JP5570806B2 - Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００６年５月１１日に出願された米国仮出願第６０／７９９，４５８号、２００６年６月２７日に出願された米国仮出願第６０／８１７，２０３号、２００６年８月２５日に出願された米国仮出願第６０／８４０，０８９号、２００６年１０月１８日に出願された米国仮出願第６０／８２９，９１４号、２００７年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／９０１，１３４号への優先権を主張する。これらの仮出願の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、およびＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉の媒介におけるその使用、ならびに高脂血症など、ＰＣＳＫ９をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程を治療するためのそのｄｓＲＮＡの使用に関する。

プロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。その他の８種の哺乳類サブチリシンプロテアーゼ、ＰＣＳＫ１〜ＰＣＳＫ８（ＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＣ７およびＳ１Ｐ／ＳＫＩ−１とも呼ばれる）は、分泌経路においてさまざまなタンパク質を処理し、多様な生物学的プロセスにおいて役割を果たすプロタンパク質コンバターゼである（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｆ．（２０００年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４巻、１〜２２頁、Ｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｋ．、（１９９８年）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９巻、１１〜１７頁、Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．（１９９９年）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８４８巻、４５〜６２頁、Ｔａｙｌｏｒ，Ｎ．Ａ．、（２００３年）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７巻、１２１５〜１２２７頁およびＺｈｏｕ，Ａ．、（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、２０７４５〜２０７４８頁）。ＰＣＳＫ９は、コレステロール代謝において役割を果たすことが提唱されている。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ発現は、コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と同様に、マウスでは、食餌によるコレステロール摂食によってダウンレギュレートされ（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．、（２００３年）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４巻、２１０９〜２１１９頁）、ＨｅｐＧ２細胞ではスタチンによってアップレギュレートされ（Ｄｕｂｕｃ，Ｇ．、（２００４年）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４巻、１４５４〜１４５９頁）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスではアップレギュレートされる（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００巻、１２０２７〜１２０３２頁）。さらに、ＰＣＳＫ９ミスセンス突然変異は、常染色体優性高コレステロール血症の一形態（Ｈｃｈｏｌａ３）と関連していることがわかっている（Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．ら（２００３年）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４巻、１５４〜１５６頁、Ｔｉｍｍｓ，Ｋ．Ｍ．、（２００４年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４巻、３４９〜３５３頁、Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４年）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５巻、４１９〜４２２頁）。ＰＣＳＫ９はまた、母集団におけるＬＤＬコレステロールレベルの決定においても役割を果たしている可能性があるが、これは、日本人の集団では、一塩基多型（ＳＮＰ）がコレステロールレベルと関連しているからである（Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．、（２００４年）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９巻、１０９〜１１４頁）。

常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は、一遺伝子による疾患であり、これでは、患者が、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫および早発性アテローム性動脈硬化症を示す（Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．、（２００３年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１巻、１７９５〜１８０３頁）。ＡＤＨおよび劣性型、常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．、（２００３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４巻、１２１〜１２７頁）の発病は、肝臓によるＬＤＬ取り込みにおける欠陥による。ＡＤＨは、ＬＤＬ取り込みを妨げるＬＤＬＲ突然変異によっても、またはＬＤＬ上のタンパク質、ＬＤＬＲと結合するアポリポタンパク質Ｂの突然変異によっても引き起こされ得る。ＡＲＨは、ＬＤＬＲ−ＬＤＬ複合体の、クラスリンとのその相互作用を介したエンドサイトーシスに必要なＡＲＨタンパク質の突然変異によって引き起こされる。したがって、ＰＣＳＫ９突然変異が、Ｈｃｈｏｌａ３ファミリーにおいて原因となる場合には、ＰＣＳＫ９が、受容体媒介性ＬＤＬ取り込みにおいて役割を果たしている可能性が高いと思われる。

過剰発現研究により、ＬＤＬＲレベル、したがって、肝臓によるＬＤＬ取り込みの制御におけるＰＣＳＫ９の役割が指摘されている（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１巻、７１００〜７１０５頁、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．ら（２００４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、４８８６５〜４８８７５頁、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．、（２００４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、５０６３０〜５０６３８頁）。３または４日間の、マウスまたはヒトＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介性過剰発現は、マウスでは、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルの上昇をもたらし、この効果は、ＬＤＬＲノックアウト動物では見られない（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１巻、７１００〜７１０５頁、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．ら（２００４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、４８８６５〜４８８７５頁、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．、（２００４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻、５０６３０〜５０６３８頁）。さらに、ＰＣＳＫ９過剰発現は、ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベルまたはＳＲＥＢＰタンパク質核対細胞質比には影響を及ぼさずに、肝臓ＬＤＬＲタンパク質の深刻な減少をもたらす。これらの結果は、ＰＣＳＫ９が、直接的にまたは間接的に、転写後機構によってＬＤＬＲタンパク質レベルを低下させるということを示唆するものである。

ＰＣＳＫ９における機能喪失突然変異が、マウスモデルで設計され（非特許文献１、ヒト個体において同定された（非特許文献２）。両方の場合において、ＰＣＳＫ９機能の喪失は、総コレステロールおよびＬＤＬｃコレステロールの低下につながる。１５年にわたるレトロスペクティブ予後研究では、１コピーのＰＣＳＫ９の喪失が、ＬＤＬｃを低く変化させ、心血管心疾患の発生からのリスク−便益保護の増大につながることが示された（非特許文献３）。今日までの証拠が、ＰＣＳＫ９レベルの低下がＬＤＬｃを低下させるということを示すことは明らかである。

最近、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構において遺伝子発現をブロックすることがわかった。特許文献１（Ｆｉｒｅら）には、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡはまた、その他の生物、例えば、植物（例えば、特許文献２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅらおよび特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚら参照のこと）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）１０：１１９１〜１２００頁）および哺乳類（ＷＯ００／４４８９５、ＬｉｍｍｅｒおよびＤＥ１０１００５８６．５、Ｋｒｅｕｔｚｅｒら参照のこと）において標的ＲＮＡを分解することもわかっている。この天然の機構は、今では、遺伝子の異常なまたは不要な調節によって引き起こされる障害を治療するための新規種類の医薬品の開発の焦点となっている。

国際公開第９９／３２６１９号パンフレット 国際公開第９９／５３０５０号パンフレット 国際公開第９９／６１６３１号パンフレット

Ｒａｓｈｉｄら、ＰＮＡＳ（２００５年）１０２巻、５３７４〜５３７９頁 Ｃｏｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００５年）３７巻、１６１〜１６５頁 Ｃｏｈｅｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００６年）３５４巻、１２６４〜１２７２頁

ＲＮＡｉの分野における大きな進歩およびＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の治療における進歩にもかかわらず、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を阻害でき、ＰＣＳＫ９遺伝子発現と関連している疾患、例えば、高脂血症を治療できる薬剤は依然として必要とされている。

要旨
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いてＰＣＳＫ９発現をサイレンシングすることによって、プロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）をダウンレギュレートすることによって調節され得る疾患を治療する問題に対する解決策を提供する。

本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにこのようなｄｓＲＮＡを用いて、細胞または哺乳類においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する組成物および方法を提供する。本発明はまた、高脂血症など、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る病状を治療するための組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さである領域を有し、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的であるＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。

一実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さである。ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。

例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１および表２のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列からなるものであり得、第２の配列は、表１および表２のアンチセンス配列からなる群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドからなるものであり得、または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドやコレステリル誘導体と連結している末端ヌクレオチドなどの少なくとも１種の修飾ヌクレオチドからなるものであり得る。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択され得る。通常、このような修飾配列は、表１および表２のセンス配列からなる群から選択される前記ｄｓＲＮＡの第１の配列、ならびに表１および表２のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づく。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの１種を含む細胞を提供する。この細胞は、通常、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞である。

別の実施形態では、本発明は、生物、通常、ヒト被験体において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物であって、１種または複数種の本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体または送達ビヒクルとを含む薬学的組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、以下の工程を含む、細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する：
（ａ）細胞に、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、ｄｓＲＮＡが、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含む工程。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖と、第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。

（ｂ）工程（ａ）において生じた細胞を、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する工程。

別の実施形態では、本発明は、高脂血症など、ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程を治療、予防または管理する方法であって、このような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量の１種または複数種の本発明のｄｓＲＮＡを投与する工程を含む方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、本発明のｄｓＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列を含むベクターを提供する。

