CN106102781A

CN106102781A - 用于hiv感染的rna指导的治疗的方法和组合物

Info

Publication number: CN106102781A
Application number: CN201480059153.1A
Authority: CN
Inventors: K·卡利里; W·胡
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-11-09
Also published as: KR20160060659A; MX2016002586A; US20180169195A1; JP2020188757A; CL2016000424A1; US20180228875A1; US9925248B2; US20180221458A1; EP4385567A2; US20180200343A1; US20180236045A1; US20180228874A1; JP2023071897A; IL244220A0; US20180228876A1; IL244220B; AU2020264257B2; US20160250300A1; US20180236043A1; US20180169193A1

Abstract

本发明涉及用于治疗免疫缺陷病毒感染的方法和组合物。所述组合物包含分离的核酸序列，其包含CRISPR相关核酸内切酶和指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。

Description

用于HIV感染的RNA指导的治疗的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请主张2013年8月29日提交的美国临时申请号61/871,626；2014年6月27日提交的美国临时申请号62/018,441；以及2014年7月18日提交的美国临时申请号62/026,103的申请日的权益。出于任何美国申请的目的，可主张美国临时申请号61/871,626、美国临时申请号62/018,441、以及美国临时申请号62/026,103的权益，这些早先提交的申请的内容据此以引用的方式整体并入。

序列表

本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表并且在此以引用的方式整体并入。在2014年8月26日创建的所述ASCII副本的名称是F5129-00031_SL.txt并且大小是74,547个字节。

关于联邦资助研究的声明

本发明在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的资助号R01MH093271、R01NS087971、及P30MH092177下在美国政府支持下完成。美国政府可对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明涉及特异性地裂解逆转录病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)中的靶序列的组合物。可向患有HIV感染或面临HIV感染风险中的受试者施用这种组合物，其可包含编码规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸内切酶的核酸及与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA。

背景技术

三十多年来，由于HIV-1的发现，AIDS始终是影响全世界超过3千5百3十万人的重大公共健康问题。AIDS仍然是不可医治的，这是由于HIV-1向宿主基因组中的永久整合。用于控制HIV-1感染和阻止AIDS发展的当前疗法(高活性抗逆转录病毒疗法或HAART)极大地减少支持HIV-1感染的细胞中的病毒复制并且减轻血浆病毒血症至最低水平。但HAART未能抑制组织中的低水平病毒基因组表达和复制并且未能靶向潜伏感染的细胞，例如静息记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质、及星形胶质细胞、肠相关淋巴样细胞，它们充当了HIV-1的储蓄库。持续性HIV-1感染还与包括心脏和肾疾病、骨量减少及神经障碍的并发症有关。仍然需要靶向持续病毒储蓄库的有疗效的治疗策略。

发明内容

本文提供有关治疗和预防逆转录病毒感染的组合物和方法。所述逆转录病毒可以是慢病毒属，例如，人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒。所述人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸序列，所述核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。在一些实施方案中，所述核酸包容在表达载体内。在一个实施方案中，所述组合物包含CRISPR相关核酸内切酶多肽及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。还提供包含本文所公开的核酸、表达载体或多肽的药物组合物。本文还提供治疗患有或处于患上人免疫缺陷病毒感染风险中的受试者的方法，其中所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的包含编码CRISPR相关核酸内切酶的载体及一个或多个指导RNA的组合物，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。还提供灭活人细胞中的逆转录病毒的方法，所述方法通过将细胞暴露于包含编码基因编辑复合体的分离的核酸的组合物实现，所述基因编辑复合体包含CRISPR相关核酸内切酶及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与逆转录病毒中的靶核酸序列互补。所述基因编辑复合体将一个或多个突变引入前病毒DNA中。在一些实施方案中，所述突变可包括缺失，其可包含所有或基本上所有的前病毒DNA序列。另一方面，还提供一种试剂盒，其包含实测数量的本文所公开的组合物。

本发明的一个或多个实施方案的细节在附图及以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的及优点将从描述和附图以及权利要求书中显而易见。

附图说明

图1示出Cas9/LTR-gRNA抑制在潜伏感染了HIV-1的CHME5小神经胶质细胞中的HIV-1报道病毒产生。(A)EGFP流式细胞术的代表性门控图显示通过稳定地表达Cas9加LTR-A或-B比对空的U6驱动的gRNA表达载体(U6-CAG)在潜伏的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP报道病毒的TSA诱导的再活化中的显著减少。(B)来自选择的表达LTR-A-或-B的稳定克隆的PCR产物(LTR内的-453至+43)的SURVEYOR Cel-I核酸酶测定显示显著的indel突变模式(箭头)。(C,D)PCR片段分析显示LTR A与B切割位点(箭头(arrowhead)和D中的箭头(arrow))之间的190-bp区域的精确缺失，剩下的306-bp片段(C中的箭头)通过TA克隆和测序结果来验证。图1D公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 1-3。(E-G)LTR-A/B稳定克隆的亚克隆显示通过EGFP流式细胞术(E)测定的报道基因再活化的完全丧失及通过EGFP和HIV-1Rev反应元件(RRE)的基因组DNA的标准(F)和实时(G)PCR扩增检测的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP前病毒基因组的消除；β-肌动蛋白是DNA纯化和加载对照。(H)使用引物的LTR-A/B亚克隆(#_8，13)的PCR基因分型以扩增覆盖HIV-1LTR U3/R/U5区域的DNA片段(-411至+129)示出indel(a，缺失；c，插入)及“完整的”或合并的LTR(b)。

图2示出Cas9/LTR-gRNA有效地根除来自U1单核细胞的潜伏的HIV-1病毒。(A)右图示出HIV-1整个基因组在染色体Xp11.4中的切除。使用基因组步查(Genome-Walker)连接PCR试剂盒鉴别HIV-1整合位点。左图：使用靶向染色体X整合位点-侧接序列的引物对(P1/P2)的PCR扩增子长度分析显示整个HIV-1基因组的消除(9709-bp)，留下两个片段(833-和670-bp)。(B)LTR片段(833-bp)的TA克隆和测序显示宿主基因组序列(小写字母，226-bp)及5'-LTR(使用虚线加下划线)和3'-LTR(第一个加下划线的部分)的部分序列(634-27＝607bp)，其中在LTR-A靶向位点周围有27-bp缺失(第二个加下划线的部分)。底图：从15个测序的克隆扩增子鉴别的两个indel等位基因。670-bp片段由宿主序列(226-bp)及通过在LTR-A和B靶向位点处的同时切割的190-bp切除之后的剩余LTR序列(634-190＝444bp)组成。加下划线并突出显示的序列表示gRNA LTR-A靶位点和PAM。图2B公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 4-13。(C)HIV-1基因组的LTR-A/B诱导的根除的功能分析显示TSA/PMA再活化诱导的p24病毒粒子释放的实质性阻断。U1细胞用pX260-LTR-A、-B或-A/B转染。2周嘌呤霉素选择之后，在进行p24Gag ELISA之前用TSA(250nM)/PMA处理细胞2d。

图3示出Cas9加LTR-A/B的稳定表达针对新的HIV-1病毒感染接种TZM-bI细胞。(A)用抗Flag抗体的免疫细胞化学(ICC)和蛋白质印迹(WB)分析证实Flag-Cas9在TZM-bI稳定克隆中的表达，嘌呤霉素(2μg/ml)选择2周。(B)Cas9/LTR-A/B稳定克隆(cl-c7)的PCR基因分型显示LTR切除与LTR荧光素酶报道基因活化抑制的紧密相关性。倍数变化表示超过相应的非诱导水平的TSA/PMA诱导水平。(C)将稳定表达Cas9/LTR-A/B的细胞(c4)用假型化-pNL4-3-Nef-EGFP慢病毒在所示的感染复数(MOI)和通过感染后2d进行的EGFP流式细胞术所测量的感染效率下感染。(D)代表性相衬/荧光显微图显示LTR-A/B稳定的而不是对照(U6-CAG；黑色)细胞抵抗pNL4-3-ΔE-EGFP HIV-1报道病毒(灰色)的新感染(右图)。

图4示出Cas9/LTR-A/B对人基因组的靶标外作用。(A)SURVEYOR测定显示在人TZM-bI和U1细胞中在预测/潜在的靶标外区域中没有indel突变。LTR-A靶标上区域(A)被用作阳性对照且空的U6-CAG载体(U6)被用作阴性对照。(B-D)LTR-A/B稳定的TZM-bI亚克隆的全基因组测序示出在U6-CAG对照和LTR-A/B样品中的所谓的indel的数量(B)，在两种样品中靠近gRNA靶位点的10个所谓的indel的详细信息(C)，以及靶标外所谓的indel的分布(D)。图4C公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 14-15。

图5示出通过从人TZM-bI细胞的基因组DNA的TA克隆和PCR产物(-411至-10)测序鉴别的整合的慢病毒LTR-荧火虫荧光素酶报道基因的LTR U3序列。突出显示了4gRNA(LTR-A至D)的原型间隔区和PAM(NGG)序列及所示转录因子的预测结合位点。精确的裂解位点用剪刀标记。+1表示转录起始位点。图5公开了SEQ ID NO:16。

图6示出LTR-C和LTR-D显著地抑制潜伏的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP病毒在CHME5小神经胶质细胞中的TSA诱导的再活化。(A)该图示意性地示出含有Tat、Rev、Env、Vpu、及Nef的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP载体，其具有报道基因d2EGFP。(B)SURVEYOR测定显示在Cas9/LTR-D而不是Cas9/LTR-C转染细胞的靶标上LTR基因组中的indel突变。(C)EGFP流式细胞术的代表性门控图显示与空的U6驱动gRNA表达载体(U6-CAG)相比，通过Cas9/LTR-C或LTR-D的稳定表达，潜伏的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP报道病毒的TSA诱导的再活化的明显减少。

图7显示LTR-C和LTR-D诱导的indel突变及在合并有HIV-1LTR-荧火虫荧光素酶报道基因的TZM-bI细胞中显著降低的组成型和TSA/PMA诱导型荧光素酶活性。(A)功能荧光素酶报道基因测定揭示通过LTR-C、LTR-D或这两者的LTR再活化的明显减少。(B)SURVEYOR测定显示通过LTR-C和LTR-D(上箭头)诱导的LTR DNA(-453至+43)中的indel突变。LTR-C与LTR-D的组合产生194bp片段(下箭头)，其是由LTR-C与LTR-D之间的302bp区域的缺失引起。(C,D)30个克隆的Sanger测序证实对于LTR-C在23％下的indel效率和对于LTR-D在13％下的indel效率并且实施例色谱图显示插入/缺失。图7C公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS17-25。图7D公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 26-30。(E)使用BsaJI切割覆盖LTR的-453至+43的PCR产物的5个位点(96、102、372、386、482)的PCR限制片段长度多态性(RFLP)分析展示在U6-CAG对照样品中的的两条主带(96bp和270bp)，但在96/102位点处在LTR-C诱导的indel突变之后有另一条372bp带(上箭头)、在372位点处在LTR-D诱导的突变之后的290bp带(中间箭头)以及在LTR-C/D诱导的切除之后的180bp片段(下箭头)。(F)实施例色谱图显示在LTR-C与LTR-D之间的302bp片段的缺失(上面)及另外17bp缺失(下面)。红色箭头表示接合位点。*P<0.05指示与U6-CAG对照相比，在LTR-C或LTR-D介导的荧光素酶活化方面的明显减少。图7F公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 31-32。

图8示出使用覆盖HIV-1LTR U3/R/U5区域(-411至+129)的引物，从LTR-A/B的CHME5亚克隆及空的U6-CAG对照的TA克隆和PCR产物的Sanger测序。(A)在5'-和3'-LTR两者上的LTR-A与LTR-B切割物的可能组合产生如所示的潜在片段a-c。(B)片段a(351bp)的Blast分析显示在LTR-A与LTR-B切割位点之间的190bp缺失。(C)片段c(682bp)的Blast显示在LTR-A裂解位点处的175bp插入和在LTR-B裂解位点处的27bp缺失。图8C公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 33-34。

图9证明Cas9/LTR-gRNA有效地根除来自U1单核细胞的的潜伏HIV-1病毒。(A)使用靶向染色体2整合位点-侧接序列(小写字母，467-bp)的引物对(T492/T493)进行的来自长距离PCR的1.1kb片段的Sanger测序显示整个HIV-1基因组(9709-bp)的消除，留下合并的5’-LTR(使用虚线加下划线)与3’-LTR，其中恰好在来自PAM(TGG)LTR-A靶位点(加下划线)的第三核苷酸处具有6-bp插入(加框)及4-bp缺失(nnnn)。图9A公开了SEQ ID NO:35。(B)代表性DNA凝胶图片显示HIV-1基因组的特异性根除。NS：非特异性带。(C,D)使用靶向Gag基因(T457/T458)的引物对的定量PCR分析显示在表达Cas9/LTR-A/B的U1细胞中整个HIV-1基因组根除的85％效率。U1细胞用pX260空载体(U6-CAG)或LTR-A/B编码载体转染。2周嘌呤霉素选择之后，细胞基因组DNA被用于绝对定量qPCR分析，使用掺加的pNL4-3-ΔE-EGFP人基因组DNA作为标准。**P<0.01指示与U6-CAG对照相比的显著降低。

图10显示Cas9/LTR gRNA有效地根除J-Lat潜伏感染的T细胞中的HIV-1前病毒。(A)通过EGFP流式细胞术的功能分析显示EGFP报道病毒的PMA和TNFα诱导的再活化的50％减少。(B)SURVEYOR测定显示在Cas9/LTR-A/B转染细胞的靶标上LTR基因组中的indel突变(箭头)。J-Lat细胞用pX260空载体或LTR-A和-B转染。在2周嘌呤霉素选择之后，将细胞用PMA或TNFα处理24h。基因组DNA经受使用覆盖HIV-1LTR U3/R/U5区域(-411至+129)的引物的PCR并且进行SURVEYOR测定。**P<0.01指示与U6-CAG对照相比的显著降低。(C)使用覆盖HIV-1LTR(-374至+43)的引物的PCR片段分析显示在LTR A与B切割位点之间的190-bp区域的精确缺失，留下227-bp片段(箭头)。持家基因β-肌动蛋白充当DNA纯化和加载对照。

图11示出基因组编辑效率取决于Cas9和gRNA的存在。(A,B)PCR基因分型显示在嘌呤霉素选择的TZM bI亚克隆中U6-驱动的LTR-A或LTR-B表达盒(A)的不存在和CMV-驱动的Cas9DNA(B)的不存在/减少，而没有基因组编辑的任何迹象。来自所示亚克隆的基因组DNA经受使用覆盖U6启动子(T351)和LTR-A(T354)或-B(T356)并且靶向Cas9(T477/T491)的引物对的常规(A)或实时(B)PCR分析。(C,D)Cas9蛋白表达在无效的TZM-bI亚克隆中是不存在的。Flag标记的Cas9融合蛋白通过蛋白质印迹(WB)和免疫细胞化学(ICC)用抗Flag单克隆抗体检测。稳定表达Flag-Cas9的HEK293T细胞系被用作WB的阳性对照(C)。GAPDH充当蛋白加载对照。克隆c6含有Cas9DNA但没有Cas9蛋白表达，提示在嘌呤霉素选择之后表观遗传抑制的潜在机制。克隆c5和c3可代表截短的Flag-Cas9(tCas9)。将核用Hoechst 33258染色(D)。

