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MX2011003763A - Inmunoterapeuticos de completo tcr. - Google Patents

Inmunoterapeuticos de completo tcr.

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MX2011003763A
MX2011003763A MX2011003763A MX2011003763A MX2011003763A MX 2011003763 A MX2011003763 A MX 2011003763A MX 2011003763 A MX2011003763 A MX 2011003763A MX 2011003763 A MX2011003763 A MX 2011003763A MX 2011003763 A MX2011003763 A MX 2011003763A
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MX
Mexico
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region
fusion protein
cells
amino acid
immunoglobulin
Prior art date
Application number
MX2011003763A
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English (en)
Inventor
Peter R Baum
Peter A Thompson
Philip Tan
John W Blankenship
Sateesh Kumar Natarajan
Valerie Odegard
Catherine J Mcmahan
Original Assignee
Emergent Product Dev Seattle
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Publication date
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Abstract

Se proveen proteínas de fusión de cadena individual que específicamente se unen a un complejo TCR o uno de sus componentes, tales como TCRa, TCRß, o CD3(, junto con composiciones y métodos para utilizarlas.

Description

I MUNOTERAPEUTICOS DE COMPLEJO TCR Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas de unión recombinantes inmunológicamente activas y, en particular, a proteínas de fusión de cadena individual específicas para un complejo TCR o uno de sus componentes, tal como CD3. La presente invención también se refiere a composiciones y métodos para tratar enfermedades autoinmunitarias y otros trastornos o afecciones (por ejemplo, rechazo al trasplante) .
Antecedentes de la Invención La activación del complejo TCR en células T humanas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 se ha utilizado por largo tiempo en el tratamiento de rechazo a los trasplantes de órganos. Los anticuerpos monoclonales de ratón específicos para CD3 humano, tales como 0KT3 (Kung et al. (1979) Science 206: 347-9), fueron la primera generación, de tales tratamientos. Aunque 0KT3 tiene una fuerte potencia inmunosupresora, su uso clínico se dificultó por serios efectos secundarios enlazados a sus potenciales inmunogénico y mutagénico (Chatenoud (2003) Nature Reviews 3:123-132). Se indujo una respuesta anti -globulina, promoviendo su rápida depuración y neutralización (Chatenoud et al. (1982) Eur. J. Immunol . 137:830-8) . Además, la proliferación de la célula T Ref. 219205 inducida por 0KT3 y la producción de citocinas in vitro y condujo a una liberación a gran escala de la citocina in vivo (Hirsch et al. (1989) J. Immunol 142: 737-43, 1989). La liberación de la citocina (también referida como "tormenta de citocina") a su vez condujo a un síndrome "de tipo gripe", caracterizado por fiebre, escalofríos, dolores de cabeza, náusea, vómito, diarrea, dificultad respiratoria, meningitis séptica e hipotensión (Chatenoud, 2003) . Tales serios efectos secundarios limitaron el uso más extendido de 0KT3 en el trasplante así como la extensión de su uso a otros campos clínicos tales como autoinmunidad (Id.).
Para reducir los efectos secundarios de la primera generación de anticuerpos monoclonales anti-CD3, se ha desarrollado una segunda generación de anticuerpos. monoclonales anti-CD3 genéticamente modificados no solamente a través del injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de anticuerpos monoclonales anti-CD3 de murino en secuencias IgG humanas, sino también a través de la introducción de mutaciones que no se unen a FcR en el Fe (Colé et al. (1999) Transplantation 68: 563; Colé et al. (1997) J. Immunol . 159: 3613). La humanización de los anticuerpos monoclonales de murino dio como resultado la disminución de la inmunogenicidad y una vida útil del mAb mejorada (Id.) . Además, los mAb no de unión a FcR tienen un potencial reducido para inducir la liberación de la citocina y una toxicidad aguda in vivo (Chatenoud et al. (1989) N. Engl . J. Med. 320:1420). Sin embargo, la liberación de la citocina, aún a un nivel reducido, aún está limitada por la dosis y tóxica a dosis de fármaco muy bajas (microgramos/paciente) (Plevy et al., (2007) Gastroenterology 133 : 1414-1422) .
Existen varias dificultades para mejorar la terapia dirigida anti-CD3/TCR. Por ejemplo, el mecanismo de inmunosupresión mediado por anticuerpos monoclonales anti-CD3 es complejo y no está completamente entendido. Se cree que tales anticuerpos funcionan a través de cuatro mecanismos: recubrimiento de célula, depleción de célula, modulación descendente TCR y señalización celular, con los dos anteriores siendo los mecanismos principales (Chatenoud (2003) Nature Reviews : 123-132) . Además se cree que la inducción de la tormenta de citocinas y la activación de la célula T in vivo son requeridas para la eficacia de la terapia dirigida a CD3/TCR (Carpenter et al. (2000) J. Immunology 165:6205-13). Finalmente, la segunda generación de anticuerpos monoclonales anti-CD3 se reportan como estando "no activados" in vitro pero aún tienen inducida una tormenta de citocinas in vivo.
Un número de anticuerpos dirigidos anti-CD3 están actualmente siendo probados en la clínica para utilizarse en enfermedades autoinmunitarias , enfermedades inflamatorias, y paciente de trasplante. Esos anticuerpos incluyen ????3?1 (Ala-Ala) (Macrogenics) , visilizumab (Nuvion®, PDL) , TRX-4 (Tolerx) , y NI- 0401 (Novlmmune) . Sin embargo, los pacientes tratados con cada uno de estos anticuerpos han experimentado eventos adversos asociados con la liberación de citocinas (de moderado a severos) y algunas veces la reactivación viral por arriba de la típicamente observada en la población de pacientes .
Dados los efectos adversos asociados con la liberación de citocina relacionados con el anticuerpo de la célula T actual y otras terapias biológicas, existe una necesidad continua de terapias alternativas. La presente invención cumple todas las necesidades, y además proporciona otras ventajas relacionadas.
Breve Descripción de la Invención La presente descripción proporciona proteínas de fusión que se unen a un complejo TCR o a uno de sus componentes, composiciones y formas de dosificación unitarias que comprenden tales proteínas de fusión, polinucleótidos y vectores de expresión que codifican tales proteínas de fusión, métodos para reducir el rechazo de trasplantes de órganos sólidos o tratar enfermedades autoinmunitarias , y métodos para la detección de la activación de célula T.
En un aspecto, la presente descripción proporciona una proteína de fusión, que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, del término amino al término carboxi : (a) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, (b) un polipéptido enlazador, (c) un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina que comprende (i) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297; (ii) una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238; (iii) por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, o 331; (iv) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234-238; (v) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y por lo menos una sustitución o eliminación en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331; (vi) una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238, y por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331; o (vi) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238, y por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331, y (d) un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina, en donde la proteína de fusión no induce una tormenta de citocina o induce una liberación de citocina mínimamente detectable, y en donde los residuos de aminoácido en la región CH2 de inmunoglobulina se enumeran a través del sistema de enumeración de EU. Las proteínas de fusión adicionales son provistas de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 20 y se describen en la presente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende una proteína de fusión provista en la presente y un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una forma de dosificación unitaria que comprende la composición farmacéutica antes indicada.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión provista en la presente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión provista en la presente que está operablemente enlazada a una secuencia de control de expresión.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para reducir el rechazo de un trasplante de órgano sólido, que comprende administrar al receptor del trasplante de órgano sólido una cantidad efectiva de una proteína de fusión provista en la presente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, diabetes mellitus, asma y artritis), que comprende administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de una proteína de fusión provista en la presente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la liberación de citocina inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, que comprende: (a) células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes (por ejemplo, una proteína de fusión y un anticuerpo) , y (c) detectar la liberación de una citocina de las células T cebadas que han sido tratadas en el paso (b) .
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la activación de la célula T inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, que comprende: (a) proporcionar células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes (por ejemplo, una proteína de fusión y un anticuerpo) , y (c) detectar la activación de las células T cebadas que han sido tratadas en el paso (b) .
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra el porcentaje de células activadas que resultan del tratamiento de las células T humanas cebadas con PHA con varios anticuerpos y pequeños productos inmunofarmacéuticos modulares (SMIP™) . "No Rx" se refiere a no tratamiento, que se utiliza como un control negativo .
La Figura 2 muestra el porcentaje dé células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con varios anticuerpos y proteínas de fusión SMIP en un ensayo de reacción de linfocito mixto. "MLR" se refiere a la reacción de linfocito mixta sin ningún tratamiento adicional. "Solamente respondedor" se refiere a una reacción en donde solamente las células respondedoras estuvieron presentes. "IgG2a" se refiere a células respondedoras tratadas con 10 g/ml mAb IgG2a.
La Figura 3 muestra el porcentaje de células T activadas que resultan del tratamiento de células respondedoras con varios anticuerpos y proteínas de fusión SMIP en un ensayo de reacción de linfocito mixto. "MLR" se refiere a la reacción de linfocito mixta sin ningún tratamiento adicional. "Solamente respondedor" se refiere a una reacción en donde solamente las células respondedoras estuvieron presentes .
La Figura 4 muestra el porcentaje de células T activadas que resultan del tratamiento de células T de memoria con un anticuerpo monoclonal y varias proteínas de fusión SMIP. "Responder (No TT) " se refiere a una reacción. en la ausencia del toxoide de tétanos.
Las Figuras 5A y 5B son gráficas de punto del análisis FACS de TCR y CD3 en células T humanas teñidas (Figura 5A) inmediatamente después del aislamiento (día 0) o (Figura 5B) 4 días después del tratamiento con el anticuerpo monoclonal 0KT3 o varias proteínas de fusión 0KT3 SMIP.
Las Figuras 6A y 6B son gráficas de punto del análisis FACS de TCR y CD3 en células T humanas teñidas (Figura 6A) inmediatamente después del aislamiento (día 0) o (Figura 6B) 4 días después del tratamiento con 0KT3 IgGlAA o proteínas de fusión 0KT3 HM1 SMIP.
La Figura 7 muestra los cambios en la fluorescencia de un tinte indicador del flujo de calcio con el tiempo que resulta del tratamiento de células T humanas purificadas con anticuerpos monoclonales , combinaciones de anticuerpos, o varias proteínas de fusión 0KT3 SMIP.
Las Figuras 8A y 8B muestran (Figura 8A) IFNy o (Figura 8B) la liberación de IP-10 después de tratar células T de ratón cebadas con ConA con anticuerpos monoclonales (2C11 mAb y mAb H57) o proteínas de fusión^ SMIP (2C11 Null2 y H57 Null2) .
La Figura 9 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con varios anticuerpos o proteínas de fusión SMIP en un ensayo de reacción de linfocito mixto. "Solamente R" se refiere a una reacción que tiene solamente células respondedoras presentes; "solamente S" se refiere a una reacción que tiene solamente células estimuladoras presentes; y "R:S" se refiere a una reacción ambas células respondedoras y células estimuladoras presentes.
Las Figuras 10A y 10B muestran los cambios en (Figura 10A) los pesos corporales y (Figura 10B) la puntuación clínica con el tiempo después de administración intravenosa del anticuerpo (mAb H57) y la proteína de fusión H57 Null2 SMIP a varias concentraciones. PBS e IgG2a se utilizaron como controles negativos.
Las Figuras 11A y 11B muestran la concentración de (Figura 11A) IL-6 y (Figura 11B) IL-4 en suero 2 horas, 24 horas, 72 horas después de la administración intravenosa en ratones BALB/c normales de un anticuerpo anti-TCR (mAb H57) o varias concentraciones de una proteína de fusión anti-TCR (H57 Null2) . El anticuerpo IgG2a de ratón y PBS (diluyente) se utilizaron como controles negativos.
La Figura 12 muestra el porcentaje de células T encontradas en un bazo de ratón que se recubrió con H57 Null2 SMIP en los días 1 ó 3 después de la administración intravenosa de varias concentraciones de una proteína de fusión anti-TCR (H57 Null2) . PBS e IgG2a se utilizaron como controles negativos.
La Figura 13 muestra el porcentaje de cambio del peso corporal inicial de los ratones receptores durante 14 días después de la transferencia de células de donador en un modelo de Injerto Agudo contra Enfermedad Hospedera (aGVHD) . "Receptor Inexperto" indica ratones que no recibieron la transferencia de células de donador con un control negativo. El ratón receptor se trató con la proteína de fusión H57 Null2 SMIP, dexametasona (DEX) , o control (PBS o IgG2a) .
Las Figuras 14A a 14C muestran las concentraciones de suero de (Figura 14A) G-CSF, (Figura 14B) KC, o (Figura 14C) IFNy en el día 14, día 14, o día 7, respectivamente, después de la transferencia de células de donador.
La Figura 15 muestra la relación de linfocito de donador/hospedero en el día 14 después de la transferencia de las células de donador. "No transferencia de células" indica un ratón de control negativo que no recibió células de donador. PBS e IgG2a se utilizaron como tratamientos de control .
La Figura 16 muestra las alineaciones de secuencia entre las regiones CH2 de IgGl humano, IgG2 humano, IgG4 humano, e IGHG2c de ratón (SEC ID NOS: 64, 66, 68 y 73, respectivamente) . Las alineaciones se llevaron a cabo utilizando el método Clustal W con parámetros por omisión del programa MegAlign de DNASTAR 5.03 (DNASTAR Inc.). Las posiciones del aminoácido de la CH2 IgGl humano se basaron en la numeración de EU de acuerdo con Kabat (ver Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991) ) . Es decir, loa región variable de cadena pesada del IgGl humano se considera como siendo de 128 aminoácidos en longitud, por lo que el residuo de aminoácido más amino-terminal en la región constante del IgGl humano está en la posición 129. Las posiciones de aminoácido de otras regiones CH2 se indican con base en las posiciones de los residuos de aminoácido en IgGl humano con los cuales se alinea. Los residuos Asn en la posición 297 (N297) se subrayan y están en negrillas.
La Figura 17 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con ya sea un anticuerpo o una proteína de fusión SMIP en un ensayo de reacción de linfocito mixta (MLR) . "R" se refiere a una reacción en donde solamente las células respondedoras estuvieron presentes, "S" se refiere a una reacción sonde solamente están presentes las células estimuladoras, "R+S" se refiere a la reacción de linfocito mixta sin ningún tratamiento adicional, "muIgG2b" se refiere a células respondedoras tratadas con 10 µg/ml de IgG2b de ratón. "SMIP de control" es una proteína de fusión SMIP que tiene un dominio de unión scFv que no se une a las células T. Las células se ensayaron con Cris-7 IgGl N297A (SEC ID NO: 265) .
La Figura 18 muestra las gráficas de puntos de análisis FACS de TCR y CD3 en células T humanas teñidas inmediatamente después del aislamiento. Los dos paneles superiores mostraron células T humanas tratadas con el anticuerpo monoclonal Cris-7 y dos paneles inferiores mostraron el tratamiento con Cris-7 IgGl N297A (SEC ID NO: 265) . Los panales en la izquierda muestran las distribuciones celulares en el día de tratamiento (día 0) y los paneles en la derecha muestran las distribuciones celulares 2 días después del tratamiento (día 2) .
La Figura 19 muestra los cambios en la fluorescencia de un tinte indicador del flujo de calcio con el tiempo que resulta del tratamiento de células T con BC3 IgGl-N297A (SEC ID NO: 80, que tiene el Enlazador 87 como una bisagra entre los dominios scFv y CH2CH3) comparado con esta misma proteína de fusión que tiene el Enlazador 87 de bisagra intercambiado para otras abrazaderas de varias longitudes (en particular, los Enlazadores 115-120 y 122, que corresponden a SEC ID NOS:212-218, respectivamente).
La Figura 20 muestra el porcentaje de células T activadas que resultan del tratamiento de células respondedoras con ya sea un anticuerpo o una proteína de fusión SMIP en un ensayo MLR. "SMIP de control" se refiere a una proteína de fusión SMIP que tiene un dominio de unión scFv que no se une a las células T. "Solamente respondedor" se refiere a una reacción en donde solamente están presentes las células respondedoras . Los números entre corchetes son los números identificadores de la secuencia de las proteínas de fusión SMIP.
La Figura 21 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con las proteínas de fusión BC3 IgGl-N297A SMIP que contienen varios enlazadores de bisagra en un ensayo MLR.
La Figura 22 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con el anticuerpo monoclonal Cris7, las proteínas de fusión Cris7 SMIP quiméricas humanizadas, o una proteína de fusión BC3 SMIP quimérica (SEC ID NO:80), en un ensayo MLR. "SMIP de control" se refiere a una proteína de fusión SMIP que tiene un dominio de unión scFv que no se une a las células T y "solamente respondedor" se refiere a una reacción en donde solamente las células respondedoras estuvieron presentes. Los números en corchetes son números identificadores de secuencia de las proteínas de fusión SMIP.
La Figura 23 muestra el porcentaje de células T activadas que resultan del tratamiento de células respondedoras con Cris7 IgGl-N297, IgG2 -??-?297? e IgG4-AA-N297A humanizado, y HMl y las proteínas de fusión SMIP o Cris7 IgGl-N297A quimérica y proteínas de fusión HMl SMIP en un ensayo MLR. "mAb progenitor" se refiere a un rtiAb Cris7 y "SMIP de control" se refiere a una proteína de fusión SMIP que tiene un dominio de unión scFv que no se une a las células T.
La Figura 24 muestra el porcentaje de células T activadas después que las células T humanas cebadas con PHA se trataron con Cris7 (VH3-VL1) IgGl-N297A humanizado o proteínas de fusión Cris7 (VH3-VL2) IgGl-N297A SMIP humanizadas. "SMIP de control" es una proteína de fusión SMIP que se une a una no célula T.
Las Figuras 25A y 25B muestran la concentración de (Figura 25A) IFNy y (Figura 25B) IL-17 en suero 24 horas (día 1) y 72 horas (día 3) después de la re-estipulación de células T cebadas con PHA con varias proteínas de fusión Cris7 humanizadas quiméricas, la proteína de fusión SMIP, BC3 SMIP (SEC ID NO: 80), y varios anticuerpos (BC3 mAb, mAb Cris7 progenitor y Nuvion FL) . Los números en corchetes son los números identificadores de secuencia de las proteínas de fusión SMIP.
Las Figuras 26A a 26H muestran el nivel de (Figura 26A) IFNY, (Figura 26B) IL-10, (Figura 26C) IL-1B, (Figura 26D) IL-17, (Figura 26E) IL-4, (Figura 26F) TNF-a, (Figura 26G) IL-6, y (Figura 26H) IL-2 en PBMC primario tratado por 24 horas (di), 48 horas (d2) , o 72 horas (d3) con la proteína de fusión Cris7 (VH3-VL1) IgG4-AA-N297A SMIP humanizada, proteína de fusión Cris7 (VH3-VL2) IgG4-AA-N297A SMIP, o el mAb Cris7.
La Figura 27 muestra los cambios en los pesos corporales con el tiempo después de la administración intravenosa de mAb IgG2a (411 \ig) , mAb H57 (5 \ig) , la proteína de fusión H57 Null2 SMIP (300 vg) , la proteína de fusión SMIP media nula H57 (300 pg) , o la proteína de fusión H57 HM2 SMIP (300 g) .
La Figura 28 muestra la concentración de la célula T en sangre periférica 2 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2, H57 medio nulo, o H57 HM2 , como se dosifica en la Figura 27.
La Figura 29 muestra las concentraciones de célula T periférica 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2 , H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 30A a 30C muestran la concentración de IL-2 en suero (Figura 30A) 2 horas, (Figura 30B) 24 horas, y (Figura 30C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2, H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 31A a 31C muestran la concentración de IL-10 en suero (Figura 31A) 2 horas, (Figura 31B) 24 horas, y (Figura 31C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2 , H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 32A a 32C muestran la concentración de IP-10 en suero (Figura 32A) 2 horas, (Figura 32B) 24 horas, y (Figura 32C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2, H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 33A a 33C muestran la concentración de TNFa en suero (Figura 33A) 2 horas, (Figura 33B) 24 horas, y (Figura 33C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2 , H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 34A a 34C muestran la concentración de IL-4 en suero (Figura 34A) 2 horas, (Figura 34B) 24 horas, y (Figura 34C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2, H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 35A a 35C muestran la concentración de MCP-1 en suero (Figura 35A) 2 horas, (Figura 35B) 24 horas, y (Figura C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2, H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 36A a 36C muestran la concentración de KC en suero (Figura 36A) 2 horas, (Figura 36B) 24 horas, y (Figura 36C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2 , H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 37A a 37C muestran las concentraciones de IL-17 2 horas (Figura 37A) , 24 horas (Figura 37B) y 72 horas (Figura 37C) después de la administración intravenosa de IgG2a, mAb H57 y H57 Nulo2 , medio nulo y HM2 SMIP.
Las Figuras 38A a 38C muestran la concentración de IP-10 en suero (Figura 38A) 2 horas, (Figura 38B) 24 horas, y (Figura 38C) 72 horas después de la administración intravenosa de mAb IgG2a, mAb H57, H57 Nulo2 , H57 medio nulo, o H57 HM2 como se dosifica en la Figura 27.
Las Figuras 39A y 39B son gráficas de las concentraciones en suero medias contra el tiempo para H57-HM2 y H57 medio nulo. Los resultados se expresan como el grupo de datos observados y los valores pronosticados calculados a través del software in onLin™. El valor Rsq y los valores ajustados Rsq son los más eficaces para adaptar las estadísticas para la fase de eliminación terminal, antes y después de ajustar el número de putos utilizados en la estimación de HL_Lambda z (6.6 y 40.7 horas) .
La Figura 40 muestra la concentración de G-CSF en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 pg cada uno) .
La Figura 41 muestra la concentración de IFN-? en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 cada uno) .
La Figura 42 muestra la concentración de IL-2 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µg cada uno) .
La Figura 43 muestra la concentración de IL-5 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 ]ig cada uno) .
La Figura 44 muestra la concentración de IL-6 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 g cada uno) .
La Figura 45 muestra la concentración de IL-10 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µg cada uno) .
La Figura 46 muestra la concentración de IL-17 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µ9 cada uno) .
La Figura 47 muestra la concentración de IP-10 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µ9 cada uno) .
La Figura 48 muestra la concentración de KC 15 en suero minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µg cada uno) .
La Figura 49 muestra la concentración de MCP-1 en suero 15 minutos, 2 horas, 6 horas, 24 horas y 48 horas después de la administración intravenosa de H57-HM2 o H57 Nulo2 (200 µg cada uno) .
La Figura 50 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con H57 Nulo2 , H57 medio nulo, H57-HM2, mAb IgG2a de ratón, o mAb H57.
La Figura 51 muestra el porcentaje de células T activadas que resulta del tratamiento de células respondedoras con H57 Nulo2, H57 medio nulo, H57-HM2, o mAb H57 normalizado a (R+S) - sin tratamiento = 100%.
La Figura 52 muestra el porcentaje de células T cebadas con ConA activadas a través de los tratamientos de H57 Nulo2, H57 medio nulo, H57-HM2, mAb IgG2a de ratón, mAb H57, o 2C11 mAb.
Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona proteínas de fusión que contienen uno o más dominios de unión dirigidos contra el complejo TCR en la forma de pequeños productos inmunofarmacéuticos modulares (SMIP™) o en la forma de una molécula SMIP de una molécula SMIP con el dominio Fe y de unión en la orientación N-terminal a C-terminal inversa (PIMS) que induce un solo perfil de señalización de célula T. El perfil de señalización se caracteriza por una liberación de citocina pequeña, mínima o nominal (es decir, la ausencia de o una tormenta de citocinas mínimas) , la inducción de flujo de calcio, la fosforilación de las proteínas de señalización TCR sin la activación de las células T, o cualquier combinación de estos. Tal perfil de señalización no se replica utilizando anticuerpos monoclonales , lo que demuestra una identificación de la señalización inesperada causada por la unión de las proteínas SMIP o PIMS a sus objetivos. A la fecha, las moléculas de proteína dirigidas contra el complejo TCR ya sea inducen una fuerte señal de célula T (por ejemplo, tormenta de citocinas) junto con la activación de la célula T o tienen poco efecto sobre las células en la ausencia de entrelazamiento.
Además, esta descripción proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas de fusión, así como vectores y células hospederas para la producción recombinante de tales proteínas, y composiciones y métodos para utilizar las proteínas de fusión de esta descripción en varias aplicaciones terapéuticas, que incluyen el tratamiento así como la mejora de por lo menos un síntoma de una enfermedad o afección (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, un rechazo a trasplante de órgano) .
Antes de establecer esta descripción con mayor detalle, puede ser útil el entendimiento de la misma para proporcionar definiciones de ciertos términos a ser utilizados en la presente. Las definiciones adicionales se establecen a lo largo de esta descripción.
En la presente descripción, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción, o intervalo de enteros se entienden como incluyendo el valor de cualquier entero dentro del intervalo recitado y, cuando es apropiado, sus fracciones (tales como un décimo y un centésimo de un entero) , a menos que se indique lo contrario. También, cualquier intervalo de números recitado en la presente es referente a cualquier característica física, tales como subunidades, tamaño o espesor de polímero, se entienden incluyendo cualquier entero dentro del intervalo recitado, a menos que se indique lo contrario. Como se utiliza en la presente, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" significa ± 20% del intervalo, valor o estructura indicado a menos que indique lo contrario. Como se utiliza en la presente, los términos "incluye" y "comprende" se utilizan como sinónimos. SE debe entender que los términos "uno" y "una" como se utiliza en la presente se refiere "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de alternativo (por ejemplo, "o") deberá entenderse significando ya sea uno, ambos o cualquier combinación de éstos de las alternativas. Además, se debe entender que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de varias combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en la presente, se describen a través de la presente solicitud al mismo grado, como si cada compuesto o grupo de compuestos se representará individualmente. De esta forma, la selección de estructuras particulares o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente invención.
