Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

HU228499B1 - Streptococcus vaccine - Google Patents

Streptococcus vaccine Download PDF

Info

Publication number
HU228499B1
HU228499B1 HU0200373A HUP0200373A HU228499B1 HU 228499 B1 HU228499 B1 HU 228499B1 HU 0200373 A HU0200373 A HU 0200373A HU P0200373 A HUP0200373 A HU P0200373A HU 228499 B1 HU228499 B1 HU 228499B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
polysaccharide
vaccine
mpl
adjuvant
Prior art date
Application number
HU0200373A
Other languages
English (en)
Inventor
Carine Capiau
Marguerite Deschamps
Pierre Michel Desmons
Craig Antony Joseph Ferriere
Jan Poolman
Jean-Paul Prieels
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906437.0A external-priority patent/GB9906437D0/en
Priority claimed from GBGB9909077.1A external-priority patent/GB9909077D0/en
Priority claimed from GBGB9909466.6A external-priority patent/GB9909466D0/en
Priority claimed from GBGB9916677.9A external-priority patent/GB9916677D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of HUP0200373A2 publication Critical patent/HUP0200373A2/hu
Publication of HU228499B1 publication Critical patent/HU228499B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Sztrepfokokknsz oltóanyag
A találmány tárgyát bakteriális poliszscbarid-aaiigéu: oltóanyagok, azok gyártása· és az ilyen poliszacharidok gyógyhatású anyagokba» történő alkalmazása képezik.
Közelebbről a találmány tárgyát három összefüggő megvalósítási mód képezi: 1. -- konjugált paeumofcökknsz-amígánt, tipikusan pneumokokkusz konjugált pollszacharlá-antlgéa tartalmazó oltóanyagok, Stótptóiweux pmswmonKte föhétjeantigeunel és opcionálisa» fh l-isdakáló adjuvánssal kiszerelve; 2. ··· specifikus, előnyös pnernnokckkusz koajugánsmok Thl-adjovánssal kiszerelve; és 3> - bakteriális poliszacharíd konjugúrtmtok általában f£ fo/lgeRsae D proteinjéhez konjiugálva.
A .So^íöcecoe? pneíiíííontóe Gram-pezitív baktérium, amely jelentős morbiditásért és mortalitásért (különösen fiatalokban és Idősekben) felelős, és olyan invazív betegségeket okoz, mint például a tüdőgyulladás, baktetótnta és agyhártyagyulladás, ás kolonlzáciőval kapesofetos betegségeket, mint például az akut középfülgyulladás. Á pneumokokkusz-eredeté tüdőgyulladás aránya az Amerikai Egyesült Államokban a őö évnél idősebb személyek között körülbelül 3 és 3 között van 1Ö0ÖÖÖ emberre számítva. Az esetek 20%-ában ez bakterámiához és más mamfesztácíókboz, mim például agyhártyagynllralás vezet, közei 3Ö%-os mortalitási aránnyal -még antibiotikumos kezelés mellett is,
Á pneumokkokkusat kémiailag kapcsolt poliszacbarid burkolja be, amely szerodpus-specifitást eredményez, 90 tsmert pnenmokokkiisz szerotípus van, és a borok a pseumokokktjszok virufeuciájílrusk alapvető meghatározó faktora, mivel a burok nemcsak védi a baktérium belső felszíneit a kompfement-rendszertői, hanem önmagában véve gyenge nxumwogéa &; A poliszacharidak T- sejtektől független antigének, és nem: processzálhatok és nem dolgozhatók fel MHC-molektilákon T-scitekkel való kőlcténhatáshoz. Azonban alternatív mechanizmuson keresztül stimulálhatják az immunrendszert, ami a .8-seííek felszí® receptórsinak kemsztkőtésével történik.
Számos kísérlet megmutatta, hogy az invazív pseumckokkuszos betegségek elleni védelem legjobban a burokra· specifikus ellenanyagok mennyiségével korrelál, és a védelem szeíohpos-speedjkus.
Follszaeharíd-antigénen alapuló oltóanyagok jól ismertek a szakirodalomban. A négy emberi alkalmazásra is. engedélyezett köze tartozik a Őbősottelfe rtpAt Vi-pobszaefearidja, a .f&mppMtc? úrtfyensse PRFpoliszsebaridja, sz A, ·€, W1.35 és Y szerotípnsekat tartalmazó teteavtéens-menmgekokkusz oltóanyag, és a 23vsless· pneumokekkusz oltóanyag, amely az 1, 2, 3,4, 5, 68, 7f, .8, 9N, 9V, IÖA. IIA, 12F, 14, : 58, 17F, íBC, 19A, 19F, 2ö, 22F, 23F és 33 szerotipusokoek megfelelő poliszachurtdból áll (amelyek a várból izolált pruíutnokokkoszökn&k legalább 90%-át teszik ki).
Az utóbbi három oltóanyag légúti fertőzéseket okoző baktériumok ellen nyújt védettséget, amelyek komoly morbiditást és mortalitást eredményeznek cseesetnökbets, viszont ezen oltóanyagokat nem engedélyezték 2 évűéi fiatalabb gyermekek esetén történő alkalmazásra, mivel nem· kellően imrmmogének ebben a korosztályban pfeltoks és mtsai., N. bogi, X Med. 3 2.0, 1561 -156ő, old, (19S4)j. A öírepíococata pHeumostűe az invazív bakteriális betegségek ás középfülgyulladás, leggyakoribb oka csecsemők és kisgyermekek körében. Az Idősek hasonlóképpen gyenge választ fejlesztenek ki pneutnűkokku-í^í^téanysígcáaa {Roghmann és mtsai., 1 -Geronteí. 42, 265-270. old. (19S7)}, irmen van a bakteriális, tüdőgyulladás megaővekedett előfordulása ebben a populációban (Verghese és Beik, Medicina (Baitmmre) 62, 271-285, old. (19S3)j.
Akíaszámunk: 95229-3072A/Í..T *5 »» 4 ♦ ♦ X » * ~ ·Χ ~
A csecsemőkben való immnaogenitás hiányának .leküzdésére tervezett stratégiák közé tartozik a poliszscbariddkndc nagy imHiuaegáa fehérjékhez való· kapcsolása, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak, és amelyek immurmlőgbd memóriái váltanak ki azokkal a poliszachariá-mitigteekkel szemben, amelyekhez, konjögáiva vannak. Pnemnokokkusz konjugált glikoprotein oltóanyagokat jelenleg is tesztelnek biztonság, nanmnogentós és hatékonyság szeniponíisból különböző korosztályokban.
Az alábbiak az 1,, pneumokokkusz pobazacharid-oliőasyagokai tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A 23-vaíeos konjngáíatte pnemKokokk-isz-oltöanyag széleskörű variációt mutat a klinikai hatékonyság területén, 0%-íól Sl%-ig [Fedsoa és mtsai., Arch. Intem. Med. 154, 2531-2535. old. {1994}], A hatékonyság sz iimmmizák kockázati csoporttal ~ mint például idősek, Hödgkm-íete betegség, lépelfávclitás·, sarlósejtes betegség, és agatnmagiobubnőmiák. jFine és mtsai., Arcb. istent. Med. 154, 2660-2077,, old. (1994)] - látszik, összefüggni, és a betegség mtefosztációjávaí is, A 23-vates· oltóanyag nem mutat védettséget pueumokokkuszeredetű tüdőgyulladás (bizonyos magas kockázatú csoportokban, mint például az idősek) és középfülgyulladás elten.
Tétót szükség van javítod ptteumsácokkusz-oltóaayagtkészteényekre, előnyösen olyanokra, melyek hatásosabbak a pnemokokknsz-betegségek (különösen, tüdőgyulladás} megelőzésére és enyhítésére az idősek és kisgyermekek körében.
Az alábbiak a 2., kiválasztott pneumokokkusz poliszaebarid-koujagátumolmt és 3D-M.Pl. készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
Általánosan elfogadott, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható pneumokokkusz-oltőanyag védötsatékoaysága többé-kevesbé az immunizálással kiváltott elleaanyag-koneen.tráeiőval függ össze; valóban, a 23 pohszaeharidof kizárólag az egyes komponens. peíiszacharidok itamunogenitása alapján, engedélyezték [Williams és mtsai., New York Academyof Sciences, 241-249. old. (1995)], Tehát a pneumokokkusz-poliszacharídok elleni eilenanvagvátesz további fokozása növelheti azon csecsemők és idősek százalékát, akik védő szintű ellenanyaggal reagálnak a poljszacharid vagy pchszactórid-ktmjágátmn -első oltására, és csökkentheti a dózist és a óNvpröoweeys /wumonűm által okozott fertőzések eltel védő immunitás kiváltásához szükséges oltások számát.
A 2ő. század kezdete óta a kutatók nagyszámú vegyüiettei kísérleteztek, amelyek antigéaekb-ez adva javítják azok immanegemtását olíéanyag~készíta!.éayekb<nj [összöfőglalás; Powell és Newman·, „Vaccine Design the Sobtmit and Adjúvant Approaoif 7, fejezet, „A compendium of Vaccine Adjavants ásd Exciptets” kiad,: Pteaum Press NY (1995)], Sok nagyon hatásos,, de szignifikáns helyi, és szisztémás káros reakciót okoz, ami kizárja aifastoazásukat emberi olíóaöy&g-készimiéuyekhem z\z alnmíoimn-alnpú aójuvánsok -(mint például alom, alaminímn-hidroxid, almniníuin-foszfái), amelyeket először 192ő~baa írtak lé, maradnak: az Amerikai Egyesült Államokban engedélyeseit emberi oltóanyagban alkalmazóit kizárólagos hnmuncfégi&i adjavássok.
Az afoíöírííoiH-alapú adjutánsok, az adjavássok hordozó öszíáiyánsk példái, amelyek a kiváltod „depóhatás” revén működnek. Az antigén az adjuváas felszínére adszorrieálódtk, és amikor a készítményt, injektálják, az adjovfe es az antigén nem oszlik szét azonnal a véráramban, hanem a készítmény megmarad az nyékem helyi környezetében, és jobban kifejezett isuasav^am eredményez. Az ilyen hordozó adjuváusoknak további ismert előnye, hogy alkalmasak a lebomlásra érzékeny aalígések, páldáal pollszaeharid-antlgének stabilizálására.
A 3D-MPL a JKou-bordozó adjuvánsok példája. Teljes neve 3-O-dezacíl-n.iottofoszteril lipid A (vagy 3-BeO-acil-monoibszforíl Ifeul A, vagy 3~ö-d«zacíl-4fonomzfoszforil lipfe A), és azért nevezik SD-MPL-rtek, meri ez kif^ezi, hogy a 3. hely a redukáló végen lévé glüközaminbsn de-O»aeetilált Az előállítását a CB 2220211. számú .szabadalmi irat tátja M Kémiailag 4-, 5- vagy ö-aeilált lánccal rendelkező 3~deacil~mmmiószforii lipid: A keveréke. Az 1990-es évek elején készítették el, amikost a lipid A dMuretofószferil származékáoák (MPL) 3-üde&cílálásárs szolgáló eljárás elvan molekulát eredményezett, amelynek toxicítása tovább gyengült a az iirsmta· stimuláló aktivitás változása nélkül,
A 3ö-MPL~t magában, vagy előnyösen depó-tipusu hordozó adjuvánsokkai, mint például aluminíumhidroxíddai, alumlrriunt-foszfáhel vagy oksj-viz emulziókkal kombinálva alkalmazták adjuvánském. Áz ilyen készítményekben a 3D-MP1. és az antigén ugyanazon részecskében található, ami lehetővé teszi az antigén és ímmossíimaláns szignálok hatásosabb célba juttatását Vizsgálatok kimutatták, hogy a 3D-MPL. képes tovvább fokozni az aium-adso-orbeált antigétt inunnrtiígenisásái (Tfeoelea és mísai., Varáé 16, 7ÖS-7Í4. old, (1993); BP ők9 454 Bl. számú európai szabadalmi iraij. Az ilyen kombinációk előnyösek a szakirodalomban adszorpcióra. hajlamos (például bakteriális poliszacharié-konjngátmnok} antigének számára is. álról az alomra való adszorpció az antigén stabilizálásának kedvez. Legtöbbször kicsapod alumítimm-álapa adjuváusokat alkalmaznak, mivel jelenleg kizárólag ezek vannak engedélyezve emberi oltóanyagban, Ennek megfelelően a 3D~MPL-t alumínium-alapú adjuvánssal kombinálva tartalmazó oltóanyagok előnyben vannak részesítve a szakirodalomban a kifejlesztésük könnyűsége és a piacra való bevezetésük sebessége miatt.
A nem 3-áea.elláit MPL-t vizsgálták adjuvánsként számos menovalcns poluszaohsrid-konjugámm oltóanyag-anfigéimel. Az MPL sóoldaihan való együttes injekciója fokozta a szérum ellcnanyagválaszát négy monovalens pohxzaebarid-konjugámmra: pnettmokokkssz PS óB-lotanusz-foxoid, pneumokokkusz PS 12áiftérűt-foxoid, és 51 «η» 5. típus és 5'. «w §. típus,mtrag/at.vm A jelű oxotoxíujához feoujagáiva (Schneerson és mtsaí., J. fmmunology 147, 213Ő-2Í40, old. (1991)]. A fokozott válaszról azt gondolták, hogy antigén-specifikus. MPL olaj-víz emulzióban (hordozó típusú adjuváns) következetesen fokozta az MPL sóoldafban lévő Itatását, soriad, hogy az: MPL és az antigén ugyanazon részecskében volt jelen, és ezt más polisztícharid-koniugátum oltóanyagok esetén is optimális beadási rendszerének tartották.
Devi és mtsai. pnlect. Immun. 59 ,3700-3707. old. (1991)] vizsgállak a nem 3-deacetlÍált MPL adjuváns hatását sóoklstban, TT-kottjugák Cnpíococcas neafemans burok-poliszachariddal egér sHenanyagválaszm. Amikor az MPL-t egyidejűleg alkalmazták a konjugáturnsnák csupán csekély növekedés volt a poiisz&eharidra adott IgM- és ígö-speciP.kus válaszban; azonban az MPL-aek sakkal nagyobb hatású volt, amikor 2 nappal a konjugátum után adták be. Az olyun mmru&izálási séma alkaltnazásának a gyakorlatiassága, amely az MPL beadásának késleltetését igényli az antigénhez képest, különösen csecsemők esetében, kérdéses. Az MPL adjuváns hatása poliszacimrídokkal és pöliszacharid-fébéuje konjugátutnokkal készímúrnv-függőnél; tüetik. Az MPL-nek megfelelő, lassú-folszabadulású bejuttató rendszerbe (például hordozó adjuváns alkalmazása) való beépítése tartós adjuváns hatást biztosit, és megkerüli az időzítés és késleltetett beadás problémáját.
-4♦ * * ♦
Összefoglalva, a technika állása ügy tankja, hogy bizonyos poliszacharid vagy polisztoeharíd-kesjugátum antigének, ahol MPL vagy 3D-MFL az adjuváns. előnyösen alkalmazhatók hordozó adjuvánssal (például alumínium .-alapé: sdiuvánsokkal) együtt, annak érdekében, hogy maximalizáljuk az. fonnunstínsniátö hatást.
Meglepő módos azt találtok, hogy bizonyos pneamokokkusz poiiszacharíd-koajagátnmok esetén az oltóanyag-készlirnóny immutíogenkásu szignifikánsan nagyobb, amikor az antigént egyedül 315-MPL-lel szereljük ki, mint 3D-MPI.-tel és hordozó adjuvánssal (nmt példán! alaminhtm-alapá adjavánsokkalj együtt. Továbbá a megfigyeli javulás független az alkalmazót;. 3D-MPL. koncentrációjától, és áltól hogy az adott konjugátem ntoaovaleas készítményben van-e, vagy kombinálva polivalem; készítményt alkotva.
Az alábbiak a 3., bakteriális poliszauhaná-proie’m D koajugátBxnokaí iaríaimaző megvalósítási módra vonatkoznak.
Mist ahogyan fent einlltetsük, poisszaebmd-aníxgér· alapú oltóanyagok jól ismertek a szaktríxlalomban. Az fent említett engeilélyezeit pohszaefeand-oltóanyagok demonstrált klinikai hatékonysága különböző. A VIpoliszachand-oltóanyag becsült hatékonysága 55% és 77% között van tenyészettel igazolt tífusz megelőzésére [Plotkm és Caa), Arc, faters. Med 155, 2293-2299, old, (1995)1. A ntenimgdcokkuezC-pohszacharid-oltóaayag hatékonysága 79%-aak bizonyult járványos körülmények között [De Waís és mtsai.. Bolt, World Health Otgaa. 74,407-4Π. old, (1996)]. A 23-valmrs pnsumokokkusz-oltőanyng széles variációt mutatott klinikai hatékonyság Serén, 054-tól 81.%-ig [Fedson és mista., Arca. intern. Meá. 154, 2531-2535. old. (1994)1. Mint ahogy fent említettük, elfogadott tény, 'nogy a paeumokokknsz-oltósnyag hatékonysága tóbbé-kevésbé az inminnizálássai kiváltott eiknanyag-koocemrációval függ össze.
Az immunizálás polsszacferafos megközelítésével kapcsolatos problémák között van az a tény, hogy a poíiszachsridok önmagukban gyenge Immunogének. Az ianauncgaiitás ezen hiányának leküzdésére tervezett stratégiák közé tartozik a pohamebaridokttak nagy ímmunogén fehóriékhsz való kapcsolása,, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak.
Ezen jelentősen imnmogén, jelenleg általánosan alkalmazott hordozók példái közé tartozik a óiftériafoxoíd (DT vagy .a CB.M197 mutáns), tetajsnsz-toxoid (TT), khrtöscsiga („keyhoie Jimpet”) hemocinttmja (HLH), és a ínberknlio tisztított fefeórjeszármazéka (PPD).
Az. általánosat) alkalmazott htsrdozőkkal kapcsolatos problémák
Az. általánosan- alkalmazott hordozók mindegyikével számos probléma kapcsolatos, köztük a .konjugátunsök GMP előállításában, és a konjugátamok immunológiai jellemzőiben.
Ezen hordozók általánosan elterjedi alkalmazásának es anti-poiíszaeharíd eilenanyag-válaazok kiváltásában való sikerük ellenére számos hátrányuk van. ísmssrt például, hogy az. aníígén-specíFkus immunvátesz szupresszáiható (epitóp-szupcessziő) a hordozó, jelen esetben tetanasz-tnxh; ellen irányuló korábbi ellenanyagok jelenléte állal [Di John és mtsai., Láncét 2, 1415-1418. old, (l9S9)j, Az· emberek esetében a populáció nagyon .magas százalékának vau korábbról jelenlévő- ímmwítása DT és TT ellen, mivel rutinszerűét) immunizálják az embereket ezen antigénekkel, Az Egyesüli Királyságban például a gyermekek 95%-a kap 'DTP-öltóanyagot, amely mind DT-L mind TT-í tartalmaz. Más szerzők állati modellekben Írták le pepfsd-oítóaayagokra az epifep· sxupresszíó probiémí'ljáí. [Sad és misül., ímmunology 74, 223-227. okf (1991); Sehntze és mtsai., 1. Immunoi. 135, 2319-2322. old. (1985)1, »9í*e ** * « « « * * « Φ »♦ ♦· ♦ 4 » « ο ♦ ♦ ·*»
.. 5··..· ♦♦«*. * χ* *
Bzcn&loi az olyan oltóanyagok®^, amelyek rendszeres megerősítést igényelnek, a jelentésen xmmxmegén berdoaók, mint például DT és TT alkalmazása valószínű módos S2x.i|>xesszáha a polxssasharid elleni ellenanyagválaszt nsfeáxsv injekció után. Ezen többszörös immumzásxót uexn kívánatos reakciók is kísérhetik, mi»t példád késleltetett tlpusü hípexéxzékeaység („delayed iype•hypentesponsxveness*’, Dili).
A KLH-ról ismert, hogy hatásos ixsxoöacgéa, és xnár alkalmazták hordozóként ígE-pephdokhez embesi klinikai vizsgálatokban. Azonban néhány káros reakciót (DTO-szerö reakciók, vagy igE-éfzékeuyítés), valamint ellenanyag elleni ellenanyag-reakciókat is megfigyeltek;.
Tehát a hordozófehérjék kiválasztása poliszachariá-alapú oltóanyaghoz nxegkóvetéli a inindea betegbe® működő hordozó (széles MHC-feíissneres) szükségessége, az .aatl-polisméband elieaanyxtg-vMaszok magas szintje, és a hordozó ellenx alacsony eHenanyag-válasz közti egyensúlyt.
A poliszachariá-alapú oltóanyagokban korábban alkalmazott hordozóknak tehát számos hátránya van. Ez különösen így van kombinált oltóanyagok esetében, ahol az ephóp-sznpressziö kütöniegeseo prohlé-Kás, ha ugyanazt a hordozót alkalmazzák különbőzé .poiíszaelmíd-aaugénekbez, A WO 98/51335-. szánni nemzetközi közzétételi irat szerint több hordozót- alkalmaznak kombinált oltóanyagokba» ezen hatás -elkerülésnek megkísérlésére,
A találmány tárgyát pohsztícherjd/potípepdd-íiispú m»mmogéxt készítmények előállítására alkabnazott hordozó képezi, amely nem szenved a feni említett hátrányoktól,
A találmány tárgya //öo?r;opék«,s mflaenzae protein D fehérjéje (EP O 594 61ÖB. számú európai szabadalmi irat), vagy annak .fragmensei, poliszachteíd-aí&pú mmmnogén keszjíméuyek, köztük oltóanyagok hordozójaként, Ezen hordozó .alkalmazása kúlönősea előnyös kombinációs oltóanyagában.
Az alábbiak az 1pneamokokkasz poliszachand-oltóanyagokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgyát k^ezi oltóanyag-kés^inwy, amely legalább egy -(előnyösen konjugáit) ŐWjjfoeocctís jmmte poüszachadd-aníigént, és óih^x/íxoccus /mmKemtoe iehérieamigéaí, vagy altnak munandógiaxiag funkcionális ekvivalenséi tartalmazza, öpcioaálísaa Tb 1 '-adjuvánwl (olyan aájavánssal, amely Thl immunválaszt vált ki), Elónyösea az oitóanyag-készíttróay mind a pssamókokkasz fehérjét, mind a Tb 1 -adjuvánsí tartalmazza. A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasak az időskori tüdőgyulladás, kezelésére.
A pnemnokokkasz poíiszacbarid-oltóanyagok. (konjugáhak vagy sem) nem biztos, hogy képesek megvédeni a. tüdőgyulladás ellen az idős populáció esetébe®, amelyben ezen betegség előfordulása nagyon magas,. A pseumokokkusz elleni védekezés kulcsmechanizmusa az opszonoíágodtózis (Immorális B-sejték és neuürofíl sejtek által közvetített esemény, amelyet a pneumokokkusz. poliszaobmd elleni' ellenanyagok termelése okoz, miáltal a baktérium- végül fagocitőzisra kerül), azonban a. részi vevő opszonikos mechanizmusok részei nem műkődnek. az idősekben, azaz 'például a polimorf ma-gvő sejtek („pölymorphonueisar cell”, PMN) sznperoxid előállítása, más reaktív ozxgénfajták előállítása, PM'N mobilizálása, PMN apoptózisa, PMN áefonnálhatósága. Az ellenanyag-válaszok szánén hibásak lehetnek az Idösekhstt.
A Komális·»; elfogadott dogmával ellentétben az asti-burok-poliszacharíd ellenanyagok normális szintje nem biztos, hogy hatásos a. baktériumok teljes kiürítésére, mivel a pneumckokkuszok gazdasej tehet is megtámadhatnak, elkerülve az immunrendszer ezen ágát.
»-♦ φ
- 6 ·
Meglepő módon ögy találtak, hogy az inuncmreodszsr -sejt-közvétitett ágának {példáid T-sejtek által közvetített íionriítás) egyidejű ingerlése az immunrendszer immorális ága (B-sejtek által közvetíteti) mellett szin.ergetLkss hatást eredményez, amelykópes fokozni a gneunrokekkusz kiürülését. a gazdából- Bz egy felismerés, amely segítheti a pammokokkusz-fortözós megelőzését (vagy kezeléséi) általában, de különösen fontos tehet a tüdőgyulladás megelőzésébe» (vagy kezelésében) az idősekben, akikben a poliszacharid-alapú oltóanyagok nem hatásosak.
Azt. találtuk, hogy az imtaöit-Rsoászer mindkét ága szinergizálhai ezen a módon, ha (előnyösen konjugált) pneumokokkusz políszaeharídot pnentsokokkusz: fehérjével -{előnyösen a paeuraokokkusz fo.lszhtéfi expresszait, vagy szekretált vagy kieresztett fehérjével, amely processzálható és prezentálható a fertőzött emlőssejtek felszínén 1 és Ik osztályba tartozó MHC kontextusában) adunk:be. Sár a pnentnokokkusz íefeéxje indukálhatja a sejtes immunitást inasában ís, azt találtuk, hogy egy Ihl-mdakáló adjuváns jelenléte az oltóanyag-kiszerelésben segíti, az imniuurendszer ezen ágát, és meglepő módon tovább fokozza az immtmrendszer két ága közti szinergiát.
Az alábbiak a 2,, kiválasztott pöeumekoRkusz políssacharíd-konjugálnmokat és 3DAÍPL készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgyát antigén készítmény is képezi, amely egy vagy több poetsmokokknsz poliszaehnridkoujtigátumeí tsrtalutaz 3Ö-MPL adjuvanssal kiszerelve, alapjában véve alunuuiam-alapú sdjüváastól mentesen, attól legalább egy pnettmokokkusz pohszaehadá-komugátuís szignifikánsan immuuogéuehb TD-M'PL-t tartalmó készítményekben, adni olyanokban, amelyek 3D~MFL-t és aiuminium-alapú adjuvánst is tartalmaznak.
