ES2375561T3 - Inhibidores de la plasmina humana derivados de dominios kunitz y �?cidos nucleicos que codifican los mismos. - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido inhibidor de plasmina aislado que comprende una estructura de dominio Kunitz, que comprende una secuencia de aminoácido que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Gly-Xaa13-Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa17- Xaa18-Xaa19-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe- Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49- Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa57-Xaa58, en la que cualquiera de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 puede estar ausente; Xaa10 se selecciona de Asp y Glu; Xaa11 se selecciona de Thr, Ala y Ser; Xaa13 es Pro; Xaa15 es Arg; Xaa16 es Ala; Xaa17 es Arg; Xaa18 es Phe; Xaa19 se selecciona de Glu y Asp; Xaa21 se selecciona de Phe y Trp; Xaa22 se selecciona de Tyr y Phe; Xaa23 se selecciona de Tyr y Phe; Xaa31 se selecciona de Asp y Glu; Xaa32 se selecciona de Thr, Ala y Glu; Xaa34 se selecciona de Val, IIe y Thr; Xaa35 es Tyr; Xaa36 es Gly; Xaa39 se selecciona de Glu, Gly y Asp; Xaa40 se selecciona de Gly y Ala; Xaa43 se selecciona de Asn y Gly; y Xaa45 se selecciona de Phe y Tyr, en la preparación de un medicamento para tratar la fibrinólisis o fibrinogenolisis inadecuadas, asociadas con circulación extracorpórea, cirrosis hepática, amiloidosis, leucemia promielocítica aguda, tumores sólidos y para bloquear la metástasis tumoral.

Description

Inhibidores de la plasmina humana derivados de dominios Kunitz y acidos nucleicos que codifican los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Campo de la invencion

5 Esta invenci6n se refiere a nuevos mutantes del primer dominio Kunitz (K1) del inhibidor de coagulaci6n asociado a lipoprotefnas LACI humano, que inhibe la plasmina. La invenci6n tambien se refiere a otros dominios Kunitz modificados que inhiben la plasmina y a otros inhibidores de plasmina.

Descripcion de la tecnica anterior

El agente principal responsable de la fibrin6lisis es la plasmina, la forma activada del plasmin6geno. Muchas

10 sustancias pueden activar el plasmin6geno, incluyendo el factor Hageman activado, estreptoquinasa, uroquinasa (uPA), activador del plasmin6geno de tipo tisular (tPA), calicrefna plasmatica (pKA). La pKA es tanto un activador de la forma de zim6geno de la uroquinasa como un activador directo de plasmin6geno.

La plasmina no se puede detectar en la sangre que circula normal, pero el plasmin6geno, el zim6geno, esta presente en una concentraci6n de aproximadamente 3 IM. Una cantidad adicional, no medida, del plasmin6geno

15 esta unida a fibrina y otros componentes de la matriz extracelular y superficies celulares. La sangre normal contiene el inhibidor fisiol6gico de la plasmina, el inhibidor de plasmina α2 (α2-PI), en una concentraci6n de aproximadamente 2 IM. La plasmina y el α2-PI forman un complejo 1:1. La plasmina unida a la matriz o a la celula esta relativamente inaccesible para la inhibici6n por el α2-PI. Por lo tanto, la activaci6n de la plasmina puede superar la capacidad neutralizante del α2-PI produciendo un estado profibrinol6tico.

20 Una vez formada, la plasmina:

i. degrada los coagulos de fibrina, a veces de forma prematura;

ii. digiere el fibrin6geno (el material estructural de los coagulos) deteriorando la hemostasia produciendo la formaci6n de coagulos disgregables y que son lisados facilmente a partir de los productos de degradaci6n, y la inhibici6n de la adhesi6n/agregaci6n de plaquetas por los productos de degradaci6n del

25 fibrin6geno;

iii. interacciona directamente con las plaquetas para escindir las glicoprotefnas Ib y IIb/IIIa impidiendo la adhesi6n al endotelio danado en zonas de flujo sangufneo de alta tensi6n de cizallamiento, y deteriorando la respuesta de agregaci6n necesaria para la formaci6n de tapones de plaquetas (ADEL86);

iv. inactiva enzimas proteolfticamente en la ruta de coagulaci6n extrfnseca promoviendo ademas un 30 estado proteolftico.

Robbins (ROBB8?) revis6 con detalle el sistema de plasmin6geno-plasmina.

Fibrin6lisis y fibrinogenolisis

La fibrin6lisis y fibrinogenolisis inadecuadas que conducen a la hemorragia excesiva son una complicaci6n frecuente en los procedimientos quirurgicos que requieren circulaci6n extracorp6rea, tal como la circulaci6n extracorp6rea y

35 tambien se encuentra en la terapia trombolftica y el trasplante de 6rganos, particularmente de hfgado. Otras afecciones clfnicas caracterizadas por una alta incidencia de diatesis hemorragica incluyen cirrosis hepatica, amiloidosis, leucemia promielocftica aguda y tumores s6lidos. La restauraci6n de la hemostasia requiere la infusi6n de plasma y/o productos del plasma, la cual tiene riesgo de reacciones inmunol6gicas y exposici6n a pat6genos, por ejemplo virus de la hepatitis y VIH.

40 Una perdida muy grande de sangre puede no resolverse incluso con infusi6n masiva. Cuando se considera potencialmente mortal, la hemorragia se trata con antifibrinolfticos tales como acido ε-amino-caproico (vease HOOV93) (EACA), acido tranexamico o aprotonina (NEUH98). La aprotonina tambien se conoce como Trasylol® y como inhibidor de la tripsina pancreatica bovina (BPTI). En lo sucesivo, la aprotinina se denominara "BPTI". El EACA y el acido tranexamico s6lo impiden la uni6n de la plasmina a la fibrina por uni6n a los kringles, dejando asf a la

45 plasmina como una proteasa libre en el plasma. El BPTI es un inhibidor directo de la plasmina y es el mas eficaz de estos agentes. Debido a las potenciales complicaciones tromb6ticas, toxicidad renal, y en el caso del BPTI, inmunogenicidad, estos agentes se usan con precauci6n y normalmente se reservan como "ultimo recurso" (PUTT89). Los tres agentes antifibrinolfticos carecen de especificidad y afinidad de objetivo, e interaccionan con tejidos y 6rganos por rutas metab6licas no caracterizadas. Las grandes dosis necesarias debido a la baja afinidad,

50 los efectos secundarios debidos a la falta de especificidad y la potencial reacci6n inmunitaria y toxicidad en

6rganos/tejidos, se unen contra el uso de estos antifibrinolfticos para la prevenci6n profilactica de hemorragias o como terapia postoperatoria rutinaria, para evitar o reducir la terapia por transfusi6n. Por lo tanto, se necesita un antifibrinolftico seguro. Los atributos esenciales de dicho agente son:

i. Neutralizaci6n de la o las enzimas fibrinolfticas objetivo relevantes;

ii. Alta afinidad de uni6n a las enzimas objetivo para minimizar la dosis;

iii. Alta especificidad por el objetivo, para reducir los efectos secundarios; y

iv. Alto grado de similitud con la protefna humana para minimizar la potencial inmunogenicidad y/o toxicidad en 6rganos/tejidos.

Todas las enzimas fibrinolfticas que son objetivos candidatos para la inhibici6n mediante un antifibrinolftico eficaz son serina proteasas hom6logas a la quimiotripsina.

Hemorragia excesiva

La hemorragia excesiva puede ser el resultado de una actividad de coagulaci6n deficiente, elevada actividad fibrinolftica, o una combinaci6n de los dos procesos. En la mayorfa de las diatesis hemorragicas se debe controlar la actividad de la plasmina. Se cree que el efecto clfnico beneficioso del BPTI en la reducci6n de la perdida de sangre resulta de la inhibici6n de la plasmina (KD ∼ 0,3 nM) o la calicrefna plasmatica (KD ∼ 100 nM) o ambas enzimas.

En GARD93 se revisan los trombolfticos actualmente usados, diciendo que aunque los agentes trombolfticos (por ejemplo, tPA) abren los vasos sangufneos, la hemorragia excesiva es un problema de seguridad grave. Aunque el tPA y la estreptoquinasa tienen semividas en el plasma cortas, la plasmina que activan permanece en el sistema durante un periodo de tiempo largo, y como se ha expuesto, el sistema es potencialmente deficiente en inhibidores de plasmina. Por lo tanto, la activaci6n excesiva de plasmin6geno puede conducir a una incapacidad de coagular peligrosa y a hemorragias perjudiciales o mortales: en dichos casos serfa util un inhibidor de plasmina potente y altamente especffico.

El BPTI es un inhibidor de plasmina potente, sin embargo, se ha encontrado que es suficientemente antfgeno para que los segundos usos requieran ensayo de la piel. Ademas, las dosis de BPTI necesarias para controlar la hemorragia son bastante altas y el mecanismo de acci6n no esta claro. Algunos dicen que el BPTI actua sobre la plasmina, mientras que otros dicen que actua inhibiendo la calicrefna del plasma. En FRAE89 se describe que dosis de aproximadamente 840 mg de BPTI a 80 pacientes de cirugfa a coraz6n abierto, redujeron la perdida de sangre en casi la mitad, y la cantidad media de transfusi6n disminuy6 en ?4%. Miles Inc. ha introducido recientemente el Trasylol en EE.UU. para reducir la hemorragia en cirugfa (vease el folleto del producto de Miles sobre el Trasylol). En LOHM93 se sugiere que los inhibidores de plasmina pueden ser utiles para controlar la hemorragia en la cirugfa ocular. En SHER89 se describe que el BPTI puede ser util para limitar la hemorragia en la cirugfa de colon.

Un inhibidor de plasmina que es aproximadamente tan potente como el BPTI o mas potente, pero que es casi identico a un dominio de protefna humana, ofrece un potencial terapeutico similar, pero tiene menor potencial antigenico.

Angiogenesis:

La plasmina es la enzima clave en la angiogenesis. En OREI94 se describe que un fragmento de 38 kDa de la plasmina (que carece del dominio catalftico) es un potente inhibidor de la metastasis, indicando que la inhibici6n de la plasmina podrfa ser util para bloquear la metastasis de tumores (FIDL94). Vease tambien ELLI92.

Plasmina

La plasmina es una serina proteasa derivada del plasmin6geno. El dominio catalftico de la plasmina (o "CatDom") corta enlaces peptfdicos, en particular despues de restos de arginina y en menor medida despues de lisinas, y es altamente hom6logo a la tripsina, quimiotripsina, calicrefna, y muchas otras serina proteasas. La mayor parte de la especificidad de la plasmina deriva de la uni6n de la fibrina a los kringles (LUCA83, VARA83, VARA84). Cuando se activa, se corta el enlace entre Arg561-Val562, permitiendo que los extremos amino libres recien formados formen un puente salino. Sin embargo, los kringles permanecen unidos al CatDom por dos disulfuros (COLM8?, ROBB8?).

Se ha descrito que el BPTI inhibe la plasmina con una KD de aproximadamente 300 pM (SCHN86). En AUER88 se describe que el BPTI (R15) tiene una Ki para la plasmina de aproximadamente 13 nM, sugiriendo que R15 es sustancialmente peor que K15 para la uni6n a la plasmina. En SCHN86 se describe que el BPTI en el que los restos C14 y C38 se han convertido en alanina, tiene una Ki para la plasmina de 4,5 nM. En KIDO88 se describe que el APP-I tiene una Ki para la plasmina de aproximadamente ?5 pM (?,5 x 10-11 M), el inhibidor mas potente de la plasmina humana descrito hasta ahora. Sin embargo, en DENN94a se describe que el APP-I inhibe la plasmina con una Ki =

225 nM (2,25 x 10-? M). La segunda y tercera bibliotecas de los autores de la presente invenci6n se disenaron suponiendo que el APP-I es un potente agente de uni6n a la plasmina. El procedimiento de selecci6n no selecciona los restos del APP-I en la mayorfa de las localizaciones, y en la descripci6n de DENN94a se explica por que se produce esto.

Con tecnicas de ADN recombinante, se puede obtener una nueva protefna por expresi6n de un gen mutado que codifica un mutante del gen de la protefna nativa. Se conocen varias estrategias para seleccionar mutaciones. En una estrategia, se mantienen constantes algunos restos, otros se mutan de forma aleatoria, y otros mas se mutan de una forma predeterminada. Esto se llama "variegaci6n" y lo definen Ladner et al. en el documento USP 5.223.409, que se incorpora por referencia.

