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KR20230153529A - 다양한 면역세포를 위한 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체 - Google Patents

다양한 면역세포를 위한 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체 Download PDF

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KR20230153529A
KR20230153529A KR1020237031803A KR20237031803A KR20230153529A KR 20230153529 A KR20230153529 A KR 20230153529A KR 1020237031803 A KR1020237031803 A KR 1020237031803A KR 20237031803 A KR20237031803 A KR 20237031803A KR 20230153529 A KR20230153529 A KR 20230153529A
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KR
South Korea
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sar
cell
receptor
antigen
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Application number
KR1020237031803A
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Inventor
프리트 엠. 쇼드하리
Original Assignee
프리트 엠. 쇼드하리
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Filing date
Publication date
Application filed by 프리트 엠. 쇼드하리 filed Critical 프리트 엠. 쇼드하리
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Abstract

본 개시내용은 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체, 이러한 합성 항원 수용체의 제조 방법 및 질환 및 장애를 치료하기 위한 이의 용도를 제공한다.

Description

다양한 면역세포를 위한 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제63/151,421호 및 2021년 9월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제63/245,181호로부터 35 U.S.C. §119에 따른 우선권을 주장하며, 이들의 개시 내용은 모든 목적을 위해 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 생명공학 분야에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2022년 2월 21일에 생성되고 IBM-PC, MS-Windows 운영 체제에서 기계 포맷된 34,352,306바이트의 데이터가 있는 "NK-DNA-PRT-1-11231_ST25.txt"라는 제목의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
CAR은 T 세포를 리디렉션하여 종양 세포를 선택적으로 죽일 수 있는 합성 면역 수용체이다. CAR-T 세포의 성공에도 불구하고 이 접근 방식에는 "사이토카인 방출 증후군"(CRS)과 같은 독성 및 신경 독성을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있다.
CAR-T와 달리 NK(자연 살해) 세포는 자연적으로 세포 용해 기능과 항바이러스 면역을 부여받지만 GvHD를 유발할 수 있는 TCR이 부족하다. CAR-NK 세포는 CAR-T와 달리 과도한 사이토카인 생성을 유발할 가능성이 적다.
현재 임상에서 사용되는 2세대 CAR은 여러 다른 폴리펩티드의 융합체이다. 예를 들어, 킴리아(Kymriah)는 뮤린(murine) scFv (FMC63), 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 인간 4-1BB 공동자극 도메인 및 인간 CD3z 활성화 도메인을 포함한다. 이들 도메인은 다소 임의적인 방식으로 함께 이어붙여져 있으며, 결과물로 생성된 구조물은 비특이적 응집, 강직성 신호전달 및 생리학적 조절의 부족과 같은 여러 가지 문제를 겪는다.
이론에 얽매이기를 바라지 않고, 이러한 문제는 scFvs가 이중특이성, 2가, 또는 이중파라토프성 항원 결합 잔기를 갖는 CAR을 설계하기 위해 사용될 때 복합화될 가능성이 있다.
위의 차세대 SAR 설계 대부분의 또 다른 주요 한계는T 세포에서 주로 활성이며 NK 세포, 단핵세포/대식세포, 수지상 세포 및 호중구와 같은 다른 면역 세포에서는 기능하지 않는다는 것이다.
종래의 2세대 CAR의 설계 한계의 일부를 극복하기 위해, 집합적으로 차세대 CAR로 지칭되는 몇 가지 대안적인 설계가 설명되었으며, 여기에는 Ab-TCR (본원에 참조로 포함된 WO 2017/070608 A1), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP (본원에 참조로 포함된WO 2016/187349 A1), 합성 면역 수용체 (SIRs) (본원에 참조로 포함된 WO 2018/102795 A1 참조), 삼중기능의 T 세포 항원 커플러 (Tri-TAC) (본원에 참고로 포함된 WO 2015/117229 A1 참조)를 사용할 수 있다. 이러한 대체 CAR 설계들은 일반적으로 공동자극 도메인이 부족하다.
요약
본 명세서는 단일특이성, 이중특이성, 다중특이성 및 범용 차세대 SAR 설계를 제공한다.
본 명세서는 세포외, 막관통 및 세포질 도메인의 특정 구성을 가진 합성 항원-수용체(SAR)을 제공한다. 종래의 키메라 항원 수용체 (CAR), 즉, CD3z 활성화 도메인 및 41BB 또는 CD28 공동자극 도메인을 발현하는 2세대 CAR를 발현하는 면역 세포와 비교하여, 이 도메인은 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵세포, 대식세포, 호중구 등)에서 발현될 때, 개선된 면역-세포 활성화, 표적 세포 사멸, 사이토카인 분비 (예를 들어, IL-2, 인터페론-감마, 및 TNFa) 및 생체내 활성을 입증한다.
본 명세서는 또한 본 명세서의 SAR과 함께 표현될 수 있는 새로운 부속 모듈을 제공한다. 본 개시내용은 다음과 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다: a) 사이토카인의 막 고정된 저친화성 변이체 (예를 들어, IL-2 및/또는 IL-15); b) 에피토프(epitope) 태그를 갖는 막 고정 사이토카인; c) 자살, 생존 및 마커 기능을 제공하는 다목적 유전자 스위치
본 명세서는 본 명세서의 임의의 하나 이상의 단일사슬 또는 다중사슬 SAR와 함께 임의의 하나 이상의 부속 모듈을 표현하는 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 부속 모듈은 SAR 없이 세포에서 표현할 수 있다. 본 명세서는 또한 개시물의 부속 모듈 및/또는 SAR의 발현에 최적화된 짧은 프로모터 및 내부 리보솜 부위를 갖는 최적화된 벡터를 제공한다.
한 측면에서, 본 명세서는 생리학적 신호전달을 제공하는 단일사슬 신규한 차세대 SAR 설계에 관한 것이다. 더욱 중요하게는, 다른 측면에서, 본 명세서는 다중사슬 신규한 차세대 SAR 설계에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 T 세포, NKT 세포, NK 세포, 단핵세포/대식세포 및 호중구 등을 포함하는 다양한 면역 세포에서 활성인 신규한 차세대 합성 항원 수용체(SAR) 설계에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 명세서는 T 세포 수용체 유사 항원 결합 특이성을 임의의 세포에 부여하는 범용 TCR-SAR (또는 uTCR-SAR)로 불리는 신규한 SAR 설계에 관한 것이다.
본 명세서는 또한 MHC (또는 HLA) 분자와 회합하여 펩티드 항원에 결합하는 능력을 포함하는 T 세포와 유사한 결합 특성을 갖는 임의의 세포를 포함하는 비-T 세포를 제공한다. 본 명세서는 이러한 세포를 생성하기 위한 일반적인 방법 및 다양한 질환의 치료에서의 이의 용도를 제공한다.
본 명세서는 또한 세포 생존, 검출, 추적, 농축, 선택 및 제거 기능을 제공하기 위한 입양 세포 치료에 사용될 수 있는 다목적 스위치를 제공한다.
본 명세서는 또한 유형 I 및 유형 II 막관통 단백질을 포함하는 키메라 융합 단백질의 생성을 위한 보편적인 방법을 제공한다. 상기 방법은 유형 I 단백질의 항원 결합 도메인 및 유형 II 단백질의 세포질, 막관통, 힌지 및/또는 세포외 항원 결합 도메인을 통합하는 합성 항원 수용체를 생성하는데 사용될 수 있다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬 또는 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 암호화하는 핵산이 제공된다. 또한 본원에는 본원에 기재된 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈 중 임의의 것을 함께 암호화하는 핵산 세트가 제공된다.
일부 실시 형태에서, 상술한 임의의 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)에 따라, 표면에 SAR을 제시하는 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, iPSC 등)가 제공된다. 이 이펙터 세포는 SAR의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬 및/또는 상기 선택적인 부속 모듈을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 프로모터를 갖는 하나 이상의 벡터를 포함한다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 포유동물 세포가 제공된다. 또한 본원에 제공된 것은 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 함께 암호화하는 본원에 기재된 핵산의 임의의 세트를 포함하는 포유동물 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 TCR과 대조적으로, 본 명세서의 SAR이 임의의 포유동물 세포에서 발현될 수 있고 기능적으로 활성일 수 있음을 제공한다. 일 실시 예에서, 포유동물 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구 등이다. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 다음의 그룹으로부터 선택된다: CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 기억 T 세포, 나이브(naive) T 세포, T 줄기 세포, Treg 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, iNKT(선천적 자연 살해 세포), NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC 유래 NK 세포, α/β T 세포, γ/δ T 세포, iPSC 유래 T 세포, B 세포, 대식세포/단핵세포, iPSC. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 하기의 그룹으로부터 선택된다. 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포)를 야기할 수 있는 iPSC (유도만능 줄기 세포) 또는 배아 줄기 세포 또는 유도만능 줄기 세포. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 불멸화된(immortalized) 세포주, 예컨대 NK92, NK92MI, YTS 또는 이의 유도체이다. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 대상체로부터 획득된 포유동물 세포이다. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는 것으로 진단 또는 확인된다. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 세포는 자가적이다. 일부 실시형태, 세포는 동종이계이다.
또한, 본원에는 NK 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포 및 과립구를 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 이외의 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 단일사슬 및 다중사슬 TCR이 제공된다.
또한 본원에 제공된 것은 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 또한 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또한 본원에 제공된 것은 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산, 또는 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 함께 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 세트를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적으로 허용가능한 담체이다. 또한 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는 방법이 제공되며, 상기 기재된 임의의 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)에 따라 SAR을 발현하는 이펙터 세포와 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 SAR은 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 표적 세포를 사멸시키는 임의의 방법에 따르면, 접촉은 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 접촉은 시험관내에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 SAR을 발현하는 세포의 검출, 분리, 정제, 증식, 농축 및 제거를 위한 방법이 제공된다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의SAR 및 부속 모듈 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산, 또는 본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR를 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 세트를 포유동물 세포로 도입하는 것을 포함하는 단일사슬, 이중사슬 및 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈을 발현하는 세포를 생성하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 일부의 실시형태에서, 포유동물 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 기억 T 세포, Treg 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 대식세포/단핵세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 대상체로부터 획득된 포유동물 세포이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는 것으로 진단 또는 확인된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 도입 단계 후에, 세포를 액체 배양 배지에서 배양하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 도입 단계 전에, 대상체로부터 포유동물 세포를 획득하는 것을 추가로 포함한다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포를 대상체에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 대상체에게 질병 (예: 암, 감염, 알레르기, 면역 장애 등)을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 투여 단계 이전에, 대상체로부터 초기 세포를 획득; 및 초기 세포에 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬, 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈 중 임의의 것을 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 단일사슬, 이중사슬, 다중사슬 SAR 및/또는 부속 모듈 중 임의의 것을 함께 암호화하는 본원에 기재된 임의의 핵산 세트를 도입하여, 대상체에게 투여되는 포유동물 세포를 생성하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 도입 단계와 투여 단계 사이에, 대상체에게 투여되는 세포를 액체 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 이종성 항원-결합 도메인은 다음의 그룹으로부터 선택된다: 항체, 항체 단편 (vL, vH, Fab 등), scFv, (scFv)2, VHH 도메인, FHVH(완전 인간 vH 도메인), 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(scaffold) (예를 들어, 센티린(Centyrin), 아피바디(affibody), ZIP 도메인, 어댑터 등), VNAR 도메인, 리간드(ligand), TCR, TCR의 가변 도메인(Va, Vb, Vg, Vd) 및 수용체. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 이종성 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, 이종성 항원-결합 영역은 단일 항원에 특이적으로 결합한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 단일 항원은 종양 항원이다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 종양 항원은 표 B에 열거된 항원으로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일-사슬 SAR은 ITAM을 포함하는 비-자연 발생 세포외 항원 결합 도메인(들), 선택적 링커, 자연 발생 수용체의 선택적 세포외 리간드-결합 도메인(들), 선택적 힌지 도메인, 막관통 도메인, 선택적 세포질 공동자극 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 선택적 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 선택적 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, 공동자극 도메인과 ITAM은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 공동자극 도메인 및 ITAM은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일-사슬 SAR은 비-자연 발생 세포외 항원 결합 도메인(들), 선택적 링커, 자연 발생 수용체의 선택적 세포외 리간드-결합 도메인(들), 선택적 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 1차 신호전달 도메인 및 ITAM을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일사슬 SAR은 비-자연 발생 세포외 항원 결합 도메인(들), 막관통 도메인, 1차 신호전달 도메인, ITAM 및 공동자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일사슬 합성 항원 수용체는 비-자연 발생 세포외 항원 결합 도메인(들), 막관통 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, ITAM, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일사슬 합성 항원 수용체는 이종성 세포외 항원 결합 도메인(들), 막관통 도메인, ITAM, 1차 신호전달 도메인, 및 공동자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 단일사슬 합성 항원 수용체는 비-자연 발생 세포외 항원- 결합 도메인(들), 막관통 도메인, ITAM, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 세포외 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다.
본원에 기재된 임의의 단일사슬SAR의 일부 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3z로부터의 것이다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 FcRγ로부터의 것이다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 DAP10으로부터의 것이다. 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 DAP12로부터의 것이다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 단일사슬 SAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 벡터를 포함하는 포유동물 세포가 제공된다. 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 iPSC이다.
또한 본원에는 SAR 발현 세포를 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 벡터를 포유동물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 다음의 그룹으로부터 선택되는 세포이다: CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 나이브(naive) T 세포, 기억 T 세포, Treg 세포, 자연 살해 T 세포, NK 세포, B 세포, 및 대식세포/단핵세포. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 다음의 그룹으로부터 선택되는 세포이다. 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포)를 야기할 수 있는 iPSC (유도만능 줄기 세포) 또는 배아 줄기 세포 또는 유도만능 줄기 세포. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 불멸화된 세포주, 예컨대 NK92, NK92MI 또는 이의 유도체이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 대상체로부터 획득된 포유동물 세포이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는 것으로 진단 또는 확인된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는 도입 단계 후: 세포를 액체 배양 배지에서 배양하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는 도입 단계 전에: 대상체로부터 포유동물 세포를 획득하는 것을 추가로 포함한다.
또한 본원에는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포를 대상체에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 투여 단계 이전에, 대상체로부터 초기 세포를 획득하는 단계; 및 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 벡터를 초기 세포 내로 도입하여, 대상체에게 투여되는 포유동물 세포를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는, 도입 단계와 투여 단계 사이에, 대상체에게 투여되는 세포를 액체 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 제공되는 것은 세포외 항원 결합 도메인; 선택적 힌지 도메인, 막관통 도메인; 및 선택적 세포질 도메인을 포함하는 적어도 하나의 제1 폴리펩티드를 포함하는 다중사슬 SAR이다.
본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 세포외 항원-결합 도메인은 다음의 그룹으로부터 선택된다: Vα, Vβ, Vγ, Vδ, vL, vH 도메인, scFv, (scFv)2, VHH 도메인, FHVH(완전 인간 vH 도메인), 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, VNAR 도메인, 리간드 및 수용체. 본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 세포외 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 제1 폴리펩티드는 단일 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 영역을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, 단일 항원은 종양 항원이다.
본원에 기재된 임의의 다중사술 SAR의 일부 실시형태에서, SAR은 ITAM이 결여되어 있지만, ITAM을 함유하는 1차 자극 도메인을 포함하는 신호전달 단백질을 모집한다. 본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, SAR은 CD3z, FcRγ, DAP10 및/DAP10의 그룹으로부터 선택된 신호전달 단백질을 모집한다.
본원에 기재된 임의의 다중사슬 SAR의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR의 적어도 제1 폴리펩티드는 ITAM을 포함하는 이종 항원 결합 도메인(들), 선택적 링커, 자연 발생 수용체의 선택적 세포외 리간드-결합 도메인(들), 선택적 힌지 도메인, 막관통 도메인, 선택적 세포질 공동자극 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 선택적 세포질 1차 신호전달 도메인은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 선택적 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 선택적 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인은 1 내지 500개의 아미노산들 (예를 들어, 1 내지 250개의 아미노산들, 또는 1 내지 50개의 아미노산들)에 의해 분리된다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 공동자극 도메인과 ITAM은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 공동자극 도메인 및 ITAM은 1 내지 500개 아미노산들 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산들)에 의해 분리된다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR은 이종 항원 결합 도메인(들), 선택적 링커, 선택적 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 1차 신호전달 도메인, 및 ITAM을 포함한다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR의 적어도 제1 폴리펩티드는 이종 항원 결합 도메인(들), 막관통 도메인, 1차 신호전달 도메인, ITAM 및 공동자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR의 적어도 제1 폴리펩티드는 이종 항원 결합 도메인(들), 막관통 도메인, 제2 세포내 신호전달 도메인, ITAM 및 제1 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR의 적어도 제1 폴리펩티드는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, ITAM, 1차 신호전달 도메인, 및 공동자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로 갈 때, 다중사슬 SAR의 제1 폴리펩티드는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, ITAM, 제2 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인은 서로 직접 접한다. 본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 세포외 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인은 1 내지 500개 아미노산 (예를 들어, 1 내지 250개 아미노산, 또는 1 내지 50개 아미노산)에 의해 분리된다.
본원에 기재된 다중사슬 SAR의 임의의 적어도 제1 폴리펩티드의 일부 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3z, FcRγ, DAP10 또는 DAP12의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질로부터 유래한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 도면, 그리고 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 다음의 제한되지 않는 도면들에 추가로 기재된다.
도 1은 다양한 이중사슬 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 개략도를 보여준다.
도 2는 AABD의 다양한 형태 (예를 들어, vHH, SVH, aVH, 아피바디(affibody), 센티린(Centyrin) 등)를 포함하는 다양한 이중사슬 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 개략도를 보여준다.
도 3 은 본 명세서의 단일사슬 및 이중사슬 CD16-SAR이 발현 시 가질 수 있는 다양한 형식을 보여준다. 이러한 SAR은 이의 Ig 유사 도메인 (D1 및 D2 도메인)을 모두 포함하는 CD16의 전체 세포외 도메인을 기반으로 한다.
도 4는 본 명세서의 CD16-SAR이 발현 시 가질 수 있는 다양한 형식을 보여준다. 이러한 SAR은 CD16의 부분 세포외 도메인을 기반으로 한다. 이러한SAR은 형식이 모듈식이므로 CD16 모듈은 다양한 SAR를 생성하기 위해서 NKp44, NKp46 등에서 파생된 다른 모듈로 대체될 수 있다.
도 5는 본 명세서의 NKp30 SAR이 발현 시 가질 수 있는 다양한 형식을 보여준다. SAR은 형식이 모듈식이므로 NKp30 모듈은 다양한 SAR를 생성하기 위해서 NKp44, NKp46 등에서 파생된 다른 모듈로 대체될 수 있다.
도 6은 CD19를 발현하는 RS4;11 GLuc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양했을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 7 은 RS4;11 GLuc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양했을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 8은 L363-GLuc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양하였을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 9는 RS4;11 Gluc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양했을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 10은 RS4;11 GLuc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양했을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 11 은 L363-Gluc 표적 세포와 2시간 동안 공동 배양하였을 때 지시된 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포에 대한 Matador세포독성 분석의 결과를 보여준다.
도 12는 NKG2D와 같은 유형II 막 단백질의 세포외 도메인에 항원 결합 도메인을 융합하는 것을 포함하는 SAR을 만드는 일반적인 설명을 보여준다.
도 13A-C는 (A) U266 세포(NY-ESO1+/HLA-A2)와 공동 배양할 때NY-ESO1 펩타이드(서열번호 10880)를 표적으로 하는 uTCR-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)을 발현하는NK92, 일차 NK 세포 및 일차 T 세포에 의한 세포 사멸 유도, 및 T세포가 대조군 T2 세포 또는 펩타이드가 로딩된 T2 세포와 함께 공동 배양할 때 하는 NY-ESO1 펩타이드를 표적으로 하는 uTCR-SAR (061621-SCjJ7; 서열번호 9366)를 발현하는 일차 T 세포에 의한 (B) TNFα의 상향조절 및 (C) IFNγ의 상향조절(upregulation)을 보여준다.
상세한 설명
이제 본 발명은 더 설명된다. 이하의 구절들에서, 본 발명의 다양한 측면들이 보다 상세히 정의된다. 이렇게 정의된 각 측면은 명백하게 반대되는 것으로 나타나지 않는 한 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 선호되거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 선호되거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 결합될 수 있다.
달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시되지 않는 한, 다음 용어 및 구문에는 아래에 제공된 의미가 포함된다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 또는 문맥에서 명백하지 않는 한, 아래의 용어 및 문구는 용어 또는 구문이 관련된 기술에서 획득된 의미를 배제하지 않는다. 상기 정의는 특정 실시형태를 설명하는데 도움을 주기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위가 청구항에 의해서만 제한되기 때문에 청구된 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprises)"은 조성물, 방법, 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용되며, 이는 유용하든 그렇지 않든 특정 요소의 포함에 대해 개방적이면서도 실시형태에 유용하다. 본 명세서에서 일반적으로 사용되는 용어들은 일반적으로 "개방된(open)" 용어로서 의도된다는 것을 당업자에 의해 이해될 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하지만 이에 한정되지 않는(including but not limited to)"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는(having)"은 "적어도 갖는(having at least)"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다(includes)"은 "포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다(includes but is not limited to)"등으로 해석되어야 하며 한다).
