667)、WO 2014/093635(PCT/US 2013/074691)、WO 2014/093655(PCT/US 2013/074736)、WO 2014/093712(PCT/US 2013/074819)、WO 2014/093701(PCT/US 2013/074800)和WO 2014/018423(PCT/US 2013/051418)。还参考分别提交于2013年1月30日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日和2013年5月28日的美国临时专利申请61/758,468；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803和61/828,130。还参考提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/836,123。另外参考各自提交于2013年6月17日的美国临时专利申请61/835,931、61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080和61/835,973。进一步参考提交于2013年8月5日的美国临时专利申请61/862,468和61/862,355；提交于2013年8月28日的61/871,301；提交于2013年9月25日的61/960,777和提交于2013年10月28日的61/961,980。又进一步参考各自提交于2014年6月10日(6/10/14)的PCT专利申请号PCT/US 2014/041803、PCT/US 2014/041800、PCT/US 2014/041809、PCT/US 2014/041804以及PCT/US 2014/041806；提交于2014年6月11日的PCT/US 2014/041808；以及提交于2014年10月28日的PCT/US 2014/62558、及各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请序列号：61/915,251、61/915,301以及61/915,260；提交于2014年1月22日的61/930,214；各自提交于2014年6月10日的62/010,329和62/010,441；各自提交于2014年2月12日的61/939,228和61/939,242；提交于2014年4月15日的61/980,012；提交于2014年8月17日的62/038,358；各自提交于2014年9月25日的62/054,490、62/055,484、62/055,460以及62/055,487；以及提交于2014年10月27日的62/069,243。这些专利、专利公开、以及申请的每一个、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文件(“申请引用文件”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文件，连同其中提到的或在其中任何文件中提到并通过引用结合在其中的针对任何产品的任何说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用结合在此，并且可以在本发明的实践中采用。所有文件(例如，这些专利、专利公开、以及申请和申请引用文件)在如同每个单独文件被确切地且单独地指明为通过引用结合的相同程度上通过引用结合在此。
另外关于CRISPR-Cas系统的一般信息，提及的是：
使用CRISPR/Cas系统进行的多元基因组工程化(Multiplex genomeengineering using CRISPR/Cas systems).丛(Cong)，L.、兰(Ran)，F.A.、科克斯(Cox)D.、林(Lin)，S.、巴雷德(Barretto)，R.、哈比卜(Habib)，N.、徐(Hsu)，P.D.、武(Wu)，X.、江(Jiang)，W.、马拉菲尼(Marraffini)，L.A.，&张(Zhang)，F.《科学》(Science)2月15日；339(6121):819-23(2013)；
使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA-指导的编辑(RNA-guided editingof bacterial genomes using CRISPR-Cas systems).江(Jiang)W.、比卡德(Bikard)D.、科克斯(Cox)D.、张(Zhang)F、马拉菲尼(Marraffini)LA.《自然生物技术》(Nat BiotechnolMar)；31(3):233-9(2013)；
通过CRISPR/Cas-介导的基因组工程化在多基因中携带突变的小鼠的一步产生(One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering).王(Wang)H.、杨(Yang)H.、奇瓦里拉(Shivalila)CS.、多拉蒂(Dawlaty)MM.、程(Cheng)AW.、张(Zhang)F.、耶尼施(Jaenisch)R.《细胞》(Cell)五月9；153(4):910-8(2013)；
哺乳动物内源转录和外遗传状态的光控制(Optical control of mammalianendogenous transcription and epigenetic states).科纳曼(Konermann)S、布里格姆(Brigham)MD、特里维诺(Trevino)AE、徐(Hsu)PD、海登里希(Heidenreich)M、丛(Cong)L、普莱特(Platt)RJ、斯科特(Scott)DA、丘奇(Church)GM、张(Zhang)F.《自然》(Nature).2013年8月22日；500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.电子版2013年8月23日；
通过RNA指导的CRISPR Cas9进行的双切以用于增强的基因组编辑特异性(Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9for Enhanced Genome EditingSpecificity).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、林(Lin)，CY.、古滕伯格(Gootenberg)，JS.、科纳曼(Konermann)，S.、特里维诺(Trevino)，AE.、斯科特(Scott)，DA.、井上(Inoue)，A.、马托巴(Matoba)，S.、张(Zhang)，Y.，&张(Zhang)，F.《细胞》(Cell)8月28日.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013)；
RNA指导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性(DNA targeting specificity ofRNA-guided Cas9nucleases).徐(Hsu)，P.、斯科特(Scott)，D.、温斯坦(Weinstein)，J.、兰(Ran)，FA.、科纳曼(Konermann)，S.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、李(Li)，Y.、法恩(Fine)，E.、吴(Wu)，X.、沙勒姆(Shalem)，O.、克拉迪克(Cradick)，TJ.、马拉菲尼(Marraffini)，LA.、包(Bao)，G.，&张(Zhang)，F.《自然生物技术》(Nat Biotechnol)doi:10.1038/nbt.2647(2013)；
使用CRISPR-Cas9系统进行的基因组工程化(Genome engineering using theCRISPR-Cas9system).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、赖特(Wright)，J.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、斯科特(Scott)，DA.、张(Zhang)，F.《自然工具》(Nature Protocols)十一月；8(11):2281-308.(2013)；
在人类细胞中基因组规模CRISPR-Cas9敲除筛选(Genome-Scale CRISPR-Cas9Knockout Screening in Human Cells).沙勒姆(Shalem)，O.、桑耶纳(Sanjana)，NE.、哈尔特宁(Hartenian)，E.、史(Shi)，X.、斯科特(Scott)，DA.、迈克尔森(Mikkelson)，T.、赫克尔(Heckl)，D.、埃伯特(Ebert)，BL.、罗特(Root)，DE.、登奇(Doench)，JG.、张(Zhang)，F.《科学》(Science)12月12.(2013).[电子版先于印刷版]；
在与指导RNA和靶DNA复合物中的cas9的晶体结构(Crystal structure ofcas9 in complex with guide RNA and target DNA).尼氏玛素(Nishimasu)，H.、兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、科纳曼(Konermann)，S.、舍哈塔(Shehata)，SI.、多米耶(Dohmae)，N.、石谷(Ishitani)，R.、张(Zhang)，F.、努尔基(Nureki)，O.《细胞》(Cell)2月27.(2014).156(5):935-49；
在哺乳动物细胞中CRISPR内切核酸酶Cas9的基因组宽结合(Genome-widebinding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells).吴(Wu)X.、斯科特(Scott)DA.、凯里兹(Kriz)AJ.、邱(Chiu)AC.、徐(Hsu)PD.、达东(Dadon)DB.、程(Cheng)AW.、特里维诺(Trevino)AE.、科纳曼(Konermann)S.、陈(Chen)S.、耶尼施(Jaenisch)R.、张(Zhang)F.、夏普(Sharp)PA.《自然生物技术》(Nat Biotechnol.)(2014)4月20日.doi:10.1038/nbt.2889，
用于基因组编辑和癌模造的CRISPR-Cas9敲入小鼠(CRISPR-Cas9 KnockinMice for Genome Editing and Cancer Modeling)，普莱特(Platt)等人，《细胞》(Cell)159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/细胞杂志(j.cell.)2014.09.014，
用于基因组工程化的CRISPR-Cas9的开发与应用(Development andApplications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering)，徐(Hsu)等人，《细胞》(Cell)157，1262-1278(2014年6月5日)(徐2014)，
使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中进行遗传筛选(Genetic screens inhuman cells using the CRISPR/Cas9system)，王(Wang)等人，《科学》(Science)，2014年1月3日；343(6166):80-84.doi:10.1126/科学(science).1246981，
对于CRISPR-Cas9-介导的基因失活的高效sgRNA的合理设计(Rational designof highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation)，登奇(Doench)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，在线公开于2014年9月3日；doi:10.1038/nbt.3026，以及
使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中的基因功能的体内探询(In vivointerrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9)，斯维希(Swiech)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)；在线公开于2014年10月19日；doi:10.1038/nbt.3055。
将这些文献的每一个通过引用结合在此，并且简要讨论如下：
■丛(Cong)等人基于嗜热链球菌Cas9以及还有化脓链球菌Cas9两者改造了II型CRISPR-Cas系统以用于在真核细胞中使用，并且证实了Cas9分子可以通过短RNA指导以诱导在人类和小鼠细胞中DNA的精确切割。他们的研究进一步显示Cas9在转化成一种切口酶时可以用来以最低诱变活性促进在真核细胞中的同源定向修复。另外，他们的研究证实多个指导序列可以被编码进单一CRISPR阵列中以使得能够在哺乳动物基因组内的内源性基因组座位位点处同时编辑若干，证实了RNA指导的核酸酶技术的容易可编程性和广泛可应用性。这种使用RNA以编程细胞内序列特异性DNA切割的能力定义了新一类的基因组编辑工具。这些研究进一步显示，其他CRISPR座位可能是可移植入哺乳动物细胞中的，并且还可以介导哺乳动物基因组切割。重要地，可以设想的是CRISPR-Cas系统的若干方面可以进一步改进以增加其效率和多功能性。
■江(Jiang)等人使用规律间隔成簇短回文重复(CRISPR)-关联的Cas9内切核酸酶，与双-RNA复合，以在肺炎链球菌和大肠杆菌的基因组中引入精确的突变。该途径依赖于在靶基因组位点处的双-RNA:Cas9-引导的切割，以杀死未突变的细胞，并且回避对选择性标记或反选择系统的需要。该研究报道通过改变短CRISPR RNA(crRNA)的序列以使单一-和多个多核苷酸变化被携带在编辑模板上而重编程双-RNA:Cas9特异性。该研究显示，同时使用两种crRNA使得多元诱变成为可能。另外，当该途径与重组工程组合使用时，在肺炎链球菌中使用描述的途径回收的接近100％的细胞包含希望的突变，并且在大肠杆菌中回收的65％包含突变。
■科纳曼(Konermann)等人解决了在本领域中对通用和稳固技术的需要,其使得能够基于CRISPR Cas9酶以及还有转录激活因子样效应子对DNA-结合结构域进行光调节和化学调节。
■如在本说明书中讨论的，来自微生物CRISPR-Cas系统的Cas9核酸酶通过20nt指导序列而靶向特异性基因组座位，其可以耐受与该DNA靶标的某些错配并由此促进不希望的脱靶诱变。为了解决此问题，兰(Ran)等人描述了将Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA相组合以引入靶向的双链断裂的途径。因为基因组中的单独切口以高保真性被修复，所以同时经由适当补偿指导RNA而形成切口对于双链断裂是必需的，并且所述切口形成延伸了特异性识别的碱基的数目以用于靶标切割。作者证实了使用配对的切口形成可以降低在细胞系中的脱靶活性50至1,500倍，并且从而促进在小鼠受精卵中的基因敲除而不牺牲中靶切割效率。这个通用策略使得多种多样的要求高特异性的基因组编辑应用成为可能。
■徐(Hsu)等人表征了在人类细胞中SpCas9靶向特异性以告知靶位点的选择并避免脱靶效应。该研究评价了在293T和293FT细胞中的>100个预测的基因组脱靶座位处>700个指导RNA变体和SpCas9-诱导的indel突变水平。这些作者示出SpCas9以序列依赖性方式耐受指导RNA与靶DNA之间在不同位置处的错配，对错配的数目、位置和分布敏感。这些作者进一步示出SpCas9-介导的切割不受DNA甲基化的影响，并且SpCas9和sgRNA的剂量可被滴定为使得脱靶修饰最小化。另外，为了促进哺乳动物基因组工程应用，这些作者报道提供基于网络的软件工具以指导靶序列的选择和验证连同脱靶分析。
■兰(Ran)等人描述了用于在哺乳动物细胞中Cas9-介导的经由非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)基因组编辑、连同产生修饰的细胞系(以用于下游功能研究)的一组工具。为了最小化脱靶切割，这些作者进一步描述了一种双-切口策略，使用的是Cas9切口酶突变体与配对的指导RNA。由这些作者提供的方案经实验得出用于选择靶位点、评价切割效率和分析脱靶活性的指南。这些研究显示，以靶设计开始，基因修饰可以在少至1-2周内实现，并且修饰的克隆细胞系可以在2-3周内得以衍生。
■沙勒姆(Shalem)等人描述了新的在基因组广度范围上探询基因功能的方式。他们的研究显示，递送基因组范围的CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文库利用64,751个独特的指导序列靶向18,080个基因，这些指导序列使得在人类细胞中阴性和阳性选择筛选两者成为可能。首先，这些作者显示，使用该GeCKO文库来鉴定癌症和多能干细胞中对于细胞活力至关重要的基因。接着，在黑色素瘤模型中，这些作者针对基因进行筛选，这些基因的损失涉及对维罗非尼(一种抑制突变体蛋白激酶BRAF的治疗剂)的抗性。他们的研究显示，最高级候选物包括先前验证的基因NF1和MED12连同新颖的命中物NF2、CUL3、TADA2B、和TADA1。这些作者观察到在靶向相同基因的独立指导RNA之间的高水平的一致性以及高比率的命中确认，并且因此证实了采用Cas9进行基因组范围筛选的前景。
■尼氏玛素(Nishimasu)等人以2.5A°分辨率报道了与sgRNA复合的化脓链球菌Cas9以及其靶DNA的晶体结构。该结构揭示了一种由靶识别和核酸酶叶片组成的两叶片构造，其将sgRNA:DNA异源双链体容纳在它们的界面处的带正电的凹槽中。然而识别叶片对于结合sgRNA和DNA是至关重要的，核酸酶叶片包含HNH和RuvC核酸酶结构域，这些结构域适合地被定位为分别用于靶DNA的互补和非互补链的切割。核酸酶叶片还包含负责与原型间隔子邻近基序(PAM)相互作用的羧基-末端结构域。这种高分辨率结构和伴随的功能分析已经揭示了RNA-指导的由Cas9进行的DNA靶向的分子机制，由此为合理设计新的通用基因组编辑技术做好准备。
■吴(Wu)等人标定了在小鼠胚胎干细胞(mESC)中，来自化脓链球菌的无催化活性Cas9(dCas9)(加载有单一指导RNA(sgRNA))的基因组广度的结合位点。这些作者显示，测试的四种sgRNA中的每一种将dCas9靶向至数十和数千个之间的基因组位点，这些基因组位点频繁地通过sgRNA中的5-核苷酸种子区和NGG原型间隔子邻近基序(PAM)表征。染色质不可接近性降低了dCas9与具有匹配种子序列的其他位点的结合；因此70％的脱靶位点是与基因相关联的。这些作者显示，在用催化活性的Cas9转染的mESC中295dCas9结合位点的靶向测序鉴定出超过背景水平的仅一个突变位点。这些作者提出了一种针对Cas9结合和切割的两态模型，其中种子匹配触发了结合但是需要与靶DNA的广泛配对用于切割。
■徐(Hsu)2014是一篇综述文章，它大体讨论了CRISPR-Cas9的从酸奶到基因组编辑的历史，包括细胞的基因筛选，其在2014年6月5日之前提交的本说明书的谱系中的申请的信息、数据和发现中。徐2014的总体传授不涉及本说明书的特定模型、动物。
一般而言，该CRISPR-Cas或CRISPR系统是如在前述文献(如WO2014/093622(PCT/US2013/074667))中所使用的并且总共是指转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)、或如本文使用的术语“RNA”(例如，指导Cas9的RNA，例如，CRISPR RNA和反式激活(tracr)RNA或单一指导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施例中，可以通过计算机搜索重复基序来鉴定同向重复，其满足下列标准的任一项或全部：1.发现一个在II型CRISPR座位侧翼的基因组序列的2Kb窗口；2.跨从20到50bp；以及3.以20到50bp间隔开。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。在一些实施例中，在CRISPR复合物中可以优选的是该tracr序列具有一个或多个发夹并且长度是30个或更多个核苷酸、长度是40个或更多个核苷酸或长度是50个或更多个核苷酸；该指导序列长度是在10至30个核苷酸之间，该CRISPR/Cas酶是II型Cas9酶；在本发明的实施例中，术语指导序列和指导RNA可互换地使用，如在前述引用文献(如WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667))中。一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对是，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(BurrowsWheeler Aligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司；在www.novocraft.com可获得)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施例中，指导序列在长度上为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。优选地，该指导序列是10-30个核苷酸的长度。可以通过任何适合的测定法来评估指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿主细胞中，随后通过如本文所述的Surveyor测定来评估在该靶序列之内的优先切割。类似地，通过提供该靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分、和不同于该测试指导序列的对照指导序列，并且比较在该测试指导序列与该对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。指导序列可以被选择为靶向任何靶序列。在一些实施例中，该靶序列是在细胞的基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中为独特的那些。例如，对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。对于嗜热链球菌CRISPR1Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW的嗜热链球菌CRISPR1Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在这些序列的每一个中，“M”可以是A、G、T、或C，并且在序列鉴定中不必考虑为是独特的。在一些实施例中，指导序列被选择为降低在该指导序列内的二级结构程度。在一些实施例中，在最佳地折叠时，该指导序列的约或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、或更少的核苷酸参与自我互补碱基配对。可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定最佳折叠。一些算法是基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一种这样的算法的实例是mFold，正如祖克(Zuker)和施蒂格勒(Stiegler)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)9(1981)，133-148)所描述。折叠算法的另一个实例是使用由维也纳大学(University of Vienna)的理论化学研究所(Institutefor Theoretical Chemistry)研发的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber)等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PA Carr)和GM丘奇(GMChurch)，2009，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)27(12):1151-62)。
一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以可以进一步对二级结构做出解释，如在该tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施例中，该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，该tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。在本发明的一个实施例中，该转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施例中，该转录物具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的一个另外的实施例中，该转录物具有至多五个发夹。在一个发夹结构中，在该环的最终“N”和上游的序列5’的部分相应于该tracr配对序列，并且该环的序列3’的部分相应于该tracr序列。另外的包含指导序列、tracr配对序列、和tracr序列的单一多核苷酸的非限制性实例如下(列出为5’到3’)，其中“N”代表指导序列的碱基，小写字体的第一区代表tracr配对序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的多聚T序列代表转录终止子：(1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT；(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT；(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT；(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT；以及(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT。在一些实施例中，序列(1)到(3)与来自嗜热链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，序列(4)到(6)与来自化脓链球菌的Cas9结合使用。在一些实施例中，该tracr序列是一个与包含该tracr配对序列的转录物分开的转录物。
在一些实施例中，随后可以通过满足下列标准的任一项或全部的序列来预测候选tracrRNA：1.与同向重复同源的序列(在Geneious中搜索的具有高达18-bp错配的基序)；2.在转录方向上的预测的不依赖Rho的转录终止子的存在；以及3.在tracrRNA与同向重复之间的稳定发夹二级结构。在一些实施例中，可以使用这些标准中的2条，例如1和2、2和3、或1和3。在一些实施例中，可以使用所有这3条标准。
在一些实施例中，嵌合的合成指导RNA(sgRNA)设计可以在同向重复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。
为了将毒性和脱靶效应降低到最低限度，重要的是控制所递送的CRISPR酶mRNA和指导RNA的浓度。CRISPR酶mRNA和指导RNA的最佳浓度可以通过在细胞或非人类真核生物动物模型中测试不同的浓度并且使用深度测序分析在潜在的脱靶基因组座位处的修饰的范围而确定。例如，对于靶向人类基因组的EMX1基因中的5’-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3’的指导序列，可以使用深度测序来评定在下列两个脱靶位点处的修饰水平，1：5’-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3’和2：5’-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3’。对于体内递送，应当选择产生最高的中靶修饰水平同时将脱靶修饰水平最小化的浓度。可替代地，为了将毒性水平和脱靶效应最小化，可以用一对靶向感兴趣部位的指导RNA来递送CRISPR酶切口酶mRNA(例如，具有D10A突变的化脓链球菌Cas9)。这两个指导RNA需要如下间隔开。将毒性和脱靶效应最小化的指导序列和策略可以是如在WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667)中的。
该CRISPR系统有利地衍生自II型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。在本发明的优选实施例中，该CRISPR系统是一个II型CRISPR系统，并且该Cas酶是Cas9，其催化DNA切割。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物、或其修饰形式。
在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶指导在靶序列位置处(例如在该靶序列之内和/或在该靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶指导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对之内的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得该突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。例如，在来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9为切口酶的其他突变实例包括而不限于H840A、N854A、和N863A。作为一个另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II、和RuvC III或该HNH结构域)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性不多于该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时，则该酶被考虑为实质上缺乏所有DNA切割活性；一个实例可以是当突变形式的DNA切割活性与非突变形式相比是零或可忽略不计时。在该酶不是SpCas9的情况下，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在其他Cas9中的相应位置处的相同取代(或这些突变的保守性取代)也是优选的。特别优选的是在SpCas9中的D10和H840。然而，在其他Cas9中，相应于SpCas9D10和H840的残基也是优选的。SpCas9的直向同源物可以用于本发明的实践中。一种Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为这可以是指与来自II型CRISPR系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该Cas9酶来自或衍生自spCas9(化脓链球菌Cas9)或saCas9(金黄色葡萄球菌Cas9)。“StCas9”是指来自嗜热链球菌的野生型Cas9，其蛋白质序列在登录号G3ECR1下给出于SwissProt数据库中。类似地，化脓链球菌Cas9或spCas9在登录号Q99ZW2下被包括在SwissProt中。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。应当理解的是，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的II型CRISPR座位的Cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的Cas9，如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等等。通过来源于化脓链球菌或Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用，产生了在靶位点序列处的双链断裂，所述靶位点序列杂交到该指导序列的20个核苷酸上并且具有在该靶序列的20个核苷酸之后的原型间隔子相邻基序(PAM)序列(实例包括NGG/NRG或可以如本文所述进行确定的PAM)。经由Cas9的对于位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性是由该指导序列、部分杂交到该指导序列上的tracr序列以及该PAM序列定义的。该CRISPR系统的更多方面描述于卡吉诺夫(Karginov)和汉农(Hannon)的“CRISPR系统：在细菌和古细菌中的小RNA指导的防御”(The CRISPR system:small RNA-guided defence in bacteria and archaea)，《分子细胞学杂志》(Mole Cell)2010，1月15日；37(1):7。II型CRISPR座位来自化脓链球菌SF370，该座位含有四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的聚簇以及两个非编码RNA元件tracrRNA和由非重复序列的短段(间隔子，每个约30bp)间隔开的重复序列(同向重复)的特征性阵列。在此系统中，以四个连续步骤产生靶向的DNA双链断裂(DSB)。第一步，从CRISPR座位转录两个非编码RNA前-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，将tracrRNA杂交到前-crRNA的同向重复上，然后将其加工成含有单独的间隔子序列的成熟crRNA。第三步，该成熟crRNA:tracrRNA复合物经由在crRNA的间隔子区与原型间隔子DNA之间形成异源双链体而指导Cas9到由原型间隔子和对应的PAM组成的DNA靶标。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以在原型间隔子内产生一个DSB。由单个间隔子组成的前-crRNA阵列，该单个间隔子侧翼为两个同向重复(DR，还被术语“tracr配对序列”所涵盖)。在某些实施例中，Cas9可以结构性地存在或诱导性地存在或有条件地存在或被给予或递送。Cas9优化可以用来增强功能或者用来开发新的功能，人们可以产生嵌合Cas9蛋白。并且Cas9可以用作通用的DNA结合蛋白。
典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，该tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分上。
密码子优化序列的一个实例是在这种情形下针对在真核生物(例如，人类)中表达(即，针对在人类中表达进行优化)或针对如本文论述的另一种真核生物、动物或哺乳动物进行优化的序列；参见，例如，WO 2014/093622(PCT/US 2013/074667)中的SaCas9人类密码子优化序列。虽然这是优选的，但是应当理解的是，其他实例也是可能的，并且针对除人类之外的宿主物种的密码子优化或针对具体器官的密码子优化是已知的。在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化，以便在特定的细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，如哺乳动物，包括但不限于人、或如本文论述的非人类真核生物或动物或哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜、或非人类哺乳动物或灵长动物。在一些实施例中，对于人类或动物而言很可能使得他们(它们)受苦而没有任何实质性医学益处的用于修饰人类的种系遗传同一性的方法和/或用于修饰动物的遗传同一性的方法、以及还有作为这样的方法的结果的动物，可以被排除在外。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，中村Y.(Nakamura Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态”(“Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year 2000.”)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)28:292(2000年)。用于密码子优化特定的序列以便在特定的宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在一些实施例中，一种载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS)如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS的CRISPR酶。在一些实施例中，该CRISPR酶包含在或接近于氨基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，在或接近于羧基端约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个NLS，或这些的组合(例如在氨基端的零个或至少一个或多个NLS以及在羧基端的零个或一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可以被选择为不依赖于其他NLS，使得在多于一个拷贝中可以存在单个NLS和/或与在一个或多个拷贝中存在一个或多个其他NLS相组合。在本发明的一个优选实施例中，该CRISPR酶包含至多6个NLS。在一些实施例中，当NLS的最近的氨基酸是在从N端或C端沿着该多肽链的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个、或更多个氨基酸之内时，NLS可以被视为接近该N端或C端。NLS的非限制性实例包括来源于以下项的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列PKKKRKV；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK的核质蛋白二分NLS)；c-myc NLS，其具有氨基酸序列PAAKRVKLD或RQRRNELKRSP；hRNPA1M9NLS，其具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP和PPKKARED；人p53的序列POPKKKPL；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP；流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK；以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。一般而言，该一个或多个NLS具有足够的强度，以便在真核细胞的核中驱动该CRISPR复合物以可检测到的量积聚。一般而言，核定位活性的强度可以驱动在该CRISPR酶中的NLS的数目、所使用的一个或多个特定的NLS、或这些因素的组合。可以通过任何适合的技术进行细胞核中积聚的检测。例如，一种检测标记可以融合到CRISPR酶上，使得细胞内的位置可以被可视化，如与检测细胞核的位置的手段(例如，对于细胞核特异的染料，如DAPI)相结合。还可以将细胞核从细胞中分离出来，然后可以通过任何适合的用于检测蛋白质的方法分析其内容物，如免疫组织化学、Western印迹或酶活性测定。如通过测定CRISPR复合物形成的作用(例如，测定在靶序列处的DNA切割或突变、或测定由于CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性的影响而改变的基因表达活性)，与没有暴露于CRISPR酶或复合物、或暴露于缺乏该一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比较，还可以间接地确定细胞核中的积聚。
