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KR20200071079A - 공동-자극을 위한 신규한 플랫폼, 신규한 car 설계 및 입양 세포 치료를 위한 다른 향상 - Google Patents

공동-자극을 위한 신규한 플랫폼, 신규한 car 설계 및 입양 세포 치료를 위한 다른 향상 Download PDF

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KR20200071079A
KR20200071079A KR1020207012047A KR20207012047A KR20200071079A KR 20200071079 A KR20200071079 A KR 20200071079A KR 1020207012047 A KR1020207012047 A KR 1020207012047A KR 20207012047 A KR20207012047 A KR 20207012047A KR 20200071079 A KR20200071079 A KR 20200071079A
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KR
South Korea
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receptor
antigen
cell
protein
immune
Prior art date
Application number
KR1020207012047A
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English (en)
Inventor
프릿 엠. 차우다리
Original Assignee
유니버시티 오브 써던 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 개시내용은 입양 세포 요법을 촉진하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용은 NFkB 활성의 특이적 활성화제와 조합하여, 키메라 항원 수용체 (CAR), 합성 면역 수용체 (SIR) 등을 포함함으로써, 세포 증식, 발현 및 감소된 아폽토시스를 개선하고, 입양 세포 요법에서의 세포 지속성을 개선하는 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 시스템 및 세포를 제공한다.

Description

공동-자극을 위한 신규한 플랫폼, 신규한 CAR 설계 및 입양 세포 치료를 위한 다른 향상
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 27일자로 출원된 미국 가출원 제 62/564,249호에 대해 35 U.S.C. §119 하의 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
암, 감염, 알레르기, 퇴행성 및 면역 장애의 입양 세포 요법(adoptive cellular therapy)을 위한 신규한 공자극 모듈 및 신규한 키메라 항원 수용체가 본 명세서에 제공된다.
서열목록의 참조 포함
본 출원에는 2018년 9월 27일에 생성된 60,347,260 바이트의 데이터를 가진 MS-Windows 운영 체제인 IBM-PC에서 장치 포맷된 "Sequence_ST25.txt"라는 파일명의 서열목록이 첨부되어 있다. 서열목록은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
입양 T 세포 면역요법은 암에 대한 치료 접근법의 최전선으로 부상했다. T 세포는 종양 관련 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 유전자를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR은 조작된 면역-수용체로서, T 세포를 방향 전환시켜 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 암 면역요법에서의 그 용도를 위한 일반적인 전제는 활성 면역화의 장벽과 증량적 동역학을 우회하여 '살아 있는 약물'로 작용하여 종양 표적화된 T 세포를 급속하게 생성하는 것이다. HLA-펩타이드 복합체와 결합하는 생리학적 T 세포 수용체 (TCR)와 달리, CAR은 펩타이드 가공 또는 인식되는 HLA 발현이 필요하지 않은 분자와 결합한다. 따라서, CAR은 환자의 일배체형에 일치해야 하는 TCR과 달리 임의의 HLA 백그라운드에서 항원을 인식한다. 또한, CAR은 TCR-매개 면역으로부터 종양 탈출에 관여하는 2가지 메커니즘인 하향 조절된 HLA 발현 또는 프로테아좀 항원 가공을 갖는 종양 세포를 표적화할 수 있다. CAR의 광범위한 적용의 또 다른 특징은 단백질뿐만 아니라, 탄수화물 및 당지질 구조에 결합하여 잠재적인 표적의 범위를 다시 확장시키는 능력이다.
본 개시내용은 (i) 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및 (ii) NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시키는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 발현하는 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합을 제공한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 적어도 하나의 항원-결합 도메인 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 적어도 하나의 TCR 관련 신호전달 모듈을 채용할 수 있다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 재조합 TCR이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체의 적어도 하나의 항원-결합 도메인은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 (Interleukin-13) 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린 (Mesothelin); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (Protease Serine 21) (테스티신 (Testisin) 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (Mucin 1) (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제 (Prostase); 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2 (Ephrin B2); 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (Proteasome) (프로좀 (Prosome), 마크로파인 (Macropain)) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 (Abelson) 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (transglutaminase 5) (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (Claudin 6) (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (uroplakin 2) (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (adrenoceptor beta 3) (ADRB3); 파넥신 3 (pannexin 3) (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (Wilms tumor protein) (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴 (angiopoietin)-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인 (prostein); 서바이빈 (survivin); 텔로머라제 (telomerase); 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8 (Galectin 8)), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체 (androgen receptor); 사이클린 Bl (Cyclin B1); v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제 (Tyrosinase)-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질 (Zinc finger protein))-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 (proacrosin) 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (renal ubiquitous 1) (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인 (legumain); 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (influenza A hemagglutinin) (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (desmoglein 3) (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4 (Nectin-4), 크립토 (Cripto), gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 vFLIP K13, K13-opt, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 임의의 유전자 편집 시스템, 이들의 임의의 상동체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 비 바이러스 유래이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 유전자 편집 시스템이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 NEMO/IKKγ의 올리고머화를 유도한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 IKK 복합체의 활성화를 유도한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 AKT 경로를 활성화시키지 않는다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 항시적 또는 유도성 방식으로 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 일시적으로 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 안정하게 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로의 활성을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 세포와 화합물의 접촉을 통해 번역 후 제어된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 스위치 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물로서 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, NF-κB 경로의 활성을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 스위치 도메인의 이량체화의 이량체화를 유도하는 화합물의 치료 유효량의 투여에 의해 번역 후 수준에서 제어된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 스위치 도메인은 FKBP12 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 화합물은 AP20187 또는 리미두시드 (Rimiducid) 또는 그의 상동체이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 면역 세포는 T-림프구 (T 세포), CAR-T 세포, TCR-발현 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 조직 상재 림프구, 줄기세포, 유도된 전능성 줄기세포 또는 자연 살해 (NK) 세포이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 면역 세포는 기능성 고유 T 세포 수용체 (TCR) 신호전달 복합체 및/또는 β2 마이크로글로불린이 부재하도록 조작된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 제제의 발현이 TCR 유전자의 내인성 조절 요소/프로모터의 제어 하에 있도록 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 제제는 내인성 TCR 유전자 내에 클로닝된다. 본 개시내용은 또한 암, 감염성 질병, 면역 질병 및 알레르기 질병의 군으로부터 선택되는 질병의 예방 및 치료에 사용되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 세포 또는 면역 세포 집합의 용도를 제공한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 단일 프로모터로부터 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 개별 프로모터를 사용하여 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는, 제1 및 제2 핵산 코딩 서열의 발현시 비천연 발생 면역 수용체 및 NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제가 물리적 또는 화학적으로 연결되지 않도록, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제를 인코딩하는 제2 핵산 서열로부터 분리된 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 제1 핵산 코딩 서열을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 적어도 하나의 NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제가 TCR 유전자의 내인성 조절 요소/프로모터의 제어 하에 있도록 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 코딩 폴리뉴클레오타이드(들)를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 내인성 TCR 유전자 내에 클로닝된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, TCR 유전자의 하나 이상의 불변 사슬이 기능적으로 재 발현된다.
본 개시내용은 또한 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드로서, (a) 일부 또는 전체 막관통 및/또는 세포질 도메인 및 선택적으로 내인성 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 도메인으로서, 내인성 단백질은 림프구의 표면에 발현되고, 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 제1 핵산 도메인; (b) 선택적으로 폴리뉴클레오타이드 링커; (c) 제1 핵산 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 도메인으로서, 제2 핵산 도메인은 하나 이상의 비천연 TCR 항원 결합 도메인(들)을 인코딩하는 제2 핵산 도메인; (d) 공자극 도메인을 인코딩하는 선택적 제3 핵산 도메인; 및 (e) 보조 모듈을 인코딩하는 추가의 선택적 핵산 도메인을 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 개시내용은 또한 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 제1 핵산; 및 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 보조 모듈을 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 실시형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 절단 가능한 펩타이드 링커를 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드 링커에 의해 분리된다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나는 제1 핵산 및 제2 핵산이 별도의 벡터로부터 발현되도록, 2개의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 비천연 발생 선택적 NF-κB 활성화제이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체는 CAR, Ab-TCR, TFP, cTCR, SIR 및 재조합 TCR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체는 (i) 세포외 항원 특이적 도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 선택적 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, (iii)은 비천연 발생 면역 수용체의 C 말단에 위치한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열의 발현시 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NF-κB 활성화제 폴리펩타이드는 물리적 또는 화학적으로 연결되지 않는다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 세포외 항원-특이적 도메인은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); AFP/MHC 복합체; 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); WT1/MHC I 복합체; 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); NY-ESO-1/MHC I 복합체, 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); HPV E6/MHC I 복합체; 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); HPV E7/MHC I 복합체; AFP/MHC I 복합체; Ras/MHC I 복합체; 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4, 크립토, gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원 중 임의의 하나에 결합한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 vFLIP K13, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, FKBPx2-RIP-ID, IKK1, FKBPx2-IKKα, IKK2, FKBPx2-IKK2, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 유전자 편집 시스템, NF-κB를 선택적으로 활성화시키는 RNA 간섭 시스템 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물을 발현한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 세포외 항원 특이적 도메인은 소정의 표적 항원에 특이적인 항체의 중쇄의 가변 영역 (vH) 또는 그의 단편; 소정의 표적 항원에 특이적인 항체의 경쇄의 가변 영역 (vL) 또는 그의 단편; 소정의 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편; 소정의 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예를 들어, Fv, Fab, (Fab')2); 소정의 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB) 단편; 소정의 표적 항원에 특이적인 낙타과 vHH 도메인; 소정의 표적 항원에 특이적인 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 소정의 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 그의 단편; 소정의 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 그의 단편; 하나 이상의 소정의 표적 항원에 특이적인 이중특이적-항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 자기항원 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서의 상기에 기재된 임의의 전술한 폴리뉴클레오타이드 작제물의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 제공한다. 일 실시형태에서, 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty) 트랜스포손 벡터, 및 피기백 (piggybac) 트랜스포손 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서의 상기에 기재된 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드, 작제물 또는 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기세포를 제공한다. 일 실시형태에서 면역 세포는 항원 제시 세포이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 인간 T 세포, 인간 NKT 세포 또는 합성 T 세포, NK 세포, 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포이고, 선택적으로, T 세포는 디아글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 Ikaros 결핍 및/또는 Brd4 결핍이다.
본 개시내용은 또한 (i) 발현 면역 세포의 수명을 연장하고, (ii) 면역 세포의 증식을 자극하고, (iii) 면역 세포에 의한 사이토카인 생성을 자극하고, (iv) 면역 세포에 의한 항원 제시를 증대시키고, (v) 아폽토시스로부터 면역 세포를 보호하기 위한 방법으로서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 면역 세포를 형질감염시키거나 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 vFLIP K13, K13-opt, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, 이들의 임의의 상동체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 항시적 또는 유도성 방식으로 발현된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 T 세포와 화합물의 접촉을 통해 번역 후에 제어된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물을 발현한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드의 활성은 FKBP 도메인의 이량체화를 유도하는 화합물의 치료 유효량의 투여에 의해 번역 후 수준에서 제어된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 화합물은 AP20187 또는 리미두시드이다.
본 개시내용은 또한 비천연 발생 면역 수용체-발현 면역 효과기 세포를 제조하는 방법으로서, 비천연 발생 면역 수용체가 발현되고, 면역 효과기 세포는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드가 부재하는 CAR-T 세포와 비교하여, (i) 연장된 수명, (ii) 개선된 T 세포 증식, 및/또는 (iii) 감소된 아폽토시스를 포함하도록 하는 조건 하에서 본 개시내용의 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 조혈모세포 또는 전구 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 방법은 면역 효과기 세포의 집합을 제공하는 단계; 및 상기 집합으로부터 T 조절 세포를 제거함으로써, T 조절-고갈 세포의 집합을 제공하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 단계는 벡터 또는 CAR 및/또는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 상기 집합에 도입시키기 전에 수행된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, T 조절 세포는 항-CD25 항체, 또는 항-GITR 항체를 사용하여 세포 집합으로부터 제거된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 방법은 a) 면역 효과기 세포의 집합을 제공하는 단계; 및 b) P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-양성 세포를 상기 집합으로부터 다량화함으로써, P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-다량화된 세포의 집합을 제공하는 단계를 추가로 포함하고; 단계 a) 및 b)는 벡터 또는 CAR 및/또는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 도입 전 또는 후에 수행된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, P-당단백질 양성 세포는 i) P-당단백질 특이적 항체 중 하나 또는 그의 칵테일을 사용한 면역선택 단계, ii) P-당단백질의 기질인 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 (TMRM), 아드리아마이신 (Adriamycin) 및 액티노마이신-D)의 형광 염료 중 하나 이상에 의해 P-당단백질이 펌프로서 활성인 조건 하에서 염색하고, 염료에 의해 덜 염색된 세포를 다량화하는 단계, iii) P-당단백질의 기질, 예컨대 TH9402, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 메틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 에틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 octyl 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(6-에틸 아미노-3-에틸 이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 하이드로클로라이드, 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상의 광독성 화합물에 저항성인 세포의 선택 단계, 및 iv) P-당단백질의 기질, 예컨대 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 탁솔 (taxol), 파클리탁셀 (paclitaxel), 미톡산트론 (mitoxantrone), 에토포시드 (etoposide), 아드리아마이신, 다우노루비신 (daunorubicin) 및 액티노마이신-D의 세포독성 화합물에 저항성인 세포의 선택 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 중 임의의 하나 이상을 사용하여 다량화된다.
본 개시내용은 또한 RNA-조작된 세포의 집합을 생성하는 방법으로서, 시험관내 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포의 집합 내에 도입시키는 단계를 포함하고, RNA 또는 RNA들은 본 개시내용의 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 항-질병 면역을 제공하는 방법으로서, 본 개시내용의 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 세포는 자가유래 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가유래 NKT 세포 또는 동종이계 NKT 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 자가유래 또는 동종이계 조혈모세포 또는 자가유래 또는 동종이계 iPSC인 방법을 제공한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NKT 세포 또는 조혈모세포 또는 iPSC는 기능성 TCR 또는 기능성 HLA의 발현이 부재하거나, 그의 발현이 낮다.
본 개시내용은 또한 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NFkB 활성화제를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 포함하는 조성물로서, 비천연 발생 면역 수용체는 관련된 질병-관련 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 질병-관련 항원은 CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙 (surviving); 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모막 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), KSHV-K8.1 단백질, KSHV-gH 단백질, 데스모글레인 3에 대한 자기항체 (Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자기항체 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 질병-관련 항원의 발현과 관련된 질병을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NFkB 활성화제를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 대상체에 투여함으로써, 대상체를 치료하거나, 대상체에서 질병을 예방하는 단계를 포함하고, 비천연 발생 면역 수용체는 관련된 질병-관련 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 질병-관련 항원은 CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모막 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), KSHV-K8.1 단백질, KSHV-gH 단백질, 데스모글레인 3에 대한 자기항체 (Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자기항체 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 제공한다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 질병 관련 항원의 발현과 관련된 질병은 증식성 질병, 전암성 병태, 암, 및 질병 관련 항원의 발현과 관련된 비 암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 (ALL), B 세포 급성 림프성 백혈병 (B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈병 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종, 1차 삼출 림프종, 여포성 림프종, 모세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 백혈병 전증 중 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 암은 결장암, 직장 암, 신장 세포 암종, 간 암, 폐의 비소세포 암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부 암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 자궁관암, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질병, 비호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 혈관신생 종양, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 메르켈세포암 (Merkel cell cancer), 표피암, 편평 세포 암, T 세포 림프종, 환경 유발 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 포진바이러스 6, 인간 포진바이러스 8 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, MERS 및 SARS 코로나바이러스, 크림 반도 콩고 유행성 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 랏사열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트밸리열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스를 포함하는 바이러스에 의한 감염과 관련되거나, 결핵균, 비정형 마이코박테리아 종, 폐포자충, 톡소포자충증, 리케차, 노카르디아, 아스페르길루스, 무코르, 또는 칸디다의 감염과 관련된 것이다. 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 심상성천포창, 강직성 척추염, 하시모토 갑상선염, SLE, 사르코이드증, 피부경화증, 혼합결합조직병, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병을 포함하는 면역 또는 퇴행성 질병이다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 첨부 도면 및 하기의 상세한 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 현재 항체, T 세포 수용체 (TCR), CAR 및 차세대 CAR 및 SIR의 도식을 도시한다.
도 2는 CD28 또는 41BB는 부재하나, NF-κB 자극 분자 (NEMO 및/또는 K13, 또는 그의 돌연변이체)를 발현하는 CAR을 도시하는 본 개시내용의 실시형태와 2세대 CAR 생물학적 활성 및 구조를 비교하는 도식을 도시한다.
도 3은 mNEMO-K270A, hNEMO-K277A에 의한 NF-κB의 강한 활성화 및 hNEMO-K277I 및 hNEMO-K277G 돌연변이체에 의한 약한 활성화를 도시한다.
도 4는 MPL을 표적화하고 161-scFv 표적화 도메인을 사용하는 이중특이적 T 세포 관여 인자의 활성을 도시한다. HEL-pLENTI-hGluc 및 T 세포를 4℃에서 2시간 동안 다음 상청액 배지 단독 및 pLENTI-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02 (042517-P02-SC)와 함께 별도로 사전 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 37℃에서 4시간 동안 1:1 또는 5:1의 E:T 비로 U-바닥 96-웰 플레이트에서 공동 배양하였다. 50 μl의 세포+상청액/웰을 삼중 반복실험으로 하여 384웰로 옮겼다. 15 ul의 CTZ 분석 완충액 (1:100)을 사용하여 hGLuc 분석을 수행하였다.
도 5a 내지 도 5c는 TRAC 좌위로 표적화된 CRISPR/Cas9-매개 TFP 유전자 및 TRAC 발현을 회복시키기 위한 전략을 도시한다. 상부, TRAC 제1 엑손의 5 '말단 (회색), TRAC gRNA (청색) 및 해당 PAM 서열 (적색)을 갖는 a, Top, TRAC 좌위. 2개의 청색 화살표는 예측된 Cas9 이중 가닥 파손을 나타낸다. 하부, TRAC 좌위로의 CRISPR/Cas9-표적화된 혼입. 표적화 작제물 (AAV)은 스플라이싱 수용체 (SA), 이어서 F2A 코딩 서열, TFP 유전자 및 폴리A 서열을 포함하고, 이는 TRAC 좌위 (LHA 및 RHA, 좌 및 우 상동성 아암)와 상동성인 서열에 측접해 있다. 혼입되면, 내인성 TCRα 프로모터는 TFP 발현을 유도하고, TRAC 좌위는 분리된다. B) 표적화 작제물은 TFP를 발현하고, 2A 서열을 통해 TRAC (TCRα 불변 사슬)를 공동 발현한다. C) 표적화 작제물은 TFP를 발현하고, RHA에 존재하는 제1 엑손과 프레임 내에 존재하는 신호 펩타이드를 2A 서열을 통해 공동 발현하여, TCRα 프로모터는 TFP 발현뿐만 아니라, TCRα 가변 영역 (TRAV)이 부재하는 TRAC; TRAJ, TCRα 결합 영역; 2A, 자가 절단 2A 서열 발현을 유도한다. pA: SV40/β-글로빈 폴리A 서열.
도 6a 내지 도 6e는 Ab-TCR을 TRAC 좌위로 유도하기 위해 카세트 표적화를 위한 다양한 작제물 설계를 도시한다.
도 7a 내지 도 7f는 cTCR (SIR)을 TRAC 좌위로 유도하기 위해 카세트 표적화를 위한 다양한 작제물 설계를 도시한다.
도 8a 내지 도 8d는 cTCR (SIR) 및 TCR을 TRAC 좌위로 유도하기 위해 카세트 표적화를 위한 다양한 작제물 설계를 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 단일 사슬 cTCR (SIR)을 TRAC 좌위로 유도하기 위해 카세트 표적화를 위한 다양한 작제물 설계를 도시한다.
우선, CD1-ζ 또는 Fc 수용체 γ 사슬로부터 유래된 세포질 신호전달 도메인에 연결된 불활성 CD8 막관통 도메인에 scFv (단일 사슬 단편 가변)-기반 항원 결합 도메인의 융합을 통해 1세대 CAR을 작제하였다 (도 1).
CD3-ζ 사슬 응집이 T 세포의 용해 활성을 가능하게 하기에 충분하지만, 이는 인터루킨-2 (IL-2)를 포함하여 강력한 사이토카인 반응을 유도하지 못하고, 항원에 반복 노출될 때 T 세포 확장을 지원하지 못했다. 최적의 활성화 및 증식을 위해, T 세포는, 표적화된 종양 세포 또는 항원 제시 세포에 의해 발현되는 동족 리간드 (즉, CD80/86, 4-1BBL, OX-40L)에 결합하는 T 세포 상의 공자극 수용체 (즉, CD28, 4-1BB, OX-40)를 통한 공자극 신호전달뿐만 아니라, T 세포 수용체 결합 및 신호전달 둘 모두가 필요하다. T 세포 공자극(co-stimulation)의 부재를 극복하기 위해, T 세포 공자극 수용체의 세포질 신호전달 도메인을 도입함으로써 1세대 CAR을 추가로 변형시켰다. 이러한 2세대 CAR은 변형된 T 세포의 신호전달 강도 및 지속성을 향상시켜 더 우수한 항 종양 활성을 유도하였다. 2세대 CAR 작제물에 존재하는 공자극 도메인을 통한 신호전달은 NF-κB, AKT 및 ERK와 같은 수 개의 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 특히, AKT 활성화는 T 세포 활성화를 촉진하지만, 또한 최종 분화, 고갈 및 지속성의 부재를 초래하는 것으로 나타났다.
도 2는 상기 기재된 바와 같은 2세대 CAR 다음 제1세대 CAR 플러스 특이적 NF-κB 자극 분자의 도식이 도시하며, 각각과 관련된 생물학적 활성이 도시되어 있다.
현재 임상 용도로 사용되는 CAR 작제물은 수 개의 상이한 단백질의 융합을 나타내므로 설계 상 인공적이다. 특히, 2세대 CAR 작제물에의 공자극 도메인의 포함은 수용체를 통한 비 생리학적 신호전달을 초래하고, 이는 결과적으로 그의 독성의 원인이 될 수 있다. 일부 CAR은 긴장성 항원-비의존적 신호전달을 나타내며, 이는 억제되지 않은 세포 활성화를 초래하여, 결국 아폽토시스, 동족 항원과 독립적인 과도한 사이토카인 방출 및 면역학적 고갈을 초래한다. 공자극 도메인 (예를 들어, 41BB 및 CD28 도메인)을 통한 긴장성 신호전달은 T 세포 생존을 방해하는 것으로 나타났다. 따라서, 사이토카인 방출 증후군 (CRS)과 같은 과도한 독성의 위험없이 CAR 변형 T 세포의 장기간 지속성을 달성하기 위해 CAR 설계를 개선할 필요가 있다.
종래의 2세대 CAR의 설계 한계 중 일부를 극복하기 위해, Ab-TCR (WO 2017/070608 A1, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP (WO 2016/187349 A1, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨), 합성 면역 수용체 (SIR) (WO 2018/102795 A1 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨), Tri-기능성 T 세포 항원 연결 인자 (Tri-TAC) (WO 2015/117229 A1 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨)을 포함하여, 차세대 CAR로 총칭되는 수 개의 대안적인 설계가 기재되었다. 이러한 대안적인 CAR 설계는 일반적으로 공자극 도메인이 존재하지 않는다.
AKT 활성화 및 긴장성 신호전달의 한계를 극복하기 위해, 본 개시내용은 공자극 기능을 제공하기 위한 선택적 NF-κB 활성화제, 예컨대 NEMO-돌연변이체 (예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A), K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E의 용도를 입증하였다. 다수의 신호전달 경로를 활성화시키는 41BB- 및 CD28 유래 공자극 도메인과 달리 (도 1의 2세대 및 3세대 CAR 참조), 예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E와 같은 선택적 NF-κB 활성화제는 I-카파B 키나제 (IKK) 복합체를 활성화하여 NF-κB 경로를 선택적으로 활성화한다. 본 개시내용은 대안적 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR)와 공동-발현되는 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 보조 모듈에 의해 공자극이 제공되는 설계인 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR을 추가로 기재한다. 그러나, 공자극 도메인이 성숙 CAR 폴리펩타이드의 성분인 2세대 CAR 작제물과 달리, 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 보조 모듈은 반드시 성숙 면역 수용체, 예를 들어 CAR 폴리펩타이드의 필수 부분일 필요는 없다. 이러한 설계는 공자극 도메인을 통한 응집 및 비 생리적 신호전달에 의해 야기되는 긴장성 신호전달, 과도한 사이토카인 생성 및 T 세포의 조기 고갈의 문제점을 극복함에 따라 이점을 갖는다. 본 개시내용은 스위치 도메인과의 융합, 예를 들어 FKBP12v36 도메인의 탠덤 카피와의 융합시 이를 발현함으로써, NF-κB 활성화제의 활성을 조절하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 T 세포에서 예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176-S180E 및 K13-opt와 같은 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 노화의 부재 하에 배양에서 장기간 증식하는 능력을 연장시켜, 단일 경로 (즉, NF-κB)의 활성화가 T 세포의 노화를 지연시키기에 충분하다는 것을 최초로 입증함을 나타낸다. 예를 들어, CD19-CAR 작제물은 hNEMO-K277A 또는 hNEMO-K277A-델타V249-K255를 공동-발현하지만, 임의의 공자극 도메인의 부재는 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR 작제물과 비교하여 더 우수한 생체내 효능을 나타낸다. 본 개시내용은 NF-κB의 선택적 활성화가 T 세포의 증식을 촉진하고, 노화를 지연시키고, CAR-T 세포 요법을 포함하여, 입양 세포 요법에서 T 세포의 성능을 개선시키기에 충분하다는 것을 추가로 입증한다. 따라서, 본 개시내용은 면역 세포에서 NF-κB 경로의 선택적 또는 우선적 (즉, AKT 활성화) 활성화를 통해, 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CAR-T 또는 TCR-T 또는 SIR-T 세포, 및/또는 비천연 발생 면역 수용체를 발현하는 면역 세포의 생존, 증식, 사이토카인 분비를 향상시키고, 고갈 및 노화를 지연시키고, 생체내 확장, 지속성 및 항 종양 활성을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 개시내용은 예를 들어, hNEMO-K277A 또는 hNEMO-K277A-델타V249-K255와 같은 선택적 NF-κB 활성화제의 용도는 이들이 T 세포 발현 내인성 TCR (예를 들어, 종양 침윤 림프구), 외인성 TCR, SIR 등을 포함하여, 입양 세포 요법을 위한 임의의 T 세포에서 사용될 수 있으므로, CAR-T 세포에서의 그 용도에 제한되지 않는다.
본 개시내용은 또한 예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E와 같은 선택적 NF-κB 활성화제는 면역 세포, 예를 들어 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포에 의한 사이토카인 분비 및 항원 제시를 촉진함으로써 백신의 성능을 개선시키는데 사용될 수 있음을 추가로 입증한다. 예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E와 같은 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 골수 유래 수지상 세포 (DC)는 대조군 DC와 비교하여 더 우수한 사이토카인 생성, 항원 제시 및 면역 반응 (예를 들어, 항 종양 반응 또는 항 감염성 제제 반응)을 나타낸다.
본 개시내용은 인간 유래로서, 면역원성이 적은 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 NF-κB 활성화제를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 시토졸에서 발현될 수 있는 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 NF-κB 활성화제를 추가로 제공한다. 본 개시내용은 항시적으로 활성이고, NF-κB를 활성화시키는 그 능력을 위해, 자극, 예를 들어 리간드의 처리가 필요하지 않은 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 NF-κB 활성화제를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 입양 세포 요법에서의 용도를 위한 SIR, zSIR, Ab-TCR, 및 TFP와 같은 차세대 CAR뿐만 아니라, 종래의 CAR (예를 들어, 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR)뿐만 아니라, SIR, zSIR, Ab-TCR 및 TFP와 같은 차세대 CAR의 생성에 사용될 수 있는 수 개의 항원 결합 도메인을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 항원 결합 도메인은 혈액 악성 종양 및 고형 종양 둘 모두에서 발현되는 표적 항원 및 항체로부터 유래된다. 이들 항원 결합 도메인의 vL, vH 및 scFv 단편의 서열번호는 표 6a 내지 도 6c에 제시되어 있다. 경쇄 (vL) 및 중쇄 (vH) 사슬의 상보성 결정 영역 (CDR)의 서열번호는 표 6a 내지 도 6b에 제시되어 있다. 이들 항원 결합 도메인을 기반으로 한 41BB 공자극 도메인 및 차세대 CAR (예를 들어, zCAR-K13, zCAR-NEMO-K277A, SIR, Ab-TCRs 및 TFP)을 포함하는 예시적인 2세대 CAR의 핵산 및 아미노산 서열번호가 표 10 내지 표 14에 제시되어 있다. 이들 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 다양한 시험관내 및 생체내 특성, 예컨대 표적 항원에 대한 결합 친화도, 사이토카인 분비, 증식, 세포독성, 고갈 및 장기간 지속성을 나타낸다. 이와 같이, 이들 표적 항원을 포함하는 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 다양한 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 발현 작제물, 본 개시내용의 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 재조합 조작 세포뿐만 아니라, 이러한 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 세포의 제조 및 사용 방법은 당 업계에 공지된 방법 및 PCT/US2017/024843, WO 2014/160030 A2, WO 2016/187349 A1, WO 2017/070608 A1 및 WO 2018/102795 A1에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 이들 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 면역 세포는 당 업계에 공지된 방법 및 WO 2017/070608 A1, WO 2016/187349 A1, WO 2018/102795 A1, WO 2015/117229 A1에 기재된 방법을 사용하여 생성하여, 암, 감염성 및 면역 장애의 입양 세포 요법에 사용될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 기존 입양 세포 요법의 목적을 위해 차세대 CAR (예를 들어, TFP, SIR, Ab-TCR, cTCR)을 포함하여 TCR 및 CAR을 발현하는 동종이계 T 세포를 생성하는 신규한 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 차세대 CAR (예를 들어, TFP, SIR, Ab-TCR 및 cTCR)을 포함하여 TCR 및 CAR을 발현하는 자가유래 및 동종이계 T 세포를 사용하는 신규한 조합 요법의 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 TFR을 발현하는 세포에서 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ의 불변 사슬을 공동 발현함으로써 천연 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 사슬의 발현이 부재하는 T 세포에서의 CD3ε, CD3γ 및 CDδ 사슬을 기반으로 한 TFP의 발현 및/또는 활성을 복원하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 TFP를 발현하는 세포에서 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ의 불변 사슬의 전장 또는 단편을 인코딩하는 SIR 또는 Ab-TCR을 공동 발현함으로써, 천연 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 사슬의 발현이 부재하는 T 세포에서 CD3ε, CD3γ 및 CDδ 사슬을 기반으로 한 TFP의 발현 및/또는 활성을 복원하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 CD3ε, CD3γ 및 CDδ 사슬을 기반으로 한 TFP가 동종이계 및 기존 요법의 목적을 위해, 천연 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ이 부재하는 T 세포에서 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 불변 사슬의 불변 사슬을 인코딩하는 SIR 또는 Ab-TCR과 조합할 수 있음을 제공한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "폴리뉴클레오타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대한 언급을 포함하는 등과 같다.
또한, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 " 및/또는"을 의미한다. 유사하게, "~들을 포함하다", "~를 포함하다", "~를 포함하는", "~들을 포괄하다", "~를 포괄하다" 및 "~를 포괄하는"은 혼용 가능하며 제한하려는 것이 아니다.
다양한 실시형태의 설명이 "~를 포함하는"이라는 용어를 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정 예에서, 대안적으로 어구 "이로 필수적으로 이루어진" 또는 "이로 이루어진"을 사용하여 설명되는 것으로 추가로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley&Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley&Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012); and Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)]은 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 항체를 제조하는 방법에 대한 참조를 위해, 문헌[Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Kφhler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U. S. Patent No. 5,585,089 (1996 Dec); and Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7]을 참조한다. 본 명세서에 제공된 모든 표제 및 부제는 단지 가독의 편의를 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 모순되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 특정 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서의 모든 간행물은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본 명세서에 제공된 임의의 정보는 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 묵시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술이라는 인정이 아니다.
양, 시간 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 "약"이라는 용어는 지정된 값의 ±20% 또는 일부 경우 ±10%, 또는 일부 경우 ±5 또는 일부의 경우 ±1%, 또는 일부의 경우 ±0.1%의 변동을 포함하는 의미이며, 이러한 변형은 개시된 방법을 수행하거나, 본 명세서의 조성물을 기재하기에 적합한 것이다. 더욱이, 임의의 값 또는 범위 (예를 들어, 20 미만 또는 유사한 용어)는 그러한 값 사이 또는 상기 값까지의 임의의 정수를 명시적으로 포함한다. 따라서, 예를 들어, "1 내지 5개의 돌연변이"는 1, 2, 3, 4 및/또는 5개의 돌연변이를 명시적으로 포함한다.
용어 "Ab-TCR" 또는 "AbTCR"은 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2017/070608 A1에 기재된 차세대 CAR 플랫폼을 지칭한다. 일 실시형태에서, Ab-TCR은 적어도 하나의 TCR 신호전달 모듈을 채용할 수 있는 TCR 모듈에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. Ab-TCR의 작제물에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 모듈은 SEQ ID NO: 959 내지 964 (표 6d) 및 WO 2017/070608 A1에 제공되며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다. TCR 모듈 TCRb-IAH-6MD에서, 인간 TCRb 사슬 (SEQ ID NO: 15053)에 존재하는 3개의 아미노산 잔기 (F133, E136 및 Q139) (표 4, 표 5 및 표 6d 참조)를 이 모듈의 발현을 향상시키기 위해 각각 쥣과동물 TCRb 사슬에 존재하는 이소류신, 알라닌, 및 히스티딘으로 돌연변이시킨다. 유사하게, TCR 모듈 IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD에서, 인간 TCRa 사슬 (SEQ ID NO: 15041)에 존재하는 4개의 아미노산 잔기 (P91, E92, S93, S94)를 이 모듈의 발현을 향상시키기 위해 잔기 S, D, V, P로 돌연변이시킨다 (표 3 및 표 6d 참조). NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 예시적인 Ab-TCR이 SEQ ID NO: 3124 내지 3523에 제공되어 있다 (표 14). 그러나 NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈은 선택적이다. 본 개시내용에 기재된 항원 결합 도메인 (즉, vL 및 vH 단편, 리간드 및 수용체 등)을 갖는 Ab-TCR은 NEMO-K277A 없이 작제될 수 있다. 따라서 이 보조 모듈과 같이, 상류 퓨린-SGSG-F2A 서열을 Ab-TCR로부터 결실시킬 수 있다. 대안적으로, NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈을 hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E, 및 MyD88-L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2 등과 같은 다른 단백질을 인코딩하는 보조 모듈로 대체할 수 있다. 추가로, Ab-TCR에 존재하는 TCR 모듈을 WO 2017/070608 A1에 기재된 다른 TCR 모듈로 치환할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 3124 내지 3323으로 표시되는 Ab-TCR은 TCR 모듈 IgCL-TCRb-IAH-6MD (SEQ ID NO: 960) 및 IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD (SEQ ID NO: 963)를 포함하며, 이는 각각 TCR 모듈 IgCL-TCRb-wt2-opt-6MD (SEQ ID NO: 961) 및 IgG1-CH1-TCRa-wt2-opt-6MD (SEQ ID NO: 964)로 치환될 수 있다. TCR 모듈 IgCL-TCRg-6MD (SEQ ID NO: 959) 및 IgG1-CH1-TCRd-6MD (SEQ ID NO: 962)를 포함하고, NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 예시적 Ab-TCR이 SEQ ID NO: 3324 내지 3523에 제공되어 있다. 이들 작제물에서의 항원 결합 도메인의 순서는 표 14에 나타낸 작제물의 순서와 동일하므로, 특정 항원을 표적화하고, 특정 항원 결합 도메인을 포함하는 IgCL-TCRg-6MD (SEQ ID NO: 959) 및 IgG1-CH1-TCRd-6MD (SEQ ID NO: 962)를 기반으로 한 Ab-TCR을 표 14를 참조하여 확인할 수 있다.
용어 "보조 모듈"은 면역 세포의 활성을 저하, 조절 또는 변형시키기 위해, 면역 세포 (예를 들어, T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포)에서 발현되는 hNEMO-K277A (또는 NEMO-K277A), hNEMO-K277A-델타-V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E (또는 IKK2-SS/EE), IKK1-S176E-S180E (또는 IKK1-SS/EE), MyD88-L265P, TCL-1a, MTCP-1, CMV-141, 41BBL, CD40L, vFLIP-K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-Ipilimumab-scFv, CTLA4-Ipilimumab-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, shRNA 표적화 Brd4, IgSP-[hTRAC-opt2], IgSP-[hTRBC-opt2] 및 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 보조 모듈은 CAR 또는 TCR 또는 CAR-발현 또는 TCR-발현 세포의 발현 또는 활성을 증가, 저하, 조절 또는 변형시키기 위해, CAR 또는 TCR과 같은 면역 수용체와 공동 발현된다. 보조 모듈은 단일 벡터를 사용하거나, 2개 이상의 상이한 벡터를 사용하여, CAR 또는 TCR과 공동 발현될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 보조 모듈은 그 활성이 이량체화제 분자의 투여에 의해 조절될 수 있는 FKBP (FK506 결합 단백질)-융합 단백질, 예컨대 FKBPx2-NEMO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보조 모듈은 항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에서 발현된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "친화도"는 결합 강도의 척도를 기재하는 것을 의미한다. 친화도는 일부 경우에 결합제와 그의 표적 사이 (예를 들어, 결합 도메인에 특이적인 에피토프를 포함하는 항원과 항체 사이)의 입체화학적 적합성의 근접성, 이들 사이의 접촉 면적의 크기 및 하전된 소수성 기의 분포에 따라 달라진다. 친화도는 일반적으로 그의 표적에 결합하는 결합제의 "능력"을 지칭한다. "친화도"를 측정하기 위해 당 업계에서 사용되는 많은 방법이 있다. 예를 들어, 친화도를 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 결합 친화도는 당 업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 바이오 층 간섭, 이중 편광 간섭, 정적 광산란, 동적 광산란, 등온 적정 열량측정, ELISA, 분석 초원심분리 및 유세포분석을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용한다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 BIAcore 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 바이오 특이적 상호작용을 분석할 수 있는 광학 현상이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 적어도 10-6 M의 결합 친화도의 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 양상에서, 항체는 적어도 약 10-7M, 및 바람직하게는 10-8　M, 10-9　M, 10-10　M, 10-11　M, 또는 10-12　M의 친화도로 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "AKT 경로" 또는 "PI3K-AKT 경로"는 세포외 신호에 반응하여 생존 및 성장을 촉진하는 신호 도입 경로이다. 관련된 주요 단백질은 PI3K (포스파티딜이노시톨 3-키나제) 및 Akt (단백질 키나제 B)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 항체는 단일클론 또는 다클론, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있으며, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 항체는 '인간화', '키메라' 또는 비인간의 것일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab'h, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화-연결 Fvs (sdFv), VH 및 CHl 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 (sdAb) 예컨대 vL 또는 vH, 낙타과 vHH 도메인, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함한다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내에 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩타이드를 기반으로 한 스캐폴드로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩타이드 미니바디를 기재한 미국 특허 제 6,703,199호 참조).
용어 "항체 중쇄"는 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 것을 지칭하며, 일반적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄를 이소형을 지칭한다.
"항산화제"는 비정상적 세포 분열 및 성장을 억제하거나, 신생물 세포의 이동을 억제하거나, 침습성을 억제하거나, 암 성장 및 전이를 방지하는 제제를 지칭한다. 상기 용어는 화학요법제, 생물학적 제제 (예를 들어, siRNA, 바이러스 벡터, 예컨대 조작된 MLV, 아데노바이러스, 세포독성 유전자를 전달하는 포진 바이러스), 항체 등을 포함한다.
용어 "항암 효과"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 종양 체적의 감소, 암 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하여, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 처음 암 발생을 예방하는 CAR의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역 적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대 분 자기항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 당업자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 일부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 개시내용은 다음에 제한되는 것은 아니나, 하나 초과의 유전자의 일부 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하며, 이들 뉴클레오타이드 서열은 적절한 면역 반응을 유발하는 폴리펩타이드를 인코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열된다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성되거나, 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩타이드 이외의 거대 분자일 수 있다는 것이 용이하게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 다음에 제한되는 것은 아니나, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있다.
표적 항원의 비 제한적인 예는 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4, 크립토, gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원을 포함한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 나타내는 면역계 세포 예컨대 보조 세포 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T 세포는 그의 T 세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하여 T 세포에 이를 제시한다.
용어 "항 감염 효과"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 감염원의 역가 감소, 감염원의 콜로니 수 감소, 감염 병태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.. "항 감염 효과"는 또한 처음 감염의 발생을 예방하는 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "항 종양 효과" 또는 "항암 효과"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 종양 체적의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
"항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 모듈" 또는 "항원 결합 절편" 또는 "항원 특이적 도메인" (ASD)은 1차, 2차 또는 3차 서열 번역 후 변형 및/또는 변화로 인해, 높은 특이성 정도로 항원에 결합하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 상이한 공급원, 예를 들어 항체 (전장 중쇄, Fab 단편, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편, 2가 단일 사슬 항체 또는 디아바디), 비면역글로불린 결합 단백질, 리간드 또는 수용체로부터 유래될 수 있다. 그러나, 연결된 사이토카인 (사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 유도함), 아피바디, 천연 발생 수용체로부터의 리간드 결합 도메인, 수용체 (예를 들어, 종양 세포 상)에 대한 가용성 단백질/펩타이드 리간드 및 면역 반응을 유발하는 펩타이드 및 백신과 같은 수많은 대안이 있으며, 이는 각각 본 발명의 다양한 실시형태에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업자에게 인식되는 바와 같이, 소정의 항원에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 분자가 ASD로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체 (TCR) 또는 그의 일부를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, scFV를 포함하는 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산은 본 명세서에서 SEQ ID NO: 642 내지 902 및 표 6c에 제시되어 있다. 예시적인 실시형태에서, scFV를 포함하는 항원 결합 도메인을 인코딩하는 아미노산은 본 명세서에서 표 6c의 SEQ ID NO: 4555 내지 4815에 제시되어 있다.
용어 "결합 상수 (Ka)"는 수용체와 리간드의 결합의 평형 상수로 규정된다.
" 자기항체"는 자기항원에 특이적인 B 세포에 의해 생성된 항체를 지칭한다.
용어 " 자기항원"은 자기항체의 생성과 같은 자가 면역 반응의 생성을 자극하는 내인성 항원을 지칭한다. 자기항원은 또한 자가 면역 질병의 발병을 초래할 수 있는 세포 매개 또는 항체-매개 면역 반응의 표적인 정상 조직으로부터의 항원 또는 자기항원을 포함한다. 자기항원의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 데스모글레인 1, 데스모글레인 3 및 이들의 단편을 포함한다.
"결합성"은 결합제와 그의 표적 사이의 상호작용의 강도 (예를 들어, 항체 및 그의 항원 표적, 수용체 및 그의 상동체 등의 상호작용의 강도)를 지칭한다. 결합성은 약하거나 강할 수 있다. 친화도를 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 기능 분석 (예를 들어, 유세포분석)에서의 항체 활성은 또한 항체 친화도를 반영한다. 항체 및 친화도를 기능 분석 (예를 들어, 유세포분석)을 사용하여 표현형적으로 특성화하고, 비교할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "백본 (backbone)"은 표 2에 기재된 바와 같은 CAR (표 1) 및 보조 모듈의 특정 조합을 지칭한다. 예시적인 실시형태에서, 다양한 백본을 포함하는 CAR 및 보조 모듈의 특정 조합은 표 2에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, CAR 및 보조 모듈은 단일 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 다른 실시형태에서, CAR은 제1 핵산 분자에 의해 인코딩되고 보조 모듈은 제2 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 보조 모듈은 보조 모듈의 성분의 수에 따라 하나 초과의 핵산 분자에 의해 인코딩된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유익한 결과"는 어떠한 방식으로든 다음에 제한되는 것은 아니나, 질병 병태의 중증도의 감소 또는 완화, 질병 병태의 악화의 예방, 질병 병태의 치유, 질병 병태의 발병의 예방, 환자에서 질병 병태가 발병할 확률의 감소 및 환자의 수명 또는 기대 수명의 연장을 포함할 수 있다. 비 제한적 예로서, "유익한 결과" 또는 "적절한 결과"는 하나 이상의 증상 (들)의 완화, 결핍 정도의 감소, 암 진행 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 전이 또는 침습성의 지연 또는 감속화, 암과 관련된 증상의 개선 또는 경감일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 비특이적 도메인보다 더 높은 친화도로 표적에 결합할 수 있는 적어도 하나의 도메인, 예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편, 리간드 도메인 또는 그의 단편 (가능한 경우)을 의미한다. 상기 용어는 항체 및 항체 단편, 또는 리간드 및 리간드 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 이는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 복수의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 복수의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 이중특이성 분자는 제1 항원 결합 도메인이 T 세포 상에 발현되는 항원 (예를 들어, CD3ε)에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인이 질병 유발 또는 질병 관련 세포 (예를 들어, 암 세포) 상에 발현되는 항원에 결합하는 이중특이적 T 세포 결합 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 제2 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 T 세포 매개 세포독성을 유도하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용에 기재된 항원 결합 도메인은 이중특이적 T 세포 결합인자를 작제하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용에 기재된 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)을 포함하는 예시적인 이중특이적 T 세포 결합인자의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3545 내지 3830 (표 13)에 제시되어 있다. 해당 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7458 내지 7721에 제시되어 있다.