图12显示Cas9/LTR-A/B gRNA在TZM-bI细胞中的稳定表达针对假型化或天然的HIV-1病毒进行接种。(A)流式细胞术显示在表达Cas9/LTR-A/B的TZM-bI亚克隆中天然的pNL4-3-ΔE-EGFP报道病毒感染效率的明显降低。(B,C)实时PCR分析显示通过Cas9/LTR-A/B gRNA的病毒RNA(B)和DNA(C)的抑制或消除。(D)萤火虫荧光素酶发光测定证明通过Cas9/LTR-A/B gRNA的病毒感染刺激的LTR启动子活性的明显抑制。用所示天然HIV-1病毒感染稳定表达Cas9/LTR-A/B gRNA的TZM-bI细胞2h，并且用PBS洗涤两次。在感染后2d，将细胞收集，固定并且通过流式细胞术分析EGFP表达(A)，或溶解用于总RNA提取和RT-qPCR(B)，基因组DNA纯化用于qPCR(C)和发光测量(D)。*P<0.05和**P<0.01指示与U6-CAG对照相比的显著降低。

图13示出预测的LTR gRNA及其靶标外数量(100％匹配)。pHR’-CMV-LacZ慢病毒载体(AF105229)的5’-LTR有义和反义序列(分别是SEQ ID NOS 79-111和112-141)(634bp)被用于使用Jack Lin's CRISPR/Cas9gRNA搜寻工具(http://spot.colorado.edu/～slin/ cas9.html)搜索含有20-bp指导序列(原型间隔区)加原型间隔区邻近基序序列(NGG)的Cas9/gRNA靶位点。用所呈现的1000个比对序列，将每个gRNA加NGG(AGG、TGG、GGG、CGG)对可利用的人基因组和转录序列进行blast检索。在按下Control+F之后，复制/粘贴靶序列(1-23至9-23核苷酸)并且找出具有100％匹配的基因组靶标的数量。因为重复的基因组文库，将每次搜索的靶标外数量除以3。所示数目指示4次搜索的总和(NGG)。上面的数目(例如，对于gRNA序列(有义)：20、19、19、17、16、15、14、13、12)指示距NGG最远的gRNA靶序列。分别用红色和绿色突出显示所选的LTR-A/B和LTR-C/D的序列和靶标外数量。

图14描绘用于PCR和测序的gRNA靶位点和引物(按出现次序分别为SEQ ID NO 36-78，)的寡核苷酸。

图15显示LTR-A和LTR-B的预测的gRNA靶位点的位置并且公开了“查询序列(querySeq)”序列作为SEQ ID NOS 142-252和“参考序列(ref Seq)”序列作为SEQ ID NOS 253-363，所有都分别按出现次序。

图16示出LTR-C和LTR-D两者降低了稳定地合并有HIV-1LTR萤火虫荧光素酶报道基因的TZMBI细胞中组成型和TSA/PMA诱导的荧光素酶活性并且组合诱导精确的基因组切除。为HIV-LTR的启动子区域设计六个gRNA靶标(图16A)图16A公开了SEQ ID NO:16。通过脂转染胺2000将TZMBI细胞用Cas9-EGFP和嵌合体gRNA表达盒(PCR产物)共转染。3d之后，通过FACS对EGFP阳性细胞进行分选并且为荧光素酶测定收集每组2000个细胞(图16B)。图16B公开了SEQ ID NO:31。培养群体分选细胞2d并且在荧光素酶测定之前用TSA/PMA处理1d。将单细胞分选到96孔平板中并且培养直到为在TSA/PMA的不存在(图16D)或存在(图1E)下荧光素酶测定汇合持续1d。用Surveyor Cel-I核酸酶测定(图1F)和用BsajI的限制片段长度多态性(图16G)分析来自群体分选细胞的PCR产物，所述多态性展示突变(图16F)或未切割的(图16G)带(红色箭头)。由如预测的LTR-C与LTR-D之间的321bp区域(图16A，红色箭头)的缺失产生的200bp片段(图16F、16G，黑色箭头)是通过展示精确的基因组切除的TA-克隆和测序来验证(图16H)。来自个别的LTR-C和-D的PCR产物的Sanger测序分别鉴别indel突变效率％和％(图16)。*p<0.05指示与相应的U6-CAG对照相比，使用学生t检验的统计上显著的降低。原型间隔区(E)、原型间隔区(C)、原型间隔区(A)、原型间隔区(B)、原型间隔区(D)及原型间隔区(F)对应于分别按出现次序的SEQ ID NOS 365、367、369、371、373及375。

图17示出Cas9/LTR-gRNA抑制通过EGFP流式细胞术测量的HIV-1病毒在HIV-1潜伏感染的CHME5小神经胶质细胞系中的组成型和诱导型产生。将具有报道基因d2EGFP的含有Tat、Rev、Env、Vpu、及Nef的pHR慢病毒载体转导到人胎儿小神经胶质细胞系CHME5中并且图解在3’-LTR的U3区域中的400bp缺失(图17A)。在Cas9/gRNA的瞬时转染之后，人HIV-1LTR-A、B、C、D单独或组合降低了强度而非EGFP的百分比，这是由于LTR启动子活性的抑制(图17B、17C)。在抗生素选择1-2周之后，EGFP细胞的百分比也降低(图17D、17E)。用SurveyorCel-I核酸酶测定(图17F)分析来自稳定选择的克隆的PCR产物，所述测定展示在LTR-A和LTR-B中剧烈的indel突变但在LTR-A/B组合中微弱的突变(红色箭头)。由如预测的LTR-A与LTR-B之间的190bp区域(图17H，红色箭头)的缺失产生的331bp片段(图17F、17G，黑色箭头)是通过展示精确的基因组切除的TA-克隆和测序来验证(图17H)。图17H公开了分别按出现次序的SEQ ID NOS 1-3。

图18示出代表性HIV-1序列(SEQ ID NO:376)的LTR。U3区域从核苷酸1延伸至核苷酸432(SEQ ID NO:377)，R区域从核苷酸432延伸至核苷酸559(SEQ ID NO:378)，并且U5区域从560延伸至核苷酸644(SEQ ID NO:379)。

图19示出代表性S IV序列(SEQ ID NO:380)的LTR。U3区域从核苷酸1延伸至核苷酸517(SEQ ID NO:381)，R区域从核苷酸518延伸至核苷酸693(SEQ ID NO:382)，并且U5区域从694延伸至核苷酸818(SEQ ID NO:383)。

具体实施方式

本发明部分地基于以下发现：可通过以单一和多重构型形式使用RNA指导的规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-Cas 9核酸酶系统(Cas9/gRNA)消除来自HIV-1感染细胞的整合的HIV-1基因组。鉴别了HIV-1LTR U3区域内由Cas9/gRNA有效编辑的高度特异性靶标，其灭活在潜伏感染的小神经胶质前单核细胞和T细胞中的病毒基因表达和复制。Cas9/gRNA既不引起遗传毒性又不靶标外编辑至宿主细胞，并且完全切除跨越5'-至3'-LTR的整合前病毒DNA的9709-bp片段。此外，多重gRNA在表达Cas9的细胞内的存在预防了HIV-1感染。结果表明Cas9/gRNA可被工程改造以提供针对AIDS的特异性、有效预防和治疗方法。

因此，本发明涉及包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸及与逆转录病毒(例如HIV)中的靶序列互补的指导RNA的组合物；以及包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸及与HIV中的靶序列互补的指导RNA的药物制剂。还涉及包含CRISPR相关核酸内切酶多肽及与HIV中的靶序列互补的指导RNA的组合物；以及包含CRISPR相关核酸内切酶多肽及与HIV中的靶序列互补的指导RNA的药物制剂。

还涉及施用所述组合物以治疗逆转录病毒感染，例如HIV感染的方法；消除病毒复制的方法；以及预防HIV感染的方法。本文所述的治疗方法可结合其他抗逆转录病毒疗法(例如HAART)进行。

HIV感染的临床过程可根据许多因素而变化：包括受试者的遗传背景、年龄、一般健康状况、营养、所接受的治疗、以及HIV亚型。一般说来，大多数个体在感染的几周或几个月内发展为流感症状。症状可包括发热、头痛、肌肉痛、皮疹、寒战、喉咙痛、口腔或生殖器溃疡、淋巴结肿胀、关节痛、盗汗、以及腹泻。症状的强度从轻度变化至重度可取决于个体。在急性期，HIV病毒颗粒被吸引到并进入表达适当的CD4受体分子的细胞。一旦病毒进入宿主细胞，编码逆转录酶的HIV便产生HIV RNA的前病毒DNA拷贝并且所述前病毒DNA变得整合到宿主细胞基因组DNA中。也就是此HIV原病毒是由宿主细胞复制，导致新的HIV病毒粒子的释放，这随后可能感染其他细胞。本发明的方法和组合物一般并以不同方式适用于整合HIV前病毒DNA的切除，尽管本发明不因此受限制，并且所述组合物可向处于任何感染阶段的受试者或处于HIV感染风险中的未感染的受试者施用。

原发性HIV感染在几周至几个月内消退，并且通常继之以较长的临床“潜伏”期，可持续多达10年。潜伏期也被称为无症状的HIV感染或慢性HIV感染。受试者的CD4淋巴细胞数量反弹，但没有达到感染前水平并且大多数受试者经历血清转化，即，他们在感染的2至4周内在其血液中具有可检测水平的抗HIV抗体。在此潜伏期期间，在周围血液单核细胞中没有可检测的病毒复制并且在周围血液中几乎没有或没有可培养的病毒。在潜伏期(也称为临床潜伏阶段)期间，感染了HIV的人可能不经历HIV相关症状，或仅有轻度症状。但HIV病毒继续以极低水平繁殖。在已用抗逆转录病毒疗法治疗的受试者中，此潜伏期可延续几十年或更久。然而，在此阶段的受试者仍能将HIV传输给其他人，即使他们正在接受抗逆转录病毒疗法，但抗逆转录病毒疗法降低传播的风险。如上所述，抗逆转录病毒疗法不抑制病毒基因组表达的低水平，也不有效地靶向潜伏感染的细胞，如静息记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞以及肠相关淋巴样细胞。

AIDS(获得性免疫缺陷综合征)的临床体征和症状表现为CD4淋巴细胞数量减少，导致免疫系统的不可逆性损伤。许多患者还表现出AIDS相关并发症，包括例如机会性感染，如肺结核、沙门氏菌病、巨细胞病毒、念珠菌病、隐球菌脑膜炎、弓形体病、及隐孢子虫病；以及某些种类的癌症，包括例如卡波济氏肉瘤和淋巴瘤；以及消耗综合征、神经并发症、及HIV相关肾病。

组合物

本发明组合物包含编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9)的核酸及与逆转录病毒(例如HIV)中的靶序列互补的指导RNA。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对可移动遗传元件(病毒、可转座元件及接合质粒)的RNA指导的适应性免疫系统。已鉴别三种类型(I-III)的CRISPR系统。CRISPR簇含有间隔区，与先前的可移动元件互补的序列。将CRISPR簇转录并加工到成熟的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)RNA(crRNA)中。CRISPR相关核酸内切酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统并且具有强核酸内切酶活性以切割靶DNA。Cas9是由成熟crRNA，其含有独特靶序列(称为间隔区)的约20个碱基对(bp)；和反式活化的小RNA(tracrRNA)指导，所述tracrRNA充当用于前crRNA的核糖核酸酶III辅助加工的指导。crRNA:tracrRNA双链体经由crRNA上的间隔区与靶DNA上的互补序列(称为原型间隔区)之间的互补碱基配对指导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原型间隔区邻近基序(PAM)以指定切割位点(距PAM的第三核苷酸)。crRNA和tracrRNA可单独地表达或经由合成的茎环(AGAAAU)被工程改造成人工融合小指导RNA(sgRNA)以模拟天然的crRNA/tracrRNA双链体。这种sgRNA(像shRNA)可合成或体外转录用于指导RNA转染或由U6或H1促进的RNA表达载体表达，但人工sgRNA的裂解效率比其中crRNA和tracrRNA单独表达的系统的效率要低。

本发明组合物可包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸。在一些实施方案中，所述CRISPR相关核酸内切酶可以是Cas9核酸酶。Cas9核酸酶可具有与野生型化脓链球菌序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，CRISPR相关核酸内切酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌物种，如嗜热链球菌；绿脓假单胞菌、大肠杆菌、或其他测序的细菌基因组和古细菌、或其他原核细胞微生物。或者，野生型化脓链球菌Cas9序列可被修饰。所述核酸序列可以是为在哺乳动物细胞中的有效表达(即“人源化”)而优化的密码子。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由在以下列出的任一表达载体编码的Cas9核酸酶序列：Genbank登记号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765。或者，Cas9核酸酶序列可以是例如在可商购获得的载体如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260内所含的序列。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶可具有作为Genbank登记号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765的Cas9核酸内切酶序列或者PX330或PX260(Addgene,Cambridge,MA)的Cas9氨基酸序列中的任一个的变体或片段的氨基酸序列。Cas9核苷酸序列可被修饰以编码Cas9的生物活性变体，并且这些变体可具有或可包含例如借助于含有一个或多个突变(例如，添加、缺失、或取代突变或者这类突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。取代突变中的一个或多个可以是取代(例如保守氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可具有与野生型Cas9多肽至少或约50％序列同一性(例如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％序列同一性)的氨基酸序列。保守的氨基酸取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。在Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的那些以及非标准氨基酸(例如，具有D-构型而非L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可包括作为标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如，吡咯赖氨酸可代替赖氨酸使用且硒代半胱氨酸可代替半胱氨酸使用)。非天然存在的氨基酸残基是在自然界中没有发现但符合氨基酸的基本配方并且可并入肽中的那些。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。关于其他例子，可查阅教科书或万维网(网站目前由California Institute of Technology维护并且展示已成功地并入功能蛋白中的非天然氨基酸的结构)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可在保守的HNH和RuvC结构域中突变，其参与了链特异性裂解。例如，在RuvC催化结构域中的天冬氨酸盐向丙氨酸(D10A)的突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)切刻而非裂解DNA以产生单链断裂，并且经由HDR的后续优先修复可潜在地降低来自靶标外双链断裂的不需要的indel突变的频率。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含由如上所述的任何核酸序列编码的CRISPR相关核酸内切酶多肽。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，不过它们通常是指具有不同尺寸的肽序列。本发明的基于氨基酸的组合物可指的是“多肽”，意味着它们是氨基酸残基的线性聚合物，并且帮助将其与全长蛋白区分开。本发明的多肽可“构成”或“包括”CRISPR相关核酸内切酶的片段，并且本发明包括构成或包括CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体的多肽。应了解，所述多肽可仅包括CRISPR相关核酸内切酶(或其生物活性变体)的片段，但也可包括另外的残基。生物活性变体将保留足以裂解靶DNA的活性。

