PT1489097E - Inibidores de plasmina humana derivados de domínios kunitz e ácidos nucleicos codificando os mesmos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "INIBIDORES DE PLASMINA HUMANA DERIVADOS DE DOMÍNIOS KUNITZ E ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANDO OS MESMOS" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da invenção

Esta invenção refere-se a novos mutantes do primeiro domínio Kunitz (Ki) do inibidor de coagulação associado a lipoproteínas humanas LACI, que inibem a plasmina. A invenção refere-se também a outros domínios Kunitz modificados que inibem a plasmina e a outros inibidores de plasmina.

Descrição dos Antecedentes da Técnica 0 agente principalmente responsável pela fibrinólise é a plasmina, a forma activada de plasminogénio. Muitas substâncias podem activar o plasminogénio, incluindo o factor de Hageman, a estreptocinase, a urocinase (uPA), o activador de plasminogénio do tipo de tecido (tPA) e a calicreína plasmática (pKA). A pKA é um activador da forma zimógena da urocinase e um activador directo do plasminogénio. A plasmina não é detectável no sangue circulante normal, mas o plasminogénio, o zimogénio, está presente a cerca de 3 μΜ. Uma quantidade adicional, não medida, de plasminogénio está ligada à fibrina e a outros componentes da matriz extracelular e das 1 superfícies celulares. 0 sangue normal contém o inibidor fisiológico da plasmina, o inibidor de plasmina 0.2 (0Í2-PI), a cerca de 2 μΜ. A plasmina e a 0Í2-PI formam um complexo 1:1. A plasmina da matriz ou ligada à célula é relativamente inacessível à inibição por αμ-ΡΙ. Assim, a activação da plasmina pode exceder a capacidade de neutralização de ομ-ΡΙ causando um estado profibrinolítico. A plasmina, assim que formada: i. degrada coágulos de fibrina, às vezes prematuramente; ii. digere o fibrinogénio (o material de construção dos coágulos) alterando a hemóstase por formação de coágulos friáveis, facilmente lisados, a partir dos produtos de degradação e inibição da adesão/agregação de plaquetas pelos produtos da degradação do fibrinogénio; iii. interage directamente com as plaquetas para clivar as glicoproteínas Ib e Ilb/IIIa impedindo a adesão ao endotélio lesionado em áreas de fluxo sanguíneo de elevado cisalhamento e impede a resposta de agregação necessária para a formação de um tampão de plaquetas (ADEL86); iv. inactiva proteoliticamente enzimas na via de coagulação extrínseca promovendo ainda um estado pró-lítico.

Robbins (ROBB87) reviu o sistema plasminogénio-plasmina em detalhe. 2

Fibrin01i.se e Fibrinogenólise A fibrinólise e a fibrinogenólise inapropriadas que conduzem a hemorragia excessiva são uma complicação frequente dos processos cirúrgicos que requerem circulação extracorporal, tal como o bypass cardiopulmonar, e são também encontradas na terapia trombolitica e transplante de órgãos, particularmente o fígado. Outros estados clínicos caracterizados pela incidência elevada da diátese hemorrágica incluem cirrose hepática, amiloidose, leucemia promielocítica aguda e tumores sólidos. A restauração da hemóstase requer a infusão de plasma e/ou de produtos plasmáticos, com riscos de reacção imunológica e exposição a patogénios, por exemplo, vírus da hepatite e VIH.

Uma grande perda de sangue pode resistir ao desaparecimento, mesmo com infusão maciça. Quando avaliada como extremamente grave, a hemorragia é tratada com antifibrinolíticos, tais como ácido ε-aminocapróico (Ver HOOV93) (EACA), ácido tranexâmico ou aprotinina (NEUH89). A aprotinina é também conhecida como

Trasylol™ e como Inibidor da Tripsina Pancreática Bovina (BPTI).

Doravante, a aprotinina será referida como "BPTI". 0 EACA e o ácido tranexâmico impedem somente a ligação da plasmina à fibrina por ligação a "kringles", deixando assim a plasmina como uma protease livre no plasma. 0 BPTI é um inibidor directo da plasmina e é o mais eficaz destes agentes. Devido ao potencial para complicações trombóticas, toxicidade renal e, no caso de BPTI, imunogenicidade, estes agentes são utilizados com cuidado e reservados geralmente como um "último recurso" (PUTT89). Todos os três agentes antifibrinolíticos não possuem especificidade e afinidade para o alvo e interagem com os tecidos e órgãos através de vias metabólicas não caracterizadas. As doses grandes necessárias devido à baixa afinidade, os efeitos secundários 3 devido à falta de especificidade e o potencial para reacção imunológica e a toxicidade para o órgão/tecido aumentam contra a utilização destes antifibrinoliticos profilacticamente para impedir hemorragias ou como uma terapia pós-operatória de rotina para evitar ou reduzir a terapia de transfusão. Deste modo, existe uma necessidade para um antifibrinolítico seguro. Os atributos essenciais de tal agente são: i. Neutralização de enzima(s) fibrinolitica(s) alvo relevante(s); ii. Ligação de elevada afinidade a enzimas alvo para minimizar a dose; iii. Especificidade elevada para o alvo, para reduzir efeitos secundários; e iv. Elevado grau de semelhança com a proteína humana para minimizar potencial imunogenicidade e toxicidade do órgão/tecido.

Todas as enzimas fibrinolíticas que são alvos candidatos para inibição por um antifibrinolítico eficaz são proteases de serina homólogas da quimotripina.

Hemorragia excessiva A hemorragia excessiva pode resultar de actividade de coagulação deficiente, de actividade fibrinolítica elevada ou de uma combinação dos dois estados. Na maioria das diáteses hemorrágicas deve controlar-se a actividade da plasmina. Pensa- 4 se que o efeito benéfico clinico de BPTI na redução da perda de sangue resulte da sua inibição da plasmina (KD ~ 0,3 nM) ou da calicreína plasmática (KD ~ 100 nM) ou de ambas as enzimas. GARD93 revê os trombolíticos actualmente utilizados, afirmando que, embora os agentes trombolíticos (e. g. , tPA) abram os vasos sanguíneos, a hemorragia excessiva é uma séria questão de segurança. Embora o tPA e a estreptocinase tenham um tempo de semi-vida curto no plasma, a plasmina que activam permanece no sistema por muito tempo e, como indicado, o sistema é potencialmente deficiente em inibidores de plasmina. Assim, a activação excessiva do plasminogénio pode conduzir a uma incapacidade perigosa para coagular e a hemorragia lesiva ou fatal. Um potente inibidor, altamente específico da plasmina seria útil nesses casos. 0 BPTI é um potente inibidor da plasmina, verificou-se no entanto, que é suficientemente antigénico para uma segunda utilização necessitar de um teste na pele. Além disso, as doses de BPTI necessárias para controlar a hemorragia são bastante elevadas e o mecanismo da acção não é muito claro. Alguns dizem que o BPTI actua sobre a plasmina enquanto outros dizem que actua inibindo a calicreína plasmática. FRAE89 relata que doses de aproximadamente 840 mg de BPTI a 80 doentes de cirurgia de coração aberto reduziram a perda de sangue para quase metade e a quantidade média aplicada por transfusão diminuiu em 74%. Miles Inc. introduziu recentemente o Trasylol nos EUA para a redução de hemorragia na cirurgia (Ver folheto do produto de Miles em Trasylol) . LOHM93 sugere que os inibidores de plasmina podem ser úteis no controlo da hemorragia na cirurgia do olho. SHER89 relata que o BPTI pode ser útil para limitar a hemorragia na cirurgia do cólon. 5

Um inibidor de plasmina que seja aproximadamente tão potente quanto o BPTI ou mais potente, mas que é quase idêntico a um domínio de proteína humana, oferece um potencial terapêutico semelhante mas apresenta menos potencial para antigenicidade.

Angiogénese: A plasmina é a enzima chave na angiogénese. ORE194 relata que um fragmento de plasmina de 38 kDa (sem o domínio catalítico) é um potente inibidor de metástase, indicando que a inibição da plasmina poderia ser útil no bloqueamento de metástases tumorais (FIDL94). Ver também ELLI92.

Plasmina A plasmina é uma protease de serina derivada do plasminogénio. 0 domínio catalítico da plasmina (ou "CatDom") cliva ligações peptídicas, particularmente depois de resíduos de arginina e, numa extensão menor, depois de lisinas e é muito homóloga à tripsina, quimotripsina, calicreína e muitas outras proteases de serina. A maior parte da especificidade da plasmina deriva da ligação de "kringles" à fibrina (LUCA83, VARA83, VARA84) . Na activação, a ligação entre ARG56i-Val562 é clivada, permitindo que o novo terminal amino forme uma ponte salina. Os "kringles" permanecem, não obstante, ligados ao CatDom através de dois dissulfuretos (COLM87, ROBB87).

Foi relatado que o BPTI inibe a plasmina com uma KD de cerca de 300 pM (SCHN86). AUER88 relata que BPTI(R15) tem uma Ki para a 6 plasmina de cerca de 13 nM, sugerindo que Ri5 é substancialmente pior do que Κχ5 para a ligação à plasmina. SCHN86 relata que o BPTI, em que os resíduos Ci4 e C38 foram convertidos em Alanina, tem uma Κ4 para a plasmina de cerca de 4,5 nM. KIDO88 relata que o APP-I tem uma K4 para a plasmina de cerca de 75 pM (7,5 x 10-11 Μ) , o inibidor mais potente da plasmina humana relatado até agora. DENN94a relata, no entanto, que o APP-I inibe a plasmina com uma Ki = 225 nM (2,25 x 1CT7 M) . A segunda e terceira bibliotecas da requerente foram concebidas sob a suposição de que o APP-I é um potente ligante da plasmina. 0 processo de selecção não seleccionou os resíduos de APP-I na maioria de posições e o relatório de DENN94a explica porque é que isto aconteceu.

Com técnicas de ADN recombinante, é possível obter uma nova proteína expressando um gene mutado que codifica um mutante do gene nativo da proteína. São conhecidas diversas estratégias para detectar mutações. Numa estratégia, alguns resíduos são mantidos constantes, outros são aleatoriamente mutados e outros são ainda mutados de um modo pré-determinado. Isto é denominado "variegação" e é definido em Ladner et al. Documento USP 5223409 que é aqui incorporado por referência. DENN94a e DENN94b reportam selecções de domínios Kunitz baseados em APP-I para ligação ao complexo do Factor de Tecido com o Factor Vllg. Estes não utilizam LACI-K1 como percursor e não utilizam a plasmina como alvo. O ligante com maior afinidade que obtiveram possuía uma KD para o seu alvo de cerca de 2 nM. O primeiro ciclo de selecção da requerente teve afinidade neste intervalo, mas os seleccionados do segundo ciclo da requerente são cerca de 25 vezes melhores do que isto. 7

Assume-se que as proteínas provenientes de espécies particulares tenham menos probabilidade de provocar uma resposta imunitária quando injectadas em indivíduos dessa espécie. Os anticorpos de murino são altamente antigénicos em humanos. Os anticorpos "quiméricos" possuindo domínios constantes humanos e domínios variáveis de murino são decididamente menos antigénicos. Os anticorpos denominados "humanizados" têm domínios constantes humanos e domínios variáveis em que as CDR são provenientes de anticorpos de murino enquanto a estrutura dos domínios variáveis são de origem humana. Os anticorpos "humanizados" são muito menos antigénicos do que os anticorpos "quiméricos". Num anticorpo "humanizado", cinquenta a sessenta resíduos da proteína são de origem não humana. As proteínas desta invenção compreendem, na maioria dos casos, apenas cerca de sessenta aminoácidos e normalmente existem dez ou apenas algumas diferenças entre a proteína manipulada e a proteína percursora. Embora os humanos desenvolvam anticorpos mesmo contra proteínas humanas, tais como insulina humana, estes anticorpos tendem a ligar-se fracamente e frequentemente não impedem que a proteína injectada desempenhe a função biológica pretendida. Utilizar uma proteína da espécie a ser tratada não garante que não haja nenhuma resposta imunitária. Não obstante, escolher uma proteína com uma sequência muito próxima de uma proteína humana reduz grandemente o risco de uma forte resposta imunitária em humanos.

Os domínios Kunitz são altamente estáveis e podem ser produzidos eficientemente em leveduras ou em outros organismos hospedeiros. Foram relatados, pelo menos, dez domínios Kunitz humanos. Embora se tenha pensado, a dada altura, que o APP-I era um potente inibidor da plasmina, não existem, actualmente, quaisquer domínios Kunitz humanos que inibam a plasmina tão bem 8 como o BPTI o faz. Deste modo, é um objectivo da presente invenção proporcionar sequências do domínio Kunitz que sejam inibidores potentes da plasmina e próximos em sequência dos domínios Kunitz humanos. A utilização de mutagénese específica para o local, seja não aleatória ou aleatória, para obter proteínas de ligação mutantes com actividade melhorada é conhecida na técnica, mas o sucesso não é assegurado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção divulga mutantes de domínios Kunitz humanos homólogos com BPTI que inibem potentemente a plasmina humana. Em particular, esta invenção divulga mutantes de um domínio de LACI humano que são provavelmente não imunogénicos para os humanos e que inibem a plasmina com uma KD, de um modo preferido, de cerca de 5 nM ou inferior, de um modo mais preferido, de cerca de 300 pM ou inferior e, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 100 pM ou inferior. A invenção também divulga a utilização terapêutica e de diagnóstico destas novas proteínas.

As proteínas que inibem a plasmina são úteis para a prevenção ou tratamento dos estados clínicos provocados ou exacerbados pela plasmina, incluindo fibrinólise ou fibrinogenólise inapropriadas, hemorragia excessiva associada com trombolíticos, hemorragia pós-operatória e androgénese inapropriada. Os mutantes de ligação a plasmina, inibidores ou não, são úteis para o ensaio da plasmina nas amostras, in vitro, para áreas de imagiologia da actividade da plasmina, in vivo, e para a purificação de plasmina. 9

Os mutantes preferidos QS4 e NS4 foram seleccionados a partir de uma biblioteca que permitiu cerca de 50 milhões de proteínas que têm variabilidade nas posições 13, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 e 39. Estas proteínas têm uma sequência de aminoácidos quase idêntica a uma proteína humana mas inibem a plasmina com uma Ki de cerca de 2 nM (i. e., cerca de 6 vezes menos potente do que BPTI, mas 100 vezes melhor do que APP-I).