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 병리학, 종양학, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 명세서의 방법 및 기술은 일반적으로 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013)]를 참조한다. 본원에 기재된 면역학, 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여, 그리고 그 실험실 방법 및 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 제약 준비, 제형 및 전달, 환자 치료를 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "자율 항원 결합 도메인(autonomous antigen binding domain)" 또는 "AABD"는, 즉, 다른 항원 결합 도메인의 부재 하에 항원에 자율적으로, 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 의미한다. 예시적인 AABD는 단일 vH 도메인 또는 자율 vH 도메인 (aVH), 일반적으로vL 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 인간 vH 도메인 (SVH)이다. 또 다른 예시적인 AABD는 완전 인간 vH 도메인(FHVH)이다. 또 다른 예시적인 AABD는 단일 vL 도메인 또는 자율 vL 도메인, 일반적으로vH 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 인간 vL 도메인 (SVL)이다. AABD는 또한 항원에 자율적으로 결합할 수 있는 다른 항원 결합 도메인을 지칭한다. 한 실시형태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다. 예시적인 비-scFV 기반 자율 항원 결합 도메인은 vHH 도메인, 인간화 vHH 도메인, 단일 가변 도메인-TCR (svd-TCR), 및 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예를 들어 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obody), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠(kunitz) 도메인, 아르마딜로(Armadillo) 반복 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 비-scFV계 자율항원 결합 도메인의 추가의 예는 수용체의 리간드 결합 도메인 (예를 들어, CD16-V158A, NKG2D) 또는 이의 단편, 리간드의 수용체 결합 도메인 (예를 들어, 에이프릴(APRIL), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin) 등) 또는 이의 단편, 어댑터(예: RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-YA, NKG2D-AF 등) 또는 이의 단편, 어댑터 결합 단백질 (예를 들어 ULBP2R, ULBP2-S3 등) 또는 이의 단편, 에피토프 또는 태그(예를 들어, 스트렙태그, FLAG 태그 등), 자가항원 또는 이의 단편 등을 들 수 있다.
본 개시내용은 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 인간 VH(또는 vH) 도메인과 같은 AABD의 사용을 설명하였다. 실시형태에서, 본 명세서는 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 신규 SAR을 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 다수의 인간 VH 도메인과 같은 AABD의 사용을 설명한다.
양, 시간적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때, 용어 "약(about)"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 예±10%, 또는 일부 예±5%, 또는 일부 예±1%, 또는 일부 예±0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 편차는 개시된 방법을 수행하거나 본원의 조성물을 설명하기에 적절하다. 더욱이, 임의의 값 또는 범위(예를 들어, 20 미만 또는 유사한 용어)는 이러한 값들 사이 또는 그 값까지의 임의의 정수를 명시적으로 포함한다. 따라서, 예를 들어, "1 내지 5개의 돌연변이"는 명백하게 1, 2, 3, 4 및/또는 5개의 돌연변이를 명시적으로 포함한다.
본원에 기재된 용어 "ABR" 또는 "항원 결합 수용체(Antigen Binding Receptor)"는 항원 결합 도메인을 갖는 임의의 수용체를 의미한다. ABR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, VHH, 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab), 항체 유사 잔기, Vα, Vβ, svd-TCR, 사이토카인, 수용체 등을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, ABR은 세포 표면 상에서 발현될 수 있도록 하는 막관통 또는 막고정 도메인을 갖는다. 예시적인 ABR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, TFP, SIR, STAR, zSIR, cTCR, TCR, Ab-TCR, TRI-TAC 또는 TAC 등을 포함한다. 본원에 기재된 합성 항원 수용체(SAR)은 또한 ABR의 예이다.
용어 "Ab-TCR" 또는 "AbTCR"은 WO 2017/070608 A1에 기재된 바와 같은 차세대 CAR 플랫폼을 지칭하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 실시형태에서, Ab-TCR은 적어도 하나의 TCR 신호전달 모듈을 모집할 수 있는 TCR 모듈에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. Ab-TCR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 모듈은 서열번호 6009-6014 (표 6) 및 WO 2017/070608 A1에 제공되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
용어 "부속 모듈(accessory module)"은 면역 세포(예를 들어, NK 세포 또는 T 세포, 예를 들어, SAR-NK 세포, SAR-T 세포 또는 TCR-T 세포)에서 발현되어 면역 세포의 활성을 감소, 조절 또는 변형시키는 PDL1, PDL2, CD80, CD86, crmA, p35, hNEMO-K277A (또는 NEMO-K277A), hNEMO-K277A-델타-V249-K555, mNEMO-K270A, K13-opt, IKK2-S177E-S181E (또는 IKK2-SS/EE), IKK1-S176E-S180E (또는 IKK1-SS/EE), MyD88-L265P, TCL-1a, MTCP-1, CMV-141, 41BBL, CD40L, vFLIP-K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-Ipilimumab-scFv, CTLA4-Ipilimumab-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, Brd4를 표적으로 하는shRNA, IgSP-[hTRAC-opt2], IgSP-[hTRBC-opt2], 다기능 스위치 (예를 들어, IL2-tBCMA, IL15-tBCMA, IL2-RQR, IL15-RQR 등), NKG2C, CD94, DAP10, DAP12, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ 및 이의 조합을 지칭한다. 한 실시형태에서, 부속 모듈은 치료적 조절제(예를 들어, 이카파제(icapase) 9)이다. 일부 실시형태에서, 부속 모듈은 SAR 또는 TCR과 같은 면역 수용체와 동시에 발현되어 SAR 또는 TCR 또는 SAR 발현 또는 TCR 발현 세포의 발현 또는 활동을 증가, 감소, 조절 또는 변형시킨다. 부속 모듈은 단일 벡터를 사용하거나 두 개 이상의 서로 다른 벡터를 사용하여 SAR 또는 TCR과 함께 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부속 모듈은 항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "친화도(affinity)"는 결합 강도의 척도를 설명하기 위한 것이다. 친화도는 일반적으로 이의 표적에 결합하는 결합제의 "능력"을 지칭한다. "친화도"를 측정하기 위해 당업계에서 사용되는 다양한 방법들이 있다. 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하기 위한 방법은 친화성을 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여, 당업계에 공지되어 있다. 본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 적어도 10-6　M의 결합 친화도를 갖는 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 측면에서, 항체는 적어도 약 10-7M, 및 일반적으로10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합한다.
본원에 사용된 용어 "항체(antibody)"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 항체는 모노클로날, 또는 폴리클로날, 다중 또는 단일사슬, 또는 무손상 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 '인간화', '키메라', 완전 인간 또는 비-인간일 수 있다. 항체는 단일 도메인 (예를 들어, 단일 vH 도메인)을 가질 수 있다.
용어 "항체 단편(antibody fragment)"은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 능력 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해)을 보유하는, 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab'h, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설파이드-결합 Fvs (sdFv), VH 및 CHl 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 (sdAb), 예컨대 vL 또는 vH, 카멜리드 vHH 도메인, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성항체, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함한다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리이아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조) 내로 혼입될 수 있다. 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기초한 스캐폴드 내로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재하는 미국 특허 제6,703,199호 참조).
용어 "항체 중사슬(antibody heavy chain)"는 항체 분자 내에 자연적인 형태에서 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드사슬 중 보다 큰 것을 지칭하며, 이는 일반적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "항체 경사슬(antibody light chain)"는 항체 분자 내에 자연적인 형태에서 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드사슬 중 더 작은 것을 자연 발생 형태로 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경사슬은 2개의 주요 항체 경사슬 이소타입을 지칭한다.
"항암제(Anticancer agent)"는 비정상적인 세포 분열 및 성장을 억제하고, 신생물 세포의 이동을 억제하고, 침습성을 억제하거나, 암 성장 및 전이를 예방하는 작용제를 지칭한다. 상기 용어는 화학요법제, 생물학적 작용제(예를 들어, siRNA, 바이러스성 벡터, 예컨대 조작된 MLV, 아데노바이러스, 세포독성 유전자를 전달하는 헤르페스 바이러스), 항체 등을 포함한다.
용어 "항암 효과(anticancer effect)" 또는 "항 종양 효과(anti-tumor effect)"는 종양 부피의 감소, 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암세포 증식의 감소, 암세포 생존의 감소, 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 지칭한다. "항암 효과"는 SAR이 애초에 암 발생을 예방하는 능력에 의해서도 나타날 수 있다.
용어 "항원(antigen)" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역학적으로 유능한 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 거의 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 모든 거대분자가 항원 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 일반적으로 본원에 기재된 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 결합 파트너를 지칭한다. 임의의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 항원 또는 항원의 비제한적인 예는 표 B에 기재되어 있다.
용어 "항원 제시 세포(antigen presenting cell)" 또는 "APC"는 그 표면 상에 주요 조직적합성 복합체(MHC's)와 복합체화된 외래 항원을 표시하는 부속 세포(예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)와 같은 면역계 세포를 의미한다.
용어 "항-감염 효과(anti-infection effect)"는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭하며, 예를 들어, 감염원의 역가의 감소, 감염원의 콜로니 수의 감소, 감염성 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"항원 결합 도메인(antigen binding domain)" 또는 "항원 결합 모듈(antigen binding module)" 또는 "항원 결합 세그먼트(antigen binding segment)" 또는 "항원 특이적 도메인(antigen specific domain)" (ASD)은 이의 1차, 2차 또는 3차 서열, 번역 후 변형 및/또는 전하로 인해 높은 특이성으로 항원에 결합하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. ASD는 비 특정 도메인보다 선호도가 높은 대상에 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인은 상이한 공급원, 예를 들어 항체 (전장 중사슬, Fab 단편, 단일사슬 Fv (scFv) 단편, 2가 단일사슬 항체 또는 다이아바디), 비-면역글로불린 결합 단백질, 리간드 또는 수용체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 동족 또는 항원을 높은 친화력으로 결합하는 거의 모든 분자는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 ASD로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체 (TCRs) 또는 이의 일부를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 다양한 항원 결합 도메인의 표적 항원 및 서열번호는 표 3 내지 7에 본원에 제시되어 있다. 예시적인 실시형태에서, vL, vH, scFVs 및 이의 CDR 영역의 표적 항원 및 서열번호는 특허 출원 PCT/US18/53247의 표 6A-C 및 특허 출원 PCT/US19/035096의 표 3-4의본원에 제시되어 있으며, 이들은 본원에 참조로서 그 전체가 포함된다.
용어 "회합 상수(Ka)"는 수용체와 리간드의 회합에 대한 평형 상수로 정의된다.
"자가항체(autoantibody)"는 자가항원에 특이적인 B-세포에 의해 생산되는 항체를 지칭한다.
용어 "자가항원(autoantigen)"은 자가항체의 생산과 같은 자가면역 반응의 생산을 자극하는 내인성 항원을 의미한다. 자가항원의 예는 데스모글레인 1, 데스모글레인 3 및 이의 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
"결합력(avidity)"은 결합제와 이의 표적 사이의 상호작용의 강도 (예를 들어, 항체와 이의 항원 표적, 수용체 및 이의 동족 등) 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 기능적 분석(예: 유세포 분석 또는 Malibu-Glo 분석)에서 항체 활성은 또한 항체 친화도를 반영한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "골격(backbone)" 또는 "구조(architecture)"는 상이한 SAR 및 일반적으로 선택적인 임의의 부속 모듈을 포함하는 상이한 성분(예를 들어, 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 신호전달 도메인)의 구성을 지칭한다. 한 실시형태에서, SAR 및 부속 모듈은 단일 핵산 분자에 의해 암호화된다. 또 다른 실시형태에서, SAR은 제1 핵산 분자에 의해 암호화되고, 부속 모듈은 제2 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 부속 모듈은 부속 모듈 내의 성분의 수에 따라 둘 이상의 핵산 분자에 의해 암호화된다. SAR 및 부속 모듈의 2개 이상의 구성요소는 2A 리보솜 스킵 시퀀스(예를 들어, P2A, T2A, F2A 등)와 같은 절단 가능한 링커에 의해 분리될 수 있다. SAR 및 부속 모듈의 2개 이상의 구성요소는 내부 리보솜 진입 시퀀스(IRES)에 의해 분리될 수 있다. 예시적인 IRES는 KSHV로부터 유도된다. SAR 및 부속 모듈의 2개 이상의 성분을 암호화하는 핵산의 발현은 별개의 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 예시적인 프로모터는 EF1α, EFS, EFS2, CMV, RSV, mutRSV, MNDU3, Hsp70 및 Hsp90을 포함한다.
표 A1: 종래의CAR 구조들. 1세대 종래의CAR (Conventional CAR I)들은 세포내 신호전달(ISD) 도메인(예를 들어, CD3z)을 가지며, 공동자극 도메인은 없다. TCR 융합 단백질(TFP)들은 기존 CAR 1의 또 다른 예이다. 2세대 종래의CAR(Conventional CAR 2 또는 CAR II)들은 하나의 공동자극 도메인(예를 들어, 41BB 또는 CD28) 및 세포내 신호전달(ISD) 도메인(예를 들어, CD3z)을 갖는다. 3세대 종래의 CAR(Conventional CAR 3 또는 CAR III)들은 2개의 공동자극 도메인(예를 들어, 41BB 및 CD28) 및 세포내 신호전달(ISD) 도메인(예를 들어, CD3z)을 갖는다. Ab-TCR들은 vL-링커-TCR 도메인(TCRD 및 vH-링커-TCR 도메인(TCRD))을 포함하는 이중사슬 수용체며 PCT/US2016/058305에 설명되어 있다. cTCR은 하나 이상의 TCR 불변 사슬(TCR-C)에 융합되어 T 세포 신호전달의 활성화를 초래하는 vL 및 vH 단편에서 유래된 항원 결합 도메인으로 구성된 단일사슬, 1.5 또는 이중사슬 수용체다. cTCR의 TCR 불변 사슬은 야생형 핵산 서열 및 상응하는 야생형 아미노산 서열에 의해 암호화된다. cTCR의 상이한 구성들은 PCT/US2017/064379 또는 WO 2018/102795 A1에 기재되어 있다. 합성면역 수용체는 차세대 CAR이며, PCT/US2017/064379 또는 WO 2018/102795 A1에 기재되어 있다. SIR들은 단일사슬, 1.5, 또는 이중사슬 수용체다. 한 실시형태에서, SIR의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 TCR 불변 사슬 (TCR-C)에 융합되고 T 세포 신호전달의 활성화를 초래하는 vL 및 vH 단편으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 암호화되고, 이의 발현 및 사슬-쌍을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. zSIR은 선택적 링커를 가지는 2개의 CD3z 사슬 또는 이의 단편에 작동적으로 연결되고 PCT/US2019/035096에 설명된 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, vH 등)을 포함하는 이중사슬 수용체다.
표 A1-1 내지 A1-19는 본 개시내용의 단일특이성, 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 예시적인 구조를 제공한다. 사용 된 약어들은 다음과 같다 : SP (신호 펩티드); AADB (자율 항원 결합 도메인); L (선택적 링커); LL (긴 링커), (AABD-L) n (n = 0, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상인 선택적 링커를 갖는 AABD의 n 사본), AABD1-4 (하나 이상의 항원을 표적으로 하는 상이한 AABD), V1 (vL, vH, Va, Vb, Vg 또는 Vd 사슬), Ig (Ig 링커), TCR-Ig (TCR 사슬에서 유래된 Ig 링커 도메인), ConP (연결 펩타이드), TM (막관통도메인), CP (세포질 도메인), IC (세포 내 도메인), Ca (TCRα의 불변 사슬), Cb (TCRβ의 불변 사슬), Cg (TCRγ의 불변 사슬), Cd (TCRδ의 불변 사슬), scFv (단일사슬 단편 가변), scTFv (TCR의 두 개의 가변 단편, 예를 들어, Va 및 Vb을 포함하는 단일사슬 단편), dCa/dCb/dCg / dCd (이의Ig 링커 도메인이 없는TCRα, β, γ의 N-말단부분에서 삭제된 상수 사슬), TCR-ConP (TCRα, β, γ 또는 δ 불변 사슬의 연결 펩티드), Ca-ConP (TCRα 불변 사슬의 연결 펩티드), IgCL (면역 글로불린 경사슬의 Ig 링커), IgCH1 (면역 글로불린 중사슬의 Ig 링커), CD3εγδ ECD (CD3ε, γ 또는 δ 사슬의 세포 외 도메인), CSD (공동자극 도메인), 4-1BB 또는 BB (4-1BB의 공동자극 도메인), CD28 또는 28 (CD28의 공동자극도메인), CD3z 또는 zd 또는 z (CD3z의 활성화 도메인). NKp30-Ig (Nkp30의 면역글로불린 유사 도메인), NKp44-Ig (Nkp44의 면역글로불린 유사 도메인), NKp46-Ig1-Ig2 (Nkp46의 도메인의 면역글로불린 유사 도메인 1 및 2), CD16-D1 (CD16의 도메인 1), CD16-D2 (CD16의 도메인 2), scTCR (단일사슬 TCR), 세포외 도메인 (ECD), 활성화 도메인 (AD). Va, Vb, Vg, Vd (TCRα, β, γ 및 δ의 가변 도메인), FCRG (FcRγ); 힌지 도메인(Hn).
본원에서 사용되는 바와 같이, "유익한 결과(beneficial results)" 또는 "원하는 결과(desired results)"는, 이에 제한되지 않지만, 질환 상태의 중증도를 경감 또는 완화시키는 것, 질환 상태가 악화되는 것을 방지하고, 질환 상태를 치료하고, 질환 상태가 발전하는 것을 방지하고, 환자가 질환 상태를 발병할 가능성을 낮추고, 환자의 수명 또는 기대 수명을 연장시키는 것을 포함할 수 있다.
"동일한 에피토프에 결합하는(Binds the same epitope as)"은 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인이 표적 항원에 결합하는 능력 및 예시된 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인과 동일한 에피토프를 갖는 것을 의미한다. 예로서, 예시된 항체, scFv, 또는 다른 결합제 및 다른 항체의 에피토프는 표준 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 당업계에 잘 알려진 에피토프 맵핑 기술은 문헌[Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]에 있는 방법인 에피토프 맵핑 프로토콜을 포함한다. 현재 개시된 scFv, SAR, 항체 및 다른 면역치료제에 의해 결합된 인간 CD20, BCMA 및 인간 MPL 항원의 예시적인 에피토프는 특허 출원번호 PCT/US18/53247의 서열번호 15149-15154, 15155-15159 및 15160에 각각 제시되어 있으며, 이 특허 출원은 여기서 전부를 참조로 통합한다.
달리 의도되지 않은 한, 본 개시내용이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 항체, SAR, 이의 단편과 관련된 경우, 이들의 등가물 또는 생물학적 등가물이 본 개시내용의 범위 내에 있다는 것은 명시적 언급 없이 추론될 것이다. 본원에 사용된 용어 "이의 생물학적 등가물(biological equivalent thereof)" 또는 "변이체(variant)" 또는 "기능적 변이체(functional variant)"는 참조 단백질, 항체 또는 이의 단편, 이의 단편의 수용체, 리간드 또는 이의 단편, 비면역글로불린 항원 결합 도메인 또는 이의 단편, SAR 또는 이의 단편, 폴리펩티드 또는 핵산이 언급될 때, "이의 등가물(equivalent thereof)"과 동의어이고, 원하는 구조 또는 기능성을 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본원에서 구체적으로 인용되지 않는 한, 상기 중 임의의 것은 대안적으로 접합된(spliced) 동형(isoforms)들 및 다른 동물 종으로부터의 등가물을 포함하는, 이의 등가물도 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 등가물은 적어도 약 70%의 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 동일성을 의도하고, 대안적으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 적어도 98%의 상동성 또는 동일성을 의도하고, 참조 단백질, 폴리펩티드, 항체 또는 이의 단편, 또는 핵산과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건 하에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다. 대안적으로, 폴리펩티드 또는 단백질을 언급할 때, 이의 등가물은 엄격한 조건 하에서 참조 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 폴리펩티드 또는 단백질이다.
