KR100502855B1 - 인간 트롬보포이에틴 변이체 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 인간 트롬보포이에틴 (thrombopoietin, TPO) 변이체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 유전자 재조합 방법으로 천연형 TPO의 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산을 치환하여 당쇄를 도입한 신규한 인간 TPO 변이체, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이의 제조방법, 발현세포주 그리고 이들을 이용한 인간 TPO 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 TPO 변이체는 천연형 TPO보다 생체내 생물활성이 증가되고 반감기가 더 길어져 항암치료나 골수이식에 따른 혈소판 감소증 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 트롬보포이에틴 변이체 및 그의 제조방법{HUMAN THROMBOPOIETIN DERIVATIVES AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은 유전자 재조합 방법에 의해 천연형 인간 트롬보포이에틴 (thrombopoietin, TPO)의 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산을 치환하여 당쇄를 도입함으로써 트롬보포이에틴의 생물활성에는 영향을 미치지 않으면서 천연형보다 생체내 반감기가 더 긴 인간 트롬보포이에틴 변이체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

트롬보포이에틴 (Thrombopoietin, 이하 `TPO`라 약칭함)은 거핵구 (megakaryocyte)의 크기와 수를 증가시키고 혈소판으로의 분화를 촉진하는 조절인자로서, MGDF (megakaryocyte growth and development factor)나 Mpl 리간드로도 알려져 있다. TPO의 생체기능 조절은 활성이 있는 형태의 TPO 리간드 (ligand)와 수용체인 c-Mpl과의 상호작용을 통해 이루어진다. 거핵구의 전구체들을 성장·분화시킬 뿐만 아니라 분화된 거핵구를 완전히 성숙시켜 주는 단계까지 조절함으로써 특이적으로 혈소판의 생성을 촉진시키는 것으로 이미 보고된 바 있다 (Gordon and Hofferman, Blood 80: 302-307, 1992).

TPO는 332개의 아미노산으로 구성되어 있고, 분자량이 약 85 kDa인 당단백질로서 간에서 합성되어 혈장으로 분비된다. TPO는 153-154 아미노산 잔기 위치를 중심으로 N-말단 도메인 (N-terminal domain; N-domain)과 C-말단 도메인 (C-terminal domain; C-domain)으로 나눌 수 있다. N-도메인은 에리쓰로포이에틴 (erythropoietin, EPO)과 아미노산 서열에서 약 50 %의 유사성을 가지며 포유동물간에도 서열이 보존되어 있어 수용체와 결합할 수 있다. 반면, C-도메인은 다른 어떤 단백질과도 유사성이 없으며 6개의 N-결합 당화 부위 (N-linked glycosylation sites)를 갖는다. O-결합 당화 부위는 TPO 분자 전체에 12 내지 14개가 있다 (Kaushansky et al., Nature 369: 568-571, 1994; Wending et al., Nature 369, 571-574, 1994; Komatsu et al., Blood 87, 4552-4560, 1996).

중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포에서 발현된 재조합 TPO는 마우스, 쥐, 원숭이에서 혈소판을 증가시키는 생물활성을 나타낸다 (Hunt et al., Blood 84: 390A, 1994). 또한, N-말단의 151개 아미노산 잔기를 포함하는 TPO 절편도 생체내 활성을 나타낸다. TPO는 체내에서 20 내지 30시간의 반감기 (half life)를 가지며, 혈소판의 증가효과는 투여한 4일 후부터 나타나서 12일째에 최고에 달하는 것으로 보고되었다 (Vadhan-Raj et al., Ann. Intern. Med. 126: 673-681, 1997). 현재, 암 환자의 방사선치료 또는 화학요법으로 인한 골수억제에 의하여 야기되는 혈소판 감소증이나 골수이식 환자 또는 재생불량성빈혈 환자에게 출혈을 방지하기 위하여 혈소판을 수혈하고 있다. 그러나, 이러한 수혈은 면역결핍바이러스 (HIV)나 간염바이러스에 환자가 노출될 수 있고, 수혈된 혈소판에 대하여 특이적 항체를 유도하거나 수혈용 혈소판에 오염된 임파구로 인하여 이식편대 숙주질병 (GHVD)을 야기할 위험성을 안고 있다. 따라서, 재조합 TPO는 혈소판 감소증 치료제로 매우 유용할 것이다.

당화 (Glycosylation)는 단백질의 특정 부위에서 일어나고 N-결합 당화와 O-결합 당화의 두 가지 형태가 있다. O-결합 당화는 세린 (serine)이나 트레오닌 (threonin) 잔기에 올리고당 (oligosaccharide)이 붙는 것이고, N-당화는 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린 [proline]을 제외한 모든 잔기가 해당됨) 서열의 아스파라긴 (Asn)에 올리고당이 붙는 것이다. N-결합과 O-결합 올리고당의 구조와 당잔기는 다르지만, 두 형태에서 공통적으로 발견되는 당잔기는 N-아세틸뉴라민산 (acetylneuraminic acid, 시알산 [sialic acid]으로도 불림)이다. 시알산은 N-결합과 O-결합 올리고당의 말단에 존재하고 음전하 (negative charge)를 띠기 때문에 당에 산성 성질을 부과한다. 당화는 단백질 구조의 안정성이나 생체내 반감기를 증가시키는 역할을 한다. 일례를 들면, 미국 암젠사 (Amgen)에서는 TPO의 N-말단을 N-당화시켜 상기 변이체의 생물학적 활성이 증가됨을 확인하였다 (미국 특허 제5,989,538호).