Los residuos de aminoácido en las regiones CH2 y CH3 de inmunoglobulina de la presente descripción se enumeran a través del sistema de enumeración EU a menos que se indique lo contrario (ver, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991) ) .
Una "pequeña proteína inmunofarmacéutica modular (SMIP™)" se refiere a una proteína de fusión de cadena individual que comprende de su término amino a carboxi : un dominio de unión que específicamente se une a una molécula objetivo, un polipéptido enlazador (por ejemplo, una bisagra de inmunoglobulina o uno de sus derivados) , un polipéptido CH2 de inmunoglobulina y un polipéptido CH3 de inmunoglobulina (ver, la Publicación de Patente de E. U. A. Nos. 2003/0133939, 2003/0118592, y 2005/0136049) .
Una "proteína PIMS" es una molécula SMIP inversa en donde el dominio de unión está dispuesto en el término carboxi de la proteína de fusión. Sus constructos y métodos para fabricar proteínas PIMS se describe en la Publicación PCT No. WO 2009/023386. En general, una molécula PIMS es un polipéptido de cadena individual que comprende, en la orientación amino-terminal a carboxi -terminal , un polipéptido de la región CH2 opcional un dominio CH3, un péptido enlazador (por ejemplo, una región de bisagra de inmunoglobulina ) , y un dominio de unión específico.
Como se utiliza en la presente, una proteína "consistente esencialmente de" varios dominios (por ejemplo, un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, un polipéptido enlazador, una región CH2 de inmunoglobulina, y una región <¾ de inmunoglobulina) si las otras porciones de la proteína (por ejemplo, aminoácidos en el término amino o carboxi o entre los dominios) , en combinación, contribuye a lo sumo en 20% (por ejemplo, a lo sumo 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%) de la longitud de la proteína y no afecta sustancialmente (es decir, no reduce la actividad en más de 50%, tal como más de 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o 5%) las actividades de la proteína, tales como la afinidad a un complejo TCR o a uno de sus componentes, la habilidad para no inducir (o inducir mínimamente detectable) la liberación de la citocina, la habilidad para inducir el flujo de calcio o la fosforilación de la molécula en la trayectoria de la señalización del receptor de la célula T, la habilidad de bloquear la respuesta de la célula T a un aloantígeno, la habilidad de bloquear la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno, y la modulación descendente del complejo TCR de la célula. En ciertas modalidades, una proteína de fusión consiste esencialmente de un domino de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, un polipéptido enlazador, un polipéptido de región CH2 de inmunoglobulina opcional, y un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina. Tales moléculas además pueden comprender aminoácidos de empalme en el término amino o carboxi de la proteína o entre dos diferentes dominios (por ejemplo, entre el dominio de unión y el polipéptido enlazador, entre el polipéptido enlazador y el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina, o entre el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina y el polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina) .
Los términos entendidos en la técnica de la tecnología del anticuerpo a cada uno se le da el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina expresamente de manera diferente en la presente. Los anticuerpos se sabe que tienen regiones variables, una región de bisagra y dominios constantes. La estructura y la función de la inmunoglobulina se revisa, por ejemplo, en Harlow et al., Eds . , Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) . Por ejemplo, los términos "VL" y "VH" se refieren a la región de unión variable de una cadena ligera y pesada del anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variables se forman de sub-regiones bien definidas, discretas conocidas como "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y regiones de estructura" (FR) . El término "CL" se refiere a una "región constante de cadena ligera de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena ligera" es decir, una región constante de una cadena pesada ligera del anticuerpo. El término "CH" se refiere a una "región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena pesada", que además es divisible, dependiendo del isotipo del anticuerpo en los dominios CHi, CH2, y CH3 (IgA, IgD, IgG) , o CHi, CH2/ H3, y CH4 (IgE, IgM) . Una porción de los dominios de región constante forman la región Fe (la región del "fragmento cristalizable" ) de un anticuerpo y es responsable de las funciones efectoras de una inmunoglobulina tal como ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo) , ADCP (fagocitosis celular dependiente del anticuerpo) , CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y la fijación del complemento, la unión a los receptores Fe (por ejemplo, CD16, CD32, FcRn) , una vida útil mayor in vivo con relación a un polipéptido que carece de una región Fe, la unión a la proteína A, y a la mejor a una transferencia de placenta (ver, Capón et al., Nature, 337:525 (1989)).
Además, los anticuerpos tienen una secuencia de bisagra que típicamente está situada entre la región Fab y Fe (pero a una sección inferior de la bisagra puede incluir una porción amino-terminal de la región Fe) . A manera de antecedente, una bisagra de inmunoglobulina actúa como un separador flexible para permitir que la porción Fab se mueva libremente en el espacio. En contraste con las regiones constantes, las bisagras son estructuralmente diversas, varían tanto en secuencia como longitud entre las clases de inmunoglobulina y aún entre las subclases. Por ejemplo, una región de bisagra IgGl humana es libremente flexible, que permite que los fragmentos Fab giren alrededor de sus ejes de simetría y se muevan dentro de una esfera centrada en el primero de dos puentes de disulfuro inter-cadena pesada. En comparación, una bisagra IgG2 humana es relativamente corta y contiene una hélice doble de poli-prolina rígida estabilizada por cuatro puentes de disulfuro inter-cadena pesada, que restringe la flexibilidad. Una bisagra IgG3 humana difiere de otras subclases a través de su única región de bisagra extendida (aproximadamente 4 veces tan larga como la bisagra IgGl), conteniendo 62 aminoácidos (incluyendo 21 prolinas y 11 cisteínas) , formando una hélice doble de poli-prolina inflexible y proporcionando mayor flexibilidad debido a que los fragmentos Fab están relativamente lejos del fragmento Fe. Una bisagra IgG4 humana es más corta que IgGl pero tiene la misma longitud que IgG2 , y su flexibilidad es intermedia entre la de IgGl e IgG2.
De acuerdo con los estudios cristalográficos, un dominio de bisagra IgG puede funcional y estructuralmente subdividirse en tres regiones: las regiones de bisagra superior, la central o media, y la inferior (Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992)). Las regiones de bisagra superiores ilustrativas incluyen EPKSCDKTHT (SEC ID NO: 359) como se encuentra en IgGl, ERKCCVE (SEC ID NO: 360) como se encuentra en IgG2 , ELKTPLGDTT HT (SEC ID NO: 361) o EPKSCDTPPP (SEC ID NO: 362) como se encuentra en IgG3 , y ESKYGPP (SEC ID NO: 363) como se encuentra en IgG4. Las regiones de bisagra media o central ilustrativas incluyen CPPCP (SEC ID NO: 364) como se encuentra en IgGl y IgG2 , CPRCP (SEC ID NO: 365) como se encuentra en IgG3 , y CPSCP (SEC ID NO: 366) como se encuentra en IgG4. Ya que los anticuerpos IgGl, IgG2, y IgG4 cada uno parece que tiene una sola bisagra superior y media, IgG3 tiene cuatro en tándem - una siendo ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEC ID NO: 367) y tres siendo EPKSCDTPPPCPRCP (SEC ID NO: 368) .
Los anticuerpos IgA y IgD parece que carecen de la región central de tipo IgG, e IgD parece que tiene dos regiones de bisagra superiores en tándem (ver, ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT (SEC ID NO: 369) y GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP (SEC ID NO: 370) . Las regiones de bisagra superiores de tipo silvestre ilustrativas encontradas en los anticuerpos IgAl e IgA2 son VPSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEC ID NO: 371) y VPPPPP (SEC ID NO: 372), respectivamente.
Los anticuerpos IgE e IgM, en contraste, en contraste, carecen una región de bisagra típica y más bien tienen un dominio CH2 con propiedades de tipo bisagra. Las secuencias de tipo bisagra supriores CH2 de tipo silvestre de IgE e IgM se establecen en SEC ID NO: 373 (VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTA STTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA) y SEC ID NO: 374 (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLIC QATGFSPRQIQVS LREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMF TCRVDHRGLTFQQNASSMCVP) , respectivamente.
Como se utiliza en la presente, una "región de bisagra" o una "bisagra" se refiere a (a) una región de bisagra de inmunoglobulina (formada de, por ejemplo, las regiones superior y central) o una de sus variantes funcionales, (b) una región inter-dominio de lectinas o una de sus variantes funcionales, o (c) un clúster de la región de tallo de la molécula de diferenciación (CD) o una de sus variantes funcionales.
Una región de bisagra de inmunoglobulina puede ser una región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre o una región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre alterada, o una región de bisagra de inmunoglobulina alterada .
Como se utiliza en la presente, una "región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre" se refiere a secuencias de aminoácido de bisagra superior y media de existencia natural interpuestas entre y conectándose a los dominios CHi y CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o interpuestas entre y conectándose con los dominios CHi y CH3 (para IgE y IgM) encontradas en la cadena pesada de un anticuerpo.
Una "región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre alterada" o "región de bisagra de inmunoglobulina alterada" se refiere a (a) una región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre con hasta 30% de cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% sustituciones o eliminaciones de aminoácido) , o (b) una porción de una región de bisagra de inraunoglobulina de tipo silvestre que tiene una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos) hasta aproximadamente 120 aminoácidos (preferiblemente teniendo una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos o aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 aminoácidos o aproximadamente 20 a aproximadamente 25 aminoácidos) , que tiene hasta aproximadamente 30% cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta aproximadamente 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, o 1% sustituciones o eliminaciones de aminoácido o sus combinaciones) , y tiene una región de bisagra central de IgG establecida en SEC ID NOS: 364, 365, o 366.
Una "secuencia de enlace del dominio variable" es una secuencia de aminoácido que conecta una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena ligera y proporciona una función separadora compatible con la interacción de dos sub-dominios de unión de tal forma que el polipéptido resultante retiene una afinidad de unión específica a la misma molécula objetivo con un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de cadena ligera y pesada. En ciertas modalidades, una bisagra útil para enlazar un dominio de unión a un polipéptido de la región CH2 o CH3 de inmunoglobulina puede utilizarse como una secuencia enlazadora del dominio variable.
Un "polipéptido enlazador" se refiere a una secuencia de aminoácido que une un dqminio de unión a un polipéptido de la región CH2 o CH3 de inmunoglobulina en una proteína de fusión. En ciertas modalidades, el polipéptido enlazador es una bisagra como se define en la presente. En ciertas modalidades, una secuencia de enlace del domino variable útil para conectar una región variable de cadena pesada a una región variable de cadena ligera puede utilizarse como un polipéptido enlazador.
En ciertas modalidades, puede haber uno o unos cuantos (por ejemplo, 2-8) residuos de aminoácido entre dos dominios de una proteína de fusión, tal como entre un dominio de unión y un polipéptido enlazador, entre un polipéptido enlazador y un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina, y entre un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina y un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina, tal como los residuos de aminoácidos que resultan del diseño del constructo de la proteína de fusión (por ejemplo, los residuo de aminoácido que resultan del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena individual) . Como se describe en la presente, tales residuos de aminoácido pueden ser referidos como "aminoácidos de empalme" o "residuos de aminoácido de empalme" .
"Derivado" como se utiliza en la presente se refiere a una versión química o biológicamente modificada del compuesto (por ejemplo, una proteína) que es estructuralmente similar a un compuesto progenitor y (actual o teóricamente) se deriva del compuesto progenitor.
Como se utiliz en la presente, "aminoácido" se refiere a un aminoácido natural (los de existencia natural) , un aminoácido natural sustituido, un aminoácido no natural, un aminoácido no natural sustituido, o sus combinaciones. Las designaciones para aminoácidos naturales se establecen en la presente ya sea como un código de una letra o tres letras estándar. Los aminoácidos polares naturales incluyen asparagina (Asp o N) y glutamina (Gln o Q) ; también como aminoácidos básicos tales como arginina (Arg o R) , lisina (Lys o K) , histidina (His o H) , y sus derivados; los aminoácidos ácidos tales como el ácido aspártico (Asp o D) y ácido glutámico (Glu o E) , y sus derivados. Los aminoácidos hidrófobos naturales incluyen triptófano (Trp o W) , fenilalanina (Phe o F) , isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , metionina (Met o ) , valina (Val o V) , y sus derivados; así como otros aminoácidos no polares tales como glicina (Gly o G) , alanina (Ala o A) , prolina (Pro o P) , y sus derivados. Los aminoácidos naturales de polaridad intermedia incluyen serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , tirosina (Tyr o Y) , cisteína (Cys o C) , y sus derivados. A menos que se especifique lo contrario, cualquier aminoácido descrito en la presente puede ser de configuración ya sea D- o L- .
Los aminoácidos pueden clasificarse de acuerdo con sus propiedades físicas y su contribución a la estructura proteica secundaria y terciaria. Una "sustitución conservadora" se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras ilustrativas son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, O 97/09433, pág. 10, publicada el 13 de marzo, 1997; Lehninger, Biochemistry, Segunda Edición; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8. En ciertas modalidades, una sustitución conservadora incluye una sustitución de leucina a serina.
Como se utiliza en la presente, a menos que se proporcione lo contrario, una posición de un residuo de aminoácido en la región constante de la cadena pesada IgGl humana se enumera asumiendo que la región variable del IgGl humano está compuesta de 128 residuos de aminoácido de acuerdo con la convención de la numeración de Kabat . La región constante enumerada de la cadena pesada IgGl humana después se utiliza como una referencia para la enumeración de los residuos de aminoácido en regiones constantes de otras cadenas pesadas de inmunoglobuli a . Una posición de un residuo de aminoácido de interés en una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina diferente de la cadena pesada IgGl humana es la posición del residuo de aminoácido en la cadena pesada IgGl humana con la cual el residuo de aminoácido de interés se alinea. Las alineaciones entre las regiones constantes de la cadena pesada IgGl humano y otras cadenas pesadas de inmunoglobulina pueden llevarse a cabo utilizando programas de software conocidos en la técnica, tales como el programa Megalign (DNASTAR Inc.) utilizando el método Clustal W con parámetros por omisión. Las alineaciones de secuencia ilustrativas se muestran en la Figura 16. De acuerdo con el sistema de enumeración descrito en la presente, aunque la región CH2 IgG2 humana tiene una eliminación de aminoácido cerca de su término amino comparado con otras regiones CH2 en la Figura 16, la posición "N" subrayada en CH2 IgG2 está aún en la posición 297, porque su residuo se alinea con "N" en la posición 297 en la CH2 IgGl humana .
Proteínas de Fusión Dirigidas Contra el Complejo TCR En un aspecto, la presente descripción proporciona una proteína de fusión de cadena individual en la forma de una proteína de fusión SMIP que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, de su término amino a su término carboxi : (a) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, (b) un polipéptido enlazador, (c) opcionalmente un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina , y (d) un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina. El polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina cuando está presente puede comprender (1) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297; (2) una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238; (3) por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, o 331; (4) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234-238; (5) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, o 331; (6) una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238, 253, 310, 318, 320, 322, o 331; O (7) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en las posiciones 234-238, 253, 310, 318, 320, 322, o 331. En modalidades preferidas, una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción comprenderá, consiste esencialmente de, o consiste de, de su término amino a su término carboxi: (a) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes; (b) un polipéptido enlazador; (c) un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina; y (d) un polipéptido de la región <¾ de inmunoglobulina, en donde el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina comprende (i) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234-238; (ii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, una sustitución en las posiciones 234, 235, y 237, y una eliminación en la posición 236; (iii) por lo menos una sustitución o eliminación de aminoácido en las posiciones 234-238, 253, 310, 318, 320, 322, o 331; (iv) una sustitución de aminoácido en las posiciones 234, 235, 237, 318, 320, y 322, y una eliminación en la posición 236; (v) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y por lo menos una sustitución o eliminación en las posiciones 234-238, 253, 310, 318, 320, 322, o 331; O (vi) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, una sustitución de aminoácido en las posiciones 234, 235, 237, 318, 320, y 322, y una eliminación en la posición 236. En cada una de estas modalidades preferidas, el aminoácido utilizado en la subestación es preferiblemente alanina o serina.
En modalidades preferidas adicionales, una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción comprenderá, consiste esencialmente de, o consiste de, de su término amino a su término carboxi : (a) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, (b) un polipéptido enlazador, y (c) un polipéptido de la región <¾ de inmunoglobuli a , en donde el polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina comprende una región <¾ del IgM humano y una región CH3 de IgG humano (preferiblemente IgGl) .
Las proteínas de fusión solamente inducirán la liberación de la citocina de manera indetectable , nominal, mínimamente o a un bajo nivel (por ejemplo, tormenta de citocina) o activarán las células T, y pueden adicionalmente ser capaces de una o más de las siguientes actividades: (1) inducir el flujo de calcio, (2) inducir la fosforilación de las moléculas en la trayectoria de señalización TCR, (3) bloquear la respuesta de la célula T a un aloantígeno, (4) bloquear la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno, y (5) regular de manera descendente el complejo TCR.
En una modalidad preferida, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 293, 294, 298, o 299. En modalidades preferidas relacionadas, la secuencia de bisagra en los aminoácidos 247 a 261 de SEC ID NOS : 293, 294, 298, y 299 está reemplazado con una secuencia de aminoácido de bisagra como se establece en SEC ID NOS: 379-434. En modalidades preferidas adicionales, el polipéptido de la región C¾2 de inmunoglobulina de SEC ID NOS: 293, 294, 298, y 299 además comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 318, 320, y 322 de acuerdo con la enumeración EU.
En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona una proteína de fusión de cadena individual en la forma de una proteína PIMS que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, de su término amino a su término carboxi : (a) opcionalmente un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina, (b) un polipéptido . de la región CH3 de inmunoglobulina, (c) un polipéptido enlazador, y (d) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes. El polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina cuando está presente puede comprender los mismos tipos de mutaciones que las proteínas de fusión SMIP provista en la presente. Además, las proteínas PIMS tendrán una o más de las actividades biológicas deseables que las que tienen una proteína de fusión SMIP, como se describe en la presente.
Dominios de Unión Como se describe en la presente, una proteína de fusión de la presente descripción comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes (tal como CD3 , TCRa, TCR , o cualquier combinación de éstos) .
Un "dominio de unión" o "región de unión" de acuerdo con la presente descripción puede ser, por ejemplo, cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido, o péptido que posee la habilidad específicamente reconocer y unirse a una molécula biológica (por ejemplo, un complejo TCR o uno de sus componentes) . Un dominio de unión incluye cualquier asociado de unión de existencia natural, sintético, semi -sintético o recombinantemente producido para una molécula biológica de interés. Por ejemplo, un dominio de unión pueden ser las regiones del dominio variable de la cadena ligera y pesada del anticuerpo, o las regiones del dominio variable de la cadena ligera o pesada pueden unirse juntas en una sola cadena y en cualquier orientación (por ejemplo, VL-VH o VH-VL) . Se sabe que una variedad de ensayos para identificar los dominios de unión de la presente descripción que específicamente se unen con un objetivo particular, incluyen tinción Western, ELISA, citometría de flujo, o análisis Biacore™ .
Un dominio e unión (o una de sus proteínas de fusión) , "específicamente se une" a una molécula objetivo si se une a o se asociado con una molécula objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de l/M) de, por ejemplo, más de o igual a aproximadamente 105 M"1. En ciertas modalidades, un dominio de unión (o una de sus proteínas de fusión) se une a un objetivo con un Ka mayor que o igual a aproximadamente 106 M"1, 107 "1, 108 M"1, 109 M"1, ÍO10 M"1, 1011 M"1, 1012 M"1, o 1013 M"1. Los dominios de unión de "alta afinidad" (o sus proteínas de fusión de cadena individual) se refiere a aquellos dominios de unión con un K3 de al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 1011 M"1, al menos 1012 NT1, al menos 1013 M"1, o mayor. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10~s M a 10~13 M, o menor). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas de fusión de acuerdo con la presente descripción puede fácilmente determinarse utilizando técnicas convencionales (ver, por ejemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci . 51:660; y Patentes de E. U. A. Nos. 5,283,173; 5,468,614, o el equivalente).
"Receptor de célula T" (TCR) es una molécula encontrada en la superficie de las células T las cuales, junto con CD3 , son generalmente responsables del reconocimiento de la unión de los antígenos a moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) . Consiste de un heterodímero enlazado a disulfuro de cadenas y ß altamente variables en la mayor parte de las células T. En otras células T, un receptor alternativo formado de cadenas variables ? y d se expresan. Cada cadena de TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina y posee un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región de transmembrana, y una cola corta citoplásmica en el extremo C-terminal (ver, Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5a Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al, Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 4a Ed. , Current Biology Publications , pl48, 149, y 172, 1999) . El TCR como se utiliza en la presente descripción puede formarse de varias especies de animales. Incluyendo humano, ratón, rata, u otros mamíferos .
"Proteína de fusión anti-TCR, SMIP, o anticuerpo" se refiere a una proteína de fusión, SMIP, o anticuerpo que específicamente se une a una molécula TCR o una de sus cadenas individuales (por ejemplo, la cadena TCRa, TCR , TCRy o TCR5) . En ciertas modalidades, una proteína de fusión anti -TCR, SMIP, o anticuerpo específicamente se une TCRa, un TCRß, o ambos.
"CD3" se conoce en la técnica como un complejo multiproteíco de seis cadenas (ver, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., pl72 y 178, 1999). En los mamíferos, el complejo comprende una cadena CD3y, una cadena CD35, dos cadenas CD3e, y un homodímero de las cadenas CD3 ? . Las cadenas CD3y, CD35, y CD3 son proteínas de superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de inmunog1obulina que contiene un solo dominio de inmunog1obulina . Las regiones de transmembrana de las cadenas CD3y, CD36, y CD3e están negativamente cargadas, lo que es característico y permite que estas cadenas se asocien con cadenas receptoras de célula T positivamente cargada. Las colas intracelulares de las cadenas CD3yy, CD35, y CD3e cada una contiene un solo motivo conservado conocido como un motivo de activación con base en tirosina del inmuno-receptor o ITAM, mientras cada cadena CD3 ? tiene tres. Sin desear estar unido en una teoría, se cree que las ITAM son importantes para la capacidad de la señalización de un complejo PCR. CD3 como se utiliza en la presente descripción puede ser de varias especies animales, que incluyen el humano, ratón, rata u otros mamíferos.
"Proteína de fusión anti-CD3, SMIP, o anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de fusión, SMIP, o anticuerpo que específicamente se une cadenas CD3 individuales (por ejemplo, cadena CD3y, cadena CD35, cadena CD3e) o a un complejo formado por dos o más cadenas CD3 individuales (por ejemplo, un complejo de más de una cadena CD3e, un complejo de una cadena CD3y y CD3 , un complejo de una cadena CD35 y CD3e) . En ciertas modalidades preferidas, una proteína de fusión anti-CD3, SMIP, o anticuerpos específicamente se une a CD3y, a CD35, a CD3s, o cualquier combinación de éstas, y más preferiblemente a CD3e.
"Complejo TCR" , como se utiliza en la presente, se refiere a un complejo formado por la asociación de CD3 con TCR. Por ejemplo, un complejo TCR puede componerse de una cadena CD3Y, una cadena CD35, dos cadenas CD38, o un homodímero de las cadenas CD3?, una cadena TCRa, y una cadena TCRß . Alternativamente, un complejo TCR puede componerse de una cadena CD3Y, una cadena CD35, dos cadenas 0?3e, un homodímero de cadenas CD3(, una cadena TCRy, y una cadena TCR5.
"Un componente del complejo TCR", como se utiliza en la presente, se refiere a una cadena TCR (es decir, TCRa, TCRP, TCRy o TCR5) , una cadena CD3 (es decir, CD3y, CD35, CD3 o CD3?) , o un complejo formado por dos o más cadenas TCR o cadenas CD3 (por ejemplo, un complejo de TCRa y TCRP, un complejo de TCRy y TCR5, un complejo de CD3e y CD35, un complejo de CD3y y CD3s, o un sub-complejo TCR de TCRa, TCR , CD3y, CD35, y dos cadenas CD3s) .
A manera de antecedente, el complejo TCR generalmente es responsable de iniciar la respuesta de la célula T a la unión del antígeno a la molécula MHC. Se cree que la unión de un ligando de péptido :MHC al TCR y un co-receptor (es decir, CD4 o CD8) pone en contacto el complejo TCR, el co-receptor, y la tirosina fósfatasa CD45. Esto permite que CD45 remueva los grupos fosfato inhibidores y por lo tanto active las proteínas cinasas Lck y Fyn. La activación de esas proteínas cinasas conducen a la fosforilación de ITAM en las cadenas CD3 ? , que a su vez convierten estas cadenas capaces de unirse a la tirosina cinasa citosólica ZAP-70. La posterior activación de la unión ZAP-70 a través de la fosforilación activa tres trayectorias de señalización, dos de las cuales se inician a través de la fosforilación y activación de PLC-?, que después divide el fosfatidilinositol (PIPs) en diacilglicerol (DAG) e inositol trisfosfato (IP3) . La activación de la proteína cinasa C a través de DAG conduce a la activación del factor de transcripción NFKB . El repentino aumento en el Ca2+ libre intracelular como resultado de la acción de IP3 activa una fosfatasa citoplásmica , calcinerio, que permite que el factor de transición NFAT (factor nuclear de células T activadas) se desplace del citoplasma al núcleo. La completa actividad de transcripción de NFAT también requiere un miembro de la familia AP-1 de los factores de transcripción; los dímeros de los miembros de las familias Fos y Jun de los reguladores de transcripción. Una tercera trayectoria de señalización iniciada por ZAP-70 activada es la activación de Ras y la posterior activación de la cascada de cinasa MAP . Esto culmina en la activación de Fos y por lo tanto de los factores de transcripción AP-1. Juntos, NFKB, NFAT, y AP-1 actúan en los cromosomas de la célula T, iniciando la nueva transcripción del gen que da como resultado la diferenciación, proliferación, y acciones efectoras de las células T. Ver, Janeway et al., pl78, 1999.