단백질은 서로 동일성 또는 상동성을 가질 수 있고 유사하거나 동일한 기능을 유지할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 "변이체(variant)"는 폴리펩티드의 치료적, 항원적 및/또는 면역원성 특성이 유지되도록 보존적 치환 및/또는 변형에서만 인용된 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드이다. 폴리펩티드 변이체는 확인된 폴리펩티드에 대해 적어도 약 70%, 더욱 전형적으로 적어도 약 90% 및 가장 전형적으로 적어도 약 95% 상동성을 일반적으로 나타낸다. 면역반응성 특성을 갖는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 서열을 변형시키고, 변형된 폴리펩티드의 면역반응성을 평가함으로써 변이체를 대안적으로 확인할 수 있다. 이러한 변형된 서열은, 예를 들어, 본원에 기재된 대표적인 절차를 사용하여 제조되고 시험될 수 있다. 본 개시내용은 생물학적 활성을 보유하면서 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는SAR 및 SAR 성분들 (예를 들어, CD16, CD32, CD64, FcRγ, DAP10, DAP12, DNAM1, OX40, 2B4, KIR2DL1, KIR2DS4, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, 및 CD3z 등의 세포외, 힌지, 막관통, 세포질 영역)을 포함한다. 본 개시내용은 또한 생물학적 활성을 보유하면서 본원에 기재된 임의의 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 항원 결합 도메인, 세포외 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 세포질 도메인, 공동자극 도메인, 부속 모듈을 포함한다. 변종에는 다른 종의 상동체와 대안적 접합 동형이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "CD3 복합체(complex)"는 TCR 활성화의 막관통 신호전달을 위한 수많은 단백질을 포함하는 세포 표면 분자 어셈블리를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)"은 중사슬 및 경사슬 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비 인접 항원 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Bio. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Bio. 196:901-917 (1987)]; 및 MacCallum et al., J. Mol. Bio. 25 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있으며, 여기서 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 지칭하는 어느 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체의 상이한 CDR은 또한 상이한 정의의 조합에 의해 정의될 수 있었다. 예를 들어, vHCDR1은 Kabat를 기반으로 정의될 수 있고 VHCDR2는 Chothia를 기반으로 정의될 수 있다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기는 다음과 같다:
현재 개시된 SAR, 이중특이성 항체 및 다른 면역치료제의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있는 예시적인 vL 및 vH 세그먼트의 CDR의 서열번호는 각각 PCT/US2018/053247의 서열번호13204-14121 및 서열번호14122-15039 (표 6A, B), PCT/US2017/064379의 표 5-6 및 PCT/US2021/022641의 표 39에 제공되고, 이를 본원에 참조로 한다. SAR, 항체 및 다른 면역치료제의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있는 예시적인 vL 및 vH 세그먼트의 서열번호가 또한 현재 개시내용의 표 3에 제공된다. 현재 개시내용의 vL 단편 및 scFv의 경사슬 CDR1, CDR2, 및 CDR3 (예를 들어, 표 3)은 서열번호 10882-11118, 11119-11355 및 11356-11592로 제공된다. 현재 개시된 VL 단편의 CDR1, CDR2 및 CDR3 (예를 들어, 표 3)은 서열번호 10882-11118, 11119-11355 및 11356-11592로 제공된다. 현재 개시된 vH 단편 및 scFv의 중사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3(예를 들어, 표 3)은 각각 서열번호 11593-11829, 11830-12066, 12067-12303으로 제공된다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈(예: Fab-유사 또는 Fv-유사 항원-결합 모듈)에 대한 참조는 항원 결합 모듈이 대상 항원에 대해 (a)다른 분자에 대한 결합친화도보다 적어도 약 10 (예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 또는 그 이상) 배의 친화도; 또는 (b) 다른 분자에 결합하기 위한 Kd보다 최대 1/10 (예: 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1175, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 또는 그 이하)배의 Kd로 결합하는 것을 뜻한다. 결합 친화도는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, Malibu-Glo 분석, Topanga 분석, 또는 방사성 면역 침전 분석 (RIA)에 의해 결정될 수 있다.
"암(cancer)" 및 "암성(cancerous)"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 용어 "종양(tumor)" 및 "암(cancer)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 두 용어 모두 고체 및 액체, 예를 들어, 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암(cancer)" 또는 "종양(tumor)"은 전암성 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다. 용어 "암(cancer)"은 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질 전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.
"세포치료제(cell therapy)" 또는 "세포-기반 치료제(cell-based therapy)" 또는 "면역세포치료제(immune cell therapy)" 또는 "면역 이펙터 세포치료제(Immune effector cell therapy)"는 질환의 예방 또는 치료를 위해 세포를 사용하는 것을 수반하는 요법을 지칭한다. 세포치료제의 비제한적인 예로는 CAR-T 세포치료제, NK-세포치료제, 재조합형 TCR-T 세포치료제, TIL(tumor infiltrating lymphocytes) 등이 있다.
"화학요법제(chemotherapeutic agents)"는 암에 대한 화학요법에 사용되는 것으로 공지된 화합물이다.
"키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptors)" (CAR)는 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)이라고 불리는 기술을 사용하여, 암에 대한 치료제로서 사용하기 위해 고려되는 인공 (비-자연적으로 발생하는) 면역 세포 (예를 들어, T 세포) 수용체이다. CAR은 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역 수용체로도 알려져 있다. CAR은 CAR이 결합하는 특정 항원에 반응하여 T 세포 활성화 및 증식을 자극하도록 특이적으로 구축된다. 일반적으로, CAR은 폴리펩티드 세트, 일반적으로 가장 단순한 한 실시형태에서 2개를 지칭하며, 이는 면역 이펙터 세포에서 발현될 때, 세포에 표적 세포(일반적으로 암 세포)에 대한 특이성과 세포 내 신호 생성을 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭되는)을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 세트는 서로 인접한다. 한 측면에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 회합된 제타 사슬이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 아래에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 공동자극 분자는 본원에 기재된 공동자극 분자, 예를 들어, 4-lBB (즉, CD137), CD27, OX40, 2B4, 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 실시형태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단 (N-ter)에서 선택적 리더 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 세포 처리 및 CAR의 세포막으로의 국소화 동안 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다. 다양한 실시형태에서, CAR은 항원-특이적 도메인 (ASD), 힌지 영역 (HR), 막관통 도메인 (TMD), 선택적 공동자극 도메인 (CSD) 및 세포내 신호전달 도메인 (ISD)을 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 선택적인 공동자극 도메인은 일반적으로 1세대 CAR 구축물에는 존재하지 않는다. 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 포함하고 41BB 공동자극 도메인을 통합하는 몇몇 예시적인 2세대 CAR의 핵산 및 단백질 서열은 PCT/US2020/014237의 서열번호1455-1703 및 341-7589 (표 8)에 제시되어 있다.
"코돈 최적화(codon optimization)" 또는 "종 코돈 편향에 대한 조절(controlling for species codon bias)"은 특정 숙주 세포의 바람직한 코돈 용도를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 이의 발현을 향상시키기 위해 코딩 서열을 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 당업자라면, 유전자 코드의 퇴화 특성으로 인해, 그들의 뉴클레오티드 서열이 상이한 다양한 DNA 화합물이 본원의 주어진 폴리펩티드를 암호화하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동-발현(co-express)"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현을 지칭한다. 유전자는 단일 폴리펩티드 사슬로서 예를 들어 단일 단백질 또는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산일 수 있다. 본원에 기재된 SAR(예: CAR, SIR, zSIR 또는 TCR 등)는 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 단일 폴리펩티드 사슬로서 발현될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 폴리펩티드로 절단되고, 각각은 별개의 작용 단위를 나타낸다. 일부 실시형태에서, SAR이 2개 이상의 기능적 폴리펩티드 단위로 구성되는 경우, 상이한 기능적 단위는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 사슬을 사용하여 공동 발현된다. 일 실시예에서, 공동-발현은 SAR 또는 TCR과 공동-발현되지만 SAR(예를 들어, CAR, SIR, zSIR, 또는 TCR 등) 폴리펩티드의 필수적인 부분이 아닌 부속 모듈에 의해 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상이한 폴리뉴클레오티드 사슬은 절단가능한 링커 (예를 들어, T2A, F2A, P2A, E2A 등) (표 20)를 암호화하는 핵산 서열에 의해 연결된다. 또 다른 실시형태에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (서열번호 1239 및 1240)는 또한 절단가능한 링커 서열의 상류에 첨가되어, 절단의 효율을 향상시킨다. 예시적인 절단가능한 링커 및 퓨린 절단 부위의 핵산 및 아미노산 서열이 표 20에 제공된다. SAR의 상이한 단위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 연결될 수 있다. 실시예에서, SAR의 상이한 작용 단위(예를 들어, 2개 이상의 사슬)는 단일 벡터를 사용하여 표현된다. SAR의 상이한 기능 단위는 단일 프로모터 또는 다중 프로모터를 사용하여 표현될 수 있다. 구체예에서, SAR의 상이한 작용 단위는 2개 이상의 벡터를 사용하여 표현된다. 예시적인 절단가능한 링커 및 퓨린 절단 부위의 핵산 및 아미노산 서열은 표 20에 제공된다.
"보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 서열 변형(conservative sequence modifications)"은 암호화된 단백질의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 예를 들어, "보존적 서열 변형"은 개시내용의 SAR의 결합 특성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다 (예를 들어, 불변 사슬, 항체, 항체 단편, 또는 비면역글로불린 결합 도메인의 보존적 변화). 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측사슬을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측사슬를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측사슬(예: 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산성 측사슬(예: 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)), 하전되지 않은 극성 측사슬(예: 글리신(glycine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 트립토판(tryptophan)), 비극성 측사슬(예: 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine)), 베타-분지형 측사슬 (예를 들어, 트레오닌(threonine), 발린(valine), 이소류신(isoleucine)) 및 방향족 측사슬(예를 들어, 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine))을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 SAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측사슬 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 SAR은 본원에 기재된 결합 및/또는 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
본원에서 사용되는 "공동자극 세포내 신호전달 도메인(costimulatory intracellular signaling domain)" 또는 "공동자극 도메인(Co-stimulatory domain)" 또는 "CSD"는 T 세포의 증식, 생존 및/또는 발달을 향상시키는 SAR의 부분을 지칭한다. 본 개시내용의 SAR은 0, 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 공동자극 도메인은 예를 들어 TNFR 슈퍼패밀리의 구성원, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), BAFF-R, HVEM, CD27, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합의 임의의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 추가의 예시적인 공동자극 도메인은 2B4, NKp30, NKp44, NKp46, GITR, CD81, CD160, DAP10 및 B7-H3의 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 공동자극 도메인(예를 들어, 다른 단백질로부터의)은 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 동시자극 도메인은 이로부터 유래되는 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 SAR은 0(zero), 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
용어 "공동자극 분자(costimulatory molecule)" 또는 "공동자극 수용체(costimulatory receptor)"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 이에 한정되지 않으며, 증식, 활성화 또는 사이토카인 분비와 같은 면역 세포에 의한 공동자극 반응을 조절하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등) 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극성 세포외 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자는, 이에 제한되지 않으며, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체뿐만 아니라 OX40, Dap10, CD27, CD28, CD2, CD5, CD8, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CD81 및 4-1BB (CD137)를 포함한다. 공동자극 수용체는 T 세포 이외의 세포, 예를 들어 NK 세포 또는 대식세포 상에서 발현될 수 있다.
용어 "cTCR"은 TCR로부터 유래되지 않은 항원 결합 도메인에 연결된 야생형 TCR 핵산 코딩 서열 및 상응하는 야생형 TCR 단백질을 의미한다. cTCR은 (Gross, Waks, & Eshhar, 1989)에 설명되어 있다. cTCR은 일부 실시형태에서 및 기준 대조군으로서 사용된다. 예를 들어, CD19 결합 도메인 및 CD19-SIR (돌연변이 TCR 사슬 및 CD19 결합 도메인 포함하는)을 갖는 cTCR은 표적 항원에 대해 상이한 발현 및/또는 차이 결합 친화도를 가질 것이다.
용어 "세포질(cytosolic)" 또는 "세포질(cytoplasmic)"은 작용제, 예를 들어, 성숙한 형태로 세포의 세포질에 위치하는 단백질과 같은 요소를 의미한다. 세포질 단백질은 핵으로 전위될 수 있지만 막관통 단백질이 아니며 세포 외부로 분비되지 않는다.
사이토카인 방출 증후군(CRS)은 발열, 저혈압, 숨가쁨, 신장 기능 장애, 폐 기능 장애 및/또는 모세혈관 누출 증후군과 같은 징후와 증상의 집합체로 나타나는 세포 요법(예: SAR-T, 이중특이성 T 세포 참여 항체 등)의 합병증이다.
용어 "퇴행성 장애(degenerative disorders)"는 퇴행성 세포 변화에 기초한 지속적인 과정의 결과인 질병을 말하며, 조직이나 기관에 영향을 미치며, 이는 정상적인 신체 마모 또는 운동이나 식습관과 같은 생활 방식 선택으로 인해 시간이 지남에 따라 점점 더 악화된다. 예시적인 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 진성 당뇨병 (II형), 및 죽상동맥경화증을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유래된(derived from)"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자로부터 유래된 제1 분자에 대한 공정 또는 공급원 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체 분자로부터 유래되는 항원 결합 도메인의 경우, 항원 결합 도메인은 필요한 기능, 즉 항원에 결합하는 능력을 갖도록 충분한 항체 구조를 보유한다. 이는 항체를 생산하는 특정 과정에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 제공하기 위해, 항체 서열로 시작하여 항원 결합 도메인에 도달하기 위해 원치 않는 서열을 삭제하거나 돌연변이를 부과해야 한다는 것을 의미하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "이량체화 분자(Dimerization Molecule)"는 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 구체예에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연적으로 발생하지 않거나, 현저한 이량체화를 초래할 수 있는 농도에서 발생하지 않는다. 구체예에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어, 라파마이신(rapamycin) 또는 라팔로그(rapalogue), 예를 들어, RAD001, 리미듀시드(rimiducid) 또는 AP20187이다. 리미듀시드는 약 0.01-1 mg/kg일 수 있고, 약 0.1nM의 세포 배양에서 EC50을 갖는다. AP20187은 약 2-10mg/kg/일의 단일 또는 다중 용량으로 투여할 수 있다.
어구 "표적 항원의 발현과 관련된 질환(disease associated with expression of a target antigen)" 또는 "본원에 기재된 질환 관련 항원(disease associated antigen as described herein)"은, 이에 제한되는 것은 아니며, 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 골수증식성 장애 또는 전백혈병; 또는 본원에 기재된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련을 포함하는 본원에 기재된 표적 항원의 발현과 관련된 질병 또는 본 문서에 기술된 표적 항원을 발현하는 세포와 관련된 상태를 포함한다.
본원에서 사용되는 "유전자 변형 세포에 의해 표적화된 질환(disease targeted by genetically modified cells)"은 유전자 변형 세포가 병든 세포를 표적으로 하는지 또는 건강한 세포를 표적으로 삼는지에 관계없이, 본 개시물의 유전자 변형 세포에 의해 임의의 질환에 임의의 방식으로 관여하는 임의의 세포를 표적화하는 것을 포괄한다.
용어 "해리 상수(Dissociation constant) (Kd)"는 수용체-리간드(예: 결합 도메인-동족) 상호작용의 해리의 평형 상수로 정의된다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비천연 발생 면역 수용체의 다양한 세트(diverse set of non-naturally occurring immune receptors)" 또는 " SAR의 다양한 세트(diverse set of SARs)"는 항원을 표적으로 하는 다수의 비천연 발생 면역 수용체 또는 SAR을 지칭한다. 실시예에서, SAR의 다양한 세트는 신호전달 사슬의 다양한 세트 또는 "골격(backbones)"에 연결된 동일한 결합 도메인을 갖는다. 구체예에서, SAR의 다양한 세트는 표적 항원에 대한 다양한 범위의 결합 친화도를 보유할 수 있다. 구체예에서, SAR의 다양한 세트는 다양한 발현 수준을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "에피토프(epitope)"는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 부분, 또는 항체 또는 항체 단편에 결합하는 항원의 부분으로 정의된다. 에피토프는 단백질 서열 또는 서브서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인게이저(engager)"는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구) 및 면역 세포의 활성화를 초래하는 종양 세포 사이의 연결을 형성할 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩티드를 의미한다. 인게이저의 예에는, 이에 제한되지 않으나, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 킬러 세포 인게이저(BiKE), 삼중특이성 킬러 세포 인게이저(TRiKE), 또는 다중 특이성킬러 세포 인게이저, 또는 다중 면역 세포 유형과 호환되는 범용 인게이저가 포함된다.
용어 "발현 벡터(expression vector)"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소들; 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있는 발현을 위한 다른 요소들을 포함한다. 발현 벡터는 코스미드(cosmids), 플라스미드(plasmids) (예를 들어, 리포솜에 네이키드 되거나 또는 함유됨) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는, 당업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
단백질(예를 들어, SAR, IL-2, IL-15 등)의 "기능적 부분(functional portion)"("생물학적 활성 부분(biologically active portion)")은 전장 또는 성숙 단백질의 하나 이상의 기능을 보유하는 단백질의 일부를 지칭한다. IL-12 또는 IL-15에 대한 이러한 기능에는 NK 세포 생존 촉진, NK 세포 및 T 세포 활성화 및 증식의 조절뿐만 아니라 조혈 줄기 세포로부터의 NK 세포 발달 지원이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "F(ab)"는 항원에 결합하지만 1가이고 Fc 부분을 갖지 않는 항체 구조의 단편을 의미하며, 예를 들어, 효소 파파인에 의해 분해된 항체는 2개의 F(ab) 단편 및 Fc 단편 (예를 들어, 중(H) 사슬 불변 영역; 항원에 결합하지 않는 Fc 영역)을 생성한다.
본원에 사용된 바와 같이, "F(ab')2"는 전체 IgG 항체의 펩신 소화에 의해 생성된 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이 단편은 2개의 항원 결합 (ab') (2가) 영역을 가지며, 여기서 각각의 (ab') 영역은 2개의 분리된 아미노산 사슬, 항원에 결합하기 위한 S-S 결합에 의해 연결된 H 사슬의 일부 및 경 (L) 사슬을 포함하고, 여기서 나머지 H 사슬 부분들은 함께 연결된다. "F(ab')2" 단편은 두 개의 개별 Fab' 단편으로 분할될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "FcRγ" 또는 "FCER1G" 또는 "FCRG" 또는 "FcRy"는 Gene ID:2207로 표시되는 유전자를 지칭한다. 고친화성 IgE 수용체 및 기타 Fc 수용체의 일부인 이황화 링커 막관통 신호전달 어댑터이다.
SAR과 관련하여 사용되는 용어 "기능적 부분(functional portion)"은 SAR의 임의의 부분 또는 단편을 의미하며, 이 부분 또는 단편은 그것이 부분인 SAR(모 SAR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 부분은, 예를 들어, 표적 세포를 인식하거나, 질병을 검출, 치료 또는 예방하는 능력을 모 SAR과 유사하게, 동일하게, 또는 더 높은 범위로 보유하는 SAR의 부분들을 포괄한다. 모 SAR과 관련하여, 기능적 부분은 예를 들어, 모 SAR의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가요성 폴리펩티드 링커(flexible polypeptide linker)"는 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커를 지칭하며, 폴리펩티드 사슬을 함께 연결한다 (예를 들어, 가변 중사슬 및 가변 경사슬 영역을 함께). 한 실시형태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, (예를 들어, 서열번호 2431)을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=l, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=l0. 한 실시형태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "유전자 변형 세포(genetically modified cells)", "리디렉션된 세포(redirected cells)", "유전자 조작 세포(genetically engineered cells)" 또는 "변형된 세포(modified cells)"는 본원의 SAR을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 SAR을 암호화하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 동일한 벡터에서 SAR 및 하나 이상의 부속 분자 (예를 들어, PDL1, PDL2, crmA, MC159 등)을 암호화하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 SAR을 암호화하는 제1 벡터 및 부속 분자를 암호화하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 SAR을 암호화하는 제1 벡터 및 둘 이상의 부속 분자를 암호화하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 SAR을 암호화하는 제1 벡터 및 제1 부속 분자를 암호화하는 제2 벡터 및 제2 부속 분자를 암호화하는 제3 벡터를 포함한다.
본원에 정의된 "HLA-비의존성 TCR(HLA-independent TCR)" 또는 "MHC-비의존성 TCR(MHC-independent TCR)"은 MHC 제한과 무관한 항원을 인식할 수 있는 TCR이다. 예시적인 실시형태에서, HLA-비의존성 TCR은 MHC 복합체에 의해 제시되지 않는 세포 표면 상의 항원에 결합할 수 있다. 구체예에서, HLA-비의존성 TCR은 MHC 복합체에 의한 제시와 무관하게 세포 표면 상에서 발현되는 항원에 결합할 수 있다. HLA 비의존성 TCR은 자연 발생 TCR일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, HLA-비의존성 TCR은 유비쿼터스하게 발현된, 단형성 항원 제시 분자인 MR1을 인식하는 MC.7.G5 (MC7G5)이다. HLA 비의존성 TCR은 조작된 TCR 또는 재조합 TCR일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, HLA-비의존성 TCR은 CD19, CD20, 메조텔린, PSMS 또는 BCMA와 같은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질에 결합할 수 있는 조작된 TCR이다. TCR의 가변 도메인을 조작하는 방법(예: CDR 그라프팅 등)은 당업계에 공지되어 있으며, MHC 복합체와 독립적으로 세포외로 발현되는 단백질 (예를 들어, CD19, MSLN, PSMA 등) 또는 단백질 에피토프에 결합할 수 있는 HLA-비의존성 TCR을 생성하는데 사용될 수 있다. 본원은 하나 이상의 AABD를 포함하는 HLA-비의존성 TCR을 포함하는 TCR의 골격을 갖는 이중특이성, 이중파라토프성 및 다중특이성 SAR을 제공한다. TCR의 골격(예를 들어, HLA 비의존성 TCR)을 갖는 본원의 SAR의 AABD 도메인은 완전한 인간, 인간화 또는 비인간일 수 있다. 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 완전 인간 vH 도메인을 포함하는 TCR (예를 들어, HLA 비의존성 TCR)을 제공한다. 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 완전 인간 vL 도메인을 포함하는 TCR (예를 들어, HLA 비의존성 TCR)을 제공한다.