"동일한 에피토프와 결합한다"는 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인이 예시된 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인과 동일한 에피토프를 갖는 표적 항원에 결합하는 능력을 의미한다. 예로서, 예시된 항체, scFv, 또는 다른 결합제 및 다른 항체의 에피토프는 표준 에피토프 맵핑 (mapping) 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 당 업계에 널리 공지된 에피토프 맵핑 기술은 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 포함한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어 단백질 분자의 일부에 해당하는 펩타이드인 고체 지지체 상의 다수의 펩타이드를 동시에 합성하고, 펩타이드가 여전히 지지체에 부착되어 있는 동안 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 4,708,871호; 문헌[Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. lmmunol. 23: 709-715]에 기재되어 있다. CAR의 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프는 또한 에피토프 비닝 분석 (epitope Binning assay)에 의해 결정될 수 있다. 에피토프 비닝은 표적 단백질에 대해 단일클론 항체의 라이브러리를 특성화하고 분류하는데 사용되는 경쟁적 면역 분석법이다. 항체가 항원의 에피토프에 대한 서로의 결합을 차단하는지 확인하기 위해, 유사한 표적에 대한 항체를 라이브러리의 다른 모든 항체에 대해 쌍형성 방식으로 시험한다. 각각의 항체가 라이브러리의 다른 모든 항체에 대해 생성된 프로파일을 갖는 경우 그 후, 라이브러리의 다른 항체와 비교하여 각각의 항체에 대해 경쟁 차단 프로파일을 생성한다. 밀접하게 관련된 비닝 프로파일은 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프를 갖고, 함께 "비닝된" 것을 나타낸다. 유사하게, 입체형태 에피토프는 예를 들어 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의한 경우와 같이, 아미노산의 공간 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, supra]을 참조한다. 단백질의 항원성 영역은 또한 예를 들어 Oxford Molecular Group으로부터 입수 가능한 Omiga 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것과 같은 표준 항원성 및 친수성 그래프를 사용하여 확인될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 문헌[Hopp/Woods method, Hopp et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]을, 수치요법 그래프를 위해서는 문헌[Kyte-Doolittle technique, Kyte et al, (1982) J.Mol. Bioi. 157: 1 05-132]을 사용한다. 표적 (예를 들어, CD19)에 대한 선택된 단일클론 항체가 고유한 에피토프에 결합 하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체를 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, Ill.)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비 표지 단일클론 항체 및 비오티닐화된 단일클론 항체를 사용한 경쟁 연구는 CD19-세포외 도메인 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합은 스트렙타비딘 (Streptavidin)-알칼리 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다. 본 개시내용의 scFv 및 CAR에 의해 결합된 인간 CD20 항원의 예시적인 에피토프는 SEQ ID NO: 15149 내지 15154에 제공된다. 본 개시내용의 scFv 및 CAR에 의해 결합된 인간 BCMA의 예시적인 에피토프는 SEQ ID NO: 15155 내지 15159에 제공된다. 본 개시내용의 scFv 및 CAR에 의해 결합된 인간 MPL 항원의 예시적인 에피토프는 SEQ ID NO: 15160에 제공되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "그의 생물학적 균등물"은 기준 단백질, 항체 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 또는 핵산을 언급하는 경우, "그의 균등물"과 동의어로 의도되며, 여전히 적절한 구조 또는 기능을 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본 명세서에 구체적으로 열거되지 않는 한, 상기 중 임의의 것이 또한 그의 균등물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 균등물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성 및 대안적으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 상동성 또는 동일성을 의도하고, 기준 단백질, 폴리펩타이드, 항체 또는 그의 단편 또는 핵산과 실질적으로 균등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드를 언급하는 경우, 그의 균등물은 엄격한 조건 하에서 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 또는 단백질을 언급하는 경우, 그의 균등물은 엄격한 조건 하에서 기준 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두의 가변 영역 내에 존재하는 비 인접 항원 조합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Bioi. Chern. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Bioi. 196:901-917 (1987); and MacCallum et al., J. Mol. Bioi. 25 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있으며, 상기 규정은 서로 비교하는 경우, 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 규정의 적용은 본 명세서에 규정되고 사용된 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 상이한 CDR은 또한 상이한 규정의 조합에 의해 규정될 수 있다. 예를 들어, vHCDR1은 카밧 (Kabat)을 기반으로 규정되고 VHCDR2는 코티아 (Chothia)를 기반으로 규정될 수 있다. 상기 인용된 각각의 참조번호에 의해 규정된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 다음과 같다:
CDR 규정
Figure pct00001
(잔기 번호는 확인된 참조번호에 상응함)
본 개시내용의 CAR의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있는 상이한 vL 및 vH 절편의 CDR의 서열번호는 각각 SEQ ID NO: 13204 내지 14121 및 SEQ ID NO: 14122 내지 15039 (표 6a, 표 6b) 및 PCT/US2017/064379의 표 5 및 표 6에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 (예컨대 Fab-유사 또는 Fv-유사 항원-결합 모듈)에 대한 언급은 항원-결합 모듈이 표적 항원에 결합하는 것을 의미한다. (a) 다른 분자에 대한 결합 친화도의 적어도 약 10 (예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 이상)배의 친화도 ; 또는 (b) 다른 분자에 대한 결합의 Kd의 약 1/10 (예를 들어, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1175, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 미만)배 초과의 Kd로 표적 항원에 결합한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 또는 방사선 면역 침전 분석 (RIA)과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는 예를 들어 Biacore 기기를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석, 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 사용하는 동역학 배제 분석 (KinExA)과 같은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
"암" 및 "암성"은 통상적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 병태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 안드로겐-의존적 전립선 암 및 안드로겐-비의존적 전립선 암, 및 백혈병을 포함하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, B 세포 림프종 (호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), T 세포 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 피부 암, 뇌 종양, 유방 암, 결장암, 직장 암, 식도 암, 항문 암, 미지의 원발 부위의 암, 내분비 암, 고환 암, 폐암, 간세포 암, 위 암, 췌장암, 자궁경부 암, 난소 암, 간 암, 방광 암, 요로암, 생식 기관의 암, 갑상선암, 신장 암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌 암 (예를 들어, 다형성 교모세포종), 전립선 암을 포함한다. 다른 암 및 세포 증식성 장애는 당 업계에서 쉽게 인식될 것이다. 용어 "종양" 및 "암"은 본 명세서에서 혼용되며, 예를 들어, 두 용어는 모두 고형 및 액성, 예를 들어 미만성 또는 순환 종양을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암" 또는 "종양"은 악성 암 및 종양뿐만 아니라, 전암성종을 포함한다. 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침습 단계에 상관없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질전환 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 고형 종양은 유방, 간, 폐, 뇌, 림프, 위장관 (예를 들어, 결장), 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로 세포), 전립선 및 인두에 발병하는 것과 같은 다양한 기관 시스템의 악성 종양, 예를 들어 선암종, 육종 및 암종을 포함한다. 선암종은 대부분의 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 암을 포함한다. 일 실시형태에서, 암은 흑색종, 예를 들어 진행 단계 흑색종이다. 상기 언급된 암의 전이성 병변은 또한 본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 치료 또는 예방될 수 있는 다른 암의 예는 췌장암, 골암, 피부 암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 두경부암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 자궁관암, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 혈관신생 종양, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 표피암, 편평 세포 암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유발되는 것을 포함하는 환경 유발 암, 및 상기 암의 조합을 포함한다. 전이성 암, 예를 들어 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료 (문헌[Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144])는 본 명세서에 기재된 항체 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 성장이 억제될 수 있는 예시적인 암은 통상적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 또한, 재발성 또는 불응성 악성 종양은 본 명세서에 기재된 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
"화학요법제"는 암의 화학요법에 사용되는 것으로 공지된 화합물이다. 화학요법제의 비제한적인 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 (aziridine), 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa) 및 우레도파 (uredopa); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에티일렌티오포스포라미드 및 트리메틸로로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌 (acetogenin) (특히 불라타신 (bullatacin) 및 불라타시논 (bullatacinone)); 캄토테신 (camptothecin) (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴 (bryostatin); 칼리스타틴 (callystatin); CC-1065 (그의 아도젤레신 (adozelesin), 카젤레신 (carzelesin) 및 비젤레신 (bizelesin) 합성 유사체 포함); 크립토피신 (cryptophycin) (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴 (dolastatin); 두오카마이신 (duocarmycin) (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사코딕티인 (sarcodictyin); 스폰지스타틴 (spongistatin); 질소 머스타드 (nitrogen mustard), 예컨대 클로람부실, 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비친 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard); 니트로수레아스 (nitrosurea), 예컨대 카무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니투스틴 (nimustine) 및 라님누스틴 (ranimnustine); 항생제, 예컨대 에네디인 (enediyne) 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신 (calicheamicin), 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케마이신 오메가I1 (예를 들어, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)]); 디네미신 A (dynemicin A)를 포함한 디네미신; 비스포스포네이트 (bisphosphonate), 예컨대 클로드로네이트 (clodronate); 에스페라미신 (esperamicin)뿐만 아니라, 네오카지노스타틴 (neocarzinostatin) 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 액티노마이신 (actinomycin), 아우트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycins), 섹티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 사미노마이신 (caminomycin), 카지노필린 (carzinophilin), 크로모마이시니스 (chromomycinis), 덱티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데노루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (doxorubicin) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 펩로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 쿠엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라신 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린 (denopterin), 메토트렉세이트, 프테롭테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (6-azauridine), 카모푸르 (carmofur), 사이타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록수리딘 (floxuridine); 안드로겐 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스톨락톤 (testolactone); 항-부신, 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트릴로스탄 (trilostane); 폴산 보충제, 예컨대 플로린산; 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 에닐루라실 (eniluracil); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에포틸론 (epothilone); 에토글루시드 (etoglucid); 니트르산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 마이탄시노이드 (maytansinoid), 예컨대 마이탄신 (maytansine) 및 안사미토신 (ansamitocin); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론; 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카바진 (procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산 (razoxane); 리족신 (rhizoxin); 시조푸란 (sizofuran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테세네스 (trichothecenes) (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A (verracurin A), 로리딘 A (roridin A) 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미톨락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 (arabinoside) ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파 (thiotepa); 탁소이드 (taxoid), 예를 들어, 탁솔® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® 크레모포르-무함유 (Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민 조작 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (doxetaxel) (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실 (chloranbucil); GEMZAR® 젬시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린 (mercaptopurine); 메토트렉세이트 (methotrexate); 플라티늄 유사체 예컨대 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴; 플라티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE; 비노렐빈 (vinorelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 셀로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); 이리노테칸 (irinotecan) (Camptosar, CPT-11) (5-FU 및 레우코보린 (leucovorin)과 이리노테칸의 처리 용법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (capecitabine); 콤브레타스타틴 (combretastatin); 레우코보린 (leucovorin) (LV); 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 옥살리플라틴 처리 용법 (FOLFOX) 포함; 라파티닙 (lapatinib) (Tykerb); PKC-알파의 억제제, Raf, H-Ras, EGFR (예를 들어, 에르롤티닙 (erlotinib) (Tarceva®)) 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A 및 상기한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
"키메라 항원 수용체"(CAR)는 입양 세포 전달이라 불리는 기술을 사용하여 암에 대한 요법으로서 사용하기 위해 고려되는 인공 (비천연 발생) 면역 세포 (예를 들어, T 세포) 수용체이다. CAR은 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로 알려져 있다. 복합체의 항원-결합, 신호전달 및 자극 기능은 유전자 재조합 방법에 의해 일반적으로 키메라 항원 수용체 (CAR)로 지칭되는 단일 폴리펩타이드 사슬로 조작되었다. 예를 들어, Eshhar, 미국 특허 제 7,741,465호; Eshhar, 미국 특허 출원 공개 제 2012/0093842호를 참조한다. CAR은 CAR이 결합하는 특정 항원에 반응하여 T 세포 활성화 및 증식을 자극하도록 특이적으로 작제된다. 일반적으로, 가장 단순한 실시형태에서 CAR은 면역 효과기 세포에서 발현될 때, 표적 세포, 통상적으로 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 통상적으로 2개의 폴리펩타이드 세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR은 자극 분자 및/또는 공자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하여 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인 (본 명세서에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 양상에서, 폴리펩타이드 세트는 서로 인접한다. 일 양상에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 사슬이다. 일 양상에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 공자극 분자는 본 명세서에 기재된 공자극 분자, 예를 들어 4-lBB (즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일 실시형태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단 (N-ter)에서 선택적 리더 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N 말단에 리더 서열을 추가로 포함하며, 리더 서열은 세포 처리 및 세포막으로의 CAR의 위치화 동안 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다. 다양한 실시형태에서, CAR은 항원-특이적 도메인 (ASD), 힌지 영역 (HR), 막관통 도메인 (TMD), 선택적 공자극 도메인 (CSD) 및 세포내 신호전달 도메인 (ISD)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드이다. 선택적 공자극 도메인은 일반적으로 1세대 CAR 작제물에는 부재한다. 본 개시내용에 기재된 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고, NEMO-K277A 및 PAC를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 수 개의 예시적인 1세대 CAR의 표적 항원, 항원 결합 도메인 명 및 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1594 내지 1899 (표 12)에 제시되어 있다. 이들 CAR 작제물은 인간 CD8 신호 펩타이드, CD8 힌지 및 막관통 영역 및 인간 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인을 보유한다. 이들 작제물은 또한 항원 결합 도메인과 CD8 힌지 영역 사이에 MYC 링커를 보유하며, 이는 선택적이다. 본 개시내용에 기재된 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고, vFLIP K13 및 PAC를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 수 개의 예시적인 1세대 CAR의 핵산 서열이 SEQ ID NO: 1016 내지 1317 (표 13)에 제시되어 있다. 본 개시내용에 기재된 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고 41BB 공자극 도메인을 포함하는 수 개의 예시적인 2세대 CAR의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1318 내지 1593 (표 13)에 제시되어 있다. 이들 CAR 작제물은 또한 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 MYC 링커 및 퓨린-SGSG-T2A 서열에 의해 CAR 카세트로부터 분리된 퓨로마이신 내성 유전자 (PAC)를 인코딩하는 보조 모듈을 보유한다. vFLIP-K13, NEMO-K277A 및 PAC를 인코딩하는 보조 모듈은 위에서 설명한 1세대 및 2세대 CAR에서 선택적이다. 따라서, 본 개시내용에 기재된 항원 결합 도메인 (즉, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 갖는 CAR은 vFLIP-K13, NEMO-K277A 및/또는 PAC없이 작제될 수 있다. 이와 같이, 상류 절단 링커 서열 (예를 들어, F2A, P2A 또는 T2A)과 함께 이러한 보조 모듈은 SEQ ID NO: 1016 내지 1899로 표시되는 CAR로부터 결실될 수 있다. 또는 vFLIP-K13, NEMO-K277A 및/또는 PAC를 인코딩하는 보조 모듈은 hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E, 및 MyD88-L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2, TCL-1A, MTCP-1, 및 CMV-141 등과 같은 다른 단백질을 인코딩하는 보조 모듈로 대체될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CAR" 또는 "CAR"은 또한, 항체-TCR 키메라 분자 또는 Ab-TCR 또는 Ab-TCR (WO 2017/070608 A1, 본 명세서에 참조로 포함됨), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP (WO 2016/187349 A1, 본 명세서에 참조로 포함됨), 합성 면역 수용체 (SIR) (WO 2018/102795 A1 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨), Tri-기능성 T 세포 항원 연결 인자 (Tri-TAC) (WO 2015/117229 A1 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨)와 같이, 세포에 항원 특이성을 부여하는 더 신규한 접근법을 포함한다. 본 개시내용에 기재되어 있고, CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 CD3ζ 사슬을 기반으로 하여 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고, 선택적 보조 모듈 NEMO-K277A를 공동 발현하는 수 개의 예시적인 TFP의 핵산 서열은 각각 SEQ ID NO:1900 내지 2205, 2206 내지 2511, 2512 내지 2817, 2818 내지 3123 (표 13)에 제시되어 있다. 표 13에 열거된 상이한 CAR 구조 및 BiTE의 작제물에 포함된 항원 결합 도메인의 순서는 표 12에 제시된 zCAR-K277A 구조의 작제물의 순서와 동일하다. 따라서, 소정의 구조 (예를 들어, zCAR-K13)에 속하고 특정 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 아미노산 및 핵산 서열은 표 12 및 표 13의 검사에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 표 12는 huFMC63-11-(vL-vH) 항원 결합 도메인을 포함하는 zCAR-NEMO-K277A 구조 상의 CAR이 표 12의 2세대 작제물이며, 각각 핵산 및 아미노산 SEQ ID NO: 1595 및 5508로 표시됨을 보여준다. zCAR-K13 구조 상 해당 CAR의 핵산 및 아미노산 서열번호는 이 구조 상의 제2 작제물이 각각 핵산 및 아미노산 SEQ ID NO: 1017 및 4930을 가짐을 보여주는 표 13의 시험에 의해 결정될 수 있다. 상이한 구조 및 BiTE에 속하는 다른 CAR 작제물의 핵산 및 아미노산 서열번호를 결정하기 위해 유사한 접근법이 사용될 수 있다. 표 10은 상이한 백본에 속하고 HIV1-N49P6 vL 및 vH 항원 결합 도메인을 기반으로 한 HIV-1 외피 당단백질을 표적화하는 수 개의 예시적인 CAR의 핵산 및 아미노산 서열번호를 제공한다. 표 11은 표 10에 나타낸 백본에 속하지만 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 수 개의 예시적인 CAR의 핵산 및 아미노산 서열번호를 제공한다. 따라서, 표 11에 나타낸 항원 결합 도메인을 포함하는 특정 백본 상의 CAR의 핵산 및 아미노산 서열번호는 먼저 표 10에서 그의 순위를 결정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, vFLIP-K13 백본을 포함하는 1세대 CAR은 표 10의 목록 상의 제3 CAR이며, vFLIP-K13을 공동 발현하고, HIV1-N49P7 항원 결합 도메인을 포함하는 1세대 CAR의 핵산 서열번호는 표 11로부터 쉽게 결정될 수 있으며, 이는 SEQ ID NO: 8740 (즉, 8738에서 시작하는 제3 작제물)이다. 유사한 접근법을 사용하여, 이 CAR 작제물의 아미노산 서열번호는 SEQ ID NO: 11438인 것으로 결정된다. CAR은 모듈식으로 설계되어 있으므로, 상이한 항원 결합 도메인 또는 보조 모듈을 포함하는 CAR/BiTE의 핵산 및 아미노산 서열은 본 개시내용에 개시된 예시적 CAR 및 BiTE 작제물 및 상이한 모듈의 서열을 사용함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 통상적으로, "CAR-T 세포"가 사용되는데, 이는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포를 지칭한다. 따라서, 이러한 CAR을 보유하는 T 림프구는 일반적으로 CAR-T 림프구로 지칭된다. CAR은 또한 조혈모세포, 유도된 전능성 줄기세포 (iPSC), NK 세포 및 대식세포와 같은 T 세포 이외의 세포에서 발현될 수 있다.
"코돈 최적화" 또는 "종 코돈 편향의 제어"는 특정 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용을 지칭한다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 특정 숙주에서의 발현을 향상시키기 위해 코딩 서열을 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈이 중복되지만, 대부분의 유기체는 일반적으로 이 코돈의 하위세트를 사용한다. 한 종에서 가장 많이 사용되는 코돈을 최적 코돈이라고 하며, 자주 사용하지 않는 코돈은 희귀 또는 저 사용 코돈으로 분류된다.
예를 들어, 최적화되지 않은 서열로부터 생성된 전사체와 비교하여 더 긴 반감기와 같은 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성하거나, 번역 속도를 증가시키기 위해, 특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 의해 바람직한 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열 (또한, 문헌[Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508] 참조)을 제조할 수 있다. 번역 종결 코돈은 또한 숙주 선호를 반영하도록 변형될 수 있다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성 특성으로 인해, 뉴클레오타이드 서열이 상이한 다양한 DNA 화합물이 본 개시내용의 소정의 폴리펩타이드를 인코딩하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "공동 발현"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자의 발현을 지칭한다. 유전자는 예를 들어 단일 단백질 또는 키메라 단백질을 단일 폴리펩타이드 사슬로서 인코딩하는 핵산일 수 있다. 본 명세서에 기재된 CAR 또는 TCR은 단일 폴리뉴클레오타이드 사슬에 의해 인코딩될 수 있고 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현되며, 이는 후속하여, 각각 상이한 기능성 단위를 나타내는 상이한 폴리펩타이드로 절단된다. 일부 실시형태에서, CAR 또는 TCR이 2개 이상의 기능성 폴리펩타이드 단위로 구성되는 경우, 상이한 기능성 단위는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 사슬을 사용하여 공동 발현된다. 일 실시형태에서, CAR 또는 TCR과 공동 발현되지만 CAR 또는 TCR 폴리펩타이드의 필수 부분이 아닌 보조 모듈에 의해 공자극이 제공된다. CAR- 또는 TCR-발현 세포 또는 임의의 세포에 대해 공자극을 제공하지만, CAR 또는 TCR 폴리펩타이드의 필수 부분이 아닌 이러한 보조 모듈은 CAR 비의존적 공자극 모듈 또는 CICM으로 지칭된다. 다른 실시형태에서, 상이한 폴리뉴클레오타이드 사슬은 절단 가능한 링커 (예를 들어, T2A, F2A, P2A, E2A 등)를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 연결된다 (표 6d). 다른 실시형태에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (SEQ ID NO: 4844)는 또한 절단 효율을 향상시키기 위해 절단 가능한 링커 서열의 상류에 첨가된다. CAR 또는 TCR의 상이한 단위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 IRES (내부 리보손 진입 부위 (Internal Ribosomal Entry Site)) 서열에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, CAR 또는 TCR의 상이한 기능성 단위는 예를 들어, 2개의 상이한 벡터에 의해 인코딩되는 대신에, 링커를 통해 연결되지 않은 2개의 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 예시적인 절단 가능한 링커 및 퓨린 절단 부위의 핵산 및 아미노산 서열은 표 6d에 제공된다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 서열 변형"은 인코딩된 단백질의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이를 변이시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 예를 들어, "보존적 서열 변형"은 본 개시내용의 CAR 작제물의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이를 변이시키지 않는 아미노산 변형 (예를 들어, 불변 사슬, 항체, 항체 단편 또는 비면역글로불린 결합 도메인의 보존적 변화)을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 당 업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 업계에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘))를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변이된 CAR은 본 명세서에 기재된 결합 및/또는 기능 분석을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체-알파의 불변 영역" 또는 "T 세포 수용체-알파의 불변 사슬" 또는 "TCRα" 또는 "Cα"는 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15041 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다. 본 개시내용은 또한 SIR 및 Ab-TCR의 작제에 사용될 수 있는 TCRα 폴리펩타이드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다 (표 3 및 표 6d). 예를 들어, 증가된 발현 및 감소된 쌍형성 오류를 나타내는 Cα의 돌연변이 부위는 SEQ ID NO: 15041의 위치 91, 92, 93 및 94에 위치한다. Cα에서 Thr 48 Cys (T48C) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서의 Ser-57-Cys (S57C) 돌연변이를 갖는 TCR 폴리펩타이드 (본 명세서의 다른 부분에서 더 상세하게 설명됨)는 2개의 TCR 불변 사슬 (α 및 β) 사이에 추가의 이황화 결합을 초래한다. 결과적으로, 이는 면역 세포에서 내인성 TCR 사슬과의 쌍형성 오류를 감소시키고, 기능성을 향상시킨다. 유사하게, Cα에서 Ser 61 Arg (S61R) 돌연변이 (SEQ ID NO: 15048) 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서 Arg 79 Gly (R79G) 돌연변이를 갖는 CAR (본 명세서의 다른 부분에서 더 상세하게 설명됨)은 쌍형성을 위한 "노브 및 홀 (knob and hole)" 설계로 인해, 내인성 TCR 사슬과의 쌍형성 오류가 감소하고, 기능성이 향상된다. 본 개시내용은 SIR 및 Ab-TCR의 작제에 사용될 수 있는 하기 표 3에 따른 돌연변이 중 하나 이상 또는 모두를 갖는 Cα 폴리펩타이드를 제공한다.
[표 3]
Figure pct00002
인간 게놈은 2개의 고도로 상동성인 TCR 베타 불변 사슬; TCR 베타1 (TCRβ1 또는 TCRb1 또는 cβ1) 및 TCR 베타 2 (TCRβ2 또는 TCRb2 또는 cβ2)를 인코딩한다. 본 개시내용의 CAR은 이들 2개의 사슬 중 하나를 포함할 수 있다. 유사하게, 다른 포유류 종의 TCR 베타1 또는 TCR 베타2 사슬이 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체-베타 1의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 1의 불변 영역" (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 Cβ1)은 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15051 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다.
용어 "T 세포 수용체-베타 2의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 2의 불변 영역" (TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2)은 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15052 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다.
용어 "T 세포 수용체-베타의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타의 불변 영역"(TCR-베타 또는 TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ)은 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15051 내지 15053 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다.
Cβ2 (SEQ ID NO: 15052) 및 Cβ1 (SEQ ID NO: 15051) 둘 모두에 대한 단백질 서열이 공지되어 있다 (표 6d). Cβ2 및 β1의 서열 사이의 차이는 당업자에 의해 사용되는 서열의 정렬에 의해 용이하게 확인된다. 본 개시내용은 또한 SIR 및 Ab-TCR의 작제에 사용될 수 있는 TCRβ에 대한 특정 돌연변이를 제공한다. 예를 들어, 내인성 TCRα 사슬과의 증가된 발현 및 감소된 쌍형성 오류를 나타내는 Cβ에서의 돌연변이 부위가 본 명세서에 제공된다. Cβ1 및 Cβ2에서의 이들 돌연변이 부위는 SEQ ID NO: 15051 및 15052의 위치 18, 22, 57, 79 133, 136, 및 139에 위치하며 하기 표 4 및 5에 요약되어 있다. Cβ1 및 Cβ2의 돌연변이 부위는 그 위치가 동일하다. 두 서열 사이의 유일한 차이점은 위치 136에서의 돌연변이이다. 이 위치에서 글루탐산 (E)은 Cβ2에 존재하지만 발린은 Cβ1에 존재한다.
[표 4]
Figure pct00003
[표 5]
Figure pct00004
용어 "TCR-감마의 불변 사슬" 또는 "TCR-감마의 불변 영역"(TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 TCR-감마1 또는 TCRγ1 또는 TCRg1 또는 Cγ)은 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15068 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다.
용어 "TCR-델타의 불변 사슬" 또는 "TCR-델타의 불변 영역"(TCR-델타 또는 TCRδ 또는 TCRd 또는 Cδ)은 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 SEQ ID NO: 15069 또는 균등한 잔기 (즉, 상동체)로서 제공된 단백질로서 규정된다.
단백질은 서로 동일하거나 상동성일 수 있고, 유사하거나 동일한 기능을 보유할 수 있음을 인식할 것이다. 본 개시내용은 생물학적 활성을 보유하면서 본 명세서에 기재된 임의의 서열과 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 TCR 불변 영역을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 (a) SEQ ID NO:15041에 대해 적어도 98% 동일하고, 위치 61, 91, 92, 93, 및/또는 94에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:15051에 대해 적어도 98% 동일하고, 위치 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:15052에 대해 적어도 98% 동일하고, 위치 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:15068에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:15069에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 T 세포 수용체 불변 사슬을 제공한다. (a) 내지 (e) 중 임의의 것의 T 세포 수용체 불변 사슬은 동일하거나 상동성인 야생형 T 세포 수용체 불변 사슬의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다.
용어 "항시적 활성"은 자극 필요성의 부재 하에 신호전달 활성을 갖는 분자, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 예시적인 항시적 활성 단백질은 NEMO-K277A 및 vFLIP K13이며, 이는 추가적인 자극의 필요성의 부재 하에 적합한 세포에서 발현되는 경우, NF-κB 신호전달을 활성화시킬 수 있기 때문이다.
용어 "공자극 분자" 또는 "공자극 수용체"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식과 같이 T 세포에 의한 공자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 대상을 지칭한다. 공자극 세포외 분자는 효율적인 면역 반응에 관여하는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자는 다음에 제한되는 것은 아니나, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체뿐만 아니라, OX40, Dap10, CD27, CD28, CD2, CD5, CD8, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 및 4-1BB (CD137)를 포함한다. 이러한 공자극 분자의 추가의 예는 CD8, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDlOO (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IP0-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 공자극 수용체는 세포 다른 T 세포, 예컨대 NK 세포 또는 대식세포 상에 발현될 수 있다.
"공자극 세포내 신호전달 도메인" 또는 "공자극 도메인" (CSD)은 공자극 수용체의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 분자는 다음 단백질 패밀리 TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체로 표시될 수 있다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD8, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 유래된 분자 또는 그 기능성 단편 또는 유사체의 전체 세포내 부분 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 공자극 도메인을 포함할 수 있다.
용어 "cTCR"은 야생형 TCR 핵산 코딩 서열 및 항원 결합 도메인에 연결된 해당 야생형 TCR 단백질을 지칭한다. cTCR은 일부 실시형태 및 기준 대조군에 사용된다. 예를 들어, CD19 결합 도메인 및 CD19-CAR (돌연변이 TCR 사슬 및 CD19 결합 도메인 포함)을 갖는 cTCR은 표적 항원에 대해 상이한 발현 및/또는 상이한 결합 친화도를 가질 것이다.
용어 "세포질의" 또는 "세포질"은 성숙한 형태로 세포의 세포질에 위치한 제제, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 세포질의 단백질은 핵으로 이동되지만, 막관통 단백질이 아니며 세포 외부로 분비되지 않을 수 있다. 예시적인 세포질 단백질은 vFLIP K13이다.
용어 "퇴행성 장애"는 퇴행성 세포 변화를 기반으로 하여 조직 또는 기관에 영향을 미치는 연속적인 과정의 결과이며, 정상적인 신체적 마모 또는 운동 또는 식습관과 같은 생활 습관 선택으로 인해 시간이 지남에 따라 점차 악화되는 질병을 지칭한다. 예시적 퇴행성 질병은 알츠하이머병, 샤르코 마리 투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease), 크로이츠펠트 야코프병 (Creutzfeldt-Jakob disease), 척수소뇌변성증, 진성 당뇨병 (유형 II), 및 죽상경화증을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유도된 형태"는 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하고, 제2 분자로부터 유래된 제1 분자에 대한 과정 또는 공급원 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체 분자로부터 유래된 항원 결합 도메인의 경우, 항원 결합 도메인은 필요한 기능, 즉 항원에 결합하는 능력을 갖기에 충분한 항체 구조를 보유한다. 이는 항체를 생성하는 특정 과정에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않으며, 예를 들어 항원 결합 도메인을 제공하기 위해 항체 서열로 시작하여 부적절한 서열을 결실시키거나 돌연변이를 가하여 항원 결합 도메인에 도달해야 한다는 것을 의미하지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이량체화 분자"는 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 실시형태에서, 이량체화 분자는 대상체에서 천연적으로 발생하지 않거나, 유의한 이량체화를 야기하는 농도로 발생하지 않는다. 실시형태에서, 이량체화 분자는 작은 분자, 예를 들어 라파마이신 (rapamycin) 또는 라파로그 (rapalogue), 예를 들어, RAD001, 리미두시드 (Rimiducid) 또는 AP20187)이다. 리미두시드 (AP1903)는 동종이량체화 활성을 갖는 지질 투과성 타크로리무스 (tacrolimus) 유사체이다. 리미두시드는 단일 산 치환 (Phe36Val)을 포함하는 인간 단백질 FKBP12 (Fv)의 유사체를 동종이량체화한다. 리미두시드는 세포 요법 동안 하류 신호전달 활성화를 야기하는 비천연 발생 면역 수용체의 Fv-포함 약물-결합 도메인을 동종이량체화하는데 사용된다. 리미두시드는 약 0.01 내지 1 mg/kg일 수 있고, 약 0.1 nM의 세포 배양의 EC50을 갖는다. AP20187은 단일 또는 다수의 투여량으로 약 2 내지 10 mg/kg/일로 투여될 수 있다.
어구 "표적 항원의 발현과 관련된 질병" 또는 "본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 관련 항원"은 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 증식성 질병 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태 예컨대 골수이형성, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암성 관련 적응증을 포함하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원의 발현과 관련된 질병 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 병태를 포함한다. 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본 명세서에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 추가의 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 비정형 및/또는 비통상적인 암, 악성종양, 전암성 병태 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 증식성 질병을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원의 발현과 관련된 비암성 관련 적응증은 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 자가면역 질병 (예를 들어, 루푸스), 염증 장애 (알레르기 및 천식) 및 이식을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원 발현 세포는 표적 항원을 인코딩하는 mRNA를 발현하거나, 또는 임의의 시점에 발현하였다. 다른 실시형태에서, 표적 항원 발현 세포는 표적 항원 단백질 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생성하고, 표적 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 표적 항원 발현 세포는 하나의 시점에서 검출 가능한 수준의 표적 항원 단백질을 생성한 후, 실질적으로 검출 가능한 표적 항원 단백질을 생성하지 않았다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형된 세포에 의해 표적화되는 질병"은 치료적으로 유익한 결과를 초래하기 위해, 유전자 변형된 세포가 발병 세포를 표적화하는지 또는 건강한 세포를 표적화하는지에 관계없이 본 발명의 유전자 변형된 세포에 의해 임의의 질병에 임의의 방식으로 관련된 임의의 세포를 표적화하는 것을 포함한다. 유전자 변형된 세포는 다음에 제한되는 것은 아니나, 유전자 변형된 T 세포, NK 세포, 조혈모세포, 전능성 배아 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 포함한다. 유전자 변형된 세포는 통상적인 CAR 및 본 발명의 보조 모듈을 갖는 통상적인 CAR을 포함하는 신규한 백본을 발현하며, CAR은 표적 세포의 표면에 발현되는 임의의 항원을 표적화할 수 있다. 표적화될 수 있는 항원의 예는 B 세포 상에 발현되는 항원; 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식세포 종양, 및 모세포종에서 발현되는 항원; 다양한 면역 세포에서 발현되는 항원; 및 다양한 혈액 질병, 자가면역 질병 및/또는 염증 질병과 관련된 세포에서 발현되는 항원을 포함한다. 표적화될 수 있는 다른 항원은 당업자에게 명백할 것이고, 그의 대안적인 실시형태와 관련하여 본 발명의 CAR에 의해 표적화될 수 있다.
용어 "해리 상수 (Kd)"는 수용체-리간드 상호작용의 해리의 평형 상수로 규정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "다양한 비천연 발생 면역 수용체 세트" 또는 "다양한 SIR 세트" 또는 "다양한 CAR 세트"는 결합 도메인 및 상이한 T 세포 불변 사슬 또는 백본을 포함하는 각각의 작제물이 표적 항원에 대한 다양한 범위의 결합 및/또는 다양한 발현 수준을 제공하는 다양한 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 "백본" 세트에 연결된 동일한 결합 도메인을 갖는 다수의 비천연 발생 면역 수용체를 지칭한다. 예를 들어, 불변 도메인의 돌연변이 조성 (예를 들어, 돌연변이체 TCRa+TCRb)에 따라, 결합 도메인의 그의 표적에 대한 결합 친화도가 상이하다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 SIR (단일 가닥 또는 이종이량체)은 동일한 결합 도메인을 갖는 야생형 TCR (예를 들어, cTCR)보다 더 큰 결합 친화도를 포함한다. 일 실시형태에서, SIR은 cTCR보다 발현 수준이 적어도 1.25배 내지 약 10,000배 더 높으며 (및 그 사이의 임의의 수치), SIR 및 cTCR은 TCR 도메인에서의 돌연변이만이 상이하다. 다른 실시형태에서, SIR은 동일한 항원에 대한 결합 도메인을 갖는 cTCR보다 적어도 1.5배 초과 내지 약 10,000배 초과하는 표적 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, SIR은 동일한 항원에 대한 cTCR보다 더 높지만, 동일한 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 (CAR)보다 더 낮은 결합 친화도을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현 효과기 세포의 결합은 해당 cTCR-발현 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.25배 초과이지만, 해당 cTCR보다 100,000배 초과만큼 더 적다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 약 10-4 M 내지 10-8 M의 해리 상수 (KD, 그의 결합 친화도를 반영함)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 열거된 항원 중 하나 이상에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 표적 항원에 대해 약 10-4 M 내지 10-8 M, 예를 들어, 약 10-5 M 내지 10-7 M, 예를 들어, 약10-5 M 내지 10-6 M의 KD를 갖는다. 일 실시형태에서, 항원 결합 도메인의 결합 친화도는 기준 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 적다. 일 실시형태에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 기준 항체보다 적어도 5배 더 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 기준 항체는 항원 결합 도메인이 유래된 항체이다. 예를 들어, 본 개시내용은 결합 도메인과 TCR 도메인 사이의 링커의 사용 및/또는 쌍형성 또는 발현을 촉진하기 위해, 핵산 서열 코돈 최적화 및/또는 TCR 사슬에서의 돌연변이를 기반으로 하여 설계되고 스크리닝될 수 있는 특정 항원 표적에 대한 다양한 SIR 집합을 고려한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 면역 반응을 유발할 수 있는 항원의 일부분 또는 항체 또는 항체 단편에 결합하는 항원의 일부분으로 규정된다. 에피토프는 단백질 서열 또는 하위서열일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 cis-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드이거나 리포좀에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데나-관련 바이러스)를 포함하여 당 업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
CAR과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "기능적 부분"은 CAR의 임의의 부분 또는 단편을 지칭하며, 이 부분 또는 단편은 일부분을 이루는 CAR (모체 CAR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능성 부분은 예를 들어 모체 CAR과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하거나, 질병을 검출, 치료 또는 예방하는 능력을 보유하는 CAR의 부분을 포함한다. 모체 CAR과 관련하여, 기능성 부분은 예를 들어 모체 CAR의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형된 세포", "방향 전환된 세포", "유전자 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"는 본 개시내용의 CAR을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 동일한 벡터에서 CAR 및 하나 이상의 보조 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 및 보조 분자를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 및 하나 이상의 보조 분자를 인코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 CAR을 인코딩하는 제1 벡터 및 제1 보조 분자를 인코딩하는 제2 벡터 및 제2 보조 분자를 인코딩하는 제3 벡터를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "힌지 영역" (HR)은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 있는 친수성 영역을 지칭한다. 힌지 영역은 다음에 제한되는 것은 아니나, 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 Fc 단편, 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 힌지 영역의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 IgG (예컨대 인간 IgG4)의 Gly3 또는 CH1 및 CH3 도메인만큼 작을 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 인공 스페이서 및 CD8a 힌지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2, (iv) CD8a의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지 CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역 또는 (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역 중 임의의 하나 이상이다. 다른 힌지 영역은 당업자에게 명백할 것이며 본 개시내용의 대안적인 실시예와 관련하여 사용될 수 있다.
용어 "면역 장애"는 면역계의 기능 장애를 특징으로 하는 질병을 지칭한다. 자가 면역 질병은 정상적인 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 병태이다. 자가 면역 질병은 적어도 80가지 유형이 존재한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "면역 세포"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 항원 제시 세포, B 세포, 호염기구, 세포독성 T 세포, 수지상 세포, 호산구, 과립구, 헬퍼 T 세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 기억 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 호중구, 식세포, 형질세포 및 T 세포를 포함하는 포유류 면역계의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 효과기 세포"는 면역 반응에 관여하는 세포, 예를 들어 면역 효과기 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예는 T 세포, 예를 들어, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
"면역 효과기 기능" 또는 "면역 효과기 반응", "효과기 기능"은 분화된 세포의 특수 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 예를 들어, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다. 항원 제시 세포 (예컨대, 수지상 세포)의 경우 항원 제시 및 사이토카인 분비는 효과기 기능의 예이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "면역 반응"은 다음에 제한되는 것은 아니나, 선천성 면역, 체액성 면역, 세포 면역, 면역, 염증 반응, 후천성 (적응) 면역, 자가면역 및/또는 과활성 면역을 포함하는 면역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용도는 바와 같은 용어 "세포내 신호전달 도메인", (ISD) 또는 "세포질 도메인"은 분자의 세포내 신호전달 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 세포의 면역효과기 기능을 촉진시키는 신호를 생성한다. 면역 효과기 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. 효과기 기능 신호를 도입하는 도메인의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, T 세포 수용체 복합체의 z 사슬 또는 그의 상동체 (예를 들어, h 사슬, FceR1g 및 b 사슬, MB1 (Iga) 사슬, B29 (Igb) 사슬, 등), 인간 CD3 제타 사슬, CD3 폴리펩타이드 (D, d 및 e), syk 패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70, 등), src 패밀리 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn, 등) 및 T 세포 형질도입에 관여하는 다른 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28 중 임의의 것을 포함한다. 다른 세포내 신호전달 도메인은 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 대안적 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극에 관여하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호, 또는 항원 비의존적 자극에 관여하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3z의 세포질 서열을 포함할 수 있으며, 및 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD28 또는 41BB와 같은 공동 수용체 또는 공자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD3 제타, 공통 FeR 감마 (FCER1G), Fe 감마 RIIa, FeR 베타 (Fe 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAPlO, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 다른 물질이 실질적으로부재하는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다. 일 양상에서, 용어 "단리된"은 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 소기관 또는 조직 또는 기관로부터 분리된 DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드 (예를 들어, 항체 또는 그의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관 또는 조직 또는 기관을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 경우, 세포 물질, 바이러스 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 부재하는 핵산 또는 펩타이드, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학 전구체 또는 다른 화학 물질을 지칭한다. 또한, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연 발생하지 않고, 천연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 본 명세서에서 다른 세포 단백질로부터 단리되고 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 모두를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 사용되고, 배양 및 조작된 세포 또는 조직 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커" (또한 "링커 도메인" 또는 "링커 영역")는 각각 본 명세서에 개시된 CAR 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 2개 이상의 도메인 또는 영역을 함께 연결하는 올리고 또는 폴리펩타이드 (또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 올리고)를 지칭한다. 링커는 임의의 경우 1 내지 500개 아미노산 길이 또는 3 내지 1500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, "링커"는 절단 가능하거나 절단 불가능한 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 절단 불가능한 링커를 의미한다. 상기 절단 불가능한 링커는 서로에 대해 인접한 단백질 도메인이 이동할 수 있도록 하는 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 비 제한적인 예는 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 비가요성 잔기를 포함한다. 절단 가능한 링커의 예는 2A 링커 (예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 그의 기능적 균등물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 피코나바이러스 (picornavirus) 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스 (teschovirus) (P2A), 토세아 아시나 (Thosea asigna) 바이러스 (T2A)의 CHYSEL 서열 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 균등물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래하는 모티프를 포함할 수 있다 (예를 들어, T2A 서열, SEQ ID NO: 4839 및 4840, C 말단 Gly-Pro 참조). 수 개의 예시적인 절단 가능한 링커의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 925 내지 SEQ ID NO: 930에 제공되고, 수 개의 예시적인 링커의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4838 내지 서열 4843에 제공된다. 본 명세서에서 사용될 수 있는 다른 절단 가능한 링커는 당업자에 의해 쉽게 이해된다.
일 실시형태에서, 절단 효율을 향상시키기 위해 Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (SEQ ID NO: 931-32)가 또한 절단 가능한 링커 서열의 상류에 첨가된다. 절단 가능한 링커의 잠재적 단점은 N 말단 단백질의 말단에 남겨진 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 미치거나 단백질의 항원성에 관여할 수 있다는 가능성이다. 이러한 제한을 극복하기 위해, 일부 실시형태에서, 번역 후 잔류 2A 펩타이드의 절단을 용이하게 하기 위해 퓨린 절단 부위 (RAKR) (SEQ ID NO: 933 내지 935)가 SGSG 모티프의 상류에 첨가된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "가요성 폴리펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 사슬을 함께 (예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께) 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 지칭한다. 일 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n, (SEQ ID NO:4191 내지 4192)을 포함하고, n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=l, n=2, n=3. n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=l0. 일 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 다음에 제한되는 것은 아니나, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:4193 또는 4194)을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 범위 내에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커가 포함된다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비 분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서 고유하며; 이는 상당한 양의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 특히 자기 불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함한다. 비 임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용 가능하고 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 3837), pLENTI-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO: 3838), pCCLc-MNDU3-WPRE (SEQ ID NO: 7779) 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE (SEQ ID NO: 7780)이다. pLENTI-EF1a-DWPRE는 WPRE 서열의 결실에 의해 pLENTI-EF1α 벡터로부터 유래되었다. 내부 Sac II 단편을 EF1α 프로모터로부터 결실시켜, EF1알파 (EF1a)-D-SACII-프로모터 (SEQ ID NO: 3842)를 생성하였다. 예시적 실시형태에서, CAR, CAR 플러스 보조 모듈 (들) 또는 보조 모듈 (들)을 인코딩하는 핵산 단편은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여, pLENTI-EF1α 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE 벡터에 존재하는 Nhe I 및 Sal I 부위 사이에서 클로닝될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "포유류"는 제한 없이 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완용 포유류, 예컨대 개 및 고양이; 마우스, 랫트 및 기니피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물을 포함하는 포유류강의 임의의 구성원을 지칭한다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 수컷이든지 암컷이든지, 태아뿐만 아니라, 성체 및 신생 대상체가 이 용어의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "네이키드 DNA"는 적절한 발현 방향으로 적절한 발현 벡터에 클로닝된 CAR을 인코딩하는 DNA를 지칭한다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 다음에 제한되는 것은 아니나, SIN 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 거품 형성 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 혼성체 벡터 및/또는 플라스미드 트랜스포손 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템) 또는 인테그라제 기반 벡터 시스템을 포함한다. 본 발명의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있는 다른 벡터는 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "천연" 또는 "천연 발생" 또는 "내인성"은 세포에 고유하거나 세포에서 천연적으로 발현되는 유전자, 단백질, 핵산 (예를 들어, DNA, RNA 등) 또는 그의 단편을 지칭한다. 따라서, T 세포의 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 폴리펩타이드는 TCRα 불변 사슬에 연결된 가변 도메인 (Vα)으로 구성된다. 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 전구체 폴리펩타이드는 또한 성숙 폴리펩타이드로부터 절단된 아미노 말단 신호 펩타이드로 구성된다.
NF-카파-B 필수 조절제 (NEMO)는 NF-κB 활성화에 필요한 IκB 키나제 복합체의 스캐폴딩 단백질 성분을 지칭한다. NF-κB는 염증, 세포 증식 및 아폽토시스를 제어하는 전사 인자이다.
"NF-κB 경로" 또는 "NF-κB 신호전달 경로"는 NF-κB 하위단위의 핵 전좌 및 NF-κB 하위단위 반응성 유전자의 전사 활성화를 초래하는 신호 도입 경로를 지칭한다. NF-κB는 염증 및 면역 반응에 관여하는 수 개의 유전자의 조절된 발현에 관여하는 전사 인자 패밀리를 지칭한다. 이 패밀리의 5가지 공지 구성원은 현재까지 특성화되었으며, c-Rel, NF-κB1 (p50 및 그의 전구체 p105), NF-κB2 (p52 및 그의 전구체 p105), p65(RelA) 및 RelB를 포함한다. 많은 이량체 형태의 NF-κB가 기재되었지만, 통상적인 NF-κB 복합체는 p65/RelA 및 p50 하위단위의 이종이량체이고, 대부분의 세포에서 IκB라 불리는 억제 단백질 패밀리와 관련하여 발견되며, 가장 일반적인 것은 IκBα이다. 통상적인 NF-κB 경로에서, TNFα 및 IL-1과 같은 다수의 사이토카인에 의한 자극은 2개의 촉매 하위단위 IKK1/IKKα 및 IKK2/IKKβ, 및 조절 하위단위, NEMO/IKKγ를 포함하는 다중 하위단위 IκB 키나제 (IKK) 복합체의 활성화를 초래한다. 활성화된 IKK 복합체는 IκB 단백질의 유도성 인산화 및 그의 후속 분해를 야기하고, 이에 의해 NF-κB가 억제 영향으로부터 방출된다. 방출되는 경우, NF-κB는 핵으로 자유롭게 이동하여 그 동족 결합 부위를 갖는 특정 유전자의 프로모터에 결합한다. 핵에서 NF-κB 이량체의 전사 활성은 그의 인산화에 의해 추가로 변형된다. p52 하위단위으로의 p100/NF-κB2의 프로테아좀-매개 처리를 포함하는 NF-κB 활성화의 대안적 (또는 비정규적인) 경로가 기재되어 있다.