在氨基酸残基之间的键可以是常规肽键或另一个共价键(如酯或醚键)，并且多肽可通过酰胺化、磷酸化或糖基化来修饰。修饰可影响多肽主链和/或一个或多个侧链。化学修饰可以是在编码多肽的mRNA的翻译之后在体内产生的天然存在的修饰(例如，在细菌宿主中的糖基化)或体外产生的合成修饰。CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体可包括由天然存在的(即，在体内天然产生)与合成修饰(即，在体外产生的天然存在的或非天然存在的修饰)的任何组合产生的一个或多个结构修饰。修饰的实例包括但不限于酰胺化(例如，在C端的游离羧基被氨基置换)；生物素化(例如，用生物素分子酰化赖氨酸或其他反应性氨基酸残基)；糖基化(例如，添加糖基到天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上以生成糖蛋白或糖肽)；乙酰化(例如，添加乙酰基，通常在多肽的N端)；烷基化(例如，添加烷基)；异戊二烯化(例如，添加类异戊二烯基团)；硫辛酰化(例如，硫辛酸盐部分的附着)；以及磷酸化(例如，添加磷酸基(phosphate group)到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸上)。

在生物活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的那些以及非标准氨基酸(例如，具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可包括作为标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如，吡咯赖氨酸可代替赖氨酸使用且硒代半胱氨酸可代替半胱氨酸使用)。非天然存在的氨基酸残基是在自然界中没有发现但符合氨基酸的基本配方并且可并入肽中的那些。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。关于其他例子，可查阅教科书或万维网(网站目前由California Institute ofTechnology维护并且展示已成功地并入功能蛋白中的非天然氨基酸的结构)。

或者或另外，在生物活性变体中的一个或多个氨基酸残基可以是天然存在的残基，其不同于在野生型序列中的相应位置处所见的天然存在的残基。换言之，生物活性变体可包括一个或多个氨基酸取代。氨基酸残基的取代、添加、或缺失可指的是野生型序列的突变。如所示，取代可以用非天然存在的残基或仅仅不同的天然存在的残基替代天然存在的氨基酸残基。此外，取代可构成保守或非保守取代。保守的氨基酸取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。作为CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体的多肽可根据其序列与相应的野生型多肽类似或同一的程度来表征。例如，生物活性变体的序列可与野生型多肽中的相应残基至少或约80％同一。例如，CRISPR相关核酸内切酶的生物活性变体可具有与CRISPR相关核酸内切酶或其同源物或直向同源物至少或约80％序列同一性(例如，至少或约85％、90％、95％、97％、98％、或99％序列同一性)的氨基酸序列。

CRISPR相关核酸内切酶多肽的生物活性变体将保留适用于本发明方法中的足够生物活性。生物活性变体将保留足以在靶向DNA裂解中发挥作用的活性。生物活性可以本领域技术人员已知的方式评定并且包括但不限于体外裂解测定或功能测定。

多肽可通过多种方法生成，包括例如重组技术或化学合成。生成之后，可通过本领域中熟知的手段将多肽分离和纯化至任何所需程度。例如，可在例如在多糖凝胶介质如交联葡聚糖G-25上的反相(优选地)或正相HPLC或尺寸排阻或分配色谱法之后使用冻干。最终多肽的组成可通过在经由标准手段的肽降解之后的氨基酸分析、通过氨基酸测序、或通过FAB-MS技术证实。多肽的氨基的盐(包括酸式盐)、酯、酰胺、及N-酰基衍生物可使用本领域中已知的方法制备，并且这类肽适用于本发明的上下文中。

本发明的组合物包含编码指导RNA(gRNA)的序列，所述指导RNA包含与逆转录病毒中的靶序列互补的序列。所述逆转录病毒可以是慢病毒属，例如，人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒。所述人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。靶序列可包含来自任何HIV，例如HIV-1和HIV-2的序列，及其任何循环重组形式。HIV的遗传变异性反映在已描述的多个种群和亚型中。HIV序列的集合在Los Alamos HIV数据库和纲要(即，序列数据库网址是http://www.hiv.lanl.gov/)中编译。本发明的方法和组合物可施用于来自那些不同种群、亚型及循环重组形式中的任一种的HIV。这些包括例如HIV-1大种群(常称为种群M)和小种群，种群N、O及P，以及但不限于任何以下亚型：A、B、C、D、F、G、H、J及K，或HIV的种群(例如但不限于任何以下种群：N、O及P)。所述方法和组合物还可施用于HIV-2及A、B、C、F或G进化枝(也称为“亚型”或“种群”)中的任一种以及HIV-2的任何循环重组形式。

指导RNA可以是与编码或非编码序列互补的序列。例如，指导RNA可以是HIV序列，如长末端重复(LTR)序列、蛋白编码序列、或调控序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与HIV长末端重复(LTR)区域互补的序列。HIV-1LTR的长度是大约640bp。示例性HIV-1LTR是SEQ ID NO:376的序列。示例性SIV LTR是SEQ ID NO:380的序列。HIV-1长末端重复(LTR)被分成了U3、R及U5区域。示例性HIV-1LTR U3、R及U5区域分别是SEQ ID NO:377、378及379。示例性SIV LTR U3、R及U5区域分别是SEQ ID NO:381、382及383。示例性HIV-1和SIV序列的U1、R、U5区域的构型分别示于图18和19中。LTR含有用于基因表达的所有所需信号并且参与了原病毒向宿主细胞的基因组中的整合。例如，基本或核心启动子、核心增强子及调节区域见于U3内，而反式激活反应元件见于R内。在HIV-1中，U5区域包含若干个亚区域，例如TAR或反式作用反应元件，其参与了转录激活；多聚A，其参与了二聚化和基因组包装；PBS或引物结合位点；Psi或包装信号；DIS或二聚体起始位点。

有用的指导序列与LTR的U3、R、或U5区域互补。靶向HIV-1的U3区域的示例性指导RNA序列示于图13中。指导RNA序列可包含例如以下序列：

LTR A：ATCAGATATCCACTGACCTTTGG(SEQ ID NO:96)，

LTR B：CAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG(SEQ ID NO:121)，

LTR C：GATTGGCAGAACTACACACCAGG(SEQ ID NO:87)，或

LTR D：GCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGG(SEQ ID NO:110。

LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)在U3(SEQ ID NO:16)区域内的位置示于图5中。靶向U3区域的另外的示例性指导RNA序列列在图13中所示的表中并且可具有SEQ ID NO:79-111和SEQ ID NO:111-141中任一者的序列。在一些实施方案中，指导序列可包含与SEQ ID NO:79-111和SEQ IDNO:111-141中的任一者具有95％同一性的序列。因此，指导RNA序列可包含例如与以下序列具有95％同一性的序列：

LTR A：ATCAGATATCCACTGACCTTTGG(SEQ ID NO:96)，

LTR B：CAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG(SEQ ID NO:121)，

LTR C：GATTGGCAGAACTACACACCAGG(SEQ ID NO:87)，或

LTR D：GCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGG(SEQ ID NO:110)。

还可将指导RNA序列称为原型间隔区，例如原型间隔区(A)、原型间隔区(B)、原型间隔区(C)、及原型间隔区(D)。

指导RNA序列可以是见于HIV-1U3、R或U5区域参考序列或共有序列内的序列。然而，本发明不因此具限制性，并且指导RNA序列可被选择以靶向任何变体或突变HIV序列。在一些实施方案中，指导RNA可包含变体序列或准种序列。在一些实施方案中，指导RNA可以是对应于由经受治疗的受试者所载有的病毒基因组中的序列的序列。因此，例如，可获得在由受试者载有的HIV病毒中的特定U3、R或U5区域的序列并且可使用与患者的特定序列互补的指导RNA。

在一些实施方案中，指导RNA可以是与蛋白编码序列，例如编码一种或多种病毒结构蛋白的序列(例如，gag、pol、env及tat)互补的序列。因此，序列可与以下蛋白内的序列互补：gag多蛋白，例如，MA(基质蛋白，p17)；CA(衣壳蛋白，p24)；SP1(间隔肽1，p2)；NC(核衣壳蛋白，p7)；SP2(间隔肽2，p1)及P6蛋白；pol，例如，逆转录酶(RT)和RNA酶H、整合酶(IN)及HIV蛋白酶(PR)；env，例如，gp160、或gp160的裂解产物，例如gp120或SU、和gp41或TM；或tat，例如，72-氨基酸单外显子Tat或86-101氨基酸两外显子Tat。在一些实施方案中，指导RNA可以是与编码包括以下的辅助蛋白的序列互补的序列：如vif、n willef(负因子)、vpu(病毒蛋白U)及tev。

在一些实施方案中，序列可以是与以下结构或调控元件互补的序列：例如，如上所述的LTR；TAR(用于病毒反式激活的靶序列)、用于Tat蛋白且用于细胞蛋白的结合位点，由HIV-1中的病毒mRNA的开头大约45个核苷酸(或HIV-2中的开头100个核苷酸)组成，形成发夹茎-环结构；RRE(Rev反应元件)，在HIV-1的env区域内编码的RNA元件，由大约200个核苷酸(在HIV-1中从转录起始的位置7710至8061，跨越gp120与gp41的边界)组成；PE(Psi元件)，在Gag起始密码子之前并与其重叠的4个茎-环结构集合；SLIP，TTTTTT“滑动位点”，继之以茎-环结构；CRS(顺式作用抑制序列)；INS抑制性/不稳定RNA序列)，见于例如HIV-1的gag区域中的核苷酸414至631处。

指导RNA序列可以是有义或反义序列指导RNA序列一般包括原型间隔区邻近基序(PAM)。PAM的序列可取决于所用的CRISPR核酸内切酶的特异性要求而变化。在来源于化脓性链球菌的CRISPR-Cas系统中，靶DNA通常紧跟在5’-NGG原型间隔区邻近基序(PAM)之前。因此，对于化脓性链球菌Cas9，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其他Cas9直向同源物可具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌的Cas9需要用于CRISPR 1的5’-NNAGAA和用于CRISPR3的5’-NGGNG)并且脑膜炎奈瑟氏菌(Neiseria menigiditis)需要5’-NNNNGATT)。指导RNA的特异性序列可变化，但不考虑所述序列，有用的指导RNA序列将是使靶标外作用最小化同时实现高效率并且完全除去基因组整合的HIV-1原病毒的那些序列。指导RNA序列的长度可从约20变化至约60或更多个核苷酸，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。有用的选择方法鉴别在外来病毒基因组与包含内源逆转录病毒DNA的宿主细胞基因组之间具有极低同源性的区域，包括使用12-bp+NGG靶标选择标准的生物信息学筛选以排除靶标外人转录物组或(甚至很少地)非翻译-基因组位点；避免HIV-1LTR启动子内的转录因子结合位点(在宿主基因组中潜在保守的)；LTR-A-和-B-指导的、30-bp gRNA以及反映原始细菌免疫机制的前crRNA系统的选择以相对基于20-bpgRNA-、嵌合crRNA-tracRNA的系统提高特异性/效率；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR测定，用于鉴别和排除潜在的靶标外作用。

指导RNA序列可被构造成单序列或一个或多个不同序列的组合，例如多重构型。多重构型可包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同指导RNA的组合，例如在U3、R、或U5中的序列的任何组合。在一些实施方案中，可使用LTR A、LTR B、LTRC及LTR D的组合。在一些实施方案中，可使用序列LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ IDNO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)、及LTR D(SEQ ID NO:110)中的任一者的组合。在一些实施方案中，可使用具有序列SEQ ID NO:79-111和SEQ ID NO:111-141的序列的任何组合。当组合物在表达载体中施用时，指导RNA可由单个载体编码。或者，多个载体可被工程改造以便每个包含两个或更多个不同的指导RNA。有用的构型将造成在裂解位点之间的病毒序列的切除，从而使得除去HIV基因组或HIV蛋白表达。因此，使用两个或更多个不同的指导RNA促进由CRISPR核酸内切酶识别的裂解位点之间的病毒序列的切除。所述切除区域在大小上可从单个核苷酸变化至数千个核苷酸。示例性切除区域描述于实施例中。

当组合物作为核酸或包含在表达载体内施用时，CRISPR核酸内切酶可由与指导RNA序列相同的核酸或载体编码。或者或另外，CRISPR核酸内切酶可在来自指导RNA序列的物理上单独的核酸种或在单独的载体中编码。

在一些实施方案中，RNA分子例如crRNA、tracrRNA、gRNA被工程改造以包含一个或多个修饰的核酸碱基。例如，RNA分子的已知修饰可见于例如Genes VI,第9章("Interpreting the Genetic Code"),Lewis编著(1997,Oxford University Press,NewYork),and Modification and Editing of RNA,Grosjean和Benne编著(1998,ASM Press,Washington DC)中。修饰的RNA组分包括以下：2'-O-甲基胞苷；N⁴-甲基胞苷；N⁴-2'-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰胞苷；5-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲酰胞苷；2'-O-甲基-5-甲酰胞苷；3-甲基胞苷；2-巯基胞苷；赖西丁；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；2-硫代-2'-O-甲基尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；4-硫代尿苷；胸腺嘧啶核糖核苷；5,2'-O-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；5-羧基甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2'-硫代尿苷；5-氨甲酰基甲基尿苷；5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；二氢尿苷；二氢胸腺嘧啶核糖核苷；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N.sup.6N-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2'-O-三甲基腺苷；2-甲硫基-N⁶N-异戊烯腺苷；N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷；2-甲硫基-N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷；N⁶-甘氨酰基氨基甲酰基)腺苷；N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲硫基-N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；肌苷；2'O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1；2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2'-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-甲基鸟苷；N²；7-二甲基鸟苷；N²；N²；7-三甲基鸟苷；丫苷；甲基丫苷；修饰不足的(under-modified)羟基怀丁苷；怀丁苷；羟基怀丁苷；过氧基怀丁苷；辫苷；环氧基辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基-辫苷；7-氰基-7-脱氮鸟苷；arachaeosine[也称为7-甲酰胺基-7-脱氮鸟苷]；以及7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。

术语“核酸”与“多核苷酸”可互换地指示RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、及含有核酸类似物的DNA(或RNA)，其任一者可编码本发明的多肽并且其所有都被本发明涵盖。多核苷酸可具有基本上任何三维结构。核酸可以是双链或单链(即，有义链或反义链)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)及其部分、转移RNA、核蛋白体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、及引物、以及核酸类似物。在本发明的上下文中，核酸可编码天然存在的Cas9的片段或其生物活性变体及指导RNA，其中指导RNA与HIV中的序列互补。