本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的DNA分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。只有产生在这些指导序列(大于-8bp的偏移)之间具有小于8bp重叠的5’突出端的sgRNA对才能介导可检测的indel形成。重要的是，当与野生型Cas9配对时，在这些分析中使用的每个指导对于有效诱导indel是重要的，表明这些指导对的相对位置在预测双切割活性中是最重要的参数。由于Cas9n和Cas9H840A切割DNA的相对链，对于一个给定的sgRNA对而言，用Cas9H840A取代Cas9n应该会导致该突出端类型的倒转；但当用指示Cas9H840A是实质上缺乏所有DNA切割活性的CRISPR酶的Cas9H840A时，没有观察到indel形成(这是当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性不多于该酶的非突变形式的DNA切割活性的约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时；由此一个实例可以是当突变形式的DNA切割活性与非突变形式相比是零或可忽略不计时，例如在相比于生物化学或原核系统的真核系统中，当用Cas9H840A时，没有观察到indel形成)。尽管如此，将产生具有Cas9n的5’突出端的一对sgRNA原则上会相反地产生相应的3’突出端，以及双切口。因此，导致具有Cas9n的3’突出端产生的sgRNA对可以与另一个突变的Cas9一起使用，以产生一个5’突出端，以及双切口。相应地，在一些实施例中，还提供了重组模板。重组模板可以是如本文所述的另一个载体的组分，其被包含在一个分开的载体中，或者被提供为一个分开的多核苷酸。在一些实施例中，重组模板被设计为用作在同源重组中的模板，如在被作为CRISPR复合物的一部分的CRISPR酶切开或切割的靶序列之内或在其附近。模板多核苷酸可以具有任何适合的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个、或更多个核苷酸长度。在一些实施例中，该模板多核苷酸与包含该靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、5、10、15、20个、或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当一个模板序列与包含靶序列的多核苷酸进行最佳比对时，该模板多核苷酸的最近的核苷酸在距离该靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个、或更多个核苷酸之内。
在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分开的载体上的分开的调节元件上。或者，可以将CRISPR系统的RNA递送至转基因Cas9动物或哺乳动物，例如，结构性地或诱导性地或有条件性地表达Cas9的动物或哺乳动物；或以其他方式表达Cas9或具有包含Cas9的细胞的动物或哺乳动物，如通过向其先前给予用于编码以及在体内表达Cas9的一种或多种载体。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供该CRISPR系统的任何组分的一种或多种另外的载体不包括在该第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上，并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及该指导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接到该指导序列上)、和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多者的表达。在一些实施例中，该CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列、和tracr序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。用于表达CRISPR系统的一个或多个元件的递送运载体、载体、粒子、纳米粒子、配制品及其组分是如在前述文献(如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667))中所使用的。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，载体包含在tracr配对序列的上游、并且任选地在可操作地连接到该tracr配对序列上的调节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到该插入位点中之后并且在表达时该指导序列引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两种或更多种指导序列可以包含单指导序列的两个或更多个拷贝、两种或更多种不同的指导序列、或这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20种、或更多种指导序列。在一些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多种这样的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。CRISPR酶或CRISPR酶mRNA或CRISPR指导RNA或一个或多个RNA可以分开递送；并且有利地这些中的至少一者经由纳米粒子复合物递送。可以在该指导RNA在给出时间以待CRISPR酶表达之前递送CRISPR酶mRNA。可以在给予指导RNA之前1-12小时(优选约2-6小时)给予CRISPR酶mRNA。可替代地，可以一起给予CRISPR酶mRNA和指导RNA。有利地，可以在初始给予CRISPR酶mRNA+指导RNA之后1-12小时(优选约2-6小时)给予指导RNA的第二加强剂量。为了实现基因组修饰的最有效水平，另外给予CRISPR酶mRNA和/或指导RNA可以是有用的。
在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广阔的应用谱。示例性CRISPR复合物包括与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。在一个实施例中，本发明提供了一种切割靶多核苷酸的方法。该方法包括使用CRISPR复合物修饰靶多核苷酸，该CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上并且实施所述靶多核苷酸的切割。典型地，当被引入进细胞中时，本发明的CRISPR复合物在基因组序列中产生一个断裂(例如，单链或双链断裂)。例如，可以使用该方法切割细胞中的疾病基因。由该CRISPR复合物产生的断裂可以通过修复过程进行修复，如易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径或高保真同源定向修复(HDR)。在这些修复过程期间，可以将外源多核苷酸模板引入进基因组序列中。在一些方法中，该HDR过程被用于修饰基因组序列。例如，将外源多核苷酸模板引入进细胞中，该外源多核苷酸模板包括有待整合的、侧翼为上游序列和下游序列的序列。上游和下游序列与染色体中的整合位点的任一侧都具有序列相似性。在希望的情况下，供体多核苷酸可以是DNA，例如DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、一段线性DNA、PCR片段、裸核酸或与递送赋形剂(如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。该外源多核苷酸模板包括有待整合的序列(例如，突变的基因)。供整合的序列可以是对细胞而言内源或外源的序列。有待整合的序列的实例包括编码蛋白质的多核苷酸或非编码RNA(例如，微小RNA)。因此，供整合的序列可以可操作地连接到一个或多个适当的控制序列上。可替代地，有待整合的序列可以提供一种调节功能。选择外源多核苷酸模板中的上游和下游序列，以促进感兴趣的染色体序列与供体多核苷酸之间的重组。该上游序列是一个与供整合的靶向位点的上游的基因组序列具有序列相似性的核酸序列。类似地，该下游序列是一个与供整合的靶向位点的染色体序列下游具有序列相似性的核酸序列。外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列可以具有75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性。优选地，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些方法中，外源多核苷酸模板中的上游和下游序列与靶向的基因组序列具有约99％或100％序列一致性。上游或下游序列可以包括从约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中，示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具体地约700bp至约1000bp。在一些方法中，该外源多核苷酸模板可以进一步包括一种标记。这样的一种标记使得容易地筛选靶向的整合。适合的标记的实例包括限制性位点、荧光蛋白或选择性标记。可以使用重组技术构建本发明的外源多核苷酸模板(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001和奥苏贝尔(Ausubel)等人，1996)。在一种用于通过整合外源多核苷酸模板而修饰靶多核苷酸的方法中，通过CRISPR复合物将双链断裂引入进基因组序列中，经由同源重组通过外源多核苷酸模板而修复该断裂，这样使得将该模板整合进基因组中。双链断裂的存在促进模板的整合。在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的CRISPR复合物增加或降低靶多核苷酸的表达。在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞中的表达的修饰。例如，当CRISPR复合物结合到细胞中的靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。例如，可以使蛋白质或微小RNA编码序列失活，这样使得该蛋白质或微小RNA或前-微小RNA转录物不被产生。在一些方法中，可以使控制序列失活，这样使得它不再作为控制序列起作用。如在此使用，“控制序列”是指影响核酸序列的转录、翻译或可及性的任何核酸序列。控制序列的实例包括启动子、转录终止子和增强子，它们是控制序列。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，据信该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，与由CRISPR复合物识别的短序列相关。对PAM的精确序列和长度要求取决于使用的CRISPR酶而不同，但是PAM典型地是临近原型间隔子(也就是说，靶序列)的2-5个碱基对序列。在以下实例部分中给出PAM序列的实例，并且熟练人员将能够鉴定与给定的CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上；在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括对来自人或非人动物的细胞或细胞群进行取样，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。
确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。
本发明涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的工程化和优化，该序列靶向例如涉及CRISPR-Cas系统及其组分的基因组干扰或基因编辑。在有利的实施例中，该Cas酶是Cas9。本发明方法的一个优点在于，该CRISPR系统最小化或避免了脱靶结合及其所产生的副作用。这是通过使用被安排为具有针对靶DNA的高度序列特异性的系统而实现的。
该CRISPR系统特别适用于编辑核苷酸重复，例如三核苷酸重复或其他核苷酸扩增元件。这些重复是负责引起许多障碍的DNA突变。这些中的许多展示神经学症状，所以在脑和其他中枢神经系统(CNS)组织中使用CRISPR是特别感兴趣的，但是还观察到非神经学症状并且因此递送至其他组织并在所述其他组织中表达也是有用的。例如，强直性肌营养不良是由核苷酸重复(针对DM1为三核苷酸，而针对DM2为四核苷酸)的扩增引起的，但引起肌营养不良、白内障、心脏传导缺陷、以及肌强直，并且因此涉及不同的靶组织。
核苷酸重复扩增障碍
CRISPR-Cas9系统是对可存在于基因组中的核苷酸重复扩增进行编辑的有力工具。这些重复是基因组DNA中的突变，并且它们负责引起许多障碍，例如参见‘人类核苷酸扩增障碍(Human Nucleotide Expansion Disorders)’(编辑弗里和乌斯汀(Fry&Usdin)，2006)核酸与分子生物学，第19卷(ISBN 978-3-540-33336-4)。这些障碍中的大多数是神经退行性的，但它们可以影响各种组织。
包含涉及疾病和障碍的核苷酸扩增元件的核苷酸不同，但它们通常是三核苷酸重复，通常涉及CTG、CAG、CGG、CCG、GAA、或TTC。还见到较长的重复，例如CCTG四核苷酸，ATTCT和AGAAT五核苷酸，GGGGCC六核苷酸，以及CCCCGCCCCGCG和CGCGGGGCGGGG十二核苷酸。CRISPR系统的性质意味着它可用于编辑所有此类核苷酸重复。例如，CRISPR编辑核苷酸重复的用途包括该重复的切除。优选的是该重复的切除导致修复为野生型。在多种重复的存在下，多种指导物可以用于靶向多种重复。
这些重复可以存在于编码或非编码区内，例如在外显子、5'UTR、3'UTR、启动子元件或内含子内。可以不论该重复的位置来使用本发明。
因此核苷酸重复障碍，并且特别是三核苷酸重复障碍和核苷酸扩增障碍是优选的有待治疗的病症。这些也示例于本文中。
例如，美国专利公开号20110016540描述了使用锌指核酸酶基因修饰与三核苷酸重复扩增障碍相关的细胞、动物以及蛋白质。三核苷酸重复扩增障碍是复杂的、进行性的疾病，其涉及发育神经生物学并且常常影响认知以及感觉运动功能。
如上所提及的，核苷酸重复扩增蛋白是一套多样化的蛋白质，这些蛋白质与发生核苷酸重复扩增障碍的易感性、核苷酸重复扩增障碍的存在、核苷酸重复扩增障碍的严重性或其任何组合相关联。三核苷酸重复扩增障碍被分为由重复类型决定的两个类别。最常见的重复是三联体CAG，当出现在一个基因的编码区中时，其编码氨基酸谷氨酰胺(Q)。因此，这些障碍被称为多聚谷氨酰胺(polyQ)障碍并且包括下列疾病：亨廷顿病(HD)；脊延髓肌萎缩症(SBMA)；脊髓小脑性共济失调(SCA型1、2、3、6、7、和17)；以及齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)。其余的三核苷酸重复扩增障碍不涉及CAG三联体，或者该CAG三联体不在该基因的编码区中，并且因此被称为非多聚谷氨酰胺障碍。非多聚谷氨酰胺障碍包括脆性X综合征(FRAXA)；脆性X相关的震颤/共济失调综合征(FXTAS)；脆性XE精神发育迟滞(FRAXE)；FRAXF；弗里德赖希共济失调(FRDA)；强直性肌营养不良(DM)，特别是1型(DM1)或针对DM2的四核苷酸变体；和脊髓小脑性共济失调(SCA型8、和12)。其他核苷酸扩增障碍包括进行性肌阵挛性癫痫(12-mer重复)、DM2强直性肌营养不良(4-mer重复元件)、C9orf72(6-mer重复元件)以及SCA10型(5-mer重复元件)。
与核苷酸重复扩增障碍相关联的蛋白质典型地是基于核苷酸重复扩增障碍相关性蛋白质与核苷酸重复扩增障碍的实验性关联而选择的。例如，相对于没有核苷酸重复扩增障碍的群体，在具有核苷酸重复扩增障碍的群体中，与核苷酸重复扩增障碍相关的蛋白质的产生率或循环浓度可以升高或降低。可以使用蛋白质组技术评估蛋白质水平差异，包括但不限于蛋白质印迹、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及质谱法。可替代地，可以使用基因组技术通过获得编码这些蛋白质的基因的基因表达谱而鉴定与核苷酸重复扩增障碍相关的蛋白质，包括但不限于DNA微阵列分析、基因表达系列分析(SAGE)以及定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR)。已知核苷酸重复，可以实践涉及该重复的切除的CRISPR修复(优选到野生型)。以相同方式，该核苷酸重复被认为是突变。该突变可以通过将缺失的野生型序列重新引入突变体中来修复。在这种情况下，可以使用允许将缺失的野生型序列重新引入突变体中的修复模板。这种CRISPR修复可以用于修复任何突变。与三核苷酸重复扩增障碍相关联的蛋白质的非限制性实例包括AR(雄激素受体)、FMR1(脆性x精神发育迟滞1)、HTT(亨廷丁)、DMPK(肌强直性营养不良蛋白激酶)、FXN(线粒体型共济失调蛋白)、ATXN2(脊髓小脑共济失调蛋白2)、ATN1(萎缩蛋白1)、FEN1(片段结构特异内切核酸酶1)、TNRC6A(含有6A的三核苷酸重复)、PABPN1(多聚(A)结合蛋白，核1)、JPH3(亲联蛋白3)、MED15(介体复合物亚基15)、ATXN1(脊髓小脑共济失调蛋白1)、ATXN3(脊髓小脑共济失调蛋白3)、TBP(TATA盒结合蛋白)、CACNA1A(钙通道，电压依赖性，P/Q型、α1A亚基)、ATXN80S(ATXN8相反链(非蛋白质编码))、PPP2R2B(蛋白磷酸酶2，调节亚基B，β)、ATXN7(脊髓小脑共济失调蛋白7)、TNRC6B(含有6B的三核苷酸重复)、TNRC6C(含有6C的三核苷酸重复)、CELF3(CUGBP、Elav样家族成员3)、MAB21L1(mab-21-样1(秀丽隐杆线虫))、MSH2(MutS同源物2，结肠癌，无息肉病型1(大肠杆菌))、TMEM185A(跨膜蛋白185A)、SIX5(SIX同源框5)、CNPY3(冠层3同源物(斑马鱼))、FRAXE(脆性部位，叶酸型，罕见型，fra(X)(q28)E)、GNB2(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)、β多肽2)、RPL14(核糖体蛋白L14)、ATXN8(脊髓小脑共济失调蛋白8)、INSR(胰岛素受体)、TTR(转甲状腺素蛋白)、EP400(E1A结合蛋白p400)、GIGYF2(GRB10相互作用GYF蛋白2)、OGG1(8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶)、STC1(斯钙素1)、CNDP1(肌肽二肽酶1(金属肽酶M20家族))、C10orf2(染色体10开放阅读框2)、MAML3智者基因样3(果蝇)、DKC1(先天性角化不全症1，角化不良蛋白)、PAXIP1(PAX相互作用(具有转录激活域)蛋白1)、CASK(钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(MAGUK家族)、MAPT(微管相关蛋白tau)、SP1(Sp1转录因子)、POLG(聚合酶(DNA指导的)，γ)、AFF2(AF4/FMR2家族，成员2)、THBS1(凝血酶敏感蛋白1)、TP53(肿瘤蛋白p53)、ESR1(雌激素受体1)、CGGBP1(CGG三联体重复结合蛋白1)、ABT1(基本转录激活因子1)、KLK3(激肽释放酶相关肽酶3)、PRNP(朊病毒蛋白)、JUN(jun癌基因)、KCNN3(钾中间/小电导钙激活通道，亚家族N，成员3)、BAX(BCL2相关X蛋白)、FRAXA(脆性部位，叶酸型，罕见型，fra(X)(q27.3)A(巨睾丸，精神发育迟滞))、KBTBD10(Kelch重复和BTB(POZ)域包含蛋白10)、MBNL1(盲肌样(果蝇))、RAD51(RAD51同源物(RecA同源物，大肠杆菌)(酿酒酵母))、NCOA3(核受体共激活因子3)、ERDA1(扩展重复结构域，CAG/CTG 1)、TSC1(结节性硬化1)、COMP(软骨寡聚基质蛋白)、GCLC(谷氨酰半胱氨酸连接酶，催化亚基)、RRAD(Ras相关关联糖尿病)、MSH3(mutS同源物3(大肠杆菌))、DRD2(多巴胺受体D2)、CD44(CD44分子(印度血型))、CTCF(CCCTC结合因子(锌指蛋白))、CCND1(细胞周期蛋白D1)、CLSPN(扣蛋白同源物(非洲爪蟾))、MEF2A(肌细胞增强因子2A)、PTPRU(蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，U)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、TRIM22(三基序蛋白22)、WT1(维尔姆斯瘤1)、AHR(芳香烃受体)、GPX1(谷胱甘肽过氧化物酶1)、TPMT(硫嘌呤甲基转移酶)、NDP(诺里病(假神经胶质瘤))、ARX(无芒相关同源框)、MUS81(MUS81内切核酸酶同源物(酿酒酵母))、TYR(酪氨酸酶(眼皮肤白化病IA))、EGR1(早期生长反应蛋白1)、UNG(尿嘧啶DNA糖基化酶)、NUMBL(麻木同源物(果蝇)样)、FABP2(脂肪酸结合蛋白2，肠)、EN2(锯齿状同源框2)、CRYGC(晶状体蛋白，γC)、SRP14(信号识别粒子14kDa(同源Alu RNA结合蛋白))、CRYGB(晶状体蛋白，γB)、PDCD1(程序性细胞死亡1)、HOXA1(同源框A1)、ATXN2L(脊髓小脑共济失调蛋白2样)、PMS2(PMS2减数分裂后分离增加2样蛋白(酿酒酵母))、GLA(半乳糖苷酶，α)、CBL(Cas-Br-M(鼠)热带逆转录病毒转化序列)、FTH1(铁蛋白，重多肽1)、IL12RB2(白细胞介素12受体，β2)、OTX2(正小齿同源框2)、HOXA5(同源框A5)、POLG2(聚合酶(DNA指导的)，γ2，辅助亚基)、DLX2(末端减少同源框2)、SIRPA(信号调节蛋白α)、OTX1(正小齿同源框1)、AHRR(芳香烃受体阻遏物)、MANF(中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子)、TMEM158(跨膜蛋白158(基因/假基因))、以及ENSG00000078687。
核苷酸重复在大小上不同，并且可以驻留在疾病相关基因的编码区或非编码区中。技术人员将能够识别此类重复，以及此类重复是否是正常或异常的。可以使用在本申请中描述的CRISPR-Cas9途径来靶向每个座位。
有待被靶向用于CRISPR修复的在EPM1中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CCCCGCCCCGCG。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在C9ORF72中的核苷酸重复序列的异常扩增是GGGGCC。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在DM2中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CCTG。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在OPMD中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是GCG/Ala。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在SCA10中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是ATTCT。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在脆性X、FXTAS中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CGG。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在SCA12中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CAG。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在弗里德赖希共济失调中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是GAA。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在SCAs 1-3、6、7、17、DRPLA、HD、SBMA、HDL2(SCAs8、12)中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CAG/多聚谷氨酰胺。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在SCA31中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是TGGAA。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
有待被靶向用于CRISPR修复的在SCA8、DM1中的核苷酸重复序列的示例性异常扩增是CTG。使用描述的CRISPR修复，从受影响序列中切除该重复。
与三核苷酸重复扩增障碍相关联的优选蛋白质包括HTT(亨廷丁)、AR(雄激素受体)、FXN(线粒体型共济失调蛋白)、Atxn3(脊髓小脑共济失调蛋白)、Atxn1(脊髓小脑共济失调蛋白)、Atxn2(脊髓小脑共济失调蛋白)、Atxn7(脊髓小脑共济失调蛋白)、Atxn10(脊髓小脑共济失调蛋白)、DMPK(肌强直性营养不良蛋白激酶)、Atn1(萎缩蛋白1)、CBP(creb结合蛋白)、VLDLR(极低密度脂蛋白受体)、及其任何组合。
亨廷顿氏病(HD)：
通过降低HTT(亨廷顿氏病的致病基因)的表达，RNA干扰(RNAi)对这种病症提供了治疗潜能(参见，例如，麦克布赖德(McBride)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)第19卷，第12期，2011年12月，第2152-2162页)，并且因此申请人假定它可以适用于该CRISPR-Cas系统。可以使用一种算法来生成该CRISPR-Cas系统，以便降低反义序列的脱靶可能性。这些CRISPR-Cas序列可以靶向小鼠、恒河猴或人类亨廷丁(Htt)的外显子52中的一个序列并且表达于一种病毒载体如AAV中。可以按照约三次微量注射/半球(总共六次注射)来注射包括人类在内的动物：第一次在前连合的吻侧1mm(12μl)，并且用1e12vg/ml的AAV以约1μl/分的速率在第一次注射的尾侧间隔3mm和6mm进行其余两次注射(分别为12μl和10μl)，并且将针留在适当位置持续另外的5分钟，以允许注射物从针尖扩散。
迪费吉里亚(DiFiglia)等人(PNAS，10月23日，2007年，第104卷，第43期，17204-17209)观察到，向成熟的纹状体中单次给予靶向Htt的siRNA可以使突变体Htt沉默，减弱神经元病理，并且延迟在急骤起病的HD的病毒性转基因小鼠模型中观察到的异常行为表现。迪费吉里亚(DiFiglia)用2μl的Cy3标记的cc-siRNA-Htt或10μM的未结合的siRNA-Htt注射到小鼠的纹状体内。在本发明中对于人类可以考虑靶向Htt的CRISPR Cas的相似剂量，例如，可以将约5-10ml的10μM的靶向Htt的CRISPR Cas注射到纹状体内。
在另一个实施例中，布德罗(Boudreau)等人(《分子治疗》(MolecularTherapy)第17卷，第6期，2009年6月)将5μl的表达htt特异性RNAi病毒的重组AAV血清型2/1载体(以4x1012个病毒基因组/ml)注射到纹状体(straiatum)中。在本发明中对于人类可以考虑靶向Htt的CRISPR Cas的相似剂量，例如，可以将约10-20ml的4x1012个病毒基因组/ml靶向Htt的CRISPR Cas注射到纹状体内。
在另一个实施例中，可以连续给予靶向HTT的CRISPR Cas(参见，例如，于(Yu)等人，《细胞》(Cell)150，895-908，8月31日，2012年)。于(Yu)等人利用递送0.25ml/小时的渗透泵(型号2004)来递送300mg/天的ss-siRNA或磷酸盐缓冲盐水(PBS)(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，持续28天，并且使用被设计为递送0.5μl/小时的泵(型号2002)来递送75mg/天的阳性对照MOE ASO，持续14天。用稀释在无菌PBS中的ss-siRNA或MOE充满泵(度瑞公司(Durect Corporation)，进而在植入之前将其在37℃孵育24或48(型号2004)小时。用2.5％异氟烷麻醉小鼠，并且在头盖骨底部做正中切口。使用脑功能区定位导子，将套管植入右侧脑室并且用乐泰胶(Loctite adhesive)固定。将一根附接到Alzet微渗透压泵的导管附接到该套管上，并且将该泵皮下置于肩胛间区(midscapular area)中。用5.0号尼龙缝线将该切口闭合。在本发明中对于人类可以考虑靶向Htt的CRISPR Cas的相似剂量，例如，可以给予约500到1000g/天的靶向Htt的CRISPR Cas。
在连续输注的另一个实例中，斯泰尔斯(Stiles)等人(《实验神经病学》(Experimental Neurology)233(2012)463-471)将一根具有钛针尖的脑实质导管植入到右侧壳核中。将该导管连接到一个皮下植入在腹部的II泵(美敦力神经调控部门(Medtronic Neurological)，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)上。在以6μL/天输注磷酸盐缓冲盐水7天之后，用试验品将这些泵重新充满并且编程为连续递送7天。以约0.1到0.5μL/分的变化输注速率输注约约2.3到11.52mg/d的siRNA。在本发明中对于人类可以考虑靶向Htt的CRISPR Cas的相似剂量，例如，可以给予约20到200mg/天的靶向Htt的CRISPR Cas。
在另一个实施例中，转让给桑加莫(Sangamo)的美国专利公开号20130253040的这些方法也可以适合于用于治疗亨廷顿病的从塔乐斯(TALES)到本发明的CRISPR Cas系统。
关于亨廷顿氏病，CRISPR复合物的可能的靶基因：PRKCE；IGF1；EP300；RCOR1；PRKCZ；HDAC4；以及TGM2。
C9ORF72
C9orf72(染色体9开放读码框72)是在人类中对在脑的许多区域中、在神经元的细胞质中以及在突触前末梢中发现的蛋白进行编码的蛋白。C9orf72基因的一个或多个突变已经得以鉴定，所述突变包含核苷酸GGGGCC的六个字母串的六核苷酸重复扩增元件。C9orf72中的突变是显著的，因为它是首个被鉴定为家族性额颞痴呆(FTD)与肌萎缩性侧索硬化(ALS)之间的遗传联系的致病机制。
CFTR
根据另一个方面，提供了一种用于治疗具有在CFTR基因中的突变的受试者的基因治疗方法，并且该方法包括任选地经由一种生物相容性药用载体向受试者的细胞给予治疗有效量的CRISPR-Cas基因治疗粒子。优选地，该靶DNA包含突变δF508。通常，优选的是该突变被修复为野生型。在这种情况下，该突变是三个核苷酸的缺失，这些核苷酸包括在位置508处的针对苯丙氨酸(F)的密码子。因此，在这种情况下的修复要求将缺失密码子重新引入该突变体中。
为了实施这个基因修复策略，优选的是将一个腺病毒/AAV载体系统引入该宿主细胞、多个细胞或患者中。优选地，该系统包含Cas9(或Cas9切口酶)和指导RNA连同腺病毒/AAV载体系统，其包含含有F508残基的同源性修复模板。这可以经由较早论述的递送方法之一引入受试者。该CRISPR-Cas系统可以由该CFTRδ508嵌合指导RNA指导。它靶向有待切割或切割的CFTR基因组座位的特定位点。在切割之后，将修复模板经由同源重组插入切割位点中，从而校正导致囊性纤维化或引起囊性纤维化相关症状的缺失。这种利用适当的指导RNA引导递送并提供CRISPR系统的系统性引入的策略可以用来靶向基因突变，以编辑或另外地操纵引起代谢障碍、肝脏、肾和蛋白质病和障碍的基因。
一个方面是被工程化为用于体内CRISPR-Cas9介导的基因组编辑的AAV载体。包含N-末端和C-末端核定位结构域以及N-末端Flag的Cas9(例如SpCas9)可以克隆进AAV穿梭质粒中。因为Cas9cDNA的可能的尺寸约束以及希望获得体内低水平的Cas9核酸酶表达，可以省略启动子的使用。取而代之，可以由AAV反向末端重复(iTR)序列的基础转录活性驱动Cas9的表达。可以将指导RNA(gcRNA)和反式激活性RNA(tracrRNA)克隆进不同的AAV穿梭质粒中，并且分别置于两种不同的III型RNA聚合酶启动子即U6和H1启动子的调节之下。报告基因(例如EGFP)或任何其他序列可以克隆在非编码表达盒的下游。在一个系统中，可以将非编码CRISPR组分表达为由U6启动子驱动的嵌合体(sgRNA)阵列。可以使用此类AAV质粒，例如以靶向携带30个CAG核苷酸重复(正常范围)或80个CAG重复(疾病范围)的ATXN1质粒。
载体可以使用包含N-末端核定位结构域以及N-末端HA-标签的Cas9核酸酶，该Cas9核酸酶被克隆进AAV穿梭质粒中，并且置于CMV启动子的控制之下。Cas9介导的基因编辑所需要的非编码RNA元件还被包含于相同的AAV包装基因组内。这允许第二AAV载体的共递送，该第二AAV载体可以充当转导标记或每当希望HR时的模板供体。成功的载体递送可以由标记(例如EGFP)的表达指示。AAV载体可以用于将CRISPR-Cas9递送至哺乳动物组织中。
在该重复的侧翼的指导序列可以使用CRISPR-Cas9系统来去除。可以将指导序列设计为在3’非翻译区(3’UTR)中的核苷酸重复区的侧翼。当两种侧翼指导非编码RNA同时表达时，可以确认对该重复的成功编辑。对受影响序列进行测序还可以用于确认成功的修复。在异常扩增的适当切除(优选地到野生型)后，该序列被修复。
自失活系统
一旦在细胞的基因组中一种基因的所有拷贝已经被编辑，在该细胞中CRISRP/Cas9继续表达不再是必需的。事实上，持续表达在未预期的基因组位点等处的脱靶效应的情况下会是不令人希望的。因此时间限制性表达会是有用的。诱导型表达提供了一种方法，但是此外申请人已经工程化自失活CRISPR-Cas9系统，该系统依赖于在该CRISPR载体本身内使用非编码指导靶序列。因此，表达开始后，该CRISPR系统将导致其自身的破坏，但是在破坏完成之前，它将有时间编辑靶基因的基因组拷贝(在二倍体细胞中具有正常点突变的情况下，需要至多两个编辑)。简单地，该自失活CRISPR-Cas系统包括另外的RNA(即指导RNA)，该RNA靶向CRISPR酶本身的编码序列或者靶向与存在于以下项的一个或多个中的独特序列互补的一种或多种非编码指导靶序列：
(a)在驱动非编码RNA元件的表达的启动子内，
(b)在驱动Cas9基因的表达的启动子内，
(c)在Cas9编码序列中的ATG翻译起始密码子的100bp内，
(d)在病毒递送载体的例如AAV基因组中的反向末端重复(iTR)内。
另外，该RNA可以经由载体递送，例如编码CRISPR复合物的单独的载体或相同的载体。当由单独的载体提供时，靶向Cas表达的CRISPRRNA可以顺序地或同时地给予。当顺序给予时，靶向Cas表达的CRISPRRNA是在旨在用于例如基因编辑或基因工程的CRISPR RNA之后被递送。此时期可以是数分钟时期(例如5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，45分钟，60分钟)。此时期可以是数小时时期(例如2小时，4小时，6小时，8小时，12小时，24小时)。此时期可以是数天时期(例如2天，3天，4天，7天)。此时期可以是数周时期(例如2周，3周，4周)。此时期可以是数月时期(例如2个月，4个月，8个月，12个月)。此时期可以是数年时期(例如2年，3年，4年)。以此方式，Cas酶与能够杂交到第一靶标(例如一个基因组座位或多个感兴趣座位)上的第一gRNA/chiRNA关联，并且承担CRISPR-Cas系统的所希望的一种或多种功能(例如基因工程)；并且随后该Cas酶可以然后与能够杂交到包含Cas或CRISPR盒的至少部分的序列上的第二gRNA/chiRNA关联。在gRNA/chiRNA靶向编码Cas蛋白的表达的序列的情况下，该酶变得受阻碍并且该系统变为自失活。以相同方式，经由例如如在此解释的脂质体、脂质转染、纳米粒子、微囊泡来应用的靶向Cas表达的CRISPR RNA可以顺序地或同时地给予。类似地，自失活可以用于用以靶向一种或多种靶标的一种或多种指导RNA的失活。
在一些方面，提供单一gRNA，该单一gRNA能够杂交到CRISPR酶起始密码子的序列下游，借此在一段时间之后CRISPR酶表达有损失。在一些方面，提供一种或多种gRNA，所述gRNA能够杂交到编码CRISPR-Cas系统的多核苷酸的一种或多种编码区或非编码区，借此在一段时间之后CRISPR-Cas系统的一种或多种或者在一些情况下全部失活。在该系统的一些方面，并且不受理论限制，该细胞可以包含多种CRISPR-Cas复合物，其中CRISPR复合物的第一子集包含能够靶向有待编辑的一个或多个基因组座位的第一chiRNA，并且CRISPR复合物的第二子集包含能够靶向编码CRISPR-Cas系统的多核苷酸的至少一种第二chiRNA，其中CRISPR-Cas复合物的第一子集介导对靶向的一个或多个基因组座位的编辑，并且CRISPR复合物的第二子集最终使CRISPR-Cas系统失活，由此使细胞中进一步的CRISPR-Cas表达失活。
因此，本发明提供了一种CRISPR-Cas系统，包括一种或多种用于递送至真核细胞的载体，其中该一种或多种载体编码：(i)CRISPR酶；(ii)第一指导RNA，该第一指导RNA能够杂交到细胞中的靶序列上；(iii)第二指导RNA，该第二指导RNA能够杂交到编码CRISPR酶的载体中的一种或多种靶序列上；(iv)至少一种tracr配对序列；以及(v)至少一种tracr序列，该第一和第二复合物可以使用相同的tracr和tracr配对，因此区别仅在于指导序列，其中当在细胞内表达时：该第一指导RNA引导第一CRISPR复合物与细胞中的靶序列的序列特异性结合；该第二指导RNA引导第二CRISPR复合物与编码CRISPR酶的载体中的靶序列的序列特异性结合；这些CRISPR复合物包含(a)杂交到tracr序列上的该tracr配对序列，以及(b)结合到该指导RNA上的CRISPR酶，使得指导RNA可以结合到其靶序列上；并且该第二CRISPR复合物使CRISPR-Cas系统失活以防止该细胞对CRISPR酶继续表达。
在本文中的其他地方披露了该一种或多种载体、该编码的酶、该指导序列等的另外特征。例如，一种或多种指导序列的一者或两者可以是chiRNA序列的部分，该chiRNA序列在单RNA内提供了指导、tracr配对和tracr序列，这样使得该系统可以编码(i)CRISPR酶；(ii)第一chiRNA，其包含能够杂交到细胞中的第一靶序列上的序列、第一tracr配对序列、和第一tracr序列；(iii)第二指导RNA，其能够杂交到编码CRISPR酶、第二tracr配对序列、和第二tracr序列的载体上。类似地，该酶可以包括一个或多个NLS等。
这些不同的编码序列(CRISPR酶、指导RNA、tracr和tracr配对)可以被包括在单一载体上或多种载体上。例如，有可能在一个载体上编码该酶，并且在另一个载体上编码不同的RNA序列，或者有可能在一个载体上编码该酶并且编码一个chiRNA，并且在另一个载体上编码其余chiRNA，或者任何其他排列。总体上，使用总计一种或两种不同载体的系统是优选的。
在使用多种载体的情况下，有可能以不等数目递送它们，并且理想地采用相对于第二指导RNA而言的过量的编码第一指导RNA的载体，由此有助于延迟CRISPR系统的最终失活，直至基因组编辑已经具有发生的机会。
该第一指导RNA可以靶向基因组内的任何感兴趣靶序列，如在此其他地方所述。该第二指导RNA靶向编码CRISPR Cas9酶的载体内的序列，并且由此使来自该载体的酶表达失活。因此在载体中的靶序列必须能够使表达失活。适合的靶序列可以是例如接近Cas9编码序列的翻译起始密码子或在其内，在驱动非编码RNA元件的表达的启动子中的非编码序列中，在驱动Cas9基因的表达的启动子内，在Cas9编码序列中的ATG翻译起始密码子的100bp内，和/或在病毒递送载体的例如在AAV基因组中的反向末端重复(iTR)内。在此区附近的双链断裂可以诱导Cas9编码序列中的移码，导致蛋白表达的损失。“自失活”指导RNA的可替代靶序列目的在于编辑/失活多个表达CRISPR-Cas9系统所需的或者载体稳定性所需的调节区/序列。例如，如果Cas9编码序列的启动子被破坏，则转录可以被抑制或阻止。类似地，如果载体包括用于复制、维持或稳定性的序列，则有可能靶向这些。例如，在AAV载体中，有用的靶序列是在iTR内。其他用以靶向的有用序列可以是启动子序列、聚腺苷酸化位点等。
另外，如果指导RNA以阵列形式表达，同时靶向两种启动子的“自失活”指导RNA将导致从CRISPR-Cas表达构建体切除间插核苷酸，有效地导致其完全失活。类似地，在指导RNA靶向两种ITR或同时靶向两种或更多种其他CRISPR-Cas组分的情况下，间插核苷酸的切除将产生。总体上如在此解释的自失活采用用以提供CRISPR-Cas9的调节的CRISPR-Cas9系统是可应用的。例如，如在此解释的自失活可以应用至突变例如扩增障碍的CRISPR修复，如在此解释的。作为该自失活的结果，CRISPR修复仅是瞬时有活性的。
