BRPI0009163B1 - Composição imunogênica e vacina que a compreende - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "vacina". a presente invenção refere-se ao campo de vacinas antigênicas de polissacarídeos bacterianos. em particular, a presente invenção referese a polissacarídeos bacterianos conjugados a proteína d de h. influenzae.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E VACINA QUE A COMPREENDE.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a vacinas antigênicas de polissacarídeos bacterianos, sua fabricação e à aplicação de semelhantes polissacarídeos em medicamentos.

Em particular a presente invenção refere-se a três aspectos interrelacionados: A - vacinas compreendendo um antígeno de polissacarídeo de pneumococos, tipicamente um antígeno conjugado de polissacarídeos de pneumococos, formulado com um antígeno protéico de Streptococcus pneumoniae e opcionalmente um adjuvante indutor de Th1; B - conjugados de polissacarídeos de pneumococos específicos, vantajosos auxiliados com um adjuvante de Th1; e C - conjugados de polissacarídeos bacterianos em geral conjugados a proteína D de H. influenzae.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva responsável por considerável morbidez e mortalidade (particularmente nos jovens e idosos), provocando doenças invasivas tais como pneumonia, bacteremia e meningite, e doenças associadas com colonização, tais como Otite média aguda. Estima-se que o índice de pneumonia por pneumococos nos Estados Unidos para pessoas acima de 60 anos de idade seja de 3 a 8 por 100.000. Em 20 % dos casos levou a bacteremia, e outras manifestações tais como meningite, com um índice de mortalidade próximo a 30 % mesmo com tratamento antibiótico.

Pneumococos são encapsulados com um polissacarídeo ligado quimicamente o qual confere especificidade de sorotipo. Existem 90 sorotipos de pneumococos conhecidos, e a cápsula é o determinante de virulência principal para os pneumococos, uma vez que a cápsula não somente protege a superfície interna das bactérias de complemento, mas é a própria fracamente imunogênica. Polissacarídeos são antígenos T-independentes, e não podem ser processados ou apresentados sobre moléculas MHC para interagir com células T. No entanto podem estimular o sistema imune através de um mecanismo alternativo o qual envolve reticulação de receptores da superfície sobre células B.

Foi demonstrado em vários experimentos que a proteção contra doença por pneumococos invasivos está correlacionada mais fortemente com especificidade de anticorpo para a cápsula, e a proteção e sorotipo5 específica.

São de conhecimento geral na técnica vacinas à base de antígenos de polissacarídeos. Quatro que foram licenciadas para uso humano incluem o polissacarídeo Vi de Salmonella typhi, o polissacarídeo PRP de Haemophilus influenzae, a vacina meningocóccica tetravalente composta de 10 sorotipos A, C, W135 e Y, e a vacina de pneumococos 23-Valente composta dos polissacarídeos correspondentes aos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, e 33 (responsáveis por no mínimo 90 % dos isolados sangüíneos de pneumococos).

As últimas três vacinas conferem proteção contra bactérias que provocam infecções respiratórias resultando em grave morbidez e mortalidade em infantes, apesar destas vacinas não terem sido licenciadas para uso em criança com menos de dois anos de idade porque são inadequadamente imunogênicas nesta faixa etária [Peltola et al.(1984), N. Engl. J. Med.

310: 1561 - 1566]. Streptococcus pneumoniae é a causa mais comum de doença bacteriana invasiva e otite média em infantes e crianças pequenas. Do mesmo modo, os idosos têm fracas reações a vacinas de pneumococos [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265 - 270], daí a aumentada incidência de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese and

Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271 - 285].

Estratégias, as quais foram projetadas para superar esta falta de imunogenicidade em infantes, incluem a ligação do polissacarídeo a grandes proteínas imunogênicas, as quais fornecem linfócito auxiliar T circunstante e as quais induzem memória imunológica contra o antígeno de polis30 sacarídeo ao qual estão conjugadas. Vacinas de conjugados de glicoproteína de pneumococos estão sendo avaliadas atualmente para segurança, imunogenicidade e eficácia em várias faixas etárias.

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Α) Vacinas de polissacarídeos de pneumococos

Uma vacina de pneumococos não conjugada 23-valente apresentou uma ampla variação na eficácia clínica, de 0 % a 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531 - 2535). A eficácia parece estar relacio5 nada com o grupo de risco que está sendo imunizado, tal como os idosos, doença de Hodgkin, esplenectomia, doença de célula falciforme e agamaglobulinemia (Fine et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2666 - 2677), e também com a manifestação de doença. A vacina 23-valente não demonstra proteção contra pneumonia por pneumococos (em alguns grupos de alto 10 risco tais como os idosos) e doenças de otite média.

Portanto há a necessidade de composições de vacinas de pneumococos aperfeiçoadas, particularmente as que sejam mais eficazes na prevenção ou melhora da doença por pneumococos (particularmente pneumonia) nos idosos e nas crianças pequenas.

A presente invenção fornece uma tal vacina aperfeiçoada.

B) Composições de Conjugado de Polissacarídeos de Pneumococos Selecionados + 3D-MPL

Geralmente é aceito que a eficácia protetora da vacina de pneumococos não^ conjugada comercial está mais ou menos relacionada com a concentração de anticorpo induzida na vacinação; na verdade, os 23 polissacarídeos foram aceitos para licença somente devido à imunogenicidade de cada polissacarídeo componente (Ed. Williams et al. New York

Academy of Sciences 1995 pp. 241 - 249). Portanto aumento adicional das reações de anticorpos aos polissacarídeos de pneumococos pode aumentar a percentagem de infantes e de idosos respondendo com níveis protetores de anticorpos à primeira injeção de polissacarídeo ou conjugado de polissacarídeo e pode reduzir a dosagem e o número de injeções necessárias para induzir imunidade protetora para infecções provocadas por Streptococcus pneumoniae.

Desde o início do século XX, os pesquisadores experimentaram um grande número de compostos os quais podem ser adicionados aos antígenos para melhorar sua imunogenicidade em composições de vacinas [re4

visto em M.F. Powell & M.J. Newman, Plenum Press, NY, Vaccine Design the Subunit and Adjuvant Approach (1995) Capítulo 7 A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients]. Muitos são bastante eficazes, mas provocam importantes reações adversas locais e sistêmicas que impedem seu 5 uso em composições de vacinas humanas. Adjuvantes à base de alumínio (tais como alume, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio), descritos pela primeira vez em 1926, permanecem os únicos adjuvantes imunológicos usados em vacinas humanas licenciadas nos Estados Unidos.

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Adjuvantes à base de alumínio são exemplos da classe de veículos adjuvantes que funcionam através do efeito de depósito que induzem. O antígeno é absorvido sobre sua superfície e quando a composição é injetada o adjuvante e o antígeno não se dissipam imediatamente na corrente sangüínea - ao invés da composição persistir no ambiente local da injeção e alguns resultados de reação imune mais pronunciados. Tais veículos adjuvantes têm a conhecida vantagem adicional de serem adequados para estabilização de antígenos que são propensos a decomposição, por exemplo alguns antígenos de polissacarídeos.

3D-MPL é um exemplo de um adjuvante não veículo. Seu nome completo é 3-O-deacilado monofosforil lipídeo A (ou 3 De-O-acilado monofosforil lipídeo A ou 3-O-desacil-4’ monofosforil lipídeo A) e é referido como 3D-MPL para indicar que a posição 3 da glucosamina final redutora é de-Oacilada. Para sua preparação, ver GB 2220211 A. Quimicamente é uma mistura de 3-deacilado, monofosforil lipídeo A com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Foi originalmente preparado no início dos anos noventa quando o método para 3-O-deacilar o derivado 4’-monofosforil do lipídeo A (MPL) levou a uma molécula com toxicidade atenuada adicional sem alteração na atividade de imunoestimulação.

3D-MPL foi usado como um adjuvante ou por si só ou, preferencialmente, combinado com um veículo adjuvante do tipo de depósito tal 30 como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio ou emulsões óleo-em-água.

Em semelhantes composições, antígeno e 3D-MPL são contidos nas mesmas estruturas de partícula, possibilitando liberação mais eficaz de sinais

antigênicos e imunoestimulantes. Estudos mostraram que 3D-MPL tem a capacidade de aumentar adicionalmente a imunogenicidade de um antígeno adsorvido sobre alume [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708 - 14; EP 689454-B1J. Tais combinações também são preferenciais na técnica de an5 tígenos que são propensos a adsorção (por exemplo, conjugados de polissacarídeos bacterianos), onde a adsorção sobre alume tende a estabilizar o antígeno. Adjuvantes à base de alumínio precipitado são usados principalmente uma vez que são os únicos adjuvantes que são atualmente usados em vacinas humanas licenciadas. Por conseguinte, vacinas contendo 3D10 MPL em combinação com adjuvantes à base de alumínio são favorecidos na técnica devido a sua facilidade de desenvolvimento e velocidade de introdução no mercado.

MPL (não 3-deacilado) foi avaliado como um adjuvante com vários antígenos de vacina de conjugados de polissacarídeos monovalentes. A 15 co-injeção de MPL em salina reforçou a reação de anticorpo sérico para quatro conjugados de polissacarídeos monovalentes: toxóide tetânico-PS 6B de pneumococos, toxóide diftérico-PS 12 de pneumococos, e S. aureus tipo e S. aureus tipo 8 conjugados a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa [Schneerson et al. J. Immunology (1991) 147: 2136 - 2140]. Foi ensinado

que as reações intensificadas são antígeno-específicas. MPL é uma emulsão óleo-em-água (um adjuvante do tipo de veículo) reforçou de modo consistente o efeito de MPL em salina devido à presença de MPL e antígeno na mesma estrutura de partícula, e foi considerado o sistema adjuvante de escolha para ótima liberação de outras vacinas de conjugados de polissacarí deos.

Deví et al. [Infect. Immun. (1991) 59: 3700 - 7] avaliaram o efeito adjuvante de MPL (não 3-deacilado) em salina sobre a reação de anticorpo murino a um conjugado TT de polissacarídeo capsular de Cryptococcus neoformans. Quando MPL foi usado simultaneamente com o conjugado houve 30 somente um aumento marginal em ambas as reações de IgM-e IgGespecíficas ao PS; no entanto MPL teve um efeito muito maior quando administrado 2 dias após o conjugado. A praticabilidade de usar um esquema de imunização que requer um atraso na administração de MPL em relação ao antígeno, especialmente em infantes, é questionável. O efeito adjuvante de MPL com polissacarídeos e conjugados de polissacarídeosproteínas parece ser dependente da composição. Novamente, a incorpora5 ção de MPL em alguns sistemas de liberação adequados de lenta liberação (por exemplo usando um veículo adjuvante) fornece um efeito adjuvante mais durável e evita o problema de regulagem do tempo e administração retardada.

Em resumo, o estado da técnica ensinou que, para antígenos de polissacarídeos ou conjugados de polissacarídeos em particular, onde MPL ou 3D-MPL é usado como um adjuvante, é vantajosamente usado em conjunto com um veículo adjuvante (por exemplo os adjuvantes à base de alu15

mínio) de modo a maximizar seu efeito imunoestimulante.

Surpreendentemente, os inventores presentes descobriram que para alguns conjugados de polissacarídeos de pneumococos, a imunogeni (/ cidade da composição de vacina é significativamente maior quando o antí geno é formulado com 3D-MPL somente ao invés de com 3D-MPL em conjunto com um veículo adjuvante (tal como um adjuvante à base de alumínio). Além disso a melhora observada é independente da concentração de 3DMPL usado, e de se os conjugados em particular estão em uma composição monovalente ou se são combinados para formar uma composição polivalente.

C) Conjugados de proteína D - polissacarídeo bacteriano

Como mencionado acima, vacinas à base antígenos de polissa25 carídeos são de conhecimento geral na técnica. As vacinas de polissacarídeos licenciadas mencionadas acima têm diferente eficácia clínica demonstrada. Foi estimado que a vacina de polissacarídeos Vi tem uma eficácia entre 55 % e 77 % em evitar febre tifóide confirmada por cultura (Plotkin e Cam, (1995) Arch. Intern. Med. 155: 2293 - 99). Foi demonstrado que a va30 cina de polissacarídeo meningocóccico C tem uma eficácia de 79 % sob condições epidêmicas (De Wals P, et al. (1996) Boletim da Organização Mundial de Saúde 74: 407 - 411). A vacina de pneumococos 23-valente

apresentou uma ampla variação na eficácia clínica, de 0 % a 81 % (Fedson et al. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531 - 2535). Como mencionado acima, é aceito que a eficácia protetora da vacina de pneumococos está mais ou menos relacionada com a concentração de anticorpo induzida na vacinação.

Entre os problemas associados com a abordagem de polissacarídeos para vacinação, está o fato de que os polissacarídeos per se são imunógenos fracos. Estratégias que foram projetadas para superar esta falta de imunogenicidade incluem a ligação do polissacarídeo a grandes veículos protéicos altamente imunogênicos, os quais fornecem linfócito auxiliar T circunstante.

Exemplos destes veículos altamente imunogênicos os quais são usados atualmente para a produção de imunógenos de polissacarídeos incluem o toxóide diftérico (DT ou o mutante CRM197), toxóide tetânico (TT), Hemocianina de lampreia de Fissurella (KLH), e a proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD).

Problemas Associados com Veículos Usados Comumente

Uma série de problemas estão associados com cada um destes veículos usados comumente, inclusive na produção de conjugados de GMP e também nas características imunológicas dos conjugados.

Apesar da aplicação comum destes veículos e de seu sucesso na indução de reações de anticorpo anti-polissacarídeo, estão associados com várias desvantagens. Por exemplo, sabe-se que reações imunes antígeno-específicas podem ser suprimidas (supressão de epítope) pela presença de anticorpos preexistentes dirigidos contra o veículo, neste caso toxina do Tétano (Di John et al; (1989) Lancet, 2: 1415 - 8). Na população de modo geral, uma percentagem muito grande de pessoas terão imunidade preexistente para tanto DT quanto TT uma vez que as pessoas são vacinadas rotineiramente com estes antígenos. No Reino Unido por exemplo 95 % das crianças receberam a vacina DTP compreendendo tanto DT quanto TT. Outros autores descreveram o problema de supressão de epítope para vacinas peptídicas em modelos animais (Sad et al, Immunology, 1991; 74: 223 - 227; Schutze etal, J. Immunol. 135: 4, 1985; 2319 - 2322).

Além disso, para vacinas que requerem reforço regular, o uso de veículos altamente imunogênicos tais como TT e DT provavelmente suprimem a reação de anticorpo polissacarídeo após várias injeções. Estas múltiplas vacinações também podem ser acompanhadas por reações inde5 sejáveis tais como hiperresponsividade do tipo retardada (DTH).

KLH é conhecida como potente imunógeno e já foi usada como um veículo para peptídeos IgE em testes clínicos com seres humanos. No entanto, foram observados algumas reações adversas (reações semelhantes a DTH ou sensibilização IgE) bem como reações de anticorpo contra 10 anticorpo.

A escolha de uma proteína de veículo, portanto, para uma vacina à base de polissacarídeos requerirá um balanço entre a necessidade de usar um veículo com efeito em todos os pacientes (amplo reconhecimento de MHC), a indução de altos níveis de reações de anticorpos antipolissaca15 rídeos e baixa reação de anticorpos contra o veículo.

Os veículos usados anteriormente para vacinas à base de polissacarídeos, têm portanto muitas desvantagens. Isto é particularmente deste modo em vacina combinada, onde a supressão de epítope é especialmente problemática se for usado o mesmo veículo para vários antígenos de polis-

sacarídeos. Em WO 98/51339, foram usados múltiplos veículos na vacina combinada de modo a tentar obter este efeito.

A presente invenção fornece um novo veículo para uso na preparação de conjugados imunogênicos à base de polissacarídeo/polipeptídeo, que não sofre das desvantagens supracitadas.

A presente invenção fornece uma proteína D (EP 0 594 610 B1) de Haemophilus influenzae, ou fragmentos da mesma, como um veículo para composições imunogênicas à base de polissacarídeos, inclusive vacinas. O uso deste veículo é particularmente vantajoso na vacina combinada. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A) Vacinas de polissacarídeos de pneumococos

Por conseguinte a presente invenção fornece uma composição de vacina, compreendendo no mínimo um antígeno de polissacarídeo de

Streptococcus pneumoniae (preferencialmente conjugado) e um antígeno protéico de Streptococcus pneumoniae ou equivalente imunologicamente funcional do mesmo, opcionajmente com um adjuvante Thl (um adjuvante indutor de uma reação imune de Th1). Preferencialmente são incluídos tanto 5 Uma proteína de^neumococos quanto adjuvante Th1. As composições da invenção são particularmente adequadas no tratamento de pneumonia em idosos.

Vacinas de polissacarídeos de pneumococos (conjugados ou não) podem não ter a capacidade de proteger contra pneumonia na popula10 ção de idosos para a qual a incidência desta doença é muito alta. O mecanismo de defesa chave contra o pneumococo é opsonofagocitose (um evento mediado por célula B humoral/ neutrófilos provocado pela produção de anticorpos contra o polissacarídeo de pneumococos, a bactéria eventualmente se tornando fagocitosada), no entanto partes dos mecanismos op15 sônicos envolvidos são prejudicados nos idosos, isto é, produção de superóxido por PMN (células polimorfonucleares), outra produção de espécies de oxigênio reativo, mobilização de PMN, apoptose de PMN, deformabilidade de PMN. As reações de anticorpos também podem ser prejudicadas nos idosos.

Contrário ao dogma normalmente aceito, níveis normais de anticorpos antipolissacarídeo capsular podem não ser eficazes na liberação completa de bactérias, uma vez que os pneumococos podem invadir células hospedeiras para fugir deste ramo do sistema imune.

Inesperadamente, os inventores presentes descobriram que, estimulando simultaneamente o ramo mediado por células do sistema imune

(por exemplo, imunidade mediada por células T) além do ramo humoral do sistema imune (mediada por células B), resulta uma sinergia (ou cooperação) a qual tem a capacidade de reforçar a liberação de pneumococos do hospedeiro. Isto é uma descoberta a qual auxiliará a prevenção (ou o trata30 mento) de infecção por pneumococos em geral, mas será particularmente importante para a prevenção (ou o tratamento) de pneumonia nos idosos onde vacinas à base de polissacarídeos não apresentam eficácia.