"NF-κB 자극 분자" 또는 "NF-κB 자극인자" 또는 "NF-κB 활성화제"는 NF-κB 신호전달 경로의 활성 또는 NF-κB 신호전달 경로의 하류 표적 유전자의 활성/발현을 촉진하는 보조 분자의 하위세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 활성화제는 비천연 발생 NF-κB 활성화제제이다. 예시적 비천연 발생 NF-κB 활성화제제는 hNEMO-K277A이다. 일 실시형태에서, NF-κB 자극 분자 또는 NF-κB 자극인자는 선택적 NF-κB 자극인자 또는 선택적 NF-κB 활성화제이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 "선택적 NF-κB 활성화제" 또는 "선택적 NF-κB 자극인자"는 선택적으로 다른 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시키는 제제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 AKT, PI3K, JNK, p38 키나제, ERK, JAK/STAT 및 인터페론 (interferon) 신호전달 경로의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 AKT 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 AKT 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 PI3K 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 ERK 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 JNK 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 p38 키나제 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 JAK/STAT 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 인터페론 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 인산화된 IκBα, 인산화된 p65/RelA, 총 IκBα, p65 핵 전좌, NF-κB 반응성 유전자의 상향조절의 측정, 전기영동 이동성-변화 분석 (EMSA) 및 NF-κB-기반 리포터 분석 등을 포함하여 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 측정하기 위한 다수의 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 분석은 NF-κB 경로의 선택적 활성화제를 확인하기 위해, 단일 또는 조합하여 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 상이한 키나제및 상이한 경로에 속하는 하류 기질의 인산화, 하류 전사 인자의 핵 전좌, 하류 반응성 유전자의 상향조절의 측정, 전기영동 이동성 변화 분석 (EMSA) 및 루시퍼라제 기반 리포터 분석 등을 포함하여, 신호전달 경로 (예를 들어, AKT, PI3K, JNK, p38 키나제, ERK, JAK/STAT 및 인터페론 신호전달 경로)의 활성화를 측정하기 위한 다수의 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 분석은 NF-κB 신호전달 경로의 선택적 활성화제를 선택하기 위해, 단일 또는 조합하여 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 선택적 NF-κB 자극인자는 다른 보조 분자 예컨대 41BB와 비교하여, NF-κB를 특이적으로 활성화시킨다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 다음 효과 중 하나 이상을 갖는다: (i) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 수명의 연장, (ii) T 세포 증식의 자극, (iii) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포의 아폽토시스로부터의 보호, (iv) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 노화의 지연 (v) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 고갈 지연, (vi) T 세포의 최종 분화의 지연, (vii) T 세포에 의한 사이토카인, 예컨대 IL2의 생성의 촉진, (viii) CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함하여, T 세포의 생체내 확장의 촉진, (ix) CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함하여, T 세포의 생체내 지속성의 촉진, (x) CAR-T 및 TCR-T 세포를 포함하여, T 세포의 생체내 활성 (예를 들어, 항-종양 활성)의 개선. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 T 세포, 예컨대 항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포 이외의 세포에서 발현될 수 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 항원 제시 세포에 의해 생성되는 항원 제시, 사이토카인 생성 및 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 바이러스 또는 비 바이러스 (예를 들어, 인간) 유래일 수 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 세포 내에서 일시적으로 또는 안정하게 발현될 수 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 세포내에서 항시적 또는 유도성 방식으로 발현될 수 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 세포내에서 스위치 도메인, 예를 들어, FKBP12v36 도메인의 탠덤 카피의 융합시 발현될 수 있다. NF-κB 자극 분자를 포함하여, 예시적 스위치 도메인은 SEQ ID NO: 973 내지 977, 1006 내지 1009, 7763 내지 7767 및 7781 내지 7782 (표 7)에 제공되어 있다. 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여, NF-κB 자극 분자는 CAR/TCR의 코딩 서열을 포함하여, 벡터로부터 발현될 수 있거나, 상이한 벡터 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CAR/TCR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 바이러스 및 세포 신호전달 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 이는 (i) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 수명을 연장하고, (ii) T 세포 증식을 자극하고, (iii) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포를 아폽토시스로부터 보호하고, (iv) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 노화를 지연시키고, (v) T 세포, 예를 들어, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 고갈을 지연시키고, (vi) T 세포의 최종 분화를 지연시키고, (vii) T 세포에 의해 사이토카인, 예컨대 IL2의 생성을 촉진하고, (viii) CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함하여 T 세포의 생체내 확장을 촉진하고, (ix) CAR-T 세포 및 TCR-T 세포를 포함하여, T 세포의 생체내 지속성을 촉진하고/거나, (x) CAR-T 및 TCR-T 세포를 포함하여, T 세포의 생체내 활성 (예를 들어, 항-종양 활성)을 개선하는 NF-κB 자극 분자 또는 선택적 NF-κB 활성화제이다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자의 코딩 서열은 절단 가능한 링커를 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 CAR 백본 코딩 서열에 연결된다. 예시적 실시형태에서, 이러한 NF-κB 자극 분자는 다음에 제한되는 것은 아니나, 카포시 육종 관련 포진 바이러스로부터의 vFLIP-K13, 코돈 최적화된 K13 (K13-opt), NEMO 돌연변이체 ((예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277L, hNEMO-K277A-델타V249-K255, mNEMO-K270A 등), IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A, MTCP-1, IKKα, 및 IKKβ를 포함한다 (표 7). 일 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 벡터는 vFLIP-K13을 추가로 인코딩한다. 또 다른 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 벡터는 hNEMO-K277A를 추가로 인코딩한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 본 명세서에 기재된 CAR을 인코딩하는 벡터와 별도의 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 벡터를 포함하는 효과기 세포는 또한 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 해당 내인성 단백질을 인코딩하는 게놈 좌위의 변형에 의해 인코딩된다. 예를 들어, hNEMO 유전자의 하나 이상의 카피는 이를 K277A 돌연변이체 형태로 돌연변이시키기 위해, 상동성 재조합에 의해 변형될 수 있다. 내인성 인간 NEMO 유전자 내에 K277A 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있는 예시적 표적화 작제물은 SEQ ID NO: 7771에 의해 제시되어 있다. 내인성 인간 NEMO 유전자 내에 K277A-델타-V249-K255 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있는 예시적 표적화 작제물은 SEQ ID NO: 7772에 의해 제시되어 있다. 이러한 표적화 작제물은 당 업계에 공지된 기법을 사용하여, NEMO, 예를 들어, CRISP/Cas9 또는 TALON을 표적화하는 유전자 편집 시스템에 의해 인간 T 세포 내로 도입될 수 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus Pyogenes) Cas9의 예시적 NEMO gRNA 표적 서열은 SEQ ID NO: 7759 내지 7762에 제공되어 있다. 일 실시형태에서, CAR 및 NF-κB 자극 분자는 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시형태에서, CAR은 제1 핵산 분자에 의해 인코딩되고, NF-κB 자극 분자는 제2 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 NF-κB 자극 분자의 수에 따라 하나 초과의 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 본 개시내용의 특정 일부분에서, 약자 "CAR/NFκB"는 예를 들어, 본 개시내용의 CAR 및 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, NF-κB 특이적 자극 분자) 둘 모두를 발현하는 세포를 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 용어 "CAR/NFκB-발현 T 세포"는 또한 예를 들어, 카포시 육종 관련 포진 바이러스로부터의 vFLIP-K13, 코돈 최적화된 K13 (K13-opt), hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A, MTCP-1, IKK1/IKKα, 및 IKK2/IKKβ, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 NF-κB 특이적 자극 분자를 발현하는 임의의 수의 가능한 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR-T 세포를 지칭한다. NF-κB 자극 분자는 세포 내에서 CAR의 세포질 도메인에 직접 연결될 수 있거나, 비의존적으로 발현될 수 있다. NF-κB 자극 분자는 NF-κB 신호전달 경로의 억제제의 발현 및/또는 활성을 차단하는 분자일 수 있다. 예를 들어, NF-κB 신호전달 경로의 억제제의 발현 및/또는 활성을 차단하는 NF-κB 자극 분자는 A20의 유전자적 (예를 들어, siRNA, shRNA, gRNA, TALON, 또는 Zn 아연 뉴클레아제), 화학적 또는 생물학적 억제제이다. 다른 실시형태는 NEMO-융합 작제물 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, hNEMO-FKBPx2, FKBPx2-hNEMO-L600 등)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비천연 발생 제제" 또는 "비 천연" 또는 "외인성"은 세포에서 천연적으로 발현되지 않는 제제를 지칭한다. 또 다른 방식으로 언급하자면, 비천연 발생 제제는 세포 내에 발현되도록 "조작된다". 비천연 발생 제제는 천연 발생 제제의 클로닝 버전일 수 있다. 예시적 비천연 발생 제제는 CAR, SIR, Ab-TCR, TFP, 재조합 TCR, NEMO-K277A, vFLIP-K13 및 K13-opt를 포함한다. 비천연 발생 제제는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 매개 유전자 전달과 같이, 당 업계에 공지된 유전자 전달의 기법을 사용하여, 세포내로 발현될 수 있다. 비천연 발생 제제는 외인성 프로모터 (예를 들어, EF1α 프로모터) 또는 내인성 프로모터 (예를 들어, TCRα 프로모터)를 사용하여 면역 세포 내에서 발현될 수 있다. 내인성 유전자 (예를 들어, IKK1, IKK2, IKKγ/NEMO)를 클로닝하고, 세포 내에서 이소적으로 발현시키는 경우, 이는 비천연 발생 제제의 또 다른 예를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비천연 발생 면역 수용체" 또는 "외인성 면역 수용체"는 면역 세포에서 천연적으로 발현되지 않는 면역 수용체를 지칭한다. 달리 말하면, 비천연 발생 면역 수용체는 면역 세포에서 발현되도록 "조작"된다. 비 천연 발생 면역 수용체는 클로닝된 버전의 천연 발생 면역 수용체일 수 있다. 대안적으로, 비천연 발생 면역 수용체는 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 생성된 키메라 수용체일 수 있다. 예시적인 비천연 발생 면역 수용체는 CAR, SIR, Ab-TCR, TFP 및 재조합 TCR을 포함한다. 비 천연 발생 면역 수용체는 당 업계에 공지된 유전자 전달 기술, 예컨대 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 면역 세포에 도입될 수 있다. 비천연 발생 면역 수용체는 외인성 프로모터 (예를 들어, EF1α 프로모터) 또는 내인성 프로모터 (예를 들어, TCRα 프로모터)를 사용하여 면역 세포에서 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비 천연 발생 TCR 항원 결합 도메인" 또는 "외인성 TCR 항원 결합 도메인"은 자연에 존재하는 TCR과 관련하여 키메라로서 비 천연 발생하는 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 결합 도메인을 지칭한다 자연에 존재한다. 달리 말하면, 비천연 발생 TCR 항원 결합 도메인을 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 "조작"하여, TCR에 작동 가능하게 연결시키고, 또한 항원 결합 도메인을 천연으로 존재하는 TCR과 구별되는 분자로부터 획득하거나 유도한다. 천연의 TCR과 구별되는 항원 결합 도메인은 항체 vH 및 vL 단편, 인간화된 항체 단편, 키메라 항체 단편, 수용체 리간드 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비 바이러스 유래"는 바이러스에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩되지 않거나, 바이러스에 의해 인코딩되는 단백질과 80% 초과 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과) 서열 상동성을 갖는 10개 초과의 아미노산 (예를 들어, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 25개 아미노산 또는 50개 초과의 아미노산)의 임의의 도메인 또는 영역을 갖는 제제 (예를 들어, 단백질)를 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 비 바이러스 유래의 제제는 인간 유래이다. 일 실시형태에서, 비 바이러스 유래의 제제는 선택적 NF-κB 활성화제이다. 선택적 NF-κB 활성화제인 비 바이러스 유래의 예시적인 제제는 인간 NEMO-K277A (SEQ ID NO: 4892)이다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 각 성분이 기능적일 수 있도록 제1 성분과 제2 성분 사이의 기능적 연결 또는 결합을 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 것은 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이의 결합을 포함하여 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 2개의 폴리펩타이드의 맥락에서, 제1 폴리펩타이드는 임의의 연결과 무관한 방식으로 기능하고, 제2 폴리펩타이드는 둘 사이의 연결이 부재하는 경우에 기능한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "동일성 백분율"은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 비교 창 지정 영역에서 최대 대응을 위해 비교 및 정렬되거나, 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사로 측정할 때, 2개의 서열이 동일한 특정 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 경우 (예를 들어, 특정 영역 또는 특정되지 않은 경우, 전체 서열에 대해 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성), 2개의 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오타이드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역, 또는 더욱 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 이상 뉴클레오타이드 (또는 20, 50, 200개 이상 아미노산) 길이의 영역에 대해 동일성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하면, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 (Default) 프로그램 매개변수를 사용하거나 대안적 매개변수를 지정할 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기반으로 하여 기준 서열에 대비한 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당 업계에 잘 알려져있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Bioi. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson 및 Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터 구현 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 사용될 수 있는 알고리즘의 2가지 예는 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; and Altschul et al., (1990) J. Mol. Bioi. 215:403-410]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명 공학 정보 센터를 통해 공개적으로 제공된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 통합되며, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용한다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48:444-453)] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (www.gcg.com에서 입수 가능)으로 통합되며, Blossom 62 매트릭스 또는 P AM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 f 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 또는 "재조합 핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 적절한 경우 리보핵산 (RNA)과 같은 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다.
본 명세서에서 혼용되는 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 화학 결합, 이른바 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 언급되는 화학 빌딩 블록의 하나 이상의 사슬을 포함한다.
용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스 게놈의 적어도 일부분으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터의 예는 Addgene 또는 Clontech로부터 입수 가능한 MSCVneo, MSCV-pac (또는 MSCV-puro), MSCV-hygro를 포함한다.
용어 "슬리핑 뷰티 트랜스포손" 또는 "슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터"는 슬리핑 뷰티 트랜스포손 게놈의 적어도 일부분으로부터 유래된 벡터를 지칭한다.
용어 "단일 사슬 가변 영역" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어, 합성 링커, 예를 들어, 짧은 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 인접 연결되고, 단일 사슬 폴리펩타이드로서 발현될 수 있으며, scFv는 유래된 완전한 항체의 특이성을 보유한다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, scFv가 예를 들어 폴리펩타이드의 N 말단 및 C 말단에 대해 vL 및 vH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있는 경우, scFv는 vL-링커-vH를 포함할 수 있거나, vH-링커-vL을 포함할 수 있다. 본 발명에서, scFv는 또한 vL-Gly-Ser-링커-vH로 기재된다. 대안적으로, scFv는 또한 (vL+vH) 또는 (vH+vL)로서 기재된다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성함으로써 또는 그러한 메신저에 반응하여 효과기로서 기능함으로써 소정의 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포내 정보를 전송하는 단백질의 기능성 영역을 지칭한다.
용어 "합성 면역 수용체" 또는 대안적으로 "SIR"은 효과기 세포에서 발현되는 경우, 표적 세포, 통상적으로 암 세포에 대해 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 폴리펩타이드의 세트, 통상적으로 일부 실시형태에서 2개를 지칭한다. SIR은 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2018/102795 A1에 기재된 차세대 CAR 플랫폼을 나타낸다. 통상적인 실시형태에서, SIR은 본 명세서에 기재된 바와 같이 항원에 결합하고, 선택적 링커를 통해 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 세트는 서로 인접한다. 일부 실시형태에서, SIR은 2개 이상의 폴리펩타이드의 2개 이상의 세트를 포함한다. 각각의 SIR 세트의 폴리펩타이드 (기능성 폴리펩타이드 단위 1)는 서로 인접하지만, 다른 세트의 폴리펩타이드 (기능성 폴리펩타이드 단위 2)와는 인접하지 않다. 일부 양상에서, SIR의 T 세포 수용체 불변 사슬 (또는 영역)는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCR-알파 또는 hTCRα 또는 hTCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1(TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 hTCRβ1 또는 hTCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 hTCR-베타2 또는 hTCRβ2 또는 hTCRb2 또는 Cβ2 또한 소정의 TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ), 인간 Pre-T 세포 수용체 알파 ((preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 hTCR-감마 또는 hTCRγ 또는 hTCRg 또는 hTCRγ1 또는 hTCR감마1, 또는 Cγ), 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 hTCR-델타 또는 hTCRd 또는 hTCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 그 야생형 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되고, 다른 양상에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형이 아닌 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 그 코돈 최적화된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형 폴리펩타이드 서열에 의해 인코딩되고, 다른 실시형태에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 폴리펩타이드에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 그 코돈 최적화 서열에 의해 인코딩된다. 본 명세서에 기재된 것과 같은 특정 종양 메이커 "X"를 표적화하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv 또는 vHH)을 포함하는 SIR은 또한 X-SIR 또는 XSIR로 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR은 CD19-SIR 또는 CD19SIR로 지칭된다. SIR의 TCR 불변 사슬/도메인은 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 이로 구성되는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, TCR 불변 사슬은 결과적으로 SIR이 사용될 동일한 종으로부터 유래되지만 TCR 불변 사슬의 발현을 향상시키는 아미노산 치환을 보유하도록 변형되는 것이 유리하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 이로 구성되지만, 특정 아미노산이 쥣과동물 TCR 불변 사슬의 해당 아미노산으로 대체되는 것이 유리할 수 있다. 이러한 쥣과동물화된 TCR 불변 사슬은 SIR의 증가된 발현을 제공한다. SIR 또는 그의 기능적 부분은 아미노 또는 카복시 말단 또는 양쪽 말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, SIR을 구성하는 TCR 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열에서 추가 아미노산이 발견되지 않는다. 바람직하게는, 추가의 아미노산은 SIR 또는 기능적 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않으며, 예를 들어 표적 세포를 인식하고, 암을 검출하고, 암을 치료 또는 예방하는 등이다. 더욱 바람직하게는, 추가의 아미노산은 모 SIR의 생물학적 활성과 비교하여, 생물학적 활성을 향상시킨다. 예시적인 SIR의 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3878 내지 3879 및 표 10 내지 표 11에 제공되어 있다.
용어 "자극"은 그의 동족 리간드 (또는 표적 항원)와 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)의 결합을 유도함으로써, 다음에 제한되는 것은 아니나, TCR/CD3을 통한 신호 도입과 같은 신호 도입 사건을 매개하는 1차 반응을 지칭한다. 그러나 자극은 특정 분자의 변이된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양상에서 자극 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열 (들)을 제공하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일 양상에서, 신호는 예를 들어, 펩타이드에 부가된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하여, T 세포 반응의 매개를 야기하는 1차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 (또한 "1차 신호전달 도메인"으로 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD3 제타, 공통 FeR 감마 (FCERIG), Fe 감마 RIIa, FeR 베타 (Fe 엡실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAPIO, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 임의의 애완용 포유류 또는 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스위치 도메인" 또는 "이량체화 도메인"은 통상적으로 이량체화 분자의 존재하에 또 다른 스위치 도메인과 결합되는 폴리펩타이드-기반 개체를 지칭한다. 이러한 결합은, 예를 들어, 제1 스위치 도메인에 융합된 제1 물질 및 예를 들어 제2 스위치 도메인에 융합된 제2 물질의 기능적 연결을 야기한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 이량체화 스위치로 총칭된다. 실시형태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 이는 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고, 동종이량체화 스위치로 총칭된다. 실시형태에서, 스위치는 세포내에 존재한다. 실시형태에서, 스위치 도메인은 폴리펩타이드-기반 물질, 예를 들어, FKBP (FK506 결합 단백질), 및 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어, AP20187이다.
용어 "T 세포" 및 "T-림프구"는 혼용되며, 본 명세서에서 동의어로 사용된다. 예에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 나이브 T 세포 ("림프구 전구체"), 중앙 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 줄기 기억 T 세포 (Tscm), iPSC 유래 T 세포, 합성 T 세포 또는 이들의 조합이 포함된다.
용어 "TCR-관련 신호전달 모듈"은 TCR-CD3 복합체의 일부인 세포질 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 분자를 지칭한다. TCR 관련 신호전달 모듈은 CDγε, CDδε 및 CD3ζζ를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료제"는 예를 들어 질병의 치료, 억제, 예방, 효과 완화, 중증도 감소, 발병 가능성 감소, 진행 저하 및/또는 치유에 사용되는 제제를 지칭한다. 치료제에 의해 표적화되는 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 감염성 질병, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식세포 종양, 모세포종, 다양한 면역 세포에서 발현되는 항원, 및 다양한 혈액 질병과 관련된 세포에서 발현되는 항원 및/또는 염증 질병을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료적 제어"는 CAR 발현 세포의 활성을 제어하는데 사용되는 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR 발현 세포의 활성을 제어하기 위한 치료적 제어는 절단된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR), 절단된 표피 성장 인자 수용체 viii (tEGFRviii), 절단된 CD30 (tCD30), 절단된 BCMA (tBCMA), 절단된 CD19 (tCD19), 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 니트로 환원효소, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코TM 산화효소, 데옥시리보뉴클레오사이드 키나제, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/인돌-3-아세트산 (IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성 효소, CD20/알파 CD20, CD34/티미딘 키나제 키메라, 독소-의존적 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나제 (HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체 (CCR), 선택 마커 및 이들의 조합 중 어느 하나 이상을 포함한다.
용어 "치료 효과"는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 종양 체적의 감소, 암 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 감염원의 역가의 감소, 감염원의 결장 수의 감소, 질병 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하여, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "치료 효과"는 또한 처음에 질병의 발생을 예방하거나, 질병의 재발을 예방하는 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 질병 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해, 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 펩타이드 또는 그의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물의 양을 지칭하며, 적절한 효과를 제공하기 위한 약리학적 조성물의 충분한 양과 관련된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "치료 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 장애를 치료하기에 충분한 조성물의 양을 의미한다.
증상의 치료적 또는 예방적으로 유의한 감소는 대조군 또는 비 처리 대상체 또는 본 명세서에 기재된 올리고펩타이드를 투여하기 전의 대상체의 상태와 비교하여 측정된 매개변수에서 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150% 이상 이루어진다. 측정되거나 측정 가능한 매개변수는 당뇨병의 증상 또는 마커의 임상적으로 허용되는 규모와 관련된 매개변수뿐만 아니라, 임상적으로 검출 가능한 질병 마커, 예를 들어 생물학적 마커의 상승 또는 저하 수준을 포함한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 제형의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 필요한 정확한 양은 치료할 질병 유형, 대상체의 성별, 연령 및 중량과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
용어 "TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP"는 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2016/187349 A1에 기재된 바와 같은 차세대 CAR 플랫폼을 지칭한다. 일 실시형태에서, TFP는 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα 또는 TCRβ와 같은 TCR 사슬에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. TFP의 작제에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 사슬은 SEQ ID NO: 944 내지 945, 948, 949 내지 950 및 958로 표시되고, 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2017/070608 A1에 제공된다. CD3ε 사슬을 포함하는 TFP는 CD3ε TFP로 지칭된다. CD3γ 사슬을 포함하는 TFP는 CD3γ TFP로 지칭된다. CD3δ 사슬을 포함하는 TFP는 CD3δ TFP로 지칭된다. CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ 사슬을 포함하는 TFP는 집합적으로 CD3ε/γ/δ TFP로 지칭된다. 본 개시내용에 기재된 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, 리간드, 수용체 등)을 포함하고, NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 예시적인 TFP는 SEQ ID NO: 1900 내지 3123에 제공된다 (표 13). 이들 TFP 작제물은 표 12에 나타낸 NEMO-K277A를 공동 발현하는 1세대 CAR 작제물에 대해 동일한 항원 결합 도메인을 갖고, 동일한 순서의 번호로 넘버링되기 때문에, 이들 TFP의 서열번호, 항원 결합 도메인 및 표적 항원은 표 12를 참조하여 결정될 수 있다. 그러나, NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈은 선택적이다. 본 명세서에 기재된 항원 결합 도메인 (즉, vL 및 vH 단편, 리간드 및 수용체 등)을 갖는 TFP는 NEMO-K277A의 부재 하에 작제될 수 있다. 이와 같이, 상류 퓨린-SGSG-F2A 서열과 함께 이러한 보조 모듈은 SEQ ID NO: 1900 내지 3123으로 표시되는 TFP로부터 결실될 수 있다. 대안적으로, NEMO-K277A를 인코딩하는 보조 모듈은 다른 신호전달 단백질, 예컨대 hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E, 및 MyD88-L265P, FKBPx2-NEMO, NEMO-L600-FKBPx2, 및 CMV-141 등을 인코딩하는 보조 모듈로 대체될 수 있다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하는 수많은 벡터가 당 업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어 폴리 리신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로 핵산의 전달을 용이하게 하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 아데노바이러스 벡터, 아데나-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "막관통 도메인"(TMD)은 원형질막을 가로 지르는 CAR의 영역을 지칭한다. 본 발명의 CAR의 막관통 도메인은 막관통 단백질 (예를 들어, 유형 I 막관통 단백질), 인공 소수성 서열 또는 이들의 조합의 막관통 영역이다. 다른 막관통 도메인은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 백본을 포함하는 TMD 인코딩된 CAR은 T 세포 수용체, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 도메인으로부터 선택되는 막관통 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "삼중 기능성 T 세포 항원 연결 인자 또는 Tri-TAC"는 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2015/117229 A1에 기재된 차세대 CAR 플랫폼을 지칭한다. 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 본 개시내용에 기재된 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, scFv, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 사용하여 상이한 항원을 표적화하는 Tri-TAC를 작제할 수 있다. 또한, 본 개시내용에 기재된 상이한 보조 모듈 (예를 들어, NEMO-K277A, mNEMO-K270A 등)은 Tri-TAC 발현 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CAR-T 세포에서 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "개선"은 치료적 치료를 지칭하며, 목적은 질병 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 개선, 억제, 저하 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 암과 같은 병태, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다. 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 감소되는 경우 치료는 "효과적"이다. 대안적으로, 질병의 진행이 감소되거나 중단되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라, 적어도, 치료되지 않은 경우 예상되는 증상의 진행 또는 악화의 지연의 중단을 포함한다. 유리하거나 적절한 임상 결과는, 다음에 제한되는 것은 아니나, 검출 가능하거나, 검출 불가능한지에 상관없이, 하나 이상의 증상 (들)의 완화, 질병의 정도의 감소, 질병의 안정된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 낮춤, 질병 상태의 개선 또는 경감 및 호전 (부분적인지 또는 전체적인지에 무관함)을 포함한다. 용어 질병의 "치료"는 또한 질병의 증상 또는 부작용으로부터의 경감 (완화 치료 포함)을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암의 치료는 종양 체적의 감소, 암 세포 수의 감소, 암 전이의 억제, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함한다
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현 (예를 들어 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 외래 유전자)를 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 등이 포함한다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBan 수탁번호 BAG36664.1로서 제공되는 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 균등한 잔기로서 규정되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 " TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인 또는 그의 기능적 유도체로부터의 아미노산 잔기로 규정된다. 일 양상에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBan 수탁번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 그의 기능성 오르쏘로그 (ortholog)인, 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 균등한 잔기를 포함한다. 일 양상에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 SEQ ID NO: 4853 (표 6d)로서 제공된 서열이다.
CAR의 결합 도메인은 적절한 에피토프에 결합하도록 선택된다. 예를 들어, CAR에 의해 인식되는 에피토프는 또한 CAR을 포함하는 scFv에 의해 인식되는 에피토프로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, MPL을 표적화하는 CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1509 및 SEQ ID NO: 5422)의 항원 특이적 도메인은 scFv MPL-161-(vL-vH) (SEQ ID NO: 808 및 SEQ ID NO: 4721)로 구성되므로, CAR은 scFv가 유래된 모 항체 및 scFv와 동일한 에피토프를 표적화할 것으로 예상된다. scFv MPL-161-(vL-vH) (SEQ ID NO: 808 및 SEQ ID NO: 4721)에 의해 인식되는 에피토프 SEQ ID NO: 15160에 제공되어 있다. 본 개시내용의 CAR 및 백본의 작제에 사용되는 수 개의 scFv 및/또는 그의 모 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당 업계에 공지되어 있다. 대안적으로, CAR (백본의 제조물로 존재하는 CAR 포함)에 의해 표적화되는 에피토프는 그의 표적 항원의 일련의 돌연변이체를 생성하고, 돌연변이체가 CAR-발현 세포에 결합하는 능력을 시험함으로써 결정될 수 있다. 예로서, MPL을 표적화하는 CAR CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC에 의해 인식되는 에피토프는 MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5 융합 작제물의 돌연변이체 (DNA SEQ ID NO: 1015 및 PRT SEQ ID NO: 4928)의 패널을 생성함으로써 결정될 수 있다. 돌연변이체 작제물을 적합한 세포주 (예를 들어, 293FT 세포)로 형질감염시키고, 융합 단백질을 포함하는 상청액을 수집하고, 상청액에서 상이한 돌연변이체 MPL-ECD-GGSG-Nluc-AcV5 융합 단백질이 분비되는 것을 확실하게 하기 위해 NLuc 활성에 대해 분석한다. 이어서, 융합 단백질을 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR 작제물을 발현하는 세포 (예를 들어, Jurkat 세포 또는 T 세포)에 결합하는 능력에 대해 시험할 것이다. CAR-발현 세포에 결합하지 못한 돌연변이체는 MPL-특이적 CAR에 의해 표적화되는 에피토프를 포함시키는 단계를 위한 후보이다. 특정 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위한 다른 접근법은 상이한 시험 항체에 의한 기능적 경쟁 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상이한 시험 MPL 항체의 증가시킨 농도의 존재 또는 부재 하에 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR을 발현하는 T 세포를 MPL (예를 들어, HEL 세포)을 발현하는 세포주와 공동 배양시킬 수 있다. 시험 MPL 항체에 의해 인식되는 에피토프가 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR에 의해 인식되는 에피토프와 중첩되는 경우, 그 후, 시험 항체는 투여량 의존적 방식으로 CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC CAR을 발현하는 T 세포에 의해 유도되는 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생성을 차단할 것으로 예상된다. 시험 항체와 동일한 이소유형의 비특이적 항체는 대조군으로서 포함되며, CAR을 발현하는 T 세포에 의해 유도되는 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생성에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 유사하게, 특정 CAR을 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 발현시킬 수 있고, 시험 항체에 의해 인식되는 에피토프가 상기 CAR에 의해 인식되는 에피토프와 중첩되는지를 결정하기 위해, 표적 세포주와의 공동 배양시 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포에 의한 EGFP 유도를 차단하는 시험 항체의 능력을 사용할 수 있다.
비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR, 및 보조 모듈 (NF-κB 자극 분자 및 선택적 NF-κB 활성화제 포함)을 포함하는 조성물 및 암을 포함하는 질병을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 통상적인 CAR (표 1) 및 표 2에 기재된 바와 같은 보조 모듈의 특정 조합이 제공된다.
표 1: 통상적인 CAR 구조. 1세대 통상적인 CAR (통상적인 CAR I)은 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들어, CD3z)을 가지며, 공자극 도메인을 갖지 않는다. TCR 융합 단백질 (TFP)은 통상적인 CAR 1의 다른 예이다. 2세대 통상적인 CAR (통상적인 CAR 2 또는 CAR II)은 하나의 공자극 도메인 (예를 들어, 41BB 또는 CD28) 및 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들어, CD3z)을 갖는다. 3세대 통상적인 CAR (통상적인 CAR 3 또는 CAR III)은 2개의 공자극 도메인 (예를 들어, 41BB 및 CD28) 및 세포내 신호전달 (ISD) 도메인 (예를 들어, CD3z)을 갖는다. Ab-TCR은 경쟁 사슬 수용체이고, PCT/US2016/058305에 기재되어 있다. cTCR은 하나 이상의 TCR 불변 사슬에 융합되고 T 세포 신호전달의 활성화를 초래하는 vL 및 vH 단편으로부터 유래된 항원 결합 도메인으로 구성된 단일 사슬, 1/2 및 이중 사슬 수용체이다. 합성 면역 수용체는 차세대 CAR이고, US 62/429,597 및 WO 2018/102795 A1에 기재되어 있다:
표 1 기존 CAR 아키텍처
[표 1]
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[표 2]
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[표 6a]
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[표 6b]
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[표 6c]
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[표 9]
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[표 10]
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약자; 1st CAR, 1세대 CAR; 2nd Gen CAR, 2세대 CAR; DC SIR, 이중 사슬 SIR; OHC SIR, 1/2 사슬 SIR.
표 10의 상기 예시적 작제물의 보조 모듈은 선택적이며, 결실되거나 다른 보조 모듈로 대체될 수 있다.
[표 11]
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[표 12]
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[표 13]
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[표 14]
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일부 실시형태에서, 조성물은 통상적인 CAR 1 내지 6 (표 1)을 인코딩하는 핵산을 포함하고, CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본 1 내지 72 (표 2) 중 임의의 하나 이상을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 인코딩되는 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-1의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-2의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-37의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-38의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-49의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백본-1을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 백본-50의 CAR의 항원 특이적 도메인은 PCT/US2017/064379의 표 6a 내지 표 6c 또는 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특이적 항원을 표적화한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 백본의 성분, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 1, 2, 3개 이상의 항원 특이적 도메인을 인코딩한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 ASD가 사용될 수 있다. ASD의 서열은 CAR의 하나 이상의 사슬의 나머지를 인코딩하는 핵산 서열과 인접하고 동일한 리딩 프레임 내에 있다.
일 실시형태에서, VH 도메인만으로 항원-특이성을 부여하기에 충분한 경우 ("단일 도메인 항체"), 각각의 항원 특이적 영역은 VH, CH1, 힌지, 및 CH2 및 CH3 (Fc) Ig 도메인을 갖는 전장 IgG 중쇄 (표적 항원에 특이적임)를 포함한다. 전장 IgG 중쇄는 적절한 막관통 도메인을 통해 공자극 도메인 및 선택적인 세포내 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 완전히 활성 항원-특이적 표적화 영역을 생성하기 위해 VH 및 VL 도메인 둘 모두가 필요한 경우, VH-포함 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 및 전장 람다 경쇄 (IgL) 둘 모두를 세포에 도입시켜, 활성 항원-특이적 표적화 영역을 생성한다.
일부 실시형태에서, 인코딩된 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 분자의 항원 특이적 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 또는 낙타과 vHH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인은 이것이 유래된 scFv의 쥣과동물 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다.
일부 경우에, scFv는 당 업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]). ScFv 분자는 가요성 폴리펩타이드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. scFv 분자는 (예를 들어, 접힘 등을 최적화하기 위해) 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커 (예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. scFv는 그의 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복 세트를 포함한다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 향상시켜서 활성 연구에서 더 우수한 효능을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 scFv 항체 단편은 이들이 유래된 IgG 항체와 동일하거나 유사한 친화도로 동일한 항원에 결합한다는 점에서 기능성이다. 다른 실시형태에서, 항체 단편은 유래된 항체와 비교하여 항원에 대한 결합 친화도가 더 낮지만, 본 명세서에 기재된 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능성이다. 일 실시형태에서, CAR 분자는 표적 항원에 대해 10-4　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 또는 10-8　M의 결합 친화도 KD를 갖는 항체 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 특이적 도메인은 본 명세서에 열거된 항체 또는 scFv의 1, 2 또는 3개의 중쇄 (hc) CDRs, hcCDRl, hcCDR2 및 hcCDR3 모두 (표 6b; SEQ ID NO: 14122 내지 15039) 및/또는 본 명세서에 열거된 항체 또는 scFv의 1, 2 또는 3개의 경쇄 (lc) CDRs, lcCDRl, lcCDR2 및 lcCDR3 (표 6A; SEQ ID NO: 13204 내지 14121)를 포함한다(또한 PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조). 일부 실시형태에서, ASD는 특정 scFv에 속하는 3개의 경쇄 CDR을 모두 포함하는 VL (또는 vL) 단편 (표 6a; SEQ ID NO: 13204 내지 14121) 또는 특정 scFv에 속하는 3개의 중쇄를 모두 포함하는 VH (또는 vH) 단편 (표 6b; SEQ ID NO: 14122 내지 15039)을 포함한다 (또한 PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조). 표 6c는 상이한 scFv의 명칭, 표적 항원 및 서열번호를 제공하며, vL 및 vL 단편 및 CDR은 표 6a 및 표 6b에 열거되어 있다. vL 및 vH 단편 및 해당 scFv는 본 명세서의 다양한 실시형태에서 본 명세서에 기재된 CAR을 작제하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 항원 특이적 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 양상에서, 비인간 항체는 항체의 특정 서열 또는 영역이 인간에서 천연적으로 생성되는 항체 또는 그의 단편과의 유사성이 증가되도록 변형된 인간화된 것이다. 일 양상에서, 항원 결합 도메인은 인간화된 것이다. 인간화 항체는 다음에 제한되는 것은 아니나, CDR-이식, 겉치장 또는 재포장 및 사슬 정리를 포함하는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 각각의 항원 특이적 도메인은 이가 (또는 2가) 단일 사슬 가변 단편 (di-scFv, bi-scFv)을 포함할 수 있다. 예를 들어, di-scFV를 포함하는 CAR에서, 각각의 항원에 특이적인 2개의 scFv는 함께 연결되어, 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드 사슬을 생성함으로써 탠덤 scFv를 생성한다. (문헌[Xiong, Cheng-Yi; Natarajan, A; Shi, XB; Denardo, GL; Denardo, SJ (2006). "Development of tumor targeting anti-MUC-1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding". Protein Engineering Design and Selection 19 (8): 359-367; Kufer, Peter; Lutterbuese, Ralf; Baeuerle, Patrick A. (2004). "A revival of bispecic antibodies". Trends in Biotechnology 22 (5): 238-244]). 적어도 2개의 항원-특이적 표적화 영역을 포함하는 CAR은 2개의 항원 각각에 대해 특이적인 2개의 scFv를 발현할 것이다. 생성된 ASD는 힌지 영역 및 막관통 도메인을 통해 공자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 대안적으로, 2개의 항원 특이적 표적화 영역을 포함하는 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 동일한 항원의 2개의 항원 또는 2개의 에피토프 각각에 대해 2개의 vHH 특이성을 발현할 것이다. 2개의 항원을 표적화하는 예시적인 CAR은 SEQ ID NO: 1307 및 1310으로 표시되어 있다.
다른 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 각각의 ASD는 디아바디를 포함한다. 디아바디에서, scFv는 2개의 가변 영역이 함께 접혀서 scFv가 이량체화되도록 하기에는 너무 짧은 링커 펩타이드로 생성된다. 여전히 더 짧은 링커 (1 또는 2개의 아미노산)는 삼량체, 이른바 트라이아바디 (triabody) 또는 트라이바디 (tribody)의 형성을 초래한다. 테트라바디 (tetrabody)가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 ASD는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VHH 단편 (나노바디 (nanobody))을 포함한다 (PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조). 일부 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 ASD는 본 명세서에 기재된 바와 같은 아피바디 (affibody)를 포함한다 (PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조).
다른 실시형태에서, 항원 특이적 결합 도메인은 표적 세포에서 발현된 상동체에 대한 리간드를 포함한다.
일 실시형태에서, 표적 항원에 대한 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 특이적 도메인은 이 항원을 표적화하는 vHH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다 (PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조).
일 실시형태에서, 표적 항원에 대한 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 특이적 도메인은 이 항원을 표적화하는 비면역글로불린 스캐폴드의 항원 결합 부분이다 (PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조).
일 실시형태에서, 표적 항원에 대한 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 특이적 도메인은 이 표적 항원에 결합하는 것으로 공지된 수용체의 항원 결합 부분이다 (PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6 참조).
또 다른 양상에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체 ("TCR") 또는 그의 단편, 예를 들어 단일 사슬 TCR (scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365- 74 (2012)]을 참조한다 (상기 참조문헌은 그 전문이 본 명세서에 포함됨). 예를 들어, 링커 (예를 들어, 가요성 펩타이드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터 Vα 및 vβ 유전자를 포함하는 scTCR을 조작할 수 있다. 이 접근법은 그 자체로는 세포내에 존재하지만, 이러한 항원 (펩타이드)의 단편이 MHC에 의해 암세포의 표면에 존재하는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 도메인은 표적 항원에 특이적인 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체의 단편이며, 단편은 표적 항원에 대한 특이성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 특이적 도메인은 MHC 제시된 펩타이드에 결합한다. 일반적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩타이드는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 충전하고, CD8+ T 림프구상의 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 핵 형성 세포에 의해 항시적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩타이드/MHC 복합체는 면역요법에 대한 고유한 클래스의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원 (HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩타이드를 표적화하는 TCR-유사 항체가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌[Sastry et al., J Viral. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011117(16):4262-4272; Verma et al., Jlmmunol2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther20018(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어, TCR-유사 항체는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. HLA-A2와 관련하여 WT1을 표적화하는 TCR-유사 항체를 기반으로 한 예시적인 CAR은 SEQ ID NO: 1266 내지 SEQ ID NO: 1268에 표시되어 있다. 본 발명에서, CAR은 수 개의 HLA-A2 제한된 세포내 펩타이드에 대한 항체와 같은 TCR로부터 유래된 항원 결합 도메인을 사용하여 생성되었다. 표적 단백질 항원, 펩타이드 단편 및 펩타이드의 서열이 표 8에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 보조 모듈과 함께 또는 단독으로 발현되는 경우, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR에 의해 표적화될 수 있는 질병에 특이적인 항원은 다음에 제한되는 것은 아니나, 　CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4, 크립토, gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 보조 모듈과 함께 또는 단독으로 발현되는 경우, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR에 의해 표적화될 수 있는 질병에 특이적인 항원은 다음에 제한되는 것은 아니나, 4-1BB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산무수화효소 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CD123, CEA, CNTO888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 외 도메인-B, 엽산 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산재 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, LAMP1, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글리콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C (tenascin C), TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 비멘틴 (vimentin) 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 암에 특이적인 다른 항원은 당업자에게 자명할 것이며, 본 개시내용의 대안적 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
단독으로 또는 본 명세서에 기재된 보조 모듈과 함께 사용되는 경우, CAR은 질병-지원 항원 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병-지원 항원)에 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 질병-지원 항원은 질병 유발 세포의 생존 및 증식을지원하는 세포 상에 존재하는 항원이다. 일부 실시형태에서, 질병-지원 항원은 간질 세포 또는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)에 존재하는 항원이다. 기질 세포는 미세환경에서 세포 증식을 촉진하기 위해 성장 인자 및 사이토카인을 분비할 수 있다. MDSC 세포는 T 세포 증식 및 활성화를 차단할 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 일부 실시형태에서, CAR-발현 세포는 질병-지원 세포를 파괴하여 질병 유발 세포의 성장 또는 생존을 간접적으로 차단한다.
특정 실시형태에서, 기질 세포 항원은 골수 기질 세포 항원 2 (BST2), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 및 테나신 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, FAP-특이적 항체는 시브로투주맙 (sibrotuzumab)과 결합하기 위해 경쟁하거나, 그와 동일한 CDR을 갖거나 경쟁한다. 실시형태에서, MDSC 항원은 CD33, CD11b, C14, CD15 및 CD66b 중 하나 이상으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 질병 지원 항원은 골수 기질 세포 항원 2 (BST2), 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP) 또는 테나신, CD33, CDllb, C14, CD15, 및 CD66b 중 하나 이상으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 비 천연 발생 면역 수용체와 표 6a 내지 표 6c에 기재된 상이한 표적상의 동일한 에피토프에 결합하는 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR을 제공한다 (예를 들어, 본 개시내용의 임의의 CAR과 상이한 표적에 결합하기 위해 교차 경쟁할 수 있는 능력을 갖는 CAR). 일부 실시형태에서, 이러한 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 특이적 도메인은 항체의 vL 단편, vH 단편 또는 scFv 단편으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 참조 항체는 SEQ ID NO: 4555 내지 4815, 11165 내지 11401, 15070 내지 15132 (표 6c)에 제시되거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 본 명세서의 표 6c에 기재된 scFv이다. 예시적 실시형태에서, SEQ ID NO: 4555로 제시낸 참조 scFv FMC63 (vL-vH)는 교차 경쟁 연구에서 FMC63 기반의 통상적인 CAR 및 본 개시내용의 백본에 의해 인식되는 표적 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 vHH 단편은 SEQ ID NO: 4474 내지 4514에 제시된 서열을 갖는 vHH 단편이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구를 위한 교차-경쟁 연구를 위한 기준 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 SEQ ID NO: 4515 내지 4519에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 개시내용의 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 리간드는 SEQ ID NO: 4544-4554인 서열을 갖는 리간드이다. 일부 실시형태에서, 상이한 표적에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 서열번호가 표 10 내지 표 14에 제시된 CAR이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 MPL-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 항체는 특허 출원 US 2012/0269814 A1에 기재된 항체 mAb-1.6, mAb-1.111, mAb-1.75, mAb-1.78, mAb-1.169, 및 mAb-1.36이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 MPL-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 표 6c의 SEQ ID NO: 4720 내지 4727에 제시된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 scFv이다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 MPL-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 리간드는 SEQ ID NO: 4544 내지 4545에 열거된 바와 같은 서열을 갖는 TPO 및 mTPO 리간드이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 MPL-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 SEQ ID NO: 5120 내지 5126에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 CAR이다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 MPL-표적화 CAR은 SEQ ID NO: 15160에 제시된 서열에 해당 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CD19-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 표 6c의 SEQ ID NO: 4555 내지 4568에 제시된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 scFv이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CD19-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 SEQ ID NO: 4929 내지 4943에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 CAR이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CD20-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 CD20을 표적화하고, 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CD20-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 CD20을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 CD20-표적화 CAR은 SEQ ID NO: 15149 내지 15154에 제시된 하나 이상의 서열에 해당 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 BCMA-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 CD20을 표적화하고 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 BCMA-표적화 CAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 BCMA를 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 BCMA-표적화 CAR은 SEQ ID NO: 15155 내지 15159에 제시된 하나 이상의 서열에 해당하는 에피토프에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 DLL3-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 DLL3을 표적화하고 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 DLL3-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 DLL3을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 LAMP1-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 LAMP1을 표적화하고 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 LAMP1-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 LAMP1을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 TROP2-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 TROP2을 표적화하고 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 TROP2-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 TROP2을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 PTK7-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구에 대한 기준 scFv는 PTK7을 표적화하고 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 서열번호를 갖는 scFv이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 PTK7-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 PTK7을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CD22, CD123, CD33, CD37, CD70, CD138, CS1, IL13Ra2, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β, TCRB1, TCRB2, TCRγδ, CD30, 메소텔린, Her2, EGFRviii, 및 HIV1-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 이들 항원을 표적화하고, 표 6c에 열거된 바와 같거나, PCT/US2017/064379의 표 5 내지 표 6에 기재된 바와 같은 scFv이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CD22, CD123, CD33, CD37, CD70, CD138, CS1, IL13Ra2, 엽산 수용체 α, 엽산 수용체 β, TCRB1, TCRB2, TCRγδ, CD30, 메소텔린, Her2, EGFRviii, 및 HIV1-표적화 CAR에 대한 교차 경쟁 연구를 위한 기준 CAR은 이들 항원을 표적화하고 표 12에 열거된 바와 같은 서열번호를 갖는 CAR이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR은 항원 특이적 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지 또는 링커 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 항체 또는 그의 기능성 균등물, 단편 또는 유도체의 인간 CD8α 또는 Fc 단편, 항체 또는 그의 기능성 균등물, 단편 또는 유도체의 인간 CD8α의 힌지 영역 또는 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 및 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 예시적 실시형태에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2 영역, (iv) CD8α의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역, (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역, 또는 (vii) 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR의 2개 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 분리된다. 링커는 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR의 도메인/영역 중 임의의 것과 함께 연결된 약 1 내지 100개의 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩타이드 영역이다. 일부 실시형태에서, 링커는 예를 들어, 5 내지 12개의 아미노산 길이, 5 내지 15개의 아미노산 길이 또는 5 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 링커는 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기로 구성되어 인접한 단백질 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있다. 더 긴 링커, 예를 들어 100개 초과의 아미노산 링커는 본 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있고, 예를 들어 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 선택될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 유형 I, 유형 II 또는 유형 III 막관통 단백질 중 임의의 것을 포함하는 막관통 도메인을 갖는 임의의 단백질로부터의 막관통 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 CAR의 막관통 도메인은 또한 인공 소수성 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 CAR의 막관통 도메인은 막관통 도메인이 이량체화되지 않는 것으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 T 세포 수용체, CD3ε, CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 도메인으로부터 선택되는 막관통 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 백본을 포함한다.
막관통 도메인은 막관통 영역의 어느 하나의 말단에서 막관통 도메인에 하나 이상의 추가의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 내지 최대 15개의 아미노산) (예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 세포외 연장 및/또는 하나 이상의 아미노산의 세포내 연장)을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나에 인접한다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 신호전달 도메인, 공자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래할 수 있다. 또 다른 양상에서, 막관통 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래하지 않는다.
다양한 실시형태, 본 명세서에 기재된 백본의 성분, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 0, 1, 2, 3 이상의 세포내 신호전달 도메인을 인코딩한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR은 선택적으로 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 도메인은 세포질에 존재할 수 있고, 효과기 기능 신호를 유도할 수 있으며, 세포가 그의 특수 기능을 수행하도록 유도한다. 세포내 신호전달 도메인의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, T 세포 수용체 또는 그의 상동체의 ξ 사슬 (예를 들어, η 사슬, CD3ε, CD3γ, CD3δ, FcεR1η 및 β 사슬, MB1 (Igα) 사슬, B29 (Igβ) 사슬, 등), CD3 폴리펩타이드 (Δ, δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70, 등), src 패밀리 티로신 키나제 (Lck, Fyn, Lyn, 등) 및 T 세포 형질도입에 관여하는 다른 분자, 예컨대 CD2, CD5 및 CD28 중 임의의 것을 포함한다. 구체적으로, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 사슬, FcηRIII, FcεRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 보유 세포질 수용체 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 세포내 신호전달 도메인이 당업자에 자명할 것이며, 본 발명의 대안적 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 인간 CD3 제타 사슬의 신호전달 도메인, FcgRIII, FceRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 보유 세포질 수용체, 및 이들의 조합을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 백본의 성분, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 단리된 핵산 분자는 0, 1, 2, 3개 이상의 공자극 도메인을 인코딩한다. 예시적 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 및 이들의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터의 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR의 다양한 성분은 본 명세서의 상기 및 다른 부분에 제공되어 있다. 다시 말하면, 본 개시내용은 결과적으로 하나 이상의 자극 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 엔도-도메인에 연결된 것으로서, 링커의 '힌지'를 통해 막관통 도메인에 부착되고, 항원 특이적 결합 도메인을 포함하는 엑토-도메인을 포함하는 CAR을 제공함을 인식해야 한다.