将非靶向核苷酸添加至“自失活”指导RNA的5’端(例如1-10个核苷酸，优选1-5个核苷酸)可以用于延迟其加工和/或修饰其效力，作为确保在CRISPR-Cas9停止之前在靶向的基因组座位处进行编辑的手段。
在自失活AAV-CRISPR-Cas9系统的一个方面，共表达靶向感兴趣基因组序列(例如1-2、1-5、1-10、1-15、1-20、1-30)的一种或多种sgRNA的质粒可以用“自失活”sgRNA建立，所述“自失活”sgRNA靶向在工程化的ATG起始位点处或附近(例如，在5个核苷酸内，在15个核苷酸内，在30个核苷酸内，在50个核苷酸内，在100个核苷酸内)的SpCas9序列。在U6启动子区中的调节序列还可以用sgRNA靶向。U6驱动的sgRNA可以按阵列形式设计，使得多种sgRNA序列可以同时释放。当首次递送到靶组织/细胞(左细胞)中，sgRNA开始累积，同时在细胞核中的Cas9水平上升。Cas9复合所有sgRNA以介导CRISPR-Cas9质粒的基因组编辑和自失活。
自失活CRISPR-Cas9系统的一个方面是表达单一或来自1至4个或更多个不同指导序列(例如高达约20个或约30个指导序列)的串联阵列形式。每个单独的自失活指导序列可以靶向不同的靶标。这些可以从例如一个嵌合pol3转录物加工。可以使用Pol3启动子例如U6或H1启动子。Pol2启动子，例如在此遍及全文提及的那些。反向末端重复(iTR)序列可以在Pol3启动子-sgRNA(s)-Pol2启动子-Cas9的侧翼。
嵌合串联阵列转录物的一个方面是一种或多种指导物编辑一种或多种靶标，同时一种或多种自失活指导物使CRISPR/Cas9系统失活。因此，例如用于修复扩增障碍的描述的CRISPR-Cas9系统可以直接与在此描述的自失活CRISPR-Cas9系统组合。这种系统可以例如具有针对用于修复的靶区域的两种指导物，以及针对CRISPR-Cas9的自我失活的至少一种第三指导物。
一般递送
载体递送，例如质粒、病毒递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导RNA，可以使用任何适合载体，例如，质粒或病毒载体，如腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他病毒载体类型、或其组合进行递送。Cas9以及一种或多种指导RNA可以包装到一种或多种载体，例如，质粒或病毒载体中。在一些实施例中，该载体，例如，质粒或病毒载体可以，例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，而有时经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行递送。这样的递送可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待递送的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如载体选择、靶细胞、生物、或组织、有待治疗的受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、给药途径、给药方式、所寻求的转化/修饰的类型，等等。
这样的剂量可以进一步含有，例如，载体(水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油，等等)、稀释剂、药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)、药学上可接受的赋形剂、和/或本领域已知的其他化合物。该剂型可以进一步含有一种或多种药学上可接受的盐，例如像，无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。另外，也可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球体、聚合物、悬浮剂等等。另外，也可以存在一种或多种其他常规药用成分，如防腐剂、保湿剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等等，尤其是该剂型是可复原形式时。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯80、苯乙醇、三氯叔丁醇、山梨酸钾、抗坏血酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯酚、明胶、白蛋白和它们的组合。药学上可接受的赋形剂的彻底论述可获自《雷明顿药物科学》(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES)(马克出版公司，纽约，1991)，通过引用将其并入本文。
在本文的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1x105个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在本文的一个实施例中，该剂量优选地是该腺病毒载体的至少约1x106个粒子(例如，约1x106-1x1012个粒子)，更优选至少约1x107个粒子，更优选至少约1x108个粒子(例如，约1x108-1x1011个粒子或约1x108-1x1012个粒子)，并且最优选至少约1x100个粒子(例如，约1x109-1x1010个粒子或约1x109-1x1012个粒子)，或者甚至至少约1x1010个粒子(例如，约1x1010-1x1012个粒子)。可替代地，该剂量包含不多于约1x1014个粒子，优选不多于约1x1013个粒子，甚至更优选不多于约1x1012个粒子，甚至更优选不多于约1x1011个粒子，并且最优选不多于约1x1010个粒子(例如，不多于约1x109个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病毒载体，其具有例如，约1x106粒子单位(pu)，约2x106pu、约4x106pu、约1x107pu、约2x107pu、约4x107pu、约1x108pu、约2x108pu、约4x108pu、约1x109pu、约2x109pu、约4x109pu、约1x1010pu、约2x1010pu、约4x1010pu、约1x1011pu、约2x1011pu、约4x1011pu、约1x1012pu、约2x1012pu、或约4x1012pu的腺病毒载体。参见，例如，在2013年6月4日授权的授予纳贝尔(Nabel)等人的美国专利号8,454,972B2中的腺病毒载体(通过引用并入本文)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在本文的一个实施例中，该腺病毒是经由多剂量递送的。
在本文的一个实施例中，该递送是经由AAV进行的。用于针对人类的AAV的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1x1010到约1x1010个功能AAV/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治疗益处相对于任何副作用的平衡。在本文的一个实施例中，AAV剂量大致处于从约1x105到1x1050个基因组AAV、从约1x108到1x1020个基因组AAV、从约1x1010到约1x1016个基因组、或约1x1011到约1x1016个基因组AAV的浓度范围内。人类剂量可以是约1x1013个基因组AAV。这样的浓度能以从约0.001ml到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其他有效剂量。参见，例如，2013年3月26日授权的授予哈加(Hajjar)等人的美国专利号8,404,658B2，在第27栏第45-60行。
在本文的一个实施例中，该递送是经由质粒进行的。在这样的质粒组合物中，该剂量应当是足以引出反应的质粒的量。例如，在质粒组合物中的质粒DNA的适当量可以是从约0.1到约2mg，或从约1μg到约10μg/70kg个体。本发明的质粒一般将包括(i)启动子；(ii)编码CRISPR酶的序列，任选连接到所述启动子上；(iii)选择标记；(iv)复制起点；和(v)(ii)的下游的并且可操作连接到其上的转录终止子。该质粒还可以编码CRISPR复合物的RNA组分，但是这些中的一种或多种相反可以被编码到不同载体上。
本文的剂量是基于平均70kg的个体。给药频率在医学或兽医学从业者(例如医师、兽医师)或本领域熟练的科学家的范围之内。还应注意，在实验中所使用的小鼠典型地是约20g，并且从小鼠实验，一个小鼠可以扩展到70kg个体。
在一些实施例中，本发明的RNA分子在脂质体或阳离子脂质体配制品等等中进行递送并且可以通过本领域技术人员熟知的方法进行制备。这样的方法描述于，例如，美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将其通过引用并入本文。已经开发了专门针对增强和改进递送siRNA到哺乳动物细胞中的递送系统，(参见，例如，沈(Shen)等人《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Let.)2003，539:111-114；夏(Xia)等人，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)2002，20:1006-1010；赖希(Reich)等人，《分子视界》(Mol.Vision.)2003，9:210-216；索伦森(Sorensen)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)2003，327:761-766；路易斯(Lewis)等人，《自然遗传学》(Nat.Gen.)2002，32:107-108以及西梅奥尼(Simeoni)等人，NAR 2003，31，11:2717-2724)并且可以将其应用于本发明。最近，siRNA已经成功用于抑制灵长动物中的基因表达(参见例如托伦蒂诺(Tolentino)等人，《视网膜》(Retina)24(4):660，它也可应用于本发明。
实际上，RNA递送是一种有用的体内递送方法。有可能使用脂质体或纳米粒子将Cas9和gRNA(并且，例如，HR修复模板)递送到细胞中。因此，CRISPR酶如Cas9的递送和/或本发明的RNA的递送可以处于RNA的形式并且经由微囊泡、脂质体或纳米粒子来进行。例如，Cas9mRNA和gRNA可以被包装到脂质体粒子中用于体内递送。脂质体转染试剂例如来自生命技术公司(Life Technologies)的lipofectamine以及市售的其他试剂可以有效地将RNA分子递送到肝脏中。
RNA的递送手段还优选包括经由纳米粒子的RNA递送(卓(Cho)S.、金伯格(Goldberg)M.、松(Son)S.、许(Xu)Q.、杨(Yang)F.、梅(Mei)Y.、博加特廖夫(Bogatyrev)S.、朗格(Langer)R.和安德森(Anderson)D.，“用于将小干扰RNA递送到内皮细胞的脂质样纳米粒子”(Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery toendothelial cells)，《先进功能材料》(Advanced Functional Materials)，19:3112-3118，2010)或外泌体(施罗德(Schroeder)A.、莱文斯(Levins)C.、科特斯(Cortez)C.、朗格(Langer)R.、和安德森(Anderson)D.，“用于siRNA递送的基于脂质的纳米治疗剂”(Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery)，《内科学杂志》(Journal of InternalMedicine)，267:9-21，2010，PMID:20059641)。事实上，已经表明外泌体在递送siRNA中特别有用，其为与CRISPR系统有一些相似之处的系统。例如，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人“外泌体诱导的体外和体内siRNA递送”(“Exosome-mediated delivery of siRNA invitro and in vivo.”)《自然-实验手册》(Nat Protoc.)2012年12月；7(12):2112-26.doi:10.1038/nprot.2012.131.电子版2012年11月15日描述了外泌体对于跨不同的生物屏障的药物递送是有希望的工具并且可以用于体外和体内递送siRNA。其途径在于通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体产生靶向外泌体。然后将这些外泌体纯化并且从转染的细胞上清液中表征，然后将RNA加载到外泌体中。根据本发明的递送或给药可以用外泌体进行，尤其是但不限于脑。维生素E(α-生育酚)可以与CRISPR Cas结合并且连同高密度脂蛋白(HDL)一起递送到脑，例如以与乌诺(Uno)等人完成的用于将短干扰RNA(siRNA)递送到脑的类似方式《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY)22:711-719(2011年6月)。经由用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或游离TocsiBACE或Toc-siBACE/HDL充满的并且与脑灌注试剂盒3(Brain Infusion Kit 3)(Alzet公司)连接的微渗透压泵(型号1007D；Alzet公司，库比蒂诺(Cupertino)，CA)灌注小鼠。将一根脑灌注导管置于在正中线的前囱的后方约0.5mm，用于灌注到背侧第三脑室中。乌诺(Uno)等人发现，通过相同的ICV灌注方法，少至3nmol的Toc-siRNA与HDL可诱导相当程度的靶减少。可以考虑结合至α-生育酚的并且与HDL共同给予靶向脑的相似剂量的CRISPR Cas用于本发明，例如，可以考虑靶向脑的约3nmol到约3μmol的CRISPR Cas。邹(Zou)等人(《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY 22:465-475(2011年4月))描述了靶向PKCγ的短发夹RNA的慢病毒介导的递送方法，其用于在大鼠脊髓中的体内基因沉默。邹(Zou)等人通过鞘内导管给予约10μl的具有1x109个转导单位(TU)/ml的滴度的重组慢病毒。在本发明中可以考虑相似剂量的在靶向脑的慢病毒载体中表达的CRISPR Cas用于人类，例如，可以考虑靶向脑的在具有1x109个转导单位(TU)/ml的滴度的慢病毒中的约10-50ml的CRISPR Cas。
就局部递送至脑部而言，这可以以各种方法实现。例如，材料可以，例如，通过注射递送到纹状体内。注射可以通过穿颅术定向性进行。
提高NHEJ或HR效率也有助于递送。优选的是，NHEJ效率通过共表达末端加工酶(co-expressing end-processing enzyme)如Trex2而增强(杜米特拉切(Dumitrache)等人《遗传学》(Genetics)2011年8月；188(4):787-797)。优选的是，HR效率通过瞬时抑制NHEJ机构如Ku70和Ku86而增加。HR效率也可以通过共表达原核或真核同源重组酶如RecBCD、RecA而增加。
一般包装和启动子
介导体内基因组修饰的、将Cas9编码核酸分子例如DNA包装到载体，例如，病毒载体中的方式包括：
为了实现NHEJ介导的基因敲除：
单病毒载体：
含有两个或更多个表达盒的载体：
启动子-Cas9编码核酸分子-终止子
启动子-gRNA1-终止子
启动子-gRNA2-终止子
启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)
双病毒载体：
含有一个用于驱动Cas9表达的表达盒的载体1
启动子-Cas9编码核酸分子-终止子
含有一个或多个用于驱动一个或多个指导RNA表达的表达盒的载体2
启动子-gRNA1-终止子
启动子-gRNA(N)-终止子(一直到载体的大小限制)
为了介导同源定向修复。
除了上述单和双病毒载体途径之外，另外的载体可以用来递送同源定向修复模板。
用来驱动Cas9编码核酸分子表达的启动子包括：
AAV ITR可以用作一种启动子：这对于消除另外的启动子元件(可在载体中占用空间)的需要是有利的。空出来的另外的空间可以用来驱动另外的元件的表达(gRNA，等等)。同样，ITR活性是较弱的，因此可以用来降低由于Cas9的过表达所致的潜在毒性。
对于遍存表达，可以使用启动子CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链，等等。
对于脑或其他CNS表达，可以使用启动子：用于所有神经元的突触蛋白I、用于兴奋性神经元的CaMKIIα、用于GABA能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。
对于肝脏表达，可以使用白蛋白启动子。
对于肺表达，可以使用SP-B。
对于内皮细胞，可以使用ICAM。
对于造血细胞，可以使用IFNβ或CD45。
对于成骨细胞，可以使用OG-2。
用来驱动指导RNA的启动子可以包括：
Pol III启动子，如U6或H1
使用Pol II启动子和内含子盒来表达gRNA
腺相关病毒(AAV)
Cas9以及一种或多种指导RNA可以使用腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他质粒或病毒载体类型进行递送，尤其是，使用来自以下文献的配方和剂量：例如，美国专利号8,454,972(针对腺病毒的配方、剂量)、8,404,658(针对AAV的配方、剂量)和5,846,946(针对DNA质粒的配方、剂量)以及来自临床试验和关于涉及慢病毒、AAV、和腺病毒的临床试验的出版物。例如，对于AAV，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,454,972并且如涉及AAV的临床试验。对于腺病毒，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号8,404,658并且如涉及腺病毒的临床试验。对于质粒递送，给药途径、配方和剂量可以如美国专利号5,846,946并且如涉及质粒的临床试验。剂量可以基于或推断为平均70kg的个体(例如，男性成人)，并且可以针对患者、受试者、不同重量和物种的哺乳动物进行调整。给药频率在医学或兽医学从业者(例如，医师、兽医师)的范围之内，其取决于常规因素，包括患者或受试者的年龄、性别、一般健康状况、其他状况以及着手解决的特殊状况或症状。可以将病毒载体注射到感兴趣的组织中。对于细胞类型特异性基因组修饰，Cas9的表达可以由细胞类型特异性启动子驱动。例如，肝脏特异性表达可以使用白蛋白启动子，而神经元特异性表达(例如，用于靶向CNS障碍)可以使用突触蛋白I启动子。
就体内递送而言，AAV相比于其他病毒载体是有利的，这是由于几个原因：
低毒性(这可以是由于纯化方法不需要细胞粒子的超速离心所致，而超速离心可能激活免疫反应)
引起插入诱变的低概率，原因在于它未整合到宿主基因组中。
AAV具有4.5或4.75Kb的包装限制。这意味着Cas9以及启动子和转录终止子必须都配合在同一个病毒载体中。大于4.5或4.75Kb的构建体将导致病毒产生的显著降低。SpCas9是相当大的，其基因自身超过4.1Kb，使其难于包装到AAV中。因此本发明的实施例包括利用更短的Cas9同源物。例如：
因此这些物种总体上是优选的Cas9物种。
关于AAV，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合。可以选择相对于有待被靶向的细胞的AAV的AAV；例如，可以选择用于靶向脑或神经元细胞的AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合；并且可以选择用于靶向心脏组织的AAV4。AAV8可用于递送到肝脏。在此启动子和载体是单独优选的。关于这些细胞的某些AAV血清型的表格(参见格林姆(Grimm)，D.等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)82:5887-5911(2008))如下：
慢病毒
慢病毒是复杂的反转录病毒，其具有在有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞两者中感染并表达其基因的能力。最为人熟知的慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，其利其他病毒的包膜糖蛋白来靶向广泛范围的细胞类型。
慢病毒可以制备如下。在克隆pCasES10(含有慢病毒转移质粒骨架)之后，将处于低传代数(p＝5)的HEK293FT接种在T-75烧瓶中，直到在转染之前的一天在具有10％胎牛血清而没有抗生素的DMEM中50％汇合。在20小时之后，培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基，并且在4小时后进行转染。细胞用10μg的慢病毒转移质粒(pCasES10)和下列包装质粒转染：5μg的pMD2.G(VSV-g假型)、和7.5μg的psPAX2(gag/pol/rev/tat)。在具有阳离子脂质递送剂(50μL的Lipofectamine 2000和100μl的Plus试剂)的4mL OptiMEM中进行转染。在6小时之后，培养基更换为具有10％胎牛血清的无抗生素的DMEM。在细胞培养过程中，这些方法使用血清，但是无血清方法是优选的。
慢病毒可以如下纯化。在48小时后收获病毒上清液。首先清除上清液的碎片并通过0.45μm的低蛋白结合(PVDF)滤膜进行过滤。然后将它们在超速离心机中以24,000rpm旋转2小时。将病毒沉淀重新悬浮在50μl的DMEM中在4℃过夜。然后将它们等分，并且立即在-80℃冷冻。
在另一个实施例中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，尤其是对于眼基因治疗而言(参见，例如，巴鲁谷安(Balagaan)，《基因医学杂志》(JGene Med)2006；8:275(285)。在另一个实施例中，还考虑了一种经由视网膜下注射用于治疗湿型的年龄相关性黄斑变性的、表达血管生成抑制蛋白(内皮抑素和血管抑素)的基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体(参见，例如，宾利(Binley)等人，《人类基因治疗》(HUMAN GENE THERAPY)23:980-991(2012年9月))，并且这种载体可以经修饰用于本发明的CRISPR-Cas系统。
在另一个实施例中，自灭活慢病毒载体可以用于和/或适合于本发明的CRISPR-Cas系统，该自灭活慢病毒载体具有靶向由HIV tat/rev共享的共有外显子的siRNA、核仁定位TAR诱饵、和抗CCR5特异性锤头状核酶(参见，例如，迪吉斯托(DiGiusto)等人(2010)《科学转化医学》(Sci Transl Med)2:36ra43)。可以收集最少2.5×106个CD34+细胞/每千克患者体重，并且以2×106个细胞/ml的密度在X-VIVO 15培养基中(龙沙公司(Lonza))预刺激16到20个小时，该培养基含有2μmol/L-谷氨酰胺、干细胞因子(100ng/ml)、Flt-3配体(Flt-3L)(100ng/ml)、和促血小板生成素(10ng/ml)(CellGenix公司)。可以用慢病毒以感染复数5在75-cm2的包被有纤连蛋白(25mg/cm2)(重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)，宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.))的组织培养瓶中转导预刺激的细胞16到24小时。
慢病毒载体还披露于帕金森病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20120295960以及美国专利号7303910和7351585。慢病毒载体还已经披露于眼病的治疗中，参见，例如，美国专利公开号20060281180、20090007284、US 20110117189；US20090017543；US 20070054961、US 20100317109。慢病毒载体还已经披露于递送到脑中，参见，例如，美国专利公开号US 20110293571；US 20110293571、US 20040013648、US20070025970、US 20090111106和美国专利号US 7259015。
RNA递送
RNA递送：该CRISPR酶，例如Cas9，和/或任何本发明的RNA，例如指导RNA，也可以按RNA的形式递送。可以使用体外转录产生Cas9mRNA。例如，可以使用含有下列元件的PCR盒来合成Cas9mRNA：来自β珠蛋白-polyA尾(一串120个或更多的腺嘌呤)的T7_启动子-科扎克(kozak)序列(GCCACC)-Cas9-3’UTR。该盒可以用于经由T7聚合酶的转录。也可以使用体外转录从含有T7_启动子-GG-指导RNA序列的盒来转录指导RNA。
为了增强表达并且降低可能的毒性，可以，例如，使用假-U或5-甲基-C修饰该CRISPR酶-编码序列和/或指导RNA，以包括一个或多个修饰的核苷。
]mRNA递送方法用于当前的肝脏递送是特别有希望的。
关于RNA递送的很多临床工作已经集中于RNAi或反义上，但是这些系统可以适配为用于递送RNA用于实现本发明。因此，应当阅读以下针对RNAi等的提及。
纳米粒子
可以使用纳米粒子或脂质包膜同时递送CRISPR酶mRNA和指导RNA。
例如，苏X(Su X)、弗里克J(Fricke J)、卡瓦纳DG(Kavanagh DG)、欧文DJ(IrvineDJ)(“使用脂质包封的pH响应性聚合物纳米粒子的体外和体内mRNA递送”(“In vitro andin vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymernanoparticles”)《分子药理学》(Mol Pharm.)2011年6月6；8(3):774-87.doi:10.1021/mp100390w.2011年4月1日电子版)描述了生物可降解的核-壳结构纳米粒子，其具有由磷脂双层壳包封的聚(β-氨基酯)(PBAE)核。这些被开发为用于体内mRNA递送。该pH响应性PBAE被选择为促进内体破裂，而该脂质表面层被选择为将聚阳离子核的毒性最小化。因此，这些对于递送本发明的RNA是优选的。
在一个实施例中，考虑了基于自组装生物粘附聚合物的纳米粒子，其可应用于肽的经口递送、肽的静脉内递送以及肽的鼻递送，均递送到脑。其他实施例，还考虑了例如疏水性药物的经口吸收和眼部递送。分子包膜技术涉及被保护并递送到疾病部位的工程化聚合物包膜(参见，例如，马萨(Mazza)M.等人《ACS纳米》(ACSNano)，2013.7(2):1016-1026；秀(Siew)A.等人《分子药理学》(Mol Pharm)，2012.9(1):14-28；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人《控释杂志》(J Contr Rel)，2012.161(2):523-36；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人，《分子药理学》(Mol Pharm)，2012.9(6):1665-80；拉拉特萨(Lalatsa)A.等人《分子药理学》(MolPharm)，2012.9(6):1764-74；加勒特(Garrett)N.L.等人《生物光电杂志》(JBiophotonics)，2012.5(5-6):458-68；加勒特(Garrett)N.L.等人《拉曼光谱杂志》(JRaman Spect)，2012.43(5):681-688；阿哈默德(Ahmad)S.等人《皇家学会界面杂志》(JRoyal Soc Interface)2010.7:S423-33；乌切克布(Uchegbu)I.F.《药物递送专家评论》(Expert Opin Drug Deliv)，2006.3(5):629-40；曲(Qu)X.等人《生物大分子》(Biomacromolecules)，2006.7(12):3452-9和乌切克布(Uchegbu)I.F.等人《国际药学杂志》(Int J Pharm)，2001.224:185-199)。考虑了约5mg/kg的剂量，呈单剂量或多剂量形式，这取决于靶组织。
在一个实施例中，可以使用由丹·安德森实验室(Dan Anderson’s lab)在MIT开发的可将RNA递送到癌细胞以便使肿瘤生长停止的纳米粒子/并且或使其适用于本发明的CRISPR Cas系统。具体地说，安德森实验室开发了用于新生物材料和纳米制剂的合成、纯化、表征、和配制的全自动化组合系统。参见，例如，阿拉比(Alabi)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA.)2013年8月6日；110(32):12881-6；张(Zhang)等人，《先进材料》(Adv Mater.)2013年9月6日；25(33):4641-5；江(Jiang)等人，《纳米通讯》(NanoLett.)2013年3月13日；13(3):1059-64；卡拉吉安尼斯(Karagiannis)等人，《ACS纳米》(ACSNano.)2012年10月23日；6(10):8484-7；怀特海德(Whitehead)等人，《ACS纳米》(ACSNano.)2012年8月28日；6(8):6922-9和李(Lee)等人，《自然纳米技术》(Nat Nanotechnol.)2012年6月3日；7(6):389-93。
美国专利申请20110293703涉及类脂质化合物，这些化合物在多核苷酸的给药中也是特别有用的，其可适用于递送本发明的CRISPR Cas系统。在一个方面，氨基醇类脂质化合物与有待递送到细胞或受试者的药剂结合而形成微粒子、纳米粒子、脂质体、或胶束。有待通过粒子、脂质体、或胶束递送的药剂可以处于气体、液体、或固体的形式，并且该药剂可以是一种多核苷酸、蛋白质、肽、或小分子。这些氨基醇类脂质化合物可以与其他氨基醇类脂质化合物、聚合物(合成的或天然的)、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质、脂质、等等形成粒子。然后这些粒子可以任选地与药用赋形剂结合而形成药物组合物。
美国专利公开号20110293703也提供了制备氨基醇类脂质化合物的方法。使胺的一种或多种等效物与环氧化物封端化合物的一种或多种等效物在适当条件下反应而形成本发明的氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，胺的所有氨基基团与环氧化物封端化合物充分反应而形成叔胺。在其他实施例中，胺的所有氨基基团未与环氧化物封端化合物完全反应形成叔胺，由此生成在氨基醇类脂质化合物中的伯胺或仲胺。这些伯胺或仲胺照原样留下或者可以与另一种亲电体如一种不同的环氧化物封端化合物反应。正如本领域技术人员将理解的，胺与未过量的环氧化物封端化合物反应将产生多种不同的具有不同数目的尾部的氨基醇类脂质化合物。某些胺类可以用两个环氧化物衍生的化合物尾部将其完全功能化，而其他分子用环氧化物衍生的化合物尾部将不会被完全功能化。例如，二胺或多胺可包括离开该分子的不同氨基部分的一个、二个、三个、或四个环氧化物衍生的化合物尾部，从而产生伯胺、仲胺、和叔胺。在某些实施例中，并不是所有氨基基团都被完全功能化。在某些实施例中，使用相同类型的环氧化物封端化合物中的两种。在其他实施例中，使用两种或更多种不同的环氧化物封端化合物。氨基醇类脂质化合物的合成是用或不用溶剂进行的，并且该合成可以在范围从30℃-100℃，优选在大致50℃-90℃的较高温度下进行。任选地，可以将制备的氨基醇类脂质化合物纯化。例如，可以纯化氨基醇类脂质化合物的混合物而产生具有特定数目的、环氧化物衍生的化合物尾部的氨基醇类脂质化合物。或者，该混合物可以被纯化而产生特定的立体异构体或区域异构体。也可以使用烷基卤化物(例如，碘甲烷)或其他烷化剂将这些氨基醇类脂质化合物烷化，和/或它们可以被酰化。
美国专利公开号20110293703还提供了通过发明方法制备的氨基醇类脂质化合物的文库。使用涉及液体处理器、机器人、微量滴定板、计算机、等等的高通量技术，可以制备和/或筛选这些氨基醇类脂质化合物。在某些实施例中，筛选了这些氨基醇类脂质化合物的将多核苷酸或其他药剂(例如，蛋白质、肽、小分子)转染到细胞中的能力。
美国专利公开号20130302401涉及已经使用组合聚合制备的一类聚(β-氨基醇)(PBAAs)。这些发明的PBAA可以在生物技术和生物医学应用中用作涂层(如用于医疗装置或植入物的薄膜或多层薄膜的涂层)、添加剂、材料、赋形剂、生物防污剂(non-biofoulingagent)、微图像化剂(micropatterning agent)、以及细胞封装剂(cellularencapsulation agent)。当用作表面涂层时，这些PBAA在体外和体内均引出不同水平的炎症，这取决于它们的化学结构。这类材料的巨大化学多样性允许我们鉴定出体外抑制巨噬细胞激活的聚合物涂层。此外，在羧化聚苯乙烯微粒的皮下移植之后，这些涂层减少了炎症细胞的募集，并且减轻了纤维化。这些聚合物可以用来形成用于细胞封装的聚电解质复合物胶囊。本发明还可具有许多其他的生物应用，如抗微生物涂层、DNA或siRNA递送、以及干细胞组织工程。美国专利公开号20130302401的传授内容可以适用于本发明的CRISPR Cas系统。
在另一个实施例中，考虑了脂质纳米粒子(LNP)。抗转甲状腺素蛋白小干扰RNA已经被封装在脂质纳米粒子中并且被递送到人体内(参见，例如，科尔贺(Coelho)等人，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)2013；369:819-29)，并且这样一种系统可以适用于并且应用于本发明的CRISPRCas系统。考虑到静脉内给予约0.01到约1mg/kg体重的剂量。考虑了降低输注相关反应的风险的用药，如考虑到地塞米松、对乙酰氨基酚(acetampinophen)、苯海拉明或西替利嗪、以及雷尼替丁。考虑了约0.3mg/千克的多剂量，每4周一次，五个剂量。
LNP已经显示在将siRNA递送到肝脏中是高度有效的(参见，例如，塔韦内罗(Tabernero)等人，《癌症发现》(Cancer Discovery)，2013年4月，第3卷，第4期，第363-470页)，并且因此被考虑用于递送编码CRISPRCas的RNA到肝脏。考虑了6mg/kg的LNP的约四个剂量的用量，每两周一次。塔韦内罗(Tabernero)等人证明，在以0.7mg/kg给予LNP的前2个周期之后，观察到肿瘤消退，并且在6个周期结束之后，患者已经实现了部分应答，具有淋巴结转移完全消退以及肝脏肿瘤的显著萎缩。在此患者中给予40个剂量之后获得完全应答，在接受经过26个月的剂量之后其保持缓解和完全治疗。具有RCC和在用VEGF途径抑制剂进行的在先治疗之后进展的包括肾脏、肺、以及淋巴结在内的肝外部位疾病的两位患者在所有部位的疾病都保持稳定大约8到12个月，并且一位具有PNET和肝转移的患者继续在18个月(36个剂量)的延伸研究中保持疾病稳定。
]然而，必须将LNP的电荷考虑在内。当阳离子脂质与带负电的脂质结合时，诱导促进细胞内递送的非双层结构。由于带电荷的LNP在静脉注射之后迅速从循环中清除，开发了具有低于7的pKa值的可电离阳离子脂质(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。带负电荷的聚合物如RNA可以低pH值(例如，pH 4)加载到LNP中，在此pH时可电离脂质展示出正电荷。然而，在生理学pH值时，LNP展现出与更长的循环时间相容的低表面电荷。已经关注了四种可电离阳离子脂质，即1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)、以及1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)。已经表明，含有这些脂质的LNP siRNA系统在体内肝细胞中展现出显著不同的基因沉默特性，具有根据采用因子VII基因沉默模型的DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP系列而变化的潜能(参见，例如，罗辛(Rosin)等人，《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。可以考虑LNP或者在LNP中的或与LNP相关的CRISPR-Cas RNA的1μg/ml的剂量，尤其是对于含有DLinKC2-DMA的配制品而言。
LNP的制备和CRISPR Cas封装可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(Molecular Therapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月)。阳离子脂质1,2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油基氧基酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2″-(甲氧基聚乙二醇2000)琥珀酰]-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-二醇(PEG-S-DMG)、以及R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)可以由Tekmira制药公司(Tekmira Pharmaceuticals)(温哥华，加拿大)提供或者合成。胆固醇可以购自西格玛公司(圣路易斯，密苏里州)。特异性CRISPR Cas RNA可以封装在含有DLinDAP、DLinDMA、DLinK-DMA、和DLinKC2-DMA的LNP中(阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEGS-DMG或PEG-C-DOMG的摩尔比为40:10:40:10)。在需要时，可以结合0.2％SP-DiOC18(英杰公司，伯灵顿，加拿大)来评估细胞摄取、细胞内递送、和生物分布。通过将由阳离子脂质:DSPC:胆固醇:PEG-c-DOMG(40:10:40:10摩尔比)组成的混合物溶解在乙醇中直到最终脂质浓度为10mmol/l来进行封装。可以将脂质的这种乙醇溶液逐滴加入到pH 4.0的50mmol/l柠檬酸盐中而形成多层囊泡，从而产生30％(vol/vol)乙醇的最终浓度。在使用挤出机(北方脂质公司(NorthernLipids)，温哥华，加拿大)通过两个重叠的80nm Nuclepore聚碳酸酯滤膜挤出多层囊泡之后，可以形成大的单层囊泡。可以通过如下步骤实现封装：将溶解在含有30％乙醇(vol/vol)的pH 4.0的50mmol/l柠檬酸盐中的2mg/ml的RNA逐滴加入到挤出的形成的大单层囊泡中，并且在31℃孵育30分钟，伴随持续混合直到最终的RNA/脂质重量比为0.06/1(wt/wt)。通过使用Spectra/Por 2再生纤维素透析膜在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析16小时进行乙醇的去除以及配制缓冲液的中和。使用NICOMP 370型粒径分析仪、囊泡/强度模式、以及高斯拟合，通过动态光散射，可以测定纳米粒子粒径分布(Nicomp粒径分析仪公司，圣巴巴拉市，加利福尼亚州)。对于所有三个LNP系统的粒径可以是约70nm的直径。可以通过使用VivaPureD MiniH柱(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(Sartorius Stedim Biotech))从分析前后收集的样品中去除游离RNA来确定RNA封装效率。从洗脱的纳米粒子提取封装的RNA并且将其在260nm定量。通过使用来自美国瓦克化学公司(Wako Chemicals USA)(里士满(Richmond)，弗吉尼亚州)的胆固醇E酶法测定法测量囊泡中的胆固醇含量，确定了RNA与脂质的比率。与本文关于LNP和PEG脂质的讨论结合，聚乙二醇化的脂质体或LNP同样适于递送CRISPR-Cas系统或其组分。
大LNP的制备可以使用/和或改编自罗辛(Rosin)等人的《分子治疗》(MolecularTherapy)，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月。可以在含有50:10:38.5的摩尔比的DLinKC2-DMA、DSPC、和胆固醇的乙醇中制备脂质预混物溶液(20.4mg/ml总脂质浓度)。可以按照0.75:1的摩尔比(乙酸钠:DLinKC2-DMA)将乙酸钠添加到脂质预混物中。随后可以通过将该混合物与1.85倍体积的柠檬酸盐缓冲液(10mmol/l，pH 3.0)在剧烈搅拌下合并而使脂质水合，从而导致在含有35％的在水性缓冲液中的自发脂质体形成。可以在37℃孵育该脂质体溶液以允许粒径的时间依赖性增加。可以通过动态光散射(纳米粒径电位分析仪(Zetasizer Nano ZS)，马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，乌斯特郡(Worcestershire)，英国)在孵育的不同时间去除等分试样以研究脂质体大小的变化。一旦实现所希望的粒径，可以将水性PEG脂质溶液(储备溶液＝在35％(vol/vol)乙醇中的10mg/ml PEG-DMG)添加到该脂质体混合物中，以便产生3.5％总脂质的最终PEG摩尔浓度。在添加PEG-脂质之后，这些脂质体应该其大小，有效抑制进一步生长。然后以大约1:10(wt:wt)的RNA与总脂质比率将RNA添加到空脂质体，然后在37℃孵育30分钟以形成加载的LNP。随后将该混合物在PBS中透析过夜，并且用0.45-μm的注射器过滤器。