Os inventores presentes descobriram que ambos os ramos do sistema imune podem sinergizar deste modo se for administrado um polissacarídeo de pneumococos (preferencialmente conjugado) com uma proteína de pneumococos (preferencialmente uma proteína expressa sobre a su5 perfície de pneumococos, ou secretada ou liberada, a qual pode ser processada e apresentada no contexto de Classe II e MHC classe I sobre a superfície de células de mamíferos infectados). Embora uma proteína de pneumococos possa disparar imunidade mediada por células por si só, os inventores também descobriram que a presença de um adjuvante indutor de 10 Thl ^na formulação da vacina ajuda este ramo do sistema imune, e inesperadamente reforça adicionalmente a sinergia entre ambos os ramos do sistema imune.

B) Composições de Conjugados de Polissacarídeos Pneumocócicos Selecionados + 3D-MPL

Por conseguinte, a presente invenção também fornece uma composição antigênica compreendendo um ou mais conjugados de polissacarídeos de pneumococos com adjuvante de 3D-MPL e essencialmente destituídos de adjuvantes à base de alumínio, em que no mínimo um dos conjugados de polissacarídeo de pneumococos é significativamente mais

imunogênico nas composições compreendendo 3D-MPL em comparação com composições compreendendo 3D-MPL em conjunto com um adjuvante à base de alumínio.

Modalidades preferenciais fornecidas são composições antigênicas compreendendo conjugados de um ou mais dos seguintes polissaca25 rídeos de pneumococos capsulares: sorotipo 4, 6B, 18C, 19F, e 23F. Em semelhantes composições, cada um dos polissacarídeos são surpreendentemente mais imunogênicos nas composições compreendendo 3D-MPL somente comparadas com composições compreendendo 3D-MPL e um adjuvante à base de alumínio.

Portanto é uma modalidade da invenção fornecer uma composição antigênica compreendendo o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae sorotipo 4, 6B, 18C, 19F ou 23F conjugados a uma proteína imunogênica e adjuvante 3D-MPL, em que a composição é essencialmente destituída de adjuvantes à base de alumínio.

Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece uma composição antigênica combinada essencialmente destituída de adjuvantes 5 à base de alumínio e compreendendo adjuvante 3D-MPL e dois ou mais conjugados de polissacarídeos de pneumococos escolhidos entre o grupo consistindo em: sorotipo 4; sorotipo 6B; sorotipo 18C; sorotipo 19F; e sorotipo 23F.

C) Conjugados de polissacarídeo bacteriano - proteína D

Por conseguinte, a presente invenção fornece um antígeno conjugado a polissacarídeo compreendendo um antígeno de polissacarídeo derivado de uma bactéria patogênica conjugada a proteína D de Haemophilus influenzae ou um fragmento de proteína D dos mesmos. Além disso, a invenção fornece composições de vacinas polivalentes onde um ou mais dos antígenos de polissacarídeos são conjugados a proteína D. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A) Vacinas de polissacarídeos de pneumococos

A presente invenção fornece uma vacina aperfeiçoada particularmente para a prevenção ou melhora de infecção por pneumococos dos

idosos (e/ou infantes e crianças pequenas).

No contexto da invenção um paciente é considerado idoso se tiver 55 anos de idade ou mais, tipicamente acima de 60 anos e de modo mais geral acima de 65 anos.

Portanto, em uma modalidade da invenção é fornecida uma 25 composição de vacina, adequada para uso nos idosos (e/ou infantes e crianças pequenas) compreendendo no mínimo um antígeno de polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae e no mínimo um antígeno protéico de Streptococcus pneumoniae.

Em uma segunda modalidade preferencial, a presente invenção fornece uma vacina (adequada para a prevenção de pneumonia nos idosos) compreendendo no mínimo um antígeno de polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae e no mínimo um antígeno protéico de Streptococcus pneumo12

niae e um adjuvante de Th1.

É previsto que uma tal vacina também será útil no tratamento de infecção por pneumococos (por exemplo otite média) em outros grupos de alto risco da população, tais como para infantes ou crianças pequenas.

Em uma terceira modalidade é fornecida uma composição de vacina compreendendo um antígeno de polissacarídeo de pneumococos e um adjuvante de Th1.

Antígenos de Polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae da Invenção • ¹⁰

Tipicamente a vacina contra Streptococcus pneumoniae da presente invenção compreenderá antígenos de polissacarídeos (preferencialmente conjugados), em que os polissacarídeos são derivados de no mínimo quatro sorotipos de pneumococos. Preferencialmente os quatro sorotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. Mais preferencialmente, no mínimo 7 sorotipos

são incluídos na composição, por exemplo os derivados de sorotipos 4, 6B,

9V, 14, 18C, 19F, e 23F. Mais preferencialmente ainda, no mínimo 11 soro-

tipos são incluídos na composição, por exemplo a composição em uma modalidade inclui polissacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5,

6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (preferencialmente conjugados). Em uma modalidade preferencial da invenção no mínimo 13 antígenos de polissaca-

rídeos (preferencialmente conjugados) são incluídos, embora antígenos de polissacarídeos adicionais, por exemplo 23-valente (tais como sorotipos 1,

2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F,

20, 22F, 23F e 33F), também sejam contemplados pela invenção.

Para vacinação de idosos (por exemplo para a prevenção de pneumonia) é vantajoso incluir sorotipos 8 e 12F (e mais preferencialmente e 22 também) na composição antigênica 11-valente descrita acima para formar uma vacina 15-valentè, ao passo que para infantes ou crianças pequenas (onde otite média é de mais cuidados) os sorotipos 6A e 19A são incluídos vantajosamente para formar uma vacina 13-valente.

Para a prevenção/melhora de pneumonia na população de idosos (mais de 55 anos) e Otite média em infantes (até 18 meses) e crianças pequenas (tipicamente 18 meses a 5 anos), é uma modalidade preferencial

da invenção combinar um polissacarídeo de Streptococcus pneumonia multivalente como descrito neste relatório com uma proteína de Streptococcus pneumoniae ou equivalente imunologicamente funcional da mesma.

Proteínas Pneumocóccicas da invenção

Para os propósitos desta invenção, equivalente imunologicamente funcional é definido como um peptídeo de proteína compreendendo no mínimo um epítope protetor das proteínas da invenção. Tais epítopes são caracteristicamente expostos na superfície, altamente conservados, e podem provocar uma reação de anticorpos bactericidas em um hospedeiro 10 ou evitar efeitos tóxicos. Preferencialmente, o equivalente funcional tem no mínimo 15 e preferencialmente 30 ou mais aminoácidos contíguos da proteína da invenção. Mais preferencialmente, fragmentos, eliminações da proteína, tais como variantes de eliminação transmembrana dos mesmos (isto é, o uso do domínio extracelular das proteínas), fusões, derivados qui15 micamente ou geneticamente detoxificados e semelhantes podem ser usados com a condição de que tenham a capacidade de criar substancialmente a mesma reação imune que a proteína nativa.

Proteínas preferenciais da invenção são as proteínas de pneumococos as quais são expostas sobre a superfície externa do pneumococo

(capazes de serem reconhecidas pelo sistema imune de um hospedeiro durante no mínimo parte do ciclo de vida do pneumococo), ou são proteínas as quais são secretadas ou liberadas pelo pneumococo. Mais preferencialmente, a proteína é uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2componentes, ou lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, ou equivalen25 tes imunologicamente funcionais dos mesmos.

Proteínas particularmente preferenciais a serem incluídas em uma vacina combinada semelhante, incluem sem limitação: pneumolisina (preferencialmente detoxificada por tratamento químico ou mutação) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 Comparison of 30 pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2., Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67 - 72 Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification

and biological properties.¹', WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA e variantes de eliminação transmembrana dos mesmos (Patente dos Estados Unidos No. 5804193 - Briles et al.); PspC e variantes de eliminação transmembrana da mesma (WO 5 97/09994 - Briles et al); PsaA e variantes de eliminação transmembrana da mesma (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12): 5255 - 62 Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae); proteínas de ligação de colina de pneumococos e variantes de eliminação transmembrana da mesma; CbpA e 10 variantes de eliminação transmembrana da mesma (WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfato-deidrogenase (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207 - 14); M like protein, requerimento de patente SB No. EP 0837130; e adesina 18627, requerimento de patente SB No. EP 0834568.

As proteínas usadas na presente invenção são selecionadas preferencialmente entre o grupo de pneumolisina, PsaA, PspA, PspC, CbpA ou uma combinação de duas ou mais de tais proteínas. A presente invenção também engloba equivalentes imunologicamente funcionais de semelhantes proteínas (como definido acima).

Dentro da composição, a proteína pode ajudar a induzir uma reação mediada por células T contra doença por pneumococos - particularmente requerida para proteção contra pneumonia - que coopera com o ramo humoral do sistema imune para inibir invasão por pneumococos, e para estimular opsonofagocitose.

Vantagens adicionais de incluir o antígeno protéico é apresentação de antígenos adicionais para o processo de opsonofagocitose, e a inibição de adesão bacteriana (se for usada uma adesina) ou a neutralização de toxina (se for usada uma toxina).

Por conseguinte em uma modalidade da invenção é fornecida uma vacina contra Streptococcus pneumoniae compreendendo uma vacina de conjugado de polissacarídeos de pneumococo compreendendo antígenos de polissacarídeos derivados de no mínimo quatro sorotipos, preferen15 • ¹⁰

cialmente no mínimo sete sorotipos, mais preferencialmente no mínimo onze sorotipos, e no mínimo uma, mas preferencialmente duas, proteínas de Streptococcus pneumoniae. Preferencial mente uma das proteínas é Pneumolisina ou PsaA ou PspA ou CbpA (mais preferencialmente pneumolisina detoxifiçada). Uma combinação preferencial contém no mínimo pneumolisina ou um derivado da mesma e PspA.

Como mencionado acima, um problema associado com a abordagem de polissacarídeos para vacinação, é o fato de que os polissacarídeos per se são fracos imunógenos. Para superar isto, os polissacarídeos podem ser conjugados a veículos de proteína, os quais fornecem linfócito auxiliar T circunstante. É preferencial, no entanto, que os polissacarídeos utilizados na invenção sejam encadeados a um veículo de proteína semelhante. Exemplos de semelhantes veículos os quais são comumente usados atualmente para a produção de imunógenos de polissacarídeos incluem os toxóides diftérico e tetânico (DT, DT CRM197 e TT respectivamente), Hemocianina de lampreia (Keyhole Limpet Haemocyaniri), KLH), OMPC de N. meningitidis, e o derivado protéico purificado de Tuberculina (PPD).

Uma série de problemas, no entanto, estão associados com cada um destes veículos usados comumente (ver seção Problemas Associados com Veículos Usados Comumente acima).

A presente invenção fornece em uma modalidade preferencial um novo veículo para uso na preparação de estruturas de imunógenos à base de polissacarídeos, que não sofrem destas desvantagens. O veículo preferencial para as composições imunogênicas (ou vacinas) à base de polissacarídeos de pneumococos é proteína D de Haemophilus influenzae (EP 594610-B), ou fragmentos da mesma. Fragmentos adequados para uso cluem fragmentos englobando epítopes linfócito auxiliar T. Em particular fragmento de proteína D conterá preferencialmente o 1/3 terminal de N proteína.

Um veículo preferencial adicional para o polissacarídeo pneumococos é a própria proteína de pneumococos (como definido acima na seção Proteínas de Pneumococos da Invenção).

As vacinas da presente invenção preferencialmente têm um adjuvante. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio, mas também pode ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou pode ser uma suspensão insolúvel de 5 tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacarídeos cationicamente ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.

É preferencial que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo TH1 de reação para ajudar o ramo mediado por células da reação imune.

Adjuvantes TH1 da Invenção

Altos níveis de citocinas tipo Th1 tendem a favorecer a indução de reações imunes mediadas por células para um dado antígeno, ao passo que altos níveis de citocinas tipo Th2 tendem a favorecer a indução de reações imunes humorais para o antígeno.

É importante lembrar que a distinção de reação imune tipo Th1 e Th2 não é absoluta. Na realidade um indivíduo sofrerá uma reação imune a qual é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominantemente Th2. No entanto, é freqüentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos do descrito em clones de células T CD4 +ve mu-

rinas por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145 - 173). Tradicionalmente, reações tipo Th1 estão associadas com a produção das citocinas INF-ye IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas feqüentemente associadas diretamente com a indução de reações imunes tipo Th1 não são produzidas por células T, tais como IL-12. Em contraste, reações tipo Th2 estão associadas com a secreção de II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantes adequados os quais estimulam uma reação predominantemente de Th1 incluem,

Monofosforil lipídeo A ou um derivado do mesmo, particularmente 3-de-O30 acilado monofosforil lipídeo A, e uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferencialmente 3-de-O-acilado monofosforil lipídeo A (3D-MPL) junto com um sal de alumínio.

Um sistema aperfeiçoado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de Qs21 e 3D-MPL como revelado em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o Qs21 é extinto com colesterol como revelado em WO 96/33739?

Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo Qs21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão óleo em água é descrita em WO 95/17210, e é uma formulação preferencial.

Preferencialmente a vacina compreende adicionalmente uma saponina, mais preferencialmente Qs21. A formulação pode compreender(S^ também uma emulsão óleo em água e tocoferol (WO 95/17210).

A presente invenção também fornece um método para produzir uma formulação de vacina compreendendo misturar uma proteína da pre- ΐ Z / sente invenção junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.

CpG não metilado contendo oligonucleotídeos (WO 96/02555)/Ç também são indutores preferenciais de uma reação de TH1 e são adequados para uso na presente invenção.

Composições particularmente preferenciais da invenção compreendem um ou mais polissacarídeos de pneumococos conjugados, uma ou mais proteínas de pneumococos e um (adjuvante de ThIL/A indução de uma reação mediada por células por meio de uma proteína de pneumococos (como descrito acima) e a cooperação entre ambos os ramos do sistema imune pode ser auxiliada usando um adjuvante de Th-1 semelhante, resultando em uma vacina particularmente eficaz contra doença por pneumococos em geral, e, notavelmente, contra pneumonia por pneumococos nos idosos.

Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um imunógeno ou vacina como neste relatório descritos para uso em medica mento.

Em um aspecto ainda adicional da invenção, é fornecida uma

cocos e um adjuvante de Th1 (preferencialmente 3D-MPL) o qual tenha a capacidade de seroconversão ou indução de uma reação de anticorpo humoral contra o antígeno de polissacarídeo dentro de uma população de não respondedores.

Sabe-se que 10-30 % da população são não respondendores a imunização por polissacarídeos (não reagem a mais de 50 % dos sorotipos em uma vacina) (Konradsen et al., Scand. J. Immun 40: 251 (1994); Rodriguez et al., JID, 173: 1347 (1996)). Este também pode ser o caso para vacinas conjugadas (Musherefa/. Clin. Inf. Dis. 27: 1487 (1998)). Isto pode ser 10 particularmente grave para áreas de alto risco da população (infantes, crianças pequenas e os idosos).

Os inventores presentes descobriram que uma combinação de um polissacarídeo de pneumococos conjugados (que é propenso a baixa reação em uma população particular) com um adjuvante de Th1 (ver adju15 vantes de Th1 da invenção acima) pode inesperadamente superar esta não responsividade. Preferencialmente deve ser usado 3D-MPL, e mais preferencialmente 3D-MPL destituído de adjuvante à base de alumínio (o qual fornece uma melhor resposta ainda). A presente invenção portanto fornece tais composições, e fornece adicionalmente um método para tratar não res-

pondedores a polissacarídeos de pneumococos por meio da administração de semelhantes composições, e ainda adicionalmente fornece uma aplicação de um adjuvante de Th1 na fabricação de um medicamento compreendendo antígenos de polissacarídeos de pneumococos conjugados, no tratamento contra (ou proteção de) doença por pneumococos em indivíduos que sejam não responsivos ao antígeno de polissacarídeo.

Em uma modalidade há um método para evitar ou melhorar pneumonia em um ser humano idoso compreendendo administrar uma quantidade segura e eficaz de uma vacina, como descrito neste relatório, compreendendo um antígeno de polissacarídeo de Streptoccocus pneumo30 niae e ou um adjuvante de Th1, ou uma proteína de pneumococos (e preferencialmente ambos), ao paciente idoso referido.

Em uma modalidade adicional é fornecido um método para evi19

tar ou melhorar otite média em “infantes ou crianças pequenas, compreendendo administrar uma quantidade segura e eficaz de uma vacina compreendendo um Streptococcus pneumoniae antígeno de polissacarídeo e ou um antígeno protéico de Streptococcus pneumoniae ou um adjuvante de 5 Th1 (e preferencialmente ambos), ao infante ou criança pequena referido.

Preferencialmente nos métodos da invenção como descrito acima o antígeno de polissacarídeo está presente como um conjugado protéico de polissacarídeos.

Preparações de Vacina da Invenção

As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível a infecção, por meio da administração da vacina referida através de via sistêmica ou da mucosa. Estas administrações podem incluir injeção através da via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através de administração via mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. A administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferencial (uma vez que o transporte nasofaringeano de pneumococos pode ser evitado de modo mais eficaz, deste modo atenuando a infecção em seu estado mais precoce).

A quantidade de antígeno conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade a qual induz uma reação de imunoproteção sem efeitos colaterais adversos significantes em vacinas típicas. Tais quantidade variarão dependendo de qual imunógeno específico é empregado e como é apresentado. Geralmente, espera-se que cada dose compre25 enda 0,1 - 100 gg de polissacarídeo, preferencialmente 0,1 - 50 gg, preferencialmente 0,1 -10 gg, da qual 1 a 5 gg é o alcance mais preferencial.

O teor de antígenos protéicos na vacina estará tipicamente dentro do alcance de 1 - 100 gg, preferencialmente 5-50 gg, mais tipicamente dentro do alcacnce de 5 - 25 gg.

Quantidades ótimas de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos de rotina envolvendo observação de reações imunes adequadas em pacientes. Após uma vacinação inicial, os

3Q

pacientes podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

A preparação da vacina é descrita de modo geral em Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell M.F. & Newman 5 M.J.) (1995) Plenum Press New York). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente dos Estados Unidos No. 4.235.877.

B) Composições de Conjugados de Polissacarídeos de Penumococos Selecionados + 3D-MPL

Para as finalidades desta invenção, o termo conjugados de po10 lissacarídeos de pneumococos da invenção descreve os conjugados de polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae os quais são mais imunogênicos em composições compreendendo 3D-MPL em comparação com composições compreendendo 3D-MPL em conjunto com um adjuvante à base de alumínio (por exemplo, conjugados de sorotipo 4; sorotipo

6B; sorotipo 18C; sorotipo 19F; ou sorotipo 23F).

Para as finalidades desta invenção, o termo essencialmente destituído de adjuvantes à base de alumínio descreve uma composição a qual não contém suficiente adjuvante à base de alumínio (por exemplo hidróxido de alumínio, e , particularmente, fosfato de alumínio) para provocar

qualquer redução na imunogenicidade de um conjugado de polissacarídeo de pneumococos da invenção em comparação com uma composição equivalente compreendendo 3D-MPL sem adjuvante adicionado à base de alumínio. Preferencialmente a composição antigênica deve conter adjuvante que consiste essencialmente em 3D-MPL. Quantidades de adjuvante à base 25 de alumínio adicionado por dose devem ser preferencialmente menos de 50 pg, mais preferencialmente menos de 30 pg, ainda mais preferencialmente menos de 10 pg, e o mais preferencialmente não há adjuvante à base de alumínio adicionado às composições antigênicas da invenção.

Para as finalidades desta invenção, a determinação quanto a se 30 um conjugado de polissacarídeo de pneumococos é significativamente mais imunogênico em composições compreendendo 3D-MPL em comparação com composições compreendendo 3D-MPL em conjunto com um adjuvante

à base de alumínio, isto deve ser estabelecido como descrito no Exemplo 2. Como uma indicação quanto a se uma composição é significativamente mais imunogênica quando compreendendo somente 3D-MPL, a proporção de concentração de IgG de GMC (como determinado no Exemplo 2) entre 5 composições compreendendo somente 3D-MPL versus uma composição equivalente compreendendo 3D-MPL em conjunto com adjuvante de fosfato de alumínio deve ser mais de 2, preferencialmente mais de 5, mais preferencialmente mais de 7, ainda mais preferencialmente mais de 9, e o mais preferencialmente mais de 14.

Entre os problemas associados com a abordagem de polissacarídeos para vacinação, é o fato de que os polissacarídeos per se são fracos imunógenos. Estratégias, as quais foram projetadas para superar esta falta de imunogenicidade, incluem a ligação (conjugação) do polissacarídeo a grande veículos protéicos, os quais fornecem linfócito auxiliar T circunstan15 te. É preferencial que os polissacarídeos de pneumococos da invenção sejam ligados a um veículo protéico o qual fornece linfócito auxiliar T circunstante. Exemplos de semelhantes veículos os quais podem ser usados incluem os toxóides diftérico, diftérico mutante, e tetânico (DT, CRM197 e TT respectivamente), Hemocianina de lampreia de Fissurella (KLH), o derivado

de proteína purificada de Tuberculina (PPD), e OMPC de Neisseria meningitidis.

Mais preferencialmente, proteína D de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B), ou fragmentos da mesma (ver seção C), é usada como o veículo protéico imunogênico para os polissacarídeos de pneumococos da 25 invenção.

Em uma modalidade a composição antigênica da invenção compreende polissacarídeo de pneumococos sorotipo (PS) 4 conjugados a uma proteína imunogênica e formulados com adjuvante 3D-MPL, onde a composição é essencialmente destituída de adjuvante à base de alumínio. Em mo30 dalidades adicionais, a composição antigênica compreende PS 6B, 18C, 19F, ou 23F, respectivamente, conjugados a uma proteína imunogênica e formulada com adjuvante 3D-MPL, onde a composição é essencialmente

• · destituída de adjuvante à base de alumínio.

Em ainda uma modalidade adicional da invenção, é fornecida uma combinação composição antigênica compreendendo dois ou mais conjugados de polissacarídeos de pneumococos entre o grupo PS 4, PS 6B, PS 5 18C, PS19F, e PS 23F formulados com adjuvante 3D-MPL, onde a composição é essencialmente destituída de adjuvante à base de alumínio.

A imunogenicidade de conjugados de polissacarídeos de pneumococos da invenção não é afetada de modo eficaz pela combinação com outros conjugados de polissacarídeos de pneumococos (Exemplo 3). Por 10 conseguinte, um aspecto preferencial da invenção fornece uma composição antigênica combinada compreendendo um ou mais conjugados de polissacarídeos de pneumococos da invenção em combinação com um ou mais conjugados de polissacarídeos de pneumococos adicionais, onde a composição é formulada com adjuvante 3D-MPL, mas é essencialmente destituída 15 de adjuvante à base de alumínio.

Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, são fornecidas composições antigênicas combinadas as quais contêm no mínimo um e preferencialmente 2, 3, 4 ou todos os 5 entre os conjugados de polissacarídeos de pneumococos PS 4, 6B, 18C, 19F, ou 23F, e além disso

qualquer combinação de outros conjugados de polissacarídeos de pneumococos, os quais são formulados com adjuvante 3D-MPL mas essencialmente destituídos de adjuvante à base de alumínio.

Tipicamente a composição antigênica combinada de Streptococcus pneumoniae da presente invenção compreenderá antígenos conju25 gados a polissacarídeos, em que os polissacarídeos são derivados de no mínimo quatro, sete, onze, treze, quinze ou vinte e três sorotipos (ver Antígenos de Polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae da Invenção acima para combinações preferenciais de sorotipos dependentes da doença a ser tratada).

As composições antigênicas da invenção são usadas preferencialmente como composições de vacinas para evitar (ou tratar) infecções por pneumococos, particularmente nos idosos e infantes e crianças pe23

quenas.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem: o fornecimento das composições antigênicas acima para uso em medicamento; um método para induzir uma reação imune em um conjugado de polissacarídeo 5 capsular de Streptococcus pneumoniae, compreendendo as etapas de administrar uma quantidade segura e eficaz de uma das composições antigênicas acima a um paciente; e a aplicação de uma das composições antigênicas acima na fabricação de um medicamento para a prevenção (ou tratamento) de doença por pneumococos.

Para a prevenção/melhora de pneumonia na população de idosos (mais de 55 anos) e Otite média em infantes (até 18 meses) e crianças pequenas (tipicamente 18 meses a 5 anos), é uma modalidade adicional preferencial da invenção combinar um conjugado de polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae multivalentes formulados como neste relatório descritos com uma proteína de Streptococcus pneumoniae ou equivalente imunologicamente funcional da mesma. Ver seção acima Proteínas de Pneumococos da invenção para proteínas/ combinações de proteínas preferenciais.

Preferencialmente as composições antigênicas (e vacinas) des-

critas anteriormente são liofilizadas até estarem próximas de serem usadas, ponto no qual são reconstituídas extemporaneamente com diluente. Mais preferencialmente são liofilizadas na presença de 3D-MPL, e são reconstituídas extemporaneamente com solução salina.

A liofilização das composições resulta em uma composição mais estável (por exemplo evita a decomposição dos antígenos de polissacarídeos). O processo também é inesperadamente responsável por um maior título de anticorpos ainda contra os polissacarídeos de pneumococos. Foi demonstrado que isto é particularmente significante para conjugados de PS 6B. Outro aspecto da invenção é portanto uma composição antigênica liofili30 zada compreendendo um conjugado de PS 6B com adjuvante de 3D-MPL e essencialmente destituído de adjuvantes à base de alumínio.

Para preparação das vacinas, ver acima a seção Preparações

de Vacina da Invenção.

C) Conjugados de polissacarídeos bacterianos - proteína D

A tendência para vacinas combinadas tem a vantagem de reduzir o desconforto para o recebedor, facilitando a programação, e asseguran5 do a completação do regime; mas também há o risco concomitante de reduzir a eficácia da vacina (ver acima para discussão sobre supressão de epítopes através do uso em excesso de proteínas de veículos). Seria, portanto, vantajoso preparar combinações de vacinas as quais vão de encontro às necessidades de uma população, e as quais, além disso, apresentam inter10 ferência imunogênica entre seus componentes. Estas vantagens podem ser realizadas pelas composições imunogênicas (ou vacinas) da invenção, as quais são de particular benefício para a administração de vacinas combinadas para grupos de alto risco como infantes, crianças pequenas ou os idosos.

A presente invenção fornece uma proteína D de Haemophilus influenzae, ou fragmentos da mesma, como um veículo para composição imunogênica à base de polissacarídeos, inclusive vacinas. Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos englobando epítopes de linfócito auxiliar T. Em particular o fragmento de proteína D conterá preferencial-

mente o 1/3 terminal de N da proteína.

A proteína D é uma proteína de ligação de IgD de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1) e é um imunógeno potencial.

/Polissacarídeos a serem conjugados a Proteína D contemplados pela presente invenção incluem, mas não se limitam ao antígeno de polis25 saçarídeo Vi contra Salmonella typhi, polissacarídeos meningocócicos (inclusive tipo A, JD, W135 e Y, e o polissacarídeo e polissacarídeos modificados de meningococo grupo B), polissacarídeos de Staphylococcus aureus, polissacarídeos de Streptococcus agalactae, polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae, polissacarídeos de Mycobacterium por exemplo Myco30 bacterium tuberculosis (tais como manofosfoinisitídeos trealoses, ácido micólico, arabinomananos capeados com manose, a cápsula dos mesmos e arabinogalactanos), polissacarídeo de Cryptococcus neoformans, os lipopo lissacárides de Haemophilus influenzae não classificado, o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae b, os lipopolissacárides de Moraxella catharralis, os lipopolissacárides de Shigella sonnei, o lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de Trypanosoma cruzi, os gangliosídeos GD3, GD2 associados a 5 câncer, as mucinas associadas a tumor, especialmente o antígeno T-F, e o antígeno sialil T-F, e o polissacarídeo associado a HIV que é estruturalmente relacionado com o antígeno T-F.

O polissacarídeo pode ser ligado à proteína de veículo por

qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente dos Estados 10 Unidos No. 4.372.945 e por Armor et al., Patente dos Estados Unidos No.

4.474.757). Preferencialmente, é realizada a conjugação de CDAP (WO

95/08348).

Em CDAP, o reagente cianilante tetrafluoroborato de 1-cianodimetilaminopiridínio (CDAP) é usado preferencialmente pela síntese de conjugados de polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser realizada sob condições relativamente brandas, as quais evitam hidrólise dos polissacarídeos sensíveis a alcalinos. Esta síntese permite ligação direta a uma proteína de veículo.

O polissacarídeo é solubilizado em água ou uma solução salina.

CDAP é dissolvido em acetonitrilo e adicionado imediatamente à solução de polissacarídeo. O CDAP reage com os grupos oxidrila do polissacarídeo para formar um éster de cianato. Após a etapa de ativação, a proteína de veículo é adicionada. Grupamentos amino de lisina reagem com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação covalente de isouréia.

Após a reação de ligação, um grande excesso de glicina é em seguida adicionado para resfriar rapidamente funções ativadas residuais. O produto é então passado através de uma permeação de gel para remover proteína de veículo não reagida e reagentes residuais. Por conseguinte a invenção fornece um método para produzir conjugados de polissacarídeo e proteína D compreendendo as etapas de ativar o polissacarídeo e ligar o polissacarídeo à proteína D.

Em uma modalidade preferencial da invenção é fornecida uma

formulação de composição imunogênica (ou vacina) para a prevenção de infecções por Streptococcus pneumoniae.

Os mecanismos pelos quais os pneumococos se propagam para os pulmões, o fluido cerebrospinal e o sangue é mal entendido. O cresci5 mento de bactérias atingindo os alvéolos pulmonares normais é inibido por sua secura relativa e pela atividade fagocítica de macrófagos alveolares. Quaisquer alterações anatômicas ou fisiológicas destas defesas coordenadas tendem a aumentar a suscetibilidade dos pulmões para infecção. A parede celular de Streptococcus pneumoniae tem um importante papel na pro10 dução da reação inflamatória nos alvéolos dos pulmões (Gillespie et al. (1997), l&l 65: 3936).

Tipicamente a vacina contra Streptococcus pneumoniae da presente invenção compreenderá conjugados de polissacarídeo e proteína D, em que o polissacarídeo é derivado de no mínimo quatro, sete, onze, treze, 15 quinze ou 23 sorotipos. Ver acima Streptococcus pneumoniae Polysaccharide Antigens of the Invention para combinações preferenciais de sorotipos dependendo da doença a ser tratada.

Em uma modalidade adicional da invenção é fornecida uma vacina de Neisseria meningitidis; em particular de sorotipos A, B, C W-135 e Y.

Neisseria meningitidis é uma das causas mais importantes de meningite bacteriana. A cápsula de carboidrato destes organismos pode agir como um determinante de virulência e um alvo para anticorpo protetor. Não obstante os carboidratos são de conhecimento geral fracos imunógenos em crianças pequenas^A presente invenção fornece um veículo de proteína particularmente adequado para estes polissacarídeos, proteína D, que fornece epíto-

pes de células T que podem ativar uma reação de células T para auxiliar a proliferação e maturação de células B específicas de antígeno de polissacarídeo, bem como a indução de uma memória imunológica.

Em uma modalidade alternativa da invenção é fornecido um conjugado de polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae b (PRP) proteína D.

A presente invenção também contempla vacinas combinadas as

·*· quais fornecem proteção contra uma série de diferentes patógenos. Um veículo de proteína D é inesperadamente útil como um veículo em vacinas combinadas onde são conjugados/múltiplos antígenos de polissacarídeos. Como mencionado acima, é provável que a supressão de epítope ocorra se o mesmo veículo for usado para cada polissacarídeo. WO 98/51339 apresentou composições para tentar minimizar esta interferência conjugando uma proporção dos polissacarídeos nas composição sobre DT e o resto sobre TT.

Inesperadamente, os inventores presentes descobriram que a proteína D é particularmente adequada para minimizar os efeitos de supressão epitópica referidos em vacinas combinadas. Um ou mais polissacarídeos em uma combinação podem ser vantajosamente conjugados sobre proteína D, e preferencialmente todos os antígenos são conjugados sobre proteína D em semelhantes vacinas combinadas.

Uma combinação preferencial inclui uma vacina que proporciona proteção contra infecção por Neissería meningitidis C e Y (e preferencialmente A) em que o antígeno de polissacarídeo de um ou mais dos sorotipos Y e C (e mais preferencialmente A) são ligados a proteína D.

Vacina à base de polissacarídeo de Haemophilus influenzae

(PRP conjugado com preferencialmente TT, DT ou CRM197, ou mais preferencialmente com proteína D) também pode ser formulada com as vacinas combinadas acima.

Muitas vacinas Pediátricas são agora administradas como uma vacina combinada de modo a reduzir o número de injeções que uma criança 25 tem a receber. Portanto para vacinas Pediátricas podem ser formulados outros antígenos com as vacinas da invenção. Por exemplo as vacinas da invenção podem ser formuladas com, ou administradas separadamente, mas ao mesmo tempo com a vacina combinada ‘trivalente’ de conhecimento geral compreendendo toxóide/diftérico (DT), toxóide tetânico (TT), e compo30 nentes pertussis [tipicamente toxóide Pertussis detoxificado (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) com pertactina opcional (PRN) e/ou aglutinina 1+2], por exemplo a vacina comercializada INFANRIX-DTPa™ (SmithKline28 • ¹⁰

Beecham Biologicals) a qual contém antígenos de PRN, DT, TT, PT, FHA, ou com um componente pertussis de célula inteira por exemplo como comercializado pela SmithKlineBeecham Biologicals S.A., como Tritanrix™. A vacina coombinada também pode compreender outro antígeno, tal como antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg), antígenos do vírus da Polio (por exemplo vírus da polio trivalente inativado- IPV), proteínas de membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae não classificado, proteínas de membrana externa de N. meningitidis B.

Exemplos de antígenos protéicos de Moraxella catarrhalis preferenciais os quais podem ser incluídos em uma vacina combinada (especialmente para a prevenção de otite média) são: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA & TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003 - 2010]; UspA1/2 [WO 93/03761 (Universidade do Texas)]; e OmpCD. Exemplos de antígenos de Haemophilus influenzae não classificado os quais podem ser incluídos em uma vacina combinada (especialmente para a prevenção de otite média) incluem: proteína de fimbrina [(Patente dos Estados Unidos No. 5766608 Ohio State Research Foundation)] e peptídeos compreendendo fusões da mesma [por exemplo LB1(f) fusões de peptídeos; Patente dos Estados Unidos No. 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (Universidade do Estado de Nova York)]; TbpA e TbpB; Hia; Hmw 1,2; Hap; e D15.

Vacinas Pediátricas preferenciais contempladas pela presente invenção são:

a) Conjugado de polissacarídeo de N. meningitidis C e conjugado de polissacarídeo de Haemophilus influenzae b, opcionalmente com conjugado de polissacarídeo de N. meningitidis A e/ou Y, com a condição de no mínimo um antígeno de polissacarídeo, e preferencial mente todos conjugados a proteína D.

b) Vacina a) com DT, TT, componentes pertussis (preferencialmente PT, FHA e PRN), antígeno da superfície de Hepatite B e IPV

(vacina do vírus da pólio trivalente inativado).

c) Antígenos de polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae conjugados a proteína D.

d) Vacina c) com um ou mais antígenos de Moraxella ca5 tarrhalis e/ou Haemophilus influenzae não classificado.

Todas as vacinas combinadas acima, podem se beneficiar da inclusão de proteína D como um veículo. Logicamente, quanto mais veículos estiverem envolvidos em uma vacina combinada (por exemplo para superar a supressão de epítopes), mais cara e complexa a vacina final. Ter todos, 10 ou a maioria, dos antígenos de polissacarídeos de uma vacina combinada conjugados a proteína D fornece deste modo uma vantagem considerável.

Para a prevenção de pneumonia na população de idosos (acima de 55 anos) e Otite média em infantes ou crianças pequenas, é uma modalidade preferencial da invenção para combinar alguns antígenos de polis15 sacarídeos de Streptococcus pneumoniae multivalentes - proteína D como descrito neste relatório com uma proteína de Streptococcus pneumoniae or equivalente imunologicamente funcional dos mesmos. Ver acima a seção Proteínas de Pneumococos da invenção para proteínas / combinações de proteínas preferenciais que podem ser incluídas em uma combinação se-

melhante.

Por conseguinte a presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo um conjugado de proteína D - polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae e um antígeno protéico de Streptococcus pneumoniae.

Os antígenos conjugados a proteína D - polissacarídeo da presente invenção são preferencialmente com adjuvantes na formulação de vacina da invenção. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio, mas támbém podem ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou pode ser uma suspen30 são insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacarídeos cationicamente ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.

Para vacinas para idosos é preferencial que o adjuvante seja

selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo TH1 de reação.

Para adjuvantes de Th1 particulares ver adjuvantes de Th1 da invenção acima.

Em um aspecto adicional da presente invenção é fornecido um imunógeno ou vacina como descrito neste relatório para uso em medicamento.

Para preparação/administração de vacina do conjugado, ver

Preparação de Vacina da Invenção acima.

A proteína D também é usada vantajosamente em uma vacina 10 contra otite média, uma vez que é em si um imunógeno capaz de produzir proteção mediada por células B contra H. influenzae não classificado (ntHi). ntHi podem invadir células do hospedeiro, e escapam dos efeitos mediados pelas células B induzidos pelo antígeno protéico. Os inventores presentes descobriram inesperadamente um modo de aumentar a eficácia de proteína 15 D (ou por si só ou como um veículo para um polissacarídeo) como um antígeno para uma vacina contra otite média. Isto é feito com adjuvante para a proteína D de tal modo que seja induzida uma forte reação de Th1 no indivíduo de tal modo que o ramo do sistema imune mediado por células é otimizado contra proteína D. Isto é inesperadamente obtido usando uma compo-

sição liofilizada compreendendo proteína D e um adjuvante de Th1 (preferencialmente 3D-MPL) o qual é reconstituído rapidamente antes da administração. A invenção também fornece portanto tais composições, um processo para preparar tais composições (liofilizando uma mistura compreendendo proteína D e um adjuvante de Th1), e uma aplicação de uma compo sição semelhante no tratamento de otite média.

Em um sentido mais amplo, os inventores imaginam que a liofilização de um imunógeno na presença de um adjuvante de Th1 (ver adjuvantes de Th1 da invenção), preferencialmente 3D-MPL, geralmente aumentará a reação imune de Th1 contra o imunógeno. A presente invenção é 30 portanto aplicável para qualquer imunógeno para o qual é necessária uma reação imune de Th1 mais forte. Os imunógenos compreendem antígenos protéicos bacterianos, virais e tumorais, bem como auto proteínas e peptí31

Λ1 • · ··· · • · · · • ··· · • · · · • · · · · ··· ·· ·· deos.

EXEMPLOS

Os exemplos ilustram, mas não limitam a invenção.

Exemplo 1

Polissacarídeo capsular de S.nneumoniae:

A vacina 11-valente que se pretende inclui os polissacarídeos capsulares sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F os quais foram preparados essencialmente como descrito em EP 72513. Cada polissacarídeo é ativado e derivado usando química de CDAP (WO 95/08348) e conjugado ao veículo de proteína. Todos os polissacarídeos são conjugados em sua forma nativa, exceto pelo sorotipo 3 (o qual foi reduzido de tamanho para diminuir sua viscosidade).

Veículo de proteína:

O veículo de proteína selecionado é a proteína D recombinante (PD) deHaemophilus influenzae não classificado, expressa em E. coli. EXPRESSÃO DE PROTEÍNA D

Proteína D de Haemonhilus influenzae

Estrutura genética para expressão de proteína D Matérias-Primas

A Proteína D codificando DNA

Proteína D é altamente conservada entre H. influenzae de todos os sorotipos e cepas não classificados. O vetor pHIC348 contendo a seqüência de DNA codificando o gene da proteína D total foi obtido do Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiologia Médica, Universidade de Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suécia. A sequência de DNA da proteína D foi publicada por Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59: 119 - 125.

O vector de expressão pMG1 '

O vetor de expressão pMG1 é um derivado de pBR322 (Gross et al., 1985) no qual foram introduzidos os elementos de controle derivados de bacteriófago λ para transcrição e translação de genes inseridos estranhos (Shatzman etal., 1983). Além disso, o gene de resistência a Ampicilina foi permutado com o gene de resistência a canamicina.

Α Ε. coli cepa AR58

Α Ε. coli cepa AR58 foi produzida por transdução de N99 com um estoque de fago P1 previamente cultivado sobre um SA500 derivado (galE:: TN10, lâmbdaKil· cl857 ΔΗ1). N99 e SA500 são E coli cepas K12 5 derivadas do laboratório do Dr. Martin Rosenberg no Instituto Nacional de

Saúde dos Estados Unidos.

O vetor de expressão pMG 1

Para a produção de proteína D, o DNA codificando a proteína foi clonado no vetor de expressão pMG 1. Este plasmídeo utiliza sinais de DNA 10 de lâmbdafago para orientar a transcrição e translação de genes estranhos inseridos. O vetor contém o estimulador PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) para ajudar os efeitos de polaridade transcricional quando é fornecida proteína N (Gross et aí, 1985). Vetores contendo o estimulador PL, são introduzidos em um hospedeiro lisogênico de E. coli para 15 estabilizar o DNA doplasmídeo. Cepas de hospedeiro lisogênico contêm

DNA de lâmbdafago de replicação incompleta integrado no genoma (Shatzman et aí, 1983). O DNA de lâmbdafago cromossômico orienta a síntese da proteína repressora cl que liga ao repressor OL do vector e impede a ligação de polimerase de RNA ao estimulador PL e deste modo a

transcrição do gene inserido. O gene cl da cepa de expressão AR58 contém um mutante sensível à temperatura de modo que transcrição orientada por

PL pode ser regulada por troca de temperatura, isto é, um aumento na temperatura da cultura inativa o repressor e se inicia a síntese da proteína estranha. Este sistema de expressão possibilita síntese controlada de proteí25 nas estranhas especialmente das que podem ser tóxicas para a células (Shimataka & Rosenberg, 1981).

A E. coli cepa AR58

A cepa AR58 lisogênica de E. coli usada para a produção do veículo de proteína D é um derivado do padrão NIH de E. coli K12 cepa N99 30 (F' su‘ galK2, lacZ’thr). Contém um lâmbdafago lisogênico defeituoso (gaIE::TN10, lâmbdaKil· cl857 ΔΗ1). O fenótipo Kil· impede a interrupção da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação cl857 confere uma lesão

sensível à temperatura para o repressor cl. A eliminação ΔΗ1 remove o operon direito do lâmbdafago e os hospedeiros locais bio, uvr3, e chIA. A cepa AR58 foi produzida por transdução de N99 com um estoque de fago PI previamente cultivado sobre um derivado SA500 (galE:: TN10, lâmbdaKil' cl857

ΔΗ1). A introdução do lisógeno defeituoso em N99 foi selecionada com tetraciclina em virtude da presença de um transposon TN10 codificando para resistência a tetraciclina no gene galE adjacente.

Construção de vector pMGMDPPrD

O vetor pMG que contém o gene codificando a proteína S1 não 10 estrutural de vírus da gripe (pMGNSI) foi usado para construir pMGMDPPrD. O gene de proteína D foi amplificado por PCR partir do vetor pHIC348 (Janson et al. 1991) com primers de PCR contendo sítios de restrição Ncol e Xbal nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente. O fragmento Ncol/Xbal foi em seguida introduzido em pMGNSI entre Ncol e Xbal criando 15 deste modo uma proteína de fusão contendo os 81 aminoácidos de terminal de N da proteína NS1 seguida pela (proteína PD. Este vetor foi etiquetado pMGNSI PrD.

Com base na estrutura descrita acima foi produzida a estrutura final para expressão de proteína D. Um fragmento BamHI/BamHI foi removi-

do de pMGNSI PrD. Esta hidrólise de DNA remove a região codificante NS1, exceto pelos três primeiros resíduos de terminal de N. Ao religar o vector foi produzido um gene codificando uma proteína de fusão com a seqüência de aminoácido de terminal de N seguinte: ιθ/ynJ lí) —-MDP SSHSSNMANT—- '

NS1 (^Proteína D C) ^proteína D não contém um peptídeo líder ou a cisteína determinai de N à qual as cadeias de lipídeos estão ligadas normalmente. A proteína não é portanto nem excretada no periplasma nem lipidada e permanece no citoplasma em uma forma solúvel.

A estrutura final pMG-MDPPrD foi introduzida na cepa do hospedeiro AR58 por choque térmico a 37 °C. Bactérias contendo plasmídeo foram selecionadas na presença de Canamicina. A presença da proteína D

codificando inserção de DNA foi demonstrada por digestão de DNA de plasmídeo isolado com endonucleases selecionadas. A cepa de E. coli recombinante é referida como ECD4.

A expressão de proteína D está sob o controle do estimulador lâmbda P_L / Operador O_L. A cepa hospedeira AR58 contém um gene cl sensível à temperatura no genoma o qual bloqueia a expressão de lâmbda P_L em baixa temperatura por meio de ligação a O_L. Uma vez que a temperatura seja elevada cl é liberado do O_Le é expressa a proteína D. Ao final da fermentação as células são concentradas e congeladas.

A extração de células cultivadas e a purificação de proteína D foi realizada como se segue. O aglomerado de cultura de células congeladas é descongelado e ressuspenso em uma solução de ruptura celular (tampão de citrato pH 6,0) para um OD₆₅₀ final = 60. A suspensão é passada duas vezes através de um homogeneizador de alta pressão a P = 1000 bar.

O homogeneizado de cultura celular é clarificado por meio de centrifugação e os fragmentos celulares são removidos por filtragem. Na primeira etapa de purificação o lisado filtrado é aplicado a uma coluna de cromatografia de permuta de cátion (SF Sepharose Fast Flow). PD liga à matriz de gel por meio de interação iônica e é elutriado por um aumento da etapa da força

iônica do tampão de elutriação.

Em uma segunda etapa de purificação as impurezas são retidas sobre uma matriz de permuta aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não liga sobre o gel e pode ser coletado através do fluxo.

Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta da fração é monitorada por OD. O fluxo através da cromatografia de coluna de permuta aniônica contendo a proteína D purificada é concentrado por ultrafiltragem.

O retido por ultrafiltragem contendo proteína D é finalmente passado através de uma membrana de 0,2 qm.

Química:

Química de ativação e ligação:

As condições de ativação e ligação são específicas para cada

polissacarídeo. Estes são dados na Tabela 1. Polissacarídeo natural (exceto por PS3) foi dissolvido em NaCI a 2 M ou em água para injeção. A concentração ótima de polissacarídeos foi avaliada para todos os sorotipos.

De 100 mg/ml de uma solução básica em acetonitrilo, CDAP (proporção de CDAP/PS de 0,75 mg/mg de PS) foi adicionada à solução de polissacarídeos. 1,5 minuto depois, foi adicionado trietilamina a 0,2 M para obter o pH de ativação específica. A ativação do polissacarídeo foi realizada neste pH durante 2 minutos a 25°C. Proteína D (a quantidade depende da propoção inicial PS/PD) foi adicionada ao polissacarídeo ativado e a reação 10 de ligação foi realizada no pH específico por 1 hora. A reação foi então extinta com glicina por 30 minutos a 25 °C e de um dia para o outro a 4 °C.

Os conjugados foram purificador por filtragem por gel usando uma coluna de filtragem por gel Sephacryl 500HR equilibrada com NaCI a

0,2 M.

O teor de carboidrato e proteína das frações elutriadas foi determinado. Os conjugados foram reunidos e filtrados estéreis sobre uma membrana de esterilização de 0,22 pm. As proporções de PS/Proteína nas preparações de conjugados foram determinadas. Caracterização:

Cada conjugado foi caracterizado e reunia as especificações descritas na Tabela 2. O teor de polissacarídeo (gg/ml) foi medido pelo teste de Resorcinol e o teor de proteína (gg/ml) pelo teste de Lowry. A proporção final de PS/PD (em peso) é determinada pela proporção das concentrações. Teor de DMAP residual (nq/uq de PS):

A ativação do polissacarídeo com CDAP introduz um grupo cianato no polissacarídeo e é liberada DMAP (4-dimetilamino-piridina). O tero de DMAP residual foi determinado por um teste específico desenvolvido na SB.

Teor de polissacarídeo livre (%):

O teor de polissacarídeo livre de conjugados mantidos a 4 °C ou armazenados 7 dias a 37 °C foi determinado na suspensão obtida após incubação com anticorpos α-PD e sulfato de amônio saturado, seguido por

uma centrifugação.

Foi usado um ELISA oc-PS/a-PS para a quantificação do polissacarídeo livre no sobrenadante. A ausência de conjugado também foi controlada por um ELISA oc-PD/a-PS. A redução da quantidade de polissacarí5 deo livre resulta em uma vacina de conjugado aperfeiçoada.

Antiqenicidade:

A antigenicidade dos mesmos conjugados foi analisada em um ELISA tipo sanduíche em que a captura e a detecção de anticorpos foram aPS e α-PD respectivamente.

Teor de proteína livre (%):

O nível de proteína D residual livre foi determinado usando um método com tratamento com SDS da amostra. O conjugado foi aquecido 10 min a 100 °C em presença de SDS a 0,1 % e injetado sobre uma coluna de filtragem por gel SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Como a proteína D é díme15 ro, há um risco de superestimar o nível de proteína D livre por meio de dissociação da estrutura com SDS.

Dimensão molecular (K_av):

A dimensão molecular foi realizada sobre uma coluna de filtragem por gel SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).

Estabilidade:

A estabilidade foi medida sobre em filtragem por gel HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) para conjugados mantidos a 4 °C e armazenados por 7 dias a 37 °C.

A caracterização ao 11 -valente é dada na Tabela 2.

Os conjugados de proteínas podem ser absorvidos sobre fosfato de alumínio e reunidos para formar a vacina final.

Conclusão:

Foram produzidos conjugados imunogênicos, que desde se viu serem componentes de uma vacina promissora. As condições otimizadas de 30 CDAP para o produto polissacarídeo de pneumococos conjugados de melhor qualidade final foram descobertas para cada uma das 11 valências. Conjugados destes polissacarídeos de pneumococos obteníveis pelo pro37

cesso de CDAP aperfeiçoado (otimizado) acima (independente da proteiína de veículo, mas preferencialmente proteína D) é portanto um aspecto adicional da invenção.

Exemplo 2

Estudo do Efeito de Adjuvantes Avançados sobre a Imunoqenicidade da Vacina de Conjugado de PS de Pneumococos-PD 11-valente em Ratos Filhotes

Ratos filhotes foram imunizados com vacina de conjugado de PS de pneumococos-PD 11-valente em uma dosagem de 0,1 pg cada polissa10 carídeo (preparado de acordo com o método para o Exemplo 1), e usando as seguintes formulações de adjuvantes: nenhuma, AIPO₄, 3D-MPL, 3DMPL sobre AIPO₄.

A formulação com somente 3D-MPL foi estatisticamente (e inesperadamente) mais imunogênica (maior IgG de GMC) do que para as outras 15 formulações para 5 de 11 antígenos. Isto foi verdade tanto em altas quanto baixas concentrações de 3D-MPL.

Opsonofagocitose confirmou os resultados da GMC.

Materiais e Métodos

Protocolo de Imunização

Ratos filhotes OFA foram randomizados para diferentes mães e tinham 7 dias de idade quando receberam a primeira imunização. Recebe ram 2 imunizações adicionais 14 e 28 dias depois. Uma sangria foi realizada no dia 56 (28 dias post III). Todas as vacinas foram injetadas por via s.c., e havia 10 ratos por grupo de vacina.

Os ratos foram imunizados com uma vacina de conjugado de pneumococos 11-valente compreendendo os seguintes sorotipos de polissacarídeos conjugados a proteína D: 1,3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.

Formulação

Para examinar o efeito de diferentes adjuvantes avançados, a dosagem do conjugado foi mantida constante a 0,1 pg de cada polissacarídeo, e os adjuvantes AIPO₄ e 3D-MPL foram formulados em diferentes do-

	θθ ··· ··« ,*·. .·*. ? · Φ <······· • ·..· ·· ·· ’·	4 . · *» · · • · · · ·> ·· ·· * ·
•		sagens e combinações, inclusive sem nenhum adjuvante. Estes estão listados numericamente na Tabela 3 para referência.
		Adsorcão em AIPO4
-		Os monovalentes concentrados, adsorvidos foram preparados
	5	de acordo com 0 seguinte procedimento. 50 gg de AIPO4 (pH 5,1) foram
•	10	misturados com 5 gg de conjugados de polissacarídeos por 2 horas. O pH foi ajustado para pH 5,1 e a mistura foi deixada por um adicional de 16 horas. NaCI a 1500 mM foram adicionados para preparar a concentração de sal a 150 mM. Após 5 minutos foram adicionados 5 mg/mL de 2fenoxietanol. Após um adicional de 30 minutos 0 pH foi ajustado para 6,1, e
		deixado por mais de 3 dias a 4 °C. Preoaracão de diluentes Três diluentes foram preparados em NaCI a 150 mM/5 mg/mL de fenoxietanol.
	15	A: AIPO4 a 1 mg/ml.
-		B: 3D-MPL em AIPO4 a 250 e 1000 gg/ml respectivamente Pro-
•	20	porção em peso de 3D-MPL/AIPO4 = 5/20. C: 3D-MPL em AIPO4 a 561 e 1000 gg/ml respectivamente Pro- porção em peso de 3D-MPL/AIPO4 = 50/89. Preoaracão de 11-valente adsorvido
25	Os onze monovalentes PS-PD concentrados, adsorvidos foram misturados na proporção correta. O complemento de AIPO4 foi adicionado como 0 diluente A. Quando necessário, foi adicionado 3D-MPL ou como uma solução aquosa (não adsorvida, Modo 1 visto abaixo) ou como 0 diluente B ou C (3D-MPL adsorvido sobre AIPO4 em 2 doses, Modo 2, visto
	30	abaixo). Modo 1 3D-MPL foi adicionado aos conjugados adsorvidos combinados como uma suspensão aquosa. Foi misturado com 0 11-valente por 10 minutos à temperatura ambiente e armazenado a 4 °C até a administração.
		Modo 2

3D-MPL foi pré-adsorvido sobre AIPO₄ antes da adição aos • ¹⁰

·· · • · <* 9

99 ··** r » * t « * «·· « · • * • · ·· • 1 • * • · • · ·· ·♦ ·· · *· ml de conjugados adsorvidos combinados (diluente B e C). Para preparar 1 diluente, uma suspensão aquosa de 3D-MPL (250 ou 561 gg) foi misturada com 1 mg de AIPO₄ em NaCI a 150 mM pH 6,3 por 5 min à temperatura ambiente. Esta solução foi diluída em NaCI pH 6,1/fenóxi e incubada de um dia para o outro a 4°C.

Preparação de undecavalente não adsorvido

Os onze conjugados de PS-PD foram misturados e diluídos na proporção correta em NaCI a 150 mM pH 6,1, fenóxi. Quando necessário, 3D-MPL foi adicionado como uma solução (não adsorvido).

As formulações para todas as injeções foram preparadas 18 dias antes da primeira administração.

ELISA

O ELISA foi realizado para medir a IgG de rato usando o protocolo derivado do Workshop da WHO sobre o procedimento ELISA para a quantificação de anticorpo IgG contra polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae no soro humano. Em essência, polissacarídeo capsular purificado é revestido diretamente sobre a lâmina de microtítulo. Amostras de soro são pré-incubadas com o polissacarídeo de parede celular comum a todos os pneumococus (substância C) e que está presente em cerca de 0,5 % em polissacarídeos de pneumococos purificados de acordo com a revelação (EP 72513 B1). Foram empregados reagentes da Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar IgG murino ligado. As curvas de titulação foram referidas para padrões internos (anticorpos monoclonais) modelados por equação log logística. Os cálculos foram realizados usando programa SoftMax Pro. Espera-se que o máximo erro absoluto destes resultados esteja dentro de um fator de 2. O erro relativo é menos de 30 %. Opsonofaqocitose

Títulos opsônicos foram determinados para sorotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F and 23F usando o protocolo CDC (Streptococcus pneumoniae Opsonophagocytosis using Differentiated HL60 cells, versão 1.1) com PMN humanos purificados e complemento de coelho recém-nascido. A modificação incluiu o uso de cepas de estufa (in-house) de pneumococos, e as cé30

lulas HL60 fagocíticas foram substituídas por neutrófilos PMN humanos purificados (há um alto grau de correlação entre estas células fagocíticas). Além disso, foram adicionadas contas de vidro de 3 mm às cavidades do microtitulador para aumentar a mistura, e isto possibilitou a redução da pro5 porção de fagócitos : bactérias que foram recomendadas como sendo 400.

Resultados

Concentrações de IgG

As concentrações médias geométricas de IgG determinadas para todo sorotipo, e PD são apresentadas nas Tabelas 4 a 10. Para soroti10 pos 6B, 14, 19F e 23F, resultados obtidos anteriormente usando uma formulação tetravalente são incluídos para comparação.

As maiores concentrações de IgG foram realçadas nas Tabelas 4 a 10. O valor p estatístico para composições de 3D-MPL vs. composições de 3D-MPL/ AIPO₄ está na Tabela 11. A formulação adjuvante número 4 15 (alta dose de conjugados 3D-MPL não adsorvidos) que dá o maior GMC para 9 dos 11 casos. Em 5/11 casos, MPL na baixa dose é o segundo mais imunogênico . Além disso, adicionar adjuvante dá maior GMC do que modificar a dose para todos os sorotipos (dados não apresentados), e isto é estatisticamente significante para os sorotipos 4, 6B, 7F, 18C e 23F (p < 0,05

de intervalo de confiança de 95 %). Opsonofagocitose

Os resultados da opsonofagocitose em soros reunidos são apresentados para os sorotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F e 23F nas Tabelas 4 a 8. Para a maior parte, estes títulos opsônicos confirmam a IgG de GMC. Na verdade, a correlação com a concentração de IgG é maior do que 85 % para sorotipos 6B, 19F, 23F (dados não apresentados). Para sorotipo 3, é importante observar que somente o grupo 3D-MPL induziu atividade opsônica acima do limite.

Conclusões

Neste experimento, foi inesperado que o uso de 3D-MPL sozinho induzisse as maiores concentrações de IgG.

A IgG de GMC máxima obtida modificando o adjuvante foi com41 parada com a GMC máxima obtida modificando a dosagem de PS, e foi visto que 3D-MPL podia induzir reações significativamente maiores em 5/11 sorotipos.

A Tabela 11 mostra que quando composições de 3D-MPL e 3D5 MPL/AIPO4 são comparadas (comparando o processo da formulação, e a dose de 3D-MPL), 5 dos conjugados de polissacarídeo são significativamente aprimorados, em termos de imunogenicidade, quando formulados com somente 3D-MPL ao invés de 3D-MPL mais AIPO₄: PS 4, PS 6B, PS

18C, PS 19F, e PS 23F.

Exemplo 3

Estudo do efeito da combinação sobre a imunogenicidade de conjugados PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F, e PS 23F em ratos adultos

Ratos adultos foram imunizados com vacinas de conjugado de polissacarídeo de pneumococos-proteína D ou individualmente, ou combi15 nada em uma composição multivalente (ou tetra-, penta-, hepta-, ou decavalente). Grupos de 10 ratos foram imunizados duas vezes com 28 dias de diferença, e foram obtidas sangrias para teste no dia 28 e dia 42 (14 dias após a 2- dose).

Os soros foram testados por ELISA para anticorpos IgG para os

polissacarídeos de pneumococos. Todos os conjugados induziram anticorpos IgG específicos conforme medido por ELISA. A Tabela 12 mostra o efeito da combinação de conjugados de proteína D monovalente PS 6B, PS

18C, PS 19F, e PS 23F sobre sua imunogenicidade em ratos adultos, conforme medido pela concentração de IgG nos 14 dias post 2- dose.

Foi realizada análise estatística em todas as amostras para determinar se diferenças na concentração de anticorpos na combinação foram significantes. A combinação de quaisquer dos conjugados de proteína D sorotipos PS 6B, PS 18C, PS 19F, e PS 23F em uma vacina multivalente não alterou de modo significativo sua imunogenicidade.

Tabela 1

Condições de ativação ligação/resfriamento rápido específico de conjugados de PS de S. pneumoniae-Proteína D

Sorotipo	1	3 (μίΙυϊΡ.)	4	5	6	7F
Cone. PS (mg/ml)	2,0	3,0	2,0	7,5	5,4	3,0
Dissolução de PS	NaCI 2M	NaCI 2M	H2O	h2o	NaCI 2M	NaCI 2M
Cone. PD (mg/ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Proporção PS/PD Inicial (p/p)	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1	1/1
Cone. CDAP(mg/ mg PS)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
pHa=pHc= pHq	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	9,5/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0

Sorotipo	9V	14	18C	19F	23F
Cone. PS (mg/ml)	2,5	2,5	2,0	4,0	3,3
Dissolução de PS	NaCI 2M	NaCI 2M	H2O	NaCI 2M	NaCI 2M
Cone. PD (mg/ml)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Proporção PS/PD Inicial (p/p)	1/0,75	1/0,75	1/1	1/0,5	1/1
Cone. CDAP(mg/ mg PS)	0,75	0,75	0,75	0,75	0,75
pHa=pHc=p Hq	8,5/8,5/9,0	9,0/9,0/9,0	9,0/9,0/9,0	10/9,5/9,0	9,0/9,0/9,0

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ω CL 0) ~0>

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ção PS/Prot. (

k- C0 o C0 <0 C0 õ Q. Φ

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CL

H

H

H

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b

LU

CL

H

H

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V

b

LU

Tabela 3

Tabela Sumária de Formulações Adjuvantes testadas com PS-PD De pneumococos 11 -valente em Ratos Filhotes

Grupo	AIPO4	MPL	Método	Descrição
1				Nenhum
2	100			AIPO4
3		5		baixo MPL
4		50		alto MPL
5	100	5	Modo 1	baixo Modo 1
6	100	50	Modo 1	alto Modo 1
7	100	5	Modo 2	baixo Modo 2
8	100	50	Modo 2	alto Modo 2

Tabela 4

o iCO ω

Φ >

c o o o

ΙΟ ω

LL o

o Q. *·*—» o

Ϊ— o CO o

ÇÇ '~G cn

CD

Tabela φ Ό o i(0 o

Λ ϊ— c

Φ o c o O

LL « O

CO □c

Φ Ό

O tCB

O

19F Título Opson* ic	Undecavalente	<6,25	79	296	1276	172	208	323	241
19F Soroconversão	2/10	7/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
g 1 0 g o 0 ·>- çp	0,021	0,222	4,028	21,411	1,649	2,818	0,766	3,539
19F Título Opson* ic	Tetravalente	64	367					193
19F Soroconversão	2/10	9/10					10/10
19FGMC IgG (pg/ml)	'Φ o o~	1,07					1,09
Método						-	-	CM	CM
CD —1 Q_				IO	50	LO	50	in	50
AIP04 pg			100			100	100	100	o o
Grupo		v—	CM	CO		LO	CD	h-	CO

Tabela 7

ο <05 ω <υ > c ο ο ο kο ω

LL φ

CO ω ο ο.

Η-* ο X— ο ω ω ο σ

Tabela 8

JD)

Φ TJ

Ο

105

Ο ϊ—

C Φ

Ο

C ο Ο

7F Título Opson* ic	<6,25	43	477	332	54	59	30	140
7F Soroconversão	7/10	9/10	10/10	10/10	10/10	9/10	OL/8	9/10
7FGMC IgG (pg/ml)	o st· o o“	0,25	2,435	2,569	0,579	0,611	0,154	0,638
3 Título Opson* ic	<6,25	<6,25	<6,25	co	<6,25	<6,25	<6,25	<6,25
3 Soroconversão	1/10	6/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
0 CD >—. O 0 -S co	0,003	0,008	0,070	0,108	0,015	CM o o~	0,006	0,034
Método					-	-	CM	CM
D) =L _J CL 2			IO	50	LO	50	LO	50
AIP04 pg		100			100	100	100	100
Grupo	-	CM	co	sr	LD	CD	1^-	co

Tabela 9

5 Soroconversão	3/10	9/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
0 cn O É 0 3; LO	0,040	0,774	7,927	13,974	3,015	5,755	2,062	5,009
4 Soroconversão	0/10	5/10	10/10	10/10	10/10	9/10 I	9/10	10/10
4 GMC IgG (gg/ml)	0,005	0,052	3,452	7,102	0,676	CD ’Φ o”	0,267	0,423
1 Soroconversão	4/10	8/10	10/10	10/10	10/10	10/10 _______ I	10/10	10/10
0 D) O £ 0 3=	0,026 l	0,282	1,614	2,261	0,568	1,430	0,478	1,458
Método					-	-	CM	CM
D) =L —1 Q_			LO	50	LO	50	LO	50
AIPO4 pg		100			O O T“	100	100	100
Grupo	-	cm	CO		LO	CO		CO

ω ο <5 CC φ Ό ο «CQ

Ο <Β Ν ’c

Ε

ω ο Ο. οο CM ÇÚ Q

Ο C ο 105 ω ϊ_ Φ > £Ζ Ο Ο ο δ ω φ ο ο_ φ Ο οο ω φ » c

>

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ω φ c Φ ϊ— φ Η—

Q ο Ό

C Λ ω

Φ

C φ φ >

σ>

ο «ω ο C0 i—

C

Tabela 10 φ ο

C ο Ο

Q Ο. ώ CL

PD Soroconversão	0/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	OL/8	10/10
PD GMC IgG (pg/ml)	0,003	0,993	3,349	5,446	11,407	1,258	1,665	5,665
18C Soroconversão	1/10	5/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
18CGMC IgG (pg/ml)	0,013	0,092	6,560	14,023	069*0	1,771	0,528	0,980
9V Soroconversão	0/10	6/10	7/10	10/10	9/10	10/10	10/10	9/10
9VGMC IgG (gg/ml)	0,018	0,489	0,482	11,421	2,133	2,558	1,536	2,448
Método					-	-	CM	CM
CD 3. —1 CL			LO	50	LO	50	ID	50
05 3. O CL <		100			100	o o T—	100	100
Grupo	-	CM	CO		m	CO	b»	CO

Tabela 11

A importância estatística (valor p) de que alguns conjugados de polissacarídeos de pneumococos têm aperfeiçoada imunogenicidade quando formulados com somente 3D-MPL versus com 3D-MPL/AIPO4. Um valor p abaixo 5 de 0,01 é considerado altamente significante. O Modo 1 e o Modo 2 indicam o método da formulação.

Sorotipo	50 pg de 3D-MPL vs. 3D-MPL/AIPO4	50 pg de 3D-MPL vs. 3D-MPL/AIPO4
	Modo 1	Modo 2	Modo 1	Modo 2
1	0,3	0,05	0,079	0,11
3	0,075	0,01	0,27	0,008
4	0,002	0,0003	0,02	0,003
5	0,04	0,002	0,1	0,12
6B	0,001	0,0001	0,001	0,0006
7F	0,13	0,15	0,01	0,005
9V	0,02	0,02	0,1	0,04
14	0,65	0,21	0,3	0,66
18C	0,0008	0,0002	0,006	0,004
19F	0,0009	0,006	0,21	0,04
23F	0,002	0,0004	0,01	0,0004

Tabela 12

Concentração de IgG Média Geométrica (pg/mL) no dia 14 post 2- dose após imunização de ratos adultos com 1,0 pg de conjugado de polissacarí10 deo e proteína D sozinho ou combinado em vacina tetravalente, pentavalente, heptavalente ou decavalente. Estes dados são combinados de 5 experimentos separados.

Vacinas Sorotipos	4 H	6B T	18C H	19F T	23F T
Sozinho	9,3	0,11	15	5,2	2,5
Combinado	4	0,23	3,7	3,7	2,8

continuação

Vacinas sorotipos	4 H	6B T	18C H	19F T	23F T
T: combinada em combinações de vacinas tetravalente (T) (PS 6B, 14, 19F, 23F), pentavalente (T mais PS 3), heptavalente (Η) (T mais PS 4, 9V e 18C), e decavalente (H mas PS 1, 5 e 7F). H: combinada em combinações de vacinas heptavalente (Η) (T mais PS 4, 9V e 18C), e decavalente (H mais PS 1, 5 e 7F).

Exemplo 4

Impacto benéfico do acréscimo de pneumolisina e 3D-MPL sobre a eficácia protetora de vacina polissacarídeo 11-valente conjugada a PD contra colonização pulmonar por pneumococos em camundongos

Leituras imunológicas

Dosagem ELISA de IgG sérica pneu/noí/s/na-específica

Imunolâminas Maxisorp Nunc foram revestidas por 2 horas a 37°C com 100 μΙ/cavidade de 2 pg/ml de pneumolisina nativa recombinante (PLY) diluída em PBS. As lâminas foram lavadas 3 vezes com NaCI 0,9 % de Tween-20 0,05 % de tampão. Em seguida, diluições seriais de 2 vezes (em PBS/ Tween-20 a 0,05 %, 100 μΙ por cavidade) de um soro anti-PLY de referência adicionado como uma curva padrão (iniciando em 670 ng/ml de IgG) e amostras de soro (iniciando em uma diluição a 1/10) foram incubadas por 30 minutos a 20 °C sob agitação. Após lavar como descrito anteriormente, IgG anticamudongo de cabra conjugada a peroxidase (Jackson) diluída 5000x em PBS/Tween-20 a 0,05 % foram incubadas (100 μΙ/cavidade) por 30 minutos a 20 °C sob agitação. Após lavar, as lâminas foram incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente com 100 μΙ/cavidade de tampão de revelação (OPDA 0,4 mg/ml e H₂O₂ a 0,05 % em 100 mM pH 4,5 tampão de citrato). A revelação foi interrompida adicionando 50 μΙ/cavidade de HCI a 1 N. As densidades óticas foram lidas a 490 e 620 nm usando leitora imune Emax (Molecular Devices). O título de anticorpos foi calculado pelo método matemático de 4 parâmetros usando programa SoftMaxPro.

Inibição de Hemólise

Este teste foi feito para medir a capacidade de anticorpos séri54

cos para inibir a atividade hemolítica da pneumolisina (PLY). De modo a eliminar o colesterol (suscetível de interagir com PLY), amostras de soro foram tratadas 2x como se segue: foram misturadas com 1 volume igual de clorofórmio e em seguida incubadas por 45 minutos sob agitação. Os so5 brenadantes foram colhidos após centrifugação por 10 minutos a 1000 rpm.

Os soros clareados de colesterol foram diluídos (diluições seriais de 2 vezes em ditiotreitol a 1 mM, 0,01 % de BSA, TRIS a 1 mM, NaCI a 150 mM, pH

7,5) em microlâminas de 96 cavidades (Nunc). Cinquenta μΙ de uma solução contendo 4 HU (Unidades de Hemólise) de PLY foram adicionados a cada 10 cavidade e incubados por 15 minutos a 37 °C. Em seguida, 100 μΙ de células vermelhas de sangue de ovelha (solução a 1 %) foram adicionados por 30 minutos a 37 °C. Após centrifugação por 10 minutos a 1000 rpm, os sobrenadantes (150 μΙ) foram colhidos e postos em outra microlâmina de 96 cavidades para leitura da densidade ótica a 405 nm. Os resultados foram 15 expressos como títulos de diluição do ponto médio.

Detoxificação química de pneumolisina

Pneumolisina natural recombinante (PLY) foi dialisada contra tampão de Fosfato a 50 mM NaCI a 500 mM pH 7,6. Todas as etapas seguintes foram feitas a 39,5 °C sob agitação episódica. No dia 1, Tween-80 a

% (1/250 em volume), N-acetil triptofano a 57,4 mM pH 7,6 (3/100 em volume), glicina a 2,2 M em tampão de Fosfato (1/100 em volume) e formaldeído a 10 7o em tampão de Fosfato (3/100 em volume) foram adicionados a solução de PLY. Nos dias 2 e 3, formaldeído a 10 7o foi adicionado de novo, a 3/100 e 2/100 de proporção em volume, respectivamente. A incubação a 25 39,5 °C foi mantida até o dia 7 sob agitação episódica. Finalmente, PLY foi dialisado contra tampão de Fosfato a 50 mM NaCI a 500 mM pH 7,6. Foi demonstrada completa inativação de PLY neste teste de hemólise.

Estímulo intranasal por pneumococos em camundonqos OF1

Camundongos fêmeas OF1 de sete semanas de idade foram 30 inoculados por via intranasal sob anestesia com 5,10⁵ CFU de sorotipo 6B de S. pneumoniae adaptado de camundongo. Os pulmões foram removidos em 6 horas após estímulo e homogeneizados (Ultramax, 24000 rpm, 4 °C)

no meio de Caldo de Todd Hewith (THB, Gibco). Diluições seriais de 10 vezes de homogeneizados pulmonares foram laminadas de um dia para o outro a 37 °C sobre placas de Petri contendo ágar THB suplementado com extrato de levedura. Infecção pulmonar por pneumococos foi determinada 5 como o número de CFU/camundongo, expresso como média pesada logarítmica. O limite de detecção foi de 2,14 log CFU/camundongo.

Exemplo 4A

Efeito adjuvante de 3D-MPL sobre reação imune anti-pneumolisina

No presente exemplo, avaliamos o impacto de adjuvante 3D10 MPL sobre a reação imune para pneumolisina recombinante natural (PLY, fornecida por J. Paton, Children’s Hospital, North Adelaide, Austrália) e seu complemento quimicamente detoxificado (DPLY). A detoxificação química foi feita como descrito acima.

Grupos de 10 camundongos fêmeas Balb/c de 6 semanas de idade foram imunizados por via intramuscular nos dias 0, 14 e 21 com 1 gg de PLY ou DPLY contido tanto em A: AIPO4 100 gg; ou B: AIPO4 100 gg + 5 gg de 3D-MPL (3 de-O-acilado monofosforil lipídeo A, fornecido pela Ribi Immunochem). As Figuras 1A e 1B mostram títulos de IgG por ELISA IgG e de Inibição de Hemólise (HLI) medidos nos soros post-lll.

Qualquer que seja o antígeno, foram induzidas melhores reações imunes em animais vacinados com formulações suplementadas com

3D-MPL. Notavelmente, DPLY foi tão imunogênico quanto PLY quando administrado com AIPO4 + 3D-MPL, apesar de ser um imunógeno mais fraco em formulação de AIPO4. Isto mostrou a capacidade benéfica de 3D-MPL para melhorar a reação de anticorpos para pneumolisina detoxificada.

Em composições contendo pneumolisina, pode ser preferencial usar pneumolisina quimicamente detoxificada ao invés de pneumolisina mutacionalmente detoxificada. Isto porque mutantes detoxificados obtidos até o momento ainda têm atividade de toxina residual- a pneumolisina qui30 micamente detoxificada não. Portanto se considera outro aspecto da invenção que, em geral, composições compreendendo pneumolisina (ou mutantes de pneumolisina) que tenham sido quimicamente detoxificadas para uso em uma vacina, devem ter adicionado um adjuvante com um adjuvante de Th1, preferencialmente 3D-MPL. Tais composições são fornecidas pela invenção. Também se pretende um método para aumentar a reação imune de pneumolisina quimicamente detoxificada em uma composição imunogênica 5 compreendendo as etapas de adicionar um adjuvante de Th1 (preferencialmente 3D-MPL) à composição.

Exemplo 4B

Efeito benéfico do acréscimo de um mutante atenuado de pneumolisina e adjuvante 3D-MPL sobre a eficácia proteção de Vacina de polissacarídeo 10 11-valente conjugada a PD contra colonização pulmonar por pneumococos em camundongos OF1 estimulados por via intranasal com sorotipo 6B.

No presente exemplo, foi avaliada a eficácia profilática de uma vacina contendo o conjugado de polissacarídeo 11-valente-proteína D, antígeno de pneumolisina mutante atenuada (PdB, WO 90/06951) e AIPO4 + 15 adjuvantes 3D-MPL, comparada à clássica formulação de conjugado de proteína D-polissacarídeo 11-valente adsorvido a AIPO4.

Grupos de 12 camundongos OF1 fêmeas de 4 semanas de idade foram imunizados por via subcutânea nos dias 0 e 14 com formulações contendo A: 50 gg de AIPO4; B: 0,1 gg de PS/sorotipo de vacina de polissa-

carídeo 11-valente conjugado a PD + 50 gg de AIPO4; ou C: 0,1 gg de PS/sorotipo de vacina de polissacarídeo 11-valente conjugado a PD + 10 gg de PdB (fornecida por J. Paton, Children’s Hospital, North Adelaide, Austrália) + 50 gg de AIPO4 + 5 gg de 3D-MPL (fornecido pela Ribi Immunochem).

O estímulo foi feito no dia 21 como descrito acima.

Como mostrado na Figura 1C, foi conferida uma proteção muito significante (p < 0,007) pela vacina de conjugado de polissacarídeos 11valente suplementada com PdB e com adjuvante AIPO4 + MPL (barras em preto representam a média aritmética). Ao contrário, não foi observada proteção significante em animais imunizados com a formulação de conjugado de polissacarídeo 11-valente /AIPO4. Este resultado comprovou que o acréscimo de antígeno de pneumolisina (mesmo atenuado) e adjuvante 3DMPL aumentou a eficácia da vacina de conjugado de polissacarídeo 1157

valente contra pneumonia.

Exemplo 4C correlações imunes da proteção apresentada no exemplo 4B

De modo a estabelecer as correlações imunes da proteção 5 conferida no exemplo 4B, pela vacina de conjugado de polissacarídeos 11valente suplementada com pneumolisina mutante atenuada (PdB) e 3DMPL, foram medidas as reações pré-estímulo de anticorpos séricos a polissacarídeo 6B e PdB como descrito acima.

Os títulos de anticorpos foram em seguida comparados com números de colônias de bactérias medidos em pulmões dos animais correspondentes coletados em 6 horas pós estímulo. R² foram calculados sobre regressões lineares Log/Log.

R² calculados foram iguais a 0,18 e 0,02 para reações de anticorpo anti-PdD e anti-6B, respectivamente. Isto mostrou a ausência de cor15 relação entre reações imunes humorais e proteção para ambos os antígenos. Títulos de anticorpo anti-6B não foram significativamente diferentes nos grupos imunizados com a vacina conjugada 11-valente (GMT = 0,318 ng/ml) ou com a mesma vacina suplementada com PdD e 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Portanto, a melhora na proteção vista com a formulação C não foi

devida somente a uma maior reação de anticorpo para polissacarídeo 6B.

Tomados juntos, os resultados sugerem que a proteção não foi mediada por reações imunes humorais somente, mas ao invés também por uma imunidade mediada por células induzida pelo antígeno PdB na presença de 3D-MPL. Isto dá suporte adicional ao acréscimo de antígeno(s) protéi co(s) e potente(s) adjuvante(s) na vacina de conjugado de polissacarídeos de pneumococos, de modo a coordenar ambos os ramos do sistema imune para ótima proteção.

Exemplo 5

A Cooperação de ambos os ramos do Sistema Imune em camundongos imunizados ativamente com pneumolisina e imunizados passivamente com anticorpos contra PS de pneumococos • *

Exemplo 5A

Descobrir a Concentração de Anticorpo Anti-6B-Polissacarídeo Administrado Passivamente (anti-PS) Protegendo Contra Pneumonia

Método

Grupos de Vacinas: Quatro grupos de 16 camundongos foram imunizados passivamente (i.p.) no dia - 1 com 100 μΙ de anti-soro antipolissacarídeo de rato não diluído de acordo com os grupos detalhados abaixo, (total de 64 camundongos)

Grupo	Especificidade	Concentração de IgG no Anti-soro
G1	α-PS -6B	5 pg/ml.
G2	a-PS -6B	2 pg/ml.
G3	a-PS -6B	0,75 pg/ml.
G4	Controle	0 pg/ml.

Animais: 64 camundongos machos CD-1 de Charles River, Ca10 nadá, pesando aproximadamente 35 g (aproximadamente 10 semanas de idade).

Anestesia: Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (3 %) mais 02 (1 L/min).

Organismo: S. pneumoniae N1387 (sorotipo 6) foi colhido de 15 lâminas de ágar de soja tripticase (TSA) suplementadas com 5 % sangue de cavalo e suspenso em 6 ml de PBS, imediatamente antes de infecção, 1 ml de suspensão bacteriana foi diluído em 9 ml de ágar nutriente fundido congelado (BBL) e mantido a 41 °C. Os camundongos receberam aproximadamente 6,0 log 10 cfu/camundongo em um volume 50 ul.

Infecção: No dia 0 camundongos foram anestesiados como descrito acima e infectados com S. pneumoniae N1387 (50 μΙ de suspensão bacteriana resfriada) por instilação intra-brônquica através de intubação intratraqueal não cirúrgica. Este método foi descrito por Woodnut e Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Amostras: No dia 3 pós infecção, 8 camundongos/grupo foram sacrificados por overdose de CO2 e os pulmões foram excisados e homo59

geneizados em 1 ml de PBS. Foram preparadas diluições seriais de dez vezes em PBS para enumerar números bacterianos viáveis. As amostras foram inoculadas (20 μΙ) em triplicata sobre lâminas TSA suplementadas com sangue de cavalo a 5 % e incubadas de um dia para o outro a 37 °C antes da avaliação. Séries adicionais de camundongos foram sacrificados no dia 7 e mostrados como acima.

Resultados:

Cone, de IgG (ug/ml) em soro de rato	Números bacterianos (log 10 cfu/pulmões) em dias pós-infecção
3	8
5	6,7 ±0,7 (1/7)	7,2 ± 0,7 (5/8)
2	6,7 ±0,7 (1/7)	6,9 ± 1,8 (4/7)
0,75	7,7 ± 0,5 (5/8)	4,8 ± 1,4 (2/8)
0	6,7 ± 1,5 (3/6)	6,3 ± 1,5 (3/9)

O números dentro de parênteses são números de animais que morreram antes da hora da amostra.

Conclusão: Em geral, não houve diferença significante nos números bacterianos isolados de qualquer dos grupos de tratamento. Isto indica que não foi proporcionada proteção mensurável pelo anti-polissacarídeo em concentrações até 5 gg/ml inclusive.

Isto é semelhante ao que é observado em alguns testes clínicos humanos, isto é, estrutura anti-polissacarídeo é insuficiente para proteger contra pneumonia por pneumococos em algumas populações.

Exemplo 5B

Determinar a proteção contra pneumonia proporcionada por administração ativa de Ply (pneumolisina) com ou sem adjuvante, e sinergia com anticorpo anti-PS sub-ótimo.

Método

Animais: 128 camundongos CD-1 machos (6 semanas de idade na imunização, 10 semanas de idade na infecção) de Charles River, St. Constant, Quebec, Canada. Os animais pesaram aproximadamente 20 gm em 6 semanas e 38 g em 10 semanas.

Imunizações: Seis grupos de 16 camundongos foram imunizados por injeção subcutânea nos dias -22 e -14 com 100 ul de vacina como detalhado abaixo. (Total de 128 camundongos). PdB (WO 90/06951) foi obtido por cortesia do Dr. James Paton, Austrália. 3D-MPL foi obtido de Ri5 bi/Corixa.

No dia - 1, grupos específicos (ver Tabela abaixo) foram imunizados (I00 μΙ i.p.) passivamente com uma concentração de 4,26 μg/ml (4 ml de 5 μg/ml + 1,3 ml de 2 μg/ml) de anticorpo anti-polissacarídeo de camundongo.

Grupo	Volume Ativo de Injeção	Vacina administrada dias-22,-14 (Dosagem μ9)	Volume Passivo de Injeção	IgG Passiva (dia-1)
1-1	100 μΙ s.c.	PdB/AIPO4 (10/50)		Nenhuma
1-2	100 μΙ s.c.	PdB/MPL/AIPO4 (10/5/50)		Nenhuma
1-3	100 μΙ s.c.	PdB/AIPO4 (10/50)	100 μΙ i.p.	a-PS
1-4	100 μΙ s.c.	PdB/MPL/AIPO4 (10/5/50)	100 μΙ i.p.	a-PS
1-5	100 μΙ s.c.	MPL/AIPO4 (5/50)	100 μΙ i.p.	a-PS
1-6	100 μΙ s.c.	MPL/AIPO4 (5/50)		Nenhuma

Infecção: No dia 0, os camundongos foram anestesiados (3 % de isoflurano mais 1 L/min de 02). Foram preparados inóculos bacterianos colhendo o crescimento de S. pneumoniae N1387 (sorotipo 6) de lâminas de ágar de soja em tripticase (TSA) suplementado com sangue de cavalo a 5 % e suspendendo em 6 ml de PBS. Uma diluição de dez vezes (1 ml mais 9 ml) foi preparada em ágar nutriente fundido resfriado (mantido a 41 °C) imediatamente antes da infecção. Os camundongos foram infectados por instilação intra-brônquica através de intubação intra-traqueal e receberam aproximadamente 6,0 Iog10 cfu/camundongo em um volume de 50 μΙ. Este método foi descrito por Woodnut e Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).

Amostras: Em 72 pós infecção, 8 camundongos/grupo foram φ 10

sacrificados por overdose de CO2 e os pulmões foram excisados e homogeneizados em 1 ml de PBS. Foram preparadas diluições seriais de dez vezes em PBS para enumerar números bacterianos viáveis. As amostras foram inoculadas (20 μΙ) em triplicata sobre lâminas de TSA suplementadas com sangue de cavalo a 5 % e incubadas de um dia para o outro 37 °C antes da avaliação. Séries adicionais de camundongos foram sacrificados no dia 8 pós infecção e amostras como acima.

Análise dos Dados

A medida da produção para comparação do tratamento foi o número de bactérias nos pulmões em 3 e 7 dias pós infecção. Os resultados são apresentados como médias de grupos com desvios padrão. Foi realizada análise estatística usando o teste t de Students onde um valor P < 0,05 foi considerado significante.

Resultados:

72h pós infecção

As contagens bacterianas do grupo 1-4 foram significativamente menores (p < 0,05) do que as do grupo 1-3.

As contagens bacterianas do grupo 1-4 foram significativamente menores (p < 0,05) do que as do grupo 1-5.

168h pós infecção

Os números bacterianos em todos os grupos foram aproximadamente 2 logs menores nos 8 dias do que em 3 dias, indicando que a infecção estava se resolvendo.

As contagens bacterianas do grupo 1-2 foram significativamente menores (p < 0,05) do que as do grupo 1-5.

Grupo	Dia 3	Dia 8
	Log CFU/pulmão	Desvio Padrão	Log CFU/pulmão	Desvio Padrão
1-1	6,93	0,61	5,23	1,28
1-2	6,59	1,25	4,08	1,34
1-3	7,09	0,8	5,32	1,26
1-4	6,09	1,43	4,46	2,32

continuação

Grupo	Dia 3	Dia 8
	Log CFU/pulmão	Desvio Padrão	Log CFU/pulmão	Desvio Padrão
1-5	7,19	0,89	5,42	1,05
1-6	6,68	1,14	5,01	1,48

Como demonstrado acima, anticorpo anti-polissacarídeo sozi-

nho (grupo 1-5) não proporciona proteção contra crescimento de pneumococos nos pulmões. PdB com adjuvante de AIPO4 não confere proteção também, mas no dia 8 há uma tendência à proteção quando PdB é combinado com 3D-MPL (grupo 1-2).

No Dia 3, o grupo protegido de modo mais significante, grupo 14, tinha todos os três elementos, PdB, 3D-MPL e anticorpo antipolissacarídeo administrado passivamente. Esta conclusão é suportada pelo índice de mortalidade. O grupo 1-4 tinha somente 2/8 mortes comparado com 5/10 para os grupos 1-5 e 1-3.

Conclusão:

Como o experimento foi feito com animais imunizados de modo passivo, o efeito sinérgico dessa também ativamente imunização com pneumolisina e MPL não pode ser devida a um aumento no nível de anticorpos contra o antígeno de polissacarídeo.

Como os animais foram somente imunizados passivamente contra polissacarídeos de pneumococos, por volta do dia 8 os níveis de semelhante anticorpo teria dissipado em grande parte do hospedeiro.

Mesmo então, significante proteção contra pneumonia por pneumococos podería ser vista em grupos imunizados com pneumolisina mais 3D-MPL e especialmente em grupos imunizados com pneumolisina mais 3D-MPL mais anticorpo anti-polissacarídeo administrado passivamente, indicando a sinergia desta combinação.

Se a imunização com anti-polissacarídeo tiver sido realizada ativamente (preferencialmente com polissacarídeo conjugado), o efeito teria sido ainda mais notável, como o efeito de memória de células B, e níveis

constantes de anticorpo anti-PS teriam contribuído para a cooperação de reação imune (ver por exemplo a Fig. 1C onde foi mostrado que muitos dos animais imunizados ativamente com polissacarídeo e proteína não tinham bactérias nos pulmões após estímulo).

Exemplo 6

Imunogenicidade em camundongos Balb/C de 1 de idade na vacina 11valente de conjugado de polissacarídeo de pneumococos e Proteína D com adjuvante de 3D-MPL.

Introdução e obietivo(s):

Proteção contra infecção por pneumococos é mediada por anticorpo sorotipo específico através de opsonofagocitose. Pode ser presumido que aumentos na concentração de anticorpo resultará em maior proteção, e portanto foi gasto muito esforço para encontrar modos de aumentar a reação humoral. Uma estratégia tem sido aplicada com êxito para conjugar vacinas em estudos pré-clínicos é o uso de adjuvantes imunoestimulantes (revisto em Poolman et al. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. Em: Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann e H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, D).

Os dados apresentados nesta seção mostram os resultados do último experimento usando lotes clínicos em um protocolo projetado para imitar um teste clínico.

Protocolo:

Camundongos balb/c de um ano de idade foram imunizados com 1/10- da dose humana de vacina de conjugado de polissacarídeo de pneumococo e proteína D, ou vacina de polissacarídeo simples 23-valente. As vacinas usadas foram lotes clínicos DSP009, DSP013 ou DSP014 correspondentes à dosagem de 1 mcg de sorotipos 6B e 23F e 5 mcg dos sorotipos restantes da vacina conjugada 11-valente, a dosagem de 0,1 mcg da vacina conjugada 11-valente, ou a dosagem de 0,1 mcg da vacina conjugada 11-valente com adjuvante de 5 mcg de 3D-MPL, respectivamente. Todas as vacinas conjugadas 11-valentes também foram auxiliadas por 50 pg de AIPO₄.

Grupos de 20 camundongos foram imunizados por via intramuscular. Injeções dos grupos listados na seguinte tabela foram realizadas nos dias 0 e 21. As sangrias de teste foram obtidas no dia 35, (14 dias após a segunda dose).

Tabela: Esquema de imunização para camundongos Balb/c de 1 ano de idade imunizados com lotes clínicos de vacina conjugada de polissacarídeo de pneumococos e Proteína D.

Grupo	Dia 0 Vacina Dose 1	Dia 21 Vacina Dose 2	Número de camun- dongos
1	Pneumovax-23 2,5 mcg	Tampão	20
2a	Pn-PD 11-valente 0,1 mcg	Tampão	20
2b	Pn-PD 11-valente 0,1 mcg	Pn-PD 11-valente 0,1 mcg	20
3a	Pn-PD 11-valente + MPL 0,1 mcg + 5 mcg	Tampão	20
3b	Pn-PD 11-valente + MPL 0,1 mcg + 5 mcg	Pn-PD 11-valente + MPL 0,1 mcg + 5 mcg	20
4a	Pn-PD 11-valente 1/0,5 mcg	Tampão	20
4b	Pn-PD 11-valente 1/0,5 mcg	Pn-PD 11-valente 1/0,5 mcg	20
Controle	Tampão	Tampão	20

Os soros foram testados por ELISA para anticorpos IgG para os polissacarídeos de pneumococos seguindo o protocolo de consenso 10 ODC/OMS, isto é, após neutralização do soroo com polissacarídeo da parede celular. O ELISA foi calibrado para dar concentrações de anticorpos em mcg/ml usando anticorpos monoclonais de lgG1 sorotipo específico.

Análises estatísticas de comparações foram calculadas usando UNISTAT versão 5.0 beta. ANOVA pelo método Tukey-HSD foi realizado em

concentrações de IgG concentrações de IgG transformadas por log. A comparação pareada de índices de soroconversão foi realizada usando teste exato de Fisher.

Resultados:

A IgG de GMC e o intervalo de confiança de 95 % contra os 11 sorotipos e proteína D induzido 14 dias após a segunda imunização (dose 2) são apresentados na seguinte tabela. Os índices de soroconversão são apresentados onde um intervalo de confiança de 95 % não pode ser calculado.

O grupo 1 mostra o efeito da imunização com polissacarídeos simples, os quais normalmente induzem somente IgM em animais. A maioria dos níveis de IgG estão abaixo do limite de detecção; não obstante, camundongos balb/c tiveram a capacidade de fazer IgG para uns poucos polissacarídeos de pneumococos, a saber sorotipos 3, 19F e 14.

A imunização com vacinas de conjugados induziram anticorpo

IgG com altos índices de soroconversão contra todos os sorotipos exceto

23F.

Uma reação dependente da dosagem (grupo 4 vs. grupo 2) foi observada somente para os sorotipos 7F e 19F, mas estas observações não

foram estatisticamente significantes. Uma maior reação foi observada após duas doses (grupos b vs. grupos b) para os sorotipos 3, 6B, 7F e 19F, e PD, e estas observações foram estatisticamente significantes em muitos casos com todas as 3 formulações.

É mais interessante o efeito de 3D-MPL. Duas doses da vacina formulada com 3D-MPL (grupo 3b) induziram o maior GMC de IgG específica, e isto foi estatisticamente significante para todos os sorotipos exceto 23F, caso no qual tinha um índice de soroconversão significativamente maior (p = 0,02 grupo 3b vs. 2b, teste exato de Fisher).

4b	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	0,95 (0,19-1,8)	0,11 (0,05 - 0,23)	0,45 (0,20 - 1,02)	6,9 (4,6-10,6)	22,0 (16,0-30,2)	0,10 4/20#	38,7 (21,3-70,3)
05	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	0,22 (0,14-0,35)	0,09 (0,05-0,16)	0,09 (0,06-0,14)	4,0 (2,0 - 8,0)	5,9 (3,5 - 9,9)	0,06 1/18#	10,9 (6,4-18,4)
3b	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	4,84 (3,0 - 7,9)	0,74 (0,29-1,9)	o r- ™ CD ' cT	13,6 (9,4-19,7)	58,5 (42-81)	0,17 9/20#	98,0 (49,1 - 195)
3a	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	0,72 (0,51-1,0)	0,14 (0,07 - 0,27)	0,15 (0,10-0,22)	12,9 (7,8-21,2)	10,1 (5,5-18,5)	0,07 2/10#	13,5 (9,5-19,0)
2b	E q) — O 0 σ> m = O) 0	0,84 (0,47-1,5)	0,19 (0,09-0,41)	0,19 (0,10-0,39)	6,2 (3,6-10,5)	12,1 (7,6-19,3)	0,08 2/19#	11,9 (6,9 - 20,7)
2a	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	0,18 (0,11-0,27)	0,04 8/19	0,07 (0,04-0,12)	4,5 (2,5-8,1)	6,7 (3,6-12,5)	0,08 3/20#	5,2 (3,3 - 8,3)
-	GM [IgG] gg/ml (95% Cl)	0,24 (0,16-0,6)	0,02 0/20#	0,04 0/20#	0,15 3/20#	0,07 (0,56 - 2,6)	0,07 1/20#	0,25 1/2.0#
Grupo	Sorotipo	CO	6B	7F		19F	23F	PD*

9067 • ¹⁰ * Em EU/ml; no. do índice de Soroconversão, definido como 2 desvios padrão acima da média do controle negativo.

Consultar por favor a tabela anterior para definições de grupo. Conclusão:

Os dados apresentados aqui demonstram que o acréscimo de 3D-MPL à vacina de conjugado de polissacarídeo de pneumococos e Proteína D 11-valente aumentou a reação imune em camundongos balb/c idosos para todos os sorotipos testados.

Na maioria dos casos, duas doses de vacina induziram maiores concentrações de IgG médias geométricas do que uma dose. Uma vez que isto não é observado usando vacina de polissacarídeo simples, mesmo em seres humanos, considera-se uma indicação de uma reação imune dependente de células T e a indução de memória imune.

Estes dados suportam um esquema de administração de vacina usando polissacarídeos de pneumococos conjugados com adjuvante de adjuvantes de Th1 (preferencialmente 3D-MPL), por meio da qual no mínimo duas doses da vacina com adjuvante são administradas, preferencialmente com 1-12 semanas de diferença, e mais preferencialmente 3 semanas de diferença. Um esquema de administração semelhante é considerado um aspecto adicional da invenção.

Os camundongos usados no experimento foram não responsivos para PS 23 (simples ou conjugado). Notavelmente, embora os níveis de anticorpos contra o polissacarídeo permanecessem baixos independente da composição de vacina usada, muitos camundongos mais reagiram a PS 2 quando 3D-MPL foi usado como o adjuvante (a soroconversão sendo significativamente maior). Uma aplicação de adjuvantes de Th1, particularmente 3D-MPL, em composições de vacinas compreendendo polissacarídeos de pneumococos conjugados de modo a proporcionar não responsividade a um polissacarídeo de pneumococos em uma vacina é ainda um aspecto adicional da invenção. Um método para proporcionar não responsividade com a composição supracitada usando o esquema de administração de duas doses descrito acima é ainda outro aspecto.

Exemplo 7

Conjugado de polissacarídeo C de Neissería Meningitidis - Proteína D (PSCPD)

A: EXPRESSÃO DE PROTEÍNA D

Como para o Exemplo 1.

B: FABRICAÇÃO DE POLISSACARÍDEO C

A origem de polissacarídeo do grupo C é a cepa C11 de N. meningitidis. Esta é fermentada usando técnicas clássicas de fermentação (EP 72513). Os polissacarídeos em pó seco usados no processo de conjugação 10 são idênticos a Mencevax (SB Biologicals S.A.).

Uma alíquota de cepa C11 é degelada e 0,1 ml de suspensão é riscado sobre uma placa de Petri de meio de Mueller Hinton suplementada com dialisado de extrato de levedura (10 %, em volume) e incubada por 23 a 25 horas a 36 °C em uma incubadora de ar saturado com água.

O desenvolvimento da superfície é então ressuspenso em meio de fermentação esterilizado e inoculado com esta suspensão em um frasco Roux contendo meio de Mueller Hinton suplementado com dialisado de extrato de levedura (10 %, em volume) e contas de vidro esterilizadas. Após

incubação do frasco de Roux durante 23 a 25 horas a 36 °C em uma incubadora de ar saturado com água, o desenvolvimento da superfície é ressuspenso em 10 ml de meio de fermentação esterilizado e 0,2 a 0,3 ml desta suspensão são inoculados sobre 12 outros frascos de Roux com meio de

Mueller Hinton.

Após incubação durante 23 a 25 horas a 36 °C em uma incuba25 dora de ar saturado com água, o desenvolvimento da superfície é ressuspenso em 10 ml de meio de fermentação esterilizado. A suspensão bacteriana é reunida em um frasco cônico.

Esta suspensão é então transferida asseticamente para dentro do fermentado usando seringas esterilizadas.

A fermentação de meningococos é realizada nos fermentadores contidos em um ambiente limpo sob pressão negativa. A fermentação é geralmente completada após 10-12 horas correspondendo a aproximada69

mente 1O¹⁰ bactérias/ml (isto é, a fase estacionária inicial) e detectada por aumento de pH.

Nesta etapa, todo o caldo é inativado por calor (12 min a 56 °C) antes da centrifugação. Antes e após a inativação, é colhida uma amostra 5 do caldo e riscada sobre placas de Petri com meio de Mueller Hinton.

C: PURIFICAÇÃO DE PS

O processo de purificação é um procedimento multi-etapas realizado em todo o caldo de fermentação. Na primeira etapa de purificação, a cultura inativada é clarificada por centrifugação e a suspensão é recupera10 da.

A purificação de polissacarídeos se baseia na precipitação com um sal de amônio quaternário (Brometo de Cetiltrimetilamônio/CTAB, CETAVLON R). CTAB forma complexos insolúveis com poliânions tais como polissacarídeos, ácido nucléico e proteínas dependendo de seu pl. Seguin15 do condições iônicas controladas, este método pode ser usado para precipitar impurezas (baixa condutividade) ou polissacarídeos (alta condutividade).

Os polissacarídeos incluídos na suspensão clarificada são precipitados usando uma terra diatomácea (CELITE^R 545) como matriz para

evitar a formação de massa inerte insolúvel durante as diferentes precipitações/purificações.

Esquema de purificação para polissacarídeo C de K meninqitidis:

Etapa 1: Fixação do complexo PSC-CTAB em CELITE^R 545 e remoção de fragmentos celulares, ácidos nucleicos e proteínas por meio de lavagem com CTAB a 0,05 %.

Etapa 2: Elutriação de PS com EtOH a 50 %. As primeiras frações as quais são turvas e contêm impurezas e LPS são descartadas. A presença de PS nas frações seguintes é verificada por meio do teste de floculação.

Etapa 3: Refixação do complexo PS-CTAB em CELITE R 545 e remoção de ácidos nucleicos menores e proteínas por meio de lavagem com CTAB a 0,05 %.

l··

Etapa 4: Elutriação de PS com EtOH a 50 %. As primeiras frações turvas são descartadas. A presença de PS nas frações seguintes é verificada pelo teste de floculação.

O elutriado é filtrado e o filtrado contendo polissacarídeo bruto coletado. O polissacarídeo é precipitado do filtrado adicionando etanol a uma concentração final de 80 %. Em seguida o polissacarídeo é recuperado como um pó branco, seco a vácuo e armazenado a -20 °C.

D: CONJUGAÇÃO DE CDAP

Conjugação de PSC e PD

Para conjugação de PSC e PD, a tecnologia de conjugação de

CDAP foi preferencial à clássica ativação de CNBr e ligação através de um espacejador para a proteína de veículo. O polissacarídeo é primeiro ativado por meio de cianilação com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP). CDAP é um reagente cianilante hidrossolúvel no qual a eletrofilia do grupo ciano é aumentada sobre a de CNBr, permitindo que seja realizada a reação de cianilação sob condições relativamente brandas. Após ativação, o polissacarídeo pode ser ligado diretamente à proteína de veículo através de seus grupos amino sem introduzir qualquer molécula espacejadora. Os grupos estercianato não reagidos são extintos por meio de 20 extensa reação com glicina. O número total de etapas envolvidas na preparação de vacinas de conjugados é reduzido e mais notavelmente não estão presentes no produto final moléculas espacejadoras notável e potencialmente imunogênicas.

A ativação de polissacarídeos com CDAP introduz um grupo cianato nos polissacarídeos e dimetilaminopiridina (DMAP) é liberada. O grupo cianato reage com grupos NH2 na proteína durante o procedimento de ligação subseqüente e é convertido em um carbamato.

Ativação de PSC e ligação PSC-PD

A ativação e a ligação são realizadas a +25°C.

120 mg de PS é dissolvido por no mínimo 4 h em WFI.

Solução de CDAP (100 mg/ml preparada recentemente em acetonitrila) é adicionada para atingir uma proporção de CDAP/PS (em

1)!

71.

peso) de 0,75.

Após 1 min 30, o pH é aumentado para pH de ativação (pH 10) por meio de adição da trietilamina e é estabilizado até adição de PD.

Em tempo 3 min 30, NaCI é adicionado para uma concentração 5 final de 2 M.

Em tempo 4 min, PD purificado é adicionado para obter uma proporção de PD/PS de 1,5 /1; o pH é ajustado imediatamente para pH de ligação (pH 10). A solução é deixada por 1 hora sob regulação de pH. Resfriamento rápido

6 ml de uma solução a 2 M de glicina são adicionados à mistura de PS/PD/CDAP. O pH é ajustado para o pH de resfriamento rápido (pH 8,8). A solução é agitada por 30 min na temperatura da elaboração, em seguida de um dia para o outro a +2 - 8 °C com agitação lenta contínua. Purificação de PS-PD

Após filtragem (5 μιτι), o conjugado de PS-PD e purificado em um ambiente frio por meio de cromatografia de permeação por gel sobre um gel S400HR Sephacryl para remover moléculas pequenas (inclusive DMAP) e PD não conjugado: Elutriação - NaCI a 150 mM pH 6,5; Monitoração -UV 280 nm, pH e condutividade.

Com base nos diferentes tamanhos moleculares dos componentes da reação, os conjugados de PS-PD são elutriados primeiro seguido por PD livre e finalmente DMAP. Frações contendo conjugado detectado por

DMAB (PS) e μ BC A (proteína) são reunidas. As frações reunidas são filtradas estéreis (0,2 μιτι)

E: FORMULAÇÃO DE VACINA DE CONJUGADO ADSORVIDQ A PSC-PD

Lavagem de AIPO₄

De modo a otimizar a adsorção de conjugado de PSC-PD sobre AIPO₄, o AIPO₄ é lavado para reduzir a concentração de PO₄ ³':

- AIPO4 é lavado com NaCI a 150 mM e centrifugado (4x);

- o grão é em seguida ressuspenso em NaCI a 150 mM e em seguida filtrado (100 μιτι); e

- o filtrado é esterilizado termicamente.

Este AIPO4 lavado é referido como WAP (fôsfato’ aütocfavado lavado)

Processo de formulação

A massa de conjugado de PSC-PD é adsorvida sobre WAP de

AIPO4 antes da formulação final do produto acabado. WAP de AIPO₄ foi agitado com PSC-PD por 5 minutos à temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 5,1, e a mistura foi agitada por um adicional de 18 horas à temperatura ambiente. Foi adicionada solução de NaCI a 150 mM, e a mistura foi agitada por 5 minutos à temperatura ambiente. 2-fenoxietanol foi adicionado a 5 mg/mL e a mistura foi agitada por 15 minutos à temperatura ambiente, em seguida ajustada para pH 6,1.

Composição/dose final

- PSC-PD:

- WAP de AIPO4:

-NaC1:

- 2-fenoxietanol:

- Água para Injeção:

-pH:

F: INFORMAÇÃO PRÉ-CLÍNICA μg de PS 0,25 mg de Al³⁺ 150 mM

2,5 mg para 0,5 ml

6,1

Imunogenicidade de conjugado de polissacarídeos em camundongos

A imunogenicidade do conjugado de PSC-PD foi avaliada em camundongos Balb/C de 6 a 8 semanas de idade. O conjugado simples (não adsorvido) ou o conjugado adsorvido sobre AIPO4 foi injetado como uma vacina monovalente. Anticorpos anti-PSC induzidos foram medidos por ELI25 SA enquanto anticorpos funcionais foram analisados usando o teste bactericida, ambos os métodos sendo baseados nos protocolos dos CDC (Centros para Controle e Pregenção de Doenças, Atlanta, EUA). São apresentados os resultados de dois diferentes experimentos realizados para avaliar a reação versus a dose e efeito do adjuvante (AIPO₄).