본 명세서에서는 통상의 통상의 CAR 1 내지 6 (표 1) 또는 본 명세서에 기재된 백본 1 내지 72 (표 2) 중 임의의 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다.
또한 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, CAR의 항원 특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포 상의 1, 2, 3개 이상의 항원에 특이적이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR의 각 성분은 CAR의 각각의 다른 성분과 인접하고, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, CAR 포함 백본은 하나 초과의 항원 특이적 도메인을 포함하는 경우, 각각의 항원 특이적 도메인은 동일한 CAR 내의 다른 항원 특이적 도메인과 인접하며, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A 또는 그 변이체)를 인코딩하는 보조 모듈 및 통상의 CAR I을 포함하는 백본 1 내지 10을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 백본 1 내지 10의 보조 모듈은 상이한 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt, hNEMO-K277A-델타-V249-K255 또는 hNEMO-K277L 등)를 포함하는 상이한 분자를 인코딩하는 다른 보조 모듈에 의해 대체될 수 있다. 또한 본 명세서에서는 IgSP-[hTRAC-opt2] 및 IgSP-[hTRBC-opt2]를 인코딩하는 보조 모듈 및 통상의 CAR I을 포함하는 백본 11 내지 12를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, CAR 포함 백본-1 내지 12의 항원 특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포 상의 1, 2, 3개 이상의 항원에 특이적이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR의 각 성분은 CAR 포함 백본 1 내지 12의 각각의 다른 성분과 인접하고 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, CAR 포함 백본 1 내지 12는 하나 초과의 항원 특이적 도메인을 포함하는 경우, 각각의 항원 특이적 도메인은 인접하고, 동일한 CAR의 다른 항원 특이적 도메인과 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A 또는 그 변이체)를 인코딩하는 보조 모듈 및 통상의 CAR II를 포함하는 백본 13 내지 22를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 백본 13 내지 22의 보조 모듈은 상이한 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt, hNEMO-K277A-델타-V249-K255 또는 hNEMO-K277L 등)를 포함하는 상이한 분자를 인코딩하는 다른 보조 모듈에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR 백본 백본-13 내지 22의 항원 특이적 도메인은 표적 세포, 예컨대 암 세포 상의 1, 2, 3개 이상의 항원에 특이적이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CAR의 각 성분은 백본 13 내지 24를 포함하는 CAR의 각각의 다른 성분과 인접하고 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, CAR 포함 백본 13 내지 24는 하나 초과의 항원 특이적 도메인을 포함하는 경우, 각각의 항원 특이적 도메인은 동일한 CAR의 다른 항원 특이적 도메인과 인접하고, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A 또는 그 변이체)를 인코딩하는 보조 모듈 및 Ab-TCR을 포함하는 백본 37 내지 46을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 백본 37 내지 46의 보조 모듈은 상이한 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt, hNEMO-K277A-델타-V249-K255 또는 hNEMO-K277L 등)를 포함하는 상이한 분자를 인코딩하는 다른 보조 모듈에 의해 대체될 수 있다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A 또는 그 변이체)를 인코딩하는 보조 모듈 및 이중 사슬 cTCR/SIR을 포함하는 백본 49 내지 58을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 백본 49 내지 58의 보조 모듈은 상이한 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt, hNEMO-K277A-델타-V249-K255 또는 hNEMO-K277L 등)를 포함하는 상이한 분자를 인코딩하는 다른 보조 모듈에 의해 대체될 수 있다.
또한 본 명세서에서는 본 명세서에 기재된 바와 같이 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, vFLIP-K13, hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-K277A, FKBPx2-hNEMO-L753(251), FKBPx2-hNEMO-L600(200), FKBPx2-RIP-ID, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MyD88-L265P, TCL-1A 또는 그 변이체)를 인코딩하는 보조 모듈 및 1/2 사슬 (OHC) cTCR/SIR을 포함하는 백본 61 내지 70을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드가 제공된다. 백본 61 내지 70의 보조 모듈은 상이한 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt, hNEMO-K277A-델타-V249-K255 또는 hNEMO-K277L 등)를 포함하는 상이한 분자를 인코딩하는 다른 보조 모듈에 의해 대체될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세세ㅓ에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 1, 2, 3개 이상의 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, K13-vFLIP, K13opt, NEMO, NEMO K277A, 인간 NEMO-K277L, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 또는 마우스 NEMO K270A 또는 그 변이체)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 트롬보포이에틴 (thrombopoietin) 수용체, MPL에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD19에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD20에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD22에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD23에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD30에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD32에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD33에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD123에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD138에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD200R에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD276에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD324에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 BCMA에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CS1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 ALK1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 ROR1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH6에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH16에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH17에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CDH19에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 EGFRviii에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Her2에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Her3에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 메소텔린에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 엽산 수용체 알파에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 엽산 수용체 베타에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CLL-1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CLEC5A에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 NY-ESO/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 WT1/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 WT1/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 AFP/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 HPV16-E7/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 gp100/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 hTERT/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 MART1/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 HTLV1-Tax/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 PR1/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-gag/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 HIV1-외피 gp120에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 DLL3에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 PTK7에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TROP2에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 LAMP1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Tim1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 감마-델타에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 베타1 불변 사슬에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TCR 베타2 불변 사슬에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 GCC에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 B7H4에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 LHR에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TSHR에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Tn-Muc1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 TSLPR에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 조직 인자에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 SSEA-4에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-32 또는 백본-33과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 SLea에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Muc1/MHC 클래스 I 복합체에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Muc16에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 NYBR-1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 IL13Ra2에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 IL11Ra에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 L1CAM에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 EpCAM1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 gpNMB에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 GRP78에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 GPC3에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 GRPC5D에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 GFRa4에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 FITC에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD79b에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym1에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 Lym2에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 4의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CLD18A2에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 4의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 백혈병 세포 상에 발현되는 CD43 에피토프에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 4의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 CD179a에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 통상의 CAR 1 내지 6의 일부이거나, 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61과 같은 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 CAR을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드로서, CAR의 항원 특이적 도메인은 항체의 Fc 부분 (즉, Ig Fc)에 특이적인 폴리펩타이드가 제공된다. Ig Fc에 특이적인 항원-특이적 도메인을 갖는 예시적 CAR은 SEQ ID NO: 1629에 의해 표시되며, 항원 특이적 도메인으로서 CD16-V158의 세포외 도메인을 포함한다. 전술한 임의의 것에서 CAR 작제물을 인코딩하는 핵산 분자는 NF-κB 활성화제 코딩 서열을 추가로 포함하거나, 대안적으로, NF-κB 활성화제 코딩 서열은 제2 핵산 분자 상에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 선택적 NF-κB 활성화제 코딩 서열 및/또는 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR의 적절한 성분을 인코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 표준 기법을 사용하여, 핵산 분자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 핵산 분자를 유도하거나, 이를 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함에 의한 것과 같이, 당 업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여 획득될 수 있다. 대안적으로, 대상 핵산은 클로닝이 아닌 합성에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 보조 분자 (예를 들어, NF-κB 활성화제 서열) 및/또는 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 핵산 분자는 메신저 RNA (mRNA) 전사체로서 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 보조 분자 (예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제 코딩 서열) 및/또는 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 핵산 분자는 DNA 작제물로서 제공된다.
클로닝 및 발현 방법은 당업자에게 명백할 것이고, WO 2015/142675; 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY; June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716]; WO　01/96584;　WO　01/29058; 미국 특허 제 6,326,193호에 기재된 바와 같은 것일 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 제시된 바와 같이 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다. 인산칼슘 형질감염 등과 같은 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 물리적 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며 당업자에게 명백할 것이다. 예시적인 실시예에서, 이러한 방법은 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)]; 미국 특허 제 5,350,674호 및 제 5,585,362호에 제시되어 있으며, 상기 문헌의 각각의 내용은 본 명세서에 제시된 바와 같이 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 또 다른 실시형태에서, CAR 벡터는 특허 출원 WO 2013/059343 A1 (PCT/US2012/060646) 및 문헌[Ding X et al, Nat. Biomed. Eng. 1, 0039 (2017)]에 기재된 바와 같은 미세유체 장치를 사용하여 세포막에서 일시적 교란을 야기함으로써, 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 내에 형질도입되며, 상기 문헌 각각의 내용은 본 명세서에 제시된 바와 같이 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 작제물을 제공하고, 상기 핵산 분자는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 각각의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (i) 선택적 힌지/링커, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 선택적 세포내 도메인, 또는 (a) T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열과 인접하며, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. SIR의 작제에 사용될 수 있는 예시적 T 세포 수용체 불변 사슬은, 다음에 제한되는 것은 아니나, TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, preTCRα 및 그 변이체 및 돌연변이체의 불변 사슬을 포함한다. 일부 실시형태에서, NF-κB 활성화제 (예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제) 코딩 서열은 동일한 재조합 핵산 작제물 상에 존재하지만, 발현시 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR에 연결되지 않고, 오히려 (예를 들어, 펩타이드 절단 가능한 링커를 통해) 절단되거나, 폴리뉴클레오타이드의 그 자체의 발현 카세트의 일부이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR 및 보조 모듈을 인코딩하는 핵산 서열 또는 서열들을 포함하는 벡터 또는 벡터들을 제공한다. 일부 실시형태에서, 보조 모듈은 NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 비천연 발생 NF-κB 활성화제이다. 일 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및 보조 모듈, 예를 들어, NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈은 단일 벡터에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및 보조 모듈, 예를 들어, NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈은 하나 초과의 벡터에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및 보조 모듈, 예를 들어, NF-κB 활성화제를 인코딩한느 보조 모듈은 각각 별도의 벡터 또는 별도의 핵산에 의해 인코딩된다. 일 실시형태에서, 2개의 기능성 폴리펩타이드 단위 (예를 들어, CAR 및 보조 모듈)는 단일 벡터 또는 단일 핵산에 의해 인코딩된다. 일 실시형태에서, 벡터 또는 벡터들은 DNA 벡터(들), RNA 벡터(들), 플라스미드(들), 렌티바이러스 벡터(들), 아데노바이러스 벡터(들), 레트로바이러스 벡터(들), 바큘로바이러스 벡터(들), 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터(들), 또는 피기백 트랜스포손(들)으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터이다. 예시적 벡터의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3840 내지 3841에 제공된다. 벡터 pLENTI-EF1α (SEQ ID NO: 3840) 및 pLENTI-EF1α-DWPRE (SEQ ID NO: 3841)는 pLENTI-EF1α-DWPRE에 WPRE 영역이 부재한다는 점이 상이한 빈 렌티바이러스 벡터이다. pCCL3-MNDU3-WPRE 벡터의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 7779에 제공된다. 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 코딩 서열은 이들 벡터 내 Nhe I 및 Sal I 부위 사이에 클로닝될 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 또한 예를 들어, 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 프로모터, 패키징 신호 (ψ), 프라이머 결합 부위 (PBS), 하나 이상의 (예를 들어, 2개의) 긴 말단 반복 (LTR), 및 대상 전이유전자, 예를 들어, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 gag, pol, 및 env와 같은 바이러스 구조 유전자가 부재할 수 있다. 예시적 감마레트로바이러스 벡터는 쥣과 동물 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-초점 형성 바이러스 (Spleen-Focus Forming Virus) (SFFV), 및 골증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 이로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 적절한 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터의 비 제한적 예는 예를 들어 MNDU3 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 코어 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 3'UTR을 포함한다.
본 개시내용은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 작제물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하기 위한 방법은 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR") (예를 들어, 본 명세서에 기재된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (예를 들어, 본 명세서에 기재된 IRES), 발현될 핵산 및 일반적으로 50 내지 2000개의 염기쌍 길이의 폴리A 꼬리 (SEQ ID NO:3855)를 포함하는 작제물을 생성하기 위해, 특수하게 설계된 프라이머에 의한 주형의 시험관내 전사 (IVT) 이후 폴리A 첨가를 포함한다. 이렇게 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 주형은 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 NF-κB 자극 분자에 대한 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, RNA CAR-NFκB 벡터는 전기천공에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포로 형질도입된다. 다른 실시형태에서, RNA CAR 벡터 및/또는 NF-κB 활성화제 벡터는 미세유체 장치를 사용하여 세포막에서 일시적인 교란을 유발함으로써 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포로 형질도입된다. 상이한 사슬 (또는 기능성 폴리펩타이드 단위)은 또한 하나 이상의 벡터를 사용하여 상이한 벡터 또는 기술의 조합을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입될 수 있으며, 그 동안 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입된다. 다른 양상에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되고, 보조 모듈 (예를 들어, NF-κB 활성화제)은 슬리핑 뷰티 트랜스포손을 사용하여 도입된다. 또 다른 양상에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되고, 보조 모듈 (예를 들어, NF-κB 활성화제)은 RNA 형질감염을 사용하여 도입된다. 또 다른 양상에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR은 당 업계에 공지된 유전자 표적화 기술을 사용하여 내인성 TCR 사슬 좌위에서 유전자 재조합에 의해 세포에서 생성되고, 보조 모듈은 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입된다.
RNA는 다수의 상이한 방법, 예를 들어, 다음에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)) (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙션 (lipofection)을 이용한 양이온성 리포좀 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개 형질감염 또는 "유전자 총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템 (예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조) 또는 미세유체를 사용하여 세포막에 일시적인 교란을 야기하는 장치 (예를 들어, 특허 출원 WO 2013/059343 A1 및 PCT/US2012/060646 참조)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 것을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비 바이러스 방법은 트랜스포손 (또한 수송 가능 요소로 지칭됨)의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스포손은 게놈의 위치에 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어, 자가 복제하여 게놈에 그의 카피를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터 스플라이싱되어 게놈의 다른 부분에 삽입될 수 있는 DNA 조각이다. 예를 들어, 트랜스포손은 전위를 위한 역위 반복 측접 유전자로 이루어진 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포손을 사용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템 (SBTS) 및 피기백 (PB) 트랜스포손 시스템을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008): 1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; and Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하며, 상기 문헌 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다.
SBTS는 2개의 성분 1) 전이유전자를 포함하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사제 (transposase) 효소의 공급원을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포손을 담체 플라스미드 (또는 다른 공여체 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 수송할 수 있다. 예를 들어, 트랜스포사제는 담체 플라스미드/공여체 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손 (전이유전자 (들) 포함)을 절단하여 숙주 세포의 게놈에 삽입한다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al. supra]을 참조한다.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013): 1829-47; and Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하며, 상기 문헌 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다. 예시적인 트랜스포사제는 Tc 1/마리너 (mariner)-유형 트랜스포사제, 예를 들어 SB 10 트랜스포사제 또는 SB 11 트랜스포사제 (예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과활성 트랜스포사제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al.; Kebriaei et al.; and Grabundzija et al]을 참조하며, 상기 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
SBTS의 사용은 전이유전자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR 및/또는 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 핵산의 효율적인 혼입 및 발현을 가능하게 한다. 예를 들어 SBTS와 같은 트랜스포손 시스템을 사용하여 본 명세서에 기재된 CAR 및/또는 NF-κB 활성화제를 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NKT 세포 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포를 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 기재된 방법에 따르면, 일부 실시형태에서, SBTS 성분을 포함하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 플라스미드는 세포 (예를 들어, T 또는 NKT 세포 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포)로 전달된다. 예를 들어, 핵산 (들)은 핵산 (예를 들어, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 전이유전자, 예를 들어 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 CAR 및/또는 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 전이유전자 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 핵산)뿐만 아니라, 트랜스포사제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포손을 포함한다. 다른 실시형태에서, 2개의 핵산에 의한 시스템, 예를 들어 이중-플라스미드 시스템, 예를 들어, 제1 플라스미드는 전이유전자를 포함하는 트랜스포손을 포함하고, 제2 플라스미드는 트랜스포사제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 시스템이 제공된다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포로 공동 전달된다.
본 명세서의상기 및 다른 부분에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 본 개시내용의 면역 수용체 (예를 들어, CAR, 내인성 TCR 또는 재조합 TCR)와 NF-κB 자극 분자 (예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제, 예를 들어, 비천연 발생 NF-κB 활성화제제, 예를 들어, hNEMO-K277A)의 공동 발현이 면역 세포의 기능, 예를 들어 생존, 확장, 증식, 활성화, 지속성, 사이토카인 생성 및 생체내 활성을 개선시킴을 입증한다. 일부 실시형태에서, 면역 수용체는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR)이다. 일부 실시형태에서, 면역 수용체는 천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, 천연 TCR)이다. 일 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 1세대, 2세대, 3세대 CAR, TFP, AbTCR, 또는 SIR과 공동 발현된다. 위에서 언급한 바와 같이, NF-κB 자극 분자는 CAR, TCR 또는 SIR 백본에 연결될 수 있지만, 바람직하게는 연결되지 않을 수 있다. 또한, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR은 CD28 또는 41BB 도메인을 포함하지 않으며, 선택적으로 CD3 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 면역 세포 (예를 들어, T 세포, 수지상 세포, CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포 등)의 기능, 예를 들어 생존, 확장, 증식, 활성화, 지속성, 사이토카인 생성 및 생체내 활성을 개선시킴을 입증한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 선택적 NF-κB 활성화제는 다른 신호전달 경로의 활성화의 부재 하 또는 최소의 활성화의 존재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시키는 제제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 AKT, PI3K, JNK, p38 키나제, ERK, JAK/STAT 및 인터페론 신호전달 경로의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 경로의 최소 활성화 또는 활성화의 부재 하에 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시킨다. NF-κB, AKT, PI3K, JNK, p38 키나제, ERK, JAK/STAT 및 인터페론 신호전달 경로의 활성화를 측정하기 위한 다수의 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이들 분석은 NF-κB 경로의 선택적 활성화제를 확인하기 위해 본 발명의 방법에서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Akt (Ser473) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하는 측정되는 바와 같이, AKT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) 항체 (예를 들어, clone G9; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정하는 바와 같이, JNK 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 항체 (예를 들어, clone D3F9; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, p38 키나제 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat1 (Tyr701) 항체 (예를 들어, Clone D4A7; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정하는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat2 (Tyr690) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정하는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat3 (Tyr705) 항체 (예를 들어, Clone D3A7, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat5 (Tyr694) 항체 (예를 들어, Clone D47E7, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정하는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (예를 들어, Clone D13.14.4E, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정하는 바와 같이, ERK 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다.
일 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA) 하위단위에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Akt (Ser473) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, AKT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) 항체 (예를 들어, clone G9; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, JNK 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 항체 (예를 들어, clone D3F9; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, p38 키나제의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat1 (Tyr701) 항체 (예를 들어, Clone D4A7; Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat2 (Tyr690) 항체 (Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat3 (Tyr705) 항체 (예를 들어, Clone D3A7, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-Stat5 (Tyr694) 항체 (예를 들어, Clone D47E7, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, STAT 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 대조군 인간 T 세포와 비교하여, 시험 인간 T 세포에 노출되거나 발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 Phospho-IκBα (Ser32) 항체 (예를 들어, 14D4, Clone Cell Signaling Technology; Danvers, MA)에 의해 측정되는 바와 같이, NF-κB 활성의 20% 초과 (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 초과)의 증가를 유도하지만, Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (예를 들어, Clone D13.14.4E, Cell Signaling Technology; Danvers, MA)를 사용하여 측정되는 바와 같이, ERK 경로의 활성의 20% 미만의 증가를 유도한다.
NF-κB, AKT, JNK, p38, ERK, JAK/STAT 및 인터페론 신호전달 경로의 활성화를 측정하는 대안적 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, NF-κB 신호전달 경로의 선택적 활성화제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 c-Jun, c-Fos, JunD, ATF2, STAT3, NFAT1c, ELK-1, CREB, IRF3 또는 IRF7 DNA 결합 활성의 증가와 비교하여, 표적 세포 (예를 들어, T 세포 또는 293FT 세포)에 노출되거나 발현되는 경우, NF-κB DNA 결합 활성의 더 큰 증가를 유도한다. 상이한 신호전달 경로에 속하는 상이한 전사 인자의 DNA 결합 활성을 측정하기 위한 키트는 시판되는 것을 이용할 수 있으며 (예를 들어, TransAM® Transcription Factor Assays; Active Motif), NF-κB 신호전달 경로의 선택적 활성화제를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 CD28과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 둘 모두를 통한 신호전달이 유사한 조건 하에 인간 T 세포에서 활성화되는 경우, IκBα 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB와 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 둘 모두를 통한 신호전달이 유사한 조건 하에 인간 T 세포에서 활성화되는 경우, IκBα 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR과 공동-발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 CD28 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 표적 항원 포함 세포에 노출되는 경우, IκBα 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1016에 표시된 CAR)과 공동-발현된 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1318에 의해 표시되는 CAR)과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 표적 항원 포함 세포 (예를 들어, RAJI)에 노출되는 경우, IκBα 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 예를 들어, K13 (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1016)을 공동 발현하는 CD19-유도 1세대 CAR을 발현하는 T 세포는 41BB 공자극 도메인 (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1318)을 갖는 CD19-유도 2세대 CAR을 발현하는 T 세포와 비교하여, CAR-T 세포 둘 모두가 1 내지 24시간 (예를 들어, 1시간, 2시간, 4시간, 12시간 또는 24시간) 동안 1:5의 E:T 비율로 RAJI 세포에 노출되는 경우, IκBα 인산화 대 AKT 인산화의 비율의 더 큰 증가를 나타낸다. IκBα 및 AKT의 인산화는 인산화된 형태에 특이적인 항체를 사용하여 당 업계에 공지된 방법 (예를 들어, 면역 블롯팅 또는 유세포분석)을 사용하여 계산된다. IκBα 인산화의 증가는 RAJI 세포에 노출된 후 CAR-T 세포에서 IκBα 인산화로부터 CAR의 발현이 부재하는 대조군 T 세포에서 IκBα 인산화를 빼서 계산된다. AKT 인산화의 증가는 RAJI 세포에 노출된 후 CAR-T 세포에서 AKT 인산화로부터 CAR의 발현이 부재하는 대조군 T 세포에서 AKT 인산화를 빼서 계산된다. IκBα 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율은 AKT 인산화의 증가로부터 IκBα 인산화의 증가를 나누어 계산된다.
실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 CD28과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 둘 모두를 통한 신호전달이 유사한 조건 하에 인간 T 세포에서 활성화되는 경우, p65/RelA 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB와 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 유사한 조건 하에 발현되거나, 둘 모두를 통한 신호전달이 유사한 조건 하에 인간 T 세포에서 활성화되는 경우, p65/RelA 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR과 공동-발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 CD28 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 표적 항원 포함 세포에 노출되는 경우, p65/RelA 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1016에 의해 표시되는 CAR)과 공동-발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1318에 의해 표시되는 CAR)과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 표적 항원 포함 세포 (예를 들어, RAJI)에 노출되는 경우, p65/RelA 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 예를 들어, K13 (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-K13-Flag-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1016)을 공동 발현하는 CD19-유도 1세대 CAR을 발현하는 T 세포는 41BB 공자극 도메인 (CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC; SEQ ID NO: 1318)을 갖는 CD19-유도 2세대 CAR을 발현하는 T 세포와 비교하여, CAR-T 세포 둘 모두가 1 내지 24시간 동안 1:5의 효과기:표적 (E:T) 비율로 RAJI 세포에 노출되는 경우, p65/RelA 인산화 대 AKT 인산화의 비율의 더 큰 증가를 나타낸다. p65/RelA 및 AKT의 인산화는 인산화된 형태에 특이적인 항체를 사용하여 당 업계에 공지된 방법 (예를 들어, 면역 블롯팅 또는 유세포분석)을 사용하여 계산된다. p65/RelA 인산화의 증가는 둘 모두가 RAJI 세포에 노출된 후 CAR-T 세포에서 p65/RelA 인산화로부터 CAR의 발현이 부재하는 대조군 T 세포에서 p65/RelA 인산화를 빼서 계산된다. AKT 인산화의 증가는 둘 모두가 RAJI 세포에 노출된 후 CAR-T 세포에서 AKT 인산화로부터 CAR의 발현이 부재하는 대조군 T 세포에서 AKT 인산화를 빼서 계산된다. p65/RelA 인산화의 증가 대 AKT 인산화의 증가의 비율은 AKT 인산화의 증가로부터 p65/RelA 인산화의 증가를 나누어 계산된다.
일 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1016에 의해 표시되는 CAR)과 공동-발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1318에 의해 표시되는 CAR)과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 적절한 시간 간격 (예를 들어, 1 내지 24시간) 동안 표적 항원 포함 세포 (예를 들어, RAJI)에 노출되는 경우, IκBα 인산화의 증가 대 JNK, ERK, 또는 p38 키나제 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인이 부재하는 1세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1016에 의해 표시되는 CAR)과 공동-발현되는 경우, 선택적 NF-κB 활성화제는 41BB 공자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR (예를 들어, SEQ ID NO: 1318에 의해 표시되는 CAR)과 비교하여, 이들 둘 모두 인간 T 세포에서 발현되거나, 유사한 조건 하에 적절한 시간 간격 (예를 들어, 1 내지 24시간) 동안 표적 항원 포함 세포 (예를 들어, RAJI)에 노출되는 경우, p65/RelA 인산화의 증가 대 JNK, ERK, 또는 p38 키나제 인산화의 증가의 비율의 더 큰 증가를 유도한다.
일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여 NF-κB 활성화제는 비천연 발생 제제이고, 세포에서 외인적으로 발현된다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 바이러스 유래이며, 즉, 이는 바이러스에 의해 인코딩되거나, 바이러스 인코딩된 단백질로부터 유래하거나, 하나 이상의 바이러스 단백질에 80% 초과의 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의) 동일성을 갖는 10개 초과의 아미노산 잔기 (예를 들어 15개 아미노산 잔기, 20개 아미노산 잔기, 30개 아미노산 잔기 또는 50개 초과의 아미노산 잔기)의 도메인을 갖는다. 바이러스 유래의 예시적 선택적 NF-κB 활성화제는 카포시 육종 관련 포진바이러스로부터 유래된 vFLIP K13 (SEQ ID NO:)이다. 또 다른 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 포유류 또는 세포 유래이다. 포유류 유래의 예시적 선택적 NF-κB 활성화제는 인간 NEMO-K277A 돌연변이체, 인간 NEMO-K277-델타V249-K255 돌연변이체, 마우스 NEMO-K270A 돌연변이체, IKK2-S177E-S181E 및 IKK1-S176E-S180E이다. 또 다른 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 인간 유래이며; 즉, 이는 하나 이상의 인간 단백질에 80% 초과의 (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의) 동일성을 갖는 10개 초과의 아미노산 잔기 (예를 들어 15개 아미노산 잔기, 20개 아미노산 잔기, 30개 아미노산 잔기 또는 50개 초과의 아미노산 잔기)의 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 2개 이상의 융합 단백질 (예를 들어, FKBPx2-NEMO)로 구성된다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제의 2개 이상의 융합 대상은 각각 인간 단백질로부터 유래되거나, 인간 단백질에 대해 80% 초과동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 야생형 핵산 서열에 의해 인코딩되고, 다른 실시형태에서 선택적 NF-κB 활성화제는 코돈-최적화된 핵산 서열 또는 돌연변이체 서열에 의해 인코딩된다. 예시적인 실시형태에서, vFLIP K13은 인간 코돈 최적화된 핵산 서열, 예를 들어 K13-opt (SEQ ID NO: 7768)에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 단일 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하고, 다른 실시형태에서 면역 세포는 하나 초과의 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, NEMO-K277A 플러스 K13-opt 또는 IKK2-S177E-S181E 플러스 IKK1-S176E-S180E)를 발현한다.
일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 항시적 방식으로 면역 세포에서 발현된다. 다른 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 면역 세포에서 유도성 방식으로 발현된다. 예시적인 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제의 유도성 발현은 유도성 프로모터의 사용을 통해 달성될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 메탈로티오닌 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터, 프로게스테론 유도성 프로모터 및 테트라사이클린 유도성 프로모터를 포함한다. RheoSwitch® 시스템은 단백질의 발현을 제어하기 위한 또 다른 전사 조절기 플랫폼을 나타낸다.
단백질의 활성을 제어하는 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하여 NF-κB 활성화제의 활성을 제어하는데 사용될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 이는 표적 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포에서 이량체화 도메인 또는 스위치 도메인에 융합된 NEMO 또는 NEMO 돌연변이체의 발현을 포함한다. 예시적인 실시예에서, 스위치 도메인은 FKBP12 도메인 또는 FKBP12v36 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스위치 도메인은 NF-κB 활성화제 (예를 들어, NEMO)의 카복시 말단에 부착되고, 다른 실시형태에서 스위치 도메인은 NF-κB 활성화제 (예를 들어, NEMO)의 아미노 말단에 부착된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 표적 세포를 적합한 이량체 (예를 들어, 리미두시드)에 노출시키면, NEMO의 올리고머화가 유발되고, 이는 결과적으로 NF-κB 활성화로 이어진다. 대안적인 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제의 활성은 또한 기재된 바와 같이 돌연변이된 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인에 이들을 융합시킴으로써 제어될 수 있다 (문헌[Matta H et al., Journal of Biological Chemistry, 282, 34, 2007]). 돌연변이된 에스트로겐 수용체는 생리적 리간드 에스트로겐에 결합하지 않지만, 합성 리간드 4-OHT (4-하이드록시타목시펜)에 매우 높은 친화도로 결합하고, 융합 대상 (예를 들어, NF-κB 활성화제, 예를 들어, vFLIP K13 또는 NEMO)의 활성 4-OHT-의존적 방식으로 조절한다.
일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 당 업계에 공지된 유전자 편집 기술을 사용하여 게놈 카피의 변이에 의해 면역 세포에서 발현된다. 예시적 실시형태에서, 유전자 편집 시스템 (예를 들어, TALON, Zn 핑거 뉴클레아제 또는 CRISP/Cas9)은 인간 NEMO의 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두를 인간 NEMO-K277A 돌연변이체 형태로 전환시키는데 사용된다. 다른 예시적인 실시형태에서, 유전자 편집 시스템은 인간 NEMO의 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두를 인간 NEMO-K277A-델타-V249-K255 돌연변이체 형태로 전환시키는데 사용된다. K277A 및 K277A-델타-V249-K255 돌연변이를 유도하는데 사용될 수 있는 인간 NEMO 유전자 표적화 작제물의 서열은 각각 SEQ ID NO: 7171 및 7772에 제공되어 있다. 이들 서열은 적합한 벡터 (예를 들어, 혼입 결함 렌티바이러스 벡터, AAV 벡터 또는 아데노바이러스 벡터)에서 클로닝될 수 있다. 상보적 표적화 서열을 포함하는 CRISP/Cas9 gRNA가 생성될 수 있는 인간 NEMO에 대한 게놈 표적 서열의 예는 SEQ ID NO: 7759 내지 7762에 제공된다. gRNA 서열을 pX330-U6-키메라_BB-CBh-hSpCas9 벡터 (Addgene)에 클로닝한다. 대안적으로, gRNA 서열은 Addgene (플라스미드 #52961)으로부터 구입할 수 있는 pLENTI-CRISPR-v2 벡터에서 및 유통업자가 제공한 지침에 따라 클로닝될 수 있다. NEMO 표적화 작제물 및 gRNA 인코딩 작제물의 T 세포 내로의 도입은 필수적으로 전술한 바와 같이 수행된다 (문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods&Clinical Development, Vol 4, 2017]).
본 명세서에 기재된 임의의 상기 실시형태의 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 유사한 조건 하에서 비교하는 경우, 보조 모듈이 부재하는 해당 면역 효과기 세포와 비교하여 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, 또는 IKK1-S176E-S180E)를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포는 표적 항원 발현 세포에 대해 개선된 시험관내 활성 (예를 들어, 표적 항원 유도 IL2 생성, 증식, 확장 및 최종 분화 지연, 노화 지연 등)을 나타낸다. 면역 효과기 세포에서 NF-κB 활성화는 다음에 제한되는 것은 아니나, 인산화된 IκBα, 인산화된 p65, 총 IκBα, p65 핵 전좌, NF-κB 반응 유전자의 상향 조절, 전기영동 이동성 변화 분석 (EMSA) 및 NF-κB-기반 리포터 분석 등의 측정을 포함하여 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화는 면역 효과기 세포에서 AKT 경로의 활성화의 증가 배수에 대비하여, NF-κB의 활성화의 증가 배수를 측정함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt (인간 코돈 최적화된 K13) 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포는 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈의 발현이 부재하는 해당 면역 효과기 세포와 비교하여, 둘 모두 유사한 실험 조건 하에서 시험되는 경우, 표적 항원 발현 세포에 대한 더 높은 시험관내 활성 (예를 들어, 표적 항원 유도 IL2 생성, 증식, 확장 및 최종 분화 지연, 노화 지연)을 나타낸다. 예시적 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt (인간 코돈 최적화된 K13) 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 CD19-CAR-발현 면역 효과기 세포는 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈의 발현이 부재하는 해당 CD19-CAR-발현 효과기 세포와 비교하여, 둘 모두 유사한 실험 조건 하에서 시험되는 경우, Nalm6 세포에 대한 더 높은 시험관내 활성 (예를 들어, 표적 항원 유도 IL2 생성, 증식, 확장 및 최종 분화 지연, 노화 지연)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 표적 항원 발현 세포 (즉, 표적 세포)에 대해 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포의 시험관내 활성 (예를 들어 표적 항원 유도 IL2 생성, 증식, 확장 및 최종 분화 지연, 노화 지연)은 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하지 않는 해당 면역 효과기 세포의 시험관내 활성보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 더 크다. 일부 실시형태에서, 표적 항원 발현 세포 (즉, 표적 세포)에 대해 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, hNEMO-K277A)를 발현하는 면역 효과기 세포의 시험관내 활성 (예를 들어 표적 항원 유도 IL2 생성, 증식, 확장 및 최종 분화 지연, 노화 지연)은 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 해당 면역 효과기 세포의 시험관내 활성보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 크다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)는 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 대조군 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)와 비교하여, 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6 세포)에 노출되는 경우, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 초과의 IL2를 생성한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)는 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 대조군 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 비교하여, 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6 세포)에 노출되는 경우, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 초과의 증식을 나타낸다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)는 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 대조군 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 비교하여, 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6 세포)에 노출되는 경우, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 미만의 고갈 마커를 나타낸다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)는 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 대조군 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 비교하여, 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6 세포)에 노출되는 경우, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 미만의 최종 분화 마커를 나타낸다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 발현하는 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)는 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 부재하는 대조군 면역 효과기 T 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)와 비교하여, 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6 세포)에 3 내지 4주의 기간 동안 연속적으로 노출되는 경우, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 100% 초과의 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포는 T 세포 (예를 들어, CD8 T 세포, CD4 T 세포, CAR-T 세포, TIL, TREG 세포, NKT 세포), NK 세포 (예를 들어, CAR-NK 세포), 대식세포 (예를 들어, CAR-발현 대식세포), 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포), 줄기세포, 유도된 전능성 줄기세포 (iPSC) 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포이다.
본 명세서에 기재된 전술한 실시형태 중 임의의 것의 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포는 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하지 않는 대조군 면역 효과기 세포와 비교하여, 둘 모두 유사한 조건 하에서 시험되는 경우, 표적 항원 발현 세포에 대해 더 높은 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, 루시퍼라제 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)을 나타낸다. 면역 효과기 세포에서 NF-κB 활성화는 다음에 제한되는 것은 아니나, 인산화된 IκBα, 총 IκBα, p65 핵 전좌, NF-κB 반응성 유전자의 상향조절의 측정, 전기영동 이동성-변화 분석 (EMSA) 및 NF-κB-기반 리포터 분석 등을 포함하여 당 업계에 공지된 기법을 사용하여, 측정된다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화는 AKT 경로의 활성화의 증가 배수에 대비하여 면역 효과기 세포에서 NF-κB의 활성화의 증가 배수를 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt (인간 코돈 최적화된 K13) 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 CD19-CAR-발현 면역 효과기 세포는 선택적 NF-κB 활성화제 (예를 들어, K13-opt (인간 코돈 최적화된 K13) 또는 hNEMO-K277A)를 인코딩하는 보조 모듈이 부재하는 해당 CD19-CAR-발현 효과기 세포와 비교하여, 둘 모두 유사한 조건 하에서 시험되는 경우, NSG 마우스 이종이식 모델에서 Nalm6-FLuc 세포에 대해 더 높은 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, NSG 마우스 이종이식 모델에서 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6)에 대비하여 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)의 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)은 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈이 부재하는 해당 면역 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 크다. 일부 실시형태에서, NSG 마우스 이종이식 모델에서 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, Nalm-6)에 대비하여 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포 (예를 들어, CD19-CAR-T 세포)의 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)은 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈이 부재하는 해당 면역 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 크다. 일부 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 발현하는 면역 효과기 세포는 T 세포 (예를 들어, CD8 T 세포, CD4 T 세포, CAR-T 세포, TIL, TREG 세포, NKT 세포), NK 세포 (예를 들어, CAR-NK 세포), 대식세포 (예를 들어, CAR-발현 대식세포), 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포), 줄기세포, 유도된 전능성 줄기세포 (iPSC) 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포이다.
본 명세서에 기재된 전술한 실시형태 중 임의의 것의 또 다른 또는 추가의 실시형태에서, 보조 모듈, 예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, 또는 MYD88-L265P를 발현하는 면역 효과기 세포는 보조 모듈이 부재하는 해당 면역 효과기 세포와 비교하여, 둘 모두 유사한 조건 하에서 시험되는 경우, 표적 항원 발현 세포에 대해 더 높은 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 또한 hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, 또는 MYD88-L265P를 공동 발현하는 CD19-CAR-발현 면역 효과기 세포는 hNEMO-K277A 발현이 부재하는 해당 CD19-CAR-발현 효과기 세포와 비교하여, 유사한 조건 하에서 시험되는 경우, NSG 마우스 이종이식 모델에서 Nalm6-FLuc 세포에 대해 더 높은 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, NSG 마우스 이종이식 모델에서 표적 항원 발현 세포 (즉, 표적 세포)에 대비하여 본 명세서에 기재된 보조 모듈 (예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, 또는 MYD88-L265P)을 발현하는 면역 효과기 세포의 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)은 보조 모듈의 발현이 부재하는 해당 면역 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 크다. 일부 실시형태에서, NSG 마우스 이종이식 모델에서 표적 항원 발현 세포 (즉, 표적 세포)에 대비하여 본 명세서에 기재된 보조 모듈 (예를 들어, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, 또는 MYD88-L265P)을 발현하는 면역 효과기 세포의 생체내 활성 (예를 들어, 생체내 확장, 생체내 지속성, 종양 감소, FLuc 발현 종양으로부터 획득된 생물발광 값의 감소 또는 동물 생존)은 보조 모듈의 발현이 부재하는 해당 면역 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 크다. 일부 실시형태에서, 보조 모듈-발현 효과기 세포는 T 세포 (예를 들어, CD8 T 세포, CD4 T 세포, CAR-T 세포, TIL, TREG 세포, NKT 세포), NK 세포 (예를 들어, CAR-NK 세포), 대식세포 (예를 들어, CAR-발현 대식세포), 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포), 유도된 전능성 줄기세포 (iPSC) 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포이다.
본 개시내용은 선택적 NF-κB 활성화제의 발현이 수지상 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 생성된 사이토카인 분비, 항원 제시 및 면역 반응을 개선하는데 사용될 수 있음을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 생체외 또는 생체내에서 항원 제시 세포에서 선택적 NF-κB 활성화제의 발현에 의해 암 백신을 포함한 백신의 효능을 개선시키는 방법을 추가로 제공한다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제의 사용은 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)에 의한 사이토카인 생성 (예를 들어, TNFα)을 적어도 15% 증가시킨다.
본 개시내용은 CMV-141 (SEQ ID NO: 7770)을 인코딩하는 보조 모듈이 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포에서 발현되어, 그 고갈을 지연시키고, 그의 장기간 지속성을 개선할 수 있음을 추가로 제공한다. CMV-141은 면역 효과기 세포에서 유도성 또는 항시적 방식으로 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALENs), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제, 재조작된 귀속 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집 및 SBTS를 사용한 유전자 삽입의 조합을 사용하여, 본 명세서에 기재된 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포, 예를 들어, T 또는 NKT 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포가 생성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 세포 (예를 들어, 면역 효과기 세포 또는 그의 집합)를 제조하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 세포, 예를 들어, T 세포, NKT 세포 또는 줄기세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포 내에 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 도입 (예를 들어, 형질도입)시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, T 세포 또는 NK 세포를 포함하여 본 명세서에 기재된 비천연 면역 수용체 및/또는 NF-κB 자극 분자에 의한 변형을 위한 세포는 요법을 요하는 대상체로부터 획득될 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. T 세포는 조직 상재 감마-델타 T 세포일 수 있으며, 이는 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어, CAR, 및/또는 NF-κB 자극 분자의 발현 전에 시험관내에서 배양 및 확장될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 질병-관련 항원, 예를 들어, 종양 항원에 특이적으로 결합하도록 조작된 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함하는 다수의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 조작된 면역 효과기 세포는 치료 특성을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 조작된 면역 효과기 세포는 항암 또는 항-감염 (예를 들어, 항-HIV-1) 특성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 그의 내인성 TCR을 갖는 T 세포 (예를 들어 종양 침윤 림프구 또는 TIL)에서 발현될 수 있으며, 조작된 면역 효과기 세포는 항암 또는 항-감염 (예를 들어, 항-HIV-1) 특성을 나타낸다. 일 실시형태에서, 세포는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및 NF-κB 자극 분자로 형질전환되며, 비천연 발생 면역 수용체는 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시형태에서, 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 이러한 일부 실시형태에서, 세포는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 안정적으로 발현할 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 이러한 일부 실시형태에서, 세포는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 일시적으로 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 그의 내인성 TCR을 갖는 T 세포 (예를 들어 종양 침윤 림프구 또는 TIL)에서 발현될 수 있다.
본 개시내용은 면역 효과기 세포를 발병 세포 또는 질병-관련 세포, 예컨대 암 세포로 유도하는 하나 이상의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR/TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 포함하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 이는 암 관련 항원에 특이적인 면역 수용체 상의 항원 결합 도메인을 통해 달성된다. 본 개시내용의 CAR에 의해 표적화될 수 있는 2개의 클래스의 암 관련 항원 (종양 항원)이 있다: (1) 암 세포의 표면 상에 발현되는 암 관련 항원; 및 (2) 그 자체가 세포내에 존재하는 암 관련 항원이지만, 이러한 항원의 단편 (펩타이드)은 MHC (주요 조직적합성 복합체)에 의해 암 세포의 표면에 존재하는 항원. 본 개시내용은 또한 면역 효과기 세포를 발병 세포 또는 질병-관련 세포, 예컨대 암 세포로 유도하는 하나 이상의 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작되고/거나, 내인성 TCR을 포함하는 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공한다.
또한, 본 개시내용은 NF-κB 자극 분자를 발현하는 CAR, TCR 및 CAR/TCR-발현 세포 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원 또는 질병 관련 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 포함하는 것으로, 다른 질병 중에서도 암 또는 임의의 악성종양 또는 자가 면역 질병 또는 감염성 질병 또는 퇴행성 질병 또는 알레르기 질병을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 그의 용도를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR, 및 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하고, 조작된 면역 효과기 세포는 항 종양 특성과 같은 항-질병 특성을 나타낸다. 한 유형의 항원은 본 명세서에 기재된 암 관련 항원 (즉, 종양 항원)이다. 일 양상에서, 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 항체 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 비 천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인은 부분적으로 인간화된 scFv를 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 인간화된 항원 결합 도메인을 포함하고, 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포로 조작되며, 세포는 또한 NF-κB 자극 분자를 발현하는 비천연 발생 면역 수용체, 예를 들어 CAR 및 입양 요법에서의 그 용도를 위한 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 내인성 면역 수용체 (예를 들어, TCR)를 갖는 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 조작된 면역 효과기 세포는 항 종양 특성 또는 항-HIV-1 특성과 같은 항 질병 특성을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 비천연 발생 면역 수용체를 포함하는 유전자 조작된 세포가 본 명세서에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 T-림프구 (T 세포)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 조절 T 세포 (Treg) 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포, 조혈모세포 (HSC), 배아 줄기세포, 또는 전능성 줄기세포이다. NF-κB 자극 분자와 조합하여 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)를 포함하고 발현할 수 있는 유전자 조작된 세포는 다음에 제한되는 것은 아니나, T-림프구 (T 세포), 나이브 T 세포 (TN), 기억 T 세포 (예를 들어, 중앙 기억 T 세포 (TCM), 효과기 기억 세포 (TEM)), 자연 살해 세포, 조혈모세포 및/또는 치료에 적절한 자손을 생성할 수 있는 전능성 배아/유도된 줄기세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 세포는 자기유래 세포이다. 일 실시형태에서, 유전자 조작된 세포는 동종이계 세포이다. 예로서, 본 발명의 개별 T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- 또는 CD4+/CD8+일 수 있다. T 세포는 CD4+/CD8- 및 CD4-/CD8+ 세포의 혼합 집합 또는 단일클론의 집합일 수 있다. 본 발명의 CD4+ T 세포는 시험관내에서 표적 항원을 발현하는 세포 (예를 들어, CD20 + 및/또는 CD19+ 종양 세포)와 공동 배양되는 경우, IL-2, IFNη, TNFα 및 다른 T 세포 효과기 사이토카인을 생성할 수 있다. 본 발명의 CD8+ T 세포는 시험관내에서 표적 세포와 공동 배양되는 경우, 항원-특이적 표적 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 임의의 하나 이상의 CD45RA+ CD62L+ 나이브 세포, CD45RO+ CD62L+ 중앙 기억 세포, CD62L-효과기 기억 세포 또는 이들의 조합일 수 있다 (문헌[Berger et al., Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity. Curr Opin Immunol 2009 21(2)224-232]). 유전자 변형 세포는 본 발명의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 DNA로 세포를 안정적으로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 단일 혼입된 재 배열되지 않은 벡터의 존재 및 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자의 발현을 나타내는 형질감염된 세포는 생체외에서 확장될 수 있다. 일 실시형태에서, 생체외 확장을 위해 선택된 세포는 CD8+이고, 항원-특이적 표적 세포를 특이적으로 인식하고 용해시키는 능력을 나타낸다.
적절한 조건 하에서 항원에 의한 T 세포의 자극은 세포의 증식 (확장) 및/또는 IL-2의 생성을 초래한다. 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 포함하는 세포는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)의 항원-특이적 표적화 영역에 대한 하나 이상의 항원의 결합에 반응하여 수적으로 확장될 것이다. 본 개시내용은 또한 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)를 발현하는 세포를 제조하고 확장시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 T 세포를 제조 및 확장시키기 위해, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 벡터 (들)로 세포를 형질감염 또는 형질도입하고, 세포의 증식을 야기하기 위해 수용체에 대한 항체, 재조합 표적 항원 또는 표적 항원을 발현하는 세포로 세포를 자극하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 임의의 하나 이상의 T-림프구 (T 세포), 자연 살해 (NK) 세포, 조혈모세포 (HSC) 또는 치료에 적절한 자손을 생성할 수 있는 전능성 배아/유도된 줄기세포일 수 있다. 일 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)의 도입 없이 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 면역 세포를 생성시킬 수 있는 줄기세포))에서 발현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 포함하는 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 효과기 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제 6,352,694호; 제 6,534,055호; 제 6,905,680호; 제 6,692,964호; 제 5,858,358호; 제 6,887,466호; 제 6,905,681호; 제 7,144,575호; 제 7,067,318호; 제 7,172,869호; 제 7,232,566호; 제 7,175,843호; 제 5,883,223호; 제 6,905,874호; 제 6,797,514호; 제 6,867,041호; 및 미국 특허 출원 제 20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일 실시형태에서, 유전자 조작 세포는 백본-1, 백본-2, 백본-13, 백본-14, 백본-37, 백본-38, 백본-49, 백본-50, 백본-60 또는 백본-61, 및 NF-κB 자극 분자와 같이, 본 명세서에 기재된 백본의 일부인 통상의 CAR 1 내지 6 또는 통상의 CAR 1 내지 6을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, CAR의 항원 특이적 도메인은 MPL, CD19, CD20, BCMA, CD22, CD30, CD33, CD123, CD138, CLL1, TCR-베타 1 불변 사슬, TCR-베타2 불변 사슬, TCR감마/델타, 메소텔린, IL13Ra2, ALK, PTK7, DLL3, TROP2, Tim1, LAMP1, CS1, Lym1, Lym2, TSHR, NY-ESO-1/MHC 클래스 1 복합체, WT1/MHC 클래스 I 복합체, Ras/MHC 클래스 I 복합체, AFP/MHC 클래스 I 복합체, HPV-E6/MHC 클래스 I 복합체, HPV-E7/MHC 클래스 I 복합체, CD179a, CLD18A2, CD43 에피토프, 또는 HIV1 env 단백질 gp120에 특이적이다.
