Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

PL204890B1 - Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej - Google Patents

Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej

Info

Publication number
PL204890B1
PL204890B1 PL355180A PL35518000A PL204890B1 PL 204890 B1 PL204890 B1 PL 204890B1 PL 355180 A PL355180 A PL 355180A PL 35518000 A PL35518000 A PL 35518000A PL 204890 B1 PL204890 B1 PL 204890B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polysaccharide
protein
polysaccharides
mpl
conjugated
Prior art date
Application number
PL355180A
Other languages
English (en)
Other versions
PL355180A1 (pl
Inventor
Carine Capiau
Marguerite Deschamps
Pierre Michel Desmons
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Jean-Paul Prieels
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906437.0A external-priority patent/GB9906437D0/en
Priority claimed from GBGB9909077.1A external-priority patent/GB9909077D0/en
Priority claimed from GBGB9909466.6A external-priority patent/GB9909466D0/en
Priority claimed from GBGB9916677.9A external-priority patent/GB9916677D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
Publication of PL355180A1 publication Critical patent/PL355180A1/pl
Publication of PL204890B1 publication Critical patent/PL204890B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej.
Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji i szczepionek z bakteryjnym antygenem polisacharydowym, ich produkcji i zastosowania takich kompozycji polisacharydów do wytwarzania leków.
Konkretnie wynalazek dotyczy kompozycji zawierających koniugaty bakteryjnych polisacharydów z białkiem D z H. influenzae.
Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną chorobowość i śmiertelność (w szczególności u osób bardzo młodych i u starych) powodującą inwazyjne choroby takie jak zapalenie płuc, bakteriemia i zapalenie opon mózgowych i choroby związane z kolonizacją takie jak ostre zapalenie ucha środkowego. Częstość zapalenia płuc powodowanego przez pneumokoki w USA dla osób w wieku ponad 60 lat ocenia się na 3 do 8 na 100000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, takich jak zapalenie opon mózgowych, ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami.
Pneumokok jest otoczony związanym chemicznie polisacharydem, który nadaje specyficzność serotypu. Znanych jest 90 serotypów pneumokoków i otoczka jest główną determinantą wirulencji pneumokoków, ponieważ otoczka nie tylko chroni wewnętrzną powierzchnię bakterii przed dopełniaczem, ale sama jest słabo immunogenna. Polisacharydy są antygenami T-niezależnymi i nie mogą być obrabiane lub prezentowane na cząsteczkach MHC, aby reagowały z komórkami T. Mogą one jednak stymulować układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który obejmuje krzyżowe połączenie receptorów powierzchniowych na komórkach B.
Wykazano w kilku doświadczeniach, że ochrona przed inwazyjną chorobą pneumokokową jest najsilniej skorelowana z przeciwciałem specyficznym dla otoczki i ochrona jest specyficzna w stosunku do serotypu.
Szczepionki oparte na antygenach polisacharydowych są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które uzyskały licencje do stosowania u ludzi, obejmują polisacharyd Vi z Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, tetrawalentną szczepionkę przeciw meningokokom złożoną z serotypów A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową złożoną z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (co obejmuje przynajmniej 90% izolatów pneumokoków z krwi).
Trzy ostatnie szczepionki dają ochronę przed bakteriami wywołującymi zakażenia dróg oddechowych powodujące poważną chorobowość i śmiertelność u niemowląt, jednak te szczepionki nie uzyskały licencji na stosowanie u dzieci poniżej dwóch lat, ponieważ nie są dostatecznie immunogenne w tej grupie wiekowej (Peltola i wsp. (1984) N. Engl. J. Med. 310:1561-1566). Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego w niemowląt i małych dzieci. Podobnie, osoby starsze słabo reagują immunologicznie na szczepionki pneumokokowe (Roghmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42:265-270), stąd też zwiększone występowanie bakteryjnego zapalenia płuc w tej populacji (Verghese i Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285).
Strategie, które zaprojektowano aby pokonać ten brak immunogenności u niemowląt, obejmują łączenie polisacharydu z dużymi immunogennymi białkami, które dostarczają pomocy obecnych obok komórek T i które wpływają na pamięć immunologiczną w stosunku do polisacharydowego antygenu, z którym są koniugowane. Szczepionki koniugatów glikoprotein pneumokoków są obecnie oceniane pod kątem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych.
A) Pneumokokowe szczepionki polisacharydowe
23-walentna niekoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała znaczną zmienność skuteczności klinicznej, od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154:2531-2535). Skuteczność wydaje się być związana z immunizowaną grupą ryzyka, taką jak osoby starsze, choroba Hodgkina, usunięcie śledziony, anemia sierpowata i agammaglobulinemie (Fine i wsp. (1984) Arch Intern Med 154:2666-2677) i także z przejawami choroby. 23-walentna szczepionka nie wykazuje ochrony przed powodowanym przez pneumokoki zapaleniem płuc (w niektórych grupach wysokiego ryzyka, takich jak osoby starsze) i chorobami ucha środkowego.
Istnieje więc potrzeba ulepszonych kompozycji szczepionek przeciwko pneumokokom, szczególnie takich, które będą bardziej skuteczne w zapobieganiu lub łagodzeniu choroby pneumokokowej (w szczególności zapalenia płuc) u osób starszych i małych dzieci.
Niniejszy wynalazek dostarcza taką kompozycję immunogenną i zawierającą ją szczepionkę.
PL 204 890 B1
B) Wybrane kompozycje pneumokokowy koniugat polisacharydów + 3D-MPL
Ogólnie przyjmuje się, że efekt ochronny handlowo dostępnej szczepionki przeciwko pneumokokom jest mniej lub bardziej związany ze stężeniem przeciwciała indukowanym po szczepieniu; faktycznie 23 polisacharydy były zaakceptowane do licencji wyłącznie na podstawie immunogenności każdego składowego polisacharydu (wyd. Williams i wsp. New York Academy of Sciences 1995 str. 241-249). Tak więc dalsze zwiększenie odpowiedzi przeciwciał na polisacharydy pneumokoków mogłoby zwiększyć procent niemowląt i osób starszych odpowiadających ochronnymi poziomami przeciwciała na pierwszą iniekcję polisacharydu lub koniugatu polisacharydu i mogłoby zmniejszyć dawkę i ilość iniekcji wymaganych do indukcji ochronnej odporności na choroby powodowane przez Streptococcus pneumoniae.
Od wczesnych lat 20-go wieku naukowcy eksperymentowali z dużą liczbą związków, które mogą być dodawane do antygenów, aby poprawić ich immunogenność w kompozycjach szczepionek (przegląd w M.F. Powell i M. J. Newman. Plenum Press, NY, „Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach” (1995). Rozdział 7: „A compendium of vaccine adjuvants and excipients”). Wiele jest bardzo skutecznych, ale powoduje znaczące lokalne i ogólnoustrojowe niekorzystne reakcje, które wykluczają ich stosowanie w kompozycjach ludzkich szczepionek. Adiuwanty na bazie glinu (takie jak alum, wodorotlenek glinu lub fosforan glinu) opisane po raz pierwszy w 1926 r. pozostają jedynymi adiuwantami licencjonowanymi w Stanach Zjednoczonych do szczepionek ludzkich.
Adiuwanty na bazie glinu są przykładem nośnikowej klasy adiuwantów, która działa przez „efekt depot” który indukują. Antygen jest adsorbowany na powierzchni adiuwanta i gdy kompozycja jest wstrzyknięta, adiuwant i antygen nie są natychmiast rozproszone w krwiobiegu - zamiast tego kompozycja pozostaje w lokalnym otoczeniu wstrzyknięcia i powstaje bardziej wyraźna odpowiedź immunologiczna. Takie nośnikowe adiuwanty mają dodatkową znaną zaletę, polegającą na tym, że są odpowiednie do stabilizacji antygenów, które są podatne na rozkład, na przykład, niektórych antygenów polisacharydowych.
3D-MPL jest przykładem adiuwantu nienośnikowego. Jego pełna nazwa to 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-De-O-deacylowany monofosforylolipid A lub 3-O-dezacylo-monofosforylolipid A) i jest określany jako 3D-MPL, aby wskazać, że pozycja 3 glukozoaminy na redukującym końcu jest de-O-acylowana. Jego preparatyka opisana jest w GB 2220211. Chemicznie jest to mieszanina 3-deacylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. Został on oryginalnie wytworzony we wczesnych latach 1990-tych, gdy metoda 3-O-deacylacji 4'-monofosforylowej pochodnej lipidu A (MPL) doprowadziła do cząsteczki z dalej zmniejszoną toksycznością i bez zmian aktywności immunostymulującej.
3D-MPL jest stosowany jako adiuwant albo sam albo korzystnie w kombinacji z adiuwantem nośnikowym typu depot, takim jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu lub w emulsjach olej-w-wodzie. W takich kompozycjach antygen i 3D-MPL są zawarte w tych samych strukturach czą steczkowych, co pozwala na bardziej skuteczne dostarczenie antygenowych i immunostymulujących sygnałów. Badania wykazały, że 3D-MPL jest zdolny do dalszego zwiększenia immunogenności antygenu zaadsorbowanego na adiuwancie glinowym (Thoelen i wsp. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1). Takie kombinacje są także korzystne w dziedzinie dla antygenów podatnych na adsorpcję (na przykład, koniugaty polisacharydów bakteryjnych), gdzie adsorpcja na adiuwancie glinowym (alum) stabilizuje zazwyczaj antygen. Zazwyczaj stosowane są strącone adiuwanty na bazie glinu, ponieważ są jedynymi adiuwantami, które są obecnie stosowane w licencjonowanych ludzkich szczepionkach. Tak więc szczepionki zawierające 3D-MPL w kombinacji z adiuwantami glinowymi są preferowane w dziedzinie ze względu na łatwość ich opracowania i tempo wprowadzania na rynek.
MPL (nie 3-deacylowany) był oceniany jako adiuwant z kilkoma monowalentnymi antygenami koniugatów polisacharydowych. Wspólne wstrzyknięcie MPL w roztworze soli zwiększało odpowiedź przeciwciał w surowicy dla czterech monowalentnych koniugatów polisacharydów: pneumokokowy PS 6B-toksoid tężca, pneumokokowy PS 12-toksoid dyfterytu i S. aureus typ 5 i S. aureus typ 8S koniugowane z egzotoksyną A. Pseudomonas aeruginosa (Schneerson i wsp. J. Immunology (1991) 147:2136-2140). Zwiększone odpowiedzi podano jako specyficzne w stosunku do antygenu. MPL w emulsji olej-w-wodzie (adiuwant typu nośnika) powtarzalnie zwiększał efekt MPL w soli fizjologicznej ze względu na obecność MPL i antygenu w tej samej strukturze cząsteczkowej, i uważano, że jest to system adiuwantu z wyboru dla optymalnego dostarczania innych szczepionek koniugatów polisacharydów.
Devi i wsp. (Infect. Immun. (1991) 59:3700-7) oceniali wpływ adiuwantu MPL (nie 3-deacylowany) w soli fizjologicznej na odpowiedź przeciwciał myszy na koniugat TT polisacharydu otoczki Cryptococcus neoformans. Gdy stosowano MPL równocześnie z koniugatem, istniał tylko marginalny wzrost specyficznej odpowiedzi zarówno IgM i IgG specyficznej na PS, jednak MPL miał znacznie większy wpływ gdy
PL 204 890 B1 był podany 2 dni po koniugacie. Praktyczność stosowania schematu immunizacji, który wymaga opóźnienia w podawaniu MPL w stosunku do antygenu, szczególnie u niemowląt, jest problematyczna. Efekt adiuwantu MPL z polisacharydami i koniugatami polisacharyd-białko wydaje się być zależny od składu. Ponownie, włączenie MPL do odpowiednich systemów powolnego uwalniania (na przykład stosując adiuwant nośnikowy) daje bardziej trwały efekt adiuwantu i obchodzi problem czasu i opóźnionego podawania.
Pokrótce, według obecnego stanu wiedzy dla danego polisacharydu lub antygenu koniugatu polisacharydu, gdy MPL lub 3D-MPL jest stosowany jako adiuwant, jest on korzystnie stosowany razem z adiuwantem noś nikowym (na przykład adiuwantami na bazie glinu), aby zmaksymalizować efekty immunostymulujące.
Nieoczekiwanie, obecni wynalazcy stwierdzili, że dla pewnych koniugatów pneumokokowych polisacharydów immunogenność kompozycji szczepionki jest znacząco większa, gdy antygen jest formułowany z samym 3D-MPL a nie z 3D-MPL i z adiuwantem nośnikowym (takim jak adiuwant na bazie glinu). Co więcej, zaobserwowana poprawa jest niezależna od stosowanego stężenia 3D-MPL i od tego czy dane koniugaty są w kompozycji monowalentnej, czy są w kombinacji tworzącej antygen poliwalentny.
C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D
Jak wymieniono powyżej szczepionki oparte na antygenie polisacharydowym są dobrze znane w dziedzinie. Licencjonowane szczepionki polisacharydowe wymienione powyż ej mają róż ne wykazane skuteczności kliniczne. Szacowano, że szczepionka oparta na polisacharydzie Vi ma skuteczność między 55% i 77% w zapobieganiu tyfusowi potwierdzonemu przez hodowlę (Plotkin i Cam (1995) Arch Intern Med 155:2293-2299). Wykazano, że szczepionka oparta na polisacharydzie C meningokoków ma skuteczność 79% w warunkach epidemii (De Wals P. i wsp. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). 23-walentna szczepionka pneumokokowa wykazała szeroki zakres skuteczności klinicznej od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Jak wspomniano powyżej, przyjmuje się, że ochronna skuteczność szczepionki pneumokokowej jest mniej lub bardziej zależna od stężenia przeciwciała indukowanego po szczepieniu.
Wśród problemów związanych z podejściem polisacharydowym do szczepień, jest fakt, że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Strategie zaprojektowane, by przezwyciężyć ten brak immunogenności, obejmują podłączenie polisacharydu do dużych wysoce immunogennych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T.
Przykłady tych wysoce immunogennych nośników, które są obecnie często stosowane dla produkcji immunogenów polisacharydowych, obejmują anatoksynę dyfterytu (DT lub mutant CRM197), anatoksynę tężca (TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD).
Snapper i wsp. (WO 96/32963) omawiają równoczesne podawanie antygenu z lipoproteiną D. Akkoynlu i wsp. (1997) omawiają koniugaty D-HiB. Lee i wsp. (1997) omawiają stosowanie koniugatów polisacharyd pneumokokowy-białko, jako szczepionek multiwalentnych. Eskola i wsp. (1990) badali podawanie szczepionki zawierającej koniugat polisacharydu typu B z Haemophilus influenzae - białko zmieszanej ze szczepionkami zawierającymi nieskoniugowany otoczkowy polisacharyd meningokokowy i/lub pneumokokowy. W WO 99/33488 ujawniono szczepionkę obejmującą koniugat polisacharydowy z immunostymulującym oligonukleotydem CpG.
Problemy związane z często stosowanymi nośnikami
Z każdym z tych powszechnie stosowanych noś ników związane są problemy, w tym przy produkcji koniugatów GMP i także w immunologicznych cechach koniugatów.
Mimo powszechnego stosowania tych nośników i ich sukcesu w indukcji odpowiedzi przeciwciał przeciwko polisacharydom są one związane z kilkoma wadami. Na przykład, wiadomo, że specyficzne w stosunku do antygenu odpowiedzi odpornościowe mogą ulec supresji (supresja epitopu) przez obecność już istniejących przeciwciał skierowanych przeciwko nośnikowi, w tym przypadku toksynie tyfusu (Di John i wsp. (1989) Lancet 2:1415-8). W ogólnej populacji bardzo wysoki procent ludzi będzie mieć uprzednio istniejącą odporność zarówno na DT jak i TT, ponieważ ludzie są rutynowo szczepieni tymi antygenami. W Wielkiej Brytanii, na przykład, 95% dzieci otrzymuje szczepionkę DTP zawierającą zarówno DT i TT. Inni autorzy opisali problem supresji epitopu na szczepionki peptydowe w modelach zwierzęcych (Sad i wsp., Immunology, 1991; 74:223-227; Schutze i wsp., J. Immunol. 133: 4, 1985; 2319-2322.
Dodatkowo, dla szczepionek, które wymagają regularnych dawek przypominających, stosowanie wysoko immunogennych nośników, takich jak TT i DT, prawdopodobnie zniesie odpowiedź przeciwciał na polisacharydy po kilku iniekcjach. Tym wielokrotnym szczepieniom mogą także towarzyszyć niepożądane odpowiedzi, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH).
PL 204 890 B1
Wiadomo, że KLH jest silnym immunogenem i był już stosowany jako nośnik dla peptydów IgE w ludzkich próbach klinicznych. Jednak były obserwowane pewne niekorzystne reakcje (reakcje DTH-podobne lub sensytyzacja IgE), jak i odpowiedzi przeciwciał na przeciwciała.
Tak więc wybór białka nośnikowego dla szczepionki opartej na polisacharydzie będzie wymagał wyważenia pomiędzy koniecznością stosowania nośnika działającego u wszystkich pacjentów (szerokie rozpoznawanie MHC), indukcją wysokich poziomów odpowiedzi przeciwciał przeciw polisacharydom i niskiej odpowiedzi przeciwciał przeciw nośnikowi.
Uprzednio stosowane nośniki dla szczepionek polisacharydowych mają więc wiele wad, szczególnie dla szczepionek skojarzonych, gdzie supresja epitopu jest szczególnym problemem, jeśli ten sam nośnik jest stosowany do różnych antygenów polisacharydowych. Według WO 98/51339 stosowano wiele nośników w szczepionkach skojarzonych, aby starać się obejść ten efekt.
Niniejszy wynalazek dostarcza nowego nośnika do stosowania w przygotowaniu immunogennych koniugatów opartych na polisacharydzie który nie wykazuje wymienionych powyżej wad.
Według niniejszego wynalazku białko D (EP 0594 610 B1) z Haemophilus influenzae lub jego fragmenty są nośnikiem dla opartych na polisacharydzie kompozycji immunogennych, w tym szczepionek. Stosowanie tego nośnika jest szczególnie korzystne w szczepionkach skojarzonych.
Kompozycja immunogenna według wynalazku obejmuje wiele koniugowanych antygenów polisacharydowych składających się z antygenu polisacharydowego pochodzącego z patogennej bakterii skoniugowanego z białkiem D z Haemophilus influenzae lub fragmentem białka D zawierającym epitopy komórek T pomocniczych.
Korzystnie antygen polisacharydowy jest wybrany z grupy składającej się z: polisacharydów Vi z Salmonella typhi, polisacharydów meningokokowych, polisacharydów i zmodyfikowanych polisacharydów z meningokoków grupy B, polisacharydów ze Staphylococcus aureus, polisacharydów ze Streptococcus agalactiae, polisacharydów ze Streptococcus pneumoniae, polisacharydów z mykobakterii, polisacharydów z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydów z nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharydu otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydów z Moraxella catharralis, lipopolisacharydów z Shigella sonnei oraz lipopeptydofosfoglikanu (LPPG) z Trypanosoma cruzi.
Korzystna kompozycja immunogenna według wynalazku obejmuje antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące z co najmniej czterech serotypów Streptococcus pneumoniae. Korzystnie antygeny polisacharydowe skoniugowane z białkiem D pochodzą z kombinacji serotypów A, C lub Y T N. meningitidis.
Korzystna kompozycja obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki z Haemophilus influenzae b, meningokoka C i meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z biał kiem D z H. influenzae, pod warunkiem, ż e polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca.
Korzystna jest też kompozycja, która obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki ze Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b, meningokoka C oraz meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z białkiem D z H. influenzae, pod warunkiem, że polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca.
Kompozycja immunogenna według wynalazku, korzystnie dodatkowo zawiera adiuwant.
Korzystnie skoniugowany antygen polisacharydowy-białko D jest zaadsorbowany na fosforanie glinu.
Korzystnie adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi Th1, który obejmuje przynajmniej jeden spośród: 3D-MPL, saponinowego czynnika immunostymulującego i immunostymulującego oligonukleotydu CpG.
Wynalazek obejmuje określoną powyżej kompozycję do stosowania jako lek.
W zakres wynalazku wchodzi też szczepionka, która zawiera kompozycję immunogenną wedł ug wynalazku.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej wobec wielu patogennych bakterii, który obejmuje etapy:
izolowania wielu antygenów polisacharydowych z patogennych bakterii; aktywacji polisacharydów;
koniugowania polisacharydów z białkiem D z H. influenzae; oraz mieszania skoniugowanych polisacharydów.