본원에 정의된 "HLA-비의존성 TCR 가변 도메인(HLA-independent TCR variable domain)"은 HLA-비의존적 방식으로 항원에 결합할 수 있는 TCR의 가변 도메인이다. HLA 비의존성 가변 도메인은 HLA 비의존성 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 가변 도메인일 수 있다. HLA 독립적 TCR 가변 도메인은 단일 가변 도메인 TCR (즉, svd-TCR)일 수 있다. HLA 비의존성 TCR 가변 도메인은 자연 발생 HLA 비의존성 가변 도메인 또는 조작된 HLA 비의존성 가변 도메인일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 조작된 HLA-비의존성 가변 도메인은 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, CDR 그라프팅(grafting), 선별하는 파지 디스플레이 라이브러리(screening phage display libraries) 등)을 사용하여 단백질 (예를 들어, CD19, CD22, BCMA, MSLN, PSMA)의 세포외 도메인에 대해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "HLA-제한된(HLA-restricted)" 또는 "MHC-제한된(MHC-restricted)"은 MHC 분자 및 이의 펩티드 둘 다를 필요로 하는 항원 인식을 지칭한다. "HLA 제한 없음(not HLA-restricted)" 또는 "HLA 비의존성(HLA-independent)" 또는 "MHC 제한 없음(not MHC-restricted)"인 항원 인식과 달리.
본원에 사용된 용어 "이종 유전자(heterologous gene)"는 이의 천연 환경에 존재하지 않는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 이종 유전자는 한 종에서 다른 종으로 도입된 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 또한 어떤 식으로든 변형된(예를 들어, 돌연변이, 다중 사본으로 추가된, 비천연 조절 서열에 연결된) 유기체에 고유한 유전자를 포함한다. 또 다른 예로서, 이종 유전자는 세포의 이전 또는 미래의 세포 계통 또는 분화 상태에서 발현되는 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 이종 유전자 서열이 전형적으로 염색체 내의 유전자 서열과 자연적으로 연관되어 발견되지 않거나 자연에서 발견되지 않는 염색체의 부분과 회합되는 DNA 서열에 결합된다는 점에서 내인성 유전자와 구별된다 (예를 들어, 유전자가 정상적으로 발현되지 않는 유전자좌에서 발현된 유전자).
본원에서 사용되는 "힌지 영역(hinge region)" (HR)은 SAR의 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 있는 친수성 영역을 의미한다. 상기 힌지 영역은 항체의 Fc단편 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 힌지 영역 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인조 스페이서 서열 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 힌지 영역의 예는 CD8a 힌지, 및 예를 들어 Gly3 또는 IgGs의 CH1 및 CH3 도메인 (예를 들어, 인간 IgG4)만큼 작을 수 있는 폴리펩티드로 제조된 인공 스페이서를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 (i) IgG4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (ii) IgG4의 힌지 영역, (iii) IgG4의 힌지 및 CH2, (iv) CD8a의 힌지 영역, (v) IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 영역, (vi) IgG1의 힌지 영역 또는 (vi) IgG1의 힌지 및 CH2 영역 중 어느 하나 이상이다. 몇몇 예시적인 힌지 영역이 본 명세서의 표 29에 제공된다. 다른 힌지 영역은 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 대안적인 실시예와 관련하여 사용될 수 있다.
용어 "면역 장애(immune disorder)"는 면역계의 기능장애를 특징으로 하는 질환을 의미한다. 자가면역 질환은 정상적인 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 상태이다. 자가면역질환에는 최소 80가지 유형이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 세포(Immune effector cell)"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어, 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 비만 세포, 단핵세포/대식세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
"면역 이펙터 기능(Immune effector function)" 또는 "면역 이펙터 반응(immune effector response)", "이펙터 기능(effector function)"은 분화된 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포 또는 NK 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다. 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)의 경우, 항원 제시 및 사이토카인 분비가 이펙터 기능의 예이다.
본원에서 사용되는 "면역 반응(Immune response)"은 선천성 면역, 체액성 면역, 세포성 면역, 면역, 염증 반응, 후천성(적응성) 면역, 자가면역 및/또는 과민성 면역을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "인터루킨(Interleukin)-2" ("IL-2") 및 "인터루킨(Interleukin)-15" ("IL-15")는 T 및 NK 세포 활성화 및 증식을 조절하는 사이토카인을 지칭한다. 이 사이토카인은 많은 생물학적 활동을 공유한다. 그들은 공통 수용체 서브 유닛들에 결합하는 것으로 밝혀졌으며 동일한 수용체에 대해 경쟁할 수 있으므로 서로의 활성을 부정적으로 조절할 수 있다. 다양한 IL-2 및 IL-15 분자의 서열이 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, IL-2는 야생형 IL-2 또는 70-99.9% 아미노산 서열 상동성을 갖는 이의 변이체다 (예를 들어, 서열번호 7833-7837). 한 측면에서, IL-15는 야생형 IL-15 또는 70-99.9% 아미노산 서열 상동성을 갖는 이의 변이체다 (예를 들어, 서열번호 7838-7841). 일부 측면에서, IL-2는 포유동물 IL-2이다. 일부 측면에서, IL-15는 포유동물 IL-15 (예를 들어, 호모 사피엔스 인터루킨 15 (IL15), 전사체 변이체 3, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_000585.4; Canis lupus familiaris interleukin 15 (IL15), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001197188.1; Felis catus interleukin 15 (IL15), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001009207.1). 특정 측면에서, IL-2 또는 IL-15의 전부 또는 기능적 부분들은 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 연결된다. 한 측면에서, NK 세포 또는 T 세포는 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 IL-2 또는 IL-15의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 특정 측면에서, 막관통 단백질의 부분은 막관통 단백질의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)" (ISD) 또는 "활성화 도메인(activation domain)"은 분자의 세포내 신호전달 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. 이펙터 기능 신호를 형질 도입하는 도메인의 예는 T-세포 수용체 복합체 또는 임의의 이의 상동체의 z 사슬, 인간 CD3 제타 사슬, CD3 폴리펩티드 (γ, δ 및 ε), syk패밀리 티로신 키나제 (Syk, ZAP 70 등), src 계열 티로신 키나제(Lck, Fyn, Lyn 등) 및 CD2, CD5 및 CD28과 같은 T 세포 형질 도입에 관여하는 다른 분자들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 세포내 신호전달 도메인은 당업자에게 자명할 것이며, 본원의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 "1차 세포내 신호전달 도메인(primary intracellular signaling domain)" 또는 "활성화 도메인(activation domain)"을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극 또는 항원 의존성 모사를 담당하는 분자들로부터 유래된 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극성 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 비의존성 자극을 담당하는 분자들로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3z의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극성 세포내 신호 도메인은 CD28 또는 41BB와 같은 공동수용체나 공동자극 분자의 세포질 서열로 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지되어 있는 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, CD3-제타, 공통 FcR 감마 (FCER1G 또는 FcRγ 또는 FCRG), Fc 감마 RIIIa, FcR 베타 (Fc 엡실론 (Epsilon) R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "단리된(isolated)"은 다른 물질로부터 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 작용제 또는 세포 물질을 의미한다. 한 측면에서, 용어 "단리된"은 천연 공급원에 각각 존재하며, 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관으로부터 분리된, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관을 지칭한다. 용어 "단리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 의미한다. 더욱이, "단리된 핵산(isolated nucleic acid)"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 단백질로부터 단리되는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 정제된 및 재조합한 폴리펩티드 모두를 포괄하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 단리되는 세포 또는 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 배양 및 조작된 세포 또는 조직 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
"긴 링커(long linker)" 또는 "긴 링커 도메인(long linker domain)"은 길이가 25 내지 500개 아미노산인 링커이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500개 아미노산 및 그 사이의 임의의 수이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 25 내지 125개 아미노산이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 50 내지 150개 아미노산이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 75 내지 175개 아미노산이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 100 내지 200개 아미노산이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 120 내지 220개 아미노산이다. 한 실시형태에서, 긴 링커는 길이가 100 내지 300개 아미노산이다.
실시형태에서, 링커는 면역글로불린 (Ig) 도메인 또는 Ig 유사 도메인 또는 이의 단편을 암호화하거나 포함한다. 용어 "Ig 도메인", "Ig 링커 도메인", "Ig 유사 도메인" 또는 "Ig 유사 링커 도메인"은 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용된다. 면역 글로불린 도메인은 약 125 개의 아미노산으로 구성된 그리스 키 토폴로지를 가진 두 개의 β 시트로 배열된 7-9 개의 역 평행 β 가닥의 2 층 샌드위치로 구성된 단백질 도메인 유형이다. Ig 도메인은 IgV, IgC1, IgC2 또는 IgI로 분류할 수 있다. 9개의 베타 가닥을 갖는 IgV 도메인은 일반적으로 7개의 베타 가닥을 갖는 IgC 도메인보다 길다. 실시형태에서, 링커는 IgV 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 링커는 IgC 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. Ig 도메인은 면역글로불린, T 세포 수용체 사슬, 클래스 I MHC, 클래스 II MHC, β2 마이크로글로불린, 보조수용체 (예를 들어, CD4, CD8, CD19 등), 항원 수용체 보조 분자 (예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD79a, CD79b), 공동자극 또는 억제 분자 (예를 들어, CD28, CD80, CD86), NK 세포 수용체 (예를 들어, KIR), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 (LILR), IgSF CAM (예를 들어, NCAM, ICAM, CD2 등), 사이토카인 수용체(예: IL-1R, CSF-1R 등), 성장 인자 수용체 (예를 들어, PDGFR), 수용체 티로신 키나제 및 포스파타제, Ig 결합 수용체, 세포골격 단백질 (예를 들어, 티틴, 팔라딘 등) 및 기타 단백질(예: CD147, CD90 등)에서 발견된다. 예시적인 Ig 링커 도메인은 IgCL (서열번호 3536) 및 IgG1-CH1 (서열번호 3537)이다. 추가의 예시적인 Ig 링커는 표 13에 제시되어 있다 (서열번호(PRT) 3538-3569). 실시형태에서, 링커는 E 세트 도메인을 소유한다. E 세트 도메인은 면역글로불린 및/또는 피브로넥틴 III형 슈퍼패밀리와 관련이 있을 수 있는 "초기(early)" Ig 유사 폴드 패밀리이다. 구체예에서, 링커는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 보유한다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 a) vL, Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 b) vH, Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 Fv-유사 또는 Fc-TCR 항원 결합 모듈을 포함한다. 일부 실시형태에서, vL, Vα 또는 Vγ 도메인의 C-말단에 융합된 제1 펩티드 링커 및/또는 vL, Vα 또는 Vγ 도메인의 C-말단에 융합된 제2 펩티드 링커가 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 펩티드 링커는 서로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 중사슬 및/또는 경사슬 불변 영역으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 CH3 항체 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드 링커에 함유된 면역글로불린 중사슬 불변 도메인 (예를 들어, CHI 또는 CH3)은 IgG (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA (예를 들어, IgAl 또는 IgA2), IgD, IgM, 또는 IgE 중사슬, 선택적으로 인간으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 TCR 서브유닛 불변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 a) TCRa 및 β 서브유닛 불변 도메인; 또는 b) TCR γ 및 δ 서브유닛 불변 도메인으로부터 유도된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 합성이다. 일부 실시형태에서, 모든 vL, Vα 또는 Vγ 및 vH, Vβ 또는 Vδ CDR은 동일한 항체 또는 TCR 모이어티로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, vL 항체 도메인 및 vH 항체 도메인은 둘 이상의 항체 모이어티로부터 유래된 항체 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, vL 항체 도메인은 vH 항체 도메인으로부터 유래된 항체 CDR을 포함하고/하거나 vL 항체 도메인은 vH 항체 도메인으로부터 유래된 항체 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, vL 항체 도메인은 하나의 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 다른 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하고/하거나, vH 항체 도메인은 하나의 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 다른 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vα 도메인 및 Vβ 도메인은 둘 이상의 TCR로부터 유래된 TCR CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vα 도메인은 Vβ TCR 도메인으로부터 유래된 CDR을 포함하고/하거나 Vβ 도메인은 Vα 도메인으로부터 유래된 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vα 도메인은 하나의 TCR로부터 유래된 프레임워크 영역 및 다른 TCR로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하고, 및/또는 Vβ 도메인은 하나의 TCR로부터 유래된 프레임워크 영역 및 다른 TCR로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인 및 Vδ 도메인은 둘 이상의 TCR로부터 유래된 TCR CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 Vδ TCR 도메인으로부터 유래된 CDR을 포함하고/하거나 Vδ 도메인은 Vγ 도메인으로부터 유래된 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 하나의 TCR로부터 유래된 프레임워크 영역 및 다른 TCR로부터 유래된 하나 이상의 CDR들을 포함하고, 및/또는 Vδ 도메인은 하나의 TCR로부터 유래된 프레임워크 영역 및 또 다른 TCR로부터 유래된 하나 이상의 CDR들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 공유 결합(예를 들어, 펩티드 또는 다른 화학적 연결) 또는 비공유 결합에 의해 등적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 디설파이드(disulfide)결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 펩티드 링커는 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 그것이 유래되는 서열과 비교하여 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실)을 포함하는 변이체이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 서로에 대한 이의 결합 친화도를 실질적으로 변경하지 않는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 서로에 대한 이의 결합 친화도를 증가시키고/시키거나 비-자연적으로 발생하는 디설파이드 결합을 도입하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 펩티드 링커는 노브-인-홀 변형을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Carter P. Immunol Methods. 248:7-15, 2001] 참조). 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 펩티드 링커는 서로와의 회합을 향상시키기 위해 정전기적 조향에 의해 변형된다 (예를 들어, 문헌 [WO2006106905] 및 [Gunasekaran K, et al. J Biol Chem. 285:19637-46, 2010] 참조). 일부 실시형태에서, Fv-유사 또는 TCR-Fv-유사 항원-결합 모듈은 인간, 인간화, 키메라, 반합성, 또는 완전 합성이다.
IgCL 및 IgG1-CH1 링커를 포함하는 예시적인 SAR 구축물은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-DAP10-opt1-Spe-CD3zCP-opt1-F-P2A-dSPE-IgSP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-DAP10-opt2-Xba-CD3zCP-opt2-F-F2A-dXBA-Nde-K13-opt (서열번호 5869)로 표시된다. 이러한 구축물에서 IgG1-CHI 링커 (서열번호(DNA) 1143, 서열번호(PRT) 3537)는 표 13에 제시된 다른 Ig 유사 링커, 예컨대 IgG2-IC-CHI1, IgG3-CHI1, IgG4-CHI1, IgAI-CHI1, IgA2-CHI1, IgD-CHI1, IgE-CHI1 또는 IgM-CHI1에 의해 대체될 수 있다. IgCL 및 IgG1-CH1 링커는 또한 각각 TCRα 및 TCRβ로부터 유래된 Ig 유사 링커로 대체될 수 있다(표 13). 대안적으로, IgCL 및 IgG1-CH1 링커는 또한 TCRγ 및 TCRδ 사슬로부터 유래된 Ig 유사 링커에 의해 대체될 수 있다 (표 13).
본원에 사용된 용어 "리간드(ligand)"는 수용체에 결합하는 분자를 의미한다. 특히, 리간드는 다른 세포의 수용체에 결합하여 세포 간 인식 및/또는 상호작용을 허용한다.
본원에 사용된 용어 "링커(linker)" (또한 "링커 도메인(linker domain)" 또는 "링커 영역(linker region)")는 본원에 개시된 SAR 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 2개 이상의 도메인 또는 영역을 각각 함께 결합하는 올리고(oligo) 또는 폴리펩티드 (또는 폴리펩티드를 암호화하는 올리고)를 의미한다. 링커는 길이가 1 내지 500 아미노산이거나 길이가 3 내지 1500 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, "링커"는 절단가능하거나 비-절단가능하다. 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "링커"는 비-절단가능한 링커를 의미한다. 상기 비-절단가능한 링커는 서로에 대해 인접한 단백질 도메인의 자유로운 이동을 허용하는 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 비제한적인 예는 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 비가요성 잔기를 포함한다. 절단가능한 링커의 예는 2A 링커(예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 피코르나바이러스(picornaviral) 2A 유사 링커, CHYSEL 서열의 돼지 테스코바이러스(P2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A) 또는 조합, 이의 변이체 및 기능적 균등물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래하는 모티프를 포함할 수 있다 (예를 들어, T2A 서열 참조). 몇몇 예시적인 절단가능한 링커의 핵 서열은 서열번호 1233 내지 서열번호 1238에 제공되고, 몇몇 예시적인 링커의 아미노산 서열은 서열번호 3627 내지 서열번호 3632에 제공된다. 본원에서 사용될 수 있는 다른 절단가능한 링커는 당업자에 의해 용이하게 인식된다. 링커 모듈은 또한 표 13에 제시된 TCR 및 항체 링커를 지칭한다.
실시형태에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티프 (서열번호 3633)는 또한 절단가능한 링커 서열의 상류에 첨가되어, 절단의 효율을 향상시킨다. 절단가능한 링커의 잠재적인 단점은 N-말단 단백질의 끝에 남아 있는 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 미치거나 단백질의 항원성에 기여할 수 있다는 가능성이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 일부 실시형태에서, 퓨린 절단 부위 (RAKR) (서열번호3635)가 SGSG 모티프의 상류에 첨가되어 번역 후에 잔류 2A 펩티드의 절단을 촉진한다.
용어 "렌티 바이러스(lentivirus)"는 Retroviridae 계통의 속을 의미한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하다. 그들은 숙주 세포의 DNA에 상당한 양의 유전 정보를 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티 바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)"는 특히 Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)에 제공된 바와 같은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 의미한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어, 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)로부터의 렌티벡터 유전자 전달 기술(LENTIVECTOR® gene delivery technology), Lentigen으로부터의 렌티맥스(LENTIMAX™) 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스 벡터의 비임상적 유형이 또한 이용 가능하며, 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 pLENTI-EF1α (서열번호 1), pLENTI-EF1α-DWPRE (서열번호 2), pCCLc-MNDU3-WPRE (서열번호 4) 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE (서열번호 5)이다. 예시적인 실시형태에서, SAR, 또는 SAR 플러스 부속 모듈(들), 또는 부속 모듈(들)을 암호화하는 핵산 단편은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 pLENTI-EF1α 및 pCCLc-MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPRE 벡터에 존재하는 부위Nhe I 및 Sal I사이에 복제될 수 있다.
본원에서 사용되는 "킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(Killer cell immunoglobulin-like receptors)" 또는 "KIRs"는 자연 살해 세포 및 T 세포의 하위세트에 의해 발현되는 막관통 당단백질의 패밀리를 지칭한다.
본원에 사용된 "포유동물(mammal)"은 포유류 클래스의 임의의 구성원을 지칭한다.
"마커 유전자(marker gene)"는 표적 세포에 의해 정상적으로 발현되지 않는 단백질을 암호화하여 성공적인 형질도입을 식별할 수 있다. 마커 유전자는 또한 형질 도입된 세포 (예를 들어, SAR-발현 세포)의 선택적 고갈 또는 농축을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 마커 유전자는 tEGFR, CD20, tCD19, tBCMA 및 RQR8을 포함한다.
"다목적 스위치(multipurpose switch)" 또는 "다목적 유전자(multipurpose gene)"는 자살, 생존 및 마커 기능을 제공하는 단백질을 암호화한다. 구체예에서, 상기 모든 기능은 단일 폴리펩티드 사슬에 의해 제공된다. 예시적인 다목적 스위치는 IL2-tBCMA, IL15-tBCMA, IL2-RQR8, 및 IL2-tHer2 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 "미모토페(Mimotope)"는 거대분자, 종종 펩티드이며, 이는 에피토프의 구조를 모방한다. 이 특성 때문에 에피토프에 의해 유도된 것과 유사한 항체 반응을 일으킨다. 주어진 에피토프 항원에 대한 항체는 그 에피토프를 모방하는 미모토페를 인식할 것이다. 미모토페는 펩타이드 압타머의 일종이다.