일 실시형태에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 in 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬이 부재한다. 본 개시내용에 따른 기능성 TCR의 발현이 안정적으로 부재하는 T 세포는 Zn 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISP/Cas9 및 내인성 T 세포 수용체 사슬을 표적화하는 shRNA의 사용과 같은 다양한 접근법을 사용하여, 생성될 수 있다. shRNA와 관련된 비 제한적인 예시적인 방법은 US 2012/0321667A1에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. TCR의 α 및 β 사슬의 불변 영역을 표적화하는 ZFN을 사용하여 내인성 TCR 발현을 제거하는 것과 관련된 또 다른 비 제한적 예시적인 방법은 문헌[Torikai H et al. (Blood, 119(24), June, 14 2012)]에 기재되어 있다.
기능성 내인성 TCR이 부재하는 T 세포는 그 표면에 임의의 기능성 내인성 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능성 내인성 TCR을 포함하는 하나 이상의 하위단위 (예를 들어 내인성 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬)를 발현하지 않도록 조작되거나, 그 표면에 기능성 내인성 TCR이 매우 극소수 생성되도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 하나 이상의 하위단위의 돌연변이 또는 절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 내인성 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"는 이 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 유발하지 않을 것을 의미한다. 또 다른 대안에서, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자는 T 세포 게놈에서 TCR 좌위로 클로닝될 수 있고, 따라서 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자는 내인성 T 세포 발현 시스템의 제어 하에 있을 것이다.
본 개시내용은 1세대 또는 2세대 CAR 작제물의 상황과 달리, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 사슬을 기반으로 하는 TFP (CD3ε/γ/δ TFP로 지정됨)는 그 표면에 기능성 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나, 손상된 αβ T 세포에서 발현되는 경우, 발현 및 활성이 저조한 것으로 나타난다. 예를 들어, CD3ε/γ/δ TFP는 내인성 TRAC 게놈 좌위가 TFP 발현 카세트에 의해 파괴된 αβ T 세포에서 발현 및 활성 (예를 들어, T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성 등)이 손상된 것으로 관찰되었다. 본 개시내용은 천연 전장 TCRα 사슬 폴리펩타이드의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 TCRα 불변 사슬 (TRAC 사슬) 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 재 발현함으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드 또는 TCRα 불변 사슬 단편은 천연 TCRα 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 αβ T 세포에서 기능성 CD3ε/γ/δ TFP-TCR-CD3 신호전달 복합체의 재작제를 가능하게 한다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRα 불변 사슬 또는 TCRα 불변 사슬 단편은 천연 TCRα 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 CD3ε/γ/δ TFP-발현 αβ T 세포의 표적 항원-유도된 사이토카인 (예를 들어, IL2, TNFα, IFNγ) 생성, 증식 및/또는 세포독성 활성을 15% 초과 (예를 들어, 20%, 50%, 75%, 또는 100% 초과 등) 향상시킨다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRα 불변 사슬 또는 TCRα 불변 사슬 단편은 천연 TCRα 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 αβ T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현을 증대시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRα 불변 사슬 또는 TCRα 불변 사슬 단편은 천연 TCRα 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 αβ T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현의 15% 초과 (예를 들어, 20%, 50%, 75%, 또는 100% 초과 등) 증가를 가능하게 한다. 예시적 실시형태에서, CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 신호전달 활성은 외인성 TCRα 불변 사슬 (TRAC 사슬)을 인코딩하는 핵산 작제물 (예를 들어, SEQ ID NO: 1010)을 이러한 T 세포 내로 도입함으로써 천연 TCRα 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 αβ T 세포에서 회복될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 외인성 TRAC 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되고, 그의 뉴클레오타이드 서열에서 내인성 또는 천연 TCRα 불변 사슬과 상이하다. 대안적인 실시형태에서, 외인성 TRAC 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되고, 인간 TCRα 불변 사슬의 발현을 향상시키는 것으로 알려진 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한다 (표 3 참조). 예시적 실시형태에서, 내인성 TCRα 유전자의 발현이 하향조절되거나 제거된 αβ T 세포에서 TFP-TCR-CD3 복합체의 재 발현 및/또는 활성을 가능하게 하는데 사용될 수 있는 외인성 TRAC 사슬은 SEQ ID NO: 3886 내지 3894에 제시된 바와 같은 서열을 가지거나, SEQ ID NO: 3886 to 3894에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드에 80% 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 갖는다. 그의 세포 표면 발현을 가능하게 하기 위해, 외인성 TCRα 불변 사슬 (TRAC)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일 실시형태에서, TCR-CD3 신호전달 복합체 및/또는 CD3ε/γ/δ TFP의 다른 성분을 채용하는 능력을 방해하지 않는 한, TRAC 사슬을 인코딩하는 서열에 추가의 비천연 발생 서열 (예를 들어, 링커 또는 항원 결합 도메인)을 선택적으로 첨가할 수 있다. 일 실시형태에서, 외인성 TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드는 이것이 발현되는 T 세포에 존재하는 천연 Vα 서열 (즉, 항원 결합 도메인)에 작동 가능하게 연결되지 않는다. 일 실시형태에서, 외인성 TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현은 αβ T 세포가 그의 천연 항원 인식 특이성 및/또는 친화도를 재획득하여, 예를 들어 그의 내인성 TCRα 사슬을 갖는 T 세포에 의해 인식되는 MHC-펩타이드 항원 복합체를 인식하는 것을 불가능하게 한다. 예시적 실시형태에서, 외인성 TCRα 불변 사슬을 인코딩하는 보조 모듈은 적절한 방법 (예를 들어, 렌티바이러스 매개 유전자 전달)을 사용하여 그 자체 (SEQ ID NO: 1010)로 αβ T 세포에서 발현될 수 있거나, 이는 단일 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 TFP 발현 카세트와 공동 발현될 수 있다. 2개 이상의 유전자 또는 RNA의 대안적 전달 및 발현 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 본 개시내용에 기재되어 있으며, 본 발명의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다. MPL을 표적화하는 CD3ε/γ/δ TFP 작제물과 TCRα 불변 사슬을 공동 발현하는 예시적 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3538, 3540 및 3542에 제시되어 있다. 예시적 작제물 CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRAC-opt2] (SEQ ID NO: 3538)에서, 제1 카세트는 CD8 신호 펩타이드 후 인간 MPL 단백질 및 CD3ε의 세포외, 막관통 및 시토졸 도메인을 표적화하는 인간화된 scFV를 포함하는 CD3ε-TFP를 인코딩한다. 이 TFP 인코딩 카세트 다음에는 링커 인코딩 퓨린-SGSG-P2A 및 신호 펩타이드를 인코딩하는 카세트 (IgSP) 및 TRAC를 인코딩하는 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열이 후행한다. 예시적인 실시형태에서, 전체 카세트는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 내인성 TCRα 사슬이 부재하는 αβ T 세포에서 발현될 수 있다.
대안적 실시형태에서, TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현은 내인성 TCRα 불변 사슬 유전자를 사용함으로써 그 표면에 기능성 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나 손상된 αβ T 세포에서 회복될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현은 당 업계에 공지된 유전자 편집 기술을 사용하여, 내인성 TCRα 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 카피에 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 프레임 내에 기능적으로 연결됨으로써, 그 표면에 기능적 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나 손상된 αβ T 세포에서 회복될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 TCRα 불변 사슬 유전자 중 적어도 하나의 제1 엑손에 프레임 내에 작동 가능하게 연결되어, TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드가 T 세포의 표면 상에 발현될 수 있도록 한다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRα 불변 사슬 유전자를 인코딩하는 발현 카세트는 내인성 TCRα 프로모터의 전사 조절 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRα 불변 사슬 유전자를 인코딩하는 발현 카세트는 내인성 TCRα 유전자의 3' 비번역 서열 및 조절 제어를 공유한다. 대안적인 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRα 불변 사슬 유전자를 인코딩하는 발현 카세트는 외인성 프로모터 (예를 들어, EF1α 또는 CMV 프로모터) 하에 존재한다.
예시적인 실시형태에서, TFP 카세트 다음에는 2A 절단 가능한 링커, 신호 펩타이드 (예를 들어, CD8 신호 펩타이드 또는 IgH 신호 펩타이드) 및 TCRα 불변 사슬 (TRAC)의 제1 엑손이 프레임 내에 후행하도록 표적화된 카세트를 설계함으로써, TFP를 인코딩하는 카세트의 표적화된 혼입에 의해 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 유전자가 파괴된 αβ T 세포에서 TCRα 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현이 회복될 수 있다 (도 5c). 이러한 예시적 표적화 작제물은 SEQ ID NO: 3860으로 표시된다. 이 실시형태에서, TCRα 불변 사슬은 세포 표면 발현이 표적화 카세트에 존재하는 신호 펩타이드에 의해 촉진되는 내인성 TCRα 불변 사슬 (TRAC) 유전자로부터 발현된다. 이 실시형태에서, TCRα 불변 사슬은 TCRα 유전자 프로모터 및 TCRα 3' 비번역 영역의 조절 제어 하에 발현된다. 대안적인 예시적 표적화 작제물은 SEQ ID NO: 3859로 표시되고, TFP를 인코딩하는 카세트의 혼입을 표적화하면서, 동시에 코돈 최적화된 TCRα 불변 사슬 cDNA 및 폴리A 서열이 후행하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 발현 카세트로부터 TCRα 불변 사슬을 재발현시킴으로써, 내인성 TCRα 사슬을 파괴하기 위해 본 개시내용의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다 (도 5b).
본 개시내용은 또한 1세대 또는 2세대 CAR 작제물의 상황과 달리,그 표면에 기능성 내인성 또는 천연 TCRβ1 및 TCRβ2 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나 손상된 αβ T 세포 (즉, TCRα 및 TCRβ 사슬을 발현하는 T 세포)에서 CD3ε/γ/δ TFP가 발현되는 경우, 그의 활성을 상실한다는 것을 입증한다. 예를 들어, 본 개시내용은 내인성 TCRβ1 및 TCRβ2 게놈 좌위가 파괴된 αβ T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성 (예를 들어, T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성 등)이 손상된다는 것을 제공한다. 본 개시내용은 천연 전장 TCRβ1 및 TCRβ2 사슬 폴리펩타이드의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 TCRβ1 또는 TCRβ2 불변 사슬 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 재 발현시킴으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드 또는 TCRβ1/β2 불변 사슬 단편은 천연 TCRβ1 및/또는 β2 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 T 세포, 예를 들어 αβ T 세포에서 기능성 TFP-TCR-CD3 신호전달 복합체의 재작제를 가능하게 한다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRβ1/β2 불변 사슬 또는 TCRβ1/β2 불변 사슬 단편은 천연 TCRβ1 및/또는 β2 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 TFP-발현 αβ T 세포의 표적 항원 유도 사이토카인 (예를 들어, IL2, TNFα, IFNγ) 생성, 증식 및/또는 세포독성 활성을 15% 초과 (예를 들어, 20%, 50%, 75% 또는 100% 초과 등) 향상시킨다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRβ1/β2 불변 사슬 또는 TCRβ1/β2 불변 사슬 단편은 천연 TCRβ1 및/또는 TCRβ2 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 αβ T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현을 향상시킨다. 일 실시형태에서, 재 발현된 TCRβ1/β2 불변 사슬 또는 TCRβ1/β2 불변 사슬 단편은 천연 TCRβ1 및/또는 TCRβ2 불변 사슬의 발현이 손상, 감소 또는 제거된 αβ T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현의 15% 초과 (예를 들어, 20%, 50%, 75% 또는 100% 초과 등)의 증가를 가능하게 한다. 예시적 실시형태에서, T 세포에 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬 (TRBC 사슬)을 인코딩하는 핵산 작제물 (예를 들어, SEQ ID NO: 1011)을 도입시킴으로써, 천연 TCRβ1 및/또는 TCRβ2 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 신호전달 활성이 회복될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되고, 그 뉴클레오타이드 서열 내의 내인성 또는 천연 TCRβ1 및 TCRβ2 불변 사슬과 상이하다. 대안적인 실시형태에서, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되고, 인간 TCRβ1/β2 불변 사슬의 발현을 향상시키는 것으로 알려진 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한다 (표 4a, 표 4b 참조). 예시적 실시형태에서, 내인성 TCRα 유전자의 발현이 하향조절되거나 제거된 T 세포에서 TFP-TCR-CD3 복합체의 재 발현 및/또는 활성을 가능하게 하는데 사용될 수 있는 외인성 TCRβ1/β2 사슬은 SEQ ID NO: 3895 내지 3900에 제시된 바와 같은 서열을 가지거나, SEQ ID NO: 3895 내지 3900에 제시된 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드에 80% 초과의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 갖는다. 그의 세포 표면 발현을 가능하게 하기 위해, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬 (TRBC)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일 실시형태에서, TCR-CD3 신호전달 복합체 및/또는 TFP의 다른 성분을 채용하는 능력을 방해하지 않는 한, TCRβ1/β2 불변 사슬 (TRBC)을 인코딩하는 서열에 추가의 비천연 발생 서열 (예를 들어, 링커 또는 항원 결합 도메인)을 선택적으로 첨가할 수 있다. 일 실시형태에서, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드는 이것이 발현되는 T 세포에 존재하는 천연 Vβ 서열 (즉, 항원 결합 도메인)에 작동 가능하게 연결되지 않는다. 일 실시형태에서, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현은 T 세포가 그의 천연 항원 인식 특이성 및/또는 친화도를 재획득하여, 예를 들어 그의 내인성 TCRβ1/β2 사슬을 갖는 T 세포에 의해 인식되는 MHC-펩타이드 항원 복합체를 인식하는 것을 불가능하게 한다. 예시적 실시형태에서, 외인성 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 보조 모듈은 적절한 방법 (예를 들어, 렌티바이러스 매개 유전자 전달)을 사용하여 그 자체 (SEQ ID NO: 1011)로 T 세포에서 발현될 수 있거나, 이는 단일 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 CD3ε/γ/δ TFP 발현 카세트와 공동 발현될 수 있다. 2개 이상의 유전자 또는 RNA의 대안적 전달 및 발현 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 본 개시내용에 기재되어 있으며, 본 발명의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다. MPL을 표적화하는 TFP 작제물과 TCRβ 불변 사슬을 공동 발현하는 예시적 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3537, 3539, 및 3541에 제시되어 있다. 예시적 작제물 CD8SP-MPL-Hu-161-2-(vL-vH)-CD3e-ECDTMCP-opt2-F-P2A-IgSP-[TRBC-opt2] (SEQ ID NO: 3537)에서, 제1 카세트는 CD8 신호 펩타이드 후 인간 MPL 단백질 및 CD3ε의 세포외, 막관통 및 시토졸 도메인을 표적화하는 인간화된 scFV를 포함하는 TFP를 인코딩한다. 이 TFP 인코딩 카세트 다음에는 링커 인코딩 퓨린-SGSG-P2A 및 신호 펩타이드를 인코딩하는 카세트 (IgSP) 및 TCRβ 불변 사슬 (TRBC)을 인코딩하는 코돈 최적화 뉴클레오타이드 서열이 후행한다. 예시적인 실시형태에서, 전체 카세트는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 내인성 TCRα 사슬이 부재하는 T 세포에서 발현될 수 있다.
대안적 실시형태에서, TCRβ1 또는 β2 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현은 내인성 TCRβ1 또는 β2 불변 사슬 유전자를 사용함으로써 그 표면에 기능성 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나 손상된 αβ T 세포에서 회복될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드 및 공동 발현된 TFP의 발현은 당 업계에 공지된 유전자 편집 기술을 사용하여, 내인성 TCRβ1 또는 TCRβ2 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 카피에 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 프레임 내에 작동 가능하게 연결됨으로써, 그 표면에 기능적 내인성 또는 천연 TCRα 사슬 폴리펩타이드가 부재하거나 손상된 αβ T 세포에서 회복될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 TCRβ1 또는 TCRβ2 불변 사슬 유전자 중 적어도 하나의 제1 엑손에 프레임 내에 작동 가능하게 연결되어, TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드 및 공동 발현된 TFP가 T 세포의 표면 상에 발현될 수 있도록 한다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 발현 카세트는 내인성 TCRβ1/β2 프로모터의 전사 조절 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 발현 카세트는 내인성 TCRβ1/β2 유전자의 3' 비번역 서열 및 조절 제어 하에 있다. 대안적인 실시형태에서, 신호 펩타이드 및 TCRβ1/β2 불변 사슬을 인코딩하는 발현 카세트는 외인성 프로모터 (예를 들어, EF1α 또는 CMV 프로모터) 하에 존재한다.
예시적인 실시형태에서, TFP 카세트 다음에는 2A 절단 가능한 링커, 신호 펩타이드 (예를 들어, CD8 신호 펩타이드 또는 IgH 신호 펩타이드) 및 TCRβ1/β2 불변 사슬 (TRAC)의 제1 엑손이 프레임 내에 후행하도록 표적화된 카세트를 설계함으로써, TFP를 인코딩하는 카세트의 표적화된 혼입에 의해 내인성 또는 천연 TCRβ1 및 TCRβ2 사슬 유전자가 파괴된 αβ T 세포에서 TCRβ1/β2 불변 사슬 폴리펩타이드의 발현이 회복될 수 있다.
CAR 카세트를 TRAC 좌위로 유도함으로써, 대략 95% T 세포가 TCR 음성이 되는 것으로 관찰되었다. 이러한 TCR-음성 T 세포는 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유발할 가능성이 적으므로 동종이계 설정에서 사용될 수 있다. 그러나, TRAC 좌위가 TFP 카세트에 의해 표적화된 T 세포에서 TRAC 사슬의 재 발현은 잠재적으로 Vβ 영역을 포함하는 전장 TCRβ 사슬의 발현을 초래할 것이다. 이러한 T 세포는 Vα 영역에 의해 제공된 MHC 인식이 부재함에도 불구하고, 그의 TCRβ 사슬을 통해 MHC 복합체에 의해 제시된 동종-항원을 잠재적으로 인식할 수 있어서 잠재적으로 GVHD를 유발할 수 있다. 본 개시내용의 대안적인 실시형태에서, TCRα 및 TCRβ1 또는 β2 사슬 둘 모두는 내인성 TCRα 및 TCRβ1 및 TCRβ2 사슬의 발현이 하향 조절되거나 제거된 CD3ε/γ/δ TFP-발현 αβ T 세포에서 재 발현된다.
상기 예에서, 예를 들어 그의 게놈 좌위의 표적화에 의해 하향 조절되거나 제거된 α/β T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및/또는 활성을 회복시키기 위해 외인성 TRAC 또는 TRBC는 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬의 발현이 TFP-발현 작제와 공동 발현된다. 본 발명의 대안적인 실시형태에서, 외인성 TCRα 및/또는 TCRβ1/β2 불변 사슬의 발현은 야생형 α/β T 세포 또는 키메라 항원 수용체, 키메라 T 세포 수용체 (cTCR), AbTCR, 또는 합성 면역 수용체를 발현하는 α/β T 세포를 포함하는 임의의 α/β T 세포에서 TCR/CD3 복합체 발현을 회복시키는데 사용된다. 마지막으로, 유사한 접근법을 사용하여 내인성 TCRγ 및/또는 TCRδ 사슬의 발현이 하향 조절되거나 제거된 γ/δ T 세포에서 CAR/TFP 및/또는 TCR/CD3 발현을 회복시킬 수 있다. 내인성 TCRγ 및/또는 TCRδ 사슬의 발현이 하향 조절되거나 제거된 γ/δ T 세포에서 발현될 수 있는 TCRγ (TRGC) 및 TCRδ (TRDC)의 예시적인 불변 사슬은 SEQ ID NO: 3912 및 3913에 의해 표시된다.
본 개시내용은 또한 TCRα/β/γ 또는 δ의 불변 사슬의 단편 또는 변이체를 재 발현시킴으로써, 천연 TCRα/β/γ 또는 δ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성이 회복될 수 있음을 제공한다. 천연 TCRα/β/γ 또는 δ 사슬이 부재하는 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현을 회복시키는데 사용될 수 있는 TCRα/β/γ 및 δ의 불변 사슬의 단편/변이체는 SEQ ID NO: 15141 내지 15144 (표 6d)에 제공되어 있다. IgH 신호 펩타이드를 갖는 이들 사슬을 인코딩하는 발현 카세트는 SEQ ID NO: 15145 내지 15148 (표 7)에 열거되어 있다.
본 개시내용은 상실된 TCRα/β/γ 또는 δ 불변 사슬을 포함하는 SIR 또는 Ab-TCR의 공동 발현에 의해, 천연 TCRα/β/γ 또는 δ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 T 세포에서 CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성이 회복될 수 있음을 추가로 제공한다. 따라서, 천연 TCRα 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성은 TCRα 불변 사슬을 포함하는 SIR의 발현에 의해 복원될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 천연 TCRα 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRα 불변 사슬을 포함하는 SIR (예를 들어, 서열 9668, 9669 또는 9684 등으로 표시되는 SIR)의 발현에 의해 복원될 수 있다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 천연 TCRα 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708-8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRα 불변 사슬의 일부를 포함하는 Ab-TCR (예를 들어, 서열 9677 또는 9678 등으로 표시되는 Ab-TCR)의 발현에 의해 복원될 수 있다. 본 개시내용은 2개의 CAR을 포함하는 동종이계 T 세포와의 조합 요법의 경우, CD3α/γ/δ TFP는 바람직하게는 동종이계 T 세포에서 발현이 감소되거나 상실된 TCR 불변 사슬 또는 TCR 불변 사슬 단편을 포함하는 SIR 및/또는 Ab-TCR과 조합된다.
본 개시내용은 추가로 천연 TCRβ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성이 TCRβ 불변 사슬을 포함하는 SIR의 발현에 의해 복원될 수 있음을 제공한다. 예시적 실시형태에서, 천연 TCRβ1/β2 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성이 TCRβ 불변 사슬을 포함하는 SIR (예를 들어, 서열 9668, 9669 또는 9684 등으로 표시되는 SIR)의 발현에 의해 복원될 수 있다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 천연 TCRα 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 αβ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRβ 불변 사슬의 일부를 포함하는 Ab-TCR (예를 들어, 서열 9677 또는 9678 등으로 표시되는 Ab-TCR)의 발현에 의해 복원될 수 있다.
본 개시내용은 또한 천연 TCRγ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성이 TCRγ 불변 사슬을 포함하는 SIR의 발현에 의해 복원될 수 있음을 추가로 제공한다. 예시적 실시형태에서, 천연 TCRγ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRγ 불변 사슬을 포함하는 SIR (예를 들어, SEQ ID NO: 9689로 표시되는 SIR)의 발현에 의해 복원될 수 있다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 천연 TCRγ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRγ 불변 사슬의 일부를 포함하는 Ab-TCR (예를 들어, SEQ ID NO: 9676으로 표시되는 Ab-TCR)의 발현에 의해 복원될 수 있다.
본 개시내용은 천연 TCRδ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP의 발현 및 활성이 TCRδ 불변 사슬을 포함하는 SIR의 발현에 의해 복원될 수 있음을 추가로 제공한다. 예시적 실시형태에서, 천연 TCRδ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRδ 불변 사슬을 포함하는 SIR (예를 들어, SEQ ID NO: 9689로 표시되는 SIR)의 발현에 의해 복원될 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 천연 TCRδ 사슬의 발현이 손상되거나 부재하는 γδ T 세포에서, CD3ε/γ/δ TFP (예를 들어, SEQ ID NO: 8708 내지 8714에 의해 인코딩되는 TFP)의 발현 및 활성은 TCRδ 불변 사슬의 일부를 포함하는 Ab-TCR (예를 들어, 서열 9676으로 표시되는 Ab-TCR)의 발현에 의해 복원될 수 있다.
본 개시내용은 또한 차세대 CAR (예를 들어, SIR 및 AbTCR), cTCR 및 TCR이 내인성 TCR 유전자에 의해 제공되는 생리적 조절 메커니즘 하에서 발현될 수 있게 하는 방법 및 작제물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 차세대 CAR (예를 들어, SIR 및 AbTCR), cTCR 및 TCR이 내인성 TCR 유전자에 의해 제공되는 프로모터 및 3' 비 번역 조절 메커니즘 하에서 발현될 수 있게 하는 방법 및 작제물을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR을 인코딩하는 발현 카세트가 내인성 TCRα, TCRβ1/β2, TCRγ 또는 TCRδ 유전자 좌위를 표적화하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRα 유전자 좌위 (TRAC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRα 불변 사슬은 내인성 천연 TCRα 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRα 유전자 좌위 (TRAC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRα 불변 사슬은 내인성 TCRα 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 엑손에 의해 완전히 또는 부분적으로 인코딩된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRα 유전자 좌위 (TRAC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRα 불변 사슬은 천연/내인성 TCRα 불변 사슬 유전자의 3' 비번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 공유한다.
일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRβ 유전자 좌위 (TRBC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRβ 불변 사슬이 내인성 천연 TCRβ1 또는 TCRβ2 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRβ1/β2 유전자 좌위 (TRBC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRβ 불변 사슬은 내인성 TCRβ 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 엑손에 의해 완전히 또는 부분적으로 인코딩된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRβ1/β2 유전자 좌위 (TRBC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRβ 불변 사슬은 천연/내인성 TCRβ 불변 사슬 유전자의 3' 비 번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유한다.
일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRγ 유전자 좌위 (TRGC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRγ 불변 사슬은 내인성 천연 TCRγ 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRγ 유전자 좌위 (TRGC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRγ 불변 사슬이 내인성 TCRγ 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 엑손에 의해 완전히 또는 부분적으로 인코딩된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRγ 유전자 좌위 (TRGC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRγ 불변 사슬은 천연/내인성 TCRγ 불변 사슬 유전자의 3' 비 번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유한다.
일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRδ 유전자 좌위 (TRDC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRδ 불변 사슬은 내인성 천연 TCRδ 불변 사슬 유전자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 발현된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRδ 유전자 좌위 (TRGC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRδ 불변 사슬은 내인성 TCRδ 불변 사슬 유전자의 적어도 하나의 엑손에 의해 완전히 또는 부분적으로 인코딩된다. 일 실시형태에서, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR은 내인성 TCRδ 유전자 좌위 (TRDC)에 표적화되어, SIR/cTCR/Ab-TCR/TCR의 TCRδ 불변 사슬이 천연/내인성 TCRδ 불변 사슬 유전자의 3' 비 번역 영역 및 폴리아데닐화 서열을 완전히 또는 부분적으로 공유한다.
T 세포 또는 자연 살해 (NK) 또는 줄기세포는 대상체로부터 획득될 수 있다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유류)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. T 세포는 조직 상재 감마-델타 T 세포일 수 있으며, 이는 CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자의 발현 전에 시험관내에서 배양 및 확장될 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예를 들어 Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 획득될 수 있다. 하나의 바람직한 양상에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분 채집술에 의해 획득된다. 성분 채집 산물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 형성 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 포함한다. 일 양상에서, 성분 채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안적인 실시형태에서, 세척액은 칼슘이 부재하고, 마그네슘이 부재할 수 있거나, 모든 2가 양이온은 아니더라도 대부분이 부재할 수 있다.
칼슘의 부재 하의 초기 활성화 단계는 확대 활성화로 이어질 수 있다. 당업자는 당업자에 공지된 방법, 예컨대 제조업체의 지침에 따라 반자동 "유체 통과" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써, 세척 단계를 달성할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 무 Ca, 무 Mg PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액의 존재 또는 부재 하의 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분 채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거할 수 있고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 공지된 배양 배지 조건 및 조성물, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical&Translational Immunology (2015) 4, e31; doi: 10.1038/cti.2014.31]에 기재된 것을 사용할 수 있다.
일 양상에서, 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 반류 원심분리 용리 또는 원심분리에 의해 적혈구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 T 세포를 단리한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 X-CAR 또는 X-TCR 및 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성시킬 수 있는 줄기세포를 필요한 대상체에 제공함으로써, 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, X는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 관련 항원을 나타내고, 질병 유발 또는 질병 관련 세포는 상기 X 항원을 발현한다. 표 9는 상이한 항원 및 이들 항원을 표적화하는 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포를 사용하여 예방, 억제 또는 치료될 수 있는 예시적인 질병의 목록을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성시킬 수 있는 줄기세포를 필요한 대상체에 제공함으로써, 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 선택적 NF-κB 활성화제이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 비 바이러스 NF-κB 활성화제이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어 선택적 NF-κB 활성화제는 막관통 단백질이 아니며, 시토졸에서 발현되거나, 우선적으로 시토졸에 존재한다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어 선택적 NF-κB 활성화제는 항시적으로 활성이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어 선택적 NF-κB 활성화제는 항시적으로 활성이 아니다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 유도제 (예를 들어, 이량체화제)의 투여에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 vFLIP K13, NEMO-K277A 또는 그의 유도체이다. CAR/NF-κB 자극 분자-발현 면역 효과기 세포는 환자에게 투여된다. 일 양상에서, 질병 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포 (예를 들어, HIV-1 감염된 세포), 또는 혈장 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, 천연 TCR) 및 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 필요한 대상체에 제공함으로써, 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, NF-κB 자극 분자는 선택적 NF-κB 활성화제이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 비 바이러스 NF-κB 활성화제이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 막관통 단백질이 아니며, 시토졸에 발현되거나, 우선적으로 시토졸에 존재한다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 항시적으로 활성이다. 일 실시형태에서, NF-κB 활성화제, 예를 들어, 선택적 NF-κB 활성화제는 항시적으로 활성이 아니다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 유도제 (예를 들어, 이량체화제)의 투여에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 선택적 NF-κB 활성화제는 vFLIP K13, NEMO-K277A 또는 그의 유도체이다. 천연 TCR 및 NF-κB 자극 분자-발현 면역 효과기 세포는 환자에 투여된다. 일 양상에서 질병 관련 세포는 암 세포, 감염 세포 (예를 들어, HIV-1 감염 세포), 또는 혈장 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 본 개시내용의 천연 발생 (예를 들어, 천연 TCR) 또는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 재조합 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 필요한 대상체에 제공함으로써, 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR-T 또는 TCR-T 세포의 활성은 다사티닙 (Dasatinib)의 수용성 염을 사용하여 제어될 수 있다.
또 다른 양상에서, 대상체를 치료하는 방법, 예를 들어 대상체의 과증식성 장애 또는 병태 (예를 들어, 암), 예를 들어 고형 종양, 연조직 종양, 혈액암 또는 전이성 병변을 감소 또는 개선하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 개시내용의 천연 발생 및/또는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 재조합 TCR) 및/또는 본 개시내용의 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포를 대상체에 투여하여, 대상체에서 질병을 치료하는 단계를 포함한다. 일 양상에서 상기 방법은 본 개시내용의 그의 내인성 (또는 천연) TCR 및 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포를 대상체에 투여하여, 대상체에서 질병을 치료하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 질병 관련 항원의 발현과 관련된 질병은 감염성 질병이다. 일 양상에서 감염성 질병은 HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 포진바이러스 6, 인간 포진바이러스 8, A형 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, MERS 및 SARS 코로나바이러스, 크림 반도 콩고 유행성 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 랏사열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트밸리열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 결핵균, 비정형 마이코박테리아 종, 폐포자충, 톡소포자충증, 리케차, 노카르디아, 아스페르길루스, 무코르, 또는 칸디다에 의한 감염과 관련된 질병이다.
일부 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)는 HIV 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 HIV-1 항원이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 HIV 외피 단백질 또는 그의 일부분이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 gpl20 또는 그의 일부분이다. 일부 실시형태에서 HIV 항원은 gpl20 상의 CD4 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 gpl20 상의 CD4-유도 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 gpl20 상의 N-글리칸이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 gpl20의 V2이다. 일부 실시형태에서, HIV 항원은 gp41 상의 막 근접 영역이다.
본 개시내용은 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 T 세포를 생성시키는 줄기세포)가 본 개시내용의 CAR 또는 TCR 및/또는 NF-κB 자극제를 발현하도록 유전자 변형되고, CAR-발현 T 세포 또는 줄기세포가 필요한 수용체에 주입되는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 본 개시내용은 또한 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 T 세포를 생성시키는 줄기세포)가 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 유전자 변형되고, 이러한 세포를 필요한 수용체에 주입하는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용체에서 질병 관련 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포)를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, NF-κB 활성화제 변형 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, 줄기세포)는 생체내에서 복제되어, 장기간 지속성을 가짐으로써, 종양 제어를 지속시킬 수 있다. 다양한 양상에서, 환자에 투여된 NF-κB 활성화제 변형 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 T 세포를 생성시킬 수 있는 줄기세포) 또는 그 자손은 T 세포 또는 줄기세포를 환자에게 투여한 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.
본 개시내용은 또한 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)를 생성시킬 수 있는 줄기세포 (예를 들어, 조혈모세포 또는 림프성 줄기세포 또는 배아 줄기세포, 또는 유도된 전능성 줄기세포)가 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 변형되는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 투여된 줄기세포는 수용체에게 이식 후 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)를 생성시키며, 이 (즉, 면역 효과기 세포)는 수용체에서 질병 관련 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 양상에서, CAR/NFκB-활성화제-발현 줄기세포의 투여 후 환자에서 생성된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)는 환자에게 T 세포 또는 줄기세포의 투여 후, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 또는 20년 동안 환자에서 지속된다. 본 개시내용은 또한 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)를 생성시킬 수 있는 줄기세포가 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 변형되고, 시험관내에서 분화되어, 필요한 수용체에 주입되는 면역 효과기 세포를 생성시키는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 수용체에의 주입 후 주입된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)는 수용체에서 질병 관련 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 양상에서 환자에 투여된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 또는 20년 동안 환자에서 지속된다.
본 개시내용은 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 T 세포를 생성시키는 줄기세포)는 동일한 세포에서 2개 이상의 상이한 항원을 표적화하는 CAR을 발현하도록 유전자 변형되고, 이러한 T 세포 또는 줄기세포는 필요한 수용체에 주입되는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR이 조형 세포 상에 발현되는 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD138, Lym1, Lym2, CD33 및 CD123의 군으로부터 선택되는 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 조혈 세포 상에 발현되는 항원을 표적화하고, 적어도 하나의 다른 CAR은 고형 종양 상에 발현되는 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD138, Lym1, Lym2, CD33 또는 CD123의 군으로부터 선택되는 항원을 표적화하고, 적어도 하나의 다른 CAR은 메소텔린, Her2, 엽산 수용체 1, ROR1, IL13Ra2, AFP, WT1, Ras, NY-ESO-1, DLL3, CD70 및 PTK7의 군으로부터 선택되는 항원을 표적화한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 SIR이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 Ab-TCR이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 SIR이고, 다른 CAR은 CD3ε/γ/δ TFP이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 CAR은 Ab-TCR이고, 다른 CAR은 CD3ε/γ/δ TFP이다. 일 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 천연 TCR 사슬의 발현이 손상되어 있다. 본 개시내용은 또한 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 T 세포를 생성하는 줄기세포)는 2개의 상이한 항원을 표적화하는 CAR 및 NF-κB 자극 분자를 발현하도록 유전자 변형되고, 이러한 세포는 필요한 수용체에 주입되는 일 유형의 세포 요법을 포함한다. 실시형태에서, 세포는 자가유래이고, 다른 실시형태에서 세포는 동종이계이다. 주입된 세포는 수용체에서 질병 관련 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포)를 사멸시킬 수 있다.
생체외 면역과 관련하여, 포유류에 세포를 투여하기 전에 다음 중 적어도 하나가 시험관내에서 이루어진다: i) 세포의 확장, ii) 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 핵산의 세포로의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 당 업계에 널리 공지되어 있고, 하기에 보다 상세히 논의되어 있다. 간략하게, 세포는 포유류 (예를 들어, 인간)로부터 단리되고, 본 개시내용의 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 본 명세서에 개시된 NF-κB 자극 분자를 발현하는 하나 이상의 벡터로 유전자 변형된다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염됨). 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및 NF-κB 활성화제-변형 세포는 포유류 수용체에 투여되어, 치료적 이점을 제공할 수 있다. 포유류 수용체는 인간일 수 있고, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및 NF-κB 활성화제--변형 세포는 수용체에 대해 자가유래일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용체와 관련하여 동종이계, 동계 또는 이종이계일 수 있다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 확장 절차는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 5,199,942호에 기재되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법은 당 업계에 공지되어 있으므로, 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 간단히 말하면, 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)의 생체외 배양 및 확장은 (1) 말초 혈액 수확 또는 골수 외식편으로부터 포유류로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 생체외에서 이러한 세포를 확장시키는 단계. 미국 특허 제 5,199,942호에 기재된 세포 성장 인자 이외에 다른 인자 예컨대 flt3-L, IL-l, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포의 배양 및 확장에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역 손상된 개체에서 발생하는 질병의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 관련 항원의 발현과 관련된 질병, 장애 및 병태가 발생할 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 관련 항원의 발현과 관련된 질병, 장애 및 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, CAR/TCR/NF-κB 자극 분자-변형 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 본 개시내용의 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포의 치료적 유효량을 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 양상에서 본 개시내용의 CAR/TCR/NF-κB 자극 분자-발현 세포는 증식성 질병 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태 예컨대 골수이형성, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 암 관련 항원과 관련된 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 비정형 및/또는 비 통상적 암, 악성종양, 전 암성 병태 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 증식성 질병을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 관련 항원의 발현과 관련된 비암 관련 적응증은, 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 자가면역 질병, (예를 들어, 루푸스), 염증 장애 (알레르기 및 천식), 감염성 병태 (예를 들어, HIV1, CMV, EBV, 인플루엔자) 및 이식을 포함한다.
본 개시내용의 CAR/TCR/NF-κB 자극 분자-변형 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집합과 같은 다른 성분과 조합하여, 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
혈액학적 암 또는 혈액암 병태는 혈액, 골수 및 림프계에 발병하는 백혈병, 림프종 및 악성 림프 증식성 병태와 같은 암의 유형이다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병으로 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 급성 림프성 백혈병 (ALL)으로 추가로 분류될 수 있다. 만성 백혈병에는 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 만성 림프성 백혈병 (CLL)이 포함된다. 다른 관련 병태는 AML에 대한 형질전환의 위험 및 골수 혈액 세포의 비효과적인 생성 (또는 이형성증)에 의해 연합되는 혈액학적 병태의 다양한 집합인 골수이형성 증후군 (MDS, 공식적으로는 "전백혈병"으로 공지됨)을 포함한다.
림프종은 림프구로부터 발생하는 혈액 세포 종양 그룹이다. 예시적인 림프종은 비호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함한다.
본 개시내용은 암을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 양상에서, 암은 다음에 제한되는 것은 아니나, 혈액학적 암, 백혈병 또는 림프종을 포함하는 혈액학적 암 또는 혈액암이다. 일 양상에서, 본 개시내용의 CAR/TCR/NFκB-발현 세포는 암 및 악성종양 예컨대, 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, B 세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하는 급성 백혈병; 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하는 하나 이상의 만성 백혈병; 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모세포 백혈병, 소세포 또는 거대 세포 여포성 림프종, 악성 림프 증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생성 (또는 이형성)에 의해 연합된 다양한 혈액학적 병태의 집합인 "전백혈병"을 포함하는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 암 관련 항원과 관련된 질병은, 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 비정형 및/또는 비 통상적인 암, 악성종양, 전암성 질병 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 증식성 질병을 포함한다.
본 개시내용은 각각의 세포는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 포함하는 것으로, 세포, 예를 들어, 면역 효과기 세포, 또는 그의 집합의 유효량을 선택적으로, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제와 조합하여, 대상체에 투여하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제는 (i) 단백질 포스파타제 억제제; (ii) 키나제 억제제; (iii) 사이토카인; (iv) 면역 억제 분자의 억제제; (v) TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제; (vi) CAR/NF-κB 자극 분자-변형 세포의 증식 및/또는 지속성을 증가시키는 제제; (vii) 케모카인; (viii) CAR/TCR의 발현을 증가시키는 제제; (ix) CAR의 발현 또는 활성의 조절할 수 있는 제제; (x) 변형된 세포의 생존 및/또는 지속성을 제어할 수 있는 제제; (xi) 변형된 세포의 부작용을 제어하는 제제; (xii) Brd4 억제제; (xiii) 치료제 (예를 들어, sHVEM) 또는 예방제를 질병 부위로 전달하는 제제; (xiv) CAR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; (xv) 아데노신 A2a 수용체 길항제; 및 (xvi) (i)-(xv)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료 또는 예방되는 질병은 혈액암이다. 추가의 실시형태에서, 혈액암은 백혈병이다. 급성 백혈병의 비제한적인 예는 B 세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL); 다음에 제한되는 것은 아니나, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하는 하나 이상의 만성 백혈병; 다음에 제한되는 것은 아니나, B 세포 전림프구성 백혈병, 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모세포 백혈병, 소세포 또는 거대 세포 여포성 림프종, 악성 림프 증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, non호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생성 (또는 이형성)에 의해 연합된 다양한 혈액학적 병태의 집합인 "전백혈병"을 포함하는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 병태를 포함하고, 본 명세서에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 비정형 및/또는 비 통상적인 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 증식성 질병; 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 항원과 관련된 질병은 고형 종양이다.
일부 실시형태에서, 질병 관련 종양 항원은 CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (또한 CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모막 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), KSHV-K8.1 단백질, KSHV-gH 단백질, 데스모글레인 3에 대한 자기항체 (Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자기항체 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료되는 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 포진바이러스 6, 인간 포진바이러스 8 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, MERS 및 SARS 코로나바이러스, 크림 반도 콩고 유행성 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 랏사열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트밸리열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 결핵균, 비정형 마이코박테리아 종, 폐포자충, 톡소포자충증, 리케차, 노카르디아, 아스페르길루스, 무코르, 또는 칸디다에 의한 감염을 포함하는 감염성 질병이다. 이러한 질병에서, 질병과 관련된 표적 항원은 HIV1 외피 당단백질, HIV1-gag, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA) 및 GAD로부터 선택된다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 질병은 면역 또는 퇴행성 질병, 예를 들어, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 심상성천포창, 강직성 척추염, 하시모토 갑상선염, SLE, 사르코이드증, 피부경화증, 혼합결합조직병, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 질병과 관련된 표적 항원은 자기항체이다.
표적 항원의 발현과 관련된 질병의 추가의 비제한적인 예는 다음 암 또는 관련 병태 중 임의의 하나를 포함한다; 결장암, 직장 암, 신장 세포 암종, 간 암, 폐의 비소세포 암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부 암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 자궁관암, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질병, 비호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 혈관신생 종양, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 표피암, 편평 세포 암, T 세포 림프종, 환경 유발 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변.
본 명세서에 기재된 방법 또는 용도의 특정 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자 분자를 포함하는 CAR/TCR-발현 세포는 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예를 들어 단백질 포스파타제 억제제, 키나제 억제제, 사이토카인, 케모카인, scFV 단편, 이중특이적 항체, 면역 억제 분자의 억제제; 세포 신호전달 단백질, 바이러스 신호전달 단백질, 또는 TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제 중 하나 이상과 조합하여 투여된다. 단백질 포스파타제 억제제의 비 제한적인 예는 SHP-1 억제제 및/또는 SHP-2 억제제를 포함한다. 키나제 억제제의 비 제한적 예에는 CDK4 억제제, CDK4/6 억제제 (예를 들어, 팔보시클립 (palbociclib)), BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙 (ibrutinib) 또는 RN-486), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신 또는 에버롤리무스 (everolimus) (RAD001)), MNK 억제제, 또는 이중 P13K/mTOR 억제제를 포함한다. 일 실시형태에서, BTK 억제제는 인터루킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않는다. A2a 수용체 길항제의 비 제한적인 예는 비파데난트 (Vipadenant)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 억제 분자를 억제하는 제제는 억제 분자의 발현을 억제하는 항체 또는 항체 단편, 억제 핵산, 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) (CRISPR), 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN) 중 하나 이상일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 또는 용도의 다른 실시형태에서, TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제는 사이클로포스파미드, 항GITR 항체, CD25-고갈 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 본 명세서에 기재된 방법 또는 용도의 특정 실시형태에서, 면역 억제 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 IL2, IL-7, IL-15 또는 IL-21, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자 및 두 번째로, 예를 들어 본 명세서에 개시된 임의의 조합 요법 (예를 들어, 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제)을 포함하는 면역 효과기 세포는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일 실시형태에서, 사이토카인은 CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자를 포함하는 세포 또는 세포의 집합의 투여와 동시에 (예를 들어, 동일한 날 투여됨) 또는 그 직후 (예를 들어, 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일째에 투여됨) 대상체에 투여된다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 세포 또는 세포의 집합의 투여 후 또는 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후 연장된 기간 (예를 들어, 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주 이상) 후에 대상체에 투여된다.
다른 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포는 CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포의 투여와 관련된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여된다. CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자)-발현 세포와 관련된 부작용은 사이토카인 방출 증후군 (CRS), 혈구탐식성 림프조직구증식증 (HLH) 또는 신경학적 합병증으로부터 선택될 수 있다. 이러한 제제의 예로는 스테로이드 (예를 들어, 프레드니손, 덱사메타손), IL6R 길항제 (예를 들어, 토실리주맙 (tocilizumab)), IL1R 길항제 (예를 들어, 아나키라 (anakinra)), src 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙 (dasatinib) 또는 다사티닙의 수용성 염), 키나제 억제제 (예를 들어, 이브루티닙 (Ibrutinib)), 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 타크로리무스 또는 사이클로스포린 A) 또는 화학요법 약물 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 또는 빈크리스틴)을 포함한다.
일 실시형태에서, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포는 mTOR 억제제의 낮은 면역 강화 투여량과 조합하여 투여된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 낮은 면역 강화 투용량 (예를 들어, 투여량이 면역계를 완전히 억제하지는 않지만 면역 기능을 향상시키기에 충분함)으로의 치료는 PD-1 양성 T 세포의 감소 또는 PD-1 음성 세포의 증가를 수반한다. PD-1 음성 T 세포는 그러하지 않으나, PD-1 양성 T 세포는 PD-1 리간드, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2를 발현하는 세포와의 결합에 의해 고갈될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자 발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR/TCR 및/또는 NF-κB 자극 분자-발현 세포를 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 등; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 추가로 2차 활성 제제 (예를 들어, 항암제, 항바이러스제 또는 항생제)를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료되는 (또는 예방되는) 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자의 병태 및 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다. "면역 유효량", "항 종양 유효량", "종양 억제 유효량", 또는 "치료량" 또는 "항 감염성"을 지칭하는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 양은 가능한 경우, 환자 (대상체)의 연령, 중량, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 병태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 104 내지 109 세포/kg 체중, 일부 경우 105 내지 106 세포/kg 체중의 투여량에서 투여될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 양상에서, 활성화된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 대상체에 투여한 다음, 혈액을 다시 채혈하거나 (또는 성분 채집술 수행), 본 개시내용에 따른 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 활성화시키고, 이러한 활성화 및 확장된 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)를 환자에 다시 주입하는 것이 적절할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 다회 수행될 수 있다. 특정 양상에서, 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)는 10cc 내지 400cc의 혈액 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 양상에서, 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 또는 l00cc의 혈액 채혈로부터 활성화된다..