En ciertas modalidades, un dominio de unión de la presente descripción específicamente se une a una cadena CD3 individual (por ejemplo, CD3Y, CD35, o CD3e) o una combinación de dos o más cadenas CD3 individuales (por ejemplo, un complejo formado de CD3Y y CD3e o un complejo formado de CD35 y CD3e) . En ciertas modalidades, el dominio de unión específicamente se une a una cadena CD3 humana individual (por ejemplo, la cadena CD3y humana, la cadena CD35 humana, y la cadena CD3s humana) o una combinación de dos o más de las cadenas CD3 humanas individuales (por ejemplo, un complejo de CD3y humana y CD38 humana o un complejo de CD35 humana y CD3s humana) . En ciertas modalidades preferidas, los dominios de unión específicamente se unen a una cadena CD3 .
En ciertas otras modalidades, un dominio de unión de la presente descripción específicamente se une a TCRa, TCR , o un heterodímero formado de TCRa y TCR . En ciertas modalidades preferidas, un dominio de unión específicamente se une a uno o más de TCRa humano, TCR humano, o un heterodímero formado de TCRa humano y TCR humano .
En ciertas modalidades, un dominio de unión de la presente descripción se une a un complejo formado de una o más cadenas CD3 con una o más cadenas TCR, tal como un complejo formado por una cadena CD3Y, una cadena CD35, una cadena 0?3e, una cadena TCROÍ, o una cadena TCR , o cualquier combinación de éstos. En otras modalidades, un dominio de unión de la presente descripción se une a un complejo formado por una cadena CD3Y, una cadena CD35, dos cadenas CD3e, una cadena TCRa, y una cadena TCR . En modalidades preferidas adicionales, un dominio de unión de la presente descripción se une a complejo formado por una o más cadenas CD3 humanas, con una o más cadenas TCR humanas, tal complejo formado por una cadena CD3Y humana, una cadena CD35 humana, CD3e humano, una cadena TCRa humana, o una cadena TCR humana, o cualquier combinación de éstas. En ciertas modalidades, un dominio de unión de la presente descripción se une a un complejo formado por una cadena CD3Y, una cadena CD35 humana, dos cadenas CD3s humanas, una cadena TCRa humana, y una cadena TCR humana.
Los dominios de unión de esta descripción pueden generarse como se describe en la presente o a través de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Patentes de E. U. A. Nos. 6,291,161; 6,291,158) . Las fuentes de los dominios de unión incluyen secuencias de ácido nucleico del dominio variable del anticuerpo de varias especies (que pueden formatearse como anticuerpos, sFvs, scFvs o Fabs , tales como una colección de fago) , incluyendo de humano, camélido (de camellos, dromedarios, o llamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol . , 275:413), tiburón (Roux et al. (1998) Proc . Nat ' 1. Acad. Sci. (USA) 95:11804), peces (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics , 54:39), roedor, aves, u ovinos. Los anticuerpos CD3 ilustrativos de los cuales el dominio de unión de esta descripción pueden derivarse incluyen el anticuerpo monoclonal Cris-7 (Reinherz, E. L. et al. (eds. ) , Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986)), anticuerpo monoclonal BC3 (Anasetti et al. (1990) J. Exp . Med. 172:1691), OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) y sus derivados tales como OKT3 ala-ala (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest . 11:409), visilizumab (Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712), y el anticuerpo monoclonal 145-2C11 (Hirsch et al. (1988) J. Immunol . 140:3766). Un anticuerpo anti-TCR ilustrativo es el anticuerpo monoclonal H57 (Lavasani et al. (2007) Scandinavian Journal of Immunology 65:39-47) .
Una fuente alternativa del dominio de unión de esta descripción incluyen secuencias que codifican colecciones o secuencias de péptidos aleatorias que codifican una diversidad modificada de aminoácidos en las regiones de bucle de andamios no de anticuerpo alternativos, tales como dominios de fibrinógeno (ver, por ejemplo, Weisel et al. (1985) Science 230:1388) , dominios Kunitz (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 6,423,498) , dominios de lipocalina (ver, por ejemplo, WO 2006/095164) , dominios del grupo V (ver, por ejemplo, Solicitud de Publicación de E . U. A. No. 2007/0065431) , dominios de lectinas de tipo C (Zelensky and Gready (2005) FEBS J. 272:6179), mAb2 o Fcab™ (ver, por ejemplo, Solicitudes de Patente PCT Nos. WO 2007/098934; WO 2006/072620) , o similares. Por ejemplo, los dominios de unión de esta descripción pueden identificarse a través de la clasificación de la colección de fago Fab para fragmentos Fab que específicamente se unen a una cadena CD3 (ver, Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol . 23:344) .
Adicionalmente , las estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas utilizando una cadena CD3 como un inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, ratón HuMAb mouse®, ratón TC mouse™, ratón KM-mouse®, llamas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etc.) pueden utilizarse para desarrollar dominios de unión de esta descripción.
En algunas modalidades, un dominio de unión es un fragmento Fv de cadena individual (scFv) que comprende los dominios VH y VL específicos para un complejo TCR o uno de sus componentes. En modalidades preferidas, los dominios VH y VL son dominios VH y VL humanos o humanizados. Los dominios VH ilustrativos incluyen los dominios VH BC3 , OKT3 VH, H57 VH, y 2C11 VH como se establece en SEC ID NOS: 2, 6, 49 y 58, respectivamente. Los dominios VH ilustrativos adicionales incluyen los dominios VH Cris-7, tales como los establecidos en SEC ID NOS: 220, ' 243, 244, y 245. Los dominios VL ilustrativos son dóminos BC3 VL, 0KT3 VL, H57 VL/ y 2C11 VL como se establece en SEC ID NOS: 4, 8, 51 y 60, respectivamente. Los dominios VL ilustrativos adicionales incluyen los dominios VL Cris-7, tales como los establecidos en SEC ID NOS: 222, 241, y 242. En ciertas modalidades, el dominio de unión comprende o es una secuencia que es por lo menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99.5%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VL) (por ejemplo, SEC ID NO: 4, 8, 51, 60, 222, 241, ó 242) o a una región variable de cadena pesada (VH) (por ejemplo, SEC ID NO: 2, 6, 49, 58, 220, 243, 244, ó 245), o ambas de anticuerpos monoclonales o fragmentos o sus derivados que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, tal como CD3e, TCRa, TCRp, TCRy y TCR5 , o sus combinaciones.
"Identidad de secuencia" como se utiliza en la presente se refiere al porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia que son idénticos con los residuos de aminoácido en otra secuencia de polipéptido de referencia después de la alineación de las secuencies y la introducción de huecos si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentaje máxima, y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los valores de identidad de secuencia porcentaje pueden generarse utilizando el software NCBI BLAST2.0 como se define por Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, con los parámetros establecidos en valores por omisión.
En ciertas modalidades, una región VH del dominio de unión de la presente descripción puede derivarse de o basarse en un VH de un anticuerpo monoclonal conocido (por ejemplo, Cris-7, BC3 , 0KT3 , incluyendo sus derivados) y contiene una o más inserciones, una o más eliminaciones, una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadores o sustituciones de aminoácido no conservadoras) o una combinación de los cambios antes mencionados, cuando se comparan con VH del anticuerpo monoclonal conocido. La inserción (s) , eliminación (s) o sustitución (s) puede ser en cualquier lugar en la región VH, incluyendo el término amino o carboxi o ambos extremos de esta región, siempre que el dominio de unión contenga la región VH modificada y aún puede específicamente unirse a su objetivo con una afinidad similar al dominio de unión de tipo silvestre.
En ciertas modalidades, una región VL en un dominio de unión de la presente descripción se deriva o se basa en un VL de un anticuerpo monoclonal conocido (por ejemplo, Cris-7, BC3 , 0KT3 , incluyendo sus derivados) y contiene una o más inserciones, una o más eliminaciones, una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras) , o una combinación de los cambios antes observados, cuando se compara con el VL del anticuerpo monoclonal conocido. La inserción (s) , eliminación (s) o sustitución (s) puede ser en cualquier lugar en la región VL, incluyendo el término amino o carboxi o ambos entremos de esta región, siempre que un dominio de unión que contenga la región VL modificada aún puede específicamente unirse a su objetivo con una afinidad similar al dominio de unión de tipo silvestre.
Los dominios VH y VL pueden configurarse en cualquier orientación (es decir, de término amino al término carboxi, VH-VL o VL-VH) y pueden separarse a través de una secuencia de enlace de dominio variable. En ciertas modalidades, las secuencias de enlace de dominio variable incluyen las que pertenecen a la familia de GlySer, Gly2Ser (SEC ID NO: 339), Gly3Ser (SEC ID NO: 340), Gly4Ser (SEC ID NO: 341), y Gly5Ser (SEC ID NO: 342), incluyendo (Gly3Ser) ! (Gly4Ser) ! (SEC ID NO: 343), (Gly3Ser) 2 (Gly4Ser) i (SEC ID NO: 344), (Gly3Ser) 3 (Gly4Ser) i (SEC ID NO: 345), (Gly3Ser) 4 (Gly4Ser) ! (SEC ID NO: 346), (Gly3Ser) 5 (Gly4Ser) i (SEC ID NO : 347), (Gly3Ser) i (Gly4Ser) i (SEC ID NO: 348), (Gly3Ser) i (Gly4Ser)2 (SEC ID NO: 349), (Gly3Ser) i (Gly4Ser) 3 (SEC ID NO: 350), (Gly3Ser) ? (Gly4Ser) 4 (SEC ID NO : 351), (Gly3Ser) ! (Gly4Ser)5 (SEC ID NO : 352), (Gly3Ser) 3 (Gly4Ser) 3 (SEC ID NO: 353), (Gly3Ser) 4 (Gly4Ser) 4 (SEC ID NO : 354), (Gly3Ser) 5 (Gly4Ser) s (SEC ID NO : 355), o (Gly4Ser)2 (SEC ID NO : 356) , (Gly4Ser)3 (SEC ID NO: 145), (Gly4Ser) 4 (SEC ID NO: 357) , o (Gly4Ser) 5 (SEC ID NO: 358). En ciertas modalidades, la secuencia de enlace del dominio variable es GGGGSGGGGSGGGGSAQ (SEC ID NO : 98) . En modalidades preferidas, esos enlazadores con base en (GlyxSer) se utilizan para enlazar varios dominios y no se utilizan para enlazar un dominio de unión (por ejemplo, scFv) a una cola Fe (por ejemplo, un IgG CH2CH3) . En ciertas modalidades, la secuencia de unión del dominio variable comprende de 5 a aproximadamente 35 aminoácidos y preferiblemente comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos.
Cualquiera de las inserciones, eliminaciones o sustituciones en el término amino o carboxi de un dominio o región particular, como se describe en la presente, puede ser un resultado, por ejemplo, de cómo una región variable se modifica para enlazarse a otra región variable (por ejemplo, cambios de aminoácido en los empalmes entre la región VH y una VL, o entre una región VL y una VH) o cómo un dominio de unión se modifica para enlazarse a una región constante (por ejemplo, los cambios de aminoácido en el empalme entre un dominio de unión y enlazador de bisagra) . Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, 2-8) aminoácidos pueden adicionarse, eliminarse o sustituirse en uno o más de los empalmes de la proteína de fusión, como se describen con mayor detalle a continuación .
Los dominios de unión ilustrativos de la presente descripción incluyen los establecidos en SEC ID NOS: 18, 20, 48, 62, y 258-264. En ciertas modalidades preferidas, una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción comprende un dominio de unión que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en cualquiera de SEC ID NOS: 258-264.
Polipéptido Enlazador Como se describe en la presente, las proteínas de fusión de la presente descripción comprenden un polipéptido enlazador que se une al dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o uno de sus componentes ya sea a una región CH2 de inmunoglobulina o una región CH3 de inmunoglobulina . Además de proveer la función separadora entre el dominio de unión y el resto de la proteína de fusión, un enlazador puede proporcionar flexibilidad o rigidez adecuada para apropiadamente orientar el dominio de unión de la proteína de fusión para interactuar con su objetivo (es decir, un complejo TCR o a uno de sus componentes, tal como CD3). Además, un enlazador puede soportar la expresión de una proteína de fusión de longitud completa y proporcionar estabilidad a una proteína purificada tanto in Vitro como in vivo después de la administración a un sujeto en la necesidad del mismo, tal como un humano, y es preferiblemente no inmunogénica o pobremente inmunogénica en tal sujeto.
Los enlazadores contemplados en esta descripción incluyen, por ejemplo, péptidos derivados de una región de inter-domino de un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina, una región inter-dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una región de bisagra de anticuerpo) , o una región de tallo de lectinas de tipo C, una familia de proteínas de membrana de tipo II (ver, por ejemplo, las secuencias de la región de tallo de lectinas ilustrativas establecidas en la Solicitud de Publicación de Patente PCT No. O 2007/146968, tal como SEC ID NOS : ni, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 , 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287 , 289, 297, 305, 307, 309- 311, 313-331, 346, 373 1-377, 380, o 381 de esa publicación, que se incorpora aquí por referencia) , y un clúster de la región de tallo de la molécula de diferenciación.
Un enlazador adecuado para utilizarse en las proteínas de fusión de esta descripción incluye una región de bisagra de anticuerpo seleccionada de la bisagra IgG, bisagra IgA, bisagra IgD, IgE CH2, I M CH2, o sus fragmentos o sus variantes. En ciertas modalidades preferidas, un enlazador puede ser una región de bisagra del anticuerpo seleccionada de IgGl humano, IgG2 humano, IgG3 humano, IgG4 humano, o sus fragmentos o variantes.
En algunas modalidades, el enlazador es una región de bisagra de i munoglob lina de tipo silvestre, tal como la región de bisagra de inmunoglobulina humana de tipo silvestre. Los enlazadores ilustrativos son una región de bisagra IgGl humana de tipo silvestre y una región de bisagra IGHG2c de ratón de tipo silvestre, la secuencia de la cual se establece en SEC ID NOS: 63 y 72, respectivamente.
En ciertas modalidades, uno o más residuos de aminoácido pueden adicionarse al término amino o carboxi de la región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre como parte de un diseño de constructo de la proteína de fusión. Los enlazadores modificadores representativos pueden tener residuos de aminoácido de empalme adicionales en el término amino tal como "RT" (por ejemplo, mostrado en SEC ID NOS: 100 y 52), "RSS" (por ejemplo, mostrado en SEC ID NOS: 328 y 331-338), "TG" (por ejemplo, mostrado en SEC ID NO: 177) , o "?" (por ejemplo, mostrado en SEC ID NO: 300) ; en el término carboxi, tal como "SG" (por ejemplo, mostrado en SEC ID NOS: 212 y 213); o una eliminación combinada con una adición, tal como ?? con "SG" adicionado en término carboxi (por ejemplo, mostrado en SEC ID NO: 212) .
En modalidades preferidas, un enlazador es una región de bisagra de inmunoglobulina mutada, tal como una región de bisagra de inmunoglobulina IgG mutada. Por ejemplo, una región de bisagra IgGl humana de tipo silvestre contiene tres residuos de cisteína: La cisteína más amino-terminal es referida como la primera cisteína, mientras la cisteína más carboxi -termina de la región de bisagra es referida como la tercera cisteína. En ciertas modalidades, un enlazador es una región de bisagra IgGl humana mutada con solamente dos residuos de cisteína, tal como una región de bisagra IgGl humana con la primera cisteína sustituida por una serina. En ciertas otras modalidades, un enlazador es una región de bisagra IgGl humana mutada con solamente un residuo de cisteína, tal como la primera, segunda o tercera cisteína. En ciertas modalidades, la primera prolina carboxi -terminal a la tercera cisteína en una región de bisagra IgGl humana está sustituida, por ejemplo, por una serina. Las regiones de bisagra IgGl humanas mutadas ilustrativas que pueden utilizarse como polipéptido enlazador entre un dominio de unión y el resto de la proteína de fusión se enumeran en el listado de secuencia tales como los enlazadores 47-49, 51, y 53-60 (SEC ID NOS: 99, 146-148 y 150-157, respectivamente) . En ciertas modalidades, uno o más residuos de aminoácido pueden adicionarse en el término amino o carboxi de una región de bisagra de inmunoglobulina mutada como parte de un diseño del constructo de la proteína de fusión. Los ejemplos de tales enlazadores modificados se establecen en SEC ID NOS : 10, 335 y 300, en donde los residuos de aminoácido "RT" , "RSS" , o "T" , respectivamente, se adicionan al término amino de la región de bisagra IgGl humana mutada.
En ciertas modalidades, un enlazador puede tener uno o más residuos de cisteína pero tiene un solo residuo de cisteína para la formación de un enlace de sulfuro inter-cadena tales como la segunda y la tercera cisteína de IgGl. En otras modalidades, un enlazador puede tener más de dos residuos de cisteína pero tiene dos residuos de cisteína para la formación de los enlaces de disulfuro inter-cadena .
En ciertas modalidades, los polipéptido enlazadores de la presente descripción se derivan de la región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre (por ejemplo, una región de bisagra IgGl) y contienen una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, o 4) inserciones, una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, o 4) eliminación, una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, o 4) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservadoras o sustituciones de aminoácido no conservadoras) , o una combinación de las mutaciones antes mencionadas, cuando se comparan con la región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre siempre que la bisagra modificada retenga la flexibilidad o la rigidez adecuada para orientar apropiadamente el dominio de unión de una proteína de fusión para interactuar con su objetivo. La inserción (s) , eliminación (s) o sustitución (s) puede ser en cualquier lugar en la región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre, incluyendo el término amino o carboxi o ambos extremos. En ciertas modalidades, un polipéptido enlazador comprende o es una secuencia que es por lo menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a una región de bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre, tal como una bisagra IgGl humana de tipo silvestre, una bisagra IgG2 humana de tipo silvestre, o una bisagra IgG4 humana de tipo silvestre.
Las secuencias de bisagra o enlazadores alternativas pueden diseñarse de porciones de los receptores de superficie celular que conectan los dominios de tipo IgV o IgC. Las regiones entre los dominios de tipo IgV en donde el receptor de la superficie celular contiene múltiples dominios de tipo IgV en tándem y entre dominios de tipo IgC en donde un receptor de superficie celular contiene múltiples regiones de tipo IgC en tándem también podrían utilizarse como una región de conexión o péptido enlazador. Las secuencias de bisagra o enlazadoras representativas de las regiones inter-dominio entre los dominios de tipo IgV y de tipo IgC o entre los dominios de tipo IgC o IgV se encuentran en CD2 , CD4 , CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD96, CD150, CD166, y CD244. Más bisagras alternativas pueden diseñarse de regiones que contienen disulfuro de receptores de tipo II de miembros de la superfamilia no de inmunoglobulina, tales como CD69, CD72, y CD161. En ciertas modalidades, las secuencias de bisagra o enlazadoras tienen de 2 a 150 aminoácidos, de 5 a 60 aminoácidos, de 2 a 40 aminoácidos, preferiblemente tienen 8-20, más preferiblemente 12-15 aminoácidos, y pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas o pueden contener principalmente una estructura helicoidal con una estructura de lámina ß mínima. Preferiblemente, las secuencias de bisagra y enlazadoras son estables en plasma y suero y son resistentes a la división proteolítica . En ciertas modalidades, la primera lisina en la región de bisagra superior IgGl se muta para minimizar la división proteolítica, preferiblemente la lisina está sustituida con metionina, treonina, alanina o glicina, o está eliminada (ver, por ejemplo, SEC ID NOS: 379-434, que puede incluir aminoácidos de empalme en el extremo amino, preferiblemente RT) . En algunas modalidades, las secuencias pueden contener un motivo de existencia natural o adicionado tal como el CPPC de estructura central (SEC ID NO: 330) que confiere la capacidad de formar un enlace de disulfuro o múltiples enlaces de disulfuro para estabilizar el término carboxi de una molécula. En otras modalidades, las secuencias pueden contener uno o más sitios de glicosilación . Una característica inesperada de la alteración de la longitud de la bisagra es permitir la modulación del nivel del flujo de calcio causado por proteínas de fusión de cadena individual de la presente descripción (ver, Ejemplo 5) . Las bisagras ilustrativas para modular el flujo de calcio incluyen SEC ID NOS: 212-218. Además, la longitud de la bisagra y/o la secuencia también pueden afectar las actividades de las proteínas de fusión en el bloqueo de la respuesta de la célula T a el aloantígeno (ver, Ejemplo 19. Los enlazadores útiles como regiones de conexión en las proteínas de fusión de esta descripción se establecen en SEC ID NOS: 379-434.
Polipéptido de la Región Cgg de Inmunoglobulina Como se describe en la presente, la proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una región CH2 de inmunoglobulina que comprende una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 (por ejemplo, asparagina a alanina) . Tal sustitución de aminoácido reduce o elimina la glicosilación en el sitio e invalida la unión de Fe eficiente a FcvR y Clq.
En ciertas modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una región CH2 de inmunoglobulina que comprende al menos una sustitución o eliminación en las posiciones 234 a 238. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulina puede comprender una sustitución en la posición 234, 235, 236, 237 ó 238, las posiciones 234 y 235, las posiciones 234 y 236, las posiciones 234 y 237, las posiciones 234 y 238, las posiciones 234-236, las posiciones 234, 235 y 237, las posiciones 234, 236 y 238, las posiciones 234, 235, 237, y 238, las posiciones 236-238, o cualquier otra combinación de dos, tres, cuatro, o cinco aminoácidos en las posiciones 234-238. Además o alternativamente, una región CH2 mutada puede comprender una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) eliminaciones de aminoácido en las posiciones 234-238, preferiblemente en una de las posiciones 236 o la posición 237 mientras la otra posición está sustituida. La mutación (s) antes observada disminuye o elimina la actividad de la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) o la capacidad de unión del receptor Fe a la proteína de fusión. En ciertas modalidades preferidas, los residuos de aminoácido en una o más de posiciones 234-238 han sido reemplazados con uno o más residuos de alanina'. En modalidades adicionales preferidas, solamente uno de los residuos de aminoácido en las posiciones 234-238 ha sido eliminado mientras uno o más de los aminoácidos restantes en las posiciones 234-238 puede sustituirse con otro aminoácido (por ejemplo, alanina o serina) .
En ciertas otras modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una región CH2 de inmunoglobulina que comprende una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, y 331. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulina puede comprender una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331, las posiciones 318 y 320, las posiciones 318 y 322, las posiciones 318, 320 y 322, o cualquiera de una combinación de dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, y 331. La mutación(s) antes observada disminuye o elimina la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la proteína de fusión.
En ciertas otras modalidades, además de la sustitución de aminoácido en la posición 297, una región CH2 mutada en una proteína de fusión de la presente descripción además puede comprender una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, o cinco) sustituciones adicionales en las posiciones 234-238. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulina puede comprender una sustitución en las posiciones 234 y 297, las posiciones 234, 235, y 297, las posiciones 234, 236 y 297, las posiciones 234-236 y 297, las posiciones 234, 235, 237 y 297, las posiciones 234, 236, 238 y 297, las posiciones 234, 235, 237, 238 y 297, las posiciones 236-238 y 297, o cualquier combinación de dos, tres, cuatro, o cinco aminoácidos en las posiciones 234-238 además de la posición 297. Además o alternativamente, una región CH2 mutada puede comprender una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) eliminaciones de aminoácidos en las posiciones 234-238, tal como en la posición 236 o la posición 237. La mutación (s) adicional disminuye o elimina la actividad de la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) de la capacidad de unión del receptor Fe de la proteína de fusión. En ciertas modalidades, los residuos de aminoácido en una o más of positions 234-238 han sido reemplazadas con uno o más residuos de alanina. En modalidades adicionales, solamente uno de los residuos de aminoácido en las posiciones 234-238 ha sido eliminado mientras uno o más de los aminoácidos restantes en las posiciones 234-238 puede sustituirse con otro aminoácido (por ejemplo, preferiblemente alanina o serina) .
En ciertas modalidades, además de una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, o 5) sustituciones de aminoácido en las posiciones 234-238, la región CH2 mutada en una proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o 6) sustituciones de aminoácido adicionales (por ejemplo, sustituidas con alanina) en una o más positions involucradas en la fijación del complemento (por ejemplo, en las posiciones 1253, H310, E318, K320, K322, o P331) . Las regiones CH2 de inmunoglobulina mutadas preferidas incluyen las regiones C2 de IgGl, IgG2', IgG4 humano e IgG2a de ratón, con sustituciones de alanina en las posiciones 234, 235, 237 (si están presentes), 318, 320 y 322. Una región CH2 de inmunoglobulina mutada ilustrativa es la región CH2 IGHG2c de ratón con sustituciones de alanina en L234, L235, G237, E318, K320, y K322 (SEC ID NO: 50) .