Előnyös megvalósítási módok szerint a találmány tárgyát antigén készítmények képezik, amelyek az alábbi pueumokokkusz butttk-poliszaohariáok közül egyet vagy többet fortahnaznak: 4, 68, 18C, 19F és 23F szeroíipusok. Az ilyen készítményekben a poliszáéi;aridok mindegyike meglepő módon. immunogénebb egyedül 3D-MPL-Í tartáhaazó készéimenvekben, 3D-MPL-t és: aluminium-alapu adjuvánst is tartalmazó készítményekhez hasonlítva.
Tehát a. találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát 4, 68, 1SC, 19F vagy 23F szerotípusó, ínnnuisögás fehérjéhez konjugált ób-epíooocoiö· pneutnoni&e barok-poliszacharidot, és 3D-MPL adjuvánst tartalmazó antigén készítmény képezi, ahol a készítmény alapjában véve mentes akmrinium-alapü adjuvánstól.
A találmány egy második megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát kombinált antigén készítmény képezi, amely alapjában véve mentes aíumimarn-slapú adjuvánstól, és amely 3D-MPL adjuvánst, és kettő vagy több pnenmokokkmsz burok-pöliszaehas-id-kottjugáttmtot tartalmaz, amelyek a 4, 68, IhC, 19.F vagy 23F szerotípusok bármelyike.
.Az alábbiak: a 3., bakteriális poliszacharid-proteiu ,D konjugátumokat tartalmazó n-egvaiősifás; módra vonslkoznak.
A találmány tárgyát pohszacharid-konjugáíutn antigén képezi, amely patogén baktériumból származó pohszaehnnd-antigént tartaimsz ff&ewofúifes ieílsenzoe protein D fehérjéjéhez, vagy annak fragmeaséhez konjugálva, Ezenfelül a találmány tárgyát képezik pebvates készítmények, ahol egy vagy több poliszachmidastigén protein D-hez van koajugálva.
Az alábbiak az L, piteamokokkuszpolíszacluirid-eltóanyagokat tártaim ázó megvalósítási módra vonatkoznak.
a » ♦ ♦
-7A Sniálmány tárgya javított oltóanyag, előnyösen idősek (és/vagy csecsemők és kisgyermekek} pnemnakoskusz-fertőzésének megelőzésére és enyhítésére.
A találmánnyal összefüggésben egy beteget idősnek tekintünk, ha 55 éves vagy annál idősebb, 'tipikusan 60 éves vagy idősebb, és általártosabban 65 évesnél idősebb.
Tehát a találmány egy megvalósitási módja szerint a találmány tárgya idősekben (és/vagy csecsemőkben és kisgyermekekben) való alkalmazásra megfelelő oííóanyag-késztíméöy, amely legalább egy Streptoaaoats pseumostae poliszacharid-amíg&ih és legalább egy Süxgjmee&sis pwumoKto febérjsantigést tartalmas:.
A találmány egy második, előnyös megvalósitási módja szerint a találmány tárgya (idősek tüdőgyulladásnak megelőzésére alkalmas) oltóanyag-készítmény, amely legalább egy ΑόρρίοίοοοΗί pneammíae pollszaelmrki-amígént, és legalább egy SíftgRococcas /mtSíemném íeherjeamigént, és Th 1 -aájuvángt tartalmaz.
blöreiátbaíótm az oltóanyag alkalmas- lehet pnemnokokknsz-fertözések (például középSiígynliadás} kezelésére is a populáció más magas kockázata csoportjaiban, mint például csecsemők és kísgyetmekek.
A találmány egy harmadik megvalósitási módja szerint a találmány tárgya oltóanyag-készítmény, amely pneumokokkusz noliszacharid-antigént és Th 1 xadjdvfet tartalmaz.
Tipikusan a találmány szerinti Sfrepíöceosw ^neumaniae oltóanyag (előnyösen konjugált) poliszacharídanttgénékét tartalmazhat, ahol a pohszacharidok legalább 4 pnenmokokkusz szerotlpusböl származnak. Előnyősén a négy szerotipus a őB, 14, !9F és 23F. Előnyösebben: legalább 7 szerotipus van a készítményben, például 8 4, óB, 9V, 14, iSC, 19F és 23F szerötipusboi származók, Még előnyösebben legalább 11 szerotipus van a készsttnénybes, példád egy megvalósítási -mód szerint a készítmény tartaltnaz 1, 3, 4, 5, őB, F, 9V, 14, 18C, Γ9Ε és 23F szerotipusböi származó (előnyösen koníngáit) burok-poiíszachnridokat, A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint legalább 13 (előnyösen konjugált} pollszncharid-antígéní van a készítményben, bár további pcdiszacharid-antigéoek, például 23-valens (mint például 1, 2, 3, 4, 5, 6E, 7.F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 lA, 12F, 14, 15B, 17E, ISC, IFA, 19F, 20, 22F, 23F és 33) készítmény szintén a találmány tárgykörébe. tartozik.
idősek immunizálására (például Ü'dögytíliadás megelőzésére) előnyös a 8 és 12F szerotípusok felvétele (és legelőnyösebben a 15 és 22. szerotipusoké is) a fent feltárt 11-valens oltóanyagba, 15-vaicns oltóanyagot kialakítva, míg csecsemők vagy kisgyermekek esetén (ahol a középfülgyulladás a to gond), előnyösen a 6A és 19A szerotípasokat vesszük fel 13-vaiens oltóanyag kialakítására.
Tüdőgyulladás idős (5S év feletti) populációban és középlnlgynliadás csecsemők (18 hónapos korig) és kisgyennekek (tipikusan 18 hónaptól 5 évesig) körében történő megelőzésére és javítására a találmány előnyös megvalósítási módja a feltárt rsruidvafena őknymwceus poliszacharidokat Őfeepíocoecus pnesímofííöe' fehérjével, vagy annak immunoiógiailag lankefesális ekvivalensével kombinálni,
Á találmány szerinti értelemben „iasmunológiailsg fenkeionális ekvivalens’'' alatt lekérje olyas pephájét értjük, amely a találmány szerűül fehérjék legalább egy epríópjáí tartalmazza. Ilyen epitópok jellemzően. felszíni kitottséguek, magasan megőrzőitek, és képesek baktériumölő ellenanyag-választ kiváltat», vagy toxikus hatásokat megelőzni a gazdában. A funkcionális ekvivalens a találmány szerimi fehérje legalább 15, és előnyösen 30 vagy több összefüggő anfemsaváuak felei meg. Legelőnyösebben a fehérje fragmensei, dei.éeiői, mint például annak transztnejnbrán-áeléclé» variánsai (azaz a Fehérje extraceiluláris doménjének az alkalmazása), fúziók, ke»*** mí&ilag vagy genetikailag áetesifíkálí származékok és hasonlók alkalmazhatók azzal a költéssel, hogy alapvetően ugyanolyan immunválaszt képesek kiváltani, isist a natív fehérje,
Á taláhnány szerinti; előnyös fehérjék azok a pne-umokokkasz fehérjék, amelyek a pnemnokokknsz külső felsz ínére khetíek (a gazda imummondszere képesek azokat felismerni legalább az életciklusuk-egy része során), vagy olyan fehérjék, amelyeket a pnenmokokknsz szekreíál vagy kiereszt, Legelőnyösebben a fehérje Sír^píececew pn&ttm&niae taxin, adhezm, kélkontpenöw jeltovábbító vagy lipoprotein, vagy annak immunolégiailag iúttkcienáhs ekvivalense.
Különösen, előnyős fehérjék sem korlátozó példái közé tartoznak ilyen kombinált oltóanyagban a (előnyösen kémiailag vagy mutációval detoxífíkált) pneumohzin [Mitekéi! és mtsal., Nücleic Acids Rés, 18, 4010, old, (1990); Mitchell és mlsai,, Bioehem, Biephys. Acta 1.007, 67-72, oki, (1989); WO 96/05859., WO 90/0695!. és WO 99/03884. számú nemzetkőzs közzétételi h&tokj; PspA és íransznmnferán-áeletál;. variánsai (5 804193. számú amerikai egyesült áhatttökbeh szabadalmi irat); FspC és transzmembrán-deletáit variánsai (WO 97/09994, számú nemzetközi, közzétételi. irat); PsaA és íranszniembrári-íieletálí variánsai. [Berry és haton, Infect, Immun. 64, 5355-5262. old. (1996)]; pneumekokkuss kcslio-kötö fehérjék és transzmembrán-deleták variánsai; CbpA tr&nszmenrbrámdeletáh variánsai (Wö 97/41151, WO 99/51266. számú nemzetközi közzétételi iratok); gücer«ldehid-3'fosKfíti-dehídrogeaáz [Infect Immun. 64, 3544. old. (1996)); B.S.P70 (WO 96/4092&. számú nemzetközi közzétételi irat); FepA [Sanchez-Beato- és mtsal., FEMS .Míerobiaí Len. 164, 207-214. dd. (1998)]; M-azeru fehérje, SB szabadalmi bejelentés, EP ö 837 130; és aiihezln-18627, SB szabadalmi bejelentés, EP O 834 568.
A tatóteányhae. alkalmazott fehérjék előnyösen a pneatnollzto, PsaA, PspA, PspC, CbpA bármelyike; vagy kettő vagy több kombinációja. A találmány tárgya az ilyen fehérjék immnnológiaílag funkcionális ekvivalensei s fenti definíció szerint.
A készítményben a fehérje segíthet a príenmokokkuaz-betegség elleni T-sejtek által .közvetített áutnunvár lasz kiváltásában - ami különösen szükséges tüdőgyulladás elleni védelemben atnely együttműködik az immuntendszer hnnörális ágával a pneumokokkusz ímváziójának gátlásában, es stimulálja az opszoaefagecitözíst.
A fehérjeantigén alkalmazásának további előnyei közé tartozik további antigének prezentálasa- az: opszonotágocísözís folyammában, és a bakteriális adhézlé gátlása (ha adhezint alkalmazunk) vagy toxin semlegesítése (ha tcxmt alkalmazunk}.
Ennek megfelelően a találmány egy megvalósítási utódja szerint a találmány tárgya 5/.η?ηίί><?.<χζ'η> pmeorit» oltóanyag, amely legalább négy, előnyösen legalább hét, előnyösebben legalább tizenegy szerotipusből származó konjugált pseamokekkasz peiissacbarid antigént, és legalább egy, de előnyösen kettő S&eptococetis pneumonfee fehérjét tartalmaz. A fehérjék egyike előnyösen pnenmolizin vagy PsaA vagy PspA vagy CbpA (legelőnyösebben demxiSkáií pnenmoliztn). Előnyös kombináció legalább pneumoiízint vagy annak származékát es PspA-t tartalmaz.
Mint ahogyan fent említettük, az Immunizálás poliszaehnrhlos megközelítésével kapcsolatos problémák egyike az a tény, hogy a pcíiszacharidok önmagukban gyenge ímmtmogének. Azért, hogy felülkerekedjünk ezen, a pohszaehariáokat hofoozöfehérlékhez konmgálhaijuk, amelyek mellékes T-seites segítséget nyújtanak, Ezért előnyős, hogy a találmány szerint alkalmazón peliszaeharidoktü ilyen hordozófehésjéhez kapcsoljak. ilyen poiiszaeharid-immunogének előállítására jelenleg általánosan alkalmazott hordozók példái közé tartozik a difié-9ria- és jehujnsz-texoid (DT, DTC8M197 és TT), köriősesigs („kevhole limpet”) hemoetantefa (KÖT), ;V. me»tegt'íá£j? ÖMEC-je, és a íuherkutin tisztított fehétjeszármazéka (PPD).
Azonban számos. probléma kapcsolatos ezea általánosan alkalmazott hordozók mindegyikével (lásd az „Az. általánosan .alkalmazott hordozókkal kapcsolatos problémák’’ szakaszt).
A találmány tárgyát képezi egy elöayds megvalósítási mód szerint egy őj hordozó poltszacharid-alapő immunogéa komtrukeíők előállításában való alkalmazásra, amely nem. szenved ezen hátrányoktól. A pneamekokkusz poliszacbsifid-alapú tmumnogén készítmények (vagy oltóanyagok) előnyös hordozója a /Tsemopáíííts ö^«enz«« protein D fehérjéje (EP ö 594 610 8, számú európai szabadalmi irat), vagy annak fragmensei. Az alkalmazásra megfelelő fragmensek közé tartoznak T-sejteket segítő epttópokat hordozó fragmensek,. Előnyősén a protein D fitagmens a. fehérje N-termínális 1/3-áí: tertabnazhatja.
A pneumokokkesz políszaeharid további előnyös. hordozója maga a pneamokokkusz fehérje (mint ahogy az „A találmány szerinti pneumokokkasz fehérjék” szakaszban definiáltuk),
A találmány szerinti oltóanyagokban előnyösen adjuváns található. Megfelelő adiuvaosek: közé tartoznak alumínium-sók, mint például dumtetum-hidtoxid gél (ahm) vagy afemiámm-föszíát, de kalcium, vas vagy cink sói is alkalmazhatók, vagy aceídált tirozin vagy acefrláfr cukrok, kaüonosao vagy amonosan származtatott pohszacharídok vagy poliíószfazésak oldhatatlan sznszpeoziója.
Az adjuváns előnyösen Thl tipnsú válasz kiváltója az. teununválasz sejí-kőzvetitett ágának segítésére.
A Thl-típusú citokmek magas koncenlrádója hajlamos kedvezni a sejt-közvetített immunválasz kiváltásának adott antigénre, míg a Th2-;ípusó ekökinek magas koncentrációja hajlamos kedvezni« humoráiis immtmvár lasz kiváltásának sz antigénre.
Fontos, hogy emíékezKÜnk arra, hogy a Thl- és TfrT-típusú imrmmváasz megküloobözieíése nem abszolút A valóságban egy egyén olyan imamnválaszt fejlesz ki, amelyet elsősorban Th 1-nek, vagy Th2-nek írhatunk le. Azonban gyakran késyelroes a citokisek családjait oly módon figyelembe venni, ahogyan Mosmann és Coffinan íÁiHsnal Review of Immunefegy 7, 145-173. old, (IlWíj leírták egér CD4-pozitiv T-sejt kiónokban.. Hagyományosan a Tirl-íipusn válaszok a T-ihníocitsk IMF-γ és 11.-2 .cítoktetermelésével kapcsolatosak. Más, gyakran a Fhl-tfpusú immunválasz kiváltásával -fcozverienül kapcsolatos ejtókinéket, mint például az IL- í2-t nem T-sejtek temjeinek. Ezzel ellentétben a Thd-típnsö válaszok 11-4, 11.-5, ΪΪ..-6 és íl.-lö szekréciójával kapcsolatosak. Az elsősorban Th 1 -típusú választ előidéző megfelelő atijnváns-rendszerefc közé tartoznak a moaofosztortl 1 ípíd A és· származékai, különösen T-ee-O-acíl-nmoföszferil lipid A, és monofbszfórii lipid A, előnyösen 3-de-O-acllmonofoszforil lipid A kombinációja alumínium sóval.
Javított rendszer mosofesztoríl lipid A és szapontn-sztoazék kombinációját tartalmazza, előnyösen QS21 és 3D-MPL kombiíjáckijíi, a WO 94/00153. számó nemzetközi közzétételi tett.: feltárása szerint, vagy kevésbé reagáló készstiaényt, ahol a QSSl-et kofeszíeriosel gyengítjük a WO 96/33739. szántó. nemzetközi közzétételi irat feltárása szerint.
Különösen hatásos adjnváns kiszerelést íár fel WO 95/17210, számú nemzetközi. közzétételi irat, amely
QS21-t, 3D-MPL-t és tekoförolt tartalmaz olaj-víz emulzióban, amely egy előnyős kiszerelés.
Előnyösen -az oltóanyag tettetem továbbá egy szapeniní, előnyösebben QS21-Í. A kiszerelés előnyösen tartalmazhat olaj-víz emstóő-t és Sokoferolt (WO 95/17210, számú oenxzeticőzi közzétételi irat).
ϊ ό *
Κ ♦♦♦χ
-16A folálssány tárgyát képezi továbbá eljárás oltőaí?ysg-kis2erelé» előállítására, amely szériát találmány szerinti tehénét gyógyszerészeti elfogadható kötőanyaggal, mint például 3D-ME'L-fol keverünk
Metilátótlasí CpG-t tartalmazó oligcmukietóidok i WO Óő/'O2555. szárító nemzetközi közzétételi irat) szintén előnyös indukálószerei a Thl-típusú immunváiusaxtak, és .megfelelőek találmány szerinti alkalmazásra.
A találmány szerinti különösen előnyös készítmények iartaknaznak egy vagy több konjugált pseutmakokkusz políszacharidot, egy vagy több pneumokokkusz fehérjét és Thl-adjuvánst A seít-közvetitett válassz kiváltása paetmmkokkusz fehérje által (mint ahogy fent leírtuk), és sz immunrendszer két ága közti együttműködés elősegíthető ilyen Th 1 -adjuváns alkalmazásával, különöse» hatásos oltóanyagot eredményezve pneumókokkusz-betegaég ellen általában, és fontos módon az idősek píwmokokkusz tüdőgyulladása ellen.
A találmány további megvalósítás! mód szerint, a találmány tárgya a feltárt imrmmegés vagy oltóanyag, gyógyászatban történő alkalmazásra.
Még egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya készítmény, amely pnemnokokkusz poiíszaetótrld-koujugámmot és Thl-adjuvánst (előnyösen 3D-MPL-1) tartalmaz, amely képes szerokonverzlöra, vagy hntnopá&s ellenanyag-válasz kiváltására a pollszachariá-antigén ellen a aem reagálók populációjában.
A populáció 5 0-30%-a ismert módon nem reagál pokszseharid ímmaruzáiásra snena reagál az oltóanyagban lévő szerotipusok több jet 56%-árs) {Koaxadssn és tKtsaí., Scantt. i. Immunoi. 40, 251. old. (;994); Koárigsez és misak, JID 173, 1347. old. (199ö)j. Ez előfordulhat konjogálí oltóanyagokkal is [.Músherés rntsai., Clln. Inf. Dis. 27, 1487. old, (1968)1. Ez különösért komoly leltet a populáció magas kockázató részeiben (csecsemők, kisgyerekek és Idősek).,
Azt találtak, hogy konjugált psentnokoktesz poliszneharid (amely hajlamos alacsony válaszra egy bizonyos populációban) és Thí-aájnváns (lásd az „A találmány szerinti Tht-adjuvánsok” szakaszt) kombinációja meglepő módon felülkerekedhet ezen a nem reagáló állapoton. Előnyösen 30-MPE-í keli alkalmaznunk, legelönyósebbeu 3D-MPL~t ahtmítónm-alanú adjuváns nélkül (ami ?nég jobb választ biztosít). Á találmány tárgyát képezik: tehát ilyen készítmények, és továbbá eljárás pnemmokokfcusz poliszachsridokra nem reagálók kezelésére ilyen készítmények beadásává, és még továbbá Thl-adjováns alkalmazása.»príUszacharid-satigéare nem reagáló egyénekben pnenmokokkíisz-betegség ellesi kezelésére vagy attól való védelmére alkalmas koajugálf paeomokokknsz ponszaehartó-antigénekeí tartalmazó gyógyszer gyártásában.
Egy megvalósítási mód szerint adott egy eljárás tüdőgyulladás megelőzésére vagv javítására idős: emberben, amely szerint az oltóanyag biztonságos es hatásos mennyiségét adjuk be a leírás szeritó idős betegnek, amely oltőartyag Óri-eptocuccKs rzeewío.ow pohszaehariá-aníigérjt és akár Ihl-adjuváust, akár pneumokokkusz fotósáét (előnyöset? taindkettőt) tartalmaz.
Egy további megvalósítási mód szerint adott egy eljárás középtólgyalladás megelőzésére vagy javítására csecsemőkben vagy kisgyermekekbe??:, amely szerint az oltőauyag biztonságos és hatásos mennyiségét adjuk be a leírás szeri?» csecsemőnek vagy kisgyermeknek, amely oltóanyag Sfr^focoeeíis píteumotóöe polaszacfearidamige?rt és akár ΊΈ1-adjuvánst, akár pmammkokkusz fehérjét (előnyőse» mindkettőt) tartalmaz.
A font foltárt találmány szerinti eliárásekba?t a pohszaclísrid-iiHtigéJt előnyösen poüszaehariá-fehéijekoí?jo:gátaruként van jelén.
♦'* 0 ♦ »9 4 9 4
-πiXííau^atiKiiusis
A találmány szerntí oltóanyag-preparátnnrok fertőzésre fogékony esnlös védelmére vagy kezelésére alkalmazhatók, az oltóanyag szisztémás vagy tíyálkaháríyaí beadásával, Essen beadási módok közé tartoznak intramnszknlárís, imraperitöneális, útíxadermális vagy sssfekot&x injekciók; vagy nyálkahártyái beadás a szájSfeg/Mlrexiásaeri, légúti, hógyivati szervekbe, Az intraaazáfe beadás tüdőgyulladás vagy kőzépOiigymladás kezelésére előnyős (mivel a pneamokokkusz orr-garathregl bevitele hatásosabban megelőzhető, így a fertőzés a legkorábbi fázisban gyengíthető),
Akonjugált antigén mennyiségét.rnMen oltóanyag-dózisban úgy választjuk meg, hogy védő immoavábszt váltson ki tipikus oltóanyagokban szignifikáns káros hálások nélkül. Ez a mennyiség változhat az, alkalmazott specifikus ismmmogéntöl és a prezentációtól függően. Általában várhatóan minden dózis 0,1.-100 pg poliszaeharídot t&rtsknaz, előnyösen 0,1-50 μν-ot, előnyösebben ö, 1 -lö gg-ot, legelőnyösebben 1 -5 pg-oí:.
Az oltóanyag fehérjetartalma tipikusa» az l-löö pg tartományban lehet, előnyösen 5-50 pg». leguipíkusabbaa 5-25 pg.
Egy adott oltóanyag komponenseinek, optimális mennyiségét az alanyokban megfigyelt megfelelő immunválaszokat magában foglaló szokásos vizsgálatokkal áilaphhagok meg. Az elsődleges immunizálást követően az alanyok egy vagy több megerősítő immunizálási kaphatnak megfelelő időközönként
Az oitőarryag-elöállitási általánosan & „Vaocitte- Design - the Subtmir aaá Ádjnvaat Approaeb (szerk,: Poweil és Newfnan. kiad.: Piéoam Press NY (1995)1 dmü könyv tárja fel, A hposzómákba való bezárást Föllertoa (4 235 877. számú amerikai egyesük államokbeh szabadalmi írat) tárja fel.
Az alábbiak: a 2... kiválasztott pnsutnokoktosz poiiszachariá-konjngáhunokaí és 3-D-MPL készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány szerinti értelembe» ,,a találmány szerinti pneísm.okoLkusz poisszacharid-kosjngátsmok'’ kifejezés alatt a Aó'eptooooeas pnenmeííím? hurok-poiiszacfearidok olyan, konjugáíumait értjük, amelyek: mmmnogénebhek: 3D-MPL-Í tartalmazó készítményekben, mint 3D-.MPL-t aiumlmum-alapú adjnvánsokkal együtt tartalmazó készítm<myekben (példán! 4, 6S, 18C, 19f vagy 23F szerottpux konjugásumsi).
A találmány szerinti értelemben „alapjában véve ahrmialum-alapú adjuvánstól mentes’' kifejezés alap olyas készítményt értőnk, amely jsstn tartalmaz elegendő aluminímn-alapú adjuvánst (például alamíuium-hidroxidot. és előnyösen alumlnnmi-foszlátot) tóthoz, hogy a találmány szerinti pnemnokokkusz poliszacharid-konjugáium immuoogennásának bármilyen csökkenését eredményezze ekvivalens készítményhez képest, amely 3D-MPL-1 tartalmaz hozzáadott ahímmiutn-alapú adjuváns nélkül. Előnyösen az aatígénhatásá készítmény lényegében 3DMPI.-t tartalmazó adjuvánst kell, hogy tartalmazzon. A. dózisonként: hozzáadott alumínium.-alapú adjuváns .mennyisége előnyösen kevesebb, mint 50 pg, előnyösebben kevesebb, mint 20 ug, még előnyösebben kevesebb, mint lő pg. keli, hogy legyem, és legelőnyösebben nem adónk alutmalnm-álapa adjuvánst & találmány .szerinti asdgénhatású készítményhez,
A találmány céljaira annak meghatározását, hogy egy prtemuokokkusz poliszacharíd-konjugáium szignifikánsan immuuogénebb^-e 3D-MPí..-t tartahmísó készítményekben, miül 3B-MPL--S: alomúnum-alapú adjuvánsokhal együtt tartalmazó készítményekben, a 2. példa feltárása szerint kell megvalósítani. Annak a jele, hogy egy készítmény szignifikánsan imnmnogénebb. amikor egyedül 313-MPL-t tartalmaz, egyedül 3D-Mfil,-t tartalmazó es 3D-h4PL-t alumsnínm-tbszfát adjuvánssal együtt, tartalmazó ekvivalens készítmény közötti GMC
Μ.«
- 12 IgG-ksucesteádö aránynak nagyobbnak káli fennie, mini 2, előnyösen mint 5, előnyösebben mint 7. még előnyösebben mint 9, és. legelőnyösebben mint 14..
Az·: immunizálás. poliszachttridos megközelítésével kapcsolatos problémák között van az a tény, begy a poliszachsridok önmagákban gyenge iatamnogének. Az anmanogeaitás ezen hiányának leküzdésére tervezett stratégiák közé· tartozik a poiiszackaridoksak: nagy ímmtsscgén fcoMosáfehérjékhez való kapcsolása, amelyek melléken T-sejtes segítséget: nyújtanak. Előnyős, bőgj·’ a találmány szerint alkalmazott poíiszacbaridokat hordozófehériéhez kapcsoljuk, amely tsdlókes T-sejtes segítséget: nyújt.. Ilyen aíkahnazhslő hordozók példái közé tartozik a diftéria-, mutáns dífícria- és tetanusz-resok! (DT, DT -CRM197 és TT), kürtöscsiga {„keyhole Msnpef) .hemociariinja (KÉPI), a teberkulin tisztított fetójeszármazéka (PPD), és Afem-erin fneningítíitís OMPC-jc.