Wynalazek obejmuje też zastosowanie skutecznej ilości kompozycji immunogennej według wynalazku do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia patogenną bakterią.
PL 204 890 B1
A) Szczepionki z polisacharydów pneumokoków
Niniejszy wynalazek dostarcza ulepszoną szczepionkę szczególnie dla zapobiegania lub łagodzenia zakażeń pneumokokowych u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci).
W kontekś cie wynalazku pacjent jest uważ any za osobę starszą , jeś li ma ponad 55 lat, typowo ponad 60 lat i bardziej ogólnie ponad 65 lat.
Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku zawiera kompozycję immunogenną, która zawiera antygeny polisacharydowe pochodzące z przynajmniej czterech serotypów pneumokoków. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 7 serotypów, na przykład pochodzące z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 11 serotypów, na przykład pochodzące z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie koniugowanych).W korzystnym wykonaniu wynalazku włączonych jest przynajmniej 13 skoniugowanych antygenów polisacharydowych, choć dalsze polisacharydowe antygeny, na przykład 23-walentne (takie jak serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są też objęte wynalazkiem.
Dla szczepienia osób starszych (na przykład dla zapobiegania zapaleniu płuc) jest korzystne włączenie serotypów 8 i 12F (i najbardziej korzystnie także 15 i 22) do opisanej 11-walentnej kompozycji immunogennej, podczas gdy dla niemowląt i małych dzieci (gdzie chodzi o zapalenie ucha środkowego) korzystnie włącza się serotypy 6A i 19A, aby wytworzyć szczepionkę 13-walentną.
W kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się nowy nośnik dla polisacharydów, którym jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty zawierające epitopy pomocniczych komórek T. W szczególności fragment białka D będzie korzystnie zawierał N-końcową 1/3 białka.
Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinową taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być to sole wapnia, żelaza lub cynku, lub może to być nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowe lub anionowe pochodne polisacharydów, lub polifosfazeny.
Korzystny adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu Th1, który wspomaga ramię komórkowe odpowiedzi odpornościowej.
Wysokie poziomy cytokin typu Th1 sprzyjają zazwyczaj indukcji komórkowych odpowiedzi odpornościowych na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 zazwyczaj sprzyjają indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych na antygen.
Należy pamiętać, że różnica między odpowiedzią odpornościową typu Th1 i Th2 nie jest bezwzględna. W rzeczywistości u danej osoby wystąpi odpowiedź odpornościowa, którą można opisać jako przede wszystkim Th1 lub przede wszystkim Th2. Jednak często dogodnie rozważa się rodziny cytokin w terminach opisanych dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z produkcją INF-γ i cytokin IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi odpornościowej typu Th1 nie są produkowane przez komórki T, takie jak IL-12. Przeciwnie, odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Odpowiednie systemy adiuwantowe, które sprzyjają odpowiedzi przede wszystkim Th1, obejmująmonofosforylolipid A lub jego pochodną szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipd A, i kombinację monofosforylolipidu A, korzystnie 3-O-deacylowanego monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL), razem z solą glinu.
Ulepszony system obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, szczególnie kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153 lub kompozycję mniej reaktogenną, gdzie QS21 jest wygaszony cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739.
Szczególnie silną formulacją adiuwantu obejmującą QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie opisano w WO 95/17210 i jest to korzystna formulacja.
Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, bardziej korzystnie QS21. Formulacja może też zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol (WO 95/17210).
Oligonukleotydy zawierające niemetylowany CpG (WO 96/02555) są także korzystnymi induktorami odpowiedzi Th1 i są odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku.
PL 204 890 B1
Według jednego z wykonań wynalazku kompozycja zawiera koniugat polisacharydu pneumokoków i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL), który jest zdolny do serokonwersji lub indukcji odpowiedzi humoralnej przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu w populacji nieodpowiadającej.
Wiadomo, że 10-30% populacji nie reaguje na immunizację polisacharydami (nie odpowiadają na ponad 50% serotypów w szczepionce) (Konradsen i wsp., Scand. J. Immun 40:251 (1994); Rodriquez i wsp., JID, 173: 1347 (1996)). Może też być tak w przypadku szczepionek koniugowanych (Musher i wsp. Clin. Inf. Dis. 27:1487 (1998). Może być to szczególnie poważne w obszarach wysokiego zagrożenia populacji (niemowlęta, małe dzieci i osoby starsze).
Obecni wynalazcy stwierdzili, że kombinacja koniugowanego polisacharydu pneumokoków (na które część populacji może mieć niską odpowiedź) z adiuwantem Th1 może zadziwiająco obejść ten brak odpowiedzi. Korzystnie powinien być stosowany 3D-MPL, a najbardziej korzystnie 3D-MPL pozbawiony adiuwantu na bazie glinu (co daje jeszcze lepszą odpowiedź). Niniejszy wynalazek dostarcza więc takich kompozycji, które umożliwiają leczenie osób nie reagujących na polisacharydy pneumokoków.
Sposób zapobiegania lub łagodzenia zapalenia płuc u osób starszych obejmuje podanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki tu opisanej, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i adiuwant Th1 temu starszemu pacjentowi.
Również sposób zapobiegania lub łagodzenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub małych dzieci obejmuje podanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki tu opisanej zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i adiuwant Th1 temu niemowlęciu lub małemu dziecku.
Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do chronienia lub leczenia ssaka podatnego na zakażenie przez podanie tej szczepionki drogą ogólnoustrojową lub przez śluzówki. Te podania mogą obejmować iniekcje przez drogi domięśniowe, dootrzewnowe, śródskórne lub podskórne lub przez podanie śluzówkowe do dróg ustnych/pokarmowych, oddechowych i moczowo-płciowych. Do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego korzystne jest donosowe podanie szczepionek (ponieważ można bardziej skutecznie zapobiec nosicielstwu pneumokoków w nosogardzieli, w ten sposób osłabiając zakażenie w jego najwcześniejszym stadium).
Ilość koniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość będzie zmienna w zależności od tego, który specyficzny immunogen jest stosowany i jak jest prezentowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 0,1 - 100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1 - 50 μg, korzystnie 0,1-10 μg, z czego 1 do 5 μg jest najbardziej korzystnym zakresem.
Optymalne ilości składników dla danej szczepionki można ustalić przez standardowe badania obejmujące obserwację odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u osobników. Po wstępnym szczepieniu, osobnicy mogą otrzymywać jedno lub więcej odpowiednio rozłożonych w czasie szczepień przypominających.
Przygotowanie szczepionki jest ogólnie opisane w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach“ (wyd. Powell M.F. i Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nowy Jork). Kapsułkowanie w obrębie liposomów jest opisane przez Fullerton, opis patentowy USA 4,235,877.
Dla celów niniejszego wynalazku określenie „koniugaty polisacharydów pneumokoków według wynalazku” obejmuje te koniugaty polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae, które są bardziej immunogenne w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu (na przykład koniugaty serotypu 4, serotypu 6B, serotypu 18C, serotypu 19F, lub serotypu 23F).
Dla celów niniejszego wynalazku określenie „zasadniczo wolna od adiuwantów na bazie glinu” obejmuje kompozycję, która nie zawiera dostatecznej ilości adiuwantu na bazie glinu (na przykład wodorotlenku glinu i w szczególności fosforanu glinu), aby spowodować jakiekolwiek zmniejszenie immunogenności koniugatu polisacharydu pneumokoków w kompozycji według wynalazku w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL bez dodanego adiuwantu na bazie glinu. Korzystnie kompozycja antygenowa powinna zawierać adiuwant, który składa się zasadniczo z 3D-MPL. Ilości adiuwantu na bazie glinu dodawane na dawkę powinny korzystnie być mniejsze niż 50 μg, bardziej korzystnie mniejsze niż 30 μg, jeszcze bardziej korzystnie mniejsze niż 10 μg i najbardziej korzystnie immunogenne kompozycje według wynalazku nie zawierają adiuwantu na bazie glinu.
Dla celów niniejszego wynalazku określenie, czy koniugat polisacharydu pneumokoków jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu, powinno być prowadzone jak opisano w Przykładzie 2. Jako wskazanie czy kompozycja jest znacząco bardziej immunogenna, gdy zawiera sam
PL 204 890 B1
3D-MPL, stosunek stężenia GMC IgG (określony jak w Przykładzie 2) między kompozycjami zawierającymi sam 3D-MPL w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL w połączeniu z fosforanem glinu jako adiuwantem powinien być większy niż 2, korzystnie większy niż 5, bardziej korzystnie większy niż 7, jeszcze bardziej korzystnie większy niż 9 i jeszcze bardziej korzystnie większy niż 14.
Wśród problemów związanym z podejściem polisacharydowym do szczepienia jest fakt, że polisacharydy jako takie są słabo immunogenne. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują podłączenie polisacharydu do dużych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T. Jest korzystne by pneumokokowe polisacharydy w kompozycji według wynalazku były podłączone do nośnika białkowego, który zapewnia pomoc obecnych komórek T. Przykłady takich nośników, które mogą być stosowane obejmują anatoksynę dyfterytu, mutanta dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD) i OMPC Neisseria meningitidis.
Według wynalazku nośnikiem białkowym jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B) lub jego fragmenty.
W jednym wykonaniu kompozycja antygenowa według wynalazku zawiera polisacharyd pneumokoków serotyp (PS) 4 skoniugowany z białkiem immunogennym D i formułowany z adiuwantem 3D-MPL, przy czym ta kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. W dalszych wykonaniach kompozycja antygenowa obejmuje PS 6B, 18C, 19F lub 23F, odpowiednio, skoniugowane z biał kiem immunogennym i formuł owane z adiuwantem 3D-MPL przy czym kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
W jeszcze dalszym wykonaniu wynalazku dostarczona jest skojarzona kompozycja antygenowa zawierająca dwa lub więcej koniugaty polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
Na immunogenność koniugatów pneumokokowych polisacharydów według wynalazku nie wpływa znacząco kombinacja z innymi koniugatami polisacharydów pneumokoków (Przykład 3). Kompozycja immunogenna według wynalazku jest kombinowaną kompozycją antygenową zawierającą jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków w kombinacji z jednym lub więcej dalszych koniugatów polisacharydów pneumokoków, sformułowana z adiuwantem 3D-MPL, ale jest zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu.
W dalszych korzystnych wykonaniach wynalazku dostarczone są skojarzone kompozycje antygenowe, które zawierają przynajmniej jeden, a korzystnie 2, 3, 4 lub wszystkie 5 z koniugatów polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, i w dodatku dowolną kombinację innych koniugatów polisacharydów pneumokoków, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL ale zasadniczo pozbawionych adiuwantów na bazie glinu.
Typowo skojarzona kompozycja antygenowa Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku będzie zawierała koniugowane antygeny polisacharydowe, które pochodzą z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub dwudziestu trzech serotypów.
Kompozycje antygenowe według wynalazku są korzystnie stosowane w szczepionkach, które stosuje się aby zapobiegać (lub leczyć) zakażenia pneumokokami, szczególnie u osób starszych i niemowląt i małych dzieci.
Korzystnie kompozycje immunogenne (i szczepionki) opisane tu uprzednio są liofilizowane aż do momentu stosowania, gdy są rekonstytuowane rozcieńczalnikiem. Bardziej korzystnie są liofilizowane w obecności 3D-MPL i są rekonstytuowane roztworem soli fizjologicznej.
Liofilizacja kompozycji daje w efekcie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zapobiega rozpadowi antygenów polisacharydów). Proces jest też zadziwiająco odpowiedzialny za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokoków. Wykazano, że ma to szczególne znaczenie dla koniugatów PS 6B.
Trend do szczepionek skojarzonych ma zaletę zmniejszenia niedogodności u biorcy, ułatwienia rozkładu szczepień, i zapewnienia zakończenia cyklu szczepień; ale istnieje zarazem równoczesne ryzyko zmniejszenia skuteczności szczepionki (patrz dyskusja o supresji epitopu przez nadużycie białek nośnikowych powyżej). Byłoby więc korzystne przygotowanie kombinacji szczepionek, które spełniają potrzeby populacji i które dodatkowo nie wykazują interferencji immunogennej między składnikami. Te korzyści mogą być uzyskane przez kompozycje immunogenne (lub szczepionki) według wynalazku, które są szczególnie korzystnie do podawania kombinowanych szczepionek grupom wysokiego ryzyka, takim jak niemowlęta, małe dzieci lub osoby starsze.
PL 204 890 B1
Białko D, które jest składnikiem koniugatu z polisacharydem bakteryjnym, jest białkiem wiążącym IgD z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 BI) i jest potencjalnym immunogenem.
Polisacharydy do koniugacji z białkiem D obejmują korzystnie, antygen polisacharydowy Vi przeciwko Salmonella typhi, polisacharydy meningokoków (w tym typ A, C, W 135 i Y, i polisacharyd i modyfikowane polisacharydy meningokoków grupy B), polisacharydy ze Staphylococcus aureus, polisacharydy ze Streptococcus agalactiae, polisacharydy z Streptococcus pneumoniae, polisacharydy z Mycobacterium np. Mycobacterium tuberculosis (takie jak mannofosfoinozytydy trehalozy, kwas mykolinowy, arabinomannany zakończone mannozą otoczka z nich i arabinogalaktany), polisacharyd z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydy nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharyd otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydy Moraxella catharralis, lipopolisacharydy Shigella sonnei, lipopeptydofosfoglikan (LPPG) Trypanosoma cruzi.
Polisacharyd może być połączony z białkiem nośnikowym dowolnym znanym sposobem (na przykład Likhite, opis patentowy USA, 4,372,945 i Armor i wsp., opis patentowy US 4,474,757). Korzystnie przeprowadza się koniugację CDAP (WO 95/08348).
W CDAP do syntezy koniugatów polisacharyd-biał ko jest korzystnie stosowany odczynnik cyjanylujący, tetrafluoroboran 1-cyjano-dimetyloamonopirydyniowy (CDAP). Reakcja cyjanylacji może być przeprowadzona w stosunkowo łagodnych warunkach, przez co unika się hydrolizy polisacharydów wrażliwych na zasady. Ta synteza pozwala na bezpośrednie połączenie z białkiem nośnikowym.
Polisacharyd jest solubilizowany w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. CDAP rozpuszcza się w acetonitrylu i dodaje natychmiast do roztworu polisacharydu. CDAP reaguje z grupami hydroksylowymi polisacharydu tworząc ester cyjanowy. Po etapie aktywacji dodaje się białko nośnikowe. Grupy aminowe lizyny reagują z aktywowanym polisacharydem tworząc kowalencyjne wiązanie izomocznikowe.
Po reakcji sprzęgania dodaje się duży nadmiar glicyny, by wygasić resztkowe aktywowane grupy funkcyjne. Produkt następnie poddaje się sączeniu w żelu, aby usunąć nieprzereagowane białko nośnikowe i resztkowe odczynniki. Tak więc, sposób produkcji koniugatów polisacharyd-białko D obejmuje etap aktywacji polisacharydu i połączenia polisacharydu z białkiem D.
W korzystnym wykonaniu według wynalazku dostarczona jest formulacja kompozycji immunogennej (lub szczepionki) dla zapobiegania zakażeniom Streptococcus pneumoniae.
Mechanizmy, za pomocą których pneumokoki rozchodzą się do płuca, płynu mózgowordzeniowego i krwi, są słabo zrozumiane. Wzrost bakterii osiągających normalne pęcherzyki płucne jest hamowany przez ich stosunkową suchość i aktywność fagocytową makro fagów pęcherzykowych. Każde zmiany anatomiczne lub fizjologiczne tych skoordynowanych mechanizmów obrony mają skłonność do zwiększania podatności płuc na zakażenie. Ściana komórkowa Streptococcus pneumoniae odgrywa ważną rolę w generacji odpowiedzi zapalnej w pęcherzykach płuca (Gillespie i wsp. (1997)I&I 65:3936).
Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według niniejszego wynalazku będzie zawierała koniugaty polisacharydowe z białkiem D, w których polisacharyd pochodzi z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub 23 serotypów, a kombinacja serotypów zależy od choroby, która ma być leczona.
W dalszym wykonaniu dostarczona jest szczepionka Neisseria meningitidis, w szczególnoś ci z serotypów A, B, C W-135 i Y. Neiserria meningitidis jest jednym z najważ niejszych ź ródeł bakteryjnego zapalenia opon mózgowych. Otoczka węglowodanowa tych organizmów może działać jako determinanta wirulencji i cel dla przeciwciała ochronnego. Jednak wiadomo, że węglowodany są słabymi immunogenami u małych dzieci. Zgodnie z wynalazkiem dostarczony jest szczególnie odpowiedni nośnik białkowy dla tych polisacharydów, białko D, które dostarcza epitopy komórek T, które mogą aktywować odpowiedź komórek T, aby pomóc w proliferacji i dojrzewaniu komórek B specyficznej dla antygenu polisacharydowego, jak i w indukcji pamięci immunologicznej.
W alternatywnym wykonaniu wynalazku kompozycja obejmuje koniugat polisacharyd otoczki Haemophilus influenzae b (PRP)-białko D.
Wynalazek obejmuje też szczepionki skojarzone, które dostarczają ochrony przed szeregiem różnych patogenów. Białko D jako nośnik jest nieoczekiwanie użyteczne jako nośnik w szczepionkach skojarzonych, zawierających wiele koniugowanych antygenów polisacharydowych. Jak wspomniano powyżej, jest prawdopodobne zajście supresji epitopu jeśli dla każdego polisacharydu jest stosowany ten sam nośnik. W WO 98/51339 przedstawiono kompozycje, w których próbowano zminimalizować tę interferencję przez koniugację części polisacharydów w kompozycji na DT i resztę na TT.
PL 204 890 B1
Nieoczekiwanie, obecni wynalazcy stwierdzili, że białko D jest szczególnie odpowiednie do minimalizacji takich efektów supresji epitopów w szczepionkach skojarzonych, w których wszystkie antygeny są koniugowane z białkiem D.
Korzystna kombinacja obejmuje szczepionkę, która nadaje ochronę przed zakażeniem Neisseria meningitidis C i Y (i korzystnie A) zawierająca antygen polisacharydowy z jednego lub więcej z serotypów Y i C (i najbardziej korzystnie A) połączony z białkiem D.
Szczepionka oparta na polisacharydzie z Haemophilus influenzae (PRP koniugowany z korzystnie TT, DT lub CRM197, lub najbardziej korzystnie z białkiem D) może być sformułowana z powyższymi szczepionkami skojarzonymi.
Wiele szczepionek pediatrycznych jest obecnie podawanych jako szczepionka skojarzona, tak aby zmniejszyć liczbę iniekcji, które dziecko musi otrzymać. Tak więc dla szczepionek pediatrycznych inne antygeny mogą być formułowane ze szczepionkami według wynalazku. Na przykład, szczepionki według wynalazku mogą być formułowane z lub podawane oddzielnie ale w tym samym czasie ze znaną „triwalentną” szczepionką skojarzoną zawierającą anatoksynę dyfterytu (DT), anatoksynę tężca (TT) i składniki kokluszu (typowo detoksyfikowaną anatoksynę kokluszu (PT) i filamentalną hemaglutyninę (FHA) ewentualnie z pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], na przykład jak sprzedawana szczepionka INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), która zawiera antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub z całymi komórkami bakterii wywołującej koklusz, na przykład jak sprzedawana przez SmithKlineBeecham Biologicals s.a. jako Tritanrix™. Szczepionka skojarzona może też zawierać inne antygeny, takie jak antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg), antygeny wirusa polio (na przykład inaktywowany triwalentny wirus polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalnego Haemophilus influenzae, białka zewnętrznej błony N. meningitidis B.
Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis w szczepionce skojarzonej (szczególnie dla zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: OMP106 [WO 97/41731( Amtex) i WO 96/34960 (PMC)]. OMP21; LbpA i LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA i TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME i wsp. (1993) Infect Immun, 61:2003-2010]; UspAl/2 [WO 93/03761 (University of Texas); i OmpCD. Przykłady antygenów nietypowalnego Haemophilus influenzae, które mogą być włączone do szczepionki skojarzonej (szczególnie do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbryny [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] i fuzje zawierające pochodzące stąd peptydy [np. fuzje peptydowe LB1(f); US 5843464(OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA i TbpB; Hia; Hmw1,2; Hap i D15.