용어 "다중사슬 합성 항원 수용체(multi-chain synthetic antigen receptor)" "다중사슬 SAR(multi-chain SAR)"은 2개 이상의 폴리펩티드 사슬 포함하는 합성 항원 수용체를 의미한다. 다중 체인 SAR은 이중사슬SAR일 수 있다. 이중사슬 SAR은 2개의 막관련 도메인(예를 들어, 막관통 또는 막고정 도메인)을 포함한다. CD19를 표적으로 하는 예시적인 다중사슬 SAR은 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-Spe-SP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC (서열번호(DNA) 5451 및 서열번호 (PRT) 6283)이다. 이 SAR 구축물에서, hu-mROO5-1 vL 단편은 CD16-F158V-FL-TMCP-v1 모듈에 작동적으로 연결되고, hu-mROO5-1-vH 단편은 CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3에 작동적으로 연결된다. 이 SAR의 두 사슬은 퓨린(F) 및 P2A 절단 가능한 링커 서열에 의해 분리된다. 이 SAR 구축물은 또한 퓨린 (F) 및 F2A 절단 가능한 링커 서열에 의해 SAR 폴리펩티드로부터 분리되는 퓨로마이신(puromycin) 내성 유전자 (PAC)를 발현한다. SAR은 모듈식으로 설계되므로 CD16A-F158V-S197P-FL-v3 모듈 및 CD16-F158V-FL-TMCP-v1 모듈을 다른 신호전달 모듈로 대체되어 다른 신호전달 사슬을 가진 SAR을 생성할 수 있다. 또한, hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-vH 단편은 다른 항원을 표적으로 하는 항원 결합 도메인(예를 들어, vL, vH, vHH, FHVH, 센티린, svd-TCR 등)에 의해 대체되어 다른 항원을 표적으로 하는 SAR을 생성할 수 있다. 예시적인 이러한 다중사슬SAR은 가출원의 표 41에 제공된다. (예를 들어, 서열번호 5451-5462, 5483-5494, 5515-5526, 5547-5558, 5579-5590, 5611-5622, 5643-5654 등). 이들 신규 SAR의 발현 및 활성은 최적의 기능적 활성을 갖는 SAR을 선택하기 위해 개시내용에 기술된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "MHC" 또는 "주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)"는 포유동물에서 다수의 유전자에 의해 암호화되는 세포 표면 분자를 지칭한다. MHC 분자는 클래스 I 및 클래스 II를 포함한다. 클래스 I 분자는 대안적으로 인간에서 "HLA" 또는 "인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)"으로 지칭된다. 부분적으로, HLA 분자 발현의 복잡성으로 인해, HLA는 또한 HLA 시스템으로서 지칭될 수 있다. 인간은 일반적으로 CD8 세포, 즉, 제한된HLA에 처리된 항원을 제시하는 데 관여하는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자를 발현한다. 클래스 II 분자, 예를 들어 DR, DQ, DP 등은 일반적으로 외부에서 유래된 펩타이드를 CD4+ 세포, 즉, 제한된 MHC 클래스 II에 제시하는 것과 관련이 있다. 일반적으로 제한된 MHC는 이식(골수) 매칭에서와 같이 클래스 I 및 클래스 II를 모두 포함한다.
본원에서 사용되는 "천연(native)" 또는 "자연 발생(naturally occurring)" 또는 "내인성(endogenous)"은 세포에 천연하거나 세포에서 자연적으로 발현되는 유전자, 단백질, 핵산 (예를 들어, DNA, RNA 등) 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, T 세포의 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 폴리펩티드는 TCRα 불변 사슬에 접합된 가변 도메인 (Vα)로 구성된다. 천연 또는 내인성 TCRα 사슬 전구체 폴리펩티드는 또한 성숙 폴리펩티드로부터 절단되는 아미노-말단 신호 펩티드로 구성된다.
본원에서 사용되는 "천연 수용체(native receptor)" 또는 "자연 발생 수용체(naturally occurring receptor)" 또는 "내인성 수용체(endogenous receptor)" 또는 "천연 수용체(native receptor)"는 자연에서 발생하는 임의의 수용체를 의미하며, 항원 결합 또는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 이 용어는 다른 포유류 종으로부터의 기능적 변이체, 이소 폼 및 상동체를 포함한다. 천연 수용체는 표적에 결합할 때 세포 신호를 전달할 수 있는 경우 "천연 신호 수용체(native signaling receptor)" 또는 "자연 발생 신호 수용체(naturally occurring signaling receptor)"일 수 있다. 자연 발생 수용체 또는 천연 수용체는 세포에 고유하거나 세포에서 자연적으로 발현된다. 자연 발생 신호전달 수용체 또는 천연 수용체의 예는 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DS4, NKG2D 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, CD3 신호전달 사슬 (CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ)은 "자연 발생 수용체(naturally occurring receptor)"의 정의 내에 포함되지 않고, 대신 신호전달 어댑터로서 분류된다.
본원에 사용된 용어 "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)" 또는 "비-TCR 자연 발생 신호전달 수용체(non-TCR naturally occurring signaling receptor)" 또는 "비-TCR 수용체(non-TCR receptor)" 또는 '비-TCR 신호전달 수용체(non-TCR signaling receptor)'는 T 세포 수용체 (TCR)가 아닌 수용체를 의미한다. 비-TCR 수용체는 T 세포 이외의 세포에서 발현될 수 있다. 비-TCR 수용체는 CD3ζ, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ 사슬의 발현이 결여된 세포에서 발현될 수 있다. "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)"는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인이 결여되어 있다. "non-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)"는 전체 TCR 신호전달 모듈을 모집하지 않는다. 한 실시형태에서, "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)"는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)"는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 전체 코딩 영역을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)"는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 전체 불변 사슬을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)""는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 전체 힌지 도메인 (또는 연결 펩티드)을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, "비-TCR 자연 발생 수용체(non-TCR naturally occurring receptor)""는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하지 않는다. 비-TCR 수용체는 T 세포 이외의 세포에서 발현될 수 있다. "비-TCR 신호전달 수용체(non-TCR receptor)"는 TCR 가변 도메인 (예를 들어, Vα, Vβ, Vγ, Vδ) 또는 Ig 도메인 (예를 들어, 서열번호1158-1175)과 같은 TCR의 단편을 포함할 수 있다. 비-TCR 신호전달 수용체는 전체 TCR 불변 사슬 (즉, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬)을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "비-T 세포 수용체 모듈(non-T cell receptor module)" 또는 "비-TCR 모듈(non-TCR module)" 또는 "비-TCR 신호전달 모듈(non-TCR signaling module)" 또는 "NTCRM"은 T 세포 수용체 막관통 도메인으로 구성된 서열이 결여된 모듈을 지칭하고, T 세포 수용체 연결 펩티드 및/또는 세포내 도메인의 전부 또는 일부를 추가로 결여될 수 있다. NTCRM에는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 막관통 도메인으로 구성된 서열이 결여되어 있다. NTCRM은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 연결 펩티드 및/또는 세포내 도메인의 전부 또는 일부가 추가로 결여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비-CD3 어댑터 모듈(non-CD3 adaptor module)" 또는 "비-CD3 어댑터(non-CD3 adaptor)" 또는 "비-TCR/CD3 어댑터(non-TCR/CD3 adaptor)" 또는 "비-TCR/CD3 신호전달 어댑터(non-TCR/CD3 signaling adaptor)" 또는 ""NCAM"은 T 세포 수용체/CD3 수용체 복합체의 성분이 아닌 신호전달 어댑터를 지칭한다. 실시형태에서, "비-TCR/CD3 어댑터"는 CD3ε, CD3ζ, CD3γ 또는 CD3δ 사슬의 막관통 및/또는 세포질 영역 또는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "N 말단 근처(near the N-terminus)"는 N 말단 내 30개의 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 용어 "vL 및/또는 vH 도메인의 N-말단 또는 N-말단 부근에 작동 가능하게 연결된 AABD(an AABD operably linked to the N-terminus or near the N-terminus of a vL and/or vH domain)"는 vL 또는 vH 단편의 N-말단에서 작동 가능하게 연결되거나 vL 또는 vH 도메인을 포함하는 N-말단의2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 또는 30개 아미노산과 작동 가능하게 연결되는 AABD를 의미한다. 유사하게, 용어 "Va 및/또는 Vb 도메인의 N-말단 또는 N-말단 부근에 작동 가능하게 연결된 AABD(an AABD operably linked to the N-terminus or near the N-terminus of a Va and/or Vb domain)"는 Va 또는 Vb 단편의 N-말단에서 작동 가능하게 연결되거나 Va 또는 Vb 도메인을 포함하는 N-말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 30개의 아미노산과 작동 가능하게 연결된 AABD를 뜻한다. 본원의 AABD는 직접 또는 중간에 있는 링커 서열을 통해 다른 도메인의 N-말단 또는 그 근처에서 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "자연 살해 세포 수용체(Natural Killer Cell Receptor)" 또는 "NK 수용체(NK receptor)"는 자연 살해(NK) 세포에서 발현되는 세포 표면 수용체를 지칭하고, 다른 포유동물 종으로부터의 기능적 변이체, 이소형 및 상동체를 포함한다. NK 수용체는 활성화 수용체 또는 억제 수용체일 수 있다. 예시적인 활성화 NK 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D 및 KIR3DS4를 포함한다. 예시적인 억제성 NK 수용체는 CD94-NKG2A, TIGIT 및 CD96을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "자연 살해 세포(Natural Killer Cells)"("NK 세포")는 면역계의 세포독성 림프구의 일종을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "NKp30" 또는 "NCR3"은 종양 세포의 용해에서 NK 세포를 도울 수 있는 천연 세포독성 수용체(NCR)인 단백질을 암호화하는 유전자(Gene ID: 259197)이다. 이 용어는 다른 포유류 종으로부터의 기능적 변이체, 이소폼 및 상동체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "NKp44" 또는 "NCR2"는 천연 세포독성 수용체(NCR)인 단백질을 암호화하는 유전자(Gene ID: 9436)이다. 이 용어는 다른 포유류 종으로부터의 기능적 변이체, 이소 폼 및 상동체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "NKp46" 또는 "NCR1"은 천연 세포독성 수용체(NCR)인 단백질을 암호화하는 유전자(Gene ID: 9437)이다. 상이한 이소형을 암호화하는 5개의 전사체 변이체가 이 유전자에 대해 발견되었다. 이 용어는 다른 포유류 종으로부터의 기능적 변이체, 이소폼 및 상동체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "NKG2D" 또는 "KLRK1"은 C형 렉틴의 구성원인 단백질을 암호화하는 유전자(Gene ID: 22914)이다. 암호화된 막관통 단백질은 II형 막 배향(세포외 C 말단을 가짐) 및 C형 렉틴 도메인의 존재를 특징으로 한다. 이 용어는 다른 포유류 종으로부터의 기능적 변이체, 이소폼 및 상동체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 작용제(non-naturally occurring agent)" 또는 "비-천연(non-native)" 또는 "외인성(exogenous)"은 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 작용제를 지칭한다. 다른 방식으로 말하자면, 비-자연 발생 작용제는 세포에서 발현되도록 "조작(engineered)"된다. 비-자연 발생 작용제는 자연 발생 작용제의 복제된 버전일 수 있다. 예시적인 비-자연 발생 작용제는 SAR (예를 들어, CAR, SIRs, Ab-TCRs, TFPs, 재조합 TCR)를 포함한다. 비-자연 발생 작용제는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 매개 유전자 전달과 같은 당업계에 공지된 유전자 전달의 기술을 사용하여 세포 내로 발현될 수 있다. 비-천연 발생제는 외인성 프로모터 (예를 들어, EF1α 프로모터) 또는 내인성 프로모터 (예를 들어, TCRα 또는 TRAC 프로모터)를 사용하여 면역 세포에서 발현될 수 있다. 내인성 유전자(예를 들어, CD16, NKp30 등)인 경우)는 세포에서 복제되고 이소성으로 발현되며, 비자연 발생 작용제의 또 다른 예를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 발생 면역 수용체(non-naturally occurring immune receptor)" 또는 "외인성 면역 수용체(exogenous immune receptor)", "비-자연 발생 수용체(non-naturally occurring receptor)"는 면역 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 면역 수용체를 지칭한다. 달리 말하자면, 비-자연 발생 면역 수용체는 면역 세포에서 발현되도록 "조작(engineered)"된다. 비-자연 발생 면역 수용체는 자연 발생 면역 수용체의 복제된 버전일 수 있다. 대안적으로, 비-자연 발생 면역 수용체는 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 생산되는 키메라 수용체일 수 있다. 예시적인 비-자연 발생 면역 수용체는 SAR (예를 들어, 2세대 CAR, SIR, cTCR, STAR, zSIR, Ab-TCRs, TFPs 및 재조합 TCR)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-자연 발생 TCR 항원 결합 도메인(non-naturally occurring TCR antigen binding domain)" 또는 "외인성 TCR 항원 결합 도메인(exogenous TCR antigen binding domain)"은 자연에 존재하는 TCR에 대하여 키메라 및 비-자연적으로 발생하는 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 결합 도메인을 지칭한다. 다른 방식으로 설명하면, 비-자연 발생 TCR 항원 결합 도메인은 TCR에 작동 가능하게 연결되도록 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 "조작(engineered)"되고, 더욱이, 항원 결합 도메인은 자연에서 발견되는 TCR과 구별되는 분자로부터 얻거나 유도된다. 자연에서 TCR과 구별되는 항원 결합 도메인은 항체 vH 및 vL 단편, 인간화 항체 단편, 키메라 항체 단편, 수용체 리간드 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-자연 발생 항원 결합 도메인(non-naturally occurring antigen binding domain)" 또는 "비-자연 발생 세포외 항원 결합 도메인(non-naturally occurring extracellular antigen binding domain)" 또는 "이종 항원 결합 도메인(heterologous antigen binding domain)"은 자연 발생 수용체의 일부가 아닌 항원 결합 도메인을 지칭한다. 다른 방식으로 설명하면, 비-천연 발생 항원 결합 도메인은 자연 발생 신호전달 수용체에 작동 가능하게 연결되도록 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 "조작(engineered)"되고, 더욱이, 항원 결합 도메인은 자연에서 발견되는 신호전달 수용체와 구별되는 분자로부터 얻어지거나 유도된다. 예시적인 이종 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편 (예를 들어, vL, vH, scFv, Fab, F(ab)2), 단일 도메인 항체 (예를 들어, sVH, FHVH, vHH 등), 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, 단일 가변 도메인-TCR (svd-TCR), 재조합 TCRs, HLA-비의존성 TCR, scTCR, 에피토프, 어댑터, 리간드 및 수용체를 포함한다.
용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)" 또는 "기능적으로 연결된(functionally linked)" 또는 "작동적으로 연결된(operationally linked)"은 각 구성요소가 기능적일 수 있도록 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 기능적 연계 또는 연관을 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결됨은 조절 서열과 후자의 발현을 초래하는 이종 핵산 서열 사이의 회합을 포함한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드의 맥락에서, 제1 폴리펩티드는 임의의 연결과 무관한 방식으로 기능하고, 제2 폴리펩티드는 둘 사이의 결합이 없는 것처럼 기능한다. 본원의 SAR의 상이한 도메인의 맥락에서 사용될 때 용어 "작동적으로 연결된(operationally linked)"은 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합 또는 비-펩티드 화학 결합)을 통해 연결되는 도메인을 의미한다. 예시적인 실시형태에서, CD16A의 세포외 도메인의 N-말단에 조작적으로 연결되어 있는 이종 항원 결합 도메인 (예를 들어, CD19 scFv)을 포함하는 SAR은 CD16A의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 프레임에 융합되어 있는 CD19 scFv를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 SAR 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 상이한 도메인 사이의 조작적 결합은 펩티드 결합을 통해 달성된다. 그러나, 특정 실시형태에서, SAR의 상이한 도메인은 비-펩티드 결합, 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 화학적 접합 등을 통해 연결될 수 있다.
"퍼센트 동일성(Percent identity)"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 비교 윈도우를 통해 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 다음의 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 측정된 바와 같은 영역을 지정할 때, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율을 갖는 경우(예를 들어, 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성, 특정 영역에 대한 동일성, 또는, 특정되지 않은 경우, 전체 서열에 걸쳐) 2개의 서열은 "실질적으로 동일(substantially identical)"하다. 선택적으로, 동일성은 길이가 최소 약 50개 뉴클레오티드들 (또는 10개 아미노산들) 이상의 영역에서, 또는 보다 일반적으로 길이가100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드들(또는 20, 50, 200개 또는 그 이상의 아미노산들)인 영역 위에 존재한다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 알고리즘의 두 가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; and Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 E. Meyers 및 W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이는 PAM120 중량 잔류물 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다.
표적 항원의 비제한적인 예는 표 B에 열거되어 있다. 본원의 SAR은 표 B에 열거된 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의) 표적 항원을 직접 또는 본원에 기술된 SAR 어댑터를 통해 통합할 수 있다
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 질환 관련 항원(예: 종양-연관 또는 바이러스-암호화된 항원; 예를 들어, NY-ESO-1, MAGE-A3, MAGE-A4, WT1, 돌연변이체 Ras, HPV16-E7, EBV-LMP2A, AFP, gp100, PSA, 돌연변이체 p53, HIV-1 등으로부터 유래된 펩티드) 및 MHC 클래스 I 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Fv, TCR-Fv, svd-TCR, scTCR 등)을 포함하고, 여기서 MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G이다. 일부 구체예에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C이다. 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A이다. 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-B이다. 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-C이다. 일부 구체예에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74, 또는 HLA-A80이다. 일부 구체예에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A02이다. 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01-555, 예를 들어 HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02: 17, HLA-A*02: 18, HLA-A*02: 19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22, 또는 HLA-A*02:24. 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01이다. HLA-A*02:01은 모든 백인의 39-46%에서 발현되며, 따라서 본원의 사용하기 위한 MHC 클래스 I 단백질의 적합한 선택을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 질환 관련 항원 (예를 들어, 종양-연관 또는 바이러스-암호화된 항원) (예를 들어, NY-ESO-1, MAGE-A3, MAGE-A4, WT1, 돌연변이체 Ras, HPV16-E7, EBV-LMP2A, AFP, gp100, PSA, 돌연변이 p53, HIV-1 등으로부터 유래된 펩티드) 및 MHC 클래스 II 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, vH, Va, Vb, Vg, Vd, Fv, TCR-Fv, svd-TCR, scTCR 등)을 포함하고, 여기서 MHC 클래스 II 단백질은 HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR이다.
본원의 SAR은 또한 다른 종 (예를 들어, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 원숭이 등)으로부터의 질환 관련 항원 및 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함하는 복합체에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "수용체(receptor)"는 하나 이상의 리간드에 선택적으로 결합하는 세포막 상에 존재하는 폴리펩티드 또는 그 일부를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "영역(region)" 또는 "일부(portion)"은 핵산 분자와 관련하여 사용될 때 본원에 기재된 CD3ζ 신호전달 영역과 같은 분자의 전체 길이보다 작은 연결된 뉴클레오티드산 분자를 의미한다.
용어 "레트로바이러스 벡터(retrovirus vector)"는 레트로바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 의미한다. 레트로바이러스 벡터의 예는 Addgene 또는 Clontech로부터 입수가능한 MSCVneo, MSCV-pac (또는 MSCV-puro), MSCV-hygro를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SAR" 또는 "합성 항원 수용체(Synthetic Antigen Receptor)"는 종래의 CAR(예를 들어, 41BB 또는 CD28 공동자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함하는 2세대 CAR)을 포함하고, 또한 항원 특이성을 세포에 부여하기 위한 새로운 접근법, 예를 들어 항체-TCR 키메라 분자 또는 Ab-TCR (WO 2017/070608 A1 본원에 참조로 포함됨), TCR 수용체 융합 단백질 또는 TFP (WO 2016/187349 A1 본원에 참조로 포함됨), 합성 면역 수용체 (SIRs) (본원에 참조로 포함된 WO 2018/102795 A1 참조), STAR (WO 2020/029774 참조), HLA-비의존성 TCR (WO2019157454A1 참조), 삼관능성 T 세포 항원 커플러 (Tri-TAC 또는 TAC) (본원에 참조로 포함된 WO 2015/117229 A1 참조) 및 zSIR (본원에 참고로 포함된 PCT/US2019/035096 참조)를 포괄한다. 이중특이성 및 다중특이성 CARs은 PCT/US2021/022641에 설명되어 있다. 용어 "SAR"은 CAR 뿐만 아니라 재조합 TCR을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 항원 결합 수용체를 포함한다.
일반적으로 "SAR-T"라는 용어는 합성 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포를 지칭하는데 사용된다. 따라서, 이러한 SAR을 보유하는 T 림프구는 일반적으로 SAR-T 림프구로 지칭된다. SAR은 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), NK 세포 및 대식세포와 같은 T 세포 이외의 세포에서도 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, SAR은 불멸화된 세포주, 예컨대 NK92, NK92MI 또는 이의 유도체에서 발현된다. 용어 "SAR-NK"는 SAR을 발현하도록 조작된 NK세포를 의미한다.
일반적으로, 용어 "SAR-T"는 합성 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포 (예를 들어, αβ T 세포, γδ T 세포, Treg, TIL 등)을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 이러한 SAR을 보유하는 T 림프구는 일반적으로 SAR-T 림프구로 지칭된다. SAR은 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 대식세포, B 세포, 과립구, 수지상 세포, 사이토 카인 유도 킬러 세포 (CIK) 등과 같은 T 세포 이외의 세포에서도 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, SAR은 불멸화 된 세포주, 예컨대 NK92, NK92MI 또는 이의 유도체에서 발현된다. 용어 "SAR-NK"는 SAR을 발현하도록 조작된 NK(자연 살해) 세포를 의미한다.
용어 "슬리핑 뷰티 트랜스포존(Sleeping Beauty Transposon)" 또는 "슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터(Sleeping Beauty Transposon Vector)"는 슬리핑 뷰티 트랜스포존게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 의미한다.