En DENN94a y DENN94b se describen selecciones de dominios de Kunitz basadas en el APP-I para la uni6n al complejo del factor tisular con el factor VII. No usaron LACI-K1 como origen y no usaron plasmina como objetivo. El agente de uni6n de mayor afinidad que obtuvieron tenfa una KD para su objetivo de aproximadamente 2 nM. Los seleccionados en el primer ciclo por los autores de la invenci6n tienen una afinidad de este orden, pero los seleccionados en el segundo ciclo son aproximadamente 25 veces mejores que estos.

Se supone que es menos probable que las protefnas cogidas de una especie particular produzcan una respuesta inmunitaria cuando se inyectan a individuos de esa especie. Los anticuerpos murinos son altamente antfgenos en seres humanos. Los anticuerpos "quimericos" que tienen dominios constantes humanos y dominios variables murinos son indudablemente menos antfgenos. Los anticuerpos llamados "humanizados" tienen dominios constantes humanos y dominios variables en los que las CDR se cogen de anticuerpos murinos mientras que la regi6n armaz6n de los dominios variables son de origen humano. Los anticuerpos "humanizados" son mucho menos antfgenos que los anticuerpos "quimericos". En un anticuerpo "humanizado", de 50 a 60 restos de la protefna no son de origen humano. Las protefnas de esta invenci6n comprenden, en la mayorfa de los casos, s6lo aproximadamente 60 aminoacidos, y normalmente hay diez diferencias o menos entre la protefna disenada y la protefna parental. Aunque los seres humanos desarrollan anticuerpos incluso contra protefnas humanas, tales como la insulina humana, dichos anticuerpos tienden a unirse debilmente y con frecuencia no impiden que la protefna inyectada presente su funci6n biol6gica pretendida. El uso de una protefna de la especie que se va a tratar no garantiza que no haya respuesta inmunitaria. Sin embargo, la selecci6n de una protefna con una secuencia muy pr6xima a una protefna humana reduce mucho el riesgo de una respuesta inmunitaria fuerte en seres humanos.

Los dominios Kunitz son muy estables y se pueden producir eficazmente en levaduras u otros organismos hospedantes. Se han descrito al menos diez dominios Kunitz humanos. Aunque en cierto momento se pens6 que el APP-I era un potente inhibidor de plasmina, realmente no hay dominios Kunitz humanos que inhiban la plasmina tan bien como lo hace el BPTI. Por lo tanto, un objetivo de la presente invenci6n es proporcionar secuencias del dominio Kunitz que sean tanto potentes inhibidores de plasmina como que tengan una secuencia pr6xima a los dominios Kunitz humanos.

Se conoce en la tecnica el uso de la mutagenesis de sitio especffico, sea aleatoria o no aleatoria, para obtener protefnas de uni6n mutantes con mejor actividad, pero el exito no esta asegurado.

SUMARIO DE LA INVENCION

Esta invenci6n describe mutantes de dominios Kunitz hom6logos al BPTI que inhiben potentemente la plasmina humana. En particular, esta invenci6n describe mutantes de un dominio de LACI humano, que es probable que no sean inmun6genos para seres humanos, y que inhiben la plasmina con una KD, preferiblemente, de aproximadamente 5 nM o menos, mas preferiblemente de aproximadamente 300 pM o menos, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 100 pM o menos. La invenci6n tambien describe el uso terapeutico y de diagn6stico de estas nuevas protefnas.

Las protefnas inhibidoras de la plasmina son utiles para prevenir o tratar afecciones clfnicas producidas o exacerbadas por la plasmina, incluyendo la fibrin6lisis o fibrinogenolisis inadecuadas, hemorragia excesiva asociada con trombolfticos, hemorragia postoperatoria y androgenesis inadecuada. Los mutantes que se unen a la plasmina, sean o no inhibidores, son utiles para el ensayo de la plasmina en muestras, in vitro, para la generaci6n de imagenes de zonas de actividad de la plasmina, in vivo, y para la purificaci6n de la plasmina.

Se seleccionaron los mutantes preferidos QS4 y NS4 de una biblioteca que tenfa aproximadamente 50 millones de protefnas que tenfan variabilidad en las posiciones 13, 16, 1?, 18, 19, 31, 32, 34 y 39. Estas protefnas tienen una secuencia de aminoacidos practicamente identica a una protefna humana, pero inhiben la plasmina con una Ki de aproximadamente 2 nM (es decir, aproximadamente 6 veces menos potente que el BPTI, pero 100 veces mejor que la APP-I).

Se seleccion6 una protefna especialmente preferida, SPI11, de una biblioteca que permite variabilidad en las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 1?, 18, 19 y 21, y tiene una afinidad por la plasmina que es menor que 100 pM (es

decir, aproximadamente 3 veces superior al BPTI en la uni6n), y ademas tiene una secuencia mucho mas parecida al LACI, una protefna humana, que al BPTI, una protefna bovina. Otros mutantes de LACI-K1 seleccionados de esta biblioteca y que se piensa que tienen una afinidad muy alta por la plasmina, incluyen SPI15, SPI08 y SPI23. Se ha cribado una biblioteca adicional que permite variaci6n en las posiciones 10, 11, 13 15, 16, 1?, 18, 19, 21, 31, 32, 34, 5 35 y 39, y se ha encontrado una secuencia de consenso (SPIcon1). Las variantes que se ha mostrado que son mejores que QS4, y por lo tanto mas preferidas, incluyen SPI15 y SPI4?. Se han identificado secuencias que es probable que tengan una afinidad muy alta por la plasmina y retengan todavfa una secuencia de aminoacidos esencialmente humana, e incluyen las secuencias de SPI60, SPI59, SPI42, SPI55, SPI56, SPI52, SPI46, SPI49, SPI53, SPI41 y SPI5?. La informaci6n de la secuencia de aminoacidos que confiere una alta afinidad por el sitio

10 activo de la plasmina se puede transferir a otros dominios Kunitz, particularmente a dominios Kunitz de origen humano; se describen disenos de varias de dichas protefnas.

Los inhibidores de plasmina preferidos descritos en la esta memoria cumplen uno o mas de las siguientes desiderata:

1) la Ki para la plasmina es como maximo 20 nM, preferiblemente no mayor de aproximadamente 5 nM,

15 mas preferiblemente no mayor de aproximadamente 300 pM, y lo mas preferiblemente, no mayor de aproximadamente 100 pM,

2) el inhibidor comprende un dominio Kunitz que satisface los requisitos mostrados en la Tabla 14 con el numero de los restos con referencia al BPTI,

3) en las posiciones del dominio Kunitz 12-21 y 32-39, uno de los tipos de aminoacidos listados para esa 20 posici6n en la Tabla 15, y

4) el inhibidor tiene una secuencia de aminoacidos mas parecida a una secuencia de referencia seleccionada del grupo de SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, NS4, LACI-K2 humano, LACI-K3 humano, KuDom de a3 de colageno humano, dominio 1 de TFPI-2 humano, dominio 2 de TFPI-2 humano, dominio 3 de TFPI-2 humano, ITI-K1 humano, ITI-K2 humano, proteasa nexina-II

25 humana, APP-I humano, DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.2.1, DPI-1.3.1, DPI-2.1, DPI-3.1.1, DPI3.2.1, DPI-3.3.1, DP1-4.1.1, DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4, DPI-4.2.5, DPI-5.1, DPI-5.2, DPI- 6.1, DPI-6.2, que la secuencia de aminoacidos de dicho dominio Kunitz respecto a la secuencia del BPTI.

NOMENCLATURA

30 En esta memoria, las afinidades se exponen como KD (KD(A,B) = [A][B]/[A-B]). Una KD numericamente mas pequena refleja una afinidad mayor. Para los prop6sitos de esta invenci6n, una "protefna inhibidora de plasmina" es una que se une e inhibe la plasmina con una Ki de aproximadamente 20 mM o menos. "Inhibici6n" se refiere a bloquear la actividad catalftica de la plasmina, y por lo tanto se puede medir en ensayos in vitro usando sustratos crom6genos o fluor6genos, o en ensayos que implican macromoleculas.

35 Se habla de los restos de aminoacidos de tres formas: nombre completo del aminoacido, c6digo de referencia de tres letras, y c6digo de referencia de una letra. Las tablas usan s6lo el c6digo de una letra. El texto usa los nombres completos y el c6digo de tres letras cuando se requiera claridad.

A = Ala G=Gly M=Met S=Ser C=Cys H = His N = Asn T = Thr D = Asp I=Ile P=Pro V=Val E = Glu K=Lys Q=Gln W = Trp F = Phe L = Leu R=Arg y=Tyr

Para el prop6sito de esta invenci6n, secuencias "sustancialmente homologas" son al menos 51%, mas

40 preferiblemente al menos 80% identicas, en cualesquiera regiones especificadas. En esta memoria, las secuencias que son identicas se entiende que son "sustancialmente hom6logas". Las secuencias todavfa serfan "sustancialmente hom6logas" si dentro de una regi6n de al menos 20 aminoacidos, son suficientemente similares (51% o mas) pero fuera de la regi6n de comparaci6n son totalmente diferentes. Una inserci6n de un aminoacido en una secuencia respecto a la otra cuenta como un malapareamiento. Mas preferiblemente, no hay mas de seis

45 restos, a parte de los extremos, que sean diferentes. Preferiblemente, la divergencia de secuencia, en particular en las regiones especificadas, es en forma de "modificaciones conservativas".

Las "modificaciones conservativas" se definen como

(a) sustituciones conservativas de aminoacidos como se definen en la Tabla 9; y

(b) inserciones puntuales o multiples o eliminaciones de aminoacidos en los extremos, en los lfmites de dominios, en bucles, o en otros segmentos de movilidad relativamente alta.

Preferiblemente, excepto en los extremos, no se insertan o eliminan mas de aproximadamente seis aminoacidos en ningun locus, y las modificaciones estan fuera de las regiones que se sabe que contienen sitios de uni6n importantes.

Dominios Kunitz

En esta memoria, "dominio Kunitz" y "KuDom" se usan de forma intercambiable para significar un hom6logo del BPTI (no del inhibidor de la tripsina de soja Kunitz). Un KuDom es un dominio de una protefna que tiene al menos 51 aminoacidos (y hasta aproximadamente 61 aminoacidos) que contienen al menos dos, y preferiblemente tres disulfuros. En esta memoria, los restos de todos los dominios Kunitz se numeran con referencia al BPTI (es decir, restos 1-58). Por lo tanto, el primer resto de cistefna es el resto 5 y la ultima cistefna es la 55. Una secuencia de aminoacidos, para el prop6sito de esta invenci6n, se considerara un dominio Kunitz si se puede alinear, con tres o menos malapareamientos, con la secuencia mostrada en la Tabla 14. Una inserci6n o eliminaci6n de un resto contara como un malapareamiento. En la Tabla 14, "x" empareja con cualquier aminoacido y "X" empareja con los tipos listados para esa posici6n. Los enlaces disulfuro unen al menos dos de: 5 a 55, 14 a 38, y 30 a 51. El numero de disulfuros se puede reducir en uno, pero no se debe dejar desapareada ninguna de las cistefnas patr6n. Por lo tanto, si se cambia una cistefna, entonces se anade una cistefna para compensar en una posici6n adecuada, o la cistefna de emparejamiento se sustituye tambien por un resto no cistefna (prefiriendose en general esto ultimo). Por ejemplo, el inhibidor de proteasa de la glandula accesoria de la Drosophila funebris macho no tiene cistefna en la posici6n 5, pero tiene una cistefna en la posici6n -1 (justo antes de la posici6n 1); se supone que esta forma un disulfuro con la Cys55. Si se sustituyen la Cys14 y Cys38, disminuyen los requisitos de Gly12, (Gly o Ser)3? y Gly36. Se pueden unir a cualquiera de los extremos de un dominio Kunitz desde cero hasta muchos restos, incluyendo dominios adicionales (incluyendo otros KuDoms).

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Los inhibidores de proteasas, tales como los dominios Kunitz, funcionan mediante la uni6n al sitio activo de la proteasa de forma que un enlace peptfdico (el "enlace escindible"): 1) no se escinde, 2) se escinde muy despacio, o 3) se escinde sin efecto porque la estructura del inhibidor impide la liberaci6n o separaci6n de los segmentos escindidos. En los dominios Kunitz, los enlaces disulfuro actuan para mantener la protefna junta, incluso si los enlaces peptfdicos expuestos son escindidos. Desde el resto en el lado amino del enlace escindible, y moviendose alejandose del enlace, los restos se denominan convencionalmente P1, P2, P3, etc. Los restos que siguen al enlace escindible se denominan P1', P2', P3', etc. (SCHE6?, SCHE68). En general, se acepta que cada serina-proteasa tiene sitios (que comprenden varios restos) S1, S2, etc., que reciben los grupos laterales y los atomos de la cadena principal de los restos P1, P2, etc. del sustrato o inhibidor, y sitios S1', S2', etc., que reciben los grupos laterales y los atomos de la cadena principal de P1', P2', etc. del sustrato o inhibidor. Son las interacciones entre los sitios S y los grupos laterales P y atomos de la cadena principal, las que dan la especificidad de la proteasa con respecto a los sustratos y la especificidad de los inhibidores respecto a las proteasas. Debido a que el fragmento que tiene el nuevo extremo amino sale de la proteasa primero, muchos investigadores que disenan moleculas pequenas inhibidoras de proteasas se han concentrado en compuestos que se unen a los sitios S1, S2, S3, etc.