Experimento de faixa de dose

Neste experimento, o PSC-PD foi injetado duas vezes (com duas semanas de separação) em camundongos Balb/C. Foram usadas quatro

doses diferentes de conjugado formulado sobre AIPO4: Ô,1; CT,5;*2,5’;’e ^,6’* pg/animal. Os camundongos (10/grupo) foram sangrados nos dias 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) e 42 (28 Pós II). As concentrações médias geométricas (GMCs) de anticorpos específicos de polissacarídeo C medidas por

ELISA foram expressas em pg de IgG/ml usando IgG purificado como referência. Anticorpos bactericidas foram medidos em soros reunidos e os títulos expressos como o recíproco da diluição capaz de matar 50 % das bactérias, usando a cepa C11 de N. meningitidis na presença de complemento de coelho recém-nascido.

A dose-resposta obtida apresenta um platô a partir da dose de

2,5 μg. Os resultados indicam que há uma boa reação de reforço entre 14 Post I e 14 Post II. Os níveis de anticorpos em 28 Post II são no mínimo equivalentes aos em 14 Post II. Os títulos de anticorpos bactericidas estão de acordo com as concentrações de ELISA e confirmam a imunogenicidade do conjugado de PSC-PD.

Efeito do adjuvante

Neste experimento, foi avaliado um lote de conjugado de PSCPD formulado sobre AIPO4, o conjugado simples (sem adjuvante) foi injeta-

do para comparação. 10 camundongos/grupo foram injetados duas vezes,

com duas semanas de separação, por via subcutânea, com 2 pg de conjugado. Os camundongos foram sangrados nos dias 14 (14 Post I), 28 (14

Post II) e 42 (28 Post II), e medidos ELISA e títulos de anticorpos funcionais (somente em 14 Post II e 28 Post II para o teste bactericida). A formulação de AIPO4 induz títulos de anticorpos até 10 vezes maior comparados às 25 formulações sem adjuvante.

Conclusões

Podem ser tiradas as seguintes conclusões gerais a partir dos resultados dos experimentos descritos acima:

- conjugado de PSC-PD induz uma reação de memória imunoló30 gica demonstrando que PSC, quando conjugado, se torna um antígeno dependente de células T.

- As concentrações de anticorpos anti-PSC medidas por ELISA • ¹⁰ • - ·:· , .·· » f · ··· . : : · : se correlacionam bem com os títulos de anticorpos bactêricidãs ttioStrahdo que os anticorpos induzidos pelo conjugado de PSC-PD são funcionais contra N. meningitidis sorogrupo C.

- Cerca de 2,5 gg de conjugado adsorvido sobre AIPO4 parece provocar uma reação ótima de anticorpos em camundongos.

- A química de CDAP parece ser um método adequado para preparar conjugados de PSC-PD imunogênicos.

Exemplo 8

Preparação de um Conjugado de Polissacarídeo de N. meningitidis Sorogrupo A - PD

Um pó seco de polissacarídeo A (PSA) é dissolvido por uma hora em solução de NaCI a 0,2 M para uma concentração final de 8 mg/ml. Em seguida o pH é fixado para um valor de 6 ou com HCI ou NaOH e a solução é termoregulada a 25 °C. 0,75 mg de CDAP/mg de PSA (uma preparação a 100 mg/ml de acetonitrila) é adicionado à solução de PSA. Após 1,5 minutos sem regulação do pH, NaOH a 0,2 M é adicionado para obter um pH de 10. 2,5 minutos depois, proteína D (concentrada a 5 mg/ml) é adicionada de acordo com uma proporção de PD/PSA de aproximadamente 1. Um pH de 10 é mantido durante o período de 1 hora da reação de ligação. Em seguida, é adicionado 10 mg de glicina (2 M, pH 9,0)/mg de PSA e o pH é regulado a um valor de 9,0 por 30 minutos a 25 °C. Em seguida a mistura é conservada de um dia para o outro a 4 °C antes de purificação por cromatografia de coluna de exclusão (Sephacryl S400HR da Pharmacia). O conjugado elutria primeiro seguido por PD não reagido e subprodutos (DMAP, glicina, sais). O conjugado é recolhido e esterilizado por meio de uma filtragem de 0,2 gm sobre uma membrana Sartopore da Sartorius.

Exemplo 9 caracterização in vitro dos produtos dos Exemplos 7 e 8

As principais características estão resumidas na tabela abaixo:

NQ	Descrição do conjugado	Teor de proteína e PS (pg/ml)	Proporção de PS/proteína (P/P)	• · · ♦ ProteVna” Livre (%)	’pè’Livfe (%)
1	PS C - PD NaOH para regular 0 pH	PD : 210 PS : 308	1/0,68	<2	8-9
2	PS C - PD TEA para regular 0 pH	PD : 230 PS : 351	1/0,65	<2	5-6
3	PS A - PD NaOH para regular 0 pH	PD : 159 PS:149	1/1,07	5	5-9

Resultados in vivo

Camundongos Balb/C foram usados como modelo animal para testar a imunogenicidade dos conjugados. Os conjugados foram absorvidos ou sobre AIPO₄ ou AI(OH)₃ (10 pg de PS sobre 500 pg de Al³⁺) ou não absorvidos. Os camundongos foram injetados como se segue: 2 injeções em intervalos de duas semanas (2 pg de PS/injeção).

A partir destes resultados, pode-se concluir primeiro que PS livre influencia grandemente a reação imune. Foram obtidos melhores resultados como conjugados tendo menos de 10 % de PS livre. O aperfeiçoamento acima do processo de CDAP é portanto um aspecto adicional da invenção.

A formulação também é importante. AIPO₄ parece ser o adjuvante mais adequado neste modelo. Os conjugados induzem um efeito de reforço o qual não é observado quando os polissacarídeos são injetados sozinhos.

Conclusões

Conjugados de N. meningitidis A e C foram obtidos com uma proporção final de PS/proteína de 1 e 0,6 - 0,7 (em peso) respectivamente. 20 PS livre e proteína de veículo livre estavam abaixo de 10 % e 15 % respectivamente. A recuperação de polissacarídeos é maior do que 70 %. Portanto conjugados de PSA e PSC obteníveis por meio do processo•ápêrféfçdayd (otimizado) de CDAP acima (indiferente da proteína de veículo, mas preferencialmente proteína D) é um aspecto adicional da invenção.

Exemplo 10

Preparação de um Conjugado de Polissacarídeo de H. influenzae b - PD

H. influenzae b é uma das causas principais de meningites em infantes abaixo de 2 anos de idade. O polissacarídeo capsular de H. influenzae (PRP) como um conjugado sobre toxóide tetânico é de conhecimento geral (conjugado por química desenvolvida por J. Robbins). CDAP é uma química aperfeiçoada. O seguinte é descrição de condições ótimas de CDAP encontradas para conjugar PRP, preferencialmente para PD.

Os parâmetros que influenciam a reação de conjugação são os seguintes:

• A concentração inicial de polissacarídeos (a qual pode ter um duplo impacto sobre os níveis finais de polissacarídeos livres e sobre a etapa de filtragem estéril).

• A concentração inicial da proteína de veículo.

• A proporção inicial de polissacarídeo para proteína (a qual também pode ter o duplo impacto sobre os níveis finais de polissacarídeos li-

vres e sobre a etapa de filtragem estéril).

• A quantidade de CDAP usado (geralmente em grande excesso).

• A temperatura da reação (a qual pode influenciar a decomposição do polissacarídeo, a cinética da reação, e a decomposição dos grupamentos reativos).

· O pH de ativação e ligação.

• O pH de resfriamento rápido (influenciando o nível de DMAP residual).

• O tempo de ativação, ligação e resfriamento rápido.

Os inventores presentes descobriram que os 3 parâmetros mais cruciais para otimizar a qualidade do produto final são: a proporção inicial de polissacarídeo/proteína; a concentração inicial de polissacarídeo; e o pH de ligação.

Uma cuba de reação foi portanto projetada cctm ãtí3*oôrtdrçõe’s acima como os três eixos. Os pontos centrais (e faixa de valor experimentado) para estes eixos foram: proporção de PS/proteína - 1/1 (± 0,3 /1); [PS] = 5 mg/ml (± 2 mg/ml); e pH de ligação = 8,0 (± 1,0 unidade de pH).

Os parâmetros menos essenciais foram fixados nos seguintes:

foram usados 30 mg de polissacarídeos; temperatura de 25 °C; [CDAP] = 0,75 mg/mg de PS; pH titulado com NaOH a 0,2 M; pH de ativação = 9,5; temperatura para ativação = 1,5 minutos; temperatura de ligação - 1 hora; [proteína] = 10 mg/ml; pH de resfriamento rápido = 9,0; temperatura de res10 friamento rápido = 1 hora; temperatura de PS dissolvendo em solvente = 1 hora em NaCI a 2 M; purificação sobre Sephacryl S-400HR elutriado com NaCI a 150 mM a 12 cm/hora; e filtrar esterilizando com um SARTOLAB P20 a 5 ml/min.

Os dados observados para determinar condições otimizadas ao preparar produtos dentro da cuba de reação supracitada foram: dados do processo- rendimento máximo após filtragem, nível máximo de proteína incorporada; e qualidade dos dados do produto - proporção final PS/proteína, nível de PS livre, nível de proteína livre, níveis mínimos de DMAP residual (um produto da decomposição de CDAP).

Produção da filtragem

O fator que afeta a produção após filtragem é a interação entre o [PS] inicial e o pH de ligação e a proporção inicial PS/proteína. Em baixo [PS] há pouca interação com os últimos 2 fatores, e sempre resulta boa filtrabilidade (aproximadamente 95 % para todos os produtos). No entanto, em altas concentrações a filtrabilidade diminui se o pH e a proporção inicial aumentar (alto [PS], menor proporção, menor pH = 99 % filtragem; mas alto [PS], maior proporção e pH = 19 % filtragem).

Nível de incorporação da proteína

A proporção da proporção final de PS/proteína com respeito à proporção inicial é uma medida da eficácia de ligação. Em alto [PS], o pH não afeta a proporção de proporções. No entanto a proporção inicial sim (1,75 em baixa proporção inicial, 1,26 em alta proporção inicial). Em baixo • ¹⁰

[PS], a proporção de proporções é para a maior parte mâno^.nó.eníantb.o ’? pH agora tem mais de um efeito (baixo pH, baixa proporção = 0,96; baixo pH, alta proporção = 0,8; alto pH, baixa proporção = 1,4; e alto pH, alta proporção = 0,92).

Proporção final PS/proteína

A proporção final depende da proporção inicial e do [PS]. As maiores proporções finais são obtidas com uma combinação de altas proporções iniciais e alto [PS]. O efeito do pH sobre a proporção final não é tão significante quanto um fraco [PS].

Nível de proteína D livre

A menor quantidade de proteína D livre é observada com alto pH e alto [PS] (níveis próximos de 0,0). O efeito de alto [PS] se torna especialmente notável quando o pH é baixo. O aumento da proporção inicial contribui um pouquinho para o aumento da proteína D livre.

DMAP residual

A proporção inicial não tem um efeito significante. Em contraste, o nível de DMAP aumenta com o [PS], e diminui quando o pH é aumentado. Conclusões

As condições de conjugação mais preferenciais são portanto as

seguintes: pH de ligação = 9,0; [PS] = 3 mg/ml; e proporção inicial = 1/1. Com semelhantes condições as características do produto final são como se segue:

Proporção final PS/proteína	Rendimento de PS da filtragem (%)	Proporção de proporções	Proteína D livre (%)	Níveis de DMAP (ng/10 gg PS)
valor	faixa	valor	faixa	valor	faixa	valor	faixa	valor	faixa
1,10	0,91- 1,30	92,6	50- 138	1,16	1,03- 1,29	0,71	Ο- Ι 0,40	4,95	2,60- 7,80

Conjugados de PRP obteníveis pelo processo aperfeiçoado acima (otimizado) de CDAP (independente da proteína de veículo, mas 25 preferencialmente proteína D) é portanto um aspecto adicional da invenção.

Exemplo 11

Proteína D como um antígeno - como sua eficácia protetora contra H. influ enzae não classificado pode ser melhorada formulando-o com 3D-MPL

Camundongos fêmeas Balb/c (10 por grupo) foram imunizados (por via intramuscular) com a vacina de conjugado de proteína D - polissacarídeo de pneumococos undecavalente por uma primeira vez na idade de 20 semanas (DO) e receberam uma segunda imunização duas semanas depois (D14). O sangue foi colhido 7 dias depois da segunda imunização. Os títulos de anticorpos contra proteína D foram medidos em termos da quantidade de anticorpos tipo lgG1, lgG2a e lgG2b.

Vacinas undecavalentes secas por congelamento (sem AIPO₄) foram preparadas combinando os conjugados com 15,75 % de lactose, agitando por 15 minutos à temperatura ambiente, ajustando o pH a 6,1 + 0,1, e liofilizando (o ciclo geralmente iniciando em -69 °C, gradualmente ajustando a -24 °C durante 3 horas, em seguida mantendo esta temperatura por 18 horas, em seguida gradualmente ajustando para -16 °C durante 1 hora, em seguida mantendo esta temperatura por 6 horas, em seguida gradualmente ajustando para + 34 °C por 3 horas, e finalmente mantendo esta temperatura por 9 horas).

Composição de formulações e reconstituintes para liofilizados são apresentados na Tabela 13.

Sabe-se que a medida mais característica quando se ocorre uma resposta imune mediada por células tipo Th1 está correlacionada com o nível de anticorpo lgG2a. Como pode ser visto a partir dos dados, resulta um aumento inesperadamente grande de lgG2a se a proteína D tiver sido liofilizada com um adjuvante de Th1 (neste caso 3D-MPL).

Φ <0 o TJ

E o o

(Λ O CD C O Ό c 3 E co o E φ Q co c 'φ

O kQ.

CO ϊ_ -4—· c o o

Φ o

Q.

k_

O Q ’-4c CO

Φ T5

CD _O

Σ5 co _ç0 Φ

CÜ

CO c CO E

C

Φ cd o Ό

O ^Q.

V) Φ <O

O _CB

E k_ o φ T5

O 1C0 ç> ’ω

O

Q.

E o O

lgG2b	<>	0,313	0,265	0,526	0,795	0,853	1,477	09Ι-Ό	0,620
CO CM 0 _cp	0,554	CM M θ'	3,02	3,12	CO rcm-	0,967	3,96	o θ'
0 _σ>	99,1	99,3	96,4	96,1	96,4	97,6	95,9	99,0
lgG2b	gg/ml	0,24	0,176	0,036	0,043	0,046	0,168	0,075	0,119
CO CM 0 _cp	0,425	0,284	0,207	0,169	0,147	Τ- ο	CO CO T~	0,077
0 _CD	76	99	6,6	5,2	5,2	11,1	45	σ> τ—
Reconstituinte	não	não	não	não	ce õ CB O Z LO	õ £ CB o z: «o	o o 10 CM d § CL <	ο ο CM ο § CL <
Conservante	CO LU Οι CM	2-PE	2-PE	2-PE	não	não	não	não
Agente de coque	não	não	não	não	lactose a 3,15%	lactose a 3,15%	lactose a 3,15%	lactose a 3,15%
Imunoestimulante	não	não	não	não	não	não	não	não
—í 2 8 < iO	σ> zl O O LO	CD =L O O LO	CD =1 o	CD =1 o	CD =L O	CD =1 o	CD =1 o	CD zl O
O CO O O CL LO =L	O) =1	CD =L LO	D) =1 T—	CD =1 LO	CD =1	CD LO	CD v—	CD LO
Estado físico	líquido	líquido	líquido	líquido	seco por congelamento	seco por congelamento	seco por congelamento	seco por congelamento

continuação

JD CM 0 _O)		6,849	3,089	8,062	1,990	0,298
05 CM 0 _O)	5,09	Ί~ LO	cõ	S9‘J-	0,465
0 _D)	T~ CO 00	81,8	60,8 I	96,5	99,2
lgG2b	Ê ~O) =L	3,5	IO	5,7 I	σί	668‘0
lgG2a	<D cm	25	22		Ί“—
0 _o)	45	135	43	441	299
Reconstituinte	—1 CD CL =L S ° LO	—1 CD CL zt IO	o 105 Q. E 05 »	não	não
Conservante	não L	não	não	2-PE	2-PE i
Agente de coque	lactose a 3,15%	lactose a 3,15%	lactose a 3,15%	não i	não
Imunoestimulante	I não	não	CL =· s o !£	_l §5 CL =- í£.	CL =*· °
o 9= 8 < iO	CD =5. O	O) =L O	CD d. O	O) zi o o m	D) =L O O IO
O CO O rr CL LO zL	D)	CD zL LO	CD =L	CD =L	D) =L ID
Estado físico	seco por congelamento	seco por congelamento	seco por congelamento	líquido	líquido

Claims (9)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de antígenos de polissacarídeos conjugados que consistem em um antígeno de polissacarídeo derivado de uma bactéria patogênica conjugado à proteína D não lipidada de Haemophilus influenzae compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e em que os antígenos de polissacarídeos são selecionados do grupo consistindo em polissacarídeos meningocóccicos, polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae, e polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae b.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende antígenos de polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae de no mínimo quatro sorotipos de Streptococcus pneumoniae.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os antígenos de polissacarídeos conjugados à proteína D são derivados de uma combinação dos sorotipos A, C ou Y de N. meningitidis.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeos capsulares conjugados de Haemophilus influenzae b, meningococos C e meningococos Y, em que os antígenos de polissacarídeos capsulares são conjugados à proteína D de H. influenzae, com a condição de que o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae b é conjugado à toxóide tetânico.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeos capsulares conjugados de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b, meningococos C e meningococos Y, em que os antígenos de polissacarídeos capsulares são conjugados à proteína D de H. influenzae, com a condição de que o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae b é conjugado à toxóide tetânico.

6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um adjuvante.

7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os antígenos conjugados de proteína D - po-

5 lissacarídeo são adsorvidos sobre fosfato de alumínio.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um indutor preferencial de uma resposta TH1.

9. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a compo10 sição imunogênica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

5.