이에, 본 발명에서는 TPO의 N-도메인에서 수용체 결합에 관여하지 않는 부분의 아미노산을 N-당화시켜 TPO의 생물활성에는 영향을 미치지 않으면서 천연형 TPO보다 생체내 반감기가 더 긴 TPO 변이체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 천연형 TPO보다 생체내 생물활성이 증가되고 생체내 반감기가 더 길어진 신규한 인간 TPO 변이체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 TPO의 N-도메인에서 수용체 결합에 관여하지 않는 부분의 아미노산을 치환하여 N-당쇄를 도입시킨 TPO 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 TPO 변이체를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 이의 제조방법 및 발현세포주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 발현세포주를 이용한 인간 TPO 변이체의 제조방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 인간 TPO 변이체를 유효성분으로 함유하는 혈소판 감소증 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TPO의 N-도메인에서 수용체 결합에 관여하지 않는 부분의 아미노산을 치환하여 N-당쇄를 도입시킨 TPO 변이체를 제공한다.

우선, 본 발명은 생체내 활성은 그대로 유지하면서 반감기가 향상된 인간 TPO 변이체를 개발하기 위하여, TPO의 N-도메인에서 수용체 결합에 관여하지 않는 부분의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산을 치환하여 N-당쇄를 도입시킨다. 인간 TPO는 서열번호 1로 기재되는 1,073 bp 길이의 염기서열을 가지며, 이로부터 서열번호 2로 기재되는 332개 아미노산 서열을 갖는 성숙 TPO 단백질이 암호화된다.

구체적으로, 인간 TPO 단백질의 특정 부위, 즉 N-도메인에서 수용체 결합에 관여하지 않는 1 내지 174번 아미노산 잔기 부분이 N-당쇄의 도입 부위인 아스파라긴-X-세린 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이 해당됨) 서열이 되도록 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써 N-당쇄가 하나 이상 도입된 TPO 변이체를 제조한다. 구체적으로, 본 발명에서는 서열번호 2로 기재되는 천연형 인간 TPO의 아미노산 서열에서 82번 글리신, 83번 프롤린 및 117번 아르기닌 잔기를 각각 아스파라긴, 알라닌 및 아스파라긴으로 치환시켜 N-당쇄를 도입하였다. 아미노산의 치환은 재조합 중합효소 연쇄반응 (recombinant polymerase chain reaction; rPCR)에 의한 부위특이 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용하여 천연형의 인간 TPO의 특정 아미노산이 치환된 TPO 변이체를 제조한다.

우선, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 TPO 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는데, 상기 발현벡터는 발현된 TPO 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 TPO의 C-말단에 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus; HBV)의 preS1 항원의 아미노산 35 내지 47에 해당하는 서열번호 16으로 기재되는 펩티드 표지 (peptide tag)를 가지며, TPO 단백질의 대량생산을 위하여 유전자의 증폭이 가능하도록 dhfr (dihydrofolate reductase) 유전자가 삽입된 벡터를 시발벡터로 사용한다. 이로부터 1136 bp의 TPO 유전자 DNA 절편을 포함하는 TPO 발현벡터 pCMV-dhfr-TPO/S1과 630 bp의 TPO N-말단 유전자 DNA 절편을 포함하는 TPO-N 발현벡터 pCMV-dhfr-TPO-N/S1을 제작하였다 (도 2 참조).

한편, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 변이 염기서열을 포함하는 시발체를 화학적으로 합성한다. 이 시발체는 양 방향의 올리고뉴클레오티드로 각각 새롭게 치환시키고자 하는 아미노산의 염기서열을 포함하고 그 서열을 중심으로 5' 방향과 3' 방향으로 인간 TPO 유전자의 염기서열에 해당하는 몇 개의 염기가 연결된 한 쌍의 센스 및 안티센스 시발체이다.

TPO 변이체의 발현벡터를 제작하기 위한 재조합 PCR은, 구체적으로 TPO 유전자가 클로닝되어 있는 상기 pCMV-dhfr-TPO/S1 벡터를 주형으로 하고, HindIII 제한효소 부위와 TPO 전사 개시코돈을 암호화하는 염기서열을 포함하는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 상기 표 1의 변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 중 안티센스 시발체, 또는 나머지 센스 시발체와 XhoI 제한효소 부위와 연결 펩티드 (ttaggggttgaagtccga)를 포함하는 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 각각 시발체로 사용한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, TPO의 아미노산 서열 중 82번과 117번 아미노산을 N-당화시킨 TPO 변이체 (이하 "gTPO1"이라 명명함)를 얻기 위하여 82번 글리신 잔기를 아스파라긴으로, 117번 아르기닌 잔기를 아스파라긴으로 각각 치환한다. 상기 아스파라긴 부가 위치는 TPO의 3차 구조에서 TPO의 표면에 존재하고 수용체와의 결합에 영향을 주지 않을 것이라 생각되는 아미노산 잔기를 선택하였다 (Park et al., J. Biol. Chem. 273: 256-261, 1998). 이때, 각 치환부위가 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기가 해당됨) 아미노산 서열을 갖도록 하기 위하여 83번 프롤린 잔기를 알라닌으로 치환한다. 이러한 돌연변이의 도입은 pCMV-dhfr-TPO/S1 벡터를 주형으로 하고 서열번호 3 및 8의 시발체 쌍, 서열번호 9 및 10의 시발체 쌍 및 서열번호 11 및 7의 시발체 쌍을 이용한 PCR에 의해 증폭된 각각의 단편을 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 7의 시발체 쌍을 이용한 재조합 PCR에 의해 이루어진다. 그 결과, 82번과 117번 아미노산이 N-당화된 TPO 변이체를 포함하는 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1/S1을 얻는다. 본 발현벡터에 포함된 TPO 변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는다.

또한, TPO 변이체 N-말단의 발현벡터는 TPO N-말단 유전자가 클로닝되어 있는 상기 pCMV-dhfr-TPO-N/S1 벡터를 주형으로 하고, HindIII 제한효소 부위와 TPO 전사 개시코돈을 암호화하는 염기서열을 포함하는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 상기 표 1의 변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 중 안티센스 시발체, 또는 나머지 센스 시발체와 XhoI 제한효소 부위와 연결 펩티드를 포함하는 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 각각 시발체로 사용하여 재조합 PCR을 수행한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기에서 제작된 82번과 117번 아미노산이 N-당화된 TPO 변이체의 N-말단 부위만을 포함하는 발현벡터를 제작하기 위하여, pCMV-dhfr-TPO-N/S1 벡터를 주형으로 하고 서열번호 3 및 7의 시발체 쌍, 서열번호 9 및 10의 시발체 쌍 및 서열번호 11 및 4의 시발체 쌍을 이용한 PCR에 의해 증폭된 각각의 단편을 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 시발체 쌍을 이용한 재조합 PCR을 수행한다. 그 결과, 82번과 117번 아미노산이 N-당화된 TPO 변이체의 N-말단을 포함하는 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1을 얻는다. 본 발현벡터에 포함된 TPO-N 변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 17로 기재되는 염기서열 중 78 내지 599번 염기서열을 갖는다.

아울러, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기에서 제작된 TPO 변이체들의 생체내 생물활성을 비교할 대조군으로서 30번 프롤린 잔기와 32번 발린 잔기가 각각 아스파라긴과 트레오닌으로 치환되고, 120번 알라닌 잔기와 122번 라이신 잔기가 각각 아스파라긴과 트레오닌으로 치환된 TPO 변이체 (이하 "gTPO2"라 명명함, 미국 특허 제5,989,538호)와 그의 N-말단을 포함하는 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO2/S1 및 pCMV-dhfr-gTPO2-N/S1을 제조한다.

이로부터 얻어진 TPO 변이체 발현벡터들의 종류와 그 발현벡터 내의 변화된 TPO 변이체 유전자 서열과 그로 인해 치환되는 아미노산 부위를 하기 표 2에 나타내었다.

이때, 유전자 암호 서열의 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 기인하여 상기 표 2에 표시된 DNA 염기서열과는 다르지만 표 2의 아미노산 서열을 암호화하는 조건에 부합하는 동종의 다른 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다. 즉, 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1/S1의 경우 82번 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는데, 이를 암호화하는 염기서열은 서열번호 17로 기재되는 염기서열뿐만 아니라 유전자 암호 서열의 코돈 축퇴성에 기인한 동종의 염기서열 (예를 들면, AAT 뿐만 아니라 AAC)을 포함할 수도 있다.

상기와 같이 제작된 TPO 변이체들의 생체외 세포 증식활성을 분석한 결과, 본 발명의 TPO 변이체들은 천연형 TPO와 거의 유사한 수준의 생체외 생물학적 활성을 나타내었다 (도 3 참조).

또한, 본 발명은 상기와 같이 제작된 TPO 변이체 발현벡터로 형질전환되어 TPO 변이체를 발현하는 동물세포 형질전환체를 제공한다.

구체적으로, 상기 발현벡터를 리포펙타민 방법을 이용하여 동물세포 CHO에 형질감염시켜 각각의 TPO 변이체를 발현하는 동물세포 형질전환체를 제조하였다.

이로부터, 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1/S1이 형질감염되어 TPO 변이체 gTPO1을 발현하는 CHO 변이 세포주를 1C9라 명명하고, 이를 2003년 4월 9일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10459). 또한, 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1이 형질감염되어 TPO 변이체 gTPO1-N을 발현하는 CHO 변이 세포주를 70이라 명명하고, 이를 2003년 4월 9일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10460).

상기 세포주를 무혈청 배지에서 대량으로 배양한 후 이로부터 각 변이체를 공지의 방법을 사용하여 정제할 수 있는데, 형질전환 세포주로부터 TPO 변이체를 정제하기 위해서 다양한 컬럼 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 S1 표지에 대한 단일클론항체가 결합된 세파로스 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 TPO 변이체를 정제하였다 (도 4 참조).

상기와 같이 정제된 TPO 변이체들의 생체내 생물활성을 조사하기 위하여, TPO 변이체들을 마우스에 투여한 후 혈소판 수의 변화를 측정한 결과, 본 발명의 TPO 변이체 gTPO1 또는 gTPO1-N이 천연형 TPO 또는 TPO-N은 물론 기존에 알려진 TPO 변이체인 gTPO2 또는 gTPO2-N보다 생물활성이 더욱 향상되었으며, 생체내 반감기도 천연형 TPO 또는 기존 TPO 변이체보다 더 길어졌음을 확인하였다 (도 5a 내지 도 6b 참조).

따라서, 본 발명의 TPO 변이체들은 TPO의 생체내 생물활성에는 영향을 미치지 않으면서 효과적으로 혈소판 전구세포의 증식을 유도하고 천연형 TPO보다 생체내 반감기가 더 길어져 항암치료나 골수이식에 따른 혈소판 감소증 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 TPO 변이체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양한 질환에 의한 혈소판 감소증의 예방 및 치료에 사용될 수 있는데, 예를 들면 항암제 투여, 방사선 요법에 의한 혈소판 감소증, 골수이식에 의한 혈소판 감소증, 간염·간경화에 의한 혈소판 감소증 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 TPO 변이체를 유효성분으로 함유한 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 유효성분으로서 체중 1 ㎏당 0.01 내지 1,000 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 증증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TPO 및 TPO 변이체 발현벡터의 제조

TPO 및 TPO 변이체를 CHO 세포에서 대량으로 생산하기 위하여 하기와 같이 발현벡터를 제작하였다. 우선, 발현된 TPO의 정제가 용이하도록 TPO의 C-말단에 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus; HBV) preS1 항원의 아미노산 35 내지 47에 해당하는 서열번호 16으로 기재되는 펩티드 표지 (peptide tag, 이하 "S1 표지"라 약칭함)를 붙여 발현벡터에 삽입하였다. 또한, 본 발명의 발현벡터는 TPO 및 TPO 변이체의 대량생산을 위하여 유전자의 증폭이 가능하도록 dhfr (dihydrofolate reductase) 유전자를 삽입한 벡터 (pCMV-dhfr)를 시발벡터로 사용하였다.

<1-1> TPO 발현벡터의 제조

TPO cDNA 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드 pcDNA3 (Park et al., J. Biol. Chem. 273: 256-261, 1998)를 주형으로 하고 서열번호 3 및 7의 시발체 쌍으로 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 1093 bp DNA 단편을 얻었다. 또한, HBV preS1의 발현벡터인 pGST-preS1 (Kim and Hong, Biotechnol. Lett. 17: 871-876, 1995)을 주형으로 사용하여 서열번호 5 및 6의 시발체 쌍으로 PCR을 수행하여 57 bp DNA 단편을 얻었다. 상기 두 DNA 단편을 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 6의 시발체 쌍을 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편을 HindⅢ와 XhoI으로 절단하여 얻어진 1136 bp의 DNA 단편을 시발벡터 pCMV-dhfr (대한민국 특허 제162021호)의 HindⅢ-XhoI 위치에 서브클로닝 (subcloning)하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-TPO/S1이라 명명하였다 (도 1).

<1-2> N-말단 TPO (TPO-N) 발현벡터의 제조

상기 실시예 <1-1>에서 사용된 TPO 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 시발체 쌍으로 PCR을 수행하여 618 bp의 DNA 단편을 얻었다. 또한, 상기 pGST-preS1을 주형으로 사용하여 서열번호 5 및 6의 시발체 쌍으로 PCR을 수행하여 57 bp DNA 단편을 얻었다. 상기 두 DNA 단편을 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 6의 시발체 쌍을 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편을 HindⅢ와 XhoI으로 절단하여 얻어진 630 bp의 DNA 단편을 상기 pCMV-dhfr의 HindⅢ-XhoI 위치에 서브클로닝하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-TPO-N/S1이라 명명하였다 (도 2).

<1-3> 변이체 gTPO1 발현벡터의 제조

TPO의 82번과 117번 아미노산을 N-당화시킨 TPO 변이체 (gTPO1)를 얻기 위해서, 82번 글리신 잔기와 83번 프롤린 잔기를 각각 아스파라긴과 알라닌으로 치환하고 117번 아르기닌 잔기를 아스파라긴으로 치환하였다. 이를 위하여 상기 실시예 <1-2>에서 제작된 pCMV-dhfr-TPO/S1을 주형으로 사용하여 서열번호 3 및 8의 시발체 쌍, 서열번호 9 및 10의 시발체 쌍과 서열번호 11 및 7의 시발체 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편인 337 bp, 118 bp 및 711 bp를 혼합한 후 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 7의 시발체 쌍을 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편을 HindⅢ와 KpnI으로 절단하여 얻어진 1136 bp의 DNA 단편을 pCMV-dhfr-TPO/S1의 HindⅢ-KpnI 위치에 서브클로닝하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-gTPO1/S1이라 명명하였다

<1-4> 변이체 gTPO1의 N-말단 절편 (gTPO1-N) 발현벡터의 제조

상기 실시예 <1-3>에서 제작된 변이체 gTPO1의 N-말단부위만을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 실시예 <1-2>에서 제작된 발현벡터 pCMV-dhfr-TPO-N/S1을 주형으로 사용하여 서열번호 3 및 8의 시발체 쌍, 서열번호 9 및 10의 시발체 쌍과 서열번호 11 및 4의 시발체 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편인 337 bp, 118 bp 및 237 bp를 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 DNA 단편을 HindⅢ와 KpnI으로 절단한 후, 얻어진 630 bp의 DNA 단편을 pCMV-dhfr-TPO-N/S1의 HindⅢ-KpnI 위치에 서브클로닝하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1이라 명명하였다.

<1-5> 변이체 gTPO2의 발현벡터 제조

상기 실시예 <1-3>에서 제작된 본 발명의 변이체 gTPO1의 생물활성과 비교하기 위하여, TPO의 30번과 120번 아미노산을 N-당화시킨 TPO 변이체 (gTPO2; 미국특허 제5,989,538호)를 하기와 같이 제작하였다. 구체적으로, 30번 프롤린 잔기와 32번 발린 잔기를 각각 아스파라긴과 트레오닌으로 치환하였고, 120번 알라닌 잔기와 122번 라이신 잔기를 각각 아스파라긴과 트레오닌으로 치환하였다. 이를 위하여, 상기 pCMV-dhfr-TPO-N/S1을 주형으로 사용하여 서열번호 3 및 12의 시발체 쌍, 서열번호 13 및 14의 시발체 쌍과 서열번호 15 및 7의 시발체 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 182 bp, 284 bp 및 699 bp의 DNA 단편을 혼합한 후 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 7의 시발체 쌍을 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻어진 1136 bp의 DNA 단편을 HindⅢ와 KpnI으로 절단한 후, pCMV-dhfr-TPO/S1의 HindⅢ-KpnI 위치에 서브클로닝하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-gTPO2/S1이라 명명하였다

<1-6> 변이체 gTPO2의 N-말단 절편 (gTPO2-N) 발현벡터의 제조

상기 실시예 <1-5>에서 제작된 변이체 gTPO2의 N-말단부위만을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 상기 pCMV-dhfr-TPO-N/S1을 주형으로 사용하여 서열번호 3 및 12의 시발체 쌍, 서열번호 13 및 14의 시발체 쌍과 서열번호 15 및 4의 시발체 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 182 bp, 284 bp 및 225 bp의 DNA 단편을 혼합한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 시발체 쌍으로 재조합 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻어진 630 bp의 DNA 단편을 pCMV-dhfr-TPO-N/S1의 HindⅢ-KpnI 위치에 서브클로닝하였다. 이 결과 얻어진 플라스미드를 pCMV-dhfr-gTPO2-N/S1이라 명명하였다.

상기 실시예 <1-1> 내지 <1-6>에서의 모든 PCR 반응조건은 Taq DNA 중합효소 (polymerase)를 사용하여 94℃에서 5분간 예비-변성 (pre-denaturation)한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분 어닐링 (anealing), 72℃에서 2분 연장 (elongation)의 반응을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 후연장 (post-elongation)을 수행하였다.

<실시예 2> TPO-N 및 TPO-N 변이체의 생체외 세포 증식활성 분석

상기 실시예 1에서 제작된 TPO-N 및 TPO-N 변이체의 생체외 세포 증식활성을 분석하기 위하여, TPO, TPO-N, gTPO1, gTPO1-N, gTPO2 및 gTPO2-N 발현벡터를 COS7세포에서 각각 발현시켰다. 구체적으로, 1×10⁶개의 COS7 세포 (ATCC CRL 1651)를 10% 송아지 혈청 (FBS, Gibco BRL사)이 포함된 DMEM (Gibco BRL사) 배지를 포함하는 100 ㎝ 접시에서 1일 동안 배양하였다. OPTI-MEM (Gibco BRL사) 배지에 리포펙타민 (lipofectamin, 2 ㎎/㎖, Gibco BRL사) 25 ㎕와 실시예 1에서 제작된 TPO 발현벡터 pCMV-dhfr-TPO/S1, TPO-N 발현벡터 pCMV-dhfr-TPO-N/S1, gTPO1 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1/S1, gTPO1-N 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1, gTPO2 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO2/S1 및 gTPO2-N 발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO2-N/S1의 DNA 7 ㎍씩을 각각 잘 혼합한 후, 제조사의 지침에 따라 COS7 세포에 형질감염 (transfection)시킨 다음, 37℃에서 48시간 동안 배양한 상등액을 회수하였다.

TPO 수용체를 가진 BaF3-Mpl 세포 (Park et al., J. Biol. Chem. 273: 256-261, 1998)를 이용하여 이 세포의 생장을 측정함으로써 TPO 및 TPO 변이체의 생체외 생물학적 활성을 비교하였다. BaF3-Mpl 세포는 10% FBS가 첨가된 RPMI1640 (Gibco BRL사) 배지에서 배양하였다. 96-웰 플레이트에 웰당 2×10⁴의 BaF3-Mpl 세포를 넣은 다음, 상기에서 얻은 각각의 발현벡터가 형질감염된 COS7 세포의 배양 상등액 및 상등액과 생리식염수를 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:124, 1:248, 1:496 및 1:992의 비율로 혼합하여 제조한 희석액을 각각 50 ㎕씩 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, PBS에 녹인 MTT (USB, 5 ㎎/㎖)를 웰당 10 ㎕씩 첨가하였다. 이를 다시 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액과 세포 침전물 (pellet)을 분리하였다. 세포 침전물에 DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Pierce)를 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 TPO 변이체들이 천연형 TPO와 거의 유사한 수준의 생체외 생물학적 활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3).

<실시예 3> TPO 발현 CHO 세포주의 제조

형질감염은 DHFR-결핍 중국 햄스터 난소 (DHFR-deficient Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포 DG44 (ATCC CRL 9096)를 대상으로 상기 실시예 2와 동일한 리포펙타민 방법을 이용하여 수행하였다. 이때, DG44 세포는 10% FBS가 포함되어 있는 DMEM-F12 (Gibco BRL사) 배지에서 배양하였다. 상기 실시예 1에서 제작된 TPO, TPO-N, gTPO1, gTPO1-N, gTPO2 및 gTPO2-N의 발현벡터 DNA 7 ㎍씩을 각각 리포펙타민 (2 ㎎/㎖) 25 ㎕가 첨가된 OPTI-MEM 배지와 잘 혼합한 후, 제조사의 지침에 따라 DG44 세포에 형질감염시켰다. 여기에 10% 투석된 FBS (Gibco BRL사)가 포함되어 있는 MEMα(Gibco BRL사) 배지를 첨가한 후 1 M HEPES 완충용액에 G418을 500 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 96-웰 플레이트에 웰당 2×10³의 세포가 되도록 분주하였다. 약 3주 후 자란 세포 클론들의 배양액에 존재하는 TPO의 양을 ELISA로 분석하여 OD (Optical Density, 흡광도) 값이 높은 세포주들을 1차로 선택하였다. 이들 CHO 세포주들의 배양액에 5∼20 nM MTX (methotraxate)를 첨가하여 살아남은 세포주들을 분리하였고, 이 세포주들의 TPO 생산성을 ELISA로 분석하여 그 중 생산성이 높은 세포주들을 최종적으로 선택하였다. 이로부터 선택된 TPO 발현세포주는 57, TPO-N 발현세포주는 19, 변이체 gTPO1 발현세포주는 1C9, 변이체 gTPO1-N 발현세포주는 70, 변이체 gTPO2 발현세포주는 20 및 변이체 gTPO2-N 발현세포주는 25라 명명되었다. 이 중, 본 발명의 변이체 gTPO1을 발현하는 pCMV-dhfr-gTPO1/S1 벡터가 형질감염된 CHO 변이 세포주 1C9를 2003년 4월 9일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였고 (수탁번호: KCTC 10459), 변이체 gTOP-N을 발현하는 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1 벡터가 형질감염된 CHO 변이 세포주 70을 2003년 4월 9일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10460).

<실시예 4> TPO 및 TPO 변이체의 생산 및 정제

다량의 TPO 및 TPO 변이체 단백질을 얻기 위해서, 상기 실시예 3으로부터 선택된 CHO 발현세포주들을 각각 무혈청배지인 CHO-S-SFM II (Gibco BRL사)에 접종한 후, 37℃에서 48시간 배양하여 TPO 및 TPO 변이체들을 대량으로 발현시켰다. 이로부터 얻은 배양 상등액을 S1 표지에 대한 단일클론 항체인 AP1이 결합된 세파로스 컬럼 (Aprogen, Inc사)에 결합시키고 친화성 크로마토그래피 (용출액: 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.7)를 수행하여 TPO 및 TPO 변이체들을 정제하였다.

TPO 변이체들에 당쇄가 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, TPO 변이체들의 밴드가 천연형 TPO 밴드보다 더 무거운 쪽에 나타남을 확인하였다 (도 4).

<실시예 5> TPO 및 TPO 변이체의 생체내 생물활성 측정

상기 실시예 4에서 정제한 TPO 및 TPO 변이체 단백질들의 생체내 생물활성은 이들을 투여한 마우스에서 혈소판 수의 변화를 측정하여 확인하였다.

구체적으로, 실험동물로는 Balb/c (8주령, 25±2 g, 웅성; 한국생명공학연구원 실험동물실) 또는 C57BL/6 (8주령, 23±2 g, 웅성; 한국생명공학연구원 실험동물실) 마우스를 사용하였고, 개체간의 차이를 최소화하기 위하여 상태가 양호한 개체만을 선별한 후 한 우리 (가로 27 ㎝ x 세로 22 ㎝ x 높이 13 ㎝)에 5마리씩 넣어 사육하였다. 동물은 온도 (22±2℃), 습도 (50 내지 60%), 환기 (15 내지 17 회/h), 암모니아 농도 (20 ppm 이하), 소음 (60 db 이하), 조도 (150 내지 300 Lux) 및 명암주기 (12L/12D)가 조절되는 SPF (specific pathogen free) 조건에서 사육하였다. 먹이는 조단백질 (22.0% 이상), 조지방 (4.5% 이상), 조섬유 (6.0% 이하), 조회분 (7.0% 이하) 및 미네랄 (4.0% 이상)이 함유되어 있는 배합사료 (대한바이오링크)를 CO⁶⁰ 방사선으로 조사하여 멸균된 것을 이용하였다. 모든 우리와 깔짚은 고온으로 멸균한 것을 사용하였다.

첫 번째 동물실험은 TPO, gTPO1 및 gTPO2의 생물활성을 C57BL/6 마우스에서 실험하였다. 대조군 동물에게는 BSA를 생리식염수에 0.2%가 되도록 녹여 체중 25 g당 0.5 ㎖씩 7일 동안 마우스의 피하에 주사하였다. 실험군 동물에게는 상기 실시예 4에서 정제된 TPO, gTPO1 및 gTPO2를 0.2% BSA가 포함된 생리식염수에 각각 20 ㎍/㎏/일과 40 ㎍/㎏/일의 농도로 준비한 후 마우스의 피하에 7일간 투여하였다. 혈액은 시료를 투여하기 전날 (0 일)과 5일, 8일, 12일 및 16일째 눈에서 300 ㎕씩 채혈한 후, 자동혈액분석기로 분석하였다.

그 결과, 대조군 동물의 혈소판은 실험기간 (0 내지 16일) 내내 유의성 있는 차이를 보이지 않았으나, TPO와 gTPO1 투여군에서는 혈소판 수가 5일째부터 증가하여 8일째 최고의 혈소판 수를 유지하다가 그 이후 점점 감소하여 16일째는 거의 정상수준으로 감소함을 보였다 (도 5a). TPO, gTPO1 또는 gTPO2를 20 ㎍/㎏ 투여한 경우에는 0일에 비하여 8일째에 혈소판 수가 75 내지 95% 증가하였고, 40 ㎍/㎏ 투여한 경우에는 140 내지 150% 증가하였다. gTPO1 투여군은 TPO 투여군에 비해 동일한 농도에서 혈소판의 수가 10 내지 20% 더 증가함을 보여 본 발명의 변이체 gTPO가 개선된 생물활성을 나타냄을 알 수 있으며, 또한 gTPO2보다 동일한 농도에서 혈소판의 수가 더 증가함을 확인하였다. 반면, 적혈구용적율은 모든 군에서 8일째가 0일보다 약 10% 감소하는 경향을 보였으나 16일째는 0일 수준으로 회복됨을 나타내었다 (도 5b).

두 번째 동물실험은 TPO N-말단만으로도 혈소판 증식 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여 천연형 TPO의 생물활성과 TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N의 생물활성을 Balb/c 마우스에서 측정하여 비교하였다. 이때, 한 그룹 당 10 마리씩 실험하였다. 대조군 동물에게는 BSA를 생리식염수에 0.2%가 되도록 녹여 체중 25 g당 0.5 ㎖씩 마우스의 피하에 주사하였고, 실험군 동물에게는 상기 실시예 4에서 정제된 TPO, TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N 단백질을 0.2% BSA가 포함된 생리식염수에 각각 녹인 후, 각 시료 당 500 nM/㎏/일, 1000 nM/㎏/일 및 2000 nM/㎏/일의 농도로 5일 동안 Balb/c 마우스의 피하에 주사하였다. 시료를 마지막 주사하고 24시간 후에 눈에서 채혈한 다음, 자동혈액분석기 (Hemavet, 3700)로 혈구를 분석하였다.

그 결과, TPO, TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N의 투여 농도가 증가함에 따라 혈소판의 수가 증가하였다 (도 6a). TPO-N은 천연형 TPO의 74 내지 89% 수준의 혈소판 생성 능력을 나타내었는데, 이는 TPO의 N-말단 도메인만으로도 거핵구 (megakaryocyte)의 발달과 성숙, 혈소판의 생성에 기능적인 역할을 수행할 수 있음을 나타내는 것이다. gTPO1-N은 1000 nM과 2000 nM/㎏/일 농도로 투여했을 경우에 천연형 TPO를 동일한 농도로 투여한 경우보다 각각 약 6% 및 22% 높은 생물활성을 나타내었다. 또한, gTPO1-N을 1000 nM과 2000 nM/㎏/일 농도로 투여했을 경우, 혈소판 수가 TPO-N을 투여했을 때보다는 각각 43% 및 55% 증가하였고, gTPO2-N을 투여했을 때보다는 각각 33% 및 44% 증가하였다. 이로부터 본 발명의 변이체 gTPO1-N의 생물활성이 TPO-N 뿐만 아니라 변이체 gTPO2-N보다 증가하였음을 확인하였다. 그러나, TPO 및 TPO 변이체 투여에 따른 적혈구용적률 (hematocrit)의 변화에는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다 (도 6b).

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 TPO 변이체는 천연형 TPO의 생물활성과 동일하거나 향상된 생물활성을 나타내면서도 천연형 TPO보다 생체내 반감기가 더 길어져 항암치료나 골수이식에 따른 혈소판 감소증 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 인간 트롬보포이에틴의 염기서열 및 아미노산 서열 중에서 본 발명의 TPO 변이체의 제조를 위하여 사용한 시발체의 위치를 표시한 것으로, 시발체 번호는 화살표의 시작부위에 표시하였고, 염기서열 및 아미노산 서열에서 굵은 글씨체는 TPO 단백질의 번역시작 코돈을 나타내는 1번 아미노산인 메치오닌 (methionine, ATG)과 성숙 (mature) TPO의 시작 아미노산인 세린 (serine, AGC)을 표시한 것이고, 아미노산 코돈에 밑줄 치고 그 아래 다른 코돈의 서열을 적은 것은 본 발명에 따라 제작된 TPO의 변이체의 변형된 아미노산 잔기를 표시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 TPO와 그의 N-말단만을 포함하는 TPO-N의 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따라 제작된 TPO와 TPO 변이체들의 생체외 생물활성을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 따라 제작된 TPO와 TPO 변이체들의 발현벡터가 각각 형질감염된 CHO 세포주로부터 분리·정제된 TPO, gTPO1, gTPO2, TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이고,

도 5a는 본 발명에 따라 분리·정제된 TPO, gTPO1 및 gTPO2 단백질의 마우스에서의 생체내 생물활성을 측정한 결과이고,

도 5b는 본 발명에 따라 분리·정제된 TPO, gTPO1 및 gTPO2 단백질의 투여에 따른 마우스의 적혈구용적율 (hematocrit) 변화를 조사한 결과이고,

도 6a는 본 발명에 따라 분리·정제된 TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N 단백질의 마우스에서의 생체내 생물활성을 측정한 결과이고,

도 6b는 본 발명에 따라 분리·정제된 TPO-N, gTPO1-N 및 gTPO2-N 단백질의 투여에 따른 마우스의 적혈구용적율 변화를 조사한 결과이다.

<110> APROGEN INC. <120> HUMAN THROMBOPOIETIN DERIVATIVES AND METHOD FOR PREPARING SAME <130> FPD/200302-130 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1073 <212> DNA <213> human thrombopoietin gene <400> 1 cacaagcttc cagaatggag ctgactgaat tgctcctcgt ggtcatgctt ctcctaactg 60 caaggctaac gctgtccagc ccggctcctc ctgcttgtga cctccgagtc ctcagtaaac 120 tgcttcgtga ctcccatgtc cttcacagca gactgagcca gtgcccagag gttcaccctt 180 tgcctacacc tgtcctgctg cctgctgtgg actttagctt gggagaatgg aaaacccaga 240 tggaggagac caaggcacag gacattctgg gagcagtgac ccttctgctg gagggagtga 300 tggcagcacg gggacaactg ggacccactt gcctctcatc cctcctgggg cagctttctg 360 gacaggtccg tctcctcctt ggggccctgc agagcctcct tggaacccag cttcctccac 420 agggcaggac cacagctcac aaggatccca atgccatctt cctgagcttc caacacctgc 480 tccgaggaaa ggtgcgtttc ctgatgcttg taggagggtc caccctctgc gtcaggcggg 540 ccccacccac cacagctgtc cccagcagaa cctctctagt cctcacactg aacgagctcc 600 caaacaggac ttctggattg ttggagacaa acttcactgc ctcagccaga actactggct 660 ctgggcttct gaagtggcag cagggattca gagccaagat tcctggtctg ctgaaccaaa 720 cctccaggtc cctggaccaa atccccggat acctgaacag gatacacgaa ctcttgaatg 780 gaactcgtgg actctttcct ggaccctcac gcaggaccct aggagccccg gacatttcct 840 caggaacatc agacacaggc tccctgccac ccaacctcca gcctggatat tctccttccc 900 caacccatcc tcctactgga cagtatacgc tcttccctct tccacccacc ttgcccaccc 960 ctgtggtcca gctccacccc ctgcttcctg acccttctgc tccaacgccc acccctacca 1020 gccctcttct aaacacatcc tacacccact cccagaatct gtctcaggaa ggg 1073 <210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> human thrombopoietin mature protein <400> 2 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn 165 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 325 330 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 cacaagcttc cagaatggag ctgac 25 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 ccggagccgg taccgagctc gttcagtgt 29 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 5 cggtaccggc tccggagcca acgcaaac 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 6 cctcgagtta ggggttgaag tccgag 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 7 agaggtaccc ccttcctgag acagattc 28 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 8 caagtgcatt cagttgtccc cg 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 9 ctgaatgcca cttgcctctt catc 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 10 ctgtggtatt gccctgtgga gga 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 11 cagggcaata ccacagctca caa 23 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 12 gtgagtctcg ttgcactggc tcagtct 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 13 tgcaacgaga ctcacccttt gccctac 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 14 atccgtgtga tttgtggtcc tgccctg 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 15 acaaatcaca cgggtcccaa ttgccat 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> hepatitis B virus preS1 antigen (S1 tag) <400> 16 Asn Ala Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe 1 5 <210> 17 <211> 1073 <212> DNA <213> human thrombopoietin derivative (gTPO1) <400> 17 cacaagcttc cagaatggag ctgactgaat tgctcctcgt ggtcatgctt ctcctaactg 60 caaggctaac gctgtccagc ccggctcctc ctgcttgtga cctccgagtc ctcagtaaac 120 tgcttcgtga ctcccatgtc cttcacagca gactgagcca gtgcccagag gttcaccctt 180 tgcctacacc tgtcctgctg cctgctgtgg actttagctt gggagaatgg aaaacccaga 240 tggaggagac caaggcacag gacattctgg gagcagtgac ccttctgctg gagggagtga 300 tggcagcacg gggacaactg aatgccactt gcctctcatc cctcctgggg cagctttctg 360 gacaggtccg tctcctcctt ggggccctgc agagcctcct tggaacccag cttcctccac 420 agggcaatac cacagctcac aaggatccca atgccatctt cctgagcttc caacacctgc 480 tccgaggaaa ggtgcgtttc ctgatgcttg taggagggtc caccctctgc gtcaggcggg 540 ccccacccac cacagctgtc cccagcagaa cctctctagt cctcacactg aacgagctcc 600 caaacaggac ttctggattg ttggagacaa acttcactgc ctcagccaga actactggct 660 ctgggcttct gaagtggcag cagggattca gagccaagat tcctggtctg ctgaaccaaa 720 cctccaggtc cctggaccaa atccccggat acctgaacag gatacacgaa ctcttgaatg 780 gaactcgtgg actctttcct ggaccctcac gcaggaccct aggagccccg gacatttcct 840 caggaacatc agacacaggc tccctgccac ccaacctcca gcctggatat tctccttccc 900 caacccatcc tcctactgga cagtatacgc tcttccctct tccacccacc ttgcccaccc 960 ctgtggtcca gctccacccc ctgcttcctg acccttctgc tccaacgccc acccctacca 1020 gccctcttct aaacacatcc tacacccact cccagaatct gtctcaggaa ggg 1073

Claims (16)

1. 서열번호 2로 기재되는 천연형 인간 트롬보포이에틴의 아미노산 서열에서 82번 글리신, 83번 프롤린 및 117번 아르기닌 잔기가 각각 아스파라긴, 알라닌 및 아스파라긴으로 치환되어 N-당쇄가 도입된 인간 트롬보포이에틴 변이체.
2. 제 1항의 인간 트롬보포이에틴 변이체를 암호화하는 재조합 인간 트롬보포이에틴 유전자.
3. 제 2항에 있어서,

   서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제 2항 또는 제 3항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
5. 제 4항에 있어서,

   플라스미드 pCMV-dhfr-gTPO1/S1인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
6. 제 4항의 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포주.
7. 제 6항에 있어서,

   발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1/S1로 형질전환된 포유동물 세포주 1C9 (수탁번호: KCTC 10459BP).
8. 서열번호 2로 기재되는 천연형 성숙 인간 트롬보포이에틴의 N-말단 1 내지 151번 아미노산 잔기로 이루어지고, 이중 82번 글리신, 83번 프롤린 및 117번 아르기닌 잔기가 각각 아스파라긴, 알라닌 및 아스파라긴으로 치환되어 N-당쇄가 도입된 인간 트롬보포이에틴 변이체.
9. 제 8항의 인간 트롬보포이에틴 변이체를 암호화하는 재조합 인간 트롬보포이에틴 유전자.
10. 제 9항에 있어서,

    서열번호 17로 기재되는 염기서열 중 78 내지 599번 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
11. 제 9항 또는 제 10항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
12. 제 11항에 있어서,

    플라스미드 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
13. 제 11항의 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포주.
14. 제 13항에 있어서,

    발현벡터 pCMV-dhfr-gTPO1-N/S1로 형질전환된 포유동물 세포주 70 (수탁번호: KCTC 10460BP).
15. 제 6항 또는 제 13항의 포유동물 세포주를 배양하고, 배양 상등액을 정제하여 인간 트롬보포이에틴 변이체를 얻는 것을 특징으로 하는 제 1항 또는 제 8항의 인간 트롬보포이에틴 변이체의 제조방법.
16. 제 1항 또는 제 8항의 인간 트롬보포이에틴 변이체를 유효성분으로 함유하는 혈소판 감소증 예방 및 치료용 조성물.