En LASK80 se revisan los inhibidores de proteasas protefnicos. Algunos inhibidores tienen varios sitios reactivos en una cadena de polipeptido, y estos dominios normalmente tienen secuencias, especificidades e incluso topologfas diferentes. Se sabe que la sustituci6n de aminoacidos en la regi6n P a P5' influye en la especificidad de un inhibidor. Previamente, se ha centrado la atenci6n en el resto P1 y en los que estan muy cerca de este, porque estos pueden cambiar la especificidad de una clase de enzima a otra. En LASK80 se sugiere que entre los KuDoms, los inhibidores con P1 = Lys o Arg inhiben la tripsina, los que tienen P1 = Tyr, Phe, Trp, Leu y Met inhiben la quimotripsina, y los que tienen P1 = Ala o Ser es probable que inhiban la elastasa. Se continua diciendo en LASK80, que entre los inhibidores de Kazal, los inhibidores con P1 = Leu o Met son inhibidores fuertes de la elastasa, y en la familia de Bowman-Kirk la elastasa es inhibida con P1 = Ala, pero no con P1 = Leu. Dichos cambios limitados no proporcionan inhibidores con afinidad realmente alta (es decir, mejor que 1 a 10 nM).

Los dominios Kunitz se han definido antes. Se conoce la estructura 3D (con alta resoluci6n) del BPTI (el dominio Kutzal prototfpico). Una de las estructuras de rayos X esta depositada en el Brookhaven Protein Data Bank como "6PTI". Se conocen las estructuras 3D de algunos hom6logos del BPTI (EIGE90, HyNE90). Se conocen al menos setenta secuencias KuDom. Entre los hom6logos humanos conocidos se incluyen tres KuDoms de LACI (WUNT88, GIRA89, NOVO89), dos KuDoms del inhibidor inter-α-tripsina, APPI-I (KIDO88), un KuDom de colageno, y tres KuDoms de TFPI-2 (SPRE94).

LACI

El inhibidor de coagulaci6n asociado a lipoprotefnas (LACI) es una fosfoglicoprotefna del suero humano con un peso

molecular de 39 kDa (secuencia de aminoacidos en la Tabla 1) que contiene tres KuDoms. En lo sucesivo se denomina a la protefna LACI y a sus dominios Kunitz LACI-K1 (restos 50 a 10?), LACI-K2 (restos 121 a 1?8), y LACI-K3 (213 a 2?0). La secuencia de ADNc de LACI se describe en WUNT88. En GIRA89 se describen estudios de mutaciones en los que se alteraban los restos P1 de cada uno de los tres KuDoms. LACI-K1 inhibe el Factor VIIa (F.VII), cuando F.VII forma complejo con el factor tisular y LACI-K2 inhibe el Factor Xa. No se sabe si LACI-K3 inhibe algo. Ni LACI ni ninguno de los KuDoms de LACI es un inhibidor potente de plasmina.

Los KuDoms de esta invenci6n son sustancialmente hom6logos a LACI-K1, pero difieren de forma que confieren la fuerte actividad inhibidora de plasmina antes discutida. Otros KuDoms de esta invenci6n son hom6logos a otros KuDoms naturales, particularmente a otros KuDoms humanos. Para usar en seres humanos, las protefnas de esta invenci6n se disenan para que tengan una secuencia mas parecida a un KuDom humano que al BPTI, para reducir el riesgo de producir una respuesta inmunitaria.

Primera biblioteca de LACI-K1 y seleccionados para la union a plasmina

Los autores de la invenci6n han cribado en una primera biblioteca de LACI-K1 los mutantes que tienen alta afinidad por la plasmina humana, y han obtenido las secuencias mostradas en la Tabla 2 y Tabla 3. Estas secuencias se pueden resumir como se muestra en la Tabla 16, en la que los "restos preferidos" son los que aparecen en al menos una de las 32 variantes que se ha identificado que se unen a la plasmina. Las preferencias en los restos 13, 16, 1?, 18 y 19 son fuertes, como se muestra en la Tabla 1?. Aunque la variedad de tipos permitidos en 31 y 32 esta limitada, la selecci6n indica que se prefiere un grupo acido en 31 y un grupo neutro en 32. En el resto 1? se prefiere Arg; la Lys, otro aminoacido positivamente cargado, no estaba en la biblioteca, y puede ser un sustituto adecuado para la Arg. Muchos tipos de aminoacidos en las posiciones 34 y 39 estan de acuerdo con la uni6n de alta afinidad a la plasmina, pero algunos tipos pueden dificultar la uni6n.

Se entendera que los autores de la invenci6n no han secuenciado todos los aislados positivos de estas o de otras bibliotecas descritas en esta memoria, y que algunas de las protefnas posibles pueden haber estado presentes en cantidades no detectables.

Los autores de la invenci6n han preparado una de las protefnas seleccionadas, QS4, mostrada en la tabla 2. QS4 inhibe la plasmina con una Ki de aproximadamente 2 nM. Aunque este nivel de inhibici6n es menor que el de BPTI, QS4 es una molecula preferida para usar en seres humanos porque tiene menos potencial de inmunogenicidad. Otras protefnas mostradas en la tabla 2 y tabla 32 es muy probable que sean inhibidores potentes de la plasmina y es probable que tengan poca antigenicidad.

Segunda biblioteca que varia los restos 10-21

Los autores de la invenci6n han preparado una segunda biblioteca de derivados de LACI-K1 mostrados en la Tabla 5, y que permite variaciones en los restos 10, 11, 13, 15, 16,1?, 18, 19, y 21. En esta se crib6 la uni6n a la plasmina, y se obtuvieron las protefnas mostradas en la Tabla 6.

"Consenso" en la Tabla 6 es E10TGPCRARFERW21, en el que los siete restos subrayados difieren de LACI-K1. En la posici6n 10 s6lo se vieron aminoacidos acidos (Glu:1? o Asp:15); Lys y Asn no son aceptables. Puesto que Glu y Asp aparecen casi con la misma frecuencia, probablemente contribuyen igual a la uni6n. No se vieron restos acidos en la posici6n 11. La Thr era la mas comun (11/32), la Ser aparecfa con frecuencia (9/32); la Gly aparecfa 8 veces. En 13, la Pro era muy preferida (24/32) siendo segunda la Ala con 5/32. En 15, la Arg era muy preferida (25/32), pero algunos aislados (?/32) tenfan Lys. Hay que indicar que BPTI(R15) es un inhibidor de plasmina peor que BPTI. En 16, la Ala era preferida (22/32), pero la Gly aparecfa con bastante frecuencia (10/32). En 1?, la Arg era la mas comun (15/32), siendo Lys la segunda (9/32). En los restos 1? y 18, APP-I tenfa Met e Ile. En 18, se permitfa Ile o Phe. S6lo cuatro aislados tienen Ile en 18, y ninguno de estos tiene Met en 1?. Esto era sorprendente de acuerdo con KIDO88, pero bastante comprensible de acuerdo con DENN94a. Esta colecci6n de aislados tiene una amplia distribuci6n en 19: (Glu:8, Pro:?, Asp:4. Ala:3, His:3, Gly:2, Gln:2, Asn:1, Ser:1 y Arg:1), pero se prefieren mucho mas los grupos laterales acidos frente a los basicos. En 21, la distribuci6n era (Trp:16, Phe:14, Leu:2, Cys:0); BPTI tiene Tyr en 21.

Se compar6 la uni6n del fago cl6nicamente puro que presenta una u otra de estas protefnas, con la uni6n del fago de BPTI (Tabla 6). Los autores de la invenci6n han determinado la Ki de la protefna SPI11, y han encontrado que es aproximadamente 88 pM, que es sustancialmente superior a la de BPTI.

Tercera biblioteca que varia 10-21 y 31-39

Los autores de la invenci6n usaron una mezcla de fagos de la segunda biblioteca (variaciones en los restos 10, 11, 13, 15, 16, 1?, 18, 19 y 21) que se habfan seleccionado dos veces por la uni6n a plasmina, como fuente de ADN en la que se habfa introducido variegaci6n en los restos 31, 32, 34, 35 y 39, como se muestra en la Tabla ?.

En esta biblioteca se crib6 la uni6n a plasmina en tres ciclos, y se obtuvieron los aislados mostrados en la Tabla 8. La distribuci6n de tipos de aminoacidos se muestra en la Tabla 18 donde "x" significa que el tipo de aminoacido no estaba permitido, y "*" indica el tipo natural de LACI-K1.

Estas secuencias dieron un consenso en la regi6n 10-21 y 31-40 de E10TGPCRAKFDRW21...E31AFVyGGCGG40 (SPIcon1 en la Tabla 4). Los diez aminoacidos subrayados difieren de LACI-K1. En ocho posiciones variadas, era bastante comun un segundo tipo: Asp en 10, Ala en 11, Glu en 19, Phe en 21, Thr en 31, Pro o Ser en 32, Leu o Ile en 34, y Glu en 39. En la posici6n 1?, el inhibidor SPI11 muy potente tiene R. Por lo tanto, la secuencia D10TGPCRARFDRF21...E31AFIyGGCEG40 (DPI-1.1.1 en la Tabla 4) difiere de LACI-K1 s6lo en seis restos, se empareja con las secuencias seleccionadas en los restos que tienen fuerte consenso, y tiene sustituciones preferidas en las posiciones 10, 1?, 21, 34 y 39. Se espera que DPI-1.1.1 tenga una afinidad muy alta por la plasmina y poco potencial de inmunogenicidad en seres humanos.

Los ensayos previos de la actividad inhibidora de la plasmina de las protefnas SPI11, BPTI, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, SPI22, SPI54 y SPI43, las colocaron en el orden mostrado. SPI11 es significativamente mas potente que BPTI con una Ki de aproximadamente 88 pM. SPI23 y SPI51 son muy similares en actividad y solo un poco menos potentes que BPTI. SPI4? es menos potente que SPI51 pero mejor que QS4. SPI22 es mas debil que QS4. SPI54 y SPI43 no son tan potentes como QS4, con Ki probablemente > 4 nM.

Un KuDom que es muy hom6logo en los restos 5-55 respecto a cualquiera de las secuencias de SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4 y NS4 como se muestra en la Tabla 4, es probable que sea un inhibidor potente (KD > 5 mM) de la plasmina y tenga un bajo potencial de antigenicidad en seres humanos. Mas preferiblemente, para tener una alta afinidad por la plasmina, un KuDom tendrfa una secuencia que serfa identica en los restos 10-21 y 3139 y tendrfa cinco o menos diferencias en los restos 5-9, 22-30 y 40-55, cuando se compara con cualquiera de las secuencias SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, y NS4.

Usando las secuencias seleccionadas y los datos de uni6n de los KuDoms seleccionados y naturales, se puede escribir una receta para un KuDom inhibidor de plasmina de alta afinidad, que se puede aplicar a otros KuDom humanos parentales. Primero, el KuDom debe cumplir los requisitos de la Tabla 14. Es probable que las sustituciones mostradas en la Tabla 15 confieran actividad inhibidora de plasmina de alta afinidad en cualquier KuDom. Asf, una protefna que contenga una secuencia que es un KuDom, como se muestra en la Tabla 14, y que contenga en cada una de las posiciones 12-21 y 32-39 un tipo de aminoacido mostrado en la Tabla 15 para esa posici6n, es probable que sea un potente inhibidor de la plasmina humana. Mas preferiblemente, la protefna tendrfa un tipo de aminoacido mostrado en la Tabla 15 para todas las posiciones listadas en la Tabla 15. Para reducir la potencial respuesta inmunitaria, se debe usar uno u otro KuDom humano como protefna parental para dar la secuencia fuera de la regi6n de uni6n.