Legelőnyösebben a ííaemopsátas ififiwwcse proteinD fehérjéjét (EPE S94 610 B. számú európai szabadalmi irat), vagy annak. fcagmeaseít alkalmazzuk (lásd a kővetkező szakaszt a találmány 3., bakteriális poliszacharid-protem D kotpugáfetmokat fertahnazó megvalósítási módjáról) immunegén herdozófehérjének a találmány szerinti pnenmókokkw poliszacbatidokhoz.
Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti aniigénhatású készítmény pnetiraokokkusz 4-es pollszacharid szeroíipust (PS) tartalmaz mrnmnogén fehérjéhez konjugálva és 3D-MPL adjuvánssai kiszerelve, ahol a készítmény alapjában véve aluurÍKiutu-alapú ttdjnvássíól mentes. További megvalósítási módok szerint az anrigoahatású készítmény PS fsB-í, PS I SC -í, PS i 9F-et vagy PS 23F-et tartalmaz mmamogén fehérjéhez konjugálva és 3D-MPL adjuvánssai kiszerelve, ahol a készítmény alapjában véve afemfeium-áfepú aájuvártstóí mentes.
A találmány még további megvalósítási módja, szerint a találmány tárgya kombinált arsttgénhsíásá készítmény, amely kér vagy több puemrtokok&usz poliszaoharld-kmjugámmot tartalmaz a PS 4, PS 6B, PS 18C, PS I9F és PS 23F közül 3D-MPP. adiuváassaí kiszerelve, ahol a készítiuéuy alapjában véve sluminium-siapú adp-vánstöl mentes.
A találmány szerinti ptteutnokokkosz peíiszacharid-konjogáiutnok immuuogenitását sem befolyásolja szignifikánsan más psentsekokkusz políszaehtuíd-koíijogárosiokkal való kombinálás (lásd a 3. példát). Ennek megfelelően a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya kombinált antigénhatású készítmény, amely egy vagy több, találmány szerinti pnenmokokkusz polisztseharkl-konjugáínmoí tartalmaz egy vagy több, további találmány szerinti pneumokoiíkusz pcíiiszacbiirid-korijr:gái3.tmmal kombinálva, ahol a készítmény 3D-MPL adjuvánssai kiszerelve, áe alapjában véve nlnrnímnm-túapú adjuvánstől mentes,
A. találmány további: előnyös megvalósítási módjai szerint a .találmány tárgya kombinált.antígénhatásá készítmény, amely legalább egy, de előnyösen. 2,3,4, vagy mindaz 5 pneumokokkasz poltacharid-konjugátamot tartalmazza a PS 4, PS 6B, PS 1SC, PS I9P és PS 23F közül, és ezenfelül más pnenmeknkkusz pohszaeharidk'onjugáítmtot bármilyen kombinációját tartalmazza, almi a készítményTD-MPL adjuvánssai kiszerelve, de alapjában véve aiamfeium-aiapú aájuvátsstél mentes,
A találmány szerinti Strsepíococcns pnesmonáze kombinációs mttigénbatású készítmény tipikusan konjugáit políszaehíttid-ímttgéueket tartalmazhat, amelyek legalább négy,· hét, tizenegy, tizenhárom,: tizenöt vagy buszosbárom szeroiipusból származnak (lásd az ,A találmány szerinti Síreptococeus pseumoaíac pohszaohsridastigének” szakaszt fent a szerotípusök előnyös kombinációhoz, a kezelendő betegségtől függően).
*« * »
- η A találmány szerinti eaitigésbslásó készílméoyeket előnyösen ©Móanyag-készíttnáxyekben: alkabnazzuk poeumtíkokkosz-íerlőzések megelőzésére (vagy kezelésére), különösen idősekben, csecsemőkben és kisgyermekekbe®,
A találmány további megvalöshásr módjai kösé iartezssak; a festi antigénhatásó készítmények biztosítása gyógyászaiban történő alkalmazásra: eljárás immunválasz kiváltására ÓP-epmcöceus pmmmoníöe bnrokpobszacharid-koojngátinn eben, amely a fenti aniigéuhstásó. készítmények biztonságos és hatásos mennyiségének betegnek történő beadásának lépését tartalmazza; és a fenti artiigénhatásd készítmények egyikének alkalmazása pnenmokokkasz-betegség megelőzésére (vagy kezelésére) alkalmas .gyógyszer gyártásában.
'Tüdőgyulladás idős (55 év feletti) populációban és középi&lgynlfeáás csecsemők (18 hónapos korig) és kisgyermekek (tipikusan 18 hónaptól 5 évesig) körében történő -«egeldzésére/javstására a találmány további előnyös megvalósítási mélája a feltárt mnitivaleus SbvmfecoecKa psemaosme poliszachariáok óWpmcoeettó' peemtm fehérjével, vagy annak immatteJógmlag hmkeionálts ekvivalensével történő kombinálása (lásd az „A. találmány szerinti prmumokokkusz fehérjék” szakaszt fent az előnyős fehérjékhez és fehérje kombinációkhoz).
.Az eddig leltárt sntigéahaiásó készítmények (és oltóattyagok) előnyösen, lioűlízálfek a felhasználásig, amikor azokat oldószerrel rögtönözve rekonstítoálink. Legelőnyösebben azokat 3D-MFL jeiertiéíébert líoSlizáljuk, és söoldattal rckonstituáljnk,
A készítmények iioflhzáíás» stabilabb készítményt eredményez (például megakadályozza a poliszaeharidantigének lebomlását}.. A folyamat meglepő íoodon még magasabb ellmonyag-títetí okoz a paesmokekkasz poliszachmidok ellen. Ez különösen szigaififetetak bizonyok a PS SB konjagálmnokra. Tehát a találmány egy másik megvalósítási .módja Pb 6.8' konjugátumot tartalmazó lioföizált wügéöbaíáső készítmény 3B-MPL adjuvátmsal és alapjában véve ahímininm-alapii adjovásstől mentesen.
Áz oltóanyagok előállításáról bővebben lásd a festi ,Λ találmány szerinti oltóanyag-preparúltmck” szakaszt.
Az alábbiak a 3., bakteriális poliszaeharíd-protein P konjugátunmkat tartalmazó megvalósítási módra vonsíkoznnk,
A kombinált oltóanyagokra való törekvés előnye a beteg kényelmetlenségének csökkentése, a tervezés megkönnyítése, és a terápia befejezésének bíztositása; azonban ezzel együtt jár az oltóanyag hatékonysága esők? köntösének a kockázata (lásd fent az ephőp-szupresszió tárgyalását a hordozófehérjék tslzott aíkaitnazásávai kapcsolatban), Ezáltal előnyös tenne olyas oitóaayag-líontbiuácíök előállítása, amelyek eleget tesznek a populáció igényelnek, és emellett nem mutatnak immanológraí zavaró hatást a komponenseik között. Ezen előnyöket elérhetjük. a istáknány szerinti immonogén készítményekkel (vagy oltóanyagokkal), amelyek különösen előnyösek kombinált oltóanyagok beadására magas kockázató csoportokban, mint például csecsemők, kisgyermekek: vagy idősek.
A találmány tárgyát képezi fferrtííopnífes' óíddcnsoe protein D fehérjéje, vagy annak íragmenseí, pohszaeharíd-alapu immunogén készítmények, köztük oltóanyagok hordozójaként Az alkalmazásra megfelelő Iragmensek közé tartoznak a T-sejteket segítő epitópokat .hordozó feagmensek. Előnyősön a protein D frsgtsens a íenérje N-terminális i/3-át tartalmadat ja.
- ΜΑ protein D ffa&tiopöifyts mfluemme IgD-kötő fehérjéje (EP ö 594 ŐK) B, szántó-európai szabadalmi irat) és potenciális immunogén.
A találmány tárgykörébe tartalmazó protein 'D-hez kcsjugálandó pohszacharidok oaa korlátozó példái közé tartozik a Saímaneifa ?}p&' Vi-políszacharidja, meningokokkusz poliszadtaridok (köztük az A, C, W135 és Y típusú, és a B-esoporios menisgokokkusz polwAcfemdok és módosított pdíszaohródok:), .Ste^áy/ococc?^ űíff'íííí.s poliszacharídok, Strepíococms. agniaetae poiiszaeharidok. Srreplöeoecus’ pfieumonüie poiíszaeharidok, mikobaktérmm poliszacharídok, például Aft-wbrm.ksoúsra ftróerea/osís poliszaehnridok (mint például masnofoszfoinizítídek, behálózok, mikolssv, mtmnóz-sapkázoti arabinoglikáeok. azok hurka, és arabmogalaktánok), Cnyjíoeor’cíís .«eopwn&w poliszaebarídok, nem tipizálható Jfemöp&íte influenzáé lipopohszachsridok, Haemopfiikts influenzáé b burrik-pcllszachsridja, AróraxeZia .catkamtlis iipopokszaeharidok, S&igefia sonttei lípopoliszacharidjok, Pnpanewffta meri iipopeptidoföszfbgiíkán (LPFG), rákkal kape.scda-.es GD3, GD2 gangkozidok, tumorral kapcsolatos muciuok, különösen a T-F-anügét-t» és a. sziaKl-T-F-anögás, és a HlV-vol kapcsolatos políszaebarid, amely szerkezetileg a T-F-antigénnel rokon.
A poliszaeharidot bármilyen ismert eljárással kapcsolhatjuk a hordozólebépehez, például Likhite (4 372 $45. szmnu smmkai egyesüli állansokbeli szabadalmi irat) és Arator és misei. (4 474 757. szánni amerikai egyesült államokbeh szabadalmi irat) eljárása szerint. Előnyősén CDÁP-kosjogálá-st végzünk (WO 95/Ö8348. szfeö-netnzetifó?i közzétételi irat).
Az l-ciano-dímerilarítinopiridlBísm'tetraíluoroborát (CDAP) damiáló reagenst előnyösen alkalmazzuk poliszscharid-fehérje-konjugátu-stA szintézisére. A dsniláló reakciót viszonylag enyhe körülmények között hajthatjuk végre, elkerülve az aikslikns pB-ra érzékeny pofcachítridok hidrolízisét. Ezen szintézis lehetővé teszi a líordozóiéhátjéhez történő közvetlen kapcsolást
A poliszaeharidol vízben vagy sóoldatban oldjuk, fel. A CDAP-t acetoaitrilben oldjuk fel, és azonnal a poliszacharíd-oldathoz adjuk. A CSAP a políszaeharid ludorxd-esoporíjaival reagál danút-eszteri alkotva. Az aktiválási lépés után hozzáadjuk a bcrdösóféhériéí a reakdcslegyhez. A llzánek an-rno-csoportjal reagálnak az aktivált: poliszadtííridddai kovalens Izourea-kötést alkotva,
A kapcsolási reakciót kővetően glichs nagy feleslegét adjuk a reakeióelegyhez a maradék aktíváit csoportok lekötéséhez. Ezután a terméket géiszüsjük a reagálatlan hordozőffehérje és maradék reagensek eltávolítására. Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás poiiszacharid-pro-iem D konjugátumok előállítására, amely során a políszaebarid aktiváljuk és a pollszacbarldot protein D-hez kapcsoltuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát immunogén készítmény (vagy címanyag) kiszerelés képezi •S'w/xtoöoccwpzíeswníae fertőzések megakadályozására.
Az 8 mechanizmust, amellyel a pneu-nokokkuszck a tüdőbe, gerincvelői folyadékba és a vérije jutnak, alig értjük. A normális tlldóiéghőlyagokat elérő Ijaktériumok növekedését gátolja azok viszonylagos szárazsága és az léghőtyagok makrofágiaisak aktivitása. Bármilyen anatómiai vagy élettani. változás ezen koordinált védekezőmechanizmusok megváltoztatására a tüdő fertőzésre való fogékonyságát fokozza. A Aíreptococims yjnenworúm? sejtfalának fontos szerepe a tüdő léghólyagalnak. gyulladásának előidézése (Gíílespie. és mtsai., Ι&Ϊ 65, 3936. old. (i997)j.
Tipikusa® a találmány szerinti So-epíococcÍis pneumeniae oltóanyag protein D-konjagáttimokat tartalmaz, amelyek legalább négy, bét, tizenegy, tizenhárom, tizenöt vagy huszonhárom szerotípusbói származnak. Lásd az *4 4·»
- 15,Λ találmány szerinti Streptóeoceus pneumonlae polmaeh^t^-stótgónek” szakaszt, fent a szerotfpusok előnyös kombioácíóltoz, & kezelendő betegségtől függően.
A találmány egy további megvalósítási módja szerrnt a találmány tárgya Afehserfo menfagiíüfis oltóanyag; előnyöseit az A, C, W15S és Y szerotipusofe'ból. .Yetwrfe: menóígiííriri a bakteriális agybártyagyulitidás egyik, legfontosabb oka. Esés organizmusok szénhidrái burka virafeneiát meghatározó tényezőkéin működhet, és védő ellenanyagok célpontja. A szétdüdrátok mindazonáltal jól ismert módon gyenge hmnnucgenek Salai gyermekekben. A találmány tárgya különösen .megfelelő hordozófehérje ezen políszacharidok számára, protein D, amely olyast T-sejí-epítópoknt biztosít, amelyek akriváihaiják a T-sejte választ as antigén-specifikus B-sejtes proliferáciő és érés segítéséhez, valamint az ímstunoiőgiaí. memória isdukálásához.
A találmány egy más megvalósítási módja szerint a találmány tárgyú fíaemap&ílus faftuensae b burokpoliszacharid (PRP)-proteln D konjogáíum.
Á találmány tárgykörébe tartóznak kombinált oltóanyagok is, ntnelyek különböző kórokozók kőre ellen ayájtanak védettséget, A protein D hordozó meglepően alkalmas hordozóként kombinált oltóanyagokban, ahol több polrizacbarid-anfigént konjugálnuk. Mini ahogyan fent említettük, epitóp-szupresszió előfordulása valószínű, ha ugyanazt a hordozót alkalmazzák kúlönhőző poliszauh&rid-aaíigéöekhez, .A WO 9S/51359. számú nemzetközi közzétételi iratban olyan készítményekéi tárnak fel, amelyek m.rígkísériik minimalizálni ezt a zavaró hatást a készítményben lévő poliszachsrí.dok egy részének DT-h.ez, a maradéknak TT-bez való konjugálásával.
Meglepő módon úgy találtuk, hogy a préséin D külojsósen alkalmas az ilyen epi.tóp-Bznpressziés hatások mbslmalizálására kombinált oltóanyagokban. Egy koinbináctóhars egy vagy több pollsosaoharidot kedvezően protein D-bez kosbugálltotonk, és előnyösen az összes antigént protein D-hes konjugáJhapuk az ilyen kombinált oltóanyagokban.
Előnyös kombináció olyan oltóanyagot tartalmaz, amely AWsserin meírimpridri C és Y lés előnyösen A.) szerotípasa általi fertőzés elles nyúlt védelmet,, áltól Y és C lés legelőnyösebben A) szeroflpns egy vagy több polisz.aebarid-antigéaríéí protein D-hez kapcsolunk.
/dasmoptoms· fe/formam· poliszachariá-alapú olróanyagot (RRP konjogálva előnyösen TT-hez, DT-hez vagy CB.M 197-hez, vagv legelőnyösebben protein D-hez) is kiszerelhetünk a festi kombinált oltóanyagokkal.
Számos gyermekgyógyászati oltóanyagot kombinált oltóanyagként adnak be manapság, hogy csökkentsék a gyereknek adandó oltások számát. Ezért gyermekgyógyászati oltóanyagokhoz egyéb antigének is kiszerelheíők a taláhnátjy szerinti oltóanyagokkal. Például a találmány szerinti oltóanyagok kiszerelhetek, vagy külön, de egyldöbes beadhatók jól ismert trivaiess kombinált oltóanyagokkal, amelyek dihéría-toxidot. (DT). telanusztoxoidot (TT) és pertosszisz kouiponcnst ittpikösan detóxirikált pertasszísz-toxoídot (PTjj és toualas hemagghitínmí (FHA) tartalmaznak opcionális períacmnal (RRN) és/vagy agglutimnoel, példáid a kereskedelmi forgalomban kapható INFANTRÍX-DTPa™ {SmhhOueBeecham Rioiogícab), amely DT, TT, FT, FHA és PRN antigéneket tartalmaz, vagy egész sejtes perfosszísz kornjsmenssel, például a SmithKlmeBet-x;ham. Dlologfeals által forgalmazott Trlíanríx™. A kombhiált oltóanyag tartalmazhat más antigént is, mint például hepatitisz δ felszíni antigént (HbsAg), políovims-antígéneket (például inaktivált írivalens polío vírus - IPY), Aforecurifo ozzíámzéfl/ri kslsó membrán fehérjéket, nem tipizálható fíoemopá/foí fehérjéket, .Y.
«rtming-íridri B külső membrán fehérjéket, *β
- 16 Előnyős hAnazdb' aiifiarr&afíg fehérjsaníigéoek példái, amelyek kombinált oltóanyagban lehetnek: (kúlönősen középtdlgyulladás megelőzésére): OMEÍ86 [WO $7/41731. (Aníex) és WO 96/34968. számé nemaetkösi közzétételi hat (EMC)]; LbpA és LbpB [WO 98/5568$. számú nemzetközi közzétételi irat (PMC)]; TpbA és TpbS [WO $7/13785, és WO 97/32980. számú semzetközi közzétételi írat (EMC)]; CopB [Helmineu és mtsai. .ínfect. ítnntKt!, 61, 2803-2018. old, (1993)]; UspAl/2 [WO $3/93761. számé nemzetközi közzétételt irat (feniversity of Texas}]; és OmpCD·. Nem tipizálható /főemoptótis tntfiít’KzeM! antigének példái, amelyek kombinált oltóanyagban lehetnek (különösen középíUIgyulladás megelőzésére); fájásán fehérje [5 766 698. szánm amerikai egyesült államokbeli szabadakul irat (Ohio State Research Poanáarionjj és abból származó peptidek fúziói [például LBl(f) pspliáfósiók, 5 843 464. számé stoeriikai egyesük államokbeli szabadalmi irat (OSI/) vagy WO $9/64867. számú nemzetközi közzétételi iratig OME26 (WO $7/81638. számé nemzetközi közzétételi irat (Conees)}; P6 [EE 281 673, számú entöpai szabadalmi irat (State University of New York)]; TbpA és TbpB; Hís; fímwl.,2; Hnp; és 015,
A találmány tárgykörébe tartozó előnyös gyermekgyógyászati oltóanyagok: a) A’’. meRíngótoW C poliszseharid-ken^igto» éa βιιαίφ/ϋιβ ó poítecharid-kmsjugátum, opcionálisa·! X si&mísiíílis' A és/vagy Y poliszacharid-ktmjugáíunsnial, feltéve, hogy legalább egy jsokszacíxarid-antigén, és előnyösen az összes protein. D-hez van koajugálva.
fe) ,4:· a) pont szerinti oltóanyag, plasz DT, TY, pertnsszisz. komponens (eiőnyösen ET, FHA és PRN), hepatitisz R felszíni antigén és IPA (i&akiíváit írivaietis políovirus oltóanyag).
c) Ő'/rep/ocíX-'Of.a· pnettmoníae políszaclutrid-iurtigének protein D-hez konjugálva,
d) A c) pont szerinti oltóanyag, plusz egy vagy több Aforoe/Zn <?iífeíi??óitífe és/vagy aem tipizálható ffleemephÜus influenzcfe antigén.
Az összes fenti kombinált oltóanyagnak hasznára válhat protein D hordozókéin való alkalmazása. Nyilvánvalóan minél több hordozót alkalmazunk egy kombinált oltóanyagban (például epúőp-szupresszio elkerülésére), annál drágább és bonyolultabb & végsó oltóanyag, A kombinált oltóanyag összes poliszacharid-antigénjének, vagy többségüknek protein D-hez konjugálása tehát jelentős előnnyel j ár.
Tüdőgyulladás idős (55 év feletti) populációban és középfülgyulladás csecsemők és kisgyermekek körében történő megelőzésére a találmány előnyős megvalósítási módja a feltárt mnltlvaiens $n?píöcöceus p/wwontne pollszachmidok-prorein D konjugátusaokat Sfesptoeomís pftewtieRiae fehérjével, vagy annak ímmuncfóglaSag tuokcioiiálís ekvivalensével kombinálni. Lásd az ,A találmány szerinti pneusrsokokkusz fehérjék” szakaszt fent as előnyös fehérjékhez és fehérje kombinációkhoz, amelyeket ilyen kombinációkban alkalmszh&mok).
Emsék megfelelőét; a találmány tárgya immunogén készítmény, amely 5rre/?/o«?cc«.$' /wamomeu poliszaeharíd-protein D konjugátasnot és 5/re/«m:öce«s pveuw&fiíae fehétjeastígónt tartalmaz.
A találmány szerinti polis;md:<3rid-proiein D fconjugátmmk előnyösen adjuvánasal együtt szerepelnek a találmány szerinti oiíöauyag-kiszerelésekhen, Megfelelő adjuvánsok közé tartoznak alumínium-sók, mint például aiiunínsKSH-hkiroxjd gél (shrm) vagy alumimmn-toszfét, de kalcium, vas vagy cink sóit is sikahnazhatjnk, vagy acetílalt tírozín vagy aeetilálí cukrok, kaíionosas vagy anhsnosan srimiaztaM poliszachariáok vagy polifeszfazértek oldhatatlan ssuszpenzíósját.
Időskori oltóanyagok esetében előnyös, ha a kiválasztott adjuváns Th I -típusú válasz prefereneiális indnkálőszere.
»**♦
-17I'.h 1 -íídiavánsokról bővebben lásd az ,,A találmásy szerinti Th l -adjavánsok,, szákaszi..
A találmány egy további meg valósi tási módja szerint a találmány tárgya a feltárt ímmunogén vagy oltóanyag, gyógyászatban történő alkalmazásra.
z\ konjagátumot tartalmazó oltóanyag öíőáttifásárői és beadásáról bővebben lásd a fenti „A találmány szerinti pltóaayag-preparátnmók” szakaszt.
Protein D-ΐ előnyösen alkalmazzak középiulgyttiladás elleni oltóanyagban is. mivel önrnsgábas egy olyan iramunogón, amely képes S-sejiek által közvetíteti védelmei. kiváltani sctn tipizálható A’dcníopéíkö üh?í<esoce (atffi} etíen. Az ntHi eláraszthatja a gazdasejfeket, és elkerülheti a fehérjeantigén áhaí kiváltott, B-sejtek által közvetített hatásokat. Meglepő módon tatátok egy utat. & protein D ba-ásosságának növelésére (akár önmagábsn, akár hordozóként polissachariá számára· kőzéptitigyailadás elleni oltóanyag antigénjeként. Ezt úgy érttik el, hogy a protein D-i adjnvánssai -együtt adtuk be oly módos, hogy erős Thi-választ indukáltunk az alanyban oly mádon, hogy az nmunmndszer -sejt-közvéíiott ágának optimalizáltuk protein D ellen.. Ezt meglopó módos protein. D-í és Thl-adjuvánst (előnyösen SlAMPL-t) tartalmazó liotiíízálí.készítmény alkalmazásával értük el, antelyet röviddel beadás élőit rekonsíituátok. A találmány tárgyát képezik: tehát ilyen készítmények is, eljárás ilyen készítmények előálíitáslra (protein B-t és Thl-adjuvánst tartalmazó elegy lioftlizálásával), és ilyen készítmények alkalmazása. középfülgyulladás kezelésére.
’Fágabb értelemben elképzelhető, hogy irrmanogén liotiíízálása Th t -adjuváns (lásd az; „A találmány szerinti Thl-adjuvánsok” szakaszt), előnyösen 3Ö-.MPL jelenlétében általában fokozza az íxmmmogón éllem: immunválaszt. A találmány tehát alkalmazható bármifyen immunogénhez, amelyre erősebb Thl immunválasz szükséges, Ilyen immnsogének bakteriális, vitális és íumorns fehétie&ntigénefel, valamint sajátsnyag-elleni fehérjéket
SédáiSífeMLgááB
Az alábbi példákkal a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjak a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
1. példa
5. p»ewne»w! burnk-poltszaeharid.
z\ 1i-vafens oltőaxiyag-jelők tartalmazza az 1, 3, 4, 5, öB, 7F, §V, 14, ISC, 19F és 23.F szerotípusú bnrokponszacbartdokat, amelyeket lényegében az EP 72513. szórná európai szabadalmi írat feltárása alapján készítettünk el. Minden poljszachsridol a €DAP kémia alkalmazásával (WO 45/08348. számú rtemzeíközi közzétételi írat) aktiváltunk és módosítottnak, és a hordozófehérjéhez: kmjugálmnk. Az összes pohszscharidot natív formájában konjngáítiifc, kivéve a 3-as szerotípust (amelynek méretét csökkentettük: a viszkozitás csökkentésére).
A választott hordozőfehérje rekombináns protein D sem tipizálható .fíoemopö’/Mx /«/?;.«mzo.z-ből, E. ósdiban expresssáiva.
PROTEIN B EXPRESSZIÓJA á? íiífísopAí7«i5 ütjfiieíi&is? prötoíH B
Rrofeín B expres&dójátttEk genetikai konstrukciója Kiindulási anyagok * * jmtóstó D-r hhtófó ©A'á
A protein D nagyon konzervált a rf. toflumzae összes szsroiipusában és »iena tipizálható· törzseiben. A teljes -protein ©-gént kódoló DNS-saekvenciát tartalmazó pHrC348-voktert Dr A. Porsgreen-tö) (Department of Medícal Mícrobíology, Dníverssty of Ltrnd. Makaó General Hospital, Makaó, Sweefen} szereztük be. A protein © ©N5-swkv«eíáját Jamoa-és mtsai. [látóét kmuun. 59,119-125. old, 0991)) publikálták.