Korzystne szczepionki pediatryczne rozważane przez niniejszy wynalazek obejmują:
a) Koniugat polisacharydu C N. meningitidis i koniugat polisacharydu Haemophilus influenzae b, ewentualnie z koniugatem polisacharydu N. meningitidis A i/lub Y, pod warunkiem, że wszystkie polisacharydy są skoniugowane z białkiem D.
b) Szczepionka a) z DT, TT, składnikami kokluszu (korzystnie PT, FHA i PRN), antygenem powierzchniowym wirusowego zapalenia wątroby typu B i IPV (inaktywowana triwalentna szczepionka wirusa polio).
c) Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae koniugowane z białkiem D.
d) Szczepionka c) z jednym lub więcej antygenami z Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnego Haemophilus influenzae.
Wszystkie powyższe szczepionki skojarzone mogą skorzystać z włączenia białka D jako nośnika. Jest jasne, że im więcej nośników bierze udział w skojarzonej szczepionce (na przykład by zapobiec supresji epitopu) tym droższa i bardziej złożona będzie ostateczna szczepionka. Zatem uzyskuje się znaczne korzyści, gdy wszystkie antygeny polisacharydowe są koniugowane z białkiem D.
W szczepionce według wynalazku antygeny polisacharydowe z białkiem D korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinową taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być solą wapnia, żelaza lub cynku, lub mogą być nierozpuszczalną zawiesiną acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, lub polifosfazenami.
Do szczepionek dla osób starszych korzystnie adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu Th1.
Białko D jest korzystnie stosowane w szczepionce przeciwko zapaleniu ucha środkowego, ponieważ samo jest immunogenem zdolnym do generowania ochrony z udziałem komórek B przeciwko nietypowalnym H. influenzae (ntHi), które mogą wnikać do komórek gospodarza i unikać efektów z udziałem komórek B indukowanych przez antygen białkowy. Obecni wynalazcy wykryli nieoczekiwanie
PL 204 890 B1 znaleźli sposób zwiększenia skuteczności białka D (albo samego albo jako nośnika dla polisacharydu) jako antygenu dla szczepionki przeciw zapaleniu ucha środkowego. Sposób ten polega na dodaniu adiuwantu do białka D, co indukuje silną odpowiedź Th1 u pacjenta tak, że ramię komórkowe układu odpornościowego jest optymalizowane przeciw białku D. Jest to nieoczekiwanie osiągnięte przez stosowanie liofilizowanej kompozycji zawierającej białko D i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL), która jest rekonstytuowana krótko przed podaniem.
W szerszym znaczeniu wynalazcy przewidują że liofilizacja immunogenu w obecności adiuwantu Th1, korzystnie 3D-MPL, zazwyczaj będzie wzmagała odpowiedź Th1 przeciw immunogenowi.
P r z y k ł a d y
Przykłady ilustrują lecz nie ograniczają wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Polisacharyd otoczki S. pneumoniae:
11-walentny kandydat na szczepionkę obejmuje serotypy polisacharydów otoczki 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, przygotowane zasadniczo tak jak opisano w EP 72513. Każdy polisacharyd jest aktywowany i derywatyzowany metodą chemii CDAP (WO 95/08348) i koniugowany z nośnikiem białkowym. Wszystkie polisacharydy koniuguje się w ich formie natywnej, oprócz serotypu 3 (którego rozmiar zmniejszono w celu obniżenia jego lepkości).
Nośnik białkowy:
Wybranym nośnikiem białkowym jest zrekombinowane białko D (PD) z nietypowalnego Haemophilus influenzae, wyrażane w E. coli.
Ekspresja białka D
Białko D z Haemophilus influenzae
Konstrukty genetyczne do ekspresji białka D
Materiały wyjściowe
DNA kodujący białko D
Białko D jest silnie konserwowane pośród wszystkich serotypów H. influenze i szczepów nietypowalnych. Wektor pHIC348 zawierający sekwencję DNA kodującą całe białko D otrzymano od dr A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. Sekwencja DNA białka D została opublikowana przez Janson i wsp. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.
Wektor ekspresyjny pMG1
Wektor ekspresyjny pMG1 pochodzi od pBR322 (Grossi i wsp., 1985), do którego wprowadzono elementy kontrolne dla transkrypcji i translacji wstawionych obcych genów, pochodzące z bakteriofaga λ, (Shatzman i wsp., 1983). Ponadto gen oporności na ampicylinę zastąpiono genem oporności na kanamycynę.
Szczep E. coli AR58
Szczep E. coli AR58 uzyskano przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cI857 .\H1). N99 i SA500 są szczepami E. coli K12 pochodzącymi z laboratorium dr Martina Rosenberga w National Health Institute.
Wektor ekspresyjny wektora pMG1
W celu produkcji białka D, DNA kodujący białko wklonowano do wektora ekspresyjnego pMG 1. Plazmid ten do kierowania transkrypcją i translacją wstawionych obcych genów wykorzystuje sygnały z DNA faga lambda. Wektor zawiera promotor PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystywania (NutL i NutR) do uwolnienia mechanizmów polarności transkrypcyjnej po dostarczeniu białka N (Gross i wsp., 1985). Wektory zawierające promotor PL wprowadza się do lizogenicznego szczepu E. coli aby stabilizować DNA plazmidowy. Lizogeniczne szczepy gospodarze zawierają wadliwy pod względem replikacji DNA faga lambda wintegrowany w genom (Shatzman i wsp., 1983). Chromosomowy DNA faga lambda kieruje syntezą białka represora cl, które wiąże się z represorem OL w wektorze i zapobiega wiązaniu się polimerazy RNA z promotorem PL, a więc transkrypcji wstawionego genu. Gen cl szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera mutanta termowrażliwego, tak że, transkrypcja kierowana przez PL może być regulowana przez zmianę temperatury, tj. wzrost temperatury hodowli inaktywuje represor i rozpoczyna się synteza obcego białka. System ekspresyjny pozwala na kontrolowaną syntezę obcych białek, szczególnie takich, które mogą być toksyczne dla komórki (Shimataka i Rosenberg, 1981). Szczep E. coli AR58
Lizogeniczny szczep E. coli wykorzystywany do produkcji nośnikowego białka D jest pochodną standardowego szczepu E. coli K12 z NIH - N99 (F- su- galK2, lacZ-, thr-). Zawiera wadliwy lizogenny
PL 204 890 B1 fag lambda (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΗ1). Fenotyp Kil- zapobiega wyłączeniu syntezy makrocząsteczek gospodarza. Mutacja cI857 nadaje patologiczną zmianę termo wrażliwą represorowi cl. Delecja .\H1 usuwa prawy operon faga lambda i loci gospodarza bio, uvr3 i chlA. Szczep AR58 uzyskano przez transdukcję N99 wyjściową zawiesiną faga P1 wcześniej hodowanego na pochodnej SA500 (ga- 1E::TN10, lambdaKil- cI857 \H1). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selekcjonowano na tetracyklinie dzięki obecności transpozonu TN10 kodującego oporność na tetracyklinę w przylegającym genie galE.
Konstrukcja wektora pMGMDPPrD
Wektora pMG 1, który zawiera gen kodujący niestrukturalne białko S1 wirusa grypy (pMGNSI) użyto do skonstruowania pMGMDPPrD. Gen białka D amplifikowano techniką PCR z wektora pHIC348 (Janson i wsp., 1991) za pomocą starterów do PCR zawierających miejsca restrykcyjne Ncol i Xbal, odpowiednio, na końcach 5' i 3'. Fragment NcoI/Xbal następnie wprowadzono do pMGNS1 między Ncol i Xbal, w ten sposób tworząc fuzję białkową zawierającą 81 N-końcowych aminokwasów białka NS1, po których następuje białko PD. Wektor ten oznaczono jako pMGNS1PrD.
W oparciu o konstrukt opisany powyżej wytworzono ostateczny konstrukt do ekspresji białka D. Fragment BamHI/BamHI usunięto z pMGNS1PrD. Taka hydroliza DNA usuwa region kodujący NS1, oprócz pierwszych trzech N-końcowych aminokwasów. Po ponownej ligacji wektora, wytworzono gen kodujący fuzję białkową o następującej sekwencji aminokwasowej na N końcu:
----MDP SSHSSNMANT---NS1 Białko D
Białko D nie zawiera peptydu liderowego lub N-końcowej cysteiny, do której normalnie przyłączone są łańcuchy lipidowe. Białko nie jest więc ani wydzielane do periplazmy, ani lipidowane i pozostaje w cytoplazmie w formie rozpuszczalnej.
Końcowy konstrukt pMG-MDPPrD wprowadzono do szczepu gospodarza AR58 przez szok temperaturowy w 37°C. Bakterie zawierające plazmid selekcjonowano w obecności kanamycyny. Obecność wstawki DNA kodującego białko D wykazano przez trawienie wyizolowanego DNA plazmidu wybranymi endonukleazami. Zrekombinowany szczep E. coli określono jako ECD4.
Ekspresja białka D jest pod kontrolą promotora lambda PL/operatora OL. Szczep gospodarz AR58 zawiera w genomie termo wrażliwy gen cl, który przez wiązanie z OL blokuje ekspresję z lambda PL w niskiej temperaturze. Gdy temperatura się podniesie, cl uwalnia się z OL i białko D ulega ekspresji. Pod koniec fermentacji komórki zagęszcza się i zamraża.
Ekstrakcję z zebranych komórek i oczyszczanie białka D przeprowadzono w następujący sposób. Zamrożony osad hodowli komórek rozmrożono i zawieszono w roztworze do rozrywania komórek (bufor cytrynianowy pH 6,0) do końcowego OD650 = 60. Zawiesinę dwukrotnie przepuszczano przez homogenizator wysokociśnieniowy przy P = 100 Pa. Homogenat hodowli komórek klarowano przez wirowanie i szczątki komórek usuwano przez filtrację. Na pierwszym etapie oczyszczania filtrowany lizat nanoszono na kolumnę do chromatografii kationowymiennej (SP Sepharose Fast Flow™). PD wiąże się z matrycą żelową przez oddziaływanie jonowe i jest wypłukiwane przez stopniowy wzrost siły jonowej buforu do wypłukiwania.
Na drugim etapie oczyszczania zanieczyszczenia zatrzymują się na matrycy anionowymiennej (Q Sepharose Fast Flow). PD nie wiąże się z żelem i można je zebrać z cieczą przepływającą.
Na obu etapach chromatografii kolumnowej zbieranie frakcji śledzi się przez OD. Ciecz wypływającą z anionowymiennej chromatografii kolumnowej zawierającą oczyszczone białko D zagęszcza się przez ultrafiltrację.
Retentat z ultrafiltracji zawierający białko D na końcu przepuszcza się przez błonę 0,2 μm. Chemia
Aktywacja i chemia sprzęgania:
Warunki aktywacji i sprzęgania są specyficzne dla każdego polisacharydu. Podano je w Tabeli 1. Natywne polisacharydy (oprócz PS3) rozpuszczano w 2M NaCl lub w wodzie do wstrzykiwania. Optymalne stężenie polisacharydów ustalono dla wszystkich serotypów.
Ze 100 mg/ml roztworu wyjściowego w acetonitrylu, dodano CDAP (stosunek CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) do roztworu polisacharydu. 1,5 minuty później dodano 0,2M trietyloaminy, aby otrzymać specyficzne pH aktywacji. Aktywację polisacharydu przeprowadzano w tym pH w ciągu 2 minut w 25°C. Białko D (ilość zależy od początkowego stosunku PS/PD) dodano do aktywowanego polisacharydu i przeprowadzono reakcję sprzęgania w specyficznym pH przez 1 godzinę. Reakcję następnie tłumiono glicyną przez 30 minut w 25°C i przez noc w 4°C.
PL 204 890 B1
Koniugaty oczyszczano przez filtrację w żelu używając kolumny do filtracji żelowej Sephacryl™ 500HR zrównoważonej 0,2M NaCl.
Oznaczono zawartość białka i węglowodanu w wypłukanych frakcjach. Koniugaty połączono w pule i sterylnie filtrowano na błonie sterylizującej 0,22 μm. Oznaczono stosunki PS/Białko w preparatach koniugatów.
Charakteryzowanie:
Scharakteryzowano wszystkie koniugaty, które pasowały do specyfikacji opisanych w Tabeli 2. Zawartość polisacharydów (ig/ml) zmierzono testem rezorcynolowym a zawartość białka (ig/ml) testem Lowry'ego. Końcowy stosunek wagowy PS/PD określono jako stosunek stężeń.
Resztkowa zawartość DMAP (ng/ig PS):
Aktywacja polisacharydu przez CDAP wprowadza do polisacharydu grupę cyjanianową i uwalniana jest DMAP (4-dimetyloaminopirydyna). Resztkową zawartość DMAP określono za pomocą specyficznego testu rozwiniętego na SB.
Zawartość wolnych polisacharydów (%):
Zawartość wolnych polisacharydów w koniugatach trzymanych w 4°C lub przechowywanych 7 dni w 37°C określono w supernatancie otrzymanym po inkubacji z przeciwciałami α-PD i nasyconym siarczanem amonowym, po wirowaniu.
Do określenia ilości wolnych polisacharydów w supernatancie użyto α-PS/a-PS ELISA. Nieobecność koniugatu także kontrolowano przez α-PD/a-PS ELISA. Obniżanie ilości wolnych polisacharydów prowadzi do polepszenia szczepionki z koniugatu.
Antygenowość:
Antygenowość analizowano w tych samych koniugatach testem ELISA typu kanapkowego, gdzie, odpowiednio α-PS i α-PD wiązały i wykrywały przeciwciała.
Zawartość wolnych białek (%):
Poziom resztkowego „wolnego” białka D oznaczono stosując metodę z traktowaniem próbki SDS. Koniugat podgrzewano 10 min w 100°C w obecności 0,1% SDS i wstrzykiwano na kolumnę do filtracji żelowej SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Białko D jest dimerem, stąd istnieje ryzyko przeszacowania poziomu „wolnego” białka D przez dysocjację struktury przez SDS.
Wielkość cząsteczki (Kav):
Określenie wielkości cząsteczki przeprowadzono na kolumnie do filtracji żelowej SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL).
Stabilność:
Stabilność mierzono przez filtrację żelową SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL) dla koniugatów trzymanych w 4°C lub przechowywanych 7 dni w 37°C.
Charakterystyki 11-walentów podano w Tabeli 2
Koniugaty białkowe można adsorbować na fosforanie glinu i łączyć w pule, aby uzyskać ostateczną szczepionkę.
Wniosek:
Wyprodukowano koniugaty immunogenne, które jak dotąd wykazano, są składnikami obiecującej szczepionki. Opracowano zoptymalizowane warunki CDAP prowadzące do lepszej jakości końcowego skoniugowanego polisacharydowego produktu pneumokokowego dla każdego z 11 antygenów. Koniugaty tych polisacharydów pneumokokowych, które można otrzymać w powyższym ulepszonym (zoptymalizowanym) procesie CDAP (niezależnie od białka nośnikowego, ale korzystnie będącego białkiem D), są więc dalszym aspektem wynalazku.
P r z y k ł a d 2 - Badanie wpływu zaawansowanych adiuwantów na immunogenność szczepionki 11-walentnej będącej koniugatem pneumokokowego PS-PD u nowonarodzonych szczurów
Nowonarodzone szczury immunizowano szczepionką 11-walentną będącą koniugatem pneumokokowego PS-PD, w dawce 0,1 ig każdego polisacharydu (wytworzonego zgodnie z techniką z przykładu 1), i stosowano następujące formulacje adiuwantów: brak, AlPO4, 3D-MPL, 3D-MPL na AIPO4.
Formulacja oparta jedynie na 3D-MPL była statystycznie (i zadziwiająco) bardziej immunogenna (najwyższy GMC IgG) niż inne formulacje dla 5 z 11 antygenów. Sprawdziło się to zarówno przy dużych jak i przy małych stężeniach 3D-MPL.
Opsonofagocytoza potwierdziła wyniki GMC.
PL 204 890 B1
Materiały i metody
Protokół immunizacji
Nowonarodzone szczury OFA losowo przydzielono różnym matkom i gdy miały 7 dni po raz pierwszy poddano immunizacji. Dodatkowo poddano je immunizacji jeszcze 2 razy, 14 i 28 dni później. Skrwawianie przeprowadzono 56 dnia (28 dni po III). Wszystkie szczepionki wstrzykiwano podskórnie, a w grupie był o 10 szczurów na szczepionkę .
Szczury immunizowano szczepionką 11-walentną będącą koniugatem pneumokokowym, obejmującą następujące serotypy polisacharydów skoniugowanych z białkiem D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.
Formulacja
Aby zbadać wpływ różnych zaawansowanych adiuwantów, dawkę koniugatu utrzymywano na stałym poziomie 0,1 μg każdego polisacharydu, a adiuwanty AlPO4 i 3D-MPL formułowano w różnych dawkach i kombinacjach, w tym również brak adiuwantu. Wymieniono je liczbowo w Tabeli 3 w celu odniesienia.
Adsorpcja na AIPO4
Stężone, adsorbowane monowalentne PS-PD przygotowano zgodnie z następującą procedurą. 50 μg AIPO4 (pH 5,1) zmieszano z 5 μg skoniugowanego polisacharydu przez 2 godziny. pH doprowadzono do 5,1 i mieszaninę pozostawiono na następne 16 godzin. W celu doprowadzenia stężenia soli do 150 mM dodano 1500 mM NaCl. Po 5 minutach dodano 5 mg/ml 2-fenoksyetanolu. Po kolejnych 30 minutach pH doprowadzono do 6,1 i pozostawiono na więcej niż 3 dni w 4°C.
Przygotowanie rozcieńczalników
Trzy rozcieńczalniki przygotowano w 150 mM NaCl/ 5mg/ml fenoksyetanolu
A: AIPO4 o stężeniu 1 mg/ml
B: 3D-MPL na AIPO4 o stężeniach odpowiednio 250 i 1000 μg/ml. Stosunek wagowy 3D-MPL/AIPO4 = 5/20
C: 3D-MPL na AIPO4 o stężeniach odpowiednio 561 i 1000 μg/ml. Stosunek wagowy 3D-MPL/AlPO4 = 50/89
Przygotowanie zaadsorbowanej undekawalentnej kompozycji
Jedenaście stężonych, zaadsorbowanych monowalentnych PS-PD zmieszano w prawidłowym stosunku. Uzupełnienie z AIPO4 dodano jako rozcieńczalnik A. Gdy to było potrzebne, dodano 3D-MPL, albo jako roztwór wodny (nie zaadsorbowany, sposób 1 patrz niżej), albo jako rozcieńczalnik B lub C (3D-MPL zaadsorbowane na AIPO4 w dwóch dawkach, sposób 2, patrz niżej).
Sposób 1
3D-MPL dodano do kombinacji zaadsorbowanych koniugatów jako zawiesinę wodną. Zmieszano z kompozycją undekawalentną przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przechowywano w 4°C do czasu podawania.
Sposób 2
3D-MPL wcześniej adsorbowano na AIPO4 przed dodaniem do kombinacji zaadsorbowanych koniugatów (rozcieńczalnik B i C). Aby przygotować 1 ml rozcieńczalnika, wodną zawiesinę 3D-MPL (250 lub 561 μg) mieszano z 1 mg AIPO4 w 150 Mm NaCl, pH 6,3 przez 5 minut, w temperaturze pokojowej. Roztwór ten rozcieńczono w NaCl pH 6,1/ fenoksy i inkubowano przez noc w 4°C. Przygotowanie niezaadsorbowanej undekawalentnej kompozycji
Jedenaście koniugatów PS-PD zmieszano i rozcieńczono w odpowiednim stosunku w 150 mM NaCl pH 6,1, fenoksy. Gdy to było potrzebne, dodano 3D-MPL jako roztwór (nie adsorbowany)
Formulacje do wszystkich iniekcji przygotowano na 18 dni przed pierwszym podawaniem.