“分离的”核酸可以是例如天然存在的DNA分子或其片段，前提条件是一般直接侧接天然存在的基因组中的那个DNA分子的核酸序列中的至少一个被除去或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于作为单独分子而存在的DNA分子，不依赖于其他序列(例如，化学合成的核酸、或通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离的核酸也指的是并入载体、自主复制质粒、病毒、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。另外，分离的核酸可包括工程改造的核酸，如DNA分子，其是杂合或融合核酸的一部分。存在于许多(例如，几十，或几百至几百万)其他核酸中，例如cDNA文库或基因组文库或含有基因组DNA限制性消化的凝胶片内的核酸不是分离的核酸。

分离的核酸分子可通过标准技术产生。例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述的核苷酸序列的(包括编码本文所述的多肽的核苷酸序列)分离的核酸。PCR可用于从DNA以及RNA扩增特异性序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。各种PCR方法描述于例如PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach和Dveksler编著,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1995中。通常，用感兴趣区域末端或更远处的序列信息设计与待扩增模板的反义链序列相同或相似的寡核苷酸引物。可获得各种PCR策略，通过这些策略可以将位点特异性的核苷酸序列修饰引入模板核酸中。

还可以化学合成分离的核酸，或是单一核酸分子(例如使用自动化DNA合成法，以3'至5'方向，使用亚磷酰胺技术)或是一系列寡核苷酸。例如，可以合成包含期望序列的一对或多对长寡核苷酸(例如，>50-100个核苷酸)，其中每一对包含互补短区段(例如约15个核苷酸)，使得寡核苷酸对在退火时形成双链体。使用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每对寡核苷酸生成单一双链核酸分子，然后可将其连接到载体上。本发明的分离的核酸还可通过诱变例如编码Cas9的DNA的天然存在部分(根据例如上式)而获得。

两个核酸或它们所编码的多肽可被描述为彼此具有一定程度的同一性。例如，Cas9蛋白及其生物活性变体可被描述为展现一定程度的同一性。比对可通过以下方法来组装：在蛋白质信息研究(PIR)网站(http://pir.georgetown.edu)中定位短Cas9序列，接着用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上的“短的几乎相同的序列”BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)算法进行分析。

如本文所用，术语“序列同一性百分比”是指任何给定查询序列和主题序列之间的同一性程度。例如，天然存在的Cas9可以是查询序列并且Cas9蛋白的片段可以是主题序列。类似地，Cas9蛋白的片段可以是查询序列并且其生物活性变体可以是主题序列。

为了测定序列同一性，可使用计算机程序ClustalW(1.83版，默认参数)将查询核酸或氨基酸序列分别与一个或多个主题核酸或氨基酸序列比对，所述计算机程序允许核酸或蛋白序列的比对在其整个长度上进行(总比对)参见Chenna等人,Nucleic AcidsRes.31:3497-3500,2003。

ClustalW计算查询与一个或多个主题序列之间的最佳匹配并且对其进行比对以便测定同一性、相似性和差异。一个或多个残基的缺口可插入查询序列、主题序列或两者中，以最大程度进行序列比对。在核酸序列的快速成对比对中，采用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：百分比；顶端对角线数量：4；以及缺口罚分：5。在核酸序列的多重比对中，采用以下参数：缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；以及重量转换：是。在蛋白序列的快速成对比对中，采用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：百分比；顶端对角线数量：5；缺口罚分：3。对于蛋白序列的多重比对，使用下述参量：重量基质：blosum；缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水性缺口：开启；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、和Lys；残基特异性缺口罚分：开启。输出是反映序列间关系的序列比对。可以在例如贝勒医学研究开拓者学院网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和在欧洲生物信息研究院万维网址(ebi.ac.uk/clustalw)上运行ClustalW。

为了测定查询序列与主题序列之间的同一性百分比，ClustalW将最佳比对中的同一性数量除以所比较的残基数量(缺口位置被排除)，并且将结果乘以100。输出是主题序列关于查询序列的同一性百分比。注意到，同一性百分比的数值可四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入到78.2。

本文所述的核酸和多肽可被称为“外源性”。术语“外源性”表示该核酸或多肽是重组核酸构建体的一部分或由其编码，或者不是在其天然环境下。例如，外源性核酸可以是来自一个物种的序列，该物种被引入另一物种中，即异源核酸。通常，这类外源性核酸经由重组核酸构建体被引入另一物种中。外源性核酸也可以是某种生物体天然具有并再引入该生物体细胞中的序列。常常可通过连接于该外源性核酸的非天然序列，如侧接重组核酸构建体中天然序列的非天然调控序列的存在，将包含天然序列的外源性核酸与天然存在的序列区分开。另外，稳定转化的外源性核酸一般整合到发现天然序列的位置以外的位置上。

重组构建体也在本文中提供并且可用于转化细胞以表达Cas9和/或与HIV中的靶序列互补的指导RNA。重组核酸构建体包含编码Cas9的核酸和/或如本文所述的与HIV中的靶序列互补的指导RNA，其与适用于在细胞中表达Cas9和/或与HIV中的靶序列互补的指导RNA的调控区域可操作地连接。应理解，许多核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性在本领域中是众所周知的。对于许多氨基酸而言，存在超过一种的作为氨基酸的密码子的核苷酸三联体。例如，在Cas9的编码序列中的密码子可被修饰以使得在特定生物体中获得最佳表达，使用那个生物体的适当密码子偏好表。

也提供含有核酸如本文所述的那些核酸的载体。“载体”指可以在其中插入另一种DNA区段从而使得插入的区段进行复制的复制子，如质粒、噬菌体、或粘粒。通常，载体当与适当的控制元件相连时能够复制。合适的载体骨架包括例如：本领域常规使用的那些载体，如质粒、病毒、人工染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体、以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包括调控区域的载体。广泛多种宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的核酸序列。合适的表达载体包括但不限于质粒和病毒载体，其来源于例如噬菌体、杆状病毒及逆转录病毒。许多载体和表达系统可从以下公司商购获得：如Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)及Invitrogen/LifeTechnologies(Carlsbad,CA)。

本文所提供的载体还可包含例如复制起点、骨架附着区(SAR)和/或标记。标记基因可对宿主细胞赋予可选择的表型。例如，标记可赋予抗微生物剂抗性，如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性。如上所述，表达载体可包含经设计有利于所表达的多肽的操作或检测(例如纯化或定位)的标签序列。标签序列，如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素、或Flag^TM标签(Kodak,New Haven,CT)序列，通常表达为与编码多肽的融合物。这种标签可以插入多肽中的任何位置，包括羧基或氨基末端。

另外的表达载体还可包含例如染色体、非染色体及合成DNA序列的区段。合适的载体包括SV40及已知细菌质粒的衍生物，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体1的众多衍生物，例如NM989及其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，如2μ质粒或其衍生物；适用于真核细胞中的载体，如适用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体，如被修饰以采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。

也可使用酵母表达系统。例如，可根据本发明采用非融合pYES2载体(XbaI、SphI、Shol、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1及HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI及HindIII克隆位点，N端肽用ProBond树脂纯化并用肠激酶裂解；Invitrogen)，仅提到其中两例。也可根据本发明制备酵母双杂合表达系统。

载体还可包含调控区域。术语“调控区域”是指影响转录或翻译起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或流动性的核苷酸序列。调控区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白识别位点、诱导型元件、蛋白结合序列、5’和3’非翻译区域(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、核定位信号、以及内含子。

如本文所用，术语“可操作连接”是指调控区域和有待转录的序列在核酸中的定位以便影响这类序列的转录或翻译。例如，为了在启动子控制下产生编码序列，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游的一个与约五十个核苷酸之间。然而，启动子可定位在翻译起始位点上游差不多约5,000个核苷酸处或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子通常包含至少一个核心(基本)启动子。启动子还可包含至少一个控制元件，如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。有待包括的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、选择性、可诱导性、所需表达水平、以及细胞或组织优先表达。本领域技术人员常规地通过相对于编码序列适当地选择和定位启动子及其他调控区域来调节编码序列的表达。

载体包括例如病毒载体(如腺病毒(“Ad”)、腺相关病毒(AAV)、及水疱性口腔炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体及其他含有脂质的复合体、及其他能够介导多核苷酸向宿主细胞递送的大分子复合体。载体还可包含进一步调节基因递送和/或基因表达或另外向靶细胞提供有利性质的其他组分或功能物。如以下更详细地描述和说明，这种其他组分包括例如影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的组分(如介导核定位的因子)；以及影响多核苷酸表达的组分。这种组分也可能包括标记，如可检测和/或可选择的标记，其可被用于检测或选择已经摄入并开始表达被载体递送的核酸的细胞。这种组分可作为载体的天然特征来提供(如具有介导结合和摄取的组分或功能物的某种病毒载体的使用)，或可通过修饰载体来提供此功能物。其他载体包括由Chen等人；BioTechniques,34:167-171(2003)所述的那些载体。很多种此类载体在本领域中是已知的并且通常是可获得的。

“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。因为许多病毒载体展现与包装有关的尺寸限制，所以异源基因产物或序列通常通过替代病毒基因组的一个或多个部分而被引入。此类病毒可变成复制缺陷型，需要有待在病毒复制和包衣壳化期间反式提供的缺失功能(通过使用例如辅助病毒或携带复制和/或包衣壳化所必需的基因产物的包装细胞系)。还描述了其中有待递送的多核苷酸在病毒颗粒外携带的修饰的病毒载体(参见，例如Curiel,D T等人PNAS 88:8850-8854,1991)。

合适的核酸递送系统包括重组病毒载体，通常是来自以下至少一种的序列：腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒、或日本脂质体(HVJ)复合体的血细胞凝集病毒。在此情况下，病毒载体包含与多核苷酸可操作地连接的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。重组病毒载体可包含其中的一个或多个多核苷酸，优选约一个多核苷酸。在一些实施方案中，本发明方法中所用的病毒载体具有约10⁸至约5×10¹⁰pfu的pfu(嗜菌斑形成单位)。在其中多核苷酸有待用非病毒载体施用的实施方案中，使用约0.1纳克至约4000微克将是有用的，例如约1纳克至约100微克。

另外的载体包括病毒载体、融合蛋白及化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一个基于HIV的病毒载体包含至少两个载体，其中gag和pol基因来自于HIV基因组，而env基因来自于另一种病毒。DNA病毒载体包括痘载体，如正痘病毒或禽痘病毒载体；疱疹病毒载体，如单纯性疱疹I病毒(HSV)载体[Geller,A.I.等人,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.等人,DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover编著(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等人,ProcNatl.Acad.Set:U.S.A.:90 7603(1993)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990)]、腺病毒载体[LeGal LaSalle等人,Science,259:988(1993)；Davidson等人,Nat.Genet.3:219(1993)；Yang等人,J.Virol.69:2004(1995)]以及腺相关病毒载体[Kaplitt,M.G.等人,Nat.Genet.8:148(1994)]。

痘病毒载体将该基因引入细胞胞质中。禽痘病毒载体仅产生核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些本发明实施方案的适应症。腺病毒载体比腺相关病毒产生更短期的表达(例如小于约一个月)，在一些实施方案中，腺相关病毒可展现久得多的表达。所选的具体载体将取决于靶细胞和被治疗的病状。可容易完成适当启动子的选择。合适的启动子的一个例子是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。可用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于劳氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等人,Hum Gene Ther 4:151(1993))、SV40早期启动子区域、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调控序列、原核细胞表达载体如β-内酰胺酶启动子、tac启动子、来自酵母或其他真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及动物转录控制区域，其展现组织特异性并且已经用于转基因动物中；弹性蛋白酶I基因控制区域，其在胰腺腺泡细胞中有活性；胰岛素基因控制区域，其在胰腺β-细胞中有活性；免疫球蛋白基因控制区域，其在淋巴样细胞中有活性；小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性；白蛋白基因控制区域，其在肝脏中有活性；甲胎蛋白基因控制区域，其在肝脏中有活性；α1-抗胰蛋白酶基因控制区域，其在肝脏中有活性；β-球蛋白基因控制区域，其在骨髓细胞中有活性；髓磷脂碱性蛋白基因控制区域，其在脑中的少突胶质细胞中有活性；肌球蛋白轻链-2基因控制区域，其在骨骼肌中有活性；及促性腺释放激素基因控制区域，其在下丘脑中有活性。某些蛋白质可使用其天然启动子表达。也可包括可增加表达的其他元件，如增强子或系统，其产生高水平的表达，如tat基因和tar元件。此盒能因此插入载体中，例如质粒载体，如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体，其包括例如大肠杆菌复制起点。参见Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory press,(1989)。质粒载体还可包括可选择的标记，如针对氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，前提条件是该标记多肽不会不利地影响所治疗的生物体的代谢。所述盒还可结合至合成递送系统如WO 95/22618中所公开的系统中的核酸结合部分。

需要时，本发明的多核苷酸也可与微递送媒介物如阳离子脂质体和腺病毒载体一起使用。关于脂质体制备、内容物的靶向和递送过程的综述，参见Mannino和Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)。也参见Feigner和Holm,BethesdaRes.Lab.Focus,11(2):21(1989)及Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)。

复制缺陷型重组腺病毒载体可根据已知技术产生。参见Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等人,J.Clin.Invest.,90:626-630(1992)；及Rosenfeld等人,Cell,68:143-155(1992)。

另一种递送方法是使用产生载体的单链DNA，其可在细胞内产生表达的产物。参见，例如Chen等人,BioTechniques,34:167-171(2003)，其以引用的方式整体并入本文。

药物组合物

如上所述，本发明的组合物可以本领域技术人员已知的多种方式来制备。不管其原始来源或其获得的方式，本发明组合物可根据其用途配制。例如，如上所述的核酸和载体可在组合物内配制以便应用于组织培养中的细胞或施用于患者或受试者。本发明的任何药物组合物可被配制用于药剂的制备，并且在以下治疗的上下文中显示具体用途，例如患有HIV感染或面临HIV感染风险中的受试者的治疗。当用作药物时，任何核酸和载体可以药物组合物的形式施用。这些组合物可以药物领域技术人员熟知的方式制备，并且可通过多种途径施用，取决于是否需要局部或全身治疗和有待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼睛且至粘膜，包括鼻内、阴道及直肠递送)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮及经皮)、眼部、口服或肠胃外。用于眼部递送的方法可包括局部施用(滴眼剂)、结膜下、眼周或玻璃体内注射或通过气囊导管或外科地置于结膜囊中的眼科插入物引入。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或心室内施用。胃肠外施用可呈单次推注剂量，或者可以用连续的输液泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等等。常规的药物载体、水性、粉状或油性基质、增稠剂诸如此类可能是必需的或合乎需要的。