別の実施形態では、本発明は、細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。このベクターは、本発明のｄｓＲＮＡの１種の少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列を含む。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞においてヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含み、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、該相補性の領域が、３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ。
（項目２）
上記第１の配列が、表１および２からなる群から選択され、上記第２の配列が、表１および２からなる群から選択される、項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目３）
少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む、項目１に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目４）
少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む、項目２に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目５）
上記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基と結合している末端ヌクレオチドからなる群から選択される、項目３に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目６）
上記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、項目３に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目７）
上記第１の配列が、表１および２からなる群から選択され、上記第２の配列が、表１および２からなる群から選択される、項目３に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目８）
上記第１の配列が、表１および２からなる群から選択され、上記第２の配列が、表１および２からなる群から選択される、項目６に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目９）
項目１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
（項目１０）
生物において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、ｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを含み、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含み、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、該相補性の領域が、３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する、薬学的組成物。
（項目１１）
上記ｄｓＲＮＡの上記第１の配列が、表１および２からなる群から選択され、上記ｄｓＲＮＡの上記第２の配列が、表１および２からなる群から選択される、項目１０に記載の薬学的組成物。
（項目１２）
上記ｄｓＲＮＡの上記第１の配列が、表１および２からなる群から選択され、上記ｄｓＲＮＡの上記第２の配列が、表１および２からなる群から選択される、項目１０に記載の薬学的組成物。
（項目１３）
細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための方法であって、
（ａ）該細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２種の配列を含み、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、該相補性の領域が、３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において生じた細胞を、該ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、該細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する工程と
を含む方法。
（項目１４）
ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程を治療、予防または管理する方法であって、該方法は、このような治療、予防または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効な量のｄｓＲＮＡを投与する工程を含み、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含み、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、該相補性の領域が、３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する、方法。
（項目１５）
細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列を含み、該ｄｓＲＮＡの鎖のうち一方が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該ｄｓＲＮＡが、３０塩基対未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
（項目１６）
項目１５に記載のベクターを含む細胞。
（項目１７）
細胞においてヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを低下させるための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、互いに相補的である少なくとも２種の配列を含み、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列を含み、該ｄｓＲＮＡが、該ＰＣＳＫ９を発現する細胞と接触した際、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルが低下する、二本鎖リボ核酸。
（項目１８）
上記接触によって、上記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルが低下する、項目１７に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目１９）
上記接触を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３０ｎＭ以下で実施する、項目１７に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目２０）
生物においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを低下させるための薬学的組成物であって、項目１７に記載のｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物。
（項目２１）
ＰＣＳＫ９が関連している障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の項目１７に記載のｄｓＲＮＡを投与する工程を含む、方法。
（項目２２）
ＰＣＳＫ９関連障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の項目１７に記載のｄｓＲＮＡを投与する工程を含む方法。

ＮＤ−９８脂質の構造を示す図である。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの種々のＯＲＦ領域を対象とする（グラフに示されるＯＲＦ位置に対応している第１のヌクレオチドを有する）、１６種のマウス特異的（ＡＬ−ＤＰ−９３２７〜ＡＬ−ＤＰ−９３４２）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示す図である。各処理群にわたって、肝臓溶解物における、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比の平均をとり、ＰＢＳで処理した対照群または非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群と比較した。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの種々のＯＲＦ領域を対象とする（グラフに示されるＯＲＦ位置に対応している第１のヌクレオチドを有する）１６種のヒト／マウス／ラット交差反応性（ＡＬ−ＤＰ−９３１１〜ＡＬ−ＤＰ−９３２６）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示す図である。各処理群にわたって、肝臓溶解物における、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比の平均をとり、ＰＢＳで処理した対照群または非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群と比較した。

ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのサイレンシングは、総血清コレステロールレベルの低下をもたらした。

ＰＳＣＫ９メッセージｓｉＲＮＡをノックダウンするという点で最も効果的なものが、最も顕著なコレステロール低下効果（約２０〜３０％）を示した。
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における、１６種のマウス特異的（ＡＬ−ＤＰ−９３２７〜ＡＬ−ＤＰ−９３４２）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示す図である。各処理群にわたって、総血清コレステロールレベルの平均をとり、ＰＢＳで処理した対照群または非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群と比較した。 Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹の動物／群）における、１６種のヒト／マウス／ラット交差反応性（ＡＬ−ＤＰ−９３１１〜ＡＬ−ＤＰ−９３２６）ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの結果を示す図である。各処理群にわたって、総血清コレステロールレベルの平均をとり、ＰＢＳで処理した対照群または非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群と比較した。 ＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ結果の比較を示す図である。 サル初代肝細胞を用いた、ＰＣＳＫ９のサイレンシングについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ結果を示す図である。 ｐｃｓｋ−９に対する、ＬＮＰ−０１に製剤されたｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す図である。 種々の時点での、ＬＮＰ−０１に製剤された化学修飾９３１４および１０７９２親分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す図である。修飾された形の１０７９２がｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング活性を示すことが明らかである。

発明の詳細な説明
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を用いてＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングすることによって、ＰＣＳＫ９遺伝子のダウンレギュレーションによって調節され得る疾患を治療する問題に対する解決策を提供し、したがって、高脂血症などの疾患のための治療を提供する。

本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにそのｄｓＲＮＡを用いて、細胞または哺乳類においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る病状および疾患を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによるｍＲＮＡの配列特異的分解を導く。

本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さである領域を有し、ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的であるＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡを使用することで、ナトリウム輸送に関与するｍＲＮＡの標的分解が可能となる。本発明者らは、細胞ベースのアッセイおよび動物アッセイを用いて、極めて低い投与量のこれらのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に媒介し、その結果、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の大幅な阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、ＰＣＳＫ９をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程を治療するのに、例えば、高脂血症の治療において有用である。

以下の詳細な説明は、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびに、高脂血症など、ＰＣＳＫ９の発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る疾患を治療するための組成物および方法を開示する。本発明の薬学的組成物は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを一緒に含む。

したがって、本発明の特定の態様は、本発明のｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを一緒に含む薬学的組成物、この組成物を用いてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法およびこの薬学的組成物を用いて、ＰＣＳＫ９の発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る疾患を治療する方法を提供する。

Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に用いた特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書のその他の部分における用語の用法とこの項に提供されるその定義の間に明らかな不一致がある場合には、この項にある定義を優先するものとする。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々通常、塩基として、それぞれグアニン、シトシン、アデニンおよびウラシル含むヌクレオチドを表す。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、以下にさらに詳述される修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指す場合があることは理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルは、このような置換部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、その他の部分によって置換され得るということは十分に承知している。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドで置換されている場合がある。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

本明細書において、「ＰＣＳＫ９」とは、プロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン９遺伝子またはタンパク質（ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ−１、ＮＡＲＣ１としても知られる）を指す。ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ配列は、ヒト：ＮＭ＿１７４９３６、マウス：ＮＭ＿１５３５６５およびラット：ＮＭ＿１９９２５３として提供されている。

本明細書において、「標的配列」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写の際に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分、例えば、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを指す。

本明細書において、用語「配列を含む鎖」とは、標準ヌクレオチド命名法を用いて呼ばれる配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書において、また特に断りのない限り、用語「相補的」とは、当業者には理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するために用いられる場合に、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、これでは、ストリンジェントな条件として、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０^ｏＣまたは７０^ｏＣで１２〜１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる。その他の条件、例えば、生物内で遭遇され得るような生理学的に関連のある条件を適用できる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用に従って、２種の配列の相補性の試験にとって最も適当な条件のセットを決定することができる。

これは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成を含む。このような配列は、本明細書では互いに対して「十分に相補的」と呼ばれ得る。しかし、本明細書において、第１の配列が、第２の配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合には、２種の配列は十分に相補的である場合もあり、または、その最終的な適用に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションの際に、１つまたは複数の、通常、４、３または２つ以下のミスマッチした塩基対を形成する場合もある。しかし、２種のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に、１つまたは複数の一本鎖突出を形成するよう設計されている場合には、このような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとみなされないものとする。例えば、一方のオリゴヌクレオチド、長さ２１ヌクレオチドと、もう一方のオリゴヌクレオチド、長さ２３ヌクレオチドとを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに対して十分に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的上、やはり「十分に相補的」と呼ぶことができる。

本明細書において「相補的な」配列とは、それらのハイブリダイズする能力に対する上記の必要条件が満たされている限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含み得る、またはそれらから全体的に形成されたものであり得る。

本明細書において、用語「相補的な」、「十分に相補的な」および「実質的に相補的な」とは、その使用の関連から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基マッチングに対して用いる場合もある。

本明細書において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的である」ポリヌクレオチドとは、注目する（例えば、ＰＣＳＫ９をコードする）ｍＲＮＡの連続部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分と実質的に相補的である場合に、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。

本明細書において、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とは、２種の逆平行の、上記で定義されるような実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。二本鎖構造を形成するこの２種の鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子のうちの異なる部分であってもよいし、または別個のＲＮＡ分子であってもよい。別個のＲＮＡ分子の場合には、このようなｄｓＲＮＡは、文献では、ｓｉＲＮＡ（「低分子干渉ＲＮＡ」）と呼ばれることが多い。２種の鎖が１つの大きな分子のうちの一部であり、したがって、一方の鎖の３’末端と、二本鎖構造を形成しているそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間で、ヌクレオチドの中断されていない鎖によって接続されている場合には、接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。２種の鎖が、一方の鎖の３’末端と、二本鎖構造を形成しているそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間で、ヌクレオチド中断されていない鎖以外の手段によって共有結合によって接続されている場合には、接続している構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同数のヌクレオチドを有する場合もあり、異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。塩基対の最大数は、最短のｄｓＲＮＡの鎖中のヌクレオチド数から二本鎖中に存在するあらゆる突出を差し引いたものである。ｄｓＲＮＡは、二本鎖構造に加え、１つまたは複数のヌクレオチド突出を含み得る。さらに、本明細書に用いられる「ｄｓＲＮＡ」は、リボヌクレオチドの化学修飾、例えば、複数のヌクレオチドでの相当な修飾を含み、本明細書に開示され、または当技術分野で知られているすべての種類の修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子において用いられる、このような修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。

本明細書において、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、もう一方の鎖の５’末端を越えて伸びている、またはその逆の場合に、対を形成していないヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出しているヌクレオチドを指す。「ブラント」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡの末端に対を形成していないヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖になっている、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡである。明確にするために、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端とコンジュゲートしている化学キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、ｓｉＲＮＡが突出を有するか、平滑末端化されているかどうかを判定する際には考慮されない。