Es probable que una protefna que comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente hom6loga a SPI11 desde el resto 5 al resto 55 (como se muestra en la Tabla 4) y que es identica a SPI11 en las posiciones 1319, 31, 32, 34 y 39, inhiba la plasmina humana con una Ki de 5 nM o menor. SPI11 difiere de LACI-K1 en ? posiciones. No esta claro que estas sustituciones sean igualmente importantes para fomentar la uni6n a la plasmina y la inhibici6n. Hay siete moleculas en las que una de las posiciones sustituidas de SPI11 se cambia al resto encontrado en LACI-K1 (es decir, "se invierte"), 21 en las que se invierten dos de los restos, 35 en las que se invierten tres restos, 35 en las que se invierten cuatro, 21 en las que se invierten cinco, y ? en las que se invierten seis. Se espera que las que tienen mas restos invertidos tengan menos afinidad por la plasmina, pero tambien menor potencial de inmunogenicidad. Un experto en la tecnica puede seleccionar una protefna de suficiente potencia y baja inmunogenicidad de esta colecci6n de 126. Tambien es posible que las sustituciones en SPI11 por aminoacidos que difieren de LACI-K1, puedan reducir la inmunogenicidad sin reducir la afinidad por la plasmina en un grado que haga a la protefna inadecuada para usarla como un farmaco.

INHIBIDORES DE PLASMINA DISENADOS KuDom

En lo sucesivo, "DPI" significara un "Inhibidor de plasmina disenado" (por sus siglas en ingles Designed [lasmin Inhibitor"), que son KuDoms que incorporan informaci6n de secuencias de aminoacidos de la serie de moleculas SPI, especialmente SPI11. En la Tabla 4 se dan secuencias de varios DPI y sus protefnas parentales.

Las secuencias DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.1.4, DPI-1.1.5 y DPI-1.1.6 (en la Tabla 4) difieren de LACI-K1 en los aminoacidos 6, 5, 5, 4, 3 y 2 respectivamente, y representan una serie en la que la afinidad por la plasmina puede disminuir lentamente mientras que la similitud con una secuencia humana aumenta, para reducir asf la probabilidad de inmunogenicidad. Las selecciones de cada una de las bibliotecas muestran que M18F es una sustituci6n clave, y que I1?K o I1?R son muy importantes. Las selecciones de la segunda y tercera biblioteca indican que la Arg es muy preferida en 15, y que un grupo lateral acido en 11 es desventajoso para la uni6n. El inhibidor SPI11 muy potente difiere del consenso en que tiene R1? como BPTI. DPI-1.1.1 lleva las mutaciones D11T, K15R, I1?R, M18F, K19D y E32A, y es probable que sea tan potente como un inhibidor de plasmina. DPI-1.1.2 lleva D11A, K15R, I1?R, M18F y K19D, y es probable que sea muy potente. DPI-1.1.3 lleva las mutaciones D11A, K15R, I1?R,

M18F y K19D respecto a LACI-K1. DPI-1.1.3 difiere de DPI-1.1.2 en que tiene A11 en lugar de T11; es probable que ambas protefnas sean inhibidores de la plasmina muy potentes. DPI-1.1.4 lleva las mutaciones I1?R, M18F, K19D y E32A y deberfa ser bastante potente. Puesto que DPI-1.1.4 tiene menos mutaciones que SPI11, puede ser menos potente, pero tambien es menos probable que sea inmun6geno. DPI-1.1.5 lleva las mutaciones I1?R, M18F y K19D. Es probable que esta protefna sea un buen inhibidor y es menos probable que sea inmun6gena. DPI-1.1.6 lleva s6lo las mutaciones I1?R y M18F pero deberfa inhibir la plasmina.

La protefna DPI-1.2.1 se basa en LACI-K2 humano y se muestra en la Tabla 4. Es probable que las mutaciones P11T, I13P, y1?R, I18F, T19D, R32E, K34I, y L39E confieran una alta afinidad por la plasmina. Algunas de estas sustituciones pueden no ser necesarias, en particular P11T y T19D pueden no ser necesarias. Otras mutaciones que pueden mejorar la afinidad por la plasmina incluyen E9A, D10E, G16A, y21W, y21F, R32T, K34V y L39G.

La protefna DPI-1.3.1 (Tabla 4) se basa en LACI-K3 humano. Se pretende que las mutaciones R11T, L13P, N1?R, E18F, N19D, R31E, P32E, K34I y S36G confieran una alta afinidad por la plasmina. Algunas de esas sustituciones pueden no ser necesarias, en particular N19D y P32E pueden no ser necesarias. Otros cambios que pueden mejorar KD incluyen D10E, N1?K, F21W y G39E.

La protefna DPI-2.1 (Tabla 4) se basa en el KuDom α3 de colageno humano. Es probable que las mutaciones E11T, T13P, D16A, F1?R, I18F, L19D, A31E, R32E y W34I confieran una alta afinidad por la plasmina. Algunas de estas sustituciones pueden no ser necesarias; en particular, L19D y A31E pueden no ser necesarias. Otras mutaciones que pueden mejorar la afinidad por la plasmina incluyen K9A, D10E, D16G, K20R, R32T, W34V y G39E.

DPI-3.1.1 (Tabla 4) deriva del dominio 1 de TFPI-2 humano. Es probable que los intercambios y11T, L1?R, L18F, L19D y R31E confieran una alta afinidad por la plasmina. La mutaci6n L19D puede no ser necesaria. Otras mutaciones que pueden favorecer la uni6n a la plasmina incluyen y21W, y21F, Q32E, L34I, L34V y E39G.

DPI-3.2.1 (Tabla 4) deriva del dominio 2 de TFPI-2 humano. Este dominio parental contiene inserciones despues del resto 9 (un resto) y 42 (dos restos). Es probable que las mutaciones (V9SVDDQC14 sustituido por V9ETGPC14), E15R, S1?K, T18F, K32T, F34V y (H39RNRIENR44 sustituido por E39GNRNR44) confieran afinidad por la plasmina. Debido a la necesidad de cambiar el numero de aminoacidos, DPI-3.2.1 tiene un potencial de inmunogenicidad mayor que otros KuDoms humanos modificados.

DPI-3.3.1 (Tabla 4) deriva del dominio 3 de TFPI-2 humano. Es probable que las sustituciones E11T, L13P, S15R, N1?R, V18F, T34I y T36G confieran una alta afinidad por la plasmina. Las mutaciones E11T, L13P y T34I pueden no ser necesarias. Otras mutaciones que pueden favorecer la uni6n a la plasmina incluyen D10E, T19D, y21W y G39E.

DPI-4.1.1 (Tabla 4) procede de ITI-K1 humano, por aserci6n de S10E, M15R, M1?K, T18F, Q34V y M39G. Las mutaciones M39G y Q34V pueden no ser necesarias. Otras mutaciones que deberfan favorecer la uni6n a la plasmina incluyen: A11T, G16A, M1?R, S19D, y21W e y21F.

DPI-4.2.1 (Tabla 4) procede de ITI-K2 humano por las mutaciones V10D, R11T, F1?R, I18F y P34V. La mutaci6n P34V puede no ser necesaria. Otras mutaciones que pueden favorecer la uni6n a la plasmina incluyen: V10E, Q19D, L20P, W21F, P34I y Q39E. DPI-4.2.2 es una protefna especialmente preferida puesto que s6lo tiene tres mutaciones: R11T, F1?R e I18F. DPI-4.2.3 es una protefna especialmente preferida puesto que s6lo tiene cuatro mutaciones: R11T, F1?R, I18F y L20R. DPI-4.2.4 es una protefna especialmente preferida puesto que s6lo tiene cinco mutaciones: R11T, F1?R, I18F, L20R y P34V. DPI-4.2.5 lleva las mutaciones V10E, R11T, F1?R, I18F, L20R, V31E, L32T, P34V y Q39G, y es muy probable que inhiba la plasmina de forma muy potente. Es muy probable que cada una de las protefnas DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4 y DPI-4.2.5 sea un inhibidor muy potente de la plasmina.

Antes del documento DENN94a, se pensaba que APP-I era un inhibidor de la plasmina muy potente. Por lo tanto, era sorprendente seleccionar protefnas de una biblioteca que se disen6 para permitir que los restos de APP-I en las posiciones 10-21 difirieran mucho de APP-I. Sin embargo, APP-I se puede convertir en un potente inhibidor de plasmina. DPI-5.1 se obtiene de APPI-I humano (tambien conocido como proteasa nexina-II) por las mutaciones M1?R e I18F, y es probable que sea un inhibidor de plasmina mucho mejor que el propio APP-I. DPI-5.2 lleva las mutaciones adicionales S19D, A31E y F34I, que pueden favorecer la mayor afinidad por la plasmina.

DPI-6.1 deriva del KuDom de HKI B9 (NORR93) por las cinco sustituciones: K11T, Q15R, T16A, M1?R y M18F. Es probable que DPI-6.1 sea un potente inhibidor de plasmina. DPI-6.2 lleva las mutaciones adicionales T19D y A34V que deberfan favorecer la uni6n a la plasmina.

Aunque BPTI es el mejor KuDom natural inhibidor de plasmina conocido, se podfa mejorar. DPI-?.1 deriva de BPTI por la mutaci6n I18F que es probable que aumente la afinidad por la plasmina. DPI-?.2 lleva la mutaci6n adicional K15R que deberfa aumentar la uni6n a la plasmina. DPI-?.3 lleva la mutaci6n anadida R39G. DPI-?.4 lleva las mutaciones y10D, K15R, I18F, I19D, Q31E y R39G, y deberfa tener una afinidad muy alta por la plasmina.

MODIFICACION DE DOMINIOS KUNITZ

Los KuDoms son bastante pequenos; si esto produjera un problema farmacol6gico, tal como la eliminaci6n excesivamente rapida de la circulaci6n, se pueden unir dos o mas de dichos dominios. Un conector preferido es una secuencia de uno o mas aminoacidos. Un conector preferido es uno encontrado entre los dominios repetidos de una protefna humana, en especial los conectores encontrados en hom6logos de BPTI humanos, uno de los cuales tiene dos dominios (BALD85, ALBR83b) y otro de los cuales tiene tres (WUNT88). Los conectores peptfdicos tiene la ventaja de que despues se puede expresar la protefna entera por tecnicas de ADN recombinante. Tambien se puede usar un conector que no sea peptidilo, tal como uno de los usados normalmente para formar los conjugados inmun6genos. Un medio alternativo para aumentar la permanencia en el suero de un KuDom de tipo BPTI, es unirlo al polietilenglicol, llamado PEGilaci6n (DAV1?9).

FORMAS DE MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DE SPI11 Y OTROS INHIBIDORES DE PLASMINA KuDom

Debido a que una gran parte de la superficie del KuDom de SPI11 se ha hecho complementaria a la superficie de la plasmina, R15 no es esencial para la uni6n especffica a la plasmina. Muchas de las enzimas de las rutas de coagulaci6n y fibrinolftica cortan preferiblemente despues de Arg o Lys. No tener un resto basico en la posici6n P1 puede dar una mayor especificidad. La variante SPI11-R15A (mostrada en la Tabla 11) que tiene una Ala en P1, es probable que sea un buen inhibidor de plasmina y puede tener mayor especificidad por la plasmina respecto a otras proteasas, que SPI11. Es probable que la afinidad de SPI11-R15A por la plasmina sea menor que la afinidad de SPI11 por la plasmina, pero es probable que la perdida de afinidad por otras enzimas que prefieren Arg/Lys sea mayor, y en muchas aplicaciones la especificidad es mas importante que la afinidad. Otros mutantes que es probable que tengan buena afinidad y una muy alta especificidad incluyen SPI11-R15G y SPI11-R15N-E32A. Este planteamiento se podrfa aplicar a otros inhibidores de plasmina de alta afinidad.

AUMENTO DE LA AFINIDAD DE SPI11

Es probable que la variaci6n de SPI11 como se muestra en la Tabla 12 y la selecci6n de conectores, produzca un dominio Kunitz que tenga una afinidad por la plasmina mayor que SPI11. Esta cuarta biblioteca permite la variegaci6n del disulfuro 14-38. Se sintetizan los dos segmentos de ADN mostrados y se usan con cebadores en una reacci6n PCR para producir ADNbc que va de NsiI a BstEII. Los cebadores son identicos a los extremos 5' de los trozos sinteticos mostrados y tienen una longitud de 21 el primero y 1? el segundo. Puesto que la variabilidad es muy grande, se procurarfa obtener entre 108 y 109 transformantes (cuanto mas mejor).