A P'WGI npprcssrjds vek&rr
A pMGl expressziős -vektor a pBR.322 (ötoss és mtsai., 1985) szánnazéka, amelybe λ-bakteriofág eredetű transzkripciós- és transzlációs szabályozóelemeket építettünk be (Scbaíztnan és mtsai,, 1983). Ezenfelül az smpleílhn rewztónciagéat'kanalaiéin rczisztetKÍagénre cseréltük ki.
AzAtíAÖE cfeíiífes
Az .AR58 A. co/f törzset N99 Pl-tággal való kmiszduk-clójávaí állítottuk elő, amelyet előzőleg SA500számazékon tenyésztettünk (galEzTNiO- lamhdaKil' ci85? ΔΗ1). .Az N99 és SA5ÖÖ· Dr. .Martin Rosenberg laboratóriumitól .(National kistt-fctíe of Health) származó £ coli törzsek,
A pM(SI expressziós rektor
A protein D termeléséhez a fehérjét kódoló DNS-tpMGl expressziós vektorba klónoztuk. Esen plazmád iambdafág ©NS-ből: származó szignálokat használ a beillesztett idegen: gének transzkripciójának és transzlációjárnák irányítására.. A vektor PL promótert, ÖL operátort és két hasznosítási helyet (NatL és NütR) tartalmaz a transzkripciós pol&riiási hatások enyhítésére N-fehésje alkalmazása esetén (Gross és mtsai., 1985). A PLprornótert tartalmazó vektor-okai Iizogén A, colt gazdába. juttatják -a plaznrid DNS stabilizálására. Lizogén gazdatörzsek repiikáció-híásyos l&nrbdafág: DNS-t tartalmaznak a genomba Integrálódva (Schatzma® ás mtsai., 1983), A kromoszómáiis lambdafág. DNS aanyitfa. a el reprosszorfehesje szintézisét, amely a vektor OL-represszoráhos kötődik és megakadályozza, az RNS-polúneráz kötődését a PL-promótethez, és ezáltal a beillesztett gén transzkripcióját. Az AR58 expressziós törzs ci-génje hőmérsékletre érzékeny mutánst tartalmaz, ily módon a PLiráoyhott transzkripciói hőmérséklet váltással szabályozhatjuk, -azaz & tenyészet .hőmérsékletének emelése íusktiválja a ropreszszorí és· az idegen fehérje szintézise megindul- Ezen expressziós rendszer lehetővé teszi idegen fehérjék szabályozott szintéziséi, különösen azokét, -amelyek toxikusaik lehetnek a sejt számára (Shimataka. és Roseofeerg, 1981).
Az A&S8 £, co/í törzs
A. protein D hordozó termelésére alkalma;® tt ÁS58 Iizogén A. coli törzs a szokványos N1H £. coli N99~es KI.2 törzs származéka (F su' galK2 lacZ thr'). Hibás Iizogén hnnbdafágot (g&lEzTNIÓ, iambdaKIF «Χ857 ΛΗ1) tartalmaz. A Ki-Γ fenotipus megakadályozza a gazda makroroolókma-sriatézisének kikapcsolását, A ¢857 mutáció a eí-represszor hőmérséklet-érzékeny zavarát okozza, A AH1 deléció eltávolítja a lambáatag jobboldali operosját és a gazda bio, uvr3 és ebi A iőkusz&ü, Az AR58 £. coó torzsot N99 Pl-Sggd való tr&nszduferiöjával áilttePrik elő, amelyet előzőleg SASOÖ-szárm&zéfcon tenyésztettünk (gttlEzTNlö, lamhdaKil c.1857 ΛΗ1). A. hibás Iizogén N99-be való beépítését tetracíkilBött- szelektáltuk a TNÍ O-írauszpozon jelenléte révén, amely teteacíklin-reziszteneiát kódol a szomszédos galb'géubett.
A pAf tJMDPPrD-reArof' An,«íszr«íAci<?/o
Az ínnnenzavírtjs sem szerkezeti SÍ-fehérjéjét ipMGNSI) kódoló gént tartalmazó pMGI -vektort alkalmaztak a pMGMDPPr© megkonstruálásához. A protein D~gént PCR-rel amplíítkáltak a píííC348-vektörbő) (Janson és xnís&L, 1991), az 5’ és 3' végeken sorrendben Nco 1 és Xfeaí restrikciós helyeket tartafeaző PCRláncuiáítökkal. Az Nco 1/Xba í ffagmensí ezután pMGNSl-lx: illesztettük be Νεο I és Xba I helyek közöd, így olyas fúziós fehérjéi hoztunk. létre, amely tartalmazza az Sl-febétje N-terminális 81. amínosava mögött a -protein D-t. Ezt s vektort pMGNSlPrD-aek jelöltük;
A font föltárt konstrukció alapján slíhoöuk elő a végső konstrukciót a protein D agressziójához. A •pMGNSlPrD-lJöl eltávolítottunk egy Bam Bí/Bans Hí fragmenst. Ez eltávolítja az KS1 kódoló régióját az Nterminális első három aminesava kivételével. A vektor religációját kővetően az alábbi N-ternánális aminosavszekvenciájú fúziós fehérjéi: kódoló géni álltfotíursk elő:
.......MDF SSHSSNMANT-------'.NSI protein D
A. protein. D nem tartalmaz vezető pepiidet vagy N-terminális eisztsint, amelyhez normálisan ílpiáek kapcsolódnak. Tehát a fehérje se sn exprcsszálodik a peripíazmábs, se nem módosul lípid-szátmazckká, hanem oldható- alakban a ehoplazníábiut roatad..
A végső mPG-MBPPrD konstrukciót az AR58- gazdatörzsbe juttattuk be hősokk révén 37’C-en. A piazmidot tartalmazó baktériumokat kananucin jdneiétébea szelektáltuk.. .A protein D-t tartalmazó- DNS-inzert jelenlétét az Izolált plazmid ÖNS kiválasztott endonukleázokk&i való emésztésével igazoltuk. A rekontblnáits Z coíí -törzset BCDá-sek nevezzük,
A protein D szpressziója a lambda PL-promóíer és OL-operátor szabályozása alatt áll. Az AR58 gazdatörzs hömérséklewbzékeny cí-géut tartalmaz, amely gátolja a lambda PL-röí való expressziét alacsonyt hőmérsékleten az ÖL-hez. való kötődés révén. Ha egyszer a hőmérsékletei tnegetneijük, e.1 felszabadul azOL-ről, és a protein D exptessaálóáát. A fermentálás végén a sejteket tőtnényíijük és fogyasztjuk.
Az összegyűjtött sejtek exúakeíóját és a- protein: D tisztítását az alábbiak szerint végeztük. A fagyasztott sejttenyészet-csapadékot fölolvasztottuk és újra foiszuszpendáhtA sejtfeltáró oldatban (eítrát-puífer, pH~ő.ö) OD650“őO értékre. A szuszpenziői kétszer átnyorutuk magasnyomású feomogenizátOKsn 1000 bar nyomással. A sejttenyészet homogefozáföttíát centrifogálással derheííük, és a sejltórmeléket szűréssel íáveh'teítuk el. Az első tisztítást lépésben a szőrt lizátumot fcsíloncseréiő krotnaíográfitls oszlopra (5? Őbpáarase Fart .Fföföí vutök föl, A Protein .15 ionos kölcsönhatással kötődik az oszloptölföthez, és az elúciös puffot ionerejéuek lépcsős emelésével eluálöáik.
Egy második tisztítási lépésben a szennyezéseket aaioneserélö kromatográfiás (t'5 Sepáörare Fasí Ffávvj tölteten tartottuk vissza, A Protein. 15 nem kötődik a tökeihez,, és az álfolyőbau összegyűjthető.
Mindkét kromatogrkűás lépésben a Sakdószedést ÖD alapján követtük. Az auloncserélő tíszlopkrnmatognifia kifolyóját, amely a tisztított protein D-t tartalmazza, altfaül'öáciőval tőménydmttűk,
A protein D-t tartalmazó ulírshltrátumot végül (1,2 gns-cs membránon szűrtük, £&»úk reakciók
Jkm-á/ári ds fepesofos’/ raske «iá;
Az aktiválási és kapcsolási körülmények specifikusak minden egyes polisaacbaridna. Ezeket az 1. láblázatbsa. adjuk meg. A natív pohsz&charklokat (kivéve a PSo-td) 2 M NaCl-bau vagy vízben oldottuk fel az iniekciözáshoz. Az optimális poliszachariá-koncenú'áciöi. az összes szerotípusra értékeltük..
«*** * X ♦ « » * * *»* * ·»
«... ; ♦„·
-201Ö0 mg/ml-es .acetonítriles törzsoidatből CDÁP-t (a CDAP/PS arány 0,75 mg/mg) adtunk a poliszáé handuldathuz. I-Ö5 perc elteltével 0,2 M trietílsmiat adtunk hozzá a specifikus aktiválási pH elérésére. A pobszaeharid aktiválását ezen a pfí-a végeztük, 2 percig 25’C-on. Protein D-i (a mennyiség a kezdeti PS/PD aránytól függ) adtunk aa aktivált. políszachariához, és a kapcsolási reakciót a specifikus pH-η végeztük 1 óráig. Ezután a reakciót giicinnel állítottuk le, 30 percig 25“C-oa és éjszakán keresztül 4’C-on.,
A kunjugátumókat gélszüréssei tisztitotük 0,2 M NaCl-lel ekvílíbált óepánm'/ 508818 gélszűrő oszlop alkalmazásávai.
Az ehxált frakciók szénhidrát- és fekétje-sartarását meghatároztuk. A konjugátumot tartalmazó frakciókat összelőttük, és sterilre szűrtük 0,22 pro-es sterilizáló menxbráaori. A. konjugátum preparátumok PS/febétje arányát meghatároztuk,
Jette&szés;
Minden konjagátümot jellemeztünk, és azok ráljesítették a 2. táblázatban leírt előírásokat. A poíiszacharidtartalmaí. (pg/rol) rezorcmol-teszttek a fehérjeíariahuat (pg/ml) Lnsvry-léle teszttel mértük. A kapott PS/febétje arányt (sv/w) a koncentrációk arányával határoztuk meg,
Jstezí'i&df»' (?íg//ígESjr
A pdiszaeharid aktiválása CDAP-vei eiauát-esoportoka; épít ki a poliszac'aaridon, és DMAP (4dimetílasífeí's-píridm) szabadul fel. A reziduális DM.AP-tartalmat specifikus, SB-nél kifejlesztett vizsgálati eljárással határoztuk meg.
Szabad políszacharid tartatom (%>;
A 4'C-os tárolt és ,37‘C-un 7 napig tartott kottjugálurook szabad políszacharid-taríaiasáí a íélűlüszóbóí határozták meg, amelyet α-PD ellenanyagokkal és· teliíeít anmróomm-szalrátíal való mkufeáíám'l, majd centrifagálással kaptunk.
A szabad pohszackariá meghatározásához n-FD/a-PS enzimes immunológiai vizsgálati eljárást íEElSA) alkalmaztunk. A konjugátum hiányát szintét! α-PD/ó-PS BUSA-val mértük. A szabad polxszaeharid mennyiségitek csökkenése javított konjugált oltóanyagot eredményez.
Antigénhaíás:
Ugyanezen kenjugátumok antígé&batását szeadvies-ELISA eljárással elemeztük, amelyben a befogó és detektáló ellenanyagok sorrendben u-PS és α-PD voltuk.
Szabad fehérje tartatom (%};
A „szabad” rezidoúlls protein D-t a minta SDS-keselésével járó eljárás alkalmazásával határoztak meg. A konjugátumot Í Ö percig melegítettük i 0G A7-on (1,1)9 SDS jelenlétében, és SEC-HPLC gélszürö oszlopra {HSAI aÖöö-FOí.) vittük fel. Mivel a protein D dírn.er, fennáll annak a kockázata, hogy túlbecsüljük a „szabad” protein D szintjét a szerkezet disszociációja miatt SDS hatására.
Möiefculamáret íAs„i;
molekulanséret meghatározása·: SEC-tíPLC gélszürö oszlopon i11SA' 5ík?ö-íUC¥ó) végeztük el.
Stabilitás:
A stabilitást S.EC-HPLC gélszürö oszlopon dóCö-EíkáX) mertük 4‘C-on tárolt és 37’C-au 7 napig tartod koojugátumokkal.
A 11 -valens oltóanyag jellemzését a 2, táblázatban adjuk meg, ♦ ♦•«Κ φφ φ * β φ * »%* φ «, * * X φφφ* * φφ φ
-21 A fehérje4ceajugámm«kat sítomisium-töszíatm adszorbeálhaíjuk és ősszeöníhetjök a kész oitöai’yag kialakbásáijoz.
Következtetések:
ímnmnogén konjagáhanokat állítottunk elő, amelyekről azóta bebizonyosodoö, hogy egy ígéretes oltóanyag kompommá. Feltártuk a. legjobb minőségű konjugált gwumokokkusz késztermékhez az optimalizált O&F-könőtaényeket mind a I 1 komponens esetében. A testi javított (optimalizált) CDAP-eljárássni kapható pnennsokokkusz polímcharíá-konjagátumók {iuggettöndi a feordözófehérjétóí, de előnyösen protein B-vel) tehát a iaiáteáay további megvalósítási módiéi képezik,
2. példa - Javított atijneánsek hatásának tanulmányozása a H-v&tos pnemmekekkusz FS-PÖ koajwgáít oltóanyag bamaeogenítására paíháoycseesemókben
Patkánycseesemöket immuttizáítok a 1 l-valens pnemnokokkusz: FS-PD· oltóanyaggal, minden egyes (az. I. példa eljárása szentit előállított) poliszacharid 0,1 ng~os dózisával, és az alábbi adjuvfeis-kiszereíésseí: semmi, A1FO4, 3D-MPL, 3.B-MFL A!POron.
Az. egyedül 3D-MPL-Í tartalmazó kiszerelés statisztikusan (és meglepő módon) űrnnnnogénebb volt flegnagyobb GMC IgG), mist a többi kiszerelések 11-fedi 5 antigénre. Ez igaz vöt mind magas, mind alacsony 3.D•MPL-koacantrácíókra.
Az opszosofagociíózis megerősítette a CMC -eredményeket.
Anyagok és eljárások /»í??í«eizáÓ?5Í tdzdrás
Különböző anyától származó, véletlenszerbe» választott csecsemő OFA patkányokat 7 napos korban immunizáltönk elsődleges oltással. Két további megerősítő tiltást adtunk 14 és 2S nappal később. Az 56. napon vért vettünk (2S nappal a 3. oltást kővetően). Minden oltóanyagot sznhkután adtunk be, és oltóanyag-csoportonként 10 patkányt alkalmaztunk.
A patkányokat 11-váltass pneumokckkusz konjugált oltóanyaggal Immmtizáhnk, amely az alábbi poliszachariti szerotipusokat tartalmazta protein D-re konjugáiva: l, 3, 4, 5,6B, 7F, $V, 14, ISO, 19F és 23E áSseePiSíés
A kölőabözö javított adjnváasók hatásnak tanulmányozására a konjugálás dózisát állandó szinten tartottuk, ö,í ag minden poliszaobandból, és a?; AIFO4 és 3D-MPL adjuvánsokat különböző dózisokban és kombinációkba» szereltük ki, beleértve as adjuváns nélküli esetet is. Ezeket a 3, táblázatban soroljuk fel referenciaként sorszámozva.
Adszorpcóí AZPÖ^-rn
A koncentrált, abszorbeált naon&vaíenseket az alábbi eljárás szerint állítottak elő: Sö ng ΑΙΡΟ-rOt (plfe-5,1) kevertünk 5 gg konjugálí jxdiszaebariddal 2 órán keresztül, A pfí-t 5,1-re állítottuk be, és az elegyet további: 16 órán. ál hagytok. 1500 mM 'NaCl-t adtunk az eíegyhez a sókoscentráolő iád mM-ra való beállításához. 5 pere múlva 5 mg/ml 2-fenoxfeíanolt adtok az eíegyhez. További 3d perc elteltével a pkí-t 6,1-re élíítottak be, és több mint három napig hagytok 4-X-on.
OWszéreA eí&álfftáse
Három oldószert állítottunk elő i 50 mM NaCt/5 mg/ml fenoxleianolhan,
A: 1 mg/ml AIPO4 * « ο » i * **« < ,
- 22 B: 3D-MTB, AtPO4-cn, sorrendben 250 és ÍÖÖöggónt, tömegarány S;2ö
C: 3D-MPL AlPíC-on, sorrendben S61 és I00ö pg/snl, tömegarány 50:$9
MshMt H-ra&fts e/öéö&ifea
A H koncentrált, abszorbeált PS-PD monovalensí a helyes arányokban összekevertüL. Az A1PÖ<idegészílőst az A jéíö oldószerként adtak. Ahol szükséges, 3D-MPL~t vagy vizes oldalként (nem adszorheált, alábbi 1. át), vagy B vagy C jelt: oldószerként (3Ö-MPI.. ÁJPO^on arszorbeátva 2 dózisban, alábbi 2, út) adtak az elsgyhez, .·?, dí
A kombinált adszorbeáit ktatjagátutnokhoz vizes oldatként adtuk a SD-MPL-t, 10 percig kevertük a tlvalens eleggyeí és 4’C-on tároltak beadásig.
2. dr
3B-MPI.-t elöadszorbeáltuk AJPQj-rat a kombinált abszorbeált koojngátutnokboz történő hozzáadás előtt (B és € jelű oldószer), 1 mi oldószer előállításához 3D-MPL vizes szuszpenzióját (250 vagy 561 pg) 1 tng AlPO^-tal (150 aM NaCl-ban, pH-ö,3) kevertük 5 percig szobabotnérséklcten. Ezt az oldatot blgitottok NaCl pB~bs Víenoxietanohah és ínkubáltuk éjszakán át CC-oo,
Nem aószerbeáU 22~vatefts o&Asnyag o/ádí/Aásn
A tizenegy PS-PD kortjugátumot a megleíelö arányokban kevertük és 150 siM NaCl, pBfeó, 1 denoxíetanol puífereel hígítottuk. Ahol szükséges, 3D-MPL-Í adít-nk az oldathoz (nem abszorbeált).
Az összes oltáshoz szükséges kiszerelései 18 nappal az első beadás előtt készítettük el.
Ε/../ΛΜ
BUSA eljárást végeztünk a patkány IgG mérésére (az BUSA eljárás végzésére vonatta» WHO Munkaértekezlet szerinti eljárás alkalmazásával) Strsptecőccus· pveiemmiae burok-poliszackaridiai elleni IgGelíenanyagok mennyiségének meghatározására szérumban. Lényegében a mikroamrletsezt közvetlenül vontuk be dsziltoö burok-poliszaeharídd&l. A ssérnamüntákat előiskabálmk az összes paeumokokkuszbtm közös sejtfal poliszaeharidddsl (G-anyag), and az BP 72513 Bl. szánul európai szabadalmi írat (ellátása szerint tisztított pnensnokokknsz pohszaeharidbsn körülbelül 05%-ban jelen van. Jaekson Ijmmmolaboratones Ine.-töl származó reagenseké; alkalmaztunk a kötött egér IgG detektálására. A íitrálási görbéket belső standardokhoz viszonyítottak {monoklonális ellenanyagok) íog-íog egyenlettel modeliezve. A számitásokat So/Wax Pro szoftvered végeztük. Ezen eredmények maximális abszolút, hibája várhatóan egy 2-es faktoron belül van, z\ relatív hiba kisebb, mint 3öAk öpszoao/egoeiídzás·
Az opszonikes litereket a 3, 6B, 7E 14, 19E és 23.F szerodpusokra határoztunk meg a CQC-eljárás; (,5nrepíocooetö’ psesmosw Opsonephagoeyttssís usíng Difiereatísted BL60 eells, version Id”) alkalmazásával, tisztított emberi PMN-neí és nydfcsecsetnö komplementtel. Módosításként házilag előállított pnemm>k».kkKsz-tö.tzseket alkalmaztunk, és a fagecitáló Hí,őö-sojtokot tisztított emberi netüroíil PMN-nel (nagymértékű korreláció van e két (ágotítáló sejt között) helyettesítettük. Ezenfelül 3 tnrn-es üveggyöíjgyöket adtunk a mikroiiíerlsmezekhsz a keverés növelésére, és ez lehetővé tette a fiigocltafeaktérmm arány csökkentését, aminok az. ajánlott értéke 4Ö0 volt.
* « 4 * Φ * ♦ »*·** *
- 23fedménygk
Ig&kőticetttráciék
A míndea szerotípusra ás FD-se meghatározott ígG-korsecntrácíók geoaicüilcus átlagát 4-1Ö. táblázatokban mutatjuk be. A 68, 14, 19F és 23F szeroüpusra a korábbi íetravaleas kiszereléssel kapott eredményeket isbersutapnk összebasonbtásképpen.
A legmagasabb IgG-koncentrác iókat kiemeltük a 4~íö. táblázatokban. A statisztikai ρ-énékekei a 3D-MPL és SD-MH/AlKb készítmények között a-11. táblásaiban mutatjuk be. A 4, adjuváas-ksszerelés (nem adszorbeált konjugátomok xnagas dózisa SD-MPL-vel) adja a legmagasabb GMC-értéfcet l 1-ből 9 esetben. 1 l-bői 5 esetben az alacsony dózisú MPI, a második leginrínunogésébb kiszerelés. Ezenfelül az adjuváns alkalmazása magasabb GMC-értéket ad, mint a szeronpusók dózisának módosítása (adatokat ut közlőnk), és ez statisztikusan szignifikáns a 4, 6B, 7F, 18C és 23F szerotípusokra (p<0,ü5 95%-os koaSdeaeia-mtervallummal).
{?/tsso«0j5^ecííózfe
Az összeöntötí szérumok öpszonofagocitozis eredményeit a 3,6B, 7.F, 14,19F és 23F szerotípusokra a 4-8, táblázatokban mutatjuk be. A legtöbb esetben ezen opszmnkus Éterek alátámasztják a GMC IgG-éríéket. Valóban, az IgG-koncentaícióval való korreláció nagyobb, mint 85% a őB, 19F és 23F szeroiipusra (adatokat sem közlünk). A 3-as szerotlpus esetén fontos megjegyeznünk, hogy csak a 3D-MPL-csopo« váltott ki küszöbérték feletti opszóaíkas aktivitást.
Kfete&E&sk
Ebben a kisérletbeu váratlan volt, hogy a 2D-M:PL egyedüli alkalmazása váltja ki a legmagasabb IgGkottcenírációt.
Az adjuváns változtatásával kapott maximális GMC Igö-ertéket összehasonlítottuk a FS~dözis módosításával kapott maximális GMG IgG-ériékkel, és azt találtuk, hogy a 3D-MFL szignifikánsan magasabb választ vált ki 11-böI 5 szerotipussak
Ali. táblázatban a 3D-MPL és SD-MFL/AiPCh készítmények összehasonlítását mufaíínk be (a kiszerelési eljárást és a 3D-MPL dózisát hasonlítjuk össze), a poliszaebarid-koajugátumok közül 5 szignifikánsan javult az immmcgcaitás tekintetében, amikor csak 30-MPL-leí volt kiszerelve, 3D-MPL és AlPCfi helyett: PS 4, ?S 6B, PS 18C,PS 19FésPS.23E.
3, példa - A kombináció batásáa&fc tanulmányozása FS4, PSŐB, PS ÍSC, PS I9F és FS23F knnjtígáiuxstok ímmnnogeKÍtására felnőtt patkányokban
Felsőit patkányokat immunizáltunk pneumckobkusz: potiszaehariö-píoiein D korsfeáh oltóanyagokkal vagy ladön-külöu, vagy -kombinálva multivaiens készítményben (tótra-, penta-, bepia- és dekavafens). Padcáayok tizes csoportjait immumzáhuk kétszer 28 nap különbséggel, és vért vettünk a 28. és 42. napon (14 nappal a második dózis irtán).
A szérumokat ELÍSA-vat teszteltük pnemokokkusz poliszacharlöok elleni ígö-eíleaanyagokta. Minden kenjugáíum specifikus Igö-elleaanyag termelését váltotta ki az ELÍSA-vté való mérés alapján. A 12. táblázatban a monevafens PS 6S, PS I8C, PS 19F és FS 23F protein £>-teijagtota<át kombinálásának a hatását mutatjuk he azok ínummogertkására felnőtt patkányokban, az IgG-koncentráció mérése alapján 14 nappal a 2. dózis atáu.
♦ ♦ « « XX n > ♦ * <·♦
-24Minden snintá» statisztikai elemzési végeztünk annak nseghatározásár, hogy a kombináció nyomán· kialakult eUesanyag-koneentrécíó különbségek szignifíkánsak-e. A PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F protein Dkonjugátonok bármelyikének kíanbináiáss sem változtatta meg szignifikánsan azok itnntntnigeeitását.