用語「アンチセンス鎖」とは、標的配列と実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において、用語「相補性の領域」とは、本明細書において定義される、配列、例えば、標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に対して十分に相補的でない場合は、ミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在すれば、１つまたは複数の末端領域、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３または２ヌクレオチド内において通常許容される。

本明細書において、用語「センス鎖」とは、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。

「細胞に導入すること」は、ｄｓＲＮＡに関する場合には、当業者には理解されるであろうが、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的な拡散性細胞プロセスまたは能動的細胞プロセスを介して、または助剤もしくは装置によって起こり得る。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されるものではなく、ｄｓＲＮＡはまた、生命体の一部である「細胞に導入」され得る。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達には、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射してもよいし、全身投与してもよい。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入は、当技術分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。

用語「サイレンシングする」および「の発現を阻害する」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子に関する限り、本明細書では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指し、ＰＣＳＫ９遺伝子が転写され、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が阻害されるよう処理されている第１の細胞または細胞群から単離され得るＰＣＳＫ９遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量の、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのようには処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比べた減少によって示される。阻害度は通常、以下によって表される。

あるいは、阻害度は、ＰＣＳＫ９遺伝子転写と機能的に関連しているパラメータ、例えば、細胞によって分泌されるＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるタンパク質の量または特定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞数の減少という点から得てもよい。原則として、ＰＣＳＫ９遺伝子サイレンシングは、構成的に、または遺伝子操作によって標的を発現する任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって決定することができる。しかし、所与のｄｓＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を特定の程度に阻害するか、したがって、本発明に包含されるどうかを判定するために参照が必要とされる場合には、以下の実施例に示されるアッセイがこのような参照として役立つであろう。

例えば、特定の例では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。表１、２は、種々の濃度の種々のＰＣＳＫ９ ｄｓＲＮＡ分子を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて得られた発現の阻害についての広範な値を提供する。

本明細書において、ＰＣＳＫ９発現との関連で、用語「治療する」、「治療」などは、ＰＣＳＫ９遺伝子をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の軽減または緩和を指す。本発明との関連で、本明細書において以下の列挙される任意のその他の状態と関連する限り（ＰＣＳＫ９遺伝子をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程以外）、用語「治療する」、「治療」などは、このような状態と関連している少なくとも１つの症状を軽減または緩和すること、またはこのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。例えば、高脂血症との関連では、治療は、血清脂質レベルの低下を含む。

本明細書において、語句「治療上有効な量」および「予防上有効な量」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程またはＰＣＳＫ９遺伝子をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の顕在的症状の治療、予防または管理において治療上の利益を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、一般の開業医によって容易に決定することができ、当技術分野で既知の因子、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の種類、患者の病歴および年齢、ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の段階およびその他のＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程に反するものの投与に応じて変わり得る。

本明細書において、「薬学的組成物」は、薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを含む。本明細書において、「薬理学的に有効な量」、「治療上有効な量」または単純に「有効な量」とは、意図される薬理学的結果、治療結果または予防結果が生じるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連している測定可能なパラメータの少なくとも２５％の減少がある場合に所与の臨床治療が有効であると考えられる場合には、疾患または障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、そのパラメータの少なくとも２５％の減少を達成するのに必要な量である。

用語「薬学的に受容可能な担体」とは、治療薬を投与するための担体を指す。このような担体として、それだけには限らないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが挙げられ、以下により詳細に記載される。この用語は、厳密には、細胞培養培地を排除する。

本明細書において、「形質転換された細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子が発現され得るベクターが導入されている細胞である。

ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド未満の長さ、通常、１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、前記ｄｓＲＮＡは、前記ＰＣＳＫ９遺伝子を発現する細胞と接触した際、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である２種のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する、標的配列に対して実質的に相補的である、通常、十分に相補的である相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含み、その結果、２種の鎖は、適した条件下で組み合わされると、ハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する。一般に、二本鎖構造は、１５と３０の間、より一般には、１８と２５の間、さらにより一般には、１９と２４の間、最も一般には、１９と２１の間の塩基対の長さである。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５と３０の間、より一般には、１８と２５の間、さらにより一般には、１９と２４の間、最も一般には、１９と２１の間のヌクレオチドの長さである。本発明のｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチド突出をさらに含み得る。ｄｓＲＮＡは、以下にさらに論じられる当技術分野で既知の標準法によって、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザー、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものの使用によって合成できる。好ましい実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１および２のセンス配列から選択される鎖と、表１および２のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列とを含む。表１および２に提供される標的配列のどこかを標的とする代替アンチセンス作用物質は、標的配列およびフランキングＰＣＳＫ９配列を用いて容易に決定することができる。

さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表１および２に提供される配列の群から選択される少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む。その他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２種の配列を含み、少なくとも２種の配列のうち一方は、少なくとも２種の配列のもう一方に対して相補的であり、少なくとも２種の配列のうち一方は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現で生じるｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。通常、ｄｓＲＮＡは、２種のオリゴヌクレオチドを含み、１種のオリゴヌクレオチドは、表１および２においてセンス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表１および２においてアンチセンス鎖として記載される。

当業者ならば十分に承知しているであろうが、２０から２３具体的には、２１塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であると認められている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ２００１年、２０巻：６８７７〜６８８８頁）。しかし、他の者が、より短いか、より長いｄｓＲＮＡも、同様に有効であり得るということを見出した。上記の実施形態では、表１および２に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明のｄｓＲＮＡは、最小２１ｎｔの長さの少なくとも１種の鎖を含み得る。一方または両方の末端で数ヌクレオチド少ないだけの、表１および２の配列のうち１種を含むより短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得るということは合理的に期待できる。したがって、表１および２の配列のうちの１種に由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列を含み、本明細書において以下に記載されるＦＡＣＳアッセイにおいて、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するその能力が、全配列を含むｄｓＲＮＡと、５、１０、１５、２０、２５または３０％以下の阻害により異なるｄｓＲＮＡが本発明によって考慮される。表１および２に提供される標的配列内を切断するさらなるｄｓＲＮＡは、ＰＣＳＫ９配列および提供される標的配列を用いて容易に作製できる。

さらに、表１および２に提供されるＲＮＡｉ作用物質は、ＲＮＡｉに基づく切断に感受性のあるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ中の部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の作用物質の１種によって標的とされる配列内を標的とするＲＮＡｉ作用物質をさらに含む。本明細書において、第２のＲＮＡｉ作用物質は、第２のＲＮＡｉ作用物質が、第１のＲＮＡｉ作用物質のアンチセンス鎖に対して相補的であるｍＲＮＡ内のどこかのメッセージを切断する場合に、第１のＲＮＡｉ作用物質の配列内を標的とするといわれる。このような第２の作用物質は、通常、ＰＣＳＫ９遺伝子中の選択された配列と連続する領域から得られたさらなるヌクレオチド配列と結合している、表１および２に提供される配列のうち１種に由来する少なくとも１５の連続するヌクレオチドからなる。例えば、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の次の６ヌクレオチドと組み合わせた、配列番号１の最後の１５ヌクレオチド（加えられたＡＡ配列を引く）から、表１および２に提供される配列の１種に基づいている２１ヌクレオチドの一本鎖作用物質が生じる。

本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対して１つまたは複数のミスマッチを含み得る。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、わずか３つのミスマッチしか含まない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含む場合には、ミスマッチ領域が相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含む場合には、ミスマッチが、いずれかの末端から５ヌクレオチドに、例えば、相補性の領域の５’または３’末端のいずれかから５、４、３、２または１ヌクレオチドに限定されることが好ましい。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の領域と相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖については、ｄｓＲＮＡは、通常、中心の１３ヌクレオチド内にはミスマッチを全く含まない。本発明内に記載される方法を用いて、標的配列に対してミスマッチを含むｄｓＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを判定することができる。ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害において、ミスマッチを含むｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＰＣＳＫ９遺伝子中の特定の相補性の領域が、集団内に多型配列変動を有するとわかっている場合には重要である。

一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４、通常、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出を有する。少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、平滑末端化された対応物よりも予想外に優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、１つだけのヌクレオチド突出の存在が、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化するということを発見した。１つだけの突出を有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ならびに、さまざまな細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定かつ有効であるとわかった。通常、一本鎖突出は、アンチセンス鎖の３’末端に、あるいは、センス鎖の３’末端に位置している。ｄｓＲＮＡはまた、通常、アンチセンス鎖の５’末端に位置している平滑末端を有していてもよい。このようなｄｓＲＮＡは、改善された安定性と阻害活性を有しており、したがって、低い投与量、すなわち、１日あたり５ｍｇ／受容者の体重１ｋｇ未満での投与が可能となる。通常、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチド突出を有し、５’末端はブラントである。別の実施形態では、突出中の１つまたは複数のヌクレオチドが、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。

さらにもう１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、安定性を増強するよう化学修飾されている。本発明の核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡに記載されるものによって合成および／または修飾できる。化学修飾として、それだけには限らないが、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基のその他の部位での修飾、オリボヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学部分への共有結合およびヌクレオチドリン酸塩間結合の、チオリン酸塩などの別の結合での置換が挙げられる。１を超えるこのような修飾が用いられていてもよい。