ELISA
Przeprowadzono test ELISA, aby zmierzyć szczurze IgG stosując protokół pochodzący z warsztatów WHO dotyczących procedury ELISA do ustalania ilości przeciwciała IgG przeciw polisacharydom otoczki Streptococcus pneumoniae w surowicy ludzkiej. W istocie, oczyszczony polisacharyd otoczki opłaszcza się bezpośrednio na płytce mikrotitracyjnej. Próbki osocza preinkubuje się z polisacharydem ściany komórkowej powszechnym dla wszystkich pneumokoków (substancja C) i stanowiącym około 0,5% polisacharydów pneumokokowych oczyszczonych według ujawnienia (EP 72513 B1). Do wykrycia związanego szczurzego IgG zastosowano odczynniki Jackson ImmunoLaboratories Inc. Krzywe miana odnoszono do standardów wewnętrznych (przeciwciała monoklonalne) modelowanych przez logistyczne równanie log. Obliczenia przeprowadzono stosując oprogramowanie SoftMax Pro.
PL 204 890 B1
Maksymalny błąd bezwzględny oczekiwany dla tych wyników był w granicach czynnika 2. Względny błąd jest niniejszy niż 30%.
Opsonofagocytoza
Miana opsoniczne oznaczono dla serotypów 3, 6B, 7F, 14, 19F i 23F stosując protokół CDC (Streptococcus pneumoniae Opsonophagocytosis using Differentiated HL60 cells, wersja 1,1) z oczyszczonym ludzkim PMN i dopełniaczem z młodych królików. Modyfikacje obejmowały wykorzystanie posiadanych przez autorów szczepów pneumokoków i komórki fagocytujące HL60 zastąpiono oczyszczonymi komórkami zasadochłonnymi PMN (istnieje duży stopień korelacji między tymi komórkami fagocytującymi). Dodatkowo dodano 3 mm kulki szklane do studzienek mikrotitracyjnych, aby zwiększyć mieszanie, co pozwoliło na zmniejszenie stosunku fagocyt:bakterie, który rekomendowano jako 400.
Wyniki
Stężenia IgG
Stężenia IgG będące średnią geometryczną ustalono dla każdego serotypu i PD pokazano w tabelach 4 do 10. Dla serotypów 6B, 14, 19F i 23F włączono dla porównania poprzednie wyniki otrzymane dla formulacji tetrawalentnej.
Najwyższe stężenia IgG podkreślono w Tabelach 4 do 10. Statystyczna wartość p dla kompozycji 3D-MPL względem 3D-MPL/AlPO4 jest w Tabeli 11. Formulacja adiuwantu adiuwanta numer 4 (nie adsorbowane koniugaty o wysokiej dawce 3D-MPL) daje najwyższe GMC dla 9 z 11 przypadków. W 5/11 przypadków, MPL w niskiej dawce jest drugim najbardziej immunogennym. Dodatkowo, wprowadzenie adiuwanta daje wyższe GMN niż modyfikacja dawki dla wszystkich serotypów (dane nie prezentowane) i jest to istotne statystycznie dla serotypów 4, 6B, 7F, 18C i 23F (p<0,05 z 95% CI). Opsonofagocytoza
Wyniki opsonofagocytozy na spulowanych osoczach pokazano dla serotypów 3, 6B, 7F, 14, 19F i 23F w Tabelach 4 do 8. Dla większości te miana opsoniczne potwierdzają GMC IgG. Rzeczywiście, korelacja ze stężeniami IgG jest większa niż 85% dla serotypów 6B, 19F, 23F (dane nie prezentowane). Dla serotypu 3, istotne jest zwrócenie uwagi, że tylko grupa 3D-MPL indukowała aktywność opsoniczną powyżej wartości granicznej.
Wnioski
W tym eksperymencie nieoczekiwanym było, że zastosowanie samego 3D-MPL będzie indukować najwyższe stężenia IgG.
Maksymalne GMC IgG otrzymane dla modyfikacji adiuwanta porównano z maksymalnym GMC otrzymanym dla modyfikacji dawki PS i stwierdzono, że 3D-MPL może indukować znacząco wyższą odpowiedź w 5/11 serotypów.
Tabela 11 pokazuje, że gdy porównuje się kompozycje 3D-MPL i 3D-MPL/AlPO4 (porównując proces tworzenia i dawkę 3D-MPL), 5 z koniugatów polisacharydów jest znacząco polepszonych pod kątem immunogenności, gdy są formułowane tylko z 3D-MPL niż z 3D-MPL plus AlPO4: PS 4, PS 6B,
PS 18C, PS 19F i PS 23F.
P r z y k ł a d 3 - Badanie wpływu kombinacji na immunogenność koniugatów PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F u dorosłych szczurów
Dorosłe szczury immunizowano szczepionkami koniugatu pneumokokowego polisacharydu-białka D albo indywidualnie, albo w kombinacji w kompozycji multiwalentnej (tetra-, penta-, heptaalbo dekawalentnej). Grupy po 10 szczurów immunizowano dwukrotnie w odstępie 28 dni i testowe skrwawienie przeprowadzano dnia 28 i 42 (14 dni po drugiej dawce).
Osocza badano testem ELI SA na przeciwciała IgG przeciw polisacharydom pneumokokowym. Wszystkie koniugaty indukowały specyficzne przeciwciała IgG mierzone testem ELISA. Tabela 12 pokazuje wpływ kombinacji koniugatów monowalentnych PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F z białkiem D na ich immunogenność u dorosłych szczurów, jak zmierzono przez stężenie IgG 14 dni po drugiej dawce.
Analizę statystyczną przeprowadzono dla wszystkich próbek, aby ustalić, czy różnice w stężeniu przeciwciał w zależności od kombinacji były istotne. Kombinacja któregokolwiek z koniugatów serotypów PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F z białkiem D w szczepionce multiwalentnej nie zmieniała znacząco ich immunogenności.
PL 204 890 B1
T a b e l a 1.
Warunki specyficznej aktywacji/sprzęgania/wygaszania koniugatów PS S. pneumoniae-Białko D
Serotyp 1 3 (μ płyn.) 4 5 6B 7F
Stężenie PS (mg/ml) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
Rozpuszczalnik dla PS NaCl 2M NaCl 2M H2O H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (wagowy) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
Serotyp 9V 14 18C 19F 23F
Stężenie PS (mg/ml) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3
Rozpuszczalnik dla PS NaCl 2M NaCl 2M H2O NaCl 2M NaCl 2M
Stężenie PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Początkowy stosunek PS/PD (wagowy) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
Stężenie CDAP (mg/mg PS)* 0,75 0.75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHq 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0/ 10/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
T a b e l a 2.
Specyfikacje 11-walentnej szczepionki pneumokokowej PS-PD (pierwsze numery kodu w nagłówku wskazują na serotyp)
Kryteria D01PDJ227 D03PDJ236 D04PDJ228 D05PDJ235 D06PDJ209
1 2 3 4 5 6
Stosunek PS/białko (wagowy) 1/,066 1/1,09 1/0,86 1/0,86 1/0,69
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 1 1 7 9 0
Zawartość wolnych białek (%) <15% 8 <1 19 21 9
Zawartość DMAP (ng^g PS) < 0,5 ng^g PS 0,2 0,6 0,4 1,2 0,3
Wielkość cząsteczki (Kav) 0,18 0,13 0,12 0,11 0,13
Stabilność brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia niewielkie przesunięcie brak przesunięcia
Kryteria D07PDJ225 D09PDJ222 D14PDJ202 D18PDJ221 D19PDJ206
Stosunek PS/białko (wagowy) 1/0,58 1/0,80 1/0,68 1/0,62 1/0,45
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 1 <1 <1 4 4
Zawartość wolnych białek (%) <15% 8 0,3 3 21 10
PL 204 890 B1 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5 6
Zawartość DMAP (ng/pg PS) < 0,5 ng/pg PS 0,1 0,6 0,3 0,2 0,1
Wielkość cząsteczki (Kav) 0,14 0,14 0,17 0,10 0,12
Stabilność brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia brak przesunięcia przesunięcie
Kryteria D23PDJ212
Stosunek PS/białko (wagowy) 1/0,74
Zawartość wolnych polisacharydów (%) <10% 0
Zawartość wolnych białek (%) <15% 12
Zawartość DMAP (ng/pg PS) < 0,5 ng/pg PS 0,9
Wielkość cząsteczki (Kav) 0,12
Stabilność brak przesunięcia
T a b e l a 3.
Tabela podsumowująca formulacje adiuwantów badane z 11-walentną pneumokokową PS-PD u nowonarodzonych szczurów
Grupa AlPO4 MPL Metoda Opis
1 Brak
2 100 AlPO4
3 5 Mało MPL
4 50 Dużo MPL
5 100 5 Sposób 1 Sposób 1 mało
6 100 50 Sposób 1 Sposób 1 dużo
7 100 5 Sposób 2 Sposób 2 mało
8 100 50 Sposób 2 Sposób 2 dużo
T a b e l a 4.
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypu 6B (i porównanie z immunizacją tetrawalentną)
Grupa AlPO4 pg MPL pg Metoda 6B GMC IgG (pg /ml) Serokonwersja 6B Miano opso- niczne 6B* 6B GMC IgG (pg /ml) Serokonwersja 6B Miano opso- niczne 6B*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0,047 2/10 12,5 0,004 1/10 <6,25
2 100 0,048 4/10 65 0,019 4/10 <6,25
3 5 1,345 10/10 43
PL 204 890 B1 cd. tabeli 4
4 50 4,927 10/10 192
5 100 5 1 0,042 7/10 <6,25
6 100 50 1 0,255 10/10 <6,25
7 100 5 2 0,033 3/10 <6,25 0,048 8/10 <6,25
8 100 50 2 0,057 8/10 <6,25
T a b e l a 5.
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypu 14 (i porównanie z immunizacją tetrawalentną)
Grupa AlPO4 MPL Metoda 14 GMC Serokon- Miano 6B GMC Serokon- Miano
ig ig IgG (ig/ml) wersja 14 opsoniczne 14* IgG (ig/ml) wersja 14 opsoniczne 14*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,046 3/10 64 0,022 3/10 <6,25
2 100 0,99 10/10 88 0,237 8/10 27
3 5 0,233 10/10 41
4 50 0,676 10/10 81
5 100 5 1 0,460 9/10 67
6 100 50 1 0,477 10/10 98
7 100 5 2 0,81 10/10 49 0,165 8/10 81
8 100 50 2 1,611 10/10 133
T a b e l a 6.
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypu 19F (i porównanie z immunizacją tetrawalentną)
Grupa AIPO4 ig MPL ig Metoda 19F GMC IgG (ig/ml) Serokonwersja 19F Miano opsoniczne 19F* 19F GMC IgG ig/ml) Serokonwersja 19F Miano opsoniczne 19F*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,04 2/10 64 0,021 2/10 <6,25
2 100 1,07 9/10 367 0,222 7/10 79
3 5 4.028 10/10 296
4 50 21,411 10/10 1276
5 100 5 1 1,649 10/10 172
6 100 50 1 2,818 10/10 208
7 100 5 2 1,09 10/10 193 0,766 10/10 323
8 100 50 2 3,539 10/10 241
PL 204 890 B1
T a b e l a 7.
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypu 23F (i porównanie z immunizacją tetrawalentną)
Grupa AlPO4 pg MPL pg Metoda 23F GMC IgG (pg/ml) Serokon- wersja 23 F Miano opsoniczne 23F* 23F GMC IgG (pg/ml) Serokonwersja 23F Miano opsoniczne 23F*
Tetrawalentna Undekawalentna
1 0,06 2/10 <6,25 0,152 3/10 <6,25
2 100 0,29 10/10 70 0,56 8/10 <6,25
3 5 2,296 9/10 389
4 50 4,969 10/10 >1600
5 100 5 1 0,462 5/10 17
6 100 50 1 0,635 8/10 54
7 100 5 2 0,38 10/10 <6,25 0,203 3/10 18
8 100 50 2 0,501 7/10 43
T a b e l a 8.
Średnia geometryczna stężenia IgG, serokonwersja i średnie miano opsoniczne w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypów 3 i 7F
Grupa AIPO4 pg MPL pg Metoda GMC IgG (pg/ml) 3 Serokon- wersja 3 Miano opso- niczne GMC IgG (pg/ml) 7F Serokonwer- sja 7F Miano opso- niczne 7F*
1 0,003 1/10 <6,25 0,040 7/10 <6,25
2 100 0,008 6/10 <6,25 0,25 9/10 43
3 5 0,070 10/10 <6,25 2,435 10/10 477
4 50 0,108 10/10 18 2,569 10/10 332
5 100 5 1 0,015 10/10 <6,25 0,579 10/10 54
6 100 50 1 0,027 10/10 <6,25 0,611 9/10 59
7 100 5 2 0,006 10/10 <6,25 0,154 8/10 30
8 100 50 2 0,034 10/10 <6,25 0,638 9/10 140
T a b e l a 9.
Średnia geometryczna stężenia IgG i serokonwersja w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypów 1, 4 i 5
Grupa AIPO4 pg MPL pg Metoda GMC IgG (pg/ml) 1 Serokon- wersja 1 GMC IgG (pg/ml) 4 Serokon- wersja 4 GMC IgG (pg/ml) 5 Serokon- wersja 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0,026 4/10 0,005 0/10 0,040 3/10
2 100 0,282 8/10 0,052 5/10 0,774 9/10
3 5 1,614 10/10 3,452 10/10 7,927 10/10
4 50 2,261 10/10 7,102 10/10 13,974 10/10
5 100 5 1 0,568 10/10 0,676 10/10 3,015 10/10
6 100 50 1 1,430 10/10 0,419 9/10 5,755 10/10
PL 204 890 B1 cd. tabeli 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7 100 5 2 0,478 10/10 0,267 9/10 2,062 10/10
8 100 50 2 1,458 10/10 0,423 10/10 5,009 10/10
T a b e l a 10.
Średnia geometryczna stężenia IgG i serokonwersja w dniu 28 po III immunizacji nowonarodzonych szczurów 11-walentną PS-PD z różnymi adiuwantami dla serotypów 9V, 18C, i PD
Grupa AlPO4 μg MPL μg Metoda GMC IgG ^g/ml) 9V Sero- konwer- sja 9V GMC IgG ^g/ml) 18C Sero- konwer- sja 18C GMC IgG ^g/ml) PD Sero- konwer- sja PD
1 0,018 0/10 0,013 1/10 0,003 0/10
2 100 0,489 6/10 0,092 5/10 0,993 10/10
3 5 0,482 7/10 6,560 10/10 3,349 10/10
4 50 11,421 10/10 14,023 10/10 5,446 10/10
5 100 5 1 2,133 9/10 0,690 10/10 11,407 10/10
6 100 50 1 2,558 10/10 1,771 10/10 1,258 10/10
7 100 5 2 1,536 10/10 0,528 10/10 1,665 8/10
8 100 50 2 2,448 9/10 0,980 10/10 5,665 10/10
T a b e l a 11.
Istotność statystyczna (wartość p), czy niektóre koniugaty polisacharydów pneumokokowych poprawiły immunogenność, gdy były formułowane z samym 3D-MPL względem 3D-MPL/AlPO4. Wartość p poniżej 0,01 jest uważana za silnie istotną. Sposób 1 i Sposób 2 oznaczają technikę formułowania.
serotyp 50 μg 3D-N4PL względem 3D-MPL/AIPO4 5μg 3D-MPL względem 3D-MPL/AIPO4
Sposób 1 Sposób 2 Sposób 1 Sposób 2
1 0,3 0,05 0,079 0,11
3 0,075 0,01 0,27 0,008
4 0,002 0,0003 0,02 0,003
5 0,04 0,002 0,1 0,12
6B 0,001 0,0001 0,001 0,0006
7F 0,13 0,15 0,01 0,005
9V 0,02 0,02 0,1 0,04
14 0,65 0,21 0,3 0,66
18C 0,0008 0,0002 0,006 0,004
19F 0,0009 0,006 0,21 0,04
23F 0,002 0,0004 0,01 0,0004
T a b e l a 12.
Średnia geometryczna stężenia IgG ^g/mL) w 14 dniu po drugiej dawce po immunizacji dorosłych szczurów 1,0 μg szczepionki samego koniugatu polisacharyd-białko D lub w kombinacji tetrawalentnej, pentawalentnej, heptawalentnej lub dekawalentnej szczepionki. Dane te stanowią kombinację 5 oddzielnych eksperymentów.
Serotypy szczepionki 4 H 6B T 18C H 19F T 23F T
Sam 9,3 0,11 15 5,2 2,5
W kombinacji 4 0,23 3,7 3,7 2,8
PL 204 890 B1
T: w kombinacji szczepionki tetrawalentnej (T) (PS 6B, 14, 19F, 23F), pentawalentnej (T plus PS3), heptawalentnej (H) (T plus PS 4, 9V i 18C) i dekawalentnej (H) plus PS 1, 5 i 7F). H: w kombinacji szczepionki heptawalentnej (H) (T plus PS 4, 9V i 18C) i dekawalentnej (H plus PS 1, 5 i 7F).
P r z y k ł a d 4
Korzystny wpływ dodania pneumolizyny i 3D-MPL na wydajność ochronną polisacharydowej 11-walentnej szczepionki skoniugowanej z PD przeciw pneumokokowej kolonizacji płuc u myszy Odczyty immunologiczne
Dawkowanie specyficznych dla pneumolizyny IgG osocza przy ELISA
Płytki immunologiczne Maxisorp Nunc opłaszczano przez 2 godziny w 37°C 100 μl/studzienkę rekombinowanej natywnej pneumolizyny (PLY) o stężeniu 2 μg/ml rozcieńczonej PBS. Płytki 3 razy płukano buforem 0,9% NaCl, 0,005% Tween-20. Następnie, jako krzywą standardową podawano seryjne dwukrotne rozcieńczenia (w PBS/Tween-20 0,005%, 100 μl na studzienkę) referencyjnej surowicy przeciw-PLY (rozpoczynając od 670 ng/ml IgG) i próbki surowicy (rozpoczynając od rozcieńczenia 1/10 inkubowano przez 30 minut w 20°C poddając wstrząsaniu. Po płukaniu, jak opisano wcześniej, skoniugowane z peroksydazą kozie IgG przeciw myszy (Jackson) rozcieńczone 5000 x w PBS/Tween-20 0,05% inkubowano (100 studzienkę) przez 30 minut w 20°C poddając wstrząsaniu. Po płukaniu, płytki inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 100 μl/studzienkę buforu wywołującego (4 mg/ml OPDA i 0,05% H2O2 w 100 mM buforze cytrynianowym pH 4,5). Wywoływanie zatrzymywano przez dodanie 50 μl/studzienkę 1N HCl. Gęstości optyczne odczytywano przy 490 i 620 nm za pomocą immunoczytnika Emax (Molecular Devices). Miano przeciwciał obliczano 4-parametrową metodą matematyczną wykorzystując oprogramowanie SoftMaxPro.
Inhibicja hemolizy
Ten test przeprowadzono w celu zmierzenia zdolności przeciwciał surowicy do hamowania aktywności hemolitycznej pneumolizyny (PLY). W celu wyeliminowania cholesterolu (podatnego na oddziaływania z PLY), próbki surowicy traktowano 2x w następujący sposób: mieszano je z 1 równą objętością chloroformu i następnie inkubowano przez 45 minut poddając wytrząsaniu. Supernatanty zbierano po wirowaniu przez 10 minut przy 1000 obr./min. Oczyszczone z cholesterolu surowice rozcieńczano (seryjne dwukrotne rozcieńczenia w 1 mM ditiotreitolu, 0,01% BSA, 15 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,5) w mikropłytkach o 96 studzienkach (Nunc). Pięćdziesiąt μl roztworu zawierającego 4HU (ang. Hemolisis Unit, jednostka hemolizy) PLY dodano do każdej studzienki i inkubowano przez 15 minut w 37°C. Następnie dodano 100 μl czerwonych krwinek owcy (roztwór 1%) na 30 minut w 37°C. Po wirowaniu przez 10 minut przy 1000 obr./min zebrano supernatanty (150 μθ i naniesiono na następną mikropłytkę o 96 studzienkach w celu odczytania gęstości optycznej przy 405 nm. Wyniki wyrażono jako punkt środkowy mian rozcieńczeń.
Chemiczna detoksykacja pneumolizyny
Rekombinowaną natywną pneumolizynę (PLY) dializowano wobec buforu 50 mM fosforan 500 mM NaCl, pH 7,6. Wszystkie następne etapy przeprowadzano w 39,5°C przy epizodycznym wytrząsaniu. Dnia 1 do roztworu PLY dodano 10% Tween-80 (1/250 obj./obj.), 57,4 mM N-acetylotryptofanu pH 7,6 (3/100 obj./obj.), 2,2 M glicyny w buforze fosforanowym (1/100 obj./obj.) i 10% formaldehyd w buforze fosforanowym (3/100 obj./obj.). Dnia 2 i 3 znów dodano 10% formaldehyd w stosunkach odpowiednio 3/100 obj./obj. i 2/100 obj./obj.. Inkubację w 39,5°C podtrzymywano do dnia 7 przy epizodycznym wytrząsaniu. Na koniec PLY dializowano wobec buforu 50 mM fosforan 500 mM NaCl pH 7,6. Całkowitą inaktywację PLY wykazano w teście hemolitycznym.