용어 "TCR 불변 사슬(TCR constant chain)" 또는 "T 세포 수용체의 불변 영역(constant region of T cell receptor)"은 TCRα/TCRa, TCRβ1/TCRb1, TCRβ2/TCRb2, TCRγ/TCRd, TCRδ/TCRd 및 pre-TCRα의 불변 사슬로서 정의된다. 예시적인 TCR 불변 사슬은 표 12에 열거되어 있다. TCR 불변 사슬은 Ig 유사C1 도메인(예를 들어, 서열번호 1168-1175; 표 13), 연결 펩티드(예를 들어, 서열번호 1177-1184; 표 14), 막관통 도메인(서열번호 1187-1190; [표 15] 및 세포질 도메인(예를 들어, 서열번호1193-1196; 표 16)과 같은 여러 서브도메인으로 분할될 수 있다. TCRα, TCRβ1/β2, TCRγ 및 TCRδ 사슬의 세포질 도메인은 짧고 일반적으로 신호전달 활성에 중요한 역할을 하지 않는 것으로 여겨진다. 본원은 또한 TCR 사슬의 예시적인 결실 돌연변이체 및 변이체를 제공한다(표 12). 이들 결실 돌연변이체 및 변이체는 표적 항원 발현 세포에 의해 결합될 때, 상보적 TCR 사슬과 쌍을 이루는 능력, TCR/CD3 복합체와 조립하는 능력 및 T 세포 신호를 전달하는 능력(예를 들어, NFAT 경로 활성화)와 같은 본래의 TCR 사슬의 기능적 및 생물학적 특성 중 하나 이상을 보유하는 한, SAR 구성에 사용될 수 있다.
용어 "단일사슬 가변 영역(single chain variable region)" 또는 "scFv"는 경사슬의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중사슬의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경사슬 및 중사슬 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 짧고 유연한 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단일사슬 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래되는 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 특정되지 않는 한, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 말단에 대하여, 본원에서 사용되는 바와 같이 scFv는 vL 및 vH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있고, scFv는 vL-링커-vH를 포함할 수 있거나 또는 vH-링커-vL-링커를 포함할 수 있다. 본원에서, scFv는 또한 vL-Gly-Ser-Linker-vH로 기재된다. 대안적으로, scFv는 또한 (vL+vH) 또는 (vH+vL)로서 기재된다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는(specifically binds)" 또는 "특이적인(is specific for)"은 측정 가능하고 재현가능한 상호작용들, 예컨대 표적과 항체 또는 항체 모이어티 사이의 결합, 즉 생물학적 분자들을 포함하는 분자들의 이질적인 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 결정짓는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 SAR 또는 항원 결합 도메인은 다른 표적들에 대한 결합 친화도의 약 10배 이상인 결합 친화도로 항원의 하나 이상의 항원 결정인자 (예를 들어, 세포 표면 항원 또는 펩티드/MHC 단백질 복합체)와 반응한다.
용어 "신호전달 도메인(signaling domain)"은 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응하여 이펙터들로서 기능함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전달하는 단백질의 기능적 영역을 지칭한다.
용어 "신호전달 모듈(signaling module)"은 세포 신호를 개시할 수 있는 하나 이상의 신호전달 매개체 또는 신호전달 어댑터를 포함하는 분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 세포 신호는 NFAT, AKT, STAT 또는 NF-κB 경로와 같은 세포 신호전달 경로의 활성화를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 모듈은 신호전달 복합체의 일부인 세포질 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 하나 이상의 단백질을 모집한다. 예를 들어, TCR 관련 신호전달 모듈에는 CDγε, CDδε 및 CD3ζζ가 포함된다. 예시적으로, NK 세포에서 작동하는 신호전달 모듈은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및 DAP12와 같은 신호전달 어댑터를 포함한다.
용어 "신호전달 매개체(signaling mediator)" 또는 "신호전달 어댑터(signaling adaptor)"는 천연 또는 비천연 신호전달 수용체에 의해 모집될 때 세포 신호를 개시하거나 억제할 수 있는 분자를 지칭한다. 신호전달 수용체와 대조적으로, 신호전달 어댑터는 그 자신의 항원 결합 도메인 또는 리간드 결합 도메인이 결여되어 있다. 예시적인 신호전달 어댑터는 CD3ζ (CD3z), FcRγ, DAP10, DAP12, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ를 포함한다. 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인이 신호전달 어댑터의 하나 이상의 사슬의 힌지 도메인 또는 막관통 도메인에 조작적으로 연결된 SAR을 제공한다. 구체예에서, SAR은 TCR 복합체(예를 들어, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3ε 등)의 성분인 신호전달 어댑터를 포함한다. 구체예에서, SAR은 TCR 복합체의 TCRα, β, γ 및/또는 δ 사슬과 상호작용하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 구체예에서, SAR은 TCR 복합체의 TCRα, β, γ 및/또는 δ 사슬과 상호작용하지 않는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 TCRα/β 막관통 영역 내의 양전하를 띤 잔기와 상호작용하는 이의 막관통 도메인 내에 보존된 아스파르트산 잔기를 갖는 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ)를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 이의 막관통 도메인에서 보존된 아스파르트산 잔기가 결여된 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시예에서, SAR은 TCR 복합체의 성분이 아닌 신호전달 어댑터(예를 들어, DAP10)를 포함한다. 구체예에서, SAR은 세포 신호전달 (예를 들어, CD3ζ)을 활성화시키는 신호전달 어댑터를 포함한다. 구체예에서, SAR은 세포 신호전달을 억제하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 구체예에서, SAR은 하나 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시예에서, SAR은 2개 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시예에서, SAR은 단일 ITAM 모티프를 소유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 ITAM 모티프가 결여된 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 이의 천연 형태의 디설파이드 링커 이량체인 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 이의 천연 형태의 디설파이드 링커 이량체가 아니다. 실시형태에서, SAR은 이의 천연 상태에서 이의 막관통 영역에 위치하는 사슬간 디설파이드 결합을 함유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 이의 막관통 영역에 위치하지 않는 사슬간 디설파이드 결합을 포함하는 이의 천연 상태의 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, SAR은 이의 천연 상태에서 이의 세포외 영역에 위치하는 사슬간 디설파이드 결합을 함유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 길이가 10개 아미노산 미만이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 길이가 8개 아미노산 미만이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 10개 이상의 아미노산 길이이다. 한 구체예에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 15개 이상의 아미노산 길이이다. 구체예에서, SAR은 단백질 인산화를 유도하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 구체예에서, SAR은 단백질 탈인산화를 유도하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시예에서, SAR은 Zap70과 상호작용하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시예에서, SAR은 Zap70과 상호작용하지 않는 신호전달 어댑터를 포함한다. 실시형태에서, 이중사슬SAR의 2개의 사슬은 동일한 신호 어댑터(예를 들어, CD3ζ 및 CD3ζ)를 포함한다. 구체예에서, 이중사슬 SAR의 2개의 사슬은 동일하지 않은 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ 및 FcRγ 또는 CD3ζ 및 DAP10 등)를 포함한다.
용어 "신호전달 사슬(signaling chain)" 또는 "신호전달 단편(signaling fragment)"은 세포 신호전달 수용체의 막관통 및/또는 세포내 영역 및 선택적 세포회 힌지/연결 펩티드 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예시적인 신호전달 사슬은 TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ의 불변 사슬을 포함한다. 추가의 예시적인 신호전달 사슬은 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, DAP12, DNAM-1, NKG2D, CD32, CD64, KIR3DL1, KIR2DS4, FcRγ 및 CD3z의 막관통 및/또는 세포내 영역을 포함하는 사슬을 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 사슬은 또한 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, DAP12, DNAM-1, NKG2D, CD32, CD64, KIR3DL1, KIR2DS4, FcRγ 및 CD3z의 힌지 도메인 또는 연결 펩티드를 포함한다.
용어 "합성 항원 수용체(Synthetic Antigen Receptor)" 또는 "SAR"은 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는 비-자연 발생 수용체 또는 합성 수용체를 지칭하고, 적어도 1개의 이종 항원 결합 도메인 및 적어도 1개의 막관련 도메인을 포함하며, 여기서 막관련 도메인은 막관통 도메인 또는 막고정 도메인(즉, GPI 연결된 도메인)일 수 있다. SAR의 항원 결합 도메인은 이의 막관련 도메인과 이종성이며, 즉, 항원 결합 도메인은 막 관련 도메인과 상이한 공급원으로부터 유래된다. SAR은 힌지 도메인, 세포외 리간드 결합 도메인 및/또는 세포질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 실시형태에서, SAR은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 세트를 포함하고, 이는 이펙터 세포에서 발현될 때, 표적 세포, 일반적으로 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 발생을 세포에 제공한다. SAR은 단일사슬, 두 개의 사슬 또는 두 개 이상의 사슬일 수 있다. SAR은 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다. SAR은 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 용어 "SAR"은 종래의 키메라 항원 수용체 (예를 들어, 2세대 CAR) 및 차세대 CAR (예를 들어, SIR, cTCR, AbTCR, zSIR, HIT, TFP, TAC 등)을 포함한다. 본원은 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec3, Siglec-7, Siglec-9, CD3ζ, DAP10, DAP12, FcRγ, TCRαβ 및 TCRγδ 등 및 이의 변이체 및 단편으로부터 유래한 하나 이상의 영역을 포함하는 신규한SAR 구성물을 설명한다. 본원은 또한 상기 유전자들의 기능적 변이체를 포함하는 SAR을 제공하고 및/또는 단백질은 대안적인 접합된 이소형들 및 다른 종으로부터의 상동체들을 포함한다. 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 상기 유전자들 및 단백질의 예시적인 영역 또는 단편은 가출원의 표 12-18 및 25-31에 제공된다. 천연 수용체의 예시적인 세포외 도메인은 서열번호: 10842-10877로 제공된다. SAR은 또한 가출원의 표 12-18 및 25-31에 제공된 단편 중 임의의 단편과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 단편으로 구축될 수 있다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 추가 성분들의 핵산 및 아미노산 서열 (예를 들어, vL, vH, scFv, vHH 등)은 표 2-11에 제공된다. SAR은 또한 가출원의 표 2-18 및 25-31의 제공된 단편 중 임의의 것에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 단편으로 구축될 수 있다. 본원의 예시적인 SAR은 가출원의 표 32-34에 제공된다. SAR은 모듈식으로 설계되었으며 SAR의 한 모듈을 다른 모듈로 교체하여 추가 SAR을 구성할 수 있다. 이들 신규 SAR의 발현 및 활성은 최적의 기능적 활성들을 갖는 SAR을 선택하기 위해 개시내용에 기술된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "단일사슬 합성 항원 수용체(single-chain synthetic antigen receptor)" 또는 "단일사슬SAR(single chain SAR)"은 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하는 합성 항원 수용체를 의미한다. CD19를 표적으로 하고 CD16 신호전달 사슬에 기초한 예시적인 단일사슬 SAR은 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-(vL-vH)-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 4954)이다. 이 SAR에서, CD19를 표적으로 하는 인간화 scFv(hu-mROO5-1)는 F158V 및 S197P 돌연변이(CD16A-F158V-S197P-FL-v3)을 운반하는 CD16의 고친화성 비 절단 가능한 돌연변이체의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된다. 상이한 항원 결합 도메인이 CD16A-F158V-S197P-FL-v3 모듈에 조작적으로 연결된 추가의 예시적인 단일사슬 SAR은 가출원의 표 36-39에 제공된다. 추가의 예시적인 단일사슬 SAR은 서열번호 5463-5482에 제공된다. SAR은 모듈식으로 설계되므로, CD16A-F158V-S197P-FL-v3 모듈(서열번호(DNA) 1417 및 서열번호(PRT) 3811)은 NKp30-ECDTMCP-opt2(서열번호 1375), NKp44-ECDTMCP-opt2(서열번호 1389), NKp46-ECDTMCP-opt2(서열번호 1405), CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-2(서열번호 1434), CD32-ECDTMCP-opt2(서열번호 1582), CD64-ECDTMCP-opt2(서열번호 1405), CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-2(서열번호 1434), CD32-ECDTMCP-opt2(서열번호 1582), CD64-ECDTMCP-opt2(서열번호 1584), 2B4-ECDTMCP-opt2 (서열번호 1580), OX40-ECDTMCP-opt2 (서열번호 1578), CD28-ECDTMCP-opt2 (서열번호 1576), 41BB-ECDTMCP-opt2 (서열번호 1574), KIR3DL1 (서열번호 9644) 및 KIR2DS4 (서열번호 9653) 등은 다른 모듈로 대체 될 수 있고, 서로 다른 신호 체인들을 가진 단일 체인 SAR을 생성한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체로부터 유래된 예시적인 모듈은 서열번호 9635-9668로 제공된다. 예시적인 이러한 SAR은 서열번호 9860-9895 및 가출원의 표 41에 제공된다. 이들 신규 SAR의 발현 및 활성은 최적의 기능적 활성을 갖는 SAR을 선택하기 위해 개시내용에 기술된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "합성 면역 수용체(Synthetic Immune Receptor)" 또는 대안적으로 "SIR"은 폴리펩티드 세트, 일반적으로 일부 실시형태에서 2개를 지칭하며, 이는 이펙터 세포에서 발현될 때, 표적 세포, 전형적으로 암 세포, 및 세포내 신호 생성에 대한 특이성을 세포에 제공한다. SIR들은 본원에 참조로 포함되는 WO 2018/102795 A1에 기술된 차세대 CAR 플랫폼을 나타낸다. 일반적인 실시형태에서, SIR은 본원에 기재된 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함하고, 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역에 선택적 링커를 통해 결합된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접한다. 일부 실시형태에서, SIR은 2개 이상의 폴리펩티드의 2개 이상의 세트들을 포함한다. SIR들의 각 세트의 폴리펩티드는 서로 인접하지만(기능성 폴리펩티드 유닛 1), 다른 세트의 폴리펩티드(기능성 폴리펩티드 유닛 2)와는 인접하지 않는다. 일부 구현예에서, SIR의 T 세포 수용체 불변 사슬(또는 영역)은 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCR-알파 또는 hTCRα 또는 hTCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-beta1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-beta1 또는 hTCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타2 (TCR-beta2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 hTCR-beta2 또는 hTCRb2 또는 cβ2 또는 hTCRb2 또는 Cβ2 TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ), 인간 Pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-alpha 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 hTCR-감마 또는 hTCRγ 또는 hTCRg 또는 hTCRγ1 또는 hTCRgamma1, 또는 Cγ), 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 hTCR-델타 또는 hTCRd 또는 hTCRδ 또는 Cδ)에서 선택된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 이의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 반면, 다른 측면에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형이 아닌 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 이의 코돈 최적화된 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형 폴리펩티드 서열을 암호화하는 반면, 다른 실시형태에서는 SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 수반하는 폴리펩티드를 대해 암호화한다. 일부 실시형태에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 운반하는 이의 코돈 최적화된 서열에 의해 암호화된다. 본원은 또한 대응하는 전장 TCR 사슬의 생물학적 및 기능적 특성 중 적어도 하나를 보유하는 TCR 불변 사슬의 결실 돌연변이체를 포함한다. 본원에 기재된 것과 같은 특정 종양 제조자 "X"를 표적으로 하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, 또는 vHH)을 포함하는 SIR은 X-SIR 또는 XSIR로도 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR은 CD19-SIR 또는 CD19SIR로 지칭된다. SIR의 TCR 불변 사슬/도메인은 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 인간 TCR 불변 사슬로 구성되는 것이 유익할 수 있다. 그러나, 일부 예에서, TCR 불변 사슬이 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유도되는 것이 유익하지만, TCR 불변 사슬의 발현을 향상시키는 아미노산 치환을 운반하도록 변형된다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬이 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 인간 TCR 불변 사슬로 구성되는 것이 유익할 수 있지만, 여기서 특정 아미노산은 뮤린 TCR 불변 사슬로부터의 상응하는 아미노산들로 대체된다. 이러한 뮤린화된 TCR 불변 사슬은 SIR의 증가된 발현을 제공한다. SIR 또는 이의 기능적 부분은, 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양쪽 말단에 추가의 아미노산들을 포함할 수 있으며, 이는 SIR을 구성하는 TCR 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열에서 발견되지 않는 추가적인 아미노산이다. 바람직하게는, 추가의 아미노산들은 SIR 또는 기능적 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않는, 예를 들어, 표적 세포를 인식하고, 암을 검출하고, 암을 치료 또는 예방하는 등의 작용을 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 추가적인 아미노산들은 모 SIR의 생물학적 활성과 비교하여 생물학적 활성을 향상시킨다.
본원에 사용된 용어 SVH 도메인은 단일 인간 VH 도메인 항체 (VH sdAb)를 의미한다. 따라서 이러한 용어는 상호 교환적으로 사용된다. SVH라는 용어는 또한 독립적인 vH 도메인과 상호교환적으로 사용된다. SVH는 자율 항원 결합 도메인(AABD)의 한 예이다. 예시적인 SVH는서열번호(DNA) 827-828 및 서열번호(PRT) 3221-3222로 제시된 완전 인간 vH 도메인 (FHVH)이다. 또 다른 예시적인 SVH는 서열번호(DNA) 830-831 및 서열번호(PRT) 8223-8224로 제시된 chVH 도메인이다. 또 다른 예시적인 SVH는 서열번호(DNA) 850-851 및 서열번호(PRT) 3244-3245로 제시된 aVH 도메인이다. 다른 예시적인 SVH 도메인의 서열번호는 표 5에 제시되어 있다. 본 개시내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가의 SVH 도메인은 WO2016062988, WO2016113556, WO2017191476, WO2018039180, WO2019006072, WO2018237037, WO2018119215, WO2019126756, WO2019055689 및 WO2020018922에 제공되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 그 전체가 포함된다.
용어 "자극(stimulation)"은 자극 분자(예: TCR/CD3복합체)와 동족 리간드(또는 표적 항원)의 결합에 의해 유도된 1차 반응을 지칭하며, 이에 제한되지 않으나, 이에 따라 TCR/CD3를 통한 신호전달과 같은 신호전달 이벤트를 매개로 한다. 자극은 특정 분자들의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극성 분자(stimulatory molecule)"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대해 자극적 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 한 측면에서, 신호는 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 개시되고, 이는 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 반응의 매개를 유도하는 1차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 (또한 "1차 신호전달 도메인"으로 지칭되는)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcRγ, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
용어 "대상체(subject)"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 임의의 길들여진 포유동물 또는 인간)를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "대상체(subject)" 또는 "개체(individual)" 또는 "동물(animal)" 또는 "환자(patient)"는 본원의 조성물 또는 제약 조성물의 투여가 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 포유류 대상은 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소(cattle), 소(cows) 등을 포함하며, 인간이 바람직하다.
본원에서 사용되는 "스위치 도메인(Switch domain)" 또는 "이량체화 도메인(dimerization domain)"은 일반적으로 이량체화 분자의 존재 하에, 다른 스위치 도메인과 회합하는 폴리펩티드-기반 엔티티를 지칭한다.
"자살 유전자(suicide gene)", "자살 스위치(suicide switch)" 또는 "킬 스위치(Kill-switch)"는 세포 사멸을 유도할 수 있는 유도 가능한 능력을 가진 단백질을 암호화한다. 예시적인 자살 유전자들은 HSV-TK, iCaspase 9, tEGFR, CD20, tCD19, tHer2, tBCMA, RQR8 등을 포함한다. 예를 들어, CD20-발현 세포는 항체 리툭시맙(Rituximab)으로 처리함으로써 선택적으로 절제될 수 있다. 유사하게, tBCMA 발현 세포는 벨란타맙(belantamab) 마포도틴(mafodotin)으로 처리함으로써 선택적으로 절제될 수 있고, tHer2 발현 세포는 허셉틴(Hercepti)으로 처리함으로써 선택적으로 절제될 수 있다.
"생존 유전자(survival gene)", "생존 스위치(survival switch)" 또는 "생명 스위치(Life-switch)"는 세포에 생존 촉진 신호를 제공하는 단백질을 암호화한다. 예시적인 생존 유전자들은 IL2의 막고정 형태 및 IL15의 막고정 형태를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "T 림프구(T lymphocyte)" 또는 "T 세포(T cell)"는 CD3 (CD3+) 및 T 세포 수용체 (TCR+)를 발현하는 세포를 지칭한다. 구체예에서, T 세포는 CD3 및 TCR을 발현하는 천연 세포 (즉, 재조합 또는 조작되지 않은 세포)이다.