일부 실시형태에서, 대상체에서 백혈구 채집술을 수행할 수 있으며, 백혈구는 대상 세포, 예를 들어 T 세포를 선택 및/또는 단리하기 위해 생체외에서 수집, 농축 또는 고갈된다. 이들 T 세포 단리물은 당 업계에 공지된 방법에 의해 확장될 수 있고, 처리 및/또는 형질전환되어, 본 개시내용의 하나 이상의 작제물이 도입될 수 있도록 함으로써, NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 본 개시내용의 CAR-T 또는 TCR-T 세포를 생성할 수 있다. 필요한 대상체는 이어서 고 투여량 화학요법에 의한 표준 처리 후, 말초 혈액 줄기세포 이식을 수행할 수 있다. 특정 양상에서, 이식 후 또는 이식과 동시에, 선택적으로 NF-κB 활성화제를 인코딩하는 보조 모듈을 공동 발현하는 본 개시내용의 확장된 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포의 주입이 대상체에 제공된다. 추가 양상에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
본 개시내용을 실시하기 위한 키트가 또한 제공된다. 예를 들어, 대상체에서 암을 치료하거나, 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 세포를 제조하기 위한 키트가 본 명세서에 제공된다. 키트는 핵산을 면역 효과기 세포에 도입하는 방법과 함께 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 키트는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 및 바이러스 형질도입을 향상시키기 위한 화학물질, 예컨대 폴리브렌 (polybrene)을 포함할 수 있다. 키트는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR)를 발현하기 위한 T 세포의 단리를 위한 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 또는 줄기세포를 포함할 수 있다. 개시된 비천연 발생 면역 수용체 (예를 들어, CAR 및/또는 TCR) 및/또는 NF-κB 자극 분자 중 하나 초과의 것이 키트에 포함될 수 있다. 키트는 용기 및 용기 상에 또는 그에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 통상적으로 하나 이상의 핵산 분자, 바이러스, 벡터, T 세포 등을 포함하는 조성물을 보유한다. 수 개의 실시형태에서 용기는 멸균 유입부를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 구비된 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 표지 또는 패키지 삽입물은 통상적으로 예를 들어 종양의 치료 또는 예방 방법 또는 CAR-T 세포의 제조 방법에서 개시된 성분의 사용을 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 패키지 삽입물은 통상적으로 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 이러한 치료 산물의 사용에 관한 금기사항 및/또는 경고에 관한 정보를 포함하는 치료 산물의 시판 패키지에 통상적으로 포함된 설명서를 포함한다. 지침 자료는 전자 형태 (예를 들어, 컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크)로 작성되거나, 시청용 자료 (예를 들어, 비디오 파일)일 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위해 추가 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 T 세포 상 또는 그 내부에 CAR 및/또는 NF-κB 자극 분자의 발현을 측정하거나, CAR 및/또는 NF-κB 자극 분자를 발현하는 T 세포의 수 또는 백분율을 결정하거나, 세포의 기능성을 결정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 특정 방법의 실시에 통상적으로 사용되는 완충액 및 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 적절한 함량은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명은하기 다음 실험 예를 참조하여 추가로 기재된다. 이들 예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 것이 아니다. 따라서, 본 개시내용은 결코 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
상이한 세포 표면 및 세포내 항원을 표적화하는 상이한 작제물의 세포독성을 측정하기 위해 루시퍼라제 (예를 들어, GLuc 또는 NLuc)를 발현하도록 조작된 세포주가 표 a에 제공된다. 이 실험에 사용된 세포주, 세포주 상의 표적 항원 및 그의 성장 배지가 하기 표 a에 제시되어 있다. 세포를 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포주를 ATCC, NIH AIDS 시약 프로그램으로부터 획득하거나, 실험실에서 입수할 수 있었다.
[표 a]
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
NFAT-의존적 EGFP (또는 GFP) 리포터 유전자로 조작된 Jurkat 세포주 (클론 E6-1)는 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 Arthur Weiss 박사에 의해 제공되었으며, CAR-신호전달을 연구하는 것으로 기재되었다 (문헌[Wu, CY et al., Science 350:293-302,2015]). Jurkat 세포를 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다.
MPL에 대한 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터의 생성
pLENTI-Blast 벡터는 LacZ 유전자의 제거에 의해 pLENTI6v5gw_lacz 벡터 (Invitrogen; ThermoFisher Scientific)로부터 유래되었다. pLENTI-MP2는 Pantelis Tsoulfas (Addgene plasmid # 36097)에 의해 제공되었으며, 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 인간 EF1α 프로모터로 대체하여 pLENTI-EF1a 또는 pLENTI-EF1α [SEQ ID NO: 3837] 렌티바이러스 벡터를 생성하는데 사용하였다. pLENTI-EF1a-DWPRE [SEQ ID NO: 3838]는 WPRE 서열의 결실에 의해 pLENTI-EF1α 벡터로부터 유래되었다. 내부 Sac II 단편을 EF1α 프로모터로부터 결실시켜, EF1알파 (EF1a)-D-SACII-프로모터 (SEQ ID NO: 3842)를 생성하였다. psPAX2 벡터는 Didier Trono (Addgene plasmid # 12260)에 의해 제공되었다. pLP/VSVG 외피 플라스미드 및 293FT 세포는 Invitrogen (ThermoFisher Scientific)으로부터 입수하였다. 레트로바이러스 전달 벡터 MSCVneo, MSCVhygro 및 MSCVpac 및 패키징 벡터 pKAT는 Robert Illaria 박사의 실험실로부터 획득하였다. phRGTK Renilla 루시퍼라제 플라스미드는 Promega로부터 입수하였다.
BBz, CD28z 및 z-K13 백본을 갖는 벡터를 포함하는 키메라 항원 수용체의 생성, GGS-NLuc 융합 단백질의 생성 및 사용, 및 Matador 분석을 사용한 세포 세포독성의 측정을 위한 루시퍼라제 (예를 들어, GLuc) 리포터 세포주의 생성 및 사용은 (PCT/US2017/024843, PCT/US2017/025602 및 PCT/US2017/052344)에 기재되어 있다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터
렌티바이러스를 필수적으로 전술한 바와 같이 293FT 세포에서 인산칼슘 기반 형질감염에 의해 생성하였다 (문헌[Matta H et al, Cancer biology and therapy. 2(2):206-10. 2003]). 293FT 세포를 10% FCS 4 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 비 필수 아미노산 및 1 mM MEM 피루브산나트륨 (이하 DMEM-10으로 지칭함)이 포함된 DMEM에서 성장시켰다. 렌티바이러스의 생성을 위해, 293FT 세포를 10 cm 조직 배양 플레이트에서 항생제없이 10 ml의 DMEM-10 배지에 플레이팅하여 형질감염 당일에 대략 80 컨플루언스 (confluence)에 도달하도록 하였다. 다음날, 상이한 유전자를 인코딩하는 10 μg의 렌티바이러스 발현 플라스미드, 7.5 μg의 PSPAX2 플라스미드 및 2 μg의 PLP/VSVG 플라스미드를 사용하여 인산칼슘 형질감염 방법으로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 약 15 내지 16시간째에, 9 ml의 배지를 제거하고, 5 ml의 새로운 배지로 교체하였다. 형질감염 후 약 48시간째에, 5 ml의 상청액을 수집하고 (제1 수집), 새로운 5 ml 배지로 교체하였다. 형질감염 후 약 72시간째에, 모든 배지를 수집하였다 (제2 수집, 보통 약 6 ml). 수집된 상청액을 풀링하고, 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 임의의 세포 잔해 및 비 부착성 세포를 제거하였다. 무 세포 상청액을 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하였다. 일부 경우에, 상청액을 4℃에서 2시간 동안 18500 rpm에서 초원심분리에 의해 추가로 농축시켰다. 바이러스 펠릿을 XVIVO 배지에서 초기 부피의 1/10로 재현탁시켰다. 바이러스를 새로 사용하여, 표적 세포를 감염시키거나, -80℃에서 분취량으로 동결 저장하였다.
T 세포 및 PBMC의 감염
Buffy 외피 세포는 로스앤젤레스의 어린이 병원의 혈액 은행으로부터 건강한 비확인 성인 공여체로부터 획득하였고, 이를 사용하여, Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하였다. PBMC는 그대로 사용하거나, CD3 자기 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여, 제조업체의 지침에 따라 T 세포를 분리하는데 사용하였다. PBMC 또는 단리된 T 세포를 10 ng/ml CD3 항체, 10 ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2가 보충된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재현탁시켰다. 세포를 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 렌티바이러스 벡터로 감염시키기 전에 세포를 상기 배지에서 1일 동안 활성화시켰다. 일반적으로, 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 no. H9268) 8 μg/ml의 존재하에 XVIVO 배지에 재현탁된 300 μl의 농축 바이러스로 스핀-감염 (37℃에서 90분 동안 1800 rpm)을 사용하여 1차 세포 (예를 들어, T 세포)를 아침에 감염시켰다. 저녁에 배지를 교체하고, 추가로 2일 동안 감염을 반복하여, 총 3회의 감염을 실시하였다. 3차 감염 후 세포를 펠렛화하고, 10ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2를 포함하고, (지정된 경우) 각각의 항생제가 보충된 새로운 XVIVO 배지에 재현탁하고, 달리 지시되지 않는 한 선택을 위해 세포 배양 플라스크에 배치한다. 약물 선택을 사용하지 않는 경우 10 내지 15일 동안, 세포를 배양하고, 약물 선택을 사용하는 경우 20 내지 30일 동안 세포를 배양하였다. 세포가 EGFP를 발현하는 렌티바이러스에 감염된 경우, 이를 약물 선택없이 확장시키거나, 유동 분류하여, EGFP-발현 세포를 농축시켰다. 암 세포주의 감염을 위해, 약 500,000개의 세포를 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 no. H9268)으로 총 3 ml의 비 농축 바이러스 상청액 2 ml로 감염시켰다. 이어서 다음날 아침, 세포를 펠렛화하고, 각각의 항생제가 포함된 배지에 재현탁시키고, 선택을 위해 세포 배양 플라스크에 배치하였다.
필수적으로 렌티바이러스 벡터 생성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 절차를 사용하였으나, 예외적으로, 10 μg의 레트로바이러스 작제물, 4 μg의 pKAT 및 2 μg의 VSVG 플라스미드를 사용하여, 10 ml의 DMEM-10 배지에서 10 cm 조직 배양 플레이트에서 293FT 세포를 일반적으로 형질감염시켜, 레트로바이러스 작제물을 생성하였다. 표적 세포의 바이러스 수집 및 감염을 필수적으로 렌티바이러스 벡터에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
항체 및 약물
블리나투모맙 (Blinatumomab)은 Amgen으로부터 입수하였다. 디지토닌 (Digitonin)은 Sigma (Cat. no D141)로부터 구입하였고, 100 mg/ml의 스톡 용액을 DMSO에서 제조하였다. 1 mg/ml의 희석된 스톡을 PBS에서 제조하였다. 세포 용해에 사용된 디지토닌의 최종 농도는 달리 지시되지 않는 한 30 μg/ml이었다.
ELISA
제조사의 권장 사항에 따라 R&D 시스템 (Minneapolis, MN) 및 BD Biosciences로부터 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 24 내지 96시간 동안 특이적 표적 세포주와 공동 배양한 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 효과기 세포 또는 T 세포의 세포 배양 상청액 중 인간 IL2, IFNγ, IL6 및 TNFα를 측정하였다.
CAR의 발현을 검출하기 위한 FACS 분석
마우스 항-인간 c-Myc APC 접합 단일클론 항체 (카탈로그 # IC3696A)를 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 입수하였다. 비오티닐화된 단백질 L을 GeneScript (Piscataway, NJ)로부터 구입하고, 1 mg/ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 조제하고, 4℃에서 저장하였다. 스트렙타비딘-APC (SA1005)를 ThermoFisher Scientific으로부터 구입하였다.
Myc 염색을 사용한 CAR의 검출을 위해, 1 x 106개의 세포를 수확하고, 4% 소 혈청 알부민 (BSA) 세척 완충액을 포함하는 3 ml의 빙냉 1 x PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, 세포를 10 μl의 APC-접합 Myc 항체를 포함하는 0.1 ml의 빙냉 세척 완충액에 재현탁시키고, 1시간 동안 암소에서 인큐베이션한 후, 빙냉 세척 완충액으로 2회 세척하였다.
단백질 L 염색을 사용한 CAR의 검출을 위해, 1 x 106개의 세포를 수확하고, 4% 소 혈청 알부민 (BSA) 세척 완충액을 포함하는 3 ml의 빙냉 1 x PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, 세포를 1 μg의 단백질 L을 포함하는 0.1 ml의 빙냉 세척 완충액에 4℃에서 1시간 동안 재현탁시켰다. 세포를 빙냉 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 0.1 ml의 세척 완충액에서 10 μl의 APC-접합 스트렙타비딘과 30분 동안 (암소에서) 30분 동안 인큐베이션한 후, 빙냉 세척 완충액으로 2회 세척하였다. BD Biosciences의 FACSVerse 분석기를 사용하여 FACS를 수행하였다.
세포 사멸 분석
세포 사멸을 측정하기 위해, PCT/US2017/052344 "A Non-Radioactive Cytotoxicity Assay"에 기재된 바와 같이, Gluc, NLuc 및 다른 루시퍼라제의 이소성 시토졸 발현을 기반으로 한 신규 분석을 이용하였다. 상기 방법은 표적 세포에서 리포터의 발현을 포함하며, 이는 건강한 세포 내에서 우선적으로 유지되지만, 사멸 및 사멸 중 세포로부터 방출되거나, 사멸 및 사멸 중 세포에서 활성을 우선적으로 측정할 수 있는 방식으로 이루어진다. 이 분석에 바람직한 리포터는 1) Gaussia princeps와 같은 요각류로부터의 비 분비 형태의 루시퍼라제, 2) NanoLuc와 같은 심해 새우로부터의 조작된 루시퍼라제 리포터이다. 수 개의 이러한 예시적인 리포터 벡터의 서열은 SEQ ID NO: 3845 내지 SEQ ID NO: 3851에 제공된다. 상기 벡터를 사용하여 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 생성하고, 이어서 GLuc, NLuc, 또는 TurboLuc를 안정적으로 발현하는 수 개의 표적 세포주의 다클론 집합을 생성하는데 사용하였다. 달리 지시되지 않는 한, 상이한 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 표적 세포를 표적 세포 성장에 사용된 배지에서 384웰 플레이트에 3중 반복 실험으로 플레이팅하였다. 현탁액에서 성장하는 표적 세포를 일반적으로 웰당 2 내지 3 x 104의 농도로 플레이팅하고, 부착성 단층으로서 성장하는 표적 세포를 웰당 1 내지 2 x 104의 농도로 플레이팅하였다. 달리 지시되지 않는 한, 표적 세포를 4 시간 내지 96시간 동안 1:1 내지 10:1로 효과기:표적 (E:T) 비를 변화시키면서, 유전자 변형된 T 세포 (즉, CAR을 발현하는 세포)와 공동 배양하였다. 표적 세포가 부착성 세포로서 성장하는 경우 (예를 들어, HeLa 세포), 이를 밤새 웰의 바닥에 부착되도록 한 후, T 세포를 첨가하였다. 표적 세포의 용해의 T 세포 매개 유도를 루시퍼라제 활성의 증가에 의해 분석하였으며, 이는 하기 기재된 바와 같이 천연 코엘로엔트라진 (coeloentrazine) (Nanaolight)을 포함하는 0.5 x CTZ 분석 완충액을 직접 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같다.
CTZ 분석
시간 경과에 따른 CTZ의 산화를 방지하기 위해, 30 μl의 6N HCl이 보충된 1.1 ml의 100% 메탄올에 1 mg의 동결건조된 CTZ 분말을 용해시켜 천연 코엘로엔트라진 (CTZ; Nanolight, cat # 303)의 100X 스톡 용액을 제조하였다. CTZ 분석 완충액을 제조하기 위해, CTZ의 100X 스톡 용액을 PBS에서 0.5X 농도로 희석시켰다. 달리 지시되지 않는 한, 총 부피 15 μl의 CTZ 분석 완충액 (상기 제조된 바와 같음)을 비-분비 형태의 루시퍼라제를 발현하는 세포를 포함하는 384-웰 백색 플레이트 (Greiner, 384웰 백색 플레이트 cat # 781075)의 각 웰에 대략 50 내지 60 μl 부피의 배지에 첨가하고, BioTek synergyH4 플레이트 리더를 사용하여 발광도에 대해 플레이트를 판독하였다. 96웰 플레이트의 경우, 세포를 200 μl의 배지에 플레이팅하고, 대략 50μl의 0.5X CTZ 분석 완충액을 첨가하였다. 달리 지시하지 않는 한, 0.5X CTZ 분석 완충액을 사용하여 GLuc, TurboLuc16 및 MLuc7의 활성을 분석하였다. 일부 실험에서 CTZ 분석 완충액 (0.125X 농도로 희석됨)을 사용하여 NLuc 활성을 측정하였다. 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한, 또한, 0.5X CTZ 분석을 1:1 부피의 세포를 포함하는 배지에 첨가하는 경우, 분석을 수행하더라고, 첨가된 0.5X CTZ 분석 완충액의 부피는 세포를 포함하는 웰에서의 액체 부피의 대략 1/4이었다. 배지 단독 (Med)을 포함하는 웰 및 표적 세포가 임의의 CAR 작제물 (T-UI)로 감염되지 않은 T 세포와 인큐베이션된 웰 중 Gluc 활성을 지시된 바와 같이 대조군으로서 사용하였다.
표적 세포에서 항원의 발현을 검출하고, CAR 및 BiT의 작제에 사용된 다양한 항원 결합 모이어티의 항원 결합 활성을 결정하기 위한 분석
그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT/US2017/025602에 기재된 바와 같이 항원 특이적 항체 또는 고도의 감응성인 항원 검출 분석과 면역 염색을 조합한 생물정보학 접근법에 의해 표적 세포에서의 항원의 발현을 결정하였다. 이 분석은 항체의 항원 결합 도메인, scFv, vHH 또는 임의의 다른 항원 결합 단편 또는 임의의 수용체 및 리간드에 대한 GLuc 또는 NLuc 리포터 단편의 융합을 포함한다. 생성된 융합 단백질을 시험 항원을 발현하는 표적 세포와 인큐베이션하고, 융합 단백질의 결합을 코엘로엔트라진 또는 루시퍼라제 리포터의 다른 적합한 기질의 첨가에 의해 결정한다.
CAR T 세포의 다양한 풀의 생성
상기 분석을 사용하여, 본 발명의 CAR의 작제에 사용된 상이한 항원 결합 모듈 (예를 들어, scFv, vHH, 수용체, 리간드)을 스크리닝하고, 특이적 결합 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 항원 결합 모듈을 CAR의 작제를 위해 선택하였다. 추가로, 일부 scFV 단편을 또한 문헌 또는 실험실에서 공지된 활성을 기반으로 하여 선택하였다.
상이한 CAR 또는 CAR의 하위세트는 다음에 제한되는 것은 아니나, 질병 유발 및 질병-관련 세포에 대한 표적 항원의 발현 정도 및 수준, 질병 부담 및 질병 진행률을 포함하는 다양한 인자에 따라 상이한 질병 병태에 최적으로 적합할 수 있다. 상이한 CAR은 효능 및 독성 프로파일 및 환자의 병태에 따라 상이한 환자에서 단일 질병 병태에 대해서도 최적으로 적합할 수 있다. 본 개시내용은 다양한 입양 면역 반응을 생성하기 위한 중요한 기술 및 전달 장애에 대한 해결 방안을 제공한다.
정상적인 TCR 다양성은 유전자 재배열에 의해 생성된다. 흉선에서의 엄격한 양성 및 음성 선택 과정에 의해, 낮은 친화도 범위 내에서 자기 펩타이드/MHC를 인식하도록 제한되는 αβ TCR을 발현하는 T 세포만이 주변부에 집합될 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 이러한 흉선 환경에 의해 자기 제한적이지만 자기 반응성이 아닌 αβ T 세포의 풀을 생성할 수 있다.
상이한 항원 결합 도메인으로부터 다양한 CAR-T 세포 풀을 생성하는 것은 다중 항원 결합 도메인을 생성하고 시험하는 기술 및 재정적 장애에 의해 제한된다. 더욱 중요하게는, 각각의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체의 vL 및 vH 단편)은 다른 항원에 결합하여, 표적외 독성을 유발할 수 있는 가능성을 가지므로, 잠재적으로 복수의 항원 결합 도메인만을 기반으로 하는 다양한 CAR 풀은 독성 위험이 증가한다. 따라서, 이러한 풀의 잠재적 다양성은 표적외 독성을 감소시키기 위해 제한되어야할 것이다. 본 개시내용은 TCR 사슬, 신호전달 도메인 및 백본의 상이한 변이체에 부착하여, 단일 또는 소수의 항원 결합 도메인으로부터 다양한 CAR 풀을 생성함으로써 이 문제를 극복한다. CAR 풀의 다양성은 상이한 링커의 사용에 의해 더욱 증가된다. 풀을 발현하는 T 세포의 다양성은 본 개시내용에 기재된 상이한 보조 모듈을 사용함으로써 추가로 증가될 수 있다.
이 다양한 CAR 풀은 상기 항원을 발현하는 질병 유발 또는 질병 관련 세포에 대한 다양한 면역 반응을 제공하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 다양한 CAR 풀은 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 선택적으로 DNA 바코딩될 수 있고, 이어서 최적의 생물학적 및 임상 특성을 갖는 CAR의 단일 또는 하위그룹을 선택하는데 사용될 수 있다. 이들 특성은 다음에 제한되는 것은 아니나, 시험관내 생물학적 분석에서의 성능 (예를 들어, 세포독성, 사이토카인 분비, 결합 친화도, 세포 표면 발현, 표적외 효과, T 세포 증식, 고갈 마커의 발현 및 최종 분화 등), 생체내 분석에서의 성능 (예를 들어, 생존, 종양 감소, T 세포 지속성, T 세포 확장 등) 및 임상 경험 (예를 들어, 질병 완화, 재발률, 독성 등)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 CAR을 단독으로 또는 당 업계에 공지된 다른 CAR 및 다른 천연 및 합성 면역 수용체와 조합하여 사용하여, 그 표적 항원을 발현하는 세포에 의해 야기되거나 이와 관련된 다양한 질병 병태의 예방 및 치료를 위한 다양한 면역 효과기 세포 풀을 생성할 수 있다.
적절한 특성을 갖는 CAR을 선택하기 위한 시험관내 및 생체내 선택의 사용. CAR 표적화 CD19 (SEQ ID NO: 1594-1608, 1016-1026, 1900-1910)의 풀은 당 업계에 공지된 기술 및 TRAC gRNA를 사용하여 T 세포에서 TRAC 좌위를 표적화한다. 표적화 벡터는 또한 CAR 삽입물의 종결 코돈의 하류에 위치한 DNA 바코드를 보유한다. T 세포는 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, T 세포는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 iPSC 또는 조혈모세포의 단일클론으로부터 유래된다. CAR의 풀을 발현하는 T 세포를 시험관내에서 1 내지 21일 동안 RAJI 세포와 공동 배양하였다. CAR-T 세포 풀의 분취량을 표적 세포와의 배양 전 및 공동 배양 후 다른 날에 수집한다. 표적 세포에 노출 후 상이한 CAR의 상대 빈도를 결정하기 위해 샘플을 차세대 시퀀싱에 적용한다. 생물정보학 분석을 사용하여, 표적 세포와의 공동 배양 후 더 나은 증식 반응과 관련된 CAR을 결정한다. 필수적으로 유사한 접근법을 사용하여, 종양 유발 실험에 적용된 동물과 비교하여, 생체내에서 T 세포에 더 높은 증식 가능성을 부여하고/거나, 생체내에서 장기간 지속되고/거나, 생존 동물에서 개시 T 세포 집합에서 그의 빈도에 대해 정규화하는 경우, 더 높은 빈도로 존재하는 CAR을 결정한다. 본 개시내용의 대안적인 실시형태에서, 필수적으로 유사한 접근법을 인간 임상 샘플에 사용하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, 더욱 우수한 장기 생존, 사이토카인 방출 증후군의 더 낮은 발생률, 더 낮은 신경독성 및/또는 더 높은 장기 지속성을 포함하여, 상이한 특성 및/또는 결과와 관련된 CAR을 확인한다. 이러한 CAR을 후속하여 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용하여, 상이한 질병 병태 및 상이한 환자의 치료를 위한 다양한 특성을 갖는 동일하거나 상이한 항원 결합 도메인을 표적화하는 CAR을 포함하는 상이한 CAR 하위풀을 개발할 수 있다. 다른 가능성으로는, CAR-T 세포를 그의 표적 세포주에 노출시킨 후, 유세포분석에 의해 결정된 바와 같은 세포내 IFNγ의 정도를 기반으로 하여 상이한 세트로 분류한다. 낮은 IFNγ 집합 대 높은 IFNγ 집합에서 상이한 CAR의 빈도를 차세대 시퀀싱에 의해 결정하고, 대조군 CAR-T 세포 집합, 즉 표적 세포주에 노출되지 않았거나, CAR의 표적을 발현하지 않는 세포주에 노출된 CAR-T 세포에서의 빈도로 정규화한다. 이 분석으로부터, 상이한 수준의 IFNγ 생성과 관련된 CAR을 결정할 수 있다. 유사한 접근법을 사용하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, 고갈 마커의 더 낮은 발현, 최종 분화 마커의 더 낮은 발현 및/또는 세포독성 마커의 더 높은 발현을 포함하는 적절한 특성 또는 속성 중 임의의 것 또는 그 조합에 의해 CAR을 스크리닝 및 선택한다.
공자극을 제공하기 위한 NEMO-돌연변이체의 사용
마우스 NEMO-K270A (SEQ ID NO: 992)는 NF-κB를 항시적으로 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 이 돌연변이체가 T 세포에 대한 공자극을 제공하는 능력을 입증하기 위해, CD3+ve T 세포를 10 ng/ml 가용성 항-CD3, 10 ng/ml 가용성 항-CD28 및 100 IU 재조합 인간-IL2가 보충된 XVIVO 배지 (Lonza)에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양하고, 1일 후 EGFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (pLENTI-EGFP-블라스타시딘 (Blasticidin)) 및 마우스 NEMO-K270A 돌연변이체 (pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-블라스티시딘 및 pLENTI-mNEMO-K270A-HA-블라스티시딘), 또는 마우스 NEMO-wt (pLENTI-mNEMO-FLAG-블라스티시딘)을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시킨다. mNEMO-K270A 및 mNEMO-wt의 서열은 각각 SEQ ID NO: 992 및 991에 제공된다. 감염 후 대략 1일째에, 세포를 블라스티시딘으로 선택하고, 세포 수를 주기적으로 계산하였다. 마우스 NEMO-K270A 돌연변이체 (pLENTI-mNEMO-K270A-FLAG-블라스티시딘 및 pLENTI-mNEMO-K270A-HA-블라스티시딘)를 인코딩하는 렌티바이러스로 감염된 T 세포는 EGFP 또는 마우스 NEMO-wt (pLENTI-mNEMO-FLAG-블라스티시딘)을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염된 T 세포와 비교하여 더 활발하게 증식하는 것으로 나타났다.
인간 NEMO는 마우스 NEMO보다 길고, 인간 NEMO-K277A (hNEMO-K277A; SEQ ID NO: 979) 돌연변이체는 마우스 NEMO-K270A (mNEMO-K270A) 돌연변이체에 해당한다. hNEMO-K277A 돌연변이체가 NF-κB를 활성화시키는지 시험하기 위해, 이 돌연변이체를 인코딩하는 발현 벡터 (pCDNA3)를 생성하였다. 또한, 아미노산 잔기 277에서 Lys (K)가 상이한 아미노산 잔기로 대체된 (예를 들어, K277Q, K277T, K277I, K277N, K277S, K277M, K277G, K277R이 생성됨) hNEMO의 수 개의 다른 돌연변이체를 인코딩하는 발현 작제물. 상이한 작제물을 NF-κB-루시퍼라제 리포터 작제물 및 RSV-LacZ (정규화 대조군) 리포터 작제물과 함께 293FT 세포에서 형질감염시키고, 전술한 분석을 사용하여 NF-κB를 활성화시키는 능력을 시험하였다. 도 3은 mNEMO-K270A, hNEMO-K277A에 의한 NF-κB의 강한 활성화 및 hNEMO-K277I 및 hNEMO-K277G 돌연변이체에 의한 약한 활성화를 나타낸다. 유사한 실험에서, hNEMO-K277L 및 hNEMO-K277A-델타V249-K255 돌연변이체는 293FT 세포 내로 형질감염되는 경우, NF-κB 활성화를 나타냈다. hNEMO-K277A-델타V249-K255 돌연변이체는 인간 NEMO의 아미노산 잔기 V249-K255가 부재하고, 또한 K277A 돌연변이를 보유한다. 이러한 결과는 마우스 NEMO K270 잔기 및 인간 NEMO K277 잔기를 돌연변이시킴으로써 NEMO의 항시적 활성 돌연변이체를 신속하게 생성하여, 확인할 수 있음을 시사한다. 유사한 접근법을 사용하여, NF-κB를 활성화시키는 능력을 갖는 다른 NEMO 잔기에서 돌연변이를 생성할 수 있다.
FMC63 기반 CD19 CAR CAR 작제물을 생성하여, N 말단 FKBPx2 이량체화 도메인과 융합하여 전장 hNEMO-K277A 또는 hNEMO-L753 돌연변이체 (아미노산 1 내지 251을 인코딩함)로 공동 발현시켰다. 작제물을 NF-κB-루시퍼라제 리포터 작제물 및 RSV-LacZ 리포터 작제물과 함께 293FT 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 후 대략 8시간째에, 세포를 처리하지 않고 방치하거나, AP20187 (100 nM)로 처리하였다. 대략 72시간 후, 세포 용해물을 제조하고, 전술한 바와 같이 NF-κB 루시퍼라제 및 LacZ 활성에 대해 분석하였다. 형질감염 효율의 차이를 제어하기 위해 NF-κB-Luc 활성을 LacZ 활성에 대해 정규화하였다. 결과는 AP20187로의 처리가 FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1006) 및 FKBPx2-hNEMO-L753 (SEQ ID NO: 1007) 돌연변이체를 공동 발현하는 CAR 인코딩 작제물로 형질감염된 293FT 세포에서 NF-κB 활성의 증가를 초래한다는 것을 보여주었다. 이들 결과는 이량체 도메인과의 융합에서 전장 NEMO 또는 그의 결실 돌연변이체의 공동 발현에 이어 이량체화제의 첨가에 의해 CAR 또는 TCR 또는 키메라 TCR 작제물에서 유도성 방식으로 NF-κB를 활성화시키는 능력을 입증한다.
J-N-G 세포를 FKBPx2-hNEMO-K277A 또는 FKBPx2-hNEMO-L753을 공동 발현하는 CD19-유도 FMC63 기반 1세대 CAR로 감염시킨다. 세포를 AP20187 화합물의 존재 및 부재 하에 EGFP 발현을 유도하는 것으로 나타난 RAJI 표적 세포와 공동 배양하였고, 이는 FKBPx2-hNEMO-K277A 또는 FKBPx2-hNEMO-L753가 그의 활성이 방해되지 않으면서, CAR과 공동 발현될 수 있음을 시사한다.
NEMO 이외에도, 다수의 다른 세포 단백질이 NF-κB를 항시적으로 활성화시키는 것으로 공지되어 있으며, 본 발명의 대안적인 실시형태에서 입양 세포 요법의 목적으로 T 세포에 공자극 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 단백질은 TCL-1A (SEQ ID NO: 1005) 및 IKKα/IKK1 (IKK1-S176E-S180E; SEQ ID NO: 1004), IKKβ/IKK2 (IKK2-S177E-S181E; SEQ ID NO: 1002) 및 MYD88-L265P (SEQ ID NO: 1000)의 항시적 활성 돌연변이체를 포함한다. 일 실시형태에서, 이들 단백질은 이량체화 도메인의 부재 하에 발현되어, 입양 세포 요법의 목적으로 T 세포에 항시적 공자극을 제공한다. 당 업계에 공지된 임의의 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, AAV 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터) 또는 비-벡터 (DNA 또는 RNA 형질감염) 유전자 전달 방법을 사용하여 T 세포에서 이들 단백질을 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 당 업계에 공지된 유전자 변이 기술 (예를 들어, Cas9, Talons, Zn 핑거 뉴클레아제)을 사용하여 그 게놈 카피를 변이시킴으로써 이들 단백질을 발현시킬 수 있다. 예시적 실시형태에서, hNEMO의 하나 이상의 게놈 카피를 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 T 세포에서 상동성 재조합을 사용하여 hNEMO-K277A로 돌연변이시킨다.
당 업계에 공지된 유도성 프로모터, 예컨대 Tet-유도성 프로모터 또는 RheoGene 시스템을 사용하여 이들을 발현시킴으로써 이들 공자극 단백질의 발현을 제어할 수 있다. 일 실시형태에서, hNEMO-K277A 돌연변이체 및 hNEMO-K277A-델타V249-K255를 pSLIK-Tet-On 벡터로 클로닝시키고 (문헌[Gopalakrishnan et al, Clinical Cancer Res; 19(18), 2013]), 생성된 바이러스를 사용하여, T 세포를 감염시킨다. 독시사이클린에 의한 T 세포의 처리는 hNEMO-K277A 및 hNEMO-K277A-델타V249-K255 발현 및 NF-κB 활성을 유도하는 것으로 나타났다. NF-κB 활성을 AlexaFlour-접합 Phospho-IκBα 항체 및 유세포분석에 의해 측정한다.
본 발명의 대안적인 실시형태에서, 다른 NF-κB 활성화 단백질 또는 그의 신호전달 도메인 (예를 들어, IKK1, IKK2, RIP 등)은 이량체화제 도메인과의 융합으로 발현되어 유도성 방식으로 T 세포에 공자극을 제공한다. 본 발명의 이러한 항시적 또는 유도성 NF-κB 활성화 단백질의 사용은 다른 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, 수지상 세포, 항원 제시 세포 등)에 공자극을 제공하는데 사용될 수 있기 때문에 T 세포에 공자극을 제공하는 것으로 제한되지 않으며, NF-κB 활성화는 그 기능을 향상시키는 것으로 공지되어 있다. NF-κB가 아폽토시스를 방지하고, 세포 생존을 촉진하는 것으로 공지되어 있으므로, 이러한 항시적 및 유도성 NF-κB 활성화 단백질은 또한 생물학적 산물 제조에 사용되는 세포의 생존을 향상시키기 위해 세포 조작에 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 하이브리도마 세포는 항시적으로 그 증식 및 높은 세포 밀도로 성장하는 능력을 향상시키기 위해, hNEMO-K277A, hNEMO-K277A-델타V249-K255 (SEQ ID NO: 7769), K13, IKKα/IKK1 (IKK1-SS/EE; SEQ ID NO: 1004), IKKβ/IKK2 (IKK2-S177E-S181E; SEQ ID NO: 1002) 또는 MYD88-L265P (SEQ ID NO: 1000)를 발현하도록 조작된 것이다.
T 세포 입양 세포 요법을 위한 NF-κB 활성화제.
Buffy 외피 세포를 혈액 은행으로부터 건강한 비확인 성인 공여체로부터 획득하여, Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하는데 사용한다. T 세포를 CD3 마이크로 비드 (Miltenyi)를 사용하여 단리하고, CD3/CD28 다이나비드 (Dynabead) 및 50 IU/ml의 재조합 IL2가 보충된 XVIVO 15 배지에서 배양한다. 대안적으로, T 세포를 10 ng/ml CD3 항체, 10 ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 보충된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재현탁한다.
다음날, T 세포를 pCCL3-MND3 백본에서 CD19-표적화된 CAR (차세대 CAR 포함)-인코딩 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. CAR의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1016 내지 1029, 1318 내지 1331, 1594 내지 1604, 1900 내지 1913, 2206 내지 2219, 2512 내지 2525, 2818 내지 2831, 3124 내지 3127, 3324 내지 3327에 제시되어 있다. 또한, T 세포를 상기 작제물에 해당하지만 hNEMO-K277A 모듈이 부재하는 CAR 작제물로 감염시킨다. 각 감염에 대해 1,800만개의 T 세포를 6-웰 플레이트에서 90분 동안 2800 rpm, 32℃에서 스핀 감염 (spinfection)에 의해 8 μg/ml 폴리브렌 (Polybrene) 및 상이한 CAR 작제물을 인코딩하는 500 μl의 농축 바이러스로 감염시켰다. 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 수집하고, 원심분리하여 바이러스 및 폴리브렌을 제거하고, 새로운 배양 배지에 재현탁시키고, 37℃에서 밤새 배양한다.
다음날, 스핀 감염을 반복하고 CD3/CD28 다이나비드, 50 IU/ml IL2 및 5% FBS가 보충된 XVIVO 15 배지를 사용하여 세포를 T-75 세포 배양 플라스크로 옮겼다.
4일의 확장 후, CAR-T 세포를 단백질 L 염색, CD19-결합, 사이토카인 생성 (IL2, IFNγ, TNFα) 및 세포독성 (Matador assay)을 사용하여 CAR 발현에 대해 확인한다.
10일의 확장 후, CAR/SIR-T 세포를 생체내 실험에 사용한다. 이를 위해, NSG 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 106개의 Nalm-6-Luc 세포를 주사하였다. 2일 후, 3x106개의 CAR/SIR-T 세포를 주사하였다. 마우스를 D-루시페린의 투여 후 생물발광 영상화에 의해 매주 영상화하고, 생존을 추적 조사하였다.
hNEMO-K277A와 함께 1세대 CAR (SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포는 BBz 공자극 도메인과 함께 2세대 CAR (SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포와 비교하여 RAJI 세포에 노출되는 경우, ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, 더 우수한 IL2 생성을 나타낸다는 점에 주목한다. 또한, hNEMO-K277A와 함께 1세대 CAR (SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포는 BBz 공자극 도메인과 함께 2세대 CAR (SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포와 비교하여 3주 동안 RAJI 세포와 공동 배양되는 경우, 세포 증식, 사이토카인 (IL2, IFNγ, TNFα) 생성, 고갈 마커 (예를 들어, PD1)의 발현 및 세포독성 (Matador 세포독성 분석)에 의해 측정되는 바와 같이, 더 낮은 고갈 징후를 나타낸다. 마지막으로, hNEMO-K277A와 함께 1세대 CAR (SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포는 T 세포 확장 및 생체내 지속성, 종양 성장 감소 및 개선된 생존에 의해 결정되는 바와 같이, NALM-6-Luc 세포로 이종이식된 NSG 마우스에 투여되는 경우, 더 우수한 생체내 활성을 나타낸다. hNEMO-K277A와 함께 1세대 CAR (백본 2; SEQ ID NO: 1594 내지 1604)을 발현하는 T 세포는 일반적으로, vFLIP K13을 공동 발현하는 1세대 CAR (즉, 백본 1; SEQ ID NO: 1016 내지 1029)을 발현하는 T 세포와 비교하여 RAJI 세포에 노출되는 경우, 더 낮은 사이토카인 (예를 들어, IL2, IFNγ 및 TNFα) 생성을 나타낸다.
hNEMO-K277A를 발현하는 SEQ ID NO: 1900 내지 1913, 2206 내지 2219, 2512 내지 2525, 2818 내지 2831, 3124 내지 3127, 3324 내지 3327에 해당하는 CAR 작제물을 발현하는 T 세포는 유사한 작제물을 발현하지만 hNEMO-K277A 모듈이 부재하는 T 세포와 비교하여 더 우수한 시험관내 및 생체내 활성을 나타낸다. hNEMO-K277A 모듈의 공동 발현은 또한 CD20을 표적화하는 SIR (SEQ ID NO: 9683)을 발현하는 T 세포의 시험관내 및 생체내 성능을 향상시키는 것으로 나타났다. 이들 결과에 의하면 hNEMO-K277A 보조 모듈의 공동 발현이 1세대 CAR 작제물뿐만 아니라, TFP, Ab-TCR 및 SIR의 시험관내 (예를 들어, 증식, 사이토카인 생성, 고갈 지연) 및 생체내 활성 (예를 들어, T 세포의 개선된 확장 및 항 종양 활성)을 향상시키는 것으로 나타났다.
동일한 백본을 포함하지만 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 상이한 작제물 사이에도 차이가 주목된다. 따라서, hNEMO-K277A를 공동 발현하는 1세대 CAR 작제물 (즉, 백본 2) 중, 4G7 (예를 들어, SEQ ID NO:1599), huBly3 (예를 들어, SEQ ID NO: 1604), 및 huSJ25C1 (예를 들어, SEQ ID NO: 1605) scFV로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물은 FMC63 (예를 들어, SEQ ID NO: 1594), hu-FMC63-11 (예를 들어, SEQ ID NO: 1595), huFMC63-11-N203Q (예를 들어, SEQ ID NO: 1596), Bu12 (예를 들어, SEQ ID NO: 1597), CD19-MOR0028 (예를 들어, SEQ ID NO: 1602) 및 CD19-hu-mROO5 (예를 들어, SEQ ID NO: 1607)를 기반으로 한 scFv로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물과 비교하여 일반적으로 더 약하다. 항원 결합 도메인의 특성을 기반으로 하여 다른 백본에 대한 CAR의 시험관내 및 생체내 활성에서 유사한 경향이 관찰된다.
상기 실험에서, hNEMO-K277A 모듈을 단일 벡터를 사용하여 T 세포에서 CAR 모듈과 공동 발현시킨다. 2개의 모듈을 2개의 개별 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현시키는 실험을 반복한다. hNEMO-K277A 모듈이 부재하는 예시적인 CD20 CAR을 인코딩하는 핵산 작제물의 서열번호는 SEQ ID NO: 9668에 제시되어 있다. T 세포를 5의 감염 다중도에서 2개의 렌티바이러스 벡터로 공동 감염시키고, 2개의 벡터 (즉, CAR:hNEMO-K277A)의 비율은 1:1 내지 1:10으로 다양하다. T 세포를 확장시키고, 시험관내 및 생체내 분석에서 시험한다. CAR 작제물과 함께 hNEMO-K277A의 공동-발현은 IL2 생성, 세포 증식, 고갈 부재, 생체내 확장 및 항 종양 활성에 대한 분석에 의해 결정된 바와 같이, CAR-T 세포의 시험관내 및 생체내 성능을 개선시키는 것으로 나타났다.
대안의 실시형태에서, 당 업계에 공지된 유전자 편집 기술 (예를 들어, CRISP/Cas9, TALON, Zn 핑거 뉴클레아제 등)을 사용한 상동성 재조합을 사용하여, T 세포에서 내인성 인간 NEMO 유전자의 카피 중 하나 또는 둘 모두에서 K277A 돌연변이를 유도한다. 이어서, hNEMO-K277A 돌연변이를 보유하는 생성 T 세포를 CD19를 표적화하는 CAR 작제물 및 NY-ESO-1을 표적화하는 TCR 작제물을 발현시키는 단계를 포함하여, 입양 세포 요법에 사용한다. hNEMO-K277A 돌연변이를 보유하는 T 세포는 hNEMO-K277A 돌연변이가 부재하는 대조군 T 세포와 비교하여 증대된 증식, 사이토카인 생성, 확장, 생체내 장기 지속성 및 항 종양 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
hNEMO-K277A 보조 모듈이 FKBPx2-hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1006), FKBPx2-hNEMO-L753(251) (SEQ ID NO: 1007), FKBPx2-hNEMO-L600(200) (SEQ ID NO: 1008), IKK2-델타-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7782), IKK1-델타-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7781) 및 FKBPx2-RIP-ID (SEQ ID NO: 1009)를 인코딩하는 보조 모듈에 의해 대체된 CAR 작제물을 사용하여 상기 문단에 기재된 실험을 반복한다. CAR 및 이러한 보조 모듈을 발현하는 T 세포를 이량체화제 AP20187 (100nM)의 존재 및 부재 하에 시험관내 분석을 사용하여 시험한다. AP20187의 첨가는 표적 항원 (즉, CD19) 발현 RAJI 세포에 노출되는 경우, FKBPx2-hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1006), FKBPx2-hNEMO-L753(251) (SEQ ID NO: 1007), IKK2-델타-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7782), IKK1-델타-SCD-FKBPv36x2 (SEQ ID NO: 7781), FKBPx2-hNEMO-L600(200) (SEQ ID NO: 1008) 및 FKBPx2-RIP-ID (SEQ ID NO: 1009) 모듈을 발현하는 CAR-T 세포에 의해 증식 및 사이토카인 생성을 유도하는 것으로 나타났다. 생체내 실험에서, NSG 마우스 (그룹당 n=12)에 200만개의 RAJI-Luc 세포를 꼬리 정맥 주사에 의해 이종이식하고, 3일 후에 CD19-CAR을 발현하고, FKBPx2-hNEMO, FKBPx2-hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1006), FKBPx2-hNEMO-L753(251) (SEQ ID NO: 1007), FKBPx2-hNEMO-L600(200) (SEQ ID NO: 1008) 및 FKBPx2-RIP-ID (SEQ ID NO: 1009) 모듈을 공동 발현하는 500만개의 T 세포를 투여한다. 각 그룹의 마우스의 절반 (n=6)에 이전에 기재된 바와 같이, 복강내 주사에 의해 10일 동안 매일 40μg의 AP20187을 투여한다 (문헌[Chinnery et al, J Immunol 2009; 182:2738-2744]). AP20187의 투여는 CAR-T 세포의 확장을 촉진하는 것으로 나타났다. 대안적인 실시형태에서, 두 FKBP 도메인이 지질 투과성 이량체화 리간드인 리미두시드에 높은 친화도로 결합하는 FKBP12V36 돌연변이를 보유하는 작제물을 사용하여 실험을 반복한다. 융합 단백질의 이량체화는 리미두시드의 투여에 의해 이루어진다. 시험관내 실험의 경우, 10 내지 100 nM의 최종 농도의 리미두시드를 사용한다. NSG 마우스에서의 생체내 연구의 경우, 리미두시드는 매주 5 mg/kg의 복강내 (i.p) 주사에 의해 투여된다.
hNEMO-K277A 보조 모듈이 hNEMO-K277A-델타V249-K255, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MYD88-L265P, TCL-1A, 및 MTCP-1을 인코딩하는 보조 모듈에 의해 대체된 작제물을 사용하여 상기 문단에 기재된 실험을 반복한다. hNEMO-K277A-델타V249-K255, IKK2-S177E-S181E, IKK1-S176E-S180E, MYD88-L265P 보조 모듈을 발현하는 CAR-T 세포는 보조 모듈이 부재하는 CAR-T 세포와 비교하여, 증가된 사이토카인 생성, 증식, 생체내 확장 및 항 종양 활성을 나타내는 것으로 나타났다. TCL-1A 및 MTCP-1 보조 모듈을 발현하는 CAR-T 세포는 증식 반응이 증가한 것으로 나타났다.
백신화에서의 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E의 사용
인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 생성한다. 또한 문헌[Rowe HM et al, Molecular Therapy, 13, 2, 2006]에 기재된 바와 같이, 닭 오브알부민 아미노산 잔기 242 내지 353 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 불변 사슬 (Ii-OVA)의 C 말단을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 생성한다. 마지막으로, Ii-OVA를 인코딩하는 카세트와 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 또는 IKK2-S177E-S181E를 인코딩하는 카세트를 공동 발현하는 렌티바이러스 벡터를 생성한다.
DC의 형질도입 및 유동세포분석. 쥣과동물 골수 유래 수지상 세포 (DC)를 전술한 바와 같이 제조한다. 문헌[Rowe HM et al, Molecular Therapy, 13, 2, 2006]에 기재된 바와 같이, 미성숙 DC를 4일째에 렌티바이러스 벡터에 의해 20의 MOI로 형질도입하고, 4일마다 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (50 ng/ml; Peprotech)를 포함하는 새로운 배지를 공급한다. 형질도입 후 5일째에, DC를 수집하고, 세척하고, Fc 수용체에 대해 차단한 후, 비오틴-접합 Ab: 항-CD11c, 항-CD86, 및 항-I-Ab (MHC 클래스 II) (모두 BD Pharmingen); 항-CD40 (Serotec); 및 항-CD80, 항-ICAM-1, 및 항-Kb (MHC 클래스 I) (모두 eBioscience)로 성숙 마커에 대해 표면 염색한다. 햄스터 이소형 대조군 Ab (비오틴 접합)는 BD Pharmingen으로부터 구입하였다. 이어서, 스트렙타비딘 RPE Cy-5 2o 시약 (DakoCytomation)으로 Ab를 표지한 후, 유세포분석한다. 지질다당류 (LPS) (50 ng/ml) (Sigma)를 형질도입되지 않은 DC에 첨가하고 성숙에 대한 양성 대조군으로서 밤새 방치한다. 자이모산 A (Zymosan A) (10 μg/ml) 처리 (37℃에서 30분)를 ERK 활성화를 위한 대조군으로서 사용한다.