Uma proteína especialmente preferida, SPI11, foi seleccionada de uma biblioteca que permite variabilidade nas posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 e 21, e possui uma afinidade para a plasmina que é menos de 100 pM (i. e., cerca de 3 vezes superior à ligação a BPTI), e é ainda muito mais semelhante em sequência ao LACI, uma proteína humana, do que BPTI, uma proteína bovina. Outros mutantes LACI-K1 seleccionados desta biblioteca e que se pensou possuírem uma afinidade muito elevada para a plasmina incluem SPI15, SPI08 e SPI23. Uma biblioteca adicional que permite variação nas posições 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 31, 32, 34, 35 e 39 foi rastreada e foi encontrada uma sequência de consenso (SPIconl). As variantes apresentadas como melhores do que QS4 e, deste modo, mais preferidas, incluem SPI51 e SPI47. Foram identificadas sequências que provavelmente possuem uma afinidade muito elevada para a plasmina embora retenham uma sequência de aminoácidos essencialmente humana e incluem as sequências SPI60, SPI59, SPI42, SPI55, SPI56, SPI52, SPI46, SPI49, SPI53, SPI41 e SPI57. A informação para a sequência de aminoácidos que confere afinidade elevada para o sítio activo da plasmina pode ser transferida a outros domínios Kunitz, particularmente aos domínios Kunitz de origem humana; são divulgadas diversas concepções destas proteínas. 10

Os inibidores de plasmina preferidos aqui divulgados preenchem um ou mais das seguintes condições desejáveis: 1) o Ki para a plasmina é no máximo 2 0 nM, de um modo preferido, não mais do que cerca de 5 nM, de um modo mais preferido, não mais do que cerca de 300 pM e , de um modo ainda mais preferido, não mais do que cerca de 100 pM, 2) o inibidor compreende um domínio Kunitz que preenche os requisitos apresentados na Tabela 14, com o número dos resíduos em referência a BPTI, 3) nas posições 12-21 e 32-39 do domínio Kunitz, um dos tipos de aminoácidos listados para essa posição na Tabela 15, e 4) o inibidor é mais semelhante em sequência de aminoácidos a uma sequência de referência seleccionada do grupo SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4, NS4, LACI-K2 humano, LACI-K3 humano, a3 KuDom de colagénio humano, DOMÍNIO 1 de TFPI-2 humano, DOMÍNIO 2 de TFPI-2 humano, DOMÍNIO 3 de TFPI-2 humano, ITI-K1 humano, ITI-K2 humano, protease NEXIN-II humana, APP-I humano, DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.2.1, DPI-1.3.1, DPI-2.1, DPI-3.1.1, DPI-3.2.1, DPI-3.3.1, DP1-4.1.1, DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4, DPI-4.2.5, DPI-5.1, DPI-5.2, DPI-6.1, DPI-6.2 do que é a sequência de aminoácidos do referido domínio Kunitz em relação à sequência de BPTI. 11

NOMENCLATURA

Aqui, as afinidades são apresentadas como KD (Kd(A,B)=[A][B]/[A-B]). Uma KD numericamente menor reflecte uma maior afinidade. Para os objectivos desta invenção, uma "proteína inibidora de plasmina" é uma que se liga e inibe a plasmina com uma Ki de cerca de 20 nM ou inferior. "Inibição" refere-se ao bloqueamento da actividade catalítica da plasmina e, deste modo, é mensurável em ensaios in vitro utilizando substratos cromogénicos ou fluorogénicos ou em ensaios envolvendo macromoléculas.

Os resíduos de aminoácidos são discutidos de três modos: nome completo do aminoácido, código convencional de três letras e código convencional de letra única. A Tabela utiliza apenas o código de letra única. O texto utiliza nomes completos e código de três letras sempre que a clareza o exija. A = Ala G = Gly M = Met S = Ser C = Cys H = His N = Asn T = Thr D = Asp I = Ile P = Pro V = Vai E = Glu K = Lys Q = Gin W = Trp F = Phe L = Leu R = Arg Y = Tyr

As sequências "substancialmente homólogas" são idênticas em, pelo menos, 51%, de um modo mais preferido em, pelo menos, 80%, em qualquer das regiões especificadas. Aqui as sequências que são idênticas são entendidas como sendo "substancialmente homólogas". As sequências serão ainda "substancialmente homólogas" se numa região de, pelo menos, 20 aminoácidos, estas forem suficientemente semelhantes (51% ou mais) mas fora da 12 região de comparação difiram totalmente. Uma inserção de um aminoácido numa sequência em relação às outras conta como um desemparelhamento. De um modo mais preferido, não mais do que seis resíduos são diferentes, além dos terminais. De um modo preferido, a divergência na sequência, particularmente nas regiões especificadas, está na forma de "modificações conservadoras". "Modificações conservadoras" são definidas como (a) substituições conservadoras de aminoácidos como definido na Tabela 9, e (b) inserções simples ou múltiplas ou eliminações de aminoácidos nos terminais, na fronteira dos domínios, em ansas ou em outros segmentos de mobilidade relativamente elevada.

De um modo preferido, excepto nos terminais, não são inseridos ou eliminados mais do que seis aminoácidos em qualquer dos locais e as modificações são fora das regiões conhecidas como contendo sítios de ligação importantes.

Dominios Kunitz

Aqui "domínio Kunitz" e "KuDom" são utilizados indistintamente para significar um homólogo de BPTI (não do inibidor da tripsina de soja de Kunitz) . Um KuDom é um domínio de uma proteína possuindo, pelo menos, 51 aminoácidos (e até cerca de 61 aminoácidos) contendo, pelo menos, dois e, de um 13 modo preferido, três dissulfuretos. Aqui, os resíduos de todos os domínios Kunitz são numerados em referência a BPTI (i. e., resíduos 1-58). Assim, o primeiro resíduo de cisteína é o resíduo 5 e a última cisteína é 55. Uma sequência de aminoácidos deve, para os objectivos desta invenção, ser considerada um domínio Kunitz se puder ser alinhada, com três ou menos desemparelhamentos, com a sequência apresentada na Tabela 14. Uma inserção ou eliminação de um resíduo contarão como um desemparelhamento. Na Tabela 14, "x" emparelha com qualquer aminoácido e "X" emparelha com os tipos listados para essa posição. Os dissulfuretos ligam, pelo menos, dois de: 5 a 55, de 14 a 38 e 30 a 51. O número de dissulf uretos pode ser reduzido em um, mas nenhuma das cisteínas padrão deve ser deixada desemparelhada. Assim, se uma cisteína for alterada, então é adicionada uma cisteína de compensação numa posição apropriada ou a cisteína desemparelhada é também substituída por uma não cisteína (o último é geralmente preferido). Por exemplo, o inibidor da protease da glândula acessória masculina de Drosophila funebris não tem nenhuma cisteína na posição 5, mas tem uma cisteína na posição -1 (imediatamente antes da posição 1); presumivelmente isto dá forma a um dissulfureto com Cys55. Se Cysi4 e Cys38 forem substituídas, a exigência de Glyi2, (Gly ou Ser) 37 e de Gly36 caem. Podem ser ligados desde zero a muitos resíduos, incluindo domínios adicionais (incluindo outros KuDoms), a qualquer extremidade de um domínio Kunitz.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Os inibidores de proteases, tais como os domínios Kunitz, funcionam por ligação ao sítio activo da protease, de modo que uma ligação peptídica ("a ligação clivável") é: 1) não clivada, 14 2) clivada muito lentamente ou 3) clivada sem nenhum efeito porque a estrutura do inibidor impede a libertação ou a separação dos segmentos clivados. Nos domínios Kunitz, as ligações dissulfureto actuam para manter a proteína junta, mesmo se forem clivadas ligações peptídicas expostas. Do resíduo do lado amino da ligação clivável, e movendo-se a partir da ligação, os resíduos são denominados convencionalmente Pl, P2, P3, etc. Os resíduos que se seguem à ligação clivável são denominados Pl', P2', P3', etc. (SCHE67, SCHE68) . É geralmente aceite que cada protease de serina tem locais (compreendendo vários resíduos) Sl, S2, etc. que recebem os grupos laterais e os átomos da cadeia principal dos resíduos Pl, P2, etc. do substrato ou inibidor e os sítios Sl', S2', etc. que recebem os grupos laterais e os átomos da cadeia principal de Pl', P2', etc. do substrato ou inibidor. São as interacções entre os locais S, os grupos laterais P e os átomos da cadeia principal que dão a especificidade da protease em relação aos substratos e a especificidade dos inibidores em relação às proteases. Porque o fragmento que possui a nova extremidade amino deixa a protease primeiro, muitos profissionais que concebem pequenas moléculas inibidoras de protease concentraram-se em compostos que se ligam aos locais Sl, S2, S3, etc. LASK80 revê proteínas inibidoras de protease. Alguns inibidores têm vários locais reactivos numa cadeia polipeptídica e estes domínios têm geralmente sequências, especificidades e mesmo topologias diferentes. Sabe-se que substituindo aminoácidos nas regiões P5 a P5' influencia-se a especificidade de um inibidor. Previamente, a atenção foi focalizada no resíduo Pl e naqueles muito próximos dele porque estes podem alterar a especificidade de uma classe de enzimas noutra. LASK80 sugere que entre os KuDoms, os inibidores com Pl=Lys ou Arg inibem a 15 tripsina, aqueles com Pl=Tyr, Phe, Trp, Leu e Met inibem a quimotripsina e aqueles com Pl=Ala ou Ser inibem provavelmente a elastase. Entre os inibidores de Kazal, LASK80 continua, os inibidores com Pl=Leu ou Met são inibidores fortes da elastase e na família do Bowman-Kirk a elastase é inibida com Pl=Ala, mas não com Pl=Leu. Tais alterações limitadas não fornecem inibidores com afinidade verdadeiramente elevada (i. e., melhores do que 1 a 10 nM).

Os domínios Kunitz são definidos acima. A estrutura 3D (a elevada resolução) de BPTI (o domínio Kunitz arquétipo) é conhecida. Uma das estruturas de raios-X foi depositada no banco de dados de Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". A estrutura 3D de alguns homólogos de BPTI (EIGE90, HYNE90) é conhecida. São conhecidas, pelo menos, setenta sequências de KuDom. Os homólogos humanos conhecidos incluem três KuDoms de LACI (WUNT88, GIRA89, N0V089), dois KuDoms de Inibidor de Inter-a-Tripsina, APP-I (KID088), um KuDom de colagénio e três KuDoms de TFPI-2 (SPRE94).

LACI O inibidor de coagulação associado a lipoproteína (LACI) é uma fosfoglicoproteína do soro humano com um peso molecular de 39 kDa (sequência de aminoácidos na Tabela 1) contendo três

KuDoms. A requerente refere-se doravante à proteína como LACI e aos seus domínios Kunitz como LACI-K1 (resíduos 50 a 107), LACI-K2 (resíduos 121 a 178) e LACI-K3 (213 a 270) . A sequência de ADNc do LACI é descrita em WUNT88. GIRA89 relata estudos de mutagénese em que os resíduos PI de cada um dos três KuDoms foram alterados. LACI-K1 inibe o Factor Vila (F.VII) quando 16 F.VII é complexado com o factor do tecido e LACI-K2 inibe o Factor Xa. Não se sabe se LACI-K3 inibe qualquer coisa. Nem LACI nem nenhum dos KuDoms de LACI são um potente inibidor da plasmina.

Os KuDoms desta invenção são substancialmente homólogos com LACI-K1, mas diferem nos modos em que conferem uma forte actividade inibidora da plasmina, discutida a seguir. Outros KuDoms desta invenção são homólogos com outros KuDoms que ocorrem naturalmente, particularmente com outros KuDoms humanos. Para utilização em humanos, as proteínas desta invenção são concebidas para serem mais semelhantes em sequência a um KuDom humano do que a BPTI, para reduzir o risco de causar uma resposta imunitária.

Primeira biblioteca de LACI-K1 e Seleccionados para a Ligação a Plasmina A requerente rastreou uma primeira biblioteca de LACI-K1 para os mutantes que possuem uma afinidade elevada para a plasmina humana e obtive as sequências mostradas na Tabela 2 e na Tabela 3. Estas sequências podem ser sumariadas como apresentado na Tabela 16, onde "resíduos preferidos" são aqueles que aparecem em, pelo menos, uma das 32 variantes identificadas como ligando plasmina. As preferências nos resíduos 13, 16, 17, 18 e 19 são fortes, como apresentadas na Tabela 17. Embora o intervalo dos tipos permitidos em 31 e 32 seja limitado, a selecção indica que é preferido um grupo acídico em 31 e um grupo neutro em 32. No resíduo 17, foi preferido Arg; Lys, um outro aminoácido positivamente carregado, não estava na biblioteca e pode ser um substituto apropriado para Arg. Muitos 17 tipos de aminoácidos nas posições 34 e 39 são consistentes com a ligação da plasmina com elevada afinidade, mas alguns tipos podem impedir a ligação.

Deve ser entendido que a Requerente não sequenciou todos os isolados positivos desta ou de outras bibliotecas aqui divulgadas, e que algumas das proteínas possíveis podem não estar presentes em quantidades detectáveis. A requerente preparou uma das proteínas seleccionadas, QS4, mostrada na Tabela 2. A QS4 inibe a plasmina com uma Ki de cerca de 2 nM. Embora este nível da inibição seja menor do que o do BPTI, a QS4 é uma molécula preferida para a utilização em humanos porque tem menos potencial para imunogenicidade. Outras proteínas mostradas na Tabela 2 e na Tabela 3 são muito provavelmente inibidores potentes da plasmina e provavelmente apresentam pouca ameaça de antigenicidade.

Segunda Biblioteca que Varia os Residuos 10-21 A requerente preparou uma segunda biblioteca de derivados de LACI-K1 apresentados na Tabela 5 e permitiu variação nos resíduos 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 e 21. Isto foi rastreado para ligação a plasmina e foram obtidas as proteínas apresentadas na Tabela 6. 0 "consenso" na Tabela 6 é E10GPCRARFERW21, onde os sete resíduos sublinhados diferem de LACI-K1. Somente aminoácidos acídicos (Glu: 17 ou Asp: 15) foram vistos na posição 10; Lys e Asn não são aceitáveis. Como Glu e Asp apareceram com frequência praticamente igual, estes provavelmente contribuem igualmente 18 para a ligação. Os resíduos acídicos não foram vistos na posição 11. A Thr era o mais comum (11/32) com Ser a aparecer frequentemente (9/32); Gly apareceu 8 vezes. Em 13, Pro foi fortemente preferido (24/32) com Ala em segundo com 5/32. Em 15, Arg foi fortemente preferido (25/32), mas apenas alguns isolados (7/32) possuíam Lys. Note-se que BPTI(Ri5) é um inibidor de plasmina pior do que BPTI. Em 16, foi preferido Ala (22/32), mas Gly apareceu frequentemente (10/32). Em 17, Arg era o mais comum (15/32), com Lys em segundo (9/32). Nos resíduos 17 e 18, o APP-I possui Met e Ile. Em 18, a requerente permitiu Ile ou Phe. Somente quatro isolados têm Ile em 18 e nenhum destes tem Met em 17. Isto foi surpreendente à luz de KID088, mas completamente compreensível à luz de DENN94a. Esta colecção de isolados tem uma distribuição larga em 19: (Glu:8, Pro:7, Asp:4, Ala:3,

His:3, Gly:2, Gln:2, Asn:l, Ser:l. e Arg:l), mas os grupos laterais acídicos são fortemente preferidos face aos básicos. Em 21, a distribuição foi (Trp:16, Phe:14, Leu:2, Cys:0); BPTI tem

Tyr em 21. A ligação do fago clonalmente puro que apresenta uma ou outra destas proteínas foi comparada à ligação do fago de BPTI (Tabela 6). A requerente determinou a Ki da proteína SPI11 e verificou que era cerca de 88 pM, que é substancialmente superior a BPTI.