MODO DE PRODUCCION

Las protefnas descritas en esta memoira se pueden producir por cualquier tecnica convencional, incluyendo

a) sfntesis no biol6gica por acoplamiento secuencial de los componentes, por ejemplo aminoacidos,

b) producci6n por tecnicas de ADN recombinante en celulas hospedantes adecuadas, y

c) semisfntesis, por ejemplo, por eliminaci6n de secuencias no deseadas de LACI-K1 y acoplamiento de secuencias de sustituci6n sinteticas.

Las protefnas descritas en esta memoria preferiblemente se producen de forma recombinante, en un hospedante adecuado, tal como bacterias de los generos Bacillus, Escherichia, Salmonella, Erwinia, y levaduras de los generos Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces y Schizosaccharomyces, o celulas de mamffero cultivadas tales como COS-1. Los hospedantes mas preferidos son microorganismos de las especies [ichia pastoris, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Yarrowia lipolytica. Se puede usar cualquier promotor que sea funcional en la celula hospedante para controlar la expresi6n del gen.

Preferiblemente, las protefnas son secretadas, y mas preferiblemente, se obtienen de medio condicionado. La secreci6n es la vfa preferida porque es mas probable que las protefnas se plieguen correctamente y se pueden producir en medio condicionado con pocos contaminantes. No se requiere secreci6n.

Salvo que haya una raz6n especffica para incluir grupos glico, se prefieren protefnas disenadas para que carezcan de sitios de glicosilaci6n unidos a N, para reducir la posible antigenicidad de los grupos glico, y asf, estas protefnas equivalentes se pueden expresar en una amplia variedad de organismos, incluyendo: 1) E. coli, 2) B. subtilis, 3) [. pastoris, 4) S. cerevisiae, y 5) celulas de mamffero.

Existen varios medios para disminuir el problema de las celulas hospedantes que producen proteasas que degradan el producto recombinante; vease, entre otros BANE90 y BANE91. En VAND92 se describe que la sobreexpresi6n de la peptidasa senal de B. subtilis en E. coli conduce a mayor expresi6n de una protefna de fusi6n heter6loga. ANBA88 describe que la adici6n de PMSF (un inhibidor de serina proteasas) al medio de cultivo mejora el rendimiento de una protefna de fusi6n.

Otros factores que pueden afectar a la producci6n de estas y otras protefnas descritas en esta memoria incluyen: 1) uso de cod6n (se prefiere optimizar codones para el hospedante), 2) secuencia senal, 3) secuencia de aminoacidos en los sitios de procesamiento pretendidos, presencia y localizaci6n de enzimas de procesamiento, eliminaci6n, mutaci6n o inhibici6n de diferentes enzimas que pueden alterar o degradar el producto disenado y mutaciones que hacen al hospedante mas permisivo en la secreci6n (se prefieren hospedantes de secreci6n permisiva).

Los trabajos de referencia sobre principios generales de la tecnologfa de ADN recombinante incluyen Watson el al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (198?); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., New york, N.y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, New york, N.y. (1985); Old, et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ny (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Ny, (198?, 1992).

ENSAYOS DE UNION A LA PLASMINA E INHIBICION

Se puede usar cualquier metodo adecuado para ensayar los compuestos de esta invenci6n. Scatcherd (Ann. NY Acad. Sci. (1949) 51:660-669) describi6 un metodo clasico para medir y analizar la uni6n que es aplicable a la uni6n de protefnas. Este metodo requiere la protefna relativamente pura y la capacidad de distinguir la protefna unida de la no unida.

Un segundo metodo adecuado para medir la KD es medir la actividad inhibidora contra la enzima. Si la KD que se va a medir esta en el intervalo de 1 nM a 1 μM, este metodo requiere sustratos crom6genos o fluor6genos y de decenas de microgramos a miligramos de inhibidor relativamente puro. Para las protefnas de esta invenci6n, que tienen una KD en el intervalo de 5 nM a 50 pM, son suficientes de nanogramos a microgramos de inhibidor. Cuando se usa este metodo, la competici6n entre el inhibidor y el sustrato de la enzima puede dar una Ki medida que es mayor que la verdadera Ki. Las mediciones presentadas aquf no estan corregidas porque la correcci6n serfa muy pequena, y cualquier correcci6n reducirfa la Ki. Aquf, se usa la Ki medida como una medici6n directa de la KD.

Un tercer metodo para determinar la afinidad de una protefna por un segundo material es tener la protefna presentada en un paquete genetico, tal como M13, y medir la capacidad de la protefna para adherirse al "segundo material" inmovilizado. Este metodo es muy sensible porque los paquetes geneticos se pueden amplificar. Se obtienen valores al menos semicuantitativos para las constantes de uni6n mediante el uso de un gradiente por pasos de pH. Se usan inhibidores de afinidad conocida para la proteasa para establecer perfiles patr6n contra cualesquiera otros inhibidores presentados en fagos que se consideren. Se puede usar cualquier otro metodo adecuado para medir la uni6n de protefna.

Preferiblemente, las protefnas de esta invenci6n tienen una KD para la plasmina como maximo de aproximadamente 5 nM, mas preferiblemente como maximo de aproximadamente 300 pM, y mas preferiblemente 100 pM o menos. Preferiblemente, la uni6n es inhibidora, de forma que Ki es la misma que KD. La Ki de QS4 es aproximadamente 2 nM. La Ki de SPI11 para la plasmina es aproximadamente 88 pM.

METODOS Y PREPARACIONES FARMACEUTICAS

El sujeto preferido de esta invenci6n es un mamffero. La invenci6n es particularmente util en el tratamiento de seres humanos, pero tambien es adecuada para aplicaciones veterinarias.

En esta memoria, "protecci6n" incluye "prevenci6n", "supresi6n" y "tratamiento". "Prevenci6n" implica la administraci6n de farmaco antes de la inducci6n de la enfermedad. "Supresi6n" implica la administraci6n de farmaco antes de la aparici6n clfnica de la enfermedad. "Tratamiento" implica la administraci6n de farmaco despues de la aparici6n de la enfermedad.

En medicina humana y veterinaria, es posible que no se pueda distinguir entre "prevenir" y "suprimir", puesto que el(los) suceso(s) inductor(es) pueden no conocerse o estar latentes, o no se determina en el paciente hasta despues de aparecer el(los) suceso(s) inductor(es). Se usa el termino "profilaxis" de forma distinta a "tratamiento" para abarcar "prevenir" y "suprimir". En esta memoria, "protecci6n" incluye "profilaxis". No es necesario que la protecci6n sea absoluta para ser util.

Las protefnas se pueden administrar por cualquier medio, por vfa sistemica o t6pica, para proteger a un sujeto frente a una enfermedad o afecci6n adversa. Por ejemplo, la administraci6n de dicha composici6n puede ser por cualquier vfa parenteral, por inyecci6n de bolo o por perfusi6n gradual. Alternativamente, o simultaneamente, la administraci6n puede ser por la vfa oral. Un regimen adecuado comprende administrar una cantidad eficaz de la protefna, administrada como una sola dosis o como varias dosis en un periodo de horas, dfas, meses o anos.

La dosificaci6n adecuada de una protefna descrita en esta memoria puede depender de la edad, sexo, salud y peso

del receptor, tipo de tratamiento simultaneo, si hay alguno, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Sin embargo, la dosificaci6n mas preferida se puede adaptar para el sujeto individual, como puede entender y determinar un experto en la tecnica, sin excesiva experimentaci6n, ajustando la dosis de formas conocidas en la tecnica.

Para metodos de ensayo preclfnicos y clfnicos de farmacos, incluyendo protefnas, vease por ejemplo, Berkow et al., eds., The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 198?; Goodman el al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.y., (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (198?), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985).

Ademas de una protefna descrita aquf, una composici6n farmaceutica puede contener vehfculos, excipientes o auxiliares farmaceuticamente aceptables. Vease, por ejemplo, Berker, vease antes, Goodman, vease antes, Avery, vease antes y Ebadi, vease antes.

METODOS Y REACTIVOS DE DIAGNOSTICO IN VITRO

Las protefnas se pueden aplicar in vitro a cualquier muestra adecuada que pueda contener plasmina, para medir la plasmina presente. Para hacer esto, el ensayo debe incluir un Sistema Productor de Senal (SPS) que proporciona una senal detectable que depende de la cantidad de plasmina presente. La senal se puede detectar de forma visual o instrumental. Entre las senales posibles se incluyen la producci6n de productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes, alteraci6n de las caracterfsticas de absorci6n o emisi6n de radiaci6n por un componente o producto del ensayo, y precipitaci6n o aglutinaci6n de un componente o producto.

El componente del SPS mas fntimamente asociado con el reactivo de diagn6stico se llama "marcador". Un marcador puede ser, por ejemplo, un radiois6topo, un fluor6foro, una enzima, una coenzima, un sustrato de enzima, un compuesto con densidad electr6nica, o una partfcula aglutinable. Un is6topo radiactivo se puede detectar usando, por ejemplo, un contador γ o un contador de centelleo o por autorradiograffa. Los is6topos que son particularmente utiles son 3H, 125I, 131I, 32S, 14C, y preferiblemente, 125I. Tambien se puede marcar un compuesto con un compuesto fluorescente. Cuando el compuesto con marcador fluorescente se expone a luz de la longitud de onda adecuada, se puede detectar su presencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes mas habitualmente usados estan el isotiocianato de fluorescefna, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehfdo y fluorescamina. Alternativamente, se pueden unir metales emisores de fluorescencia, tales como 125Eu u otro lantanido, a la protefna de uni6n usando grupos quelantes de metales tales como acido dietilentriaminapentaacetico o acido etilendiaminatetraacetico. Las protefnas tambien se pueden marcar de forma detectable por acoplamiento con un compuesto quimioluminiscente, tal como luminol, isolumino, ester de acridinio teromatico, imidazol, sal de acridinio y ester de oxalato. Igualmente se puede usar un compuesto bioluminiscente, tal como luciferina, luciferasa y acuorina para marcar las protefnas de uni6n. La presencia de una protefna bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Se prefieren marcadores enzimaticos tales como peroxidasa de rabano picante y fosfatasa alcalina.

Hay dos tipos basicos de ensayos: heterogeneos y homogeneos. En los ensayos heterogeneos, la uni6n de la molecula de afinidad al analito no afecta al marcador; por lo tanto, para determinar la cantidad de analito, se debe separar el marcador unido del marcador libre. En los ensayos homogeneos, la interacci6n afecta a la actividad del marcador, y se puede medir el analito sin separaci6n.

En general, se puede usar una protefna de uni6n a la plasmina (PBP, por sus siglas en ingles plasmin-binding protein) para diagn6stico de la misma forma que se usa un anticuerpo antiplasmina. Por lo tanto, dependiendo del formato de ensayo, se puede usar para ensayar plasmina, u otras sustancias que se unen a la plasmina por inhibici6n competitiva.

Normalmente, la muestra sera un fluido biol6gico, tal como sangre, orina, linfa, semen, leche o lfquido cefalorraqufdeo, o uno de sus derivados, o un tejido biol6gico, por ejemplo, una secci6n u homogeneizado de tejido. La muestra puede ser cualquiera. Si la muestra es un fluido biol6gico o tejido, se puede coger de un ser humano u otro mamffero, vertebrado o animal, o de una planta. La muestra preferida es sangre, o una de sus fracciones o derivados.

En una realizaci6n, la protefna de uni6n a la plasmina (PBP) se inmoviliza, y se deja que la plasmina en la muestra compita con una cantidad conocida de un analogo de plasmina marcado o que se puede marcar especfficamente. El "analogo de plasmina" es una molecula que puede competir con la plasmina por la uni6n a la PBP, que incluye la propia plasmina. Puede estar ya marcada, o se puede marcar posteriormente por uni6n especffica del marcador a un resto, que diferencie el analogo de plasmina de la plasmina. Se separan las fases y se cuantifica el analogo de plasmina marcado en una fase.

En un "ensayo de tipo sandwich", se usa tanto un agente de uni6n a la plasmina (PBA, por sus siglas en ingles,

plasmin-binding agent) insolubilizado, como un PBA marcado. El analito de plasmina es capturado por el PBA insolubilizado y es marcado por el PBA marcado, formando un complejo terciario. Los reactivos se pueden anadir a la muestra en cualquier orden. Los PBA pueden ser iguales o diferentes, y de acuerdo con esta invenci6n s6lo es necesario que un PBA sea una PBP (el otro puede ser, por ejemplo, un anticuerpo). La cantidad de PBA marcado en el complejo terciario es directamente proporcional a la cantidad de plasmina en la muestra.

Las dos realizaciones descritas antes son ambas ensayos heterogeneos. Un ensayo homogeneo requiere que la uni6n de la PBP a la plasmina afecte s6lo al marcador. El analito de plasmina puede actuar como su propio marcador si se usa un inhibidor de plasmina como un reactivo de diagn6stico.