ELISA. 배양 상청액을 웰당 5 x 105개의 세포 (1.5 ml)로 플레이팅된 DC로부터 수확한다. IL-12p70 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 제조사의 지침에 따라 eBioscience로부터의 키트를 사용하여 샌드위치 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 검출한다.
림프절로부터의 DC 정제. C57/BL6 마우스 (Harlan)에 꼬리의 기저부에 1 x 108개의 감염 단위 (i.u.) 렌티벡터를 피하 (s.c.) 주사한다. 6일 후, 림프절 (대동맥 및 사타구니)을 수확하고 (각 그룹의 마우스로부터의 세포를 풀링함), 콜라게나제 CLS-4 (Worthington)와 함께 인큐베이션하고, 걸러서, 단일 세포 현탁액을 획득한다. Fc 수용체를 차단한 후, MACS 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD11c 양성 세포를 선택한다.
오량체 염색. 샘플당 백만개의 비장세포를 10 μl의 피코에리트린-접합 SIINFEKL/Kb 오량체 또는 사량체 (Proimmune)와 함께 실온에서 12분 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 세척하고, 15분 동안 비오틴-접합 항-CD8 (Serotec)과 함께 얼음에서 인큐베이션한 후, 세척하고, 스트렙타비딘-알로피코시아닌 (eBioscience)과 15분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 Cell-Quest 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 BD LSR 기계에서 세척 및 획득된다.
세포내 사이토카인 염색. 비장세포를 OVA257-264 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 밤새 인큐베이션한다. 모넨신 (Monensin) 용액 (eBiosciences; 최종 농도, 2 μM)을 첨가하고, 3시간 동안 방치한 후, CD8에 대해 세포를 표면 염색한다. 이어서 세포를 BD Biosciences로부터의 Cytofix/Cytoperm 키트를 사용하여 고정 및 투과시킨다. 이어서, 알로피코시아닌-접합 항 감마 인터페론 (항-IFN-γ) Ab (BD Pharmingen)를 첨가하고, 30분 동안 방치한 후, 세포를 세척하고, 샘플을 BD LSR 기계에서 작동시킨다.
ELISPOT 분석. 효소 연결 면역 스팟 (ELISPOT) 플레이트 (Millipore)를 정제된 항-IFN-γ (BD Pharmingen)로 4℃에서 밤새 코팅한다. 생체외 ELISPOT 분석을 클래스 I OVA257-264 펩타이드 (Proimmune)의 존재 또는 부재 하에 총 비장세포의 연속 희석액에 의해 삼중 반복 실험으로 수행한다. 플레이트를 밤새 배양하고, 제조사의 지침에 따라 현상한다. 스팟을 AID ELISPOT 카운터 및 소프트웨어를 사용하여 계수한다.
종양 요법. EG7.OVA 종양 세포를 RPMI 플러스 0.4 mg/ml G418 (Invitrogen)에서 성장시켰다. C57BL/6 마우스의 측복부에 2 Х106개의 종양 세포를 s.c. 주사하여 유발실험을 한 후, 백신화한다. 동물의 직경이 15 mm 초과에 도달하면 동물을 치사시킨다.
마우스 BM 유래 수지상 세포 (DC)에 단독으로 또는 Ii-OVA와 조합하여 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E를 인코딩하는 렌티벡터를 주사한다. 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E의 발현은 DC의 핵에서 p65 (RelA)의 핵 전좌가 LPS-처리 DC와 유사한 수준이나, 비처리 또는 대조군 벡터 DC에서는 그러하지 않고, 세포질 p65의 수준이 더 높은 결과를 나타내었다. 증가된 핵 NF-κB 결합 활성은 또한 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-형질도입 DC에서 검출되지만, MAPK 경로의 활성화에 영향을 주지 않으며, 이는 핵 API 결합 활성에 의해 결정되는 바와 같다.
인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E에 의한 BM 유래 DC의 형질도입 후, 형질도입 또는 비형질도입 세포 상의 성숙 마커를 분석한다. CD86, CD40, ICAM-1, 및 CD80는 대조군 벡터 그룹에서의 형질도입 DC와 비교하여, 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-발현 DC에서 상향조절된다. 추가로, 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-형질도입 DC는 수 주의 배양 동안 상향조절된 CD86이 유지되는 것으로 나타났다. IL-12p70 및 TNF-α의 분비는 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E로 형질도입된 DC의 배양시 상향조절되는 것으로 나타났다.
렌티벡터의 s.c. 주사 후, 형질도입된 DC는 배액 림프절에서 검출된다. 대조군 또는 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E 벡터를 s.c. 주사한 후 유사한 백분율의 림프절 DC (CD11c+/MHC 클래스 II+)가 형질도입된다. 그러나, 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-주사된 동물에서 대조군 벡터-주사된 동물과 비교하여 DC 상의 CD86이 상향조절된다.
s.c. 백신화 후 마우스에서 인간 NEMO-K277A-2A-Ii-OVA, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-2A-Ii-OVA, 마우스 NEMO-K270A-2A-Ii-OVA, IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA 및 Ii-OVA를 인코딩하는 벡터가 Ova-특이적 CD8+T 세포 반응을 유도하는 능력을 조사한다. 5 Х 105　i.u.의 벡터 투여량을 사용한다. 인간 NEMO-K277A-2A-Ii-OVA, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-2A-Ii-OVA, 마우스 NEMO-K270A-2A-Ii-OVA 및 IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA 백신화 마우스는 SIINFEKL/Kb　오량체-양성 CD8+　T 세포 및 IFN-γ-분비 CD8+　T 세포를 나타내며, 이는 세포내 형광-활성화 세포 분류 또는 ELISPOT 분석에 의해 측정되는 바와 같다.
마우스에 EG7.OVA 종양 세포의 치사 투여량으로 접종한 후, 형질도입된 DC 또는 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-벡터로 마우스를 직접 백신화한다. 모든 마우스에서 종양이 발생한 것으로 나타났다. 형질도입된 DC 주사 또는 직접 렌티벡터 주사 후, 인간 NEMO-K277A-, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-, 마우스 NEMO-K270A- 및 IKK2-S177E-S181E-그룹의 종양-부재 마우스의 수는 대조군 그룹보다 더 높다. NEMO-K277A-2A-Ii-OVA, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255-2A-Ii-OVA, 마우스 NEMO-K270A-2A-Ii-OVA, IKK2-S177E-S181E-2A-Ii-OVA 벡터의 효능을 기생충 보호 모델에서 오브알부민을 발현하는 L. 도노바니 (L. donovani)를 사용하여 시험한다 (문헌[Polley R et al, Infect. Immun. 74:773-776, 2016]).
백신화에서의 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E의 사용
단일 백혈구 채집술에서 수집된 항원 제시 세포를 인간 NEMO-K277A, 인간 NEMO-K277A-델타V249-K255, 마우스 NEMO-K270A 및 IKK2-S177E-S181E를 인코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입한 후, 인간 전립선-특이적 막 항원의 세포외 도메인을 포함하는 단백질 PA001과 함께 인큐베이션한다. 화학요법 용법 1 이하 후 진행성 mCRPC를 갖는 남성을 등록시켜, 2 내지 4주마다 생성된 백신 (4 Х 106, 12.5 Х 106 및 25 Х 106개의 세포)의 3회 투여량을 피내 투여하여 이를 평가한다. 투여량 제한 독성이 부재한다. PSA 감소로 면역 상향조절뿐만 아니라, 항 종양 활성이 관찰된다.
scFv 단편 유래 형태 161 항체를 기반으로 한 인간화된 MPL CAR의 작제 및 시험
쥣과동물 단일클론 항체 161은 인간 MPL (트롬보포이에틴 수용체 o TPO-R)을 표적화한다. MPL을 표적화하지만 면역원성이 감소된 CAR을 생성하기 위해, 쥣과동물 161 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFV 단편의 서열을 인간화시켰다. hu-161-2로 지정된 인간화된 161 scFv 단편 (SEQ ID NO: 891)을 41BB 공자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인 (SEQ ID NO: 1582)을 포함하는 2세대 CAR 백본에서 클로닝하였다. Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) 세포를 인간화된 MPL-hu-161-2 CAR 작제물을 인코딩하는 렌티바이러스로 안정적으로 형질도입시켰다. 모 및 CAR-발현 Jurkats를 이후 HEL 세포와 공동 배양하고, 4시간 후 FACS 분석에 의해 EGFP 발현의 유도를 모니터링하였다. MPL-hu-161-2 CAR 작제물을 발현하는 Jurkat 세포와 HEL 세포의 공동 배양은 HEL 세포에 노출되지 않은 세포와 비교하여 EGFP 발현이 증가하였으며, 이는 인간화 MPL-hu-161-2 CAR 작제물이 표적 항원을 인식하고 신호전달을 활성화시키는 능력을 나타낸다. hu-161-2 scFV를 포함하고 vFLIP K13 (SEQ ID NO: 1286) 또는 hNEMO-K277A 돌연변이체 (SEQ ID NO: 1878)를 공동 발현하는 1세대 CAR로 실험을 반복하는 경우, 필수적으로 유사한 결과가 획득된다.
scFv 단편 유래 형태 175 및 111 항체를 기반으로 한 인간화된 MPL CAR의 작제 및 시험
쥣과동물 단일클론 175 및 111은 또한 인간 MPL에 결합한다. 따라서, 이들 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFV 단편의 서열을 인간화하고, 이를 사용하여, vFLIP K13 (SEQ ID NO: 1287, 1288) 및 hNEMO-K277A (SEQ ID NO: 1896 및 1897)를 공동 발현하는 백본 1 및 2뿐만 아니라, 2세대 CAR (CAR II) 작제물 (SEQ ID NO: 1583 및 1584)을 제조하였다. 실험을 이전 실시예에서와 같이 반복한다. MPL-hu-175-2 및 hu-111-2 CAR 작제물을 발현하는 Jurkat 세포와 HEL 세포의 공동 배양은 HEL 세포에 노출되지 않은 세포와 비교하여, EGFP 발현이 증가하였으며, 이는 인간화된 MPL-hu-175-2 및 hu-111-2 CAR 작제물이 표적 항원을 인식하고, 신호전달을 활성화시킴을 시사한다.
CD70을 표적화하는 CAR의 작제 및 시험
CD70을 표적화하는 다수의 작제물을 작제한다 (SEQ ID NO: 9781 내지 10086; 및 7783 내지 7789). 상기 작제물을 J-N-G 및 T 세포에서 발현시키고, 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 CD70-발현 표적 세포주 RAJI 및 THP-1에 대한 T 세포 활성화 및 세포독성에 대해 시험한다.
백혈병 세포에 발현된 CD70, PTK7, 카파 경쇄, 클라우딘18A2, Ras/HLA-A2 복합체, NY-ESO/HLA-A2 복합체, Streptag 및 CD43의 에피토프를 표적화하는 CAR의 작제 및 시험.
vFLIP K13 또는 hNEMO-K277A를 공동 발현하는 2세대 백본 (예를 들어, 통상의 CAR II) 또는 백본 1 및 2에서 백혈병 세포에 발현된 PTK7, 카파 경쇄, 클라우딘18A2, Ras/HLA-A2 복합체, NY-ESO/HLA-A2 복합체, Streptag 및 CD43의 에피토프를 표적화하는 CAR 작제물을 생성한다. 실험을 이전 실시예에서와 같이 반복한다. 각각의 표적 세포와 상이한 CAR 작제물을 발현하는 Jurkat 세포의 배양은 표적 세포에 노출되지 않은 세포와 비교하여 EGFP 발현을 증가시켰다. 유사하게, 상이한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포와 GLuc를 발현하는 각각의 표적 세포의 공동 배양은 세포 사멸을 증가시켰으며, 이는 GLuc 활성의 증가에 의해 측정되는 바와 같다.
MPL을 표적화하는 TFP
항원 결합 도메인으로서 hu-161-2 scFV를 기반으로 하여 MPL을 표적화하는 수 개의 TFP 기반 CAR을 작제한다. 이들 TFP CAR 작제물의 서열은 SEQ ID NO: 3526 내지 3533에 제시되어 있다. Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) 세포를 MPL을 표적화하는 TFP CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입시키고, 퓨로마이신으로 선택한다. MPL을 표적화하는 TFP CAR을 발현하는 J-N-G 세포는 4시간 동안 HEL.92.1.7 (HEL) 세포와의 공동 배양시 EGFP 발현을 유도하는 것으로 나타났다. MPL을 표적화하는 TFP CAR을 또한 1차 T 세포에서 발현시키고, 4시간 동안 공동 배양시 HEL-GLuc 세포의 용해를 유도하는 능력에 대해 시험한다. 175, 111, hu-175-2 및 hu-111-2 scFv를 기반으로 한 MPL TFP CAR 작제물 (SEQ ID NO: 10476 내지 10483)을 hu-161-2 기반 TFP CAR. J에 대해 상기 기재된 바와 같이, J-N-G 및 1차 T 세포를 사용하여 유사하게 작제하고, 시험한다.
다른 항원을 표적화하는 TFP
다수의 상이한 항원을 표적화하는 다음 TFP CAR을 작제한다. 공자극을 제공하기 위해, 작제물은 또한 hNEMO-K277A를 공동 발현한다. 이러한 작제물을 J-N-G 및 1차 T 세포에서 발현시키고, 상기 기재된 분석을 사용하여 이들이 그의 표적 항원을 발현하는 세포를 인식하는 능력을 시험한다. TFP CAR 발현 J-N-G 세포는 그의 동족 항원을 발현하는 표적 세포와의 공동 배양시 EGFP 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 상이한 항원을 표적화하는 이들 TFP CAR을 발현하는 T 세포는 상기 기재된 GLuc 기반 세포독성 분석을 사용하여 해당 항원을 발현하는 표적 세포의 세포독성을 유도하는 것으로 나타났다. 표 a는 분석에 사용된 상이한 표적 항원을 발현하는 표적 세포주를 보여준다. 상이한 표적 항원을 발현하는 추가의 세포주는 당 업계에 공지되어 있거나, 당 업계에 공지된 기술에 의해 적절한 항원을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 실시예에서, TFP 작제물은 공자극을 제공하기 위해 hNEMO-K277A 돌연변이체를 공동 발현하는 보조 모듈을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 공자극을 제공하는 보조 모듈이 부재하거나, vFLIP K13과 같은 다른 단백질의 공동 발현을 통해 공자극을 제공하는 보조 모듈을 포함하는 TFP 작제물을 또한 작제한다. J-N-G 및 1차 T 세포에서 TFP 작제물의 발현에 의해 상기와 같이 실험을 반복하였으며, 결과는 유사하였다.
MPL을 표적화하는 Ab-TCR
항원 결합 도메인으로서 쥣과동물 161 scFV를 기반으로 하여 MPL을 표적화하는 수 개의 Ab-TCR을 작제한다. TCRα 및 TCRβ 기반 Ab-TCR의 발현을 개선시키기 위해, 특이적 돌연변이를 그의 TCR 수용체 모듈에 도입한다. TCRγ/TCRd, 야생형 TCRα/TCRβ (표지된 wt-op2) 및 돌연변이체 TCRα/TCRβ (표지된 SDVP-IAH) 포함 Ab-TCR 작제물의 서열은 SEQ ID NO: 959 내지 964에 제시되어 있다. Jurkat-NFAT-EGFP (J-N-G) 세포를 MPL을 표적화하는 Ab-TCR을 인코딩하는 렌티바이러스 (SEQ ID NO: 2091, 2397, 2703)로 형질도입시키고, 퓨로마이신으로 선택한다. MPL을 표적화하는 Ab-TCR을 발현하는 J-N-G 세포는 4시간 동안 HEL 세포와 공동 배양시 EGFP 발현을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 MPL을 표적화하는 Ab-TCR이 MPL을 인식하고, 신호전달을 활성화시키는 능력이 있음을 시사한다. MPL을 표적화하는 Ab-TCR을 또한 1차 T 세포에서 발현시키고, 이를 4시간 동안 공동 배양시 HEL-GLuc 세포의 용해를 유도하는 능력에 대해 시험한다. MPL Ab-TCR을 발현하는 T 세포는 HEL-GLuc 세포의 용해를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 GLuc 활성의 증가에 의해 측정되는 바와 같다. 쥣과동물 175 및 111 scFv를 기반으로 한 MPL Ab-TCR 작제물 (SEQ ID NO: 10492 내지 10493)을 161 기반 Ab-TCR에 대해 전술한 바와 같이 J-N-G 및 1차 T 세포를 사용하여 유사하게 작제하고 시험한다.
다른 항원을 표적화하는 Ab-TCR
다수의 상이한 항원을 표적화하는 다음 Ab-TCR을 작제한다. 공자극을 제공하기 위해, 작제물은 또한 hNEMO-K277A를 공동 발현한다. 작제물을 J-N-G 및 1 차 T 세포에서 발현시키고, 이를 상기 기재된 분석을 사용하여 그의 표적 항원을 발현하는 세포를 인식하는 능력에 대해 시험한다. J-N-G 세포를 발현하는 Ab-TCR은 그의 동족 항원을 발현하는 표적 세포와 공동 배양시 EGFP 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 상이한 항원을 표적화하는 이들 Ab-TCR을 발현하는 T 세포는 상기 기재된 GLuc 기반 세포독성 분석을 사용하여 해당 항원을 발현하는 표적 세포의 세포독성을 유도하는 것으로 나타났다. 표 a는 분석에 사용된 상이한 표적 항원을 발현하는 표적 세포주를 보여준다. 상이한 표적 항원을 발현하는 추가의 세포주는 당 업계에 공지되어 있거나, 당 업계에 공지된 기술에 의해 적절한 항원을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 실시예에서, Ab-TCR 작제물은 공자극을 제공하기 위해 hNEMO-K277A 돌연변이체를 공동-발현하는 보조 모듈을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 공자극을 제공하는 보조 모듈이 부재하거나, vFLIP K13과 같은 다른 단백질의 공동 발현을 통해 공자극을 제공하는 보조 모듈을 포함하는 Ab-TCR 작제물을 작제한다. J-N-G 및 1 차 T 세포에서 Ab-TCR 작제물의 발현에 의해 상기와 같이 실험을 반복하였으며, 그 결과는 유사하였다.
HIV-1-감염된 표적 세포에 대한 반응으로 형질도입된 CD8+ T 림프구의 CAR-매개 증식에 대한 유동 세포 측정
HIV1 외피 당단백질을 표적화하는 다수의 CAR을 생성하고, 이는 SEQ ID NO: 8704 내지 9349로 표시된다. 시험관내에서 항-HIV1 활성을 시험하기 위해 하기 분석을 사용한다. 활성 작제물을 HIV1 및 AIDS 환자의 치료를 위해 단독으로 또는 조합하여 사용한다.
가공과 관련된 수송인자 (TAP)에서의 결실로 인해 MHC 클래스 I이 적고 (문헌[Salter, et al. (1986) EMBO J 5:943-949]), HIV-1-특이적 CAR에 대해 적합한 표적 세포인 것으로 이전에 밝혀진 (문헌[Severino, et al. (2003) Virology 306:371-375]) HIV-1-감염된 T2 세포가 표적 세포로서 기능한다. 이를 vpr 좌위에서 쥣과동물 CD24에 대한 유전자 (mCD24)를 포함하는 과량의 HIV-1 NL4-3 기반 리포터 바이러스에 감염시켰고 (문헌[Ali, et al. (2003) J Virol Methods 110: 137-142]), 전술한 바와 같이, 감염 후 3일 또는 4일까지 90% 초과의 감염된 세포가 생성되었다 (문헌[Bennett, et al. (2007) J Virol 81:4973-4980; Yang, et al. (1996) J Virol 70:5799-5806; 및 Yang, et al. (1997) J Virol 71:3120-3128]). 세슘 조사기에서 10,000 rad를 사용하기 직전에 조사하고, 건강한 공여체로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (피더 PBMC)에 3,000 rad을 조사한다. HIV1-CAR 형질도입된 1차 CD8+ T 림프구를 제조사 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)의 지침에 따라 CellTrace Violet으로 표지하고, 세척한다. 48웰 플레이트 웰에서, 5 x 105개의 표지된 형질도입 세포를 5 x 105개의 조사된 감염 T2 세포 및 2 x 106개의 조사된 피더 PBMC에 첨가하고, 5일 동안 1 ml R10-50에서 배양하고, 3일 후 배지를 교체한다. 이어서, 유세포분석 (LSR Fortessa II 세포분석기, BD Biosciences)을 수행하고, 인간 CD8 (PerCP-항-인간 CD8, 카탈로그 #30130, Biolegend, San Diego, CA)에 대해 공동 염색하고, FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, Ashland, OR)를 사용하여 증식을 분석한다. HIV1-CAR-유도된 T 세포는 HIV-1-감염된 T2 세포에 노출되는 경우, 증식하는 것으로 나타났다.
바이러스 억제 분석
HIV-1의 복제를 억제하는 HIV1-CAR 형질도입된 CD8+ T 림프구 및 그의 확장 및 농축 클론의 능력을 전술한 바와 같이 시험한다 (문헌[Yang, et al. (1997) PNAS USA 94: 11478-11483; 및 Yang, et al. (1997) J Virol 71:3120-3128]). 94US_3393 IN (카탈로그 #11250), 90JJS873 (카탈로그 #11251), 96TH_NP1538 (카탈로그 #11252), 00TZ_A246 (카탈로그 #11256)을 포함하여 시험된 HIV-1 균주는 NIH AIDS 참조 및 시약으로부터 입수한 것이다. 요약하면, 인간 CCR5로 형질도입된 T1 세포를 세포당 0.1 조직 배양 감염성 투여량의 다중도로 감염시키고, 대조군으로서 효과기 세포의 부재 하에 또는 200 μl의 Rl 0-50에서 각각 5 x 104 대 1.25 x 104개의 세포의 비율로 HIV1 CAR 형질도입된 세포와 함께 96-웰 플레이트에서 공동 배양한다. 효과기 세포는 90% 초과가 형질도입된 것으로 확인되었다. 각각의 조건을 삼중 반복실험으로 수행하고, 바이러스 복제를 p24 정량적 ELISA (XpressBio, Frederick, MD)를 사용하여 모니터링한다. HIV1 CAR 세포에의 노출은 HIV1의 억제를 야기하는 것으로 나타났으며, 이는 p24 ELISA에 의해 측정되는 바와 같다.
HIV1-CAR을 발현하는 효과기 세포를 또한 감염된 CD4+ 세포에 대한 항 바이러스 활성에 대해 시험한다. T2-CCR5 세포를 1차 R5-회귀 단리물을 포함하는 HIV-1 균주 패널로 감염시키고, HIV1-CAR 형질도입된 효과기 세포의 존재 또는 부재 하에서 배양한다. 바이러스 복제를 배양 7 내지 10일 사이의 p24 항원의 측정에 의해 평가한다. 복제 억제를 효과기 세포의 부재 대 존재 하의 배양물 사이의 p24의 로지 단위의 차이로 계산하며, 효과기 세포의 부재 하의 총 복제에 대한 비율로 정규화한다.
HIV-1-감염된 표적 세포의 CAR-매개 사멸에 대한 크롬 방출 사멸 분석
상기와 같이 HIV-1 균주 NL4-3으로 감염된 T2-GLuc 세포를 상기에 기재된 바와 같이, 표준 51Cr-방출 분석을 사용하거나, Matador 분석에서 HIV1-CAR 형질도입된 1차 CD8+ T 림프구에 대한 표적 세포로서 사용한다 (문헌[Bennett, et al. (2007) J Virol 81 :4973-4980; Yang, et al. (1996) J Virol 70:5799-5806; and Bennett, et al. (2010) Aids 24:2619-2628]). 간략하게, 감염된 T2 세포 및 비감염된 대조군 T2 세포를 1시간 동안 51Cr-표지시키고, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 다양한 세포 비율로 4시간 동안 효과기 CD8+ T 림프구의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션한다. 이어서, 96웰 플레이트에서 마이크로204-신틸레이션 카운팅 (scintillation counting)에 의해 세포외 51Cr의 측정을 위해 상청액을 수확한다. 효과기 세포의 부재 하에 표적 세포에서 자발적 방출을 측정하고, 2.5% Triton X-100으로 용해된 표적 세포에서 최대 방출을 측정하였다. 특이적 용해를 다음과 같이 계산한다: (실험적 방출 크롬-자발적 방출) ÷ (최대 방출-자발적 방출).
MPL을 표적화하는 이중특이적 항체
이중특이적 항체 예컨대 이중특이적 T 세포 결합인자 (BiTE) 및 이중 친화도 재 표적화 (DART)를 사용하여, 특정 항원을 발현하는 표적 세포로 T 세포를 재 표적화할 수 있다.
항원 결합 도메인으로서 161 scFV를 기반으로 하여 MPL 표적화 기반 이중특이적 T 세포 결합인자를 작제한다. 이러한 이중특이적 작제물의 서열은 SEQ ID NO: 3736에 제시되어 있다. 이중특이적 작제물은 GGGSG-Streptagx2-태그 링커 (SEQ ID NO: 287)를 포함하지만 대안적 링커 (예를 들어 SGGGS)가 사용될 수 있다.
이중특이적 작제물을 48 내지 96시간 후에 수집된 융합 단백질을 포함하는 상청액 및 293FT 세포에서 형질감염시켰다. MPL-161 이중특이적 융합 단백질의 존재 하에 T 세포와 함께 배양된 HEL-GLuc 세포는 이중특이적 융합 단백질 단독 또는 T 세포 단독으로 배양된 세포와 비교하여 GLuc 분석에 의해 결정된 바와 같이 세포 용해가 진행되는 것으로 나타났다.
175, 111, hu-161-2, hu-175-2 및 hu-111 scFv를 기반으로 한 작제물을 인코딩하는 이중특이적 항체를 다음으로 작제하고, 이는 HEL-GLuc 세포독성 분석에서 활성을 갖는 것으로 나타난다. 마지막으로, PTK7, DLL3, TROP2, CD179a, CD179b, CD23, LAMP1, CDH1, CDH17, CD32, CDH19, HIV1-gp120 외피 당단백질 등을 포함하는 다수의 다른 항원을 표적화하는 이중특이적 항체를 유사하게 작제하고, 그의 동족 항원을 발현하는 표적 세포주와 공동 배양하는 경우, 활성을 갖는 것으로 나타난다.
도 4. MPL을 표적화하고 161-scFv 표적화 도메인을 사용하는 이중특이적 T 세포 결합인자의 활성. HEL-pLENTI-hGluc 및 T 세포를 4℃에서 2시간 동안 배지 단독으로 및 pLENTI-161-StreptagII-CD3-Myc-His-P02 (042517-P02-SC)로 다음 상청액과 별도로 사전 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 37℃에서 4시간 동안 1:1 또는 5:1의 E:T 비율로 U-바닥 96-웰 플레이트에서 공동 배양하였다. 삼중 반복실험으로 50 μl의 세포+상청액/웰을 384웰 플레이트로 옮겼다. 15 ul의 CTZ 분석 완충액 (1:100)을 사용하여 hGLuc 분석을 수행하였다.
TCRα 및 TCRβ 발현이 부재하는 Jurkat 세포에서 TFP의 발현 및 활성.
Jurkat-NFAT-GFP (J-N-G) 세포 (T 세포 림프종)를 TCRα 및 TCRβ1/β2 불변 사슬을 표적화하는 gRNA를 발현하고, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9를 공동 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시킨다. TCRα 사슬에 대한 예시적인 gRNA 표적 서열은 SEQ ID NO: 7754 및 7755에 제공된다. TCRβ1/β2 사슬에 대한 예시적인 gRNA 표적 서열은 SEQ ID NO: 7756 내지 7758에 제공된다. 대안적 실시형태에서, TCRα 및 TCRβ1/β2 불변 사슬 좌위를 문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol 4, 2017]에 기재된 바와 같이 gRNA 및 TALON을 사용하여 표적화시킨다. TCRα 또는 TCRβ1/β2 사슬의 발현이 부재하는 J-N-G 세포를 TCR/CD3 복합체에 대해 유도된 항체를 사용하여 세포 분류에 의해 정제한다. EF1α 프로모터 하에 인간 MPL에 대해 유도된 TFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 2184, 2490, 2796)를 사용하여 모 J-N-G 세포 (대조군) 및 TCRα 또는 TCRβ1/β2 사슬의 발현이 부재하는 것을 감염시킨다. 세포에서 TFP의 발현을 단백질 L 염색으로 면역 염색하고, MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질 (SEQ ID NO: 4923)로 염색함으로써 결정한다. J-N-G 모 세포는 세포 표면상에서 강력한 TFP 발현을 나타내고, TCRα 또는 TCRβ1/β2 사슬이 부재하는 J-N-G 세포는 TFP 발현이 저조하거나 부재하는 것으로 나타난다. J-N-G 세포의 상이한 집합을 24시간 동안 HEL.92.1.7 표적 세포에 노출시키고, NFAT-프로모터 유도 GFP 발현 및 IL2 생성의 증가를 조사한다. MPL-특이적 TFP를 발현하는 J-N-G 모 세포는 HEL.92.1.7 세포와의 공동 배양시 GFP 형광 및 IL2 분비의 현저한 증가를 나타낸다. 이와 달리, TCRα 또는 TCRβ1/β2 사슬의 부재 하의 MPL-특이적 TFP-발현 J-N-G 세포는 GFP 유도 및 IL2 분비가 약한 것으로 나타났다. CD19 (SEQ ID NO: 1913, 2219, 2525), CD20 (SEQ ID NO: 1945, 2251, 2557) 및 CD22 (SEQ ID NO: 1950, 2256, 2562)를 표적화하는 TFP의 발현 및 RAJI 및 Nalm6 표적 세포의 공동 배양 시, J-N-G 모 및 TCRα- 또는 TCRβ1/β2-결핍 세포로 실험을 반복하는 경우, 필수적으로 유사한 결과가 획득된다.
EF1α 프로모터 하에 코돈 최적화된 TCRα 불변 사슬 (IgSP-[hTRAC-opt2]; SEQ ID NO: 1010) 또는 TCRβ 불변 사슬 (IgSP-[hTRBC-opt2]; SEQ ID NO: 1011)를 발현하는 다음 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 상이한 J-N-G 세포 집합을 감염시킨다. gRNA 매개 유전자 녹아웃에 의해 TCRα 사슬이 파괴된 MPL-특이적 TFP-발현 J-N-G 세포에서 TCRα 불변 사슬의 발현은 HEL.92.1.7 표적 세포와의 공동 배양시 세포 표면에서 TFP의 발현 증가 및 GFP 발현 및 IL2 분비의 유도를 야기한다. 유사하게, gRNA-매개 유전자 녹아웃에 의해 TCRβ1/β2 사슬이 파괴된 MPL-특이적 TFP-발현 J-N-G 세포에서의 TCRβ 불변 사슬의 발현은 HEL.92.1.7 표적 세포와의 공동 배양시 세포 표면에서 TFP의 발현 증가 및 GFP 발현 및 IL2 분비의 유도를 야기한다.
TCRα 및 TCRβ 발현이 부재하는 Jurkat 세포에서 Ab-TCR 및 cTCR/SIR의 발현 및 활성.
인간 CD19를 표적화하는 Ab-TCR 및 SIR을 인코딩하는 발현 카세트가 CD19를 표적화하는 TFP 대신에 사용되는 것을 제외하고는 상기 실험을 반복한다. CD19를 표적화하는 Ab-TCR은 SEQ ID NO: 3124로 표시된다. CD19를 표적화하는 cTCR/SIR은 SEQ ID NO: 3878 내지 3880으로 표시된다. TCRα 또는 TCRβ1/β2 발현이 부재하는 J-N-G 세포에서 Ab-TCR, cTCR 및 SIR의 발현은 모 J-N-G 세포에서의 그의 발현과 비교하여 증가된 발현 및 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
본 개시내용의 CAR, TFP 및 Ab-TCR을 발현하는 동종이계 및 기존 T 세포
동종이계 또는 기존 CAR-T 세포를 TALON, CRISP/Cas9 또는 다른 뉴클레아제를 사용하여 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 생성한다.
MPL-특이적 TFP 카세트 (SEQ ID NO: 3527, 3529, 3531)를 TRAC 게놈 좌위로의 표적화를 위해 설계되고 TRAC 게놈 서열로부터 유래된 우측 및 좌측 상동성 아암을 포함하는 표적화 작제물에서 클로닝한다. 폴리아데닐화 서열을 TFP의 종결 코돈의 하류에 삽입한다. 표적화 작제물 및 표적화 전략의 개략도가 도 5a에 도시되어 있다. 표적화 작제물의 서열은 SEQ ID NO: 3858, 7773 및 7776에 제공된다. 표적화 작제물을 혼입 결함 렌티바이러스 벡터 (IDLV) 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에서 클로닝한다. 작제물은 당 업계에 공지된 기술에 기재된 바와 같이 CRISP/Cas9 (도 5a)를 사용하고, TRAC gRNA 서열(SEQ ID NO: 7751): 5' C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU* U* U* U-3'를 사용하여 정제된 인간 T 세포에서의 TRAC 좌위로 유도된다. 별표 (*)는 2'-O-메틸 3' 포스포로티오에이트를 나타낸다. IDLV 및 AAV를 사용하여 TRAC 좌위에 표적화 작제물을 전달하는 예시적인 기술은 각각 문헌[Knipping F et al, Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, Vol 4, 2017 and Eyquem J et al Nature, 543(7643):113-117, 2017]에 기재되어 있다. 동시에, 정제된 인간 T 세포를 또한 EF1α 프로모터 하에 해당 TFP 작제물 (SEQ ID NO: 2184, 2490, 2796)을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 이용한 통상적인 접근법을 사용하여 형질도입시켜, 상이한 TFP를 발현하는 세포를 생성한다. T 세포에서 TCRαβ 및 TFP의 발현을 각각 TCR/CD3 항체 및 단백질 L 염색에 의한 면역 염색에 의해 결정한다. MPL-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질 (SEQ ID NO: 4923)로 염색함으로써 T 세포에서의 TFP의 발현을 또한 조사한다. T 세포의 상이한 집합을 HEL.92.1.7-GLuc 표적 세포에 노출시키고, 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생성 (예를 들어, IL2), 표적 세포 용해, 노화, 고갈, 생체내 확장, 생체내 지속성 및 생체내 항 종양 활성의 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 비교한다. TFP는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 경우와 비교하여 그의 발현이 TRAC 좌위로 유도되는 경우, T 세포 표면에서의 발현의 손상 및 T 세포에서 활성 (예를 들어, T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생성 및 세포독성 등)의 감소 또는 부재를 나타낸다. 다음으로 TCRα 불변 사슬 (TRAC 사슬)의 발현이 TFP 발현 카세트에 의해 내인성 TRAC 게놈 좌위가 파괴된 T 세포에서 TFP 발현 및 신호전달 및 활성을 회복시키는데 사용될 수 있는지 시험한다. 이를 위해, 아미노 말단 신호 펩타이드 (IgSP)를 갖는 TCRα 불변 사슬을 인코딩하는 보조 모듈과 TFP를 공동 발현하는 표적화 작제물을 작제한다 (도 5b). 보조 모듈을 퓨린-SGSG-P2A 링커에 의해 TFP 인코딩 서열와 분리한다. MPL을 표적화하는 TFP 작제물과 TCRα 불변 사슬을 공동 발현하는 예시적인 표적화 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3859, 7774 및 7777에 제시되어 있다. 이들 작제물에서 TCRα 불변 사슬의 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된 것으로서, 그의 뉴클레오타이드 서열에서 내인성 TCRα 불변 사슬와 상이하다. 대안적인 실시형태에서, TRAC 사슬은 코돈 최적화된 것이며, 인간 TCRα 불변 사슬의 발현을 향상시키는 것으로 공지된 아미노산 치환을 보유한다. 내인성 TCRα 유전자의 발현이 표적화에 의해 하향 조절되거나 제거된 T 세포에서 TCR/CD3 복합체의 재 발현을 가능하게 하는데 사용될 수 있는 예시적인 외인성 TRAC 사슬의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3886 내지 3894에 제시되어 있다. 외인성 TRAC는 T 세포에서 그 자체로 발현될 수 있거나 (SEQ ID NO: 1010), 이는 단일 벡터를 사용하여 TFP 발현 카세트와 공동 발현될 수 있다.
이전에 기재된 바와 같이, MPL-특이적 TFP 작제물 (SEQ ID NO: 3858, 7773 및 7776) 및 TFP-TRAC 작제물 (SEQ ID NO: 3859, 7774, 및 7777)을 IDLV 및 AAV 벡터에서 클로닝하고, TRAC 좌위로 유도한다.
작제물을 발현하는 세포를 HEL.92.1.7-GLuc 표적 세포에 노출시키고, 상기 기재된 바와 같이 기능 분석으로 시험한다. TFP-TRAC 작제물이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 TFP 작제물 단독으로 (즉, 외인성 TRAC 사슬의 공동 발현이 부재함) TRAC 좌위로 유도된 T 세포와 비교하여 세포 표면에서 TFP의 더 우수한 발현을 나타낸다. 또한, TFP-TRAC 작제물이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 TFP 작제물 단독으로 (즉, 외인성 TRAC 사슬의 공동 발현이 부재함) TRAC 좌위로 유도된 T 세포와 비교하여 더 큰 증식, 활성화, 사이토카인 (예를 들어, IL2 및 TNFα) 생성, 세포독성, 생체내 확장, 표적 세포에 대한 생체내 항 종양 활성을 나타낸다.
TFP의 발현 및 활성은 또한 TFP 카세트 다음으로 2A 절단 가능한 링커, 신호 펩타이드 (예를 들어, CD8 신호 펩타이드 또는 IgH 신호 펩타이드) 및 TCRα 사슬 (TRAC)의 제1 엑손이 프레임 내에 후행하는 표적화 카세트를 설계함으로써, 내인성 TRAC 좌위가 파괴된 T 세포에서 복원된다 (도 5c). 예시적인 표적화 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3860, 7775 및 7778에 제시되어 있다. 이 실시형태에서, TRAC 단백질은 세포 표면 발현이 표적화 카세트에 제공된 신호 펩타이드에 의해 촉진되는 내인성 TRAC 사슬에 의해 생성된다.
천연 TCRα 사슬의 발현이 부재하지만, TCRα 불변 사슬의 발현에 의해 TFP 세포 표면 발현 및 활성이 회복된 TFP-TRAC-발현 T 세포의 동종이계 반응성을 동종이계 공여체로부터 유래된 조사된 T 세포를 사용하여 혼합 림프구 배양 반응을 사용하여 시험한다. 천연 TCRα의 발현이 부재하는 TFP-TRAC-발현 T 세포는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 TFP가 발현되는 T 세포와 비교하여, 증식 반응에 의해 측정되는 바와 같이, 동종이계 반응성의 현저한 감소 내지 부재를 나타낸다. 천연 TCRα의 발현이 부재하는 TFP-TRAC-발현 인간 T 세포가 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 동물당 5백만개의 TFP-TRAC-발현 TCRα-결핍 T 세포를 면역 결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 투여함으로써 조사한다. 동물을 90일 이상 동안 관찰한다. TFP-TRAC-카세트가 TRAC 좌위로 유도된 인간 T 세포는 면역 결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 주입되는 경우, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 현저한 감소 내지 부재를 나타내고, TFP가 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 T 세포가 제공된 동물에서는 GVHD가 관찰된다. 또한, 림프구 고갈 화학요법이 제공된 동종이계 인간 수용체에 킬로그램당 1백만개의 세포의 투여에 의해, TFP-TRAC-발현 TCRα-결핍 T 인간 T 세포가 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 조사한다. TFP-TRAC 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 동종이계 T 세포는 동종이계 수용체에게 제공되는 경우, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 발생률 및 중증도가 현저하게 감소되는 것으로 나타난다.
TFP가 TRBC 좌위로 유도된 T 세포로 실험을 반복하는 경우, 필수적으로 유사한 결과가 획득된다. TRBC를 표적화하는 gRNA의 표적 서열은 SEQ ID NO: 7756 내지 7758에 제시되어 있다. 이들 gRNA를 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 스트렙토코커스 파이오제네스 (Streptococcuc Pyogenes) Cas9와 조합하여 사용한다. TFP 발현 카세트를 TRBC 게놈 좌위로 유도하는 것은 MPL-특이적 TFP의 활성의 손상을 초래하는 것으로 나타난다. 그러나, TFP의 활성은 외인성 TCRβ 불변 사슬 (TRBC)의 공동 발현에 의해 회복된다. TCR/CD3 복합체 신호전달 기능을 회복 시키는데 사용될 수 있는 예시적인 외인성 TRBC 사슬의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3899 내지 3910에 제시되어 있다. 외인성 TRBC는 T 세포에서 그 자체로 발현될 수 있거나 (SEQ ID NO: 1011), 이는 단일 벡터로부터 TFP 발현 카세트와 공동 발현될 수 있다. MPL을 표적화하는 TFP 작제물과 TRBC 사슬을 공동 발현하는 예시적인 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3537, 3539 및 3541에 제시되어 있다. 이들 TFP 발현 작제물은 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 적합한 TRBC 표적화 벡터에서 클로닝될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, TFP의 발현 및 활성은 TFP 카세트 다음으로 2A 절단 가능한 링커, 신호 펩타이드 (예를 들어, CD8 신호 펩타이드 또는 IgH 신호 펩타이드) 및 TCRα 사슬 (TRAC)의 제1 엑손이 프레임 내에 후행하는 표적화 카세트를 설계함으로써, 내인성 TRAC 좌위가 파괴된 T 세포에서 복원될 수 있다.
TRAC 좌위로의 Ab-TCR 작제물의 유도
FMC63 scFv를 기반으로 한 CD19를 표적화하는 2개의 Ab-TCR 작제물을 EF1α 프로모터에 의해 유도되는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 3837)에서 생성한다. 이들 작제물의 뉴클레오타이드 서열,CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD] 및 CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]는 SEQ ID NO: 3124 및 3324의 Ab-TCR 성분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 표시된다. 1차 인간 T 세포를 해당 렌티바이러스 상청액으로 감염시키고, FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 상청액을 사용하여 Ab-TCR (SEQ ID NO: 1014)의 세포 표면 발현 및 RAJI-GLuc 세포에 대한 세포독성에 대해 분석한다. Ab-TCR을 발현하는 T 세포는 적정한 발현 및 활성을 나타낸다. Ab-TCR의 발현은 유전자 표적화 작제물 (도 6 참조)을 사용하여 필수적으로 문헌[Eyquem J et al (Nature, 543(7643):113-117, 2017]에 의해 기재된 TRAC 좌위로 유도되고, 이는 SEQ ID NO: 3861 내지 3864로 표시된다. 표적화 작제물은 스플라이싱 수용체 (SA), 이어서 F2A 코딩 서열, Ab-TCR 카세트, 이에 측접된 TRAC 좌위 (LHA 및 RHA, 좌 및 우 상동성 아암)와 상동성인 서열을 포함한다. 카세트 A 및 B (SEQ ID NO: 3861 내지 3862)에서, Ab-TCR 발현 카세트를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 다음으로 종결 코돈, 폴리A 서열, TRAC의 엑손 1 및 TRAC 좌위와 상동성인 서열 (RHA: 우측 상동성 아암)이 후행한다. 카세트 C에서, Ab-TCR 발현 카세트를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 다음으로 종결 코돈, TRAC의 엑손 1 및 TRAC 좌위와 상동성인 서열 (RHA: 우측 상동성 아암)이 후행하지만, 폴리A 서열이 부재하여, 전사체가 3'말단에서 TRAC 유전자 및 그의 폴리아데닐화 서열을 보유한다. 카세트 D에서, Ab-TCR 카세트는 자체 TCRα 모듈이 부재하고, IgG1-CH1 영역까지만 연장되며, 이는 TRAC의 제1 엑손의 3' 절반에 프레임 내에 융합된다. 따라서, 이 작제물에서, TCRα 모듈은 엑손 1의 일부, 및 엑손 2 및 엑손 3의 전체를 포함하는 게놈 TRAC 좌위에 의해 인코딩된다. 카세트 E는 표적화 작제물내의 RHA가 돌연변이 (SDVP)를 보유하는 것을 제외하고는 카세트 D와 유사하며, 이는 TRAC의 발현을 향상시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 Ab-TCR 카세트와 비교하여, Ab-TCR 카세트가 TRAC 좌위로 유도되는 T 세포는 생체내 및 시험관내 분석을 사용하여 결정되는 바와 같이, 전이유전자의 균일한 생리학적 발현 및 장기 지속성 및 활성을 나타낸다. Ab-TCR 발현 T 세포를 PE-단백질 L로 염색한 후 유동 분류함으로써 정제한다. Ab-TCR-발현 T 세포의 동종이계 반응성을 동종이계 공여체로부터 유래된 조사된 T 세포를 사용하여 혼합 림프구 배양 반응을 사용하여 시험한다. Ab-TCR이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 Ab-TCR이 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 T 세포와 비교하여 증식 반응에 의해 측정된 바와 같이 동종이계 반응성의 현저한 감소 내지 부재를 나타낸다. Ab-TCR 발현 인간 T 세포가 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 동물당 5백만개의 Ab-TCR 발현 T 세포를 면역 결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 투여함으로써 조사한다. 동물을 90일 이상 동안 관찰한다. 면역결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 주입되는 경우, Ab-TCR 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 인간 T 세포는 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 현저한 감소 내지 부재를 나타내며, Ab-TCR이 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 T 세포가 제공된 동물에서는 GVHD가 관찰된다. 또한, 동종이계 인간 수용체에 Ab-TCR 발현 T 세포 (킬로그램당 1백만개의 세포)의 투여에 의해, Ab-TCR 발현 인간 T 세포가 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 조사한다. Ab-TCR 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 동종이계 T 세포는 동종이계 수용체에 제공되는 경우, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 발생률 및 중증도의 현저한 감소를 나타낸다. 발현 카세트를 TRBC 좌위로 유도함으로써, Ab-TCR이 발현되는 T 세포를 사용하여 필수적으로 유사한 결과가 획득된다.