Terceira Biblioteca que Varia 10-21 e 31-39 A requerente utilizou uma mistura de fagos da segunda biblioteca (variada nos resíduos 10, 11, 13, 15, 16, 17, 10 18, 19 e 21) que tinha sido seleccionada duas vezes para a ligação a plasmina como uma fonte de ADN em que a variegação foi 19 introduzida nos resíduos 31, 32, 34, 35 e 39, como apresentado na Tabela 7.

Esta biblioteca foi rastreada em três ciclos para ligação a plasmina e foram obtidos os isolados apresentados na Tabela 8. A distribuição dos tipos de aminoácidos é apresentada na Tabela 18, onde "x" significa que o tipo de aminoácido não era permitido e indica o tipo selvagem para LACI-K1.

Estas sequências deram um consenso na região 10-21 e 31-40 de EiqTGPCRAKFDRW2i . . .E31AFVYGGCGG40 (SPIconl na Tabela 4). Os dez aminoácidos sublinhados diferem de LACI-K1. Em oito posições variadas, um segundo tipo era bastante comum: Asp em 10, Ala em 11, Glu em 19, Phe em 21, Thr em 31, Pro ou Ser em 32, Leu ou Ile em 34 e Glu em 39. Na posição 17, 0 inibidor altamente potente SPI11 tem R. Deste modo, a sequência D10TGPCRARFDRF21. . . E31AFIYGGCEG40 (DPI-1.1.1 Na Tabela 4) difere de LACI-K1 por somente seis resíduos, emparelha as sequências seleccionadas nos resíduos possuindo um consenso forte, e preferiu substituições nas posições 10, 17, 21, 34, e 39. Espera-se que DPI-1.1.1 tenha uma afinidade muito elevada para a plasmina e pouco potencial para imunogenicidade em humanos. O teste preliminar das proteínas SPI11, BPTI, SPI23, SPI51, SPI47, QS4, SPI22, SPI54 e SPI43 para a actividade inibidora da plasmina colocou-as na ordem apresentada. A SPI11 é significativamente mais potente do que BPTI com um Ki de cerca de 88 pM. A SPI23 e a SPI51 são muito semelhantes em actividade e apenas ligeiramente menos potentes do que BPTI. A SPI47 é menos potente do que SPI51 mas melhor do que QS4. A SPI22 é mais fraca do que QS4. A SPI54 e a SPI43 não são tão potentes como QS4, Ki provavelmente > 4 nM. 20

Um KuDom que é altamente homólogo nos resíduos 5-55 com qualquer das sequências SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4 e NS4, como apresentadas na Tabela 4, é provavelmente um potente inibidor (KD > 5 nM) da plasmina e possui um baixo potencial para antigenicidade em humanos. De um modo mais preferido, para ter uma elevada afinidade para a plasmina, um KuDom deveria ter uma sequência que é idêntica nos resíduos 10-21 e 31-39 e que tem cinco ou menos diferenças nos resíduos 5-9, 22-30 e 40-55, comparativamente com qualquer das sequências SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4 e NS4.

Utilizando as sequências seleccionadas e os dados de ligação dos KuDoms seleccionados e naturais, a requerente pode definir uma fórmula para um KuDom inibidor de plasmina de elevada afinidade, que possa ser aplicada a outros percursores de KuDom humano. Em primeiro lugar, o KuDom deve respeitar aos requisitos na Tabela 14. As substituições mostradas na Tabela 15 conferem provavelmente actividade inibidora da plasmina de elevada afinidade em qualquer KuDom. Deste modo, uma proteína que contenha uma sequência que seja um KuDom, como apresentada na Tabela 14 e que contém em cada uma das posições 12-21 e 32-39 um tipo de aminoácidos apresentado na Tabela 15 para essa posição, será provavelmente um potente inibidor da plasmina humana. De um modo mais preferido, a proteína teria um tipo de aminoácido apresentado na Tabela 15 para todas as posições listadas na Tabela 15. Para reduzir o potencial para uma resposta imunitária, deverá utilizar-se um ou outro KuDom humano como proteína percursora para dar a sequência externa à região de ligação. 21 É provável que uma proteína que compreenda uma sequência de aminoácidos que seja substancialmente homóloga a SPI11 do resíduo 5 ao resíduo 55 (como apresentado na Tabela 4) e que seja idêntica a SPI11 nas posições 13-19, 31, 32, 34 e 39, irá inibir a plasmina humana com uma Ki de 5 nM ou menos. A SPI11 difere de LACI-K1 em 7 posições. Não está claro que estas substituições sejam igualmente importantes na promoção da ligação a plasmina e na inibição. Existem sete moléculas em que uma das posições substituídas de SPI11 é alterada no resíduo encontrado em LACI-K1 (i. e., "revertida"), 21 em que dois dos resíduos são revertidos, 35 em que três resíduos são revertidos, 35 em que quatro são revertidos, 21 em que cinco são revertidos e sete em que seis são revertidos. Espera-se que aqueles com mais resíduos revertidos tenham menos afinidade para a plasmina, mas também, menos potencial para imunogenicidade. Um especialista da técnica pode escolher uma proteína com potência suficiente e baixa imunogenicidade desta colecção de 126. E também possível que as substituições em SPI11 por aminoácidos que diferem de LACI-K1 possam reduzir a imunogenicidade, sem que reduzam a afinidade para a plasmina a um grau que torne a proteína inadequada para utilização como um fármaco.

KUDOM CONCEBIDOS COMO INIBIDORES DE PLASMINA

Doravante, "DPI" significará um "Inibidor de Plasmina Concebido", que são KuDoms que incorporam a informação da sequência de aminoácidos da série de moléculas SPI, especialmente SPI11. As sequências dos diversos DPI e suas proteínas percursoras são apresentadas na Tabela 4. 22

As sequências DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.1.4, DPI-1.1.5 e DPI-1.1.6 (na Tabela 4) diferem de LACI-K1 por 6, 5, 5, 4, 3 e 2 aminoácidos, respectivamente, e representam uma série em que a afinidade para a plasmina pode diminuir lentamente, quando a semelhança com uma sequência humana aumenta de modo a reduzir a probabilidade de imunogenicidade. As selecções de cada uma das bibliotecas mostram que M18F é uma substituição chave e que I17K ou I17R são muito importantes. As selecções da segunda e terceira biblioteca indicam que Arg é fortemente preferido em 15, que um grupo lateral ácido em 11 é desvantajoso para a ligação. 0 inibidor altamente potente SPI11 difere do consenso tendo R17, como o faz BPTI. 0 DPI-1.1.1 contém as mutações D11T, K15R, I17R, M18F, K19D e E32A e será provavelmente altamente potente como um inibidor de plasmina. 0 DPI-1.1.2 contém o D11T, K15R, I17R, M18F, e K19D e será provavelmente altamente potente. 0 DPI-1.1.3 contém as mutações D11A, K15R, I17R, M18F e K19D em relação a LACI-K1. 0 DPI-1.1.3 difere de DPI-1.1.2 por possuir An em vez de Tu; ambas as proteínas são provavelmente inibidoras muito potentes da plasmina. 0 DPI-1.1.4 contém as mutações I17R, M18F, K19D e E32A e deve ser bastante potente. Como DPI-1.1.4 tem menos mutações que SPI11, pode ser menos potente, mas é também provavelmente menos imunogénico. 0 DPI-1.1.5 contém as mutações I17R, M18F e K19D. Esta proteína é provavelmente um bom inibidor e é provavelmente menos imunogénico. 0 DPI-1.1.6 contém somente as mutações I17R e M18F mas deve inibir a plasmina. A proteína DPI-1.2.1 é baseada em LACI-K2 humano e mostrada na Tabela 4. As mutações P11T, I13P, Y17R, I18F, T19D, R32E, K34I e L39E conferem provavelmente afinidade elevada para a plasmina. Algumas destas substituições podem não ser em particular, necessárias, em particular, P11T e T19D podem não ser 23 necessárias. Outras mutações que podem melhorar a afinidade para a plasmina incluem E9A, D10E, G16A, Y21W, Y21F, R32T, K34V e L39G. A proteína DPI-1.3.1 (Tabela 4) é baseada no LACI—K3 humano. As mutações R11T, L13P, N17R, E18F, N19D, R31E, P32E, K34I e S36G pretendem conferir afinidade elevada para a plasmina. Algumas destas substituições podem não ser necessárias; em particular, N19D e P32E podem não ser necessárias. Outras alterações que podem melhorar KD incluem D10E, N17K, F21W e G39E. A proteína DPI-2.1 (Tabela 4) é baseada no KuDom a3 do colagénio humano. As mutações E11T, T13P, D16A, F17R I18F, L19D, A31E, R32e e W34I conferem provavelmente afinidade elevada para a plasmina. Algumas destas substituições podem não ser necessárias; em particular, L19D e A31E podem não ser necessárias. Outras mutações que podem melhorar a afinidade para a plasmina incluem K9A, D10E, D16G, K20R, R32T, W34V e G39E. 0 DPI-3.1.1 (Tabela 4) é derivado do domínio 1 de TFPI-2 humano. É provável que as trocas Y11T, L17R, L18F, L19D e R31E confiram afinidade elevada para a plasmina. A mutação L19D pode não ser necessária. Outras mutações que podem conter ligação da plasmina incluem Y21W, Y21F, Q32E, L341, L34V e E39G. 0 DPI-3.2.1 (Tabela 4) é derivado do domínio 2 de TFPI-2 Humano. Este domínio percursor contém inserções após o resíduo 9 (um resíduo) e 42 (dois resíduos). É provável que as mutações (V9SVDDQC14 substituído por V9ETGPC14) , E15R, S17K, T18F, K32T, F34V e (H39RNRIENR44, substituído por (E39GNRNR44) confiram afinidade para a plasmina. Devido à necessidade de alterar o 24 número dos aminoácidos, o DPI-3.2.1 tem um potencial mais elevado para imunogenicidade do que outros KuDoms humanos modificados. 0 DPI-3.3.1 (Tabela 4) é um derivado do domínio 3 de TFPI—2 humano. É provável que as substituições E11T, L13P, S15R, N17R, V18F, T341 e T36G confiram afinidade elevada para a plasmina. As mutações E11T, L13P e T34I podem não ser necessárias. Outras mutações que podem promover a ligação da plasmina incluem D10E, T19D, Y21W e G39E.

0 DPI-4.1.1 (Tabela 4) é de ITI-K1 humano por inserção de S10E, M15R, M17K, T18F, Q34V e M39G. As mutações M39G e Q34V podem não ser necessárias. Outras mutações que devem promover a ligação da plasmina incluem: A11T, G16A, M17R, S19D, Y21W e Y21F. 0 DPI-4.2.1 (Tabela 4) é de ITI-K2 humano com as mutações V10D, R11T, F17R, I18F e P34V. A mutação P34V pode não ser necessária. Outra mutação que deve promover a ligação a plasmina inclui: V10E, Q19D, L20R, W21F, P34I e Q39E. 0 DPI-4.2.2 é uma proteina especialmente preferida porque tem somente três mutações: R11T, F17R e I18F. 0 DPI-4.2.3 é uma proteina especialmente preferida porque tem somente quatro mutações: R11T, F17R, I18F e L20R. 0 DPI-4.2.4 é uma proteina especialmente preferida porque tem somente cinco mutações: R11T, F17R, I18F, L20R e P34V. 0 DPI-4.2.5 contém as mutações V10E, R11T, F17R, I18F, L20R, V31E, L32T, P34V e Q39G e é altamente provável que iniba a plasmina de modo muito potente. É muito provável que cada uma das proteínas DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4 e DPI-4.2.5 seja um inibidor altamente potente da plasmina. 25

Antes de DENN94a, pensava-se que o APP-I era um inibidor de plasmina muito potente. Assim, foi surpreendente seleccionar proteinas a partir de uma biblioteca que foi concebida para permitir os residuos do APP-I nas posições 10-21 que diferiam fortemente da APP-I. Não obstante, o APP-I pode ser convertido num potente inibidor de plasmina. 0 DPI-5.1 é derivado do APP-I humano (também conhecido como Protease Nexina-II) pelas mutações M17R e I18F e é provável que seja um inibidor muito melhor da plasmina do que é o próprio APP. 0 DPI-5.2 contém as outras mutações S19D, A31E e F34I, que podem promover uma afinidade mais elevada para a plasmina. 0 DPI-6.1 é derivado de HKI B9 KuDom (NORR93) através das cinco substituições: K11T, Q15R, T16A, M17R e M18F. É provável que o DPI-6.1 seja um potente inibidor da plasmina. O DPI-6.2 contém as mutações adicionais T19D e A34V que devem promover a ligação da plasmina.

Embora o BPTI seja o melhor inibidor de plasmina de KuDom que ocorre naturalmente, conhecido, poderia ser melhorado. O DPI-7.1 é derivado de BPTI através da mutação I18F que provavelmente aumenta a afinidade para a plasmina. O DPI-7.2 contém ainda a mutação K15R que deve aumentar a ligação da plasmina. 0 DPI-7.3 contém a mutação adicional R39G. O DPI-7.4 contém as mutações Y10D, K15R, I18F, I19D, Q31E e R39G e deve possuir uma afinidade muito elevada para a plasmina. 26

MODIFICAÇÃO DE DOMÍNIOS KUNITZ

Os KuDoms são bastante pequenos; se isto causar um problema farmacológico, tal como eliminação excessivamente rápida da circulação, podem ser ligados dois ou mais desses dominios. Um ligante preferido é uma sequência de um ou mais aminoácidos. Um ligante preferido é um que se encontra entre dominios repetidos de uma proteína humana, especialmente os ligantes encontrados em homólogos de BPTI humanos, um dos quais tem dois domínios (BALD85, ALBR8 3b) e outro dos quais tem três (WUNT88) . Os ligantes peptídicos têm a vantagem de a proteína inteira poder, então, ser expressa através de técnicas do ADN recombinante. É também possível utilizar um ligante não peptídico, tal como um daqueles utilizados geralmente para formar conjugados imunogénicos. Um meio alternativo de aumentar a residência no soro de um KuDom do tipo BPTI é ligá-lo ao polietilenoglicol, a denominada PEGuilação (DAVI79). FORMAS PARA MELHORAR A ESPECIFICIDADE DE SPI11 E DE OUTROS INIBIDORES DE PLASMINA DE KuDom:

Porque se tornou uma parte grande da superfície do KuDom SPI11 complementar à superfície de plasmina, R15 não é essencial para a ligação específica à plasmina. Muitas das enzimas nas vias de coagulação e fibrinolitica clivam, de um modo preferido, depois de Arg ou Lys. Não ter um resíduo básico na posição PI podem originar uma maior especificidade. A variante SPI11-R15A (apresentada na Tabela 11), que tem uma Ala em Pl, é provável que seja um bom inibidor de plasmina e pode ter uma especificidade mais elevada para a plasmina, em relação a outras proteases do que SPI11. A afinidade de SPI11-R15A para a 27 plasmina é provável que seja menos do que a afinidade de SPI11 para a plasmina, mas a perda da afinidade para outras enzimas preferindo Arg/Lys é provável que seja maior e, em muitas aplicações, a especificidade é mais importante do que a afinidade. Outros mutantes que têm provavelmente uma boa afinidade e uma muito elevada especificidade incluem SPI11-R15G e SPI11-R15N-E32A. Esta abordagem pode ser aplicada a outros inibidores de plasmina de elevada afinidade. AUMENTO DA AFINIDADE de SP111 A variação da SPI11, como apresentada na Tabela 12 e a selecção dos ligantes podem provavelmente produzir um domínio Kunitz possuindo uma afinidade para a plasmina que é mais elevada do que a de SPI11. Esta quarta biblioteca permite a variegação do dissulfureto 14-38. Os dois segmentos de ADN apresentados são sintetizados e utilizados com iniciadores numa reacção de PCR para produzir o d3ADN entre Nsi I e BstEII. Os iniciadores são idênticos nas extremidades 5' dos fragmentos sintéticos apresentados com 21 de comprimento para o primeiro e 17 para o segundo. Como a variabilidade é muito elevada, a requerente procurou obter entre 108 a 109 transformantes (quanto mais, melhor).

MODO DE PRODUÇÃO

As proteínas aqui divulgadas podem ser produzidas por qualquer técnica convencional, incluindo 28 a) síntese não biológica por acoplamento sequencial de componentes, e. g., aminoácidos, b) a produção por técnicas de ADN recombinante em células hospedeiras adequadas, e c) semi-síntese, por exemplo, por remoção de sequências indesejadas de LACI-K1 e acoplamento de sequências sintéticas de substituição.

As proteínas aqui divulgadas são de um modo preferido, produzidas de forma recombinante, num hospedeiro apropriado, tal como bactérias dos géneros Bacillus, Escherichia, Salmonella, Erwinia e leveduras dos géneros Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces e Schizosaccharomyces, ou células de mamífero em cultura, tal como COS-1. Os hospedeiros mais preferidos são microrganismos das espécies Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli e Yarrowia lipolytica. Qualquer promotor que for funcional na célula hospedeira pode ser utilizado para controlo da expressão génica.

De um modo preferido, as proteínas são segregadas e, de um modo muito preferido, são obtidas a partir de meio condicionado. A secreção é a via preferida porque as proteínas apresentam maior probabilidade de se enrolarem correctamente e de poderem ser produzidas no meio condicionado com poucos contaminantes. A secreção não é necessária. A menos que haja uma razão específica para incluir glicogrupos, prefere-se proteínas concebidas sem sítios de glicosilação ligados em N para reduzir o potencial de 29 antigenicidade dos glicogrupos e de modo que as proteínas equivalentes possam ser expressas numa vasta variedade de organismos, incluindo: 1) E. coli, 2) B. subtilis, 3) P. pastoris, 4) S. cerevisiae e 5) células de mamífero.

Existem diversos meios para reduzir o problema das células hospedeiras que produzem proteases que degradam o produto recombinante; ver, inter alia, BANE90 e BANE91. VAND92 relata que a sobreexpressão da peptidase sinal de B. subtilis em E. coli conduz à expressão aumentada de uma proteína de fusão heteróloga. ANBA88 relata que a adição de PMSF (um inibidor de proteases de serina) ao meio de cultura melhorou o rendimento de uma proteína de fusão.

Outros factores que podem afectar a produção destas e outras proteínas aqui divulgadas incluem: 1) codões utilizados (é preferido utilizar codões optimizados para o hospedeiro), 2) sequência sinal, 3) sequência de aminoácido em sítios de processamento pretendidos, a presença e a localização de enzimas de processamento, eliminação, mutação ou inibição de várias enzimas que podem alterar ou degradar o produto modificado e as mutações que tornam o hospedeiro mais permissivo à secreção (são preferidos os hospedeiros permissivos à secreção).

Os trabalhos de referência nos princípios gerais da tecnologia de ADN recombinante incluem Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I e II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Nova Iorque, N.I. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.I. (1985); Old et al., Principies of Gene

Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2a edição, 30

University of Califórnia Press, Berkeley, CA (1981); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NI (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley

Interscience, NI, (1987, 1992).

ENSAIOS PARA LIGAÇÃO E INIBIÇÃO DE PLASMINA

Qualquer método apropriado pode ser utilizado para testar os compostos desta invenção. Scatchard (Ann NY Acad Sei (1949) 51:660-669) descreveu um método clássico de medir e analisar ligações que é aplicável à ligação à proteína. Este método requer a proteína relativamente pura e a capacidade de distinguir a proteína ligada da não ligada.

Um segundo método apropriado de medir KD é a medição da actividade inibidora contra a enzima. Se a KD a ser medida estiver no intervalo de 1 nM a 1 μΜ, este método requer substratos cromogénicos ou fluorogénicos e dezenas de microgramas a miligramas do inibidor relativamente puro. Para as proteínas desta invenção, ter uma KD no intervalo de 5 nM a 50 pM, são suficientes nanogramas a microgramas do inibidor. Ao utilizar este método, a competição entre o inibidor e o substrato da enzima pode dar uma Ki medida que é mais elevada do que a Ki verdadeira. A medição aqui relatada não é assim corrigida porque a correcção seria muito pequena e toda a correcção reduziria a Kj.. Aqui, utiliza-se a Ki medida, como uma medida directa de KD.

Um terceiro método de determinar a afinidade de uma proteína para um segundo material é ter a proteína apresentada 31 num invólucro genético, tal como M13 e medir a capacidade da proteína em aderir ao "segundo material" imobilizado. Este método é altamente sensível porque os invólucros genéticos podem ser amplificados. Obtiveram-se, pelo menos, valores semiquantitativos para as constantes de ligação pela utilização de um passo de gradiente de pH. Os inibidores de afinidade conhecidos para a protease são utilizados para estabelecer os perfis padrão contra outros fagos que apresentem inibidores que são julgados. Qualquer outro método apropriado para medir a ligação da proteína pode ser utilizado.

De um modo preferido, as proteínas aqui divulgadas têm uma KD para a plasmina de no máximo cerca de 5 nM, de um modo mais preferido, no máximo cerca de 300 pM e, de um modo muito preferido, 100 pM ou menos. De um modo preferido, a ligação é inibidora de modo que Ki seja a mesma que KD. A Ki de QS4 para a plasmina é de cerca de 2 nM. A Ki de SPI11 para a plasmina é cerca de 88 pM.

MÉTODOS E PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS O indivíduo preferido desta invenção é um mamífero. A invenção é particularmente útil no tratamento de humanos, mas é também apropriada para aplicações veterinárias.

Aqui, "protecção" inclui "prevenção", "supressão" e "tratamento". A "prevenção" envolve a administração do fármaco antes da indução da doença. A "supressão" envolve a administração do fármaco antes do aparecimento clínico da doença. O "tratamento" envolve a administração do fármaco após o aparecimento da doença. 32

Na medicina humana e veterinária, pode não ser possível distinguir entre "apresentar" e "suprimir" uma vez que o(s) evento(s) indutivo(s) pode(m) ser desconhecido(s) ou latente(s), ou o doente só ser identificado após a ocorrência do(s) evento(s) indutivo(s). Utilizou-se o termo "profilaxia" como distinto de "tratamento" para abranger o "impedir" e "suprimir". Aqui, a "protecção" inclui a "profilaxia". A protecção não necessita ser absoluta para ser útil.

As proteínas podem ser administradas, por quaisquer meios, sistémica ou topicamente, para proteger um indivíduo contra uma doença ou estado adverso. Por exemplo, a administração de tal composição pode ser por qualquer via parentérica, por injecção do bólus ou por perfusão gradual. Alternativamente, ou simultaneamente, a administração pode ser pela via oral. Um regime apropriado compreende a administração de uma quantidade eficaz da proteína, administrada como uma dose única ou como várias doses durante um período de horas, dias, meses ou anos. A dosagem apropriada de uma proteína aqui divulgada pode depender da idade, sexo, saúde e peso do receptor, tipo do tratamento simultâneo, se existir, da frequência do tratamento e do efeito desejado. Contudo, a dosagem mais preferida pode ser adaptada ao indivíduo particular, como é compreendido e determinável pelo especialista da técnica, sem experimentação supérflua, por ajustes da dose pelas formas conhecidas na técnica.

Para métodos de teste pré-clínico e clínico de fármacos, incluindo proteínas, ver, e. g. , Berkow et al. , eds. , The Merck

Manual, 15a edição, Merck e Co., Rahway, N. J., 1987; Goodman et 33 al., eds Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a edição, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.I., (1990); Avery's Drug Treatment: Principies and Practice of Clinicai Pharmacology and Therapeutics, 3a edição, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987), Ebadi,

Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985) .

Para além de uma proteína aqui divulgada, uma composição farmacêutica pode conter veículos, excipientes ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis. Ver, e. g., Berker, supra,

Goodman, supra, Avery, supra e Ebadi, supra.

MÉTODOS E REAGENTES DE DIAGNÓSTICO IN VITRO

As proteínas podem ser aplicadas in vitro a qualquer amostra adequada que podem conter plasmina, para medir a plasmina presente. Para assim fazer, o ensaio deve incluir um Sistema de Produção de Sinal (SPS) que proporciona um sinal detectável que depende da quantidade de plasmina presente. O sinal pode ser detectado visualmente ou instrumentalmente. Os sinais possíveis incluem a produção de produtos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, a alteração das características de absorção ou de emissão da radiação por um componente ou produto de ensaio e precipitação ou aglutinação de um componente ou produto. 0 componente do SPS mais intimamente associado com o reagente de diagnóstico é denominado "o marcador". Um marcador pode ser, e. g., um radioisótopo, um fluoróforo, uma enzima, uma co-enzima, um substrato enzimático, um composto denso aos electrões ou uma partícula aglutinável. Um isótopo radioactivo 34

pode ser detectado pela utilização de, por exemplo, um contador γ ou um contador de cintilações ou por autorradiografia. Os isótopos que são particularmente úteis são 3H, 125I, 131I, 35S, 14C e, de um modo preferido, 125I. É também possível marcar um composto com um composto fluorescente. Quando o composto marcado fluorescentemente é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detectada. Entre os compostos de marcação fluorescente mais geralmente utilizados estão o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina.

Alternativamente, os metais de emissão de fluorescência, tal como 125Eu ou outro lantanideo, podem ser unidos à proteína de ligação utilizando grupos quelantes de metal, como o ácido dietilenotriaminapenta-acético ou o ácido etilenodiamina-tetra-acético. As proteínas também podem ser marcadas de forma detectável acoplando a um composto quimioluminescente, tais como luminol, isolumino, éster teromático de acridinio, imidazole, sal de acridinio e éster de oxalato. Do mesmo modo, um composto bioluminescente, tais como luciferina, luciferase e aequorina, pode ser utilizado para marcar as proteínas de ligação. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada detectando a presença do luminescente. Os marcadores enzimáticos, tais como peroxidase de rábano e fosfatase alcalina são preferidos.

Existem dois tipos básicos de ensaios: heterogéneo e homogéneo. Em ensaios heterogéneos, a ligação da molécula de afinidade ao analito não afecta o marcador; assim, para determinar a quantidade de analito, o marcador ligado deve ser separado do marcador livre. Em ensaios homogéneos, a interacção afecta a actividade do marcador e o analito pode ser medido sem separação. 35

No geral, uma proteína de ligação à plasmina (PBP) pode ser utilizada para diagnóstico, do mesmo modo que é utilizado um anticorpo antiplasmina. Assim, dependendo do formato do ensaio, podem ser utilizadas para ensaiar a plasmina ou, através de inibição competitiva, outras substâncias que ligam a plasmina. A amostra será normalmente um fluido biológico, tal como sangue, urina, linfa, sémen, leite ou o líquido cefalorraquidiano, ou um seu derivado ou um tecido biológico, e. g., uma secção ou um homogenato de tecido. A amostra pode ser qualquer coisa. Se a amostra for um fluido ou um tecido biológico, pode ser retirado de um humano ou outro mamífero, vertebrado ou animal, ou de uma planta. A amostra preferida é sangue ou uma fracção ou seu derivado.

Numa forma de realização, a proteína de ligação à plasmina (PBP) é imobilizada e a plasmina na amostra é deixada competir com uma quantidade conhecida de um análogo de plasmina marcado ou especificamente marcado. 0 "análogo de plasmina" é uma molécula capaz de competir com a plasmina para ligação à PBP, que inclui a própria plasmina. Pode ser já marcada ou pode ser marcada subsequentemente através de ligação especifica do marcador a uma unidade que diferencia o análogo de plasmina da plasmina. As fases são separadas e o análogo de plasmina marcado numa fase é quantificado.

Num "ensaio em sanduíche", são empregues um agente de ligação a plasmina insolubilizada (PBA) e um PBA marcado. 0 analito da plasmina é capturado pelo PBA insolubilizado e é etiquetado através de um PBA marcado, formando um complexo terciário. 0 reagente pode ser adicionado à amostra em qualquer 36 ordem. Os PBA podem ser iguais ou diferentes, e somente um PBA necessita ser um PBP de acordo com esta invenção (o outro pode ser, e. g., um anticorpo) . A quantidade de PBA marcado no complexo terciário é directamente proporcional à quantidade de plasmina na amostra.

As duas formas de realização descritas acima são ensaios heterogéneos. Um ensaio homogéneo requer somente que a marcação seja afectada pela ligação do PBP à plasmina. 0 analito da plasmina pode actuar como o seu próprio marcador se um inibidor de plasmina for utilizado como um reagente de diagnóstico.

Um marcador pode ser conjugado, directa ou indirectamente (e. g., através de um anticorpo anti-PBP marcado), covalentemente (e. g., com SPDP) ou não covalentemente, à proteína de ligação à plasmina, para produzir um reagente de diagnóstico. De modo semelhante, a proteína de ligação à plasmina pode ser conjugada a um suporte de fase sólida para formar um reagente de diagnóstico de fase sólida ("captura").

Suportes adequados incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases e magnetite. 0 veículo pode ser muito solúvel ou insolúvel para os objectivos desta invenção. 0 material de suporte pode possuir qualquer estrutura desde que a molécula acoplada seja capaz de ligar a plasmina.

Utilizações de Diagnóstico in vivo

Um domínio Kunitz que se ligue muito firmemente à plasmina pode ser utilizado para imagiologia in vivo. A imagiologia de diagnóstico de focos da doença foi considerada uma das maiores oportunidades comerciais para anticorpos monoclonais, mas esta 37 oportunidade ainda não foi conseguida. Apesar do esforço considerável, somente dois agentes de imagiologia baseados em anticorpos monoclonais foram aprovados. Os resultados decepcionantes obtidos com anticorpos monoclonais são devidos em grande medida a: i) Afinidade e/ou especificidade inadequada; ii) Baixa penetração nos locais alvo; iii) Baixa eliminação dos locais não alvo; iv) Imunogenicidade (a maioria são de murino); e v) Custos de fabrico elevados e baixa estabilidade.