球形核酸(SNATM)构建体和其他纳米粒子(尤其是金纳米粒子)也被考虑为将CRISPR-Cas系统递送到预期靶标的手段。重要数据表明，基于核酸功能化的金纳米粒子的AuraSense治疗性球形核酸(SNATM)构建体是有用的。
可以与本文的教导结合使用的文献包括：卡特勒(Cutler)人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2011 133:9254-9257，郝(Hao)等人，Small.2011 7:3158-3162，张(Zhang)等人，《ACS纳米》(ACS Nano.)2011 5:6962-6970，卡特勒(Cutler)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012 134:1376-1391，杨(Young)等人，《纳米通讯》(Nano Lett.)2012 12:3867-71，郑(Zheng)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2012 109:11975-80，米尔金(Mirkin)，《纳米医学》(Nanomedicine)2012 7:635-638张(Zhang)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)2012 134:16488-1691，因特劳布(Weintraub)，《自然》(Nature)2013 495:S14-S16，崔(Choi)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)2013 110(19):7625-7630，詹森(Jensen)等人，《科学转化医学》(Sci Transl Med)5，209ra152(2013)以及米尔金(Mirkin)等人，Small,10:186-192。
具有RNA的自组装纳米粒子可以用被聚乙二醇化的聚乙烯亚胺(PEI)进行构建，其中Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体附接在聚乙二醇(PEG)的远端。例如，这一系统已经被用作靶向表达整合素的肿瘤新血管系统和递送抑制血管内皮生长因子受体2(VEGF R2)表达以及由此实现抑制肿瘤血管发生的siRNA的手段(参见，例如，施弗勒斯(Schiffelers)等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，2004，第32卷，第19期)。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。设想了CRISPR Cas的约100到200mg的剂量，用于施弗勒斯(Schiffelers)等人的自组装纳米粒子中的递送。
巴特利特(Bartlett)等人的纳米束(PNAS，2007年9月25日，第104卷，第39期)也可以应用于本发明。通过将等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液混合从而产生在2到6范围上的可电离氮(聚合物)相比磷酸盐(核酸)的净摩尔过量，从而制备巴特利特(Bartlett)等人的纳米束。在阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致聚复合物的形成，其具有约100nm的平均粒径分布，此后称为纳米束。巴特利特(Bartlett)等人的DOTA-siRNA合成如下：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHSester)订购自Macrocyclics公司(达拉斯(Dallas)，德克萨斯州)。将碳酸盐缓冲液(pH 9)中的具有100倍摩尔过量的DOTA-NHS-酯的胺修饰的RNA有义链加入到微量离心管中。通过在室温搅拌4小时使这些内容物反应。将该DOTA-RNA有义缀合物用乙醇沉淀，重新悬浮在水中，并且退火到未修饰的反义链上而产生DOTA-siRNA。所有液体用Chelex-100(伯乐公司，赫库斯(Hercules)，加利福尼亚州)预处理，以便去除微量金属污染物。通过使用含有环糊精的聚阳离子可以形成Tf靶向和非靶向的siRNA纳米粒子。典型地，纳米粒子以3(+/-)的进料比和0.5g/升的siRNA浓度在水中形成。用Tf(金刚烷-PEG-Tf)修饰在靶向纳米粒子表面上的百分之一的金刚烷-PEG分子。将纳米粒子悬浮在用于注射的5％(wt/vol)的葡萄糖载体溶液中。
戴维斯(Davis)等人(《自然》，第464卷，2010年4月15日)使用靶向的纳米粒子递送系统进行了RNA临床试验(临床试验登记号NCT00689065)。在21天周期的第1、3、8和10天通过30分钟的静脉输注对患有标准护理治疗难治的实体癌的患者给予靶向纳米粒子剂量。这些纳米粒子包含合成递送系统，该系统含有：(1)线性的、基于环糊精的聚合物(CDP)，(2)展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白蛋白(TF)靶向配体，(3)亲水聚合物(用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))，以及(4)被设计为降低RRM2(在临床中使用的序列，先前表示为siR2B+5)表达的siRNA。TFR已经久为所知在恶性细胞中被下调，并且RRM2是一种确立的抗癌靶标。已经显示这些纳米粒子(临床版本表示为CALAA-01)在非人类灵长动物中的多剂量研究中良好耐受。虽然已经通过脂质体递送向患有慢性粒细胞白血病的单一患者给予了siRNA，但是戴维斯等人的临床试验是初期人类试验，该试验用一个靶向的递送系统全身性地递送siRNA并且治疗患有实体癌的患者。为了确定该靶向的递送系统是否能够将功能性siRNA有效递送到人类肿瘤，戴维斯等人研究了来自三个不同的剂量组群的三位患者的活组织检查；患者A、B和C均患有转移性黑素瘤并且分别接受了18、24和30mg m-2siRNA的CALAA-01剂量。还可以针对本发明的CRISPR Cas系统考虑相似的剂量。用含有一种线性的基于环糊精的聚合物(CDP)、一种展示在纳米粒子的外部上的用于接合癌细胞表面上的TF受体(TFR)的人转铁蛋白(TF)靶向配体和/或一种亲水聚合物(例如，用来促进在生物流体中的纳米粒子稳定性的聚乙二醇(PEG))的纳米粒子，可以实现本发明的递送。
粒子递送系统和/或配制品：
已知一些类型的粒子递送系统和/或配制品在不同种类的生物医学应用中是有用的。总体上，粒子被定义为小物体，该物体在其运输和特性方面以整体单元表现。将粒子根据直径进一步分类。粗粒子覆盖2,500与10,000纳米之间的范围。细粒子的尺寸在100与2,500纳米之间。超细粒子、或纳米粒子的大小通常是在1和100纳米之间。100-nm极限的基础是以下事实：使粒子区分于大块材料的新颖特性典型地是在100nm之下的临界长度规模下显现的。
如在此所使用的，粒子递送系统/配制品被定义为任何包括根据本发明的粒子的生物学递送系统/配制品。根据本发明的粒子是任何具有小于100微米(μm)的最大尺寸(例如直径)的实体。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于10μm的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于2000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于1000纳米(nm)的最大尺寸。在一些实施例中，本发明的粒子具有小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、或100nm的最大尺寸。典型地，本发明的粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有250nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有200nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有150nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施例中，本发明的粒子具有100nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在本发明的一些实施例中使用更小的粒子(例如，具有50nm或更小的最大尺寸)。在一些实施例中，本发明的粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。
粒子表征(包括，例如表征形态、尺寸、等)是使用各种不同的技术进行的。通用技术是电子显微术(TEM、SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、X-射线光电子光谱法(XPS)、粉末X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、紫外-可见光谱法、双偏振干涉法以及核磁共振(NMR)。表征(尺寸测量)可以针对天然粒子(即预加载)或在加载负荷物(在此负荷物指代例如CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA、或其任何组合，并且可以包括另外的载体和/或赋形剂)后进行，以提供具有最适大小的粒子以用于任何本发明的体外、离体和/或体内施用的递送。在某些优选实施例中，粒子尺寸(例如，直径)表征是基于使用动态激光散射(DLS)的测量。可提及的是美国专利号8,709,843；美国专利号6,007,845；美国专利号5,855,913；美国专利号5,985,309；美国专利号5,543,158；以及詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(Carmen Barnes)等人在《自然纳米技术》(NatureNanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84，以上文献涉及粒子、制造和使用它们的方法及其测量。
在本发明的范围内的粒子递送系统可以按任何形式提供，包括但不限于固体、半固体、乳液、或胶体粒子。这样可以将在此描述的任何递送系统，包括但不限于例如基于脂质的系统、脂质体、胶束、微泡、外泌体、或基因枪，提供为在本发明的范围内的粒子递送系统。
纳米粒子
就本发明而言，优选的是使用纳米粒子或脂质包膜递送CRISPR复合物的一种或多种组分例如CRISPR酶或mRNA或指导RNA。其他递送系统或载体可以结合本发明的纳米粒子方面使用。
通常，“纳米粒子”是指任何具有小于1000nm的直径的粒子。在某些优选实施例中，本发明的纳米粒子具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在25nm与200nm之间的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有100nm或更小的最大尺寸。在其他优选实施例中，本发明的纳米粒子具有范围在35nm与60nm之间的最大尺寸。
包含于本发明中的纳米粒子可以提供为不同形式，例如提供为固体纳米粒子(例如，金属如银、金、铁、钛，非金属，基于脂质的固体，聚合物)、纳米粒子悬浮液、或其组合。可以制备金属纳米粒子、介电纳米粒子和半导体纳米粒子连同混合结构(例如，核-壳纳米粒子)。由半导体材料制成的纳米粒子也可以经量子点标记，如果它们足够小(典型地低于10nm)使得电子能级的量子化发生的话。此类纳米级粒子作为药物载体或成像剂用于生物医学应用中，并且可以被适配为用于本发明中的相似目的。
半-固体和软纳米粒子已经制造出，并且是在本发明的范围内。具有半-固体性质的原型纳米粒子是脂质体。各种类型的脂质体纳米粒子目前在临床上用作用于抗癌药物和疫苗的递送系统。一半亲水并且另一半疏水的纳米粒子称为杰那斯(Janus)粒子，并且对于稳定乳液是特别有效的。它们可以在水/油界面处自组装，并且充当固体表面活性剂。
美国专利号8,709,843(通过引用结合在此)提供了用于将包含治疗剂的粒子靶向递送至组织、细胞和细胞内隔室的药物递送系统。本发明提供了包含聚合物的靶向粒子，该聚合物缀合至表面活性剂、亲水聚合物或脂类。
通过引用结合在此的美国专利号6,007,845提供了以下粒子，这些粒子具有多嵌段共聚物的核，该多嵌段共聚物是通过将多官能化合物与一种或多种疏水聚合物和一种或多种亲水聚合物共价连接而形成的，并且这些粒子包含生物活性材料。
通过引用结合在此的美国专利号5,855,913提供了一种具有空气动力学上轻的粒子的微粒组合物，这些空气动力学上轻的粒子具有小于0.4g/cm3的振实密度，其平均直径在5μm与30μm之间，将一种表面活性剂结合在其表面以用于将药物递送至肺部系统。
通过引用结合在此的美国专利号5,985,309提供了以下粒子，这些粒子结合表面活性剂和/或带正电或负电的治疗剂或诊断剂和相反电荷带电分子的亲水或疏水复合物，以用于递送至肺部系统。
通过引用结合在此的美国专利号5,543,158提供了生物可降解的可注射纳米粒子，这些可注射纳米粒子具有生物可降解的固体核，该固体核在表面上包含生物活性材料和聚(亚烷基二醇)部分。
通过引用结合在此的WO 2012135025(也公开为US 20120251560)描述了缀合的聚乙烯亚胺(PEI)聚合物和缀合的氮杂-大环化合物(统称为“缀合的微脂体(lipomer)”或“微脂体”)。在某些实施例中，可设想此类缀合的微脂体可以在CRISPR-Cas系统的背景下使用，以实现体外、离体和体内基因组干扰以修饰基因表达，包括调节蛋白表达。
在一个实施例中，该纳米粒子可以是环氧化物-修饰的脂质-聚合物，有利地为7C1(参见，例如詹姆斯(James)E.达尔曼(Dahlman)和卡门巴尔内斯(Carmen Barnes)等人在《自然纳米技术》(Nature Nanotechnology)(2014)的公开物，在线公开于2014年5月11日，doi:10.1038/nnano.2014.84)。C71是通过使C15环氧化物终止的脂质与PEI600以14:1摩尔比进行反应来合成，并且与C14PEG2000配制以产生在PBS溶液中稳定持续至少40天的纳米粒子(直径在35与60nm之间)。
可以利用环氧化物-修饰的脂质-聚合物将本发明的CRISPR-Cas系统递送至肺部细胞、心血管细胞或肾细胞，然而本领域的技术人员可以调适该系统以递送到其他靶器官。设想了从约0.05至约0.6mg/kg的剂量范围。还设想了经数天或数周的剂量，其中总剂量为约2mg/kg。
外泌体
外泌体是转运RNA和蛋白质的并且可以向脑和其他靶器官中递送RNA的内源纳米囊泡。为了降低免疫原性，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人(2011，《自然生物技术》29:341)使用了用于外泌体产生的自我衍生的树突细胞。通过将树突细胞工程化为表达Lamp2b(一种外泌体膜蛋白，融合到神经元特异性RVG肽上)而实现了靶向脑。通过电穿孔使纯化的外泌体加载外源RNA。静脉注射的RVG靶向的外泌体特异性地将GAPDH siRNA递送到脑中的神经元、小胶质细胞、少突神经胶质细胞，导致特异性的基因敲除。预暴露于RVG外泌体未减弱敲低，并且在其他组织中未观察到非特异性摄取。通过BACE1的强的mRNA(60％)和蛋白质(62％)敲低证明了外泌体介导的siRNA递送的治疗潜能，BACE1是一种阿尔茨海默病中的治疗靶标。
为了获得免疫惰性的外泌体池，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人收获了来自具有同源主要组织相容性复合体(MHC)单体型的近交C57BL/6小鼠的骨髓。由于未成熟树突细胞产生大量的缺乏T细胞激活剂如MHC-II和CD86的外泌体，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人选择具有粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的树突细胞持续7天。次日，使用良好建立的超速离心方案从培养上清从纯化外泌体。这些产生的外泌体在物理上是同质的，具有直径为80nm的粒径分布峰，正如通过纳米粒子跟踪分析(NTA)和电子显微镜检查所测定。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人获得了6-12μg的外泌体(基于蛋白质浓度测量的)/每106个细胞。
其次，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人研究了使用适用于纳米级应用的穿孔方案给修饰的外泌体加载外源负荷的可能性。由于电穿孔对于纳米级的膜粒子尚未良好表征，使用非特异性Cy5标记的RNA用于电穿孔方案的经验优化。在外泌体超速离心和溶解之后测定了封装的RNA的量。在400V和125μF的电穿孔导致RNA的最好保留并且用于所有的后续实验。
阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)向正常C57BL/6小鼠给予被包封在150μg的RVG外泌体中的150μg的每种BACE1siRNA并且将敲低效率与四个对照进行比较：未处理的小鼠、仅仅用RVG外泌体注射的小鼠，用与一种体内阳离子脂质体试剂络合的BACE1siRNA注射的小鼠、以及用与RVG-9R络合的BACE1siRNA注射的小鼠，该RVG肽与静电结合到siRNA上的9个D-精氨酸缀合。在给药之后3天，分析皮层组织样品，并且在siRNA-RVG-9R处理的和siRNARVG外泌体处理的小鼠中均观察到显著的蛋白质敲低(45％，P<0.05，相对于62％，P<0.01)，这是由于显著的BACE1mRNA水平降低(分别为66％[+或-]15％，P<0.001以及61％[+或-]13％，P<0.01)。而且，申请人证明了在RVG-外泌体处理的动物中在总[β]-淀粉样蛋白1-42水平上的显著降低(55％，P<0.05)，其中β淀粉样蛋白为一种在阿尔茨海默病理学中的淀粉样斑块的主要成分。所观察到的降低大于在心室内注射BACE1抑制剂之后的正常小鼠中证明的β淀粉样蛋白1-40降低。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)在BACE1切割产物上进行了5'-cDNA末端快速扩增(RACE)，其提供了经由siRNA的RNAi介导的敲低的证据。
最后，阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人通过评定IL-6、IP-10、TNFα和IFN-α血清浓度研究了RNA-RVG外泌体是否诱导了体内免疫反应。在外泌体处理之后，类似于与有力地刺激IL-6分泌的siRNA-RVG-9R相反的siRNA转染试剂处理，登记了在所有细胞因子上的非显著性变化，证实了该外泌体处理的免疫惰性属性。假定外泌体仅仅封装20％的siRNA，用RVG-外泌体递送比RVG-9R递送显得更有效，因为用少五倍的siRNA实现了相当的mRNA敲低和更好的蛋白质敲低，而没有相应水平的免疫刺激。这个实验证明了RVG-外泌体技术的治疗潜力，其潜在地适合于与神经退行性疾病相关的基因的长期沉默。阿尔瓦雷斯-尔维蒂(Alvarez-Erviti)等人的外泌体递送系统可以用于将本发明的CRISPR-Cas系统递送至治疗靶标，尤其是神经退行性疾病。对于本发明可以考虑封装在约100到1000mg的RVG外泌体中的约100到1000mg的CRISPR Cas的剂量。
艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人(《自然－实验手册》(Nature Protocols)7,2112-2126(2012))披露了可以如何利用来源于培养的细胞的外泌体用于体外和体内递送RNA。这个方案首先描述了通过转染一种包含与肽配体融合的外泌体蛋白的表达载体的靶向外泌体的产生。其次，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人解释了如何纯化和表征来自转染的细胞上清液的外泌体。接着，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人详述了将RNA加载到外泌体中的关键步骤。最后，艾尔·安达卢西(El-Andaloussi)等人概述了如何使用外泌体有效体外递送RNA以及体内递送到小鼠脑中。还提供了预期结果的实例，其中外泌体介导的RNA递送通过功能分析和成像而评估。整个方案进行约3周。根据本发明的递送或给药可以使用从自我衍生的树突细胞产生的外泌体来进行。根据本文的教导，这可以在本发明的实践中采用。
在另一个实施例中，考虑了瓦尔格伦(Wahlgren)等人的血浆外泌体(《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，2012年，第40卷，第17期，e130)。外泌体是由包括树突细胞(DC)、B细胞、T细胞、肥大细胞、上皮细胞和肿瘤细胞在内的许多细胞类型产生的纳米囊泡(30-90nm大小)。这些囊泡通过晚期核内体的向内出芽而形成，并且然后在与质膜融合后释放到细胞外环境中。由于外泌体天然地在细胞之间运送RNA，这种特性在基因治疗中可以是有用的，并且根据本披露可以用于本发明的实践中。
来自血浆的外泌体可以通过如下制备：在900g离心血沉棕黄层持续20分钟以便分离血浆，之后收获细胞上清液，在300g离心10分钟以便去除细胞，并且在16 500g离心30分钟，之后通过0.22mm过滤器进行过滤。通过在120 000g离心70分钟使外泌体沉淀。根据在RNAi人/小鼠启动试剂盒(Quiagen，希尔顿(Hilden)，德国)中的制造商的说明进行siRNA到外泌体中的化学转染。siRNA以终浓度2mmol/ml添加到100mlPBS中。在加入HiPerFect转染试剂之后，将该混合物在室温下孵育10分钟。为了去除过量的胶束，使用醛/硫酸盐乳胶珠再分离外泌体。可以类似于siRNA进行CRISPR Cas到外泌体中的化学转染。外泌体可以与从健康供体的外周血中分离的单核细胞和淋巴细胞共培养。因此，可以考虑的是，可以将含有CRISPR Cas的外泌体引入人单核细胞和淋巴细胞中并且以自体方式再引入。因此，可以使用血浆外泌体进行根据本发明的递送或给药。
脂质体
可以用脂质体进行根据本发明的递送或给药。脂质体是球形囊泡结构，其组成为围绕内部水性区室的单层或多层脂质双层以及相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层。脂质体作为药物递送载体受到了相当的重视，因为它们是生物相容、无毒的，可以递送亲水和亲脂性药物分子，包护它们的负荷物免于被血浆酶降解，并且运送它们的负荷跨过生物膜和血脑屏障(BBB)(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。
可以从几种不同类型的脂质制造脂质体；然而，磷脂最常用来产生作为药物载体的脂质体。虽然当脂质膜与一种水性溶液混合时脂质体形成是自发的，但也可通过使用一个均质机、超声发生器、或挤出设备以振摇的形式施加力使其加速(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。
可以将几种其他的添加剂添加到脂质体，以便修饰其结构和特性。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质体混合物中，以便帮助稳定脂质体结构并且防止脂质体内部负荷物的泄漏。此外，从氢化卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇、和磷酸二鲸蜡脂制备脂质体，并且脂质体的平均囊泡大小被调整到约50至100nm。(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。
脂质体配制品主要可以由天然磷脂和脂质如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷酯构成。由于这种配制品仅仅由磷脂组成，脂质体配制品已经遇到了许多挑战，其中之一是在血浆中的不稳定性。已经作出战胜这些挑战的若干尝试，特别是在脂质膜的处理方面。这些尝试之一集中于胆固醇的处理。将胆固醇添加到常规配制品中减缓了封装的生物活性化合物到血浆中的迅速释放，或者添加1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加稳定性(对于评述，参见，例如，斯普奇(Spuch)和纳瓦罗(Navarro)《药物递送杂志》(Journal of Drug Delivery)，2011卷，文献标识码469679，第12页，2011.doi:10.1155/2011/469679)。
在一个特别有利的实施例中，特洛伊木马(Trojan Horse)脂质体(也称为分子木马)是令人希望的并且方案可见于http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long。这些粒子允许转基因在血管内注射之后递送到整个脑。不受到限制，表面结合有特异性抗体的中性脂质粒子允许经由胞吞作用跨过血脑屏障。申请人假定利用特洛伊木马脂质体将核酸酶的CRISPR家族经由血管内注射递送到脑，这将允许全脑转基因动物，而不需要胚胎操作。对于在脂质体中的体内给药，可以考虑约1-5g的DNA或RNA。
在另一个实施例中，该CRISPR Cas系统可以在脂质体中给药，如一种稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)(参见，例如，莫里西(Morrissey)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)，第23卷，第8期，2005年8月)。考虑了约1、3或5mg/kg/天的靶向SNALP中的特异性CRISPR Cas的每日静脉注射。日治疗可以经过约三天，然后每周治疗持续约五周。在另一个实施例中，还考虑了通过以约1或2.5mg/kg的剂量静脉注射给药的封装有特异性CRISPR Cas的SNALP(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(NatureLetters)，第441卷，2006年5月4日)。该SNALP配制品可含有以2:40:10:48的摩尔百分比的脂质3-N-[(w甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基-丙胺(PEG-C-DMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇，(参见，例如，齐默尔曼(Zimmerman)等人，《自然通讯》(Nature Letters)，第441卷，2006年5月4日)。
在另一个实施例中，已经证明稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)将分子有效递送到高度血管化的HepG2-衍生的肝脏肿瘤，但是不递送到血管化不良的HCT-116衍生的肝脏肿瘤(参见，例如，李(Li)，《基因治疗》(Gene Therapy)(2012)19，775-780)。可以通过如下制备这些SNALP脂质体：使用25:1的脂质/siRNA比率和48/40/10/2的胆固醇/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA的摩尔比，用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和siRNA配制D-Lin-DMA和PEG-C-DMA。生成的SNALP脂质体在大小上为约80-100nm。
在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids公司，阿拉巴斯特(Alabaster)，阿拉巴马州，美国)、3-N-[(w-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基胺、和阳离子的1,2-二亚油基氧基-3-N,N二甲基氨基丙烷(参见，例如，盖斯伯特(Geisbert)等人，《柳叶刀》(Lancet)2010；375:1896-905)。例如可以考虑静脉推注给予约2mg/kg总CRISPR Cas/剂的剂量。
在又另一个实施例中，SNALP可以包含合成胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC；Avanti Polar Lipids公司)、PEG-cDMA、和1,2-二亚油基氧基-3-(N；N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMA)(参见，例如，贾奇(Judge)，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)119:661-673(2009))。用于体内研究的配制品可包含约9:1的最终脂质/RNA质量比。
]已经由阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)的巴洛斯(Barros)和格罗布(Gollob)评论了RNAi纳米药物的安全性(参见，例如，《先进药物递送评论》(Advanced Drug Delivery Reviews)64(2012)1730-1737)。稳定的核酸脂质粒子(SNALP)由四种不同的脂质构成—一种在低pH时为阳离子的可电离脂质(DLinDMA)、一种中性辅助脂质、胆固醇、和一种可扩散的聚乙二醇(PEG)-脂质。该粒子直径大约为80nm并且在生理pH时是电中性的。在配制过程中，该可电离脂质用于在粒子形成过程中使脂质与阴离子RNA缩合。当在渐增的酸性内体条件下带正电荷时，该可电离的脂质还介导了SNALP与内体膜的融合，从而使得能够将RNA释放到细胞质中。该PEG-脂质在配制过程中使该粒子稳定并且减少聚集，随后提供中性的亲水性外部，以改进药代动力学特性。
到目前为止，已经使用具有RNA的SNALP配制品开始两个临床项目。Tekmira制药公司最近完成了SNALP-ApoB在具有增高的LDL胆固醇的成年志愿者中的I期单剂量研究。ApoB主要在肝脏和空肠中表达，并且对于VLDL和LDL的组装和分泌是必需的。十七位受试者接受了SNALP-ApoB的单剂量(跨7个剂量水平的剂量递增)。没有肝脏毒性(预期为基于临床前研究的潜在剂量限制性毒性)的证据。处于最高剂量的(两位中的)一位受试者经历了与免疫系统刺激一致的流感样症状，于是做出结束该试验的决定。
阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)已经类似地推出了ALN-TTR01，其采用上述SNALP技术并且靶向突变体和野生型TTR的肝细胞产生，从而治疗TTR淀粉样变性(ATTR)。已经描述了三个ATTR综合征：家族性淀粉样多发性神经病变(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)-两者均由TTR中的常染色体显性突变引起；以及由野生型TTR引起的老年全身性淀粉样变性(SSA)。最近在具有ATTR的患者中完成了ALN-TTR01的安慰剂对照单剂量递增I期试验。向31位患者(23位用研究药物，8位用安慰剂)在0.01到1.0mg/kg(基于siRNA)的剂量范围内以15分钟静脉内输注给予ALN-TTR01。治疗耐受良好，其中在肝功能试验中没有显著增加。在≥0.4mg/kg时在23位患者的3位中注意到输注相关反应；对所有患者均做出减慢输注速率的反应并且所有患者继续参与研究。在处于1mg/kg的最高剂量(如根据临床前和NHP研究预期的)的两位患者中注意到血清细胞因子IL-6、IP-10和IL-1ra的最小与瞬时升高。在1mg/kg时观察到ALN-TTR01的预期药理效应，即，血清TTR的降低。
在又另一个实施例中，可以通过将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以40:10:40:10的摩尔比分别溶解在例如乙醇中来制作SNALP(参见，森普尔(Semple)等人，《自然生物技术》(Nature Niotechnology)，第28卷，第2期，2010年2月，第172-177页)。将该脂质混合物添加到水性缓冲液中(50mM柠檬酸盐，pH 4)，混合至最终的乙醇和脂质浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/ml，允许在22℃平衡2分钟，然后挤出。使用Lipex挤出仪(北方脂质公司(Northern Lipids))，在22℃将水合脂质通过两层80nm孔径大小的过滤器(Nuclepore)直到获得70-90nm直径的囊泡时为止，正如通过动态光散射分析测定的。这大致需要1-3次通过。将该siRNA(溶解在50mM柠檬酸盐中，pH为4的含有30％乙醇的水溶液)以约5ml/min的速率在混合下添加到预平衡的(35℃)囊泡中。在达到0.06(wt/wt)的最终靶siRNA/脂质比率之后，将该混合物在35℃另外孵育30分钟，以允许囊泡重组和该siRNA的封装。然后去除乙醇并且通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl、3mM Na2HPO4、1mMKH2PO4，pH 7.5)替换外部缓冲液。使用控制的逐步稀释法工艺将siRNA封装在SNALP中。KC2-SNALP的脂质组分为以57.1:7.1:34.3:1.4的摩尔比使用的DLin-KC2-DMA(阳离子脂质)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC；Avanti Polar Lipids公司)、合成胆固醇(西格玛公司)和PEG-C-DMA。在形成加载的粒子后，将SNALP在PBS中透析并且在使用之前通过0.2μm的滤膜消毒过滤。平均粒径为75-85nm，并且将90％-95％的siRNA封装在脂质粒子内。用于体内测试的在配制品中的最终siRNA/脂质比率是大约0.15(wt/wt)。在使用之前即刻将含有因子VIIsiRNA的LNP-siRNA系统在无菌PBS中稀释到适当浓度，并且通过侧尾静脉以10ml/kg的总体积静脉内给药。这种方法和这些递送系统可以类推到本发明的CRISPR Cas系统。
其他脂质
其他阳离子脂质，如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)可以例如类似于SiRNA地用来封装CRISPRCas或其组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子(参见，例如，加雅拉曼(Jayaraman)，《德国应用化学》(Angew.Chem.Int.Ed.)2012，51，8529-8533)，并且因此可以在本发明的实践中采用。可以考虑具有下列脂质组成的预成型囊泡：分别处于摩尔比40/10/40/10的氨基脂质、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、胆固醇和(R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基碳酸酯(PEG-脂质)，以及大约0.05(w/w)的FVII siRNA/总脂质比率。为了确保在70-90nm范围内的窄粒径分布以及0.110+04(n＝56)的低多分散性指数，可以在添加CRISPR Cas RNA之前将粒子通过80nm的膜挤出达三次。可以使用含有高度有效的氨基脂质16的粒子，其中四种脂质组分16、DSPC、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比(50/10/38.5/1.5)可以被进一步优化，以增强体内活性。
迈克尔S D科尔曼(Michael S D Kormann)等人(“在小鼠中递送化学修饰的mRNA之后治疗蛋白的表达”(“Expression of therapeutic proteins after delivery ofchemically modified mRNAin mice”)：《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，第29卷，第154-157页，(2011))描述了脂质包膜用于递送RNA的用途。脂质包膜的用途在本发明中也是优选的。
在另一个实施例中，脂质可以与本发明的CRISPR Cas系统配制在一起而形成脂质纳米粒子(LNP)。脂质包括但不限于，DLin-KC2-DMA4、C12-200和辅助脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG，可以使用自发囊泡形成程序将其与CRISPR Cas而不是siRNA一起配制(参见，例如，Novobrantseva，《分子治疗-核酸》(Molecular Therapy-NucleicAcids)(2012)1，e4；doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以是约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。在DLin-KC2-DMA和C12-200脂质纳米粒子(LNP)的情况下，最终脂质:siRNA重量比可以分别是约12:1和9:1。配制品可以具有约80nm的平均粒径，具有>90％的包覆效率。可以考虑3mg/kg的剂量。
Tekmira公司在美国和国外具有一组针对LNP和LNP配制品的不同方面的大约95个同族专利(参见，例如，美国专利号7,982,027；7,799,565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，所有这些专利均可用于和/或适用于本发明。
该CRISPR Cas系统或其组分或对其进行编码一个或多个核酸分子可以封装在PLGA微球中进行递送，例如进一步描述于美国公开申请20130252281和20130245107以及20130244279(转让给ModernaTherapeutics公司)中，其涉及包含修饰的核酸分子的组合物的配制品方面，所述核酸分子可以编码蛋白质、蛋白质前体、或该蛋白质或蛋白质前体的部分或完全加工形式。该配制品具有50:10:38.5:1.5-3.0(阳离子脂质:融合脂质:胆固醇:PEG脂质)的摩尔比。该PEG脂质可以选自，但不限于PEG-c-DOMG、PEG-DMG。该融合脂质可以是DSPC。还参见，施鲁姆(Schrum)等人，“工程化核酸的递送和配制”(Delivery andFormulation of Engineered Nucleic Acids)，美国公开申请20120251618。
Nanomerics公司的技术着手解决针对广泛治疗学的生物利用度挑战，包括基于低分子量疏水药物、肽以及核酸(质粒、siRNA、miRNA)的治疗学。该技术已经证明了明显优势的特异性的给药途径包括口服途径、跨血脑屏障的运送、向实体瘤以及眼部的递送。参见，例如，马萨(Mazza)等人，2013，《ACS纳米》(ACS Nano.)2013年2月26日；7(2):1016-26；乌切克布(Uchegbu)和秀(Siew)，2013，《制药科学杂志》(J Pharm Sci.)102(2):305-10和拉拉特萨(Lalatsa)等人，2012，《控释杂志》(J Control Release)，2012年7月20日；161(2):523-36。
美国专利公开号20050019923描述了用于向哺乳动物身体递送生物活性分子例如多核苷酸分子、肽和多肽和/或药剂的阳离子树状聚合物。这些树状聚合物适合于将生物活性分子的递送靶向到例如肝、脾、肺、肾或心脏(或甚至脑)。树状聚合物是从简单的支化单体单元以逐步方式制备的3维大分子，其性质和功能性可以容易地进行控制和改变。经由向多功能核(发散式合成法)或朝向多功能核(收敛式合成法)重复加成结构单元(buildingblocks)而合成树状聚合物，并且结构单元的3维壳的各次加成导致更高级别的树状聚合物的形成。聚丙烯亚胺树状聚合物从二氨基丁烷核开始，通过对伯胺的丙烯腈的双迈克尔加成反应向其上添加两倍数目的氨基基团，继之为腈的氢化。这导致氨基基团的加倍。聚丙烯亚胺树状聚合物含有100％的可质子化氮以及高达64个末端氨基基团(5级，DAB 64)。可质子化基团常常为能够在中性pH时接受质子的胺基。树状聚合物作为基因递送剂的用途在很大程度上集中于聚酰胺-胺和含磷化合物的用途，其中胺/酰胺的混合物或N--P(O2)S分别作为缀合单元，没有报道关于更低级别的聚丙烯亚胺树状聚合物用于基因递送的用途的工作。还研究了作为pH敏感的控制释放系统的聚丙烯亚胺树状聚合物，其用于药物递送以及当被外周氨基酸基团化学修饰时用于它们的客体分子的封装。还研究了聚丙烯亚胺树状聚合物的细胞毒性和与DNA的相互作用以及DAB 64的转染效力。
美国专利公开号20050019923是基于与早期报道相反的观察：阳离子树状聚合物例如聚丙烯亚胺树状聚合物展示出适当的特性，如，特异性靶向和低毒性，其用于在生物活性分子如基因材料的靶向递送中使用。另外，阳离子树状聚合物的衍生物也展示出适当的用于生物活性分子的靶向递送的特性。还参见，《生物活性聚合物》(Bioactive Polymers)、美国公开申请20080267903，其披露了不同的聚合物，包括阳离子聚胺聚合物和树枝状聚合物，其显示具有抗增殖活性，并且因此可用于治疗其特征为不希望的细胞增殖的失调，如新生物和肿瘤、炎性失调(包括自身免疫性失调)、银屑病和动脉粥样硬化。这些聚合物可以作为活性剂单独使用、或者作为其他治疗剂(如药物分子或用于基因治疗的核酸)的递送载体。在这样的情况下，这些聚合物自身固有的抗肿瘤活性可以补足有待递送的药剂的活性。这些专利公开的披露可以与本文针对递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子的教导结合使用。
超电荷蛋白
超电荷蛋白是一类具有非常高的正或负理论净电荷的工程化的或天然存在的蛋白质并且可以用于递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。超负电荷蛋白和超正电荷蛋白两者都展示出显著的抵抗热诱导或化学诱导的聚集的能力。超正电荷蛋白还能够渗透哺乳动物细胞。使负荷物与这些蛋白质结合，如质粒DNA、RNA、或其他蛋白质，可使得这些大分子到体外和体内的哺乳动物细胞中的功能递送成为可能。刘大卫实验室(David Liu’s lab)在2007年报道了超电荷蛋白的建立和表征(劳伦斯(Lawrence)等人，2007，《美国化学会志》(Journal of the AmericanChemical Society)129，10110-10112)。
RNA和质粒DNA到哺乳动物细胞中的非病毒递送对于研究和治疗应用都是有价值的(阿肯克(Akinc)等人，2010，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)26，561-569)。纯化的+36GFP蛋白(或其他超正电荷蛋白)与RNA在适当的无血清培养基中混合并且允许在添加到细胞中之前复合。在这个阶段的血清的包含将会抑制超电荷蛋白-RNA复合物的形成和降低治疗效果。已经发现以下方案对于多种细胞系是有效的(麦克诺顿(McNaughton)等人，2009，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116)。然而，应当进行改变蛋白质和RNA剂量的先导实验来优化用于特异性细胞系的程序。
(1)在治疗前一天，以1x105个细胞/孔铺板于48孔板中。
(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的+36 GFP蛋白直到终浓度200nM。添加RNA到50nM的终浓度。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。
(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。
(4)在孵育+36 GFP和RNA之后，向细胞加入蛋白质-RNA复合物。
(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。
(6)在孵育之后，抽出培养基并且用20U/mL的肝素PBS洗涤三次。用含血清培养基另外孵育细胞48小时或更长，这取决于用于活性的试验。
(7)通过免疫印迹、qPCR、表型分析、或其他适当的方法分析细胞。
刘大卫实验室(David Liu’s lab)已经进一步发现+36 GFP在一些列细胞中是一种有效的质粒递送试剂。由于质粒DNA是一种比siRNA大的负荷物，有效复合质粒需要成比例地更大的+36 GFP蛋白。为了有效质粒递送，申请人已经开发了一种带有C末端HA2肽标签的+36 GFP变体，这种肽是一种已知的从流感病毒血凝素蛋白衍生的内体破坏肽。下列方案在多种细胞中是有效的，但是如上所述，建议针对特异性细胞系和递送应用优化质粒DNA的超电荷蛋白的剂量。
(1)在治疗前一天，以1x105/孔铺板于48孔板中。
(2)在治疗当天，在无血清的培养基中稀释纯化的蛋白直到终浓度2mM。加入1mg的质粒DNA。涡旋混合并且在室温孵育10分钟。
(3)在孵育过程中，抽吸培养基离开细胞并且再次用PBS洗涤。
(4)在孵育和质粒DNA之后，向细胞轻轻加入蛋白质-DNA复合物。
(5)将细胞与复合物在37℃孵育4小时。
(6)在孵育之后，抽出培养基并且用PBS洗涤。在含血清培养基中孵育细胞，并且另外孵育24-48小时。
(7)在适当时分析质粒递送(例如，通过质粒驱动的基因表达)。
还参见，例如，麦克诺顿(McNaughton)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)106，6111-6116(2009)；克罗尼肯(Cronican)等人，《ACS化学生物学》(ACS Chemical Biology)5，747-752(2010)；克罗尼肯(Cronican)等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)18，833-838(2011)；汤普森(Thompson)等人，《酶学方法》(Methods in Enzymology)503，293-319(2012)；汤普森(Thompson)D.B.，等人，《化学与生物学》(Chemistry&Biology)19(7)，831-843(2012)。超电荷蛋白的这些方法可以使用和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统的递送。吕博士(Dr.Lui)以及与本文的教导结合的本文的文献的这些系统可以用于递送一种或多种CRISPR Cas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。
可植入装置
在另一个实施例中，还考虑可植入装置用于递送该CRISPRCas系统或其一种或多种组分或对其进行编码的一个或多个核酸分子。例如，美国专利公开20110195123披露了一种可植入医用装置，其局部地并且在延长的时期内洗脱药物，包括几种类型的这种装置、实施的治疗方式和植入方法。该装置包含聚合物基材，例如，用作装置主体的基质、以及药物，并且在一些情况下包含另外的支架材料，如金属或另外的聚合物，以及增强可见度和成像的材料。可植入递送装置在提供局部的并且在延长的时期内的释放方面可以是有利的，其中药物直接释放到患病区域的细胞外基质(ECM)，所述患病区域如肿瘤、炎症、退化，或用于针对症状的目的，或者释放到受损的平滑肌细胞，或者用于预防。如上文披露的，一类药物是RNA，并且这个系统可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。在一些实施例中，植入方式为用于包括近距离放射疗法和针吸活组织检查在内的其他治疗的、当今开发和使用的现有植入程序。在这样的情况下，在本发明中描述的新植入物的尺寸类似于初始植入物。典型地在相同的治疗程序中植物很少的装置。
正如在美国专利公开20110195123中所述，提供了一种药物递送可植入或可插入系统，包括适用于空腔例如腹腔和/或其中药物递送系统未被锚定或附接的任何其他类型的给药，其包含生物稳定的和/或可降解的和/或生物可吸收的聚合物基材，其可以例如任选地是一种基质。应当指出的是术语“插入”也包括植入。该药物递送系统优选地被实施为如美国专利公开20110195123中描述的“装填器(Loder)”。
聚合物或多种聚合物是生物相容的，其结合一种药剂和/或多种药剂，使得药剂以控制的速率释放，其中该聚合物基材如基质的总体积，例如在一些实施例中是任选地并且优选地不大于容许达到该药剂的治疗水平的最大体积。作为非限制性实例，这样的体积优选在0.1m3至1000mm3的范围内，正如该药剂负荷的体积所要求的。该装填器任选地是更大的，例如当结合有一个其大小由功能性决定的装置时，例如而不限于，膝关节、宫内节育环或子宫颈环等等。
在一些实施例中，该药物递送系统(用于递送该组合物)被设计为优选地采用可降解聚合物，其中主要释放机制是本体溶蚀(Bulk erosion)；或者在一些实施例中，使用了不可降解的、或缓慢降解的聚合物，其中主要释放机制是扩散而不是本体溶蚀，使得外部部分用作一种膜，而其内部部分用作一种储药池，该储药池在一个延长的时期内(例如从约一周到约几个月)实际上不受环境的影响。还可以任选地使用具有不同释放机制的不同聚合物的组合。在总药物释放期的重要时段期间，在表面处的浓度梯度优选地被维持有效地恒定，并且因此扩散速率是有效地恒定的(称为“零模式”扩散)。关于术语“恒定”，它意指优选地维持在治疗效果的低阈值以上的扩散速率，但是可以仍然任选地具有初期突释的特征和/或可以波动，例如增加和降低到一定程度。该扩散速率优选地被如此维持一个延长的时期，并且它被考虑为相对于一定的水平是恒定的，以便优化治疗有效期，例如该有效沉默期。
该药物递送系统任选地并且优选地被设计为保护基于核苷酸的治疗剂免于降解，而不论化学性质或由于受试者体内的酶和其他因素的攻击。
如描述于美国专利公开20110195123中的该药物递送系统任选地与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法在该装置的植入之时和/或之后被操作，例如任选地包括但不限于热力加热和冷却、激光束和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置。
根据美国专利公开20110195123的以下实施例，用于局部递送的部位可以任选地包括其特征为高度异常的细胞增殖、受到抑制的细胞凋亡的靶部位，包括肿瘤、活动性和/或慢性炎症和感染，包括自身免疫性疾病状态、退化组织(包括肌肉和神经组织)、慢性疼痛、退行性部位，以及用于增强组织再生的骨折位置以及其他伤口位置，以及损伤的心肌、平滑肌和横纹肌。
用于植入该组合物的部位、或靶部位，优选地其特征为用于靶向局部递送的足够小的半径、面积和/或体积。例如，该靶部位任选地具有在从约0.1mm到约5cm范围内的直径。
该靶部位的位置优选地针对最大治疗效力而选择。例如，该药物递送系统的组合物(任选地与如上所述的用于植入的装置一起)任选地并且优选地被植入在肿瘤环境或与之相关的血供之内或者附近。
例如该组合物(任选地与该装置一起)任选地植入在胰脏、前列腺、乳房、肝脏之内或附近，通过乳头，在血管系统之内，等等。
靶位置任选地选自下组，该组由以下各项组成(仅仅作为非限制性实例，因为任选地在身体内的任何部位可以适合于植入一个装填器)：1.在退行性部位的脑，像在帕金森病或阿尔茨海默病中的基底神经节、白质和灰质；2.如在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的情况下的脊柱；3.预防HPV感染的子宫颈；4.活动性或慢性炎性关节；5.在银屑病情况下的真皮；6.用于止痛作用的交感神经部位和感觉神经部位；7.骨内植入；8.急性和慢性感染部位；9.阴道内；10.耳内--听觉系统、内耳的迷路、前庭系统；11.气管内；12.心内；冠状动脉、心外膜；13.膀胱；14.胆道系统；15.实质组织，包括且不限于肾脏、肝脏、脾脏；16.淋巴结；17.唾液腺；18.牙龈；19.关节内(进入关节)；20.眼内；21.脑组织；22.脑室；23.空腔，包括腹腔(例如但不限于，卵巢癌)；24.食管内以及25.直肠内。
任选地，该系统(例如含有该组合物的装置)的插入与向在该靶部位和该部位附近的ECM注射材料有关，从而影响该靶部位和这个部位附近的ECM中的局部pH和/或温度和/或影响该药物的扩散和/或药物动力学的其他生物因素。
任选地，根据一些实施例，所述药剂的释放可以与传感和/或激活器具相关联，这些器具通过激活和/或加速/减速的无创和/或微创方法和/或别的方法在插入之前和/或之时和/或之后被操作，所述方法包括激光束、放射、热力加热和冷却、和超声波，包括聚焦超声和/或RF(射频)方法或装置、以及化学激活剂。
根据美国专利公开20110195123的其他实施例，该药物优选地包括RNA，例如，对于局限性癌症情况，在乳房、胰脏、脑、肾脏、膀胱、肺、以及前列腺中，如下文所述。尽管用RNAi进行示例，但是许多药物可适用于封装在装填器中，并且可以与本发明相关联，只要这样的药物可以被封装在装填器基材(例如像一种基质)中即可，并且这种系统可以使用和/或适配来递送本发明的CRISPR Cas系统。
作为特殊应用的另一个实例，神经肌肉退行性疾病由于异常基因表达而发生。RNA的局部递送可以具有干扰这样的异常基因表达的治疗特性。包括小分子药物和大分子在内的抗凋亡、抗炎和抗退行性药物的局部递送也可以任选地是治疗性的。在这样的情况下，该装填器用于以恒定速率和/或通过单独植入的专用装置延长释放。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。
作为特殊应用的又另一个实例，用基因修饰剂治疗精神和认知障碍。基因敲低是治疗选项。向中枢神经系统部位局部递送药剂的装填器是对于精神和认知障碍的治疗选项，这些精神和认知障碍包括但不限于，精神病、双极性疾病、神经性障碍和行为疾病(behavioral maladies)。这些装填器也可以在特定脑部位进行植入时局部递送包括小分子药物和大分子的药物。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。
作为特殊应用的另一个实例，在局部部位的先天性和/或适应性免疫介质的沉默使得能够预防器官移植排斥。用植入到移植器官和/或植入部位的装填器局部递送RNA和免疫调节试剂致使经由排斥性免疫细胞(如针对移植器官而被激活的CD8)的局部免疫抑制。这都可以用于和/或适用于本发明的CRISPR Cas系统。
作为特殊应用的另一个实例，包括VEGF和血管生成素及其他在内的血管生长因子对于新血管形成是必需的。这些因子、肽、肽模拟物的局部递送或抑制它们的抑制物是一种重要的治疗模式；使阻遏物沉默以及用装填器局部递送刺激血管发生的这些因子、肽、大分子和小分子药物对于周围血管疾病、全身性血管疾病和心血管疾病是治疗性的。
插入的方法，如植入，可以任选地已用于其他类型的组织植入和/或用于组织取样，任选地在这样的方法中没有修改，或者可替代地任选地仅仅具有非重点修改。这样的方法任选地包括但不限于，近距离放射治疗方法、活组织检查、用和/或不用超声的内窥镜检查如ERCP、进入脑组织的立体定向法、腹腔镜检查，包括用腹腔镜进入关节、腹腔器官、膀胱壁和体腔的植入。
患者特异性筛选方法
靶向核苷酸(例如三核苷酸重复)的CRISPR-Cas系统可以用于针对此类重复的存在对患者或患者样品进行筛选。这些重复可以是该CRISPR-Cas系统的RNA的靶标，并且如果被该CRISPR-Cas系统结合至其上，则可以检测到该结合，以由此指示存在这样一个重复。因此，CRISPR-Cas系统可以用于针对该重复的存在对患者或患者样品进行筛选。然后可以向该患者给予一种或多种适合的化合物以解决该病症；或者，可以向该患者给予CRISPR-Cas系统，该系统结合到并且引起插入、缺失或突变并且减轻该病症。
核酸、氨基酸和蛋白质、调节序列、载体等
核酸、氨基酸和蛋白质：本发明使用核酸结合靶DNA序列。这是有利的，因为产生核酸比产生蛋白质容易且价廉得多，并且特异性可以根据其中寻求同源性的拉伸长度而变化。例如多指的复杂3-D复杂定位是不需要的。术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。该术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如，埃克斯坦(Eckstein)，1991；巴塞加(Baserga)等人，1992；米利根(Milligan)，1993；WO 97/03211；WO 96/39154；马塔(Mata)，1997；施特劳斯-绍库普(Strauss-Soukup)，1997；和扎姆斯塔(Samstag)，1996。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。如本文所用的术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征。“野生型”可以是基线。如本文所用的术语“变体”应当被理解为表示具有衍生自在自然界中存在的模式的性质的展示。术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表面人工的参与。这些术语，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例描述于蒂森(Tijssen)(1993)的《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交》(LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With NucleicAcid Probes)，第I部分，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略”(“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。在提及一个多核苷酸序列时，那么也设想了互补的或部分互补的序列。能够在高严格条件下杂交到参考序列上的这些序列是优选的。通常，为了使杂交率最大化，选择了相对低严格性的杂交条件：低于热熔点(Tm)约20℃到25℃。Tm是50％的特异性靶序列在具有规定的离子强度和pH的溶液中杂交到完全互补的探针上的温度。通常，为了要求杂交序列的至少约85％的核苷酸互补性，高严格洗涤条件被选择为低于Tm约5℃到15℃。为了要求杂交序列的至少约70％的核苷酸互补性，中等严格洗涤条件被选择为低于Tm约15℃到30℃。高容许(极低严格性)洗涤条件可以低至在Tm之下50℃，从而允许在杂交序列之间的高水平错配。本领域技术人员将认识到，在杂交和洗涤阶段中的其他物理和化学参数也可以改变，从而影响来自在靶序列与探针序列之间的特定同源性水平的可检测杂交信号的结果。优选的高严格条件包括在50％甲酰胺、5×SSC、和1％SDS中在42℃孵育，或者在5×SSC和1％SDS中在65℃孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，该复合物经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式而发生。该复合物可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自我杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程(如PCR的开始、或经由一种酶的多核苷酸的切割)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补物”。如本文使用的，术语“基因组座位(locus)”或“座位(locus)”(复数是座位(loci))是在染色体上的基因或DNA序列的特定位置。“基因”是指编码多肽或RNA链的DNA或RNA的段(stretch)，其在生物中发挥功能作用并且因此是活生物体遗传的分子单元。出于本发明的目的，可以考虑包括调节基因产物的产生的区域的基因，而不论这样的调节序列是否接近编码和/或转录的序列。因此，基因包括而不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、核基质附着位点和座位控制区。如本文使用的“基因组座位的表达”或“基因表达”是藉此在功能性基因产物的合成中使用来自基因的信息的过程。基因表达的产物常常是蛋白质，但是在非蛋白质编码基因如rRNA基因或tRNA基因中，产物是功能性RNA。基因表达的过程由所有已知的生物利用-产生功能性产物以便存活的真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)以及病毒。如本文使用的基因或核酸的“表达”不仅涵盖细胞基因表达，而且涵盖在克隆系统中或在任何其他背景下的一个或多个核酸的转录和翻译。如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵，如与标记组分的结合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。如本文使用的，术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可以独立于该蛋白质链的其余部分而存在并且起作用的蛋白质序列的一部分。正如在本发明的多个方面中所描述，序列一致性与序列同源性有关。可以通过肉眼、更通常地借助于可得的序列比较程序来进行同源性比较。这些可商购的计算机程序可以计算在两个或更多个序列之间的同源性的百分比(％)并且还可以计算由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列一致性。在一些优选的实施例中，本文描述的dTALE的封端区具有与本文提供的封端区氨基酸序列至少95％一致性或共享一致性的序列。可以通过本领域已知的许多计算机程序(例如BLAST或FASTA等等)来生成序列同源性。用于进行这样的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(美国威斯康星大学；德弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，出处同上-第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Atschul)等人，1990，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，403-410)以及GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，出处同上，7-58页到7-60页)。然而，优选使用GCG Bestfit程序。可以计算在连续序列上的序列同源性百分比(％)，即，将一个序列与另一个序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一个序列中的相应氨基酸或核苷酸直接进行比较，一次比较一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位比对仅仅在较少数目的残基上进行。虽然这是一种非常简单和一致的方法，但是它未能考虑的是，例如，在其他方面完全相同的序列对中，一个插入或缺失可以引起随后的氨基酸残基被排除在比对之外，因此当进行全局比对时可能导致在同源性％上的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生考虑到可能的插入和缺失的优化比对，而没有过度地使总体同源性或一致性评分不利。这是通过在序列比对中插入“空位”来实现的，以便试图将局部同源性或一致性最大化。然而，这些更复杂的方法向出现在该比对中的每个空位分配“空位罚分”，从而对于相同数目的一致的氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列比对-反映了在这两个比较的序列之间的更高关联性-可以比具有许多空位者实现更高的得分。“亲合空位成本”(“Affinity gap costs”)典型地用于对空位的存在要求相对高的成本并对空位中的每个后续残基施加较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种序列比较软件时优选使用默认值。例如当使用GCG威斯康星Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分为对于每个空位的-12，以及对于每个延伸的-4。因此计算最大同源性％首先要求产生最佳比对，考虑空位罚分。用于进行这样的比对的适合的计算机程序是GCG威斯康星Bestfit软件包(德弗罗(Devereux)等人，1984，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)12p387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST软件包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999《精编分子生物学实验指南》(Short Protocols in MolecularBiology)，第4次编辑-第18章)、FASTA(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)403-410)以及GENEWORKS系列比较工具。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，《精编分子生物学实验指南》(Short Protocolsin Molecular Biology)，7-58页到7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种新的工具，称为BLAST 2序列，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》(FEMS Microbiol Lett.)1999 174(2):247-50；《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》1999 177(1):187-8以及在国立卫生研究院的网址的国家生物技术信息中心的网址)。虽然最终同源性％可以按照一致性进行测量，但是比对过程自身典型地不是基于全或无配对比较(all-or-nothing pair comparison)。相反，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对各个成对比较评分。通常使用的这种矩阵的实例为BLOSUM62矩阵-BLAST系列程序的默认矩阵。GCG威斯康星程序通常使用公开的默认值或自定义符号比较表(更多细节详见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件情况下的默认矩阵，如BLOSUM62。可替代地，可以基于类似于CLUSTAL(希金斯DG(Higgins DG)和夏普PM(SharpPM)(1988)，《基因》(Gene)73(1)，237-244)的一种算法，使用在DNASISTM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对特征来计算同源性百分比。一旦软件已经产生最佳比对，就有可能计算同源性％，优选序列一致性％。软件典型地这样进行，作为序列比较的一部分，并且产生数字结果。这些序列也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并生成功能上等同的物质。可以基于氨基酸特性(如残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性)的相似性做出有意氨基酸取代，并且因此它在将氨基酸集合成官能团中是有用的。可以仅仅基于氨基酸的侧链特性将它们集合在一起。然而，包括突变数据同样是更有用的。出于结构原因，如此衍生的氨基酸的集合很有可能是保守性的。这些集合可以被描述为文氏图形式(Venn diagram)(利文斯敦C.D.(Livingstone C.D.)和巴顿G.J.(Barton G.J.)(1993)“蛋白质序列比对：用于残基保守些的分级分析的策略”(“Proteinsequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residueconservation”)《生物科学计算应用》(Comput.Appl.Biosci).9:745-756)(泰勒(Taylor)W.R.(1986)“氨基酸保守性的分类”(“The classification of amino acidconservation”)《理论生物学杂志》(J.Theor.Biol.)119；205-218)。例如可以根据下表做出保守性取代，该表描述了普遍接受的氨基酸的文氏图分组。
本发明的实施例包括可包含同源取代(本文使用取代和置换两者来表示现有氨基酸残基或核苷酸与替代残基和核苷酸之间的互换)的序列(多核苷酸或多肽两者)，该同源取代，即，在氨基酸的情况下发生同类取代(like-for-like substitution)，如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性。也可以发生非同源取代，即，从一类残基到另一类残基，或者可替代地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(在下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(在下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(在下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(如甘氨酸或β-丙氨酸)之外的烷基基团，如甲基、乙基或丙基基团。一个另外的变化形式，其涉及处于类肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，也是本领域技术人员熟知的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备处于该类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙RJ(Simon RJ)等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和豪威尔DC(Horwell DC)，《生物技术趋势》(Trends Biotechnol.)(1995)13(4)，132-134。
出于本发明的目的，扩增意指利用引物和聚合酶的能够以合理的保真度复制靶序列的任何方法。可以通过天然或重组DNA聚合酶，如TaqGoldTM、T7 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段以及逆转录酶进行扩增。一种优选的扩增方法是PCR。
在某些方面，本发明涉及载体。如本文使用的，“载体”是一种允许或促进一个实体从一个环境转移到另一个环境中的工具。它是一种复制子，如质粒、噬菌体、或粘粒，另一个DNA片段可以插入其中，从而引起该插入的片段的复制。通常，当与适当的控制元件关联时，一种载体能够复制。一般而言，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒(AAV))的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。
重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。关于重组和克隆方法，提及2004年9月2日以US 2004-0171156 A1公开的美国专利申请10/815,730，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。
本发明的多个方面涉及用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子载体。用于嵌合的RNA与Cas9的双顺反子表达载体是优选的。一般而言并且特别地，在这个实施例中，Cas9优选由CBh启动子驱动。嵌合RNA可以优选地由Pol III启动子(如U6启动子)驱动。理想地，将这两者结合。嵌合的指导RNA典型地由20bp指导序列(N)组成并且这可以接合到tracr序列上(从下链的第一个“U”到该转录物的结尾)。该tracr序列可以在如指示的不同位置被截短。指导序列和tracr序列被该tracr配对序列隔开，该tracr配对序列可以是GUUUUAGAGCUA。这之后可以是如所示的环序列GAAA。这两者都是优选的实例。申请人已经通过SURVEYOR测定证明了在人EMX1和PVALB座位处的Cas9介导的indel。ChiRNA由其“+n”标志指示，并且crRNA是指指导序列和tracr序列被表达为分开的转录物的杂交体RNA。贯穿本申请，嵌合RNA也可以被称为单指导、或合成指导RNA(sgRNA)。该环优选地是GAAA，但是并并限于这个序列或者实际上在长度上仅仅为4bp。实际上，用于在发夹结构中使用的优选环形成序列在长度上为四个核苷酸，并且最优选地具有序列GAAA。然而，可以使用更长或更短的环序列，正如可替代的序列。这些序列优选地包括三联体(例如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和AAAG。在实践在此披露的任何方法中，可以经由本领域已知的一种或多种方法将适合的载体引入进细胞或胚胎中，这些方法包括但不限于，显微注射、电穿孔、声致穿孔、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、热休克转染、核转染、磁转染、脂转染、刺穿转染(impalefection)、光学转染、专有剂增强的核酸摄取以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒或人工病毒体进行递送。在一些方法中，通过显微注射将该载体引入进胚胎中。可以将这个或这些载体显微注射进胚胎的细胞核或细胞质中。在一些方法中，通过核转染将这个或这些载体引入进细胞中。
术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子以及EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。关于调节序列，提及美国专利申请10/491,026，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。关于启动子，提及PCT公开WO 2011/028929和美国申请12/511,940，这些专利的内容通过引用以其全文并入本文。
载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。
载体可以被引入原核生物或原核细胞中并且在其中增殖。在一些实施例中，原核生物用来扩增有待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为有待引入真核细胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部分)。在一些实施例中，原核生物用来扩增一个载体的多个拷贝并且表达一种或多种核酸，如提供用于递送到宿主细胞或宿主生物中的一种或多种蛋白质的来源。蛋白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编码的蛋白质上，如该重组蛋白的氨基端上。这样的融合载体可以用于一个或多个目的，如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白切割位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(发玛西亚生物技术有限公司(Pharmacia BiotechInc)；史密斯和约翰逊，1988.《基因》(Gene)67:31-40)、pMAL(纽英伦生物技术公司(NewEngland Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))以及pRIT5(发玛西亚公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋白。适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann(阿姆兰)等人，(1988年)《基因》(Gene)69:301-315)以及pET 11d(Studier(斯图迪尔)等人，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)60-89。在一些实施例中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例包括pYepSec1(巴尔戴利(Baldari)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)6:229-234)、pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)，1982，《细胞》(Cell)30:933-943)、pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987，《基因》(Gene)54:113-123)、pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif))、以及picZ(英杰公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在一些实施例中，使用杆状病毒载体，载体驱动昆虫细胞中的蛋白质表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3:2156-2165)和pVL系列(拉克瑙(Lucklow)和萨莫斯(Summers)，1989，《病毒学》(Virology)170:31-39)。
在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(锡德(Seed)，1987，《自然》(Nature)329:840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能典型地由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.)(第2版)的第16和第17章，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约，1989。
在一些实施例中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异型调节元件来表达核酸)。组织特异型调节元件是本领域中已知的。适合的组织特异型启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(Genes Dev.)1:268-277)，淋巴特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《免疫学进展》(Adv.Immunol)43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(维纳图(Winoto)和巴尔迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)8:729-733)和免疫球蛋白(巴纳吉(Baneiji)等人，1983.《细胞》(Cell)33:729-740；奎恩(Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989.《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育型调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和蒂尔曼(Tilghman)，1989.《基因发育》(Genes Dev.)3:537-546)。关于这些原核和真核载体，提及美国专利6,750,059，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。本发明的其他实施例可涉及病毒载体的使用，关于它提及美国专利申请13/092,085，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。组织特异型调节元件是本领域中已知的，并且在这个方面提及美国专利7,776,321，该专利的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，调节元件可操作地连接至CRISPR系统的一个或多个元件，从而驱动该CRISPR系统的该一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的同向重复)，构成通常对于特定细菌物种而言特异性的DNA基因座的家族。该CRISPR座位包含在大肠杆菌中被识别的间隔开的短序列重复(SSR)的一个不同类(石野(Ishino)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，169:5429-5433[1987]；和中田(Nakata)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，171:3553-3556[1989])、以及相关基因。类似的间隔开的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、化脓链球菌、鱼腥藻属、和结核分枝杆菌中(参见，格鲁恩(Groenen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，10:1057-1065[1993]；霍(Hoe)等人，《新发感染性疾病》(Emerg.Infect.Dis.)，5:254-263[1999]；马斯波尔(Masepohl)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1307:26-30[1996]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》，17:85-93[1995])。这些CRISPR座位典型地不同于其他SSR的重复结构，这些重复已被称为规律间隔的短重复(SRSR)(詹森(Janssen)等人，《OMICS：整合生物学杂志》(OMICS J.Integ.Biol.)，6:23-33[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，36:244-246[2000])。一般而言，这些重复是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开(莫吉卡(Mojica)等人，[2000]，同上)。虽然重复序列在菌株之间是高度保守的，许多间隔开的重复和这些间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(冯·埃姆登(van Embden)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，182:2393-2401[2000])。已经在40种以上的原核生物中鉴定出CRISPR座位(参见，例如，詹森(Janssen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:1565-1575[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，[2005])，包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、焦球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、类杆菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希菌属(Escherichia)、军团杆菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光细菌属(Photobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)以及栖热袍菌属(Thermotoga)。
在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码一种蛋白质或蛋白质片段的基因序列上，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4 DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US 20110059502中，通过引用将其并入本文。在一些实施例中，使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。
在一些实施例中，CRISPR酶可以形成可诱导系统的组分。该系统的诱导性质将允许该系统利用一种能量形式对基因编辑或基因表达进行时空控制。该能量形式可以包括但不限于，电磁辐射、声能、化学能和热能。可诱导系统的实例包括四环素诱导型启动子(Tet-开(Tet-On)或Tet-关(Tet-Off))、小分子双杂交体转录激活系统(FKBP、ABA等)或光可诱导系统(光敏素、LOV结构域或隐花色素)。在一个实施例中，该CRISPR酶可以是以序列特异性方式指导转录活性的变化的光诱导的转录效应因子(LITE)的一部分。光的组分可以包括CRISPR酶、光响应细胞色素异二聚体(例如，来自拟南芥)、以及转录激活/抑制结构域。诱导型DNA结合蛋白和关于使用它们的方法的其他实例提供在US 61/736465和US 61/721,283中，特此通过引用以其全文并入。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
修饰靶标
在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括对来自人或非人动物的细胞或细胞群进行取样，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物中。对于重新引入的细胞，特别优选的是这些细胞是干细胞。
在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。
在一个方面，本发明提供了修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交或可杂交到在所述多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。事实上，这些取样、培养和重新引入选择跨本发明的多个方面而适用。
确实，在本发明的任何方面，该CRISPR复合物可以包括与杂交或可杂交到靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列可以连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而可以杂交到tracr序列上。类似的考虑因素和条件适用如上文针对修饰靶多核苷酸的方法。
试剂盒
在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含披露于以上方法和组合物中的元件中的任何一个或多个。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于用于插入进载体中的指导序列，以便可操作地连接该指导序列和调节元件。在一些实施例中，该试剂盒包括同源重组模板多核苷酸。在一些实施例中，该试剂盒包括在此描述的载体中的一个或多个和/或在此描述的多核苷酸中的一个或多个。该试剂盒可以有利地允许提供本发明的系统的所有元件。
实例
以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方式限制本发明。本发明实例连同在此描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。
实例1：CRISPR-Cas9系统作为用于在人类基因组中编辑引起疾病的核苷酸重复扩增的工具
本发明涉及CRISPR-Cas9系统作为用于在人类基因组中编辑引起疾病的核苷酸重复扩增的工具的开发和应用(图1)。申请人提供了支持以下的证据：申请人已经设计并测试的序列、质粒和/或病毒载体促进在若干疾病相关基因组座位处的核苷酸重复序列的基因组编辑，这些疾病相关基因组座位包括与CAG三联体重复障碍(即多聚谷氨酰胺疾病)、脆性X和脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)相关的基因组座位。并且，申请人描述了使用腺相关病毒(AAV)作为载体到哺乳动物脑的CRISPR-Cas9的设计和应用。
靶序列的选择。该途径的目标是使用CRISPR-Cas9系统来产生在疾病相关核苷酸重复序列的侧翼(即，刚好在上游和刚好在下游)的基因组序列中的DNA双链断裂。通过非同源重复的过程，这应导致CRISPR-Cas9介导的对引起疾病的核苷酸重复序列进行的基因组切除。可以使用此途径靶向的基因列表提供于下表中。基于三个主要标准来选择靶序列：1)原型间隔子邻近基序(PAM)序列在核苷酸重复上游和下游的存在，2)与鉴定的PAM基序关联的20-核苷酸靶序列的低预测脱靶潜力(基于张(Zhang)实验室中开发的算法进行生物信息学分析)，靶序列靠近(在100个核苷酸内)核苷酸重复扩增序列。
在培养的人类细胞系中CRISPR-Cas9指导序列的初步筛选。为了评估效力，在核苷酸重复区侧翼的靶序列被单独地克隆到pX260CRISPR-Cas9载体系统内，参见张(zhang)实验室公开物中的以及描述于www.genome-engineering.org.的方案。pX260载体系统促进在U6RNA聚合酶III启动子的控制下CRISPR靶指导RNA的表达，在H1RNA聚合酶III启动子的控制下CRISPR反式激活性RNA(tracrRNA)的表达，以及在鸡β肌动蛋白RNA聚合酶III启动子的控制下密码子优化的化脓链球菌Cas9基因的表达。筛选过程涉及靶指导序列在人类细胞系(即HEK293、HeLa或HT1080)中的瞬时表达，随后进行基因组DNA提取，并且进行PCR扩增以评估CRISPR-Cas9介导的对核苷酸重复序列的切除(图2a)。为了确认CRISRP/Cas9靶向的位点的切除和非同源修复，通过PCR扩增在预期靶位点周围的区域，并且对PCR扩增产物进行克隆和测序。在图2b-5中示出来自这些分析的结果。
ATXN1编辑：将HT1080细胞用编码SpCas9的质粒+/-编码指导RNA的质粒转染，以便编辑在ATXN1编码序列中的三核苷酸CAG重复。这些质粒还允许使用嘌呤霉素选择转染的细胞。在五天的选择和生长之后，>90％的细胞群体包含经编辑的缺乏CAG重复的ATXN1座位。图9a示出在接受PS2和PS5质粒的细胞中基因组座位缩短了大约150bp(参见图2b)。另外，图9b示出ATXN1转录物的稳态水平在接受PS2+PS5或PS1+PS5的细胞中得以显著降低。SpCas9单独的表达不影响ATXN1转录物水平。
对于ATXN1的类似结果已经在神经前体细胞中实现，并且还实现用于编辑HTT基因的编码序列。
DMPK编辑：类似途径用于编辑DMPK非编码3'-UTR中的CTG重复。在HT1080细胞中设计并表达这些重复的上游和下游的指导序列。。图10a示出当细胞用编码Cas9和指导序列的质粒共转染时，基因组座位被缩短。还在获得自DM1强直性肌营养不良患者(该患者具有大约550个CTG重复)的原代皮肤成纤维细胞中观察到相同结果。将这些成纤维细胞经由电穿孔用质粒转染，并且图10c示出CTG扩增被有效地使用Cas9CRISPR系统来切除。至少1500nt的序列被从基因组中的DMPK座位切除。DMPK蛋白表达未受影响。
用以将CRISPR-Cas9系统递送至哺乳动物组织(包括但不限于脑、肺、肝和肌肉)的AAV的设计和使用：为了实现CRISPR-Cas9系统在靶疾病组织中的高效表达，申请人将需要的表达盒改造到AAV中。在一个中，使用标准PCR克隆技术，将在pX260质粒中发现的核靶向的密码子优化的化脓链球菌Cas9核酸酶亚克隆在AAV血清型-2穿梭质粒的反向末端重复(iTR)之间。在最小启动子的不存在的情况下，在AAV血清型-2iTR中存在的基础转录活性足以驱动Cas9核酸酶的产生(图6)。该系统还适合于细菌核酸酶的Cas家族的其他成员的表达。此外，如果更高水平的组织或细胞特异性Cas9表达是所希望的话，可以考虑短的最小合成的或天然存在的启动子序列或RNA稳定元件。
将CRISR/Cas9系统的非编码RNA组分亚克隆到第二AAV穿梭载体中。CRISPR-Cas9指导靶序列可以单独地或作为阵列形式的部分表达，其中多种指导靶序列(gcRNA)是在III型RNA聚合酶启动子(即U6或H1RNA)的控制下在细胞内产生。可以使用pol III启动子，从相同的AAV穿梭载体表达非编码tracrRNA。gcRNA和tracrRNA还可以表达为嵌合分子，其中gcRNA和tracrRNA序列在III型RNA聚合酶启动子的控制下融合为单一转录物(即sgRNA)。多种sgRNA还可以使用III型RNA聚合酶启动子(即U6或H1RNA)以阵列形式表达。以上所述的非编码RNACRISPR-Cas9组分是足够小的，以使得当克隆到AAV穿梭载体中时保留足够的空间以包含其他元件(例如报告基因，抗生素抗性基因或其他序列)，使用标准方法将这些元件克隆进AAV穿梭质粒中。
对于AAV CRISPR-Cas9组分在靶组织中的表达，iTR-SpCas9AAV和AAV.指导.taCRISPR是遵循先前描述的AAV纯化方案产生的，并且同时进行体内递送。这可以例如通过在融合之前以在相同缓冲液中的指定比率将两种病毒组合来实现。这导致靶向的组织用Cas9核酸酶和指导核酸酶到靶向的基因组座位所需的非编码RNA两者进行转导。AAV衣壳或者合成修饰的AAV衣壳的不同组织嗜性提供了将AAV CRISPR-Cas9组分有效递送至不同组织的机会。虽然描述了二-病毒系统，还可以使用三-病毒系统以将这些组分递送到靶组织中。这可以是令人希望的，例如当一些非编码靶指导RNA需要在不同时间递送时。
在尝试增加效率中，设计了可替代的AAV载体。图11a示出一种系统，其中AAV9病毒编码SaCas9(具有N-末端NLS，在CMV启动子的控制下)和一种或多种合成的指导RNA。如果希望的话，该载体可以与第二载体一起递送，该第二载体编码例如转导标记(例如EGFP，如在图11a中所示)或模板供体(如果同源重组是希望的话)。该实验使用了DM1的转基因小鼠HSALR模型，该模型具有人类骨骼肌动蛋白(hACTA1)转基因中的扩增的CTG重复。六周龄小鼠接受颈静脉内注射(全身递送，主要靶向肌肉和肝脏)AAV9和指导序列，该AAV9编码EGFP标记或SaCas9，这些指导序列靶向CTG扩增。在肌肉活组织检查中的荧光(图11b)确认了载体有效地靶向肌肉组织。针对图11c中的肌肉组织的PCR结果示出在接受SaCas9和sgRNA的小鼠中CTG重复区被切除，但在接受EGFP-编码载体的小鼠中或在接受SaCas9连同对照sgRNA(其序列已经打乱)的小鼠中没有被切除。HSALR模型示出由于转录物的保持所得的核聚焦点，但FISH分析示出在处理的小鼠中核聚焦点的减少。
实例2：等位基因特异性CRISPR-Cas9介导的在显性遗传疾病中突变体等位基因的失活
多个单核苷酸多态性(SNP)以与成为显性遗传疾病的基础的基因突变处于连锁不平衡而存在。这些SNP在突变体等位基因中的存在可以导致从头原型间隔子邻近基序(PAM)的创建，可以使用在本申请中描述的CRISPR-Cas9系统靶向这些基序。由于Cas9核酸酶需要PAM序列的存在以便介导双链DNA断裂，可以利用连锁不平衡中的SNP实现在显性遗传疾病中突变体等位基因的等位基因特异性失活。
在图8中，申请人描述了CRISPR-Cas9介导的等位基因特异性靶向的概念。如在图8a中所示，在β等位基因中SNP(X至G，其中X是任何除了G之外的核苷酸)的存在导致从头形成在α等位基因中丢失的5’-NGG-3’PAM。这一核苷酸区别可以用于设计用以使用SpCas9来靶向β等位基因的失活的指导序列(灰色N)。申请人在图8b中提供了此策略的一个实例。然而，该策略可以针对任何其他侯选者Cas9的任何其他PAM基序来进行。在ATXN2基因中的CAG重复核苷酸扩增成为显性遗传的神经退行性疾病脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)的基础。如通过乔杜里(Choudry)等人所示的，rs695871SNP(G至C)以与含扩增的CAG重复的等位基因处于连锁不平衡而存在。SNP导致形成5’-NGG-3’PAM(加下划线)，可以使用SpCas9靶向该5’-NGG-3’PAM，以优选使携带CAG扩增的突变体ATXN2等位基因失活，同时保持来自缺乏CAG扩增的第二等位基因的正常活性。
使用合成的表达构建体在体外验证此概念，这些合成的表达构建体包含ATXN2mRNA的前342个核苷酸(从ATG起始位点)，这些核苷酸在框内融合至EGFP(G等位基因)或mCherry(C等位基因)的N-末端。实验结果指示使用CRISPR-Cas9进行等位基因特异性靶向C等位基因导致培养的细胞中mCherry(C等位基因)但不是EGFP(G等位基因)表达的损失(参见图)。
更具体地，包含ATXN2mRNA的前342bp(从ATG起始位点)的合成的融合表达构建体融合至EGFP(G等位基因)或mCherry(C等位基因)的N-末端。将这些构建体与对照指导物或特异性地靶向C等位基因(等位基因特异性指导物＝AS-sgRNA)的指导物瞬时共转染到人类HT1080(纤维肉瘤细胞系)细胞中。使用用于EGFP和mCherry激发的UV灯和滤波器，在显微镜下在转染后72小时分析EGFP和mCherry表达。如在图中所示，只有在接受AS-sgRNA构建体的细胞中mCherry表达受到抑制，并且在对照中未受到抑制。相比之下，在接受对照或C-等位基因特异性(AS-sgRNA)指导RNACRISPR/Cas9的细胞中EGFP表达是类似的。
实例3：自失活CRISPR-Cas9系统的设计，例如以限制和/或预防Cas核酸酶基因的不必要的长期慢性表达-以控制Cas核酸酶表达。
本发明还提供了用于使CRISPR-Cas9系统自行失活的方法，作为限制其在靶向的细胞中活性和/或表达的持续时间的手段。图13描绘了自失活CRISPR-Cas9系统的一方面，并且图14描绘了用于对ATXN1座位具有特异性的嵌合串联阵列转录物的示例性自失活CRISPR-Cas9系统。
原则上，经由CRISPR-Cas9进行的人类基因组编辑需要最多两个Cas9分子(靶向两个不同等位基因上的基因组位点)。因此，导致Cas9基因和/或其非编码RNA组分的持续细胞表达的CRISRP/Cas9系统的递送对于成功实现编辑引起疾病的突变而言是不必要的。并且，持续的CRISPR-Cas9活性可以导致在非预期的基因组位点处不希望的脱靶效应，随着时间，这些脱靶效应可以对宿主细胞、组织或有机体是有害的。
申请人已经改造了自失活CRISPR-Cas9系统(SIN-CC9)，该系统依赖于与独特序列互补的非编码指导靶序列的使用，这些独特序列存在于：i)驱动非编码RNA元件的表达的启动子内，ii)驱动Cas9基因的表达的启动子内，iii)Cas9编码序列中的ATG翻译起始密码子的100bp内，iv)AAV基因组的反向末端重复内。该“自失活”指导RNA可以单独或按阵列形式表达以实现CRISPR-Cas9系统的失活。例如，在Cas9编码序列中的ATG翻译起始密码子附近的双链断裂将诱导Cas9编码序列中的移码，导致蛋白表达的损失。如果以阵列形式表达，同时靶向两种启动子的“自失活”指导RNA将导致从AAV转基因/基因组中切除400-800个核苷酸，有效地导致其完全失活。这些策略图解于图7和12中。
图12提供了包含克隆盒的示例性自失活构建体，该克隆盒任选地侧翼为在该盒5’和3’端的每一端上的反向末端重复(iTR)，其中该盒进一步包含驱动sgRNA的Pol III启动子和驱动Cas9的Pol II启动子。“自失活”sgRNA(其靶位点以红线示出)可以单独地或以来自1至4个不同指导序列的串联阵列形式表达，这些指导序列是从一个嵌合Pol III转录物加工。黑色括号描绘了当至少两个不同的“自失活”sgRNA以串联阵列表达时，由靶向的双链断裂造成的期望的DNA切除。可获得自失活靶序列的广泛选择，以用于SaCas9系统，包括但不限于失活Cas9、CMV、U6、modU6、ITR等中的靶序列。Pol III启动子可以选自但不限于U6或H1启动子。PolII启动子可以选自但不限于遍及说明书提供的那些启动子，包括遍存启动子和细胞类型特异性启动子。
为了实现CRISPR-Cas9失活，同时还实现对靶向的基因组位点的编辑，遵循上述程序将靶向希望的基因组座位的CRISPR-Cas9指导RNA以及一种或多种“自失活”指导RNA共递送/共表达于相同的细胞/靶组织中。基本概念以图表形式呈现(图7a)。该途径导致对预期基因组位点的编辑，随后在48小时内使Cas9核酸酶基因失活(图7b)。如果必要的话，将非靶向核苷酸添加至“自失活”指导RNA的5’端可以用于延迟其加工和/或修饰其效力，作为确保在CRISPR-Cas9停止之前在靶向的基因组座位处进行编辑的手段。
申请人已经采用SpCas9和SaCas9两者使SIN-CC9概念付诸实施，并且靶向于在Cas9ATG处/附近的且在AAV载体的ITR内的序列(参见例如图12)。并且，认为此系统足够严格以“失活”基于任何其他重组AAV的基因治疗系统。设计并且添加这种用于自我失活此类系统的选择对于用于基因治疗系统中是特别有意义的，因AAV序列不希望地整合在人类基因组中，这些基因治疗系统可能导致肿瘤形成。
实例4：U6驱动的串联指导RNA递送两种功能性sgRNA；串联sgRNA支架构造的优化；串联sgRNA到单独的亚单元的加工发生；针对自身靶向Cas9(自失活；SIN)。
使用独立转录的sgRNA的合并的递送在本质上是随机的，并且可以与单一载体系统相比，不太可重现；例如，在其中靶饱和可以不是希望的或不可以实现的情况下的应用中。许多内源微生物CRISPR系统天然地作为由原型间隔子间隔的单一启动子驱动的同向重复阵列而出现，这些原型间隔子在它们被加工成单独的成熟crRNA之前被转录为单一转录物。然而，考虑到嵌合sgRNA系统表现地比天然crRNA:tracrRNA双链体的效率高得多，申请人力图开发如下系统，通过该系统，单一启动子可以驱动串联排列的多个sgRNA的表达，类似于天然微生物CRISPR座位。不希望受任何具体理论束缚，当多个单元在同一转录物中被一起转录时，结构稳定的sgRNA支架更可能折叠成独立的功能活性单位。申请人将8-nt接头插入在串联的相邻sgRNA之间；对于每种不变的sgRNA支架(非指导区)，申请人使用了原始sp85 sgRNA对或具有稳定的远端发夹的支架。引人注目的是，申请人观察到当这些串联合成指导RNA(tsgRNA)靶向先前示出通过Cas9切口酶诱导indel的非常接近的基因组座位时，稳定化的支架能够以类似于由共转染的单独sgRNA诱导的频率的频率诱导indel。此外，当与野生型Cas9核酸酶配对时，tsgRNA在人EMX1座位中能够类似地以可与多元单独sgRNA相比的水平诱导基因组微小缺失。已经显示串联转录的sgRNA能够同时靶向两个基因组座位，申请人接下来力图确定用于连接邻近指导物-支架的最适接头。申请人在用两个sgRNA进行的基因组微小缺失测定中使用不同长度的接头序列设计了tsgRNA。考虑到单独的内源原型间隔子被36-nt长的同向重复序列分开，并且还测试了编码一半同向重复或全长同向重复的接头。有趣的是，在接头序列长度与基因组修饰效率之间并不存在强烈的相关性，即使在不存在将sgRNA的远端与第二sgRNA的指导序列分开的接头的情况下。然而，显现包含同向重复序列可以不利地影响活性，虽然对于切割效率有朝向8-16例如10-14例如12-nt接头长度的适度优先性。为了解决共转录的串联sgRNA(在相同启动子转录多种sgRNA)是否被加工为单独的指导-支架单元，申请人设计了在第一或第二位置中携带相同指导物的串联sgRNA(图15A)。随后的对转染细胞的Northern印迹分析显示了三个不同的RNA种类，对应于200+nt(可能是未被加工的串联RNA转录物)、约140nt转录物(与由第二支架中的poly-U束进行信号传导的转录提前终止一致)和约100nt完全加工的sgRNA(图15B)。当该靶间隔子位于该tsgRNA的第一位置中时，申请人观察到与单独U6转录的sgRNA尺寸相同的丰富的完全加工的sgRNA。当放置在第二位置中时，仅仅存在痕量的完全加工的sgRNA。与此一致，在微小缺失测定中颠倒间隔子顺序可以显著改变基因组修饰的效率。当测试靶向不同基因组座位的其他sgRNA对时，当放置在第一而非该第二位置中时，同一指导序列典型地具有更好的活性(图15C)。这些观察结果表明，在串联sgRNA的背景下，虽然大多数间隔子可与单一指导转录物相容，但是第二间隔子的序列更可能影响第二sgRNA的活性。序列相异的支架配对产生更好的第二间隔子活性：为了优化第二间隔子的活性，申请人想出了用于通过荧光细胞术来评估其活性的测定。通过在表达Cas9-2A-GFP的质粒中将第二指导物靶向Cas9自身，申请人可以通过测量转染细胞的荧光分数和强度来评估indel活性(图16A)。用靶向Cas9的单一sgRNA转染细胞或共递送靶向Cas9的sgRNA与另一个sgRNA显著降低了经Cas9-2A-GFP转染的GFP阳性部分的平均荧光强度(MFI)，而用Cas9-2A-EGFP和非Cas9靶向的sgRNA转染的细胞维持较高的MFI(图16B)。考虑到每个sgRNA支架都需折叠成稳定的二级结构，在不希望受任何具体理论束缚的情况下，第二间隔子的活性降低的可能原因可以归因于二级结构相互作用不在单一sgRNA支架内而是在两个sgRNA支架之间。在不受任何具体理论束缚的情况下，使用较不可能彼此碱基配对的相异的最低限度同源的sgRNA支架可以减少对之间的相互作用并辅助单独的折叠。申请人设计了一组十二个不同的sgRNA支架，每个支架都具有靶向GRIN2B的第一指导物和靶向Cas9的第二指导物，并且对所有支架组合进行了逐对比较。随后的流式细胞术分析鉴定了五个潜在的侯选sgRNA支架，它们显著降低GFP阳性部分的MFI以及GFP阳性细胞的总体百分比两者；降低水平类似于通过转染单独转录的靶向Cas9的sgRNA获得的水平(图16C)。与如下观点一致，即支架间相互作用可能破坏正确的sgRNA折叠和加工，当与高度同源的sgRNA串联转录时，五个支架中的大部分显示了相对较差的活性。实际上，十二个支架的序列比对分析显示，显示出最高活性的串联支架对在两个sgRNA之间具有最大的序列差异(图17)。串联阵列的sgRNA代表共递送处于单一RNA转录物中的两个sgRNA的潜在有用的途径。虽然一些指导序列在第二位置中显现功能良好，但是优化sgRNA构造以将支架间序列差异最大化并改进结构稳定性可以辅助串联sgRNA的加工和活性。并且，sgRNA可以被设计为使得该系统是SIN。
实例5：在多聚谷氨酰胺疾病小鼠模型中CRISPR/Cas9体内基因组编辑效率和治疗益处。
该实例是结合图18理解的，其中申请人提供了在多聚谷氨酰胺疾病小鼠模型中，体内CRISPR/Cas9基因组编辑效率和治疗益处的证据。该实例证实了在脊髓小脑性共济失调1型小鼠模型(B05转基因小鼠系)中，使用AAV-递送的CRISPR/Cas9(AAV-CC9)(使用来自金黄色葡萄球菌的小Cas9核酸酶(SaCas9))对扩增的CAG三核苷酸重复进行的基因编辑。为了实现此目的，申请人开发了单一AAV载体，该载体表达CMV启动子驱动的带HA标签的SaCas9，并且包含驱动多聚体sgRNA转录物的表达的U6启动子盒(参见图18A)。当在细胞中表达时，该非编码RNA转录物被加工为释放与SaCas9复合的两个单独sgRNA以介导基因编辑。产生携带对照(靶向海肾(Renilla reniformis)荧光素酶基因)和抗-ATXN1 sgRNA的CTRL-AAV-CC9和ATXN1-AAV-CC9载体，并且使用立体定向仪将这些载体递送至成年SCA1/BO5小鼠的小脑中。SCA1/BO5转基因小鼠携带很多拷贝(>20)的突变体人类ATXN1转基因，该转基因包含84个CAG核苷酸重复，并且几乎唯一地表达在小脑浦肯野细胞中(伯里特(Burright)EN,克拉克(Clark)HB,塞尔瓦迪奥(Servadio)A,马蒂利亚(Matilla)T,费德森(Feddersen)RM,尤尼斯(Yunis)WS,杜维克(Duvick)LA,佐格比(Zoghbi)HY,奥尔(Orr)HT.SCA1转基因小鼠：一种用于由扩增的CAG三核苷酸重复引起的神经退行性变(SCA1transgenic mice:a model for neurodegeneration caused by an expanded CAGtrinucleotide repeat).细胞(Cell).1995年9月22日；82(6):937-48.PubMed PMID:7553854)。如在图18B中所示，在ATXN1-AAV-CC9递送后16周，HA-SaCas9的表达持续于SCA1/BO5浦肯野细胞的细胞核中(红色信号)。可以在对全部ATXN1CAG扩增进行PCR增多后检测到较快的迁移条带，确认了在SCA1/BO5小脑组织中突变体ATXN1CAG扩增的转基因的切除/编辑(图18C)。在编辑的和未编辑的PCR产物之间的比率的半定量分析表明41％的基因编辑效率。然而，在表达ATXN1-AAV-CC9载体的SCA1/BO5小鼠中，观察到ATXN1转基因表达的更显著丢失(通过qPCR得出损失约80％的mRNA，并且如通过Western印迹检测到的损失约70％的蛋白)(图18D、18E)。ATXN1转基因主要表达于浦肯野细胞(由AAV高度转导)中同时ATXN1转基因基因组序列存在于所有细胞(包括浦肯野细胞)的基因组中的事实解释了在基于基因组的PCR和基于mRNA的qPCR测定之间基因编辑效率方面的明显矛盾。最终，在与非注射的或注射对照的SCA1/BO5小鼠相比时，在旋转仪器中注射有ATXN1-AAV-CC9的小鼠表现更好。在表型进展中的这种影响提供了在注射的SCA1/BO5小鼠中观察到的突变体ATXN1转基因失活的程度；证明了本发明的效力；并且提供了出人意料的且更优的结果，因为这种结果在先前通过其他基因组编辑技术是不可实现的。
参考文献
班克(Banker)G、戈斯林(Goslin)K，神经元细胞培养物中的发育(Developmentsin neuronal cell culture).《自然》(Nature).1988年11月10日；336(6195):185-6。
比德尔(Bedell)、V.M.等人，使用高效率TALEN系统进行体内基因组编辑(In vivogenome editing using a high-efficiency TALEN system).《自然》(Nature)491，114-U133(2012)。
布哈雅(Bhaya)，D.、戴维森(Davison)，M.&巴郎镐(Barrangou)，R.，细菌和古细菌中的CRISPR-Cas系统：用于获得性防御和调节的通用小RNA(CRISPR-Cas systems inbacteria and archaea:versatile small RNAs for adaptive defense andregulation).《遗传学年评》(Annu Rev Genet)45，273-297(2011)。
博维斯-沃佐维奇(Bobis-Wozowicz)，S.、奥斯克(Osiak)，A.、拉赫曼(Rahman)，S.H.&凯思曼(Cathomen)，T.，使用锌指核酸酶的多能干细胞中的靶向基因组编辑(Targeted genome editing in pluripotent stem cells using zinc-fingernucleases).《方法》(Methods)53，339-346(2011)。
博赫(Boch)，J.等人，打破TAL-III型效应器的DNA结合特异性的密码(Breakingthe code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors).《科学》(Science)326，1509-1512(2009)。
伯根哈根(Bogenhagen)，D.F.&布朗(Brown)，D.D.，转录终止所需的非洲蟾蜍5SDNA中的核苷酸序列(Nucleotide sequences in Xenopus 5S DNA required fortranscription termination).《细胞》(Cell)24，261-270(1981)。
布尔特曼(Bultmann)，S.等人，通过组合设计者TALE和抑制表观遗传修饰剂而靶向转录激活沉默的oct4多能性基因(Targeted transcriptional activation of silentoct4pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition ofepigenetic modifiers).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)40，5368-5377(2012)。
卡尔松(Carlson)，D.F.等人，家畜中的有效的TALEN介导的基因敲除(EfficientTALEN-mediated gene knockout in livestock).《美国国家科学院院刊》(Proc NatlAcad Sci U S A)109，17382-17387(2012)。
陈(Chen)，F.Q.等人，使用ssDNA寡核苷酸用锌指核酸酶进行高效基因组编辑(High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-fingernucleases).《自然方法》(Nat Methods)8，753-U796(2011)。
陈(Chen),Y.H.,M.常(Chang),以及B.L.戴维森(Davidson),疾病脑内皮的分子特征提供了用于CNS-引导的酶疗法的新位点(Molecular signatures of disease brainendothelia provide new sites for CNS-directed enzyme therapy).自然医学(NatMed),2009.15(10):第1215-8页。
陈(Chen),Y.H.,等人,在溶酶体贮存病的小鼠模型中唾液酸沉积损害AAV9的效用，但不损害用于脑基因疗法的肽修饰的AAV的效用(Sialic acid deposition impairsthe utility of AAV9,but not peptide-modified AAVs for brain gene therapy in amouse model of lysosomal storage disease).分子理论(Mol Ther),2012.20(7):第1393-9页。
丘(Cho)，S.W.、吉姆(Kim)，S.、吉姆(Kim)，J.M.&吉姆(Kim)，J.S.，在人细胞中用Cas9RNA-指导的核酸内切酶进行的靶标基因组工程化(Targetedgenome engineering inhuman cells with the Cas9RNA-guided endonuclease).《自然生物技术》(NatBiotechnol)31，230-232(2013)。
克里斯汀(Christian),M.等人，用TAL效应器核酸酶靶向DNA双链断裂(TargetingDNA double-strand breaks with TAL effector nucleases).《遗传学》(Genetics)186,757-761(2010)。
丛(Cong)，L.等人，使用CRISPR-Cas系统进行的多元基因组工程化(Multiplexgenome engineering using CRISPR/Cas systems).《科学》(Science)339，819-823(2013)。
戴维森(Davidson),B.L.,等人,重组的腺相关病毒2、4、和5型载体：变体细胞类型的转导以及在哺乳动物中枢神经系统中的区域(Recombinant adeno-associated virustype 2,4,and 5vectors:transduction of variant cell types and regions in themammalian central nervous system).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U SA),2000.97(7):第3428-32页。
戴维森(Davidson),B.L.以及J.A.基奥里尼(Chiorini),重组的腺相关病毒载体4和5型。CNS基因转移的制备和应用(Recombinant adeno-associated viral vector types4and 5.Preparation and application for CNS gene transfer).分子医学方法(Methods Mol Med),2003.76:第269-85页。
戴尔特彻瓦(Deltcheva)，E.等人，通过反式编码的小RNA和宿主因子RNA酶III进行的CRISPR RNA成熟(CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and hostfactor RNase III).《自然》(Nature)471，602-607(2011)。
德沃(Deveau)，H.、加尔诺(Garneau)，J.E.&莫万诺(Moineau)，S.，CRISPR-Cas系统及其在噬菌体-细菌相互作用中的角色(CRISPR-Cas system and its role in phage-bacteria interactions).微生物学年鉴(Annu Rev Microbiol)64，475-493(2010)。
丁(Ding)，Q.等人，一种用于产生人类干细胞基的疾病模型的TALEN基因组编辑系统(A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based diseasemodels).《细胞—干细胞》(Cell Stem Cell)12，238-251(2013)。
加尔诺(Garneau)，J.E.等人，CRISPR-Cas细菌免疫系统切割噬菌体和质粒DNA(The CRISPR-Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmidDNA).《自然》(Nature)468，67-71(2010)。
加斯诺斯(Gasiunas)，G.、巴郎镐(Barrangou)，R.、霍瓦特(Horvath)，P.&西克斯尼斯(Siksnys)，V.，Cas9-crRNA核糖核蛋白复合体在细菌中针对获得性免疫介导特异的DNA切割(Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavagefor adaptive immunity in bacteria).《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci US A)109，E2579-2586(2012)。
格尤特思(Geurts)，A.M.等人，经由胚胎微注射锌指核酸酶敲除大鼠(KnockoutRats via Embryo Microinjection of Zinc-Finger Nucleases).《科学》(Science)325，433-433(2009)。
格雷(Gray)SJ、福蒂(Foti)SB、施瓦兹(Schwartz)JW、帕夏博纳(Bachaboina)L、泰勒-布雷克(Taylor-Blake)B、科尔曼(Coleman)J、埃莱尔(Ehlers)MD、泽尔卡(Zylka)MJ、麦克考恩(McCown)TJ、萨穆尔斯基(Samulski)RJ.，使用自互补载体优化外周和中枢神经系统中的重组腺相关病毒介导的基因表达的启动子(Optimizing promoters for recombinantadeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and centralnervous system using self-complementary vectors).《人类基因治疗》(Hum GeneTher.)2011年9月；22(9):1143-53.doi:10.1089/hum.2010.245。
格斯钦(Guschin)，D.Y.等人，用于监测内源性基因修饰的快速和一般分析(Arapid andgeneral assay formonitoring endogenousgenemodification).《方法分子生物学》(Methods Mol Biol)649，247-256(2010)。
黑斯蒂(Hasty)，P.、里维拉-佩雷斯(Rivera-Perez)，J.&布兰得利(Bradley)，A.，胚胎干细胞中的基因靶向所需的同源性长度(The length of homology required forgene targeting in embryonic stem cells).《分子与细胞生物学》(Mol Cell Biol)11，5586-5591(1991)。
霍瓦特(Horvath)，P.&巴尔朗勾(Barrangou)，R.，CRISPR-Cas，细菌和古细菌的免疫系统(CRISPR-Cas，the immune system of bacteria and archaea).《科学》(Science)327，167-170(2010)。
徐(Hsu)，P.D.&张(Zhang)，F.，使用靶向的基因组工程技术剖分神经功能(Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies).《ACS化学神经科学》(ACS Chem Neurosci)3，603-610(2012)。
休斯(Hughes),S.M.,等人,病毒介导的基因转移到小鼠原代神经前体细胞(Viral-mediated gene transfer to mouse primary neural progenitor cells).分子理论(Mol Ther),2002.5(1):第16-24页。
黄(Hwang)，W.Y.等人，使用CRISPR-Cas系统在斑马鱼中进行有效的基因组编辑(Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system).《自然生物技术》(Nat Biotechnol)31，227-229(2013)。
江(Jiang)，W.、比卡德(Bikard)，D.、科克斯(Cox)，D.、张(Zhang)，F.&马拉菲尼(Marraffini)，L.A.，使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA指导的编辑(RNA-guidedediting of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems).《自然生物技术》(NatBiotechnol)31，233-239(2013)。
季聂克(Jinek)，M.等人，在自适应细菌免疫中的可编程双重-RNA-指导的DNA核酸内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity).《科学》(Science)337，816-821(2012)。
季聂克(Jinek)，M.等人，人类细胞中的RNA编程的基因组编辑(RNA-programmedgenome editing in human cells).eLife 2，e00471(2013)。
卡普利特(Kaplitt)，M.G.等人，用携带腺相关病毒(AAV)的GAD基因对帕金森病进行基因治疗的安全性与可容许性：开放标签的I期试验(Safety and tolerability ofgene therapy with an adeno-associated virus(AAV)borne GAD gene for Parkinson’s disease:an open label，phase I trial).《柳叶刀》(Lancet).2007年6月23日；369(9579):2097-105。
莱维特(Levitt)N.、布里格斯(Briggs)D.、吉尔(Gil)A.、普劳德富特(Proudfoot)N.J.，高效的合成的聚(A)位点的定义(Definition of an efficient synthetic poly(A)site).《基因开发》(Genes Dev)1989；3:1019–1025。
刘(Liu)D、费舍尔(Fischer)I.，两个替代性启动子指导大鼠微管相关蛋白质1B基因的神经元特异性表达(Two alternative promoters direct neuron-specificexpression of the rat microtubule-associated protein 1B gene).《神经科学杂志》(J Neurosci.)1996年8月15日；16(16):5026-36。
刘(Liu),G.,等人,腺相关病毒4型(AAV4)靶向室下区和RMS中的室管膜和星形胶质细胞(Adeno-associated virus type 4(AAV4)targets ependyma and astrocytes inthe subventricular zone and RMS).基因理论(Gene Ther),2005.12(20):第1503-8页。
洛佩斯(Lopes)，V.S.等人，使用腺相关病毒用大MYO7A cDNA进行的视网膜基因治疗(Retinal gene therapy with a large MYO7A cDNA using adeno-assocaitedvirus).《基因治疗》(Gene Ther)，2013年1月24日，doi:10.1038/gt 2013.3.[Epub优先出版]
洛特里(Lotery),A.J.,等人,腺相关病毒5型：在灵长目动物视网膜中的转导效率和细胞类型特异性(Adeno-associated virus type 5:transduction efficiency andcell-type specificity in the primate retina).人类基因理论(Hum Gene Ther),2003.14(17):第1663-71页。
马赫福兹(Mahfouz)，M.M.等人，具有新颖的DNA结合特异性的从头工程化的转录激活因子样效应器(TALE)杂合核酸酶产生双链断裂(De novo-engineered transcriptionactivator-like effector(TALE)hybrid nuclease with novel DNA bindingspecificity creates double-strand breaks).《美国国家科学院院刊》(Proc Natl AcadSci U S A)108，2623-2628(2011)。
马卡洛夫(Makarova)，K.S.等人，CRISPR-Cas系统的进化与分类(Evolution andclassification of the CRISPR-Cas systems).《自然微生物学综述》(Nat RevMicrobiol)9，467-477(2011)。
玛丽(Mali)，P.等人，经由Cas9进行RNA-指导的人类基因组工程化(RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9).《科学》(Science)339，823-826(2013)。
麦克卢尔(McClure)C、科尔(Cole)KL、伍尔夫(Wulff)P、克卢格曼(Klugmann)M、默里(Murray)AJ，重组腺相关病毒载体的产生和滴度测定(Production and titering ofrecombinant adeno-associated viral vectors).《可视化实验杂志》(J Vis Exp)，2011年11月27日；(57):e3348.doi:10.3791/3348。
米凯利斯(Michaelis)，L.M.，Maud“Die kinetik der invertinwirkung.”《生物化学》(Biochem.)z(1913)。
米勒(Miller)，J.C.等人，用于高度特异的基因组编辑的改进的锌指核酸酶构造(An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genomeediting).《自然生物技术》(Nat Biotechnol)25，778-785(2007)。
米勒(Miller)，J.C.等人，用用于有效基因组编辑的TALE核酸酶构造(A TALEnuclease architecture for efficient genome editing).《自然生物技术》(NatBiotechnol)29，143-148(2011)。
莫斯科(Moscou)，M.J.&保达诺夫(Bogdanove)，A.J.，简单的密码管理由TAL效应器进行的DNA识别(A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors).《科学》(Science)326，1501(2009)。波蒂厄斯(Porteus)，M.H.&巴尔的摩(Baltimore)，D.，嵌合的核酸酶刺激人类细胞中的基因靶向(Chimeric nucleases stimulate gene targetingin human cells).《科学》(Science)300，763(2003)。
墨索里诺(Mussolino)，C.等人，新颖的TALE核酸酶支架允许与较低的毒性组合的较高的基因组编辑活性(A novel TALE nuclease scaffold enables high genomeediting activity in combination with low toxicity).《核酸研究》(Nucleic acidsresearch)39，9283-9293(2011)。
纳斯瓦尼(Nathwani)，A.C.等人，腺病毒相关病毒载体介导的B型血友病的基因转移(Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophiliaB).《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med.)2011年12月22日；365(25):2357-65.doi:10.1056/NEJMoa1108046.电子出版日2011年12月10日。
奥利韦拉(Oliveira)，T.Y.等人，转位捕获测序：一种用于高通量标绘染色体重排的方法(Translocation capture sequencing:a method for high throughput mappingof chromosomal rearrangements).《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods)375，176-181(2012)。
佩雷斯(Perez),E.E.等人，使用锌指核酸酶通过基因组编辑在CD4(+)T细胞中建立HIV-1抗性(Establishment of HIV-1resistance in CD4(+)Tcells by genomeediting using zinc-finger nucleases).《自然生物技术》(NatBiotechnol)26,808-816(2008)。
齐(Qi)，L.S.等人，改变CRISPR作为RNA-指导的平台以用于基因表达的序列特异性控制.《细胞》(Cell)152，1173-1183(2013)。
兰(Ran)，F.A.等人，通过RNA-指导的CRISPR Cas9形成双切口以用于增强的基因组编辑特异性(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genomeediting specificity).细胞(Cell)2013，154(6):第1380-9页。
兰(Ran)，F.A.等人，使用CRISPR-Cas9系统进行基因组工程化(Genomeengineering using the CRISPR-Cas9system).自然方案(Nat Protoc)，2013.8(11):第2281-308页。
雷明顿药物科学(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(马克出版公司(MackPub.Co.)，新泽西州1991)
雷荣(Reyon)，D.等人，用于高通量基因组编辑的TALEN的FLASH组装(FLASHassembly of TALENs for high-throughput genome editing).《自然生物技术》(NatBiotechnol)30，460-465(2012)。
罗德里格斯-勒布朗(Rodriguez-Lebron),E.,等人,等位基因特异性减轻阿耳茨海默病的转基因模型中的表型进展(RNAiAllele-specific RNAi mitigates phenotypicprogression in a transgenic model of Alzheimer's disease).分子理论(Mol Ther),2009.17(9):第1563-73页。
萨利赫-德哈利(Saleh-Gohari)，N.&荷雷德(Helleday)，T.，保守同源重组优先修复人类细胞中的处于细胞周期的S期的DNA双链断裂(Conservative homologousrecombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phaseof the cell cycle in human cells).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)32，3683-3688(2004)。
桑德尔(Sander)，J.D.等人，通过情境依赖性组装的无选择性锌指核酸酶工程(CoDA)(Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependentassembly(CoDA)).《自然方法》(Nat Methods)8，67-69(2011)。
萨亚纳(Sanjana)，N.E.等人，用于基因组工程的转录激活因子样效应器工具箱(Atranscription activator-like effector toolbox for genome engineering).《自然-实验手册》(Nat Protoc)7，171-192(2012)。
萨普拉诺斯卡斯(Sapranauskas)，R.等人，嗜热链球菌CRISPR-Cas系统在大肠杆菌中提供免疫力(The Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas system providesimmunity in Escherichia coli).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)39，9275-9282(2011)。
沈(Shen)，B.等人，经由Cas9/RNA介导的基因靶向产生基因修饰的小鼠(Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting).《细胞研究》(Cell Res)23，720-723(2013)。
斯米蒂斯(Smithies)，O.、格雷格(Gregg)，R.G.、博格斯(Boggs)，S.S.、科拉雷斯基(Koralewski)，M.A.&库切尔拉帕提(Kucherlapati)，R.S.，提供同源重组将DNA序列插入人类染色体β-珠蛋白座位中(Insertion of DNAsequences into the human chromosomalbeta-globin locus byhomologous recombination).《自然》(Nature)317，230-234(1985)。
索德奈尔(Soldner)，F.等人，产生在两个早期发作的帕金森蛋白点突变处排他地相异的同基因多能干细胞(Generation of isogenic pluripotent stem cellsdiffering exclusively at two early onset Parkinson point mutations).《细胞》(Cell)146，318-331(2011)。
高须(Takasu)，Y.等人，使用锌指核酸酶mRNA注射靶向诱变家蚕(Targetedmutagenesis in the silkworm Bombyx mori using zinc finger nuclease mRNAinjection).《昆虫生物化学与分子生物学》(Insect Biochem Molec)40，759-765(2010)。
腾格里(Tangri)S等人，具有减少的免疫原性的合理工程化的治疗性蛋白质(Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity)，《免疫学杂志》(J Immunol.)2005年5月15日；174(6):3187-96。
托马斯(Thomas)，K.R.、福尔杰(Folger)，K.R.&卡佩基(Capecchi)，M.R.，将基因高频靶向哺乳动物基因组中的特定位点(High frequency targeting of genes tospecific sites in the mammalian genome).《细胞》(Cell)44，419-428(1986)。
杜施(Tuschl)，T.，扩展小RNA干扰(Expanding small RNA interference).《自然生物技术》(Nat Biotechnol)20，446-448(2002)。
浦部(Urabe),M.,C.丁(Ding),以及R.M.科廷(Kotin),昆虫细胞作为产生腺相关病毒2型载体的工厂(Insect cells as a factory to produce adeno-associated virustype 2vectors).人类基因理论(Hum Gene Ther),2002.13(16):第1935-43页。
乌尔诺夫(Urnov)，F.D.、雷巴尔(Rebar)，E.J.、福尔摩斯(Holmes)，M.C.、张(Zhang)，H.S.&格雷戈里，P.D.(Gregory，P.D.),用工程化的锌指核酸酶进行的基因组编辑(Genome editing with engineered zinc finger nucleases).《遗传学自然评论》(NatRev Genet)11，636-646(2010)。
沃尔顿(Valton)，J.等人，克服转录激活因子样效应器(TALE)DNA结合结构域对胞嘧啶甲基化的敏感性(Overcoming transcription activator-like effector(TALE)DNAbinding domain sensitivity to cytosinemethylation).《生物化学杂志》(J BiolChem)287，38427-38432(2012)。
王(Wang)，H.等人，在通过CRISPR-Cas介导的基因组工程一步产生携带多个基因突变的小鼠(One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genesby CRISPR-Cas-Mediated Genome Engineering).《细胞》(Cell)153，910-918(2013)。
渡边(Watanabe)，T.等人，使用锌指和TAL效应器核酸酶在半变态昆虫中进行非转基因基因组修饰(Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insectusing zinc-finger and TAL effector nucleases).《自然通讯》(Nat Commun)3(2012)。
威尔逊(Wilson)，E.B.，可能的推断、继承法则与统计推断(Probable inference，the law of succession，and statistical inference).《美国统计协会杂志》(J Am StatAssoc)22，209-212(1927)。
伍德(Wood)，A.J.等人，使用ZFN和TALEN跨物种进行靶向的基因组编辑(Targetedgenome editing across species using ZFNs and TALENs).《科学》(Science)333，307(2011)。
吴(Wu)，S.、应(Ying)，G.X.、吴(Wu)，Q.&卡佩基(Capecchi)，M.R.，一种用于构建基因靶向载体的方案：产生钙粘素家族及以外的基因敲除小鼠(A protocol forconstructing gene targeting vectors:generating knockout mice for the cadherinfamily and beyond).《自然-实验手册》(Nat Protoc)3，1056-1076(2008)。
杨(Yang),G.S.,等人,病毒介导的用腺相关病毒转导鼠类视网膜：病毒衣壳和基因组大小的影响(Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus:effects of viral capsid and genome size).病毒学杂志(JVirol),2002.76(15):第7651-60页。
扎布纳(Zabner),J.,等人,腺相关病毒5型(AAV5)但不是AAV2结合至气道上皮的顶面，并且促进基因转移(Adeno-associated virus type 5(AAV5)but not AAV2binds tothe apical surfaces of airway epithelia and facilitates gene transfer).病毒学杂志(J Virol),2000.74(8):第3852-8页。
张(Zhang)，F.等人，有效构建用于调控哺乳动物转录的序列特异的TAL效应器(Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription).《自然生物技术》(Nat Biotechnol)29，149-153(2011)。
***
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。

Claims (38)

1.一种用于在具有缺陷型核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核苷酸重复元件或核苷酸扩增的细胞中使用的非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
A.
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种第一指导序列，该至少一种第一指导序列能够杂交到该细胞内的靶DNA上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的多核苷酸序列上，
其中项A.I和项A.II包含CRISPR-Cas系统，并且其中所述组合物当转录时包含
CRISPR复合物，该CRISPR复合物包含与(1)杂交到或可杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
其中该指导序列引导CRISPR复合物与该靶DNA的序列特异性结合，并且介导对该缺陷的影响或修复；
或，
B.
I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
(a)至少一种指导序列，该至少一种指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
(b)至少一种tracr配对序列，和
(c)至少一种tracr序列，并且
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
II.CRISPR酶，
其中项B.I和项B.II包含该CRISPR复合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该细胞是真核细胞。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该CRISPR-Cas系统进行了密码子优化。
4.如权利要求2所述的组合物，其中项A.II包含对于一个或多个核定位信号(NLS)的编码；或项B.II包含一个或多个NLS。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中项A.I是由第一病毒载体编码，并且项A.II是由第二病毒载体编码。
6.如权利要求5所述的组合物，其中该第一病毒载体和该第二病毒载体是慢病毒载体或重组AAV。
7.如权利要求6所述的组合物，其中该重组AAV基因组包含反向末端重复(iTR)。
8.如权利要求7所述的组合物，其中该CRISPR酶的表达是由该AAV基因组中的该反向末端重复(iTR)驱动的。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该第一调节元件是III型RNA聚合酶启动子，并且该第二调节元件是III型RNA聚合酶启动子。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该第一调节元件是U6启动子或H1启动子。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该第二调节元件是遍存表达启动子或细胞类型特异性启动子。
12.如前述权利要求1中任一项所述的组合物，其中存在包含FLAG-标签的选择标记。
13.如权利要求4所述的组合物，其中该CRISPR酶包含C-末端NLS和N-末端NLS。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，是经由注射进行递送。
15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该组合物或其部分是经由脂质体、纳米粒子、外泌体或微囊泡进行递送。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该指导序列引导该CRISPR复合物与该靶DNA序列的序列特异性结合并且改变该细胞中基因组座位的表达。
17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR复合物介导结合至或者双链或单链DNA断裂，并且可以任选地存在DNA的插入，借此在该细胞中存在基因组座位的编辑。
18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR-Cas系统是多元CRISPR酶系统，该多元CRISPR酶系统进一步包含多种嵌合体和/或多种多指导序列和单一tracr序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶是切口酶。
20.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR-Cas系统是多元CRISPR酶系统以最小化脱靶活性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶包含一个或多个突变。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中该CRISPR酶包含选自D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A中的一个或多个突变。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中该一个或多个突变是在该CRISPR酶的RuvC1结构域内。
24.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中该CRISPR酶进一步包含功能结构域。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR复合物介导基因组工程化，该基因组工程化包括：修饰靶多核苷酸或其表达，敲除基因、增强或增加或减少多核苷酸或基因的表达、或修复突变、或通过插入多核苷酸进行编辑。
26.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR酶是Cas9。
27.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该CRISPR复合物介导至少一个双链DNA断裂，由此引起对该靶DNA的编辑。
28.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该细胞是哺乳动物脑细胞或中枢神经组织细胞。
29.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该核苷酸重复元件选自以下项中的一种或多种：包含CTG、CAG、CGG、CCG、GAA、或TTC的三核苷酸重复；包含CCTG的四核苷酸重复，包含ATTCT或AGAAT的五核苷酸重复；包含GGGGCC的六核苷酸重复；以及包含CCCCGCCCCGCG或CGCGGGGCGGGG的十二核苷酸重复。
30.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该缺陷产生了选自以下项中的一种或多种的病症：脆性X(FXS)；脆性X震颤共济失调(FXTAS)；翁韦里希特-伦德伯格氏病(EPM1)；脊髓小脑性共济失调12型(SCA12)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；额颞叶痴呆(FTD)；弗里德赖希共济失调；强直性肌营养不良1型(DM1)；强直性肌营养不良2型(DM2)；脊髓小脑性共济失调8型(SCA8)；脊髓小脑性共济失调10型(SCA10)；脊髓小脑性共济失调31型(SCA31)；眼咽肌营养不良(OPMD)；脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)；脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)；脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)；脊髓小脑性共济失调6型(SCA6)；脊髓小脑性共济失调7型(SCA7)；脊髓小脑性共济失调17型(SCA17)；齿状红核-苍白球吕伊斯体萎缩症(DRPLA)；脊延髓肌萎缩症(SBMA)；亨廷顿氏病样2型(HDL2)以及亨廷顿氏病(HD)。
31.一种治疗或抑制具有缺陷型核苷酸元件或三核苷酸重复元件或其他核苷酸重复元件或核苷酸扩增的细胞中的病症的方法，该方法包括递送如权利要求1-30中任一项所述的非天然存在的或工程化的组合物。
32.如权利要求1-30中任一项所述的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。
33.如权利要求32所述的用途，其中该疾病或障碍包括脑疾病或障碍或中枢神经系统疾病或障碍。
34.如权利要求1-30中任一项中定义的组合物在制造药剂中的用途，该药剂用于在离体基因或基因组编辑中使用、或用于在通过操纵感兴趣基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用、或者在治疗或抑制病症的方法中使用。
35.如权利要求34所述的用途，其中该病症包括脑疾病或障碍或中枢神经系统疾病或障碍。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法、用途或组合物，其中该CRISPR-Cas系统RNA是嵌合RNA(chiRNA)。
37.如任一前述权利要求所述的方法、用途或组合物，进一步包括至少一种第二指导序列，该至少一种第二指导序列能够杂交到该CRISPR-Cas系统的RNA序列上或杂交到用于该CRISPR-Cas复合物的组分的表达的核酸分子上，以减弱或消除该系统或复合物的功能表达，借此该系统或复合物自行失活。
38.如权利要求38所述的方法、用途或组合物，其中该第二指导序列能够杂交到用于表达该CRISPR酶的核酸分子上。
CN201480072798.9A 2013-12-12 2014-12-12 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法 Pending CN106029880A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361915150P 2013-12-12 2013-12-12
US61/915,150 2013-12-12
US201462010888P 2014-06-11 2014-06-11
US201462010879P 2014-06-11 2014-06-11
US62/010,888 2014-06-11
US62/010,879 2014-06-11
PCT/US2014/069902 WO2015089354A1 (en) 2013-12-12 2014-12-12 Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106029880A true CN106029880A (zh) 2016-10-12

Family

ID=52273577

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480072798.9A Pending CN106029880A (zh) 2013-12-12 2014-12-12 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法
CN201480072803.6A Pending CN106103705A (zh) 2013-12-12 2014-12-12 核苷酸重复障碍中crispr‑cas系统的组合物和使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480072803.6A Pending CN106103705A (zh) 2013-12-12 2014-12-12 核苷酸重复障碍中crispr‑cas系统的组合物和使用方法

Country Status (12)

Country Link
US (5) US10851357B2 (zh)
EP (4) EP3080258A1 (zh)
JP (2) JP6625055B2 (zh)
KR (2) KR20160097338A (zh)
CN (2) CN106029880A (zh)
AU (2) AU2014362245A1 (zh)
BR (2) BR112016013547A2 (zh)
CA (2) CA2932472A1 (zh)
IL (2) IL246118A0 (zh)
MX (2) MX2016007325A (zh)
SG (2) SG10201804973TA (zh)
WO (2) WO2015089351A1 (zh)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105793425A (zh) * 2013-06-17 2016-07-20 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
CN110234762A (zh) * 2016-10-28 2019-09-13 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN110337493A (zh) * 2016-10-28 2019-10-15 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN110799645A (zh) * 2017-04-12 2020-02-14 博德研究所 新型vi型crispr直系同源物和系统
CN110959039A (zh) * 2017-03-15 2020-04-03 博德研究所 新型cas13b直向同源物crispr酶和系统
CN112543650A (zh) * 2018-04-24 2021-03-23 利甘达尔股份有限公司 基因组编辑的方法和组合物
CN113106081A (zh) * 2018-10-29 2021-07-13 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统
CN113544270A (zh) * 2018-12-23 2021-10-22 美国杰特贝林生物制品有限公司 用于递送细胞调节剂的纳米胶囊
CN113710799A (zh) * 2018-11-28 2021-11-26 克里斯珀医疗股份公司 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA
CN113874504A (zh) * 2019-04-23 2021-12-31 莱特比奥有限公司 核酸构建体和其制造方法
CN114958920A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 北京中因科技有限公司 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用
WO2023108405A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 中国科学院深圳先进技术研究院 重组载体及其构建方法和应用
US11708588B2 (en) 2016-06-16 2023-07-25 Adam Brian Robertson Gene editing
WO2024046393A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海鲸奇生物科技有限公司 非神经元细胞转分化为神经元的方法及应用

Families Citing this family (279)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012333134B2 (en) 2011-07-22 2017-05-25 John Paul Guilinger Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CA2879997A1 (en) * 2012-07-25 2014-01-30 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP3327127B1 (en) 2012-12-12 2021-03-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
JP6738728B2 (ja) 2013-06-17 2020-08-19 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 肝臓ターゲティングおよび治療のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ベクターおよび組成物の送達および使用
WO2014204725A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
CN106029880A (zh) 2013-12-12 2016-10-12 布罗德研究所有限公司 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN118813621A (zh) 2013-12-12 2024-10-22 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CN106164271B (zh) 2014-02-11 2020-06-02 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） Crispr支持的多路基因组工程化
ES2879373T3 (es) * 2014-03-18 2021-11-22 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión de proteínas de dedo de zinc
US10280418B2 (en) 2014-03-18 2019-05-07 Univeristy Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2015173436A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
RU2020109343A (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
RU2719192C2 (ru) 2014-11-14 2020-04-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Модулирующие полинуклеотиды
CA2967367C (en) 2014-11-14 2023-05-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
PL3221457T3 (pl) 2014-11-21 2019-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do celowanej modyfikacji genetycznej z zastosowaniem sparowanych przewodników RNA
EP3626832B1 (en) 2014-11-25 2024-06-12 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Method of identifying a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
KR102350405B1 (ko) * 2014-12-16 2022-01-11 다니스코 유에스 인크. 진균 게놈 변형 시스템 및 사용 방법
EP3234192B1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 The Broad Institute, Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
WO2016106244A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
CN107787367B (zh) 2015-04-06 2021-10-26 里兰斯坦福初级大学理事会 用于crispr/cas介导的基因调控的化学修饰的引导rna
KR20230174291A (ko) 2015-05-06 2023-12-27 스니프르 테크놀로지스 리미티드 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
MX2017014665A (es) * 2015-05-16 2018-04-24 Genzyme Corp Edicion de genes de mutaciones intronicas profundas.