En modalidades adicionales, además de la sustitución de aminoácido en la posición 297 y la eliminación (s) o sustitución (s) adicional en las posiciones 234-238, una región CH2 mutada en una proteína de fusión de la presente descripción además puede comprender una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) sustituciones adicionales en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322, y 331. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulina puede comprender una (1) sustitución en la posición 297, (2) una o más sustituciones o eliminaciones o sus combinaciones en las posiciones 234-238, y una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o 6) sustituciones de aminoácido en las posiciones 1253, H310, E318, K320, K322, y P331, de tal forma que una, dos, tres sustituciones en las posiciones E318, K320 y K322. Preferiblemente, los aminoácidos en las posiciones antes observadas están sustituidos por alanina o serina.
En ciertas modalidades, el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina comprende (i) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una sustitución de aminoácido en la posición 234, 235, 236 ó 237; (ii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácido en las dos posiciones 234-237; (iii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácido en tres posiciones 234-237; (iv) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, sustituciones de aminoácido en las posiciones 234, 235 y 237, y una eliminación de aminoácido en la posición 236; (v) sustituciones de aminoácido en tres de las posiciones 234-237 y sustituciones de aminoácido en las posiciones 318, 320 y 322; o (vi) sustituciones de aminoácido en tres de las posiciones 234-237, una eliminación de aminoácido en la posición 236, y sustituciones de aminoácido en las posiciones 318, 320 y 322.
Las regiones CH2 de inmunoglobulina mutadas ilustrativas con sustituciones de aminoácido en la asparagina de la posición 297 en las proteínas de fusión de la presente descripción incluyen: la región CH2 IgGl humana con sustituciones de alanina en L234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 (SEC ID NO: 103) , la región CH2 IgG2 humana con sustituciones de alanina en V234, G236, y N297 (SEC ID NO: 104) , la región CH2 IgG4 humano con sustituciones de alanina en F234, L235, G237 y N297 y una eliminación de G236 (SEC ID NO: 75), la región CH2 IgG4 humano con sustituciones de alanina en F234 y N297 (SEC ID NO: 375) , la región CH2 IgG4 humano con sustituciones de alanina en L235 y N297 (SEC ID NO: 376) , la región CH2 IgG4 humano con sustituciones de alanina en G236 y N297 (SEC ID NO: 377), y la región CH2 IgG4 humano con sustituciones de alanina en G237 y N297 (SEC ID NO: 378) .
En ciertas modalidades, la adición de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente, una región CH2 mutada en una proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más sustituciones de aminoácido adicionales en una o más posiciones de las posiciones antes observadas. Tales sustituciones de aminoácido pueden ser sustituciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras. Por ejemplo, en ciertas modalidades, P233 puede puede cambiarse a E233 en una región CH2 IgG2 mutada (ver, por ejemplo, SEC ID NO: 104) . Además o alternativamente, en ciertas modalidades, la región CH2 mutada en una proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más inserciones, eliminaciones o ambas de aminoácido. La inserción (s) , eliminación ( s) o sustitució (s) puede ser en cualquier lugar en una región CH2 de inmunoglobulina, tal como en el N-terminal o C-terminal de una región Ctí2 de inmunoglobulina de tipo silvestre que resulta del enlace de la región CH2 con otra región (por ejemplo, una región variable) a través de un enlazador.
En ciertas modalidades, la región CH2 mutada in una proteína de fusión de la presente descripción comprende o es una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a una región CH2 de inmunoglobulina de tipo silvestre, tal como la región CH2 de IgGl, IgG2 , o IgG4 humano de tipo silvestre, o IgG2a de ratón (por ejemplo, IGHG2c) .
Una región CH2 de inmunoglobulina mutada en una proteína de fusión de la presente descripción puede derivarse de una región ¾2 de varios isotipos de inmunoglobulina, tales como IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl , IgA2 , e IgD, de varias especies (incluyendo, humano, ratón, rata, y otros mamíferos) . En ciertas modalidades preferidas, una región CH2 de inmunoglobulina mutada en una proteína de fusión de la presente descripción puede derivarse de una región CH2 de IgGl, IgG2 o IgG4 humano, o IgG2a de ratón (por ejemplo, IGHG2c) , cuyas secuencias se establecen en SEC ID NOS: 64, 66, 68 y 73.
Se conocen métodos en la técnica para hacer mutaciones dentro y fuera de un dominio Fe que pueden alterar las interacciones Fe con los receptores Fe (CD16, CD32, CD64, CD89, FceRl, FcRn) o con el componente complemento Clq (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,624,821; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol . 3:237).
En ciertas modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción no comprende ninguna región CH2 de inmunoglobulina .
Polipéptido de la Región CH3 de Inmunoglobulina Como se describe en la presente, una proteína de fusión de la presente descripción comprende uno o más polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina. En ciertas modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción no contiene ninguna región CH2 · En tales modalidades, el dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes está directamente enlazado a una región CH3 de inmunoglobulina a través de un polipéptido enlazador (por ejemplo, bisagra) . En ciertas modalidades en donde la región CH2 está ausente, una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender solamente una región H3. Las modalidades alternativas incluyen una proteína de fusión de la presente descripción que comprende dos regiones CH3 y ninguna región CH2 · En las modalidades en donde la proteína de fusión comprende tanto una región CH2 de inmunoglobulina mutada como una región CH3 de inmunoglobulina, las regiones CH2 y CH3 pueden derivarse de la misma o diferentes inmunoglobulinas , isotipos de anticuerpo, o variantes alélicas.
Preferiblemente, la región CH2 está directamente enlazada al término de la región CH3 · Las secuencias ilustrativas que comprenden una región CH2 directamente enlaza al término amino de la región CH3 se establecen en SEC ID NOS: 11-14 y 101. Alternativamente, la región CH2 puede enlazarse a la región CH3 a través de uno o más aminoácidos o a través de un enlazador (ver, por ejemplo, los enlazadores establecidos en el listado de secuencias) .
En ciertas modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender dos regiones CH3 de inmunoglobulina . Estas regiones CH3 puede ser regiones CH3 de tipo silvestre o mutadas de los mismos isotipos de inmunoglobulina o pueden ser de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una proteína de fusión comprende una región CH3 de IgM humano o una región CH3 de IgGl humano. Las secuencias ilustrativas en donde una región CH3 del IgM humano y una región CH3 del IgGl humano están enlazadas juntas incluyen SEC ID NOS: 15 y 74. En ciertas otras modalidades, una proteína de fusión comprende una región CH3u de ratón y una región (¾3? de ratón. Las secuencias ilustrativas en donde una región 0?3µ de ratón y una región CH3r de ratón están enlazadas juntas incluyen SEC ID NOS : 308 y 309.
En las modalidades en donde la proteína de fusión comprende dos regiones <¾ de inmunoglobulina, una región <¾ localizada en el amino-terminal en la otra región CH3 es referida como "la primera región (¾" . La otra región CH3 es referida como "la segunda región <¾" . En tales modalidades, las dos regiones CH3 de inmunoglobulina pueden fusionarse directamente entre sí. En otras palabras, el C-terminal de la primera región CH3 está directamente enlazado al término amino de la segunda región CH3 sin ningún residuo de aminoácido de intervención entre ellos (es decir, la ausencia de un enlazador) . Alternativamente, las dos regiones CH3 pueden enlazarse a través de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 2-8) o a través de un enlazador (ver, por ejemplo, los enlazadores establecidos en el listado de secuencias) .
En ciertas modalidades, una región (¾ de inmunoglobulina en la proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más sustituciones de aminoácido adicionales (por ejemplo, 2-8) . Tales sustituciones de aminoácido pueden ser conservadoras o no conservadoras. Además o alternativamente, en ciertas modalidades, las región CH3 en la proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más inserciones, eliminaciones o ambos de residuos de aminoácidos (por ejemplo, 2-8) en diferentes posiciones. La inserción (s ) , eliminación (s) o sustitución (s) puede estar en cualquier lugar en la región CH3 de inmunoglobulina, que incluye el carboxi o amino terminal o ambos .
En ciertas modalidades, la región CH3 de inmunoglobulina en la proteína de fusión de la presente descripción comprende o es una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a una región CH3 de inmunoglobulina de tipo silvestre, tal como la región CH3 de Ig , IgGl, IgG2, o IgG4 humano de tipo silvestre.
En ciertas modalidades, un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina es un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina de tipo silvestre, que incluye una región CH3 de tipo silvestre de cualquiera de los varios isotipos de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgD, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgE, o IgM) de varias especies (es decir, de humano, ratón, rata u otros mamíferos) . Por ejemplo, la región CH3 de inmunoglobulina puede ser una región CH3 IgGl humana de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 65), una región CH3 IgG2 humana de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 67), una región CH3 IgG4 humana de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 69), una región CH3 IgM humana de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 71), una región ¾3? de ratón (por ejemplo, SEC ID NO: 329) o una región CH3 IGHG2C de ratón de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 54) . En modalidades adicionales, un polipéptido de la región CH3 de inmunoglob lina es un polipéptido de la región (¾ de inmunoglobulina mutado. Las mutaciones en la región CH3 de inmunoglobulina pueden estar en una o más posiciones que están involucradas en la fijación del complemento, tal como H433 o N434.
Secuencias y Modificaciones Adicionales Como se describe en la presente, una proteína de fusión de cadena individual de la presente descripción puede comprender del término amino al término carboxi : (a) un dominio de unión que específicamente se une a CD3 (tal como CD3e), (b) un polipéptido enlazador, (c) opcionalmente un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina, y (d) un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina. Además, una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender una o más regiones adicionales, tal como la secuencia líder en su término amino para la expresión de la proteína de fusión, una sub-región Fe adicional (por ejemplo, una región CH4 de tipo silvestre o mutada de la región IgM o IgE) , o una secuencia de cola en su término carboxi para propósitos de identificación o purificación. La secuencia de cola ilustrativa puede incluir etiquetas de epítopo para la detección o purificación, tal como la región de 6-histidina o una epítopo FLAG.
Por ejemplo, la proteína de fusión puede tener residuos de aminoácido adicionales que surgen del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte de un producto de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina adicional en la posición 1 después de la división del componente GST del polipéptido deseado. Las variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de vector también están contempladas, incluyendo los cuales en donde las etiquetas de histidina se incorporan en la secuencia de aminoácido, generalmente en el término carboxi y/o término amino de la secuencia. Una secuencia adicional ilustrativa que puede estar presente en el término carboxi o amino de una proteína de fusión comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI, y seis histidinas como se establece en SEC ID NO: 70.
En ciertas modalidades, la proteína de fusión de la presente descripción comprende un péptido líder en su N-terminal. El péptido líder facilita la secreción de las proteínas de fusión expresadas. El uso de cualquiera de los péptidos líderes convencionales (secuencias de señal) se espera que dirija polipéptidos nacientemente expresados o proteínas de fusión en una trayectoria secretora y dar como resultado la división del péptido líder de la proteína de fusión madura en o cerca del empalme entre el péptido líder y la proteína de fusión. Un péptido líder particular se seleccionará con base en consideraciones conocidas en la técnica, tales como el uso de secuencias codificadas por moléculas de ácido nucleico que permiten la fácil inclusión de los sitios de división de endonucleasa de restricción al inicio o al final de la secuencia de codificación para el péptido líder para facilitar la modificación molecular, proporcionar los aminoácidos especificados de las secuencias introducidas que ya sea no interfieren inaceptablemente con cualquier procesamiento deseado del péptido líder de la proteína nacientemente expresada o no interfieren de manera inaceptable con cualquier función deseada de un polipéptido o proteína de fusión si el péptido líder no está dividido durante la maduración de los polipéptidos o proteínas de fusión. Los péptidos líderes ilustrativos de esta descripción incluyen secuencias líderes naturales u otras, tales como H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG-C02H (SEC ID NO : 9) .
En ciertas modalidades, una proteína de fusión de la presente descripción está glicosilada, en donde el patrón de glicosilación depende de una variedad de factores que incluyen la célula hospedera en la cual se expresa la proteína (si se prepara en células hospederas recombinantes) y las condiciones de cultivo.
En modalidades adicionales, las regiones CH2 o <¾ de la inmunoglobulina de una proteína de fusión de la presente descripción pueden tener un patrón de glicosilación alterado con relación a las regiones CH2 o CH3 de una secuencia de referencia de inmunoglobulina. Por ejemplo, cualquiera de una variedad de técnicas genéticas pueden utilizarse para alterar uno o más residuos de aminoácido particulares que forman el sitio de glicosilación (ver Co et al. (1993) Mol. Immunol . 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost . 4:1047; Schuster et al. (2005) Cáncer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol . Bioeng. 92:831). Alternativamente, las células hospederas en cuyas proteínas de fusión de esta descripción se producen pueden modificarse para producir un patrón de glicosilación alterado.
En ciertas modalidades, la presente descripción también proporciona derivados de las proteínas de fusión descritas en la presente. Los derivados incluyen proteínas de fusión que llevan modificaciones diferentes de inserciones, enumeraciones o sustituciones de residuos de aminoácido. Preferiblemente, las modificaciones son covalentes en naturaleza e incluyen, por ejemplo, el enlace químico con polímeros, lípidos, u otras fracciones orgánicas e inorgánicas. Los derivados de esta descripción pueden preparase para aumentar la vida útil en circulación de una proteína de fusión específica o pueden diseñarse para mejorar la capacidad de activación de la proteína de fusión a células, tejidos u órganos deseados.
En ciertas modalidades, la vida útil in vivo de la proteína de fusión de esta descripción puede aumentarse utilizando métodos conocidos en la técnica para aumentar la vida útil de grandes moléculas. Por ejemplo, esta descripción abarca proteínas de fusión que están covalentemente modificadas o derivatizadas para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol , polioxietilenglicol , propilenglicol (ver, por ejemplo, Patentes de E. U. A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337). Aún otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi -polietilenglicol , dextrina, celulosa, y otros polímeros a base de carbohidrato, poli- (N-vinil pirrolidona) -polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilado (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de estos polímeros.
Particularmente preferidas son las proteínas derivatizadas de polietilenglicol (PEG) . Los polímeros solubles en agua pueden unirse en posiciones específicas, por ejemplo en el término amino de las proteínas de fusión de acuerdo con esta descripción o unirse aleatoriamente a una o más cadenas del polipéptido. El uso de PEG para mejorar las capacidades terapéuticas se describen en . la Patente de E. U. A. No. 6,133,426.
En algunas modalidades, una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción es una molécula PIMS que además contiene una región de bisagra de inmunoglobulina amino-terminalmente dispuesta. La región de bisagra amino-terminal puede ser igual que, o diferente de, el enlazador encontrado entre una región <¾ de inmunoglobulina y un dominio de unión. En algunas modalidades, en enlazador amino-terminalmente dispuesto contiene un motivo de existencia natural o adicional (tal como CPPC, SEC ID NO: 330) para promover la formación de por lo menos un enlace de disulfuro para estabilizar el término amino de una molécula dimerizada o multimerizada .
Métodos para Hacer y Purificar Proteínas de Fusión Las proteínas de fusión de la presente descripción pueden hacerse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para fabricar proteínas de fusión SMIP se describen en la Publicación de Patente de E. U. A. Nos. 2003/0133939, 2003/0118592 y 2005/0136049, y los métodos hacer proteínas PIMS se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud PCT No. WO 2009/023386.
En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona proteínas de fusión purificadas, como se describe en la presente. El término "purificado" como se utiliza en la presente, se refiere a una composición, que se puede aislar de otros componentes, en donde la proteína de fusión se purifica a cualquier grado con relación a su estado que naturalmente se obtiene. Una "proteína purifica" por consiguiente también se refiere a tal proteína, aislada del entorno en la cual ocurre naturalmente. En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona proteína de fusión sustancialmente purificadas como se describe en la presente. "Sustancialmente purificado" se refiere a una composición proteica en la cual la proteína forma un componente principal de la composición, tal como constituyendo por lo menos aproximadamente 50%, tal como aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99%, de la proteína, en peso, en la composición.
Las técnicas de purificación de proteína son bien conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas involucran, a un nivel, el fraccionamiento crudo del polipéptido y las fracciones no de polipéptido. La purificación adicional utilizando técnicas cromatográficas y electroforáticas para lograr la purificación completa o parcial (o purificación a homogeneidad se desea frecuentemente. Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de una proteína de fusión pura son cromatografía de intercambio de ión, cromatografía de exclusión; la electroforesis en gel poliacrilamida; y enfoque isoeléctrico. Los métodos particularmente eficientes para purificar péptidos son la cromatografía líquida de proteína rápida y HPLC.
Varios métodos para cuantificar el grado de purificación son conocidos por experto en la técnica en luz de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, la determinación de la actividad de unión específica de una fracción activa, o la evaluación de la cantidad de proteína en una fracción a través del análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción de proteína es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla con la actividad de unión del extracto inicial, y de esta forma calcular el grado de purificación, en la presente evaluado a través de un "número de veces de purificación" . Las unidades actuales utilizadas para representar la cantidad de actividad de unión por supuesto, dependerán de la técnica de ensayo particular seleccionada para seguir la purificación, y sí o no la proteína expresada exhibe una actividad de unión detectable.
Proteínas de Fusión Ilustrativas Las proteínas de fusión de cadena individual ilustrativas de la presente descripción incluyen BC3 igGl N297, BC3 IgGlAA, BC3 IgG2AA, BC3 IgG4AA, BC3 HM1, BC3 ACH2, OKT3 IgGlAA, 0KT3 IgG2AA, 0KT3 IgG4AA, OKT3 HM1, OKT3 ACH2, H57 null2, y 2C11 null2 como se establece en SEC ID NOS: 80-85, 88-93, 96 y 97, respectivamente. Las proteínas de fusión de cadena individual preferidas ilustrativas de la presente descripción incluyen Cris-7 IgGlAA quimérico, Cris-7 IgG2AA quimérico, Cris-7 IgG4AA quimérico, Cris-7 H 1 quimérico, Cris-7 IgGlAA humanizado, Cris-7 IgG2AA humanizado, Cris-7 IgG4AA humanizado, y Cris-7 HM1 humanizado, como se establece en SEC ID NOS: 265-299, respectivamente. Las proteínas de fusión de cadena individual ilustrativas adicionales incluyen BC3 HM1, BC3 ACH2 , 0KT3 HM1, y 0KT3 ACH2 sin sus etiquetas del término carboxi como se establece en SEC ID NOS: 86, 87, 94, y 95, respectivamente. Las proteínas de fusión ilustrativas adicionales incluyen la proteína de fusión antes indicada con sus secuencias líder en el término amino como se establece en SEC ID NOS: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 47, 56, 76-79, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 247, 249, 251, 253, 255, y 257. Las proteínas de fusión ilustrativas adicionales con sus secuencias líder en el término amino incluyen H57 medio nulo (SEC ID NO: 304) y H57 HM2 (SEC ID NO: 306) . Las proteínas de fusión ilustrativas adicionales son BC3 IgGl N297 con varias secuencias enlazadoras como se establece en SEC ID NOS: 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325 y 327. Varias de estas proteínas de fusión de cadena individual ilustrativas se describen en detalle en la sección Ejemplos siguiente.
Características Funcionales Como se describe en la presente, una proteína de fusión de cadena individual de la presente descripción puede tener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7), o cualquier combinación de éstas, de las siguientes características o características funcionales: (1) no activar células T, (2) no inducir o inducir una liberación de citocina mínima, (3) inducir la fosforilación de las moléculas en la trayectoria de señalización TCR, (4) aumentar el flujo de calcio más de el anticuerpo monoclonal correspondiente, (5) bloquear la respuesta de la célula T a un aloantígeno, (6) bloquear la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno, y (7) regular de manera descendente el complejo TCR.
En ciertas modalidades preferidas, una proteína de fusión de cadena individual de la presente descripción no activa o activa mínimamente las células T. Una proteína de fusión "no activa o activa mínimamente o nominalmente las células T" sí, cuando se utiliza para tratar células T (por ejemplo, células T cebadas con PHA- o ConA) , la proteína de fusión no causa un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de células T activadas cuando se compara con células no tratadas en por lo menos un ensayo in Vitro o in vivo provisto en los ejemplos de la presente invención. Preferiblemente, la activación de la célula T se mide en el ensayo de activación de célula T cebado in Vitro descrito en el Ejemplo 1.
En modalidades preferidas adicionales, una proteína de fusión de la presente descripción no induce una tormenta de citocina o no induce una liberación de citocina clínicamente relevante. Una proteína de fusión "no induce una tormenta de citocina" (también referida como "inducción de una liberación de citocina indetectable , nominal o mínima), o "no induce o induce una liberación de citocina mínimamente detectable") si, cuando se utiliza para tratar células T, no causa un aumento estadísticamente significativo de la cantidad de por lo menos una citocina que incluye IFNy; preferiblemente al menos dos citocinas que incluyen IFNy y TNFa o IL-6 y TNFOÍ; preferiblemente tres citocinas que incluyen IL-6, IFNy, y TNFa; preferiblemente cuatro citocinas que incluyen cuatro IL-2, IL-6, IFNy, y TNFa ; y preferiblemente al menos cinco citocinas que incluyen IL-2, IL-6, IL-10, IFNy, y TNF ; liberadas de células tratadas según se compara con nada de tratamiento en por lo menos un ensayo in Vitro o in vivo conocido en la técnica o provisto en los ejemplos de la presente descripción. Preferiblemente la tormenta de citocinas se mide en la liberación de citocina in Vitro a través del ensayo de células T cebadas descritas en el Ejemplo 1. Clínicamente, el síndrome de liberación de citocina se caracteriza por fiebre, escalofríos, salpullido, náusea y algunas veces disnea y taquicardia, que es en paralelo con la liberación máxima de ciertas citocinas, tal como IFNy, así como IL-2, IL-6, y TNFa. Las citocinas pueden ensayarse para la liberación en un ensayo in vitro o in vivo e incluyen G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1, IFNy, y TNFa ; y más preferiblemente incluyen IL-2, IL-6, IL-10, IFNy, y TNFa.
En modalidades preferidas adicionales, una proteína de fusión de la presente descripción causa un aumento en el flujo de calcio en las células, tales como las células T. Una proteína de fusión causa un "aumento en calcio" si, cuando se utiliza para tratar células T, causa un aumento rápido, estadísticamente significativo en el flujo del calcio de las células tratadas (preferiblemente dentro de 300 segundos, más preferiblemente dentro de 200 segundos, y más preferiblemente dentro de 100 segundos de tratamiento) cuando se compara con células tratadas con el anticuerpo correspondiente (por ejemplo, un anticuerpo con el mismo dominio de unión que a una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción) en un ensayo in Vitro conocido en la técnica provisto en la presente. Preferiblemente el flujo de calcio causado por una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción se compara con el flujo causado por un anticuerpo correspondiente en el ensayo de flujo de calcio in Vitro descrito en el Ejemplo 5 y se observa o se mide dentro de al menos los primeros 10 a 300 segundos del tratamiento.
En modalidades adicionales, una proteína de fusión de cadena individual de la presente descripción induce la fosforilación de una molécula en la trayectoria de transduccion de señal TCR. La "trayectoria de transduccion de señal TCR" se refiere a la trayectoria de transduccion de señal iniciada a través de la unión de un ligando de péptido: MHC a TCR y su co-receptor (CD4 o CD8) . Una "molécula en la trayectoria de transduccion de la señal TCR" se refiere a una molécula que está directamente involucrada en la trayectoria de transduccion de señal TCR, tal como una molécula cuyo estado de fosforilación (por ejemplo, si la molécula está fosforilada o no) , cuya afinidad de unión a otra molécula, o cuya actividad enzimática, ha sido cambiada en respuesta a la señal de la unión de un ligando de péptido :MCH a TCR y su co-receptor. Las moléculas ilustrativas en la trayectoria de la transducción de señal TCR incluyen el complejo TCR o sus componentes (por ejemplo, cadenas CD3?), ZAP-70, Fyn, Lck, fosfolipasa c-?, proteína cinasa C, el factor de transcripción NFKB, fosfatasa calcinerio, el factor de transcripción NFAT, el factor de intercambio de nucleósido de guanina (GEF) , Ras, cinasa cinasa cinasa MAP (MAPKKK) , cinasa cinasa MAP (MAPKK) , cinasa MAP (ERKl/2) , y Fos .
Una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción "induce la fosforilación de una molécula en la trayectoria de transducción señal TCR" si, cuando se utiliza para tratar células T, causa un aumento estadísticamente significativo en la fosforilación de la molécula en la trayectoria de transducción de señal TCR (por ejemplo, las cadenas CD3 ? , ZAP-70, y ERK1/2) en un ensayo in vitro o in vivo como se describe en los ejemplos de la presente descripción o los ensayos de señalización del receptor conocidos en la técnica. Los resultados de la mayor parte de los ensayos de señalización del receptor conocidos en técnica se determinan utilizando métodos inmunohistoquimieos , tales como tinciones Western o microscopía de fluorescencia.