1. táblázat: áfc PS-protein 8 konjngátnnsok specifikus aktiválási, konjngáláss és reakciók'ábstásí körülményei
Szerotípus 1 3 4 5 ÓB 7P
PS kosé. üng/ntl} 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
PS oldat 2M NaCl 2M NaCi H?.O h2o 2M NaCÍ 2MNaCl
PD konc. tángíOíi) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Kezded PS/PB arány (w/w) 1/1 t/l 1/1 1/1 1/1 1/1
CDAF konc, (nsg/ssg PS) 0,75 0.75 0/75 0,75 0,75 0,75
plVpíVpii; 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9
Szerotspns 9V 14 1SC 1<ÍF 23F
PS konc, <rng/«nt) 2,5 X.v? 2,0 4,0 3,3
PS oldat 2M NaCl 2M NaCÍ h2o 2M NaCl 2M NaCl
PB konc, (mg/nd) 5,0 5,0 5,0 5,0 5.0
Kezdeti PS/PD arány (w/sv) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
CDAP konc. (tng/mg PS) 0,75 0,75 0,75 9,75 0,75
piVp'Sfe/pKi 8,5/8,5/9 9/9/9 9/9/9 10/9,5/9 9/9/9
Kritm» 9filPDJ227 MBÍ D4TOJ22S 8$í©5 M
»érj««y 11.89 iw 1M w
« $ 1 ? 9 3
SzaM fehérje W:í1«(%) <15% $ : <1 19 21 *
X71* 81 w u
MefctafeW ώ 813 ........ 8,12 811 813
Stabilitás Midi mdt urait iM<á OTÉ
Méri» ÖWÍ25 ÍIB B1M1 ΒΪΪΜ2Ϊ BiíM« 823108212
WíÍaUUj, u«. n«rj£ &8 aay : 1O W8 1018 a,82 W5 t,?4
&íttFS«te(‘4) « í <1 «? 4 4 9
SaWfefejíirttepl) « ,9 8,3 3 2 18 12
M tartói (í^K) <WS 81 8,5 81 32 91 82
»WíwI« 814 8,14 81? 8,13 812 812
»«ás teli mi eai wáí mát mái
,* »χ« ♦ X ♦ * χχ « « '♦ * * 4 * * ν « * * » * * »* *
3·. táblázat; A tl-v&lens pamjtíjmk&kkasz FS-PB-vel patkássyeseösemŐkbeia teszteb adjuváns kiszerelések
Csoport AíPCb MFC j Eljárás Lenás
Semmi
100 A1PO4
3 5 MPL alacsony
4 50 MPL magas
§ 100 $ 1 át 1. út alacsony
6 100 50 i. út I. út magas
7 IC>0 5 2 út 2 át alacsony
8 100 50 2 ót 2 út magas
>7 ύΐ *
Csöjxjrí ®0( MPL g Ep SIC 2$ W Séfemé OpMikKte «€%£ »Μ) C< ZÍO Cpsfesiia
Tmvaleas Μ
ί 0,047 2® 12,5 8,804 1(20 . . Ο
2 3,«2 4Π0 65 0,01? 4® <6,25
3 5 «5 Γο 5
4 58 Ö 10’
5 ί ί» 5 ΐ ά : 8,842 W <6,25
Μ 50 ί 6,265 ΜΙ <6,25
7 iöü 5 2 0,033 3(10 < 0« 0® <25
1 Β 50 2 ................................. 0,057 ö <25 .............................
Csowi «1, 00 M?L s Ep SMEP W»l Szcwkonvcrzii) öp«h titer iiP) Szmsro öpsota liter
ttavfe ll-vásis í
0M 3® 04 3,022 3:10 <6,25
2 100 0,99 18:10 SS 0,231 1 <® 2?
5 5 (1,233 | sö® 43
4 Sö 0,878 10(10 8
: 5 1(4) 5 5 0,480 : ^ΐθ 62
:...........0' ' 100 50 1 0,47: 10® 98
JL
Csapat s f'S Hj» «&β..... (®Μ) 1 SzefífawÍö i ! Opszoiystte öMCIjö Szerobvensó ......................^0^.0 öpszonibfe
7 100 o | 1» « w ö
§ w i ................... J*. k........Κ<«^«Λ^Λ*ΛΛ^ύ .............7............................************* Ϊ 1,611 ffl ............
Csoport ÁW4 »:l Srafonwzió ....................................ί Opehtfe SMGlgÖ illái) 1 Szefokosvmió Öpoeth,
Tetíavate Mas
30 0,621 MO <5
2 w 10? : 900 36? 0,223 w ?9
3 5 o ®0 296
4 a ........................... 21,411 » 1276
5 íii!) 5 I w »10 ®
6 109 » 2 2,818 iW 200
Λ ISO 5 1, X. 1® L iw 193 0,766 «8 323
s 200 50 7 h 2,3? Mtt 241
Csoport Oj MFC 9? Eljárás C«lí>G W Sotavrió öpíjzws te «1?G fe«í $ZvK)XÖSV$$ö Qmabröcr
2 195 0,29 18119 28 is ö e
3 5 W 9/a 389
4 59 w »119 >1«
5 W i 1 ÖÍ62 1?
£ 109 59 . 1 9,835 8118 ?4
: 1 .................... 100 5 ) ,Λ» O 16% 425 9,223 i% 18
I iÖÍ! 59 '7 w 2,591 3119 43
Csoport AKij .4 MFC g DVA.Á* fcjjaía^ ÖMCIgG j ígsl) Szorokonverzió Qp«tetÍH βΜφ (pH ferokwm Öpszcafcte
3 2F
i 8,® 1119 ' 425 0,949 2115 425
109 9,203 $% 425 9,25 3112 43
3 5 p 1Ö <4,25 2,435 » 42?
4 59 8,88 1Ö 8 w ®8 332
5 » 5 1 0,015 16% 425 9,539 1Ö $4
£ 1« 52 3 5,522 19219 425 5,811 9112 5?
2 1» 5 2. !W 19110 425 9,154 8119 39
8 ffi 59 2,534 15115 425 w 9218 140
*««♦ *
»ο
Csoport i ffi, B Ujűií» ÖMC$ W< S&eAmó CÖCígG Szeriwziö ü Aví! StiZll1
’
1 0,626 O «,«5 : 636 0,840 386
) « 0,252 Oi 8,652 5.06 6,774 868
3 5 w tíB 3,452 fi 7,827............. W9
4 58 '!,'!« M 7,1® » ip «10 1
; 5 li 5 í W 10/W 6,676 }Ö 3,815 1838
6 w s i w 16718 0,418 688 5,755 1888
7 106 5 0 6,475 1686 0,267 Íi W 1638
S 108 50 l 1 LS: i 16716 8,423 _ ; W 5,668 1688 í
Obifa
tb
Csoport ’ AB 81 i MH, 3? * ösei?ö Wí j Sziwkonvra.) 6W fe«} Sotevdö GMClgG A’-' had
w í> c proteD
í : 0,GK i 538 3,613 tóö 8,883 8?» 1
2 1® 6,438 «6 8,852 5716 8,683 16716
3 5 0,452 788 6,M 187« 3,345 1836
4 i $0 31,421 1« 14,823 16« 5,446 18718
5 i® 5 1 2,133 «5 6,680 18718 11,487 Í8
6 > 188 $0 I 2,53 1688 1,771 1688 113 1838 ΐ™...................................
•31-
Csoport Α», 83 »L κ Apás iei$ «ώ) STOifaverztö GMeigfi Szcrota'vvfZió ÖMCÍgG Wt SzwkonvCTÓ
1 α 5 2 15« W/1Ö na Wtó 1,665 86
8 ω 58 2 W w w 1335 w itó
fewtípis 55ig3D'Mft-3Wffi2AlfÖí 5pg3D«L--3D>U.«).(
Lót hit Ui Ilii :
ΐ 9,3 8,85 ® 0,11
3 6,325 9,21
4 0,932 (« 8j82 0,883
3 9,94 0,802 L §,t 3,12
a 6,881 0,01 9,531 0,6866
?F «3 : 0,15 0,61 9,905
8¥ 0>02 0,02 8,1 6,«
H «5 5,21 : 8,3 0,66
18C 0,8088 0,3962 3,386 8,094
íff 8« 8,356 821 9Í
23F 0,062 3,3(fi 9,51 0,0894
« ί ΦΦ ♦ ♦ X χ > ♦
Φ
Φί Φ X ί XX
XXX ♦ ♦ 4 4 X X ♦
♦ ♦♦Φ X φφχ ♦ *
- 32 13. táblázat: Geometrikus IgG átlagkoneestráeibk (pg/ml) 1.4 nssppai felnőtt patkányok 2. immunizálását kővetően, 1,0 pg pní&zacharid-prnteitt ö konjugáfum alkalmazásával egyedül vagy kumblaálvs, íetrav&tens, pentovafens, heptavateas vagy dekavalens oltóanyagban- Az adatok 5 külenátlő 'kísérlet knmbteált eredményei.
Szerotlpas 4 óB 18C 1SF 23F
Oltóanyag H T H T T
Egyedül 9,3 0,11 15 5,3 2,5
Kombinálva 4 8,23 3,7 3,7 2.,8
T: Kombinálva tetravaiems <T) (PS 6B, 14.19F, 23P), pentavates (T plusz PS 3), heptavaletts (Η) (T plusz ES 4,9V és IbC), és dekavalens (El plusz: PS 1, 5 és 7P) konjbninálí oltóanyagban, H: Kombinálva hepfavaiens (Η) (T plusz PS 4, 9V és 1 8C), és dekavalens (H plusz PS l, 5 és 7E) kombinált oltóanyagban.
4. példa - Paeaxaelhtineek és 30-MPL-nek a PD-konjwgáb: íl-valeas pobszacfesrid-oltóanyagbox történő hozzáadásának a jótékony Itatása paennjökokktmos iOdó-kötomzádá ellen egérben m erőgA~
PfíRíímofem-speeí/íkiiS szérum égő EX/&4 e&gefa
Maxísnry Ntme mlkrotiterkanesekeí vontunk be 2 órán keresztül 37“C-on, I8Ö gg/otóröhely 2 pgánl koncentrációjú, PBS-ben hígított rekembiaám natív pneumolízinoei (PEV), A lemezeket háromszor mostak 0,9% NaCI, 0,05%· Tween-20 puí&rrel. Azután anií-PLY reícmmciaszérum kétszeres hisitási sorozatát {PBS/8,05% Tween-20 pofeferben, 100 ui/utetnhely) adtok a lemezekhez standard görbeként (570 ag/mí IgG-vel kezdve), és szzhtimmmt:ái.at (I/IO-szeres hígítástól kezdve) hiktíbálínnk 3-0 percig 28’C-ou rázás mellett .A fend módon való mosás atáa PBS/0,05% Tween-2ö paiférfeen áQOO-szeresre hígított (300 nl/mérőhely) peroxidázza! konjugált kecske aríti-egér-IgG-t (Jacksoa) mkubáiirmk 30 percig 2öC-en rázás melleit Mosás után a lemezeked 15 percig inkobáltuk szobabémérsekletet; 180 piánéroheiy ksoutató pafferel (0,4 mg/ml OPDA és 8,85% H-O- ICO mM cibátpuffetben, pH-4,5), A kimutatást 50 uVmérőfeely 1 19 1-ICi hozzáadásával áHitoUuk le. Az optikai deozitásokat fim áKWwresásr (Moiecoiar Devices) alkalmazásával olvastak le 498 és 520 ma-eu. Az ellenítnyag-üfert ó-paraméteres matematikai eljárásssl számítottak SufíMax Pr& szoftver alkalmazásával.
Ezt a vizsgálati eljárást a szérum dleaattyagek azon képességesek mérésére végeztük, hogy gátolják a pnetsmohzin (PLY') hemoiítíkus aktivitását. A koleszterin (ami fogékony a PLY-vel való kölcsönhatásra) ehávolításám a szsirommintákaí kétszer kezeltük az alábbi módon: azonos térfogatú kloroformmal keverték azokat, majd 45 percig inkabsltuk rázás mellett. A felülászókat 10 perc, 1800 rpm ceatrifogáíás után összegyűjtöttük. A koleszterínmentes szérumokat hígítottuk (kétszeres sorozathígítás 1 mM ditiotreitol, 0,0154. BSA, 15 mM Trís, 150 mM NaCJ, pEb-7,5 püffedjen) 96-mérőhelyes mikrofíterlemezen (Nunc). 50 pl, 4 HU (hemoiízis egység) PLY-t tartohnazö oldatot adtuk minden mérőhelyhez, és 15 percig mkubáltak 37C-om Azután I'00 μί juh vőrosvértestei í 1%-os oldat) adtunk a lemezekhez 30 percig 37€-om 1Ö pere, 1:008 rpm eentrifúgálást követően: a felálúszókat (150 pl) összegyűjtöttük és· egy másik 96-meröhelyes raíkrofltűrtetnezre tettük az optikai deirziíás leolvasásához 405 nia-en. Áz eredményeket felezőpont; higitási ikerben fejeztük ki.
* ♦* ♦ * φ ♦ »** X Φ » * χ««« »6 X
Rekombináns natív pmaa<üímt (PLY) dtslizálíuak 5ö «iM foszfát. 500 mM NáCl, oH~?,6 pallértól szemben, As összes kővetkező lépést 39,.5* l * * *'C-or; hajtottak végre epízódszerü keverés mellett. .Az első napon 10% T\veen-8ö (1/250 v/v), 57,4 mM N-scetyl-foptofáa (l/3öö: v/vt p.H-'-7,6, 2,2 M glicin foszfát pufferben (1/109 v/vi, és 10%· íbnualdehtd foszfát pufferben (3/100 v/v) eiegyet adtunk a PLY-old&tboB, A 2. és 3. napon megint 10% formaldehid-oldatot adtunk, sorrendben 3/100; v/v és 2/100 v/v arányban.. A 3-7’C-on történő iukubálást a 7, napig folytattak, epizödszeru keverés mellett. Végezetül-a PLY-i 50. ®M foszfát, 5ÖÖ mMNaCi, pH~7,ö ptrfferreí szemben dializátak. A PLY teljes inaktiválását a hemoüzíses vizsgálati eljárással demonstráltuk.
Hét hetes nőstény OR -egereket mtranazálisttn oltottunk érzéstelenítés alatt 5>:.i05 CPO egérbez-adaptsk őB-s szerotipusú 5. p:na«?»o«foe-vsl, A tüdőket b órával a fertőzés után: ehávolhottssk és homogenizáltuk (thtramax, 2.4000 rpm, 4C-mt) Poí/d-.femytt/.l/f'í.’íh (THB, Gibeo)- tápoldatban. A Wdöfeomogemzátumok tízszeres. scvozathlgltását tenyésztettük 3?T'~an éjszakán keresztül, éíesrlökívonattal kiegészített THB-agart. tartalmazó Fetrscsészékea, A poeumokokkuszos ttidőfertözést CPWegér egységben határoztak meg, logaritmikus súlyozott átlagként. A kimutatási határ 2,14 fog CPV/egérvolt
4/A példa ΰΌ-Λ/ΤΥ ad/imte «vidra uítti-pymwmo/szút /«wwwátezra
Ebben a példában a 3D-MFL adjuváns alkalmazásának hatását értékeltük a natív rekoutbinátrs pueutuolizinre (ΡΙ..Ύ, 1 Patoa, Chddren’s Hespiíal, Nofíh Adelaide.. Australia), és kémiai úton deíoxiftfcált változatára (DPLY) adott immunválaszra. Á kémiai deíoxslrfcálsát a fenti módos hajtottuk végre.
Hat hetes nőstény Am’ő/C-egerek bses csoportjait ímkamtsszktthúíxan immunizáltunk a 0., 14, ős 21, napon pg PLY-vel vagy DPLY-vel, amely vagy A: 1ÖÖ p.g ,AiPO<-e$, vagy B: 100 gg A1PO4 plusz 5 pg 3.D-M.PL-t (3de-O-acetíláli-monofoszforil lipid A, fóibi Immunodsem) tartalmazott. Az 1A és IB ábrás a 3. oltást követő BUSA ígG- és hmriolmís-gáilási étereket mutatjuk be.
Akármelyik antigéned is, a legjobb immunválaszt a 3'D-MPL-lel kiegészített kiszerelésekkel immunizált állatokban kaptuk. Érdekes módón a DPLY ttgytutartnyira volt immuaegén mint a PLY, ha .AlPO4/3D-MPL-iel együtt adtuk be, és gyengébb iuummogéu volt az AlPO<-kiszereléshen,. Ez mutatta a 3D-MPL előnyös képessegét a detoxsfikált pneumolmn eltel ellenanyag-válasz javítására,
Pneumeíixint tartalmazó készítményekben előnyösebb lehet a kémiai úton detoxífikálí paeumolizin alkalmazása, mint mutációval deteíSkátt pneamotósé. Ennek az az oka, hogy az eddig kapott detoxiiskált mutánsoknak még van reziduális toxiaaktivitása, de a kémiai úton deíttxifikáit pneumolízismek nincs. Yefeáí általában a találmány egy másik megvalósítási módjának számit kémiai úton deíexiilkáli pseumolíziat (vagy paeumolízinmtttánsí) í&rtalíuaxó készítmény, oltőarsyagbars történő alkalmazásra, amennyiben Thl-adjuvánssai, előnyösen 3'D-MPL-iel együtt adjuk be. ilyen készítmények a találmány tárgyát képezik. A kémiai -útoa detoxlfikált pseumollzm ellem iwswte növelésére szolgáló eljárás, amely Thl-adjaváns (előnyőse» 3D-MFI.) készítményhez való adását tartalmazza, szintén elképzelhető.
4/B példa .Psetuntt/úfo: fogyeagíte w/íte és AÖ-AííY ttd/wvmw Áezzátáásámk yóréknyy teása a EDA'nrybgúíí //-wteí /wífftsőckartd-oZfoa^ag vA/o teásöSsa^óM $3 wejijpwía/ /«tewezáZá'a» fert&eöfi ÖPT-egefvvpttewofeíáfeísrött rteíMíwád/áriítej ♦ ♦ ’ 34 Ebben & példában íí 1 l-v&tens pulísKactetriá-protete D konjugátumot, legyengített mutáns pneumaiizmazüigént t'Pdö, WÖ 90/0695 L száma aetnzzítk.őzi közzételeh test), és AÍPQ* és 3D-MPE adjutánsokat tartalmazó -oltóanyag proElektikas hatékonyságát értékeltük, összehasonlítva a klasszikus ÁlTO«-adsSK>fbeáU 1I-valens poliszaclwíd-pxotein D-konjugáhtm kiszereléssel.
Négy kétes nőstény öP'Aegerek 12-es csoportjait sznhkutáo immunizáltunk a 0. és 14. import az alábbi kiszerelésekkek A: $0 pg AlPCfi; B; szerotípasonkéní ö.l gg PS-t tartalmazó il-valesus protein D-konjugált pobszaehítriá-olíóanyag v 50 pg AlPCfi; vagy C: szerotípusonként 0,1 ng PS-t. imtahnazó ii-vuleus protein Dkonjugált pohszacbmid-ohótínyag 10 gg PdS (3. Eaton, ChtkfeeB’s Hospilal, Noríh AtfcWe, Aastraha) ·*· 50 pg AlPCfe ·*· 5 gg 3D-MPt (Bibi Itstmmochem). A fert&üést a 21. napon végeztük a fenti leírás szerint.
Mint ahogy az IC ábrán bemutatjuk, a PdB-vei és AÍPÖ4 + MPL-ld kiegészített 11-valens poliszacharidkorsfegátem oltóanyag nagyon szignifikáns (p<b,bö?) védelmet oyájt-oö fa fekete téglalapok matatják az aritmetikai átlagot}. Ezzel elleniéiben a 11-valeus peliszacharid-konjtigátum. oltóanyag i ÁlPCfe kiszereléssel immunizált állatokban nem figyeltünk meg szignifikáns védelmet. Ez az eredmény bebizonyította, hogy a pneumolízinaniigén (még a legyengítetté is) és a 3D-MPL adjuváns. hozzáadása javította a Il-vaiens poliszaehnridkenjugáíum. oltóanyag hatásosságát tüdőgyulladás ellen.
4/C példa /1 4P pékkibnn bemxíatatt védetem «»mw?/óg/eí íseg/bfe/m
A 4Ö példában nyájtok, legyengített mutáns -paeumofa'aael (PáB) és 3D-MPE~iel kiegészítek 11 -vatens poHszacharid-konjngámm oltóanyag általi védetem immunológiai megfelelőinek megállapítása érdekében megmértük a fertőzés előtti, őS poliszacbaridra és PdB-re adott szerolögíai ellenanyag-válaszokat & lenti leírás szerint.
Azután: az ellenanyag-titereket a megfelelő állatok fertőzés után 6 órával begyűjtött tüdejében mért baktérimm-kölőnísszámokhoz hasonlítotínk. Az: R'-értékeket logdog lineáris regresszióval számítottuk,
A számítolt R~-értékek sorrendijén és 0,02 voltak snti-PdB és anti-6B ellenanyag-válaszokra. Ez a korreláció hiányát mutatta a hmuorális mmmnváíssz és a védelem között mindkét antigénre. Az anli-őB ellenanyag-literek nem voltak szígölfikánssn különbözőek a. i 1-valens konjugáit oltóanyaggal imaumizák csoportokban (GMT ~ ö,31k ng/ml), vagy a PdB-vei és :3D-MPL-lef kiegészített ugyanilyen oltóanyagokban (GMT “ 0,45b ng/mí). Tehát a védelem C-kiszereléssel látott javulása, nem kizárólag a óB-poiíszaeh.aríő elleni magasabb ellenanyag-s'álasznak a következménye.
Együttesen az eredmények azt sugallják, hogy a védelmet nem egyedül a humorális immunválasz közevedtette, hanem .a PdS-autígés 3D-MPL jelenlétében indukált sejt-közvetített immunitása is. Ez további támogatást adott a febénet:ndgén(ek)nek és hatásos adjuváns(ok)nak a pnemmokokfcusz pohszaolrarid-konjugátum oltóanyaghoz való hozzáadásához, ily módon összehangolva az immunrendszer mindkét ágát az opdmális védetem elérésére.
5» példa - Az immunrendszer mindkét ágának együttműködése pnenmoltzínnei aktívan mmtuuteáíí, és pssesnno&ukknsz PS elleni eliennnyngekkal passzívan immunizált egerekben
5/A példa - Passzívan beadott anti-óB-políSzacharid-eltenanyag (aau-PS) tüdőgyulladás ellen védő koncentrációjának megtalálása.
Eljárás
-35Öltótinyag-esoportok: Egerek négy 16-os csoportját passzivao xmas»«mH«H(k (mtrspoitóaeálssan) a -L import 1ÖÖ pl higitatlan patkány antl-políszacharid amEssénammal az alábbi, csoportokban, (összeses 64 egér)
Csoport Spseilhás IgG-koscenföáció az ;mtiszérmnban
Gl. ő-ES-öB 5 pg/ml
G2 fö-FS-őB 2 pghil
G3 K-FS-6B 0,75 pgAtti
G4 Kontroli ö pg/mi
Állatok: 64 hím CD-7-egér (Charles Kiver, Csmda), tömegük körülbelül 35 g (körülbelül II) hetesek).
Érzéstelenítés: Az egereket izofiurámtaí (3%) plusz Cb-vel (1 L/perc) érzéstelenítettük.
Organizmusok: Az S. pneamoHÚ-m Ni 387 törzset (6-os szerotípus) 5% Jó-vértet kiegészített, íréptíkázes szója-agar ('FSA.) csészékről gyűjtöttük össze, és 6 ml FBS-ben felszuszpemJálí?uk. A fertőzést közvetlenül megelőzően I mi baktérium-szuszpenzlöt § ml lehűtött, olvasztott tápagarba (BBL) higttottek, és 4Γ€-οπ tartottoak. Az egerek körülbelül lö6 CFUfegér dózist kaptak 50 pl térfogatban,
Fertőzés: A 0, napon az egereket érzéstelenítettük a fest leírt módszerrel, és S*.pneu/ttanlae NI387 törzzsel fertőztük (50 pl lehűtött baktértum-ssttszpenrióval) mda-bronhíálís becsepegtetéssel, sem sebészi, mttatraeheális esöbevezetéssel. ezt az eljárást Woobat és Betry [Aötímicrob. Ag. Cfeemothcrap, 43, 29. oki. (1.999'}] tárták lel.
Minták: A fertőzés mán a 3. napon csoportonként 8 egeret feláldoztunk CQj-túiadagoiással, és 3 tüdőket kivágtak és homogenizáltuk 1 ml PSS-feea; Tízszeres soroz&iMgításí készítésiünk PBS-hen az: életképes baktériumok .számának meghatározására. A mintákat három párhímamosfem (20 pl) 5% lóvénei kiegészített TSAcsószékre oltottuk, és 37“C-on inkubáltuk éjszakán: keresztül a kiértékelés előtt. Az: egerek további csoportját áldoztuk lel a 7, napon és a mintákat a fenti módon. értékeltük.
Eredmények
Igö-koncentráció (pg/ml) a patkányszérumfcan öakíéríamszám (lóg CEG/tüdő) fertőzés után:
3 8
5 6,7 0,7 (1/7) 7,2 * (),? (5/8)
2 6,5 * 0,7 (1/7) 6.9 * 1,8 (4/7)·
ö,?5 7,7 ± «3,5 (5/8) 4,8* 1,412/8)
Ö 6,7 A 1,5 (3/6) 6,3 4 1,5 (3/9)
A zárójelben lévő számok a mintavétel ideje előtt elpusztult állatok számát je lzik.
Okttíkezíeíés:
Általában nem volt szignifikáns különbség egyik kezelést csoportból izolált baktériumszám között sem. Ez azt mulatja, begy az anti-poliszacharíd «ess nyújtott mérhető védelmet 5 pgfod koncentrációig, azt. is beleértve.
Ez hasonló ahhoz, amit néhány emberi klinikai vizsgálatban megfigyeltek, azaz az ami-poliszaeharid elégtelen pneutnokokkuszos ?üdőgydladás elleni védelemre bizonyos poprdáesókban.
- 36 5/B példa - PLY (pneumolszin) aktív beadásával (adjuvánssal és anélkül). nyújtott védetem meghatározása, és szinergia ssfevspfenális anti-PS-ellenanyaggal.
Bliárás
Állatok: 128 hím C^-Z-egér (Charles Kiver, St Coastam, -Qadsse, Canada), 6 hetes immunizáláskor, 10 hetes fertőzéskor, Az állatok tömege kőrülbelSl 20 g volt 6 hetesen, és körülbelül 38 g 10 hetes korban.
Immunisilás: Egerek hat 1 δ-os csoportját szubkután injekcióval rnnmmizáittink & -22. és -19. napos, löő pl oltóanyaggá as alábbiak szerint, (összesen 128 egér)· PdB-t (WO 90/06951. számú nemzetközt közzététel:: irat) Dr. 1 Eaton, Anstralia szívességéből, 3D-MFL4 Ribi/Coflxa cégtől szereztük be.