Un marcador se puede conjugar, directa o indirectamente (por ejemplo, por un anticuerpo anti-PBP marcado), covalente (por ejemplo, con SPDP) o no covalentemente, a la protefna de uni6n a la plasmina, para producir un reactivo de diagn6stico. Igualmente, la protefna de uni6n a la plasmina se puede conjugar con un soporte en fase s6lida para formar un reactivo de diagn6stico en fase s6lida ("captura"). Entre los soportes adecuados se incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas y magnetita. El vehfculo puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los prop6sitos de esta invenci6n. El material de soporte puede tener cualquier estructura siempre que la molecula acoplada pueda unirse a la plasmina.

Usos de diagnostico in vivo

Se puede usar un dominio Kunitz que se une muy fuertemente a la plasmina para generar imagenes in vivo. Las imagenes para el diagn6stico de focos de enfermedad se consideraron una de las mayores oportunidades comerciales de los anticuerpos monoclonales, pero esta oportunidad no se ha alcanzado. A pesar del considerable esfuerzo, s6lo se han aprobado dos agentes de generaci6n de imagenes basados en anticuerpos monoclonales. Los decepcionantes resultados obtenidos con los anticuerpos monoclonales, se deben en gran medida a:

i) la inadecuada afinidad y/o especificidad;

ii) poca penetraci6n en los sitios objetivos;

iii) aclaramiento lento de los sitios que no son objetivo;

iv) inmunogenicidad (la mayorfa son murinos); y

v) alto coste de producci6n y poca estabilidad.

Estas limitaciones han hecho que en el campo de la generaci6n de imagenes de diagn6stico se empiecen a desarrollar agentes de generaci6n de imagenes basados en peptidos. Aunque solucionan potencialmente los problemas de poca penetraci6n y aclaramiento lento, no es probable que los agentes de generaci6n de imagenes basados en peptidos tengan la afinidad, especificidad y estabilidad in vivo adecuadas para ser utiles en la mayorfa de las aplicaciones.

Las protefnas disenadas son excepcionalmente adecuadas para los requisitos de un agente de generaci6n de imagenes. En particular, la extraordinaria afinidad y especificidad que se pueden obtener disenando dominios protefnicos de origen humano, estables y pequenos, que tienen tasas de aclaramiento y mecanismos in vivo conocidos, se combinan para proporcionar resultados mas fiables y mas pronto, menos toxicidad/efectos secundarios, menor coste de producci6n y almacenamiento, y mayor conveniencia de la preparaci6n del marcador. Realmente, se podrfa lograr el objetivo de la generaci6n de imagenes en tiempo real con los agentes de generaci6n de imagenes de protefnas disenadas. Las protefnas de uni6n a la plasmina, por ejemplo SPI11, pueden ser utiles para localizar sitios de hemorragia interna.

Se puede administrar la protefna de uni6n radiomarcada al sujeto humano o animal. La administraci6n tfpicamente es por inyecci6n, por ejemplo, intravenosa o arterial, u otros medios de administraci6n, en una cantidad suficiente para permitir la posterior generaci6n de imagenes dinamica y/o estatica usando dispositivos radiodetectores adecuados. La dosificaci6n es la cantidad mas pequena capaz de proporcionar una imagen eficaz para el diagn6stico, y se puede determinar por medios convencionales en la tecnica, usando agentes de generaci6n de radioimagenes conocidos como gufas.

Tfpicamente, la generaci6n de imagenes se lleva a cabo en el cuerpo entero del sujeto, o en la parte del cuerpo u 6rgano relevante para la afecci6n o enfermedad que se estudia. La protefna de uni6n radiomarcada se ha acumulado. Despues, se puede cuantificar la cantidad de protefna de uni6n radiomarcada acumulada en un momento determinado en 6rganos objetivo relavantes.

Un dispositivo radiodetector particularmente adecuado es una camara de centelleo, tal como una camara γ. El dispositivo de detecci6n en la camara detecta y registra (y opcionalmente digitaliza) la desintegraci6n radiactiva. La informaci6n digitalizada se puede analizar de cualquier forma adecuada, muchas de las cuales son conocidas en la

tecnica. Por ejemplo, un analisis de tiempo-actividad puede ilustrar la absorci6n mediante el aclaramiento de la protefna de uni6n radiomarcada por los 6rganos objetivos con el tiempo.

Se tienen en cuenta diferentes factores para seleccionar un radiois6topo adecuado. El is6topo se selecciona: para permitir una resoluci6n de buena calidad tras la generaci6n de imagen, que sea seguro para usar en el uso de diagn6stico en seres humanos y animales, y preferiblemente, que tenga una semivida corta de forma que se disminuya la cantidad de radiaci6n que recibe el cuerpo. El radiois6topo usado preferiblemente debe ser farmacol6gicamente inerte, y las cantidades administradas no deben tener un efecto fisiol6gico sustancial. La protefna de uni6n se puede radiomarcar con diferentes is6topos de yodo, por ejemplo 123I, 125I o 131I (vease por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.609.?25). La cantidad de marcador se debe seguir de forma adecuada.

En las aplicaciones a sujetos humanos, puede ser conveniente usar radiois6topos distintos del 125I para el marcaje, para disminuir la exposici6n dosimetrica total del cuerpo, y optimizar la detectabilidad de la molecula marcada. Considerando la facil disponibilidad clfnica para usar en seres humanos, los radiomarcadores preferidos incluyen: 99mTc, 6?Ga, 68Ga, 90y, 111In, 113mIn, 123I, 186Re, 188Re o 211At. Se puede preparar una protefna radiomarcada por diferentes metodos. Entre estos se incluyen radiohalogenaci6n con cloramina T o el metodo de la lactoperoxidasa y posterior purificaci6n por cromatograffa lfquida de alta presi6n, por ejemplo, vease Gutkowska et al., en "Endocrinology and Metabolism Clinics of America": (198?) 16 (1):183. Se pueden usar otros metodos de radiomarcaje, tales como IODOBEADS® .

Se puede administrar una protefna radiomarcada por cualquier medio que permita al agente activo alcanzar el sitio de acci6n del agente en un mamffero. Debido a que las protefnas son sometidas a digesti6n cuando se administran por vfa oral, normalmente se usara la administraci6n parenteral, es decir, intravenosa, subcutanea, intramuscular, para optimizar la absorci6n.

Otros usos

Las protefnas de uni6n a la plasmina descritas en esta memoria tambien se pueden usar para purificar la plasmina de un fluido, por ejemplo, la sangre. Para este prop6sito, la PBP preferiblemente se inmoviliza en un soporte insoluble. Dichos soportes incluyen los mencionados como utiles para preparar reactivos de diagn6stico en fase s6lida.

Las protefnas se pueden usar como marcadores de peso molecular como referencia en la separaci6n o purificaci6n de protefnas. Puede ser necesario desnaturalizar las protefnas para que sirvan como marcadores de peso molecular. Una segunda utilidad general de las protefnas es el uso de protefna hidrolizada como una fuente nutriente. Las protefnas tambien se pueden usar para aumentar la viscosidad de una soluci6n.

La protefna descrita en esta memoria se puede usar para cualquiera de los prop6sitos anteriores, asf como para prop6sitos terapeuticos y de diagn6stico como se discute mas adelante en esta memoria descriptiva.

PREPARACION DE PEPTIDOS

La sfntesis qufmica de polipeptidos es un area que evoluciona rapidamente en la tecnica, y en las siguientes referencias se describen metodos de sfntesis de polipeptidos en fase s6lida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963); Merrifield, Science 232:341-34? (1986); Wade et al., Biopolymers 25:S21-S3? (1986); Fields, Int. J. [olypeptide [rot. Res. 35:161 (1990); MilliGen Report Nos. 2 and 2a, Millipore Corporation, Bedford, MA, 198?) Ausubel et al., vease antes, y Sambrook et al., vease antes. Tan y Kaiser (Biochemistry, 19??, 16:1531-41) sintetizaron hace dieciocho anos el BPTI y un hom6logo.

Como se sabe en la tecnica, dichos metodos implican el bloqueo o protecci6n de grupos funcionales reactivos, tales como grupos amino, carboxilo y tio libres. Despues de la formaci6n del enlace de polipeptido, se eliminan los grupos protectores. Por lo tanto, la adici6n de cada resto de aminoacido requiere varias etapas de reacci6n para proteger y desproteger. Los metodos actuales usan la sfntesis en fase s6lida, en la que el aminoacido C-terminal se une covalentemente a una partfcula de resina insoluble que se puede filtrar. Los reactivos se separan por lavado de las partfculas de resina con disolventes adecuados usando una maquina automatica. Se conocen bien en la tecnica diferentes metodos, incluyendo el metodo del "tBoc" y el metodo del "Fmoc". Vease, entre otros, Atherton et al., J. Chem. Soc. [errin Trans 1:538-546 (1981) y Sheppard et al., Int. J. [olypeptide [rot .Res. 20:451-454 (1982).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construccion de la biblioteca de LACI (K1)

Se clon6 un duplex de oligonucle6tido sintetico que tiene extremos NsiI-y MluI-compatibles, en un vector parental (LACI-K1::III) previamente escindido con las dos enzimas anteriores. El material ligado resultante se transfect6 por electroporaci6n en la cepa de E. coli XLIMR (F-) y se cultiv6 en placas con ampicilina (Ap) para obtener colonias ApR generadoras de fagos. El esquema de variegaci6n para la Fase 1 se centra en la regi6n P1, y afect6 a los restos 13, 14 10

16, 1?, 18 y 19. Permite 6,6 x 105 secuencias de ADN diferentes (3,1 x 105 secuencias de protefnas diferentes). La biblioteca obtenida consistfa en 1,4 x 106 ufc independientes, que es aproximadamente una representaci6n de dos veces la biblioteca entera. El cultivo madre de fagos generado en este cultivo en placa dio una valoraci6n total de 1,4 x 1013 ufc en aproximadamente 3,9 ml, estando representado cada clon independientemente, como media, 1 x 10? en total y 2,6 x 106 veces por ml de cultivo madre de fagos.

Para permitir la variegaci6n de los restos 31, 32, 34 y 39 (fase II), los duplex de oligonucle6tidos sinteticos con extremos MluI-y BstEII-compatibles, se clonaron en ADN Rf previamente escindido, obtenido de uno de los siguientes:

i) la construcci6n parental,

ii) la biblioteca de fase I, o

iii) fago de presentaci6n seleccionado de la primera fase, que se une a un objetivo dado.

El esquema de variegaci6n para la fase II permite 4096 secuencias de ADN diferentes (1600 secuencias de protefnas diferentes) debido a las alteraciones en los restos 31, 32, 34 y 39. La variegaci6n de la fase final II depende del nivel de variegaci6n que queda despues de tres ciclos de uni6n y eluci6n con un objetivo dado en la fase I.

La posible variegaci6n combinada de ambas fases es igual a 2,? x 101 secuencias de ADN diferentes o 5,0 x 10? secuencias de protefnas diferentes. Cuando se usa el fago de presentaci6n previamente seleccionado, como el origen del ADN Rf para la variegaci6n de la fase II, probablemente el nivel de variegaci6n final esta en el intervalo de 105 a 106.

Ejemplo 2: Cribado de la union a la plasmina en la biblioteca de LACI-K1

El esquema para seleccionar variantes de LACI-K1 que se unen a la plasmina implica la incubaci6n de la biblioteca de presentaci6n en fagos con perlas de plasmina (Calbiochem, San Diego, CA; catalogo nO 52?802) en un tamp6n (PBS que contiene BSA 1 mg/ml) antes de lavar las variantes de fagos de presentaci6n no unidos o debilmente retenidos con PBS que contiene Tween 20 al 0,1%. Los fagos de presentaci6n unidos mas fuertemente se eluyen con un tamp6n de eluci6n a pH bajo, tfpicamente tamp6n de citrato (pH 2,0) que contiene BSA 1 mg/ml, que inmediatamente se neutraliza con tamp6n Tris a pH ?,5. Este procedimiento constituye un s6lo ciclo de selecci6n.

El fago de presentaci6n eluido neutralizado se puede usar:

i) para inocular una cepa F+ de E. coli para generar un nuevo cultivo madre de fagos de presentaci6n, para usar en los siguientes ciclos de selecci6n (llamada cribado convencional), o

ii) directamente para otro ciclo inmediato de selecci6n con las perlas de proteasa (llamada cribado rapido).