本发明还包括药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的核酸和载体作为活性成分，与一种或多种药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指在适当地向动物或人施用时不产生不利的、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等等，其可用作药学上可接受的物质的介质。在制造本发明组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或者包装入例如胶囊、片剂、小药囊、纸或其他容器形式的这种载体内。当赋形剂充当稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体材料(例如生理盐水)，其用作活性成分的媒介物、载体或介质。因此，所述组合物可呈以下形式：片剂、丸剂、粉剂、糖锭、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、霜剂、膏剂、凝胶、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液、以及无菌包装粉剂。如本领域中已知，稀释剂的类型可根据施用的预定途径而变化。所得的组合物可包含另外的试剂，如防腐剂。在一些实施方案中，载体可以是或可包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施方案中，载体材料可以是胶体，其被配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束。如所述，载体材料可形成胶囊，并且所述材料可以是基于聚合物的胶体。

本发明的核酸序列可递送给受试者的适当细胞。这可通过例如使用聚合、生物可降解的微粒或微胶囊递送媒介物实现，它们被调整尺寸以便使吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用最优化。例如，可使用直径为大约1-10μm的PLGA(聚-乳-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸在这些微粒中胶囊化，其被巨噬细胞摄入并且在细胞内逐渐生物降解，从而释放多核苷酸。一旦释放，DNA便在细胞内表达。第二种类型的微粒不想要被细胞直接摄入，而是主要充当核酸的缓释储蓄库，其一旦经由生物降解从微粒释放，便仅被细胞摄入。这些聚合颗粒因此大到足以排除吞噬作用(即，大于5μm且优选地大于20μm)。实现核酸摄取的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可单独并入到这些递送媒介物中或与组织特异性抗体合并，例如，靶向作为HIV感染的通常潜伏感染的储蓄库的细胞类型的抗体，例如脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞及肠相关淋巴样细胞。或者，可制备由质粒或通过静电或共价力连接至聚-L-赖氨酸上的其他载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合至可结合至靶细胞上的受体的配体。向肌内、皮内或皮下部位递送“裸DNA”(即，没有递送媒介物)是实现体内表达的另一种手段。在相关多核苷酸(例如表达载体)中，编码分离的核酸序列的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合可操作地连接，所述分离的核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列和指导RNA。启动子和增强子如上所述。

在一些实施方案中，本发明组合物可被配制成纳米颗粒，例如包含高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)的核心的纳米颗粒，该核心与DNA复合并且由聚乙二醇修饰的(聚乙二醇化)低分子量LPEI的外壳包围。

所述核酸和载体也可施用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴剂或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可单独或在混合物中在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)存在下施用。基于施用模式和途径选择赋形剂或载体。合适的药物载体以及在药物制剂中使用的药物必需品描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)，即在此领域中众所周知的参考文本；及USP/NF(United StatesPharmacopeia and the National Formulary)中。

在一些实施方案中，所述组合物可被配制成用于阻断HIV的性传播的局部凝胶。在性活动之前，所述局部凝胶可直接施用于男性或女性生殖区的皮肤或粘膜。或者或另外，所述局部凝胶可施用于男性或女性避孕套或隔膜的表面上或包含在避孕套或隔膜内。

在一些实施方案中，所述组合物可配制成纳米颗粒，该纳米颗粒胶囊化编码Cas9的核酸或变体Cas9和与靶HIV互补的指导RNA序列或包含编码Cas9的核酸和与靶HIV互补的指导RNA序列的载体。或者，所述组合物可配制成纳米颗粒，该纳米颗粒胶囊化CRISPR相关核酸内切酶多肽，例如Cas9或变体Cas9和与靶标互补的指导RNA序列。

本发明制剂可包括编码Cas9的载体和与靶HIV互补的指导RNA序列。指导RNA序列可包括与单一区域(例如LTR A、B、C、或D)互补的序列，或其可包括与LTR A、B、C及D互补的序列的任何组合。或者，编码Cas9的序列和编码指导RNA序列的序列可以在单独的载体上。

治疗方法

本文所公开的组合物一般并以不同方式适用于治疗患有逆转录病毒感染，例如HIV感染的受试者。可互换地提到受试者、患者或个体。所述方法适用于靶向任何HIV，例如HIV-1、HIV-2及其任何循环重组形式。每当临床上有利的结果跟着出现时，受试者便受到有效治疗。这可能意味着例如疾病症状的完全消退、疾病症状严重性的降低、或疾病进展的减慢。这些方法可进一步包括以下步骤：a)鉴别患有HIV感染的受试者(例如，患者且更具体地人患者)；及b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的核酸和与HIV靶序列(例如HIV LTR)互补的指导RNA的组合物。可使用标准临床试验鉴别受试者，例如使用免疫测定检测HIV抗体或HIV多肽p24在受试者血清中的存在，或经由HIV核酸扩增测定。向受试者提供的产生感染症状的完全消退、感染症状严重性的降低或感染进展的减慢的此类组合物的量被认为是治疗有效量。本发明方法还可包括监测步骤以帮助优化剂量和用药时间安排以及预示结果。在本发明的一些方法中，可首先确定患者是否具有潜伏的HIV-1感染，然后作出关于是否用本文所述的一种或多种组合物治疗患者的决定。监测还可用于检测耐药性的发生并且快速地将反应性患者与非反应性患者区分开。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括以下步骤：测定由患者载有的具体HIV的核酸序列，然后设计与那些具体序列互补的指导RNA。例如，可测定受试者的LTR U3、R或U5区域的核酸序列，然后设计与患者的序列精确互补的一个或多个指导RNA。

所述组合物还适用于治疗(例如预防性治疗)处于患上逆转录病毒感染(例如HIV感染)风险中的受试者。这些方法可进一步包括以下步骤：a)鉴别处于患上HIV感染风险中的受试者；b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的核酸和与HIV靶序列(例如HIV LTR)互补的指导RNA的组合物。处于患上HIV感染风险中的受试者可以是例如参与无保护的性行为，即参与没有使用避孕套的性活动的任何性行为活跃个体；具有另一种性传播感染的性行为活跃个体；静脉内药物使用者；或未受割礼的男性。处于患上HIV感染风险中的受试者可以是例如以下个体，其职业可使得他或她与HIV感染群体接触，例如医疗保健工作者或第一急救者。处于患上HIV感染风险中的受试者可以是例如在监禁场所中的收容者或性工作者，也就是为了有收入的职业或非货币物品如食物、药物或避难所而从事性活动的个体。

还可向患有HIV感染的妊娠或哺乳期女性施用组合物以降低HIV从母体向她的后代传播的可能性。感染了HIV的孕妇可在子宫内经胎盘、在分娩之时经由产道或分娩之后经由母乳将病毒传给她的后代。本文所公开的组合物可在产前、围产期或产后在母乳喂养期间向感染HIV的孕产妇施用，或者产前、围产期和产后施用的任何组合。可向该母亲施用组合物以及如下所述的标准抗逆转录病毒疗法。在一些实施方案中，本发明的组合物还在分娩之后立即向婴儿施用，并且在一些实施方案中，此后以一定的时间间隔。该婴儿也可接受标准抗逆转录病毒疗法。

本文所公开的方法和组合物适用于逆转录病毒感染的治疗。示例性逆转录病毒包括人免疫缺陷病毒，例如HIV-1、HIV-2；猿免疫缺陷病毒(SIV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；以及山羊关节炎/脑炎病毒(CAEV)。本文所公开的方法可施用于大范围的物种，例如，人、非人灵长类动物(例如猴子)、马或其它家畜、狗、猫、白鼬或作为宠物饲养的其它哺乳动物、大鼠、小鼠或其它实验室动物。

本发明的方法可根据药剂的制备来表现。因此，本发明包括本文所述的试剂和组合物在药剂制备中的用途。本文所述的化合物适用于治疗性组合物和方案中或适用于制造供治疗如本文所述的疾病或病状用的药剂。

本文所述的任何组合物可施用于宿主身体的任何部分，以便后续递送给靶细胞。组合物可递送给但不限于哺乳动物的脑、脑脊髓液、关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。根据分娩途径，组合物可通过静脉内、颅内、腹膜内、肌内、皮下、肌肉内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内、或经皮注射；通过口服或鼻施用；或通过随时间逐渐输注来施用。在另一个例子中，组合物的气溶胶制剂可通过吸入给予宿主。

所需剂量将取决于施用途径、制剂的性质、患者疾病的性质、患者的身高、体重、体表面积、年龄和性别、所施用的其他药物、以及主治医师的判断。鉴于细胞靶标的多样性以及各种施用途径的不同效率，应当预期所需要的剂量有广泛的变化。正如本领域内所熟知的，这些剂量水平上的变化可采用标准经验程序调整优化。施用可以是单次或多次(例如2-或3-、4-、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-或更多倍)。化合物在合适的递送媒介物(例如，聚合微粒或可植入装置)中的胶囊化可提高递送效率。

本文所提供的任何组合物的治疗持续时间可以是从短至一天到长达宿主寿命(例如，许多年)的任何时间长度。例如，化合物可每周施用一次(例如，持续4周至数月或数年)；一月一次(例如，持续三个月至十二个月或持续数年)；或一年一次，持续5年、10年或更久。还应注意治疗频率是可变的。例如，本发明化合物可每天、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。

有效量的本文所提供的任何组合物可向需要治疗的个体施用。如本文所用的术语“有效的”是指在患者中诱发所需反应而不诱发显著毒性的作何数量。这一数量可通过评定施用已知量的特定组合物之后患者的反应来确定。另外，毒性(如果有的话)水平可通过评定施用已知量的特定组合物之前和之后患者的临床症状来确定。注意到，向患者施用的特定组合物的有效量可根据所需结果以及患者的反应和毒性水平来调整。显著的毒性可因每个具体患者而变化并且取决于多个因素，包括但不限于患者的疾病状态、年龄以及对副作用的耐受性。

本领域技术人员已知的任何方法都可用于确定是否诱导了特定的反应。可评定具体的疾病状态程度的临床方法可用于确定反应是否被诱发。用于评估反应的具体方法将取决于患者病症的性质、患者的年龄和性别、所施用的其他药物、以及主治医师的判断。

组合物还可与另一种治疗剂例如用于HAART中的抗逆转录病毒剂一起施用。示例性抗逆转录病毒剂包括逆转录酶抑制剂(例如核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、叠氮胸苷、恩曲他滨、拉米夫定和替诺夫韦；及非核苷逆转录酶抑制剂，如依法韦仑(efavarenz)、奈韦拉平、利匹韦林)；蛋白酶抑制剂，例如tipiravir、地瑞纳韦、茚地那韦；进入抑制剂，例如马拉维若；融合抑制剂，例如恩夫韦地；或整合酶抑制剂，例如raltegrivir、dolutegravir。示例性抗逆转录病毒剂还可包括多类组合试剂，例如，恩曲他滨、依法韦仑和替诺夫韦的组合；恩曲他滨、利匹韦林和替诺夫韦的组合；或艾特格韦(elvitegravir)、cobicistat、恩曲他滨和替诺夫韦的组合。

两种或更多种治疗剂的同时施用不要求这些试剂同时或通过相同的途径施用，只要在这些试剂发挥其治疗作用期间的时间段上存在重叠。可以预期同时或连续施用，也可以预期在不同的天或周的施用。治疗剂可在节奏性方案下施用，例如，连续低剂量的治疗剂。

此类组合物的剂量、毒性和治疗效能可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序测定，例如，用于测定LD₅₀(对50％群体致命的剂量)和ED₅₀(有效治疗50％群体的剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数并且其可表示为比率LD₅₀/ED₅₀。

从细胞培养测定和动物研究处获得的数据可用于配制供人使用的剂量范围。此类组合物的剂量优选地落在包括ED₅₀的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。剂量可在此范围内变化，这取决于采用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何组合物，治疗有效剂量可最初由细胞培养测定来估算。可在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，包括如细胞培养中所测定的IC₅₀(即，实现症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法测量。

如所描述，组合物的治疗有效量(即有效剂量)意指足以产生治疗上(例如临床上)合乎需要的结果的量。组合物可每天施用一次或多次至每周施用一次或多次；包括每隔一天一次。熟练的技术人员将理解，某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、及其他现存疾病。此外，用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。

本文所述的组合物适用于在如上所述的多种药物递送系统中使用。另外，为了延长所施用的化合物的体内血清半衰期，组合物可被胶囊化、引入脂质体的腔中、制备成胶体，或者可采用提供组合物的延长血清半衰期的其他传统技术。可获得用于制备脂质体的多种方法，如例如Szoka等人,美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述，其各自以引用的方式并入本文。此外，可在靶向药物递送系统中，例如在涂覆有组织特异性抗体的脂质体中施用药物。脂质体将会靶向于器官并被其选择性地吸收。

还提供灭活哺乳动物细胞中的逆转录病毒的方法，例如慢病毒属，如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒。所述人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。人免疫缺陷病毒可以是染色体整合的原病毒。哺乳动物细胞可以是由HIV感染的任何细胞类型，包括但不限于CD4+淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞如郎格罕氏细胞和滤泡型树突状细胞、造血干细胞、内皮细胞、脑小神经胶质细胞、以及胃肠上皮细胞。此类细胞类型包括通常在原发感染期间感染的那些细胞类型，例如CD4+淋巴细胞、巨噬细胞、或郎格罕氏细胞；以及构成潜伏的HIV储蓄库的那些细胞类型，即潜伏感染的细胞。

所述方法可包括将细胞暴露于包含编码基因编辑复合体的分离的核酸的组合物，所述基因编辑复合体包含CRISPR相关核酸内切酶及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与逆转录病毒中的靶核酸序列互补。接触步骤可在体内进行，即，组合物可直接施用于患有HIV感染的受试者。然而，所述方法不因此受限制，且接触步骤可离体进行。例如，细胞或多个细胞或组织外植体可从患有HIV感染的受试者中除去且置于培养中，然后与包含CRISPR相关核酸内切酶和指导RNA的组合物接触，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。如上所述，组合物可以是编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸和指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；包含所述核酸序列的表达载体；或药物组合物，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸和指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；或包含所述核酸序列的表达载体。在一些实施方案中，所述基因编辑复合体可包含CRISPR相关核酸内切酶多肽和一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。

不管组合物是作为核酸抑或多肽施用，其都以一定方式被配制以促进哺乳动物细胞的摄取。有用的载体系统和制剂如上所述。在一些实施方案中，载体可将组合物递送至特定的细胞类型。然而，本发明因此不受限制，并且还可以预期其他的DNA递送方法，如使用例如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂复合物、表面活性剂及全氟代化学液体的化学转染，同样可以预期物理递送方法，如电穿孔、微米注射、弹道颗粒及“基因枪”系统。

标准方法，例如用于检测CRISPR相关核酸内切酶的免疫测定，或用于检测gRNA的基于核酸的测定如PCR可用于证实复合体已经被将复合体引入其中的细胞摄入和表达。工程改造的细胞可随后被再引入到如下所述细胞所源自的受试者中。