A -1. napon specifikus· csoportokat (lásd az alábbi táblázatot) passzívan immunizáltunk (imr&perifoneáfisaa 100 pl) 4,26 -.ug/wl koncentrációjú egér ar:b-poliszaeharíd-eilenanyaggal (4 ml 5 pg/ml oldat + 13 ml 2 μκ/toi oldat).
Csoport Aktív iaj. térfogata Oltóanyag dózis (pg, -22,, -14. nap) Passzív ínj. térfogata Passzív íg<3, -1. nap
l-l 108 ul, se. ΙΜΒ Ά1Ρ0.: (10/58)
1-2 100 pl, se. PdB/MPL.; AJPO4 (18/3/50)
1-3 100 μϊ, se. BáB/AÍPG) (10/58) 1ÖÖ μϊ, ip. s-PS
1-4 100 pl, se. P<1B/MPI/A1PÖ4 (18/5/50) 180 pl, ip a-PS
1-5 100 gi, se. MPL/AIPÖ4 (5/50) 100 pl, ip ö-BS
1-6 100 pl, se. MFL/AIPÖs (5/50)
Fertőzés; A 0. napon az egereket érzéstelenítettük. (3% ssofíurámal plusz 1 L/pere Orv-eí). Öaktéríamiaokülöütokat 5, jmernnöRÍoe N138? törzs (á-os szerodpus) 5% lóvérrel kiegészítés, ttíptíkázos szőia-agar (TSÁ) csészékről való összegyűjtésével áliiíottenk elő, 6 tttl PBS-ben fetatsapeadálva. Tízszeres bsgíiásí készíttetünk (1 ml plusz 9 ml) lehűtött, olvasztott íápagarral (4 1 ‘C-on tartva) közvetlenül a fertőzési megelőzően. Az egereket: íntra-bronhiális becsepegtetéssel, nem sebészi istnsttacbeálís esőbevezetéssel fertőztük, és azok körülbelül 30* CFÜ/egér dózist kaptak 50 pl térfogatban. Ezt az eljárást Woodaut és Berry {Aatimicmb. Ag. Chessotfeersp. 43,20. old. (1999)] tárták fel
Minták: A fertőzés után a 72 órával csoportonként § egeret feláldoztunk COj-tüladagulással, és a tüdőket kivágtok és homogenizáltok I ntl FBS-bea; Tízszeres sorozatfcighást készítettünk: PBS-ben az életképes baktériumok számának meghatározására. A mintákat három párlmstmoshan (28 ul) 5% lövárel kiegészített TSAesészékre oltottuk, és 3T-C-O8 inkubáltuk éjszakán kérésztől a kiértékelés előtt. Az egerek további csoportját áldoztuk fel a 8.. napon és a mintákat a fenti módon értékeltük.
Azudnfofcefemzése
Az összehasonlító kezelés kimenetelének toéröszánm a baktériumok száma volt a tüdőben 3 és 7 nappal a fertőzés ntáu. Az eredményeket csoportok átlagaként fejeztük ki szórással. A statisztikai elemzést Staáont-féle teszttel végeztük, ahol a 0,Ö5~nél kisebb P-ériéket tertottok szignifikánsnak.
Eiedményfec órfetoí ö /őrtűzét «fás
- 37 A bak-éAímzszámofc az 1-4 csoportban. szignifikánsan (p<ö,ö5) alacsonyabbak voltak, mint az 1-3 csoportba.®.
A baktérínmszániok az 1 -4 csoportban sAgnifífcássan (p<0,Ö5) alacsonyabbak voltak, mint az 1 -S csoportban.
főd őrdvtfí a/'éríazés «tón
A baktétiumszátnok minden csoportban körülbelül ?kéí nagyságrenddel alacsonyabbak voltak a 8, napon.
mint a 3, papon, a fertőzés felbomlását mutatva.
A hakténnmszámok az 1-2 csoportban sAgrnirkánsaa (ρ<0,05) alacsonyabbak voltak, mint az 1-5 csoportban.
Csoport 3. naa S. nap
lóg CPU /tüdő Szórás lóg CPU/íüdó Szórás
1-1 6,93 0,61 5,23 1,28
1-2 6,59 1,25 4,08 1,34
1-3 7,09 0,8 5,32 1,26
1-4 6,09 1,43 4,46 o 30 Λ.Λ.Ϊ*
1-5 7,19 0,89 5,42 1,05
1-6 6,68 1,14 5,01 1,48
Mjttrt ahogy fent demonstráltuk, egyedül az: and-poliszachartd-ellemuryng (1-5 csoport) sem nyújt védelmet a pneusiokokkuszok növekedése elles a tüdőben. A PdB -és AlPOvadjaváns szinten nent biztosít védelmei, de a 8. napos vas egy trend a védelemre, ba a PdS-t 3D-MPi.4ei kombináljuk (1-2 csoport).
A 3. napon a iegszigniökánsabfcan védeti csoport, az 1-4 csoport, ártsd a három komponenst tartalmazta, PáB-t, 3D-MPL-1 és passzívan beadott anti-políszacbarid-elleaaayagot. Ezt a következtetést a mortalitási adatok is alátámasztják. Az l -4 csoportban 2/8 állal pusztait el az 1 -S és 1-3 csoportok 5/1 ő halálozásával összehasonlítva.
Mivel a kísérletet passzívan immanizált állatokkal végeztük, a pneumobzínnei és ΜΡΙ..-lel való aktív Émmunizálás ssincrgetikns hatása nem lehet a poliszncband-antigén elleni ellenanyagok szintjében bekövetkező növekedés következménye.
Mivel az illatokat csak passzívan «rmmaáálSrk pnenraokokkasz poliszachartd ellen, a 8. napra az ilyen ellenanyagok nagyrészt eltűntek volna s gazdából.
Még Igy is szignifikáns védelem fájható pmumrokolömszos tüdőgyulladás ellen a pneomohzhi + 3D-MPLlel immunizált csoportokban, és különösen a pneumolizin + 3D-MFí„-lel. + passzívan beadod anti-pohszachsrideílesanyaggal immunizálj: csoportokbtm, matatva ezen kombináció szinergedkus hatását.
Ha sz aati-poliszactaid .Immunizálást aktívan hajtottak. volna végre (előnyösen konlugált pobszachariddal), a hatás még kifejezettebb lett volna, mivel a B-sejtes memória hatása és &z anti-PS ellenanyagok állandó színije hozzáadódott volna az immunválasz együttműködéséhez (lásd például az. IC ábrát, abo-1 számos,. pobszaehatíddai és fehérjével aktívan immtmizált állatban nem volt knmit.aíbaió baktérium a tüdőkben a fertőzés után).
«X* « # * * **$* *'♦ Λ ás 3Ö-MPL « * «««« «
-38 ó, példa - 1 l-vztens pneumokokkast pnltezaebaríá-protoín JMöSjjagátsm oltóanyag adjuváns ía^tnaegeaítás» egyéves ^n/ó/C~egerek.ben
BeyezgíáséLSÉbk:
A pneuntokokknsz-tertőzés elten; védelmet szerotipus-s^eeiitkus ellenanyagok közvetítik ígtszoaofagocitózis revén. EeitételezhetÖ, hogy az elk^nauyag-korteontrseió növekedése nagyobb fokú védelmet eredményez, és száital sok energiát fordítottak a immorális immunválasz fokozásának útjainak megtalálására. Az egyik sikeresen alkalmazott stratégia klinikai elővizsgálatokban konjugált oltóanyagok esetén imntunstrntalSó adjuvánsok alkalmazása (összefoglalás: Poolman és mtsai., „Carbtútydrate-Based Bacterial Vaccures, „Handbook of Experimentsl Pfeaanacology”, szerk.: Perhonon és Wigsell. kiad.: Springer-Verlag, ífeídelbe.rg, D (1998)!.
As: ebben a szakaszban feltárt adatok a legutóbb):, klinikai mintákat alkalmazó kísérte;, eredményiéit mutatják, be, klinikai vizsgálatukat utánzására tervezett sbárásbas.
Eljárás:
Egyéves ztó/ó/C-egereket iounumzáltmik a pneumokokkusz pohszaeharíd-proteia D-konjugátum oltóanyag emberi dózisának I/lö-ével, vagy a 23-vaisns egyszerű políszacharíd-oiSöanyaggak As alkalmasod oltóanyagok a DSP909, DSPÖ13 vagy DSP9í4 sorszámú klinikai minták voltak, amelyek sorrendben a 1 l-valens konjugált oltóanyag öB és 23)? szerotipus 1 meg dózisának, és a többi szerotípus 5 meg dózisának, a 11-vatens konjugált oltóanyag 0,1 meg dózisának, vagy a 1 s -vafeas konjugált olíóauyag 9,1 meg dózisának 5 meg oD-MPL-iel léteitek meg. Az összes 11 -vafens konjugált oltóanyagot 59 ng: AIPCL-adiu vaussal is kiszereltük.
Egerek .20-as csoportjait snmanizáltuk ímramuszkuisrisan. Az alábbi táblázatban felsorolt csoportok oJtá·sat a 0. és 21. napon végeztük. A 35 . napon (14 nappal az második dózis utáni teszt véreztetést hajtottunk végre.
Táblázat; Egyéves ^«WC-egerek lmt»»»ízáBssl terve puenmnkokknsz poHszaeharrd-prnteiu Dkorjjngátuns oltóanyag klinikai mintáival
Csoport lk nap Oltóanyag L dózis 21. nap Oltóanyag 2. dózis Egerek szánra
I Paeutnovax-23 2,5 meg Buffer 20
2ít 1 l-valens Pn-PD 0,1 meg Pof te) 29
2b 1; -vaíens Pn-PD 9,1 meg 1 1-vakus Pn-PD 0,1 meg 29
3a. 1 l-valens Pn-PD ·+· MPL 9,1 tneg + 5 meg Pufe· 20
3b 1 l-valens Pn-PD + MPL 0,1 meg v 5 meg 1 i-vatens Pn-PD + MPL 0,1 meg te 5 meg 29
4a 11-valeus Pn-PD 1/0,5 meg Pufiin 20
* « « Μ » ♦ * * *.
« « V ♦ >
* * * « *'♦·· **“* <· ΧΛ· ν
Csoport 0, nap Oltóanyag 1. dózis 21, nap Oltóanyag 2. dózis Egerek száma
4b 11 -valena Pn-PG 1/0,5 meg il-vaíens Pu-PL> 1/0.,.5 meg 20
Kontroli Pufter Pufiér 20
Α szérumokat ELÍSA eljárással vizsgáltuk pneumokokkusz fx>li»zncharidok elleni Igö-ellenanyagok jelenlétére a CDCZ WHO konsÍteazusos eljárást követve, azaz a. szérum ssjlíaí-pohszaeharidrkd történő semlegesítését kővetően. Az ELISA-í szerotipus-speeiilkus ígöí n-önoklar5áíis ellenanyagokkal kalibráltuk ágy, hogy sacg/mí egységű clburny^-kimceutrációkat kapjunk.
Az Összehasonlítások statisztikai, elemzését (Τ/ΤΚΈΊΓ versmn 3,0 be/« alkalmazásával számítottuk. Áz ÁNÖVA-elemzésí a r«áey-/áSÖ eljárással végeztük fog-öunsztbtmált IgG-kontxm&ácIókon. Á szerokoavtóós arányok páronkénii összehasonlítását Fisher-feie egzakt teszttel végeztük..
Eredmények:
A 11 szerotlpus és protein D ellen 14 nappal a második immunizálás után kiváltéi!: CMC ígG-értéket és 9S%-os koníideueía-iatervailmnot az alábbi táblázatban mutatjuk be. Ahol 9.5%-os konfidencia-intervallumot nem lehetett számítani, a szerokonverziós arányt mutatjuk be.
Az L csoport mutatja az egyszerű poliszacharidokkal való immunizálás hatását, amelyek notmáiisan csak. Ig.M termelését váltják ki állatokban. A legtöbb Igfí-kosoeníráció a kimutatási küszöb alatt vau; mindazonáltal a áts/feC-sgerek képesek voltak IgG-t termeim néhány pneumokokkusz políszacharíd ellen, nevezetesen a 3, 19b és 14 szerotlpnsök ellen.
A konmgáh oltóanyagokkal való immunizálás magas szerokonvorzíós arányú IgG-öllenanyag-termdést váltott ki az összes szerotipus ellen, a 23F kivételével.
Dózis-függő választ (2, a 4, csoporttal szembes) csak a ?F és 19F szerotipnseknál figyeltünk.x»sg, de essek nem voltak statisztikusa» szignifikánsak. Fokozottabb választ figyeltünk meg: ké!: dózis után ib csoportok az a. csoportokká szentben} a 3, öB. 71'·' és }9F szerotspusok és protein D esetében, és ezek statisztikusan szignifikánsak: voltak sok esetben mindhárom kiszerelésié.
A legérdekesebb a 3D-MPL hatása. A 3D-MFL-vel kiszerelt oltóanyag két dózisa (3b csoport) váltja ki s specifikus ígG legmagasabb öMC-értékét, és ez statisztikusan szignifikáns az össze szerotipnsra a 23F kivételével, amely esetén szignifikánsan magasabb volt a szerokonverziós arány (p ~ 0,02, 3b csoport a 2b csoporttal szemben, Fisher-iéle egzakt teszt).
*·* ♦ ·
-40Táblázat: Kiválasztott paeumakökkuss szerdípusok és prntdn ö IgG-kwacestrádó geemetdkns átlaga és §S% k«»fideecia4nterva0ataa egyéves Ba/ó/C-egerhen 14 nappal a J 1-valess PS-FÖ konjngálí oltóanyaggal történő smmnsjízsilás alán
Csoport : .1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
Szero- iipos GM(lgGj pg /tol (93% Ki) GMpgGI pg /mi (95% Ki) GMjlgGj Pg /tol /95% Kis GWgÖ] Pg /ml (9559 Kf) GMpgGj pg /ml (95% KI) GMOgG] pg /mi (95% KI) GMÍIgOj pg - mi (95% Kft
3 6,24 (0,16-0,6? 0,1 S (.0,11-0,2?) 0,84 (0,47-13) 0,72 (0,51-1,0) 434 (3,0-7,9} 032 (0,14-8,35) 0,95 (0,19-13)
68 0,02 0/20# 0,04 8/19# 0,19 (0,09-0,4;) 0,14 (0,07-0,27) 0,74 (0,29-),9} 0,09 (0,05-0,16) 0,11 (0,05-0,23)
7F 0,04 0/20# 0,07 (8,04-0,12) 0,19 (0,10-0,39) 0,15 (0,10-0,22) 0,97 (0,49-2,0) 0,09 (0,06-0,14) 0,45 (0,20-1,02)
14 0,15 3/204 4,5 (2,5-8,1) 6,2 (33-10,5) 12,9 (73-21,2) 13,6 (9,4-19,7) 4,0 (2,0-8,0) 6,9 (43-10,6)
BF 1,2 (036-2,6) 63 (3,6-12,5) 12,1 (7,6-19,3) 10,1 (5,5-33) SS,5 (42-81) 5,9 (3,-5-9,9} 223 (16,0-30,2)
23F 0,07 1/2,0# 0,08 3/20# 0,08 2/19# 0,07 2/10# 0,17 9/20# 0.06 1/iS# 0,18 4/20#
Fl>* 0f25 1/20# X ·-> (33-8,3) 11,9 .(6.9-20,7) 133 (93-19,0) 98,0 ¢40,1-195) 18,9 (6,4-18,4) 38,7 (21,3-70,3)
♦EU/sü egységben; feerotovenaós arány, kétszeres szórással a negatív kentroH átlaga felett Lásd as előző táblázatot a csoportok deílsicióját illetően,
Következtetés;
Az itt fekárt adatok dmossttálják. hogy a 3.D-MPI. hozzáadása a 1 l-v&iens prteiiiaekekkasz poiiszaeharid-pretem D-konjugátcm öbőanyagbuz fokozta az immunválaszt idős Pn/b/C-egerekben az összes vizsgált szerotípus esetében.
A legtöbb esetben az oltóanyag két dózisa magasabb geometrikus IgG-átlagkoucentráeiót váltott ki, mást egy' dózis. Mivel ez nem volt ínegDgyelbető az egyszerű pelissacbarid-'táíőaayag alkalmazásával, naég emberekben sem, így ez a T-sejt-fuggö immunválasz és az immunológiai memória kiváltása jelének tekinthető.
.Az adatok alátámasztanak egy Thl-adinvánssal (előnyösen 3D-MPL-ld) együtt beadott konjagák pneumokokkusz poliszaebadd oltóanyagot alkalmazó beadási sémát, ahol az az adjuváascs oltóanyagnak legalább két dózisát adjuk be, előnyösen 1-12 bét, legdőtívösebben 3 bét időközzel. Az ilyen beadási séma a találmány egy további megvalósítási módját képezi.
A kísérletben alkalmazott egerek érzéketlenek a PS 23-ra (egyszerű vagy komugáit). Érdekes módon, bár a peliszacbarid ellesi dlennnyag -koncemmdó alacsony maradt az alkalmazott o.i,ó:myag-késdtméoyiöl függetlenül, sokkal több egér válaszolt s PS23-ra, amikor 3D-MPI,-t alkalmazniuk .adjaváasként (a szerokonverzió szigttsíMasaa magasabb}.. T.bi -adjuváns, előnyösen 3D-MPL alkalmazása konmgáb pneurnr&.dskaszX X «
-41polfszaeharídokaí: tartalmazó oitőísnyag-készfenőnyekben az oltott egyén pnemnokokkasz-poliszacharidre való érzéketlenségének enyhítésére a találmány még: egy további megvalósítási módját képezi,
7, példa - Abfeacrfe jwík^Mí C-pnlsszacbarid-protein R-konjugátsma (PSC-TD)
Á: PROTEIN 8 EXERESSZtódA
Máit az 1, példában föhártnk:.
8: C-POLISZACHARID GYÁRTÁSA
A políszacharid C-csopettjáuak forrása sz ,V. rííiíítfosfoSíSís Cl í fitase. Ezt klasszikus fe«ítsntál&í módszerekkel fermentáljuk (EP 72513, számú eurőpm szabadalmi irat). A k:oojugálási eljárásban alkalmazott száraz por alakú pohszachsrsdok azonosak a. áfe«om«z-szsl (SB Bloíogicals s„a.).
A Cl 1 -törzs egy abkvotját felolvasztottuk, és a szuszpenzió ü,i mi-ét élesztökivonat disiizátnmmal {id%, v/v) kiegészítőn ΛΑίΟίίο?' Hmm?; táptalajt tartalmazó peíricsészére kentük, és 23-25 órái iukubáltnk 36‘C-on vízgőzzel telített inkubátorban.
A felszíni tenyészetet ezután újra feiszuszpeadáhok sterilizált fermentációs tápközegben, és· ezzel a sznszpenzióvsl beoltottunk egy őlesztökivonaf. diafczáttumaal 0Ö%, v/y) kiegészített Afaeí/er Hősion tápközeget és steril üveggyöngyöket tartalmazó árme-edényt, A Amso-edény 23-25 órán keresztül 3όΧ-οη vízgőzzel telített inkubátorban történő ínköbálásái követően a felszíni tenyészetet újra félsztíszpendáttnk lö ml steril fermentációs íápközegben, és ezen szas^jenció -0,2-8,3 tnl-él étoltottak 12 másik Afee/íer Jfenío?; tápközeget tartalmazó /ri»»··· edénybe,
A 23-25 órát? keresztül 3öC-on vízgőzzel telitek inkubátorban történd inkabálást követően, a felszíni tenyészetet újra felszuszpondáltok 10 ml steril forumniáeiés tápközegben, A baktéritmi-szaszpenziót kúpalaké lombikba összeöntöttük.
Ezen szuszpenziót azután aszeptikusán átvittük a fmamtotha steril fecskendők alkalmazásával,
A nseningökokkusz fermentációját negatív nyosnásü dsztaszobában. lévő fe.rmentorokban végeztük, A fermentáció általában 10-12 óra elteltével teljes, és körülbelül IOÍÖ bakíérmm/ml-nek (azaz a korai stacionárius szakasznak) felel meg, és a pH etaeíkedésével detektáljuk.
Ebben az állapotban a teljes táptalajt növel inakdváíjuk (12 pere 56’C-on) a eeatrifogálás előtt. Az inaktiválás előtt és után a táptalajból mintát veszünk, és Afoe/fe?· Aúwton potricsészére kenjük.
C: FS-TOZTÍTÁS
A tiszíifás többlépéses folyamat az egész fermentációs táptalajon végrehajtva. A tisztítás első fázisában az inaklivált tenyészetet centrifogálással derítjük, és a felülúszőt begyüjtjük.
A poHszachaud-tisztitás kvaíemer-ammórámnsóval (cetlI-trinietil-aías-ióninm-bí-OHíiil, CTAB, Cetvafoa R) történő kiesapáson alapul. A CTAB cdtotatktn komplexet képez poliamonokk&i, mint pékiául poliszacbaridokkal, nukiems&vakk&l és fehérjékkel, a pl-jüktöl függően, Az toaosaa szabályozott reakciói követően ezen eljárás alkalmazható szennyezések (alacsony vezetőképesség) vagy poliszacharidok (tnagas vezetőképesség) kfosapássxs.
A derített feiüiftszóban található ptdiszacharjdokat kovaföld (Celite* 545) hordozökénf való alkalmaziisávtd csapjukká, oldhatatlan inért: anyag keletkezésének elkerülése végett a kissapások/tiszíhások során.
- 42 ΛΪ ííígíííKgíWís ífecdófod séusííH'
1, lépés: A PSC-CTAB komplexei. rögzítjük. Gebte* $45 hördözön, és eltávolítjuk a sejfrőrmeiékeket, suktónsavakat és fehérjékéi 0.05% CTAB mosással.
'X lépés: A PS-t elfedj ok 50% etanollal. Az első zavaros és szennyezéseket és LSP-t tartalmazó frakciókat eldobjuk. A következő frakciókban a PS. jelenlétét llokkulácíós teszttel ellenőrizzük.
X lépés: a PSC-CTAS komplexet újra rögzítjük Cetbe* 545 hordozón. és eltávolítjuk a kisebb nuklemsavakat és fehérjékéi 0.05% CTAB mosással.
4, lépés:: A PS-t eluáljuk 50% etajiollal. Az első zavaros frakciókat eldobjak. A következő Irakcíőkbsn a PS jelenlétét flokkeíációs teszttel ellenőrizzük.
Az, eluátmnot szarjak és a nyers políszacharidot tartalmazó szürietet összegyűjtjük. A poiiszacharídfe kicsapjuk a szőriéiből etanoi S©% végkoneenírációban való hozzáadásával. Azután a poliszaeharidol fehér portot visszanyerlük, vákuumban száritjuk, és -SO’C-on tároljuk, »: C»AP-KONJCGÁL,ÁS
PŐ'Cés Pö fom/Kgá/dsa .A PSC és PD konjugálásához a CDAP konjugációs módszert részesítettől előnyben a klasszikus CNBr~ akriválashoz és kapcsölő-ssoiekuián keresztül fehérjéhez történő kapcsoláshoz képest. A poüszaehsrsdot először ciamtálással aktiváljuk l-ciano~4-dimedia?níí!öpúídmn?m-tstrsílaoröboráttal (CDAP). A CDAP vtzoldható eiaruláló reagens, -amelyben a ciano-csoport elektrofilsága. megnövelt a CNBr-bsz képest, lehetővé- téve- a crnniláló reakció viszonylag enyhe körülmények közit végrehajtását. Az aktiválás után a pollszscbaridot közvetlent! kapcsolhatjuk a herdosöfehérjéhez annak ammo-esoportiatB keresztül bármiféle kapesoló-umlekída alkalmazása nélkül. A reagálaőan císnátészter-cseportokaí g-licisnel való alapos reakcióval reagáhatbaluk eh A tojngátum előállkásában szereplő lépések száma csökkent, és az tt legfontosabb, hogy potenciálisan hntnonogén kapcsoló-molekulák nincsenek jeles? a végtomékben.
A poli&zachaná CDAP-val történő aktiválása cianát-csoportol épít be a pofcachar-ídba, és dfenetilamiaopíndm (DMAP) szabadul fel. A clanát-cseporí reagál a fehérje amino-csopor^aival az aktiválása követő kapcsolási reakcióban, és-ksíbmát-csoporitá. alakul ál.
PSCMöWte és AVCd® fospr S<íáÍS
Az aktiválást és kapcsolási 25''C-on végezzük.
Γ2-0 mg PS-t oldunk legalább 4 órán keresztül WH-ben (injektálható víz. „Wáser for fejectioo},
ÖBAP-otóatof (100 mg/mi, frissen készítve aceteritrilben) adunk a -poüszacbarid-oldatboz <1,75 CD.A-P/PS (Ww) arány elérésig, perc 30 másodpercnél a pH-t az aktiválási pH-ra (pH~-lö) emeljük tdeul&min hozzáadásával,, és stabilizáljak a PD hozszáaááásáíg.
perc 30 másodpercnél NaCl-ot adunk az elegyhez 2M végkonccntráclőban.
percnél tisztított PD-t adunk az elegyhez 1,5/1 PD/PS arányban; a -pH-t azonnal & kapcsolási pí-l-m (pH-Τ!) állítjuk be. Az oldatot 1 órát áltó hagyjuk a pH szabályozása tneHeti.
**♦# «*
·· 43 · „-1 resfeíd feáSííesis bú 2 M glicm-oldaíoí adunk a RS/PD/CDAP elegyhez. ,4 pH-t a leállkási pB.-xu (pH---8,8) állítják be. A reakcióeksgyet 30 percig kcverteíjök a tnunkahőtnérsékJetcn, majd éjszakán keresztül 2-SX-oa folyamatos lassú keveréssel.
PA-BB nv’drásn
Szűrés után (5 pm> a RD-PS-kcatjag^umoí hsdegszofeáfeaa tisztítjuk gélszúrő krmnatögráfíával Sephecryl Ö40öft'é‘· tölteten a kistnolebúék (beleér·ve az DMAF-t} és a koiijngálaíian PD eltávolítása végett. Elació: 150 trsM NaCl, pHM>,5; követés: BV '280 sm, pH és vezetőképesség.