Estas limitações conduziram principalmente no campo de processamento de imagem para diagnóstico ao início do desenvolvimento de agentes de imagiologia à base de péptidos. Embora resolvendo potencialmente os problemas da baixa penetração e lenta eliminação, é improvável que os agentes de imagiologia à base de péptidos possuam afinidade adequada, especificidade e estabilidade in vivo de modo a serem úteis na maioria das aplicações.

As proteínas manipuladas são adequadas de modo único às exigências para um agente de imagiologia. Em particular, a afinidade e especificidade extraordinárias que são obteníveis através da manipulação de domínios da proteína de origem humana, pequenos, estáveis, possuindo taxas de eliminação e mecanismos in vivo conhecidos combinam-se para proporcionar resultados precoces, de maior confiança, menos toxicidade/efeitos secundários, uma produção e custos de armazenamento mais baixos e maior conveniência na preparação do marcador. Na verdade, deve ser possível conseguir o objectivo da imagiologia em tempo real com agentes de imagiologia de proteína manipulada. As proteínas 38 de ligação à plasmina, e. g., SPI11, podem ser úteis para localizar locais de hemorragia interna. A proteína de ligação marcada radioactivamente pode ser administrada ao indivíduo humano ou animal. A administração é tipicamente por injecção, e. g. , por meios de administração intravenosos ou arteriais, ou outros, numa quantidade suficiente para permitir a imagiologia dinâmica e/ou estática subsequente, utilizando dispositivos apropriados para detectar radiação. A dosagem é a menor quantidade capaz de proporcionar uma imagem de diagnóstico eficaz, e pode ser determinada pelos meios convencionais na técnica, utilizando agentes de radioimagiologia conhecidos como guias.

Tipicamente, a imagiologia é realizada no corpo total do indivíduo, ou na porção do corpo ou do órgão relevante para o estado ou doença sob estudo. A proteína de ligação marcada radioactivamente acumula-se. A quantidade de proteína de ligação marcada radioactivamente acumulada num dado instante, em órgãos alvo relevantes, pode então ser quantificada.

Um dispositivo de radiodetecção particularmente apropriado é uma câmara de cintilação, tal como uma câmara J. 0 dispositivo de detecção na câmara detecta e regista (e opcionalmente digitaliza) o decaimento radioactivo. A informação digitalizada pode ser analisada de qualquer forma apropriada, muitas das quais são conhecidas na técnica. Por exemplo, uma análise de tempo-actividade pode ilustrar a incorporação através da eliminação da proteína de ligação marcada radioactivamente pelos órgãos alvo ao longo do tempo. 39 Vários factores são tomados em consideração na escolha de um radioisótopo apropriado. 0 isótopo é escolhido: para permitir uma boa qualidade de resolução após imagiologia, para ser seguro para utilização em diagnóstico em humanos e animais e, de um modo preferido, para ter um tempo de semi-vida curto de modo a diminuir a quantidade de radiação recebida pelo corpo. 0 radioisótopo utilizado deve ser, de um modo preferido, farmacologicamente inerte e as quantidades administradas não devem ter um efeito fisiológico substancial. A proteína de ligação pode ser marcada radioactivamente com diferentes *10*3 i o r iqi isótopos de iodo, por exemplo I, I ou I (ver, por exemplo,

Patente U.S. 4609725). A quantidade de marcação deve ser apropriadamente monitorizada.

Nas aplicações a indivíduos humanos, pode ser desejável utilizar radioisótopos com excepção de 125I para marcação, para diminuir a dosimetria total de exposição do corpo e para optimizar a detectabilidade da molécula marcada. Considerando a disponibilidade clínica imediata para utilização em humanos, os radiomarcadores preferidos incluem: 99mTc, 67Ga, 68Ga, 90Y, niIn, 113mIn, 1231 , 186Re, 188Re ou 211At. A proteína marcada radioactivamente pode ser preparada por vários métodos. Estes incluem a radio-halogenação por cloramina-T ou o método da lactoperoxidase e subsequente purificação por cromatografia líquida de alta pressão, por exemplo, ver Gutkowska et al. em "Endocrinology and Metabolism Clinics of America: (1987) 16(1):183. Podem ser utilizados outros métodos de marcação radioactiva, como IODOBEADS™.

Uma proteína marcada radioactivamente pode ser administrada por quaisquer meios que permitam que o agente activo alcance o local de acção do agente num mamífero. Porque as proteínas são 40 submetidas a administração intramuscular, absorção. digestão quando administradas oralmente, a parentérica, i. e., subcutânea intravenosa, seria normalmente utilizada para optimizar a

Outras Utilizações

As proteínas de ligação a plasmina aqui divulgadas podem também ser utilizadas para purificar plasmina de um fluido, e. g., sangue. Para este propósito, a PBP é, de um modo preferido, imobilizada num suporte insolúvel. Estes suportes incluem os já mencionados como úteis na preparação de reagentes de diagnóstico de fase sólida.

As proteínas podem ser utilizadas como marcadores de peso molecular para referência na separação ou purificação das proteínas. As proteínas podem necessitar ser desnaturadas para servir como marcadores de peso molecular. Uma segunda utilidade geral para as proteínas é a utilização da proteína hidrolisada como uma fonte de nutriente. As proteínas podem também ser utilizadas para aumentar a viscosidade de uma solução. A proteína aqui divulgada pode ser utilizada para alguns dos objectivos anteriores, assim como para objectivos terapêuticos e de diagnóstico, como discutido antes nesta descrição. 41

PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS A síntese química de polipéptidos é uma área na técnica em desenvolvimento rápido e os métodos de síntese de polipéptidos de fase sólida são bem descritos nas referências que se seguem: (Merrifield, J Amer Chem Soc 85:2 149-2154 (1963); Merrifield,

Science 232:341-347 (1986); Wade et al. , Biopolymers 25:S21-S37 (1986); Fields, Int J Polypeptide Prot Res 35:161 (1990);

MilliGen. Report N° 2 e 2a, Millipore Corporation, Bedford, MA, 1987) Ausubel et al, supra e Sambrook et al, supra. Tan e Kaiser (Biochemistry, 1977, 16:1531-41) sintetizaram BPTI e um homólogo há dezoito anos atrás.

Como é conhecido na técnica, estes métodos envolvem o bloqueamento ou protecção de grupos funcionais reactivos, tais como grupos amino livres, carboxilo e tio. Após formação da ligação polipeptídica, os grupos protectores são removidos. Deste modo, a adição de cada resíduo de aminoácido requer diversas etapas reaccionais para proteger e desproteger. Os métodos actuais utilizam a síntese de fase sólida, em que o aminoácido do terminal C é ligado covalentemente às partículas de resina insolúveis que podem ser filtradas. Os reagentes são removidos por lavagem das partículas de resina com solventes apropriados utilizando um aparelho automatizado. Os vários métodos, incluindo o método do "tBoc" e o método de "Fmoc", são bem conhecidos na técnica. Ver, inter alia, Atherton et al., J Chem Soc Perkin Trans 1:538-546 (1981) e Sheppard et al . , Int J Polypeptide Prot Res 20:451-454 (1982). 42

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção da Biblioteca de LACI(Kl)

Uma duplex de oligonucleótidos sintéticos possuindo as extremidades compatíveis com Nsrl e MluI foi clonada num vector parental (LACI-K1::III) previamente clivado com as duas enzimas acima. 0 material ligado resultante foi transfectado por electroporação na estirpe XLIMR(F-) de E. coli e plaqueado em placas de ampicilina (Ap) para obter colónias ApR produtoras de fagos. 0 esquema de variegação para a Fase 1 focaliza-se na região PI e nos resíduos afectados 13, 16, 17, 18 e 19. Permitiu 6,6 x 105 sequências diferentes de ADN (3,1 x 105 sequências diferentes de proteína). A biblioteca obtida consistiu em 1.4 x 106 cfu independentes que é aproximadamente uma representação de duas vezes a biblioteca inteira. 0 stock de fagos gerado por este plaqueamento produziu um título total de 1.4 x 1013 pfu em cerca de 3,9 mL, estando cada clone independente representado, em média, 1 x 107 no total e 2,6 x 106 vezes por mL de stock de fago.

Para permitir a variegação dos resíduos 31, 32, 34 e 39 (fase II), as duplex de oligonucleótidos sintéticos com extremidades compatíveis MluI e BstEII foram clonadas em ADN de Rf previamente clivado, derivado de um dos seguintes i) a construção parental, ii) a biblioteca da fase I, ou 43 iii) o fago de apresentação seleccionado da primeira fase de ligação a um dado alvo. 0 esquema de variegação para a fase II permitiu 4096 sequências diferentes de ADN (1600 sequências diferentes de proteína) devido às alterações nos resíduos 31, 32, 34 e 39. A variegação final da fase II é dependente do nível de variegação restante, seguindo por três ciclos de ligação e eluição com um dado alvo na fase I. A variegação possível combinada para ambas as fases iguala 2,7 x 108 sequências diferentes de ADN ou 5,0 x 107 diferentes sequências de proteína. Quando os fagos de apresentação previamente seleccionados são utilizados como a origem de ADN de Rf para a variegação da fase II, o nível final de variegação está provavelmente no intervalo de 105 a 106.

Exemplo 2: Pesquisa da Biblioteca de LACI-K1 para Ligação a Plasmina 0 esquema para seleccionar as variantes de LACI-K1 que ligam plasmina envolve a incubação da biblioteca de apresentação de fagos com esferas de plasmina (Calbiochem, San Diego, CA; n° de catálogo 527802) num tampão (PBS que contém 1 mg/mL de BSA) antes da lavagem das variantes de fagos de apresentação não ligados e fracamente retidos com PBS que contém 0,1% de Tween 20. Os fagos de apresentação mais fortemente ligados são eluídos com um tampão de eluição de baixo pH, tipicamente tampão citrato (pH 2,0) que contém 1 mg/mL de BSA, que é imediatamente neutralizado com tampão Tris a pH 7,5. Este processo constitui um único ciclo de selecção. 44

Os fagos de apresentação eluídos neutralizados podem ser utilizados: i) para inocular uma estirpe F+ de E. coli para produzir um novo stock de fagos de apresentação, para ser utilizada para ciclos de selecção subsequentes (denominada selecção convencional), ou ii) para ser utilizados directamente para um outro ciclo imediato de selecção com as esferas de protease (denominada selecção rápida).

Tipicamente, são executados três ciclos do método ou uma combinação de dois, para produzir o fago de apresentação seleccionado final, do qual um número representativo é sequenciado e analisado quanto às propriedades de ligação seja como misturas de apresentação de fagos ou como clones individuais.

Para a biblioteca de LACI-K1, foram executadas duas fases de selecção, cada uma consistindo em três ciclos de ligação e eluição. A selecção da Fase I utilizou a biblioteca da fase I (dos resíduos variegados 17, 18 13, 16 e 19) que atravessou três ciclos de ligação e eluição contra plasmina, dando origem a uma subpopulação de clones. 0 ADN de Rf derivado desta subpopulação seleccionada foi utilizado para produzir a biblioteca de Fase II (adição dos resíduos variegados 31, 32, 34 e 39) . Foram obtidos cerca de 5,6 x 107 transformantes independentes. As bibliotecas da fase II submeteram-se a três ciclos de ligação e de eluição adicionais com a mesma protease alvo produzindo os seleccionados finais . 45

Depois de duas fases de selecção contra esferas de agarose de plasmina, foi sequenciado um número representativo (16) de fagos de apresentação da selecção final. A Tabela 2 mostra as sequências dos domínios seleccionados de LACI-K1 com os aminoácidos seleccionados nas posições variegadas em maiúsculas. Note-se a selecção absoluta dos resíduos P13, Αιβ, R17, Fis e E19. Existe uma selecção muito forte para E em 31 e Q em 32. Não existe consenso em 34; os aminoácidos observados são {T3, Y2, H2, D, R, A, V2, I3 e L}. Os aminoácidos que têm os grupos laterais que ramificam em Cp (T, I e V) estão representados de forma múltipla e são preferidos. Na posição 39, não existe consenso forte (G6, D3, Q2, A2, R, F, E) , mas G, D, Q e A parecem ser preferidos (por essa ordem).

Um rastreio separado da biblioteca de LACI-K1 contra plasmina produziu um consenso muito semelhante a partir de 16 fagos de apresentação sequenciados seleccionados. Estas sequências são mostradas na Tabela 3 (resíduos seleccionados em maiúsculas). Estas sequências afastam-se das da Tabela 2, uma vez que E aqui predomina na posição 19. Existe um consenso em 34 (T5, V3, S3, I2, L, A, F) de T, V ou S. Combinando os dois conjuntos, há uma preferência para (por ordem de preferência) T, V, I, S, A, Η, Y e L, sendo permitidos F, D e R. EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ANÁLISE CINÉTICA.

Os três isolados QS4, ARFK N° 1 e ARFK N° 2 foram reclonados num vector de expressão de levedura. 0 vector de expressão de levedura é derivado de pMFalpha8 (KURJ82 e MIYA85).

Os genes variantes de LACI foram fundidos com parte do gene do 46 matai, produzindo um gene híbrido consistindo no péptido sinal do promotor de matai e sequência líder fundida com a variante de LACI. 0 sítio de clonagem é apresentado na Tabela 24. Note-se que a proteína variante de LACI-K1 correctamente processada deve ser como detalhada na Tabela 2 e Tabela 3, com a adição dos resíduos glu-ala-ala-glu à met do terminal N (resíduo 1 na Tabela 2 e Tabela 3) . A expressão em S. cerevisiae produziu um rendimento de cerca de 500 pg de inibidor de protease por litro de meio. A LACI expressa por leveduras (domínio de kunitz I), variantes de BPTI e de LACI: QS4, ARFK N° 1 e ARFK N° 2 foram purificados por cromatografia de afinidade utilizando esferas de tripsina-agarose. 0 hospedeiro para produção mais preferido é Pichia pastoris que utiliza o sistema da álcool oxidase. Outros produziram uma variedade de proteínas na levedura Pichia pastoris. Por exemplo, Vedvick et al, (VEDV91) e Wagner et al. (WAGN92) produziram aprotinina a partir do promotor da álcool oxidase com indução por metanol, como uma proteína segregada no meio de cultura a « 1 mg/mL. Gregg et al. (GREG93) reviram a produção de um número de proteínas em P. pastoris. A Tabela 1 de GREG93 mostra as proteínas que foram produzidas em P. pastoris e os rendimentos.