WO2016187717A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
EP3302048B1 (en) 2015-05-29 2020-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus
WO2016196887A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
EP3307887A1 (en) 2015-06-09 2018-04-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
AU2016279062A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
IL284808B (en) 2015-06-18 2022-07-01 Broad Inst Inc Mutations in the crispr enzyme that reduce unintended effects
CA3012631A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
EP3310369B1 (en) * 2015-06-19 2022-05-04 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
EP3313989A4 (en) 2015-06-29 2018-12-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
CN108350446A (zh) * 2015-07-02 2018-07-31 约翰霍普金斯大学 基于crispr/cas9的治疗
US10166255B2 (en) * 2015-07-31 2019-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Intracellular genomic transplant and methods of therapy
WO2017024111A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 The University Of Chicago Inhibitors of cacna1a/alpha1a subunit internal ribosomal entry site (ires) and methods of treating spinocerebellar ataxia type 6
KR101777367B1 (ko) * 2015-09-09 2017-09-12 연세대학교 산학협력단 Fmr1 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제를 이용한 cgg 반복의 교정
US11667911B2 (en) 2015-09-24 2023-06-06 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/CAS-mediated genome editing
AU2016336452B2 (en) * 2015-10-06 2022-10-06 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating fragile X syndrome and related syndromes
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
EP3359662A4 (en) * 2015-10-09 2019-06-19 The Children's Hospital of Philadelphia COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING HUNTINGTON DISEASE AND RELATED DISEASES
CN109153980B (zh) 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
IL310721A (en) 2015-10-23 2024-04-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
EP3368687B1 (en) 2015-10-27 2021-09-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
EP3374494A4 (en) * 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR GENE THERAPY
WO2017083368A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
CA3005878A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
WO2017091630A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
MX2018007840A (es) * 2015-12-23 2019-05-02 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica y/o la degeneracion lobar frontotemporal.
WO2017136335A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-10 The Regents Of The University Of California Self-inactivating endonuclease-encoding nucleic acids and methods of using the same
US10973930B2 (en) 2016-02-18 2021-04-13 The Penn State Research Foundation Generating GABAergic neurons in brains
WO2017161325A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
WO2017165167A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
US12011488B2 (en) 2016-03-23 2024-06-18 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
EP4047092A1 (en) 2016-04-13 2022-08-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US20190167814A1 (en) * 2016-04-14 2019-06-06 Université de Lausanne Treatment And/Or Prevention Of DNA-Triplet Repeat Diseases Or Disorders
EP3445856A1 (en) 2016-04-19 2019-02-27 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3026112A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
CA3026055A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3024448A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
EP3472321A2 (en) * 2016-06-17 2019-04-24 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
WO2017223538A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for generating barcoded combinatorial libraries
EP3478829A1 (en) 2016-06-29 2019-05-08 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders
WO2018002783A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
WO2018002886A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia 3 (sca3) and other related disorders
WO2018005873A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
WO2018002762A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) and other related disorders
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018035387A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11630103B2 (en) 2016-08-17 2023-04-18 The Broad Institute, Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
EP3500671B1 (en) 2016-08-17 2024-07-10 The Broad Institute, Inc. Method of selecting target sequences for the design of guide rnas
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US20190262399A1 (en) 2016-09-07 2019-08-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
CN109715804A (zh) * 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
AU2017336100B2 (en) 2016-09-30 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a C9ORF72 locus
US20200016202A1 (en) 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
IT201600102542A1 (it) * 2016-10-12 2018-04-12 Univ Degli Studi Di Trento Plasmide e sistema lentivirale contenente un circuito autolimitante della Cas9 che ne incrementa la sicurezza.
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US9963719B1 (en) * 2016-12-05 2018-05-08 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for one-shot guide RNA (ogRNA) targeting of endogenous and source DNA
US20200040345A1 (en) * 2016-12-08 2020-02-06 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3562515A4 (en) * 2016-12-29 2020-11-18 Applied StemCell, Inc. GENE EDITING PROCESS USING A VIRUS
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
GB201702847D0 (en) * 2017-02-22 2017-04-05 Cancer Res Tech Ltd Cell labelling, tracking and retrieval
EP3585898A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11963966B2 (en) 2017-03-31 2024-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
EP3610266A4 (en) 2017-04-12 2021-04-21 Massachusetts Eye and Ear Infirmary TUMOR SIGNATURE OF METASTASIS, COMPOSITIONS OF SUBSTANCES AND USES THEREOF
WO2018191520A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
WO2018195486A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
AU2018261790B2 (en) 2017-05-05 2024-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3622062A4 (en) 2017-05-10 2020-10-14 The Regents of the University of California DIRECTED EDITING OF CELLULAR RNA BY NUCLEAR ADMINISTRATION OF CRISPR / CAS9
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
KR102678809B1 (ko) 2017-05-18 2024-06-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
EP3635113A4 (en) 2017-06-05 2021-03-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center GENOMIC SAFE HARBORS FOR GENETIC THERAPIES IN HUMAN STEM CELLS AND MANIPULATED NANOPARTICLES TO DELIVER TARGETED GENETIC THERAPIES
CA3065813A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
KR20240027153A (ko) * 2017-06-15 2024-02-29 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 표적화된 비-바이러스 dna 삽입
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CA3064601A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas-adenine deaminase based compositions, systems, and methods for targeted nucleic acid editing
WO2019006436A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Inscripta, Inc. METHODS, MODULES, INSTRUMENTS AND SYSTEMS FOR AUTOMATED CELL PROCESSING
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2019014581A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A CYTOTOXIC LYMPHOCYTE
EP3654993A4 (en) 2017-07-17 2021-08-25 The Broad Institute, Inc. HUMAN COLON CELL ATLAS IN GOOD HEALTH WITH HEMORRHAGIC RECTO-COLITIS
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
KR102338449B1 (ko) 2017-09-21 2021-12-10 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법, 및 조성물
WO2019060686A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Massachusetts NEW DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND USES THEREOF
EP3692152A4 (en) 2017-10-04 2021-12-01 The Broad Institute, Inc. PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN LOOPS AND / OR DOMAINS
US11680296B2 (en) 2017-10-16 2023-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Mycobacterium tuberculosis host-pathogen interaction
AU2018352592A1 (en) 2017-10-16 2020-06-04 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019079772A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center SYSTEMS AND METHODS FOR GENETICALLY MODIFIED B-LYMPHOCYTES FOR EXPRESSING SELECTED ANTIBODIES
AU2018355343A1 (en) * 2017-10-24 2020-05-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of rare diseases
EP3707155A2 (en) * 2017-11-09 2020-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas systems for treatment of dmd
CN111727251B (zh) * 2017-11-21 2024-09-20 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗常染色体显性色素性视网膜炎的材料和方法
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
CN108103090B (zh) * 2017-12-12 2021-06-15 中山大学附属第一医院 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
EP3781711A4 (en) 2018-04-19 2022-01-26 Massachusetts Institute Of Technology SINGLE STRAND BREAK DETECTION IN DOUBLE STRAND DNA
WO2019204828A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 The Regents Of The University Of California Fusion proteins and fusion ribonucleic acids for tracking and manipulating cellular rna
WO2019204750A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Cellino Biotech, Inc. Directed cell fate specification and targeted maturation
SI3560330T1 (sl) 2018-04-24 2022-08-31 KWS SAAT SE & Co. KGaA Rastline z izboljšano prebavljivostjo in markerskimi haplotipi
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
US20210147831A1 (en) 2018-04-27 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
CA3098458A1 (en) * 2018-04-29 2019-11-07 University Of Massachusetts Raav-mediated nuclease-associated vector integration (raav-navi)
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
JOP20200283A1 (ar) * 2018-05-09 2020-11-08 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن atxn3
EP3806961A4 (en) 2018-05-11 2022-10-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTI-PIK3CA MUTATION T-CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGN AND USE OF GUIDE RNA
US20210371932A1 (en) 2018-06-01 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
EP4219720A3 (en) * 2018-06-13 2023-08-30 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
US10227576B1 (en) 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
KR20210040943A (ko) 2018-06-26 2021-04-14 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 Crispr 이펙터 시스템 기반 증폭 방법, 시스템, 및 진단
CN112368396A (zh) 2018-06-26 2021-02-12 博德研究所 基于crispr/cas和转座酶的扩增组合物、系统和方法
CA3106035A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 The Broad Institute, Inc. Cas12b enzymes and systems
EP3834202A4 (en) * 2018-08-08 2022-05-11 Deep Genomics Incorporated SYSTEMS AND METHODS FOR DETERMINING EFFECTS OF THERAPIES AND GENETIC VARIATION ON POLYADENYLATION SITE SELECTION
IL292273B2 (en) 2018-08-14 2023-10-01 Inscripta Inc Devices, modules and methods for improved detection of edited sequences in living cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US20210324357A1 (en) 2018-08-20 2021-10-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
US20210317429A1 (en) 2018-08-20 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US20210317479A1 (en) 2018-09-06 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
WO2020061229A2 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Vnv Newco Inc. Arc-based capsids and uses thereof
CA3113325A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich A method to treat disease using a nucleic acid vector encoding a highly compact multi-input logic gate
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
BR112021007229A2 (pt) * 2018-10-16 2021-08-10 Blueallele, Llc métodos para inserção dirigida de dna em genes
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
CA3115534A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Inscripta, Inc. Engineered nucleic acid-guided nucleases
JP2022512895A (ja) * 2018-11-01 2022-02-07 ブルーアレル， エルエルシー 遺伝性障害のための遺伝子発現を改変するための方法
EP3876746A2 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Triton Algae Innovations, Inc. Methods for overproducing protoporphyrin ix in algae and compositions therefrom
RU2699670C1 (ru) * 2018-11-16 2019-09-09 Объединенный Институт Ядерных Исследований (Оияи) Способ повышения частоты образования двунитевых разрывов днк в клетках человека при действии ионизирующих излучений в условиях влияния радиомодификаторов
US20230212604A1 (en) * 2018-12-11 2023-07-06 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Methods and compositions for efficient and precise gene editing in mammalian brain to prevent or treat nervous system disorders
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
WO2020131862A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
IT201800020230A1 (it) 2018-12-19 2020-06-19 Univ Degli Studi Di Siena Sistema CRISPR-Cas per la terapia genica.
CN116064550A (zh) 2018-12-20 2023-05-05 瑞泽恩制药公司 核酸酶介导的重复扩增
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3947691A4 (en) 2019-03-25 2022-12-14 Inscripta, Inc. SIMULTANEOUS MULTIPLEX GENOME EDITING IN A YEAST
AU2020248337A1 (en) * 2019-03-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating ATTR amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
EP3966327A1 (en) * 2019-05-08 2022-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
WO2020229533A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
US20220243178A1 (en) 2019-05-31 2022-08-04 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
EP3953477A4 (en) 2019-06-06 2022-06-22 Inscripta, Inc. HARDENING FOR RECURSIVE NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDITING
US10920189B2 (en) 2019-06-21 2021-02-16 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2020263639A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 The Penn State Research Foundation Methods and materials for treating huntington's disease
CN112168808B (zh) * 2019-07-02 2023-01-24 深圳市第二人民医院 一种基于crispr的细胞核靶向药物递送系统
KR20220038362A (ko) 2019-07-02 2022-03-28 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 재조합 ad35 벡터 및 관련 유전자 요법 개선
WO2021011504A1 (en) * 2019-07-12 2021-01-21 Duke University Nanoparticle systems for targeted delivery of crispr/cas13 and methods of using same
US20220290139A1 (en) * 2019-07-15 2022-09-15 National University Of Singapore Methods and compositions for gene specific demethylation and activation
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
TW202118873A (zh) * 2019-08-27 2021-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療與重複性ｄｎａ有關之病症之組合物及方法
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
CN115103910A (zh) 2019-10-03 2022-09-23 工匠开发实验室公司 具有工程化的双引导核酸的crispr系统
CN114846022A (zh) 2019-10-17 2022-08-02 科沃施种子欧洲股份两合公司 通过阻抑基因的下调增强作物的疾病抗性
EP4051789A4 (en) * 2019-11-01 2023-11-08 The Broad Institute Inc. TYPE I-B CRISPR-ASSOCIATED TRANSPOSASE SYSTEMS
IL293148A (en) * 2019-11-19 2024-07-01 Protalix Ltd Removal of constructs from transduced cells
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021102084A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 President And Fellows Of Harvard College Ionic liquids for drug delivery
WO2021118626A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Inscripta, Inc. Novel mad nucleases
WO2021126886A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Inscripta, Inc. Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
CN115135370A (zh) 2020-01-27 2022-09-30 因思科瑞普特公司 电穿孔模块和仪器
EP4126072A4 (en) * 2020-03-30 2024-07-24 Blueallele Llc METHODS OF INTEGRATING DNA INTO GENES WITH GAIN OF FUNCTION OR LOSS OF FUNCTION MUTATIONS
WO2021215827A1 (ko) * 2020-04-21 2021-10-28 기초과학연구원 Cas9 또는 cas9 변이체를 이용한 유전체 교정
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
CN111471720A (zh) * 2020-05-26 2020-07-31 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用
CN116782762A (zh) 2020-05-29 2023-09-19 科沃施种子欧洲股份两合公司 植物单倍体诱导
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
WO2022150269A1 (en) 2021-01-07 2022-07-14 Inscripta, Inc. Mad nucleases
EP4277647A1 (en) * 2021-01-12 2023-11-22 University of Massachusetts Allele-specific inactivation of mutant htt via gene editing at coding region single nucleotide polymorphisms
CN112626070A (zh) * 2021-01-13 2021-04-09 海南微氪生物科技股份有限公司 一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022197857A1 (en) * 2021-03-16 2022-09-22 The General Hospital Corporation Compositions and methods for the treatment of conditions associated with nucleotide repeat expansion
WO2022204543A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and materials for treating huntington's disease
KR20240012425A (ko) 2021-05-10 2024-01-29 엔트라다 테라퓨틱스, 인크. 세포내 치료제를 위한 조성물 및 방법
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
KR20240038967A (ko) 2021-06-23 2024-03-26 엔트라다 테라퓨틱스, 인크. Cug 반복을 표적화하기 위한 안티센스 화합물 및 방법
AR126622A1 (es) 2021-07-30 2023-10-25 Kws Saat Se & Co Kgaa Plantas con digestibilidad mejorada y haplotipos marcadores
KR20240055811A (ko) 2021-09-10 2024-04-29 애질런트 테크놀로지스, 인크. 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
AU2022359915A1 (en) 2021-10-08 2024-05-02 President And Fellows Of Harvard College Ionic liquids for drug delivery
CR20240195A (es) 2021-10-14 2024-06-20 Arsenal Biosciences Inc Células inmunitarias que tienen arnhc coexpresados y sistemas de compuerta lógica
MX2024005318A (es) 2021-11-01 2024-09-23 Tome Biosciences Inc Plataforma de construccion unica para el suministro simultaneo de maquinaria de edicion de genes y carga de acido nucleico.
CN114295594B (zh) * 2021-12-06 2023-09-19 贵州理工学院 一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023250324A2 (en) * 2022-06-21 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for reducing rna levels
WO2023250325A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating huntington's disease
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
CN116064667B (zh) * 2022-12-09 2024-07-02 中南大学湘雅医院 基于CRISPR/Cas9的人源化ATXN3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024216128A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trems for use in correction of missense mutations

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013130824A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Family Cites Families (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE141646T1 (de) 1986-04-09 1996-09-15 Genzyme Corp Genetisch transformierte tiere, die ein gewünschtes protein in milch absondern
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US6007845A (en) 1994-07-22 1999-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers
US7745416B2 (en) 1995-04-11 2010-06-29 The Regents Of The University Of California Method for in vivo regulation of cardiac muscle contractility
CA2223103A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
GB9720465D0 (en) 1997-09-25 1997-11-26 Oxford Biomedica Ltd Dual-virus vectors
NZ504214A (en) 1997-10-24 2003-06-30 Invitrogen Corp Recombination cloning using nucleic acids having recombination sites
US6750059B1 (en) 1998-07-16 2004-06-15 Whatman, Inc. Archiving of vectors
GB0024550D0 (zh) 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
US7033744B2 (en) 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
DK1385538T3 (da) 2001-04-05 2013-04-29 Univ Johns Hopkins Kimære vacciner omfattende det lumenale domæne fra LAMP-1 eller LAMP-2
WO2003006477A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
AU2002327430A1 (en) 2001-08-08 2003-02-24 Genzyme Corporation Methods for treating diabetes and other blood sugar disorders
WO2003016338A1 (en) 2001-08-15 2003-02-27 Parker Hughes Institute Crystal structure of the btk kinase domain
AU2002336760A1 (en) 2001-09-26 2003-06-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Mutable vaccines
GB0125216D0 (en) 2001-10-19 2001-12-12 Univ Strathclyde Dendrimers for use in targeted delivery
WO2003056022A2 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for producing a transgenic organism using a lentiviral expression vector such as eiav
US7539579B2 (en) 2002-04-09 2009-05-26 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
WO2003104414A2 (en) 2002-06-11 2003-12-18 The Scripps Research Institute Artificial transcription factors
JP4722481B2 (ja) 2002-06-28 2011-07-13 プロティバ バイオセラピューティクス リミテッド リポソーム製造方法および装置
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
US20080226553A1 (en) 2002-09-27 2008-09-18 Cold Spring Harbor Laboratory Cell-Based Rna Interference and Related Methods and Compositions
WO2004046321A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Trustees Of Boston University Cis/trans riboregulators
US20060178297A1 (en) 2003-01-28 2006-08-10 Troy Carol M Systems and methods for silencing expression of a gene in a cell and uses thereof
JP2007524399A (ja) 2003-07-03 2007-08-30 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 機能性ｄｎａエレメントおよび細胞性タンパク質のゲノムマッピング
CN101291653B (zh) 2003-07-16 2012-06-27 普洛体维生物治疗公司 脂质包封的干扰rna
EP2927318B1 (en) 2003-08-08 2020-05-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2004272646B2 (en) 2003-09-15 2011-11-24 Arbutus Biopharma Corporation Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
GB0325379D0 (en) 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
FR2862659B1 (fr) 2003-11-21 2006-02-10 Pasteur Institut Genome de legionella pneumophila souche paris- applications diagnostiques et epidemiologiques
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
WO2005074511A2 (en) 2004-01-27 2005-08-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for homozygous gene inactivation using collections of pre-defined nucleotide sequences complementary to chromosomal transcripts
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
BRPI0513390A (pt) 2004-07-16 2008-05-06 Us Gov Health & Human Serv vacinas contra aids contendo construções de ácido nucléico cmv/r
GB0422877D0 (en) 2004-10-14 2004-11-17 Univ Glasgow Bioactive polymers
EP1874794A4 (en) 2005-04-28 2009-07-29 Benitec Ltd MULTIPLE RNAI EXPRESSION CASSETTES FOR THE SIMULTANEOUS DELIVERY OF RNAI AGENTS ASSOCIATED WITH HETEROZYGOT EXPRESSION PATTERNS
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
SG10201508995QA (en) 2005-07-26 2015-11-27 Sangamo Biosciences Inc Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
DK2336362T3 (en) 2005-08-26 2019-01-21 Dupont Nutrition Biosci Aps USE OF CRISPR-ASSOCIATED GENES (CAS)
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
WO2007106690A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
US8748567B2 (en) 2006-05-22 2014-06-10 Children's Medical Center Corporation Method for delivery across the blood brain barrier
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP2008078613A (ja) 2006-08-24 2008-04-03 Rohm Co Ltd 窒化物半導体の製造方法及び窒化物半導体素子
WO2008093152A1 (en) 2007-02-01 2008-08-07 Cellectis Obligate heterodimer meganucleases and uses thereof
CN104531672B (zh) 2007-03-02 2020-01-10 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
CA2711179A1 (en) 2007-12-31 2009-07-16 Nanocor Therapeutics, Inc. Rna interference for the treatment of heart failure
US20100081707A1 (en) 2008-02-21 2010-04-01 Ali Robin R Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
DK2279254T3 (en) 2008-04-15 2017-09-18 Protiva Biotherapeutics Inc PRESENT UNKNOWN LIPID FORMS FOR NUCLEIC ACID ADMINISTRATION
AU2009265170A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Silenseed Ltd Methods, compositions and systems for local delivery of drugs
EP2309980A1 (en) 2008-07-08 2011-04-20 S.I.F.I. Societa' Industria Farmaceutica Italiana Ophthalmic compositions for treating pathologies of the posterior segment of the eye
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US20110016540A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
AU2009324534B2 (en) 2008-12-10 2015-07-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. GNAQ targeted dsRNA compositions and methods for inhibiting expression
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
CA2757831C (en) 2009-04-07 2017-09-26 Dow Agrosciences Llc Nanoparticle mediated delivery of sequence specific nucleases
WO2011036510A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genome of the herpes simplex virus and uses thereof
WO2010143917A2 (en) 2009-06-11 2010-12-16 Toolgen Incorporation Targeted genomic rearrangements using site-specific nucleases
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
SG177711A1 (en) 2009-07-24 2012-02-28 Sigma Aldrich Co Llc Method for genome editing
EP2461819A4 (en) 2009-07-28 2013-07-31 Sangamo Biosciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING TRI-NUCLEOTIDE REPEAT DISORDERS
WO2011028929A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 The Regents Of The University Of California Nitrate-responsive promoter
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
EP2504439B1 (en) 2009-11-27 2016-03-02 BASF Plant Science Company GmbH Optimized endonucleases and uses thereof
JP2013513389A (ja) 2009-12-10 2013-04-22 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ Ｔａｌエフェクターに媒介されるｄｎａ修飾
JP2013515697A (ja) 2009-12-23 2013-05-09 マックスプランク−ゲセルシャフト・ツール・フェーデルング・デル・ヴィッセンシャフテン・エー・ファウ インフルエンザ標的
CA2788850C (en) 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
ES2536791T3 (es) 2010-05-28 2015-05-28 Oxford Biomedica (Uk) Ltd Administración de vectores lentivirales al cerebro
EP3489359A1 (en) 2010-07-23 2019-05-29 Sigma Aldrich Co. LLC Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
EP2601611B1 (en) 2010-08-02 2020-12-09 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
WO2012031205A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
AU2011316575B2 (en) 2010-10-12 2015-10-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia B
EP2691443B1 (en) 2011-03-28 2021-02-17 Massachusetts Institute of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
HRP20220036T1 (hr) 2011-04-22 2022-04-01 The Regents Of The University Of California Virioni adeno-povezanog virusa s varijantom kapsida i postupci njihove upotrebe
KR102068107B1 (ko) 2011-04-27 2020-01-20 아미리스 인코퍼레이티드 게놈 변형 방법
US20120295960A1 (en) 2011-05-20 2012-11-22 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Treatment regimen for parkinson's disease
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
IL277027B (en) 2011-09-21 2022-07-01 Sangamo Therapeutics Inc Methods and preparations for regulating transgene expression
WO2013052681A1 (en) 2011-10-06 2013-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulating hiv infection
US20130122096A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 Silenseed Ltd. Compositions for drug delivery and methods of manufacturing and using same
CA2855653A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Universite Laval Methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
JP6348064B2 (ja) 2011-11-22 2018-06-27 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 効率の高いトランスジーン送達のためのウイルスベクター
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
SG10201604896TA (en) 2011-12-16 2016-08-30 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
SG11201407970VA (en) 2012-06-01 2014-12-30 Univ Drexel Modulation of hepatitis b virus cccdna transcription
CA2879997A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
DK2906684T3 (da) 2012-10-10 2020-09-28 Sangamo Therapeutics Inc T-celle-modificerende forbindelser og anvendelser deraf
SG10201809566SA (en) 2012-10-23 2018-11-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CA2891347C (en) 2012-12-06 2018-02-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP2931898B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP3327127B1 (en) 2012-12-12 2021-03-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP3705490B1 (en) 2012-12-12 2024-03-06 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
CN113355357A (zh) 2012-12-12 2021-09-07 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
WO2014093595A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG11201504621RA (en) 2012-12-17 2015-07-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
WO2014124226A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
US11135273B2 (en) 2013-02-07 2021-10-05 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
US9163837B2 (en) 2013-02-27 2015-10-20 Siemens Aktiengesellschaft Flow conditioner in a combustor of a gas turbine engine
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
EP4428141A2 (en) 2013-03-15 2024-09-11 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
ES2645931T3 (es) 2013-03-27 2017-12-11 Wilco Ag Método de inspección y/o de prueba en línea de dispositivos y aparato para realizar tal método
ES2747833T3 (es) 2013-04-04 2020-03-11 Dartmouth College Composiciones y procedimientos para la escisión in vivo del ADN proviral del vih-1
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
ES2670531T3 (es) 2013-05-29 2018-05-30 Cellectis S.A. Un método para producir una escisión de ADN precisa utilizando la actividad nickasa de Cas9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2023-03-27 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
AU2014274840B2 (en) 2013-06-05 2020-03-12 Duke University RNA-guided gene editing and gene regulation
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
WO2014204725A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG11201510286QA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
BR112015031611A2 (pt) 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
JP6738728B2 (ja) 2013-06-17 2020-08-19 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 肝臓ターゲティングおよび治療のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ベクターおよび組成物の送達および使用
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
LT3019619T (lt) 2013-07-11 2021-12-10 Modernatx, Inc. Sintetinius polinukleotidus apimančios kompozicijos, koduojančios susijusius su crispr baltymus ir sintetines sgrnas, ir jų naudojimo būdai
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
CN106102781A (zh) 2013-08-29 2016-11-09 英联邦高等教育系统天普大学 用于hiv感染的rna指导的治疗的方法和组合物
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
EP3375877A1 (en) 2013-11-18 2018-09-19 Crispr Therapeutics AG Crispr-cas system materials and methods
CN106029880A (zh) * 2013-12-12 2016-10-12 布罗德研究所有限公司 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
EP3079726B1 (en) 2013-12-12 2018-12-05 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
CN103668472B (zh) 2013-12-31 2014-12-24 北京大学 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法
US10354746B2 (en) 2014-01-27 2019-07-16 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying CRISPR/Cas off-target sites
CN103923911B (zh) * 2014-04-14 2016-06-08 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA
JP6323228B2 (ja) 2014-07-18 2018-05-16 富士電機株式会社 電力変換装置
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
DK3180426T3 (da) 2014-08-17 2020-03-30 Broad Inst Inc Genomredigering ved anvendelse af cas9-nickaser
EP3858990A1 (en) 2015-03-03 2021-08-04 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
KR20230174291A (ko) 2015-05-06 2023-12-27 스니프르 테크놀로지스 리미티드 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형
IL284808B (en) 2015-06-18 2022-07-01 Broad Inst Inc Mutations in the crispr enzyme that reduce unintended effects
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
JP6186470B2 (ja) 2016-04-20 2017-08-23 パイオニア株式会社 音響装置、音量制御方法、音量制御プログラム及び記録媒体
EP3585898A1 (en) * 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013130824A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LE CONG 等: ""Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems"", 《SCIENCE》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105793425A (zh) * 2013-06-17 2016-07-20 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
US11708588B2 (en) 2016-06-16 2023-07-25 Adam Brian Robertson Gene editing
CN110234762A (zh) * 2016-10-28 2019-09-13 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN110337493A (zh) * 2016-10-28 2019-10-15 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN110337493B (zh) * 2016-10-28 2024-03-12 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN110959039A (zh) * 2017-03-15 2020-04-03 博德研究所 新型cas13b直向同源物crispr酶和系统
US11840711B2 (en) 2017-04-12 2023-12-12 The Broad Institute, Inc. Type VI CRISPR orthologs and systems
CN110799645A (zh) * 2017-04-12 2020-02-14 博德研究所 新型vi型crispr直系同源物和系统
CN112543650A (zh) * 2018-04-24 2021-03-23 利甘达尔股份有限公司 基因组编辑的方法和组合物
CN113106081A (zh) * 2018-10-29 2021-07-13 中国农业大学 新型CRISPR/Cas12f酶和系统
CN113710799A (zh) * 2018-11-28 2021-11-26 克里斯珀医疗股份公司 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA
CN113544270A (zh) * 2018-12-23 2021-10-22 美国杰特贝林生物制品有限公司 用于递送细胞调节剂的纳米胶囊
CN113874504A (zh) * 2019-04-23 2021-12-31 莱特比奥有限公司 核酸构建体和其制造方法
CN114958920A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 北京中因科技有限公司 一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其制备方法和应用
WO2023108405A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 中国科学院深圳先进技术研究院 重组载体及其构建方法和应用
WO2024046393A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 上海鲸奇生物科技有限公司 非神经元细胞转分化为神经元的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201804974RA (en) 2018-07-30
BR112016013547A2 (pt) 2017-10-03
JP6625055B2 (ja) 2020-01-08
IL246116B (en) 2021-04-29
CA2932436A1 (en) 2015-06-18
US11591581B2 (en) 2023-02-28
WO2015089354A1 (en) 2015-06-18
IL246118A0 (en) 2016-07-31
SG10201804973TA (en) 2018-07-30
EP3080257A1 (en) 2016-10-19
EP3080258A1 (en) 2016-10-19
MX2016007325A (es) 2017-07-19
AU2014362248A1 (en) 2016-06-16
US20190153412A1 (en) 2019-05-23
KR20160097331A (ko) 2016-08-17
JP6712948B2 (ja) 2020-06-24
US10851357B2 (en) 2020-12-01
JP2017501699A (ja) 2017-01-19
IL246116A0 (en) 2016-07-31
US20230365950A1 (en) 2023-11-16
AU2014362245A1 (en) 2016-06-16
US20160355796A1 (en) 2016-12-08
BR112016013520A2 (pt) 2017-10-03
CN106103705A (zh) 2016-11-09
WO2015089351A1 (en) 2015-06-18
KR20160097338A (ko) 2016-08-17
JP2017501151A (ja) 2017-01-12
EP3653703A1 (en) 2020-05-20
US20160354487A1 (en) 2016-12-08
US20210277370A1 (en) 2021-09-09
MX2016007326A (es) 2017-02-13
CA2932472A1 (en) 2015-06-18
EP3653704A1 (en) 2020-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106029880A (zh) 核苷酸重复障碍中CRISPR-Cas系统的组合物和使用方法
US20210277371A1 (en) Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
US10377998B2 (en) CRISPR-CAS systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular CAS enzymes
AU2015101792A4 (en) Engineering of systems, methods and optimized enzyme and guide scaffolds for sequence manipulation
CN106061510B (zh) 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
CN110312799A (zh) 新型crispr酶和系统
CN105899658A (zh) 针对hbv和病毒性疾病以及障碍的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
CN108290933A (zh) 降低脱靶效应的crispr酶突变
CN107995927A (zh) 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途
CA2932475A1 (en) Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161012