２種の別個のｄｓＲＮＡ鎖の化学結合は、種々の周知の技術のうちいずれによっても、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用を導入することによって、金属イオンの配位によって、またはプリン類似体を用いることによって達成できる。通常、ｄｓＲＮＡを修飾するために用いることができる化学基として、制限するものではないが、メチレンブルー；二官能基、通常、ビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラーレンが挙げられる。一実施形態では、リンカーは、ヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合には、ｄｓＲＮＡは、固相合成によって作製され、ヘキサ−エチレングリコールリンカーが、標準方法に従って組み込まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．およびＫ．Ｂ．Ｈａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６年）３５巻：１４６６５〜１４６７０頁）。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端が、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に結合している。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端の化学結合は、通常、三重らせん結合によって形成される。表１および２は、本発明の修飾されたＲＮＡｉ作用物質の例を提供する。

さらにもう１つの実施形態では、２種の一本鎖の一方または両方のヌクレオチドが、例えば、制限するものではないが、特定のヌクレアーゼなどの細胞酵素の分解活性を妨げるか、阻害するよう修飾されている場合もある。核酸に対する細胞酵素の分解活性を阻害するための技術は、当技術分野で既知であり、それだけには限らないが、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電主鎖修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホルアミダート（例えば、Ｗａｇｎｅｒ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９５年）１巻：１１１６〜８頁参照のこと）が挙げられる。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基は、化学基によって、通常、２’−アミノまたは２’−メチル基によって置換される。また、少なくとも１つのヌクレオチドが、ロックドヌクレオチドを形成するよう修飾されてもよい。このようなロックドヌクレオチドは、リボースの２’−酸素を、リボースの４’−炭素と連結するメチレン橋を含む。ロックドヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８年）、５４巻：３６０７〜３６３０頁）およびＯｂｉｋａ，Ｓ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９８年）、３９巻：５４０１〜５４０４頁）に記載されている。オリゴヌクレオチドへの、ロックドヌクレオチドの導入によって、相補配列の親和性が改善され、融点が数度高まる（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．およびＤ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００１年）、８巻：１〜７頁）。

ｄｓＲＮＡにリガンドをコンジュゲートすることによって、細胞吸収ならびに特定の組織へのターゲッティングまたは肝臓細胞などの特定の細胞種による取り込みを増強することができる。特定の例では、細胞膜の直接透過および／または肝細胞を通じた取り込みを促進するようｄｓＲＮＡに疎水性リガンドがコンジュゲートされている。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされたリガンドは、受容体媒介性エンドサイトーシスの基質である。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびにｄｓＲＮＡ物質の細胞透過を促進するために用いられてきた。例えば、コレステロールが種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、そのコンジュゲートされていない類似体と比較して、実質的により活性な化合物が得られてきた。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２年、１２巻、１０３頁参照のこと。オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしているその他の親油性化合物として、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロールおよびメントールが挙げられる。受容体媒介性エンドサイトーシスのリガンドの一例として、葉酸がある。葉酸は、葉酸受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に入る。葉酸を保持するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に効率的に輸送される。Ｌｉおよび共同研究者らは、葉酸の、オリゴヌクレオチドの３’末端との結合が、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの８倍の増大をもたらしたと報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．； Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８年、１５巻、１５４０頁。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされているその他のリガンドとして、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、送達ペプチドおよびコレステロールなどの脂質が挙げられる。

特定の例では、カチオン性リガンドの、オリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションは、ヌクレアーゼに対する耐性の改善をもたらす。カチオン性リガンドの代表的な例として、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムがある。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドがオリゴヌクレオチド中に分散される場合に、ｍＲＮＡに対するその高い結合親和性を保持すると報告された。Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２年、１２巻、１０３頁およびその中の参照文献を参照のこと。

本発明のリガンドがコンジュゲートしているｄｓＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡへの連結分子の結合から得られる、ペンダント反応性官能性を保有するｄｓＲＮＡを用いることによって合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、任意の種々の保護基を保有する合成されたリガンドまたはそれと結合している連結部分を有するリガンドと直接反応できる。本発明の方法は、いくつかの好ましい実施形態では、リガンドで適切にコンジュゲートされており、さらに、固体支持体物質と結合している場合もあるヌクレオシドモノマーを用いることによって、リガンドがコンジュゲートしているｄｓＲＮＡの合成を促進する。このような、場合により固体支持体物質と結合していてもよいリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態に従って、選択された血清結合性リガンドと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位置に局在する連結部分との反応によって調製される。特定の例では、ｄｓＲＮＡの３’末端と結合しているアラルキルリガンドを保有するｄｓＲＮＡを、まず、長鎖アミノアルキル基を介してコントロールド・ポア・ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）支持体にモノマービルディングブロックを共有結合によって結合することによって調製する。次いで、ヌクレオチドを標準的な固相合成技術によって、固体支持体と結合しているモノマービルディングブロックに結合する。モノマービルディングブロックは、ヌクレオシドであってもよいし、または固相合成と適合するその他の有機化合物であってもよい。

本発明のコンジュゲートに用いられるｄｓＲＮＡは、固相合成の周知の技術によって都合よく日常的に作製され得る。このような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）をはじめ、いくつかの製造供給元から市販されている。当技術分野で既知の、このような合成のための任意のその他の手段を、追加として、または代替として用いてもよい。同様の技術を用いて、その他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を調製することも知られている。

特定の修飾されたオリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンがコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，１３８，０４５号および同５，２１８，１０５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーが描写されている米国特許第５，２１２，２９５号；修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，３７８，８２５号および同５，５４１，３０７号；主鎖が修飾されたオリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによるその調製が描写されている米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環構造をベースとする修飾された核酸塩基およびその合成方法が描写されている米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンをベースとする修飾された核酸塩基が描写されている米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法が描写されている米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸が描写されている米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドの合成のための方法および材料が描写されている米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシド（これでは、このような基は、ヌクレオシドの種々の部位のいずれかに結合しているその他の部分とのリンカーとして用いられ得る）が描写されている米国特許第５，５７８，７１８号；高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，５８７，３６１号および同５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび関連化合物、例えば、２，６−ジアミノプリン化合物の調製のための方法が描写されている米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドが描写されている米国特許第５，５８７，４７０号；両方とも、コンジュゲートされている４’−デスメチルヌクレオシド類似体が描写されている米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；主鎖が修飾されたオリゴヌクレオチド類似体が描写されている米国特許第５，６０２，２４０号および米国特許第５，６１０，２８９号；とりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法が描写されている米国特許第６，２６２，２４１号および同５，４５９，２５５号。

本発明の、リガンドがコンジュゲートしているｄｓＲＮＡおよび配列特異的に連結しているヌクレオシドを有するリガンド−分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準的なヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体または連結部分をすでに保有するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド−ヌクレオチドまたはリガンド分子をすでに保有するヌクレオシド−コンジュゲート前駆体または非ヌクレオシドリガンド保有ビルディングブロックを用い、適したＤＮＡシンセサイザーで構築することができる。

連結部分をすでに保有するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を用いる場合には、通常、配列特異的に連結しているヌクレオシドの合成を、完了し、次いで、リガンド分子を連結部分と反応させて、リガンドがコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを形成する。種々の分子、例えば、ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子を保有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、先に記載されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３を参照のこと）。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結しているヌクレオシドは、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導したホスホルアミダイト、さらに、市販の、オリゴヌクレオチド合成に通常用いられる標準ホスホルアミダイトおよび非標準ホスホルアミダイトを用い、自動化シンセサイザーによって合成される。

オリゴヌクレオチドのヌクレオシドへ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ基を組み込むことによって、オリゴヌクレオチドに、ハイブリダイゼーション特性の増強が与えられる。さらに、ホスホロチオエート主鎖を含有するオリゴヌクレオチドは、増強されたヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、本発明の官能基を有する、連結しているヌクレオシドは、ホスホロチオエート主鎖または２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリルもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか、または両方を含むよう増強することができる。当技術分野で既知のいくつかのオリゴヌクレオチド修飾の要約した一覧表は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３７０９１８に見られる。

いくつかの実施形態では、５’末端にアミノ基を有する、本発明の官能基を有するヌクレオシド配列を、ＤＮＡシンセサイザーを用いて調製し、次いで、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は、当業者にはよく知られている。代表的な活性エステルとして、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルの反応によって、選択されたリガンドが、連結基を介して５位と結合しているオリゴヌクレオチドが生じる。５’末端のアミノ基は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６試薬を用いて調製できる。一実施形態では、リガンド分子は、リガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いることによって５’位のオリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることができ、これでは、リガンドは、５’−ヒドロキシ基と直接またはリンカーを介して間接的に連結している。このようなリガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトは、通常、５’末端にリガンドを保有する、リガンドがコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドを提供するために自動化合成手順の最後に用いられる。

修飾されたヌクレオシド間結合または主鎖の例として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、例えば、３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結している類似体およびヌクレオシド単位の隣接する対が、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に連結している逆の極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸の形も含まれる。

上記のリン原子含有結合の調製に関する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同４，４６９，８６３号；同４，４７６，３０１号；同５，０２３，２４３号；同５，１７７，１９６号；同５，１８８，８９７号；同５，２６４，４２３号；同５，２７６，０１９号；同５，２７８，３０２号；同５，２８６，７１７号；同５，３２１，１３１号；同５，３９９，６７６号；同５，４０５，９３９号；同５，４５３，４９６号；同５，４５５，２３３号；同５，４６６，６７７号；同５，４７６，９２５号；同５，５１９，１２６号；同５，５３６，８２１号；同５，５４１，３０６号；同５，５５０，１１１号；同５，５６３，２５３号；同５，５７１，７９９号；同５，５８７，３６１号；同５，６２５，０５０号および同５，６９７，２４８号が挙げられ、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