Pneumokokowa prowokacja wewnątrznosowa u myszy OF1
Siedem tygodniowych samic myszy OF1 donosowo inokulowano pod znieczuleniem 5·105 CFU zaadaptowanego do myszy serotypu 6B S. pneumoniae. Płuca usuwano 6 godzin po prowokacji i homogenizowano (Ultramax, 24000 obr/min 4°C) w pożywce Todd Hewith Broth (THB, Gibco). Seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia homogenatów płuc umieszczano przez noc w 37°C na płytkach Petriego zawierających agar THB uzupełniony ekstraktem drożdżowym. Infekcję pneumokokową płuc ustalano jako liczbę CFU/mysz, wyrażaną jako logarytmiczna średnia ważona. Granicą detekcji było 2,14 log CFU/mysz.
P r z y k ł a d 4A.
Wpływ adiuwantu 3D-MPL na odpowiedź immunologiczną przeciw pneumolizynie
W niniejszym przykładzie oceniliśmy wpływ dodania adiuwantu 3D-MPL na odpowiedź immunologiczną na natywną rekombinowaną pneumolizynę (PLY, dostarczona przez J. Paton, Children's
PL 204 890 B1
Hospital, North Adelaide, Australia) i jej chemicznie detoksykowany odpowiednik (DPLY). Chemiczną detoksyfikację przeprowadzono jak opisano powyżej.
Grupy 10 6-tygodniowych samic myszy Balb/c immunizowano domięśniowo w dniu 0, 14 i 21 1 pg PLY lub DPLY zawartym albo w A: AlPO4 100 pg albo w B: AlPO4 100 pg + 5 pg 3D-MPL (3-de-O-acylowany monofosforylolipid A, dostarczony przez Ribi Immunochem). Figury 1A i 1B przedstawiają miana ELISA IgG i hamowania hemolizy (HLI) mierzonych w surowicach po-III.
Niezależnie od antygenu najlepsze odpowiedzi odpornościowe były indukowane u zwierząt szczepionych formulacjami uzupełnionymi 3D-MPL. Interesujące jest, że DPLY był równie immunogenny jak PLY, gdy był podany z AlPO4 + 3D-MPL, podczas gdy był słabszym immunogenem w formulacji z AlPO4. To wykazało korzystną zdolność 3D-MPL do poprawiania odpowiedzi przeciwciał na detoksyfikowaną pneumolizynę.
W kompozycjach zawierających pneumolizynę może być korzystne stosowanie chemicznie modyfikowanych detoksyfikowanych pneumolizyn raczej niż mutacyjnie detoksyfikowanych pneumolizyn, ponieważ detoksyfikowane mutanty nadal mają resztkową aktywność toksyny - chemicznie detoksyfikowaną pneumolizyna jej nie posiada. Zatem, kompozycje zawierające pneumolizynę (lub mutanty pneumolizyny), które były chemicznie detoksyfikowane do stosowania w szczepionce, powinny zawierać jako adiuwant adiuwant Th1, korzystnie 3D-MPL.
P r z y k ł a d 4B.
Korzystny wpływ dodania atenuowanego mutanta pneumolizyny i adiuwantu 3D-MPL na ochronną skuteczność skoniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej przeciwko kolonizacji płuc przez pneumokoki u myszy OF1 prowokowanych donosowo serotypem 6B
W niniejszym przykładzie ocenialiśmy skuteczność profilaktyczną szczepionki zawierającej 11-walentny koniugat polisacharyd-białko D, atenuowany zmutowany antygen pneumolizyny (PdB, WO 90/06951) i adiuwanty AIPO4 + 3D-MPL, w porównaniu z klasyczną adsorbowaną na AIPO4 formulacją koniugatu 11-walentny polisacharyd - białko D.
Grupy 12 samic 4-tygodniowych myszy OF1 immunizowano podskórnie w dniu 0 i 14 formulacjami zawierającymi A: 50 pg AIPO4; B: 0,1 pg PS/serotyp skoniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej + 50 pg AlPO4; lub C: 0,1 pg PS/serotyp koniugowanej z PD 11-walentnej szczepionki polisacharydowej + 10 pg PdB (dostarczony przez J. Paton, Children's Hospital, Adelaide, Australia) + 50 pg AIPO4 + 5 pg 3D-MPL (dostarczony przez Ribi Immunochem). Prowokację stosowano w dniu 21, jak opisano powyżej.
Jak przedstawiono na Figurze 1C, bardzo znaczącą ochronę (p < 0,007) nadawała 11-walentna szczepionka oparta na koniugowanym polisacharydzie uzupełniona PdB i z adiuwantem AIPO4 + MPL (czarne słupki przedstawiają średnią arytmetyczną). Przeciwnie, nie stwierdzono znaczącej ochrony u zwierząt immunizowanych formulacją 11-walentny koniugat polisacharydowy/AlPO4. Wynik udowodnił, że dodatek antygenu pneumolizyny (nawet atenuowanego) i adiuwantu 3D-MPL zwiększał skuteczność 11-walentnej polisacharydowej szczepionki koniugowanej przeciwko zapaleniu płuc.
P r z y k ł a d 4C.
Korelacje immunologiczne ochrony wykazanej w Przykładzie 4B
Aby ustalić korelacje immunologiczne ochrony nadawanej w przykładzie 4B przez 11-walentną szczepionkę z koniugatu polisacharydowego uzupełnioną atenuowaną zmutowaną pneumolizyną (pdB) i 3D-MPL, zmierzono odpowiedzi serologiczne przeciwciał przed prowokacją na polisacharyd 6B i PdB jak opisano powyżej.
Następnie porównano miana przeciwciał do liczb kolonii bakterii mierzonych w płucach odpowiednich zwierząt zebranych 6 godzin po prowokacji. Wyliczono R2 na regresjach liniowych log/log.
Wyliczone R2 były równe 0,18 i 0,02 dla odpowiedzi przeciwciał anty-PdD i anty-6B, odpowiednio. Wykazało to brak korelacji pomiędzy humoralnymi odpowiedziami odpornościowymi i ochroną dla obu antygenów. Miana przeciwciał anty-6B nie były znacząco różne w grupach immunizowanych 11-walentną koniugowaną szczepionką (GMT = 0,318 ng/ml) lub tą sama szczepionką uzupełnioną PdD i 3D MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Tak więc ulepszona ochrona obserwowana z formulacją C nie była wyłącznie wynikiem wyższej odpowiedzi przeciwciał na polisacharyd 6B.
Razem wzięte wyniki sugerują, że w ochronie nie pośredniczyły same humoralne odpowiedzi immunologiczne, ale raczej także odporność komórkowa indukowana przez antygen PdB w obecności 3D-MPL. Dało to dodatkowe poparcie dla dodania antygenów białkowych (antygenu białkowego) i silnych adiuwantów (adiuwantu) do koniugowanej szczepionki polisacharydu pneumokoków tak by koordynować oba ramiona układu odpornościowego dla optymalnej ochrony.
PL 204 890 B1
P r z y k ł a d 5 - Kooperacja obu ramion układu odpornościowego u myszy aktywnie immunizowanych pneumolizyną i biernie immunizowanych przeciwciałami przeciwko pneumokokowym PS P r z y k ł a d 5A - Określenie stężenia biernie podawanego przeciwciała anty-6B-polisacharyd (anty PS) chroniącego przed zapaleniem płuc
Metoda
Grupy szczepień: Immunizowano biernie cztery grupy po 16 myszy (i.p.) w dniu -1 100 μl nierozcieńczonych surowic szczura przeciw polisacharydom według grup wyszczególnionych poniżej (razem 64 myszy).
Grupa Specyficzność Stężenie IgG w surowicach odpornościowych
G1 a-PS-6B 5 gg/ml
G2 a-PS-6B 2 gg/ml
G3 a-PS-6B 0,75 gg/ml
G4 kontrola 0 gg/ml
Zwierzęta: 64 samce myszy CD-1 z Charles River, Kanada, ważące około 35 g (około 10-tygodniowe).
Znieczulanie: Myszy znieczulono izofiuranem (3%) plus O2 (1 l/min).
Organizm: S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) zebrano z płytek agarowych z tryptykazą sojową (TSA) uzupełnioną 5% krwią końską i zawieszono w 6 ml PBS. Bezpośrednio przed zakażeniem 1 ml zawiesiny bakterii rozcieńczono do 9 ml schłodzonego topionego agaru odżywczego (BBL) i trzymano w 4°C. Myszy otrzymały około 6,0 log10 cfu/mysz w objętości 50 gl.
Zakażenie: W dniu 0 myszy znieczulono jak opisano powyżej i zakażono S. pneumoniae N1387 (50 gl schłodzonej zawiesiny bakterii) za pomocą nasączania dooskrzelowego za pomocą niechirurgicznej dotchawicowej intubacji. Sposób ten opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999).
Próbki: W dniu 3 po zakażeniu 8 myszy/grupę uśmiercono za pomocą przedawkowania CO2 i płuca wycięto i homogenizowano w 1 ml PBS. Przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w PBS, aby wyliczyć liczby żywotnych bakterii. Próbki nanoszono (20 gl) w trzech powtórzeniach na płytki TSA uzupełnione 5% krwią końską i inkubowano przez noc w 37°C przed oceną. Dalsze zestawy myszy uśmiercono w dniu 7 i pobierano próbki jak powyżej.
Wyniki
Stężenie IgG w surowicach szczura (gg/ml) Liczba bakterii (log 10 cfu/płuco) w dniach po zakażeniu
3 8
5 6,7±0,7 (1/7) 7,2±0,7 (5/8)
2 6,5±0,7 (1/7) 6,9±1,8 (4/7)
0,75 7,7±0,5 (5/8) 4,8±1,4 (2/8)
0 6,7±1,5 (3/6) 6,3+1,5 (3/9)
Liczby w nawiasach są liczbą zwierząt, które padły przed czasem pobrania próbki.
Wniosek: Ogólnie nie było znaczącej różnicy w liczbie bakterii izolowanych z dowolnej z grup badanych. Oznacza to, że anty-polisacharyd nie dawał mierzalnej ochrony w stężeniach do i włącznie z 5 gg/ml.
Jest to podobne do tego, co obserwuje się w niektórych ludzkich badaniach klinicznych, to znaczy przeciwciała przeciw polisacharydom jest niewystarczające, aby chronić przez pneumokokowym zapaleniem płuc w pewnych populacjach.
P r z y k ł a d 5B - Określenie ochrony przed zapaleniem płuc nadawanej przez aktywne podanie Ply (pneumolizyny) z lub bez adiuwantu i synergia z suboptymalnym przeciwciałem anty-PS.
PL 204 890 B1
Metoda
Zwierzęta: 128 samców myszy CD-1 (wiek 6 tygodni przy immunizacji, 10 tygodni przy zakażeniu) z Charles River, St. Constant, Quebec, Kanada. Zwierzęta ważyły około 20 g po 6 tygodniach i 38 g po 10 tygodniach.
Immunizacje: Sześć grup po 16 myszy immunizowano przez iniekcję podskórną w dniach -22 i -14
100 μ! szczepionki, jak wyszczególniono poniżej. (Całość 128 myszy). PdB (WO 90/06951) uzyskano dzięki uprzejmości Dr Jamesa Patona, Australia. 3D-MPL był otrzymany od Ribi/Corixa.
W dniu -1 specyficzne grupy (patrz Tabela poniżej) były immunizowane (i.p. 100 μθ biernie stężeniem 4,26 μg/ml (4 ml 5 μg/ml + 1,3 ml 2 μg/ml) mysiego przeciwciała anty-polisacharyd.
Grupa Objętość iniekcji aktywna Szczepionka podawana w dniach -22, -14 (dawka μg) Objętość iniekcji bierna Bierna IgG (dzień -1)
1-1 100 μl s.c. PdB/AlPO4 (10/50) Brak
1-2 100 μl s.c. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50) Brak
1-3 100 μl s.c. PdB/AlPO4 (10/50) 100 μl i.p. α-PS
1-4 100 μl s.c. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50) 100 μl s.c. α-PS
1-5 100 μl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) 100 μl s.c. α-PS
1-6 100 μl s.c. MPL/AlPO4 (5/50) Brak
Zakażenie: W dniu 0 myszy znieczulano (3% izofluran plus 1 l/min O2). Inokula bakteryjne przygotowano przez zebranie rosnących S. pneumoniae N1387 (serotyp 6) z płytek agarowych z tryptykazą sojową (TSA) uzupełnioną 5% krwią końską i zawieszono w 6 ml PBS. Bezpośrednio przed zakażeniem przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenie (1 ml plus 9 ml) w schłodzonym stopionym agarze odżywczym (trzymanym w 41°C). Myszy zakażono za pomocą nasączania dooskrzelowego za pomocą niechirurgicznej dotchawicowej intubacji (BBL) i otrzymały około 6,0 log10 cfu/mysz w objętości 50 μΚ Sposób ten opisali Woodnut i Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Próbki: W dniu 72 po zakażeniu uśmiercono 8 myszy/grupę za pomocą przedawkowania CO2 i płuca wycięto i homogenizowano w 1 ml PBS. Przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w PBS, aby wyliczyć liczby żywotnych bakterii. Próbki naniesiono (20 μθ w trzech powtórzeniach na płytki TSA uzupełnione 5% krwią końską i inkubowano przez noc w 37°C przed oceną. Dalsze zestawy myszy uśmiercono w dniu 8 po zakażeniu i pobierano próbki jak powyżej.
Analiza danych
Miarą wyjściową dla porównania terapii była liczba bakterii w płucach w dniu 3 i 7 po zakażeniu. Wyniki są przedstawione jako średnie grupy z odchyleniami standardowymi. Przeprowadzono analizę statystyczną stosując test t Studenta, gdzie wartość P < 0,05 była uznana za znaczącą.
Wyniki godz. po zakażeniu
Zliczenia bakterii z grupy 1-4 były znacząco niższe (p<0,05) niż z grupy 1-3.
Zliczenia bakterii z grupy 1-4 były znacząco niższe (p<0,05) niż z grupy 1-5.
168 godz. po zakażeniu
Liczby bakterii we wszystkich grupach były około 2 logarytmy niższe po 8 dniach niż po 3 dniach, wskazując że infekcja ustępowała.
Zliczenia bakterii z grupy 1-2 były znacząco niższe (p<0,05) niż z grupy 1-5.
Grupa Dzień 3 Dzień 8
Log CFU/płuco odchylenie standardowe Log CFU/płuco odchylenie standardowe
1 2 3 4 5
1-1 6,93 0,61 5,23 1,28
1-2 6,59 1,25 4,08 1,34
PL 204 890 B1 cd.
1 2 3 4 5
1-3 7,09 0,8 5,32 1,26
1-4 6,09 1,43 4,46 2,32
1-5 7,19 0,89 5,42 1,05
1-6 6,68 1,14 5,01 1,48
Jak wykazano powyżej, samo przeciwciało anty-polisacharyd nie daje ochrony przed wzrostem pneumokoków w płucu. PdB z AIPO4 jako adiuwantem także nie daje ochrony, ale w dniu 8 jest skłonność do ochrony, gdy PdB jest kombinowany z 3D-MPL (grupa 1-2).
W dniu 3, najbardziej znacząco chroniona grupa 1-4, miała wszystkie cztery elementy PdB, 3D-MPL i biernie podane przeciwciał o anty-polisacharyd. Ten wniosek jest podtrzymywany przez czę stość śmiertelności. Grupa 1-4 miała tylko 2/8 zgonów w porównaniu z 5/10 dla grup 1-5 i 1-3.
Wniosek:
Ponieważ eksperyment przeprowadzono z biernie immunizowanymi zwierzętami, efekt synergistyczny także aktywnej immunizacji pneumolizyną i MPL nie może być wynikiem wzrostu poziomu przeciwciał przeciw antygenowi polisacharydowemu.
Ponieważ zwierzęta były tylko biernie immunizowane przeciwko pneumokokowemu polisacharydowi, do dnia 8 poziomy takiego przeciwciała w znacznym stopniu zniknęłyby u gospodarza.
Mimo tego, znacząca ochrona przed pneumokokowym zapaleniem płuc była widoczna w grupach immunizowanych pneumolizyną plus 3D-MPL i szczególnie w grupach immunizowanych pneumolizyną plus 3D-MPL plus biernie podane przeciwciało anty-polisacharyd, wskazując na synergię tej kombinacji.
Jeśli immunizacja anty-polisacharyd byłaby przeprowadzana czynnie (korzystnie ze skoniugowanym polisacharydem), efekt byłyby jeszcze bardziej wyraźny, jako efekt pamięci komórek B, i stałe poziomy przeciwciał anty-PS brałyby udział w kooperacji odpowiedzi immunologicznej (patrz na przykład Figura 1C, gdzie wiele zwierząt aktywnie immunizowanych polisacharydem i białkiem okazało się nie mieć bakterii w płucach po prowokacji).
P r z y k ł a d 6 - Immunogenność w 1-rocznych myszach Balb/C 11-walentnej szczepionki koniugowanej polisacharyd-białko D pneumokoków z 3D-MPL jako adiuwantem Wstęp i cel(e)
W ochronie przed zakaż eniem pneumokokami bierze udział przeciwciał o specyficzne dla serotypu przez opsonofagocytozę. Można przypuszczać, że zwiększenie stężenia przeciwciał da większą ochronę, tak więc włożono wiele wysiłku, aby znaleźć sposoby zwiększenia odpowiedzi humoralnej. Jedną strategią do koniugacji szczepionek z koniugatami z powodzeniem stosowaną w badaniach preklinicznych, jest stosowanie immunostymulujących adiuwantów (przegląd w Poolman i wsp. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. W: Handbook of Experimental Pharmacology, wyd. P. Perlmann i H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg D).
Dane prezentowane w tej części pokazują wyniki ostatniego doświadczenia z użyciem klinicznych partii w protokole zaprojektowanym, aby imitował badania kliniczne.
Protokół
Jednoroczne myszy balb/c immunizowano 1/10 dawki ludzkiej koniugowanej szczepionki polisacharyd pneumokoków-białko D lub 23-walentnej zwykłej szczepionki polisacharydowej. Stosowano szczepionki będące klinicznymi partiami DSP009, DSP013 lub DSP014 odpowiadające dawce 1 mcg serotypów 6B i 23F i 5 μg pozostałych serotypów 11-walentnej koniugowanej szczepionki. Dawka 0,11 μg 11-walentnej szczepionki koniugowanej lub dawkę 0,1 μg 11-walentnej szczepionki koniugowanej z 5 μg 3D-MPL, odpowiednio. Do wszystkich 11-walentnych szczepionek koniugowanych dodawano 50 μg AIPO4 jako adiuwanta.
Grupy 20 myszy immunizowano domięśniowo. Iniekcje grupom wyliczonym w następującej tabeli podawano w dniach 0 i 21. Krew do testów pobierano w dniu 35 (14 dni po drugiej dawce).
PL 204 890 B1
T a b e l a:
Schemat immunizacji dla 1-rocznych myszy Balb/c immunizowanych klinicznymi partiami szczepionki opartej na koniugatach pneumokokowy polisacharyd-białko D
Grupa Dzień 0 Szczepionka Dawka 1 Dzień 21 Szczepionka Dawka 2 Liczba myszy
1 Pneumovax-23 2,5 pg Bufor 20
2a 11-walentna Pn-PD 0,1 pg Bufor 20
2b 11-walentna Pn-PD 0,1 pg 11-walentna Pn-PD 0,1 pg 20
3a 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 pg + 5 pg Bufor 20
3b 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 pg + 5 pg 11-walentna Pn-PD + MPL 0,1 mcg + 5 pg 20
4a 11-walentna Pn-PD 1/0,5 pg Bufor 20
4b 11-walentna Pn-PD 1/0,5 pg 11-walentna Pn-PD 1/0,5 pg 20
Kontrola Bufor Bufor 20
Surowice badano za pomocą ELISA na przeciwciała IgG wobec polisacharydów pneumokoków według uzgodnionego protokołu CDC/WHO, to znaczy, po zobojętnieniu surowic polisacharydem ścian komórkowych. ELISA kalibrowano, aby dać stężenia przeciwciał w pg /ml stosując monoklonalne przeciwciała IgGl specyficzne w stosunku do serotypu.
Statystyczne analizy porównań przeprowadzono stosując UNISTAT wersja 5.0 beta. Przeprowadzono ANOVA za pomocą metody Tukey-HSD na stężeniach IgG transformowanych logarytmicznie. Porównania parami tempa serokonwersji przeprowadzono stosując dokładny test Fischera.
Wyniki
IgG GMC i 95% przedział ufności w stosunku do 11 serotypów i białka D indukowanych 14 dni po drugiej immunizacji (dawka 2) są przedstawione w następującej tabeli. Pokazano tempo serokonwersji tam, gdzie nie było możliwe wyliczenie 95% przedziału ufności.
Grupa 1 wykazuje efekty immunizacji prostymi polisacharydami, które normalnie u zwierząt tylko indukują IgM. Większość poziomów IgG jest poniżej wartości progowej detekcji; jednak myszy balb/c były zdolne do produkcji IgG na kilka polisacharydów pneumokoków, szczególnie serotypy 3, 19F i 14.
Immunizacja szczepionkami koniugowanymi indukowała przeciwciało IgG przeciwko wszystkim serotypom z wyjątkiem 23F z wysoką częstością serokonwersji.
Odpowiedź zależną od dawki (grupa 4 w porównaniu z grupą 2) zaobserwowano tylko dla serotypów 7F i 19F, ale te obserwacje nie były statystycznie znaczące. Większą odpowiedź zaobserwowano po dwóch dawkach (grupy b w stosunku do grup a) dla serotypów 3, 6B, 7F i 19F i PD i te obserwacje były statystycznie znaczące w wielu przypadkach z wszystkimi 3 formulacjami.
Najbardziej interesujący jest efekt 3D-MPL. Dwie dawki szczepionki formułowanej z 3D-MPL (grupa 3b) indukowały najwyższą GMC specyficznych IgG i było to statystycznie znaczące dla wszystkich serotypów z wyjątkiem 23F, w którym to przypadku miało znacząco wyższe tempo serokonwersji (p = 0,02 grupa 3b w porównaniu z 2b, dokładny test Fishera).
Tabela str.57
Wnioski:
Przedstawione tu wyniki pokazują że dodanie 3D-MPL do 11-walentnej skoniugowanej szczepionki polisacharyd pneumokoków-białko D podnosi odpowiedź odpornościową u myszy balb/c w podeszłym wieku na testowany serotyp.
W większości przypadków, dwie dawki szczepionki indukują wyższą średnią geometryczną stężenia IgG niż dawka pojedyncza. Ponieważ nie obserwuje się tego przy użyciu zwykłej szczepionki polisacharydowej, nawet u ludzi, uważa się, że wskazuje to na odpowiedź immunologiczną zależną od limfocytów T i indukcję pamięci immunologicznej.
Wyniki te popierają schemat podawania szczepionki z użyciem skoniugowanych polisacharydów pneumokokowych w połączeniu z adiuwantami Th1 (korzystnie 3D-MPL), gdzie co najmniej
PL 204 890 B1 dwie dawki z adiuwantem podawane są korzystnie w odstępie 1-12 tygodni, bardziej korzystnie w odstępie 3 tygodni.
Myszy użyte w doświadczeniu nie odpowiadały na PS 23 (prosty lub skoniugowany). Interesujące, że chociaż poziomy przeciwciał przeciwko polisacharydowi pozostawały niskie niezależnie od użytej szczepionki, o wiele więcej myszy odpowiadało na PS 23 wówczas, gdy jako adiuwant zastosowany był 3D-MPL (serokonwersja była znacząco wyższa). Według wynalazku, użycie adiuwantów Thl, w szczególności 3D-MPL, w szczepionkach obejmujących skoniugowane polisacharydy pneumokoka zmniejsza brak odpowiedzi na polisacharyd pneumokoka w szczepionce. Sposób zmniejszania braku odpowiedzi wspomnianą powyżej kompozycją obejmuje schemat podawania dwóch dawek opisany powyżej.
P r z y k ł a d 7. Koniugat polisacharyd C z Neisseria meningitidis-białko D (PSC-PD)
A: Ekspresja białka D
Jak w Przykładzie 1.
B: Produkcja polisacharydu C
Źródłem polisacharydów grupy C jest szczep C11 N.meningiditis. Uzyskuje sieje przy użyciu klasycznych technik fermentacji (EP 72513). Polisacharydy w postaci suchego proszku stosowane w procesie sprzęgania są identyczne jak w Mencevax (SB Biologicals s.a.).
Porcję szczepu C11 rozmraża się i 0,1 ml wyszczepia na szalki petriego z pożywką Mueller Hinton uzupełnioną dializowanym ekstraktem drożdżowym (10%, obj./obj.) i inkubuje przez 23 do 25 godzin w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą.
Murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w pożywce fermentacyjnej i inkubowana w zawiesinie w butelce Roux'a zawierającej pożywkę Mueller Hinton uzupełnioną dializowanym ekstraktem drożdżowym (10%, obj./obj.) i sterylne szklane kulki. Po inkubacji w butelce Roux'a przez 23 do 25 godzin w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w 10 ml sterylnej pożywki do fermentacji i 0,2 do 0,3 ml tej zawiesiny inokuluje się 12 innych butelek Roux'a z pożywką Mueller Hinton.
Po inkubacji przez 23 do 25 godzin w 36°C w inkubatorze z powietrzem nasyconym wodą murawka z powierzchni jest ponownie zawieszana w 10 ml sterylnej pożywki do fermentacji. Zawiesina bakterii jest zbierana w pulę do kolby stożkowej.
Zawiesina ta jest następnie jałowo przenoszona do fermentom przy użyciu sterylnych pipet.
Fermentację meningokoków przeprowadza się w fermentorach umieszczonych w czystym pomieszczeniu z podciśnieniem. Fermentacja jest zasadniczo zakończona po 10-12 godzinach, co odpowiada w przybliżeniu 1010 bakterii/ml (tzn. wczesna faza stacjonarna) i wykrywana na podstawie wzrostu pH.
Na tym etapie całe podłoże jest inaktywowane termicznie (12 minut 56°C) przed wirowaniem. Przed i po inaktywacji, pobierane są próbki podłoża i wyszczepiane na szalki petriego z pożywką Mueller Hinton.
C: Oczyszczanie PS
Proces oczyszczania jest procedurą wieloetapową przeprowadzaną na całym podłożu fermentacyjnym. W pierwszym etapie oczyszczania inaktywowana hodowla jest klarowana przez wirowanie i odzyskuje się supernatant.
Oczyszczanie polisacharydu opiera się na wytrącaniu czwartorzędową solą amoniową (bromek cetylotrimetyloamoniowy/CTAB, CETAVLON R). CTAB tworzy nierozpuszczalne kompleksy z polianionami, takimi jak polisacharydy, kwasy nukleinowe i białka w zależności od ich pl. W kontrolowanych warunkach jonowych metodę tę można użyć do wytrącania zanieczyszczeń (niska przewodność) lub polisacharydów (wysoka przewodność).
Polisacharydy zawarte w klarowanym supernatancie wytrącane są przy użyciu ziemi okrzemkowej (CELITER 545) jako podłoża, co zapobiega tworzeniu nierozpuszczalnych obojętnych złogów podczas różnicowego wytrącania/oczyszczania.
Schemat oczyszczania polisacharydu C z N. maningitidis:
Etap 1: Przyłączenie kompleksu PSC-CTAB na CELITER 545 i usunięcie resztek komórek, kwasów nukleinowych i białek przez płukanie 0,05% CTAB.
Etap 2: Wypłukanie PS przy użyciu 50% EtOH. Pierwsze frakcje, które są mętne i zawierają zanieczyszczenia i LPS, są odrzucane. Obecność PS w kolejnych frakcjach potwierdza się testem flokulacji.
Etap 3: Ponowne przyłączenie kompleksu PSC-CTAB na CELITER 545 i usunięcie mniejszych kwasów nukleinowych i białek przez płukanie 0,05% CTAB.
PL 204 890 B1
Etap 4: Wypłukanie PS przy użyciu 50% EtOH. Pierwsze mętne frakcje są odrzucane. Obecność PS w kolejnych frakcjach potwierdza się testem flokulacji.
Eluat jest filtrowany i zbierany jest przesącz zawierający surowy polisacharyd. Polisacharyd jest wytracany z przesączu przez dodanie etanolu do końcowego stężenia 80%. Następnie polisacharyd jest odzyskiwany w postaci białego proszku, suszony w próżni i przechowywany w -20°C.
D: Sprzęganie CDAP
Sprzęganie PSC i PD
Dla sprzęgania PSC i PD, zalecana jest technika sprzęgania CDAP zamiast klasycznej aktywacji CNBr i łączenia z białkiem nośnikowym poprzez łącznik. Polisacharyd jest najpierw aktywowany przez cyjanylację za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloaminopirymidyniowego (CDAP). CDAP jest rozpuszczalnym w wodzie czynnikiem cyjanującym, w którym elektrofilowość grupy cyjanowej jest wyższa niż w CNBr, co pozwala na przeprowadzenie reakcji cyjanylacji w stosunkowo łagodnych warunkach. Po aktywacji, polisacharyd można bezpośrednio sprzęgać z białkiem nośnikowym poprzez jego grupy aminowe bez wprowadzania dodatkowej cząsteczki łącznikowej. Nieprzereagowane grupy cyjanianoestrowe są wyciszane przy użyciu ekstensywnej reakcji z glicyną. Całkowita liczba etapów wymaganych do wytworzenia szczepionek koniugowanych jest zmniejszona, a co najważniejsze, w końcowym produkcie nie ma potencjalnie immunogennych cząsteczek łącznika.
Aktywacja polisacharydów za pomocą CTAP wprowadza grupę cyjanianową do polisacharydów i dimetyloaminopirydyna (DMAP) jest uwalniana. Grupa cyjanianową reaguje z grupami NH2 w białku podczas następującej procedury sprzęgania i jest przekształcana w karbaminian.
Aktywacja PSC i sprzęganie PSC-PD
Aktywacja i sprzęganie przeprowadzane są w +25°C.
120 mg PS rozpuszcza się przez co najmniej 4 godziny w WFI.
Roztwór CDAP (świeżo przygotowany, 100 mg/ml acetonitrylu) dodaje się do uzyskania stosunku CDAP/PS (wag/wag) 0,75.
Po 1,5 minuty, podnosi się pH do pH aktywującego (pH 10) przez dodanie trietyloaminy, które jest stabilne do czasu dodania PD.
Po 3,5 minutach dodawany jest NaCl do końcowego stężenia 2M.
Po 4 minutach, dodawane jest PD do uzyskania stosunku PD/PS 1,5/1; pH jest natychmiast ustawiane do pH sprzęgania (pH 10). Roztwór jest pozostawiany na 1 godzinę w regulowanym pH. Wygaszanie
Do mieszaniny PS/PD/CDAP dodaje się 6 ml roztworu 2M glicyny. Ustawiane jest pH do wygaszania (pH 8,8). Roztwór miesza się przez 30 minut w temperaturze pracy, a następnie przez noc w +2-8°C z ciągłym, powolnym mieszaniem.
Oczyszczanie PS-PD
Po filtracji (5 im), koniugat PS-PD jest oczyszczany w zimnym pomieszczeniu przez sączenie chromatograficzne w żelu typu S400HR Sephacryl™ w celu usunięcia małych cząsteczek (w tym DMAP) i nieskoniugowanego PD: elucja - NaCl 150 mM pH 6,5; monitorowanie - UV 280 nm, pH i przewodność.
Ze względu na różne wielkości cząsteczek składników reakcji, jako pierwsze wypłukiwane są koniugaty PS-PD, a następnie wolne PD i na końcu DMAP. Frakcje zawierające koniugat, co wykrywa się przez DMAB (PS) i iBCA (białko), są zbierane w pule.
Frakcje zebrane w pule są sterylnie filtrowane (0,2 im).
E: Wytwarzanie szczepionki adsorbowanych koniugatów PSC-PD
Płukanie AlPO4
W celu zoptymalizowania adsorpcji koniugatu PSC-PD na AIPO4, AIPO4 jest przepłukiwany w celu zmniejszenia stężenia PO43-:
- AIPO4 jest przepłukiwany NaCl 15 mM, i wirowany (4x);
- osad jest następnie zawieszany w NaCl 150 mM, a następnie filtrowany (100 im); oraz
- przesącz jest sterylizowany termicznie.
Taki przepłukany AIPO4 oznaczono jako WAP (ang. washed autoclaved phosphate).
Proces wytwarzania
Przed ostatecznym wytworzeniem produktu finalnego masa koniugatu PSC-PD jest adsorbowana na AIPO4 WAP. AIPO4 WAP mieszano z PSC-PD przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ustawiano pH do 5,1 i mieszaninę mieszano przez dalsze 18 godzin w temperaturze pokojowej. Dodawano roztwór NaCl do 150 mM i mieszaninę mieszano przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
PL 204 890 B1
Dodawano 2-fenoksyetanol do 5 mg/ml i mieszaninę mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ustawiano pH na 6,1.
Końcowa kompozycja/dawka
- PSC-PD: 10 μο PS
- AIPO4 WAP: 0,25 mg Al3+
- NaCl: 150 mM
- 2-fenoksy-etanol: 2,5 mg
- woda do iniekcji: do 0,5 ml
-pH: 6,1.
F: Informacje przedkliniczne
Immunogenność koniugatu polisacharydowego u myszy
Immunogenność koniugatu PSC-PD szacowano na 6- do 8-tygodniowych myszach balb/c. Prosty (nie zaadsorbowany) koniugat lub koniugat zaadsorbowany na AIPO4 podawano poprzez wstrzyknięcie jako szczepionkę monowalentną. Indukowane przeciwciała anty-PSC mierzono testem ELISA, podczas gdy funkcjonalne przeciwciała analizowano przy użyciu testów na bakteriobójczość, obie metody w oparciu o protokóły CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA). Przedstawione są wyniki dwóch różnych doświadczeń prowadzonych dla oszacowania odpowiedzi względem dawki i adiuwanta (AlPO4).
Badanie zakresu dawki
W doświadczeniu tym, PSC-PD podawano myszom Balb/C przez dwukrotne wstrzyknięcie (w odstępie dwóch tygodni). Stosowano cztery różne dawki preparatu koniugatu na AIPO4: 0,1; 0,5; 2,5 oraz 9,6 μg/zwierzę. Myszy (10 /grupę) skrwawiano w 14 dniu (14 Post I), 28 (14 Post II) i 42 (28 Post II). Średnią geometryczną stężeń (GMC) przeciwciał swoistych dla polisacharydu C mierzoną testem ELISA wyrażano w μg IgG/ml przy użyciu oczyszczonego IgG jako odniesienia. Przeciwciała bakteriobójcze badano na zebranych w pule surowicach, a miana wyrażano jako odwrotność rozcieńczenia zdolnego do zabicia 50% bakterii, przy użyciu szczepu N. meningitidis C11 w obecności komplementu z dziecka królika.
Uzyskany zakres dawki pokazuje plateau od 2,5 μg dawki. Wyniki wskazują na to, że istnieje dobra wzmocniona odpowiedź pomiędzy 14 Post I a 14 Post II. Poziomy przeciwciał w 28 Post II są co najmniej równoważne tym z 14 Post II. Miana przeciwciała bakteriobójczego są zgodne ze stężeniami w ELISA i potwierdzają immunogenność koniugatu PSC-PD.
Wpływ adiuwanta
W doświadczeniu tym badano jedną serię koniugatu PSC-PD przygotowanego na AIPO4 a prosty (bez adiuwanta) koniugat wstrzykiwano dla porównania. 10 myszy/grupę dwukrotnie szczepiono podskórnie, w odstępie dwóch tygodni, 2 μg koniugatu. Myszy skrwawiano w dniach 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) oraz 42 (28 Post II). i ELISA mierzono miana funkcjonalnych przeciwciał (tylko dla 14 Post II i 28 Post II testem na bakteriobójczość). Preparat z AIPO4 indukuje przeciwciała do 10-krotnie wyższych mian w porównaniu z preparatami nie zawierającymi adiuwanta.
Wnioski
Na podstawie opisanych powyżej doświadczeń można wyciągnąć następujące ogólne wnioski:
- Koniugat PSC-PD indukuje anamnestyczną odpowiedź pokazującą, że PSC, gdy jest skoniugowany, staje się antygenem zależnym od limfocytów T.
- Stężenia przeciwciała anty-PSC mierzone testem ELISA dobrze korelują z mianami przeciwciała bakteriobójczego, co wskazuje na to, że przeciwciała indukowane przez koniugat PSC-PD działają przeciwko serogrupie C z N. meningitidis.
- W przybliżeniu 2,5 μg koniugatu zaadsorbowanego na AlPO4 wydaje się wywoływać optymalną odpowiedź przeciwciał u myszy.
- Chemia CDAP wydaje się być stosowną metodą wytwarzania immunogennych koniugatów
PSC-PD.
P r z y k ł a d 8 - Wytwarzanie koniugatu polisacharyd z N. meningitidis serogrupy A-PD
Suchy sproszkowany polisacharyd A (PSA) jest rozpuszczany przez jedną godzinę w 0,2 M roztworze NaCl do końcowego stężenia 8 mg/ml. pH jest ustawiane do wartości 6 za pomocą albo HCl albo NaOH i roztwór jest ogrzewany do 25°C. 0,75 mg CDAP/mg PSA (preparat do 100 mg/ml acetonitrylu) dodaje się do roztworu PSA. Po 1,5 minuty bez ustawiania pH, dodawany jest 0,2 M NaOH do uzyskania pH 10. 2,5 minuty później dodawane jest białko D (w stężeniu do 5 mg/ml), tak aby uzyskać stosunek PD/PSA w przybliżeniu 1. pH równe 10 jest utrzymywane przez czas trwania reakcji sprzęgania,
PL 204 890 B1 godzinę. Następnie dodaje się 10 mg glicyny (2 M, pH 9,0)/mg PSA i reguluje się pH do wartości 9,0 przez 30 minut w 25°C. Mieszaninę następnie przechowuje się przez noc w 4°C przed oczyszczaniem na kolumnie do chromatografii ekskluzyjnej (Sephacryl S400HR z Pharmacia). Eluaty koniugatu poprzedzone są przez nieprzereagowane PD oraz inne produkty uboczne (DMAP, glicyna, sole). Koniugat jest zbierany i sterylizowany przez filtrację 0,2 μm na filtrze Sartopore firmy Sartorius.
P r z y k ł a d 9. Charakterystyka in vitro produktów z Przykładów 7 i 8
Główne dane zebrano w tabeli poniżej:
Nr Opis koniugatu Zawartość białka i PS (pg/iril) Stosunek PS/białko (w/w) Wolne białko (%) Wolny PS (%)
1 PS C-PD NaOH PD:210 1/0,68 <2 8-9
do ustawiania pH PS:308
2 PS C-PD TEA PD:230 1/0,65 <2 5-6
do ustawiania pH PS:351
3 PS A-PD NaOH PD:159 1/1,07 5 5-9
do ustawiania pH PS:149
Wyniki in vitro
Myszy Balb/C stosowano jako zwierzęcy model do testowania immunogenności koniugatów. Koniugaty były adsorbowane na AlPO4 lub Al(OH)3 (10 μg PS na 500 μg Al3+) lub nie były adsorbowane. Myszy szczepiono przez podanie 2 iniekcji z przerwą 2-tygodniową (2 μg PS/iniekcję).
Na podstawie tych wyników, po pierwsze, możemy stwierdzić, że PS w znacznym stopniu wpływa na odpowiedź immunologiczną. Lepsze wyniki uzyskano z koniugatami posiadającymi mniej niż 10% wolnego PS.
Istotny jest także preparat. Wydaje się, że AIPO4 jest najodpowiedniejszym adiuwantem w tym modelu. Koniugaty indukują zwiększony efekt, którego nie obserwuje się wówczas, gdy polisacharydy podawane są same.
Wnioski
Koniugaty z N. meningitidis A i C uzyskano z końcowym stosunkiem PS/białko odpowiednio, 1 i 0,6-0,7 (wag/wag). Wolny PS i wolne białko nośnikowe stanowiły, odpowiednio, 10% i 15%. Odzyskanie polisacharydu jest wyższe niż 70%. Koniugaty PSA i PSC uzyskane dzięki udoskonalonemu (optymalnemu) procesowi CDAP (niezależnie od białka nośnikowego, choć korzystnie białka D) są zatem dalszą zaletą wynalazku.
P r z y k ł a d 10. - Wytwarzanie koniugatu polisacharyd z H. influenzae b-PD
H. influenzae jest jedną z głównych przyczyn zapalenia opon mózgowych u dzieci poniżej drugiego roku życia. Dobrze znany jest polisacharyd otoczki z H. influenzae (PRP) jako koniugat z anatoksyną tężca (sprzężony metodą opracowaną przez J. Robbins'a). CDAP jest metodą udoskonaloną. Przedstawiono zestaw optymalnych warunków CDAP ustalonych dla koniugowania PRP, korzystnie z PD.
Parametry wpływające na reakcję koniugacji są następujące:
• Stężenie początkowe polisacharydu (które może mieć podwójny wpływ na końcowe poziomy wolnego polisacharydu oraz na etap sterylnej filtracji).
• Stężenie początkowe białka nośnikowego.
• Stosunek początkowy polisacharydu do białka (który także może mieć podwójny wpływ na końcowe poziomy wolnego polisacharydu oraz na etap sterylnej filtracji).
• Ilość użytego CDAP (zazwyczaj duży nadmiar).
• Temperatura reakcji (która może wpływać na rozkład polisacharydu, kinetykę reakcji oraz rozkład grup reaktywnych).
• pH aktywacji i sprzęgania.
• pH wygaszania (wpływające na poziom resztek DMAP).
• Czas aktywacji, sprzęgania i wygaszania.
Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że 3 najbardziej krytycznymi parametrami w optymalizacji jakości produktu końcowego są: stosunek początkowy polisacharyd/białko; stężenie początkowe polisacharydu oraz pH sprzęgania.
PL 204 890 B1
Zatem zaprojektowano sześcian reakcyjny z 3 powyższymi warunkami jako trzema osiami. Punkty centralne (i eksperymentalny zakres wartości) dla tych trzech osi wynosiły: stosunek PS/białko - 1/1 (± 0,3/1); [PS] = 5 mg/ml (± 2mg/ml) oraz pH sprzęgania = 8,0 (±1,0 jednostką pH).
Mniej istotne parametry były ustalone następująco: użyto 30 mg polisacharydu; temperatura 25°C; [CDAP] = 0,75 mg/mg PS; pH ustawiane 0,2 M NaOH; pH aktywacji = 9,5; temperatura aktywacji 1,5 minuty; temperatura sprzęgania - 1 godzina; [białko] = 10 mg/ml; pH wygaszania = 9,0; temperatura wygaszania = 1 godzina; temperatura rozpuszczania PS w rozpuszczalniku = 1 godzina w 2 M NaCl; oczyszczanie na złożu Sephacryl S-400HR, wymywanie NaCl 150 mM przy 12 cm/godz. oraz sterylizacja przez filtrację przy użyciu SARTOLAB P20 przy 5 ml/min.
Dane, które brano pod uwagę w celu ustalenia optymalnych warunków do wytwarzania produktów we wspomnianym wcześniej sześcianie reakcyjnym to: dane z procesu - maksymalna wydajność po filtracji, maksymalny poziom wbudowanego białka oraz jakość danych produktu - końcowy stosunek PS/białko, poziom wolnego PS, poziom wolnego białka, minimalne poziomy resztkowego DMAP (produkt rozkładu CDAP).
Odzysk po filtracji
Czynnikiem wpływającym na odzysk po filtracji jest oddziaływanie pomiędzy początkowym [PS] i pH sprzęgania oraz stosunkiem początkowym PS/białko. Przy niskim [PS] istnieje małe oddziaływanie z dalszymi 2 czynnikami, czego wynikiem jest dobra filtrowalność (w przybliżeniu 95% dla wszystkich produktów). Jednakże przy wysokim stężeniu filtrowalność maleje, jeśli wzrastają pH oraz stosunek początkowy (wysokie [PS], najniższy stosunek, najniższe pH = 99% filtracji; lecz wysokie [PS], najwyższy stosunek i pH= 19% filtracji).
Poziom wprowadzenia białka
Stosunek końcowego stosunku PS/białko do stosunku początkowego jest miarą wydajności sprzęgania. Przy wysokim [PS], pH nie wpływa na stosunek stosunków. Jednak stosunek początkowy ma wpływ (1,75 przy niskim stosunku początkowym, 1,26 przy wysokich stosunkach początkowych). Przy niskim [PS], stosunek stosunków jest dla większości niższy, chociaż teraz pH ma większy wpływ (niskie pH, niski stosunek = 0,96; niskie pH, wysoki stosunek = 0,8; wysokie pH, niski stosunek =1,4 oraz wysokie pH, wysoki stosunek = 0,92).
Stosunek końcowy PS/białko
Stosunek końcowy zależy od stosunku początkowego oraz [PS]. Największe stosunki końcowe uzyskuje się przy kombinacji wysokich stosunków początkowych i wysokim [PS]. Wpływ pH na stosunek końcowy nie jest tak znaczący jak niski [PS].
Poziom wolnego białka D
Najmniejsze ilości białka D obserwuje się przy wysokim pH i wysokim [PS] (poziomy zbliżone do 0,0). Wpływ wysokiego [PS] staje się szczególnie widoczny przy niskim pH. Podniesienie stosunku początkowego przyczynia się w niewielkim stopniu do podniesienia ilości wolnego białka D.
Resztkowe DMAP
Stosunek początkowy nie ma znaczącego wpływu. W przeciwieństwie do tego, poziom DMAP wzrasta wraz z [PS] i maleje, kiedy wzrasta pH.
Wnioski
Najbardziej korzystne warunki sprzęgania są następujące: pH sprzęgania = 9,0; [PS] = 3 mg/ml oraz stosunek początkowy = 1/1. Dla takich warunków właściwości produktu końcowego są następujące:
Końcowy stosunek PS/białko Wydajność filtracji PS (%) Stosunek stosunków Wolne białko D (%) Poziomy DMAP (ng/10 pg PS)
wartość zakres wartość zakres wartość zakres wartość zakres wartość zakres
1,10 0,91-1,30 92,6 50-138 1,16 1,03-1,29 0,71 0-10,40 4,95 2,60-7,80
Koniugaty PRP uzyskane za pomocą udoskonalonego (optymalnego) procesu CDAP (niezależnie od białka nośnikowego lecz korzystnie dla białka D) są zatem kolejną zaletą wynalazku.
P r z y k ł a d 11: Białko D jako antygen - jak jego skuteczność ochronną przeciwko dowolnemu H. influenzae można ulepszyć przez wytworzenie preparatu z 3D-MPL
Samice myszy Balb/c (10 na grupę) immunizowano (domięśniowo) jedenastowalentną skoniugowaną szczepionką polisacharyd pneumokoków-białko D po raz pierwszy w wieku 20 tygodni (DO)
PL 204 890 B1 i powtórnie immunizowano dwa tygodnie później (D14). 7 dni po drugiej immunizacji pobierano krew. Miana przeciwciał przeciwko białku D mierzono poziomem przeciwciał typu IgG1, IgG2a i IgG2b.
Liofilizowane undekawalentne szczepionki (bez AIPO4) przygotowywano przez mieszanie koniugatów z 15,75% laktozą mieszając przez 15 minut w temperaturze pokojowej, ustawiając pH do 6,1 ± 0,1 i liofilizując (cykl zazwyczaj rozpoczynano w -69°C, stopniowo doprowadzano do -24°C przez 3 godziny i pozostawiano tę temperaturę na 18 godzin, następnie stopniowo doprowadzano do -16°C przez 1 godzinę i pozostawiano tę temperaturę na 6 godzin, następnie stopniowo doprowadzano do +34°C przez 3 godziny i na końcu pozostawiano tę temperaturę na 9 godzin).
Skład formulacji i środków do rekonstytucji liofilizatów przedstawiono w Tabeli 13.
Najbardziej charakterystyczny pomiar mówiący, czy pojawiła się odpowiedź immunologiczna, w której pośredniczą komórki typu Th1, pozostaje w korelacji z poziomem przeciwciała IgG2a. Jak można stwierdzić na podstawie danych, zaskakująco duży wzrost IgG2a ma miejsce, kiedy białko D jest zliofilizowane z adiuwantem Th1 (w tym przypadku 3D-MPL).
T a b e l a 13:
Skład formulacji (na dawkę ludzką) i miana przeciwciał przeciw białku D u myszy (z 1/10 dawki)
Stan fizyczny PS (/500 pl) AlPO4 (/500pl) Immuno- stymu- lant Czynnik zbrylają- cy Środek konser- wujący Środek do rekonstytucji IgG1 IgG2 a IgG2 b IgG1 IgG2 a lgG2 b
pg/ml %
płyn 1 pg 500 pg nie nie 2-PE3 nie 76 0,425 0,24 99,1 0,554 0,313
płyn 5 pg 500 pg nie nie 2-PE nie 66 0,284 0,176 99,3 0,427 0,265
płyn 4 pg 0 pg nie nie 2-PE nie 6,6 0,207 0,036 96,4 3,02 0,526
płyn 0 pg nie nie 2-PE nie 5,2 0,169 0,043 96,1 3,12 0,795
liofilizo- wany 4 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie NaCl150 mM1 5,2 0,147 0,046 96,4 2,73 0,853
liofilizo- wany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie NaCl 150 mM1 11,1 0,11 0,168 97,6 0,967 1,477
liofilizo- wany 1 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie AIPO4 500 pg2 45 1,86 0,075 95,9 3,96 0,160
liofilizo- wany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie AIPO4 500 pg2 19 0,077 0,119 99,0 0,401 0,620
liofilizo- wany 4 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie MPL 50 pg1 45 2,6 3,5 88,1 5,09 6,849
liofilizo- wany 5 pg 0 pg nie laktoza 3,15% nie MPL 50 pg 1 135 25 5,1 81,8 15,1 3,089
liofilizo- wany 1 pg 0 pg MPL (50 pg) laktoza 3,15% nie bufor' 43 22 5,7 60,8 31,1 8,062
płyn 1 pg 500 pg MPL (50 pg) nie 2-PE nie 441 7,1 9,1 96,5 1,55 1,990
płyn 5 pg 500 pg MPL (50 pg) nie 2-PE nie 299 1,4 0,899 99,2 0,465 0,298
1 przed iniekcją; 2 +/- 2 godziny przed iniekcją; 3 2-fenoksyetanol

Claims (14)

1. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że obejmuje wiele koniugowanych antygenów polisacharydowych składających się z antygenu polisacharydowego pochodzącego z patogennej bakterii skoniugowanego z białkiem D z Haemophilus influenzae lub fragmentem białka D zawierającym epitopy komórek T pomocniczych.
PL 204 890 B1
2. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że antygen polisacharydowy jest wybrany z grupy składającej się z: polisacharydów Vi z Salmonella typhi, polisacharydów meningokokowych, polisacharydów i zmodyfikowanych polisacharydów z meningokoków grupy B, polisacharydów ze Staphylococcus aureus, polisacharydów ze Streptococcus agalactiae, polisacharydów ze Streptococcus pneumoniae, polisacharydów z mykobakterii, polisacharydów z Cryptococcus neoformans. lipopolisacharydów z nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharydu otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydów z Moraxella catharralis, lipopolisacharydów z Shigella sonnei oraz lipopeptydofosfoglikanu (LPPG) z Trypanosoma cruzi.
3. Kompozycja immunogenna według zastrz. 2, znamienna tym, że obejmuje antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące z co najmniej czterech serotypów Streptococcus pneumoniae.
4. Kompozycja immunogenna według zastrz. 2, znamienna tym, że antygeny polisacharydowe skoniugowane z białkiem D pochodzą z kombinacji serotypów A, C lub Y N. meningitidis.
5. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki z Haemophilus influenzae b, meningokoka C i meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z białkiem D z H. influenzae, pod warunkiem, że polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca.
6. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje skoniugowane polisacharydy otoczki ze Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b, meningokoka C oraz meningokoka Y, przy czym antygeny polisacharydowe otoczki są skoniugowane z białkiem D z H. influenzae, pod warunkiem, że polisacharyd z Haemophilus influenzae b jest skoniugowany z anatoksyną tężca.
7. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-6, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje adiuwant.
8. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że skoniugowany antygen polisacharydowy-białko D jest zaadsorbowany na fosforanie glinu.
9. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi Th1.
10. Kompozycja immunogenna według zastrz. 9, znamienna tym, że adiuwant obejmuje przynajmniej jeden spośród: 3D-MPL, saponinowego czynnika immunostymulującego i immunostymulującego oligonukleotydu CpG.
11. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-10 do stosowania jako lek.
12. Szczepionka zawierająca kompozycję immunogenna określoną w zastrz. 1-10.
13. Sposób wytwarzania kompozycji immunogennej wobec wielu patogennych bakterii, znamienny tym, że obejmuje etapy:
izolowania wielu antygenów polisacharydowych z patogennych bakterii; aktywacji polisacharydów;
koniugowania polisacharydów z białkiem D z H. influenzae; oraz mieszania skoniugowanych polisacharydów.
14. Zastosowanie skutecznej ilości kompozycji immunogennej określonej w zastrz. 1-10 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia patogenną bakterią.
PL355180A 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej PL204890B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906437.0A GB9906437D0 (en) 1999-03-19 1999-03-19 Vaccine
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) 1999-04-20 1999-04-20 Novel compositions
GBGB9909466.6A GB9909466D0 (en) 1999-04-23 1999-04-23 Vaccines
GBGB9916677.9A GB9916677D0 (en) 1999-07-15 1999-07-15 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL355180A1 PL355180A1 (pl) 2004-04-05
PL204890B1 true PL204890B1 (pl) 2010-02-26

Family

ID=27451884

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL355180A PL204890B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, szczepionka, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej i zastosowanie kompozycji immunogennej
PL00355178A PL355178A1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Szczepionka
PL355264A PL203917B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL00355178A PL355178A1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Szczepionka
PL355264A PL203917B1 (pl) 1999-03-19 2000-03-17 Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie

Country Status (32)

Country Link
US (8) US20030147922A1 (pl)
EP (6) EP1163000B1 (pl)
JP (4) JP2002539273A (pl)
KR (3) KR100642044B1 (pl)
CN (3) CN100339130C (pl)
AR (3) AR022965A1 (pl)
AT (3) ATE346608T1 (pl)
AU (3) AU750788B2 (pl)
BE (1) BE1025464I2 (pl)
BR (4) BR0009166A (pl)
CA (3) CA2365296A1 (pl)
CY (3) CY1107561T1 (pl)
CZ (3) CZ20013378A3 (pl)
DE (4) DE60032120T2 (pl)
DK (2) DK1162999T3 (pl)
ES (3) ES2275499T3 (pl)
FR (1) FR10C0008I2 (pl)
HK (3) HK1043728B (pl)
HU (4) HUP0200664A2 (pl)
IL (5) IL145044A0 (pl)
LU (1) LU91652I2 (pl)
MX (1) MXPA01009452A (pl)
MY (2) MY125202A (pl)
NL (1) NL300415I1 (pl)
NO (4) NO330736B1 (pl)
NZ (3) NZ513841A (pl)
PL (3) PL204890B1 (pl)
PT (2) PT1162999E (pl)
SI (2) SI1163000T1 (pl)
TR (3) TR200102735T2 (pl)
TW (3) TWI281403B (pl)
WO (3) WO2000056360A2 (pl)

Families Citing this family (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
EP0909323B1 (en) 1996-01-04 2007-02-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Helicobacter pylori bacterioferritin
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US20010016200A1 (en) * 1998-04-23 2001-08-23 Briles David E. Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
NZ508927A (en) 1998-05-22 2003-12-19 Ottawa Health Research Inst Methods and products for inducing mucosal immunity
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
TR200102735T2 (tr) 1999-03-19 2002-04-22 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Aşı.
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2330083T3 (es) 2000-10-27 2009-12-04 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Acidos nucleicos y proteinas de estreptococos de los grupos a y b.
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
US7082569B2 (en) 2001-01-17 2006-07-25 Outlooksoft Corporation Systems and methods providing dynamic spreadsheet functionality
PT1355673E (pt) 2001-01-23 2012-08-31 Sanofi Pasteur Inc Vacina meningocócica multivalente preparada com um conjugado de polissacárido e proteína
AU2002254901A1 (en) 2001-02-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0109297D0 (en) * 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US20050106162A1 (en) 2001-12-12 2005-05-19 Guido Grandi Immunisation against chlamydia trachomatis
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003070909A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
JP4662537B2 (ja) * 2002-05-14 2011-03-30 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 細菌性髄膜炎に関する粘膜組合せワクチン
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
PT2353608T (pt) 2002-10-11 2020-03-11 Novartis Vaccines And Diagnostics S R L Vacinas de polipéptidos para protecção alargada contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
CN1705679B (zh) * 2002-10-15 2011-04-06 英特塞尔股份公司 编码b族链球菌粘着因子的核酸、b族链球菌的粘着因子和它们的用途
JP2006504801A (ja) 2002-11-01 2006-02-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 乾燥方法
JP5814494B2 (ja) 2002-11-12 2015-11-17 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する多糖類ワクチン
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US7956043B2 (en) 2002-12-11 2011-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5′ CpG nucleic acids and methods of use
EP1585542B1 (en) 2002-12-27 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions containing phospholipid
FR2850106B1 (fr) * 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
EP1587537B1 (en) * 2003-01-30 2012-04-11 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
WO2004080490A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
WO2004081515A2 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
EP1608369B1 (en) 2003-03-28 2013-06-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of organic compounds for immunopotentiation
CA2528007C (en) 2003-06-02 2012-03-27 Chiron Corporation Immunogenic compositions based on microparticles comprising adsorbed toxoid and a polysaccharide-containing antigen
DE602004032481D1 (de) * 2003-10-02 2011-06-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Kombinationsimpfstoffe gegen Meningitis
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
AU2005237289B2 (en) 2004-04-30 2011-08-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Meningococcal conjugate vaccination
US7444197B2 (en) * 2004-05-06 2008-10-28 Smp Logic Systems Llc Methods, systems, and software program for validation and monitoring of pharmaceutical manufacturing processes
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
WO2006002422A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Compounds for immunopotentiation
WO2006115509A2 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
CA2575548A1 (en) 2004-07-29 2006-07-27 John L. Telford Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
AU2006208208B2 (en) 2005-01-27 2011-05-19 Children's Hospital & Research Center At Oakland GNA1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
LT2351772T (lt) 2005-02-18 2016-10-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Baltymai ir nukleorūgštys iš su meningitu/sepsiu susijusių escherichia coli
AU2006216844B2 (en) 2005-02-18 2012-11-08 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogens from uropathogenic escherichia coli
GB0505518D0 (en) 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR102611449B1 (ko) * 2005-04-08 2023-12-06 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
SG175456A1 (en) 2005-04-18 2011-11-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
CN102218138A (zh) 2005-06-27 2011-10-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
US8007807B2 (en) 2005-09-01 2011-08-30 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Multiple vaccination including serogroup C meningococcus
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
EP1969001A2 (en) 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
PL3017827T3 (pl) * 2005-12-22 2019-04-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Szczepionka z koniugatem polisacharydu pneumokokowego
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG10201600336RA (en) * 2006-01-17 2016-02-26 Arne Forsgren A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CN101024079B (zh) * 2006-02-17 2012-02-01 福州昌晖生物工程有限公司 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法
KR101838938B1 (ko) * 2006-03-17 2018-03-15 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
PL2004225T3 (pl) 2006-03-22 2012-09-28 Novartis Ag Schematy immunizacji koniugatami meningokokowymi
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
EP2357184B1 (en) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
JO3420B1 (ar) * 2006-03-30 2019-10-20 Brigham & Womens Hospital Inc تركيبة صيدلانية ولقاح للوقاية من اصابات المكورة العقدية
US20100021503A1 (en) * 2006-03-30 2010-01-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
PL2054431T3 (pl) * 2006-06-09 2012-07-31 Novartis Ag Konformery adhezyn bakteryjnych
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
JP2010500399A (ja) 2006-08-16 2010-01-07 ノバルティス アーゲー 尿路病原性大腸菌由来の免疫原
WO2008045852A2 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Wyeth Purification of streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
EA200901578A1 (ru) 2007-06-26 2010-08-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CA2699513C (en) 2007-09-12 2018-03-13 Novartis Ag Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies
DK2200642T3 (da) 2007-10-19 2012-07-16 Novartis Ag Meningococvaccinepræparater
WO2009062132A2 (en) 2007-11-09 2009-05-14 California Institute Of Technology Immunomodulating compounds and related compositions and methods
AU2008335457B2 (en) 2007-12-07 2015-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
CA2709927C (en) 2007-12-21 2017-05-16 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
BRPI0907843A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Novartis Ag Polipeptídeos de fhbp menigocócicos
WO2009114485A2 (en) 2008-03-10 2009-09-17 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use
EP2315747B1 (en) 2008-07-21 2017-12-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides
HUE029265T2 (en) 2008-10-27 2017-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of purifying carbohydrates from the group streptococci
CN102245198B (zh) 2008-12-09 2016-08-17 辉瑞疫苗有限责任公司 IgE CH3肽疫苗
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
US20100189737A1 (en) 2008-12-17 2010-07-29 Arico Beatrice Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
US8425922B2 (en) 2009-01-05 2013-04-23 EpitoGenesis, Inc. Adjuvant compositions and methods of use
WO2010079464A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Novartis Ag Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria
HUE049695T2 (hu) 2009-03-24 2020-10-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuváló H meningococcus faktort kötõ fehérje
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
ES2565377T3 (es) 2009-04-14 2016-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones para inmunización contra Staphylococcus aureus
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
NZ597191A (en) 2009-06-22 2013-11-29 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
SA110310528B1 (ar) 2009-06-22 2014-07-02 Wyeth Llc التركيبات المولدة للمناعة لأنتيجينات ستافيلوكوكس أوريس
US8647621B2 (en) 2009-07-27 2014-02-11 Fina Biosolutions, Llc Method of producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
RU2518291C2 (ru) 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
NZ598458A (en) 2009-08-27 2014-03-28 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
DK2473605T3 (en) * 2009-09-03 2018-05-28 Pfizer Vaccines Llc PCSK9-VACCINE
CA2773637A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"
MX2012004851A (es) 2009-10-30 2012-05-22 Novartis Ag Purificacion de sacaridos capsulares de staphylococcus aureus tipo 5 y tipo 8.