En modalidades adicionales, una proteína de fusión de cadena individual de la presente descripción puede bloquear una respuesta de la célula T a un aloantígeno. Un "aloantígeno" es un antígeno que existe en formas alternativas (alélicas) en una especie, de esta forma induciendo una respuesta inmunitaria cuando se transfiere de una forma a otro miembro de la especie que carece del aloantígeno. Los aloantígenos ... ilustrativos pueden encontrarse, por ejemplo, en células sanguíneas (por ejemplo, antígenos del grupo sanguíneo) o trasplante de tejido (es decir, alotrasplante) .
Una proteína de fusión de cadena individual de esta descripción "bloquea la respuesta de la célula T a un aloantígeno" sí, cuando se utiliza para tratar células T, causa una disminución estadísticamente significativa en un porcentaje de células T activadas en respuesta a un aloantígeno en un ensayo in Vitro o in vivo, tal como el ensayo de la reacción de linfocito mixto humano (MLR) y el modelo de la enfermedad de trasplante contra hospedero aguda (aGVHD) provisto en los ejemplos de la presente descripción. Otros ensayos conocidos en la técnica tales como los ensayos de unión y las pruebas de piel, como los ensayos de inflamación de las almohadillas de las patas, en ratones, que detectan respuestas de hipersensibilidad de tipo retrasado, también pueden utilizarse para determinar la reactividad al aloantígeno .
En modalidades adicionales, una proteína de fusión de la presente descripción bloquea la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno. Una proteína de fusión de cadena individual "bloquea la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno" sí, cuando se utiliza para tratar las células T de memoria, causa una disminución estadísticamente significativo en el porcentaje de células T activadas en respuesta a un antígeno específico (por ejemplo, el toroide de tétanos) , en un ensayo in Vitro o in vivo, tal como el ensayo que analiza la activación de la célula T de memoria utilizando el toroide de tétanos provisto en los ejemplos de la presente descripción. Los modelos de inmunización de animales también pueden utilizarse para detectar una respuesta de la célula T específica de antígeno secundaria tanto en in vivo como ex vivo a través de ensayos de presentación de antígeno. Además de los ensayos de hipersensibilidad de tipo retrasado descritos anteriormente, los ensayos de citotoxicidad tales como los ensayos de liberación de 51Cr pueden utilizarse para detectar la actividad de la célula T (Lavie et al., (2000) International Immunology 12 (4) :479-486) .
En modalidades adicionales, una proteína de fusión de la presente descripción regula de manera descendente un complejo TCR de la superficie de una célula T. Una proteína de fusión de cadena individual "modula de manera descendente un complejo TCR" sí, cuando se utiliza para tratar células T, causa una reducción estadísticamente significativa en el número de complejos TC en la superficie de una población de células T en un ensayo in vitro o in vivo. Los ensayos in vitro o in vivo útiles incluyen los ensayos para evaluar la regulación descendente TCR y CD3 de la superficie de la célula T provista en los ejemplos de la presente descripción. Tales ensayos comparan la cantidad de TCR o CD3 expresado en la superficie celular para y después de la estimulación según medida a través de técnicas conocidas en la técnica, tales como citometría de flujo y microscopía inmunofluorescente .
Métodos para Detectar la Activación de la Célula T o la Liberación de la Citocina En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona un método para detectar la activación de la célula T inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, que comprende: (a) proporcionar células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, y (c) detectar la activación de las células T cebadas que han sido tratadas en el paso (b) .
El término "mitógeno" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia química que induce mitosis en linfocitos de diferentes especificidades u orígenes clónales. Los mitógenos ilustrativos que pueden utilizarse para cebar células T incluyen fitohemaglutinina (PHA) , concanavalina A (ConA) , lipopolisacárido (LPS) , mitógeno de hierba carmín (PWM) , y miristato acetato de forbol (PMA) .
En ciertas modalidades de los métodos para detectar la activación de la célula T provista en la presente, la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes es una proteína de fusión provista en la presente. En ciertas otras modalidades, la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes es un anticuerpo monoclonal .
La activación de la célula T puede detectarse mediante la medición de la expresión de los marcadores de activación conocidos en la técnica, tales como CD25, el ligando CD40, y CD69. Las células T activadas también pueden detectarse a través de los ensayos de proliferación celular, tales como la marcación CFSE y los ensayos de absorción de timidina (Adams (1969) Exp . Cell Res. 56:55).
En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona un método para detectar la liberación de citocina inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, que comprende: (a) proporcionar células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une al complejo TCR o a uno de sus componentes, y (c) detectar la liberación de una citocina de las células T cebadas que han sido tratadas en el paso (b) .
En ciertas modalidades de los métodos para detectar la liberación de citocina provistos en la presente, la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR, o a uno de sus componentes es una proteína de fusión provista en la presente. En ciertas otras modalidades, la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes es un anticuerpo monoclonal.
Polinucleótidos , Vectores de Expresión, y Células Hospederas La descripción proporciona polinucleótidos (polinucleótidos aislados o purificados o puros) que codifican las proteínas de fusión de esta descripción, vectores (que incluyen vectores de clonación y vectores de expresión) que comprenden tales polinucleótidos y células (por ejemplo, células hospederas) transformadas o trans ectadas con un polinucleótido o vector de acuerdo con esta descripción.
En ciertas modalidades, un polinucleótido (ADN o ARN) que codifican una proteína de fusión de la presente descripción se contemplan. Los polinucleótidos ilustrativos incluyen SEC ID NOS: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 55, 303, 306, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324 y 326.
La presente invención también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido de esta descripción y, en particular, a constructos de expresión recombinantes . En una modalidad, esta descripción contempla un vector que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de esta descripción, junto con otras secuencias de polinucleótido que pueden causar o facilitar la transcripción, traducción y procesamiento de la proteína de fusión.
Los vectores de clonación y expresión apropiados para utilizarse con hospederos procariotas o eucariotas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989) . Los vectores de clonación/expresión ilustrativos incluyen vectores de clonación, vectores de transporte, y constructos de expresión, que pueden basarse en plásmidos, fagémidos, fásmidos, cósmicos, virus, cromosomas artificiales, o cualquier vehículo de ácido nucleico conocido en la técnica adecuado para la amplificación, transferencia y/o expresión de un polinucleótido contenido en la presente.
Como se utiliza en la presente, "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual ha sido enlazado. Los vectores ilustrativos incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura y genomas virales. Ciertos vectores pueden autónomamente replicar en una célula hospedera, mientras otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera y por lo tanto replican con el genoma hospedero. Además, ciertos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" o (o simplemente "vectores de expresión"), que contienen secuencias de ácido nucleico que están operativamente enlazadas a una secuencia de control de expresión y, por consiguiente, son capaces de dirigir la expresión de esas secuencias.
En ciertas modalidades, los constructos de expresión se derivan de vectores de plásmido. Los constructos ilustrativos incluyen el vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA) , que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de resistencia a ampicilina, una señal de poliadenilación y el sitio promotor T7 ; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), que tienen un promotor CHEF1; y pEE12.4 (Lonza) , que tiene un promotor CMV. Otros vectores de expresión de mamífero adecuados son bien conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., supra; ver también, por ejemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI ; Pharmacia, Piscataway, NJ) . Los constructos útiles pueden prepararse incluyendo una secuencia codificadora de dihidrofolato reductasa (DHFR) bajo el control regulador adecuado, para promover niveles de producción mejorados de las proteínas de fusión, cuyos niveles resultan de la amplificación del gen después de la aplicación de un agente de selección apropiado (por ejemplo, metotrexato) .
Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedera, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural en corriente abajo, como se describe anteriormente. Un vector en un enlace operable como un polinucleótido de acuerdo con esta descripción produce un constructo de clonación o expresión. Los constructos de clonación/expresión ilustrativos contienen por lo menos un elemento de control de expresión, por ejemplo, un promotor, operablemente enlazado a un polinucleótido de esta descripción. Los elementos de control de expresión adicionales, tales como potenciadores , sitios de unión específicos del factor, terminadores y sitios de unión de ribosoma también se contemplan en los vectores y los contractos de clonación/expresión de acuerdo con esta descripción. La secuencia estructural heteróloga del polinucleótido de acuerdo con esta descripción se ensambla en una fase apropiada con las secuencias iniciación de la traducción y de terminación. De esta forma, por ejemplo, las proteínas de fusión que codifican los ácidos nucleicos provistas en la presente pueden incluirse en cualquiera de una variedad de constructos de vectores de expresión tales como una proteína en una célula hospedera.
La secuencia (s) apropiada puede insertarse en un vector, por ejemplo, a través de una variedad de procedimientos. En general, una secuencia de ADN se inserta en un sitio de inhibición de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas estándar para la clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que involucran ligasa de ADN, polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación se contemplan. Un número de técnicas estándar se describen, por ejemplo en Ausubel et al. (1993 Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publ . Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA) ; Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ; Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) ; Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol . I y II, IRL Press, Oxford, UK) ; Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK) ; y en cualquier otro lugar.
La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente enlazada a por lo menos una secuencia de control de expresión apropiada (por ejemplo, promotor constitutivo o promotor regulado) para dirigir la síntesis de ARNm. Los ejemplos representativos de tales secuencias de control de expresión incluyen promotores de células eucariotas o de virus, como se describe anteriormente. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables . Los promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, timidina cinasa HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, y metalotioneina-I de ratón. La selección del vector apropiado y el promotor está bien dentro del nivel de la experiencia en la técnica y la preparación de ciertos constructos de expresión recombinantes particularmente preferidos que comprenden por lo menos un promotor o un promotor regulado probablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido de acuerdo con esta descripción como se describe en la presente.
Las variantes de polinucleótidos de esta descripción también se contemplan. Las variantes de polinucleótidos son al menos 90%, y preferiblemente 95%, 99%, o 99.9% idénticos a uno de los polinucleótidos de secuencias definidas como se describen en la presente, o que hibridan a uno de esos polinucleótidos de secuencias definidas bajo condiciones de hibridación estrictas de 0.015 M de cloruro de sodio, 0.0015 M de citrato de sodio a aproximadamente 65-68°C o 0.015 M de cloruro de sodio, 0.0015 M de citrato de sodio, y 50% de formamida a aproximadamente 42 °C. Las variantes de polinucleótido retienen la capacidad de codificar un dominio de unión o proteína de fusión del mismo que tiene la funcionalidad descrita en la presente.
El término "estricto" se utiliza para referirse a condiciones que tiene comúnmente la técnica como estricta. La rigidez de la hibridación principalmente se determina por la temperatura, la resistencia iónica y la concentración los agentes de desnaturalización tales como formamida. Los ejemplos de condiciones estrictas para hibridación y lavado son 0.015M de cloruro de sodio, 0.0015M de citrato de sodio a aproximadamente 65-68°C o 0.015M de cloruro de sodio, 0.0015M de citrato de sodio, y 50% de formamida a aproximadamente 42°C (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) .
Las condiciones más estrictas (tales como la temperatura más alta, una inferior resistencia iónica, una concentración más alta de formamida u otro agente desnaturalizante) también pueden utilizarse; sin embargo, el grado de hibridación estará afectado.
En ciertas modalidades, las condiciones menos estrictas (tales como una temperatura inferior, una superior resistencia iónica, una concentración más baja de formamida u otro agente desnaturalizante) pueden utilizarse. Las condiciones menos estrictas ilustrativas para hibridación y lavado son 0.015M de cloruro de sodio, 0.0015M de citrato de sodio a aproximadamente 42 °C) . Las variantes de polinucleótido retienen la capacidad de codificar un dominio de unión o proteína de fusión del mismo que tiene la funcionalidad descrita en la presente.
Un aspecto más de esta descripción proporciona una célula hospedera transformada o transfectada con, por el contrario que contiene, cualquiera de los polinucleótidos o constructos de vector/expresión de esta descripción. Los polinucleótidos o constructos de clonación/expresión de esta descripción se introducen en células adecuadas utilizando cualquier método conocido en la técnica, que incluye transformación, transfección o transducción . Las células hospederas incluyen las células de un sujeto que experimenta terapia celular ex vivo que incluye, por ejemplo, terapia de gen ex vivo. Las células hospederas eucariotas contempladas como un aspecto de esta descripción cuando alojan un polinucleótido, vector, o proteína de acuerdo con esta descripción incluyen, además de las propias células del sujeto (por ejemplo, las propias células del paciente humano) , células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO) (incluyendo células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glicosilación de moléculas de unión multivalentes expresadas, ver Publicación de Solicitud de Patente de E. U. A. No. 2003/0115614), células COS (tales como COS-7) , 138, BHK, HepG2 , 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12 , K562, células HEK293, células HepG2 , células N, células 3T3 , células Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9) , células Saccharomyces cerevisiae, y cualquier célula eucariota que se sabe en la técnica que es útil para expresar, y opcionalmente aislar, una proteína o péptido de acuerdo con esta descripción. También se ha contemplan las células procariotas, que incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Streptomycete, o cualquier célula procariota conocida en la técnica como siendo adecuada para la expresión, y opcionalmente aislamiento, de una proteína o péptido de acuerdo con esta descripción. En el aislamiento de la proteína o péptido de las células procariotas, en particular, se contempla que las técnicas conocidas en la técnica para extraer la proteína de los cuerpos de inclusión pueden utilizarse. La selección del hospedero apropiada está dentro del alcance de los expertos en la técnica de las enseñanzas de la presente. Las células hospederas que glicosilan las proteínas de fusión de la descripción, se contemplan.
El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera") se refiere a una célula que contiene un vector de expresión recombinante. Se debe entender que tales términos pretenden referirse no solamente a la célula en cuestión particular sino a la progenie de la célula. Debido a que. ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones posteriores debido a cualquier mutación o influencia ambiental, tal progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula progenitora, pero aún incluirse dentro del alcance del término "células hospedera" como se utiliza en la presente.
Las células hospederas recombinantes pueden cultivarse en un medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para la activación de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de genes particulares. Las condiciones de cultivo para células hospederas particulares seleccionadas para la expresión, tales como temperatura, pH y similar, serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Varios sistemas de cultivo celular de mamífero también pueden utilizarse para expresar la proteína recombinante . Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas por Gluzman (1981) Cell 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y, opcionalmente , un potenciador, un también cualquier sitio de unión de ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, donador de empalme y sitios aceptores, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no de transcripción de flanqueo 5', por ejemplo, como se describe en la presente con respecto a la preparación de constructos de expresión de proteína de unión multivalente . Las secuencias de ADN derivadas del empalme SV40, y los sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos referidos. La introducción del constructo en la célula hospedera puede efectuarse a través de una variedad de métodos con los cuales el experto en la técnica está familiarizado, incluyendo transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por dextrina DEAE, el electroporación (Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology) .
En una modalidad, una célula hospedera se transfiere a través de un constructo viral recombinante y que dirige la expresión de una proteína o polipéptido de acuerdo con esta descripción. La célula hospedera transferida produce partículas virales que contiene proteína o polipéptidos expresados derivados de porciones de una membrana de la célula hospedera incorpora por las partículas virales durante la germinación viral.
Composiciones y Métodos de Uso Además de las proteínas de fusión dirigidas contra un complejo TCR o uno de sus componentes, la presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas y formas de dosificación unitaria que comprende las proteínas de fusión, así como métodos para utilizar las proteínas de fusión, las composiciones farmacéuticas y las formas de dosis unitaria .
Para tratar un mamífero humano o no humano que sufre de un estado de enfermedad o afección asociado con la señalización TCR, se administra una proteína de fusión al sujeto en una cantidad que es efectiva para mejorar los síntomas del estado de la enfermedad o afección siguiendo un curso de una o más administraciones. Siendo los polipéptidos las proteínas de esta descripción pueden suspenderse o disolverse en un diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente incluyendo un estabilizante u otro excipiente farmacéuticamente aceptable, que puede utilizarse para administración intravenosa a través de inyección o infusión, como se explica más completamente a continuación.
Una cantidad o dosis farmacéuticamente efectiva es la cantidad o dosis requerida para prevenir, inhibir la aparición de, o tratar (aliviar un síntoma en algún grado, preferiblemente todos los síntomas) de un estado de enfermedad o afección. En una modalidad preferida, una cantidad terapéuticamente efectiva de proteínas de fusión de cadena individual de la presente descripción se utilizan para tratar enfermedades mediadas por la célula T. La dosis farmacéuticamente efectiva depende del tipo de enfermedad, la composición utilizada, las rutas de administración, el tipo de sujeto que se está tratando, las características físicas del sujeto específico bajo consideración para tratamiento, el medicamento concurrente, y otros factores que los expertos en la técnica reconocerán. Por ejemplo, una cantidad entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal (que puede administrarse como una dosis individual, diariamente, semanalmente , mensualmente , o en cualquier intervalo apropiado) del ingrediente activo puede administrarse dependiendo de la potencia de la proteína de fusión de esta descripción.
Como se describe anteriormente y se ilustra en los ejemplos, las proteínas de fusión dirigidas contra el complejo TCR o a uno de sus componentes, tal como CD3 , provistas en la presente excepcionalmente conectan la trayectoria de señalización TCR sin la inducción de la mitogenicidad de la célula T. Los previos estudios han demostrado que la función de la célula T periférica es la diferenciación pueden conducirse a través de la manipulación de las cascadas de señalización asociadas con TCR. Por ejemplo, tanto la anergia de la célula T como las células T reguladoras adaptativas pueden inducirse a través de señales no de activación fuertes. Además, ciertos subgrupos de células T pueden ser más propensos de la muerte celular después de la distribución de una señal TCR fuerte. De esta forma, las proteínas de fusión provistas en la presente podrían utilizarse para la modulación de la función y el destino de la célula T, por lo tanto proporcionando el tratamiento terapéutico de las enfermedades mediadas por la célula T, incluyendo enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias en donde las células T son contribuyentes significativos. Además, debido a que las proteínas de fusión de la presente descripción no activan las células T y/o no incluyen la liberación de citocinas, son ventajosas sobre las otras moléculas dirigidas contra el complejo TCR (por ejemplo, anticuerpos anti-CD3) para no tener o tener efectos secundarios reducidos tales como el síndrome de liberación de citocina y toxicidad aguda.
Los trastornos autoinmunitarios inflamatorios ilustrativos (AMD) que pueden tratarse a través de las proteínas de fusión y las composiciones y las formas de dosificación unitarias de las mismas incluyen, y no se limitan a, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa) , diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes de tipo I) , dermatomiositis , polimiositis, anemia perniciosa, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) , enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS) , hepatitis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre (GBS) , enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus sistémico eritematoso, lupus nefritis, lupus neuropsiquiátrico, esclerosis múltiple (MS) , miastenia grave, pemfigo vulgar, asma, artritis psoriática, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de célula gigante"), anemia hemolítica autoinmunitaria, pemfigoide Bulloso, vasculitis, enfermedad celiaco, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, endometriosis , Hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, morfea, escleroderma, narcolepsia, neuromiotina, vitíligo, y enfermedad del oído interno autoinmunitaria .
En ciertas modalidades, las proteínas de fusión y las composiciones y las formas de dosis unitarias provistas en la presente pueden utilizarse como inmunosupresores sin efectos secundarios, o mínimos o reducidos efectos secundarios, asociados con la liberación de citocina. Por ejemplo, las proteínas de fusión de cadena individual y las composiciones y formas de dosis unitarias provistas en la presente pueden utilizarse tanto en la inducción como en la prevención (es decir, reducir el riesgo de) o la reducción del rechazo agudo, la función de trasplante rechazada y la pérdida del injerto de trasplantes de órgano sólido (trasplantes de hígado, riñon, pulmón, corazón) . Además, sin inducir la activación de la célula T, en ciertas modalidades, las proteínas de fusión de cadena individual de esta descripción pueden ser más efectivas como un inmunosupresor que otras moléculas dirigidas contra el complejo TCR que se sabe que son ambas inmunosupresoras y mitogénicas de la célula T. En modalidades adicionales, las proteínas de fusión y las composiciones de las formas de dosis unitarias provistas en la presente pueden utilizarse para tratar otras enfermedades mediadas por la célula T, tales como la enfermedad de trasplante contra hospedero (GVHD) y trastornos autoinmunitaros e inflamatorios (AIID) .
En otro aspecto, las composiciones de las proteínas de fusión son provistas en esta descripción. Las composiciones farmacéuticas de esta descripción generalmente comprenden una proteína de fusión provista en la presente combinación como un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales portadores serán no tóxicos a los receptores a dosis y concentraciones utilizadas. Los portadores farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.) 1985). Por ejemplo, la salina estéril y la salina regulada en pH con fosfato a un pH fisiológico pueden utilizarse. Los conservantes, estabilizantes, colorantes y similares pueden ser provistos en la composición farmacéutica. Por ejemplo, el benzoato de sodio, el ácido ascórbico o ésteres de ácido p-hidroxibenzoico pueden agregarse como conservantes. Id. at 1449. Además, los antioxidantes y agentes de suspensión pueden utilizarse. Id. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse ya sea en forma de base o sal libre, con ambas formas estando consideradas como estando dentro del alcance de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas también contener diluyentes tales como reguladores de pH, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) proteínas, aminoácidos, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, dextrina) , agentes de quelatación (por ejemplo, EDTA) , glutationa y otros estabilizantes y excipientes. La salina regulada en su pH neutral o la salina mixta con albúmina de suero no específico son diluyentes ilustrativos. Preferiblemente, el producto se formula con un liofilizado utilizando soluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.
También se contempla la administración de las composiciones de la proteína de fusión de esta descripción en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser uno aceptado en la técnica como un tratamiento estándar para un estado de enfermedad o trastorno particular, tales como en trasplantes, inflamación y autoinmunidad . Los segundos agentes ilustrativos contemplados incluyen esteroides, NSAIDs, inhibidores mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus) , temsirolimus , deforolimus, everolimus, zotarolimus, curcumina, ácido farnesiltiosalicílico) , inhibidores de calcinerio (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus) , anti-metabolitos (por ejemplo, ácido micofenólico, micofenolato mofetilo) , anticuerpos policlonales (por ejemplo, anti-timiocito globulina), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, daclizumab, basiliximab) , u otros agentes activos y auxiliares, o cualquier combinación de éstos.
"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de una proteína de fusión, SMIP, o anticuerpo de esta descripción que es farmacéuticamente aceptable y posee la actividad farmacológica deseada del compuesto progenitor. Tales sales incluyen lo siguiente: (1) sales de adición de ácido, formadas de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares; o formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanpropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 1,2-etan-disulfónico, ácido 2 -hidroxietansulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 4 -clorobencenesulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 4 -toluensulfónico, ácido alcanforsulfónico, ácido 4 -metilbiciclo [2.2.2] -oct-2 -ene- 1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido lauril sulfúrico, ácido 3 - fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butil acético terciario, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y similares; o (2) sales formadas cuando un protón ha sido presente en el compuesto progenitor ya sea se reemplaza por un ión metálico, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión de tierra alcalina, o un ión de aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, o similar.
En modalidades ilustrativas particulares, una proteína de fusión de esta descripción se administra intravenosamente a través de, por ejemplo, inyección de bolo o infusión. Las rutas de administración además de la intravenosa incluyen oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o bucalmente) , sublingual, rectal, vaginal, e intranasal. El término parenteral como se utiliza en la presente incluyen inyecciones subcutáneas, intravenosa, intramuscular, intraesternal , intracavernosa , intratecal, intrameatal, inyección intrauretral o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula para permitir que los ingredientes activos contenidos en la misma estén biodisponibles después de la administración de la composición a un paciente. Las composiciones administradas a un paciente pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, en donde, por ejemplo, una tableta puede ser una sola dosis unitaria, o un contenedor de uno o más compuestos de esta descripción en forma de aerosol pueden controlar una pluralidad de unidades de dosificación.
Para administración oral, un excipiente y/o aglutinante puede estar presente, tal como sacarosa, caolín, glicerina, dextrina de almidón, ciclodextrina, alginato de sodio, carboximetilcelulosa y etilcelulosa . Los agentes edulcorante, conservantes, tinte/colorante, potenciar del sabor, o cualquier combinación de éstos pueden opcionalmente estar presente. Una coraza de recubrimiento también puede opcionalmente utilizarse.
En una composición prevista para ser administrada por inyección, uno o más de un agente tensioactivo, conservante, agente de humectación, agente de dispersión, agente de suspensión, regulador de pH, estabilizante, agente isotónico o cualquier combinación de éstos puede opcionalmente incluirse.
Para formulaciones con base en ácido nucleico, o para formulaciones que comprenden productos de expresión de acuerdo con esta descripción, de aproximadamente 0.01 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal se administrará, por ejemplo, a través de ruta intradérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa o a través de cualquier ruta conocida en la técnica como siendo adecuada bajo un grupo circunstancias dadas. Una dosificación preferida por ejemplo, es de aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 20 mg/kg, con aproximadamente 5 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg particularmente preferida. Será evidente para el experto en la técnica que el número y frecuencia de administraciones dependerá de la respuesta del hospedero.
Las composiciones farmacéuticas de esta descripción pueden estar en la forma que permite la administración a un paciente, tal como, por ejemplo, en la forma de un sólido, líquido o gas (aerosol) . La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para distribución a través de inyección, como dos ejemplos.
Una composición farmacéutica líquida como se utiliza en la presente, en la forma de una solución suspensión u otra forma similar, puede incluir uno o más de los siguientes componentes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución de salina, preferiblemente salina fisiológica, solución de Ringer, sodio isotónico, cloruro, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como el solvente o el medio de suspensión, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes de quelatación tales como ácido etilenodiaminatetraacético; reguladores de pH tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como sodio, cloro o dextrosa. La preparación parenteral puede integrarse en ampollas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis hechas de vidrio o plástico. La salina fisiológica es un aditivo preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril .
También puede ser deseable incluir otros componentes en la preparación, tales como vehículos de distribución que incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos oleosos biodegradables , emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables y liposomas. Los ejemplos de adyuvantes para utilizarse en tales vehículos incluyen N-acetilmuramil -L-alanina-D- isoglutamina (MDP) , lipopolisacáridos (LPS) , glucano, IL-12, GM-CSF, ?-interferón, y IL-15.
Ya que cualquier portador adecuado conocido por el experto en la técnica puede utilizarse en las composiciones farmacéuticas de esta descripción, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración y si se desea la liberación sostenida. Para administración parenteral, el portador puede comprender agua, salina, alcohol, una grasa, una cera, un regulador de pH, o cualquiera de sus combinaciones. Para administración oral, cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, o cualquier combinación de éstos, puede utilizarse.
La descripción contempla una unidad de dosificación que comprende una composición farmacéutica de esta descripción. Tales unidades de dosificación incluyen, por ejemplo, un frasco o jeringa de dosis individual o multidosis , que incluye un frasco o jeringa de dos compartimentos, uno comprendiendo la composición farmacéutica de esta descripción en una forma liofilizada y el otro un diluyente para reconstitución. Una unidad de dosificación multi-dosis también puede ser, por ejemplo, una bolsa o tubo para la conexión con un dispositivo de infusión intravenoso.
La descripción también contempla un kit que comprende una composición farmacéutica de esta descripción en dosis unitaria, o un contenedor, multidosis, por ejemplo, un frasco, y un grupo de instrucciones para administrar la composición a pacientes que sufren de un trastorno tal como el trastorno descrito anteriormente.
EJEMPLOS Anticuerpos Monoclonales y Proteínas de Fusión de Cadena Individual Ilustrativos Se describen brevemente en la presente los anticuerpos monoclonales ilustrativos (dominios de unión, y sus variantes, que se utilizaron para hacer proteínas de fusión de cadena individual ilustrativas) y proteínas de fusión de cadena individual.
Cris-7 (también referido como mAb Cris-7 o FL Cris-7) es un anticuerpo monoclonal IgG2a CD3s anti-humano de ratón (mAb) (Reinherz, E. L. et al. (eds.)f Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986)). El MAb Cris-7 demuestra que se une a células T de humano, mandril, y cynomolgous, y rhesus (datos no mostrados) . Cada una de las proteínas de fusión de cadena individual Cris-7 descritas en la presente también muestran que tiene esta reactividad de especies cruzadas (datos no mostrados) . Cris-7 IgGl-N297A quimérico y humanizado (SEC ID NOS: 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295) comprende del término amino al término carboxilo: una región variable de cadena pesada de Cris-7 quimérico o humanizado, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, una región variable de cadena ligera de Cris-7 quimérico o humanizado Cris-7, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , luna región CH2 de IgGl humano con una sustitución de alanina en la posición 297, y luna región CH3 de IgGl humano .
Cris-7 IgGl-AA-N297A quimérico y humanizado (SEC ID NOS: 266, 271, 276, 281, 286, 291, 296) comprende del término amino al término carboxilo : una región variable de cadena pesada de Cris-7 quimérico o humanizado, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera de Cris-7 quimérico o humanizado, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , luna región CH2 de IgGl humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 (es decir, LLGG(234- 237) AAA) , y luna región CH3 de IgGl humano .
Cris-7 lgG2-AA-N297A quimérico y humanizado (SEC ID NOS: 267, 272, 277, 282, 287, 292, 297) comprende del término amino al término carboxilo: una región variable de cadena pesada de Cris-7 quimérico o humanizado, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera de Cris-7 quimérico o humanizado, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , luna región CH2 de IgG2 humano con tres sustituciones de alanina en las posiciones V234, G236 y N297, y luna región CH3 de IgG2 humano.
Cris-7 lgG4-AA-N297A quimérico y humanizado (SEC ID NOS: 268, 273, 278, 283, 288, 293, 298) comprende del término amino al término carboxilo: una región variable de cadena pesada de Cris-7 quimérico o humanizado, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, una región variable de cadena ligera de Cris-7 quimérico o humanizado, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , luna región CH2 IgG4 humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones F234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 (es decir, FLGG(234- 237)AAA), y luna región CH3 de IgG4 humano .
Cris-7 HMl quimérico y humanizado (SEC ID NOS: 269, 274, 279, 284, 289, 294, 299) comprende del término amino al término carboxilo: una región variable de cadena pesada de Cris-7 quimérico o humanizado, un enlazador que comprende al menos tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, una región variable de cadena ligera Cris-7, región de bisagra de IgGl humano de tipo silvestre, luna región CH3 de IgM humano, y luna región CH3 de IgGl humano, y una secuencia de cola que comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI , y seis histidinas.
BC3 (también referido como BC3 mAb o BC3 FL) es un mAb IgG2b CD3e anti -humano de ratón no mitogénico (Anasetti et al., J. Exp. Med. 172: 1691- 1700, 1990).
BC3-HM1 (también referido como "BC3 HMl") (SEC ID NO: 84) comprende de su término amino al término carboxilo: luna región variable de cadena pesada BC3 , un enlazador que comprende al menos tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , región de bisagra IgGl humana de tipo silvestre, luna región CH3 de IgM humano, y luna región CH3 de IgGl humano, y una secuencia de cola que comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI, y seis histidinas.
BC3-ACH2 (también referido como "BC3 ACH2") (SEC ID NO:85) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada BC3, un enlazador que comprende al menos tres (Gly) -Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , región de bisagra IgGl de tipo silvestre, luna región CH3 de IgGl humano, y una secuencia de cola que comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI, y seis histidinas.
BC3-G1 N297A (también referido como "BC3 N297A") (SEC ID NO: 80) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada BC3 , un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgGl humano con una sustitución de alanina en la asparagina de la posición 297, y la región CH3 de IgGl humano.
BC3-G1 AA N297A (también referido como "BC3 IgGIAA") (SEC ID NO: 81 ) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada BC3 , un enlazador que comprende tres (Gly) -Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgGl humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, 237 y N297 y una eliminación en G236 (es decir, LLGG (234 -237 ) AAA) , y la región CH3 de IgGl humano.
BC3-G2 AA N297A (también referido como "BC3 lgG2AA" ) (SEC ID NO: 82) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada BC3 , un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgG2 humano con tres sustituciones de alanina en las posiciones V234, G236 y N297, y la región CH3 de IgG2 humano.
BC3-G4 AA N297A (también referido como "BC3 lgG4AA") (SEC ID NO: 83) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada BC3 , un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera BC3 , una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgG4 humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones F234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 (es decir, FLGG (234-237) AAA) , y la región CH3 de IgG4 humano. 0KT3 (también referido como OKT3 mAb o 0KT3 FL) es un mAb IgG2a CD3 anti-humano de ratón mitogénico (Ortho Multicencer Transplant Study Group, N. Engl . J. Med. 313: 337, 1985) . 0KT3-HM1 (también referido como "0KT3 HM1 ") (SEC ID NO: 92) comprende de su término amino al término carboxilo: OKT3 región variable de cadena pesada, un enlazador que comprende al menos tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, 0KT3 región variable de cadena ligera, región de bisagra IgGl humana de tipo silvestre, la región CH3 de IgM humano, y la región <¾ de IgGl humano, y una secuencia de cola que comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI, y seis histidinas.
OKT3-ACH2 (también referido como "OKT ACH2") (SEC ID NO: 93) comprende de su término amino al término carboxilo: 0KT3 región variable de cadena pesada, un enlazador que comprende al menos tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, 0KT3 región variable de cadena ligera, región de bisagra IgGl de tipo silvestre, la región CH3 de IgGl humano, y una secuencia de cola adicional que comprende tres copias del epítopo FLAG, una copia de la etiqueta AVI, y seis histidinas.
OKT3-G1 N297A (también referido como "OKT N297A" ) (SEC ID NO: 88) comprende de su término amino al término carboxilo: OKT3 región variable de cadena pesada, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, OKT3 región variable de cadena ligera, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgGl humano con una sustitución de alanina en la posición 297, y la región CH3 de IgGl humano. 0KT3-G1 AA N297A (también referido como "0KT3 IgGlAA" ) (SEC ID NO: 89) comprende de su término amino al término carboxilo: una secuencia líder derivada de de la secuencia líder 2H7 humana, región variable de cadena pesada OKT3 , un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera 0KT3 , una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgGl humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 (es decir, LLGG(234-237)AAA), y la región CH3 de IgGl humano .
OKT3-G2 AA N297A (también referido como "0KT3 IgG2AA" ) (SEC ID NO: 90) comprende de su término amino al término carboxilo: OKT3 región variable de cadena pesada, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, OKT3 región variable de cadena ligera, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgG2 humano con tres sustituciones de alanina en las posiciones V234, G236 y N297, y la región CH3 de IgG2 humano.
OKT3-G4 AA N297A (también referido como "0KT3 IgG4AA") (SEC ID NO: 91 ) comprende de su término amino al término carboxilo: región variable de cadena pesada 0KT3 , un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, OKT3 región variable de cadena ligera, una región de bisagra IgGl mutada (SCC-P) , la región CH2 de IgG4 humano con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones F234, L235, G237 y N297 y una eliminación en G236 {es decir, FLGG (234-237) AAA) , y la región CH3 de IgG4 humano.
También se hicieron y ensayaron 0KT3 IgG4-N297A (es decir, la región ¾2 de IgG4 humano teniendo solamente la sustitución N297A, también conocida como OKT3 IgG4- T-N297A o OKT3 IgG4-FLGG-N297A; SEC ID NO: 232, cuya secuencia incluye una secuencia líder del aminoácido 22 que no es parte de la proteína de fusión madura) . También, se hicieron las mutaciones de sustitución de alanina individuales en cada una de las cuatro posiciones (F234, L235, G236 y G237) en combinación con la sustitución N297A (es decir, 0KT3 IgG4-ALGG-N297A, 0KT3 IgG4-FAGG-N297A, 0KT3 IgG4-FLAG-N297A, y 0KT3 IgG4-FLGA-N297A, que corresponden a SEC ID NOS: 234, 236, 238, y 240, respectivamente - estas también incluyen una secuencia líder del aminoácido 22 que no es parte de la proteína de fusión madura) . 0KT3 ala-ala (también referido como OKT3 AA-FL o 0KT3 FL) es un mAb anti-CD3 mutado Fe, humanizado que contiene sustituciones de alanina en las posiciones 234 y 235 (Herald et al. (2003) J. Clin. Invest . 11 (3) : 409-18) .
Visilizumab (también referido como "Nuvion FL") es un mAb anti-CD3 mutado Fe, humanizado dirigido contra la cadena CD3e del TCR. Es un isotipo IgG2 humano y contiene mutaciones en las posiciones 234 y 237 (Carpenter et al., Blood 99: 2712-9, 2002). mAb H57-457 es un anticuerpo monoclonal anti-TCR de hámster. Es mitogénico y funciona similarmente al anticuerpo monoclonal 0KT3 (Lavasani et al. (2007) Scandinavian Journal of Immunology 65:39) . Las secuencias de las regiones VH y VL del mAb H57-457 se establecen en SEC ID NOS: 49 y 51.
H57 medio nulo (SEC ID NO: 304) es una proteína de fusión de cadena individual de IgG2a de ratón que tiene el dominio de unión H57 y con mutaciones en CH2 que causan la pérdida de las actividades de ADCC además de la sustitución N297A. Comprende de su término al término carboxi : región variable de cadena pesada H57, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera H57, una región de bisagra IGHG2c de ratón de tipo silvestre, la región CH2 de IGHG2c de ratón con cuatro sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, G237, y N297, y la región CH3 de IGHG2c de ratón.
H57 HM2 (SEC ID NO: 306) es una proteína de fusión de cadena individual de ratón que comprende de su término amino al término carboxi : región variable de cadena pesada H57, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera H57, una región de bisagra IGHG2c de ratón de tipo silvestre, la región CH3 de ratón, y la región CH3Y de ratón.
H57 Nulo2 (SEC ID NO: 96) es una proteína de fusión de cadena individual de IgG2a de ratón que tiene el dominio de unión H57 y con mutaciones en CH2 que causa la pérdida de las funciones ADCC y CDC. Comprende de su término amino al término carboxi: región variable de cadena pesada H57, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera H57, una región de bisagra IGHG2c de ratón de tipo silvestre, la región CH2 de IGHG2c de ratón con seis sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, G237, E318, K320, y K322, y la región CH3 de IGHG2c de ratón. 145-2C11 mAb (también referido como 2C11 mAb) es un anticuerpo monoclonal de hámster contra la cadena 0?3e del complejo TC de murino (Hirsch et al., J. Immunol . 140: 3766, 1988) . También es mitogénico y funciona similar al anticuerpo monoclonal O T3. Las secuencias de las regiones VH y VL del mAb 145-2C11 se establecen en SEC ID NOS: 58 y 60. 2C11 Nulo2 (SEC ID NO: 56) es una proteína de fusión de cadena individual de IgG2a de ratón que tiene el dominio de unión 2C11 y con mutaciones en CK2 que causan la pérdida de las actividades de ADCC y CDC. Comprende de su término amino al término carboxi : región variable de cadena pesada 2C11, un enlazador que comprende tres (Gly)4-Ser enlazados en tándem, región variable de cadena ligera 2C11, región de bisagra IGHG2c de tipo silvestre, la región CH2 de IGHG2c de ratón con seis sustituciones de alanina en las posiciones L234, L235, G237, E318, K320, y K322, y la región CH3 de IGHG2c de ratón.
EJEMPLO 1 LAS PROTEINAS DE FUSION NO ACTIVAN CELULAS T CEBADAS 0 INDUCEN LA LIBERACION DE CITOCINA A TRAVES DE CELULAS T CEBADAS O CELULAS ACCESORIAS Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) Se obtuvo sangre entera humana fresca en jeringas de 30 mi conteniendo heparina (hasta 25 mi de sangre por jeringa) y se mantuvo a temperatura ambiente hasta 2 horas antes del procesamiento. La sangre se diluyó en un tubo cónico de 50 mi con un volumen igual de RPMI-1640 a temperatura ambiente (sin suplementos) . La sangre diluida se mezcló de 2 a 3 veces mediante suave inversión. Utilizando una pipeta de 25 mi, se estratificaron de 20 a 25 mi de sangre diluida cuidadosamente sobre 15 mi de Medio de Separación de Linfocito (MP Biomedicals) contenido en un tubo cónico de 50 mi. Los tubos se centrifugaron a 400 g por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se recolectaron de la interface del gradiente de densidad y se combinaron en un tubo cónico de 50 mi, con no más de 30 mi de la suspensión de células por tubo. Los tubos conteniendo las suspensiones de células se rellenaron con RPMI-1640 conteniendo 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina (RPMI-1640 Completo) . Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se aspiró. Las células se lavaron dos veces volviendo a suspenderlas en 20 mi de RPMI completo, se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente, y aspirando el sobrenadante. Las células lavadas s contador mediante un hemacitómetro y se volvieron a suspender de acuerdo con el protocolo del ensayo que se estaba utilizando.
Marcación de PBMC humano con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) La densidad de esplenocitos de ratón se ajustó a 1 x 106/ml en PBS estéril . Las células se distribuyeron en tubos cónicos de 50 mi con no más de 25 mi (25 x 105 células) por tubo. Las células se marcaron con CFSE utilizando el Kit de Proliferación Celular CELLTRACE™ CFSE (Molecular Probes) , después de optimizar las condiciones de uso. Una solución de 5 mM de CFSE en DMSO de grado de cultivo tisular se preparó inmediatamente antes de uso mediante la adición de 19 ul de DMSO de alto grado (Componente B del kit) a un frasco conteniendo 50 pg de CFSE liofilizado (Componente A del kit) . La solución CFSE se agregó a las suspensiones de células PBMC a una concentración final de 50 nM de CFSE, después las suspensiones de células se incubaron a 37°C en 5% de C02 por 15 minutos. La reacción para la marcación de la célula se extinguió llenando los tubos con RPMI Completo (RPMI-1640 conteniendo 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) . Las células se centrifugaron a 1500 rpm por 7 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró de cada tubo y las células se volvieron a suspender en RPMI Completo. Las células se contaron y ajustaron en RPMI Completo a la densidad deseada para usarse en los ensayos.
Análisis de Mitogenicidad y Liberación de Citocina Utilizando Células T Cebadas con PHA PBMC humano se suspendió a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio RPMI completo (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ml de Estreptomicina, y 2 mM d L-glutamina) y se estimuló con 2.5 µg/ml de PHA (Sigma) a 37°C por 3 días. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con RPMI completo y se volvieron a colocar en placas a una concentración de aproximadamente 2 x 106 células/ml en un nuevo matraz sin estimulación. Las células después se colocaron a 37°C por 4 días más, permitiendo que las células T reposaran antes de la exposición a un estímulo secundario. Al final de este período de reposo de 4 días, células se cosecharon, lavaron con PBS, y marcaron con CFSE como se describió previamente. Después de la marcación, las células se suspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en RPMI completo (suero humano) (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) . En este momento, los PBMC frescos se aislaron del mismo donador y se utilizaron como células accesorias para la re-estimulación. Para preparar las células accesorias, las T células se separaron magnéticamente de la población PBMC utilizando la tecnología EasySep (Stem Cell Technologies Cat# 18051) . Las nanopartículas magnéticas junto con dextrina y un cóctel de anticuerpos dirigidos contra CD3 se incubaron con el PBMC recién aislado de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla de células y gránulos después se dejó en un primer tubo con el magneto EasySep Purple por 5 minutos y después la suspensión de células se vertió en un segundo tubo FACS de 5 mi. Las células CD3+ (células T) se volvieron a retener en el primer tubo, mientras las células accesorias se transfirieron al segundo tubo. Las células accesorias negativamente seleccionadas se trataron con mitomicina C (MMC, como se describe más adelante) para inhibir la proliferación. Ambas ráfagas PHA marcadas con CFSE y las células accesorias tratadas con MMC se suspendieron en RPMI completo (suero AB humano) a 2 x 106 células/ml . Cada población de células se agregó a una placa de cultivo tisular de 48 cavidades (0.5 ml/cavidad) junto con los tratamientos indicados. Las células se incubaron por 4 días más a 37°C y se cosecharon 50 µ? de sobrenadante a 24 hrs después de la estimulación. Las células y el sobrenadante restante se cosecharon en el Día 4 post-re-estimulación . Las células cosechadas se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (340697, BD Biosciences) CD25 (557741, BDBiosciences) y 7AAD (559925, BD Biosciences) y se corrieron a través de un citómetro de flujo (LSRII, Becton Dickenson) . Los datos se analizaron utilizando el software de citometría de flujo FlowJo (TreeStar) . La estrategia de sincronización fue como sigue: las células que caen dentro una dispersión contigua (FSC) : puerta de linfocito de dispersión lateral (SSC) se analizaron para la expresión de 7AAD . Las células que caen en la puerta negativa 7AAD después se analizaron para la expresión de CD5, y células que estuvieron dentro de la puerta CD5+ después se analizaron para la dilución de CFSE y la regulación ascendente . de CD25. Las células que fueron CD5+, CFSE10 y CD25hl se consideran células T activadas. Las muestras de sobrenadante se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de detección con base en Luminex 11-plex común de Millipore (series Milliplex) , siguiendo el protocolo del fabricante. Los 11 analitos detectados por el kit fueron: IL-ß, IL-1 RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IP-10, MCP1, IFNy, y TNFa .
La Figura 1 muestra que las proteínas de fusión OKT3 IgG2AA, OKT3 IgG4AA, y OKT3 HM1 no activaron las células T cebadas con PHA no activadas cuando se compara con los anticuerpos visilizumab y OKT3 ala-ala. Se generaron datos similares con moléculas conteniendo el dominio de unión BC3.
La Tabla 1 muestra que las proteínas de fusión O T3 IgG2AA, OKT3 IgG4AA y OKT3 HM1 no incluyen la liberación de citocina a través de células T cebadas o células accesorias, en contraste con los anticuerpos conocidos visilizumab y 0KT3 ala-ala.
Tabla 1. Datos de Citocina 5 10 EJEMPLO 2 LAS PROTEINAS DE FUSION BLOQUEAN UNA RESPUESTA DE LA CELULA T AL ALOANTIGENO Reacción de Linfocito Mixto Humano (MLR) Se aislaron PBMC humanos de dos donadores como se describe previamente y se mantuvieron separados. Con base en estudios previos, los PBMC de otro donador se programaron para ser la población estimuladora y los PBMC para el segundo donador se utilizaron como la población respondedora. Las células de ambos donadores se marcaron con CFSE como se describió previamente. Los PBMC del donador a utilizarse como el estimulador se trataron con mitomicina C (MMC) para evitar la división celular. MMC (Sigma) se volvió a suspender en medio RPMI completo (HS) (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) a una concentración de 0.5 mg/ml . Los PBMC se volvieron a suspender a una concentración de aproximadamente 1 x 106/ml y MMC se agregó a una concentración final de 25 µg/ml. La mezcla de células y MMC después se incubó a 37°C por 30 minutos tiempo después del cual las células se lavaron tres veces con medio RPMI completo (HS) . Las células estimuladoras y respondedoras preparadas se suspendieron a una concentración de aproximadamente 2 x 106 mi en RPMI completo (suero AB humano) (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) y 0.25 mi de cada población celular se agregó por cavidad a una placa de 48 cavidades. Todos los tratamientos se agregaron a la placa al mismo tiempo que las células (a las concentraciones mostradas en las Figuras 2, 3, y 17; observar que las concentraciones dadas son para anticuerpos y que las concentraciones equivalentes molares se utilizaron para las proteínas de fusión como se muestra en la Figura 17) y las muestras después se incubaron a 37°C durante todo el experimento. Los experimentos se cosecharon 7-8 días después de la configuración.
Las células cosechadas se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (340697, BDBiosciences) , CD25 (555433, BDBiosciences) , y 7AAD (559925, BD Biosciences) , y se corrieron en un citómetro de flujo (LSRII, Becton Dickenson) . Los datos se analizaron utilizando el software de citometría de flujo FlowJo (TreeStar) . La estrategia de sincronización fue como sigue: células que caen dentro de una puerta de linfocito FSC:SSC se analizaron para la expresión de 7AAD . Las células que caen dentro de la puerta 7AAD negativa se analizaron después para la expresión de CD5+, y las células que fueron CD5+ después se analizaron para dilución CFSE y regulación ascendente CD25. Las células que fueron CD5+, CFSE10 y CD25hl se consideran células T activadas.
La Figura 2 muestra que las proteínas de fusión BC3 IgG2AA y BC3 IgG4AA bloquearon la respuesta de la célula T al aloantígeno mejor que el mAb BC3 conocido y en contraste con el anticuerpo 0KT3 ala-ala. Se generaron datos similares con moléculas que expresan el dominio de unión 0KT3.
La Figura 3 muestra que las proteínas de fusión BC3 HM1 y BC3 ?<¾2 también bloquearon una respuesta de la célula T al aloantígeno. Se generaron datos similares con moléculas que expresan el dominio de unión OKT3.
La Figura 17 muestra que Cris-7 IgGl-N297A purificado (50% es el pico de interés) efectivamente bloqueó una respuesta de la célula T al aloantígeno.
EJEMPLO 3 LAS PROTEINAS DE FUSION BLOQUEAN LA RESPUESTA DE LA CELULA T DE MEMORIA PARA RECORDAR EL ANTIGENO Los PBMC humanos se aislaron de un donador que tuvo un puntaje positivo en una clasificación previa para reactividad al toxoide de tétanos. Los PBMC se marcaron con CFSE como se describió previamente y después se volvieron a suspender a una concentración de 2 x 106/ml en RPMI completo (suero AB humano) (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 ?/ml de penicilina, 100 g/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) . Se agregaron 0.5 mi de células marcadas con CFSE y 1 ug/ml de toxoide de tétanos (EMD) , junto con los tratamientos experimentales, a una placad de 48 cavidades. Las células se incubaron a 37°C con 5% C02 durante todo el experimento. Los experimentos se cosecharon 8 días después de la configuración. Las células cosechadas se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (340697, BD Biosciences) y CD25 (555433, BDBiosciences) y se corrieron en un citómetro de flujo (LSRII, Becton Dickenson) . Los datos se analizaron utilizando el software del citómetro de flujo FlowJo (TreeStar) . La estrategia de sincronización fue como sigue: las células que caen dentro una puerta de linfocito FSC:SSC se analizaron para la expresión de CD5, las células que posteriormente caen dentro de la puerta CD5+ después se analizaron para dilución CFSE y regulación ascendente CD25. Las células que fueron CD5+, CFSE10 y CD25hl se consideran células T activadas.
La Figura 4 muestra que las proteínas de fusión BC3 IgG2AA, BC3 IgG4 AA, y BC3 HM1 pueden bloquear una respuesta de la célula T de memoria para recodar un antígeno, toxoide de tétanos. Se generaron datos similares con proteínas de fusión conteniendo el dominio de unión OKT3.