본원에 사용된 용어 "TCR" 또는 "T 세포 수용체(T cell receptor)"는 MHC 분자에 의해 제시된 항원을 인식하는 데(즉, MHC 분자의 맥락에서 항원 인식) 일반적으로 관여하는 알파-베타 또는 감마-델타 수용체를 형성하는 이량체 이종 세포 표면 신호전달 단백질을 지칭한다. 본원의 TCR들은 비-자연적으로 발생되고 및/또는 정제 및/또는 조작될 수 있다. 본원의 TCR들은 모 TCR에 비해 알파 사슬 가변 도메인 및/또는 베타 사슬 가변 도메인에 하나 보다 많은 돌연변이가 존재할 수 있다. "조작된 TCR(Engineered TCR)" 및 "돌연변이 TCR(mutant TCR)"은 본원에서 동의어로 사용되며, 일반적으로 모 TCR에 대하여, 특히 이의 Va 및/또는 Vb 또는 Vg 및/또는 Vd 도메인에 하나 이상의 돌연변이가 도입된 TCR들을 의미한다. 조작된 TCR은 HLA 의존성 또는 HLA 비의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "도입유전자(transgene)"는 유기체(예를 들어, 비인간 동물)의 게놈 내로 통합되고 유성 생식 동안 유기체의 자손에게 전달되는 이종 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "T 림프구(T lymphocyte)" 또는 "T 세포(T cell)"는 CD3 (CD3+) 및 T 세포 수용체 (TCR+)를 발현하는 세포를 의미한다. 구체예에서, T 세포는 CD3 및 TCR을 천연적으로 발현하는 천연 세포 (즉, CD3 또는 TCR을 발현하도록 조작되지 않은 세포)이다. 용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 상호교환 가능하며 본원에서 동의어로 사용된다. 그 예는 나이브 T 세포 ("림프구 전구체"), 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 기억 T 세포 (TScm), iPSC-유래 T 세포, 합성 T 세포, 종양 침윤 T 세포 (TIL), αβ T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포 (Treg) 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "비-T 세포(non-T cell)"는 T 세포가 아닌 세포를 지칭한다. 한 실시형태에서, 비-T 세포는 CD3 및 T 세포 수용체의 세포 표면 발현이 결여된다. 구체예에서, 비-T 세포는 OKT3와 같은 T 세포 활성화 항체에 반응하지 않는다. 한 실시형태에서, 비-T 세포는 CD3의 표면 발현이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 비-T 세포는 CD3ε, CD3γ 및 CD3δ의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 CD3 사슬의 발현이 결여된다. 한 실시형태에서, 비-T 세포는 TCR 유전자의 생식계열 배열을 나타내고, T 세포 유전자 재배열을 겪지 않았다. 구체예에서, 비-T 세포는 기능적 T 세포/CD3 수용체 복합체를 형성하는 능력이 결여되어 있다. 예시적인 비-T 세포는 NK 세포, B 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 및 상피 세포를 포함한다. 비-T 세포는 불멸화된 세포주일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 비-T 세포는 NK 세포주, 예를 들어, NK92, NK92MI, NKG 및 YTS 등이다. 한 실시형태에서, 비-T 세포는 CD3 및 T 세포 수용체 발현이 결여된 iPSC 유래 세포이다.
용어 "T 세포 수용체 모듈(T cell receptor module)" 또는 "TCRM"은 T 세포 수용체로부터 유래된 서열을 포함하는 이종이량체를 지칭한다. 상기 TCRM은 T 세포 수용체 막관통 도메인을 포함하고, T 세포 수용체 연결 펩티드 및/또는 세포내 도메인의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "TCR-Fv" 또는 "Fv-TCR"의 "단편 가변 TCR(fragment variable TCR)"은 TCR 사슬의 가변 도메인에 의해 형성되는 항원 결합 모듈을 지칭한다. TCR-Fv는 Vα 및 Vβ 도메인 또는 Vγ 및 Vδ 도메인에 의해 형성될 수 있다. TCR-Fv는 가변 도메인이 유래된 TCR의 표적 항원(예를 들어, 펩티드/MHC 복합체)에 대한 일부 또는 전부의 특이적 결합 친화도를 나타낸다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 TCR로부터 유래된 Vα/Vβ 또는 Vγ/Vδ 사슬이 이의 2개의 폴리펩티드에 부착될 때 TCR-Fv 항원 결합 모듈을 형성하는 능력을 입증한다.
본원에 사용된 용어 "Fv" 또는 "단편 가변(fragment variable)"은 항체의 가변 도메인에 의해 형성되는 항원 결합 모듈을 지칭한다. Fv는 vL 및 vH 도메인에 의해 형성될 수 있다. Fv는 가변 도메인이 유래되는 항체의 표적 항원에 대한 일부 또는 전부의 특이적 결합 친화도를 나타낸다. 한 실시형태에서, 본 명세서의 SAR은 항체로부터 유래된 vL 및 vH 사슬이 이의 2개의 폴리펩티드에 부착될 때 Fv 항원 결합 모듈을 형성하는 능력을 입증한다.
본원에 사용된 바와 같이, "막관통 단백질(transmembrane protein)" 또는 "막 단백질(membrane protein)"은 생물학적 막의 인지질 이중층(예를 들어, 세포의 막과 같은 생체막)과 같은 막에 및/또는 내에 위치한 단백질이다. 일부 단백질은 막 표면에만 결합되어 있는 반면, 다른 단백질은 막 내에 묻혀 있는 하나 이상의 영역 및/또는 막의 한쪽 또는 양쪽에 도메인이 있다. 막관통 단백질의 구체적인 예는 CD8a, CD4, CD3ζ, CD16, NKp30, NKp44, NKG2D 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "막관통 모듈(transmembrane module)" 또는 "TMM"은 막관통 단백질 (예를 들어, CD16A)을 포함하는 분자 또는 분자 복합체를 지칭한다.
용어 "막관련 모듈(membrane associated module)" 또는 "MAM"은 막관통 단백질 (예를 들어, CD16A) 또는 막고정 단백질 (예를 들어, CD16B)을 포함하는 분자 또는 분자 복합체를 지칭한다. 이 용어는 CD16A와 같은 막관통 단백질 및 CD16B와 같은 GPI(글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol)) 연결 단백질을 포괄한다. MAM은 힌지 도메인 및/또는 세포질 도메인의 전부 또는 일부를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료제(Therapeutic agents)"는 예를 들어, 질환을 치료, 억제, 예방, 완화, 중증도 감소, 발병 가능성 감소, 진행 속도 저하 및/또는 치유하기 위해 사용되는 작용제를 의미한다. 치료제에 의해 표적화된 질환은 감염성 질환, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양, 모세포종, 다양한 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 및 다양한 혈액 질환과 관련된 세포 상에서 발현되는 항원 및/또는 염증성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "치료적 조절(Therapeutic Controls)"은 SAR 발현 세포의 활성을 조절하기 위해 사용되는 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR 발현 세포의 활성을 조절하기 위한 치료적 조절들은 절두된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR), 절두된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절두된 CD30 (tCD30), 절두된 BCMA (tBCMA), 절두된 CD19 (tCD19), 티미딘 키나제(thymidine kinase), 시토신 데아미나제(cytosine deaminase), 니트로리덕타제(nitroreductase), 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase), 인간 카스파제(human caspase) 8, 인간 카스파제(human caspase) 9, 유도성 카스파제(inducible caspase) 9, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(purine nucleoside phosphorylase), 리나마라제(linamarase)/리나마린(linamarin)/포도당 산화효소(glucose oxidase), 데옥시리보뉴클레오시드 키나제(deoxyribonucleoside kinase), 홀스래디시-퍼옥시다제(horseradish peroxidase) (HRP)/인돌-3-아세트산(indole-3-acetic)(IAA), 감마-글루타밀시스테인(Gamma-glutamylcysteine) 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나제 키메라(thymidine kinase chimera), 독스 의존성 카스파제(dox-dependent caspase)-2, 돌연변이 티미딘 키나제(mutant thymidine kinase)(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 선택 마커 및 이들의 조합 중 어떤 하나 또는 그 이상을 포함한다. 예시적인 치료적 대조군들은 가출원의 표 24에 제공된다.
용어 "치료 효과(therapeutic effect)"는 다양한 수단들에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 종양 부피의 감소, 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암세포 증식의 감소, 암세포 생존의 감소, 감염원의 역가 감소, 감염원의 집락 수 감소, 질병 상태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함한다. "치료 효과(therapeutic effect)"는 또한 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체가 질환의 발생을 예방하거나 질환의 재발을 예방하는 능력에 의해 나타날 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물의 양을 지칭하며, 원하는 효과를 제공하기에 충분한 약리학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 어구 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 장애를 치료하기에 충분한 양의 조성물을 의미한다.
용어 "TCR 수용체 융합 단백질(TCR receptor fusion proteins)" 또는 "TFP"는 WO 2016/187349 A1에 기재된 바와 같은 차세대 SAR 플랫폼을 지칭하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 한 실시형태에서, TFP는 TCR 사슬, 예컨대 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα 또는 TCRβ에 융합된 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함한다. TFP의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 TCR 체인은 본 개시내용의 서열번호 11903-11906으로 표시되며, 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/070608 A1에 제공된다. CD3ε 사슬을 포함하는 TFP는 CD3ε TFP 또는 TFPε으로 지칭된다. CD3γ 사슬을 포함하는 TFP는 CD3γ TFP 또는 TFPγ로 지칭된다. CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ 사슬을 포함하는 TFP는 집합적으로 CD3ε/γ/δ TFP 또는 TFPε/γ/δ 로 지칭된다.
용어 "전달 벡터(transfer vector)"는 단리된 핵산을 포함하고, 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터(transfer vector)"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포좀 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 "막관통 도메인(Transmembrane domain)" (TMD)은 원형질막을 가로지르는 수용체 (예를 들어, SAR)의 영역을 지칭한다. 본원의 SAR의 막관통 도메인은 막관통 단백질(예를 들어 유형 I 막관통 단백질 또는 유형 II 막관통 단백질)의 막관통 영역, 인공 소수성 서열 또는 이의 조합이다. 다른 막관통 도메인은 당업자에게 자명할 것이며, 본원의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TMD 암호화된SAR은 T 세포 수용체, CD3γ, CD3ε, CD3δ, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDlla, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (촉각), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및 / 또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 예시적인 막관통 도메인은 가출원의 표 28에 제공된다. 본원의 SAR의 막관통 도메인은 수용체에 대해 천연형 또는 비천연형일 수 있다. SAR이 모듈식으로 설계되므로, 일부 실시형태에서, 하나의 SAR의 막관통 도메인은 이의 생물학적 및 기능적 특성을 보유하는 한 다른 SAR의 막관통 도메인으로 대체될 수 있다. 따라서, NKp30 기반 SAR에서 NKp30 막관통 도메인은 NKp44의 막관통 도메인으로 대체될 수 있다. 비-천연성 막관통 도메인을 갖는 생성된 SAR은 당업계에 공지된 검정 및 본원에 기재된 검정을 사용하여 이의 세포 표면 발현 및 기능적 활성에 대해 시험할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "삼관능성 T 세포 항원 커플러(Tri-functional T cell antigen coupler)" 또는 "Tri-TAC" 또는 "TAC"는 WO 2015/117229 A1에 기재된 차세대 SAR 플랫폼을 지칭하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 상이한 항원을 표적으로 하는 Tri-TAC는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 본 개시에 기술된 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL 및 vH 단편, scFv, vHH, 리간드 및 수용체 등)을 사용하여 구축될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)", "치료하는(treating)" 또는 "개선(amelioration)"은 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 개체는 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 개선, 억제, 둔화 또는 정지시킨다.
본원에서 사용되는 "종양(tumor)"은 악성 또는 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "벡터(vector)", "클로닝 벡터(cloning vector)" 및 "발현 벡터(expression vector)"는 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 이에 의해 숙주를 형질 전환시키고 도입된 서열의 발현 (예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터에는 플라스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다.
용어 "바이러스 벡터(viral vector)"는 바이러스로부터 얻어지거나 유래된 벡터를 지칭한다. 일반적으로 바이러스는 렌티바이러스 및 감마 레트로바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는 레트로바이러스이다. 본원의 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스에 기초할 수 있다. 본원의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV)와 같은 비영장류 렌티바이러스에 기초할 수 있다. 본원의 바이러스 벡터는 바이러스 외피에서 막관통 단백질을 활성화하는 유사분열 T 세포 및/또는 막관통 단백질을 활성화하는 사이토카인 기반 T-세포를 포함한다. 위에서 설명한 바와 같이, 막관통 단백질을 활성화하는 유사분열 T 세포 및/또는 막관통 단백질을 활성화하는 사이토카인 기반 T-세포는 숙주 세포막에서 유래된다.
용어 "제타(zeta)" 또는 대안적으로 "제타 사슬(zeta chain)", "CD3-제타(CD3-zeta)" 또는 "TCR-제타(TCR-zeta)" "CD3ζ"는 GenBank Ace. No. BAG36664.1, 또는 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 원숭이 등으로부터의 등가 잔기에서 제공되는 단백질로서 정의되고, "제타 자극 도메인 (zeta stimulatory domain)" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인 (CD3-zeta stimulatory domain)" 또는 "TCR-제타 자극 도메인 (TCR-zeta stimulatory domain)"은 제타 사슬의 세포질 도메인, 또는 이의 기능적 변이제로부터의 아미노산 잔기들로 정의되고, 이는 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분하다.
HLA-클래스 I 결핍, 또는 HLA-클래스 II 결핍 또는 둘 다를 포함하는 "HLA 결핍(HLA deficient)"은 HLA 클래스 I 단백질 이종이량체 및/또는 HLA 클래스 II 이종이량체를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현 수준이 부족하거나 더 이상 유지하지 않거나, 감소되는 세포를 지칭하며, 이로 인해 감소된 또는 줄어든 수준은 다른 세포나 합성 방법들로 자연적으로 감지 가능한 수준보다 낮다.
본원에서 사용되는 "변형된 HLA 결핍 iPSC(Modified HLA deficient iPSC)"는 예컨대 비고전적 HLA 클래스 I 단백질 (예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), CD16 Fc 수용체, BCL1 lb, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP 10, DAP 12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD 113 및 PDL1과 같은 개선된 분화 전위, 항원 표적화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제, 증식, 공동자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생산(자가분비 또는 측분비), 화학주성 및 세포독성 과 관련되지만 이에 제한되지 않는 단백질을 발현하는 유전자들을 도입함으로써 추가로 변형되는 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍(modified HLA deficient)" 세포에는 iPSC들 이외의 세포도 포함된다.
FcyR 수용체인 CD16은 Fc 수용체, FcyRIIIa(CD16a) 및 FcyRIIIb(CD16b)의 두 가지 이소형들을 갖는 것으로 확인되었다. 달리 명시되지 않는 한, CD16은 CD16a 및 CD16b 이소형들, 및 인간 또는 비인간 종으로부터의 임의의 다른 대안적으로 접합된 변이체를 지칭한다. CD16a는 NK 세포에서 발현되는 막관통 단백질로, 표적 세포에 부착된 단량체 IgG에 결합하여 NK 세포를 활성화하고 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 촉진한다. 본원에 사용된 "고친화성 CD16(High affinity CD16)", "절단 불가능한 CD16(non-cleavable CD16)" 또는 "고친화성 비절단가능한 CD16(high affinity non-cleavable CD16) (hnCD16)"은 CD16의 천연 또는 비천연 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 친화도가 낮고 NK 세포 활성화 시 백혈구에서 다양한 세포 표면 분자들의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백질 분해 절단 과정인 엑토도메인 흘리기의 대상이 된다. F176V (또는 F158V 또는 V158)는 높은 친화도를 갖는 예시적인 CD16 다형성 변이체다. 변형되거나 제거된 막-근위 영역(위치 189-212)에서 절단 부위(위치 195-198)를 갖는 CD16 변이체는 탈락의 대상이 되지 않는다. 절단 부위 및 막-근위 영역은 WO2015148926에 상세히 기재되어 있으며, 이에 대한 완전한 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. CD16 S197P 또는 S197R 변형은 CD16의 조작된 절단할 수 없는 버전이다. F158V 및 S197P(또는 S197R) 모두를 포함하는 CD16 변이체는 높은 친화도를 가지며 절단할 수 없다. 또 다른 예시적인 고친화성 및 비절단가능한 CD16 (hnCD16) 변이체는 CD64 엑토도메인의 3개 엑손 중 하나 이상으로부터 유래된 엑토도메인을 포함하는 조작된 CD 16이다. 본원의 CD16 SAR은 야생형 CD16 서열 또는 이의 천연 또는 비천연 변이체, 예컨대 F158V 및 S197P(또는 S197R)를 포함할 수 있다.
면역 세포 및 CD16 또는 CD16 변이체를 발현하는 iPSC가 당업계에 공지되어 있는 반면, 한 실시형태에서, 본원은 CD16 또는 CD16 변이체의 세포외 Fc 결합 영역을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, CD16-SAR은 항체 또는 항체 단편의 Fc 영역에 결합하는 능력을 보유하지만, 이의 비천연 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, scFv, vHH, FHVH, Fv 등)을 통해 항원에 결합하는 추가적인 능력을 갖는다. 실시형태에서, CD16 SAR의 항원 결합 도메인은 CD16 또는 CD16 변이체의 D1 도메인 (서열번호 3836)의 N-말단 영역 또는 N-말단 영역 근처, 즉, CD16 또는 CD16 변이체의 세포외 도메인의 N-말단 영역 또는 그 근처에서 작동 가능하게 연결된다. 실시형태에서, 선택적인 링커는 SAR의 항원 결합 도메인과 CD16 또는 CD16 변이체의 D1 도메인 사이에 존재한다. 예시적인 링커는 가출원의 표 11에 제공된다.
실시형태에서, CD16-SAR은 항체 또는 항체 단편의 Fc 영역에 결합하는 능력이 결여되어 있지만, 이의 비천연 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, scFv, vHH, FHVH, Fv 등)을 통해 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 예시적인 실시형태에서, CD16-SAR은 선택적 힌지 도메인을 통해 CD16의 막관통 및 선택적 세포질 도메인에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 비-천연 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, scFv, vHH, FHVH, Fv 등)을 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-SAR은 이의 표적 항원에 결합할 때 신호전달 어댑터, 예컨대 CD3z 및/또는 FceRy1을 모집하는 능력을 보유한다. SAR의 결합 도메인은 원하는 에피토프 또는 항원에 결합한다. 예를 들어, SAR에 의해 인식된 에피토프는 SAR의 결합 도메인으로서 사용된 scFv에 의해 인식된 에피토프로부터 결정된다. 예를 들어, CD19를 표적으로 하는 SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275)의 항원 특이적 도메인은 hu-mROO5-1 scFv (서열번호 3027)로부터 유래된 vL (서열번호 2543) 및 vH (서열번호 2785) 단편으로 구성되므로, SAR은 scFv 및/또는 scFv가 유래된 모 항체와 동일한 에피토프를 표적으로 하는 것으로 예상된다. 본원의 SAR 및 골격의 구축에 사용되는 몇몇 scFv 및/또는 이의 모 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, SAR에 의해 표적화 된 에피토프는 이의 표적 항원의 일련의 돌연변이체를 생성하고, 예를 들어 Topanga Assay(Gopalakrishnan, R, Sci Reports, 2019)를 사용하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 SAR 발현 세포에 결합하는 돌연변이체의 능력을 시험함으로써 결정될 수 있다. 일예로서, SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275)를 표적으로 하는 CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis-T2A-Pac (DNA 서열번호1282)의 결실 및 점 돌연변이체의 패널을 생성함으로써 결정될 수 있다. 돌연변이체 구축물은 적합한 세포주 (예를 들어, 293FT 세포) 및 상이한 돌연변이체 CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis 융합 단백질이 상청액에서 분비되고 있다는 것을 보장하기 위해 NLuc 활성을 수집하고 검정하는 융합단백질을 포함하는 상청액으로 형질 감염될 것이다. 이어서, 융합 단백질은 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275) 작제물을 발현하는 세포(예를 들어, Jurkat 세포 또는 T 세포)에 결합하는 이의 능력에 대해 시험될 것이다. SAR-발현 세포에 결합하지 못하는 돌연변이체는 CD19-특이적 SAR에 의해 표적화된 에피토프를 함유하기 위한 후보이다. 특정 SAR에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위한 대안적인 접근법은 상이한 시험 항체를 갖는 기능적 경쟁적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275) SAR을 발현하는 T 세포는 상이한 시험 CD19 항체의 농도 증가의 부재 및 존재 하에 CD19를 발현하는 세포주 (예를 들어, RAJI 세포)와 공동 배양될 수 있었다. 시험 CD19 항체에 의해 인식된 에피토프가 SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275)에 의해 인식된 에피토프와 겹치는 경우, 시험 항체는 용량 의존적 방식으로 thCD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2275) SAR를 발현하는 T 세포에 의해 유도된 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생산에 영향을 미치지 않을 것으로 예상될 것이다. 시험 항체와 동일한 이소타입의 비특이적 항체가 대조군으로 포함될 것이고 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 유도된 표적 세포 사멸 및 사이토카인 생산에 영향을 미치지 않을 것으로 예상될 것이다. 유사하게, 특정 SAR은 Jurkat-NFAT-EGFP 세포에서 발현될 수 있고, 표적 세포주와 공동 배양시 SAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 세포에 의한 EGFP 유도를 차단하는 시험 항체의 능력은 시험 항체에 의해 인식된 에피토프가 상기 SAR에 의해 인식된 에피토프와 겹치는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 개시물은 자연 발생 (즉, 천연 또는 내인성)수용체 또는 이의 변이체에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 천연 수용체의 결합 능력 및 기능들을 보유하지만, 또한 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력 및 기능들을 획득한다. 한 실시형태에서, SAR은 천연 수용체의 결합 능력들 및 기능들을 부분적으로 또는 완전히 보유한다. 한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력들 및 기능들을 획득한다.
한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 세포의 표면 상에서 발현되는 임의의 수용체 (예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포)이다. 예시적인 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 과립구 및 B 세포로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 자연 발생 신호전달 수용체는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 대식세포, 수지상 세포 등)의 표면 상에서 발현된다.