修飾されたヌクレオシド間結合または中にリン原子を含まない（すなわち、オリゴヌクレオシド）主鎖の例は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル糖間結合または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子糖間結合または複素環式糖間結合によって形成される主鎖を有する。これらとして、モルホリノ結合（一部は、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファマート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するものおよび混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２成分部分を有するその他のものが挙げられる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同５，１６６，３１５号；同５，１８５，４４４号；同５，２１４，１３４号；同５，２１６，１４１号；同５，２３５，０３３号；同５，２６４，５６２号；同５，２６４，５６４号；同５，４０５，９３８号；同５，４３４，２５７号；同５，４６６，６７７号；同５，４７０，９６７号；同５，４８９，６７７号；同５，５４１，３０７号；同５，５６１，２２５号；同５，５９６，０８６号；同５，６０２，２４０号；同５，６１０，２８９号；同５，６０２，２４０号；同５，６０８，０４６号；同５，６１０，２８９号；同５，６１８，７０４号；同５，６２３，０７０号；同５，６６３，３１２号；同５，６３３，３６０号；同５，６７７，４３７号および同５，６７７，４３９号が挙げられ、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

特定の例では、オリゴヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾されていてもよい。いくつかの非リガンド分子は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するためにオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分として、脂質部分、例えば、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６巻：６５５３頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９４年、４巻：１０５３頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０巻：３０６頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３年、３巻：２７６５頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０巻：５３３頁）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１年、１０巻：１１１頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９巻：３２７頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５巻：４９頁）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻：３６５１頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８巻：３７７７頁）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４巻：９６９頁）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻：３６５１頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４巻：２２９頁）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７巻：９２３頁）が挙げられている。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列挙されている。通常のコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを保有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、適当なカップリングまたは活性化試薬を用いて、アミノ基を、コンジュゲートされている分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、さらに固体支持体と結合しているオリゴヌクレオチドを用いて、または溶液相中のオリゴヌクレオチドの切断後に実施してよい。通常、ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製によって、純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートの使用は、このような部分が、ＰＣＳＫ９発現部位である肝臓細胞を標的とすることを増大できるために、特に好ましい。

ベクターにコードされるＲＮＡｉ作用物質
本発明のｄｓＲＮＡはまた、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に組換えウイルスベクターから発現され得る。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列と、ｄｓＲＮＡ配列を発現するための任意の適したプロモーターとを含む。適したプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。その他の適したプロモーターの選択は、当技術分野の技術の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターはまた、特定の組織において、または特定の細胞内環境においてｄｓＲＮＡを発現するための誘導可能または調節可能プロモーターを含み得る。ｉｎ ｖｉｖｏで本発明のｄｓＲＮＡを細胞に送達するために組換えウイルスベクターを用いることは、以下により詳細に論じる。

本発明のｄｓＲＮＡは、２種の、別個の、相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補性領域を含む単一のＲＮＡ分子のいずれかとして組換えウイルスベクターから発現させることができる。

発現されるｄｓＲＮＡ分子（複数可）のコード配列を受容できる任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用してよい。ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、ベクターを、その他のウイルスに由来するエンベロープタンパク質またはその他の表面抗原を用いてシュードタイプ化することによって、または種々のウイルスカプシドタンパク質を置換することによって、改変することができる。

例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどに由来する表面タンパク質を用いてシュードタイプ化できる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターを、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するよう操作することによって、種々の細胞を標的とするよう作製することができる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を、血清型５カプシド遺伝子によって置換し、ＡＡＶ２／５ベクターを作製することができる。種々のカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技術は、当技術分野の技術の範囲内であり、例えば、参照によってその全開示内容が本明細書に組み込まれる、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら（２００２年）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６巻：７９１〜８０１頁参照のこと。

本発明に使用するのに適した組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入するための方法およびウイルスベクターを、注目する細胞に送達する方法は、当技術分野の技術の範囲内にある。例えば、参照によってその全開示内容が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５年）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２巻：３０１〜３１０頁；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６巻：６０８〜６１４頁；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０年）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１巻：５〜１４頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ ３９２巻：２５〜３０頁およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３巻：４０１〜４０６頁参照のこと。

好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。特に好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の、相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈら（２００２年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０巻：１００６〜１０１０頁に記載されている。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８７年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１巻：３０９６〜３１０１頁；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら（１９９６年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０巻：５２０〜５３２頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８９年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３巻：３８２２〜３８２６頁；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８；および国際特許出願ＷＯ９３／２４６４１に記載されている。

ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを含む薬学的組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、高脂血症などのＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程など、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現または活性と関連している疾患または障害を治療するのに有用である。このような薬学的組成物は、送達様式に基づいて製剤される。一例として、非経口送達によって肝臓に送達するために製剤される組成物がある。

本発明の薬学的組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与形で投与される。本発明者らは、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物は、その改善された効率のために、驚くほど低い投与量で投与できるということを見出した。１日あたり受容者の体重１キログラムあたり５ｍｇ ｄｓＲＮＡという投与量は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害または抑制するのに十分であり、患者に全身投与してよい。

通常、ｄｓＲＮＡの適した用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、通常、１日あたり体重１キログラムあたり１μｇ〜１ｍｇの範囲にある。薬学的組成物は、１日１回投与してもよいし、またはｄｓＲＮＡは、２、３またはそれより多い分割用量として、１日を通して適当な間隔で投与してもよく、またはさらに連続注入または放出制御製剤による送達を用いてもよい。その場合には、各分割用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総１日投与量を達成するために、相応に、より少ないものでなくてはならない。投与単位はまた、例えば、数日間にわたるｄｓＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる送達のために調合される場合もある。持続放出製剤は、当技術分野で周知である。

当業者には当然のことながら、それだけには限らないが、疾患または障害の重篤度、これまでの治療、被験体の全体的な健康状態および／または年齢ならびに存在するその他の疾患を含めた特定の因子が、被験体を有効に治療するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得る。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた被験体の治療は、単回の治療または一連の治療を含み得る。本発明によって包含される個々のｄｓＲＮＡの、有効な投与量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の推定は、本明細書の他の場所に記載されるように、従来の方法論を用いて、または適当な動物モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて行うことができる。

マウス遺伝学の進歩によって、種々のヒト疾患、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程の研究のためのいくつかのマウスモデルが作製されている。ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験には、ならびに、治療上有効な用量を決定するために、このようなモデルが用いられる。

任意の方法を用いて、本発明のｄｓＲＮＡを哺乳類に投与することができる。例えば、投与は直接；経口または非経口（例えば、皮下、脳室内、筋肉内または腹膜内注射によって、または点滴によって）であってもよい。投与は迅速（例えば、注射によって）であってもよいし、または一定時間をかけて行ってもよい（例えば、遅い注入または徐放製剤の投与）。

通常、高脂血症の哺乳類を治療する場合には、非経口手段によってｄｓＲＮＡ分子を全身投与する。例えば、リポソームを用いて、または用いずに、コンジュゲートされているか、またはコンジュゲートされていない、または製剤されているｄｓＲＮＡを、患者に、静脈内に投与できる。このようなために、ｄｓＲＮＡ分子は、組成物、例えば、アルコールなどの通常の溶媒中の滅菌および非滅菌水性溶液、非水性溶液、または液体もしくは固体オイルベース中の溶液に製剤できる。このような溶液はまた、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含み得る。非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のためには、ｄｓＲＮＡ分子は、組成物、例えば、同様に、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物およびその他の薬学的に受容可能な担体）を含み得る滅菌水溶液に製剤できる。

さらに、ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されるように、哺乳類に、生物学的手段または非生物学的手段として投与できる。非生物学的送達は、種々の方法、例えば、制限するものではないが、（１）リポソームに、本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ酸分子を負荷することおよび（２）ｄｓＲＮＡ分子を、脂質またはリポソームと複合体を形成させて核酸−脂質または核酸−リポソーム複合体を形成することによって達成できる。リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトするのによく用いられるカチオン性および中性脂質からなるものであり得る。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し（例えば、帯電結合）リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例として、制限するものではないが、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクトエース（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ）およびＤＯＴＡＰが挙げられる。リポソームを形成する手順は、当技術分野で周知である。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成され得る。多数の親油性物質が市販されており、例えば、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびエフェクテン（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）がある。さらに、市販のカチオン性脂質、例えば、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰを用いて全身送達方法を最適化することができ、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰは各々、中性脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはコレステロールと混合することができる。いくつかの場合には、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５巻：６４７〜６５２頁（１９９７年））によって記載されるものなどのリポソームを使用できる。その他の実施形態では、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで送達を達成することができる（Ｂｏｌｅｔｔａら、Ｊ．Ａｍ Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７巻：１７２８頁（１９９６年））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第６，２７１，３５９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９６４およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ら、２００５年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻（８号）：１００２〜７頁に見出すことができる。

生物学的送達は、制限するものではないが、ウイルスベクターの使用をはじめとする種々の方法によって達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクター）を用いて、ｄｓＲＮＡ分子を肝臓細胞に送達することができる。標準的な分子生物学の技術を用いて、本明細書に提供される１種または複数種のｄｓＲＮＡを、核酸を細胞に送達するためにこれまでに開発された多くのさまざまなウイルスベクターのうちの１種に導入することができる。これらの得られたウイルスベクターを用い、例えば、感染によって１種または複数種のｄｓＲＮＡを細胞に送達することができる。