基因编辑复合体包含CRISPR相关核酸酶，例如Cas9；和与逆转录病毒靶序列(例如HIV靶序列)互补的指导RNA。所述基因编辑复合体可将各种突变引入到前病毒DNA中。此类突变灭活病毒的机制可变化，例如，突变可影响前病毒复制、病毒基因表达或前病毒切除。突变可位于调控序列或结构基因序列中并且导致HIV的缺陷产生。突变可包括缺失。缺失的大小可从单核苷酸碱基对变化至约10,000个碱基对。在一些实施方案中，缺失可包括所有或基本上所有前病毒序列。在一些实施方案中，缺失可包括整个前病毒序列。突变可包括插入，也就是添加一个或多个核苷酸碱基对到前病毒序列中。插入序列的大小也可变化，例如从约一个碱基对至约300个核苷酸碱基对。突变可包括点突变，也就是用另一个核苷酸置换一个核苷酸。有用的点突变是具有功能结果的那些，例如，造成氨基酸密码子转换成终止密码子或造成非功能蛋白的产生的突变。

在其他实施方案中，所述组合物包含已用一个或多个Cas/gRNA载体转化或转染的细胞。在一些实施方案中，本发明方法可离体应用。也就是说，受试者的细胞可从体内除去并用培养中的组合物处理以切除HIV序列并使处理的细胞返回到受试者体内。细胞可以是受试者的细胞或者其可以是单倍型匹配或细胞系。细胞可被照射以防止复制。在一些实施方案中，细胞是人白细胞抗原(HLA)匹配、自体、细胞系或其组合。在其他实施方案中，细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导的多能干细胞(iPS细胞))。胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导的多能干细胞，iPS细胞)已从许多动物物种包括人建立。这些类型的多能干细胞将是用于再生医学的最有用的细胞来源，因为这些细胞能够通过对其分化的适当诱导分化成几乎所有的器官，其中保留活性分裂的能力，同时维持其多能性。具体说来，iPS细胞可从自我衍生的体细胞建立，且因此与通过破坏胚胎产生的ES细胞相比不可能带来伦理和社会问题。此外，作为自我衍生细胞的iPS细胞使得可能避免排斥反应，这是再生医学或移植疗法的最大障碍。

gRNA表达盒可通过本领域中已知的方法，例如递送siRNA的方法容易地递送给受试者。在一些方面中，Cas可以是其中包括Cas分子的活性结构域从而缩小分子的尺寸的片段。因此，Cas9/gRNA分子可在临床上使用，类似于由当前基因疗法所获得的手段。具体说来，用于细胞移植疗法以及HIV-1疫苗接种的Cas9/多重gRNA稳定表达干细胞或iPS细胞将发展以供受试者之用。

根据已建立的方法制备再输注所用的经转导细胞。在约2-4周的一段培养期之后，细胞数量可在1×10⁶与1×10¹⁰之间。就此而言，细胞的生长特点在患者与患者之间并且在细胞类型与细胞类型之间有差异。在转导细胞再输注之前约72小时，采集等分试样用于表达治疗剂的细胞的表型和百分比的分析。当应用于患者总的和整体的健康状况时，为了施用，本发明的细胞可以一定的速率来施用，该速率是由细胞类型的LD₅₀、和在各种浓度下细胞类型的副作用所决定。施用可经由单次或分次剂量完成。还可以使用刺激组织或间隙内生成并排出成人干细胞的外源施用因子来动员成人干细胞，所述组合或间隙可包括但不限于骨髓或脂肪组织。

制造物品

本文所述的组合物在合适的容器中包装，所述容器经标记以例如用作治疗患有逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者或面临逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者的疗法。所述容器可包含组合物，该组合物包含编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补核糖核酸指导RNA；或编码那个核酸的载体；以及合适的稳定剂、载体分子、调味剂和/或其类似物中的一种或多种，根据预期用途适当使用。因此，包括至少一种本发明组合物，例如编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA、或编码那个核酸的载体以及使用说明书的包装产品(例如，含有一种或多种本文所述并经包装供在浓缩或即用浓度下储存、运输或销售之用的组合物的无菌容器)和试剂盒也在本发明的范围内。产品可包括容器(例如小瓶、罐、瓶、袋等等)，所述容器含有一种或多种本发明组合物。另外，制造物品可进一步包括例如包装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲剂或用于治疗或监测需要预防或治疗的病状的其他对照试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种另外的抗逆转录病毒剂，例如，逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或进入抑制剂。另外的试剂可一起包装在与编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA或编码那个核酸的载体同一个容器中，或者这些试剂可单独包装。编码CRISPR相关核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA或编码那个核酸的载体与所述另外的试剂可在临使用之前合并或单独施用。

产品还可包括说明书(例如，印刷标签或内插页或描述产品使用的其他媒介(例如录音或录像带))。所述说明书可与容器相连(例如粘贴于容器上)并且可描述其中的组合物应当施用的方式(例如，施用频率和途径)、其适应症及其他用途。组合物可以即时施用(例如，以剂量适当单位形式存在)，并且可包含一种或多种另外的药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂和/或另一种治疗剂。或者，组合物可以浓缩形式提供，其中有用于稀释的稀释剂和说明。

实施例

实施例1：材料和方法

质粒制剂：含有人Cas9和gRNA表达盒、pX260及pX330(Addgene)的载体被用于生成不同的构建体，LTR-A、B、C、及D。

细胞培养和稳定的细胞系：TZM-b1报道基因和U1细胞系是从NIH AIDS ReagentProgram和CHME5小神经胶质细胞处获得的，这在本领域中是已知的。

免疫组织化学和蛋白质印迹：使用标准方法来对细胞进行免疫细胞化学观察并且通过蛋白质印迹评价蛋白质表达。

萤火虫-荧光素酶测定：将细胞在治疗后24h使用被动溶解缓冲液(Promega)来溶解并且根据制造商方案，用荧光素酶报道基因测定试剂盒(Promega)来分析。就通过平行MTT测定(Vybrant,Invitrogen)所测定的细胞数目对荧光素酶活性进行归一化。

p24ELISA：在感染或再活化之后，HIV-1病毒负荷在上清液中的水平通过p24GagELISA(Advanced Bioscience Laboratories,Inc)根据制造商方案来量化。为了评定处理之后的细胞活力，同时根据制造商手册(Vybrant,Invitrogen)进行MTT测定。

EGFP流式细胞术：将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤并且在室温下固定于2％多聚甲醛中10min，然后用PBS洗涤两次并且使用Guava EasyCyte Mini流式细胞仪(GuavaTechnologies)分析。

HIV-1报道病毒制备和感染：将HEK293T细胞使用脂转染胺2000试剂(Invitrogen)，用pNL4-3-ΔE-EGFP(NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram)转染。在48h之后，收集上清液，0.45μm过滤并且使用EGFP作为感染标记在HeLa细胞中滴定。对于病毒感染，将稳定的Cas9/gRNA TZM-bI细胞用稀释的病毒原液培养2h，然后用PBS洗涤两次。在感染后2d和4d，将细胞收集，固定并且通过流式细胞术分析EGFP表达，或者为PCR和全基因组测序进行基因组DNA纯化。

基因组DNA扩增、PCR、TA-克隆、及Sanger测序、基因组步查连接PCR：使用DNA操纵的标准方法用于克隆和测序。对于HIV-1的整合位点的鉴别，利用Lenti-X^TM整合位点分析试剂盒。

Surveyor测定：使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic)，根据制造商方案检查突变在PCR产物中的存在。简言之，将异质PCR产物在95℃下变性10min并且使用热循环仪通过逐渐冷却杂交。紧接着，在42℃下将300ng杂交DNA(9μl)在0.25μl SURVEYOR增强子S和15mM MgCl₂存在下用0.25μl SURVEYOR核酸酶消化4h。然后添加终止溶液并且将样品在2％琼脂糖凝胶中连同等量的未消化PCR产物对照一起分解(resolved)。

一些PCR产物被用于限制片段长度多态性分析。将等量的PCR产物用BsaJI消化。将消化的DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2％)上分离。对于测序，使用具有pCR^TM II载体的TA试剂盒双重启动子(Invitrogen)克隆PCR产物。通过用EcoRI消化来证实插入并且将阳性克隆送至Genewiz用于Sanger测序。

LTR靶位点的选择、全基因组测序及生物信息学和统计分析。利用Jack Lin的CRISPR/Cas9gRNA搜寻工具用于初始鉴别LTR内的潜在靶位点。

质粒制剂。将表达前crRNA的LTR-A或LTR-B的DNA区段克隆到含有嘌呤霉素选择基因的pX260载体(Addgene，质粒#42229)中。将表达嵌合crRNA-tracrRNA的LTR-C或LTR-D的DNA区段克隆到pX330载体(Addgene，质粒#42230)中。两个载体都含有由CAG启动子驱动的人源化Cas9编码序列和由人U6启动子驱动的gRNA表达盒。将载体用BbsI消化并用南极磷酸酶(Antarctic Phosphatase)处理，并且用Quick核苷酸除去试剂盒(Qiagen)纯化线性化载体。将每个靶位点的一对寡核苷酸(图14，AlphaDNA)退火，磷酸化，并连接至线性化载体。将gRNA表达盒在GENEWIZ中用U6测序引物(图14)测序。对于pX330载体，设计一对具有悬垂消化位点的通用PCR引物(图14)，其可挑出gRNA表达盒(U6-gRNA-crRNA-stem-tracrRNA)用于直接转染或亚克隆至其他载体。

细胞培养。来自Dr John C.Kappes、Dr Xiaoyun Wu和Tranzyme Inc的TZM-bI报道基因细胞系，来自Dr.Thomas Folks的U1/Hiv-1细胞系以及来自Dr.Eric Verdin的J-Lat全长克隆是通过NIH AIDS Reagent Program,Division of AIDS,NIAID,NIH获得。如先前所述生成CHME5/HIV胎儿小神经胶质细胞系。将TZM-bI和CHME5细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖Dulbecco最低必需培养基中培养。将U1和J-Lat细胞在含有2.0mM L-谷氨酰胺、10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。

稳定的细胞系和亚克隆。将TZM-b1或CHME5/HIV细胞以1.5×10⁵个细胞/孔接种于6孔平板中并且使用脂转染胺2000试剂(Invitrogen)，用1μg pX260(对于LTR-A和B)或1μg/0.1μg pX330/pX260(对于LTR-C和D)质粒转染。次日，将细胞转移到100-mm盘子中并且用含有1μg/ml嘌呤霉素的生长培养基(Sigma)培养。两周以后，使用克隆量筒(Corning)分离存活的细胞集落。使用10μl端头、3×10ms 1400V脉冲在Neon^TM转染系统(Invitrogen)将U1细胞(1.5×10⁵)用1μg DNA电穿孔。用0.5μg/ml嘌呤霉素选择细胞两周。使用限制稀释法在96孔平板中传代培养稳定的克隆并且保留单细胞衍生的亚克隆用于进一步研究。

免疫细胞化学和蛋白质印迹。将Cas9/gRNA稳定表达TZM-bI细胞在8孔载玻片室中培养2天并且在4％多聚甲醛/PBS中固定10min。三次冲洗之后，将细胞用0.5％Triton X-100/PBS处理20min并且在10％驴血清中阻断1h。在4℃下将细胞用小鼠抗Flag M2一级抗体(1:500，Sigma)培养过夜。冲洗三次以后，将细胞用驴抗小鼠Alexa-Fluor-594二级抗体培养1h，并且用Hoechst 33258培养5min。用PBS冲洗三次之后，将细胞用抗衰减水性封固剂(Biomeda)盖片并且在Leica DMI6000B荧光显微镜下分析。

将在6孔平板中培养的TZM-bI细胞溶解于200μl基于Triton X-100的溶解缓冲液中，该溶解缓冲液含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1％Triton X-100、5mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟、1x核提取蛋白酶抑制剂混合物(CaymanChemical,Ann Arbor,MI)、1mM原钒酸钠以及30mM NaF。在4℃下旋转细胞溶解产物30min。在4℃下将核及细胞碎屑通过在20,000g下离心20min而清除。等量的溶解蛋白(20μg)通过在十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中沸腾5min而变性，通过在tris-甘氨酸缓冲液中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分级，并且转移到硝化纤维膜(BioRad)上。SeeBlue预着色标准(Invitrogen)被用作分子量参照。将印迹在5％BSA/tris-缓冲盐水(pH 7.6)加0.1％Tween-20(TBS-T)中阻断1h，然后在4℃下用小鼠抗Flag M2单克隆抗体(1:1000，Sigma)或小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1:3000，Santa Cruz Biotechnology)培养过夜。用TBS-T洗涤之后，在室温下将印迹用IRDye 680LT-缀合的抗小鼠抗体培养1h。使用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)扫描并分析膜。

萤火虫-荧光素酶测定。将细胞在治疗后24h使用被动溶解缓冲液(Promega)来溶解并且根据制造商方案，用荧光素酶报道基因测定试剂盒(Promega)来分析。就通过平行MTT测定(Vybrant,Invitrogen)所测定的细胞数目对荧光素酶活性进行归一化。

p24ELISA：在感染或再活化之后，HIV-1病毒负荷在上清液中的水平通过p24GagELISA(Advanced Bioscience Laboratories,Inc)根据制造商方案来量化。为了评定处理之后的细胞活力，同时根据制造商方案(Vybrant,Invitrogen)进行MTT测定。

EGFP流式细胞术。将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤并且在室温下固定于2％多聚甲醛中10min，然后用PBS洗涤两次并且使用Guava EasyCyte Mini流式细胞仪(GuavaTechnologies)分析。

Hiv-1报道病毒制备和感染：将HEK293T细胞使用脂转染胺2000试剂(Invitrogen)，用pNL4-3-ΔE-EGFP、SF162和JRFL(NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program)转染。对于假型化的pNL4-3-ΔE-EGFP，共转染VSVG载体。48h之后，收集上清液，0.45μm过滤并且使用EGFP作为感染标记在Hela细胞中滴定。对于病毒感染，将稳定的Cas9/gRNA TZM-bI细胞用稀释的病毒原液培养2h，并用PBS洗涤两次。在感染后2天和4天，将细胞收集，固定并且通过流式细胞术分析EGFP表达，或者为PCR和全基因组测序进行基因组DNA纯化。

基因组DNA纯化、PCR、TA-克隆及Sanger测序。使用ArchivePure DNA细胞/组织纯化试剂盒(5PRIME)根据制造商推荐的方案将基因组DNA与细胞分离。使用图14中所列的引物，使用高保真FailSafe PCR试剂盒(Epicentre)使100ng萃取的DNA经受PCR。进行三步标准PCR，30个循环，55℃退火且72℃延伸。将产物在2％琼脂糖凝胶中分解。将感兴趣的带凝胶纯化并克隆到pCRII T-A载体(Invitrogen)中，并且通过使用通用的T7和/或SP6引物在Genewiz处测序来测定单个克隆的核苷酸序列。