EJEMPLO 4 LAS PROTEINAS DE FUSION INDUCEN DE MODULACION DESCENDENTE DE TCR Y CD3 DE SUPERIFICE CELULAR Y Los PBMC humanos se aislaron como se describe en el Ejemplo 1 y se suspendieron a una concentración de aproximadamente 2 x 106 células/ml. Una porción de los PBMC se separó para tinción de la superficie celular inmediata mientras el resto de los PBMC se incubaron con varios reactivos anti-CD3 por 4 días antes del análisis. Los PBMC a ser teñidos inmediatamente se enfriaron en hielo por 30 minutos después de lo cual se centrifugaron a 1500 rpm por 10 min a 4°C y el sobrenadante resultante se eliminó. Las células se suspendieron en Regulador de pH FACS helado (dPBS, 2.5% FBS) a una concentración de 1 x 106/ml. Se transfirió 1 mi de células en un tubo FACS de 5 mi (BD Falcon) para cada reactivo a ser analizado. Se agregó 1 mi de Regulador de pH FACS helado a las alícuotas de 1 mi de células y las células se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos a 4°C. Los tubos se invirtieron y el sobrenadante se decantó de tal forma que aproximadamente 0.1 mi de Regulador de pH FACS se dejó en el tubo junto con los gránulos celulares y los tubos después se colocaron en hielo. Se preparó un concentrado maestro de anticuerpos de tinción (90 µ? de regulador de pH FACS helado, 5 µ? del anticuerpo anti-CD5 (eBioscience) , y 5 µ? del anticuerpo anti-TCR (BDBiosciences) ) para analizar las muestras inmediatamente después del aislamiento. El concentrado maestro (100 µ?) se agregó a cada tubo FACS, junto con 1 ug/ml , 0.5 µg/ml , o 0.1 µg/ml de las proteínas de fusión dirigidas a CD3 o anticuerpo monoclonal (observar que las concentraciones dadas son para anticuerpos y se utilizaron las concentraciones equivalentes molares para las proteínas de fusión) . Las muestras después se incubaron en hielo, en la oscuridad por 30 minutos. Después del período de incubación, las muestras se lavaron dos veces con 2 mi de regulador de pH FACS helado y un anticuerpo secundario marcado con PE para el reactivo dirigido a CD2 se agregaron a una dilución final de 1:400. Las muestras después se incubaron sobre hielo, en la oscuridad por 30 minutos, y después se lavaron con 2 mi de regulador de pH FACS helado. Los niveles de tinción se midieron en un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickenson) .
Los PBMC a ser tratados por 4 días y después la superficie celular teñida se colocaron en placas de 0.5 mi de alícuota por cavidad (la concentración celular fue de aproximadamente 2 x 106 células/ml en media RPMI completo (suero AB humano) en placas de 48 cavidades. Los reactivos dirigidos a CD3 se agregaron a las células a 1, 0.5 y 0.1 µg/ml (observar que las concentraciones dadas son para anticuerpos y las concentraciones equivalentes molares se utilizaron para las proteínas de fusión) y las células se incubaron a 37°C por 2 a 4 días. Después de la incubación, las células se cosecharon y se tiñeron como se describe anteriormente .
Los resultados (Figuras 5A, 5B, 6A y 6B) muestran que las proteínas de fusión que comprenden el dominio de unión 0KT3 inducen la regulación descendiente de ambos, TCR y CD3 de la superficie de las células T, mientras el anticuerpo monoclonal 0KT3 solamente modula de forma descendente TCR y no CD3. Se obtuvieron resultados similares con proteínas de fusión que comprenden el dominio de unión BC3.
La Figura 18 muestra que la proteína de fusión Cris-7 IgGl-N297A induces la modulación descendente de ambos, TCR y CD3 de la superficie de la célula T, mientras el anticuerpo monoclonal Cris-7 solamente modula de forma descendente TCR. Se obtuvieron resultados similares con Cris-7 IgG2-AA-N297A, Cris-7 IgG4-AA-N297A, y Cris-7 HM1.
EJEMPLO 5 LAS PROTEINAS DE FUSION INDUCEN UN FLUJO DE CALCIO FUERTE EN CELULAS T Los PBMC humanos se aislaron como se describió previamente. Las células no T se separaron magnéticamente de las células T utilizando la tecnología MACS de Miltenyi. Las células T intactas se aislaron con el Kit II de Aislamiento de Células T Pan (Miltenyi) . Las perlas supermagnéticas recubiertas con un panel de anticuerpos dirigidos contra todos los subgrupos celulares de PBMC excepto las células T se incubaron con el PBMC recién aislado de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla de células y gránulos después se aplicó a una columna conteniendo una matriz que forma un campo magnético cuando se coloca en un Separador MACS (Miltenyi), un magneto permanente fuerte. Las células T fluyen a través de la columna mientras todas las otras células se retienen en la columna. La pureza de la célula T estuvo generalmente entre 87-93%. Las células T purificadas en RPMI completo (RPMI-1640, 10% de suero AB humano, 2 mM de L-glutamina, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina) a una concentración de aproximadamente 2 x 106 células/ml y se incubaron a 37°C en un matraz de tamaño apropiado durante la noche. La siguiente mañana, se transfirieron 100 µ? de células (200,000 células) en las cavidades de una placa de poli-D lisina, negra de 96 cavidades y se incubaron a 37°C por 3 horas. Durante este tiempo de incubación, el colorante indicador del flujo de calcio se preparó se acuerdo con las instrucciones del fabricante (Molecular Devices FLIPR Calcium 4 assay) . Además, los tratamientos experimentales se prepararon en placas con fondo en U. Los tratamientos celulares se prepararon a una concentración de 5x en la placa de tratamiento en un volumen de 75 µ?. Todos los tratamientos (proteínas de fusión y entrelazadores) se ensayaron por triplicado. Se agregaron 100 µ? del tinte indicador a las células una hora antes de la lectura de la placa. Después de la adición del tinte indicador, la placa se volvió a colocar en la incubadora durante 45 minutos más. Las placas después se centrifugaron a 1200 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente y después se regresaron a la incubadora por 15 minutos más. Al final de este período de incubación, la placa del tratamiento y la placa de las células se cargaron en la FlexStation 3 (Molecular Devices) , un lector de placas de mesa de trabajo con transferencia de fluido integrada. La Flexstation robóticaraente agregó 50 ul de tratamiento a la placa de las células y después registró la fluorescencia resultante del colorante indicador de calcio cada 7 segundos durante el curso de 750 segundos. Los datos capturados después se exportaron a Excel (Microsoft Office) para análisis.
Los resultados (Figura 7) muestran que, en contraste con los anticuerpos que tienen el mismo dominio de unión, las proteínas de fusión de cadena individual de esta descripción, en la ausencia de un entrelazador (es decir, una molécula que se une a dos o más moléculas SMIP, tal como un anticuerpo anti-IgG) , induce un fuerte flujo de calcio en las células T. Se obtuvieron resultados similares con formatos de molécula que expresan el dominio de unión BC3 , así como cuando se utilizan células T cebadas.
La Figura 19 muestra el efecto de diferentes bisagras en el nivel del flujo de calcio causado por diferentes proteínas de fusión de cadena individual que tienen el dominio BC3. En este caso, las proteínas de fusión y los controles se agregaron a 20 segundos y los entrelazadores se agregaron a los 600 segundos. La proteína de fusión con la bisagra más corta (Enlazador 122, derivado de la bisagra IgA2) causó un mayor flujo de calcio, mientras las proteínas de fusión que tiene bisagras más grandes (Enlazadores 115 y 116, derivados de un IgE CH2 Y UBA, respectivamente) indujeron un inferior nivel del flujo calcio. Pero, en todos los casos las proteínas de fusión de cadena individual que tienen el dominio de unión BC3 causaron un mayor aumento en el flujo de calcio que los anticuerpos. La bisagra, por consiguiente, puede ajustarse para modular el flujo de calcio según sea necesario.
EJEMPLO 6 EVALUACION IN VITRO DE MOLECULAS TCR/CD3 ANTI -RATON Aislamiento de Esplenocitos de Ratón Bajo condiciones específicas, se extirparon los bazos y se removieron las grandes piezas de grasa y tejido. En una capucha de cultivo celular, los bazos se colocaron en un pequeño plato con 5 mi de 1 x PBS estéril y después se trituraron entre dos portaobjetos de vidrio escarchados de un solo lado. Durante este proceso, los portaobjetos se mantuvieron a un ángulo sobre el plato de Petri para permitir que las células y el fluido corrieran de regreso al plato. Este paso se completó cuando la cápsula esplénica perdió el color rojo. La suspensión de células en el plato de Petri se transfirió a un tubo cónico de 15 mi y se sometió a vórtice para separar los aglomerados de células . El tubo después se llenó con 12 mi adicionales de 1 x PBS estéril, se colocó derecho y el contenido se dejo asentar por 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a un segundo tubo cónico de 15 mi, dejando los restos asentados sin alterar en el primer tubo. Las células después se cosecharon a 1500 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se removió y el granulado celular se suspendió en 4 mi de Regulador de pH de Lisado Celular de Sangre Roja ACK (Quality Biologies, Núm. de catálogo 118-156-101) y se incubó a temperatura ambiente por 5 minutos. El tubo cónico después se llenó con medio RPMI Completo (RPMI-1640 conteniendo 10% de FBS , 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) . La suspensión de células se filtró a través de un colador de células y se transfirió a otro tubo cónico de 15 mi . Las células se lavaron tres veces con RPMI completo y después se contaron utilizando un hemacitómetro .
Marcación de esplenocitos de ratón con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) La densidad de los esplenocitos de ratón se ajustó a 1 x 106/ml en PBS estéril. Las células se distribuyeron EN tubos cónicos de 50 mi con no más de 25 mi (25 x 106 células) por tubo. Las células se marcaron con CFSE utilizando el Kit de Proliferación Celular CELLTRACE™ CFSE de Molecular Probes (Núm. de catálogo C34554) , después de optimizar las condiciones de uso con PBMC humano y esplenocitos de ratón. Una solución de 5 mM de CFSE en DMSO de grado de cultivo tisular se preparó inmediatamente antes de uso mediante la adición de 18 µ? de DMSO de alto grado (Componente B del kit) a un frasco conteniendo 50 µg de CFSE liofilizado (Componente A del kit) . Debido a que CFSE es sensible a la luz, se debe tener cuidado durante la preparación del reactivo y los posteriores procedimientos de marcación celular para proteger el reactivo de la luz. La solución CFSE se agregó a las suspensiones de células PBMC a una concentración final de 50 nM de CFSE. Las tapas de los tubos se colocaron flojamente sobre los tubos conteniendo las suspensiones de células para permitir el intercambio de gas, y los tubos se colocaron en una incubadora a 37°C, 5% de C02 por 15 minutos. La reacción para la marcación de la célula se extinguió llenando los tubos con RPMI Completo (RPMI -1640 conteniendo 10% de FBS , 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) según el suero extingue la reacción de marcación. Las células se centrifugaron a 1500 rpm por 7 minutos a temperatura am iente. El sobrenadante se aspiró de cada tubo y las células se volvieron a suspender en RPMI Completo. Las células se contaron (pérdidas de hasta 25% de la entrada son comunes) y se ajustaron en RPMI Completo a la densidad deseada para usarse en los ensayos.
Ráfaga ConA Los esplenocitos se aislaron de un ratón BALB/c mouse como se describió previamente y se suspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio RPMI completo (RPMI, 10% de FBS, 2mM de L-glutamina, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales, pen/strep, y 1% de BME) y se estimularon con 1 ug/ml de concanavalina A (Sigma) por 3 días. Después de 3 días, las células se lavaron dos veces con RPMI completo y se volvieron a colocar en placas en un nuevo matraz sin estimulación por 4 días. Al final de este período de reposo de 4 días, células se cosecharon y marcaron con CFSE como se describió previamente. En este momento, se cosechó un segundo bazo de un ratón BALB/c y se aislaron los esplenocitos . Estos esplenocitos recién aislados se utilizaron como células accesorias durante la fase de reestimulación del experimento. Para preparar la población de células accesorias, las células T (células CD5+) se separaron magnéticamente de los esplenocitos frescos utilizando la tecnología MACS de Miltenyi. Las peras super-magnéticas recubiertas con el anticuerpo anti-CD5 (Miltenyi, Núm. de catálogo 130-049-301) se incubaron con, los esplenocitos recién aislados de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla de células y gránulos después se aplicó a una columna (Miltenyi, Núm. de catálogo 130-042-401) conteniendo una matriz que forma un campo magnético cuando se coloca en un Separador MACS (Miltenyi, Núm. de catálogo 130-042-301), un magneto permanente fuerte. Las células CD5+ (células T) se retuvieron en la columna y las células accesorias intactas fluyeron a través de ésta. Las células accesorias negativamente seleccionadas se trataron con mitomicina C (como se describió previamente) para inhibir la proliferación .
Ambas células accesorias de ráfaga ConA marcadas con CFSE y tratadas con MMX se volvieron a suspender en medio completo a 2 x 10s/ml. Se agregaron 0.5 mi de cada población de células a una placa de cultivo tisular de 48 cavidades junto con los tratamientos indicados. Se cosecharon 50 µ? de sobrenadante 24 horas después de la estimulación y las células y el sobrenadante restante se cosecharon en el Día 4 después de la re-estimulación. Las células se tiñeron con anticuerpos marcados fluorescentemente contra CD5 (45-0051, eBioscience) y CD25 (25-0251, eBioscience) , se corrieron a través de un citómetro de flujo (LSRII, Becton Dickenson) y analizaron con el software FlowJo (TreeStar) . La estrategia de sincronización fue como sigue: células que caen dentro una puerta de linfocito FSC:SSC se analizaron para la expresión de CD5, células que posteriormente caen dentro de la puerta CD5+ después se analizaron para dilución CFSE y regulación ascendente CD25. Las células que fueron CD5+, CFSE10 y CD25hl se consideran células T activadas. Las muestras del sobrenadante se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de detección con base en Luminex, Linco-plex, de 22 analitos (Lineo Research) siguiendo el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones: Perlas de analito, anticuerpos de detección, y solución concentradas de estreptavidina-PE se diluyeron: 2 antes del uso en el ensayo. Los 22 analitos detectados mediante el kit fueron: MIP-la, GMCSF, MCP-1, KC, RANTES , IFNY, IL-1 B, IL-la, G-CSF, IP-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNFa, IL-9, IL-13, IL-15, e IL-17.
Ambos anticuerpos monoclonales H57-457 y 145-2C11, pero no H57 Nulo2 o 2C11 Nulo2 SMIP, indujeron la liberación de citocina de células T cebadas con ConA. Los resultados de la liberación de citocinas ilustrativas, IFNy e IP-10, siguiendo el tratamiento de células T cebadas con ConA se muestran en las Figuras 8A y 8B. Además, ambos H57 Nulo2 (igual que "H57 Mu Nulo" en la Figura 9) y 2C11 Nulo2 SMIPs (igual que "2C11 Mu nulo SMIP" en la Figura 9) , pero no el anticuerpo monoclonal H57-457 o 145-2C11, bloquearon la respuesta de la célula T al antígeno (ver, la Figura 9) . Se obtuvieron resultados similares cuando se midió la liberación de las otras citocinas.
EJEMPLO 7 ESTUDIOS IN VIVO DE SMIP ANTI-TCR ILUSTRATIVOS Se dividieron ratones BALB/c hembra de doce semanas de edad (Harían) en grupos de seis y se inyectaron a través de la vena lateral de la cola con 7.3 g, 37 g, 75 vg, o 185 µg de H57 Nulo2 SMIP, 5 µg (dosis más alta tolerable) de mAb, H57 250 µg de control de isotipo IgG2a (equivalente molar de la dosis SMIP más alta), o 200 µ? de PBS . Todos los volúmenes de inyección fueron de 200 µ? y todos los materiales inyectados tuvieron un nivel de endotoxina por debajo de 0.5 EU/mg. Se aniquilaron tres ratones por grupo aleatoriamente seleccionados a las 24 horas y los tres ratones por grupo restantes se aniquilaron al final del experimento tres días después de la inyección. Los ratones se monitorearon para síntomas clínicos de las toxicidades asociadas con el fármaco en la forma de pérdida de peso y puntuación clínica aumentada. El científico que evaluó la puntuación clínica estaba ciego en cuanto al tratamiento administrado a cada grupo. Las puntuaciones se asignaron con base en las siguientes claves: 0=normal; l=Piloerección ligera; 2=Piloerección moderada y/o Inflamación o Irritación Ocular; 3=Postura encorvada/Apatía; 4=Moribundo. Todos los ratones se sangraron a las 2 horas después de la inyección y en su punto en el tiempo terminal. Los bazos y los nodos linfoides inguinales se cosecharon en puntos en el tiempo terminales. Las muestras séricas se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de detección a base de Luminex 14-plex normal de Millipore (serie Milliplex) , siguiendo el protocolo del fabricante, con las siguientes modificaciones: Perlas de analito, anticuerpos de detección, y soluciones concentradas de estreptavidina-PE se diluyeron 1:2 antes del uso en el ensayo. Además, las muestras séricas se corrieron en limpio (comparado con la dilución de 1:2 recomendada) . Los 14 analitos detectados por el kit fueron: G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1 , IFNy, y TNFOÍ . Las suspensiones de células del bazo y nodos linfoides se tiñeron con anticuerpos contra CD5 (eBioscience , Núm. de catálogo 45-0051) y IgG2a de ratón (BDBiosciences , Núm. de catálogo 553390) para la determinación del porcentaje de células T en estos dos órganos que se recubrieron con SMIP.
La Figura 10A muestra que la administración intravenosa de H57 Nulo2 SMIP no causó la pérdida de peso corporal. La Figura 10B muestra que tal tratamiento no causó un aumento en la puntuación clínica, tampoco. Estos resultados demuestran que este Nulo2 SMIP tiene el perfil de seguridad deseado.
Las Figuras 11A y 11B muestran que la administración intravenosa de H57 Nulo2 SMIP no indujo la tormenta de citocinas en ratones BALB/c normales, en contraste con el anticuerpo progenitor. Se muestran dos citocinas representativas, IL-6 y IL-4 del panel del analito 14.
La Figura 12 muestra que las células T recubiertas con H57 Nulo2 SMIP se detectaron en el bazo después de la administración intravenosa de H57 Nulo2 SMIP.
EJEMPLO 8 PROTEINA DE FUSION INHIBIE LA ENFERMEDAD DE TRASPLANTE CONTRA HOSPEDERO AGUDA IN VIVO Para determinar si las moléculas sustitutas son eficaces en un modelo de ratón de la enfermedad de trasplante contra hospedero aguda (aGVHD) , los ratones se trataron con proteínas de fusión ilustrativas y después se monitorearon para pérdida de peso, la relación de linfocito de donador : hospedero y la producción de citocina y quimiocina. aGVHD se indujo en ratones C57BL/6xDBA2 Fl hembra (Taconic) mediante la transferencia de esplenocitos de ratones C57BL/6 hembra donantes (Taconic) . Los bazos de los ratones donantes se recolectaron y sumergieron en RPMI frío conteniendo 10% de FBS . Los bazos recolectados se disociaron utilizando portaobjetos de vidrio escarchados, estériles. El sobrenadante se recolectó, se centrifugó, y las células se lavaron como se describe previamente. Los esplenocitos lavados después se volvieron a suspender en PBS estéril a una concentración de 65 x 106 por 200 µ? . Inmediatamente antes de la inyección, la mezcla de esplenocitos se hizo pasar a través de un colador de células de 100 µ?? (BD Falcon) para remover los restos y las grandes aglomeraciones de células. Se inyectaron intravenosamente (IV) 200 µ? de la suspensión de células de esplenocitos del donante a través de la vena lateral de la cola del ratón receptor Fl . Para inyecciones IV a través de la vena lateral de la cola, los ratones se expusieron brevemente a una lámpara de calor y se confinaron en un contenedor de plástico para ratones. Las inyecciones se administraron utilizando una aguja de calibre 27.5. Los ratones receptores tuvieron una enfermedad pronunciada en el día 14 después de la transferencia de la célula del donante, y en este punto en el tiempo el experimento se terminó y evaluó. El avance de la enfermedad estuvo asociado con la pérdida de peso corporal y la expresión de las células donantes con pérdida concomitante, debido al ataque mediado por la célula donante, de las células hospederas en el bazo de los animales transferidos. Los biomarcadores séricos tales como IFNy también estuvieron correlacionados con el avance de la enfermedad.
Para los estudios de eficacia, las células donantes se transfirieron en receptores Fl en el Día 0 (DO) del estudio como se describe anteriormente. El SMIP, IgG2a de control y los tratamientos PBS se administraron en el DO, DI, D3 , D5 , D7, D9, y Dll con el experimento cosechado .en el D14. Todos las inyecciones de tratamiento se administraron IV excepto para la inyección del DO que se dio a través del seno retro-orbital antes de la transferencia de la célula donante. Se dieron 100 de H57 Nulo2 SMIP o IgG2a en un volumen de 100 µ? o 100 µ? de PBS por inyección. Todas las proteínas utilizadas en los estudios in vivo, tuvieron menos de 0.5 EU/mg de endotoxina. Los ratones tratados con el inmunosupresor de dexametasona (DEX; Sigma) recibieron 10 mg/kg por día a través de inyección intraperitoneal (IP) . Durante el curso del experimento, los ratones se pesaron cada día alterno hasta que empezaron a perder peso en cuyo punto se pesaron cada día. El porcentaje de pérdida de peso corporal inicial a través del ratón receptor se describe en la Figura 13. La administración de H57 Nulo2 SMIP previno la pérdida de peso corporal asociado con el avance de la enfermedad aGVHD en contraste con ratones que recibieron PBS o tratamientos de control IgG2a.
Los ratones se sangraron en el día 7 para análisis biomarcador de suero. En el día 14, el punto en el tiempo terminal, los bazos y las muestras sanguíneas se cosecharon de cada animal . Los pesos y los conteos de células totales de cada bazo se determinaron. Las muestras séricas se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilzando un kit de detección a base de Luminex 14-plex normal de Millipore (serie Milliplex) , siguiendo el protocolo del fabricante. Los 14 analitos detectados por el kit fueron: G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1, IFNy, y TNFa . La producción de citocina y quimiocina se inhibió en ratones tratados con SMIP, incluyendo G-CSF (Figura 14A) , KC (Figura 14B) y IFNy (Figura 14C) . Estos resultados indican que la administración de SMIP inhibió la producción de citocina y quimiocina asociada con aGVHD, especialmente la producción de IFNy (que se elevó típicamente muy alto en el día 7 en los ratones enfermos aGVHD) . En el día 14, los esplenocitos se aislaron como se describe previamente y se tiñeron con anticuerpos contra H-2b (células donantes) y H2-d (las células H2b+ , H2-d+ fueron de origen del hospedero) para análisis utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) . Los ratones que recibieron la proteína de fusión H57 Nulo2 tuvieron una proporción de linfocito donante : linfocito hospedero similar a la de los ratones que recibieron DEX y los ratones de control negativo que no células donantes (Figura 15) . Estos resultados indican que las proteínas de fusión de esta descripción inhiben la expansión de linfocitos donantes, que coincide con la disminución en linfocitos hospederos asociados con aGVHD vistos en los ratones que recibieron los tratamientos de control de PBS e IgG2a.
Estos estudios in vivo indican que las proteínas de fusión de esta descripción inhiben el avance de aGVHD, como se demuestra por una falta de expansión del linfocito donante, producción de citocina y quimiocina inflamatoria y pérdida de peso corporal . También se ha encontrado una eficacia similar en resultados preliminares utilizando un modelo de ratón GVHD crónico.
Los modelos experimentales en aGVHD también se han completado para evaluar H57 medio nulo, H57 nulo2 , y 2C11 nulo2. H57 medio nulo y H57 nulo2 se encontró que son eficaces con resultados similares en los parámetros examinados, a pesar de la liberación temprana de algunas citocinas en los estudios de biomarcador. La proteína de fusión 2C11 nulo2 también fue eficaz y se encontró que previene la expansión de la célula donante en el modelo aGVHD .
EJEMPLO 9 PROTEINAS DE FUSION CON N297A Y UNA SUSTITUCION DE ALA INA INDIVIDUAL ADICIONAL EN LA REGION CH2 DE IGG4 BLOQUEA UNA RESPUESTA DE LA CELULA T AL ALOANTIGENO Se realizaron los ensayos MLR humanos como se describe en el Ejemplo 2 utili8zando las siguientes proteínas de fusión: 0KT3 IgG4 -WT-N297A (SEC ID NO:232), OKT3 IgG4-ALGG-N297A (SEC ID NO:234), OKT3 IgG4 -FAGG-N2 7A (SEC ID NO:236), 0KT3 IgG4 -FLAG-N297A (SEC ID NO:238), OKT3 IgG4-FLGA-N297A (SEC ID NO:240), OKT3 IgG4-AA-N297 (SEC ID NO:91), OKT3 FL y mAb OKT3.
La Figura 20 muestra que las proteínas de fusión IgG4 OKT3 conteniendo (a) solamente una sustitución de alanina en N297 o (b) ambas sustituciones de alanina en N297 y una sustitución de alanina adicional en la posición F234, L235, G236 o F237 bloquean la respuesta de célula T al aloantígeno mejor que el mAb 0KT3 conocido y el anticuerpo nOKT3 ala-ala.