Dados cinéticos A inibição da hidrólise do succinil-Ala-Phe-Lys-(F3AC) AMC (uma metilcumarina) (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) pela plasmina a 2,5 x 1CT8 M, com quantidades variadas de inibidor, foi ajustada à forma convencional de um substrato de ligação forte pelos mínimos quadrados. A análise cinética preliminar das duas variantes de ARFK demonstrou uma actividade inibidora muito 47 semelhante à da variante QS4. Estas medidas foram realizadas com quantidades fisiológicas de sal (150 mM) de modo a que as afinidades fossem relevantes para a acção das proteínas no sangue. A Tabela 23 mostra que QS4 é um inibidor altamente específico da plasmina humana. O fago que apresenta o derivado de LACI-K1 QS4 liga-se a esferas de plasmina, pelo menos, 50 vezes mais do que se liga a outras proteases alvo. NOVA BIBLIOTECA PARA A PLASMINA:

Uma nova biblioteca de domínios de LACI-K1, apresentados em M13 glllp e contendo a diversidade mostrada na Tabela 5 foi produzida e rastreada para a ligação a plasmina. A Tabela 6 apresenta as sequências seleccionadas e as de consenso. Caracterizou-se a ligação das proteínas seleccionadas comparando a ligação do fago clonalmente puro ao fago de apresentação de BPTI. Os isolados 11, 15, 08, 23 e 22 foram superiores ao fago de BPTI. Produziu-se SPI11 solúvel (Inibidor#ll de Plasmina Seleccionado) e testou-se a sua actividade inibidora, obtendo uma Ki de 88 pM que é, pelo menos, duas vezes melhor do que a de BPTI. Assim, acredita-se que os seleccionados SPI15, SPI08 e SPI22 são bastante superiores a BPTI e que SPI23 será provavelmente tão potente quanto o BPTI. Todas as proteínas listadas são muito mais próximas de uma sequência de aminoácidos de proteína humana do que é BPTI e, deste modo, deverão ter um menor potencial para imunogenicidade. 48 TABELA 1: Sequência completa de LACI: (SEQ ID N“ 1) 5 5 5 5 5

1 MIYTMKKVHA LWA.SVCLLUN UlPAFLNAds eedeehfciit dtelpplklM

51 HSFGAFKADD GPCKAIMKRF FFNIFTRQCE EFÍYGGCEGN QNRFESLEEC

101 KKMCíRhnan. riikfctlqqe kpdfCfleed pglCrgyltr yfynnqtkqC 151 erfkyqqClq raannfetlee CkniCedqpn gfqvdnygtq Inavrmsltp 2Q1 qstkvpslfe fbgpawcitp adrglCtane nrfyynsvig kcrpfkysgc 2S1 ggnennftsk qedraCkkg fiqrískggl iktkrkrkkq rvkiayeaif 301 ¥knns A sequência sinal (1-28) está em maiusculas e a sublinhado LACI-K1 está em maiúsculas LACI-K2 está em sublinhado LACI-K3 está em negrito 49 TABELA 2: Sequência de LACI-K1 e derivados que se ligam a plasmina humana

l t 3 « S 3KQ Ip NO. 2 SSQ I» NO. 3 SSQ IP NO. i tSSQ » NO. 5 5E0 IS NO. ® SEQ IS SK>- ' SKC TO NO- * SEQ Π5 NO, 9 ssq to m, to sr.Q I3> so* 11 g£Q tO NO· ** §EQ I® NO. 13 sse is no. m 3EQ IO NO- 15 SEQ i£) NO- IS SEO 10 NO. tt ssa IO NO·- 19 SSQ IN NO* 1$ mhsí'íta|;feefl-ásp<;kai;isSi;:cS.ííti;Í?Í.Jí^;í;iS«:fiygsj«isgTi;i5S5Jrfealeeck!!Bictrti

sefesfeaíIttóldgyekftRnsrfffniftrící^ftyggcRqaflBKífesiKeckjesetJíd ^sf«i#íto.^ePe!iaHç.FS»tífaiftr^ô£yyggeSi9iKpBrfBaie8c3ci5s«;tz<S ®s'? #íssf«*á*aâd^BoSEíkRíXrfff!íift!:qLe®<âíHy9®e®en««Jí***i««e3<k««ítif5S

Sbs te*flcfcd05PcÍ8«lF£í: £ jtt aí St cqsKQfDy^eR^asitirf esieecfckiBctisí ¢-3¾ iíítófciaSJíâdd.^fclitíkRfBtffíaiftrqçoefayegeOeeQBríeeleedfeln^eá sHsSs;«Í'3£aeld£rPckÃRFS:f'í'f SBifty^eOQfy^f^eQ^tsqnrfásleeç&iknKj-fcr-d jsfeeêcafkaK^gEctcMFSrí £ÍKAet^eSEfAyggcSgEqnrfsBlasek&Bsetird NS2 irá.sfcaffcsátígPci^íEífffniftraeQQfv^^s^^sfBSiÈseJÈ.ssáGtrd. *®< ísfcsfc;iíík.sdíátjP«kAB,FEríf fn.iftrqcSQfTy^gcSgníjisrfesl.eeííltfcsctní FA.sfGaíka^gPckA&S^ríífiiiftrqcgg.Çfyg^^gm^rf<ss3&^kteís:tird ^s£««£fcadN§£«fcASEEK$£t«Í£í.í:^«EQ£ly$§^gaqstfesIeeck-k^trd SS k 1 n&s fcaí kaddgfçkMi^rf tfnif çrqeÊQfí yggaSgsi^íEÍiísleiScStessstríi

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Tabela 4 Domínios Kunitz, alguns dos quais inibem a plasmina

Sequência de aminoácidos

Identificador 1111111111222222222233333333334444444444555555555 Afinidade l seq id de proteína 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678 2 nM SEQ ID N° 4 (B) SEQ ID N° 11 3nM SEQ ID N° 38 75 pM 225 nM (KID088) SEQ ID N° 39 (DENN94a) 88 pM SEQ ID N° 40 (A) SEQ ID N° 41 (A) SEQ ID N° 42 -0,5 nM SEQ ID N° 43 > 2 nM SEQ ID N0 44 SEQ ID N° 45 (B) SEQ ID N° 46 SEQ ID N° 47 SEQ ID N° 48 SEQ ID N° 49 SEQ ID N° 50 >~4 nM SEQ ID N° 51 SEQ ID N° 52 SEQ ID N° 53 -0,5 nM SEQ ID N° 54 QS4 mhsfcafkaddgPckARFErfffniftrqcEQfYyggcDgnqnrfesleeckkmctrd NS4 mhsfcafkaddgPckARFErfffniftrqcEQfTyggcGgnqnrfesleeckkmctrd BPII RPDFCLEPPYTGPCKRRIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA APP-I Humano

VREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAV

Oi K) SPI11 mhsfcafkaETgPeRAREDrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SPI15 mhsfcafkaESgPcRARFDrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SPI08 mhsfcafkaDGgPcRARFErFffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SPI23 mhsfcafkaEGgPcRAKFQrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SPI22 mhsfcafkaDGgPcKGKFPrFffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SPIconl mhsfcafkaETgPcRAkEDrWffniftrqcEAfVyggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI60 mhsfcafkaETgPcRAkFDrWffniftrqcEPfVYggcEgnqnrfesleeckkmctrd SPI59 mhsfcafkaETgPcRAkFDrWffniftrqcNTfVYggcGgriqnrfesleeckkmctrd SPI42 mhsfcafkaETgPcRGkFDrWffniftrqcQGfVYggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI55 mhsfcafkaEVgPcRAkFDrWffniftrqcHLfTYggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI56 mhfcafkaETgPcRGkFDrWffniftrqcAQfVYggcEgnqnrfesleeckkmctrd SPI43 mhsfcafkaETgPcRGkFDrWffniftrqcESfHYggcKgnqnrfesleeckkmctrd SPI52 mhsfcafkaDAgPcRAkFErFffniftrqcEAfLYggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI46 mhsfcafkaDVgPcRAkFErFffniftrqcEAfLYggcEgnqnrfesleeckkmctrd SPI51 mhsfcafkaDAgPcRAkFErFffniftrqcTAfFYggcGgnqnrfesleeckkmctrd (continuação) ai oo

Sequência de aminoácidos identificador 1111111111222222222233333333334444444444555555555 de proteína 1234561890123456783012345678301234567890123456789012345678 SPI54 mhsfcafkaDSgPcRARFDrWffniftrqcTRfPYggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI49 mhsfcafkaETgPcRAkIPrLffniftrqcEPfIWggcGgnqnrfesleeckkmctrd SPI47 mhsfcafkaDAgPcRAkFErFffniftrqcEEfIYggcEgnqnrfesleeckkmctrd SPI53 mhsfcafkaETgPcKGSFDrWffniftrqcNVfRYggcRgnqnrfesleeckkmctrd SPI41 mhsfcafkaDAgPcRARFErFffniftrqcDTfLYggcEgnqnrfesleeckkmctrd SPI57 mhsfcafkaDsgPcKGRFGrLffniftrqcTAfDWggcGgnqnrfesleeckkmctrd DPI-1.1.1 mhsfcafkadTgpcRaRFDrfffniftrqceAfiyggcegnqnrfesleeckkmctrd DPI-1.1.2 mhsfcafkadTgpcRaRFDrfffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd (A) DPI-1.1.3 mhsfcafkadAgpcRaRFDrfffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd DPI-1.1.4 mhsfcafkadlgpckaRFDrfffniftrqceAfiyggcegnqnrfesleeckkmctrd DPI-1.1.5 mhsfcafkaddgpckaRFDrfffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd DPI-1.1.6 mhsfcafkaddgpckaRFkrfffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd

KPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDG

Humano

DPI-1.2.1 kpdfcfleedlgPcrgRFDryfynnqtkqcelfIyggcEgnmnnfetleecknicedg GPSWCLTPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRACKKG

Humano DPI-1.3.1 gpswcltpadTgPcraRFDrfyynsvigkcEpfIyGgcggnennftskqeclrackkg a3 KuDom de colagénio ETDICKLPKDEGTCRDFILKWYYDPNTKSCARFWYGGCGGNENKFGSQKECEKVCAPV humano DPI-2.1 etdicklpkdTgPcrARFDkwyydpntkscEPfVyggcggnenkfgsqkecekvcapv Domínio 1 de

NAEICLLPLDYGPCRALLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRI TFPI-2 Humano

Afinidade KD SEQ ID N° >~4 nM SEQ ID N° 55 SEQ ID N° 56 -0,8 nM SEQ ID N° 57 SEQ ID N° 58 (AB) SEQ ID N° 59 SEQ ID N° 60 (A) SEQ ID N° 61 SEQ ID N° 62 (A) SEQ ID N° 63 (AB) SEQ ID N° 27 (B) SEQ ID N° 128 (0 SEQ ID N° 129 SEQ ID N° 64 SEQ ID N° 65 SEQ ID N° 66 SEQ ID N° 67 SEQ ID N° 68 SEQ ID N° 69 SEQ ID N° 70

Identificador de proteína (continuação)

Sequência de aminoácidos 11111Π11Ί222222222233333333334444444444555555555 Afinidade K„ seq id 12345δ7θ901234567θ9012345678901234567890123456789012345678 DPI-3.1:1 naeicllpldTgpcraRFDryyydrytqscEqflyggcegnannfytweacddacwri

SEQ ID r r 7i

Domínio 2 de TFPI-2 humano

SEQ ID VPKVCRLQV* SVDDQCEGSTEKYFFNLSSMTCEKFFS6GCHRNR-

IENRFPDEATCMGFCAPK

DPI-3.2.1 vpkvcrlqvETGPcRgKFekyffnlssmtceTfVYggcEGnrnrfpdeatcmgfcapk SEQ ID

Domínio 3 de IPsfCyspkdegLCSANV1RYYFBPRYR1CDAFIYIGCGGBDBNFVSREDCKRACAKA SEQ ID TFPI-2 humano

DPI-3.3.1 ipsfcyspkdTgPcRaRFtryyfnpryrtcdaftyGgcggndnnfvsredckracaka SEQ ID

ITI-K1 Humano KEDSCQLGYSAGPCMGMTSRYFYNGTSMACETFQYGGCMGNGNNFVTEKECLQTCRTV SEQ ID

DPI-4.1.1 kedscqlgyEagpcRgKFsryfyngtsmacetfVyggcGgngnnfvtekeclqtcrtv SEQ ID

ITI-K2 Humano IVAACNLPIVRGPCRAPIQLWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP SEQ ID

DPI-4.2.1 tvaacnlpiDTgpcraRFqlwafdavkgkcvlfVyggcqgncjnkfysekecreycgvp SEQ ID

DrAj- po op

VREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVIEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDIEEYCMAVCGSA SEQ ID

NEXINA-II

DPI-5.1 vrevcseqaetgpcraRFsrwyfdvtegkcapffyggcggnrnnfdteeycmavcgsa SEQ ID

DPI-5.2 vrevcseqaetgpcraRfsrwyfdvtegkcEpíIyggcggnrnnfdteeycmavcgsa SEQ ID

HKI B9 LPNVCAFPMEKGPCQIYMIRWFFNFEIGECELFAYGGCGGNSNNFLRKEKCEKFCKFI SEQ ID

DPI-6.1 lpnvcaípmeTgpcRARFtrwfínfetgecelfayggcggnsnnflrkekcekfckft SEQ ID

DPI-6.2 lpnvcafpmeTgpcRARFDrwffnfetgecelfVyggcggnsnnflrkekcekfckft SEQ ID

DPI-4.2.2 tvaacnlpivTgpcraRFqlwafdavkgkcvlípyggcqgngnkfysekecreycgvp SEQ ID

DPI-4.2.3 tvaacnlpivTgpcraRFqRwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvp SEQ ID R° 72 r 73 R° 74 N° 75 N° 76 N° 77 N° 78 R° 79 N0 80 N° 81 R° 82 r 124 R° 125 r 126 R° 130 N° 131 (continuação)

Sequência de aminoácidos

Identificador de proteína 11111Π11Ί222222222233333333334444444444555555555 Afinidade K„ seq id r 12345δ7θ901234567θ9012345678901234567890123456789012345678 DPI-4.2.4 tvaacnlpivTgpcraRFqRwafdavkgkcvlfVyggcqgngnkfysekecreycgvp SEQ ID N° 132 DPI-4,2,5 tvaacnlpiETgpcraRFDRwafdavkgkcETfVyggcGgngnkfysekecreycgvp SEQ ID N° 133 DPI-7,1 rpdfcleppytgpckarFiryfynakaglcqtfvyggcrakrnnfksaedcmrtcgga SEQ ID N°134 DPI-7,2 rpdfcleppytgpcRarFiryfynakaglcqtfvyggcrakrnnfksaedcmrtcgga SEQ ID N°135 DPI-7.3 rpdfcleppytgpcRarFiryfynakaglcqtfvyggcGakrnnfksaedcmrtcgga SEQ ID N° 136 DPI-7.4 rpdfcleppDtgpcRarFDryfynakaglcEtfvyggcGakrnnfksaedcmrtcgga SEQ ID N° 137

Sob "Afinidade", "(A)" significa que a KD é provavelmente inferior à de BPTI (viz300 pM), "(B)" significa que a KD é provavelmente inferior a 2 nM, e "(C)" significa que a KD é provavelmente inferior a 20 nM.

Oi 0

Tabela 5: ADNvg para LACI-Dl para variar os resíduos 10, 11, 13, 15, 16, 17, & 19 para a plasmina em relação a App-I (agora conhecido como não sendo muito potente).