TRAC 좌위로의 키메라 TCR 또는 합성 면역 수용체 (SIR) 작제물의 유도
FMC63 scFv를 기반으로 한 CD19를 표적화하는 3개의 cTCR (또는 SIR) 작제물을 EF1α 프로모터에 의해 유도되는 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 3837)에서 생성한다. 이들 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 각각 SEQ ID NO: 3878, 3879 및 3880으로 표시된다. 이는 모두 동일한 vL 및 vH 영역을 갖는다. SEQ ID NO: 3880은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬의 야생형 뉴클레오타이드 서열을 나타내지만, SEQ ID NO: 3878 및 3879는 코돈 최적화된 서열을 나타낸다. SEQ ID NO: 3878은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬의 발현 및 염기쌍 형성을 향상시키는 수 개의 아미노산 치환을 추가로 보유한다. 1차 인간 T 세포를 해당 렌티바이러스 상청액으로 감염시키고, FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 상청액을 사용하여 SIR (SEQ ID NO: 1014)의 세포 표면 발현 및 RAJI-GLuc 세포에 대한 세포독성에 대해 분석한다. SEQ ID NO: 3880을 갖는 cTCR/SIR 작제물은 잘 발현되거나 표적 세포 용해를 유도하는 것으로 나타나지 않는다. cTCR/SIR은 또한 필수적으로 SEQ ID NO: 3865 to 3868, 및 3873으로 표시되는 예시적 유전자 표적화 작제물 (도 7 참조)을 사용하여, 문헌[Eyquem J et al (Nature, 543(7643):113-117, 2017)]에 기재된 바와 같이 TRAC 좌위로 유도된다. 표적화 작제물은 스플라이싱 수용체 (SA) 다음으로 F2A 코딩 서열, Ab-TCR 카세트, 이에 측접하는 TRAC 좌위와 상동성인 서열 (LHA 및 RHA, 좌 및 우 상동성 아암)을 포함한다. 카세트 A 및 B (SEQ ID NO: 3865, 3866 및 3873)에서, SIR 발현 카세트를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 다음으로 종결 코돈, 폴리A 서열, TRAC의 엑손 1 및 TRAC 좌위와 상동성인 서열 (RHA: 우측 상동성 아암)이 후행한다. 카세트 E에서, SIR 발현 카세트를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 다음으로 종결 코돈, TRAC의 엑손 1 및 TRAC 좌위와 상동성인 서열 (RHA: 우측 상동성 아암)이 후행하지만, 개재된 폴리A 서열이 부재하여, 전사체는 그의 3' 말단에 TRAC 유전자 및 그의 폴리아데닐화 서열을 보유한다. 카세트 D에서, SIR 카세트는 자체 TCRα 모듈이 부재하고, FMC63-vH 영역까지만 연장되며, 이는 표적화 작제물에 존재하는 TRAC의 제1 엑손에 프레임 내에 융합된다. 따라서,이 작제물에서, TCRα 모듈은 엑손 1의 일부 및 엑손 2 및 3의 전체를 포함하는 게놈 TRAC 좌위에 의해 인코딩된다. 카세트 F는 표적화 작제물에서의 RHA가 TRAC의 엑손 1 및 2에 돌연변이 (CSDVP)를 보유하는 것을 제외하고 카세트 E와 유사하며, 이는 TRAC의 발현을 향상시킬 수 있다. cTCR/SIR 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 T 세포 (SEQ ID NO: 3873)는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 cTCR/SIR 카세트와 비교하여, 생체내 및 시험관내 분석을 사용하여 결정된 바와 같이 전이유전자의 균일한 생리학적 발현 및 장기 지속성 및 활성을 나타낸다. 다른 cTCR (SEQ ID NO: 3865 내지 3868)은 또한 TRAC 좌위로 유도되는 경우, 균일한 발현 및 활성을 나타낸다. cTCR 및 SIR 발현 T 세포를 FITC 접합된 CD3 항체 및 PE-단백질 L로 염색한 후 유동 분류함으로써 정제한다. cTCR- 및 SIR-발현 T 세포의 동종이계 반응성을 동종이계 공여체로부터 유래된 조사된 T 세포를 사용하여 혼합 림프구 배양 반응을 사용하여 시험한다. cTCR/SIR이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 cTCR/SIR이 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 T 세포와 비교하여 증식 반응에 의해 측정되는 바와 같이, 동종이계 반응성의 현저한 감소 내지 부재를 나타낸다. cTCR/SIR 발현 인간 T 세포가 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 동물당 5백만개의 cTCR/SIR 발현 T 세포를 면역결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 투여함으로써 조사한다. 동물을 90일 이상 동안 관찰한다. cTCR/SIR 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 인간 T 세포는 면역 결핍 NSG 마우스 (Jackson Lab)에 주입되는 경우, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 현저한 감소 내지 부재를 나타내며, cTCR/SIR이 렌티바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 T 세포가 제공된 동물에서는 GVHD가 관찰된다. 림프구 고갈 화학요법이 제공된 동종이계 인간 수용체에 cTCR/SIR 발현 T 세포 (킬로그램당 1백만개의 세포)의 투여에 의해, cTCR 및 SIR 발현 인간 T 세포가 이식편 숙주 질병 (GVHD)을 유도하는 능력을 또한 조사한다. cTCR/SIR 카세트가 TRAC 좌위로 유도된 동종이계 T 세포는 동종이계 수용체에게 제공되는 경우, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD)의 발생률 및 중증도가 현저하게 감소되는 것으로 나타난다. 발현 카세트를 TRBC 좌위로 유도함으로써, cTCR 및 SIR이 발현되는 T 세포를 사용하여 필수적으로 유사한 결과가 획득된다.
TRAC 좌위로의 TCR 또는 cTCR/SIR 작제물의 유도
NY-ESO-1/HLA-A2 복합체를 표적화하는 TCR 작제물 및 cTCR (또는 SIR) 작제물을 렌티바이러스 벡터 (SEQ ID NO: 3837)에서 생성하고, 이는 TCR NYESO-1G4 및 TCR 모방 항체 NYESO-35-15를 기반으로 한다. 이들 작제물의 뉴클레오타이드 서열은 각각 SEQ ID NO: 3883 및 3882로 표시된다. 2개의 작제물을 또한 SEQ ID NO: 3874 내지 3877로 표시된 표적화 작제물을 사용하여 TRAC 유전자 좌위로 표적화한다. 표적화 작제물의 설계는 도 8에 도시되어 있다. NY-ESO-1 TCR 또는 cTCR이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 전이유전자의 균일한 발현, NY-ESO-1/HLA-A2 복합체를 발현하는 표적 세포의 우수한 인식을 나타내고, 생체내 분석을 사용하여, 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 상기 작제물이 발현되는 T 세포와 동일하거나 더 우수하게 수행된다. NY-ESO-1 TCR 또는 cTCR이 TRAC 좌위로 유도된 인간 T 세포는 또한 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 NY-ESO-1 또는 cTCR이 발현되는 T 세포와 비교하여, NSG 마우스 이종이식 모델에서 혼합 림프구 반응에서 감소된 동종이계 반응성 및 감소된 GVHD를 나타낸다.
TRAC 좌위로의 단일 사슬 cTCR/SIR 작제물의 유도
FMC63-scFv가 코돈 최적화된 TCRa 불변 사슬 또는 코돈 최적화된 플러스 쥣과동물화된 TCRa 불변 사슬에 부착된 단일 사슬 cTCR/SIR (SEQ ID NO: 3881)을 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포에서 발현시키고, 이는 저조한 발현 및 활성을 나타낸다. 동일한 작제물은 도 9에 도시된 표적화 작제물을 사용하여 TRAC 좌위에 유도되며, 이는 SEQ ID NO: 3869 내지 3872로 표시된다. 단일 사슬 cTCR/SIR이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 전술한 분석을 사용하여 분석하는 경우, cTCR의 균일한 발현 및 활성을 나타낸다. 또한, 단일 사슬 cTCR/SIR이 TRAC 좌위로 유도된 T 세포는 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 NY-ESO-1 또는 cTCR이 발현되는 T 세포와 비교하여, NSG 마우스 이종이식 모델을 사용한 경우, GVHD의 발생률의 감소 및 MLR을 사용한 경우, 동종이계 반응성의 발생률의 감소를 나타낸다.
상기 실시예에서, CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCR은 TRAC 좌위로 유도된다. 필수적으로 유사한 절차를 사용하여 CAR/TFP/Ab-TCR/TCR/cTCR 또는 보조 모듈을 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 TCBC, CD3ε, CD3δ, CD3γ, 및 CD3ζ 좌위로 유도할 수 있다.
더 짧은 EF1α 프로모터는 T 세포에서 강한 프로모터 활성을 보유하고, 입양 세포 요법에 적합하다.
입양 세포 요법 적용에서 강한 바이러스 프로모터의 사용은 하류 암유전자의 활성화 및 암의 발병 위험을 수반한다. 이와 같이, 인간 신장 인자 1α (EF1α) 프로모터는 강한 발현을 제공하고 인간 유래이기 때문에 입양 세포 요법 적용에 종종 사용된다. 그러나, EF1α 프로모터의 제한은 그 크기가 비교적 크다는 것이다. 미니-EF1α 프로모터가 기재되었지만, EF1α 프로모터와 비교하여 훨씬 더 약하다. EF1α 프로모터에서의 내부 결실에 의해 그 길이를 단축시키면서 그의 프로모터 강도를 유지할 수 있는지를 결정하기 위해, SacII 단편을 EF1α 프로모터로부터 결실시켰다. 생성된 EF1α-D-SacII 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 3842에 제시되어 있다. 야생형 EF1α 프로모터 (SEQ ID NO: 3840) 또는 EF1α-D-SacII 프로모터 (SEQ ID NO: 3839)를 갖는 벡터에서 CD19-유도 FMC63-BBz CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터를 작제하였다. 상기 벡터는 또한 2A 링커를 통해 EGFP 및 블라스티시딘 내성 유전자를 공동 발현시켰다. 렌티바이러스를 293FT 세포에서 생성하고, J-N-G 세포를 감염시키는데 사용하였다. 감염된 세포를 블라스티시딘으로 선택한 후, 이들이 CD19+ve RAJI 세포와의 공동 배양시 EGFP 발현을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 렌티바이러스 작제물로 형질도입된 J-N-G 세포에서 EGFP 발현의 거의 균등한 유도가 관찰되었다. 또한, FMC63-BBz CAR의 거의 균등한 발현이 어느 하나의 작제물로 형질도입된 J-N-G 세포의 표면에서 관찰되었으며, 이는 CD19-ECD-GGS-NLuc 융합 단백질과의 결합에 의해 결정되는 바와 같다. 이들 결과는 EF1α-D-SacII 프로모터가 입양 세포 요법 적용에 사용될 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 또한 EF1α-D-SacII 프로모터가 야생형 EF1α 프로모터보다 침묵화 경향이 더 적으며, 장기 전이유전자 발현에 사용될 수 있음을 추가로 시사한다.
입양 세포 요법 동안 관찰되는 사이토카인 방출 증후군 및 신경학적 합병증의 제어를 위한 수용성 다사티닙 염의 사용
다사티닙은 난용성 약물이고, 시판 다사티닙은 일수화물로서, 24℃에서 8 μg/mL의 용해도를 갖는 것으로 보고되어 있다. CRS 및 신경학적 합병증을 가진 환자는 다사티닙의 경구 형태를 복용하는데 어려움이 있으므로, 수용성 형태의 다사티닙이 바람직하다. 다사티닙의 수용성 염은 WO2015107545 A1에 기재되어 있다. 다사티닙 메탄 술포네이트 일수화물의 가용성 염을 포함하는 주사용 조성물을 WO2015107545 A1의 방법에 따라 제조할 수 있으며, CAR-T 세포 및 블리나투모맙의 투여와 관련된 신경학적 합병증 및 CRS 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 효과적인 혈장 농도를 달성하기 위해 다사티닙 메탄 술포네이트 일수화물의 투여량을 적정할 수 있다. 예시적 실시형태에서, 다사티닙의 혈장 농도는 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 또는 300 nM보다 더 높게 유지된다. 다른 예시적인 실시형태에서, 다사티닙의 혈장 농도는 5 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml 또는 75 ng/ml보다 더 높게 유지된다. 마지막으로, 또한 정상 식염수에 용해된 다사티닙 메탄 술포네이트 일수화물을 CAR-T 세포 및 블리나투모맙으로부터의 신경학적 합병증을 가진 환자에서 척수강내 투여에 사용할 수 있다. 예시적 실시형태에서, 다사티닙 메탄 술포네이트의 척수강내 투여량을 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 또는 300 nM 초과의 CSF 농도를 달성하도록 조정한다. 예시적인 실시형태에서, 다사티닙 메탄 술포네이트의 척수강내 투여량을 5 ng/ml, 15 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml 또는 75 ng/ml 초과의 CSF 농도를 달성하도록 조정한다.
입양 세포 요법을 위한 다수의 항원을 표적화하는 통상적인 CAR 및 백본 1 내지 72를 발현하는 자가유래 T 세포의 사용
감염성 질병 (예를 들어, HIV1, EBB, CMV, HTLV1 등), 퇴행성 질병 (예를 들어, 알츠하이머병), 알레르기 질병 (예를 들어, 만성 특발성 두드러기) 및 다수의 암을 포함하는 많은 상이한 질병을 가진 환자가 상이한 질병 유발 또는 질병 관련 항원을 표적화하는 NEMO-K277A (백본 2)를 공동 발현하는 입양 전달 자가유래 CAR-T 세포에 의한 면역요법의 IRB 승인 단계 I 임상 시험에 등록한다. 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 그의 표적 항원의 공지된 발현을 기반으로 하여 상이한 질병에 대한 CAR을 선택한다. 가능한 경우, CAR의 항원 결합 도메인이 가요성 링커를 통해 비-분비 형태의 NLuc 단백질에 융합된 항원 결합 도메인-GGS-NLuc 융합 단백질과의 결합에 의해 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 CAR 표적의 발현을 확인한다. 대안적으로, 시판되는 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 유세포분석을 사용하여 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 CAR의 표적 항원의 발현을 확인한다. 백혈구 채집술을 사용하여 T 세포를 대상체로부터 수집하고, 적절한 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 폐쇄 시스템에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 생체외에서 확장한다. 생성된 세포 산물에서 특질 제어 시험 (불임 및 종양 특이적 세포독성 시험 포함)을 진행시킨 후, 이를 동결 보존한다. CAR-T 세포 산물을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 대상체에 투여한다. 그런 다음 의사의 재량에 따라 임상 및 실험 관련 후속 연구를 수행할 수 있다. 필수적으로 유사한 접근법을 사용하여, 본 개시에 기재된 다른 백본에서 CAR을 시험한다.
입양 세포 요법을 위한 다수의 항원을 표적화하는 통상적인 CAR 및 백본 1 내지 72를 발현하는 동종이계 T 세포의 사용
감염성 질병 (예를 들어, HIV1, EBB, CMV, HTLV1 등), 퇴행성 질병 (예를 들어, 알츠하이머병), 알레르기 질병 (예를 들어, 만성 특발성 두드러기) 및 다수의 암을 포함하는 많은 상이한 질병을 가진 환자가 상이한 질병 유발 또는 질병 관련 항원을 표적화하는 입양 전달 동종이계 CAR-T 세포에 의한 면역요법의 IRB 승인 단계 I 임상 시험에 등록한다. 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 그의 표적 항원의 공지된 발현을 기반으로 하여 상이한 질병에 대한 CAR을 선택한다. 가능한 경우, CAR의 항원 결합 도메인이 가요성 링커를 통해 비-분비 형태의 NLuc 단백질에 융합된 항원 결합 도메인-GGS-NLuc 융합 단백질과의 결합에 의해 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 CAR 표적의 발현을 확인한다. 대안적으로, 시판되는 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 유세포분석을 사용하여 질병 유발 또는 질병 관련 세포에서 CAR의 표적 항원의 발현을 확인한다. 백혈구 채집술을 사용하여 T 세포를 건강한 공여체로부터 수집한다. CAR 발현 카세트 (SEQ ID NO: 1900 내지 SEQ ID NO: 2205)를 표적화 벡터에 클로닝하고, CAR 모듈을 필수적으로 (문헌[Eyquem J et al, Nature, 543(7643):113-117])에 기재된 바와 같이 T 세포에서 TRAC 좌위로 유도한다. 표면 상에 CD3 발현이 부재하는 T 세포를 면역 자기 정제에 의해 선택한 후, 폐쇄 시스템에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 생체외에서 확장시킨다. 생성된 세포 산물에서 특질 제어 시험 (불임 및 종양 특이적 세포독성 시험 포함)을 진행시킨 후, 이를 동결 보존한다. CAR-T 세포 산물을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 대상체에 투여한다. 그런 다음 의사의 재량에 따라 임상 및 실험 관련 후속 연구를 수행할 수 있다. 필수적으로 유사한 접근법을 사용하여, 본 개시내용에 기재된 Vα 도메인이 부재하는 TCRα 불변 사슬 (TRAC)을 공동 발현하는 CAR을 포함하여 다른 백본에서 CAR을 시험한다.
CAR-T 세포 간 동맥 주입
정맥내 주입에 추가하여, 본 발명에 기재된 통상적인 CAR 및 백본 1 내지 72를 발현하는 T 세포를 동맥내로 주입하여, 질병과 관련된 국소 영역 또는 기관에서 고농도의 CAR-T 세포를 제공할 수 있다. 다음의 예에서, 이 접근법은 엽산 수용체 알파 (FR1)를 발현하는 위장암으로 인한 간 전이 환자의 경우에 사용된다. 필수적으로 유사한 접근법이 다른 종양 항원을 표적화하는 통상의 CAR 및 백본 1 내지 72를 발현하는 T 세포의 동맥내 주입에 사용될 수 있다.
맵핑 혈관 조영을 기준선에서 일반적인 우측 대퇴 동맥 접근법을 통해 수행한다. 간외 관류의 다른 잠재적인 공급원 외에 위 십이지장 및 우측 위 동맥을 미세 코일로 색전화한다. 작제물 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1727)를 발현하는 T 세포의 투여를 위해 동일한 동맥 접근 절차를 수행한다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이 T 세포를 0일에 환자로부터 수집하고, 작제물 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC를 인코딩하는 렌티바이러스로 감염시키고, 확장시킨다. CAR-T 세포를 14일 (107개의 CAR-T 세포), 28일 (108개의 CAR-T 세포) 및 44일 (109개의 CAR-T 세포)째에 투여량 증가 방식으로 제공한다. CAR-T 세포를 2 cc/초 미만의 속도로 60 cc 주사기를 통해 수동으로 주사한다. 총 주입 부피는 약 100 cc이다. 50 cc를 처음 주입한 후 CAR-T 주입을 완료한 후에 보정된 조영률의 혈관 조영술을 수행하여, 보존된 동맥류를 확인한다. 가능하면 적절한 간동맥으로 주입한다. 특정 환자는 우측 또는 좌측 간 동맥이 적절한 간 동맥에서 생성되지 않는 이상 간 동맥 구조를 가질 수 있다. 이러한 경우, CAR-T 세포의 투여량을 엽성 부피 계산을 기반으로 하여 분할한다. 이러한 경우에, 양쪽 간엽에 비례적인 CAR-T 전달을 보장하기 위해 분할 투여량을 우측 및 좌측 간 동맥으로 개별적으로 전달한다.
CAR-T 세포의 복강내 투여
CAR-T 세포를 또한 필수적으로 문헌[Koneru M et al (Journal of Translational Medicine; 2015; 13:102)]에 기재된 바와 같이 복강내 투여할 수 있다. 다음 실시예에서, 이 접근법을 엽산 수용체 알파 (FR1)를 발현하는 난소암에 복막 관련 환자에서 사용한다. 필수적으로 유사한 접근법을 본 개시내용에 기재된 다른 종양 항원을 표적화하는 CAR-T 세포의 복강내 주입에 사용할 수 있다.
FR1의 발현에 대한 그의 암을 시험하기 위해 재발성 고 등급 장액 난소암 환자에 스크리닝 정보 동의를 제공한다. 면역조직화학에 의해 FR1의 발현이 확인된 후, 환자는 말초 혈액으로부터 획득된 백혈구 채집술 산물을 갖는다. 백혈구 채집술 산물로부터 과량의 혈소판 및 적혈구 오염을 제거하고, 산물을 동결한다. 연구의 치료 단계에서, 백혈구 채집술 산물을 해동하고, 세척한다. 이어서, CD3/CD28 비드를 이용한 자기 분리에 의해 해동된 백혈구 채집술 산물로부터 CD3+ T 세포를 단리한다. 활성화된 T 세포를 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC 작제물로 렌티바이러스에 의해 형질도입하고, CD3/CD28 비드 확장 프로토콜을 사용하여 추가로 확장시킨다.
저장 (파라핀 포매) 또는 새로 생검된 종양의 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 확인된 FR1 항원을 발현하는 것으로 나타난 재발성 고 등급 장액 난소, 원발성 복막 또는 난관 암종을 갖는 환자가 잠재적으로 본 연구에 적합하다.
단계 I 투여량-증가 투여를 본 시험에 사용한다. 최대 내성 투여량 (MTD)을 설정하기 위해 3 내지 6명의 환자 코호트에 증가 투여량의 변형 T 세포를 주입한다. 계획된 투여량 수준은 3 Х 105, 1 Х 106, 3 Х 106, 및 1 Х 107 CAR-T 세포/kg이다. 코호트 I 및 II에 3 x 105 CAR-T 세포/kg으로 처리하고, 코호트 II의 환자에는 또한 림프구 고갈 사이클로포스파미드를 제공한다. 코호트 II 내지 V에 사이클로포스파미드로 전처리한 후 증가 투여량의 변형된 T 세포를 제공한다. 750 mg/m2로 투여된 림프구 고갈 사이클로포스파미드를 초기 T 세포 주입 2 내지 4일 전에 투여한다. 표준 3 + 3 투여량 상승 계획을 준수한다.
T 세포 주입 전에 IP 카테터를 배치한다. CAR T 세포의 첫 주입 전에 환자는 병원의 환자 입원실에 입원하고, CAR T 세포의 두 번째 주입 후 적어도 3일째까지 입원 상태를 유지한다. 치료될 제1 코호트 환자 및 각각의 후속 코호트에서 치료된 제1 환자는 중환자실 (ICU)에 입원하고; 후속 환자는 의료 종양학 입원 환자 서비스에 입원할 수 있다 (치료 의사의 임상적 판단에 따름).
환자에 CAR-변형된 T 세포로 치료를 개시하기 2 내지 4일 전에 단일 투여량의 림프구 고갈 사이클로포스파미드 (750 mg/m2 IV) 화학 요법을 제공한다. 형질도입된 T 세포를 주입 전에 수, 순도, 생존률 및 멸균성에 대해 특질 시험한다. 모든 환자에 유전자 변형된 T 세포 투여량의 50%를 정맥내로 제공한다. 독성에 대해 환자를 면밀히 모니터링한다. 1 내지 3일 후, 남은 투여량의 T 세포를 IP 주입으로 투여한다. 적어도 3명의 환자를 투여얄 수준 1로 치료하고, 각 투여량 수준 내에서 한 달에 2명 이하의 환자가 추가된다. 선행 코호트에서 치료된 모든 환자를 다음 코호트로의 진행 전에 초기 T 세포 주입 일로부터 최소 4주 동안 관찰한다. 유전자 변형된 T 세포의 독성, 치료 효과 및 생존을 평가하기 위해 치료 전 및 후에 모든 환자로부터 혈액 샘플을 채혈한다.
종양내 주사를 위한 CAR-T 세포의 사용
CAR-T 세포를 또한 필수적으로 문헌[Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072]에 기재된 바와 같이 종양내 투여할 수 있다. 다음의 실시예에서, 이 접근법을 IL13Ra2를 발현하는 재발성 교모세포종 (GBM) 환자의 경우에 사용한다. 필수적으로 유사한 접근법을 통상의 CAR을 발현하는 T 세포 또는 다른 종양 항원을 표적화하는 통상의 CAR 발현 보조 모듈 (백본 1 내지 72)을 종양내 주사하는데 사용할 수 있다.
재발성 GBM에서 T 세포를 발현하는 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1769)를 시험하기 위해, 파일럿 안전성 및 타당성 연구를 수행한다. 참여하는 모든 환자는 서면 정보 동의서를 제공해야 한다. 임상 프로토콜은 University of Southern California Institutional Review Board의 승인을 받고, Investigational New Drug Application 하에 수행하며, ClinicalTrials.gov에 등록한다. 적격 환자는 재발성 또는 불응성 단초점 천막상 등급 III 또는 IV 신경교종을 갖는 성인 (18 내지 70세)을 포함하고, 종양이 심실/CSF 경로와 소통되는 것으로 나타나지 않으며, 이를 절제할 수 있다. 이 시험에의 참여는 IL13Rα2 (또는 IL13Ra2) 종양 항원 상태와 무관하다. 환자는 고 등급 신경교종 (WHO 등급 III 또는 IV)의 초기 진단 후에 등록하며, 이때 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 수집을 위해 백혈구 채집술을 진행한다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이, 해당 렌티바이러스 벡터로 감염 후, 퓨모마이신 저항성 유전자 (PAC)를 포함하는 작제물 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC를 발현하도록 T 세포를 조작하는데 이들 세포를 사용한다. 대안적으로, CAR-T 세포를 레트로바이러스 벡터에 의한 감염 후 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포손을 사용하거나 IVT mRNA의 형질감염에 의해 생성할 수 있다. 후속하여, 방출 시험된 치료적 CAR-T 세포를 동결보존하고, 추후 사용을 위해 저장한다. 종양이 처음 재발될 때, 연구 참가자는 Rickham 저장소/카테터의 배치와 함께 종양의 절제를 받는다. 동시에, CD3/CD28 비드 기반 급속 확장 프로토콜을 사용하여 치료적 CAR-T 세포를 해동하고, 시험관내에서 재확장시킨다. 수술 회복 후 및 기준선 MR 영상 후, CAR-T 세포를 필수적으로 (문헌[Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 2015 21(18): 4062-4072])에 기재된 바와 같이 유치 카테터를 통해 절개 강내로 직접 투여한다. 21 게이지 버터플라이 바늘을 사용하여 세포를 Rickham 저장소에 수동으로 주입하여 5 내지 10분 동안 2 mL 부피를 전달한 다음, 5분 동안 보존제가 무함유된 일반 식염수로 2 mL 플러싱을 수행한다. 프로토콜 치료 계획은 환자내 투여량 증가 계획을 명시할 것이며, 이는 12회의 CAR T 세포 투여량을 매주 치료 사이클로 구성된 5주 기간 동안 두개내 투여하는 것을 목표로 한다. 사이클 1, 2, 4 및 5 동안, T 세포 주입을 사이클 주의 1, 3 및 5일에 수행하고, 3주는 휴식 사이클이다. 안전성을 위해, 사이클 1에서, 107, 5 Х 107 및 108 세포/주입의 CAR T 세포 투여량을 각각 1, 3 및 5일에 투여하는 환자내 투여량 증가 전략을 사용하고, 이어서 4주 동안 108개의 세포의 9회 추가의 CAR T 세포 주입을 수행한다. 반응을 평가하기 위한 영상화를 3주 휴식 사이클 동안 및 5주 후에 수행한다. 독성 모니터링 및 부작용 보고를 위해, NCI 공통 독성 기준 버전 2.0 (https://ctep.ifo.nih.gov/l)에 제공된 지침에 따른다.
이식 전 골수 또는 말초 혈액 줄기세포 제조물의 생체외 퍼징을 위한 CAR-T 세포의 사용
줄기세포 이식 전에 암 세포의 골수 또는 말초 혈액 줄기세포 제조물을 퍼징하는데 CAR T 세포를 사용할 수 있다. 다음 실시예에서, T 세포를 발현하는 CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC (SEQ ID NO: 1699)를 사용하여, 자가유래 줄기세포 (또는 골수) 이식 전에 다발성 골수종 환자로부터 획득 한 골수 또는 말초 혈액 줄기세포를 퍼징한다.
환자에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하기 위해 백혈구 채집술을 진행한다. T 세포를 CD3 비드를 사용하여 정제한다. 이들 세포를 사용하여, 상기 실시예에 기재된 바와 같이, 해당 렌티바이러스 벡터로 감염시킨 후 CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-z-P2A-hNEMO-K277A-T2A-PAC CAR을 발현하도록 T 세포를 조작한다. 이어서, 방출-시험된 치료적 CAR-T 세포를 동결보존하고, 추후 사용을 위해 저장되거나 신선한 상태로 사용한다. 골수 세포 및 말초 혈액 전구 세포 산물을 표준 절차에 따라 다발성 골수종 환자로부터 수집한다. 말초 혈액 줄기세포의 채집을 위해, 성분채집이 완료될 때까지, 사이클로포스파미드 24시간 후에 개시하여, 매일 사이클로포스파미드 3 gm/m2, 이 후 G-CSF 10 μg/kg을 환자에 피하 제공한다. 말초 혈액 CD34+-세포 수가 15 세포/μl가 되면, 말초 혈액 줄기세포를 수집한다. 처리 후 최소 2.0회의 106 CD34+ 세포/kg에 도달할 때까지 하루에 3회의 혈액 부피를 처리하는 것이 수집 목표이다. 골수 및 말초 혈액 줄기세포 산물에서 선택적으로 적혈구를 고갈시키고/거나, Miltenyi Biotec으로부터의 CliniMACS Prodigy® 시스템을 제조사의 권장 사항에 따라 사용하여 CD34 발현 세포를 농축시킨다. 이 산물을 사용하여, 새로운 또는 동결보존된 상태를 생체외 퍼징한다. 퍼징하기 위해, 골수 또는 말초 혈액 줄기세포 산물을 100 IU 재조합 인간-IL2가 보충된 XVIVO 배지 (Lonza)에서 5:1 내지 30:1 범위의 효과기 대 표적 비율에서 해동된 CAR-T 세포와 4 내지 24시간 동안 공동 배양한다. 세포를 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양한다. 공동 배양 기간이 끝나면, 멸균성 및 특질 시험 (CD34 및 CD138 양성 세포에 대한 유세포분석 및 CFU-GM 측정 포함)을 위해 일 분량의 세포를 채취한다. 이전에 골수 절제 화학요법을 받은 환자에게 나머지 샘플을 정맥내 투여한다 (예를 들어, 140 mg/m2의 총 투여량으로 70 mg/m2의 2회의 분할 투여량의 고 투여량의 멜팔란 (Melphalan)).
이중특이적 T 세포 결합인자의 사용
표 13에 열거된 서열번호를 갖는 작제물을 사용하여 Hela 세포에서 이중특이적 T 세포 결합인자에 의해 인코딩된 단백질을 발현시킨다. 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 금속 친화도 태그 또는 StrepTag II 컬럼을 사용하여 단백질을 정제한다. 정제된 단백질을 단계 I 임상 시험에서 시험한다. 당 업계에 공지된 상이한 분석을 사용하여 이중특이적 항체의 표적 항원의 발현을 기반으로 하여 환자를 선택한다. 이중특이적 항체를 24시간 주입으로 투여한다. 독성 모니터링 및 부작용 보고를 위해 NCI 공통 독성 기준 버전 2.0 (http [s://] ctep.ifo.nih.gov/l)에 제공된 지침에 따른다.
CAR 조합의 사용
중피종 및 교모세포종 환자에게 메소텔린 (중피종에 발현됨), IL13Ra2 (교모세포종에 발현됨) 및 조혈 마커 (CD19, CD20, CD22, BCMA)를 표적화하는 CAR의 하기 조합을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염된 T 세포를 투여한다. T 세포는 야생형 TCR 사슬 중 하나이거나, CRISP/Cas9 접근법에 의해 녹아웃된 TCRα 사슬을 갖는다. CD19, CD20, CD22 또는 BCMA를 표적화하는 CAR과 CAR 표적화 메소텔린의 야생형 TCR 사슬과의 동일한 T 세포에서의 공동 발현은 메소텔린 단독의 발현과 비교하여 생체내에서 증가된 T 세포 확장을 초래한다는 것이 관찰된다. 교모세포종을 표적화하는 CAR에 대해서도 필수적으로 유사한 결과가 획득된다. 그러나, TCR 사슬에 결함이 있는 T 세포에서, CD20을 표적화하는 TFP 기반 CAR (SEQ ID NO: 9660)의 공동 발현은 생체내 확장을 유도하지 못하고, SIR (SEQ ID NO: 9668) 또는 Ab-TCR (SEQ ID NO: 9676) 기반 CAR의 공동 발현은 성공적으로 T 세포 확장을 유도한다.
[표 15]
Figure pct00096
Figure pct00097
전술한 다양한 방법 및 기술은 본 출원을 수행하기 위한 많은 방법을 제공한다. 물론, 본 명세서에 기재된 임의의 특정 실시형태에 따라 기재된 모든 목적 또는 이점이 반드시 달성될 필요는 없음이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 본 명세서에서 교시된 하나의 장점 또는 장점 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 본 방법이 수행될 수 있으며, 본 명세서에서 교시되거나 제안된 다른 목적 또는 이점이 반드시 달성되어야 하는 것은 아님을 인식할 것이다. 다양한 대안이 본 명세서에 언급되어 있다. 일부 바람직한 실시형태는 하나의 특징, 다른 특징 또는 수 개의 특징을 구체적으로 포함하고, 다른 것은 하나의 특징, 다른 특징 또는 수 개의 특징을 배제하고, 또 다른 것은 하나의 특징, 다른 특징 또는 수 개의 유리한 특징을 포함함으로써 특정 특징을 완화시키는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 당업자는 상이한 실시형태로부터 다양한 특징의 적용 가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 상기 논의된 다양한 요소, 특징 및 단계뿐만 아니라, 이러한 각 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 공지된 균등물은 본 명세서에 기재된 원리에 따른 방법을 수행하기 위해 당업자에 의해 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 다양한 요소, 특징 및 단계 중 일부는 다양한 실시형태에서 명시적으로 포함되며 다른 것들은 명시적으로 제외된다.
본 개시내용을 설명하기 위해 다수의 실시형태가 상기에 제시되어 있다. 다음의 청구범위는 본 출원인이 그의 발명으로 간주하는 것을 추가로 제시한다.

Claims (69)

  1. 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합으로서, (i) 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및 (ii) NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로(selectively) 활성화시키는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 발현하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 적어도 하나의 항원-결합 도메인 및 적어도 하나의 막관통 도메인을 포함하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 적어도 하나의 TCR 관련 신호전달 모듈을 채용할 수 있는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 재조합 TCR인, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  5. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체의 적어도 하나의 항원-결합 도메인은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 (Interleukin-13) 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린 (Mesothelin); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 (Testisin) 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 결합 뮤신 1 (Mucin 1, cell surface associated) (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제 (Prostase); 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2 (Ephrin B2); 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (Proteasome) (프로좀 (Prosome), 마크로파인 (Macropain)) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 (Abelson) 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제 (Tyrosinase); 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (transglutaminase 5) (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (Claudin 6)(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (uroplakin 2) (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (adrenoceptor beta 3) (ADRB3); 파넥신 3 (pannexin 3) (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (Wilms tumor protein) (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴 (angiopoietin)-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인 (prostein); 서바이빈 (survivin); 텔로머라제 (telomerase); 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8 (Galectin 8)), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체 (androgen receptor); 사이클린 Bl (Cyclin B1); v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질 (Zinc finger protein))-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 (proacrosin) 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (renal ubiquitous 1) (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인 (legumain); 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (influenza A hemagglutinin) (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (desmoglein 3) (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4 (Nectin-4), 크립토 (Cripto), gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  6. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 vFLIP K13, K13-opt, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 임의의 유전자 편집 시스템, 이들의 임의의 상동체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  7. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 비 바이러스 유래인, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  8. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 유전자 편집 시스템인, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  9. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 NEMO/IKKγ의 올리고머화를 유도하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  10. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 IKK 복합체의 활성화를 유도하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  11. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 AKT 경로를 활성화시키지 않는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  12. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 항시적 또는 유도성 방식으로 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  13. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 일시적으로 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  14. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 안정하게 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  15. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제의 활성은 세포와 화합물의 접촉을 통해 번역 후 제어되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  16. 제1항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 스위치 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물(fusion construct)로서 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  17. 제9항에 있어서, NF-κB 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제의 활성은 스위치 도메인의 이량체화의 이량체화를 유도하는 화합물의 치료 유효량의 투여에 의해 번역 후 수준에서 제어되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 스위치 도메인은 FKBP12 도메인의 하나 이상의 카피를 포함하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  19. 제15항에 있어서, 화합물은 AP20187 또는 리미두시드 (Rimiducid) 또는 그의 상동체인, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  20. 제1항에 있어서, 면역 세포는 T-림프구 (T 세포), CAR-T 세포, TCR-발현 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), 조직 상재 림프구, 줄기세포, 유도된 전능성 줄기세포 또는 자연 살해 (NK) 세포인, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  21. 제1항에 있어서, 면역 세포는 기능성 고유 T 세포 수용체 (TCR) 신호전달 복합체 및/또는 β2 마이크로글로불린이 부재하도록 조작되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  22. 제1항 및 제21항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 제제의 발현이 TCR 유전자의 내인성 조절 요소/프로모터의 제어 하에 있도록 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 제제는 내인성 TCR 유전자 내에 클로닝되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  23. 제1항에 있어서, 암, 감염성 질병, 면역 질병 및 알레르기 질병의 군으로부터 선택되는 질병의 예방 및 치료에 사용되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  24. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하고, NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 단일 프로모터로부터 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  25. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및 NF-κB 신호전달 경로를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 개별 프로모터를 사용하여 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는, 제1 및 제2 핵산 코딩 서열의 발현시 비천연 발생 면역 수용체 및 NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제는 물리적 또는 화학적으로 연결되지 않도록, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제를 인코딩하는 제2 핵산 서열로부터 분리된 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 제1 핵산 코딩 서열을 포함하는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 적어도 하나의 NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 비천연 발생 제제가 TCR 유전자의 내인성 조절 요소/프로모터의 제어 하에 있도록 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체 및/또는 NF-κB 코딩 폴리뉴클레오타이드(들)를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 비천연 발생 제제는 내인성 TCR 유전자 내에 클로닝되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  28. 제21항 또는 제27항에 있어서, TCR 유전자의 하나 이상의 불변 사슬이 기능적으로 재 발현되는, 면역 세포 또는 그의 면역 세포 집합.
  29. 적어도 하나의 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 일부 또는 전체 막관통 및/또는 세포질 도메인 및 임의적으로(optionally) 내인성 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 도메인으로서, 내인성 단백질은 림프구의 표면에 발현되고, 림프구의 활성화 및/또는 증식을 촉발시키는 제1 핵산 도메인;
    (b) 임의적으로 폴리뉴클레오타이드 링커;
    (c) 제1 핵산 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 도메인으로서, 제2 핵산 도메인은 하나 이상의 비천연 TCR 항원 결합 도메인(들)을 인코딩하는 제2 핵산 도메인;
    (d) 공자극 도메인을 인코딩하는 임의적 제3 핵산 도메인; 및
    (e) 보조 모듈을 인코딩하는 추가의 임의적 핵산 도메인
    을 포함하는, 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  30. a) 비천연 발생 면역 수용체를 인코딩하는 제1 핵산; 및
    b) 선택적 NF-κB 활성화제를 포함하는 보조 모듈을 인코딩하는 제2 핵산
    을 포함하는, 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제30항에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 절단 가능한 펩타이드 링커를 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드 링커에 의해 분리되는, 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  32. 제30항에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산이 개별 벡터로부터 발현되도록 2개의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제30항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제는 비천연 발생 선택적 NF-κB 활성화제인, 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제30항에 있어서, 비천연 발생 면역 수용체는 CAR, Ab-TCR, TFP, cTCR, SIR 및 재조합 TCR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제30항에 있어서, 비천연 발생 면역 수용체는 (i) 세포외 항원 특이적 도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 임의적 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, (iii)은 비천연 발생 면역 수용체의 C 말단에 위치하는, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제30항에 있어서, 제1 및 제2 핵산 서열의 발현시 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NF-κB 활성화제 폴리펩타이드는 물리적 또는 화학적으로 연결되지 않은, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제35항에 있어서, 세포외 항원-특이적 도메인은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS1 (CD2 하위세트 1, CRACC, MPL, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타 (FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 결합 (MUC1); AFP/MHC 복합체; 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); WT1/MHC I 복합체; 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); NY-ESO-1/MHC I 복합체, 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); HPV E6/MHC I 복합체; 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); HPV E7/MHC I 복합체; AFP/MHC I 복합체; Ras/MHC I 복합체; 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원); 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn ag, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR 또는 GR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, KSHV K8.1, KSHV-gH, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자기항체, 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자기항체, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IgE, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, 넥틴-4, 크립토, gpA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원 중 임의의 하나에 결합하는, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  38. 제30항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제는 vFLIP K13, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, FKBPx2-RIP-ID, IKK1, FKBPx2-IKKα, IKK2, FKBPx2-IKK2, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, NF-κB를 선택적으로 활성화시킬 수 있는 유전자 편집 시스템, NF-κB를 선택적으로 활성화시키는 RNA 간섭 시스템 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  39. 제37항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제는 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물로서 발현되는, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제35항에 있어서, 세포외 항원 특이적 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드:
    -소정의 표적 항원에 특이적인 항체 또는 그의 단편의 중쇄의 가변 영역 (vH);
    -소정의 표적 항원에 특이적인 항체 또는 그의 단편의 경쇄의 가변 영역 (vL);
    -소정의 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편;
    -소정의 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예를 들어, Fv, Fab, (Fab')2);
    -소정의 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB) 단편;
    -소정의 표적 항원에 특이적인 낙타과 vHH 도메인;
    -소정의 표적 항원에 특이적인 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
    -소정의 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 그의 단편;
    -소정의 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 그의 단편;
    -하나 이상의 소정의 표적 항원에 특이적인 이중특이적-항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
    - 자기항원 또는 그의 단편.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 (sleeping beauty) 트랜스포손 벡터, 및 피기백 트랜스포손 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 벡터.
  43. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기세포.
  44. 제41항의 적어도 하나의 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기세포.
  45. 제42항의 적어도 하나의 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기세포.
  46. 제41항의 적어도 하나의 벡터를 포함하는 항원 제시 세포.
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 효과기 세포는 인간 T 세포, 인간 NKT 세포 또는 합성 T 세포, NK 세포, 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포이고, 임의적으로, T 세포는 디아글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 Ikaros 결핍 및/또는 Brd4 결핍인, 면역 효과기 세포 또는 줄기세포.
  48. (i) 발현 면역 세포의 수명(life span)을 연장하고, (ii) 면역 세포의 증식을 자극하고, (iii) 면역 세포에 의한 사이토카인 생성을 자극하고, (iv) 면역 세포에 의한 항원 제시를 증대시키고, (v) 아폽토시스로부터 면역 세포를 보호하기 위한 방법으로서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 면역 세포를 형질감염시키거나 형질전환시키는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 vFLIP K13, K13-opt, NEMO 돌연변이체, NEMO-융합 단백질, IKK1-S176E-S180E, IKK2-S177E-S181E, RIP, IKKα, IKKβ, Tcl-1, MyD88-L265, 임의의 NF-κB 활성화 단백질 또는 단백질 단편, NF-κB 경로의 억제제 중 임의의 억제제, 이들의 임의의 상동체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 항시적 또는 유도성 방식으로 발현되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 T 세포와 화합물의 접촉을 통해 번역 후 제어되는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드는 FKBP 도메인의 하나 이상의 카피를 갖는 융합 작제물로서 발현되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 선택적 NF-κB 활성화제 또는 NF-κB 특이적 자극 폴리펩타이드의 활성은 FKBP 도메인의 이량체화를 유도하는 화합물의 치료 유효량의 투여에 의해 번역 후 수준에서 제어되는, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 화합물은 AP20187 또는 리미두시드인, 방법.
  55. 비천연 발생 면역 수용체-발현 면역 효과기 세포를 제조하는 방법으로서, 비천연 발생 면역 수용체가 발현되는 조건 하에서, 제41항의 적어도 하나의 벡터 또는 제29항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 조혈모세포 또는 전구 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하며, 면역 효과기 세포는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드가 부재하는 CAR-T 세포와 비교하여, (i) 연장된 수명, (ii) 개선된 T 세포 증식, 및/또는 (iii) 감소된 아폽토시스를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    a) 면역 효과기 세포의 집합을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 집합으로부터 T 조절 세포를 제거함으로써, T 조절-고갈 세포의 집합을 제공하는 단계
    를 추가로 포함하고;
    단계 a) 및 b)는 벡터 또는 CAR 및/또는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 상기 집합에 도입시키기 전에 수행되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, T 조절 세포는 항-CD25 항체, 또는 항-GITR 항체를 사용하여 세포 집합으로부터 제거되는, 방법.
  58. 제55항에 있어서,
    a) 면역 효과기 세포의 집합을 제공하는 단계; 및
    b) P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-양성 세포를 상기 집합으로부터 다량화함(enriching)으로써, P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-다량화된 세포의 집합을 제공하는 단계
    를 추가로 포함하고;
    단계 a) 및 b)는 벡터 또는 CAR 및/또는 NFkB 특이적 자극 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 도입 전 또는 후에 수행되는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, P-당단백질 양성 세포는
    i) P-당단백질 특이적 항체 중 하나 또는 그의 칵테일을 사용한 면역선택 단계,
    ii) P-당단백질의 기질인 하나 이상의 형광 염료, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 (TMRM), 아드리아마이신 (Adriamycin) 및 액티노마이신-D)로 P-당단백질이 펌프로서 활성인 조건 하에서 염색하고, 염료로 덜 염색된 세포를 다량화하는 단계,
    iii) P-당단백질의 기질, 예컨대 TH9402, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 메틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 에틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 옥틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 하이드로클로라이드, 2-(6-에틸 아미노-3-에틸 이미노-3H-크산텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 하이드로클로라이드, 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상의 광독성 화합물에 저항성인 세포의 선택 단계, 및
    iv) P-당단백질의 기질, 예컨대 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 탁솔 (taxol), 파클리탁셀 (paclitaxel), 미톡산트론 (mitoxantrone), 에토포시드 (etoposide), 아드리아마이신, 다우노루비신 (daunorubicin) 및 액티노마이신-D의 세포독성 화합물에 저항성인 세포의 선택 단계
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 중 임의의 하나 이상을 사용하여 다량화되는, 방법.
  60. RNA-조작된 세포의 집합을 생성하는 방법으로서, 시험관내 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포의 집합 내에 도입시키는 단계를 포함하고, RNA 또는 RNA들은 제30항의 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는, 방법.
  61. 대상체에서 항-질병 면역을 제공하는 방법으로서, 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항의 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 세포는 자가유래 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가유래 NKT 세포 또는 동종이계 NKT 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 자가유래 또는 동종이계 조혈모세포 또는 자가유래 또는 동종이계 iPSC인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NKT 세포 또는 조혈모세포 또는 iPSC는 기능성 TCR 또는 기능성 HLA의 발현이 부재하거나, 그의 발현이 낮은, 방법.
  63. 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NFkB 활성화제를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기세포를 포함하는 조성물로서, 비천연 발생 면역 수용체는 관련된 질병-관련 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 질병-관련 항원은 CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 결합 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙 (surviving); 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모막 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), KSHV-K8.1 단백질, KSHV-gH 단백질, 데스모글레인 3에 대한 자기항체 (Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자기항체 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  64. 대상체에서 질병-관련 항원의 발현과 관련된 질병을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 비천연 발생 면역 수용체 및 선택적 NFkB 활성화제를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 대상체에 투여함으로써, 대상체를 치료하거나, 대상체에서 질병을 예방하는 단계를 포함하고, 비천연 발생 면역 수용체는 관련된 질병-관련 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 질병-관련 항원은 CD5, CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 조혈 전구체 상이 아닌 급성 백혈병 또는 림프종 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 비 조혈암 상에 발현되는 글리코실화된 CD43 에피토프, 종양태아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기세포 항원 (PSCA); 세린 프로테아제 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 결합 (MUC1); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제 (PAP); 돌연변이 연장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산무수화효소 IX (CAlX); 프로테아좀 (프로좀, 마크로파인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 쥣과동물 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl)로 이루어진 암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종관련 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오사이드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라마이드 (GloboH)의 육당류 부분; 포유류 샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질 연결 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 고환암 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 고환암 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원 (MelanA 또는 MARTI); 랫트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막관통 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍 형성 box 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 암유전자 신경아세포 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 Brother of the Regulator oflmprinted Sites), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 (SART3); 쌍 형성 box 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 중단점 2 (SSX2); 진행된 최종 당화 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 산재 인자 1 (RUl); 신장 산재 인자 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩타이드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 Tag, CD34, LAMP1 TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) 푸코실-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), 여포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), 융모막 성샘자극 호르몬 수용체 (CGHR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, A형 인플루엔자 혈구응집소 (HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 사이클라제 C (GCC), KSHV-K8.1 단백질, KSHV-gH 단백질, 데스모글레인 3에 대한 자기항체 (Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자기항체 (Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, 크립토, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널, 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 질병 관련 항원의 발현과 관련된 질병은 증식성 질병, 전암성 병태, 암, 및 질병 관련 항원의 발현과 관련된 비 암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 암은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 (ALL), B 세포 급성 림프성 백혈병 (B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈병 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종, 1차 삼출 림프종, 여포성 림프종, 모세포 백혈병, 소세포 또는 거대 세포 여포성 림프종, 악성 림프 증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 백혈병 전증 중 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암인, 용도 또는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 암은 결장암, 직장 암, 신장 세포 암종, 간 암, 폐의 비소세포 암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부 암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁 암, 난소 암, 직장 암, 항문 영역의 암, 위 암, 고환 암, 자궁 암, 자궁관암, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질병, 비호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 1차 CNS 림프종, 혈관신생 종양, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 메르켈세포암 (Merkel cell cancer), 표피암, 편평 세포 암, T 세포 림프종, 환경 유발 암, 상기 암의 조합, 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 포진바이러스 6, 인간 포진바이러스 8 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, MERS 및 SARS 코로나바이러스, 크림 반도 콩고 유행성 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 랏사열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 포진 바이러스 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트밸리열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스를 포함하는 바이러스에 의한 감염과 관련되거나, 결핵균, 비정형 마이코박테리아 종, 폐포자충, 톡소포자충증, 리케차, 노카르디아, 아스페르길루스, 무코르, 또는 칸디다에 의한 감염과 관련되는, 용도 또는 방법.
  69. 제65항에 있어서, 질병은 다음에 제한되는 것은 아니나, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 심상성천포창, 강직성 척추염, 하시모토 갑상선염, SLE, 사르코이드증, 피부경화증, 혼합결합조직병, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병을 포함하는 면역 또는 퇴행성 질병인, 용도 또는 방법.
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