Tfpicamente, se llevan a cabo tres ciclos de cada metodo, o una combinaci6n de dos, para dar lugar al fago de presentaci6n final seleccionado, a partir del cual se secuencia un numero representativo y se analizan las propiedades de uni6n como mezclas de fagos de presentaci6n o como clones individuales.

Para la biblioteca de LACI-K1, se llevaron a cabo dos fases de selecci6n, que consistfa cada una en tres ciclos de uni6n y eluci6n. La selecci6n de la fase I us6 la biblioteca de Fase I (restos variegados 13, 16, 1?, 18 y 19), que pas6 por tres ciclos de uni6n y eluci6n frente a la plasmina, dando lugar a una subpoblaci6n de clones. El ADN Rf obtenido de esta subpoblaci6n seleccionada se us6 para generar la biblioteca de Fase II (adici6n de los restos variegados 31, 32, 34 y 39). Se obtuvieron aproximadamente 5,6 x 10? transformados independientes. Las bibliotecas de Fase II experimentaron tres ciclos adicionales de uni6n y eluci6n con la misma proteasa objetivo dando lugar a los seleccionados finales.

Despues de las dos fases de selecci6n frente a perlas de agarosa-plasmina, se secuenci6 un numero representativo

(16) de fagos de presentaci6n de la selecci6n final. La Tabla 2 muestra las secuencias de los dominios LACI-K1 seleccionados con los aminoacidos seleccionados en las posiciones variegadas en mayusculas. Observese la selecci6n absoluta de los restos P13, A16, R1?, F18 y E19. Hay una selecci6n muy fuerte para E en 31 y Q en 32. No hay consenso en 34; los aminoacidos observados son {T3, y2, H2, D, R, A, V2, I3, y L}. Los aminoacidos que tienen grupos laterales que se ramifican en el Cβ (T, I y V) estan representados multiples veces y se prefieren. En la posici6n 39, no hay un alto consenso (G6, D3, Q2, A2, R, F, E), pero parece que se prefieren G, D, Q y A (en este orden).

Un cribado por separado de la biblioteca de LACI-K1 frente a la plasmina dio un consenso muy similar de 16 fagos de presentaci6n seleccionados secuenciados. Estas secuencias se muestran en la Tabla 3 (restos seleccionados en mayusculas). Estas secuencias se desvfan de las de la Tabla 2 en que aquf en la posici6n 19 predomina E. Hay un

consenso en 34 (T5, V3, S3, I2, L, A, F) de T, V o S. Combinando los dos grupos, hay una preferencia por (en orden de preferencia) T, V, I, S, A, H, y y L, estando permitidos F, D y R.

EXPRESION, PURIFICACION Y ANALISIS CINETICO

Se volvieron a clonar los tres aislados QS4, ARFK#1 y ARFK#2 en un vector de expresi6n de levadura. El vector de expresi6n de levadura se obtiene de pMFalfa8 (KURJ82 y MIyA85). Los genes variantes de LACI se fusionaron con parte del gen matα1, generando un gen hfbrido que consistfa en el promotor de matα1-peptido senal y la secuencia lfder fusionada con la variante de LACI. El sitio de clonaci6n se muestra en la Tabla 24. Observese que la protefna variante de LACI-K1 correctamente procesada deberfa ser como se detalla en la Tabla 2 y Tabla 3 con la adici6n de los restos glu-ala-ala-glu en la Met N-terminal (resto 1 en la Tabla 2 y Tabla 3). La expresi6n en S. cerevisiae dio un rendimiento de aproximadamente 500 μg de inhibidor de proteasa por litro de medio. LACI (dominio Kunitz 1), BPTI y las variantes de LACI: QS4, ARFK#1 y ARFK#2 expresados en levadura, se purificaron por cromatograffa de afinidad usando perlas de tripsina-agarosa.

El hospedante de producci6n mas preferido es [ichia pastoris que utiliza el sistema de la alcohol-oxidasa. Se han producido una serie de protefnas en la levadura [ichia pastorias. Por ejemplo, Vedvick et al. (VEDV91) y Wagner et al. (WAGN92) produjeron aprotinina a partir del promotor de la alcohol-oxidasa con inducci6n por metanol, como una protefna secretada en el medio de cultivo ≈ 1 mg/ml. Gregg et al. (GREG93) han revisado la producci6n de una serie de protefnas en [. pastoris. La Tabla 1 de GREG93 muestra protefnas que han sido producidas en [. pastoris y los rendimientos.

Datos cineticos

La inhibici6n de la hidr6lisis de succinil-Ala-Phe-Lys-(F3Ac)AMC (una metil-cumarina) (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) por la plasmina 2,5 x 10-8 M con diferentes cantidades del inhibidor, se ajust6 a la forma patr6n para un sustrato que se une fuertemente, por mfnimos cuadrados. El analisis cinetico preliminar de las dos variantes ARFK demostr6 una actividad inhibidora muy similar a la de la variante QS4. Estas mediciones se llevaron a cabo con cantidades fisiol6gicas de sal (150 mM) de modo que las afinidades son importantes para la acci6n de las protefnas en la sangre.

La Tabla 23 muestra que QS4 es un inhibidor de la plasmina humana muy especffico. Los fagos que presentan el derivado de LACI-K1 QS4 se unen a las perlas de plasmina al menos 50 veces mas de lo que se unen otros objetivos de proteasas.

NUEVA BIBLIOTECA PARA LA PLASMINA:

Se hizo una nueva biblioteca de dominios LACI-K1, presentada en M13 gIIIp, y que contenfa la diversidad mostrada en la Tabla 5 y se crib6 la uni6n a la plasmina. La Tabla 6 muestra las secuencias seleccionadas y el consenso. Se caracteriz6 la uni6n de las protefnas seleccionadas comparando la uni6n del fago clonalmente puro a BPTI presentado en fago. Los aislados 11, 15, 08, 23 y 22 eran superiores al fago de BPTI. Se produjo SPI11 (Inhibidor de plasmina seleccionado nO11) soluble, y se ensay6 su actividad inhibidora, obteniendose una Ki de 88 pM, que es al menos dos veces mejor que la de BPTI. Por lo tanto, se cree que los seleccionados SPI15, SPI08 y SPI22 son muy superiores a BPTI y que es probable que SPI23 sea aproximadamente tan potente como BPTI. Todas las protefnas listadas estan mas cerca de una secuencia de aminoacidos de protefna humana de lo que lo esta BPTI, y por lo tanto tienen menos posibilidad de inmunogenicidad.

TABLA 1: Secuencia de LACI entero: (SEQ ID No. 1)

La secuencia senal (1-28) esta en mayusculas y subrayada

LACI-K1 esta en mayusculas LACI-K2 esta subrayado LACI-K3 esta en negrilla

TABLA 2: Secuencia de LACI-K1 y derivados que se unen a la plasmina humana

TABLA 3: Secuencia de LACI-K1 y derivados que se unen a la plasmina humana

Tabla �: dominios Kunitz, algunos de los cuales inhiben la plasmina

Secuencia de aminoacidos Protefnaidentificada

Afinidad KD SEQ ID NO.

(continuacion)

Secuencia de aminoacidos Protefnaidentificada

Afinidad KD SEQ ID NO.

(continuacion)

Secuencia de aminoacidos

Protefnaidentificada

Afinidad KD SEQ ID NO.

En "Afinidad", "(A)" significa que es probable que la KD sea menor que la de BPTI (es decir 300 pM), "(B)" significa que es probable que la KD sea menor que 2 nM, y "(C)" significa que es probable que la KD sea menor que 20 nM.

Tabla 5: ADNvg para LACI-D1 para variar los restos 10, 11, 13, 15, 16, 1? y 19 para la plasmina teniendo en cuenta App-I (que ahora se sabe que no es muy potente).

ADN: 262.144 * 4 = 1.048.5?6 5 protefna: 143.360 * 4 = 5?3.440 La secuencia de aminoacidos tiene el SEQ ID NO. 85.

Esta variegaci6n permite que la secuencia de AppI aparezca en las posiciones P6-P6'.

Tabla 6: derivados de LACI-K1 seleccionados para la uni6n a la plasmina

"Difs" es el numero de diferencias respecto al Consenso. "Uni6n del fago" es la uni6n del fago que presenta la protefna designada respecto a la uni6n del fago que presenta BPTI.

Tabla 7: Variaci6n de los restos 31, 32, 34 y 39

La secuencia de aminoacidos tiene el SEQ ID NO. 8?

Se elimina el sitio EcoRI; por lo tanto, se puede usar la escisi6n con EcoRI para eliminar (o reducir al menos mucho) el ADN parental. Hay 262.144 secuencias de ADN y ?2.000 secuencias de protefnas.

Tabla �: Seleccionados por la uni6n a la plasmina con variegaci6n en el segundo bucle

Veanse las siguientes notas En la Tabla "-" significa que las protefnas tienen el tipo de consenso (Con1). Con 1 contiene el tipo mas comun en cada posici6n; los aminoacidos mostrados en Con1 no se variaron. Cuatro posiciones (10, 31, 34 y 39) mostraron significativa tolerancia por un segundo tipo, conduciendo a 15 secuencias consenso secundarias: Con2-Con16. La columna "nO Difs" muestra el numero de diferencias con CON1 en "C1", las diferencias con el mas cercano de Con1-Con16 en "C", y las diferencias con LACI-K1 en "K1". SPI11 se seleccion6 de una biblioteca en la que los restos 3139 se bloquearon en el tipo salvaje.

SPI11 �BPTI�SPI23 = SPI51 �SPI4? �QS4�SPI22�SPI54�SPI43 Muy superior muy potente potente

Tabla 9: Sustituciones conservativas y semiconservativas

Tipo de AA Categorfa Sustituciones conservativas Sustituci6n semiconservativa inicial A Pequeno no polar o G, S, T N, V, P, (C)

ligeramente polar C Dislufuro SH libre A, M, L, V, I ninguna F, G ninguna D acido, hidr6filo E, N, S, T, Q K, R, H, A E acido, hidr6filo D, Q, S, T, N K, R, H, A F aromatico Gly-s6lo W, y, H, L, M ninguna I, V, (C) ninguna

conformaci6n "normal" G conformaci6n A, S, N, T D, E, H, I, K, L, M, Q, R, V

H aromatico anf6tero y, F, K, R L, M, A, (C) I alifatico, carbono β ramificado V, L, M, A F, y, W, G (C) K basico R, H Q, N, S, T, D, E, A L alifatico M, I, V, A F, y, W, H, (C) M hidr6fobo L, I, V, A Q, F, y, W, (C), (R), (K), (E) N hidr6filo no polar S, T, (D), Q, A, G, (E) K, R P inflexible V, I A, (C), (D), (E), F, H, (K), L,

M, N, Q, (R), S, T, W, y Q alifatico mas amida N, E, A, S, T, D M, L, K, R R basico K, Q, H S, T, E, D, A, S hidr6filo A, T, G, N D, E, R, K T hidr6filo alifatico, A, S, G, N, V, I, L, M, A, T D, E, R, K, I P, (C) V carbono β ramificado W aromatico F, y, H L, M, I, V, (C) y aromatico F, W, H L, M, I, V, (C)

El cambio de A, F, H, I, L, M, P, V, W o de y a C, es semiconservativo, si la nueva cistefna permanece como un tiol libre.

5 El cambio de M a E, R, K es semiconservativo si el extremo i6nico del nuevo grupo lateral puede alcanzar la superficie de la protefna, mientras que los grupos metileno hacen contactos hidr6fobos.

El cambio de P a uno de K, R, E o D es semiconservativo si el grupo lateral esta en o cerca de la superficie de la protefna.

Tabla 10: Derivados del dominio Kunitz de LACI-K1 inhibidores de plasmina

Posicion Consenso nO 1 Consenso nO 2 Consenso nO 3 Consenso nO Tipo Estado Tipo Estado Tipo Estado Tipo Estado

10 D fijo D fijo E/D S-S D/E S-S 11 D fijo D fijo T/S G-S T/A G-S 12 G fijo G fijo G fijo G fijo 13 P Abs-S P VS-S P VS-S P Abs-S 14 C fijo C fijo C fijo C fijo 15 K fijo K fijo R S-S R S-S 16 A Abs-S A Abs-S A VS-S A S-S 1? R Abs-S R VS-S R/K S-S K S-S 18 F Abs-S F Abs-S F VS-S F VS-S 19 E Abs-S E Abs-S -E/P/ D S-S D/E VS-S 20 R fijo R fijo R fijo R fijo 21 F fijo F fijo W/F Sel-debil W/F Sel-debil 31 E S-S E S-S E fijo E/tG-S

Fuerte para tipo sin

carga, debil para 33 F fijo F fijo F fijo F fijo 34 -no consenso T/S debil I fijo V/L/ debil 35 y fijo y fijo y fijo y S-S 39 -no consenso G Sel-debil E fijo G/E Sel-algo Abs-S Selecci6n absoluta S-S selecci6n fuerte VS-S Selecci6n muy fuerte G-S Buena selecci6n

Secuencia

Tabla 12: ADNvg para LACI-D1 para variar los restos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1?, 19, 20, 21, 3?, 38 y 39 para la plasmina teniendo en cuenta App-I y SPI11

La primera (superior) cadena de ADN tiene el SEQ ID NO. 120.