EJEMPLO 10 LA REACCION MLR PUEDE TENER INFLUENCIA MEDIANTE LA SELECCIÓN DE LAS REGIONES DE BISAGRA Los ensayos MLR humanos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 2 utilizando proteínas de fusión derivadas de BC3 IgGl-N297A (SEC ID NO: 80) y conteniendo bisagras de varias longitudes y secuencias: Enlazador 125 derivadas de UBA (SEC ID NO:329), Enlazador 126 derivado de un IgE CH2 (SEC ID NO:330), Enlazador 127 derivado de una bisagra IgD (SEC ID NO:331 ), Enlazador 128 derivado de una bisagra IgA2 (SEC ID NO:332), y Enlazador 129 derivado de una bisagra IgGl (SEC ID NO: 333) . Las secuencias de aminoácido de SMIP BC3 IgG2-N297A conteniendo los enlazadores anteriores se establecen en SEC ID NOS: 325, 323, 319, 315, y 311, respectivamente. Las secuencias de nucleótido que codifican estos SMIP BC3 IgG2-N297A se establecen en SEC ID NOS: 324, 322, 318, 314, y 310, respectivamente.
La Figura 21 muestra el efecto de diferentes bisagras en la capacidad de las proteínas de fusión BC3 IgGl-N297A en el bloqueo de la respuesta de la célula T al aloantígeno. Parece que las proteínas de fusión con bisagras más cortas fueron más efectivas en el bloque de la respuesta de la célula T. Sin embargo, en todos los casos, las proteínas de fusión de cadena individual que tienen el dominio de unión BC3 fueron más efectivas en el bloqueo de la respuesta de la célula T al aloantígeno que Hulgl BC3 (una molécula de anticuerpo que contienen la región variable del mAb BC3 y la región constante IgGl humana) .
EJEMPLO 11 ANALISIS IN VITRO DE PROTEINAS DE FUSION CRIS7 HUMANIZADAS Los ensayos MLR humanos se realizaron como se describe en el Ejemplo 2 utilizando varias proteínas de fusión Cris7 humanizadas: (VH3-VL1 ) IgGl-N297A (SEC ID NO:290), Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgGl-N297A (SEC ID NO:295), Cris7 humanizada (VH3-VL1 ) IgG2 -AA-N297A (SEC ID NO:292), Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgG2-AA-N297A (SEC ID NO:297), Cris7 humanizada (VH3-VL1 ) IgG4 -AA-N297A (SEC ID NO: 293)·, Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgG4 -AA-N297A (SEC ID NO:298), Cris7 quimérica IgGl-N297A (SEC ID NO:265), Cris7 humanizada (VH3-VL1) HM1 (SEC ID NO:294), Cris7 humanizada (VH3-VL2) HM1 (SEC ID NO:299), y Cris7 HM1 quimérica (SEC ID NO:269) .
La Figura 22 muestra que las proteínas de fusión Cris7 humanizadas IgGl-N297A, IgG2-AA-N297A y IgG4-AA-N297A y una proteína de fusión Chs7 IgGl-N297A quimérica bloquean la respuesta de célula T al aloantígeno mejor que el mAb Cris7.
La Figura 23 también muestra que las proteínas de fusión Cris7 humanizada IgGl-N297A, IgG2 -AA-N297A e IgG4-AA-N297A y una proteína de fusión quimérica Cris7 IgGl-N297A bloquean la respuesta de célula T al aloantígeno mejor que el mAb Crist7 conocido. Además, las proteínas de fusión Cris7 HM1 humanizada y quimérica también bloquean la respuesta de célula T al aloantígeno mejor que el mAb Cris7.
La mitogenicidad y liberación de citocina de células T cebadas con PHA se re-estimulan por las proteínas de fusión Cris7 humanizada (VH3-VL1) IgGl-N297A y Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgGl-N297A que se analizaron utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Se ensayaron las siguientes citocinas: IL-I b, IL-10, IL- 17, IFNy, TNFa, IL6, MCP-1, IP-10, IL-2 e IL4.
La Figura 24 muestra que las proteínas de fusión Cris7 humanizada (VH3-VL1) IgGl- N297A y Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgGl-N297A no activan las células T cebadas con PHA. Se generaron datos similares con las proteínas de fusión Cris7 humanizada (VH3-VL1) IgG2-AA-N297A, Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgG2-AA-N297A, Cris7 humanizada (VH3-VL1) IgG4-AA-N297A, y Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgG4-AA-N297A.
Los resultados de la liberación de citocina muestran que (1) las proteínas de fusión Cris7 humanizada IgGl-N297A, Cris7 humanizada-IgG2-AA-N297A, Cris7 humanizada-IgG4-AA-N297A y Cris7 quimérica IgGl-N297A no fueron diferentes de la proteína SMIP de unión a célula no T de control, (2) el mAb Cris7 progenitor fue comparable con las proteínas de fusión Cris7 humanizada IgGl-N297A, Cris7 humanizada- IgG2-AA-N297A, y Cris7-IgG4-AA-N297A humanizada excepto IL-17 (mAb Cris7 progenitor indujo más liberación de IL_17 que las humanizada proteínas de fusión Cris7 humanizadas) , (3) células activadas con Nuvion FL para producir IL-10, IFNy, IL-17, TNFa, y IL-6, y (4) todas las moléculas ensayadas (incluyendo SMIP de unión a célula no T de control) causaron la secreción de MCP-1 a niveles tan altos como la re-estimulación de PHA. Los resultados de la liberación de IFNy e IL-17 se muestran en las Figuras 25A y 25B, respectivamente.
Los niveles de citocina en un ensayo de mitogenicidad primario en PBMC de cynomolgous in vitro se midieron como sigue: PBMC de primate no humano de monos cynomolgus se aislaron como se describe en el Ejemplo 1 con con las excepciones de utilizar 90% de Medio de Separación de Linfocito en PBS IX (CMF) y preparando el gradiente de densidad en tubos cónicos de 15 mi. Las células se volvieron a suspender a una concentración de 4 x 106 células/ml en medio RPMI completo (RPMI-1640 conteniendo 10% de suero AB humano, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de Estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina) y se alicuotaron en una placa de fondo plano de 96 cavidades a lOOul/cavidad junto con los tratamientos indicados. Las células se incubaron a 37°C. Los sobrenadantes de cada cavidad se muestrearon en el día 1, día 2, y día 3, y se analizaron para la presencia de citocinas de primate no humano utilizando un kit de detección a base de Luminex 9-plex normal de Millipore, siguiendo el protocolo del fabricante. Los 9 analitos detectados por el kit fueron: IL-1 ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, MCP1 , IFNy, y TNFa.
Los resultados (Figuras 26A-26H) muestran que las proteínas de fusión Cris7 humanizada (VH3- VL1) IgG4 -AA-N297A y Cris7 humanizada (VH3-VL2) IgG4-AA-N297A inducen menos liberación de IFNy, IL-17, IL-4, TNFa, IL-6 y IL-10 según comparado con mAb Cris7, mientras los niveles de IL-1B e IL-2 fueron compatibles después del tratamiento con las proteínas de fusión Cris7 humanizada IgG4-AA-N297A y después de los tratamientos con mAb Cris7.
EJEMPLO 12 ESTUDIO DE BIOMARCADOR DE PROTEINAS DE FUSION ILUSTRATIVAS QUE CONTIENEN EL DOMINIO DE UNION H57 Se compararon en cuanto a peso y dividieron en 5 grupos de 8 animales por grupo ratones C57BL/6 x DBA2 Fl hembra de diez semanas de edad. Los animales se inyectaron IV a través del seno retro-orbital (200 L del equivalente molar de 300 µ9 de H57 Nulo2 SMIP) con isotipo de control IgG2a, H57 Nulo2 SMIP (SEC ID NO: 96) , H57 Medio Nulo SMIP (SEC ID NO: 304), H57 HM2 SMIP (SEC ID NO: 306), o 5 ug de mAb H57. Se sacrificaron cuatro ratones de cada grupo a las 24 horas y los cuatro ratones restantes se sacrificaron al final del experimento tres días después de la inyección. Los ratones se monitorearon para síntomas clínicos de toxicidades asociadas con el fármaco como se describió previamente. Todos los ratones se sangraron a 2 horas después de la inyección y su punto en el tiempo terminal. Las muestras séricas se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de detección con base en Luminex 14-plex de Millipore como se describió previamente. Además de la recolección de sangre para análisis sérico, se recolectó una alícuota de sangre en tubos microtainer de sangre entera (conteniendo EDTA) para la tinción de la sangre periférica de los glóbulos blancos. En resumen, se agregaron 5 µ? de sangre entera a cavidades en una placa de fondo en U de 96 cavidades. Se agregaron 5 µ? de Bloque Fe CD16/CD32 anti-ratón de rata (BD Pharmingen) y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos, velocidad media en un agitador de placas. Se agregáronlo µ? de coctel de anticuerpo (o controles de tinción individuales apropiados) contra CD5 (PE-Cy5) , CD19 (FITC, eBioscience , ) y CD45 (PE, eBioscience , ) para una dilución final de 1:4000. Las placas se incubaron durante 20 minutos más a temperatura ambiente, protegidas de la luz, colocadas en un agitador de placas a velocidad media. Se agregaron 180 µ? de IX de regulador de pH BD Pharm Lyse y las cavidades se mezclaron vigorosamente y se dejaron asentar a temperatura ambiente por 30 minutos. Después se analizaron 50 µ? de cada muestra en un Muestreador de Alto Rendimiento BD LSRII (HTS) . La estrategia de sincronización fue como sigue: células que caen dentro a puerta de linfocito FSC:SSC se analizaron para expresión de CD45, las células que posteriormente caen dentro de la puerta CD45+ después se analizaron para expresión de CD5 y CD19. Las células por mi de cada tipo de célula se volvieron a calcular con base en la muestra de 50 µ? recolectada y el factor de dilución de 40.
La Figura 27 muestra que la administración intravenosa de las proteínas H57 Nulo2, medio nulo y HM2 SMIP no causa pérdida de peso corporal, mientras la administración intravenosa de mAb H57 causó la pérdida de peso corporal. Todos los ratones parecen normales sin signos de trastornos obvios entre el día 0 y el día 3.
La Figura 28 muestra que la administración intravenosa de H57 Nulo2 , H57 medio Nulo, H57 HM2 , o mAb H57 da como resultado una disminución temporal de las células T CD5+ circulantes (células/ml) comparada con el control de isotipo IgG2a. Los niveles de células T CD5+ circulantes (células/ml) no son significativamente diferentes entre los grupos a 72 horas después de la inyección (Figura 29) .
Las Figuras 30A-38C muestran que (1) H57 Nulo2 y H57 HM2 no causan un aumento en la producción de citocinas comparado con IgG2a, y (2) el tratamiento con H57 medio nulo elevó los niveles de IL-2, IL-10, IP-10, TNFa , e IL-17 a las 2 horas después de la inyección, pero los niveles de todos excepto IL-5 regresaron a niveles normales a las 24 horas después de la inyección.
EJEMPLO 13 ESTUDIO FARMACOCINETICO DE PROTEINAS DE FUSION ILUSTRATIVAS QUE CONTIENEN EL DOMINIO DE UNION H57 Los ratones BALB/c hembra se inyectaron intravenosamente (IV) en el tiempo 0 con 200 µ? de PBS conteniendo 200 µg de la proteína H57 Nulo2 (SEC ID NO: 96), H57-HM2 (SEC ID NO: 306) o H57 medio nulo SMIP (SEC ID NO: 304) . Se inyectaron tres ratones por grupo para cada punto en el tiempo: Para la proteína H57-HM2 SMIP, las muestras séricas se obtuvieron a los 15 min y 2, 6, 8, 24, 30, 48, 72, 168, y 336 hr, y para H57 Nulo2 y H57 medio nulo, se tomaron puntos en el tiempo adicionales a las 96 y 504 hr, pero las muestras de 8 y 30 hr se omitieron. Los ratones anestesiados se sangraron a través del plexo branquial o perforación cardiaca en los puntos en el tiempo indicados después de la inyección y el suero se recolectó como se describe más adelante.
Las concentraciones en suero de BC3 IgG4 -AA-N297A y BC3 IgG2-AA-N297A se determinaron con un emparedado ELISA utilizando un anticuerpo específico Fe de IgG anti-humano de cabra como el reactivo de captura, y los conjugados HRP de anticuerpo de anticuerpos para IgG4 e IgG2 humanos para detectar la unión de BC3 IgG4-AA-N297A o BC3-IgG2-AA-N297A SMIP, respectivamente. Las concentraciones en suero para OKT3IgG -AA-N297A y BC3-HM1 se determinaron en un ensayo de unión con base en FACS utilizando la línea de células CD3+ Jurkat . Las células Jurkat se incubaron en placas de fondo plano de 96 cavidades junto con las muestras séricas de ratones inyectados con 0KT3 IgG4 -AA-N297A o BC3-HM1. Cada muestra sérica se ensayó por triplicado a una dilución. Las diluciones utilizadas para las muestras variaron para diferentes puntos en el tiempo. Las diluciones utilizadas para las muestras variaron para diferentes puntos en el tiempo, pero en el intervalo de 1:20 a 1:15,000 para 0KT3 IgG4-AA-N297A y 1:20 a 1:1000 para BC3-HM1. (Muestras agrupadas de ratones inyectados con con OKT3 IgG2-AA-N297A o BC3-HM1 se ensayaron en un ensayo preliminar, por lo que la dilución apropiada para cada muestra era conocida) . Las células se incubaron por una hora en la presencia de muestras de suero diluidas o estándares (ver más abajo) y se lavaron antes de la adición del reactivo de detección. La unión de 0KT3 Ig4-AA-N297A a las células Jurkat se detectó utilizando un anticuerpo específico del fragmento Fe de IgG anti -humano de cabra conjugado con PE, mientras la unión de BC3-HM1 a células Jurkat se detectó utilizando un anticuerpo anti-His conjugado con PE. Las concentraciones en suero para H57 Nulo2, H57-HM2, y H57 medio nulo se determinaron en un ensayo de unión con base en FACS utilizando células EL4 , una línea de células T de ratón. Las células EL4 se bloquearon con CD16/CD32 anti-ratón y después se incubaron en placas de fondo plano de 96 cavidades junto con las muestras séricas de ratones inyectados con H57-null2. Cada muestra sérica se ensayó por triplicado a una dilución. Las diluciones utilizadas para las muestras variaron para diferentes puntos en el tiempo, pero estuvieron en el intervalo de 1:500 a 1: 10,000. (Las muestras agrupadas de ratones inyectados con H57-nulo2 se ensayaron en un ensayo preliminar, de tal forma que la dilución apropiada de cada muestra era conocida) . Las curvas estándar consistieron de varias concentraciones conocidas de H57 Nulo2 con puntas en el regulador de pH FACS, se corrieron por triplicado. El suero no se agregó a las curvas estándar porque el desarrollo del trabajo mostró que el suero a diluciones mayores de 1:50 no tiene efecto sobre las curvas estándar, y las diluciones mucho más grandes (mínimo de 1:500) de suero fueron requeridas para las muestras PK.
Las células EL4 se incubaron durante una hora en la presencia de las muestras séricas diluidas o estándares y se lavaron antes de la adición del reactivo de detección. La unión de H57Nulo2 y H57 medio nulo a las células EL4 se detectó utilizando un anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón de burro conjugado con PE, mientras la unión de H57-HM2 a células EL4 se detectó utilizando un anticuerpo anti-His conjugado con PE. Las muestras se analizaron a través de citometría de flujo. Las intensidades de fluorescencia media (MFI) se importaron en el software Softmax Pro para calcular las concentraciones en suero y para determinar la precisión y exactitud de las curvas estándar.
Las muestras séricas se analizaron para la presencia de citocinas y quimiocinas utilizando un kit de detección con base en Luminex 14-plex normal de illipore como se describió previamente. Los parámetros de deposición farmacocinéticos para cada proteína se estimaron mediante el análisis no por compartimientos utilizando el software WinNonlin™ Professional (v5.0.1) y aplicando el modelo 201 precompilado para administración de bolo IV y muestreo limitado. Los resultados PK son provistos en la Figura 40 y las vidas medias calculadas se proporcionan en la Tabla 2 siguiente, mientras los resultados de citocina son provistos en las Figuras 40-49.
Tabla 2. Resultados PK Compuesto de prueba Vida Media en suero (horas) H57 Nulo2 (SEC ID NO: 96) 83.5 H57 medio nulo (SEC ID NO: 304) 40.7 H57-HM2 (SEC ID NO: 306) 6.6 BC3-HM1 (SEC ID NO: 84) 3.2 BC3 IgG2-AA-N297A (SEC ID NO: 82) 87.5 BC3IgG4-AA-N297A (SEC ID NO: 83) 99.7 0KT3 IgG2-AA-N297A (SEC ID NO: 90) 42.4 Los resultados del estudio PK muestran que las proteínas SMIP que contienen una cola CH2CH3 tienen una vida media mucho más larga que las que contienen solamente colas CH3.
Las Figuras 39A-48 muestran que la proteína SMIP H57-HM2 generalmente no causó niveles elevados de la mayor parte de las citocinas (IFN-?, IL-2, IL-5, IL-6, o IL-17) en todos los puntos en el tiempo medidos. Este puede deberse en parte a la vida media más corta de esta molécula. Además, los pocos niveles elevados de citocina observados fueron generalmente periódicos y siempre inferiores a los niveles vistos con la proteína de fusión SMIP H57 medio nulo.
EJEMPLO 14 ESTUDIOS IN VITRO DE PROTEINAS DE FUSION ILUSTRATIVAS QUE CONTIENEN EL DOMINIO DE UNION H57 Los ensayos de re -estimulación de ráfaga MLR y ConA se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos del Ejemplo 6.
Los resultados muestran que las proteínas de fusión H57 Nulo2, H57 medio nulo y H57-HM2 (SEC ID NOS: 96, 304 y 306, respectivamente) , pero no mAb H57 bloquean la respuesta de la célula T primaria al antígeno (Figuras 50 y 51) . Además, las proteínas de fusión H57 Nulo2 , H57 medio nulo y H57-HM2 e IgG2a no inducen la activación de las células T cebadas con ConA, mAb H57 induce ligeramente la activación de las células T cebadas con ConA, y el mAb 2C11 induce la activación de las células T cebadas con ConA (Figura 52) . Las proteínas de fusión H57 Nulo2 y H57-HM2 no inducen la liberación de la citocina en ensayos de re-estimulación de ráfaga ConA, mientras la proteína de fusión H57 medio nulo resultó en niveles más altos de algunas citocinas ensayadas (por ejemplo, GM-CSF, IFN-?, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, IP-10 y TNF-a) comparado con las proteínas de fusión H57 Nulo2 y H57-HM2 (datos no mostrados) .
Las varias modalidades descritas anteriormente pueden combinarse para proveer modalidades adicionales. Todas las patentes de E.U.A., publicaciones de solicitudes de patentes de E.U.A., solicitudes de patentes de E.U.A., patentes foráneas, solicitudes de patentes foráneas y publicaciones no de patentes referidas en esta especificación y/o enumeradas en la Hoja de Datos de la Solicitud se incorporan en la presente por referencia, en su totalidad.
Estos y otros cambios pueden hacerse a las modalidades en luz de la descripción antes mencionada. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos utilizados no deberán construirse para limitar las reivindicaciones a modalidades específicas descritas en la especificación y las reivindicaciones, sino deberán construirse para incluir todas las posibles modalidades junto con el completo alcance de equivalentes a las cuales tales reivindicaciones se intitulan. Por consiguiente, las reivindicaciones no están limitadas por esta descripción.
Declaración con respecto al Listado de Secuencias El Listado de Secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato texto en lugar de una copia en papel, y es incorporado a la especificación como referencia. El nombre del archivo texto que contiene el Listado de Secuencias es 910180-416PC-SEQUENCE_LISTIG.txt. El archivo texto tiene 622 KB, fue creado el 9 de octubre de 2009, y es presentado electrónicamente vía . EFS-Web, concurrentemente con la presentación de la especificación.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1.- Una proteína de fusión de cadena individual, caracterizada porque comprende del amino terminal al carboxi terminal : (a) un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, (b) un polipéptido enlazador, (c) opcionalmente un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina que comprende (i) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234 a 238; (ii) una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234 a 238, y al menos una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331; o (iii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234 a 238, y por lo menos una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331, y (d) un polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina, en donde la proteína de fusión no induce o induce una liberación de citocina mínimamente detectable, y en donde los residuos de aminoácido en la región CH2 de inmunoglobulina se enumeran a través del sistema de enumeración de EU.
2. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de unión es un Fv de cadena individual (scFv) que específicamente se une al complejo TCR o a uno de sus componentes.
3. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2', caracterizada porque el complejo TCR o uno de sus componentes es TCRa, TCR , o CD3s.
4. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el scFv comprende cualquiera de las secuencias de aminoácido establecidas en SEC ID NOS: 258-264.
5.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el enlazador es un polipéptido de la región de bisagra de inmunoglobulina .
6. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de la región de bisagra de inmunoglobulina es una bisagra IgGl humana de tipo silvestre, una bisagra IgGl humana, con por lo menos una cisteína mutada, o una bisagra IGHG2c de ratón de tipo silvestre.
7. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polipéptido de la región de bisagra de inmunoglobulina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácido establecidas en (a) SEC ID NOS: 212-218, 300 y 379-434, o (b) los aminoácidos 3-17 de SEC ID NO: 10.
8. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina que comprende una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, y una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234 a 238.
9. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina que comprende una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234-238, y por lo menos una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322, o 331.
10. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina comprende una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, una o más sustituciones o eliminaciones en las posiciones 234 a 238, y por lo menos una sustitución en la posición 253, 310, 318,
11.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 10, caracterizada porque la sustitución de aminoácido en la posición 297 es una .sustitución de Asn a Ala.
12. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina comprende: (i) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y una sustitución de aminoácido en la posición 234, 235, 236 ó 237; (ii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácido en las dos posiciones 234-237; (iii) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácido en tres de las posiciones 234-237; (iv) una sustitución de aminoácido en la asparagina de la posición 297, sustituciones de aminoácido en las posiciones 234, 235 y 237, y una eliminación de aminoácido en la posición 236; (v) sustituciones de aminoácido en tres de las posiciones 234-237 y sustituciones de aminoácido en las posiciones 318, 320 y 322; o (vi) sustituciones de aminoácido en tres de las posiciones 234-237, una eliminación de aminoácido en la posición 236, y sustituciones de aminoácido en las posiciones 318, 320 y 322.
13. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende un polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina como se establece en cualquiera de SEC ID NOS: 102-104 75, y 375-378.
14. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque el polipéptido de la región CH2 de inmunoglobulina es un polipéptido de la región CH2 IgG2 humano, y el polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina es el polipéptido de la región <¾ IgG2 humano .
15. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque el polipéptido de la región CK2 de inmunoglobulina es un polipéptido de la región CH2 IgG4 humano, y el polipéptido de la región CH3 de inmunoglobulina es un polipéptido de la región CH3 IgG4 humano.
16.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la proteína de fusión no contiene un polipéptido de la región CH2 de inmunog1obulina.
17. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende una secuencia como se establece en cualquiera de SEC ID NOS: 11-16, 74, 101 y 307-309.
18. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia como se establece en cualquiera de SEC ID NOS: 80-97, 265-299, 304 y 306, en cualquiera de SEC ID NOS: 234, 236, 238, 240 sin la primera secuencia líder de 22 aminoácidos, o en cualquiera de SEC ID NOS: 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, y 327 sin la primera secuencia líder de 20 aminoácidos.
19. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque la proteína de fusión además no activa o activa mínimamente las células T.
20.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque la proteína de fusión además tiene por lo menos una de las actividades seleccionadas de inducción de flujo de calcio, inducción de la fosforilación de una molécula en la trayectoria de señalización del receptor de la célula T, bloqueo de la respuesta de la célula T a un aloantígeno, bloqueo de la respuesta de la célula T de memoria a un antígeno, y la regulación descendente del completo TCR.
21.- Una composición caracterizada porque comprende una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.
22. - Una forma de dosis unitaria caracterizada porque comprende la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21.
23. - Un polinucleótido caracterizado porque codifica una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
24. - Un vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23 operablemente enlazado a una secuencia de control de expresión.
25. - Un método para reducir el rechazo de un trasplante de órgano sólido, caracterizado porque comprende administrar al receptor del trasplante de órgano sólido una cantidad efectiva de una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, una composición de conformidad con la reivindicación 21, y una forma de dosificación unitaria de conformidad con la reivindicación 22.
26. - Un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, una composición de conformidad con la reivindicación 21, y una forma de dosificación unitaria de conformidad con la reivindicación 22.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad inflamatoria del intestino.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.
29. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la enfermedad autoinmunitaria es diabetes mellitus, asma o artritis.
30. - Un método para detectar la liberación de citocina inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar las células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, y (c) detectar la liberación de una citocina de las células T cebadas tratadas en el paso (b) .
31. - Un método para detectar la activación de la célula T inducida por una proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar las células T cebadas con mitógeno, (b) tratar las células T cebadas del paso (a) con la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes, y (c) detectar la activación de las células T cebadas tratadas en el paso (b) .
32. - El método de conformidad con la reivindicación 30 o reivindicación 31, caracterizado porque la proteína que comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o a uno de sus componentes es una proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.
33. - El método de conformidad con la reivindicación 30 o reivindicación 31, caracterizado porque la proteína comprende un dominio de unión que específicamente se une a un complejo TCR o uno de sus componentes es un anticuerpo.
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