常规和实时逆转录(RT)-PCR。对于总RNA提取，将细胞用RNeasy缩型试剂盒(Qiagen)按照制造商说明书来加工。潜在残余的基因组DNA通过用不含RNase的DNase套件(Qiagen)进行柱上DNase消化来除去。使用随机的六核苷酸引物，用高容量cDNA逆转录试剂盒(Invitrogen,Grand Island,NY)将每个样品的1μg RNA逆转录成cDNA。使用标准方案进行常规PCR。使用Green PCR主混合物试剂盒(Applied Biosystems)在LightCycler480(Roche)中进行定量PCR(qPCR)分析。将RT反应物稀释至每微升反应5ng总RNA并且将2μl用于20-μl PCR反应。对于HIV-1前病毒的qPCR分析，使用50ng基因组DNA。引物在AlphaDNA中合成并示于图14中。人持家基因GAPDH和RPL13A的引物是从RealTimePrimers(Elkins Park,PA)处获得。每个样品一式三份测试。用图表形式获得靶基因和持家基因的循环阈值(Ct)数值。持家基因与靶基因之间的Ct数值差异表示为ΔCt数值。ΔΔCt数值是通过用实验样品的数值减去对照样品的ΔCt数值而获得。相对倍数或变化百分比计算为2-ΔΔCt。在一些情况下，使用掺入人基因组DNA中的pNL4-3-ΔE-EGFP质粒作为标准进行绝对量化。HIV-1病毒拷贝的数量是基于用持家基因归一化之后的标准曲线来计算。

基因组步查连接PCR和长距离PCR。使用Lenti-X^TM整合位点分析试剂盒(Clontech)，根据制造商说明书鉴别HIV-1在宿主细胞中的整合位点。简言之，使用NucleoSpin Tissue试剂盒(Clontech)从U1细胞中提取高质量的基因组DNA。为了构建病毒整合文库，在37℃下将每个基因组DNA样品用生成钝端的消化酶Dra I、Ssp I或Hpal单独地消化过夜。通过在0.6％琼脂糖上电泳验证消化效率。消化的DNA是使用NucleoSpin凝胶和PCR清除试剂盒来纯化，接着在16℃下将消化的基因组DNA片段连接至Genome Walker^TM衔接子过夜。通过在70℃下培养5min终止连接反应并且用TE缓冲液稀释5次。使用Advantage 2聚合酶混合物在具有衔接子引物1(AP1)和LTR特异性引物1(LSP1)的DNA区段上进行首次PCR，接着使用AP2和LSP2引物进行二次(巢式)PCR(图14)。将二次PCR产物在含有1.5％溴化乙锭的琼脂糖凝胶上分离。将主要的带凝胶纯化并克隆到pCRII T-A载体(Invitrogen)中，并且通过使用通用的T7和SP6引物在Genewiz处测序来测定单个克隆的核苷酸序列。通过NCBI BLAST搜索分析序列读数。在染色体X和2中鉴别HIV-1在U1细胞中的两个整合位点。在AlphaDNA中合成覆盖每个整合位点的一对引物(图14)。用Phusion高保真PCR试剂盒(NewEngland Biolabs)，按照制造商方案使用U1基因组DNA进行长距离PCR。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上目测观察并且通过Sanger测序验证。

Surveyor测定。使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic)，根据制造商方案测试突变在PCR产物中的存在。简言之，将异质PCR产物在95℃下变性10min并且使用热循环仪通过逐渐冷却杂交。紧接着，在42℃下将300ng杂交DNA(9μl)在0.25μl SURVEYOR增强子S和15mM MgCl₂存在下用0.25μl SURVEYOR核酸酶消化4h。然后添加终止溶液并且将样品在2％琼脂糖凝胶中连同等量的未消化PCR产物一起分解。

一些PCR产物被用于限制片段长度多态性分析。将等量的PCR产物用BsaJI消化。将消化的DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2％)上分离。对于测序，使用具有pCR^TMII载体的TA试剂盒双重启动子(Invitrogen)克隆PCR产物。通过用EcoRI消化来证实插入并且将阳性克隆送至Genewiz用于Sanger测序。

LTR靶位点的选择和潜在的靶标外位点的预测。对于初始研究，由于传代期间LTR的潜在突变，通过TA克隆测序来自人TZM-bI细胞的基因组的PCR产物获得整合慢病毒LTR-荧光素酶报道基因的LTR启动子序列(-411至-10)。此启动子序列与pHR’-CMV-LacZ慢病毒载体(AF105229)的5’-LTR 100％匹配。因此，使用Jack Lin的CRISPR/Cas9gRNA搜寻工具(http://spot.colorado.edu/～slin/cas9.html)，利用全长pHR’5’-LTR(634bp)的有义和反义序列搜索含有20bp gRNA靶序列加PAM序列(NRG)的Cas9/gRNA靶位点。使用NCBI/blastn套件(其中E值截止为1,000且字长为7)，通过针对所有可利用的人基因组和转录序列blast分析每个gRNA靶序列加NRG(AGG、TGG、GGG及CGG；AAG、TAG、GAG、CAG)来预测具有精确匹配的潜在靶标外的数量。在按下Control+F之后，复制/粘贴靶序列(1-23至9-23核苷酸)并且找出与靶序列具有100％匹配的基因组靶标的数量。因为重复的基因组文库，将每次搜索的靶标外数量除以3。

全基因组测序和生物信息学分析。就靶标切割效率和LTR-荧光素酶报道基因的功能抑制对TZM-bI细胞的对照亚克隆C1和实验亚克隆AB7进行验证。用NucleoSpin Tissue试剂盒(Clontech)分离基因组DNA。将DNA样品提交至Temple University Fox Chase CancerCenter的NextGen测序设备。使用Illumina的NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒(NewEngland Biolab)，按照制造商说明书从每个亚克隆制备双份基因组DNA文库。在HiSeq2500仪器(Illumina)上在两个Illumina快速运行流动池中用末端配对的141-bp读取对所有文库进行测序。将来自测序文库的信号分离的读取数据送至AccuraScience,LLC(http://www.accurascience.com)用于专业的生物信息学分析。简言之，通过使用Bowtie2将原始读数针对人基因组(hg19)和HIV-1基因组作图。基因组分析工具包(GATK，2.8.1版)被用于重复读取的除去，局部比对，碱基质量再校准及indel调入。置信度得分10和30是低质量(LowQual)和高置信度调入(PASS)的阈值。通过如上所述的NCBI/blastn套件并通过CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)预测具有各种错配的LTR-A和LTR-B的潜在的靶标外位点。所有潜在的gRNA靶位点(图15)被用于为通过GATK鉴别的每个indel周围的±300bp区域作图。将重叠区在人基因组和HIV-1基因组中的位置在对照C1与实验AB7之间比较。

统计分析。定量数据代表来自3-5个独立实验的平均值±标准偏差，并且通过学生t检验或ANOVA及Newman-Keuls多重比较检验来评估。<0.05或0.01的p值被认为是统计上显著的差异。

实施例2：Cas9/LTR-gRNA抑制潜伏感染了HIV-1的CHME5小神经胶质细胞中HIV-1报道病毒的产生

评定HIV-1导向的指导RNA(gRNA)取消LTR转录活性并且从潜伏感染的骨髓细胞人口指标基因组根除前病毒DNA的能力，骨髓细胞充当脑中的HIV-1储蓄库，也是特别难处理的靶群体。我们的策略集中于靶向HIV-1LTR启动子U3区域。通过生物信息学筛选和效率/靶标外预测，鉴别了四个gRNA靶标(原型间隔区；LTR A-D)，其避免保守转录因子结合位点、使改变宿主基因表达的可能性减到最低(图5和13)。将与gRNA A-D互补的DNA片段插入到人源化Cas9表达载体(在pX260中A/B；在pX330中C/D)中并且测试其单独和合作改变整合的HIV-1基因组活性的能力。首先利用小神经胶质细胞系CHME5，其载有包含5'和3'LTR的单轮HIV-1载体的整合拷贝以及编码替代Gag的绿色荧光增强蛋白(EGFP)报道分子(pNL4-3-ΔGag-d2EGFP)的基因。用曲古抑菌素A(TSA，一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂)处理CHME5细胞恢复从大多数整合原病毒的转录并且造成EGFP及其余HIV-1蛋白质组的表达。gRNA加Cas9的表达显著地减小TSA诱导的EGFP阳性CHME5细胞的比率(图1A和6)。使用基于Cel I核酸酶的异源双链核酸分子特异性SURVEYOR测定检测LTR A-D(图1B和6B)的插入/缺失基因突变(indel)。类似地，在源自HeLa的TZM-bI细胞(其含有驱动萤火虫-荧光素酶报道基因的稳定并入的HIV-1LTR拷贝)中表达靶向LTR C和D的gRNA抑制了病毒启动子活性(图7A)，并且引出LTR U3区域内的indel(图7B-D)，通过SURVEYOR和Sanger测序所证明。此外，靶向LTR C/D的gRNA在这些细胞中的组合表达致使切除预测的302-bp病毒DNA序列并且出现残余的194-bp片段(图7E-F)。

LTR-A/B gRNA在混合无性系CHME5细胞中的多重表达致使在A与B靶位点之间190-bp片段的缺失并且以不同的程度产生indel(图1C-D)。在>20个嘌呤霉素选择的稳定亚克隆中，发现细胞群体具有TSA诱导的HIV-1前病毒再活化的完全阻断，通过对EGFP的流式细胞术所确定(图1E)。在前病毒基因组中对于EGFP和HIV-1Rev反应元件(RRE)的基于PCR的分析验证了HIV-1基因组的根除(图1F，G)。此外，PCR产物的测序显示缺失了跨越整个5'-3'LTR的病毒基因组，经由在裂解位点A和B之间的190-bp切除产生351-bp片段，和在LTR-A和-B位点处分别有175-bp插入和27-bp缺失的682-bp片段(图8C)。残余HIV-1基因组(图1F-H)可反映痕量Cas9/gRNA阴性细胞的存在。这些结果表明靶向LTR的Cas9/gRNA A/B根除HIV-1基因组并且阻断其在潜伏感染的小神经胶质细胞中的再活化。

实施例3：Cas9/LTR-gRNA有效地根除来自U1单核细胞的的潜伏HIV-1病毒。

前单核细胞U-937细胞亚克隆U1(一种受感染的血管周围巨噬细胞和单核细胞的HIV-1潜伏期模型)受到慢性HIV-1感染并且展现低水平的组成型病毒基因表达和复制。GenomeWalker绘图检测U1细胞中染色体Xp11-4(图2A)和2p21(图9A)处的两个整合前病毒DNA拷贝。代表整个9709-bp前病毒HIV-1DNA加源自侧翼226-bp X染色体的序列的9935-bpDNA片段(图2A)、和含有9709-bp HIV-1基因组加其源自侧翼2-染色体的467-bp的10176-bp片段(图9A，B)是通过亲本对照或空载体(U6-CAG)U1细胞的长距离PCR分析来鉴别。226-bp和467-bp片段代表分别来自染色体X和2的另一份拷贝的预测区段，其缺少整合的前病毒DNA。在表达LTR-A/B gRNA和Cas9的U1细胞中，在染色体X中发现833和670bp的另外两个DNA片段且在染色体2中发现另一个1102-bp片段。因此，gRNA A/B能够使得Cas9切除两个染色体中跨越HIV-1 5'-3'LTR的病毒基因组区段。833-bp片段包含来自宿主基因组的预期的226-bp和在LTR-A位点周围具有27-bp缺失的607-bp病毒LTR序列(图2A-B)。670-bp片段包含226-bp宿主序列和在190-bp片段切除之后的残余444-bp病毒LTR序列(图1D)，归因于两个LTR处的gRNA-A/B指导裂解(图2A)。另外的片段不经由环形LTR整合出现，因为其不存在于亲本U1细胞中，并且此类环形LTR病毒基因组构型在HIV-1感染之后立刻出现，但是短暂的并且不能耐受重复传代。这些细胞展现基本上减少的HIV-1病毒负荷，通过功能p24ELISA复制测定(图2C)和实时PCR分析(图9C，D)所示。可检测但低的残余病毒负荷及再活化可由细胞群异质性和/或不完全的基因组编辑引起。还使用流式细胞术分析、SURVEYOR测定及PCR基因分型(图10)验证了在载有整合的HIV-R7/E-/EGFP的潜伏感染的J-Lat T细胞中通过Cas9/LTR-A/B gRNA除去HIV-1基因组，从而支持早先对Jurkat T细胞中通过Cas9/gRNA和ZFN的HIV-1前病毒缺失报道的结果。总之，结果表明多重LTR-gRNA/Cas9系统有效地抑制HIV-1在人潜伏的HIV-1感染所典型的HIV-1潜伏感染“储蓄库”(小神经胶质细胞、单核细胞及T)细胞中以及在对于检测HIV-1转录和再活化高度敏感的TZM-bI细胞中的复制和再活化。靶向5'-和3'-LTR的单个或多重gRNA有效地根除整个HIV-1基因组。

实施例4：Cas9加LTR-A/B的稳定表达针对新的HIV-1病毒感染接种TZM-bI细胞。

紧接着使用稳定的表达Cas9/gRNA-A和-B的基于TZM-bI的克隆，测试组合的Cas9/LTR gRNA是否可以针对HIV-1感染来使细胞免疫(图3A)。7个嘌呤霉素选择的亚克隆中有两个展现跨越190-bp LTR-A/B位点的DNA片段的有效切除(图3B)。然而，其余5个亚克隆没有展现切除(图3B)和indel突变，如通过Sanger测序所验证。使用靶向Cas9和U6-LTR的引物端口命令寄存器PCR基因分型显示这些无效的亚克隆中没有一个保留Cas9/LTR-A/B gRNA表达盒的整合拷贝(图11A，B)。因此，没有检测到全长Cas9的表达(图11C，D)。Cas9/LTR-A/BgRNA的长期表达不会不利地影响细胞生长或活力，提示在此模型中在宿主基因组或Cas9诱导的毒性下靶标外干扰的低出现率。通过用VSVG假型化的pNL4-3-ΔE-EGFP报道病毒感染细胞评定HIV-1从头复制，其中通过流式细胞术确定EGFP阳性来表明HIV-1复制。不同于对照U6-CAG细胞，稳定表达Cas9/gRNA LTR-A/B的细胞未能支持在感染后2d的HIV-1复制，表明其受到了有效针对新HIV-1感染的免疫(图3C-D)。在感染了天然的T-向性X4菌株pNL4-3-ΔE-EGFP报道病毒(图12A)或天然的M-向性R5菌株如SF162和JRFL(图12B-D)的表达Cas/LTR-A/B gRNA的细胞中观察到针对HIV-1的类似免疫。