本発明のｄｓＲＮＡは、薬学的に受容可能な担体または希釈中に製剤できる。「薬学的に受容可能な担体」（本明細書では、「賦形剤」とも呼ばれる）とは、薬学的に受容可能な溶媒、懸濁剤または任意のその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に受容可能な担体は、液体であってもよいし、固体であってもよく、所望の容積、一貫性およびその他の適切な輸送および化学特性を提供するよう考慮して計画された投与様式に応じて選択することができる。通常の薬学的に受容可能な担体は、例として、制限するものではないが以下を含む：水；生理食塩水；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖類、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。

さらに、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを、その他の分子、分子構造または核酸の混合物と混合され、封入され、コンジュゲートされるか、そうでなければ、結合しているｄｓＲＮＡを含有する組成物に製剤することができる。例えば、１種または複数種の、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用物質を含有する組成物は、その他の治療薬、例えば、他の脂質低下剤（例えば、スタチン）を含み得る。

ＰＣＳＫ９の発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る疾患を治療する方法
本明細書に記載される方法および組成物を用いて、ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって調節され得る疾患および状態を治療できる。例えば、本明細書に記載される組成物を用いて、高脂血症およびその他の形の脂質インバランス（ｉｎｂａｌａｎｃｅ）、例えば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症およびこれらの障害と関連している病状、例えば、心疾患および循環器疾患を治療できる。

ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳類においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現がサイレンシングされるよう、哺乳類に本発明の組成物を投与することを含む。本発明のｄｓＲＮＡは、その高い特異性のために、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の（一次またはプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的とする。ｄｓＲＮＡを用いて、これらのＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書において他の箇所に記載されるように実施できる。

一実施形態では、本方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ｄｓＲＮＡは、治療される哺乳類のＰＣＳＫ９遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。治療される生物が、哺乳類、例えば、ヒトである場合には、組成物は、当技術分野で既知の任意の手段、例えば、それだけには限らないが、経口または非経口経路、例えば、静脈内の、筋肉内の、皮下、経皮、気道（エアゾール）投与によって投与され得る。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。

特に断りのない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似のまたは同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料は、以下に記載されている。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、参照によりその全文が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって制限であることを意図するものではない。

ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子ウォーキング
ｓｉＲＮＡ設計を実施し、２つの別個の選択物
ａ）ＰＣＳＫ９ヒトおよびマウスまたはラットいずれかのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡおよび
ｂ）標的遺伝子ＰＣＳＫ９に対して予測される特異性を有する全ヒト反応性ｓｉＲＮＡにおいて同定した。

ヒト、マウスおよびラットＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ配列を用いた：ヒト配列ＮＭ＿１７４９３６．２を、完全ｓｉＲＮＡ選択手順の際の参照配列として用いた。

第１の工程において、ヒトおよびマウスならびにヒトおよびラットＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ配列において保存されている１９マーのストレッチを、同定し、その結果、ヒトおよびマウスに対して交差反応性のｓｉＲＮＡならびにヒトおよびラット標的に対して交差反応性のｓｉＲＮＡが選択された。

第２の選択で、ヒトＰＣＳＫ９を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを同定した。ヒトＰＣＳＫ９のすべての可能性ある１９マーの配列を抽出し、候補標的配列として定義した。ヒト、サルに対して交差反応性の配列ならびにマウス、ラット、ヒトおよびサルに対して交差反応性のものがすべて、表１および２に列挙されている。それらの配列の化学修飾された形ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ両方におけるそれらの活性も、表１および２に列挙されており、図２〜８に例が示されている。

候補標的配列およびそれらの対応するｓｉＲＮＡを順位付けし、適当なものを選択するために、無関係な標的と相互作用するそれらの予測される可能性（オフターゲットの可能性）を順位付けパラメータとしてとった。オフターゲットの可能性が低いｓｉＲＮＡを、好ましいものとして規定し、ｉｎ ｖｉｖｏではより特異的であると仮定した。

ｓｉＲＮＡ特異的なオフターゲットの可能性を予測するために、以下の仮定を行った：
１）鎖の位置２〜９（５’から３’に数えて）（シード領域）は、配列の残り（非シードおよび切断部位領域）よりも、オフターゲットの可能性により寄与している可能性がある。

２）鎖の位置１０および１１（５’から３’に数えて）（切断部位領域）は、非シード領域よりも、オフターゲットの可能性により寄与している可能性がある。

３）各鎖の位置１および１９は、オフターゲット相互作用と関連がない。

４）各遺伝子および各鎖のオフターゲットスコアは、遺伝子の配列に対するｓｉＲＮＡ鎖配列の相補性およびミスマッチの位置に基づいて算出できる。

５）予測されるオフターゲットの数ならびに最高のオフターゲットスコアには、オフターゲットの可能性が考慮されなければならない。

６）オフターゲットスコアは、オフターゲットの数よりもオフターゲットの可能性とより関連があると考慮されるべきである。

７）導入された内部修飾によるセンス鎖活性の失敗の可能性を推定すると、アンチセンス鎖のオフターゲットの可能性のみが関連する。

可能性のあるオフターゲット遺伝子を同定するために、１９マーの候補配列を、公的に入手可能なヒトｍＲＮＡ配列に対するホモロジー検索にかけた。

１９マーのインプット配列各々の以下のオフターゲット特性を、オフターゲット遺伝子各々について抽出し、オフターゲットスコアを算出した：
非シード領域中のミスマッチの数
シード領域中のミスマッチの数
切断部位領域中のミスマッチの数
オフターゲットスコアは、以下の仮定１〜３を考慮するために算出した：
オフターゲットスコア＝シードミスマッチの数＊１０
＋切断部位ミスマッチの数＊１．２
＋非シードミスマッチの数＊１
インプット１９マー配列に対応する各ｓｉＲＮＡの最も関連のあるオフターゲット遺伝子を、最低オフターゲットスコアを有する遺伝子として規定した。したがって、最低オフターゲットスコアを、各ｓｉＲＮＡの関連オフターゲットスコアとして規定した。

ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に特に示されていない場合は、このような試薬は、分子生物学において適用するための品質／純度規格の分子生物学の試薬の任意の供給業者から得てよい。

ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、固相支持体としてコントロールド・ポア・ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１μモルスケールでの固相合成によって作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡは、それぞれ、対応するホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用い、固相合成によって作製した（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらのビルディングブロックを、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡに記載される標準的なヌクレオシドホスホルアミダイト化学を用いてオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル中、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ、Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）の溶液（１％）と取り替えることによって導入した。さらなる補助的試薬は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。

陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製は、確立された手順に従って実施した。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ、Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、２６０ｎｍという波長での、それぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって求めた。二本鎖ＲＮＡは、アニーリングバッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ 塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３〜４時間という時間をかけて室温に冷却することによって作製した。アニーリングしたＲＮＡ溶液は、使用まで−２０℃で保存した。

３’−コレステロールがコンジュゲートしているｓｉＲＮＡ（本明細書では、−Ｃｈｏｌ−３’と呼ばれる）の合成には、ＲＮＡ合成に適切に修飾された固相支持体を用いた。修飾された固相支持体は以下のとおりに調製した：
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ

水中、エチルグリシネートヒドロクロリド（３２．１９ｇ、０．２３モル）の撹拌氷冷溶液（５０ｍＬ）に、４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、混合物を、ＴＬＣによって反応の完了が確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）を用いて溶液を分配した。有機層を、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留すると、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）が得られた。

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ

ジクロロメタン（５０ｍＬ）にＦｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）を溶解し、氷で冷却した。０℃で、この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の添加を続けた。この溶液を室温にし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣによって確認した。反応混合物を、真空濃縮し、酢酸エチルを加えて、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を、５％塩酸水溶液、５％炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮すると、粗生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製すると１１．８７ｇ（８８％）のＡＢが得られた。

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ

０℃のジメチルホルムアミド中、２０％ピペリジンに、３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を溶解した。溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空濃縮し、残渣に水を加え、生成物を酢酸エチルを用いて抽出した。粗生成物をその塩酸塩に変換することによって精製した。

３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ

ジクロロメタンに、３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩を入れた。この懸濁液を、氷上で０℃に冷却した。この懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンを用いて希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（１０．３ｇ、９２％）によって精製した。

１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの無水トルエンでスラリーにした。この混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤを、撹拌しながら２０分以内でゆっくりと加えた。添加温度を５℃より低く維持した。撹拌を０℃で３０分間続け、１ｍＬの氷酢酸を加え、続いて直ちに、４０ｍＬの水中、４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを加えた。得られた混合物を、各１００ｍＬのジクロロメタンを用いて２回抽出し、合わせた有機抽出物を、各１０ｍＬのリン酸バッファーで２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を、６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、３部分の５０ｍＬの冷ｐＨ９．５炭酸バッファーを用いて抽出した。水性抽出物を、リン酸を用いてｐＨ３に調整し、５部分の４０ｍＬのクロロホルムを用いて抽出し、これらを合わせ、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製すると、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）が得られた。

［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ

テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中、ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混合物に、メタノール（２ｍＬ）を１時間という時間をかけて滴下した。撹拌を、還流温度で１時間続けた。室温に冷却した後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を、酢酸エチル（３×４０ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空濃縮すると、生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）によって精製した（８９％）。