A reakelókomporterisek különböző moleknlamérete szerint először a PS-PD-konjugfetm eiuálödik. majd a szabad PD és végül a DMAP. A DMAB-bal (PS) és pBCA-val (fehérje) detektált konjugáturaot tartalmazó frakciókat ősszeöotjők. Az összeöntótt ftakeiékstt sterilen szikjük (0,2 pm),
E: ABSZORBEÁLT FSC-PSXKONWGÁTOM. OLTÓANYAG RiSEERELÉSE
A PSC-PD-toajögátöm ÁÍPÖj-en való adszerbeálásáaak. optxmalízálá^oz az AÍPOa-t mossak a PO?·.....
koncentráció csökkentésére:
- az AIPOh 150 sriM NaCL-lel mossuk és centrifugáljuk (négyszer);
- a csapadékot újra feiszuszpendáljuk 15Ő mM NaOl-haa és szűrjük (18 pm): és
- a szörletet hővel sterilizáljuk.
ezt a. mosott AlPÖH WAP-sek („wasked amocfe-ved phosphate’', mosott aoíoklávozort fosziat) aevezxök,. eíámR
A PSC-PD-konjagúmm nagy mennyiségéi ÁIPO4 WAP-ta abszorbeáltuk a végtermék kiszerelését megelőzően. Az ÁÍPÖ4 WAP-oi. PSC-PB-vel kevertük 5 percig szobahőmérsékleten, A pH-ι 5,l~re •Mlítottuk, és az ©legyet további 18 órát kevertük szobsbőmét'sé&feíes, Ná€í-oidatöt adtunk az elegyhez ISO mM koncentrációban, és az eiegyet 5 peréig kevertek szobahőmérsékleten. 2-fenoxietsnok adóink 5 mg/nú koncentrációban és az elegye! 15 percig kevertük szobahőmérsékleten, majd a pB-í ő. j -re állítottuk.
i-'égso áözezo/ásÁúb A
- PSC-PD: löogPS
- ΛΙΡΟ4 WAP: 0,25 mg Al'
-NaCl: 150 mM
- 2'-feaoxietanol: 2,5 mg
- injektálható sóz: 0.5 ml-re
-pH. fel
E; PREKLINIKAÍ INEÖHMÁCBÖsR 1 /kíAszseéafűAkofdí^dísn? .ímwmogmfiíáss egárhen
A PSC-PDrkmfttgifeaa inimunogemtását 6-8 hetes RaZÓ/C-egerekben íií.lapitoti»k meg. A sima (nem abszorbeált) komugáhnnot vagy az AlíTA-rn adszorbeált konjugátenot monovalens ohóanyagként injektáltuk. Az
- 44 indukált anti-PSC-ellenartyagokat ELISA-vsl mértük, míg s iunkclonális ellenanyagokat hakterieid-teszöel «lemeztük, mindkét eljárást a CDC (Centere fér Disease Centről ásd Ereventiorf, Atlanta, USA) eljárása szennt. Á dózis-hatás es adjuváns (AJPQ,) hatásának megállapítására elvégzed két különböző kísér Jei eredményes mutatjuk be.
-Dázfe-áimB' áárérler
Ebben a kísérletben a J’SC-PD-kosjsgáttanot kétszer injektáltak .Ömő/C'-egerekbe, két hét időközzel. Négy különböző AlFOron kiszerelt konjugatum-dózist alkalmaztunk: ő.l; 0,5; 2,5 és 9,6 ng/áliat. Az egereket (csoportosként iÖ~et) a 14. (14 nappal az első oltás után), a 28·. (14 nappal a második oltás utáni, és a 42.. (28 nappal a második tiltás után) véreztsítük. Az ELiSA-vái. mért C-pohszacbarid-specdükus ellenanyagok geometrikus átlagait. (CMC) ug IgCómI-beo fejeztük ki. tisztított: IgCl referenciaként való alkalmazásával. A bakteriad ellenanyagokat összeőníött szérumokon mértük,, és a. litereket a baktériumok 50%-át elpusztítani képes hígítás merprokakeat fejeztük ki, X mes»jgkidis Cl I törzséi alkalmazva rstmlcseeseinö-komplemest jelenlétében.
A kapott dózis-hatás telítést mutas a 2,5 pg-os dózistól kezdve. Az eredmények azt jelzik, hogy jó megerősítő hatás van az első oltást követő 14. nap és a második oltási kővető 14. nap között. .28 nappal a második oltás után az ellenanyag-szintek legalább ekvivalensek a 14 nappal a második oltás utánihoz képest. A bakteriéit! eilenanyag-trierek összhangban vannak. az EldSA-val kapott koncentrációkkal, és megerősítik a PSC-PDkosjugátnm immurti^enitását.
Jz adjuváits öeíó.va
Ebben a kísérletben AIPO,<~o:o kiszerelt ESC-ED-koajugámm egy mintáját vizsgáltuk, a. sima (adjuváns nélküli) koaíugátumoí isiektáltnk összehasonlításképpen. Csoportonként 10 egeret kétszer injektáltunk, két hét Időközzel szsbkután úton, 2- ug konjugáiummal. Az. egereket a 14 . (14 nappal az első oltás után), a 28, (14 nappal a második oltás után), és a 42. (28 nappal a második oltás után) vérezíettük, és EEÍSÁ- és fuokeíonáhs ellenanyag-btereket mértünk (csak 14 nappal a második oltás után és 28 nappal a második oltás a bakterlcldteszthez), Az AlPQí-kiszerelés 10-szer magasabbig terjedő ellenanyag-ótereket vált ki a near-adjuvánsos kiszerelésekkel összehasonlítva.
Az alábbi, általános következtetéseket vonhatjuk le a fent feltárt kiseríeíek eredményeiből:
- A PSC-klb'konjugáhím emlékező választ vált ki demonstrálva, hogy·· a konjugált ESC T-sejt-ihggö antigénné válik.
- Az FIJSA-val mért anti-ESC-elleaanyag koneeötrácíöi jól korrelálnak a bsktericiá-eliettanyagtherekkel, mutatva, hogy a PSC-PD-konjugátmnmal kiváltott ellenanyagok működőképesek a Aktoró nmmXgiridir C-szerocsoposjával szemben,
- Körülbelül 2,5 pg ΑΐΡΟ4-οη abszorbeált konjugátnar látszólag optimális immunválaszt vált ki egerekben,
- A CDAE-reakeiö megfelelő eljárásnak látszik Immonogés PSC-PD-kotsjugátumok előállítására.
8. példa - Al A-szermrtoportjshdl származó pnlfezachand-protetjs D-koejagátntn előállítása
Pollszacharid-A. (ESA) száraz porát oldottuk: egy órán keresztül 0,2 M NaCl oldatban 8 mg/ml végfeoaeeatrációra. Azután a pH-t ő-os értékre állítottuk vagy HCl-lel, vagy NaOB-val, és az oldat hőmérsékletét 25'Έ~ο» * * * *
-45szabályozb-k. 0,?S mg CDAP-f /mg. PS A (100 mg/ml oldatként aeeíouitrilberi) adtunk a PSA-eláaótox. 1,5 perc elteltével (a pH szabályozása nélkül) 0,2 M NaOH-t adtunk ax elegyhez, és 10-es pH-t kantunk. 2,5 perccel később protein D-t (5 tng/ml-re koncentrálva) adtunk az elegyltsz, körülbelül 1 PD/PSA aránynak megfelelően. A ÍO-es pH-t tartoriuk a kapcsolási idő alatt, ami 1 óra volt Azuíáíj 10 mg gliciní (2 M, pH;;9,0) /mg FSA adtunk, az elegyhez, és a pH-t szabályoztuk 9,17-ra, 30 percig 25T-on. Az elegyet .azután -FC-on tartotok éjszakán. át, mielőtt gélszűrő krömatográífed tisztítottak íSep&zend 5'49óí/P a Pharmmc ia-tól). Először a kopjugátum ehiálódik, majd a reagálatíaa PD és a melléktermékek (D.MAP, glicin, sók). A konjugáhimot összegyűl lőttük, és sterilizáltuk 0,2 gm-es szűréssel ó'uf'/öpof'c-membtűnou ÍSsrtorhis).
9. példís -H 7 és $. pd&fá&a» e/O/And'tarmséfcefc irt rive jellemzése
A fö tulajdonságokat az alábbi táblázatban foglaljuk össze:
No. Koítiugáturn leírása Fehérje és PS tartalom (tigőni) PS/fehérje arány (WAV) Szabad fehérje (%i Szabad P5 : i%)
1 PSC-PD NaOH-váí szab. pH PD: 210 FS: 308 1/0,68 < 2 8-9
2 PSC-PD TEA-val szab. pH PD: 230 PS.351 1/0,65 < 2 5-6
3 FSA-FD NaOH-val szab. pH PD: 159 FS: 149 1/1,07 5 5-9
ín w .eredmények ős//?/C-egerekct alkahnazu-nk állati modellként a konjugámmok immusogenitásának vizsgálatára. A kunjugátumokaí vagy AIPEh-ra vagy Ál(OH,ű-ra aószcsrbeáituk (10 pg PS-t 5ÖÖ pg Ap*-ra'k vagy nem abszorbeáltuk. Az egereket az alábbiak szerint oltottuk: két oltás kél hetes időközzel (2 pg PS/oltás),
Ezen eredmény ékből az a következtetést vonhatjuk le először, hogy a szabad PS nagyban befolyásolja az immunválaszt. Jobb eredményeket kaptánk 10%-nál kevesebb PS-t tartalmazó konjugátumokkal. A fend javítások: a CDAP-éljárásra tehát a találmány további megvalőstosí. módját, képezik.
A kiszerelés is fontos. AlPCh látszik a legmegfelelőbb adjuvártsnak ebben a. modellben. A konjugátumok megerősítő hatást váltanak ki, ami nem figyelhető meg az egyedül injektált-políszacharídokkaí.
Aoveőhes&áíMt
A Λ1 í?:cnö?,g/rm’ó; A és € poíiszauharidisisaR kmjugátoaaít állítottuk elő sorrendben 1 és 0,6-0,7 (w/w) PS/lehérje aránnyal. A szabad 'PS és szabad hördoxótebérje sorrendben 10% és 15% alatt volt, :A poíiszacharid kitermelés magasabb·, «tini 70%. A hsait javítóit CDAP-eljárássa.1 kapható FSA és PC kosjugáhsmok (függetlenül a hordozófehétjétök de előnyösen protein D-vel) tehát a találmány további megvalósítási módját képezik,
ÍÖ, példa --<?£ infixexsae b-böi származó poliszáéitarfd-pröíein D-konjugátu® előállítása íí. itífiiiCfaaö az agyháitjagv-alladás egyik tő oka a kél évesnél fiatalabb gyenódcekbeu, A .fi m/ííamzo.·?
borok-poliszacharidja (FRF) tetannsz-toxold-konjugátumkéíit jól ismeri: (.1. Robbias által kifejlesztett reakcióval konjugálva). A CDAP alkalmazása javított reakció. Az· alábbi a PRP (előnyösen PD-hez való) konjugálásakor talált optimális körülmények leírása.
-46A konjugálása reakciót befolyásoló paraméterek az alábbiak:
» A poljszacharid kiindulási koscentrációia (aminek kettős hatása lehet a szabad poisszaeharid végső szintiére és a steril szűrési lépésre).
* A hordozőfekérje kihKiaiási koncentrációja, * A poiiszacharíd/fehérje kiindulási aránya (aminek szintén kettős hatása lehet szabad poiíszackarid végső szintjére és a steril szűrési tépésre).
* A;; alkalmazott CDAP mesmyisége (általában nagy feleslegben alkalmazzak).
* A rőakcióhőntérsékilet (ami befolyásoíkatja a jxtliszacbarid lebomlását, a reakció kinetikáját, és a reaktív csoportok lebomlását).
* As aktiválás és kapcsolás pH-ja.
* A reakció lesiklásának pí-l-ja (a reziduáiis DMA? szintiét befolyásolja);
* Az aktiválás, kapcsolás és leállilás ideje.
ügy találtuk, hogy a három legkritikusabb paraméter a végtermék minőségének optimalizálására: a poliszacharid/fokéije kiindulási aránya,; a poisszaeharid kiindulási koncentrációja; és a kapcsolás pH-ja.
Ezért egy 3-paraínéteres reakció-rendszert terveztünk a károm fenti körülménnyel a három tengelyen. A középpontok (és a kísérleti tartományok) az alábbiak voltak: PS/fohétje arány; 1/1 (*0,3/1); [PSJ: 5 mg/mi(*2 mg/mí); és kapcsolási pH: 3,0 (il ,0),
A kevésbé lényeges paramétereket az alábbiakban rögzítettük: 30 mg pohszsekaridot alkalmaztunk; hőmérséklet 25X; [CDAP} “ 0,75 mg/mg PS; a pH-t 0,2 M NaOH-val állítottuk; aktiválási pH 9,5; aktiválás ideje 1,5 perc; kapcsolás ideje 1 őrá; (fehérje] - 10 mg/ml; leállítás! pH 9,0; leállilás ideje 1 óm; PS oldásának ideje az: oldószerben; I óra 2 M NaCl-bes; tisztítás áepáoery/ ó'9dÖ///í-os;zlopon 150 mM NáCl-íel 12 cm/őra folyási sebességgel; és steril szűrés A.d?^Fí?fe-fF P2Ó szűrőn 5 ml/percsebességgel.
A vizsgált adatok a fensz reakció-rendszerrel előállítóit termékek optimalizált kórtiknényeinek meghatározásánál az alábbiak voltak: folyamat adatok - maximális kitermelés szűrés után, maximális beépített fehérjeszínt; és termék-minőségi adatok - PS/fehérle végső aránya, szakad PS- szintje, szabad fehérje színije, minimum reziduáiis DMAP (CDAP lebomlási terméke) szint, ,-í száWv Αβζββτβ
A szűrés utáni hownot befolyásoló tényező a kiindulási [PS], és a kapcsolási pH és a kiindulási PS/fohérje arány kölcsönhatása. Alacsony [PSj-nál kicsi a köícsörthsfes a. két utóbbi tényezővel, és mindig jó szürhetöség. az eredmény (körülbelül 95% az összes terméfoe). Azonban magas koncentrációknál a szöthetóség. csökken, ha a pH: és a kiindulás! arány nő (magas (PSj, legkisebb arány, legalacsonyabb pH - 99% szürhetöség: de magas [PS], legmagasabb arány és pH ~ 19% szürhetöség).
Fráérföbeépjíáfe sjfetfo
A PS/fehége végső aránya a kiindulási arányhoz képest a kapcsolás hatékonyságának a mérőszáma. Magas (PSj-nál a pH nerc befolyásolja az atáayok arányát. Azonban a kiindulási arány igen i 1,75 alacsony kündniási aránynál, 1,26 magas kiindulási aránynál). Alacsony [PSl-nái az arányok aránya legnagyobb részben alacsonyabb, azonban a pH-nak ott nagyobb hatása van (alacsony pH, alacsony arány - -Ö,9ó; alacsony pH, magas arány ----- 0,8; magas pH, alacsony arány - 1,4; és magas pH, magas arány 6,92).
LegsSPSjeháje arány φ *
ΦΦ κ » »·♦ »
-47 A végső arány a kiindulási aránytól és (PSj-tól fUgg, A legnagyobb végső arányokat a magas kiindulási arány és magas· [FSj kombinációjával kaptuk. A pH hatása a végső arányra nem annyira szignifikáns, mist as alacsony fPS].
feíóííd profm í> s?ás(p?
A legkisebb mennyiségi szabad protein D-t magas pH-nál és magas lfiS)~sál figyeltük meg (a szint 0,0-hoz közelit). A magas (OSI hatása különösen kifejezetté válik, amikor a pH alacsony. A kiindulási arány növelése egy késit járul csak hozzá a szabad protein D szintjének növekedéséhez, feídmífis WJF
A kiindulási aránynak nincs szignifikáns hatása. Ezzel ellentétben a DMA? szintje növekszik a iPS j-v&l, és csökken, amikor a pH-t emeljük,
Ovei&eztofáss'k
A legelőnyösebb konjugálást körülmények tehát az alábbiak: kapcsolási pH --- 9,0; [PSj ~ 3 mg/ml; és kiindulási arány ~ 1/1, Ilyen körülmények mellett a végtermék tulajdonságai az alábbiak:
Végső arány PS/fehérjs PS hozam szűrés után (%) Arányok aránya Szabad protein D (%) DMAP szint (as/lÖ pg FS)
érték tartomány érték tartomány értek ítírtomány érték tartomány érték tartomány
1,10 0,91-1,38 92,6 50-138 l.lö 1,03-1,29 0,71 0-10,40 4,95 2,60-7,00
A fenti javított (optimalizált) CDAP-eliárássai kapható PRP-kottiagátumok (függetlenül a hordozőfehérjétöi, de előnyösen, protein I)~vel) lehat a t&Iáhnány további megvalósítási módját képezik.
11. példa; ProtemD mint antigén - hogyan javithaíjnk a nem tipizálható K /«j&reasa» elleni védd hatékonyságát.SlKMFL-let való kiszerelés révás
Nőstény ^ö/MÜ-egereket (csqsortoakéat lö-et) Immunizáltunk (htó-amuszkulárisan) a I l-valens pneamokokküsz poliszschafid-proíein. íhkonjogátum oltóanyaggal először 20 hetes korbaji (D0), majd másodszor két héttel később (D l 4), A második Immunizálás mán 7 nappal vert vettünk. A protein D elhh ellenanyaglitereket IgGl, lgö2a és lgG2b típusú ellenanyagok mennyiségének vonatkozásába» mértük.
.Fagyaszzva-szőrítetf I l-valens oltóanyagot (ÁIPO4 nélkül)állítottunk elő a konjugámmok 15,75% laktóz·· zal való kombinálása révén, 15 perc keveréssel szobahőmérsékleten, a ρΗ-t 6,IAö,l-re állítva, és hofílíxákuk (a ciklus általában -69C-o:n kezdtük, fokozatosan -24C-ra állítottuk 3 óm alatt, majd tartottuk ezt a hőmérsékletet 18 órán keresztül, utána fokozatosan -ló'C-ra állítottuk I óra alatt majd tartottuk ezt a hőmérsékletet 6 érán ke resztül, utána fokozatosan. 34°C-ra állítottuk 3 óra alatt, maid tartottuk ezt a hőmérsékletet 9 óráit keresztül).
A kiszerelések és a lioíllizátumokaí mkonsdteáló oldatok összetételét a 13, táblázatban mutatjuk be.
A legjellegzetesebb mérés Th I -típusú sejt-közvetített immunválasz bekövetkeztére ismert módon a korreláció sz lgö2a-e.lle.na;ayagok szintjével. Mint ahogyan az adatokból láthattuk, meglepted nagy ígG2akonceafiáeió emelkedés az eredménye annak, hogy a protein D-t Thl-aáiuvánssai (ebben az esetben 3D-M.P1..lel) együtt liofilizáitok.
SzbW ?s ta»· $&«#« Wá!ó Retasfa lgö M2fe lg® Igöh Ip
w> ŐWi Sfafe gísl %
ίφ» Ug 5¾ β író 2W ” író 75 0125 9,24 »1 0,554 «,213
folyadék. hs 5¾ ni® 2-PE ni® : fe 0,204 0,170 W 0,427i 0305
folyadék Iffi «ffi író 2« β tó 0> <w 00,4 512 0,520
a?A 5 ffi tóo β : ni® ΜΈ nincs 5,2 (W 0,043 96,1 3,12 0,795
ΐ® b« «ffi író · 3,I3%IAfe ni® 150ö«ll 5,2 w »5 §0,4 2,73 0,053
& 5g «ffi iró imife ............ nró SisiMM! 11,1 (i,n 0,® §7,0 8,967 1,477
Ho iffi bs író 3,15% tt& ni® jöiffiAlW <5 0,025 95,9 B 9,1®
líü 5ffi «ffi » wiá « 1§ w 0,1» §tó 0,401 0.620
fe m «ffi « 3>M& író 53 ffi»’ 45 tó 3,5 00,1 5,00 0,099
fc Jg «ffi M Wiste 58g»ÍL' 25 tó «,§ 15,1 3»
& «ffi »íW V%Mt : nincs píífef : 41 22 5,7 W 31,i 0,002
fidyadák: iffi MRW nincs 2« ni® 441 υ y 90,5 1,55 1«
wa 5g »ffi fcplö író 2-PE író 2» M o,w w 0,405 w
LUiOl « ♦ ♦♦ ♦ ♦ í « < * »♦» ♦ 4 » ί ί 4 ♦♦♦» »
♦ 44

Claims (9)

  1. SZA8ADALMI IGÉNYPONTOK , Immunegén készítmény, amely legalább- négy szeroíipusbel származó legalább négy Sírepíococcízr p/tí'Uffta.níae poliszáé harid-astigérd, legalább két óWpío<?oeea.y/’m?í»'??.o.uás<e fehérfeaniigérsS: tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szentéi isanonegán készítmény, amely fcbétjeastigénkést Strepíococcns pneumoHte külső felszínt fehérjéiét vagy szekretáit fehérjéjét tartalmazza.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti inanoacgéa készítmény, amely fehérseantigénkéttt .óTrepóxtooua'.í /wewsűtóK toxisját, aáhezinjét vagy Üpoprotemjéí tartstaazza.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok: bármelyike szerinti mmmxtogéa készítmény, amely a legalább két Streptococmj· pneamoRám febérieantigénkáat pseuniatizm, PspA, PspC, PsaA, giíceraidehid-o-foszfát-debkkogeuás, vagy CbpA bármelyikét tartalmazza.
  5. 5. Az. 1-4, igénypontok bármelyike- szerinti tmmunogéa készítmény, amelyben a legalább négy pokszaehsrid-amigéo poliszaeharid-hordozófehérje-krttingátam alakjában van prezentálva.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti immmjogén készítmény, amely hordozófehérjekéoí áil'íéria.-toxosd, tetanusztoxöid, CRMI97, kürtöscsiga („keybole iimpeí”! benmemmja (KLíí), toberkuim íehérieszármszéka (PPDj vagy.íí. protein D bármelyikét tartnimazztt.
  7. 7. Az 1-ti. igénypontok bármelyike szerinti imr?mnegéa készítmény, amely arljüvánsiíéut az alábbiak legalább egyikét tartalmazza; 3D-MPL, szaponin. ttntnanstinaűáns vagy ímmunstimuláns hatású CgPoligonukleotiö,
    b.
  8. Az 1-7, igénypontok bármelyike szerinti immtmogést készítmény, amely legalább négy szerotipusból származó legalább négy pímomoakíe polsszaeharíd-autígéni tartalmaz kombinációban legalább két óátep/ococcto' fetfetjeantigénsel, gyógyszerként tőrfeaö alkalmazásra.
  9. 9. Oltóanyag, amel;/ az 1-7, igénypontok bármelyike sze-nnti immunoén készítményt tartalmaz,
    IÖ, Legalább négy szeroüpusbóí szárrnaző legalább négy pneumokokkusx políszaeharíd-aatigéíi legalább két Ótí-cpíbcoccu.? pnetösonme fefeérjeautígérsnel való kombinációban történő alkalmazása 55 évesnél idősebb betegek tüdőgyulladásának megelőzésére alkalmas gyógyszer gyártására.
    ti. Eljárás az 1-107. igénypontok bármelyike szerinti ímmunogén készítmény előállítására ózza! jettemew, hogy;
    kiválasztunk négy vagy több pneomokokkusz potiszseh&úd-öniigártti kiválasztunk kés vagy több poeumokokknsz fefeérfeantígéat;
    összekeverjük a políszaeharid- és felferjeautigénfekejí és adjuvánst megfelelő kötőanyaggal
HU0200373A 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine HU228499B1 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906437.0A GB9906437D0 (en) 1999-03-19 1999-03-19 Vaccine
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) 1999-04-20 1999-04-20 Novel compositions
GBGB9909466.6A GB9909466D0 (en) 1999-04-23 1999-04-23 Vaccines
GBGB9916677.9A GB9916677D0 (en) 1999-07-15 1999-07-15 Vaccine
PCT/EP2000/002467 WO2000056359A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Vaccine against streptococcus pneumoniae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0200373A2 HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
HU228499B1 true HU228499B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=27451884

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200664A HUP0200664A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine
HU0200373A HU228499B1 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine
HU0200367A HU229968B1 (hu) 1999-03-19 2000-03-17 Sztreptokokkusz oltóanyag
HUS1500040C HUS1500040I1 (hu) 1999-03-19 2015-07-14 Sztreptokokkusz oltóanyag

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200664A HUP0200664A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200367A HU229968B1 (hu) 1999-03-19 2000-03-17 Sztreptokokkusz oltóanyag
HUS1500040C HUS1500040I1 (hu) 1999-03-19 2015-07-14 Sztreptokokkusz oltóanyag

Country Status (32)

Country Link
US (8) US20030147922A1 (hu)
EP (6) EP1163000B1 (hu)
JP (4) JP2002539273A (hu)
KR (3) KR100642044B1 (hu)
CN (3) CN100339130C (hu)
AR (3) AR022965A1 (hu)
AT (3) ATE346608T1 (hu)
AU (3) AU750788B2 (hu)
BE (1) BE1025464I2 (hu)
BR (4) BR0009166A (hu)
CA (3) CA2365296A1 (hu)
CY (3) CY1107561T1 (hu)
CZ (3) CZ20013378A3 (hu)
DE (4) DE60032120T2 (hu)
DK (2) DK1162999T3 (hu)
ES (3) ES2275499T3 (hu)
FR (1) FR10C0008I2 (hu)
HK (3) HK1043728B (hu)
HU (4) HUP0200664A2 (hu)
IL (5) IL145044A0 (hu)
LU (1) LU91652I2 (hu)
MX (1) MXPA01009452A (hu)
MY (2) MY125202A (hu)
NL (1) NL300415I1 (hu)
NO (4) NO330736B1 (hu)
NZ (3) NZ513841A (hu)
PL (3) PL204890B1 (hu)
PT (2) PT1162999E (hu)
SI (2) SI1163000T1 (hu)
TR (3) TR200102735T2 (hu)
TW (3) TWI281403B (hu)
WO (3) WO2000056360A2 (hu)

Families Citing this family (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
EP0909323B1 (en) 1996-01-04 2007-02-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Helicobacter pylori bacterioferritin
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US20010016200A1 (en) * 1998-04-23 2001-08-23 Briles David E. Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
NZ508927A (en) 1998-05-22 2003-12-19 Ottawa Health Research Inst Methods and products for inducing mucosal immunity
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
TR200102735T2 (tr) 1999-03-19 2002-04-22 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Aşı.