实施例5：Cas9/LTR-A/B对人基因组的靶标外作用

Cas9/gRNA作为介入手段的吸引力依赖于其高度特异性的靶标上产indel裂解，但多重gRNA可潜在地引起宿主基因组诱变和染色体病、细胞毒性、遗传毒性或肿瘤发生。相当低的病毒-人基因组同源性降低此风险，但人基因组含有众多内源性逆转录病毒基因组，这些基因组潜在地易受HIV-1导向的gRNA的感染。因此，评定选择的HIV-1LTR gRNA对人基因组的靶标外作用。因为最靠近原型间隔区邻近基序(PAM)区域(NGG)的12-14-bp种子序列是裂解特异性的关健，所以搜寻>14-bp种子+NGG，并且没有发现LTR gRNA A-D的靶标外候选位点(图13)。逐步缩短的gRNA区段产生增加的与相应的靶标上序列100％匹配的靶标外裂解位点是不奇怪的(即，NGG+13bp分别产生6、0、2和9个靶标外位点，而NGG+12bp产生16、5、16和29个；图13)。使用高保真PCR从人基因组DNA获得覆盖一个预测的靶标外位点的500-800-bp序列，并且通过SURVEYOR和Sanger测序分析潜在的突变。没有发现突变(参见TZM-bI和U1细胞中的代表性靶标外位点#1、5和6；图4A)。

为了全面评定靶标外作用的风险，使用稳定表达Cas9/gRNA A/B的和对照U6-CAG的TZM-bI细胞(图4B-D)进行全基因组测序(WGS)。使用基因组分析工具包(GATK,v.2.8.1)鉴别了676,105个indel，其中人(hg19)和HIV-1基因组作为参照序列。在这些indel之中，24％出现在U6-CAG对照中，26％在LTR-A/B亚克隆中，且50％在两者中(图4B)。这种相当大的样品内indel调入差异提示很可能发生的靶标外作用，但多半是由其有限的置信度、有限的WGS覆盖率(15-30X)以及细胞异质性造成。GATK仅报道确信地鉴别的indel：一些见于U6-CAG对照中而不是LTR-A/B亚克隆中，且其他见于LTR-A/B中而不是U6-CAG中。预期两种样品由于有限的WGS覆盖率而有大量遗漏的indel调入。这种有限的indel调入置信度还暗示假阴性的可能性：遗漏的indel出现在LTR-A/B中而不是U6-CAG对照中。细胞异质性可反映Cas9/gRNA编辑效率的变化性以及传代的影响。因此，通过分析针对HIV-1基因组的靶向LTR-A/-B的位点和宿主基因组的预测的/潜在的gRNA靶标外位点侧接每个indel的±300bp测试是否每个indel都是诱导的。对于与含有种子(12-bp)加NRG的序列100％匹配的序列，仅鉴别针对676,105个indel的92个潜在靶标外位点中的8个重叠区：6个indel出现在两种样品中，且仅2个出现在U6-CAG对照中(图4C，D)。还在HIV-1LTR上鉴别2个indel，其仅出现在LTR-A/B亚克隆中，但如所预期不在U6-CAG对照中(图4C)。结果表明LTR-A/B gRNA诱导所示的靶标上indel，但不诱导靶标外indel，与早先使用覆盖预测的/潜在的靶标外位点的PCR产物的深度测序研究结果一致。

组合手段使靶标外作用减到最少，同时实现基因组整合的HIV-1前病毒的高效和完全除去。除外来病毒基因组与包含内源性逆转录病毒DNA的宿主细胞基因组之间的极低同源性之外，我们研究中的关键设计属性还包括：使用严格的12-bp+NGG靶标-选择标准的生物信息学筛选以排除靶标外人转录物组或(甚至很少地)非翻译-基因组位点；避免HIV-1LTR启动子内的转录因子结合位点(在宿主基因组中潜在保守的)；LTR-A-和-B-指导的、30-bp gRNA的选择以及反映原始细菌免疫机制的前crRNA系统以相比于基于20-bp gRNA-、嵌合crRNA-tracRNA的系统提高特异性/效率；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR测定，用于鉴别和排除潜在的靶标外作用。实际上，新近开发的Cas9双重切刻和RNA指导的FokI核酸酶的使用可以减少的靶标外作用进一步帮助鉴别HIV-1的不同保守区域内的新靶标。

结果表明HIV-1Cas9/gRNA系统具有靶向在不同染色体上定位的LTR的一个以上拷贝的能力，提示此基因组编辑系统可改变载有多个前病毒DNA的潜伏感染的患者细胞中HIV-1的DNA序列。为了进一步确保我们技术的高编辑效力和一致性，可以考虑HIV-1基因组的最稳定区域作为根除患者样品中的HIV-1的靶标，其可能不仅载有一个HIV-1菌株。或者，可在工程改造治疗性Cas9/gRNA分子之前基于来自源于患者的病毒基因组的深度测序的数据开发个性化治疗方式。

结果还显示Cas9/gRNA基因组编辑可用于针对HIV-1感染对细胞进行免疫。预防性疫苗接种不依赖于HIV-1菌株的多样性，因为系统靶向基因组序列而不考虑病毒如何进入感染的细胞。Cas9/gRNA系统在细胞中的先存在导致新的HIV-1在其整合到宿主基因组中之前的快速消除。可以探索用于递送Cas9/LTR-gRNA以便免疫高风险受试者的各种系统，例如基因疗法(病毒载体和纳米颗粒)及自体Cas9/gRNA-修饰的骨髓干细胞/祖细胞或诱导型多能干细胞的移植以便根除HIV-1感染。

此处，论证了Cas9/gRNA在编辑HIV-1靶基因组中的高特异性。来自亚克隆数据的结果揭示基因组编辑对Cas9和gRNA两者存在的严格依赖性。此外，在设计的gRNA靶标中仅一个核苷酸错配将减损编辑效力。另外，所有4个设计的LTR gRNA在不同的细胞系下都工作良好，表明编辑在HIV-1基因组中比在宿主细胞基因组中更有效，其中不是所有设计的gRNA都有功能性，这可能是由于不同的表观遗传调控、可变的基因组可达性、或其他原因。鉴于Cas9/gRNA发展的容易和迅速，即使HIV-1突变赋予对如上所述基于一个Cas9/gRNA的疗法的抗性，HIV-1变体仍可被基因分型以使得另一个性化疗法适用于个别患者。

已经描述了本发明的多个实施方案。尽管如此，应了解可在不背离本发明的精神和范围下做出各种修改。因此，其他实施方案也在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种灭活哺乳动物细胞中的逆转录病毒的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于包含编码基因编辑复合体的分离的核酸的组合物，所述基因编辑复合体包含CRISPR相关核酸内切酶及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与所述逆转录病毒中的靶核酸序列互补。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述逆转录病毒是选自以下慢病毒属的组合：人免疫缺陷病毒；猴免疫缺陷病毒；猫免疫缺陷病毒；牛免疫缺陷病毒。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是HIV-1或HIV-2。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述人免疫缺陷病毒包含整合的前病毒DNA。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是潜伏感染的细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述潜伏感染的细胞是CD4+T细胞、巨噬细胞、单核细胞、肠相关淋巴样细胞、小神经胶质细胞或星形胶质细胞。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述灭活是在体内。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述灭活是离体的。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞包括来自患有人免疫缺陷病毒感染的受试者、组织外植体或细胞系的培养细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述受试者的培养细胞在所述暴露步骤之后被再植入受试者体内。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述基因编辑复合体将一个或多个突变引入所述前病毒DNA中，其中所述突变能够灭活病毒的复制或病毒基因的表达。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在所述病毒DNA中的突变在与指导RNA序列互补的序列内。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述突变选自以下组合：缺失、插入、点突变。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述突变是缺失。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述缺失包含约1至约10,000个前病毒DNA的核苷酸。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述缺失包含所有或基本上所有的所述前病毒DNA。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸内切酶序列优化为能够在人细胞中表达而。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含在人免疫缺陷病毒的编码区域内的序列。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含在人免疫缺陷病毒的非编码区域内的序列。

21.如权利要求1-18或20中任一项所述的方法，其中所述非编码区域包含一个人免疫缺陷病毒的长末端重复。

22.如权利要求1-18或20-21中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含在人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列。

23.如权利要求1-18或20-22中任一项所述的方法，其中在所述人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列包含在U3、R或U5区域内的序列。

24.如权利要求1-18或20-23中任一项所述的方法，其中在所述长末端重复内的序列包含与选自由以下组成的组的序列具有95％同一性的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

25.如权利要求1-18或20-24中任一项所述的方法，其中在所述长末端重复内的序列包含选自由以下组成的组的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述基因编辑复合体进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述反式激活小RNA(tracrRNA)序列被融合至编码所述指导RNA的序列。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中编码所述基因编辑复合体的核酸进一步包含核定位信号。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中编码所述基因编辑复合体的核酸与表达载体可操作地连接。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

31.一种灭活哺乳动物细胞中的逆转录病毒的方法，所述方法包括将所述细胞与包含CRISPR相关核酸内切酶多肽及一个或多个指导RNA的组合物接触，其中所述指导RNA与所述逆转录病毒中的靶核酸序列互补。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。

33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括基于脂质或基于聚合物的胶体。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述胶体是脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束。

35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于局部施用。

36.一种灭活哺乳动物细胞中的逆转录病毒的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于包含以下的组合物：

a)CRISPR相关核酸内切酶和编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸中的至少一种；及

b)指导RNA和编码指导RNA的分离的核酸中的至少一种，其中所述指导RNA与所述逆转录病毒中的靶核酸序列互补。

37.一种分离的核酸序列，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。

38.如权利要求37所述的分离的核酸序列，其中所述逆转录病毒是选自以下慢病毒属的组合：人免疫缺陷病毒；猿免疫缺陷病毒；猫免疫缺陷病毒；及牛免疫缺陷病毒。

39.如权利要求37或38所述的分离的核酸序列，其中所述人免疫缺陷病毒是HIV-1或HIV-2。

40.如权利要求37-39中任一项所述的核酸序列，其中所述CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

41.如权利要求37-40中任一项所述的核酸序列，其中所述CRISPR相关核酸内切酶序列优化能够在人细胞中表达。

42.如权利要求37-41中任一项所述的核酸序列，其中所述靶序列包含在人免疫缺陷病毒的编码区域内的序列。

43.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含在人免疫缺陷病毒的非编码区域内的序列。

44.如权利要求37-41或43中任一项所述的方法，其中所述非编码区域包含一个人免疫缺陷病毒的长末端重复。

45.如权利要求37-41或43-44中任一项所述的核酸序列，其中所述靶序列包含在所述人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列。

46.如权利要求37-41或43-45中任一项所述的核酸序列，其中在所述人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列包含在U3、R或U5区域内的序列。

47.如权利要求37-41或43-46中任一项所述的核酸序列，其中在所述长末端重复内的序列包含与选自由以下组成的组的序列具有95％同一性的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

48.如权利要求36-41或43-46中任一项所述的核酸序列，其中在所述长末端重复内的序列包含选自由以下组成的组的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTRC(SEQ ID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

49.如权利要求37-41或43-46中任一项所述的核酸序列，其进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。

50.如权利要求49所述的核酸序列，其中所述反式激活小RNA(tracrRNA)序列被融合至编码所述指导RNA的序列。

51.如权利要求37-50中任一项所述的核酸序列，其进一步包含核定位信号。

52.一种表达载体，其包含如权利要求37-51中任一项所述的核酸序列。

53.如权利要求52所述的表达载体，其中所述表达载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

54.一种宿主细胞，其包含如权利要求52-53中任一项所述的表达载体。

55.一种药物组合物，其包含如权利要求36-51中任一项所述的核酸序列、如权利要求52-53所述的表达载体、或如权利要求54所述的细胞。

56.如权利要求37-55中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。

57.如权利要求37-56中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括基于脂质或基于聚合物的胶体。

58.如权利要求57所述的药物组合物，其中所述胶体是脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、嵌段共聚物胶束。

59.如权利要求37-58中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于局部施用。

60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述组合物容纳在避孕套内。

61.一种治疗患有人免疫缺陷病毒感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求37-59中任一项所述的组合物。

62.如权利要求61所述的方法，其进一步包括鉴别患有人免疫缺陷病毒感染的受试者。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述指导RNA与感染所述受试者的人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。

64.如权利要求61所述的方法，其中所述人免疫缺陷病毒感染是潜伏感染。

65.如权利要求61所述的方法，其中所述组合物是局部地或胃肠外施用的。

66.如权利要求61所述的方法，其进一步包括施用抗逆转录病毒剂。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述抗逆转录病毒剂选自以下组合：非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及进入抑制剂。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述抗逆转录病毒剂包括高活性抗逆转录病毒疗法。

69.一种降低处于人免疫缺陷病毒感染风险中的受试者的人免疫缺陷病毒感染风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求36-59中任一项所述的组合物。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是性活跃的。

71.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是健康护理工作者或第一应答者。

72.一种降低人免疫缺陷病毒感染从HIV感染的怀孕或哺乳期母亲传播给其后代的风险的方法，所述方法包括向所述母亲施用治疗有效量的如权利要求37-59中任一项所述的组合物。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述组合物是在产前、围产期、产后、其组合施用的。

74.如权利要求72所述的方法，其进一步包括施用抗逆转录病毒剂。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述抗逆转录病毒剂选自由以下组成的组：非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及进入抑制剂。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述抗逆转录病毒剂包括高活性抗逆转录病毒疗法。

77.如权利要求72所述的方法，其进一步包括向所述后代施用治疗有效量的如权利要求37-59中任一项所述的组合物。

78.一种治疗患有人免疫缺陷病毒感染的受试者的方法，所述方法包括：

a)测定所述人免疫缺陷病毒的核酸序列；

b)向所述受试者施用包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸序列及一个或多个指导RNA的药物组合物，其中所述指导RNA与所述人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸内切酶序列是为在人细胞中的表达而优化。

81.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述靶序列包含在所述一个人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列。

82.如权利要求78-81中任一项所述的方法，其中在所述人免疫缺陷病毒的长末端重复内的序列包含在U3、R或U5区域内的序列。

83.如权利要求78-82中任一项所述的方法，其中在所述长末端重复内的序列包含与选自由以下组成的组的序列具有95％同一性的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ IDNO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

84.如权利要求78-83中任一项所述的方法，其中在所述长末端重复内的序列包含选自由以下组成的组的序列：LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQ IDNO:87)及LTR D(SEQ ID NO:110)或其组合。

85.如权利要求78-84中任一项所述的方法，其进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列。

86.如权利要求85所述的方法，其中所述反式激活小RNA(tracrRNA)序列被融合至编码所述指导RNA的序列。

87.一种分离的核酸，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补；或表达载体的用途，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补，它们是用于制造能够治疗人免疫缺陷病毒感染用的药剂。

88.一种分离的核酸，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补；或表达载体的用途，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补，它们是用于制造能够降低人免疫缺陷病毒感染的风险用的药剂。

89.一种试剂盒，其包括实测数量的包含分离的核酸序列或编码所述核酸的载体的组合物，所述分离的核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列及一个或多个指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补；以及一个或多个选自由以下物品的组合：包装材料、包括使用说明书的包装说明书、无菌流体、注射器及无菌容器。

90.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。