（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ

ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ １．９９４ｍｍｏｌ）を、ピリジン（２×５ｍＬ）とともに真空蒸発させることによって乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら加えた。反応を、室温で一晩実施した。メタノールを加えることによって反応をクエンチした。反応混合物を真空濃縮し、残渣に、ジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。トルエンとともに蒸発させることによって、残存するピリジンを除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製した（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３においてＲｆ＝０．５）（１．７５ｇ、９５％）。

コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で一晩真空乾燥させた。混合物を、無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を、アルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。次いで、ジクロロメタン（４０ｍＬ）を用いて希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣を、したがって次の工程に用いた。

コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ

ジクロロメタン／アセトニトリルの混合物（３：２、３ｍＬ）に、コハク酸塩ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を溶解した。その溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を逐次加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）中、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物の色が明橙色に変わった。溶液を、リストアクションシェーカー（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ ｓｈａｋｅｒ）を用いて短時間（５分）撹拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を加えた。この懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗を通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルを用いて逐次洗浄した。無水酢酸／ピリジンを用いて、未反応のアミノ基をマスキングした。ＣＰＧの達成された負荷は、ＵＶ測定を行うことによって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。

５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書では、「５’−Ｃ３２−」と呼ばれる）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書では、「５’−Ｃｈｏｌ−」と呼ばれる）を保持するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体については、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて酸化工程を実施して、核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入したという点を除いて、ＷＯ２００４／０６５６０１に記載されるとおり実施した。

核酸配列は、標準的な命名法および具体的には表１〜２の略語を用いて以下に表されている。

ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｌａおよび初代サル肝細胞におけるＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡスクリーニングにより、高活性配列が発見される
ＨｕＨ−７細胞は、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（Ｓｈｉｎｊｕｋｕ、Ｊａｐａｎ、カタログ番号ＪＣＲＢ０４０３）から入手した。細胞は、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ、Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、５％ ＣＯ_２を含む雰囲気下中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ａ２２１３）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｋ０２８２）を含むよう補給したダルベッコのＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｆ０４３５）で培養した。ＨｅｐＧ２およびＨｅｌａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号ＨＢ−８０６５）から入手し、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ、Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、５％ＣＯ_２を含む雰囲気下、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ａ２２１３）、１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｋ−０２９３）および１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｌ−０４７３）を含むよう補給したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号２１０９０−０２２）で培養した。

ｓｉＲＮＡを用いるトランスフェクションには、９６ウェルプレートに、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２またはＨｅｌａ細胞を、２．０×１０^４個細胞／ウェルという密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（単回用量スクリーニングのための３０ｎＭ）のトランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１１６６８−０１９）を製造業者によって記載されるとおりに用いて実施した。

トランスフェクションの２４時間後、ＨｕＨ７およびＨｅｐＧ２細胞を溶解し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ、Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＵＳＡ、カタログ番号ＱＧ−０００−０２）を用い、プロトコールに従ってＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを定量した。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて、８個の個々のデータ点を集めた。ＰＣＳＫ９遺伝子と関係のないｓｉＲＮＡ二本鎖を対照として用いた。所与のＰＣＳＫ９特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖の活性は、対照ｓｉＲＮＡ二本鎖で処理した細胞におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ濃度に対する処理細胞におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ濃度のパーセントとして表した。

初代カニクイザル肝細胞（低温保存）は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｍ００３０５）から入手し、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ_２を含む雰囲気下３７℃で、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（カタログ番号Ｚ９９０２９）で培養した。

ｓｉＲＮＡを用いるトランスフェクションには、９６ウェルプレートにおいて、初代カニクイザル細胞を、コラーゲンコートしたプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０８−７７４−５）に３．５×１０^４個細胞／ウェルという密度で播種し、直接トランスフェクトした。２連での、ｓｉＲＮＡ（８つの３０ｎＭから出発した２倍希釈シリーズ）のトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号１１６６８−０１９）を、製造業者によって記載されるとおりに用いて実施した。

トランスフェクションの１６時間後、培地を、Ｔｏｒｐｅｄｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｘ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、カタログ番号Ｚ９９０００）を加えた新鮮ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地に変更した。

培地変更の２４時間後、初代カニクイザル細胞を溶解し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅキット（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ、Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＵＳＡ、カタログ番号ＱＧ−０００−０２）をプロトコールに従って用いて定量した。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して標準化した。次いで、標準化したＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比を、リポフェクタミン２０００のみの対照のＰＣＳＫ９／ＧＡＰＤＨ比に対して比較した。

表１〜２（および図６）には、結果が要約されており、種々の用量での種々の細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの実施例を提供する。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングは、所与の用量での残存する転写物のパーセンテージとして表した。高活性配列とは、１００ｎｍ以下の用量の所与のｓｉＲＮＡでの処理後に７０％未満の転写物しか残存していないものである。極めて活性な配列とは、１００ｎＭ以下の用量での処理後に６０％未満の転写物しか残存していないものである。活性な配列とは、高用量（１００ｎＭ）での処理後に８５％未満の転写物しか残存していないものである。活性なｓｉＲＮＡの例はまた、以下に記載される脂肪様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）製剤でマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性な配列はまた、概して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても活性であった（図６の例を参照のこと）。

ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性スクリーニング
製剤手順
脂肪様ＬＮＰ−０１・４ＨＣｌ（分子量１４８７）（図１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。エタノール中の各々の保存溶液を調製した：ＬＮＰ−０１、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。次いで、ＬＮＰ−０１、コレステロールおよびＰＥＧ−セラミドＣ１６保存溶液を４２：４８：１０モル比で合わせた。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が３５〜４５％となり、最終酢酸ナトリウム濃度が１００〜３００ｍＭとなるよう、水性ｓｉＲＮＡ（酢酸ナトリウム、ｐＨ５中）と迅速に混合した。混合すると、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子が自発的に形成された。いくつかの場合には、所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、サーモバレル（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ）押し出し機（Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を用い、ポリカーボネートメンブレン（１００ｎｍカットオフ）を通して押し出した。その他の場合には、押し出し工程は省略した。エタノール除去および同時バッファー交換は、透析または接線フロー濾過のいずれかによって達成した。バッファーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。

製剤の特徴付け
標準法または押し出しフリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ）法のいずれかによって調製された製剤を、同様の方法で特徴付ける。まず、製剤を、目視検査によって特徴付ける。それらは、凝集体または沈殿物を含まない白色がかった透明の溶液であるはずである。脂質−ナノ粒子の粒径および粒径分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）を用いて動的光散乱によって測定する。粒子の大きさは、２０〜３００ｎｍであるはずであり、理想的には、４０〜１００ｎｍである。粒径分布は、単峰型であるはずである。製剤、ならびに封入された画分中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを用いて推定する。製剤されたｓｉＲＮＡのサンプルを、製剤破壊界面活性剤、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または不在下で、ＲＮＡ結合性色素Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートする。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線と比較した、界面活性剤を含有するサンプルに由来するシグナルによって求める。封入された画分は、総ｓｉＲＮＡ含量から、「遊離」ｓｉＲＮＡ含量（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定される）を差し引くことによって求める。封入されたｓｉＲＮＡのパーセントは、通常、＞８５％である。

ボーラス投与
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群、８〜１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＡ）における、製剤されたｓｉＲＮＡのボーラス投与は、２７Ｇニードルを用い、尾静脈注射によって実施した。ｓｉＲＮＡは、１０μｌ／体重１ｇで５ｍｇ／ｋｇ用量の送達を可能にする０．５ｍｇ／ｍｌ濃度でＬＮＰ−０１に製剤し（次いで、ＰＢＳに対して透析し）た。マウスを赤外線ランプ下に約３分間維持し、その後各注射を投与した。

投与の４８時間後、マウスをＣＯ_２窒息によって屠殺した。０．２ｍｌの血液を後眼窩出血によって回収し、肝臓を採取し、液体窒素中で凍結した。血清および肝臓は−８０℃で保存した。

凍結した肝臓を、６８５０Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いて粉砕し、粉末を、分析まで−８０℃で保存した。

ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡレベルを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）製の分岐ＤＮＡ技術に基づくキットを、プロトコールに従って用いて検出した。１０〜２０ｍｇの凍結肝臓粉末を、６００μｌの０．１６μｇ／ｍｌのＴｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、プロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、＃ＭＰＲＫ０９２）に、６５℃で３時間溶解した。Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ捕獲プレート上で、９０μｌのＬｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（２容積の水中の１容積の保存Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ）に、１０μｌの溶解物を加え、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨまたはシクロフィリンＢに特異的なプローブセットとともに５２℃で一晩インキュベートした。Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＣＥ）、Ｌａｂｅｌ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ＬＥ）およびブロッキング（ＢＬ）プローブの核酸配列は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア２．０（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号ＱＧ−００２−０２）の助けを借りて、ＰＣＳＫ９、ＧＡＰＤＨおよびシクロフィリンＢの核酸配列から選択した。化学発光を、Ｖｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位として読み取った。各処理群にわたって、肝臓溶解物におけるＧＡＰＤＨまたはシクロフィリンＢ ｍＲＮＡに対するＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの比の平均をとり、ＰＢＳで処理した対照群または非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群と比較した。

ＳｔａｎＢｉｏ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒキット（ＳｔａｎＢｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｙ、Ｂｏｅｒｎｅ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を、製造業者の使用説明書に従って用いて、マウス血清において総血清コレステロールを測定した。測定は、４９５ｎｍでＶｉｃｔｏｒ２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。