N | K MHSFCAFKA D|E 123456789 10 5'- cctcct atgcat|tcc|ttc|tgc|gcc|ttc|aag|gct|RaS|-I Wsil |

C|W F|Y L | P QIH M| I N | T N | S T S|K I |T N | K V|R A| G A|P I|M DIA DIV G S|T C K|R A|G R|S F|I E | G R 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 RNt1ggt|Nct 1 tgt 1aRa|gSt|aNS1 Iwtc INNSI cgt

F | C

L|W F F N I F T R 21 22 23 24 25 26 27 28

ItKSIttc|ttc|aac|ate|ttc|acg cgt tccctcc-3' (SEQ ID NO. 83) 3'-g aag ttg tag aag tgc gea agggagg-5' (SEQ ID NO. 84) Tm - 80eC | Ml ui | ADN : 262144 * 4 = 1 048 576 proteína: 143360 * 4 = 573 440 A sequência de aminoácidos tem a SEQ ID N° 85.

Esta variegação permite que a sequência de Appl apareça nas posições P6-P6'. 56

Tabela 6: Derivados de LACI-KI seleccionados para ligação a Plasmina

Ident 111111111122 012345678901 DIFS Ligação T/ . do fago K° lpM| SEQ ID N° Consenso ETGPCRARFERW 0 SEQ ID B° 88 LACIKl ddgpckaimkrf 1 SEQ ID r 2 SPI31 ---------G - - 1 SEQ ID N° 83 SPI11 ---------D - - 1 3,2X 88 SEQ ID 40 SPI15 - S-------D - - 2 2,5X SEQ ID N° 90 SPI24 D-----G----L 3 SEQ ID B° 91 SPI33 - - - S - - G - - D - - 3 SEQ ID N° 92 SPI34 - V-----5 - P - - 3 SEQ ID B° 93 SPI26 -------T - P - F 3 SEQ ID N° 94 SPI37 - V-----s - H - - 3 SEQ ID B° 95 SPI32 D------S - G - - 3 SEQ ID K° 96 SPI12 ------G Μ - P - - 3 SEQ ID N° 97 SPI36 - G-------N - F 3 SEQ ID N° 98 SPI08 DG---------F 3 2,6X SEQ ID N° 42 SPI36 --------j S - F 3 SEQ ID B° 99 SPI18 - G-----K - - - F 3 SEQ ID N° 100 SPI23 - G-----K - Q - - 3 1,25X SEQ ID B° 43 SPI35 D S - A - - G----- 4 SEQ ID r 101 SPI02 D S----G----F 4 0,83X SEQ ID N° 102 SPI25 D------S - P - L 4 SEQ ID N° 103 SPI17 - V------I Q - F 4 0,09X SEQ ID N° 104 SPI05 - S-----K - A - F 4 0,64X SEQ ID B° 105 SPI13 - G-----K - A - F 4 SEQ ID N° 106 SPI07 D - - S---Kl--- 4 SEQ ID B° 107 SPI03 D S - - - K - - - D - - 0,48 X SEQ ID N° 108 SPI06 DG---KG----- 4 SEQ ID B° 109 SPI16 - V - A - K G - - H - - 5 0,22 X SEQ ID N° 110 SPI04 DG-----S - P - F 5 SEQ ID N° 111

Ident 111111111122 012345678901 (continuação) DIFS Ligação T/ . . do fago K° (pM) SEQ ID N° SPI01 DS-A---M-H-F 6 0,25 X SEQ ID r 112 SPI14 D S - A - - - K - R - - 5 SEQ ID M° 113 SPI28 D S - T - K - - - P - F 6 SEQ ID N° 114 SPI27 -----K G K I A - F 6 SEQ ID N0 115 SPI21 D S - A - K G K---- 6 0,38 X SEQ ID B° 116 SPI22 D G - - - K G K - P - F 1 2,0 X SEQ ID N° 44 "Difs" é o núnero de diferenças em relação ao Consenso. "Ligação do fago" é a ligação do fago que apresenta a proteína nomeada em relação à ligação do fago que apresenta BPTI._ oi oo

Tabela 7; Variaçao dos Resíduos 31, 32, 34 e 39

f R Q C 5’ -cctect acgl egt| tçc i - JftUl i F!S F1S Y!C Y|Ç IIP 1 |F G HJR H|R K|:D ri X. TjM *· TIM -ίΐ jí íi YÍC N|K N|K A|V VJA V|A XjT DtG iD IG S)P c E|S EI0 mo F FÍ1 ΥΪ8 G G € KSR G N Q 31 32 33 34 35 se 37 38 39 40 41 42 SNS [MNS tteJNHtj tRS j íígt iggtj tgtjREg ggt1saç i eag I Bstt n i

gfccgtgctcfcitagcaegscotg~3f (BEQ ΧΌ NO, 8SJ A sequência de aminoácidos é SEQ ID N° 87. 0 local de EcoRI é eliminado; assim, a clivagem com EcoRI pode ser utilizada para eliminar (ou, pelo menos, reduzir imenso) o ADN percursor. Há 262144 sequências de ADN e 72000 sequências de proteína. 59

Tabela 8: Seleccionados para ligação a plasnina com variegação da segunda ansa 6 Ο

Id 111111111122 012345678901 3333333334 1234567890 r Difs Cl c Kl Conl ETgPcRAKFDrW E A f V Ϊ g g c G g 10 SEQ ID r 45 SPI47 DA-------E - F - E - I ----E - 7 (5) 5 SEQ ID N° 57 SPI51 DA-------E - F T - - F — 6 w 9 SEQ ID N° 54 SPI52 DA-------E - F - - - L — 5 (3) 8 SEQ ID tf 52 SPI46 D V-------E - - - - L ----E - 6 (3) 7 SEQ ID K° 53 SPI41 DA-----R - E - F D T - L ----E - 9 (6) 8 SEQ ID tf 59 SPI42 ------G----- QG-------- 3 (3) 12 SEQ ID N° 48 SPI43 ------G----- - S - H ----K - 4 (4) 11 SEQ ID tf 51 SPI56 ------G----- AQ - - ----E - 4 (3) 11 SEQ ID N0 50 SPI59 N T-------- 2 (2) 11 SEQ ID tf 47 SPI60 - P - - ----E - 2 (D 9 SEQ ID tf 46 SPI55 - v----------- H L - T------ 4 (4) 11 SEQ ID ff 49 SPI49 --------I P - L - P - I w----- 6 (6) 10 SEQ ID tf 56 SPI57 D S---K G R - G - L T - - D W----- 10 (8) 11 SEQ ID N° 60 SPI53 -----K G S---- N V - R ----R - 7 (7) 11 SEQ ID tf 58 SPI54 D S-----R---- T R - P------ 6 (4) 10 SEQ ID tf 55 SPI11 -------R---- e e f i y g g c e g [1] (4) 7 SEQ ID tf 40 LACIl ddgpckaimkrf e e f i y g g c e g 10 (7) 0 SEQ ID tf 2 Ver notas abaixo. Na Tabela, significa que a proteína tem o tipo de consenso (Conl). 0 Conl contém o tipo mais comum em cada posição; os aminoácidos mostrados em Conl não foram variados. Quatro posições (10, 31, 34, e 39) mostraram a tolerância para um segundo tipo, conduzindo a 15 sequências consenso subsidiários: Con2-Conl6. A coluna "N° Dífs" mostra o número de diferenças de CON1 sob "Cl" as diferenças com o mais próximo de Conl-CON16 sob "C", e as diferenças de LACI-K1 sob o "Kl". SPI11 foi seleccionado de uma biblioteca em que os resíduos 31-39 eram bloqueados no tipo selvagem. SPI11 < ΒΡΤΙ < SPI23 = SPI51 < SPI47 < QS4 < SPI22 < SPI54 < SPI43

Altamente Muito potente potente superior

Tabela 9: Substituições conservadoras e Semi-conservadoras Τ 9

Tipo inicial AA Categoria Substituições conservadoras Substituição semi-conservadora A Não polar ou levemente polar pequena G, S, T N, V, P, (C) C dissulfureto SH livr A, M, L, V, I nada F, G nada D acídíco, hidrofílico E, N, s, T, Q K, R, Η, A E acídíco, hidrofílico D, Q, s, T, N K, R, Η, A F Gly aromático apenas W, Y, H, L, M nada I, V, (C) nada G conformação "normal" conformação A, S, N, T D, E, Η, I, K, L, M, Q, R, V H Anfotérico aromático Y, F, K, R L, M, A, (C) I alifático, carbono β ramificado V, L, Μ, A F, Ϊ, W, G (C) K básico R, H Q, N, S, I, D, E, A L alifático Μ, I, V, A F, Ϊ, W, H, (C) M Hidrofóbico L, I, V, A Q, F, Y, W, (0; (R), (K), (E) N Não polar hidrofilico s, T, (E) (D), Qr A, G, K, R P inflexível V, I a, ic: q, (r: l, (D), (E)i 1, S, I, w, F, Η, (K), L, Μ, N Y Q Alifático mais amina N, E, A, S, T, D M, L, K, R R básico K, Q, H S, I, E, D, A, hídrofílíco T hídrofílíco alifático, V carbono β ramificado W aromático Y aromático A, I, G, N D, A, S, G, N, V I, L, M, A, T ' F, Y, H L, F, W, H L, E, R, K E, R, K, I P, (C) Μ, I, V, (C) Μ, I, V, (C) 6 2 A alteração de A, F, Η, I, L, Μ, P, V, W ou Y para C é semi-conservadora se a nova cisteína permanecer como um tiol livre. A alteração de M para E, R, K é semi-conservadora se a extremidade iónica do novo grupo lateral puder alcançar a superfície da proteína enquanto os grupos metileno fazem contactos hidrofóbicos. A alteração de P para um de K, R, E, ou D é semi-conservadora se o grupo lateral estiver na superfície da proteína ou próximo dela.

Tabela 10: Derivados de domínios Kunitz de LACi-Kl que inibem a plasmina

Posição Consenso N°1 Consenso N°2 Consenso N°3 Consenso Ns4 Tipo Estado Tipo Estado Tipo Estado Tipo Estado 10 D fixo D fixo E/D S-S D/E S-S 11 D fixo D fixo T/S G-S T/A G-S 12 G fixo G fixo G fixo G fixo 13 P Abs-S P VS-S P VS-S P Abs-S 14 C fixo c fixo c fixo C fixo 15 K fixo K fixo R S-S R S-S 16 A Abs-S A Abs-S A VS-S A S-S 17 R Abs-S R VS-S R/K S-S K S-S 18 F Abs-S F Abs-S F VS-S F VS-S 19 E Abs-S E Abs-S -E/P/ D S-S D/E VS-S 20 R fixo R fixo R fixo R fixo 21 F fixo F fixo W/F fraco- Sel W/F fraco-Sel 31 E S-S E S-S E fixo E/t G-S 32 Q G-S Q G-S E fixo A/T Forte para não carregado, fraco para tipo 63 33 F fixo F fixo F fix F fixo 34 - Sem consenso T/S fraco I fixo V/L/ fraco 35 Y fixo Y fixo Y fixo Y S-S 39 - Sem consenso G fraco Sei. E fixo G/E alguns-Sel. Abs-S-S Selecção Absoluta S-S Selecção Forte Vs-s Selecção Muito Forte G-S Selecção Boa

Tabela 11: Inibidores de Plasmina Concebidos com

Especificidade Elevada

Sequência 1111111111222222222233333333334444444444555555555 Ident 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678 SEQ ID N° SPI11 mhsfcafkaETgPcRARFDrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SEQ ID N" 40 Splll-R15A mhsfcafkaETgPcAARFDrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SEQ ID N° 117 Splll-R15G mhsfcafkaETgPcGARFDrWffniftrqceefiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SEQ ID N° 118 SPI11-R15N- E32A mhsfcafkaETgPcNARFDrWffniftrqceAfiyggcegnqnrfesleeckkmctrd SEQ ID N° 117 64

Tabela 12: ADNvg para LACI-D1 variar os resíduos 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 37, 38 e 39 para a plasmina em relaçao a App-I-Eu e SPI11 MHSFCAfKA D |I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S * ~ ccfccct ãt gést \ tcç | ttç |; tgc I f ee l ttc \ ®.ag | gct I G»5 I I mn \ ¥|L· FSS F|S FIS Y)C 'f IC C|P ídP LJP HÍR H j R HÍR IfT IIT I IT Kl® KfV U|V Iff VID SIP AID AID A|D VtD A|S TSA G G Q K|R A|G RjK f 6 E1Q 11 12 13 14 15 16 17 W 19 2® INCtEHNtjHNtl iNNtíaRa jRKfcl a Ra! l ttc 1 cRt) FiC L jtí F F Μ I F T R Q C 21 22 23 24 25 26 27 2® 2® 30 ItKSsttc: 1 ttc 1 s.ac 1 ate f ttc 1 : acg egt 1cag1tgc1 3’ « laag asg ttg tag aag tgc gca gtc aeg- E 31 A 32 F 33

V 34 I Mi Cl —«· F|5 Ff 3 Y|G L [ P Y| L píh I SM HS& rii T1M Ϊ |T tík Ki$ »'|V VIA mv AID DIG Ajfi ¥ G G c GjB 35 36 31 38 3S atg cca nna nna FftS & 4Q M 41 42 I BstEll A primeira cadeia (topo) de ADN é SEQ ID N° 120. A segunda cadeia (em baixo) de ADN é SEQ ID N° 121. A sequência de aminoácidos é SEQ ID N° 122. 65 A cadeia do topo para os codões 31-42 (mostrados) não necessita ser sintetizada, mas é produzida por PCR a partir das cadeias apresentadas.

Existem 1,37 x 1011 sequências de ADN que codificam 4,66 x 1011 sequências de aminoácidos.

Tabela 14: Definição de um domínio Kunitz (SEQ ID N° 123) 1 2 3 4 5 1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678 xxxxCxxxxxxGxCxxxxxxXXXxxxxxxCxxFxXXGCxXxxXxXxxxxxCxxxCxxx

Em que: XI, X2, X3, . X4, X58, X21 = Phe, Tyr, Trp, X22 = Tyr OU Phe, X23 = Tyr ou Phe, X35 = Tyr ou Trp, X36 = Gly ou Ser, X40 = Gly ou Ala, X43 = Asn ou Gly, e X45 = Phe ou Tyr and X56 podem estar ausentes,

Tabela 15: Substituições que conferem afinidade elevada para a plasmina a KuDoms

Posição Tipos permitidos Posição Tipos permitidos 10 Asp, Glu, Tyr 20 Arg 11 Thr, Ala, Ser, Vai, Asp 21 Phe, Trp, Tyr 12 Gly 31 Asp, Glu, Thr, Vai, Gin, Ala 13 Pro, Leu, Ala 32 Thr, Ala, Glu, Pro, Gin 14 Cys 34 6 6 15 Arg, Lys 35 Tyr, Trp 16 Ala, Gly 36 Gly 17 Arg, Lys, Ser 37 Gly 18 Phe, Ile 38 Cys 19 Glu, Asp, Pro, Gly, Ser, Ile 39 Glu, Gly, Asp Arg, Ala, Gin Leu, Lys, Met

Na Tabela 15, sao preferidos os tipos de resíduos a negrito.