La segunda (inferior) cadena de ADN tiene el SEQ ID NO. 121. 2?

La secuencia de aminoacidos tiene el SEQ ID NO. 122.

No es necesario sintetizar la cadena de los codones 31-42 (mostrada), pero se produce por la PCR a partir de las cadenas mostradas. Hay 1,3? x 1011 secuencias de ADN que codifican 4,66 x 1010 secuencias de aminoacidos.

Tabla 1�: Definicion de un dominio Kunitz (SEQ ID NO. 123)

En el que:

X1, X2, X3, X4, X58, X57 y X56 pueden estar ausentes

X21 = Phe, Tyr, Trp,

10 X22 = Tyr o Phe, X23 = Tyr o Phe, X35 = Tyr o Trp, X36 = Gly o Ser, X40 = Gly o Ala,

15 X43 = Asn o Gly, y X45 = Phe o Tyr Tabla 15: Sustituciones para conferir a los KuDoms alta afinidad por la plasmina Posici6n Tipos permitidos Posici6n Tipos permitidos

Glu, Gly, Asp, Arg, Ala, Gln, Leu, Lys, Met

En la Tabla 15, se prefieren los restos en negrilla.

Tabla 16: Sumario de secuencias seleccionadas de la primera biblioteca de LACI-K1 para la union a la

plasmina

BPTI nO (tipo de BPTI)

(LACI-K1) Restos permitidos en la biblioteca Restos preferidos

13 (P)

P LHPR PL

16 (A)

A AG AG

1? (R)

I FyLIENA SCPRTVD G RS

18 (I)

M todos F

19 (I)

K LWQMKAG SPRTVE EQ

31 (Q)

EEQ EQ

32 (T)

E EQ QE

34 (V)

I todos TyHDRAVELSF

39 (R)

E todos GADRQFEMLVKNH

Tabla 17: Distribucion de secuencias seleccionadas de la primera biblioteca:

Tabla 1�: Distribucion de tipos de aminoacidos en distintos restos, en proteinas seleccionadas para la union a la plasmina de la tercera biblioteca.

KuDom presentado Plasmina Trombina Calicrefna Tripsina Tripsina, 2 lavados LACI-K1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 QS4 52 0,? 0,9 4,5 0,5 BPTI 88 1,1 1,? 0,3 0,8

El fago con LACI-K1 para cada objetivo se consider6 como uni6n unitaria, y los otros fagos de presentaci6n se muestran como de uni6n relativa. BPTI::fago III no es liberado facilmente de la tripsina.

Tabla 2�: vectores de expresion de S. cerevisiae Mat α

Matα2 (despues de introducir un conector en el corte del ADN StuI)

La solicitante espera que la secuencia previa a Matα se escinda antes de GLUa-ALAb- CITAS ADEL86: Adelman et al., Blood (1986) 68(6)1280-1284. ANBA88: Anba et al., Biochimie (1988) ?0(6)?2?-?33. AUER88: Auerswald et al., Bio Chem. Hoppe-Seyler (1988), 369(Supplement):2?-35.

BANE90:

Baneyx & Georgiou, J. Bacteriol. (1990)1?2(1)491-494.

Bank91:

Baneyx & Georgiou, J. Bacteriol. (1991) 1?3(8)2696-2?03.

BROW91:

Browne et al., entrada en GeneBanr M?4220.

BROZ90:

Broze et al., Biochemistry (1990) 29:?539-?546.

5

Cold8?: Colman et al., Editors, Hemostasis and Thrombosis, Second-Edition, 198?, J. B. Lippincott

Company, Filadelfia, PA.

DENN94a:

Dennis & Lazarus, J. Biological Chem. (1994) 269:22129-22136.

DENN94b:

Dennis & Lazarus, J. Biological Chem. (1994) 269:2213?-22144.

EIGE90:

Eigenbrot et al., [rotein Engineering (1990), 3(?)591-598.

10

ELLI92: Ellis el al., Ann. N Y Acad. Sci. (1992) 66?:13-31.

FIDL94:

Fidler & Ellis, Cell (1994) ?9:185-188.

FRAE89:

Fraedrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. (1989) 3?(2)89-91.

GARD93:

Gardell, Toxicol. [athol. (1993) 21(2)190-8.

GIRA89:

Girard et al., Nature (1989), 338:518-20.

15

GIRA91: Girard et al., J. BIOL. CHEM. (1991) 266:5036-5041.

GREG93:

Gregg et al., Bio/Technology (1993) 11:905-910.

HOOV93:

Hoover et al., Biochemistry (1993) 32:10936-43.

HyNE90:

Hynes et al., Biochemistry (1990), 29:10018-10022.

KIDO88:

Kido et al., J. Biol. Chem. (1988), 263:18104-?.

20

KID090: Kido et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm. (1990), 16?(2)?16-21.

KURJ82:

Kurjan and Herskowitz, Cell (1982) 30:933-9.43.

LASK80:

Laskowski & Kato, Ann. Rev. Biochem. (1980), 49:593-626.

LEAT91:

Leatherbarrow & Salacinski, Biochemistry (1991) 30(44)10?1?-21.

LOHM93:

Lohmann & J Marshall, Refract. Corneal Surg. (1993) 9(4)300-2.

25

LUCA83: Lucas et al., J. Biological Chem. (1983) 258(?)4249-56.

MANN8?:

Mann & Foster, Capftulo 10 de COLM8?.

MIyA85:

Miyajima et al., Gene (1985) 3?:155-161.

NEUH89:

Neuhaus et al., Lancet (1989) 2(8668)924-5.

NOVO89:

Novotny et al., J. BIOL. CHEM. (1989) 264:18832-1883?.

30

OREI94: O'Reilly et al., Cell (1994) ?9:315-328.

PARK86:

Park & Tulinsky, Biochemistry (1986) 25(14)39??-3982.

PUTT89:

Putterman, Acta Chir Scand. (1989) 155(6-?)36?.

ROBB8?:

Robbins, Capftulo 21 de COLM8?

SCHE6?:

Schechter & Berger. Biochem. Biophys. Res. Commun. (196?) 2?:15?-162.

35

SCHE68: Schechter & Berger. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1968) 32:898-902.

SCHN86:

Schnabel et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler (1986), 36?:116?-?6.

32

SHER89:

Sheridan et al., Dis. Colon Rectum (1989) 32(6)505-8.

SPRE94:

Sprecher et al., [roc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3353-335? (1994)

VAND92:

van Dijl et al., EMBO J. (1992) 11(8)2819-2828.

VARA83:

Varadi & Patthy, Biochemistry (1983) 22:2440-2446.

VARA84:

Varadi & Patthy, Biochemistry (1984) 23:2108-2112.

VEDV91:

Vedvick et al., J. Ind. Microbiol. (1991) ?:19?-201.

WAGN92:

Wagner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1992) 186:1138-1145.

WUNT88:

Wun et al., J. BIOL. CHEM. (1988) 263:6001-6004.

Las siguientes paginas contienen realizaciones preferidas.

Realizaciones

1.

Una protefna inhibidora de plasmina que comprende una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente hom6loga a los restos 5 a 55 de una secuencia de referencia seleccionada del grupo que comprende SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, y NS4, mostradas en la tabla 4.

2.

Una protefna como en la realizaci6n 1, en la que la secuencia es identica en los restos 10-21 y 31-39 y tiene 5 o menos diferencias en los restos 5-9, 22-30 y 40-55 comparada con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que comprende SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, y NS4, mostradas en la tabla 4.

3.

Una protefna inhibidora de plasmina en la que dicha protefna comprende un dominio Kunitz que cumple los requisitos mostrados en la tabla 14 con los numeros de los restos con respecto al BPTI, y en la que dicha protefna tiene en las posiciones del dominio Kunitz 12-21 y 32-39 uno de los tipos de aminoacidos listados para esa posici6n en la tabla 15, y en la que la secuencia de dicho dominio Kunitz es mas similar en la secuencia de aminoacidos a una secuencia de referencia seleccionada del grupo de SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI4?, QS4, NS4, LACI-K2 humano, LACI-K3 humano, KuDom de α3 de colageno humano, dominio 1 de TFPI-2 humano, dominio 2 de TFPI-2 humano, dominio 3 de TFPI-2 humano, ITI-KI humano, ITI-K2 humano, PROTEASA NEXINA-II humana, APP-I humano, DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.2.1, DPI-1.3.1, DPI-2.1, DPI-3.1.1. DPI-3.2.1, DPI-3.3.1, DPI4.1.1, DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4, DPI-4.2.5, DPI-5.1, DPI-5.2, DPI-6.1 y DPI-6.2 que la secuencia de aminoacidos de dicho dominio Kunitz a la secuencia del BPTI.

4.

Una protefna como en la realizaci6n 3, en la que el resto 18 es Phe, el resto 15 es Arg, el resto 16 es Ala y el resto 1? es Arg.

5.

Una protefna como en la realizaci6n 1 o realizaci6n 3, en la que dicha protefna tiene una Ki para la plasmina humana de 100 pM o menos.

6.

Un metodo para prevenir o tratar un trastorno atribuible a una actividad excesiva de la plasmina, que comprende administrar a un sujeto humano o animal que se beneficiarfa de la misma, una cantidad inhibidora de plasmina de la protefna de la realizaci6n 1 o realizaci6n 3.

?. Un metodo de ensayo de la plasmina que comprende proporcionar la protefna de la realizaci6n 1 o realizaci6n 3 en forma marcada o insolubilizada, y determinar si en una muestra se forma un complejo de dicha protefna y la plasmina.

8. Un metodo para purificar la plasmina de una mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con la protefna

o analogo de la realizaci6n 1 o realizaci6n 3 en forma insolubilizada, y dejar que se una la plasmina.

9.

Una protefna como en la realizaci6n 3, en la que el dominio Kunitz parental es de origen humano y la protefna inhibe la plasmina humana con una Ki de aproximadamente 300 pM o menos.

10.

Una protefna como en la realizaci6n 3, en la que la protefna tiene en cada una de las posiciones listadas en la tabla 15 un tipo de aminoacido mostrado para esa posici6n en la tabla 15.

11.

Una protefna inhibidora de plasmina que tiene una Ki de aproximadamente 100 pM o menos.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Uso de un polipeptido inhibidor de plasmina aislado que comprende una estructura de dominio Kunitz, que

   comprende una secuencia de aminoacido que tiene la f6rmula

   Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa?-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Gly-Xaa13-Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa1?

   Xaa18-Xaa19-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa2?-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe-

   Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa4?-Xaa48-Xaa49-

   Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa5?-Xaa58, en la que

   cualquiera de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa5? o Xaa58 puede estar ausente;

   Xaa10 se selecciona de Asp y Glu;

   Xaa11 se selecciona de Thr, Ala y Ser;

   Xaa13 es Pro;

   Xaa15 es Arg;

   Xaa16 es Ala;

   Xaa1? es Arg;

   Xaa18 es Phe;

   Xaa19 se selecciona de Glu y Asp;

   Xaa21 se selecciona de Phe y Trp;

   Xaa22 se selecciona de Tyr y Phe;

   Xaa23 se selecciona de Tyr y Phe;

   Xaa31 se selecciona de Asp y Glu;

   Xaa32 se selecciona de Thr, Ala y Glu;

   Xaa34 se selecciona de Val, IIe y Thr;

   Xaa35 es Tyr;

   Xaa36 es Gly;

   Xaa39 se selecciona de Glu, Gly y Asp;

   Xaa40 se selecciona de Gly y Ala;

   Xaa43 se selecciona de Asn y Gly; y

   Xaa45 se selecciona de Phe y Tyr,

   en la preparaci6n de un medicamento para tratar la fibrin6lisis o fibrinogenolisis inadecuadas, asociadas con

   circulaci6n extracorp6rea, cirrosis hepatica, amiloidosis, leucemia promielocftica aguda, tumores s6lidos y para

   bloquear la metastasis tumoral. 2.-Uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que el polipeptido inhibidor de plasmina comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63.
2. 3.-Uso de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que el polipeptido inhibidor de plasmina comprende una secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 40.