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2330083T3 (es) 2000-10-27 2009-12-04 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Acidos nucleicos y proteinas de estreptococos de los grupos a y b.
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
US7082569B2 (en) 2001-01-17 2006-07-25 Outlooksoft Corporation Systems and methods providing dynamic spreadsheet functionality
PT1355673E (pt) 2001-01-23 2012-08-31 Sanofi Pasteur Inc Vacina meningocócica multivalente preparada com um conjugado de polissacárido e proteína
AU2002254901A1 (en) 2001-02-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0109297D0 (en) * 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US20050106162A1 (en) 2001-12-12 2005-05-19 Guido Grandi Immunisation against chlamydia trachomatis
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003070909A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
JP4662537B2 (ja) * 2002-05-14 2011-03-30 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 細菌性髄膜炎に関する粘膜組合せワクチン
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
PT2353608T (pt) 2002-10-11 2020-03-11 Novartis Vaccines And Diagnostics S R L Vacinas de polipéptidos para protecção alargada contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
CN1705679B (zh) * 2002-10-15 2011-04-06 英特塞尔股份公司 编码b族链球菌粘着因子的核酸、b族链球菌的粘着因子和它们的用途
JP2006504801A (ja) 2002-11-01 2006-02-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 乾燥方法
JP5814494B2 (ja) 2002-11-12 2015-11-17 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する多糖類ワクチン
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US7956043B2 (en) 2002-12-11 2011-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5′ CpG nucleic acids and methods of use
EP1585542B1 (en) 2002-12-27 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions containing phospholipid
FR2850106B1 (fr) * 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
EP1587537B1 (en) * 2003-01-30 2012-04-11 Novartis AG Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
WO2004080490A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
WO2004081515A2 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
EP1608369B1 (en) 2003-03-28 2013-06-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of organic compounds for immunopotentiation
CA2528007C (en) 2003-06-02 2012-03-27 Chiron Corporation Immunogenic compositions based on microparticles comprising adsorbed toxoid and a polysaccharide-containing antigen
DE602004032481D1 (de) * 2003-10-02 2011-06-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Kombinationsimpfstoffe gegen Meningitis
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
AU2005237289B2 (en) 2004-04-30 2011-08-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Meningococcal conjugate vaccination
US7444197B2 (en) * 2004-05-06 2008-10-28 Smp Logic Systems Llc Methods, systems, and software program for validation and monitoring of pharmaceutical manufacturing processes
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
WO2006002422A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Compounds for immunopotentiation
WO2006115509A2 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
CA2575548A1 (en) 2004-07-29 2006-07-27 John L. Telford Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
AU2006208208B2 (en) 2005-01-27 2011-05-19 Children's Hospital & Research Center At Oakland GNA1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
LT2351772T (lt) 2005-02-18 2016-10-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Baltymai ir nukleorūgštys iš su meningitu/sepsiu susijusių escherichia coli
AU2006216844B2 (en) 2005-02-18 2012-11-08 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogens from uropathogenic escherichia coli
GB0505518D0 (en) 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR102611449B1 (ko) * 2005-04-08 2023-12-06 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
SG175456A1 (en) 2005-04-18 2011-11-28 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation
CN102218138A (zh) 2005-06-27 2011-10-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
US8007807B2 (en) 2005-09-01 2011-08-30 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Multiple vaccination including serogroup C meningococcus
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
EP1969001A2 (en) 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
PL3017827T3 (pl) * 2005-12-22 2019-04-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Szczepionka z koniugatem polisacharydu pneumokokowego
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG10201600336RA (en) * 2006-01-17 2016-02-26 Arne Forsgren A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CN101024079B (zh) * 2006-02-17 2012-02-01 福州昌晖生物工程有限公司 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法
KR101838938B1 (ko) * 2006-03-17 2018-03-15 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
PL2004225T3 (pl) 2006-03-22 2012-09-28 Novartis Ag Schematy immunizacji koniugatami meningokokowymi
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
EP2357184B1 (en) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
JO3420B1 (ar) * 2006-03-30 2019-10-20 Brigham & Womens Hospital Inc تركيبة صيدلانية ولقاح للوقاية من اصابات المكورة العقدية
US20100021503A1 (en) * 2006-03-30 2010-01-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
PL2054431T3 (pl) * 2006-06-09 2012-07-31 Novartis Ag Konformery adhezyn bakteryjnych
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
JP2010500399A (ja) 2006-08-16 2010-01-07 ノバルティス アーゲー 尿路病原性大腸菌由来の免疫原
WO2008045852A2 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Wyeth Purification of streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
EA200901578A1 (ru) 2007-06-26 2010-08-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CA2699513C (en) 2007-09-12 2018-03-13 Novartis Ag Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies
DK2200642T3 (da) 2007-10-19 2012-07-16 Novartis Ag Meningococvaccinepræparater
WO2009062132A2 (en) 2007-11-09 2009-05-14 California Institute Of Technology Immunomodulating compounds and related compositions and methods
AU2008335457B2 (en) 2007-12-07 2015-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
CA2709927C (en) 2007-12-21 2017-05-16 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
BRPI0907843A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Novartis Ag Polipeptídeos de fhbp menigocócicos
WO2009114485A2 (en) 2008-03-10 2009-09-17 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use
EP2315747B1 (en) 2008-07-21 2017-12-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides
HUE029265T2 (hu) 2008-10-27 2017-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa A csoportba tartozó streptococcusból származó szénhidrát tisztítási eljárása
CN102245198B (zh) 2008-12-09 2016-08-17 辉瑞疫苗有限责任公司 IgE CH3肽疫苗
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
US20100189737A1 (en) 2008-12-17 2010-07-29 Arico Beatrice Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
US8425922B2 (en) 2009-01-05 2013-04-23 EpitoGenesis, Inc. Adjuvant compositions and methods of use
WO2010079464A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Novartis Ag Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria
HUE049695T2 (hu) 2009-03-24 2020-10-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuváló H meningococcus faktort kötõ fehérje
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
ES2565377T3 (es) 2009-04-14 2016-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones para inmunización contra Staphylococcus aureus
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
NZ597191A (en) 2009-06-22 2013-11-29 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
SA110310528B1 (ar) 2009-06-22 2014-07-02 Wyeth Llc التركيبات المولدة للمناعة لأنتيجينات ستافيلوكوكس أوريس
US8647621B2 (en) 2009-07-27 2014-02-11 Fina Biosolutions, Llc Method of producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
RU2518291C2 (ru) 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
NZ598458A (en) 2009-08-27 2014-03-28 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
DK2473605T3 (en) * 2009-09-03 2018-05-28 Pfizer Vaccines Llc PCSK9-VACCINE
CA2773637A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"
MX2012004851A (es) 2009-10-30 2012-05-22 Novartis Ag Purificacion de sacaridos capsulares de staphylococcus aureus tipo 5 y tipo 8.
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
CA2836140C (en) 2009-12-17 2016-06-21 Fina Biosolutions, Llc Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the preparation of conjugate vaccines
CN107412754A (zh) 2009-12-22 2017-12-01 塞尔德克斯医疗公司 疫苗组合物
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
ES2977505T3 (es) 2010-03-30 2024-08-26 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Proteínas de unión al factor H (fHbp) con propiedades alteradas y métodos de uso de las mismas
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2555753B1 (en) 2010-04-07 2018-08-01 California Institute of Technology Vehicle for delivering a compound to a mucous membrane and related compositions, methods and systems
US20110287048A1 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Round June L Antigen Specific Tregs and related compositions, methods and systems
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
DK2575870T3 (en) * 2010-06-04 2017-02-13 Wyeth Llc vaccine Formulations
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
EP2942061A3 (en) 2010-06-07 2016-01-13 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
WO2011161653A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
EP2667852B1 (en) 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
WO2012117377A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US10357568B2 (en) 2011-03-24 2019-07-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant nanoemulsions with phospholipids
EP2511295A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions for preventing and/or treating an infection by an HIV-1 virus
EA030920B1 (ru) 2011-05-06 2018-10-31 Петр Геннадьевич АПАРИН Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
US10561720B2 (en) 2011-06-24 2020-02-18 EpitoGenesis, Inc. Pharmaceutical compositions, comprising a combination of select carriers, vitamins, tannins and flavonoids as antigen-specific immuno-modulators
CN103764171B (zh) 2011-07-08 2016-08-17 诺华股份有限公司 酪氨酸连接方法
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
WO2013038375A2 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
US20140235667A1 (en) 2011-09-22 2014-08-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazopyridyl compounds as aldosterone synthase inhibitors
WO2013068949A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Novartis Ag Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen
EP2592137A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Novartis AG Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
DE102011122891B4 (de) 2011-11-11 2014-12-24 Novartis Ag Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
DE102011118371B4 (de) 2011-11-11 2014-02-13 Novartis Ag Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung
RU2014127714A (ru) 2011-12-08 2016-01-27 Новартис Аг ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ТОКСИНОВ Clostridium difficile
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
WO2013098589A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2817320A1 (en) 2012-02-24 2014-12-31 Novartis AG Pilus proteins and compositions
US20150132339A1 (en) 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
US20150125486A1 (en) 2012-03-08 2015-05-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of pediatric antigens
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
JP6401148B2 (ja) 2012-04-26 2018-10-03 ノバルティス アーゲー 抗原および抗原の組み合わせ
HUE044612T2 (hu) 2012-05-04 2019-11-28 Pfizer Prosztata-asszociált antigének és vakcina-alapú immunterápiás rendek
CA2874210A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Novartis Ag Meningococcus serogroup x conjugate
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
KR20150073943A (ko) 2012-10-03 2015-07-01 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 면역원성 조성물
CN104918634A (zh) 2012-10-12 2015-09-16 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于组合疫苗的非交联无细胞百日咳抗原
CN104968366B (zh) * 2012-10-17 2017-12-01 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合物和含有来自流感嗜血杆菌的蛋白E和/或PilA的蛋白组分的免疫原性组合物
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CA2899787A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Intradermal delivery of immunological compositions comprising toll-like receptor agonists
EP2994161B1 (en) 2013-05-10 2020-10-28 California Institute of Technology Probiotic prevention and treatment of colon cancer
JP2016520077A (ja) 2013-05-15 2016-07-11 ザ ガバナーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アルバータ Ｅ１ｅ２ｈｃｖワクチン及び使用方法
CN103386126B (zh) * 2013-06-25 2015-06-17 北京科兴生物制品有限公司 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物
AU2014316722B2 (en) 2013-09-08 2017-09-07 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2015095868A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
EP3096785B1 (en) 2014-01-21 2020-09-09 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3957321A3 (en) 2014-01-21 2022-07-13 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2015123291A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
KR20160127104A (ko) 2014-02-28 2016-11-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 변형된 수막구균 fhbp 폴리펩티드
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
CN104829711B (zh) * 2014-04-08 2018-04-03 北京天成新脉生物技术有限公司 脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
ES2922554T3 (es) 2014-07-23 2022-09-16 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Variantes de proteínas de unión al factor H y métodos de uso de las mismas
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
HRP20230416T1 (hr) 2015-01-15 2023-07-07 Pfizer Inc. Imunogeni pripravci, namijenjeni upotrebi u cjepivima protiv pneumokoka
CN104548090B (zh) * 2015-01-27 2016-11-30 中国科学院过程工程研究所 一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
WO2016184963A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Innavirvax Treatment of hiv-infected individuals
US11331335B2 (en) 2015-06-10 2022-05-17 California Institute Of Technology Sepsis treatment and related compositions methods and systems
EP3109255A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 Institut National De La Recherche Agronomique Immunogenic composition
CN107849119A (zh) 2015-07-07 2018-03-27 阿费里斯股份公司 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
RU2721128C2 (ru) 2015-07-21 2020-05-18 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные антигены капсульного сахарида, наборы, содержащие эти композиции, и их применения
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
WO2017096374A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccination with mica/b alpha 3 domain for the treatment of cancer
TW202111125A (zh) 2016-01-19 2021-03-16 美商輝瑞股份有限公司 癌症疫苗
EP3439704A1 (en) 2016-04-05 2019-02-13 GSK Vaccines S.r.l. Immunogenic compositions
EP3474890A1 (en) * 2016-06-22 2019-05-01 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3493840B1 (en) 2016-08-05 2022-08-24 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL264552B2 (en) 2016-08-05 2023-04-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
US20180064801A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for neisseria gonorrhoeae
KR102622188B1 (ko) 2016-10-07 2024-01-05 엔터롬 에스.에이. 암 치료를 위한 면역원성 화합물
CN110022894B (zh) 2016-10-07 2024-01-19 恩特罗姆公司 用于癌症疗法的免疫原性化合物
BE1025162B9 (fr) 2016-12-06 2019-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires
PL3570879T3 (pl) 2017-01-20 2022-06-20 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne do zastosowania w szczepionkach przeciw pneumokokom
IL267733B2 (en) 2017-01-31 2023-10-01 Pfizer NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor
CN110520154B (zh) * 2017-03-15 2023-08-04 株式会社Lg化学 多价肺炎链球菌疫苗组合物
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
US11167022B2 (en) 2017-03-31 2021-11-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
CN111132691A (zh) 2017-06-10 2020-05-08 创赏有限公司 提供改善的免疫原性和亲合力的具有二价或多价缀合物多糖的多价缀合物疫苗
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
MX2020001820A (es) 2017-08-14 2020-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Metodos para reforzar las respuestas inmunitarias.
KR102573200B1 (ko) 2017-12-06 2023-08-31 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
IL276229B2 (en) 2018-02-05 2024-01-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2019173438A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Stc. Unm Compositions and methods for reducing serum triglycerides
EP3773673A2 (en) 2018-04-11 2021-02-17 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of fibrosis, autoimmune diseases and inflammation
FI3773689T3 (fi) 2018-04-11 2023-01-31 Antigeenisiä peptidejä syövän ehkäisyyn ja hoitoon
US11951162B2 (en) 2018-04-18 2024-04-09 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and immunogenic conjugate thereof
CA3106291A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes for preparing dried polysaccharides
WO2020030572A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20220016229A1 (en) 2018-12-12 2022-01-20 Pfizer Inc. Immunogenic Multiple Hetero-Antigen Polysaccharide-Protein Conjugates and uses thereof
US20220054632A1 (en) 2018-12-12 2022-02-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified carrier proteins for o-linked glycosylation
SG11202106541WA (en) 2018-12-19 2021-07-29 Merck Sharp & Dohme Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CA3126492A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Northwestern University Bioconjugate vaccines synthesis in prokaryotic cell lysates
CA3129425A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3136278A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
CN113966234A (zh) 2019-05-10 2022-01-21 葛兰素史克生物有限公司 缀合物的产生
WO2021023691A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2021023692A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide
AU2020355401A1 (en) 2019-09-27 2022-04-14 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP4045150A1 (en) 2019-10-16 2022-08-24 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of adrenal cancer
CA3159573A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN114746112A (zh) 2019-11-15 2022-07-12 恩特罗姆公司 用于预防和治疗b细胞恶性肿瘤的抗原肽
CA3161857A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine
WO2021138495A1 (en) * 2019-12-30 2021-07-08 Fraunhofer Usa, Inc. Particles for multi-dose delivery
MX2022010355A (es) 2020-02-21 2022-09-21 Pfizer Purificacion de sacaridos.
CA3173729A1 (en) 2020-02-23 2021-08-26 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN111588847B (zh) * 2020-05-18 2023-05-26 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有单磷酸化的脂质a与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
US20230250142A1 (en) 2020-06-12 2023-08-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dock tag system
WO2022035816A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Inventprise, Llc Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24f
JP2023546615A (ja) 2020-10-27 2023-11-06 ファイザー・インク 大腸菌組成物およびその方法
KR20230097160A (ko) 2020-11-04 2023-06-30 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
EP4243863A2 (en) 2020-11-10 2023-09-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
MX2023009728A (es) 2021-02-19 2023-08-30 Sanofi Pasteur Inc Vacuna recombinante meningococica b.
WO2022175423A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition, use and methods
EP4070814A1 (en) 2021-04-07 2022-10-12 Lama France Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
TW202306969A (zh) 2021-05-28 2023-02-16 美商輝瑞大藥廠 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途
JP2024522395A (ja) 2021-05-28 2024-06-19 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
CN118434441A (zh) 2021-11-18 2024-08-02 马特里瓦克斯公司 免疫原性融合蛋白组合物和其使用方法
CN118510548A (zh) 2022-01-13 2024-08-16 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
AU2023246941A1 (en) 2022-03-31 2024-10-24 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer.
AU2023268745A1 (en) 2022-05-11 2024-11-07 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024201324A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024214016A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE68929323T2 (de) * 1988-12-16 2002-04-18 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin-mutanten und pneumokokken-impfstoffe daraus
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
WO1994000153A1 (en) 1992-06-25 1994-01-06 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine composition containing adjuvants
ATE211654T1 (de) * 1992-09-16 2002-01-15 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
KR100310510B1 (ko) 1993-03-23 2002-07-04 장 스테판느 3-0-탈아세틸화모노포스포릴지질a를함유하는백신조성물
ATE226831T1 (de) 1993-05-18 2002-11-15 Univ Ohio State Res Found Impfstoff gegen mittelohrentzündung
NZ274376A (en) 1993-09-22 1997-11-24 Jackson H M Found Military Med Activating soluble carbohydrate using cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
DE69535036T3 (de) 1994-07-15 2011-07-07 The University of Iowa Research Foundation, IA Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
CA2218385A1 (en) * 1995-04-17 1996-10-24 Pierre Hauser Induction and enhancement of the immune response to polysaccharides with bacterial lipoproteins
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
PL323781A1 (en) 1995-06-07 1998-04-27 Biochem Vaccines Inc Streptococco thermal shock proteins belonging to a family hsp70
ES2164251T5 (es) 1995-06-07 2006-06-01 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vacuna que comprende un conjugado antigeno polisacarido-proteina transportadora y proteina transportadora libre.
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
SE9601158D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JPH102001A (ja) * 1996-06-15 1998-01-06 Okajima Kogyo Kk グレーチング
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
CA2292838A1 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
HUP0002475A3 (en) 1997-07-21 2002-01-28 Baxter Healthcare S A Wallisel Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
NZ530277A (en) 1998-04-07 2005-08-26 Medimmune Inc Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
NZ509986A (en) 1998-08-19 2003-10-31 Baxter Healthcare S Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines
WO2000037105A2 (en) * 1998-12-21 2000-06-29 Medimmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
TR200102735T2 (tr) 1999-03-19 2002-04-22 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Aşı.
GB9909077D0 (en) * 1999-04-20 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Novel compositions
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN201252175Y (zh) * 2008-08-04 2009-06-03 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 线缆连接器组件

Also Published As

Publication number Publication date
HK1043728B (zh) 2007-06-22
NL300415I1 (nl) 2009-12-01
DK1162999T3 (da) 2007-03-26
DE122009000054I1 (de) 2009-12-31
EP1163000B1 (en) 2008-02-27
ATE346608T1 (de) 2006-12-15
AU3813600A (en) 2000-10-09
HK1043730A1 (zh) 2002-09-27
KR20020000785A (ko) 2002-01-05
CY2009014I2 (el) 2010-07-28
NO20014325L (no) 2001-11-14
JP2002540075A (ja) 2002-11-26
KR20020000549A (ko) 2002-01-05
AU750762B2 (en) 2002-07-25
US8926985B2 (en) 2015-01-06
NZ513840A (en) 2004-02-27
CZ20013379A3 (cs) 2002-03-13
ES2339737T3 (es) 2010-05-25
IL145043A0 (en) 2002-06-30
LU91652I2 (fr) 2010-10-13
WO2000056359A2 (en) 2000-09-28
TR200102736T2 (tr) 2002-04-22
EP1776962A1 (en) 2007-04-25
IL145045A0 (en) 2002-06-30
AU3430700A (en) 2000-10-09
US20050031646A1 (en) 2005-02-10
CZ301445B6 (cs) 2010-03-03
US20030147922A1 (en) 2003-08-07
EP1163000A2 (en) 2001-12-19
DE60032120D1 (de) 2007-01-11
FR10C0008I2 (fr) 2012-10-26
US20060002961A1 (en) 2006-01-05
WO2000056359A3 (en) 2001-02-01
EP1880735A2 (en) 2008-01-23
BR0009154A (pt) 2001-12-26
CY1107390T1 (el) 2010-07-28
DE60038166T2 (de) 2009-03-12
MXPA01009452A (es) 2002-08-06
AR022963A1 (es) 2002-09-04
CZ20013380A3 (cs) 2002-03-13
ES2275499T3 (es) 2007-06-16
ES2300255T3 (es) 2008-06-16
NO330736B1 (no) 2011-06-27
HU229968B1 (hu) 2015-03-30
LU91652I9 (hu) 2019-01-03
HK1043731A1 (en) 2002-09-27
HK1043731B (zh) 2009-01-23
CA2366314A1 (en) 2000-09-28
CN1351503A (zh) 2002-05-29
MY125387A (en) 2006-07-31
WO2000056360A3 (en) 2001-01-25
AR022965A1 (es) 2002-09-04
CZ303653B6 (cs) 2013-01-30
PL204890B1 (pl) 2010-02-26
SI1162999T1 (sl) 2007-04-30
PL203917B1 (pl) 2009-11-30
BR0009163A (pt) 2001-12-26
JP2002539273A (ja) 2002-11-19
HUP0200664A2 (en) 2002-06-29
PL355180A1 (en) 2004-04-05
CN1191852C (zh) 2005-03-09
HUP0200367A2 (en) 2002-05-29
NO330532B1 (no) 2011-05-09
NO20014323L (no) 2001-11-14
US20150079125A1 (en) 2015-03-19
CA2366314C (en) 2012-01-10
NO20014322L (no) 2001-11-14
CA2366152A1 (en) 2000-09-28
CN100339130C (zh) 2007-09-26
BRPI0009163B1 (pt) 2019-04-09
NO20014323D0 (no) 2001-09-05
NZ513841A (en) 2001-09-28
PT1163000E (pt) 2008-03-20
US20100291138A1 (en) 2010-11-18
AU750913B2 (en) 2002-08-01
IL145044A (en) 2007-03-08
NO20014322D0 (no) 2001-09-05
HK1043728A1 (en) 2002-09-27
HUS1500040I1 (hu) 2018-05-28
US20100119544A1 (en) 2010-05-13
NL300415I2 (hu) 2016-12-13
DE60032120T2 (de) 2007-09-20
EP2277535A2 (en) 2011-01-26
CN1391481A (zh) 2003-01-15
NO2011014I1 (no) 2011-09-19
ATE459373T1 (de) 2010-03-15
PT1162999E (pt) 2007-02-28
EP2277535A3 (en) 2011-03-09
SI1163000T1 (sl) 2008-06-30
PL355264A1 (en) 2004-04-05
TWI235064B (en) 2005-07-01
NO20014325D0 (no) 2001-09-05
BRPI0009163B8 (pt) 2021-05-25
EP1162999A2 (en) 2001-12-19
AR022964A1 (es) 2002-09-04
AU3291900A (en) 2000-10-09
BR0009166A (pt) 2001-12-26
EP1162999B1 (en) 2006-11-29
AU750788B2 (en) 2002-07-25
HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
WO2000056358A3 (en) 2001-01-04
TR200102739T2 (tr) 2001-12-21
KR100798212B1 (ko) 2008-01-24
US20110217329A1 (en) 2011-09-08
CN1351501A (zh) 2002-05-29
DK1163000T3 (da) 2008-04-28
EP1880735A3 (en) 2008-03-12
BE1025464I2 (hu) 2019-03-06
JP5551579B2 (ja) 2014-07-16
KR20020001785A (ko) 2002-01-09
DE60038166D1 (de) 2008-04-10
WO2000056360A2 (en) 2000-09-28
TWI286938B (en) 2007-09-21
JP4846906B2 (ja) 2011-12-28
US20060093626A1 (en) 2006-05-04
IL145043A (en) 2007-06-17
CZ20013378A3 (cs) 2002-03-13
US9168313B2 (en) 2015-10-27
CY2009014I1 (el) 2010-07-28
TWI281403B (en) 2007-05-21
CN1192798C (zh) 2005-03-16
DE60043930D1 (de) 2010-04-15
CA2365296A1 (en) 2000-09-28
CY1107561T1 (el) 2013-03-13
IL145044A0 (en) 2002-06-30
WO2000056358A2 (en) 2000-09-28
NZ513842A (en) 2004-05-28
MY125202A (en) 2006-07-31
JP2011057713A (ja) 2011-03-24
EP1162998B1 (en) 2010-03-03
EP1162998A2 (en) 2001-12-19
TR200102735T2 (tr) 2002-04-22
NO2011014I2 (no) 2011-08-30
ATE387214T1 (de) 2008-03-15
PL355178A1 (en) 2004-04-05
JP2002540074A (ja) 2002-11-26
KR100642044B1 (ko) 2006-11-10
FR10C0008I1 (fr) 2010-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228499B1 (en) Streptococcus vaccine
AU2019208271A1 (en) Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
ZA200107638B (en) Vaccine.
US20150079129A1 (en) Vaccine
MXPA01009459A (es) Vacuna
BRPI0017607B1 (pt) Método para a produção de uma composição imunogênica
MXPA01009455A (en) Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees