PT1699821E - Proteína de fusão fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO
"PROTEÍNA DE FUSÃO Fc-ERITROPOIETINA COM FARMACOCINÉTICA MELHORADA"
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novas proteínas de fusão Fc-EPO, em regra altamente sialiladas, com farmacocinética melhorada. Especificamente, as proteínas Fc-EPO têm uma semivida no soro prolongada e potência in vivo aumentada. As proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK têm semividas no soro dramaticamente prolongadas e potência in vivo aumentada em comparação com proteínas de fusão Fc-EPO correspondentes produzidas noutras linhas de células, tais como, por exemplo, células NS/0. A presente invenção também se refere a Fc-EPO onde foi efetuado um par de modificações na porção Fc bem como na porção EPO para se obterem moléculas respetivas com propriedades adicionalmente melhoradas.
CONTEXTO A eritropoietina é uma hormona glicoproteica necessária para a maturação de células progenitoras eritroides em eritrócitos. É produzida no rim e é essencial na regulação dos níveis de glóbulos vermelhos na circulação. Estados marcados por níveis baixos de oxigénio tecidual sinalizam aumentos na produção de eritropoietina, que por sua vez estimula a eritropoiese. 0 nível de eritropoietina na circulação é estritamente regulado, para assegurar que só são produzidos glóbulos vermelhos em resposta a uma deficiência de oxigénio de longa duração. Setenta por cento da eritropoietina é eliminada por endocitose mediada por recetores. Quando a eritropoietina se liga ao seu recetor, 2 o complexo é submetido a endocitose e é degradado, desse modo limitando a extensão da sinalização. 0 restante da eritropoietina é eliminado através de filtração renal para a urina. Em resultado, a eritropoietina tem uma semivida no soro relativamente curta.
Eritropoietina humana de ocorrência natural ou eritropoietina recombinante produzida em células de mamifero contém três cadeias oligossacaridicas N-ligadas e uma O-ligada. Ocorre glicosilação N-ligada em residuos asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83, ao passo que glicosilação O-ligada ocorre num residuo serina localizado na posição 126 (Lai et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 3116; Broudy et al. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 2 65: 32 9) . Foi mostrado que as cadeias oligossacaridicas estão modificadas com residuos terminais de ácido siálico. As cadeias N-ligadas têm, tipicamente, até quatro ácidos siálicos por cadeia, e as cadeias 0-ligadas têm até dois ácidos siálicos. Em consequência, um polipéptido de eritropoietina pode acomodar até um total de 14 ácidos siálicos. Foi mostrado que o hidrato de carbono é requerido para a secreção de eritropoietina a partir de células, para aumentar a solubilidade da eritropoietina, e para a atividade biológica in vivo da eritropoietina (Dube et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 17516; DeLorme et al., (1992) Biochemistry 31: 9871-9876) . A administração de eritropoietina humana recombinante tem sido eficaz no tratamento de perturbações ou deficiências hematopoiéticas, tais como, por exemplo, diferentes formas de anemia, incluindo as associadas a falha renal, infeção pelo VIH, perda de sangue e doença crónica. A eritropoietina é tipicamente administrada por injeção 3 intravenosa. Uma vez que a eritropoietina tem uma semivida no soro relativamente curta, são necessárias injeções intravenosas frequentes para manter um nivel terapeuticamente eficaz de eritropoietina na circulação. Composições farmacêuticas contendo eritropoietina humana de ocorrência natural ou recombinante são tipicamente administradas três vezes por semana numa dose de aproximadamente 25-100 Unidades/kg. Esta forma de terapia com eritropoietina, apesar de ser bastante eficaz, é muito dispendiosa e inconveniente, pois a administração intravenosa requer muitas vezes uma visita a um médico ou hospital. Presentemente está disponível um análogo da eritropoietina humana recombinante hiperglicosilado, nova proteína estimuladora da eritropoiese (NESP), com a marca registada Aranesp® (Amgen Inc., Thousand Oaks, Califórnia) para o tratamento de anemia. O Aranesp® pode ser administrado menos frequentemente do que a eritropoietina regular para se obter a mesma resposta biológica.
Uma via de administração alternativa consiste em injeção subcutânea. Esta forma de administração pode ser efetuada por pacientes em casa, e é mais compatível com formulações de libertação lenta que oferecem absorção mais lenta a partir do sitio da administração, desse modo causando um efeito de libertação prolongada. No entanto, a injeção subcutânea origina níveis em circulação significativamente menores e, assim, são necessárias injeções frequentes para se obter o efeito terapêutico desejável. Além disso, a administração subcutânea de fármacos proteicos é geralmente mais imunogénica do que a administração intravenosa porque a pele, como principal barreira a infeção, é um órgão imunológico que é rico em células dendríticas e tem mecanismos sensíveis para identificar e responder a 4 abrasões e materiais estranhos. Casadevall et al. relataram recentemente que pacientes recebendo eritropoietina subcutaneamente desenvolveram anticorpos anti-eritropoietina (Casadevall et al. (2002) N Engl. J. Med. 346 (7) : 469-75) .
Em conformidade, é necessária uma terapia de eritropoietina mais eficiente que requeira administrações menos frequentes.
RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona proteínas de fusão de eritropoietina com farmacocinética melhorada comparada, em várias formas de realização, a eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural, a eritropoietina recombinante, ou ao análogo de eritropoietina hiperglicosilado NESP (publicação PCT WO 00/24893). Em conformidade, um objetivo da presente invenção consiste em simplificar a terapia de eritropoietina e reduzir os custos associados ao tratamento de humanos, ou outros mamíferos, com perturbações ou deficiências hematopoiéticas ou outras indicações para administração de eritropoietina.
Especificamente, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão Fc-eritropoietina (Fc-EPO) biologicamente ativa que tem semivida no soro prolongada e potência in vivo aumentada. "Proteína de fusão Fc-EPO", como usado aqui, refere-se a uma proteína compreendendo um polipéptido possuindo uma porção Fc e uma porção de eritropoietina. "Porção Fc", como usado aqui, abrange domínios derivados da região constante de uma imunoglobulina, preferivelmente uma imunoglobulina 5 humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. "Porção de eritropoietina", como usado aqui, abrange eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural de humano e outras espécies, eritropoietina recombinante, e moléculas do tipo eritropoietina, incluindo fragmentos de eritropoietina biologicamente ativos, análogos, variantes, mutantes ou derivados de eritropoietina. A presente invenção proporciona proteinas Fc-EPO sintetizadas em células BHK. As proteinas de fusão Fc-EPO inventivas sintetizadas em células BHK demonstraram semividas no soro dramaticamente prolongadas e potência in vivo aumentada em comparação com proteinas de fusão Fc-EPO correspondentes produzidas noutras linhas de células, tais como, por exemplo, células NS/0, PerC6, ou 293. A presente invenção também proporciona uma população de proteinas de fusão Fc-EPO altamente sialiladas adequadas para administração a um mamífero. As proteínas de fusão Fc-EPO altamente sialiladas têm semividas no soro mais longas e potência in vivo aumentada comparadas, em várias formas de realização, a eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural, a eritropoietina recombinante, ao análogo da eritropoietina hiperglicosilado NESP, ou a proteínas de fusão Fc-EPO com a mesma sequência de aminoácidos sintetizadas em células NS/0, PerC6, ou 293. De acordo com a presente invenção, uma proteína de fusão Fc-EPO pode conter modificações de aminoácidos na porção Fc que geralmente prolongam a semivida no soro de uma proteína de fusão de Fc. Por exemplo, essas modificações de aminoácidos incluem mutações que diminuem substancialmente ou eliminam a atividade de ligação de recetores de Fc ou de fixação do complemento. Adicionalmente, a proteína de fusão 6
Fc-EPO também pode conter modificações de aminoácidos na porção de eritropoietina que reduzem a endocitose mediada por recetores da EPO ou aumentam a atividade biológica da eritropoietina. Em várias formas de realização, a presente invenção combina os benefícios proporcionados por uma proteina de fusão de imunoglobulina, modificações de aminoácidos das porções Fc e de eritropoietina, e produção em células BHK (por exemplo, niveis elevados de sialilação). Os benefícios combinados têm efeitos aditivos ou sinergéticos resultantes numa proteina de fusão Fc-EPO com uma semivida no soro surpreendentemente prolongada e uma potência in vivo aumentada.
Foi descoberto que as proteínas de fusão Fc-EPO produzidas a partir de células BHK que cresceram num meio sem proteínas exibiram sialilação surpreendentemente aumentada e mais homogénea em comparação com proteínas de fusão Fc-EPO produzidas a partir de células BHK que cresceram noutros meios. 0 ácido nucleico é mantido de modo estável na célula BHK. "Ácido nucleico mantido de modo estável", como usado aqui, refere-se a qualquer ácido nucleico cuja taxa de perda de uma célula mãe para uma célula filha é menor do que três por cento na ausência de pressão seletiva, como uma seleção baseada em antibióticos, para manter o ácido nucleico. Assim quando células mantendo um ácido nucleico de modo estável se dividem, pelo menos 97 por cento (e, mais preferivelmente, mais de 98, mais de 99, ou mais de 99,5 por cento) das células resultantes contêm o ácido nucleico. Quando as células resultantes contendo o ácido nucleico se dividem, pelo menos 97 por cento das células resultantes dessa (segunda) divisão conterão o ácido nucleico. Adicionalmente, o número de cópias por célula do ácido nucleico não é substancialmente reduzido 7 por divisão celular repetida. A sequência de ácido nucleico mantida de modo estável é integrada num cromossoma de uma células BHK. A sequência de ácido nucleico pode codificar a proteina de fusão Fc-EPO em qualquer de várias configurações. A sequência de ácido nucleico codifica uma proteina de fusão Fc-EPO que inclui uma porção Fc localizada perto do terminal N da proteina de fusão Fc-EPO e uma porção de eritropoietina localizada perto do terminal C da proteina de fusão Fc-EPO. A porção Fc abrange, em geral, regiões derivadas da região constante de uma imunoglobulina, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. A porção Fc é derivada da cadeia pesada de uma imunoglobulina humana, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, ou outras classes. A proteina de fusão Fc-EPO não inclui uma região variável de uma imunoglobulina. A porção Fc inclui dominios CH2 e CH3. A porção Fc contém uma mutação que reduz a afinidade para um recetor de Fc ou reduz a função efetora de Fc. Por exemplo, a porção Fc pode conter uma mutação que elimina o sitio de glicosilação na porção Fc da cadeia pesada de uma IgG.
Nalgumas formas de realização, a porção Fc contém um domínio CH2 derivado da cadeia pesada de uma IgG2 humana. Preferivelmente, o domínio CH2 contém uma mutação que elimina o sítio de glicosilação no domínio CH2. A mutação altera a asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser no domínio CH2 da cadeia pesada de IgG2. A mutação altera a fenilalanina e a asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser. A sequência de aminoácidos
Gln-Phe-Asn-Ser é substituída por uma sequência de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser. A asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser corresponde a Asn297 de IgGl. Foi descoberto que a mutação da asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser da IgG2 (isto é, correspondente a Asn297 da IgGl) também reduz, de modo surpreendente, a ligação da proteína de fusão Fc-EPO ao recetor da EPO. Sem pretender ficar restringido pela teoria, a mutação da asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser da IgG2 (isto é, correspondente a Asn297 da IgGl) pode induzir uma alteração conformacional global na proteína de fusão Fc-EPO, conduzindo a propriedades farmacocinéticas dramaticamente melhoradas. A porção Fc inclui um domínio CH2 e pelo menos uma porção de uma região conetora. A região conetora é derivada da IgGl humana. A cisteína na sequência de aminoácidos Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys da região conetora da IgGl é alterada. Em particular, a sequência de aminoácidos Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys é substituída por uma sequência de aminoácidos Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys. 0 domínio CH2 é derivado da cadeia pesada de uma IgG2 humana, ao passo que a região conetora é derivada da cadeia pesada de uma IgGl humana alterada.
De acordo com a invenção, a porção Fc é derivada de uma sequência IgG na qual a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser perto do terminal C da região constante é alterada para eliminar potenciais epítopos de células T de junção. Em particular, a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser é substituída por uma sequência de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr. Adicionalmente, a porção Fc é derivada de uma 9 sequência de IgG na qual o resíduo lisina C-terminal é substituído. Em particular, a lisina C-terminal de uma sequência de IgG é substituída por um aminoácido diferente de lisina, como alanina, para aumentar adicionalmente a semivida no soro da proteína de fusão de Fc.
As combinações de mutações na porção Fc têm, em geral, efeitos aditivos ou sinergéticos na semivida prolongada no soro e potência in vivo aumentada da proteína de fusão Fc-EPO. Assim, em particular, a porção Fc contém (i) uma região derivada de uma sequência de IgG na qual a sequência de aminoácidos Lys-Ser-Lys-Ser é substituída por uma sequência de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr; (ii) um resíduo alanina C-terminal em vez de lisina; (iii) um domínio CH2 e uma região conetora que são derivados de diferentes isotipos de anticorpos, por exemplo, um domínio CH2 de IgG2 e uma região conetora de IgGl alterada; (iv) uma mutação que elimina o sítio de glicosilação no domínio CH2 derivado de IgG2, que é uma sequência de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser em vez da sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser no domínio CH2 derivado de IgG2. A porção de eritropoietina da proteína de fusão Fc-EPO pode ser uma eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural completa, uma eritropoietina recombinante, ou uma molécula do tipo eritropoietina, como um fragmento de eritropoietina biologicamente ativo, análogo, variante, mutante ou derivado de eritropoietina. Preferivelmente, a porção de eritropoietina é derivada de uma eritropoietina humana. Nalgumas formas de realização, a porção de eritropoietina pode conter modificações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação ao recetor da EPO ou aumentam a atividade biológica da eritropoietina. Em 10 particular, a porção de eritropoietina contém adicionalmente as substituições seguintes His32^ Gly, Cys33->· Pro, e Progo-»· Ala. A proteina de fusão Fc-EPO pode incluir um agente de ligação entre a porção Fc e a porção de eritropoietina. Se for incluído, o agente de ligação contém, em geral, entre 1 e 25 aminoácidos e preferivelmente não tem nenhum sítio de clivagem por proteases. O agente de ligação pode conter um sítio de glicosilação N-ligado ou 0-ligado para bloquear a proteólise. Por exemplo, o agente de ligação pode conter uma sequência de aminoácidos Asn-Ala-Thr. A presente invenção também se refere a um método de produção de uma proteína de fusão Fc-EPO. O método inclui manter células BHK contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO em condições adequadas para a expressão da proteína de fusão Fc-EPO codificada, e recuperar a proteína de fusão Fc-EPO expressa. As células BHK são cultivadas num meio sem proteínas. Em geral, a proteína de fusão Fc-EPO produzida nas células BHK tem uma semivida no soro mais longa do que uma proteína de fusão Fc-EPO correspondente produzida noutras linhas de células, tais como, por exemplo, células NS/0, PerC6, ou 293. A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica contendo a proteína de fusão Fc-EPO produzida em células BHK. A proteína de fusão Fc-EPO utilizada na composição farmacêutica não foi tratada para remover resíduos de ácido siálico. A composição farmacêutica também inclui um transportador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também proporciona um método de tratamento de um 11 mamífero por administração da composição farmacêutica ao mamífero. Nalgumas formas de realização, o mamífero tratado tem uma perturbação ou deficiência hematopoiética. Uma vez que as proteínas de fusão Fc-EPO da presente invenção têm potência in vivo aumentada e semivida no soro prolongada, composições farmacêuticas contendo as proteínas de fusão Fc-EPO requerem, em geral, administração menos frequente em comparação com composições farmacêuticas contendo eritropoietina de ocorrência natural ou recombinante ou proteínas de fusão Fc-EPO correspondentes produzidas noutras células. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica é administrada menos do que três vezes por semana (por exemplo, duas vezes por semana, uma vez por semana, ou não mais do que uma vez em cada dez dias, como uma vez em cada duas semanas, uma vez por mês ou uma vez em cada dois meses).
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona uma população de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas adequadas para administração a um mamífero. De acordo com a invenção, as proteínas de fusão Fc-EPO incluem uma porção Fc localizada perto do terminal N das proteínas de fusão Fc-EPO e uma porção de eritropoietina localizada perto do terminal C das proteínas de fusão Fc-EPO. De acordo com a invenção, as proteínas de fusão Fc-EPO purificadas são sintetizadas numa célula BHK. A célula BHK é adaptada para crescimento num meio sem proteínas. A população altamente sialilada de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas proporcionada pela presente invenção tem uma semivida no soro mais longa em comparação com uma população de proteínas de fusão Fc-EPO correspondentes produzidas em células tais como, por exemplo, células NS/0, PerC6, ou 293. De acordo com a presente invenção, a porção Fc e a 12 porção de eritropoietina das proteínas de fusão Fc -EPO purificadas podem conter uma ou mais mutações ou modificações como descrito aqui, proporcionando uma semivida no soro prolongada e uma potência in vi vo aumentada com efeitos que são aditivos ou sinergéticos com sialilação aumentada. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica contendo a população altamente sialilada de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas como descrito aqui. Uma composição farmacêutica preferida também inclui um transportador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também proporciona um método de tratamento de um mamifero, que inclui a administração ao mamifero da composição farmacêutica contendo a população altamente sialilada de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica é administrada menos do que três vezes por semana (por exemplo, duas vezes por semana, uma vez por semana, ou não mais do que uma vez em cada dez dias, como uma vez em cada duas semanas, uma vez por mês ou uma vez em cada dois meses) . • Em resumo, a invenção refere-se às questões seguintes:
Uma proteina de fusão dimérica purificada, consistindo essencialmente numa porção Fc dimérica de uma molécula de IgG humana compreendendo uma região conetora, um dominio CH2 e um CH3, e eritropoietina (EPO) humana, em que cada cadeia da porção Fc dimérica está ligada, via o seu terminal C diretamente ou via um péptido de ligação, ao terminal N de uma molécula de EPO, em que a referida proteina de fusão tem as propriedades 13 seguintes: (i) a molécula está altamente sialilada, ao compreender 15-28 resíduos de ácido siálico; (ii) o domínio CH2 deriva da IgG2 humana e é modificado por substituição dos resíduos de aminoácidos Phe e Asn, na extensão da sequência Gln-Phe-Asn-Ser do domínio CH2, por Ala e Asn, desse modo formando a sequência Gln-Ala-Gln-Ser no domínio CH2, e (iii) a extensão da sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser perto do terminal C do domínio CH3 é substituída por Ala-Thr-Ala-Thr. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que, adicionalmente, o resíduo Lys C-terminal do domínio CH3 é substituído por Ala. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que a região conetora é derivada da IgGl humana. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que a referida região conetora de IgGl é modificada por substituição do resíduo de aminoácido Cys na extensão da sequência Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys da região conetora por um resíduo Ser, desse modo formando a sequência Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys na região conetora. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que um resíduo de aminoácido diferente de Cys está na posição 33 da molécula de EPO em vez do resíduo Cys original, e um resíduo Cys está na posição 88 da molécula de EPO em vez do resíduo Trp original, desse 14 modo permitindo que a porção de EPO da proteina de fusão forme uma ligação dissulfureto Cys29 - Cysss· • Uma proteina de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que o resíduo de aminoácido diferente de Cys na posição 33 é Pro. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que o sítio de glicosilação compreende uma sequência de aminoácidos Asn-Ala-Thr. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, que compreende adicionalmente um domínio CHI. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que a molécula de IgG completa, incluindo CH2, CH3 e, opcionalmente, CHI, deriva de IgG2 e a região conetora deriva de IgGl. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica respetiva, em que a molécula de IgG completa, incluindo CH2, CH3 e a região conetora e, opcionalmente, CHI, deriva de IgGl. • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica que compreende a sequência: FHVrSííFLiSGKIiKl*^q3SA.C&TS3DE (SgQE>NOH4). 15 • Uma proteína de fusão Fc-EPO dimérica que compreende a sequência: ^CWÍVHííAJCtKtií Κβ Q&QS T f tWSVTI^nKKYKlC KVSNÍÍSr ΕΑΡ ΙΈ K.TI S KT K GQFREPQ^^*PPSStEMT»I0VSI/rCI^turt^SOl.ftVWESNC^gl®^'K-I'TPF?^I!DSDG ãF^líYS'KI*fV£^aMQíKMVFStSWHlMJaJHXTQI®MAmmÃ.PFRIiICl3S»VtmYM. S&KE^ÍTtGÍMGPSIJ^XrTODT^Í^^^
L·L·WStQPC3SAUQLH'vDKAVSβLK3LTτLtíU^I^Qm¾IS^PDmSÍ^>¾?tRΪI>i'Am'FRKL FS¥YS.KFiaQ^^rTGmCK?tt® 01Q tD MO: 15},’ • Uma população correspondente de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas, em que a célula BHK é adaptada para crescimento num meio sem proteínas.
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS
As Figuras IA e 1B ilustram um alinhamento das sequências de aminoácidos de regiões constantes de IgGl, IgG2 e IgG4 humanas. A Figura 2 ilustra uma experiência de farmacocinética em ratinhos mostrando uma correlação entre a dose de Fc-EPO e a quantidade de decréscimo das concentrações no soro de Fc-EPO durante a fase alfa. Nesta experiência utilizou-se uma variante Fc-EPO subsialilada sintetizada em células NS/0. A Figura 3 ilustra vias potenciais de eliminação de proteínas de fusão Fc-EPO e modificações na proteína de fusão que potencialmente modulam estas vias. A Figura 4 ilustra respostas de hematócríto exemplificativas em ratinhos após administração de Fcg2h(FN>AQ)-EPO. 16 A Figura 5 ilustra respostas de hematócrito
exemplificativas em ratos após administração de proteínas Fcg2h-EP0, Fcg2h-EP0(NDS) , Fcg4h-EP0, e Fcg4h(N>Q)-EPO produzidas a partir de células BHK. A Figura 6 ilustra respostas de hematócrito exemplificativas em ratinhos após administração de Fcg2h-EPO(NDS) produzida a partir de células BHK, Fcg2h-EP0(NDS) produzida a partir de células NS/0, e NESP (isto é,
Aranesp®). A Figura 7 ilustra uma sequência de ácido nucleico exemplificativo que codifica uma proteína Fc-EPO madura. A Figura 8 ilustra perfis farmacocinéticos de Fcg2h(N>Q)-EPO produzida a partir de células BHK e Fcg2h(N>Q)-EPO produzida a partir de células NS/0 em ratinhos. A Figura 9 ilustra perfis farmacocinéticos de Fcg2h- EPO(NDS) produzida a partir de células BHK e Fcg2h-EP0(NDS) produzida a partir de células NS/0 em ratinhos. A Figura 10 ilustra perfis farmacocinéticos de proteínas
Fcg2h-EPO(NDS) produzidas em células BHK-21, células PERC6, e células 293 em ratinhos. A Figura 11 ilustra respostas de hematócrito em cães bigle após tratamento com proteínas Fcg2h (FN->AQ) -EPO sintetizadas em células BHK.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma proteína de fusão Fc-EPO com farmacocinética melhorada. Especificamente, a 17 proteína Fc-EPO proporcionada pela presente invenção tem uma semivida no soro prolongada e potência in vivo aumentada. A presente invenção proporciona uma proteína de fusão Fc-EPO sintetizada em células BHK. As proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK demonstraram semividas no soro dramaticamente prolongadas e potência in vivo aumentada quando comparadas com proteínas de fusão Fc-EPO correspondentes produzidas noutras linhas de células, tais como, por exemplo, células NS/0, PerC6, ou 293. Noutro aspeto, a presente invenção proporciona uma população de proteínas de fusão Fc-EPO altamente sialiladas. A população de proteínas de fusão Fc-EPO altamente sialiladas tem uma semivida no soro mais longa em comparação com uma população de proteínas de fusão Fc-EPO correspondentes com níveis mais baixos de sialilação. De acordo com a presente invenção, uma proteína de fusão Fc-EPO pode conter modificações de aminoácidos na porção Fc que prolongam a semivida no soro de uma proteína de fusão de Fc, tal como diminuindo substancialmente ou eliminando a atividade de ligação de recetores de Fc, ou modificações que reduzem a atividade de fixação do complemento. Adicionalmente, a proteína de fusão Fc-EPO também pode conter modificações de aminoácidos na porção da eritropoietina que reduzem a endocitose mediada pelo recetor da EPO ou aumentam a atividade biológica da eritropoietina.
Proteína de fusão Fc-EPO "Proteína de fusão Fc-EPO", como usado aqui, refere-se a uma proteína compreendendo um polipéptido possuindo pelo menos duas porções, nomeadamente uma porção Fc e uma porção de eritropoietina, que normalmente não estão presentes no mesmo polipéptido. Em formas de realização preferidas da presente invenção, os polipéptidos possuindo uma porção Fc 18 e uma porção de eritropoietina formam homodímeros; em conformidade, uma proteina de fusão Fc-EPO é geralmente uma proteína dimérica mantida em conjunto por uma ou mais ligações dissulfureto, em que cada cadeia polipeptídica contém uma porção Fc e uma porção de eritropoietina. No entanto, uma proteína de fusão Fc-EPO da presente invenção pode ter qualquer configuração que permita a associação estável de porções de eritropoietina a porções Fc mantendo a atividade da eritropoietina. Por exemplo, essas configurações incluem mas não estão limitadas a um único polipéptido contendo duas porções Fc e duas porções de eritropoietina, um único polipéptido contendo duas porções Fc e uma porção de eritropoietina, uma proteína heterodimérica incluindo um polipéptido contendo uma porção Fc e uma porção de eritropoietina e outro polipéptido contendo uma porção Fc, e outras configurações adequadas. A porção de eritropoietina pode ser direta ou indiretamente ligada à porção Fc em várias configurações. Em particular, a porção de eritropoietina é diretamente ligada à porção Fc através de uma ligação covalente. A porção de eritropoietina é fundida diretamente à porção Fc no seu terminal N. Em particular, o terminal C da porção Fc é fundido ao terminal N da porção de eritropoietina, isto é, Nterm-Fc-Cterm-Nterm-EPO-Cterm· Nesta configuração, a porção Fc está localizada perto do terminal N da proteína de fusão Fc-EPO e a porção de eritropoietina está localizada perto do terminal C. A porção de eritropoietina pode ser ligada indiretamente à porção Fc. Por exemplo, a proteína de fusão Fc-EPO pode incluir um agente de ligação (L) entre a porção Fc e a porção de eritropoietina. De modo semelhante à fusão 19 direta, a porção de eritropoietina é preferivelmente fundida ao terminal C da porção Fc através de um agente de ligaçao, isto e, Nterm-Fc—Cterm-L—Nterm-EPO-Cterm· Assim, a porção Fc está localizada perto do terminal N da proteina de fusão Fc-EPO e está separada por um agente de ligação da porção de eritropoietina localizada perto do terminal C.
Porção Fc
Como usado aqui, "porção Fc" abrange dominios derivados da região constante de uma imunoglobulina, preferivelmente uma imunoglobulina humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. Imunoglobulinas adequadas incluem IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e outras classes. A região constante de uma imunoglobulina é definida como um polipéptido de ocorrência natural ou produzido sinteticamente homólogo à região C-terminal da imunoglobulina, e pode incluir um domínio CHI, uma região conetora, um domínio CH2, um domínio CH3, ou um domínio CH4, separadamente ou em combinação. Um alinhamento de sequências das regiões constantes da IgGl, IgG2 e IgG4 humanas está apresentado nas Figuras IA e 1B. De acordo com Paul, (1999) "Fundamental Immunology" 4a Edição, Lippincott-Raven, o domínio CHI inclui os aminoácidos 118 -215; a região conetora inclui os aminoácidos 216 - 230; o domínio CH2 inclui os aminoácidos 231 - 340; e o domínio CH3 inclui os aminoácidos 341 - 447 (as posições dos aminoácidos são baseadas na sequência da IgGl). A região conetora reúne o domínio CHI aos domínios CH2 e CH3.
Na presente invenção, a porção Fc inclui tipicamente pelo menos um domínio CH2. Por exemplo, a porção Fc pode incluir região conetora-CH2-CH3. Alternativamente, a porção Fc pode 20 incluir todos ou uma porção da região conetora, o domínio CH2 e/ou o domínio CH3. A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas funções importantes dos anticorpos, incluindo ligação ao recetor de Fc (FcR) e fixação do complemento. Há cinco classes principais de regiões constantes de cadeias pesadas, classificadas como IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, cada uma com funções efetoras características designadas pelo isotipo. Por exemplo, IgG é separada em quatro subclasses γ: γΐ, γ2, γ3, e γ4, também conhecidas como IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, respetivamente. 495-500).
As moléculas de IgG interagem com múltiplas classes de recetores celulares, incluindo três classes de recetores de Fcy (FcyR) específicos para a classe IgG de anticorpos, nomeadamente FcyRI, FcyRII, e FcyRIII. Foi relatado que as sequências importantes para a ligação de IgG aos recetores FcyR estão localizadas nos domínios CH2 e CH3. A semivida no soro de um anticorpo é influenciada pela capacidade desse anticorpo para se ligar a um recetor de Fc (FcR) . De modo semelhante, a semivida no soro de proteínas de fusão com imunoglobulina também é influenciada pela capacidade para se ligarem a esses recetores (Gillies SD et al., (1999) Câncer Res. 5_9: 2159-66) . Em comparação com os da IgGl, os domínios CH2 e CH3 da IgG2 e IgG4 têm afinidade de ligação bioquimicamente indetetável ou reduzida para recetores de Fc. Também foi relatado que proteínas de fusão de imunoglobulina contendo domínios CH2 e CH3 de IgG2 ou IgG4 tinham semividas no soro mais longas em comparação com as correspondentes proteínas de fusão contendo domínios CH2 e CH3 de IgGl (Patente U.S. N° 5,541,087; Lo et al., (1998) Protein Engineering, 11: 495-500). Em conformidade, 21 domínios CH2 e CH3 para a presente invenção são derivados de um isotipo de anticorpo com afinidade de ligação para recetores e funções efetoras reduzidas, tal como IgG2. Em particular, os domínios CH2 e CH3 são derivados de IgG2. A região conetora está normalmente localizada de modo C-terminal relativamente ao domínio CHI da região constante da cadeia pesada. Nos isotipos de IgG, ligações dissulfureto ocorrem tipicamente nesta região conetora, permitindo a formação da molécula tetramérica final. Esta região é dominada por prolinas, serinas e treoninas. Quando for incluída na presente invenção, a região conetora é tipicamente pelo menos homóloga à região da imunoglobulina de ocorrência natural que inclui os resíduos cisteína para formarem ligações dissulfureto que ligam as duas frações Fc. Sequências representativas de regiões conetoras para imunoglobulinas humanas e de ratinho podem ser encontradas em Borrebaeck, C. A. K., editor., (1992) "ANTIBODY ENGINEERING. A PRACTICAL GUIDE", W. H. Freeman and Co. Regiões conetoras adequadas para a presente invenção são derivadas de IgGl. A região conetora de IgGl tem três cisteínas, duas das quais estão envolvidas em ligações dissulfureto entre as duas cadeias pesadas da imunoglobulina. Estas mesmas cisteínas permitem a formação eficiente e consistente de ligações dissulfureto entre porções Fc. Em consequência, uma região conetora da presente invenção é derivada de IgGl, em particular de IgGl humana. A primeira cisteína na região conetora da IgGl humana é mutada noutro aminoácido, preferivelmente serina.
De acordo com a presente invenção, a porção Fc pode conter domínios CH2 e/ou CH3 e uma região conetora que são derivados de diferentes isotipos de anticorpos, isto é, uma 22 porção Fc híbrida. Em particular, a porção Fc contém domínios CH2 e/ou CH3 derivados de IgG2 e uma região conetora mutante derivada de IgGl.
Nalgumas formas de realização, a porção Fc contém modificações de aminoácidos que geralmente prolongam a semivida no soro de uma proteína de fusão de Fc. Essas modificações de aminoácidos incluem mutações que diminuem substancialmente ou eliminam a atividade de ligação de recetores de Fc ou de fixação do complemento. Por exemplo, o sítio de glicosilação na porção Fc da cadeia pesada de uma imunoglobulina pode ser removido. Por exemplo, na IgG2, o sítio de glicosilação é a asparagina contida na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser. Na IgG2, uma mutação de asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser remove o sítio de glicosilação numa porção Fc derivada da cadeia pesada de IgG2. Em particular, a fenilalanina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser é adicionalmente mutada para eliminar um potencial epítopo de células T não próprio resultante da mutação de asparagina. A sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser numa cadeia pesada da IgG2 pode ser substituída por uma sequência de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser.
Também foi observado que a alteração de aminoácidos perto da junção da porção Fc com a porção não Fc pode aumentar dramaticamente a semivida no soro da proteína de fusão de Fc (Publicação PCT WO 01/58957, cuja divulgação é aqui incorporada por referência). Em conformidade, a região de junção de uma proteína de fusão Fc-EPO da presente invenção pode conter alterações que, relativamente às sequências de ocorrência natural da cadeia pesada de uma imunoglobulina e eritropoietina, preferivelmente se situam num intervalo de 23 cerca de 10 aminoácidos do ponto de junção. Estas alterações de aminoácidos podem causar um aumento da hidrofobicidade, por exemplo, ao alterarem a lisina C-terminal da porção Fc num aminoácido hidrófobo, como alanina ou leucina.
De acordo com a invenção, a porção Fc contém alterações de aminoácidos do segmento Leu-Ser-Leu-Ser perto do terminal C da porção Fc da cadeia pesada de uma imunoglobulina. As substituições de aminoácidos do segmento Leu-Ser-Leu-Ser eliminam potenciais epitopos de células T de junção. Em particular, a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser perto do terminal C da porção Fc é substituída por uma sequência de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr. Os aminoácidos no segmento Leu-Ser-Leu-Ser são substituídos por outros aminoácidos, como glicina ou prolina. Métodos pormenorizados de geração de substituições de aminoácidos do segmento Leu-Ser-Leu-Ser perto do terminal C de uma molécula de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, ou de outra classe de imunoglobulinas, foram descritos na Publicação de Patente U.S. N° 20030166877 (isto é, requerimento de patente U.S. N° 10/112,582).
Porção de eritropoietina
Como usado aqui, "porção de eritropoietina" abrange eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural de humano e outras espécies, eritropoietina recombinante, e moléculas do tipo eritropoietina, incluindo fragmentos de eritropoietina biologicamente ativos, análogos, variantes, mutantes ou derivados de eritropoietina. A eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural é uma hormona glicoproteica de 34 kD que estimula o crescimento e desenvolvimento de glóbulos vermelhos a partir de células precursoras de eritropoietina. A eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural é produzida no rim em resposta a hipoxia (por exemplo, perda de glóbulos vermelhos devido a anemia) e regula o crescimento e diferenciação de glóbulos vermelhos através de interação com o seu recetor celular cognato. A eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural pode ser isolada e purificada de sangue (Miyake T., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252: 5558-5564), ou plasma (Goldwasser, E., et al., (1971) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 6_8: 697-698), ou urina. A eritropoietina recombinante ou sintetizada quimicamente pode ser produzida utilizando técnicas bem conhecidas dos profissionais. Estão disponíveis no mercado duas formas de eritropoietina humana recombinante (rHuEPO): EPOGEN® da Amgen e PROCRIT® da Johnson & Johnson.
Como usado aqui, a atividade biológica da eritropoietina é definida como a capacidade para estimular a proliferação celular através da interação com o recetor da eritropoietina. 0 ensaio funcional da eritropoietina pode ser conduzido in vitro ou in vivo. Por exemplo, a atividade in vitro da eritropoietina pode ser testada num ensaio à base de células. Especificamente, a atividade da eritropoietina pode ser determinada com base num ensaio de proliferação de células TF-1. As células TF-1 expressam recetores de EPO. A proliferação de células TF-1, que é determinada pela incorporação de timidina tritiada, é uma função da atividade da eritropoietina (Hammerlling et al., (1996) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, F4: 1455; Kitamura et al., (1989) J. Cellular Physiol, 140: 323). O 25 ensaio à base de células in vitro é descrito mais pormenorizadamente no Exemplo 6. Ensaios in vivo são tipicamente conduzidos em modelos animais, tais como, por exemplo, ratinhos e ratos. Exemplos de ensaios in vivo incluem mas não estão limitados a ensaios de hematócrito (HCT) e ensaios de reticulócitos. Os ensaios de HCT medem o volume de glóbulos vermelhos de uma amostra de sangue recolhida de um animal tratado com eritropoietina, e são realizados por centrifugação de sangue em tubos capilares e medição da fração do volume total ocupado por glóbulos vermelhos sedimentados. 0 ensaio de HCT in vivo é descrito mais pormenorizadamente no Exemplo 8. Os ensaios de reticulócitos medem novos glóbulos vermelhos, também conhecidos como reticulócitos, que recentemente se diferenciaram de células precursoras e ainda têm vestígios de ácidos nucleicos caracteristicos das células precursoras. Os reticulócitos são medidos por triagem de glóbulos vermelhos num citómetro de fluxo após coloração com um corante de ácidos nucleicos, como laranja de acridina ou laranja tiazolo, e contagem da fração de reticulócitos com coloração positiva.
Uma molécula do tipo eritropoietina biologicamente ativa ou funcionalmente ativa partilha, tipicamente, semelhança ou identidade substancial de sequências de aminoácidos (por exemplo, pelo menos cerca de 55%, cerca de 65%, cerca de 75% de identidade, tipicamente pelo menos cerca de 80% e muito tipicamente cerca de 90-95% de identidade) com as sequências correspondentes da eritropoietina de tipo selvagem, ou de ocorrência natural, e possui uma ou mais das funções da respetiva eritropoietina de tipo selvagem. 26
Assim, é entendido que eritropoietina da presente invenção inclui especificamente polipéptidos de eritropoietina possuindo sequências de aminoácidos análogas à sequência da eritropoietina de tipo selvagem. Essas proteínas são definidas aqui como análogos da eritropoietina. Um "análogo" é definido aqui de modo a designar uma sequência de aminoácidos com semelhança suficiente à sequência de aminoácidos da eritropoietina de tipo selvagem para possuir a atividade biológica da proteína. Por exemplo, um análogo da eritropoietina pode conter uma ou mais alterações de aminoácidos na sequência de aminoácidos da eritropoietina de tipo selvagem mas ainda assim possuir, por exemplo, a capacidade de estimular a produção ou maturação de glóbulos vermelhos. Exemplos dessas alterações de aminoácidos incluem adições, deleções ou substituições de resíduos de aminoácidos. A eritropoietina da presente invenção também abrange proteínas mutantes que exibem maior ou menor atividade biológica do que a eritropoietina de tipo selvagem, como descrito na Patente U.S. N° 5,614,184.
Variações na sequência da eritropoietina
As modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na porção da eritropoietina da presente invenção para reduzir a afinidade de ligação ao recetor da EPO; para aumentar a estabilidade da proteína; para intensificar a adoção de uma conformação ativa correta; para melhorar propriedades farmacocinéticas; para aumentar a síntese; ou para proporcionar outras características vantajosas. Por exemplo, a endocitose mediada pelo recetor da EPO é determinada pela afinidade de ligação entre a eritropoietina e o recetor da EPO. A estrutura tridimensional de um complexo de eritropoietina humana e recetor da EPO demonstra que a ligação da eritropoietina ao 27 seu recetor é dominada por cargas positivas na superfície da eritropoietina e cargas negativas no recetor da EPO. Syed et al., (1998) Nature, 395: 511. Para reduzir a velocidade de ligação podem introduzir-se mutações com a finalidade de substituir aminoácidos com carga positiva situados perto da superfície de contacto eritropoietina-recetor da EPO. Por exemplo, numa forma de realização, um ou ambos de Argl31 e Argl39 da eritropoietina humana podem ser substituídos (a numeração de aminoácidos de sequências de EPO é baseada na EPO humana madura). Preferivelmente, Argl31 e Argl39 são substituídos por ácido glutâmico, ácido aspártico, ou outros aminoácidos com carga não positiva. Podem ser introduzidas mutações em eritropoietina de outras espécies para substituir aminoácidos correspondentes a Argl31 e Argl39 da eritropoietina humana. No entanto, para conservar a atividade biológica da EPO, devem ser evitados aqueles resíduos que estão no centro da interação EPO-recetor da EPO ao fazer alterações na sequência de aminoácidos da EPO.
Em alternativa, é possível determinar empiricamente aquelas regiões ou posições que irão tolerar substituições de aminoácidos por mutagénese por varrimento de alanina (Cunningham et al., (1989) Science, 244, 1081-1085). Neste método, resíduos de aminoácidos selecionados são individualmente substituídos por um aminoácido neutro (por exemplo, alanina) para determinar os efeitos na atividade biológica. A eritropoietina humana de ocorrência natural, que aparenta ser única entre eritropoietinas de mamíferos, tem exatamente quatro cisteínas nas posições 7, 29, 33, e 161 que formam duas ligações dissulfureto. Um ou mais destes 28 resíduos cisteína da porção da eritropoietina podem ser alterados. Para gerar uma ligação dissulfureto alterada, um resíduo cisteína é mutado num aminoácido estruturalmente compatível, como alanina ou serina, e um segundo aminoácido que se encontra próximo na estrutura tridimensional é mutado em cisteína. Por exemplo, um dos aminoácidos Gln86, Pro87, Trp88, Glu8g, e Leugi pode ser substituído por Cys. Se Trp88 for substituído por Cys e CyS33 for substituído por outro aminoácido, a porção de eritropoietina irá formar uma ligação dissulfureto Cys2g-Cyss8 que não se encontra na EPO humana. Esta ligação resulta numa proteína de fusão que tem maior atividade do que uma proteína de fusão com uma ligação dissulfureto CyS2g-CyS33 típica. Adicionalmente, a proteína de fusão Cys2g-Cyss8 exibe um aumento pronunciado da atividade, em comparação com a proteína de fusão Cys2g-CyS33, na presença de outras mutações na porção da eritropoietina da proteína de fusão. Métodos para introduzir mutações na eritropoietina são bem conhecidos na área. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas por técnicas de mutagénese dirigida a sítios. É importante notar que está disponível uma grande variedade de técnicas de mutagénese dirigida a sítios, que podem ser utilizadas como alternativas para se obterem resultados semelhantes. Outras técnicas incluem mas não estão limitadas a mutagénese aleatória e semialeatória.
Agente de ligação
As proteínas de fusão Fc-EPO de acordo com esta invenção podem incluir uma molécula de ligação, preferivelmente um agente de ligação peptídico, entre a porção Fc e a porção de eritropoietina. Uma proteína de fusão com um agente de ligação pode ter propriedades melhoradas, como atividade 29 biológica aumentada. Um agente de ligação contém geralmente entre 1 e 25 aminoácidos (por exemplo, entre 5 e 25 ou entre 10 e 20 aminoácidos) . O agente de ligação pode ser concebido de modo a não incluir nenhum sítio de clivagem por proteases. Adicionalmente, o agente de ligação pode conter um sitio de glicosilação N-ligado ou O-ligado para inibir a proteólise de modo estérico. Em conformidade, o agente de ligação pode conter uma sequência de aminoácidos Asn-Ala-Thr.
Agentes de ligação adequados adicionais são divulgados em Robinson et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sei. USA: 95, 5929; e Requerimento U.S. N° de Série 09/708,506.
Glicosilação A eritropoietina humana de ocorrência natural e eritropoietina recombinante expressas em células de mamifero contêm três cadeias oligossacarídicas N-ligadas e uma O-ligada. Ocorre glicosilação N-ligada em resíduos asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83, ao passo que glicosilação O-ligada ocorre num resíduo serina localizado na posição 126 (Lai et al., (1986) J. Biol. Chem., 261: 3116; Broudy et al., (1988) Arch. Biochem.
Biophys., 265: 329). Foi mostrado que as cadeias oligossacarídicas são modificadas com resíduos terminais de ácido siálico. As cadeias N-ligadas têm, tipicamente, até quatro ácidos siálicos por cadeia, e as cadeias O-ligadas têm até dois ácidos siálicos. Em consequência, um polipéptido de eritropoietina pode acomodar até um total de 14 ácidos siálicos. 0 ácido siálico é o açúcar terminal de oligossacáridos N-ligados ou O-ligados. A extensão da sialilação é variável 30 de sítio para sítio, de proteína para proteína, e pode depender das condições da cultura de células, tipos de células, e clones celulares particulares que são utilizados. Foi descoberto que a proteína de fusão Fc-EPO da presente invenção sintetizada em células BHK é altamente sialilada. Também foi descoberto que a extensão da sialilação da proteína de fusão Fc-EPO pode ser adicionalmente aumentada por adaptação das células BHK para crescimento em meio sem proteínas. Certas linhas de células diferentes habitualmente utilizadas, como células NS/0, PerC6, ou 293, não consequem produzir a proteína de fusão Fc-EPO altamente sialilada em condições de cultura padrão. A extensão da sialilação da proteína de fusão Fc-EPO produzida a partir de diferentes linhas de células pode ser determinada por eletroforese em gel de focagem isoelétrica (IEF) em virtude dos seus resíduos de ácido siálico com carga altamente negativa; os pormenores da eletroforese em gel de IEF são descritos no Exemplo 5B. A extensão da sialilação da proteína de fusão Fc-EPO produzida em diferentes linhas de células também pode ser confirmada qualitativamente por estudos de ligação de lectina utilizando métodos que são familiares aos profissionais. Um exemplo de um ensaio de ligação de lectina é descrito no Exemplo 5B.
Tipicamente, uma população de proteínas de fusão Fc-EPO purificadas altamente sialiladas da presente invenção tem uma média de 11-28 resíduos de ácido siálico por proteína de fusão Fc-EPO purificada. Populações altamente sialiladas preferidas de proteínas de fusão Fc-EPO têm uma média de 13-28, 15-28, 17-28, 19-28, ou 21-28 resíduos de ácido siálico por proteína de fusão Fc-EPO purificada. Por exemplo, uma população altamente sialilada de proteínas de 31 fusão Fc-EPO tem uma média de 20 até 22 resíduos de ácido siálico por proteína de fusão Fc-EPO purificada. Outra população de proteínas de fusão Fc-EPO tem uma média de 23-28 resíduos de ácido siálico por proteína de fusão Fc-EPO purificada.
Farmacocinética da proteína de fusão Fc-EPO sialilada
Um dos fatores mais importantes que determinam a atividade biológica in vivo de agentes estimuladores da eritropoiese é o período de tempo em que a concentração no soro da proteína permanece acima do limite necessário para a ocorrência de eritropoiese, que é determinado pela farmacocinética dos agentes estimuladores da eritropoiese. O perfil farmacocinético da proteína de fusão Fc-EPO altamente sialilada é distinto do da eritropoietina de ocorrência natural ou recombinante. A principal diferença é que a proteína de fusão Fc-EPO altamente sialilada tem uma semivida no soro muito mais longa e eliminação mais lenta, conduzindo a potência biológica in vivo aumentada. Sem pretender ficar restringido pela teoria, crê-se que os resíduos de ácido siálico aumentam as cargas negativas na superfície de uma molécula de eritropoietina, resultando em velocidade decrescida de ligação ao recetor da EPO de carga negativa e endocitose decrescida mediada pelo recetor da EPO, prolongando a semivida no soro. Além disso, os ácidos siálicos também evitam que proteínas eritropoietina sejam submetidas a endocitose pelos recetores da asialoglicoproteína, que se ligam a glicoproteínas com resíduos galactose expostos.
Em geral, a maior parte dos perfis farmacocinéticos de uma molécula terapêutica como a eritropoietina exibe uma queda inicial da concentração no soro (uma fase alfa), seguida de 32 um decréscimo mais gradual (uma fase beta) após a administração.
Fatores que influenciam a fase alfa
De acordo com a teoria da farmacocinética de moléculas pequenas, a fase alfa define um volume de distribuição que descreve como uma molécula sofre partição em compartimentos fora do sangue. A queda observada na fase alfa varia muito para diferentes proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em diferentes linhas de células. Teoricamente, a diferença pode dever-se a variação do volume de distribuição, ou dever-se a variações no tráfego intercompartimentos. No entanto, foi observado que há uma correlação entre a extensão da sialilação e o comportamento farmacocinético das proteínas Fc-EPO em ratinhos. Por exemplo, as proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK são altamente sialiladas e exibem o melhor perfil farmacocinético. As proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células NS/0 são um pouco sialiladas e têm um perfil farmacocinético intermédio. As proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células 293 e PerC6 têm pouca ou nenhuma sialilação e têm um fraco perfil farmacocinético, caracterizado por uma queda de cerca de 100 vezes da concentração no soro nos primeiros 30 minutos. Em consequência, um fator chave que influencia a fase alfa de uma proteína de fusão Fc-EPO particular é a distribuição de espécies de glicosilação e o nível de sialilação. As proteínas de fusão Fc-EPO que estão subsialiladas desaparecem rapidamente.
Adicionalmente, como mostrado na Figura 2, a extensão da queda das concentrações de Fc-EPO no soro durante a fase alfa varia de acordo com a dose, indicando que este comportamento é saturável e muito provavelmente mediado por 33 recetores. É possível que o recetor que medeia a queda na fase alfa não seja o recetor da EPO nem recetor de Fc, mas sim outro recetor, como o recetor da asialoqlicoproteína. 0 Aranesp® tem afinidade de ligação reduzida para os recetores da EPO, em comparação com a eritropoietina humana normal, porque o Aranesp® tem cargas negativas aumentadas resultantes de sítios de glicosilação N-ligada adicionais. No entanto, o Aranesp® e a eritropoietina humana normal exibem quedas semelhantes durante fases alfa. Adicionalmente, uma vez que, em geral, o número de recetores da EPO na superfície celular de uma célula progenitora eritroide é só aproximadamente 200, estes recetores ficariam completamente saturados a doses muito menores de eritropoietina do que as utilizadas na Figura 2. É talvez improvável que recetores de Fc medeiem a queda dramática na fase alfa porque proteínas de fusão Fc-EPO com uma mutação que elimina o sítio de glicosilação, por exemplo, uma mutação do aminoácido correspondente a Asn297 de IgGl, ainda conseguem exibir uma queda acentuada na fase alfa. Adicionalmente, apesar de regiões CH2 de IgG2, quando não agregadas, geralmente não se ligarem a recetores de Fc, as proteínas Fc-EPO contendo regiões CH2 de IgG2 ainda exibem uma queda significativa durante a fase alfa.
Sem pretender ficar restringido pela teoria, a queda da concentração no soro de uma proteína de fusão Fc-EPO durante a fase alfa pode ser mediada por recetores da asialoglicoproteína via endocitose mediada por recetores da asialoglicoproteína. Proteínas de fusão Fc-EPO subsialiladas contêm resíduos galactose expostos que podem ser ligados pelo recetor da asialoglicoproteína, resultando em endocitose mediada pelo recetor da asialoglicoproteína. 34
Em resultado, proteínas de fusão Fc-EPO subsialiladas podem desaparecer rapidamente.
Fatores que influenciam a fase beta A queda das concentrações no soro das proteínas de fusão Fc-EPO na fase beta é menos acentuada quando comparada com a queda na fase alfa. Por exemplo, em ratinhos, entre as 8 e 24 horas após a administração, observa-se uma queda de 2 até 3 vezes das concentrações no soro das proteínas de fusão Fc-EPO. A diferença na queda durante a fase beta também é menos drástica entre diferentes proteínas Fc-EPO sintetizadas em diferentes linhas de células. No entanto, tal como na fase alfa, a extensão da sialilação está correlacionada com o comportamento farmacocinético na fase beta. Por exemplo, as proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK têm uma fase beta significativamente melhorada em comparação com proteínas de fusão Fc-EPO em tudo o resto idênticas sintetizadas em células NS/0. A endocitose mediada por recetores da EPO aparenta ser pelo menos parcialmente responsável pela queda da concentração no soro das proteínas de fusão Fc-EPO durante a fase beta. 0 Aranesp®, que tem afinidade de ligação reduzida para recetores da EPO em comparação com a eritropoietina humana normal, tem uma fase beta significativamente melhorada quando comparada com a eritropoietina humana normal, apesar dos perfis semelhantes da fase alfa.
As proteínas de fusão Fc-EPO da invenção exibem, em geral, uma fase beta melhorada em comparação com eritropoietina de ocorrência natural ou recombinante, indicando que a adição da porção Fc abranda significativamente o decréscimo da concentração no soro durante a fase beta. Também foi 35 observado que certas modificações de aminoácidos na porção Fc ou na porção de eritropoietina podem melhorar significativamente a fase beta. Por exemplo, mutações que eliminam o sitio de glicosilação na porção Fc melhoram a fase beta de proteínas de fusão Fc-EPO. Mutações que aumentam a estabilidade da porção de eritropoietina, por exemplo, mutações que produzem ligações dissulfureto (por exemplo, mutações NDS) na porção de eritropoietina, melhoram significativamente a fase beta da proteína de fusão Fc-EPO. Em geral, uma fase beta melhorada prolonga a semivida no soro terminal de uma proteína de fusão Fc-EPO.
Vias de eliminação de proteínas de fusão Fc-EPO Há várias vias de eliminação possíveis de uma molécula proteica de eritropoietina do corpo. Uma molécula proteica de eritropoietina de tipo selvagem ou de ocorrência natural pode ser eliminada do corpo por filtração renal e endocitose mediada por recetores. A eritropoietina submetida a endocitose é degradada de modo eficiente. Como ilustrado na Figura 3, é esperado que a adição de uma porção Fc à porção de eritropoietina resulte essencialmente em abolição da excreção da proteína de fusão Fc-EPO através do rim. Em consequência, a endocitose mediada por recetores é a principal via de eliminação de uma proteína de fusão Fc-EPO. Além disso, também é esperado que a adição de uma porção Fc à porção de eritropoietina reduza a degradação após a interiorização, pois é esperado que os recetores endossómicos FcRn reciclem a proteína de fusão de novo para fora da célula.
Em princípio, pelo menos três tipos de recetores podem mediar a eliminação da proteína de fusão Fc-EPO, nomeadamente o recetor de Fc, o recetor da EPO, e o recetor 36 da asialoglicoproteína. A eliminação da proteína de fusão Fc-EPO através do recetor de Fc deve ser significativamente reduzida utilizando um domínio CH2 derivado de IgG2 em vez de um CH2 derivado de IgGl na porção Fc. Os domínios CH2 derivados de IgG2 têm uma afinidade cerca de 100 vezes menor para FcyRI, que foi a afinidade mais elevada para IgGs, em comparação com domínios CH2 derivados de IgGl. A interação entre o CH2 derivado de IgG2 e FcyRI é indetetável na maior parte dos ensaios de ligação. No entanto, a atividade residual de ligação a FcyR do domínio CH2 derivado de IgG2 ainda pode desempenhar um papel na eliminação da proteína de fusão Fc-EPO porque a mutação de asparagina, que elimina o sítio de glicosilação no domínio CH2, reduz adicionalmente a ligação do recetor de Fc e melhora a farmacocinética da proteína de fusão Fc-EPO.
As mutações NDS têm o efeito de estabilizar a estrutura da eritropoietina e, em resultado, é esperado que reduzam a degradação da proteína de fusão Fc-EPO após a interiorização. As proteínas de fusão Fc-EPO contendo as mutações NDS têm propriedades farmacocinéticas melhoradas e semivida no soro aumentada. A sialilação aumenta as cargas negativas de proteínas de fusão Fc-EPO, reduzindo a afinidade de ligação da proteína de fusão Fc-EPO para o recetor da EPO. A sialilação também reduz o número de resíduos galactose expostos na proteína de fusão Fc-EPO, reduzindo a afinidade de ligação das proteínas de fusão Fc-EPO para os recetores da asialoglicoproteína. Em conformidade, como ilustrado na Figura 3, a sialilação reduz a endocitose mediada pelo recetor da EPO e endocitose mediada pelo recetor da asialoglicoproteína. Em consequência, proteínas de fusão 37
Fc-EPO altamente sialiladas exibem taxas de eliminação dramaticamente abrandadas, originando semividas no soro significativamente aumentadas.
Cada um dos fatores de adição de uma porção Fc, as alterações nas porções Fc e de eritropoietina, e sialilação reduzem a eliminação de proteinas de fusão Fc-EPO. Os efeitos combinados na eliminação e semivida no soro são aditivos ou multiplicativos.
Atividade in vitro e potência in vivo da proteína de fusão Fc-EPO A atividade in vitro de proteinas Fc-EPO pode ser testada num ensaio à base de células. Especificamente, a interação entre Fc-EPO e recetor da EPO pode ser determinada com base no ensaio de proliferação de células TF-1. As células TF-1 expressam recetores de EPO; em consequência, a proliferação de células TF-1, que é determinada pela incorporação de timidina tritiada, é uma função da atividade da eritropoietina (Hammerlling et al., (1996) J.
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, b4: 1455; Kitamura et al., (1989) J. Cellular Physiol, 140: 323). Na presente invenção, a proliferação de células TF-1 é uma função da interação entre a porção de eritropoietina e recetores da EPO. Especificamente, se uma porção de eritropoietina de uma proteina de fusão Fc-EPO tiver uma velocidade de associação reduzida para o recetor da EPO, a proteina Fc-EPO tem geralmente uma atividade reduzida num ensaio à base de células (marcada por um valor ED50 aumentado).
Dados de ensaios à base de células, que são relativamente fáceis de obter, estão geralmente correlacionados com a farmacocinética e potência in vivo da proteina Fc-EPO. 38
Atividade in vitro reduzida, indicando uma velocidade de associação reduzida para o recetor da EPO, está geralmente correlacionada com propriedades farmacocinéticas melhoradas e potência in vivo aumentada. Pelo contrário, atividade in vitro aumentada (marcada por um valor ED50 decrescido), indicando uma velocidade de associação aumentada para o recetor da EPO, está geralmente correlacionada com fracas propriedades farmacocinéticas e potência in vivo reduzida.
As atividades biológicas in vivo de proteínas de fusão Fc-EPO podem ser medidas por ensaios conduzidos em modelos animais, tais como, por exemplo, ratinhos e ratos. Exemplos de ensaios in vivo incluem mas não estão limitados a ensaios de hematócrito (HCT) e ensaios de reticulócitos. Os ensaios de HCT medem o volume de sangue ocupado por glóbulos vermelhos (GVs), e são realizados simplesmente por centrifugação de sangue em tubos capilares e medição da fração do volume total ocupado por GVs sedimentados. Os reticulócitos são novos GVs que recentemente se diferenciaram de células precursoras e são caracterizados por conterem vestígios de ácidos nucleicos das células precursoras. Os reticulócitos são medidos por triagem de glóbulos vermelhos num citómetro de fluxo após coloração com um corante de ácidos nucleicos, tal como, por exemplo, laranja de acridina ou laranja tiazolo, e contagem da fração corada. Tipicamente, o hematócrito e reticulócitos são medidos duas vezes por semana.
Num certo sentido, os dados de reticulócitos são um primeiro derivado dos dados do hematócrito. As contagens de reticulócitos são uma medida da taxa de produção de glóbulos vermelhos, ao passo que os hematócritos medem os glóbulos vermelhos totais. Numa experiência típica, os 39 hematócritos de animais administrados com proteínas de fusão Fc-EPO irão aumentar e depois regressar ao valor de referência. Quando os hematócritos são elevados e as proteínas Fc-EPO administradas desapareceram do sistema circulatório do animal, a contagem de reticulócitos diminui para valores inferiores ao valor de referência porque a eritropoiese é suprimida.
Os reticulócitos emergem normalmente da medula óssea 4 dias depois de os precursores ficarem comprometidos com GVs. No entanto, na presença de níveis elevados de eritropoietina, os reticulócitos abandonarão muitas vezes a medula óssea passados 1-3 dias após a administração.
Em resposta a uma injeção de proteínas Fc-EPO, as leituras do hematócrito aumentam, permanecem estacionárias, e depois regressam ao valor de referência num animal. Exemplos dessas respostas de hematócritos estão apresentados nas Figuras 4-6. A taxa máxima de decréscimo é cerca de 7% de volume de sangue por semana em ratinhos, que corresponde ao tempo de vida de GVs de cerca de 45 dias num ratinho, e cerca de 5% do volume de sangue por semana em ratos, que corresponde ao tempo de vida de GVs de cerca de 65 dias num rato. A taxa máxima de decréscimo representa, presumivelmente, a destruição de GVs na ausência de nova síntese. Se proteínas Fc-EPO biologicamente ativas permanecerem no sistema a uma concentração acima do limite para a eritropoiese, o nível do hematócrito permanecerá elevado e não diminuirá, mesmo que o nível de Fc-EPO biologicamente ativa não seja detetável em experiências de farmacocinética. 40
Foi descoberto que as propriedades farmacocinéticas de uma proteína Fc-EPO estão correlacionadas com a potência in vivo da proteína. Todas as características da presente invenção que aumentam a farmacocinética de uma proteína de fusão Fc-EPO, como discutido acima, também aumentam a potência in vivo em experiências com animais. Como mostrado na Tabela 1, essas características incluem, por exemplo, a adição da porção Fc, eliminação do sítio de glicosilação na porção Fc (por exemplo, substituição N^Q numa posição correspondente a Asn297 de IgGl), introdução das mutações NDS na porção de eritropoietina, e níveis elevados de sialilação por síntese da proteína Fc-EPO nas células BHK.
Tabela 1
Fatores que influenciam a farmacocinética e atividade biológica de proteínas Fc-EPO
Características Efeito na potência in vitro Efeito na farmaco- cinética Efeito na atividade in vivo Síntese em células BHK (versus células NS/0) Redução Aumento Aumento Adição de Fc Pequeno aumento Aumento Aumento Mutações NDS Nenhum Aumento Aumento N^Q Nenhum Aumento Aumento g2h (versus g4h) Aumento Aumento Aumento
Foi descoberto que, por porção de eritropoietina, Fcg2h (FN->AQ) -Epo e Fcg2h-EPO (NDS) produzidas a partir de células BHK exibem as melhores farmacocinéticas e as atividades biológicas in vivo mais potentes. Cada uma das Fcg2h(FN^AQ)-Epo e Fcg2h-EPO(NDS) tem uma semivida no soro mais longa e atividade in vivo mais potente por porção de eritropoietina do que o Aranesp®.
Síntese de proteínas de fusão Fc-EPO A proteína de fusão Fc-EPO da presente invenção pode ser produzida em células ou linhas de células adequadas, como 41 linhas de células humanas ou de outros mamíferos. Linhas de células adequadas incluem mas não estão limitadas a células de rim de hamster bebé (BHK), células de ovário de hamster chinês (CHO) (incluindo células deficientes em di-hidrofolato redutase (DHFR)), e células COS. Numa forma de realização preferida são utilizadas células BHK.
Para expressarem a proteína de fusão Fc-EPO em células hospedeiras adequadas (por exemplo, células BHK), sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão Fc-EPO são primeiramente introduzidas num vetor de expressão utilizando técnicas moleculares recombinantes comuns familiares aos profissionais. A sequência que codifica a porção de eritropoietina é preferivelmente otimizada quanto a codões para se obter expressão em nível elevado. A eritropoietina humana otimizada quanto a codões foi descrita na publicação PCT WO 01/36489 (isto é, Requerimento U.S. N° 09/708,506). Uma sequência exemplificativa de ácido nucleico que codifica uma porção de eritropoietina é proporcionada na SEQ ID NO: 1:
ÇÇCCÍ^CC^CGCCTCATtdX3TGACAGCeGAGTG€1^AÍ-mC^TACCXCTTGGA^CCAÍíJ3GJW3GC
CGaGAATATC^CGACCC^C^GTGCTáAAC^CTOCAGCfTGAATGAGMmTCACCaTGCCTGACA
GTGíAdAGCCCCTGCAACTGCÃTGTGGATAAAGGCGTC^QTGGCCl^CGCAdCÇSCÃCCACTCTGC
TTCC^CTCrGC^AGCCCm.GA.ajSGA&SÇCAfCTCCCCTCCAGATGCGCJCCTCAGCrGCrCCCCTC
CGCACAATC&GTGCTGACACTITCCGCAAACTCn^CCGAGTCTACTCrJ^TTtCCTCCGGGGAAA GCXGAAdCTGmC^mGGCmAC^CTG€CSGACAGa5<m£ÃGATGA (SEQ IB HOtl>
Sequências exemplificativas de ácidos nucleicos que codificam uma porção Fc preferida, por exemplo, uma porção Fc incluindo um domínio CH2 derivado de IgG2 e uma região conetora derivada de IgGl, foram descritas na Publicação de 42
Patente U.S. N° 20030044423 (isto é, Requerimento U.S. N° 10/093,958).
Em geral, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido de sinal (sequência líder). A sequência líder é clivada durante o processo de secreção. Uma sequência exemplificativa de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2) que codifica uma proteína Fc-EPO madura sem uma sequência líder está apresentada na Figura 7.
Vetores adequados incluem os que são adequados para expressão numa célula hospedeira de mamífero. Os vetores podem ser, por exemplo, plasmídeos ou vírus. O vetor conterá tipicamente os elementos seguintes: promotor e outros elementos reguladores "a montante", origem da replicação, sítio de ligação de ribossomas, sítio de terminação da transcrição, sítio poliligador, e marcador selecionável que sejam compatíveis com a utilização numa célula hospedeira de mamífero. Os vetores também podem conter elementos que permitem a propagação e manutenção também em células hospedeiras procarióticas. Vetores adequados para a presente invenção incluem mas não estão limitados a pdCs-Fc-X e vetores daí derivados, e phC10-Fc-X e vetores daí derivados.
Os vetores que codificam proteínas Fc-EPO são introduzidos em células hospedeiras por técnicas comuns de biologia celular, incluindo transfeção e técnicas virais. Por transfeção pretende-se designar a transferência de informação genética para uma célula utilizando DNA, RNA, ou polímero nucleotídico sintético isolados. Métodos de transfeção adequados incluem mas não estão limitados a 43 coprecipitação mediada por fosfato de cálcio (Sambrook et ai. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press), lipofeção (por exemplo, Lipofectamine Plus da Life Technologies de Rockville, Maryland), técnicas de transfeção mediada por DEAE-dextrano, fusão de lisozimas ou fusão de eritrócitos, raspagem, captação direta, choque osmótico ou de sucrose, microinjeção direta, microinjeção indireta - como via técnicas mediadas por eritrócitos -, fusão de protoplastos, ou sujeitando as células hospedeiras a correntes elétricas (por exemplo, eletroporação), para nomear apenas alguns. A lista acima de métodos de transfeção não é considerada exaustiva, pois sem dúvida que serão desenvolvidos outros procedimentos para introduzir informação genética em células.
Para facilitar a seleção das células hospedeiras contendo o ácido nucleico que codifica a proteina de fusão Fc-EPO, o ácido nucleico que codifica a proteina de fusão Fc-EPO é tipicamente introduzido com um marcador de seleção. 0 marcador de seleção pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico que está presente no mesmo vetor de expressão que codifica a proteina de fusão Fc-EPO. Alternativamente, o marcador de seleção pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico que está presente num vetor diferente. No último caso, os dois vetores podem ser cointroduzidos nas células hospedeiras por cotransfeção ou cotransdução. Marcadores de seleção adequados incluem, por exemplo, Higromicina B (Hyg B) e di-hidrofolato redutase (DHFR) . A expressão transitória é útil para a produção de proteínas em pequena escala e para análise rápida de uma proteína de 44 fusão Fc-EPO. As células hospedeiras contendo a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão Fc-EPO são mantidas em condições adequadas para expressão da proteína de fusão Fc-EPO codificada. Podem ser utilizados métodos, condições e meios comuns de cultura de células para a manutenção das células hospedeiras que expressam a proteína de fusão Fc-EPO. Células transfetadas de modo estável são muitas vezes preferidas para produção em larga escala, expressão em nível elevado, e para outras finalidades. 0 ácido nucleico mantido de modo estável pode estar presente em qualquer de várias configurações na célula hospedeira. Por exemplo, numa forma de realização, a sequência de ácido nucleico mantida de modo estável é integrada num cromossoma de uma célula hospedeira. Noutras formas de realização, a sequência de ácido nucleico mantida de modo estável pode estar presente na forma de uma série extracromossómica, na forma de um cromossoma artificial, ou noutra configuração adequada.
Numa forma de realização, células BHK são utilizadas para sintetizar a proteína de fusão Fc-EPO. Para se obter uma célula BHK transfetada de modo estável, uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão e uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção são introduzidas em células BHK, preferivelmente por métodos de eletroporação, fusão de protoplastos ou lipofeção. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão e a sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção podem estar presentes no mesmo vetor de expressão. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão e a 45 sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção podem estar presentes em vetores separados. 0 marcador de seleção preferido para estabelecer uma célula BHK estável é Hyg B. Também podem ser utilizados outros marcadores de seleção, como DHFR. Clones transfetados de modo estável são isolados e propagados pelo seu crescimento na presença de Hyg B numa concentração adequada (por exemplo, 200, 250, ou 300 microgramas/mL), em meio comum de cultura de tecidos, tal como, por exemplo, MEM+FBS, meio DMEM/F-12, ou VP-SFM disponibilizados pela Life Technologies, e outros meios adequados. Os niveis de expressão da proteína de fusão Fc-EPO podem ser monitorizados por ensaios comuns de deteção de proteínas, tais como, por exemplo, teste de ELISA, Coloração "Western", coloração em pontos, ou outros ensaios adequados, em amostras de sobrenadantes e meio de cultura. Clones com expressão elevada são selecionados e propagados em larga escala.
Tipicamente, a célula BHK é uma linha de células aderente e habitualmente cresce em meio contendo soro, como MEM + 10% soro fetal de bovino (FBS) inativado pelo calor. No entanto, as células BHK podem ser adaptadas para crescimento em suspensão e num meio sem soro, tal como, por exemplo, VP-SFM (Invitrogen Corp., # catálogo 11681-020) ou Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp., # catálogo 12309). Um processo de adaptação exemplificativo é descrito no Exemplo 3. As células BHK adaptadas para crescimento num meio sem soro podem ser adicionalmente adaptadas para crescimento num meio sem proteínas, tal como, por exemplo, DMEM/F-12 (Invitrogen Corp., # catálogo 11039-021). Um procedimento de adaptação exemplificativo é descrito no Exemplo 3. Preferivelmente, DMEM/F-12 é suplementado com aminoácidos 46 adequados e outros componentes, tais como, por exemplo, Glutamina, hidrolisados de proteínas, tais como HyPep 4601 (Quest International, # catálogo 5Z10419) e HyPep 1510 (Quest International, # catálogo 5X59053), Etanolamina (Sigma, # catálogo E0135), e Tropolona (Sigma, # catálogo T7387). Concentrações adequadas de cada suplemento podem ser determinadas empiricamente pelos profissionais empregando experimentação de rotina.
As proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK que crescem num meio sem proteínas são sialiladas em maior extensão e exibem sialilação mais homogénea do que a proteína correspondente sintetizada em células que crescem num meio contendo soro (por exemplo, MEM + FBS) ou um meio sem soro mas não sem proteínas (por exemplo, VP-SFM) . Adicionalmente, a proteína Fc-EPO obtida deste modo está substancialmente não agregada, isto é, aproximadamente 98 % do rendimento total não está agregada. O rendimento proteico a partir de células BHK que crescem num meio sem proteínas é semelhante ao de células BHK que crescem em meio contendo soro, isto é, acima de 10 microgramas/mililitro (mcg/mL). Assim, o crescimento em suspensão e/ou num meio sem proteínas oferecem algumas vantagens, incluindo 1) farmacocinética melhorada da proteína de fusão Fc-EPO resultante de sialilação aumentada; e 2) facilitação de processos de purificação a jusante, pois as proteínas podem ser purificadas de células que crescem em modo de suspensão e num meio desprovido de proteína.
Purificação A purificação de Fc-EPO é realizada seguindo procedimentos comuns de GMP conhecidos dos profissionais. A proteína é 47 geralmente purificada até à homogeneidade ou perto da homogeneidade. São geralmente preferidas purificações cromatográficas, como as envolvendo cromatografia em coluna. Em geral, um esquema de purificação para uma proteina de fusão Fc-EPO pode incluir mas não está limitado a um passo inicial de captura da proteina; um passo de inativação virai; um ou mais passos de polimento; um passo de remoção virai; e um passo de concentração e/ou formulação da proteina. Por exemplo, materiais de resina para cromatografia que se ligam à porção Fc da proteina de fusão podem ser utilizados para capturar proteinas Fc-EPO. Materiais de resina adequados incluem mas não estão limitados a resinas acopladas à Proteina A. Podem ser incluídos passos de polimento para remover componentes contaminantes. Por exemplo, cromatografia com hidroxiapatite, cromatografia com Sefarose Q, cromatografia por exclusão de tamanhos, ou cromatografia de interação hidrofóbica podem ser utilizados para remover contaminantes. Um método de purificação utilizando cromatografia em coluna à base de Proteina A para ligação da porção Fc e purificação da proteina de fusão Fc-EPO é descrito no Exemplo 12, bem como um método opcional para inativação e remoção do virus. As proteinas purificadas são geralmente concentradas para uma concentração desejada utilizando ultrafiltração; são diafiltradas para um tampão de formulação adequado; esterilizadas por filtração; e distribuídas em frascos.
Administração
Composições farmacêuticas e vias de administração A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas contendo a proteína Fc-EPO produzida de 48 acordo com a presente invenção. Estas composições farmacêuticas podem ser utilizadas para estimular a produção de glóbulos vermelhos e para prevenir e tratar anemia. Entre os estados que podem ser tratados pela presente invenção incluem-se anemia associada a um decréscimo ou perda da função renal (falha renal crónica), anemia associada a terapia mielossupressora, como fármacos quimioterapêuticos ou antivirais (como AZT), anemia associada à progressão de cancros não mieloides, anemia associada a infeções virais (como VIH), e anemia de doença crónica. Também podem ser tratados estados que podem conduzir a anemia num indivíduo saudável, como uma perda antecipada de sangue durante cirurgia. Em geral, qualquer estado que possa ser tratado com rHuEpo também pode ser tratado com a proteína de fusão Fc-EPO da invenção.
Formulações contendo proteínas Fc-EPO
Em geral, uma formulação contém uma proteína Fc-EPO, um tampão e um surfactante em forma líquida ou sólida. Formulações sólidas também incluem mas não estão limitadas a formulações liofilizadas, liofilizadas por pulverização ou secas por pulverização. Formulações líquidas baseiam-se preferivelmente em água, mas podem conter outros componentes, tais como, por exemplo, etanol, propanol, propanodiol ou glicerol, para nomear apenas alguns.
As proteínas Fc-EPO são formuladas em soluções aquosas após procedimentos comuns de GMP conhecidos dos profissionais. Em geral, uma formulação é gerada por mistura de volumes definidos de soluções aquosas compreendendo constituintes adequados em concentrações adequadas. Por exemplo, uma formulação contém tipicamente a proteína Fc-EPO numa concentração desde 0,1 até 200 mg/mL, preferivelmente desde 49 0,2 até 10 mg/mL, mais preferivelmente desde 0,5 até 6 mg/mL.
Componentes de tamponamento incluem quaisquer substâncias fisiologicamente compatíveis que sejam capazes de regular o pH, tais como, por exemplo, sais citrato, sais acetato, sais de histidina, sais succinato, sais maleato, sais fosfato, sais lactato, seus ácidos ou bases respetivas ou suas misturas. Componentes de tamponamento habitualmente utilizados são sais citrato e/ou os seus ácidos livres. Uma formulação contém tipicamente um componente de tamponamento numa concentração desde 10 até 100 mmol/L, preferivelmente desde 2 até 20 mmol/L, mais preferivelmente 10 mmol/L.
Surfactantes para formulações de Fc-EPO podem consistir em quaisquer excipientes utilizados como surfactantes em composições farmacêuticas, preferivelmente ésteres de polietileno-sorbitano (Tweens®), tais como Monolaurato de polioxietileno(20)-sorbitano, Monopalmitato de polioxietileno(20)-sorbitano e Monoestearato de polioxietileno(20)-sorbitano, e copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Uma formulação contém tipicamente um surfactante numa concentração desde 0,001 até 1,0 % p/v, preferivelmente desde 0,005 até 0,1 % p/v, mais preferivelmente desde 0,01 até 0,5 % p/v. por exemplo,
Uma formulação também pode conter um ou mais aminoácidos. Aminoácidos adequados incluem mas não estão limitados a arginina, histidina, ornitina, lisina, glicina, metionina, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, e triptofano. Numa forma de realização, uma formulação de Fc-EPO contém glicina. Preferivelmente, os aminoácidos são utilizados em formas de sal, por exemplo, um sal 50 cloridrato. Concentrações aplicáveis de aminoácidos variam desde 2 até 200 mmol/L, ou desde 50 até 150 mmol/L.
Adicionalmente, uma formulação pode conter açúcares, tais como sucrose, trealose, sorbitol; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou glutationa; conservantes, tais como fenol, m-cresol, metil- ou propilparabeno; clorbutanol; tiomersal; cloreto de benzalcónio; polietilenoglicóis; ciclodextrinas e outros componentes adequados. É desejável que uma formulação de Fc-EPO seja isotónica. Por exemplo, a osmolalidade de uma formulação pode variar desde 150 até 450 mOsmol/kg. Formulações farmacêuticas têm de ser estáveis durante o tempo de armazenamento desejado à temperatura de armazenamento desejada, como a 2-8°C, ou à temperatura ambiente. Uma formulação útil contendo uma proteina Fc-EPO é bem tolerada fisiologicamente, é fácil de produzir, pode ser doseada de modo rigoroso, e é estável durante o armazenamento a 2°C - 8°C ou 25°C, durante múltiplos ciclos de congelação-descongelação e "stress" mecânico, bem como outros tipos de "stress", como armazenamento durante pelo menos 3 meses a 40°C. A estabilidade de formulações de Fc-EPO pode ser testada num teste de "stress". Um teste de "stress" exemplificativo é descrito no Exemplo 13.
Administração
As composições terapêuticas contendo proteínas de fusão Fc-EPO produzidas de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um hospedeiro mamífero por qualquer via. Assim, consoante o apropriado, a administração pode ser oral ou parentérica (por exemplo, i.v., i.a., s.c., i.m.), incluindo as vias de administração intravenosa e 51 intraperitoneal. Adicionalmente, a administração pode ser realizada por injeções periódicas de um bolus do agente terapêutico ou pode ser tornada mais continua por administração intravenosa ou intraperitoneal a partir de um reservatório que é externo (por exemplo, um saco i.v.). Em certas formas de realização, o produto terapêutico da presente invenção pode ter qualidade farmacêutica. Isto é, certas formas de realização cumprem os padrões de pureza e controlo de qualidade requeridos para administração a humanos. Aplicações veterinárias também pertencem ao significado pretendido, como usado aqui.
As formulações, para utilização veterinária e utilização clinica humana, dos agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção incluem tipicamente esses agentes terapêuticos associados a um transportador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, outro (s) ingrediente(s). 0(s) transportador(es) pode(m) ser "aceitável(aceitáveis)" no sentido de ser(em) compatível(compatíveis) com os outros ingredientes das formulações e não ser(em) prejudicial(prejudiciais) para o seu recetor. A este respeito, é pretendido que transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluam quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e afins, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na área. Excetuando o caso de qualquer meio ou agente convencional ser incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições é contemplada. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. As formulações podem ser 52 convenientemente apresentadas em forma galénica unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na área da farmácia/microbiologia. Em geral, algumas formulações são preparadas por associação dos agentes terapêuticos a um transportador liquido ou um transportador sólido finamente dividido ou ambos, e então, se necessário, configuração do produto na formulação desej ada.
Uma composição farmacêutica da invenção é formulada de modo a ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração oral ou parentérica, por exemplo, intravenosa, intradérmica, por inalação (por exemplo, após nebulização), transdérmica (tópica), transmucosa, nasal, bucal, e retal. Soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica, ou subcutânea podem incluir os componentes seguintes: um diluente esterilizado, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como ácido etilenodiaminotetracético; tampões, como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajustamento da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
Um método preferido de administração de produtos de proteínas Fc-EPO da invenção é pelas vias parentéricas (por exemplo, IV, IM, SC, ou IP), e as composições administradas incluem habitualmente quantidades terapeuticamente eficazes 53 de produto em combinação com diluentes, transportadores e/ou adjuvantes aceitáveis. É esperado que dosagens eficazes variem substancialmente, dependendo do estado tratado, mas é presentemente esperado que doses terapêuticas se situem no intervalo de 0,2 até 2 mcg/kg de peso do corpo do material ativo. Diluentes comuns, como albumina do soro humano, são contemplados para composições farmacêuticas da invenção, bem como transportadores comuns, como solução salina. Materiais adjuvantes adequados para utilização em composições da invenção incluem compostos independentemente notados quanto a efeitos estimuladores da eritropoiese, tais como testosteronas, estimuladores de células progenitoras, fator de crescimento do tipo insulina, prostaglandinas, serotonina, AMP ciclico, prolactina e tri-iodotironina, bem como agentes geralmente empregues no tratamento de anemia aplástica, tais como metenoleno, estanozolol e nandrolona. Ver, por exemplo, Resegotti, et al. (1981), Panminerva Medics, 23j_ 243-248; McGonigle, et al., (1984) Kidney Int.r 2_5(2), 437-444; Pavlovic-Kantera, et al., (1980) Expt. Hematol, 8_ (Suplemento 8), 283-291; e Kurtz, (1982) FEBS Letters, 14a(1), 105-108.
Como adjuvantes também são contempladas substâncias para as quais foi relatado que aumentam os efeitos ou têm um efeito sinergético com Fc-EPO, tais como os agonistas adrenérgicos, hormonas da tiroide, androgénios e BPA, bem como as classes de compostos designados "fatores eritropoiéticos hepáticos" (ver Naughton et al., (1983) Acta. Haemat., 6_9, 171-179) e "eritrotropinas", como descrito por Congote et al. em Abstract 364, Proceedlngs 7 th International Congress of Endocrinology, Cidade do Quebeque, Quebeque, 1-7 de julho de 1984; Congote (1983), 54
Biochem. Biophys. Res. Comm., 115(2), 447-483; e Congote, (1984), Anal Biochem., 140, 428-433, e "eritrogeninas", como descrito em Rothman, et al., (1982), J. Surg. Oncol. 2_0, 105-108.
Soluções úteis para administração oral ou parentérica podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na área farmacêutica, descritos, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Gennaro, A., editor), Mack Pub., 1990. Formulações para administração parentérica também podem incluir glicocolato para administração bucal, metoxissalicilato para administração retal, ou ácido citrico para administração vaginal. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico. Supositórios para administração retal também podem ser preparados por mistura do fármaco com um excipiente não irritante, como manteiga de cacau, outros glicéridos, ou outras composições que são sólidas à temperatura ambiente e liquidas a temperaturas do corpo. Formulações também podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis, como polietilenoglicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e afins. Formulações para administração direta podem incluir glicerol e outras composições de viscosidade elevada. Outros transportadores parentéricos potencialmente úteis para estes produtos terapêuticos incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, e lipossomas. Formulações para administração por inalação podem conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato e desoxicolato, ou soluções oleosas 55 para administração na forma de gotas nasais, ou como um gel a ser aplicado de modo intranasal. Enemas de retenção também podem ser utilizados para distribuição retal.
Composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções (quando solúveis em água) ou dispersões aquosas esterilizadas e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Para administração intravenosa, transportadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremofor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição pode ser esterilizada e pode ser fluida no sentido de poder ser facilmente manuseada com seringa. Pode ser estável nas condições de preparação e armazenamento e pode ser conservada contra a ação contaminadora de microrganismos, como bactérias e fungos. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e afins), e respetivas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, utilizando um revestimento como lecitina, mantendo a dimensão requerida das partículas no caso de dispersão e utilizando surfactantes. A ação de microrganismos pode ser prevenida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e afins. Em muitos casos será preferível incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio. Pode obter-se absorção prolongada das composições injetáveis incluindo na composição um agente que retarda a 56 absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Podem preparar-se soluções injetáveis esterilizadas incorporando o composto ativo, na quantidade requerida, num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, consoante o necessário, seguido de esterilização por filtração. Em geral, preparam-se dispersões por incorporação do composto ativo num veículo esterilizado que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, métodos de preparação incluem secagem por vácuo e liofilização, que origina um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma respetiva solução previamente filtrada com esterilização.
Numa forma de realização, os produtos terapêuticos são preparados com transportadores que irão conferir proteção contra eliminação rápida do corpo, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos de preparação dessas formulações serão claros para os profissionais. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente da Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossómicas também podem ser utilizadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos dos profissionais, por exemplo, como 57 descrito na Patente U.S. N° 4,522,811. Também podem ser utilizados microssomas e microparticulas.
Composições orais ou parentéricas podem ser formuladas em forma galénica unitária, por facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma galénica unitária refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, associada ao necessário transportador farmacêutico. A especificação das formas galénicas unitárias da invenção é ditada e depende diretamente das caracteristicas únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e das limitações inerentes à área da formação de composições desse composto ativo para o tratamento de indivíduos.
Determinação da quantidade terapeuticamente eficaz de Fc-EPO e frequência da dosagem
Em geral, os produtos terapêuticos contendo proteínas de fusão Fc-EPO produzidas de acordo com a presente invenção podem ser formulados para administração parentérica ou oral a humanos ou outros mamíferos, por exemplo, em quantidades terapeuticamente eficazes, isto é, quantidades que proporcionam concentrações apropriadas do fármaco num tecido alvo durante um período de tempo suficiente para induzir o efeito desejado. Mais especificamente, como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de proteínas de fusão Fc-EPO que origina um aumento do hematócrito para um hematócrito alvo, ou para um intervalo de hematócrito alvo, que proporcione benefício a um paciente, ou então, alternativamente, que mantenha um paciente num hematócrito alvo, ou num intervalo 58 de hematócrito alvo. A quantidade irá variar de um indivíduo para outro e irá depender de alguns fatores, incluindo o estado físico global do paciente, gravidade e causa subjacente de anemia e hematócrito alvo final para o paciente individual. Um hematócrito alvo é tipicamente pelo menos cerca de 30%, ou está situado num intervalo de 30%-38%, preferivelmente superior a 38% e mais preferivelmente 40%-45%. Diretrizes gerais relativas a intervalos de hematócrito alvo para rHuEpo também se encontram no folheto da embalagem de EPOGEN® datado de 23/12/96 e são 30%-36%, ou alternativamente 32%-38%, como afirmado aí. É entendido que esses alvos irão variar de um indivíduo para outro, de modo que o critério do clínico pode ser apropriado na determinação de um hematócrito alvo real para qualquer paciente determinado. Ainda assim, a determinação de um hematócrito alvo pertence ao âmbito do profissional.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína Fc-EPO pode ser facilmente determinada pelo profissional. O Exemplo 15 apresenta um protocolo clínico em que um dos objetivos é determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Fc-EPO numa dosagem uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, e uma vez por mês. Por exemplo, um intervalo de dosagem para administração uma vez por semana ou uma vez em cada duas semanas vai desde cerca de 0,075 até cerca de 4,5 mcg de Fc-EPO por kg por dose. Um intervalo de dosagem para administração uma vez por mês é 0,45 até 4,5 mcg de Fc-EPO por kg por dose. A concentração eficaz da proteína de fusão Fc-EPO da invenção a ser distribuída numa composição terapêutica irá variar dependendo de alguns fatores, incluindo a dosagem final desejada do fármaco a ser administrado e a via de 59 administração. A dosagem preferida a ser administrada também depende, provavelmente, de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, do estado de saúde geral do paciente particular, da eficácia biológica relativa (por exemplo, nivel de sialilação) do agente terapêutico distribuído, da formulação do agente terapêutico, da presença e tipos de excipientes na formulação, e da via de administração. Nalgumas formas de realização, o agente terapêutico desta invenção pode ser administrado a um indivíduo utilizando unidades de dosagem típicas deduzidas dos estudos com mamíferos utilizando primatas não humanos e roedores. Como descrito acima, uma unidade de dosagem refere-se a uma dose unitária apta a ser administrada a um paciente, e que pode ser facilmente manuseada e embalada, permanecendo como uma dose unitária física e biologicamente estável compreendendo o agente terapêutico como tal ou uma mistura deste com diluentes ou transportadores farmacêuticos sólidos ou líquidos. A frequência da dosagem para um produto terapêutico contendo a proteína de fusão Fc-EPO irá variar dependendo do estado a ser tratado e do hematócrito alvo, mas em geral será menor do que três vezes por semana. A frequência da dosagem pode ser cerca de uma ou duas vezes por semana. A frequência da dosagem também pode ser menor do que cerca de uma vez por semana, por exemplo, cerca de uma vez em cada duas semanas (cerca de uma vez por 14 dias) , uma vez por mês ou uma vez em cada dois meses. É entendido que as frequências da dosagem realmente utilizadas podem diferir um pouco das frequências divulgadas aqui devido a variações de respostas por diferentes indivíduos à eritropoietina e seus análogos; é pretendido que o termo "cerca de" reflita essas variações. 60 A invenção também proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ferro de modo a manter eritropoiese aumentada durante a terapia. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada pelo profissional com base em terapia com rHuEpo. Adicionalmente, o agente terapêutico da presente invenção pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outras moléculas que se sabe exercerem um efeito benéfico na doença particular ou indicação de interesse. Apenas a título exemplificativo, cofatores úteis incluem cofatores que aliviam sintomas, incluindo antisséticos, antibióticos, agentes antivirais e antifúngicos e analgésicos e anestésicos.
Pró-fármaco
Os agentes terapêuticos da invenção também incluem os derivados "pró-fármacos". O termo pró-fármaco refere-se a um derivado farmacologicamente inativo (ou parcialmente inativo) de uma molécula paterna que requer biotransformação, espontânea ou enzimática, no organismo para libertar ou ativar o componente ativo. Pró-fármacos são variações ou derivados dos agentes terapêuticos da invenção que têm grupos aptos a serem clivados em condições metabólicas. Os pró-fármacos tornam-se nos agentes terapêuticos da invenção, que são farmaceuticamente ativos in vivo, quando sofrem solvólise em condições fisiológicas ou sofrem degradação enzimática. Um pró-fármaco desta invenção pode ser denominado simples, duplo, triplo, e assim por diante, dependendo do número de passos de biotransformação necessários para libertar ou ativar o componente de fármaco ativo no organismo, e indicando o número de funcionalidades presentes numa forma do tipo precursora. Formas de pró-fármacos oferecem muitas vezes 61 vantagens de solubilidade, compatibilidade tecidual, ou libertação retardada no organismo mamifero (ver Bundgard, (1985) "Design of Prodrugs", páginas 7-9, 21-24, Elsevier, Amesterdão; Silverman, (1992) "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", páginas 352-401, Academic Press, San Diego, Califórnia). Além disso, os derivados pró-fármacos de acordo com esta invenção podem ser combinados com outras caracteristicas para aumentar a biodisponibilidade.
Expressão in vivo A proteína de fusão Fc-EPO da presente invenção pode ser proporcionada por métodos de expressão in vivo. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO pode ser vantajosamente proporcionado diretamente a um paciente que sofre de uma perturbação ou deficiência hematopoiética, ou pode ser proporcionado a uma célula ex vivo, seguido da administração da célula viva ao paciente. Métodos de terapia genética in vivo conhecidos na área incluem proporcionar DNA purificado (por exemplo, tal como num plasmídeo), proporcionar o DNA num vetor virai, ou proporcionar o DNA num lipossoma ou outra vesícula (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5,827,703, que divulga transportadores lipídicos para utilização em terapia genética, e Patente U.S. N° 6,281,010, que proporciona vetores adenovirais úteis em terapia genética).
Também são conhecidos métodos de tratamento de doenças por implantação de uma célula que foi modificada para expressar uma proteína recombinante. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5,399,346, que divulga métodos de introdução de um ácido nucleico numa célula humana primária para introdução num humano. 62 Métodos de expressão in vivo são particularmente úteis para distribuir uma proteína diretamente em tecidos ou compartimentos celulares alvo sem purificação. Na presente invenção, terapia genética utilizando a sequência que codifica Fc-EPO pode ter aplicação numa variedade de estados de doença, perturbações e estados de irregularidade hematológica, incluindo anemia, em particular correção de anemia de um tipo associado a falha renal crónica e afins. Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO pode ser inserida numa cassete de transcrição ou expressão apropriada e introduzida num mamífero hospedeiro na forma de DNA nu ou complexada com um transportador apropriado. A monitorização da produção da proteína Fc-EPO ativa pode ser efetuada por hibridização de ácidos nucleicos, ELISA, hibridização "Western", e outros métodos adequados conhecidos do profissional.
Verificou-se que uma pluralidade de tecidos pode ser transformada após administração sistémica de transgenes. A expressão de DNA exógeno após injeção intravenosa de um complexo transportador lipídico catiónico/DNA exógeno num hospedeiro mamífero foi mostrada em múltiplos tecidos, incluindo linfócitos T, sistema reticuloendotelial, células endoteliais cardíacas, células pulmonares, e células da medula óssea, por exemplo, células hematopoiéticas derivadas da medula óssea. A tecnologia de distribuição de terapia genética in vivo, como descrita na Patente U.S. N° 6,627,615, é não tóxica em animais, e foi mostrado que a expressão de transgenes se prolonga durante pelo menos 60 dias após uma única administração. O transgene não aparenta ser integrado no DNA da célula hospedeira em níveis detetáveis in vivo, 63 medido por análise "Southern", sugerindo que esta técnica de terapia genética não causará problemas para o mamífero hospedeiro alterando a expressão de genes celulares normais que ativam oncogenes causadores de cancro, ou desligando genes de supressão tumoral que previnem cancro.
Exemplos
Alguns dos exemplos descrevem formas de realização que são adequadas como compostos de referência para as formas de realização reivindicadas.
Exemplo 1. Construções que codificam proteínas de fusão Fc-EPO 0 plasmídeo phC10-Fcg2h (FN->AQ) -M1-EP0, que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO contendo uma porção de eritropoietina normal, e o plasmídeo phC10-Fcg2h (FN->AQ) -Ml-EPO(NDS), que codifica uma proteína de fusão Fc-EPO com mutações NDS, foram construídos do modo seguinte. A sequência de ácido nucleico que codifica a eritropoietina humana foi otimizada quanto a codões para expressão elevada em células de mamífero. Por exemplo, a SEQ ID NO: 3 mostra um exemplo de sequências codificadoras de eritropoietina humana madura com codões modificados para otimizar a tradução. A sequência da extremidade 5' também foi modificada de modo a incluir um sítio Sma I para facilitar a subclonagem. 64 SBQDDN0:3 AGCJft©Q<ÍCÍÉ^íttó^A.^CAO^CcGSCTGTGCTí*^CACTG€AGCI*!I^ÂA.TGAGAAçâTÇACcG'rg
CCbímaiCOil^f^T^TCTAmCCfSSRàSMmTSGM^KÍ^cCÃGOWSÍSCqS^ftaAAaT
glXK5C^G^e(rraQCCCTeCTGTCSGAACSCTGTCC'rGCGGGQCCAtiGCCCTGTTGSTCÃACXCrT
CCO^CGTC^AGCCCCTGCaaCTeí^TGTGQATA^CC^TfAGT^CCTtCGCAGCCTCACC
Ac^ci^crra^scTefí^a^Gccíme^cíGA^ccATCTCCCCTco^cmTGc^ccrcítGcitic
TCCeCTCC^cAcmTOÃCIS^aACACTTTCC^CftAaCTCtTCCQftCTCmCTCCAivXtíCCTCC ©SGímAASCimi^TameitímGGgeAQQCCTgeCGGACAGÍSGCACmaATCSACtcgãS (Caracteres em minúsculas indicam diferenças de bases relativamente à sequência codificadora da eritropoietina humana de tipo selvagem. É previsto que as alterações aumentem o nivel de expressão em células de mamifero, mas que não alterem a sequência proteica expressa.)
Foram introduzidas mutações NDS na porção da eritropoietina por mutagénese dirigida a sitios, como descrito na Publicação PCT WO 01/36489. Por exemplo, foi utilizado um fragmento de DNA Xma I-Xho I contendo uma forma da sequência codificadora da eritropoietina humana com mutações resultantes nas substituições de aminoácidos His32Gly, Cys33Pro, Trp88Cys, e Pro90Ala, como divulgado no documento WOOl/36489. A sequência proteica correspondente está apresentada na SEQ ID NO: 4.
Ah PRLI CDSH^/LERYtlrEAKS AEKITTGCAEGPS LNEÍí XTV PDTKNW YAW KRMEVGQQAVEWQ ΚΤΙΤΜίΤΡΡΚΑ^ΡΚ^^βύΡΙΓίβΚ^ΕΙιΧΤΟΕΑύΚΤ'δΒΕ (SEQ ID NQ:4)
Uma porção Fc hibrida, incluindo um dominio CH2 derivado de IgG2 e uma região conetora derivada de IgGl, foi construída como descrito na Publicação de Patente U.S. N° 20020147311 e, por exemplo, no documento WO 01/058957. 65 0 fragmento de DNA Xma I-Xho I que codifica uma forma de eritropoietina foi inserido num vetor plasmídico, por exemplo, pdCs-Fc-X, que codifica uma região conetora alterada de IgGl e uma região CH2 e CH3 de IgG2, com a exceção de ter havido dois conjuntos de mutações (referidas aqui como mutações do conjunto Ml) que originaram substituições de aminoácidos na região do terminal C de CH3, de modo que a sequência na junção do terminal C de CH3 e do terminal N de EPO é a seguinte: .. .. TSKBATATPSA-APP&LX----(SBQIDNQ;5) 0 primeiro conjunto de mutações, que altera a sequência KSLSLSPG (SEQ ID NQ:6) da região CH3 de IgG2 em ksatatpg (SEQ ID NG;7):t é divulgada no documento WO 02/079232. 0 efeito da substituição de Leu-Ser-Leu -Ser (posição 3 até posição 6 da SEQ ID NO: 6) por Ala-Thr- Ala-
Thr (posição 3 até posição 6 da SEQ ID NO: 7) é remover potenciais epítopos não próprios de células T humanas que podem surgir porque a junção entre Fc humana e eritropoietina humana contém sequências peptídicas não próprias. 0 segundo conjunto, que consiste na única substituição de aminoácidos K em A no aminoácido C-terminal da região CH3, é divulgado no documento WO 01/58957. O vetor de expressão pdCs-Fc-X para a expressão de proteínas de fusão de Fc foi descrito por Lo et al., (1998) Protein Engineering 11_: 495. O plasmídeo phC10-Fc-X foi construído a partir de pdCs-Fc-X substituindo a região codificadora do gene da di-hidrofolato redutase (DHFR), que confere resistência ao metotrexato, pelo gene que confere 66 resistência à Higromicina B. Um fragmento de DNA de Higromicina B Nhe I/Nsi I foi obtido por amplificação por PCR do gene da Higromicina B a partir do plasmideo modelo pCEP4 (Invitrogen) utilizando os "primers" S^CTAGCTTGGTGCCCTCATGAAAAAGCCTQAACTC - 3' (SBQ ID MO: 8) e S'-ATGCA^rCAGTfAGCCrCCCCCATC-S^ (SBQX3DHO:93. 0 fragmento de PCR foi clonado no vetor de clonagem de TA pCR2.1 (Invitrogen), e a sua sequência foi confirmada. 0 plasmideo phC10-Fcg2h-Ml-EPO(NDS) foi gerado por uma ligação tripla dos fragmentos de DNA Nhe I/Afl I e Afl II/Nsi I de pdCs-Fcg2h-Ml-EP0(NDS) e do fragmento da Higromicina B Nhe I/Nse I.
Adicionalmente, uma mutação conducente a uma substituição dupla de aminoácidos, "FN>AQ", na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser no dominio CH2 da cadeia pesada de IgG2, que elimina um potencial epitopo de células T e glicosilação N-ligada na porção Fc, foi introduzida por mutagénese por PCR. Os "primers" mutagénicos 5’-AGCÀ^CCCAGAGCACGTTCasmrGGWCSEQIDNDaO} e GAACGTGCfCTOQCíCCTGCTCCTCCCGT^* (SEQ JDD ΝΟ:11) foram emparelhados, respetivamente, com um "primer" a jusante contendo um sitio Sac II (SEQ LT> MQ:!2) e um "primer" a montante contendo um sitio Pvu II ShCCCâ.GCTgGGTGCTGA&ACGT- T (SEQ 3P NO:l 3), e dois fragmentos de DNA sobrepostos foram amplificados a partir do DNA modelo pdC10-Fcg2h-Ml-EPO(NDS) . Numa segunda ronda de amplificação, um fragmento Pvu II/Sac II contendo a mutação (FN^AQ) foi amplificado utilizando o "primer" a montante (SEQ ID NO: 13) e o "primer" a jusante (SEQ ID NO: 12) a partir dos produtos de PCR da primeira ronda de amplificação. 0 fragmento Pvu II/Sac II foi clonado num 67 vetor de TA pCR2.1 (Invitrogen) , e a sua sequência foi verificada. A construção pdC10-Fcg2h(FN>AQ)-M1-EP0(NDS) foi gerada a partir de uma ligação tripla do fragmento Pvu II/Sac II, um fragmento Xho I/Sac II de pdC10-Fcg2h-Ml-EPO, e um fragmento Xho Ι/Pvu II de pdClO-Fcg2h-Ml-EPO(NDS).
Para introduzir a mutação FN>AQ no plasmídeo phC10-Fcg2h-M1-EP0, os fragmentos de DNA apropriados de phC10-Fcg2h-Ml-EPO e de pdC10-Fcg2h (FN-.AQ) -M1-EP0 foram combinados. Ambas as construções phC10-Fcg2h-Ml-EPO e pdC10-Fcg2h(FN^AQ)-Ml-EPO foram digeridas com Xho I e Xba I, e o fragmento de phC10-Fcg2h-Ml-EPO(NDS) Xho Ι/Xba I de 5,7 kb foi ligado ao fragmento de pdC10-Fcg2h(FN^AQ)-M1-EP0 de 1,9 kb, gerando phC10-Fcg2h (FN-»AQ) -M1-EP0.
Para introduzir a mutação FN^AQ no plasmideo phC10-Fcg2h-Ml-EPO(NDS), os dois fragmentos digeridos com Xho I/Sma I apropriados de phC10-Fcg2h-Ml-EPO(NDS) e de phClO-Fcg2h (FN->AQ) -M1-EP0 foram ligados, gerando phClO-Fcg2h (FN-+AQ) -M1-EP0 (NDS) . A sequência de aminoácidos de Fc-EPO codificada por pdClO-huFcg2h(FN^AQ)-Ml-EPO está apresentada na SEQ ID NO: 14.
/FhFPPKPIÇDTtM I SRTPEWCVVVWSHBhPWQFNWYTOQ
Q\nriZ'PPSRE&^mQVSLTCLVKaPrP$BIÃV%mSNÇK>PEm?rZTTPPMLD$mSFFhYSK'hr VDKSRWOQmVFSCSV!mEMJím^KSATAT&2^VmãC8S*M^tÍã&MEMa!tIT!X3C ΆmcsmEmτvϊ?mκ\ml·ΎΆtfmnw‘ίc^Q&\^γmGϊJ&LSEmmmhLh\mssQmEFmJM TO K&¥SGLRSLTTLLILMIjAQKEAI S> PPDAASA&ffLRTXTADT FKKLFRW SMFLRGKLKIí YTGE ACRTGDR {SEQ ID HO* 14) 68 A sequência de aminoácidos de Fc-EPO(NDS) codificada por pdC10-huFcg2h (FN->AQ) -M1-EP0 (NDS) está apresentada na SEQ ID NO: 15.
BPKSSDKTKTCPPCPABPVASPSWLFPPKPKPTI^ISRTPEVTCWVDysMEDPEVOgNWYVDS VBW^MCTKPHESQAQSTFRWS'VLrv^QDWLMGKBYKCK¥SMKGL PAFISKT13 .KTK^JPUSP 0VΎTLPPBREmτEmvsL·TCLmGFTPSDτmEmsB3Qmmγκτ'mmmsDGss’FLYBKL·ΐ mmRmQmm^scsvmEAumrrwKSÃTATPQM^mLicDBB.vhBmhmAKEmmTiQc mGψsιmmτymΎK\wfYAWκmE^GQQMEmmΐMJL·SWMmmMã^M.ssQ¥çBAhQm
S PmAASMPLRTXTADTFRKL ACRTSDR (SEQ ID HO: 153 A parte da sequência sublinhada representa a porção de EPO, a sequência duplamente sublinhada representa a região conetora de IgGl, e a sequência não sublinhada representa o domínio CH2 e CH3 da cadeia IgG modificada, em que a sequência escrita a itálico representa o domínio CH3.
Exemplo 2. Expressão de Fc-EPO em várias linhas de células Para análise rápida da proteína de fusão, um plasmídeo, phC10-Fcg2h (FN^AQ)-Ml-EPO (NDS) ou phC10-Fcg2h (FN->AQ) -Ml-EPO, foi introduzido em células de cultura de tecidos adequadas por métodos comuns de transfeção transitória, tais como, por exemplo, por coprecipitação de DNA mediada por fosfato de cálcio (Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edição, Cold Spring
Harbor Laboratory Press), ou por lipofeção utilizando Lipofectamine Plus (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante.
Para se obterem células BHK-21 transfetadas de modo estável, um plasmídeo, phC10-Fcg2h(FN^AQ)-M1-EP0(NDS) ou phClO-Fcg2h(FN^AQ)-M1-EP0, foi introduzido em células BHK- 69 21 por eletroporação. Para eletroporação de eficiência elevada, células BHK-21, que cresceram em meio MEM (suplementado com aminoácidos não essenciais e piruvato de sódio, como recomendado pela American Type Culture Collection (ATCC)), foram lavadas uma vez com PBS; e aproximadamente 5xl06 células foram ressuspensas em 0,5 mL de PBS e incubadas com 10 pg de DNA plasmidico linearizado numa Cuvete Gene Pulser™ com uma separação das pontas dos elétrodos de 0,4 cm (BioRad, Hercules, CA) em gelo durante 10 minutos. A eletroporação foi realizada utilizando um Gene Pulser™ (BioRad, Hercules, CA) com parâmetros de 0,25 V e 500 pF. As células foram deixadas recuperar durante 10 minutos em gelo, foram ressuspensas em meio de crescimento, e plaqueadas em placas de 96 cavidades. Adicionou-se Higromicina B (Hyg B) ao meio de crescimento dois dias pós-transfeção a uma concentração de 300 microgramas/mL. As células foram nutridas em cada 3 dias mais duas ou três vezes, e clones estáveis resistentes a Hyg B apareceram num periodo de 2 até 3 semanas.
Para identificar clones estáveis produtores de niveis elevados da proteina de fusão Fc-EPO, sobrenadantes de clones foram avaliados por ELISA com anticorpos anti-Fc. Os clones com produção elevada foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo 300 microgramas/mL de Hyg B. Para finalidades de produção proteica, células BHK-21 cresceram de modo rotineiro num meio DMEM/F-12 suplementado, ou noutro meio adequado, como VP-SFM (Life Technologies). A proteina de fusão Fc-EPO foi recolhida do meio condicionado por filtração comum com fluxo normal, e o material clarificado foi armazenado a 4 graus Celsius até ser adicionalmente purificado. Tipicamente, num modo de produção em frascos rotativos, obtiveram-se rendimentos de 70 6-12 mcg/mL de proteínas Fc-EPO a partir de células BHK-21.
As proteínas de fusão Fc-EPO também foram expressas em células NS/0 e recuperadas daquelas. Clones NS/0 que mantiveram de modo estável o plasmídeo pdC10-Fcg2h(FN^AQ)-M1-EP0 ou pdC10-Fcg2h (FN->AQ) -Ml-EPO (NDS) foram estabelecidos por métodos previamente descritos na Publicação PCT WO 01/36489. Tipicamente obtiveram-se rendimentos de 50 - 100 mcg/mL de proteína Fc-EPO a partir de células NS/0.
Exemplo 3. Adaptação de células BHK para crescimento em suspensão e/ou em meio sem proteínas BHK é uma linha de células aderentes que habitualmente cresce em meio contendo soro, tal como, por exemplo, MEM + 10 % soro fetal de bovino (FBS) inativado pelo calor. Para manter e expandir células BHK, periodicamente (por exemplo, em intervalos de 4 dias) são separadas do seu substrato, tipicamente pela ação de uma solução de tripsina-EDTA, são diluídas em meio fresco e novamente semeadas em recipientes apropriados. No entanto, as células BHK podem ser adaptadas para crescimento em suspensão e em meio sem soro e/ou sem proteínas pelos procedimentos seguintes.
Num processo de adaptação típico, células BHK foram primeiramente cultivadas numa mistura 75:25 (v/v) de MEM+FBS : meio alvo até à fase exponencial, e subsequentemente foram subcultivadas, a uma densidade celular apropriada, em meio original : meio alvo 50:50 (v/v), 25:75 (v/v), e finalmente 0:100 (v/v). Durante o processo de adaptação, o crescimento das células BHK foi monitorizado por inspeção visual. Testaram-se os seguintes 71 meios sem soro para a adaptação: 293 SFM II (Invitrogen Corp., # catálogo 11686-929), CHO-S-SFM II (Invitrogen Corp., # catálogo 12052-098), VP-SFM (Invitrogen Corp., # catálogo 11681-020), Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp., # catálogo 12309), CD Hibridoma (Invitrogen Corp., # catálogo 11279-023), e H-SFM (Invitrogen Corp., # catálogo 12045-076) .
Para transformar células BHK de uma linha de células aderentes para uma linha de células em suspensão durante o processo de adaptação, a mistura da cultura foi deixada assentar antes de cada passagem, e os 25% do topo da suspensão de células foram removidos e diluidos num meio fresco. Uma vez que células agregadas assentaram na base dos recipientes de cultura mais rapidamente do que células simples e de dupleto, os 25% do topo da suspensão de células geralmente contêm aquelas células que exibem a menor quantidade de agregação. Assim, cada passagem expande e enriquece as células BHK menos propensas a agregação, e linhas de células em suspensão de clones BHK que expressam proteínas Fc-EPO foram estabelecidas por este método.
Verificou-se que células BHK que expressam proteínas Fc-EPO puderam ser adaptadas para crescimento em meio sem soro VP-SFM ou Opti-PRO SFM, e obtiveram-se culturas em suspensão. As células BHK que expressam proteínas de fusão Fc-EPO não conseguiram crescer nos seguintes meios sem soro: 293 SFM II, CHO-S-SFM II, CD Hibridoma, e H-SFM.
As células BHK adaptadas ao meio sem soro, VP-SFM, foram adicionalmente adaptadas para crescimento num meio sem proteínas, por exemplo, DMEM/F-12 (Invitrogen Corp., # catálogo 11039-021) por cultura sequencial das células BHK, 72 a uma densidade celular apropriada, numa mistura VP-SFM : DMEM/F-12 75:25 (v/v), 50:50 (v/v), 25:75 (v/v), e finalmente 0:100 (v/v). 0 meio sem proteínas DMEM/F-12 foi suplementado com Glutamina (6 mM final), 2 g/L de HyPep 4601 (Quest International, Chicago, IL, # catálogo 5Z10419), 2 g/L de HyPep 1510 (Quest International,
Chicago, IL, # catálogo 5X59053) , 10 pL/L (v/v) de
Etanolamina (Sigma, # catálogo E0135), e 5 μΜ Tropolona (Sigma, # catálogo T7387). Uma linha de células BHK que expressa de modo estável a proteína de fusão Fc-EPO competente para crescimento em DMEM/F-12 suplementado foi obtida por este método e mantida a elevada viabilidade celular.
Exemplo 4. Purificação e caracterização do estado de agregação das proteínas
Para análise, proteínas de fusão Fc-EPO foram purificadas de sobrenadantes de cultura de células via cromatografia com Proteína A, com base na afinidade da porção Fc para a Proteína A. O sobrenadante condicionado de células que expressam proteínas Fc-EPO foi carregado numa coluna pré-equilibrada de Proteína A Sefarose Fast-Flow. A coluna foi extensamente lavada com tampão de fosfato de sódio (150 mM Fosfato de Sódio, 100 mM NaCl a pH neutro) . A proteína ligada eluiu com um tampão de fosfato de sódio (composição como acima) de pH baixo (pH 2,5-3) e as frações eluídas foram imediatamente neutralizadas.
Para avaliar o estado de agregação das proteínas de fusão Fc-EPO produzidas por diferentes linhas de células, amostras purificadas com Proteína A foram analisadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) analítica. As amostras foram fracionadas por HPLC-SEC (por exemplo, Super 73 3000 SW, TosoHaas, Montgomeryville, PA) , numa ronda de quinze minutos a uma taxa de fluxo de 0,35 mL/minuto. Uma porção substancial das proteínas Fc-EPO (por exemplo, até 90% a 100% do rendimento total) produzidas a partir células BHK não estava agregada. Além disso, amostras das proteínas de fusão Fc-EPO analisadas por SDS-PAGE redutora (gel NuPAGE pré-fundido 4% - 12%, NuPAGE, Novex) revelaram substancialmente uma única banda, indicando que os produtos resistiram à degradação em procedimentos operacionais comuns.
Proteínas de fusão Fc-EPO purificadas a partir de células BHK que cresceram em suspensão, em meio sem soro, e/ou em meio sem proteínas também foram caracterizadas por SDS-PAGE e SEC analítica como descrito acima. Verificou-se que as proteínas estavam substancialmente não agregadas e não degradadas, tal como proteínas sintetizadas em células BHK que cresceram em meio contendo soro.
Exemplo 5A. Caracterização de padrões de glicosilação A serinal26 na eritropoietina humana está situada numa sequência compatível com O-glicosilação, e está conservada em todas as proteínas eritropoietina de mamíferos. No entanto, a serinal26 está numa "alça mole" que não fica firmemente empacotada contra o restante da proteína. Na ausência de O-glicosilação, esta região da eritropoietina poderá ser particularmente sensível a proteólise. 0 estado de O-glicosilação em Serl26 em proteínas Fc-EPO produzidas em diferentes linhas de células foi examinado por HPLC de fase reversa. As amostras foram desnaturadas e reduzidas, foram diluídas em 0,1% ácido trifluoroacético (TFA), e injetadas numa coluna de HPLC de fase reversa (por exemplo, uma coluna Vydac C4, Grace Vydac). Aplicou-se um 74 gradiente em 0,085% TFA em acetonitrilo e registaram-se os tempos de retenção das amostras proteicas. Verificou-se que Fc-EPO e Fc-g2h (FN-+AQ) -EPO sintetizadas em células BHK-21 produziram dois picos principais parcialmente sobrepostos (Pico #1 e Pico #2) . As frações dos picos foram adicionalmente analisadas por mapeamento de péptidos. Verificou-se que o Pico #1 correspondeu a uma forma de Fc-EPO que estava glicosilada em Serl26, indicado pela ausência de um péptido de assinatura (Péptido #36), ao passo que o Pico #2 correspondeu a uma forma de Fc-EPO que não estava glicosilada em Serl26, indicado pela presença do péptido de assinatura (Péptido #36). Verificou-se que Serl26 é modificada por O-glicosilação em cerca de 60% das moléculas de Fc-EPO produzidas a partir de células BHK, o que é consistente com o que foi relatado para a EPO de ocorrência natural. Adicionalmente, o crescimento de células BHK em meio DMEM/F-12 sem proteínas suplementado teve um efeito positivo na frequência da O-glicosilação.
Exemplo 5B. Caracterização de padrões de sialilação A extensão da sialilação de proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células NS/0, BHK, 293, e PerC6 foi comparada por eletroforese em gel de focagem isoelétrica (IEF). Em resumo, amostras concentradas para 2 mg/mL e dessalinizadas, se necessário, foram adicionadas a um volume igual de Tampão de Amostra de IEF pH 3-7, e foram processadas num Gel de IEF Novex pré-fundido vertical pH 3-7 (Novex, # catálogo EC6655B/B2) durante 2,5 horas, a primeira hora a 100 V, a segunda hora a 200 V e os últimos 30 minutos a 500 V. O gel foi então fixado, corado e submetido a descoloração. 75
Numa experiência particular compararam-se as amostras seguintes (as amostras foram derivadas de células que cresceram em meio contendo soro): 1. Fcg2h-EP0(NDS) a partir de NS/0 2. Fcg2h-EP0(NDS) a partir de BHK-21 3. Fcg2h-EP0 a partir de BHK-21 4. Fcg2h("Delta Lys")-EPO a partir de BHK-21 5. Fcg4h (FN->AQ "Delta Lys")-EPO a partir de BHK-21 6. Fcg4h("Delta Lys")-EPO a partir de BHK-21
Neste grupo, "Delta Lys" refere-se a uma deleção da lisina no terminal C do dominio Fc (amostras 4-6). As amostras 1-3 têm uma mutação desta lisina C-terminal numa alanina. Em consequência, esta lisina C-terminal está ausente de todas as amostras e não há diferença de carga resultante entre as amostras. Todas as células cresceram como células aderentes em meio contendo soro.
As amostras foram carregadas num gel de IEF pH 3-7 e foram comparadas com padrões com focagem a pH 3,5, 4,2, 4,5, 5,2, 5,3, 6,0, e 6,9 (Serva Electrophoresis, Alemanha). A primeira amostra, Fcg2h-EPO(NDS) de NS/0, migrou na forma de uma distribuição de bandas com pontos isoelétricos entre cerca de pH 5,3 e 6,5; as bandas mais intensas estavam presentes a pH 6,0-6,1. A segunda amostra, Fcg2h-EPO(NDS) de BHK-21, foi processada como uma distribuição de bandas intensas com pontos isoelétricos a cerca de pH 4,6 até pH 5,0, com bandas mais esbatidas desde pH 5,0 até cerca de pH 6,0; as bandas mais intensas estavam presentes a pH 4,8-4,9. A terceira e quarta amostras, Fcg2h-EPO de BHK-21 e Fcg2h("Delta Lys")-EPO de BHK-21, respetivamente, exibiram ambas uma distribuição de bandas desde cerca de pH 4,7 até 76 6,0, com as bandas mais intensas com focagem a cerca de pH 5,3. A quinta e sexta amostras, Fcg4h(FN^AQ "Delta Lys")-EPO de BHK-21 e Fcg4h("Delta Lys")-EPO de BHK-21, respetivamente, exibiram um padrão de focagem semelhante ao da segunda amostra, isto é, foram processadas como uma distribuição de bandas intensas com pontos isoelétricos a cerca de pH 4,6 até pH 5,0, com bandas mais esbatidas desde pH 5,0 até cerca de pH 6,0. Estes resultados indicam que a sintese de proteínas de fusão Fc-EPO em células BHK originou, em geral, um produto significativamente mais acídico do que produtos idênticos ou semelhantes sintetizados em células NS/0.
Noutras experiências, amostras de Fcg2h-Ml-EPO(NDS) de células BHK foram tratadas com neuraminidase, que remove ácido siálico de oligossacáridos. As amostras resultantes tratadas com neuraminidase foram processadas num gel de IEF, e verificou-se exibirem focagem na forma de poucas bandas a pH 6,9 e maior. Quando se compararam os padrões de formação de bandas de amostras de células BHK com ou sem tratamento com neuraminidase e de amostras de células NS/0, identificaram-se cerca de 27 espécies sialiladas distintas. As 27 espécies correspondem bem às 28 espécies diferentes previstas que podem resultar de extensões variáveis de sialilação de uma proteína de fusão Fc-EPO em configuração homodimérica. De acordo com esta análise, Fcg2h-EPO com 4-5 resíduos de ácido siálico exibiu focagem com o marcador de pH 6,9, e Fcg2h-EPO com 11-12 resíduos de ácido siálico exibiu focagem com o marcador de pH 6,0. Verificou-se que uma população de proteínas Fcg2h-EPO sintetizadas em células BHK aparentou ter uma média de 21 resíduos de ácido siálico por molécula proteica. Em contraste, uma população de proteínas Fc(g2h)-EPO sintetizadas em células NS/0 77 aparentou ter uma média de cerca de 10 resíduos de ácido siálico por molécula proteica.
Em experiências subsequentes, células BHK que expressam proteínas Fc-EPO foram adaptadas a condições de crescimento sem soro e condições apropriadas para produção em larga escala, por exemplo, condições de suspensão. As proteínas Fc-EPO produzidas a partir de células BHK que cresceram em meio sem soro e em suspensão foram analisadas por eletroforese em gel de IEF como descrito acima. Estas alterações das condições de crescimento resultaram em desvios, no máximo, de apenas 0,1 até 0,3 unidades de pH no ponto isoelétrico da banda mais intensa.
Amostras das proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em meio sem proteínas DMEM/F-12 suplementado foram caracterizadas de modo semelhante por eletroforese em gel de IEF. Verificou-se que o produto proteico foi sialilado em maior extensão e exibiu sialilação mais homogénea do que o produto correspondente obtido a partir de células que cresceram em meio sem soro, tal como VP-SFM. A extensão da sialilação de proteínas Fc-EPO produzidas em diferentes linhas de células também foi confirmada qualitativamente por estudos de ligação de lectina. Por exemplo, proteínas de fusão Fc-EPO foram primeiramente separadas por eletroforese em gel de SDS comum e foram coradas, depois foram submetidas a amostragem com lectinas modificadas que reconhecem frações distintas de hidratos de carbono (por exemplo, disponibilizadas comercialmente pela Roche Applied Science, Indianápolis, IN), e lectinas ligadas podem ser visualizadas. Lectinas adequadas incluem mas não estão limitadas a aglutinina de Sambucus nigra 78 (SNA) ou aglutinina de Maackia amurensis (MAA), que reconhecem ácidos siálicos com ligações especificas, e aglutinina de Datura stramonium (DAA), aglutinina de amendoim (PNA) e jacalina, que reconhecem outras regiões da fração de hidratos de carbono, tal como o núcleo de 0-glicano. Com base nos ensaios de ligação de lectina foi possivel determinar os níveis de sialilação de proteínas de fusão Fc-EPO produzidas em diferentes linhas de células.
Exemplo 6. Atividade biológica in vitro de variantes Fc-EPO As atividades in vitro de diferentes proteínas Fc-EPO foram testadas num ensaio à base de células. A linha de células TF-1 expressa recetores da EPO e, em conformidade, em condições apropriadas de cultura, a sua incorporação de timidina tritiada é uma função da atividade da proteína EPO ou do tipo EPO (Hammerlling et al., (1996) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysís, b4: 1455; Kitamura et al., (1989) J. Cellular Physiol. 140: 323). Especificamente, células TF-1 na fase logarítmica ativa foram lavadas duas vezes num meio sem EPO, e foram plaqueadas a cerca de 104 células/cavidade em placas de microtítulo. Em seguida, as células foram incubadas num meio com uma série de diluições tituladas das variantes Fc-EPO durante 48 horas. Adicionaram-se às cavidades 0,3 pCi de 3H-timidina dez horas antes da avaliação da proliferação celular. Como controlos, células TF-1 também foram incubadas na presença de EPO humana recombinante, e do análogo hiperglicosilado da EPO Aranesp®. A incorporação de timidina radioativa foi medida na forma de contagens aptas a precipitar de TCA total. Como mostrado na Tabela 2, as atividades de moléculas Fcg2h-Ml-EPO são comparáveis às da EPO humana recombinante. 79
Destes dados podem deduzir-se algumas conclusões gerais. De modo consistente com resultados previamente relatados, a EPO produzida a partir de células CHO tem um ED50 de cerca de 0,7 ng/mL; isto inclui o padrão de EPO NIBSC, EPO da R&D Systems, e Procrit® comercial. O Aranesp® é significativamente menos ativo in vitro, presumivelmente refletindo a sua velocidade de associação reduzida devido às suas cargas negativas aumentadas. De modo semelhante, Fc-EPO produzida a partir de células BHK é menos ativa do que Fc-EPO produzida a partir de células NS/0, o que é consistente com a observação de que proteínas Fc-EPO produzidas a partir de células BHK estão altamente sialiladas, originando cargas negativas aumentadas nas proteínas.
Tabela 2
Proteína ED50 (ng/mL) D.P. N EPO (NIBSC) 0,77 0,35 22 EPO (R&D Systems) 0,6 0,26 26 EPO (Procrit®) 0,68 0,15 6 EPO (Aranesp®) 2,4 0,96 10 Fcg2h-Ml-EPO (NS/0) 0,35 0,15 14 Fcg2h-Ml-EPO (BHK) 0, 94 0,34 5
Exemplo 7. Análise farmacocinética de variantes Fc-EPO Os perfis farmacocinéticos de diferentes proteínas Fc-EPO sintetizadas em várias linhas de células foram caracterizados com base nas seguintes experiências in vivo. Numa experiência, como mostrado na Figura 8, cerca de 14 mcg de proteína Fcg2h(N>Q)-EPO sintetizada em células NS/0 e em células BHK foram administrados intravenosamente em ratinhos Swiss-Webster. Em vários instantes após a administração (por exemplo, T=0, 1/2, 1, 2, 4, 8, e 24 horas após a administração), recolheram-se amostras de 80 sangue e preparou-se soro por centrifugação. As concentrações no soro de Fc-EPO foram determinadas por ELISA utilizando anticorpos anti-Fc. Como mostrado na Figura 8, às 24 horas após a administração, mais de 10% da concentração no soro inicial de Fc-EPO derivada de BHK permaneceram no soro, ao passo que menos de 0,1% da concentração no soro inicial de Fc-EPO derivada de NS/0 permaneceram no soro.
Realizou-se uma experiência semelhante com proteínas Fcg2h-EPO(NDS) sintetizadas em células NS/0 e em células BHK. Cerca de 14 mcg de proteina Fcg2h-EPO(NDS) sintetizada em células NS/0 e em células BHK foram administrados intravenosamente em ratinhos Swiss-Webster. Recolheram-se amostras de sangue nos instantes T=0, 1/2, 1, 2, 4, 8, 24, e 36 horas após a administração e as concentrações de Fcg2h-EPO(NDS) no soro foram medidas por ELISA anti-Fc. Como mostrado na Figura 9, às 24 horas após a administração, mais de 10% da concentração no soro inicial de Fcg2h-EPO(NDS) derivada de BHK permaneceram no soro, ao passo que menos de 0,1% da concentração no soro inicial de Fcg2h-EPO(NDS) derivada de NS/0 permaneceram no soro.
Também se compararam os perfis farmacocinéticos de Fcg2h-EPO(NDS) produzida em células BHK-21, células PERC6, e células 293. Especificamente, um plasmideo que expressa Fcg2h-Epo(NDS) foi transfetado de modo transitório em células BHK, 293, e PERC6. As proteínas de fusão Fcg2h-Epo(NDS) expressas foram purificadas de diferentes linhas celulares e foram injetadas intravenosamente em ratinhos Swiss-Webster a uma concentração de 1,7 microgramas por ratinho. Recolheram-se amostras de sangue nos instantes T=0, 1/2, 1, 2, 4, 8, 24, 48, e 72 horas, e a concentração 81 de Fcg2h-Epo(NDS) no soro foi medida por ELISA anti-Fc. Como mostrado na Figura 10, às 24 horas após a administração, mais de 10 % da concentração no soro inicial de Fcg2h-EPO(NDS) derivada de BHK permaneceram no soro, ao passo que menos de 1% da concentração no soro inicial de Fcg2h-EPO(NDS) derivada de células 293 permaneceu no soro, e a Fcg2h-EPO(NDS) derivada de células PerC6 foi quase indetetável no soro. Obtiveram-se resultados semelhantes com proteinas Fcg2h (N-»Q)-EPO produzidas em células BHK, PerC6, e 293.
Conduziram-se experiências semelhantes em ratinhos para comparar os perfis farmacocinéticos de Fcg2h (N-»Q) -EPO, Fcg2h-EPO(NDS), Fcg2h-EPO, e Aranesp® (isto é, NESP). As variantes Fc-EPO utilizadas aqui foram sintetizadas a partir de células BHK. Observou-se que, às 48 horas após a administração, menos de 10% da concentração no soro inicial de Aranesp® permaneceram no soro, ao passo que mais de 10% das concentrações no soro iniciais de Fcg2h (N-»Q) -EPO e Fcg2h-EPO(NDS) permaneceram no soro. Estes resultados indicam que as proteinas Fcg2h (N->Q) -EPO e Fcg2h-EPO (NDS) produzidas a partir de células BHK-21 têm semividas no soro muito mais longas do que a do Aranesp®.
Exemplo 8. Potência in vivo de variantes Fc-EPO As atividades biológicas in vivo de diferentes variantes Fc-EPO foram medidas por ensaios de hematócrito (HCT) e ensaios de reticulócitos em ratinhos e ratos.
Numa experiência de HCT, ratinhos CD1 foram injetados intraperitonealmente com proteinas Fcg2h (FN-.AQ) -EPO sintetizadas em células BHK a doses de 20 mcg/kg e 10 mcg/kg. Recolheram-se amostras de sangue dos ratinhos nos 82 dias 4, 7, 11, e 14, tendo sido centrifugadas em tubos capilares. As quantidades de GVs sedimentados foram medidas como frações do volume total. Como ilustrado na Figura 4, em resposta à injeção de proteínas Fcg2h(FN>AQ)-EPO, os hematócritos aumentaram dramaticamente em primeiro lugar, depois permaneceram estacionários, e finalmente diminuíram.
Noutra experiência, ratos Sprague-Dawley foram injetados intraperitonealmente com as seguintes proteínas sintetizadas em células BHK. Todos os animais foram doseados a 42,5 mcg/kg. 1. Fcg2h-EP0 2. Fcg2h-EP0(NDS) 3. Fcg4h-EP0
4. Fcg4h(N>Q)-EPO
Realizaram-se ensaios de HCT com as amostras de sangue recolhidas dos ratinhos injetados como descrito acima. Como mostrado na Figura 5, em resposta a Fcg2h-EP0(NDS) e Fcg2h-EPO, a quantidade de hematócritos nos ratos injetados permaneceu estacionária durante um período de tempo prolongado, indicando que as proteínas Fcg2h-EP0(NDS) e Fcg2h-EP0 têm semividas no soro prolongadas e atividade biológica in vivo potente. Também se verificou, como mostrado na Figura 5, que Fcg4h-EP0 e Fcg4h(N^Q)-EPO exibiram um período estacionário mais curto e uma diminuição mais rápida da concentração no soro em comparação com as proteínas Fcg2h-EP0(NDS) e Fcg2h-EP0.
Noutra experiência, ratinhos CD1 foram administrados intraperitonealmente com as amostras seguintes. 83 1. Fcg2h-EP0(NDS) de células BHK às doses de 85 mcg/kg, 42.5 mcg/kg, e 21,25 mcg/kg 2. Fcg2h-EP0(NDS) de células NS/0 às doses de 85 mcg/kg, 42.5 mcg/kg, e 21,25 mcg/kg 3. Aranesp® (isto é, NESP) às doses de 50 mcg/kg, 25 mcg/kg, e 12,5 mcg/kg
As quantidades das proteínas foram calculadas com base no peso molecular das proteínas sem hidratos de carbono. Nesta experiência, o peso molecular da proteína Fcg2h-EPO(NDS) baseia-se num polipéptido monomérico. Em conformidade, a razão entre os pesos moleculares de Fcg2h-EPO(NDS) e NESP é cerca de 1,71 para 1. Em consequência, as gamas de doses de cada proteína nesta experiência foram aproximadamente iguais.
Como mostrado na Figura 6, as proteínas Fcg2h-EPO(NDS) sintetizadas em células BHK exibiram o melhor perfil do hematócrito em termos da potência e duração do efeito, indicando que proteínas Fcg2h-EPO(NDS) de células BHK têm semividas no soro mais longas e atividades in vivo mais potentes em comparação com Fcg2h-EPO(NDS) de células NS/0 e NESP. Os perfis do hematócrito de Fcg2h-EPO(NDS) de células NS/0 e NESP são comparáveis.
Exemplo 9. Os efeitos da eliminação do sítio de glicosilação na porção Fc
Conduziram-se experiências para testar os efeitos da eliminação do sítio de glicosilação da porção Fc na atividade in vitro, farmacocinética, e potência in vivo. Em particular, testaram-se proteínas de fusão Fc-EPO contendo domínios CH2 e CH3 derivados de IgG2 ou domínios CH2 e CH3 derivados de IgG4. A asparagina na sequência de aminoácidos 84
Gln-Phe-Asn-Ser da IgG2 ou IgG4, que corresponde a Asn297 da IgGl, foi substituída por uma glutamina. Na maior parte das experiências, a fenilalanina da sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser foi substituída por alanina, para eliminar possíveis epítopos não próprios de células T que podem resultar da mutação da asparagina. Como mostrado na Tabela 6, em ensaios in vitro à base de células, os valores ED50 de proteínas Fc-EPO com a mutação FN>AQ, que elimina o sítio de glicosilação N-ligado na porção Fc, são geralmente cerca de 5 vezes menores do que os de proteínas Fc-EPO sem a mutação, indicando que a eliminação do sítio de glicosilação N-ligado originou atividade in vitro decrescida em ensaios à base de células.
Também foram conduzidas experiências para testar os efeitos da eliminação da glicosilação N-ligada na farmacocinética e potência in vivo. Ratinhos CD1 foram tratados com proteínas Fcg2h-Ml-EP0, Fcg2h-Ml-EP0(NDS) , e Fcg2h(N>Q)-M1-EP0 sintetizadas em células BHK a uma dose de 42 mcg/kg cada. Observou-se que a proteína Fcg2h (N-»Q) -M1-EP0 exibiu melhor perfil farmacocinético do que a proteína correspondente sem a mutação N->Q. Em consequência, a mutação N>Q, que elimina a glicosilação N-ligada na porção Fc derivada de IgG2, originou farmacocinética melhorada (por exemplo, semivida no soro prolongada). A semivida no soro prolongada não pode ser explicada por um efeito na ligação a recetores de Fc porque os domínios CH2 e CH3 derivados de IgG2 já possuem ligação a recetores de Fc essencialmente indetetável. 85
Tabela 6: Eliminação do sítio de glicosilação na porção Fc reduz a atividade baseada em células in vitro das proteínas de fusão Fc-EPO.
Proteínas de fusão Fc-EPO ED50 (ng de EPO/mL) D. P. N° de Experiências Fcg2h-EPO BHK preparação 1 0,84 0,28 4 Fcg2h-EPO BHK preparação 2 0,95 0,32 7 Fcg2h-EPO BHK preparação 3 0,72 0,27 3 Fcg2h-EPO BHK preparação 4 0,95 0,17 3 Fcg2h-EPO BHK preparação 5 0,43 0,18 2 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 1 6,75 2,57 9 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 2 7,38 1,48 4 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 3 7,01 4,64 9 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 4 3,02 0,88 5 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 5 2,77 1,75 5 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 6 5, 07 1,64 4 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 7 2,53 0,53 5 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 8 2,92 0,52 5 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 9 1,55 0,66 5 Fcg2h(FN>AQ)-EPO BHK Preparação 10 2,37 1,78 8
Estes efeitos são inesperados e surpreendentes, pois os efeitos causados pela eliminação da glicosilação N-ligada nas porções Fc derivadas de IgG2 são muito consistentes com velocidade de associação reduzida para o recetor da eritropoietina. Sem pretender ficar restringido pela teoria, a eliminação da glicosilação N-ligada nas porções Fc derivadas de IgG2 pode causar uma alteração conformacional global na proteína de fusão Fc-EPO.
Exemplo 10. Tratamento de cães bigle com proteínas de fusão Fc-EPO sintetizadas em células BHK
Proteínas de fusão Fc-EPO foram administradas a cães bigle para testar os efeitos nos hematócritos, contagens de reticulócitos, e outros parâmetros sanguíneos. Especificamente, proteínas Fcg2h(FN^AQ)-EPO foram purificadas de duas linhas de células BHK independentemente transfetadas de modo estável, clone 65 e clone 187, e foram administradas intravenosamente a cães bigle. Um cão bigle 86 macho e uma fêmea foram injetados com cada preparação de acordo com o calendário seguinte:
Dia 0: 3 microgramas/kg Dia 16: 10 microgramas/kg Dia 23: 100 microgramas/kg
Em vários instantes após cada administração recolheram-se aproximadamente 2 mL de sangue e mediram-se parâmetros sanguíneos, tais como hematócritos, contagens de reticulócitos, e outros parâmetros sanguíneos.
As respostas dos hematócritos após o tratamento estão apresentadas na Figura 11. Após dosagem com 3 mcg/kg de proteínas de fusão Fc -EPO, os parâmetros sanguíneos não aumentaram para além da gama normal. No período de uma semana após dosagem com 10 mcg/kg, as contagens de reticulócitos aumentaram para mais de 3% do volume total do sangue em três dos quatro animais, e os hematócritos aumentaram para 51 num animal. Outros parâmetros sanguíneos não aumentaram para além da gama normal. Após dosagem com 100 mcg/kg, as contagens do hematócrito aumentaram rapidamente, atingindo níveis máximos de 57 até 62 e permanecendo acima da gama normal durante cinco até seis semanas. As contagens de reticulócitos permaneceram elevadas durante duas até três semanas.
Para cada animal, o número de glóbulos vermelhos por microlitro de sangue e a hemoglobina, medida em gramas por decilitro, foram proporcionais à quantidade dos hematócritos. Estes resultados indicaram que proteínas Fc-EPO estimulam a produção de glóbulos vermelhos de tamanho normal com teor normal de hemoglobina. 87
Exemplo 11. Purificação de proteínas Fc-EPO para utilização clínica
Proteínas Fc-EPO são purificadas seguindo procedimentos comuns de GMP conhecidos dos profissionais. Células BHK-21, de um clone de produção em banco, são cultivadas em meio DMEM/F-12 (Invitrogen) suplementado com componentes adicionais de 2,5 mM L-glutamina (Invitrogen), 2 g/L de cada HyPep 1501 e HyPep 4601 (Quest International, Chicago, IL) , 10 pL/L de etanolamina (Sigma) , e 5 μΜ Tropolona (Sigma) durante 7-10 dias em cultura descontínua mantendo elevada viabilidade celular (por exemplo, acima de 80%). O meio condicionado é recolhido e clarificado por filtração com fluxo normal, e é carregado numa coluna Fast-Flow de Proteína A Sefarose pré-equilibrada (Pharmacia), que captura a proteína de fusão com base na afinidade da Proteína A para a porção Fc. A coluna é extensamente lavada com 15 volumes da coluna de tampão de fosfato de sódio contendo 150 mM fosfato de sódio e 100 mM NaCl a pH neutro. A proteína ligada elui a pH baixo com mais 15 volumes da coluna de tampão de fosfato de sódio acídico de pH 2,5 - 3 mas também contendo 150 mM fosfato de sódio e 100 mM NaCl.
Para inativação virai, o pH das frações de pico reunidas é ajustado para pH 3,8 e o sistema é incubado durante mais 30 minutos à temperatura ambiente. Após incubação durante 30 minutos, as frações reunidas são neutralizadas e filtradas com esterilização, depois são aplicadas numa coluna de permuta aniónica de Q-Sefarose Fast-Flow (Pharmacia), que explora o pi acídico da proteína Fc-EPO, em resultado da sua extensa sialilação, para remover eficazmente potenciais contaminantes coeluídos com proteínas Fc-EPO. Especificamente, as frações neutralizadas são carregadas numa coluna de permuta aniónica de Q-Sefarose Fast-Flow 88 (Pharmacia) a pH 5,0 e são eluídas com um gradiente de solução de NaCl. As frações de Fc-EPO são depois recolhidas e reunidas para análise subsequente e para um processo de purificação adicional. Por exemplo, a faixa rica em sal da coluna de Q-Sefarose é aplicada numa coluna de crornatografia de fase reversa para remover o NaCl em excesso. 0 eluente diluído da coluna de fase reversa é adicionalmente aplicado numa segunda coluna de Q-Sefarose Fast Flow (Pharmacia, 3 cm X 9 cm).
Potenciais particulas de virus são depois removidas da reunião por nanofiltração (por exemplo, Viresolve da Millipore). Opcionalmente, podem utilizar-se passos adicionais de purificação, tais como uma coluna de hidroxiapatite ou uma coluna de fenilboronato (liga cis-dióis). Por fim, as proteínas purificadas são concentradas para uma concentração desejada utilizando ultrafiltração e depois são diafiltradas num tampão de formulação adequado. O material é finalmente filtrado com esterilização, e é distribuído em frascos para um volume predeterminado.
Exemplo 12. Teste de "stress" para determinar a estabilidade de formulações de proteínas Fc-EPO.
Frascos contendo uma formulação de amostra exemplificativa de Fc-EPO ou uma formulação de Fc-EPO de referência são armazenados a 40° C e 75% de humidade atmosférica relativa, e durante tempos de armazenamento definidos (por exemplo, 0 semanas, 4 semanas, 8 semanas, etc.). Uma amostra de alíquota é recolhida de cada frasco após um certo tempo de armazenamento e é analisada. As amostras são analisadas visualmente, sob iluminação direta com uma fonte de luz fria, quanto à turvação. A turvação é adicionalmente determinada medindo a absorção a 350 nm e 550 nm. 89
Adicionalmente, o estado da proteína Fc-EPO nas amostras e a presença de produtos de degradação proteica são analisados por cromatografia de exclusão por tamanho (HPLC-SEC) analítica. Verifica-se que uma formulação contendo 0,5 mg/mL de Fc-EPO, 10 mM Citrato pH 6,2, 100 mM Glicina, 100 mM NaCl, 0,01% p/v de polissorbato 20 possuía estabilidade significativamente aumentada em comparação com uma solução de referência.
Exemplo 13. Um estudo de fase I da proteína de fusão Fcg2h(FN>AQ)-Ml-EPO em humanos Um ensaio clínico de Fase I da proteína de fusão Fcg2h(FN>AQ)-Ml-EPO em humanos é realizado do modo seguinte. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados essencialmente como descrito para o Aranesp® por MacDougall et al. (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 1_0: 2392-2395, cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência. Verifica-se que a semivida no soro terminal da proteína de fusão Fcg2h (FN->AQ) -Ml-EPO injetada intravenosamente (doseada a 1 mcg/kg) em humanos está situado entre cerca de 20 e 30 horas. Assim, uma dose de 1 mcg/kg, ou cerca de 70 mcg num paciente anémico adulto, origina uma concentração no soro inicial de cerca de 10 ng/mL. Uma vez que a concentração normal de eritropoietina humana é cerca de 0,04 até 0,25 ng/mL (Cazzola et al., (1998) Blood _91: 2139-2145), níveis farmacologicamente ativos da proteína Fc-EPO permanecem no sistema do paciente durante pelo menos 5-10 dias.
Exemplo 14. Um estudo de fase II da determinação da dose e calendarização de doses das proteínas de fusão
Fcg2h (FN->AQ) -Ml-EPO 90
Estudos multicêntricos, aleatórios, e sequenciais de escalamento de doses são iniciados para investigar a dose ótima e calendarização de doses para a proteina de fusão Fcg2h(FN>AQ)-Ml-EPO quando administrada por injeção subcutânea ou intravenosa em pacientes com falha renal crónica (FRC) recebendo diálise.
Na prática clinica é geralmente conveniente adequar a administração da proteina de fusão Fcg2h(FN^AQ)-Ml-EPO a um paciente anémico individual de acordo com as diretrizes seguintes. Administra-se uma dose inicial e monitorizam-se parâmetros sanguíneos, tais como o hematócrito, hemoglobina, contagens de reticulócitos, e contagens de plaquetas. A dose inicial está tipicamente situada entre cerca de 0,3 e 3 mcg/kg. Uma dose inicial conveniente é 1 mcg/kg. Se o aumento do hematócrito for menor do que 5 até 6 por cento do volume de sangue após 8 semanas de terapia, a dose deve ser aumentada. Se o aumento do hematócrito for maior do que 4 por cento do volume de sangue num período de 2 semanas, ou se o hematócrito se aproximar de 36%, a dose deve ser reduzida.
Um calendário de dosagem exemplificativo é o seguinte.
Dosagem uma vez por semana: 0,075, 0,225, 0,45, 0,75, 1,5 e 4.5 mcg/kg/dose.
Dosagem uma vez em duas semanas: 0,075, 0,225, 0,45, 0,75, 1.5 e 4,5 mcg/kg/dose.
Dosagem uma vez por mês: 0,45, 0,75, 1,5 e 4,5 mcg/kg/dose.
Os estudos são realizados em duas partes. A primeira parte consiste num estudo de escalamento da dose concebido para avaliar a dose da proteína de fusão Fcg2h (FN-.AQ) -Ml-EPO 91 administrada uma vez por semana, uma vez em duas semanas, ou uma vez por mês que aumenta a hemoglobina a uma taxa ótima ao longo de quatro semanas (maior ou igual a 1 g/dL mas menor do que 3 g/dL). A segunda parte de cada estudo é concebida para determinar as doses requeridas (quando administradas uma vez por semana, uma vez em duas semanas, ou uma vez por mês pelas vias de administração intravenosa ou subcutânea) para manter o hematócrito no alvo terapêutico.
Lisboa, 16 de Agosto de 2012
Claims (5)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão dimérica purificada que consiste essencialmente numa porção Fc dimérica de uma molécula de IgG humana, compreendendo uma região conetora, um domínio CH2 e um CH3, e eritropoietina (EPO) humana, em que cada cadeia da porção Fc dimérica está ligada, via o seu terminal C, ao terminal N de uma molécula de EPO, em que a referida proteína de fusão Fc-EPO é produzida em células BHK-21 em meio sem proteínas, e é selecionada do grupo que consiste nas seguintes: (i) Fcg2h (FN^AQ)-M1-EP0 como apresentada pela SEQ ID NO: 14; e (ii) Fcg2h (FN^AQ)-M1-EP0 (NDS) como apresentada pela SEQ ID NO: 15.
2. Proteína de fusão Fc-EPO dimérica purificada de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão é produzida em meio DMEM/F-12.
3. Proteína de fusão Fc-EPO dimérica purificada de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão é produzida em meio DMEM/F-12 que é suplementado com aminoácidos, hidrolisados de proteínas, etanolamina, e tropolona.
4. Composição farmacêutica compreendendo, numa quantidade eficaz, uma proteína de fusão Fc-EPO como especificada em qualquer uma das reivindicações 1-3, opcionalmente em conjunto com um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 2
5. Proteína de fusão Fc-EPO dimérica purificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 3, ou composição farmacêutica da reivindicação 4, para utilização no tratamento de perturbações ou deficiências hematopoiéticas num mamífero. Lisboa, 16 de Agosto de 2012
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