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
CA2836140C (en) 2009-12-17 2016-06-21 Fina Biosolutions, Llc Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the preparation of conjugate vaccines
CN107412754A (zh) 2009-12-22 2017-12-01 塞尔德克斯医疗公司 疫苗组合物
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
ES2977505T3 (es) 2010-03-30 2024-08-26 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Proteínas de unión al factor H (fHbp) con propiedades alteradas y métodos de uso de las mismas
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2555753B1 (en) 2010-04-07 2018-08-01 California Institute of Technology Vehicle for delivering a compound to a mucous membrane and related compositions, methods and systems
US20110287048A1 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Round June L Antigen Specific Tregs and related compositions, methods and systems
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
DK2575870T3 (en) * 2010-06-04 2017-02-13 Wyeth Llc vaccine Formulations
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
EP2942061A3 (en) 2010-06-07 2016-01-13 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
WO2011161653A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
EP2667852B1 (en) 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
WO2012117377A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US10357568B2 (en) 2011-03-24 2019-07-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant nanoemulsions with phospholipids
EP2511295A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions for preventing and/or treating an infection by an HIV-1 virus
EA030920B1 (ru) 2011-05-06 2018-10-31 Петр Геннадьевич АПАРИН Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
US10561720B2 (en) 2011-06-24 2020-02-18 EpitoGenesis, Inc. Pharmaceutical compositions, comprising a combination of select carriers, vitamins, tannins and flavonoids as antigen-specific immuno-modulators
CN103764171B (zh) 2011-07-08 2016-08-17 诺华股份有限公司 酪氨酸连接方法
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
WO2013038375A2 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
US20140235667A1 (en) 2011-09-22 2014-08-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazopyridyl compounds as aldosterone synthase inhibitors
WO2013068949A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Novartis Ag Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen
EP2592137A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Novartis AG Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
DE102011122891B4 (de) 2011-11-11 2014-12-24 Novartis Ag Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
DE102011118371B4 (de) 2011-11-11 2014-02-13 Novartis Ag Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung
RU2014127714A (ru) 2011-12-08 2016-01-27 Новартис Аг ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ТОКСИНОВ Clostridium difficile
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
WO2013098589A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2817320A1 (en) 2012-02-24 2014-12-31 Novartis AG Pilus proteins and compositions
US20150132339A1 (en) 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
US20150125486A1 (en) 2012-03-08 2015-05-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of pediatric antigens
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
JP6401148B2 (ja) 2012-04-26 2018-10-03 ノバルティス アーゲー 抗原および抗原の組み合わせ
HUE044612T2 (hu) 2012-05-04 2019-11-28 Pfizer Prosztata-asszociált antigének és vakcina-alapú immunterápiás rendek
CA2874210A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Novartis Ag Meningococcus serogroup x conjugate
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
KR20150073943A (ko) 2012-10-03 2015-07-01 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 면역원성 조성물
CN104918634A (zh) 2012-10-12 2015-09-16 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原
CN104968366B (zh) * 2012-10-17 2017-12-01 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合物和含有来自流感嗜血杆菌的蛋白E和/或PilA的蛋白组分的免疫原性组合物
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CA2899787A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Intradermal delivery of immunological compositions comprising toll-like receptor agonists
EP2994161B1 (en) 2013-05-10 2020-10-28 California Institute of Technology Probiotic prevention and treatment of colon cancer
JP2016520077A (ja) 2013-05-15 2016-07-11 ザ ガバナーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アルバータ Ｅ１ｅ２ｈｃｖワクチン及び使用方法
CN103386126B (zh) * 2013-06-25 2015-06-17 北京科兴生物制品有限公司 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物
AU2014316722B2 (en) 2013-09-08 2017-09-07 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2015095868A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
EP3096785B1 (en) 2014-01-21 2020-09-09 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3957321A3 (en) 2014-01-21 2022-07-13 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2015123291A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
KR20160127104A (ko) 2014-02-28 2016-11-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
CN104829711B (zh) * 2014-04-08 2018-04-03 北京天成新脉生物技术有限公司 脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
ES2922554T3 (es) 2014-07-23 2022-09-16 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Variantes de proteínas de unión al factor H y métodos de uso de las mismas
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
HRP20230416T1 (hr) 2015-01-15 2023-07-07 Pfizer Inc. Imunogeni pripravci, namijenjeni upotrebi u cjepivima protiv pneumokoka
CN104548090B (zh) * 2015-01-27 2016-11-30 中国科学院过程工程研究所 一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
WO2016184963A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Innavirvax Treatment of hiv-infected individuals
US11331335B2 (en) 2015-06-10 2022-05-17 California Institute Of Technology Sepsis treatment and related compositions methods and systems
EP3109255A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 Institut National De La Recherche Agronomique Immunogenic composition
CN107849119A (zh) 2015-07-07 2018-03-27 阿费里斯股份公司 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
RU2721128C2 (ru) 2015-07-21 2020-05-18 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные антигены капсульного сахарида, наборы, содержащие эти композиции, и их применения
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
WO2017096374A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccination with mica/b alpha 3 domain for the treatment of cancer
TW202111125A (zh) 2016-01-19 2021-03-16 美商輝瑞股份有限公司 癌症疫苗
EP3439704A1 (en) 2016-04-05 2019-02-13 GSK Vaccines S.r.l. Immunogenic compositions
EP3474890A1 (en) * 2016-06-22 2019-05-01 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3493840B1 (en) 2016-08-05 2022-08-24 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL264552B2 (en) 2016-08-05 2023-04-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
US20180064801A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for neisseria gonorrhoeae
KR102622188B1 (ko) 2016-10-07 2024-01-05 엔터롬 에스.에이. 암 치료를 위한 면역원성 화합물
CN110022894B (zh) 2016-10-07 2024-01-19 恩特罗姆公司 用于癌症疗法的免疫原性化合物
BE1025162B9 (fr) 2016-12-06 2019-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires
PL3570879T3 (pl) 2017-01-20 2022-06-20 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne do zastosowania w szczepionkach przeciw pneumokokom
IL267733B2 (en) 2017-01-31 2023-10-01 Pfizer NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor
CN110520154B (zh) * 2017-03-15 2023-08-04 株式会社Lg化学 多价肺炎链球菌疫苗组合物
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
US11167022B2 (en) 2017-03-31 2021-11-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
CN111132691A (zh) 2017-06-10 2020-05-08 创赏有限公司 提供改善的免疫原性和亲合力的具有二价或多价缀合物多糖的多价缀合物疫苗
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
MX2020001820A (es) 2017-08-14 2020-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Metodos para reforzar las respuestas inmunitarias.
KR102573200B1 (ko) 2017-12-06 2023-08-31 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
IL276229B2 (en) 2018-02-05 2024-01-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2019173438A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Stc. Unm Compositions and methods for reducing serum triglycerides
EP3773673A2 (en) 2018-04-11 2021-02-17 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of fibrosis, autoimmune diseases and inflammation
FI3773689T3 (fi) 2018-04-11 2023-01-31 Antigeenisiä peptidejä syövän ehkäisyyn ja hoitoon
US11951162B2 (en) 2018-04-18 2024-04-09 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and immunogenic conjugate thereof
CA3106291A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes for preparing dried polysaccharides
WO2020030572A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20220016229A1 (en) 2018-12-12 2022-01-20 Pfizer Inc. Immunogenic Multiple Hetero-Antigen Polysaccharide-Protein Conjugates and uses thereof
US20220054632A1 (en) 2018-12-12 2022-02-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified carrier proteins for o-linked glycosylation
SG11202106541WA (en) 2018-12-19 2021-07-29 Merck Sharp & Dohme Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CA3126492A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Northwestern University Bioconjugate vaccines synthesis in prokaryotic cell lysates
CA3129425A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3136278A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
CN113966234A (zh) 2019-05-10 2022-01-21 葛兰素史克生物有限公司 缀合物的产生
WO2021023691A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2021023692A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide
AU2020355401A1 (en) 2019-09-27 2022-04-14 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP4045150A1 (en) 2019-10-16 2022-08-24 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of adrenal cancer
CA3159573A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN114746112A (zh) 2019-11-15 2022-07-12 恩特罗姆公司 用于预防和治疗b细胞恶性肿瘤的抗原肽
CA3161857A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine
WO2021138495A1 (en) * 2019-12-30 2021-07-08 Fraunhofer Usa, Inc. Particles for multi-dose delivery
MX2022010355A (es) 2020-02-21 2022-09-21 Pfizer Purificacion de sacaridos.
CA3173729A1 (en) 2020-02-23 2021-08-26 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN111588847B (zh) * 2020-05-18 2023-05-26 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有单磷酸化的脂质a与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
US20230250142A1 (en) 2020-06-12 2023-08-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dock tag system
WO2022035816A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Inventprise, Llc Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24f
JP2023546615A (ja) 2020-10-27 2023-11-06 ファイザー・インク 大腸菌組成物およびその方法
KR20230097160A (ko) 2020-11-04 2023-06-30 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
EP4243863A2 (en) 2020-11-10 2023-09-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
MX2023009728A (es) 2021-02-19 2023-08-30 Sanofi Pasteur Inc Vacuna recombinante meningococica b.
WO2022175423A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition, use and methods
EP4070814A1 (en) 2021-04-07 2022-10-12 Lama France Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
TW202306969A (zh) 2021-05-28 2023-02-16 美商輝瑞大藥廠 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途
JP2024522395A (ja) 2021-05-28 2024-06-19 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
CN118434441A (zh) 2021-11-18 2024-08-02 马特里瓦克斯公司 免疫原性融合蛋白组合物和其使用方法
CN118510548A (zh) 2022-01-13 2024-08-16 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
AU2023246941A1 (en) 2022-03-31 2024-10-24 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer.
AU2023268745A1 (en) 2022-05-11 2024-11-07 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024201324A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024214016A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE68929323T2 (de) * 1988-12-16 2002-04-18 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin-mutanten und pneumokokken-impfstoffe daraus
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
WO1994000153A1 (en) 1992-06-25 1994-01-06 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine composition containing adjuvants
ATE211654T1 (de) * 1992-09-16 2002-01-15 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
KR100310510B1 (ko) 1993-03-23 2002-07-04 장 스테판느 3-0-탈아세틸화모노포스포릴지질a를함유하는백신조성물
ATE226831T1 (de) 1993-05-18 2002-11-15 Univ Ohio State Res Found Impfstoff gegen mittelohrentzündung
NZ274376A (en) 1993-09-22 1997-11-24 Jackson H M Found Military Med Activating soluble carbohydrate using cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
DE69535036T3 (de) 1994-07-15 2011-07-07 The University of Iowa Research Foundation, IA Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
CA2218385A1 (en) * 1995-04-17 1996-10-24 Pierre Hauser Induction and enhancement of the immune response to polysaccharides with bacterial lipoproteins
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
PL323781A1 (en) 1995-06-07 1998-04-27 Biochem Vaccines Inc Streptococco thermal shock proteins belonging to a family hsp70
ES2164251T5 (es) 1995-06-07 2006-06-01 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vacuna que comprende un conjugado antigeno polisacarido-proteina transportadora y proteina transportadora libre.
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
SE9601158D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JPH102001A (ja) * 1996-06-15 1998-01-06 Okajima Kogyo Kk グレーチング
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
CA2292838A1 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
HUP0002475A3 (en) 1997-07-21 2002-01-28 Baxter Healthcare S A Wallisel Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
NZ530277A (en) 1998-04-07 2005-08-26 Medimmune Inc Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
NZ509986A (en) 1998-08-19 2003-10-31 Baxter Healthcare S Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines
WO2000037105A2 (en) * 1998-12-21 2000-06-29 Medimmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
TR200102735T2 (tr) 1999-03-19 2002-04-22 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Aşı.
GB9909077D0 (en) * 1999-04-20 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Novel compositions
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN201252175Y (zh) * 2008-08-04 2009-06-03 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 线缆连接器组件

Also Published As

Publication number Publication date
HK1043728B (zh) 2007-06-22
NL300415I1 (nl) 2009-12-01
DK1162999T3 (da) 2007-03-26
DE122009000054I1 (de) 2009-12-31
EP1163000B1 (en) 2008-02-27
ATE346608T1 (de) 2006-12-15
AU3813600A (en) 2000-10-09
HK1043730A1 (zh) 2002-09-27
KR20020000785A (ko) 2002-01-05
CY2009014I2 (el) 2010-07-28
NO20014325L (no) 2001-11-14
JP2002540075A (ja) 2002-11-26
KR20020000549A (ko) 2002-01-05
AU750762B2 (en) 2002-07-25
US8926985B2 (en) 2015-01-06
NZ513840A (en) 2004-02-27
CZ20013379A3 (cs) 2002-03-13
ES2339737T3 (es) 2010-05-25
IL145043A0 (en) 2002-06-30
LU91652I2 (fr) 2010-10-13
WO2000056359A2 (en) 2000-09-28
TR200102736T2 (tr) 2002-04-22
EP1776962A1 (en) 2007-04-25
HU228499B1 (en) 2013-03-28
IL145045A0 (en) 2002-06-30
AU3430700A (en) 2000-10-09
US20050031646A1 (en) 2005-02-10
CZ301445B6 (cs) 2010-03-03
US20030147922A1 (en) 2003-08-07
EP1163000A2 (en) 2001-12-19
DE60032120D1 (de) 2007-01-11
FR10C0008I2 (fr) 2012-10-26
US20060002961A1 (en) 2006-01-05
WO2000056359A3 (en) 2001-02-01
EP1880735A2 (en) 2008-01-23
BR0009154A (pt) 2001-12-26
CY1107390T1 (el) 2010-07-28
DE60038166T2 (de) 2009-03-12
MXPA01009452A (es) 2002-08-06
AR022963A1 (es) 2002-09-04
CZ20013380A3 (cs) 2002-03-13
ES2275499T3 (es) 2007-06-16
ES2300255T3 (es) 2008-06-16
NO330736B1 (no) 2011-06-27
HU229968B1 (hu) 2015-03-30
LU91652I9 (pl) 2019-01-03
HK1043731A1 (en) 2002-09-27
HK1043731B (zh) 2009-01-23
CA2366314A1 (en) 2000-09-28
CN1351503A (zh) 2002-05-29
MY125387A (en) 2006-07-31
WO2000056360A3 (en) 2001-01-25
AR022965A1 (es) 2002-09-04
CZ303653B6 (cs) 2013-01-30
SI1162999T1 (sl) 2007-04-30
PL203917B1 (pl) 2009-11-30
BR0009163A (pt) 2001-12-26
JP2002539273A (ja) 2002-11-19
HUP0200664A2 (en) 2002-06-29
PL355180A1 (pl) 2004-04-05
CN1191852C (zh) 2005-03-09
HUP0200367A2 (en) 2002-05-29
NO330532B1 (no) 2011-05-09
NO20014323L (no) 2001-11-14
US20150079125A1 (en) 2015-03-19
CA2366314C (en) 2012-01-10
NO20014322L (no) 2001-11-14
CA2366152A1 (en) 2000-09-28
CN100339130C (zh) 2007-09-26
BRPI0009163B1 (pt) 2019-04-09
NO20014323D0 (no) 2001-09-05
NZ513841A (en) 2001-09-28
PT1163000E (pt) 2008-03-20
US20100291138A1 (en) 2010-11-18
AU750913B2 (en) 2002-08-01
IL145044A (en) 2007-03-08
NO20014322D0 (no) 2001-09-05
HK1043728A1 (en) 2002-09-27
HUS1500040I1 (hu) 2018-05-28
US20100119544A1 (en) 2010-05-13
NL300415I2 (pl) 2016-12-13
DE60032120T2 (de) 2007-09-20
EP2277535A2 (en) 2011-01-26
CN1391481A (zh) 2003-01-15
NO2011014I1 (no) 2011-09-19
ATE459373T1 (de) 2010-03-15
PT1162999E (pt) 2007-02-28
EP2277535A3 (en) 2011-03-09
SI1163000T1 (sl) 2008-06-30
PL355264A1 (pl) 2004-04-05
TWI235064B (en) 2005-07-01
NO20014325D0 (no) 2001-09-05
BRPI0009163B8 (pt) 2021-05-25
EP1162999A2 (en) 2001-12-19
AR022964A1 (es) 2002-09-04
AU3291900A (en) 2000-10-09
BR0009166A (pt) 2001-12-26
EP1162999B1 (en) 2006-11-29
AU750788B2 (en) 2002-07-25
HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
WO2000056358A3 (en) 2001-01-04
TR200102739T2 (tr) 2001-12-21
KR100798212B1 (ko) 2008-01-24
US20110217329A1 (en) 2011-09-08
CN1351501A (zh) 2002-05-29
DK1163000T3 (da) 2008-04-28
EP1880735A3 (en) 2008-03-12
BE1025464I2 (pl) 2019-03-06
JP5551579B2 (ja) 2014-07-16
KR20020001785A (ko) 2002-01-09
DE60038166D1 (de) 2008-04-10
WO2000056360A2 (en) 2000-09-28
TWI286938B (en) 2007-09-21
JP4846906B2 (ja) 2011-12-28
US20060093626A1 (en) 2006-05-04
IL145043A (en) 2007-06-17
CZ20013378A3 (cs) 2002-03-13
US9168313B2 (en) 2015-10-27
CY2009014I1 (el) 2010-07-28
TWI281403B (en) 2007-05-21
CN1192798C (zh) 2005-03-16
DE60043930D1 (de) 2010-04-15
CA2365296A1 (en) 2000-09-28
CY1107561T1 (el) 2013-03-13
IL145044A0 (en) 2002-06-30
WO2000056358A2 (en) 2000-09-28
NZ513842A (en) 2004-05-28
MY125202A (en) 2006-07-31
JP2011057713A (ja) 2011-03-24
EP1162998B1 (en) 2010-03-03
EP1162998A2 (en) 2001-12-19
TR200102735T2 (tr) 2002-04-22
NO2011014I2 (no) 2011-08-30
ATE387214T1 (de) 2008-03-15
PL355178A1 (pl) 2004-04-05
JP2002540074A (ja) 2002-11-26
KR100642044B1 (ko) 2006-11-10
FR10C0008I1 (fr) 2010-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4846906B2 (ja) ワクチン
US20150079129A1 (en) Vaccine
MXPA01009455A (en) Vaccine
MXPA01009459A (es) Vacuna