（実施例）
ＬＮＰ−０１リポソームに製剤された３２ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡを、マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。実験は、５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ用量で実施し、少なくとも１０ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡは、ＰＢＳで処理した対照群と比較して４０％を超えるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡノックダウンを示したのに対し、非関連ｓｉＲＮＡ（血液凝固因子ＶＩＩ）で処理した対照群は効果がなかった（図２〜５）。ＰＣＳＫ９転写物のサイレンシングはまた、これらの動物におけるコレステロールの低下とも関連していた（図４〜５）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であったそれらの分子と、ｉｎ ｖｉｖｏで活性なものとの間に強力な相関関係があった（図６）。種々の化学修飾を含む配列もｉｎ ｖｉｔｒｏ（表１および２）およびｉｎ ｖｉｖｏでスクリーニングした。例として、あまり修飾されていない配列９３１４および９３１８、その配列のより修飾された形９３１４−（１０７９２、１０７９３および１０７９６）；９３１８−（１０７９４、１０７９５、１０７９７）を両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏ（初代サル肝細胞において）またはＬＮＰ−０１に製剤されたｉｎ ｖｉｖｏ（９３１４および１０７９２）で試験した。図７（表１および２も参照のこと）は、親分子９３１４および９３１８を示しており、修飾された形はすべてｉｎ ｖｉｔｒｏで活性である。図８は、一例として、親９３１４とより高度に修飾された１０７９２配列の双方ともｉｎ ｖｉｖｏで活性であり、マウスにおいて内因性ＰＣＳＫ９の５０〜６０％サイレンシングを示すことを示す。図９は、親９３１４および１０７９２のその他の化学修飾された形の活性をさらに例示するものである。

ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現活性を調節するＰＣＳＫ９特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａら、ＴＩＧ．（１９９６年）、１２巻：５〜１０頁；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．ら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２２１１４およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号参照のこと）。これらの導入遺伝子は、宿主ゲノムに組み込まれる導入遺伝子として組み込まれ、遺伝され得る、線状構築物、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入できる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするよう構築できる（Ｇａｓｓｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５年）９２巻：１２９２頁）。

ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別個の発現ベクター上にあるプロモーターによって転写させ、標的細胞に同時にトランスフェクトしてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡの個々の鎖各々を、両方とも同一の発現プラスミド上に位置しているプロモーターによって転写させることもできる。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合されている逆方向反復として発現され、その結果、ｄｓＲＮＡはステムおよびループ構造を有する。

組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、通常、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ウイルスベクターを発現するｄｓＲＮＡは、それだけには限らないが、アデノ随伴ウイルス（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２年）１５８巻：９７〜１２９頁））；アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８年）６巻：６１６頁）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２巻：４３１〜４３４頁）およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ ６８巻：１４３〜１５５頁））参照のこと）；またはアルファウイルスならびに当技術分野で既知のその他のものに基づいて構築できる。レトロウイルスも、多くのさまざまな細胞種、例えば、上皮細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで種々の遺伝子を導入するために用いられてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２３０巻：１３９５〜１３９８頁；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８年）８５巻：６４６０〜６４６４頁；Ｗｉｌｓｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：３０１４〜３０１８頁；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７巻：６１４１〜６１４５頁；Ｈｕｂｅｒら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：８０３９〜８０４３頁；Ｆｅｒｒｙら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：８３７７〜８３８１頁；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４巻：１８０２〜１８０５頁；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：７６４０〜１９頁；Ｋａｙら、１９９２年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３巻：６４１〜６４７頁；Ｄａｉら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：１０８９２〜１０８９５頁；Ｈｗｕら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻：４１０４〜４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。形質導入し、細胞のゲノムに挿入された遺伝子を発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを適したパッケージング細胞株、例えば、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰにトランスフェクトすることによって作製することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅら、１９９１年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２巻：５〜１０頁；Ｃｏｎｅら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１巻：６３４９頁）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）においてさまざまな細胞および組織に感染させるために用いることができ（Ｈｓｕら、１９９２年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、１６６巻：７６９頁）、また、感染のために、有糸分裂的に活性な細胞が必要ではないという利点も有する。

本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターいずれかにおけるプロモーターによって駆動されるｄｓＲＮＡ発現は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または広くＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドが、Ｔ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件でＴ７プロモーターであり得る。プロモーターは、導入遺伝子発現を膵臓に方向付けることもできる（例えば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３巻：２５１１〜２５１５頁）参照のこと）。

さらに、導入遺伝子の発現は、誘導可能調節配列および発現系、例えば、特定の生理学的調節因子、例えば、循環血糖値またはホルモンに対して感受性である調節配列を用いることによって正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、１９９４年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．８巻：２０〜２４頁）。このような、細胞における、または哺乳類における導入遺伝子発現の制御に適した誘導可能な発現系として、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者ならば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適当な調節／プロモーター配列を選択することができる。

通常、ｄｓＲＮＡ分子を発現できる組換えベクターは、以下に記載されるように送達され、標的細胞中に持続する。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性の発現を提供するウイルスベクターを使用してもよい。このようなベクターは、必要に応じて反復して投与できる。発現されると、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡと結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、例えば、静脈内投与または筋肉内投与による全身であってもよいし、患者から移植された標的細胞への投与と、それに続く患者への再導入によってであってもよいし、所望の標的細胞への導入を可能にする任意のその他の手段によってであってもよい。

ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、通常、カチオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。１週間以上の期間にわたる、単一のＰＣＳＫ９遺伝子または複数のＰＣＳＫ９遺伝子の種々の領域を標的とするｄｓＲＮＡ媒介性ノックダウンのための多重脂質トランスフェクションも、本発明によって考慮される。本発明のベクターが、宿主細胞にうまく導入されることは、種々の既知方法を用いてモニターできる。例えば、一過性のトランスフェクションは、レポーター、例えば、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で示され得る。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬剤）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を提供するマーカーを用いて確実に行われ得る。

ＰＣＳＫ９特異的ｄｓＲＮＡ分子はまた、ベクターに挿入し、ヒト患者のための遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号参照のこと）、または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１巻：３０５４〜３０５７頁参照のこと）被験体に送達できる。遺伝子治療ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている持続放出マトリックスを含むことができる。あるいは、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから完全な遺伝子送達ベクターが無傷で生じ得る場合には、医薬品は、遺伝子送達系を生成する１種または複数種の細胞を含み得る。

当業者ならば、本開示内容に具体的に示されるものに加えて、本発明を、添付の特許請求の範囲の最大限に実施することを可能にする方法および組成物に精通している。

^１Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：リボヌクレオチドに対応する；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに対応する；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチドに対応する；ヌクレオチドが配列中に記されている場合には、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって連結している；「ｓ」が差し込まれたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって連結している；接頭辞「ｐ−」によって表されない限り、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチドに５’−リン酸基を有していない；すべてのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチドに３’−ＯＨを保持する。

^１Ｕ、Ｃ、Ａ、Ｇ：リボヌクレオチドに対応する；Ｔ：デオキシチミジン；ｕ、ｃ、ａ、ｇ：２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに対応する；Ｕｆ、Ｃｆ、Ａｆ、Ｇｆ：２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチドに対応する；ｍｏｃ、ｍｏｕ、ｍｏｇ、ｍｏａ：２’−ＭＯＥヌクレオチドに対応する；ヌクレオチドが、配列中に記されている場合には、それらは３’−５’ホスホジエステル基によって連結している；ａｂ：３’−末端無塩基ヌクレオチド；「ｓ」が差し込まれたヌクレオチドは、３’−Ｏ−５’−Ｏホスホロチオジエステル基によって連結している； 接頭辞「ｐ−」によって表されない限り、オリゴヌクレオチドは、最も５’のヌクレオチドに５’−リン酸基を有していない；すべてのオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチドに３’−ＯＨを保持する。

Claims (14)

1. 細胞においてヒトＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
   （ａ）該センス鎖が配列番号１２２７に記載の配列からなり、該アンチセンス鎖が配列番号１２２８に記載の配列からなるか、または
   （ｂ）該センス鎖が配列番号１２２９に記載の配列からなり、該アンチセンス鎖が配列番号１２３０に記載の配列からなる
   ｄｓＲＮＡ。
2. 少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
3. 前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基と結合している末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
4. 前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
5. 前記センス鎖が配列番号１２２９からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号１２３０からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
6. 前記センス鎖が配列番号１２２７からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号１２２８からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
8. 生物において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡと、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物。
9. 細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためのｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、
   （ａ）該細胞に、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程と、
   （ｂ）工程（ａ）において生じた細胞を、該ＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、該細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する工程と
   を含む方法。
10. ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程を治療、予防または管理するための組成物であって、該組成物は、治療上または予防上有効な量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む、組成物。
11. 前記ＰＣＳＫ９遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって媒介され得る病理学的過程は、高コレステロール血症および／または高脂血症である、請求項８に記載の組成物。
12. 前記ｄｓＲＮＡは、３０ｎＭ以下の該ｄｓＲＮＡと、前記ＰＣＳＫ９遺伝子を発現する細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの接触の際に、該ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
13. ＰＣＳＫ９が関連している障害を治療するための組成物であって、治療上有効な量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む組成物。
14. 前記ＰＣＳＫ９が関連している障害が、高コレステロール血症および／または高脂血症である、請求項１３に記載の組成物。