Tabela 16: Sumário das Sequências seleccionadas a partir da primeira biblioteca de LACI-K1 para ligação a Plasmina

BPTI# (Tipo de BPTI) (LACI-K1) Resíduos permitidos na biblioteca Resíduos preferidos 13 (P) P LHPR PL 16 (A) A AG AG 17 (R) I FYLIENA SCPRTVD G RS 18 (I) M todos F 19 (I) K LWQMKAG SPRTVE EQ 31 (Q) E EQ EQ 32 (T) E EQ QE 34 (V) I todos TYHDRAVELSF 39 (R) E todos GADRQFEMLVKNH 67

Tabela 17: Distribuição de sequências seleccionadas a partir da primeira biblioteca

Posi ção A C D E F G H I K L M N P Q R s T V w Y 13 X X X X X X 0 X X 1 X X 31 * X 0 X I X I X X X 16 31 * X X X X 1 X X X X X X X X X 1 X f X X X X 17 0 0 0 X 0 0 0 0· X 0 X 0 0 X 30 2 0 0 X 0 18 0 0 0 0 32 0 0 0 0 0 0· 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 X X },l 1’ °l lx X 0* 0 0 X 0 1 0 ' 0 0 0 0 X 31 X X X 28 • X X X X X X X X X 4 X X X X X X 32 X X X 9* X X X X X X X X X 23 X X X X X X 34 2 0 1 0 1 0 2 5* 0 2 0 0 0 0 I 3 8 5 0 2 39 3 0 3 2* 1 10 1 0 2 1 |2 2 1 0 3 1 0 0 1 0 0 68

Tabela 18: Distribuição de tipos de aminoácidos em vários resíduos em proteínas seleccionadas para ligação a plasmina a partir da terceira biblioteca

Posi ção A C D H F G H I K L M N P Q R S T V W Y 10 X X T 8 X X X X 0 X X 0 X X X X X X X X 11 4 X 0* X X 0 X 0 X X X 0 X X X 2 7 2 X X 13 0 X X X X X X X X X X X 15 * X X 0 0 X X X 15 X X X X X X X X 2* X X X X X 13 X X X X X 16 10 * X X X X 5 X X X X X X X X X X X X X X 17 X X X X X X X 0* 11 X 0 0 X X 3 1 0 X X X 18 X X X X 14 X X 1 X X X* X X X X X X X X X 19 0 0 8 5 0 1 0 0 0* 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 21 X 0 X X 5* X X X X 2 X X X X X X X X 8 X 31 1 0 1 6* 0 0 1 0 0 0 0 2 0 1 0 0 3 0 0 1 0 32 4 0 0 1* 0 1 0 0 0 1 0 0 2 1 1 1 2 1 0 0 34 0 0 1 X 1 0 1 2* X 3 X 0 1 X 1 0 1 4 X 0 35 X 0 X X X X X X X X X X X X X X X X 2 13 * 39 X X X 5* X 8 X X 1 X X X X X 1 X X X X X 69

Tabela 23: Resultados de Especificidade Obtidos com Kudoms Expostos em gpIII de M13 Alvo

KuDom Exposto Plasmina Trombina Calicreina Tripsina Tripsina, 2 lavagens LACI-K1 1,0 O \—1 O \—1 O \—1 1,0 QS4 52, 0,7 0,9 LO 0,5 BPTI 88, 1,1 1,7 0,3 0, 8 0 fago LACI-K1 para cada alvo foi tomado como uma unidade de ligação e os outros fagos de apresentação são apresentados como ligação relativa. Os fagos BPTI::III não são facilmente libertados da tripsina. 70 TABELA 24: Vectores de expressão de S. cerevisiae Mat a:

K R P R 5*» 3' ♦ « SAA&i &3G|CCT|CGAÍ0, * istui ( (after Introductioa o£ a Untar into stui-eut IMA) KREAAEFWSA, * L g 5' \MhlA£GΪ GAAIGCGIGCCIGASICCA j TGGíGGC |GCCITM|TAS[CfCj SAG}3 1

í JSftOX I

MatQS-IACI“Kl

a fe c d 1 .2 3 4 S 6 7 B

KKEAAXMKSPCAFK 5 ’ íMA |AGGIGM. | GGG f GCC! GAG j atg [ cãt ftccs tte j tgc j gct f fetc j aas j i Jagfl j j mil [

1 *V * * * * * 1 * 1 —ΓΤΤΤΤΤΤΤΠΠ L L . L L 9 10 11 12 13 14 15 1« 17 18 15 20

A D D G P C K A 1 Μ K A

I gct | gafe | gaC {ggf | ccG j tgt i aaa l gct! ate í atg 1 asa j cgt | j Rsxll t j SspRH 21 22 23 24 25 26 27 28 20 30

F F F N 1 F f F Q C 11tc11tcttte f sac § att|tte j aeSf cgtϊ cag!tgc j i Mlíil' í 31 32 33 34 35 M 37 38 30 40 41 42

E E F I Y G G € E G R Q j g&gí ga&:| ttCIattltac1ggt}ggt|tgt(çaa|ggt5 aac!cag\ ) AceRI 1 j BstEIl l 43 M 45 46 4? 48 4S 50

N R F E S h E E í aact egG!ttei gs&ItctíctA I gagIgaaI 1 | B-gfcBI t I Xbãl ϊ' .L.Ãgg;L..l 51 S2 53 54 55 5S 57 58 59 60 CKKHCTRDGA I tgt I mg i a&g Satgi tgc f açt j cgt í gae | ggc | gee IYAA1TAGI CfC S GAG | -31 I Ksal j ) Xhel \

Espera-se que a pré-sequência de Mata seja clivada antes de GLUa -Alab- 71 CITAÇÕES; ADEL86: Adelman et ai., Blood(1986)68(6)1280-1284. ANBA88: Anba et al., Biochimie (1988) 70(6)727-733. AUER88: Auerswald et al. , Bio Chem Hoppe-Seyler (1988), 369 (Supplement) :27-35. BANE90: Baneyx & Georgiou, J Bacteriol (1990)172(1)491-494.

Bank91: Baneyx & Georgiou, J Bacteriol (1991) 173(8)2696-2703. BROW91: Browne et ai., GeneBank entry M74220. BROZ90: Broze et ai., Biochemistry (1990) 29:7539-7546.

Cold87: Colman et ai., Editors, Hemostasis and Thrombosis,

Second-Edition, 1987, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA. DENN94a: Dennis & Lazarus, J Biological Chem (1994) 269:22129- 22136. DENN94b: Dennis & Lazarus, J Biological Chem (1994) 269:22137- 22144. EIGE9 0: Eigenbrot et ai., Protein Engineering (1990), 3(7)591- 598 . ELLI92: Ellis el al., Ann N Y Acad Sei (1992) 667:13-31. 72 FIDL94: Fidler & Ellis, Cell (1994) 79:185-188. FRAE8 9 91 . GARD93 GIRA89 GIRA91 GREG93 HOOV93 HYNE90 KID088 KID090 167(2) KURJ82 LASK80 LEAT91 30 (44) LOHM93 9(4)30 : Fraedrich et al., Thorac Cardiovasc Surg (1989) 37(2)89- : Gardell, Toxicol Pathol (1993) 21(2)190-8. : Girard et al., Nature (1989), 338:518-20. : Girard et al., J. BIOL. CHEM. (1991) 266:5036-5041. : Gregg et al., Bio/Technology (1993) 11:905-910. : Hoover et al., Biochemistry (1993) 32:10936-43. : Hynes et al., Biochemistry (1990), 29:10018-10022. : Kido et al., J Biol Chem (1988), 263:18104-7. : Kido et al., Biochem & Biophys Res Comm (1990), 716-21. : Kurjan and Herskowitz, Cell (1982) 30:933-9.43. : Laskowski & Kato, Ann Rev Biochem (1980), 49:593-626. : Leatherbarrow & Salacinski, Biochemistry (1991) 10717-21 . : Lohmann & J Marshall, Refract Corneai Surg (1993) 0-2 . 73 LUCA83: Lucas et al., J Biological Chem (1983) 258(7)4249-56. MANN87: Mann & Foster, Chapter 10 of COLM87. MIYA85: Miyajima et al., Gene (1985) 37:155-161. NEUH89: Neuhaus et al., Lancet (1989) 2(8668)924-5. N0V089: Novotny et al., J. BIOL. CHEM. (1989) 264:18832-18837. OREI94: 0'Reilly et al., Cell (1994) 79:315-328. PARK86: Park & Tulinsky, Biochemistry (1986) 25(14)3977-3982. PUTT89: Putterman, Acta Chir Scand (1989) 155(6-7)367. ROBB87: Robbins, Chapter 21 of COLM87 SCHE67: Schechter & Berger. Biochem Biophys Res Commun (1967) 21:157-162 . SCHE68: Schechter & Berger. Biochem Biophys Res Commun (1968) 32:898-902 . SCHN86: Schnabel et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1986), 367:1167-76 . SHER89: Sheridan et al. , Dis Colon Rectum (1989) 32(6)505-8. SPRE94: Sprecher et al. , Proc Natl Acad Sei USA 91:3353-3357 (1994) 74 VAND92: van Dijl et al., EMBO J (1992) 11(8)2819-2828. VARA83:Varadi & Patthy, Biochemistry (1983) 22:2440-2446. VARA84: Varadi & Patthy, Biochemistry (1984) 23:2108-2112. VEDV91: Vedvick et al., J Ind Microbiol (1991) 7:197-201. WAGN92: Wagner et al. , Biochem Biophys Res Comm (1992) 186:1138- 1145. WUNT88: Wun et al., J. BIOL. CHEM. (1988) 263:6001-6004.

As seguintes páginas 76 a 78 contêm formas de realização preferidas. 75

Formas de realização 1. Uma proteína inibidora de plasmina que compreende uma sequência do aminoácidos que é substancialmente homóloga aos resíduos 5 a 55 de uma sequência de referência seleccionada do grupo compreendendo SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4 e NS4, como mostrada na Tabela 4. 2. Uma proteína como na forma de realização 1, em que a sequência é idêntica nos resíduos 10-21 e 31-39 e tem cinco ou menos diferenças nos resíduos 5-9, 22-30 e 40-55, comparativamente a uma sequência de referência seleccionada do grupo compreendendo SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4 e NS4, como mostrada na Tabela 4. 3. Uma proteína inibidora de plasmina em que a referida proteína compreende um domínio Kunitz que preenche os requisitos mostrados na Tabela 14 com números dos resíduos com referência a BPTI, e em que a referida proteína tem nas posições 12-21 e 32-39 do domínio Kunitz um dos tipos de aminoácidos listados para essa posição na Tabela 15 e em que a sequência do referido dominio Kunitz é mais semelhante, em sequência de aminoácidos, a uma sequência de referência seleccionada do grupo SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4, NS4, LACI-K2 humano, LACI-K3 humano, KuDom a3 de colagénio humano, Domínio 1 de TFPI-2 humano, Dominio 2 de TFPI-2 humano, Dominio 3 de TFPI-2 humano, ITI-K1 humano, ITI-K2 humano, protease NEXIN-II humana, APP-I humano, DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.2.1, DPI-1.3.1, DPI-2.1, DPI-3.1.1. , DPI-3.2.1, DPI-3.3.1, DPI-4.1.1, DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4, DPI-4.2.5, DPI-5.1, DPI-5.2, DPI-6.1 76 e DPI-6.2, do que é a sequência de aminoácidos do referido dominio Kunitz à sequência de BPTI. 4. Uma proteína como na forma de realização 3, em que o resíduo 18 é Phe, o resíduo 15 é Arg, o resíduo 16 é ala e o resíduo 17 é Arg. 5. Uma proteína como na forma de realização 1 ou na forma de realização 3, em que a referida proteína têm uma Ki para a plasmina humana de 100 pM ou menos. 6. Um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio atribuível a actividade excessiva da plasmina que compreende a administração, a um indivíduo humano ou animal que beneficie da mesma, de uma quantidade inibidora de plasmina da proteína da forma de realização 1 ou da forma de realização 3. 7. Um método de ensaio para a plasmina que compreende proporcionar a proteína da forma de realização 1 ou da forma de realização 3 em forma marcada ou insolubilizada, e determinar se é formado um complexo da referida proteína e da amostra de plasmina. 8. Um método de purificação da plasmina a partir de uma mistura que compreende colocar em contacto a mistura com a proteína ou análogo da forma de realização 1 ou da forma de realização 3 na forma insolubilizada, e permitir a ligação da plasmina. 9. Uma proteína como na forma de realização 3, em que o domínio Kunitz parental é de origem humana e a proteína inibe a plasmina humana com uma Ki de cerca de 300 picomolar ou menos. 77 10. Uma proteína como na forma de realização 3, em que a proteína tem, em cada das posições listadas na Tabela 15, um tipo de aminoácido mostrado para essa posição na Tabela 15. 11. Uma proteína inibidora de plasmina que tem uma Ki de cerca de 100 pM ou menos.

Lisboa, 14 de Dezembro de 2011 78

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido inibidor de plasmina isolado, compreendendo uma estrutura do domínio Kunitz que compreende uma sequência de aminoácidos que tem a fórmula: Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaall-Gly-Xaal3-Cys-Xaal5-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Xaal9-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe-Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa57-Xaa58, em que qualquer de Xaal, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 ou Xaa58 pode estar ausente; Xaal 0 é seleccionado de Asp e Glu; Xaal 1 é seleccionado de Thr, Ala e Ser; Xaal3 é Pr o; Xaal 5 é Arg; Xaal 6 é Ala; Xaal 7 é Arg; Xaal 8 é Phe ; Xaal9 é seleccionado de Glu e Asp; Xaa21 é seleccionado de Phe e Trp; Xaa22 é seleccionado de Tyr e Phe; Xaa23 é seleccionado de Tyr e Phe; Xaa31 é seleccionado de Asp e Glu; Xaa32 é seleccionado de Thr, Ala e Glu; Xaa34 é seleccionado de Vai, lie e Thr; Xaa35 é Tyr; Xaa36 é Gly; 1 Xaa39 é seleccionado de Glu, Gly e Asp; Xaa40 é seleccionado de Gly e Ala; Xaa43 é seleccionado de Asn e Gly; e Xaa45 é seleccionado de Phe e Tyr, na preparação de um medicamento para o tratamento de fibrinólise inapropriada ou fibrinogenólise associada com bypass cardiopulmonar, cirrose hepática, amiloidose, leucemia promielocítica aguda, tumores sólidos e para bloquear metástases tumorais.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido inibidor de plasmina compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N°: 40, SEQ ID N° : 41, SEQ ID N° : 61, SEQ ID N° : 62 e SEQ ID N°: 63.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido inibidor de plasmina compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 40. Lisboa, 14 de Dezembro de 2011 2