한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 세포 신호전달을 유도하는데, 즉, 자연 발생 신호전달 수용체이다. 자연적으로 발생된 신호전달 수용체는 활성화 수용체(즉, 세포 활성화를 유도함) 또는 억제성 수용체(즉, 세포 활성화를 차단함)일 수 있다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 NK 세포 수용체, 예를 들어, NK 활성화 또는 NK 억제 수용체이다. 한 실시형태에서, 상기 자연 발생 신호전달 수용체는 세포독성을 유도하는 수용체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 자연 발생 신호전달 수용체는 공동자극을 제공하는 수용체일 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체는 막관통 도메인을 보유한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 막관통 어댑터 단백질을 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12 또는 이의 변이체 또는 단편의 그룹으로부터 선택되는 막관통 어댑터 단백질을 모집할 수 있다. 예시적인 이러한 수용체는 CD16A, NKp30, NKp44, NKp46 및 NKG2D를 포함한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 이의 막관통 영역 내에 음전하를 띤 잔기(예를 들어, 아스파르테이트(aspartate))를 포함하는 막관통 어댑터 단백질을 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 신호 어댑터 단백질의 막관통 영역 내에서 음전하를 띤 잔기(예를 들어, 아스파르테이트)와 상호작용하는 양전하를 띤 잔기(리신 또는 아르기닌)를 포함하는 막관통 도메인을 보유한다. 구체예에서, 자연 발생 수용체는 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 보유한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 힌지(spacer) 도메인 및 막관통 도메인을 보유한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 힌지(공간) 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 보유한다. 이러한 수용체의 예시는 CD16A이다. 한 실시형태에서, 자연 발생 수용체는 힌지(공간) 도메인, 막고정도메인(예를 들어, GPI 연결된 도메인)을 보유하지만, 세포질 도메인은 결여되어 있다. 예시적인 이러한 수용체는 CD16B이다.
예시적인 실시형태에서, 본 개시내용의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체는 이에 제한되지 않으나 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec3, Siglec-7, Siglec-9, TCRαβ 및 TCRγδ 등 및 이의 변이체 및 단편을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체는 T 세포 수용체가 아니다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 프리TCRα가 아니다. 한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 전체 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 본 개시물의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 비-T 세포 수용체는 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 실시예에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM들을 포함한다. 한 실시예에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 ITIM을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 개시물의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 비-T 세포 수용체는 공동자극 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, SAR은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12로부터 유래된 세포내 활성화 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 비-TCR 자연 발생 수용체, 즉, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα가 아닌 수용체의 전체 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 실시형태에서, 본원은 비-TCR 자연 발생 수용체의 부분적인 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 실시형태에서, 본 명세서는 비-TCR 자연 발생 수용체의 부분적인 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NTCRM (비-T 세포 수용체 모듈)의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 신호전달 수용체는 CD4, CD8, CD28, CD27, CD16A 또는 NKG2D가 아니다.
한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 자연 발생 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하고, 여기서 수용체는 TCR/CD3 수용체 복합체의 일부가 아니다. 한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하고, 여기서 수용체 폴리펩티드 사슬은 TCR/CD3 수용체 복합체의 일부가 아니다. 한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 자연 발생 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하며, 여기서 수용체는 TCR/CD3 수용체 복합체와 회합하지 않는다.
한 실시형태에서, 본원은 자연 발생 수용체의 전체 또는 부분 항원 (또는 리간드) 결합 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 비-TCR 자연 발생 신호전달 수용체 또는 NTCRM의 전체 또는 부분 항원(또는 리간드)-결합 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 비-TCR 신호전달 수용체 또는 NTCRM의 전체 또는 부분 항원(또는 리간드)-결합 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 항원(또는 리간드)-결합 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하며, 여기서 자연 발생 신호전달 수용체는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCRα가 아니다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 자연 발생 신호전달 수용체가 아닌 TCR의 항원 결합 특성의 적어도 일부를 보유한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 이종 항원 결합 도메인 중 하나 이상에 의해 부여되는 신규한 항원 결합 특성을 획득한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 비-TCR 자연 발생 신호전달 수용체의 항원 결합 특성의 적어도 일부들을 보유하고, 이종 항원 결합 도메인 중 하나 이상에 의해 부여되는 신규한 항원 결합 특성을 획득한다.
한 실시형태에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 세포외 도메인에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결된 TCR의 가변 도메인(즉, Vα, Vβ, Vδ 또는 Vγ)으로부터 유래된 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 신호전달 수용체는 NTCRM(non-T cell receptor module)이다.
한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 NTCRM (비-T 세포 수용체 모듈) 및/또는 신호전달 어댑터 (예를 들어, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP10 등)의 힌지 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결된 TCR(즉, Vα, Vβ, Vδ 또는 Vγ)의 가변 도메인으로부터 유래된 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 전체 세포외 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 막관통 도메인을 포함하지 않는다.
본원의 SAR의 개략도는 도 1-5 및 표 A1-1 내지 A1-19에 제공된다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 자연 발생 수용체는 단일 폴리펩티드 사슬 또는 다중 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 자연 발생 수용체는 다중사슬 수용체 복합체 (예를 들어, T 세포 수용체 복합체)의 성분일 수 있다.
한 실시형태에서, SAR은 하나 보다 많은 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 이종성 (또는 비-자연적으로 발생하는) 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 이종 항원 결합 도메인은 자율 항원 결합 도메인 (예를 들어, 완전 인간 vH 도메인, vHH 도메인, 단일사슬 TCR, 재조합 TCR 또는 svd-TCR 등), scFv, 항체, 항체 단편(vL, vH, Fab 등), 비면역글로불린 항원 결합 도메인(예를 들어, 센티린, 아피바디, DARPIN, ZIP 도메인, 어댑터 등), 리간드, 수용체의 세포외 도메인(예를 들어, CD16A 세포외 도메인, NKp30 세포외 도메인 등), 자가항원, TCR, TCR 가변 단편 (예를 들어, Va, Vb, Vg, Vd 등) 및 이의 변이체 및 단편 등을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 scTCR, svd-TCR 또는 TCR 모방 scFv 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, SAR은 TCR-유사 결합 능력들, 예를 들어, 펩티드/MHC 복합체에 결합하는 능력을 획득한다.
현재 임상에서 사용되고 있는 2세대 키메라 항원 수용체 구조체들(예: Axicabtagene, Ciloleucel, Lisocabtagene, Maraleucel 등)은 다수의 상이한 천연 수용체로부터 유래된 줄기 (힌지), 막관통, 공동자극 및 세포질 도메인에 조작적으로 연결된 이종 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체 (예를 들어, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, KIR2DS4 등) 또는 신호전달 어댑터(예: CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12 등)의 막관통 및 세포질 도메인의 천연 구성을 포함하는 SAR (예를 들어, 차세대 CAR)가 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인의 비천연 구성을 포함하는 SAR과 비교하여 우수한 생리학적 세포 신호전달 및 조절을 나타내는 것을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인의 천연 구성을 포함하는 SAR이 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인의 비천연 구성을 포함하는 SAR과 비교하여 우수한 시험관내 및 생체내 효능을 나타낸다는 것을 제공한다.
한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 전체 세포외-, 막관통- 및 세포질 도메인 및 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체의 전체 세포외 항원 결합 도메인, 막관통- 및 세포질 도메인 및 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 하나의 자연 발생 수용체의 부분 또는 전체 세포외 항원 결합 도메인 및 상이한 자연 발생 신호전달 수용체의 막관통 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 부분 세포외 도메인 및 전체 막관통 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커 및/또는 스페이서(힌지 도메인)을 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 상이한 도메인은 펩티드 결합을 통해 조작적으로 연결되며, 즉, 이들은 폴리펩티드 사슬의 일부이다.
한 실시형태에서, SAR은 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 신호전달 어댑터로부터 유래된 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12로부터 유래된 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR의 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 2개 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 단일 ITAM 모티프를 소유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 ITAM 모티프가 결여된 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 티로신계 모티프(YINM)를 포함하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 PI3K 및/또는 Grb2의 p85 서브유닛을 모집하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 NFAT, PI3K, NF-κB 및 ERK 신호전달 경로 중 하나 이상을 활성화시키는 활성화 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 세포내 억제 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 PD1로부터 유래된 세포내 억제 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR의 억제 도메인은 하나 이상의 ITIM 모티프를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및 DAP12의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 힌지, 막관통 또는 세포질 도메인과의 상호작용을 통해 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 힌지, 막관통 도메인 및 세포질 도메인 중 하나 이상과의 상호작용을 통해 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 구체예에서, 본원의 SAR를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등)은 이의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인이 표적 항원에 결합할 때 신호전달 어댑터를 모집한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR를 발현하는 면역세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등)은 표적 세포의 사멸을 활성화, 증식, 분비 및/또는 조절(유도 또는 억제)하고, MHC-제한 및/또는 MHC-비-제한 항체-유형 특이성을 갖는다.
한 실시형태에서, SAR은 세포질 도메인이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, SAR은 100개 미만의 아미노산 길이(즉, 90, 80, 70, 60, 50, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 또는 2개 미만의 아미노산)인 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 50개 미만의 아미노산 길이인 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 길이가 25개 미만인 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 10개 미만의 아미노산 길이인 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 5개 미만의 아미노산 길이인 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 세포내 활성화 도메인이 결여된다. 한 실시형태에서, SAR은 ITAM 모티프를 함유하는 세포내 도메인이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, SAR은 세포내 신호전달 도메인이 결여된다. 구체예에서, SAR은 세포내 공동자극 도메인이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, SAR은 CD3z, 2B4, 4-1BB, CD28, ICOS, CD2, CD40, DAP10 및 DAP12 중 하나 이상으로부터 유래된 세포내 도메인이 결여된다. 한 실시형태에서, SAR은 단백질 키나제 또는 단백질 포스파타제를 직접 모집할 수 있는 세포내 신호전달 도메인이 결여되어 있다.
한 실시형태에서, SAR은 SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편 사이에 삽입된 공동자극 도메인이 결여되어 있다. 2세대 CAR과 대조적으로, 한 실시형태에서, 현재 개시된 SAR의 막관통 및 세포질 도메인은 단일 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 본원의 SAR의 막관통 및 세포질 도메인은 단일 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래되고, 공동자극 수용체로부터 유래된 이종 공동자극 도메인에 의해 중단되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 현재 개시된 SAR의 막관통 및 세포질 도메인은 단일 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터로부터 유래되고 서로 접한다. 또 다른 실시형태에서, 현재 개시된 SAR의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인은 단일 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래되고 각각에 접하는, 즉, 이들은 중단 없이 하나의 연속적인 사슬로 존재한다.
한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 CD28, 4-1BB, CD27, OX40, CD2, CD40, CD81 또는 2B4 또는 이의 변이체로부터 유래된 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 다른 공동자극 도메인은 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 SAR의 인접막 영역에 위치한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 유형 I 막관통 SAR의 막관통 영역에 C-말단에 위치한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 타입 II 막관통 SAR의 막관통 영역에 N-말단에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, SAR은 공동자극 도메인이 결여되어 있다.
한 실시형태에서, 자연 발생 신호전달 수용체(예를 들어, CD16A 또는 NKp30 등) 또는 신호전달 어댑터(예: CD3ζ, FcRγ 등) 또는 이의 변이체 또는 단편에서 유래된 막관통 및 세포질 도메인 사이에 삽입되는 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체 (예를 들어, CD16A, CD16B, CD64, NKp30 등)로부터 유래된 세포외 도메인에 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 이는 차례로 힌지 도메인 (예를 들어, CD8 힌지 또는 CD28 힌지), 막관통 도메인 (예를 들어, CD8 또는 CD28 막관통 도메인), 공동자극 도메인 (예를 들어, 4-1BB 또는 CD28 공동자극 도메인) 및 활성화 도메인 (예를 들어, CD3ζ 또는 FcRγ 활성화 도메인)에 연결된다. 이러한 SAR의 예시는 서열번호 10818 및 10821로 표시된다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본원은 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ, FcRγ 등)로부터 유래된 세포외 힌지 도메인에 조작적으로 연결된 하나 이상의 이종성 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 이는 차례로 막관통 도메인 (예를 들어, CD3ζ 또는 FcRγ 막관통 도메인), 공동자극 도메인 (예를 들어, 4-1BB, CD28, 2B4 또는 OX40 공동자극 도메인) 및 활성화 도메인 (예를 들어, CD3ζ 또는 FcRγ 활성화 도메인 등)에 연결된다.
한 실시형태에서, SAR은 자연 발생(또는 천연) 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편의 아미노 말단 또는 아미노 말단 부근에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, FHVH, 센티린, scTCR, svd-TCR 등)을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 힌지 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편의 아미노-말단 또는 아미노-말단 근처에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편의 아미노-말단 또는 그 근처에 또는 아미노-말단 근처에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 힌지(spacer) 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, SAR을 포함하는 자연 발생(또는 내인성) 신호전달 수용체는 세포외 측의 N-말단 및 세포질 측의 C-말단을 갖는 유형 I (또는 그룹 1) 막관통 단백질이다. 예시적인 이러한 유형 I (또는 그룹 1) 내인성 수용체는CD16A, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, CRTAM, TIGIT, CD96, 2B4, SLAMF6, SLAMF7, CD27, CD100, CD160, ILT2/LILRB1, CD33, SIGLEC-7, SIGLEC-9, CD32 및 CD64 등을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 유형I 막관통 자연 (또는 천연) 신호전달 수용체의 아미노 말단 또는 그 근처에 작동적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체 (SAR)를 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체의 결합 능력 및 기능을 보유하지만, 추가로 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력을 획득한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 scTCR, svd-TCR 또는 TCR 모방 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, SAR은 TCR 유사 결합 능력을 획득한다. 한 실시형태에서, SAR은 유형I 막관통 단백질인 내인성 수용체의 아미노-말단 또는 아미노-말단 근처에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 실시형태에서, SAR은 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, CRTAM, TIGIT, CD96, 2B4, SLAMF6, SLAMF7, CD27, CD100, CD160, ILT2/LILRB1, CD33, SIGLEC-7, SIGLEC-9, CD32 또는 CD64의 N-말단 또는 N-말단 근처에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 이종(비자연) 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 또한 N-말단 신호 펩티드를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 신호 펩티드에 C-말단에 위치하는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL1, KIR3DL1, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, CRTAM, TIGIT, CD96, 2B4, SLAMF6, SLAMF7, CD27, CD100, CD160, ILT2/LILRB1, CD33, SIGLEC-7, SIGLEC-9, CD32 또는 CD64의 힌지(공간), 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 하나이상의 선택적 링커를 통하여 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 자연 발생(또는 내인성) 신호전달 수용체는 세포외 측의 C-말단 및 세포질 측의 N-말단을 갖는 유형II (또는 그룹 2) 막관통 단백질이다. 본원은 유형I 막 단백질의 하나 이상의 모듈이 유형II 막 단백질의 전체 또는 부분 영역에 기능적으로 연결된 융합체를 생성하기 위해 유형I 막 단백질과 유형II 막 단백질 사이에 융합 단백질을 생성하는 일반적인 방법을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 신호 펩티드 서열이 결여된 유형I 단백질의 항원 결합 도메인의 N-말단은 유형II 막 단백질의 C-말단에 선택적으로 연결된 것을 통해 조작적으로 연결된다. 한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 자연 발생 (또는 내인성) 신호전달 수용체의 카르복시-말단 또는 카르복시-말단 근처에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 이러한 유형 II(또는 그룹 2) 내인성 수용체는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2E, NKG2H, KLRG1, CD161 및 CD94 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인 (예를 들어, vHH, FHVH, 센티린, scTCR, svd-TCR)은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 유형 II (그룹 2) 막관통 단백질인 내인성 수용체의 C-말단 또는 C-말단 근처에 프레임에서 작동적으로 연결된다. 한 실시형태에서, SAR은 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2E, NKG2H, KLRG1, CD161 또는 CD94의 C-말단 또는 C-말단 근처에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. NKG2D의 C-말단에 부착된 Her2 및 Her3 vHH 도메인을 포함하는 예시적인 이러한 SAR은 각각 서열번호(DNA) 7696-7697 및 서열번호(PRT) 8388-8389로 표시된다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 선택적 링커를 통해 유형 II (그룹 2) 막관통 단백질인 내인성 수용체의 힌지 도메인에 조작적으로 연결된다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 선택적 링커를 통해 NKG2D, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2F, NKG2E, NKG2H, KLRG1, CD161 또는 CD94의 힌지 도메인에 조작적으로 연결된다.
세포 표면에서 NKG2D를 효율적으로 발현하려면 DAP10이 있어야 한다. 본원에 제공된 것은 이펙터 세포를 얻는 전략은 안정적으로 NKG2D-SAR (즉, NKG2D의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인을 포함하는 SAR)을 단독으로 또는 유전자 조작을 통해 세포(예: iPSC)에 NKG2D-SAR를 도입한DAP10과 함께 과발현하고, 그리고 나서 지시된 iPSC 분화로부터 NK 및 T 세포를 포함하는 이펙터 세포를 얻는다. 본원은 또한 NKG2D 막관통 도메인을 포함하는 SAR과 함께 부속 모듈로서 DAP10의 이소성 발현에 의해 DAP10이 결여되거나 낮은 수준의 DAP10을 발현하는 세포에서 NKG2D-SAR의 효율적인 발현을 위한 전략을 제공한다.
CD94/NKG2C는 HLA-E에 결합하고 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프를 포함하는 단백질인 DAP12와 결합하는 이종이량체 수용체이다. 세포 표면에서 CD94/NKG2C의 효율적인 발현은 DAP 12의 존재를 필요로 하며 DAP 12 및 NKG2C의 막관통 도메인에 하전된 아미노산들이 이러한 상호작용을 매개한다. 본원에 제공된 이펙터 세포를 얻기 위한 전략은 안정적으로 NKG2C-SAR (즉, NKG2C의 막관통 도메인을 포함하는 SAR)을 단독으로 또는 유전자 조작을 통해 세포 (예를 들어, iPSC)에 NKG2C-SAR를 도입한 DAP12및 선택적으로 세포(예를들어, iPSC)에 대한DAP12와 함께 과발현하고, 이어서 지시된iPSC로부터 NK및 T세포를 포함하는 이펙터 세포를 얻는다. 일부 실시형태에서, NKG2C-SAR은 CD94 또는 CD94-SAR과 추가로 동시 발현된다.
과발현된 NKG2C-SAR을 포함하는 iPSC들 또는 그로부터 유래된 이펙터 세포에서, 세포는 과발현된 CD94 또는 CD94-SAR 및/또는 DAP12를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, NKG2C-SAR 및 CD94 (또는 CD94-SAR) 및/또는 DAP12는 별개의 구축물에서 발현된다. 또 다른 실시형태에서, NKG2C-SAR 및 CD94 (또는 CD94-SAR) 및/또는 DAP12는 바이-시스트로닉(bi-cistroni) 또는 트라이-시스트로닉(tri-cistronic) 구축물에서 공동-발현되고, 자가-절단 2A 코딩 서열에 의해 연결된다. 또 다른 실시형태에서, NKG2C-SAR, CD94 (또는 CD94-SAR) 및 DAP 12는 별개의 구축물에서 발현된다.
본원은 NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, NKG2H의 막관통 도메인을 포함하는 SAR이 CD94 및/또는 신호전달 어댑터(예를 들어, DAP10, DAP12 등)의 공동-발현에 의해 유사하게 효율적으로 발현될 수 있음을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 유형 II 막관통 자연 발생 신호전달 수용체의 카르복시-말단에 또는 카르복시-말단 근처에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체의 결합 능력 및 기능을 보유하지만, 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력을 추가로 획득한다. 한 실시형태에서, 본원은 합성 항원 수용체를 생성하기 위해 유형II 막관통 자연 발생 신호전달 수용체의 힌지 도메인 또는 막관통 도메인에 선택적 링커를 통해 프레임에서 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 제공한다. 한 실시형태에서, 생성된 SAR은 천연 신호전달 수용체의 결합 능력 및 기능을 보유하지만, 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력을 추가로 획득한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 자연 발생 수용체의 결합 특성 및 생리학적 조절을 보유하는 한편, 자연 발생 수용체가 반응할 수 있는 것 이외에 표적 항원에 반응할 수 있게 하는 추가적인 항원 결합 능력을 획득한다.
본원은 또한 자연 발생 신호전달 사슬 또는 신호전달 어댑터의 세포외 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 단일사슬 SAR을 제공한다. 본원은 또한 자연 발생 신호전달 사슬 또는 신호전달 어댑터의 힌지 도메인 또는 변이체에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 단일사슬 SAR을 제공한다. 본원은 또한 선택적 링커를 통해 자연 발생 신호전달 사슬 또는 신호전달 어댑터의 막관통 도메인 또는 이의 변이체에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 단일사슬 SAR을 제공한다. 예시적인 신호전달 사슬 또는 신호전달 어댑터는CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12 또는 이의 변이체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시형태에서, 신호전달 사슬/어댑터는 공동자극 도메인을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 NCAM (비 CD3 어댑터 모듈)의 전체 또는 부분 세포외 도메인, 힌지 도메인 또는 막관통 도메인에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 선택적 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인, 힌지 도메인 또는 막관통 도메인에 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하며, 여기서 신호전달 어댑터(또는 신호전달 사슬)는 CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ가 아니다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 FcRγ가 아니다.
한 실시형태에서, 단일사슬 SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 자율 항원 결합 도메인 (AABD), 예를 들어, 단일 도메인 항체, 단일 vH 도메인, FHVH, vHH 도메인, svd-TCR, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 (예를 들어, DARPIN, 아피바디(affibody), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(Kunitz Domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 그 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 단일사슬 SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, vL, vH, Fab, Fab'2, scFv 및 scTCR 등)을 포함한다.
SAR은 형식이 모듈식이기 때문에 서로 다른 영역을 다른 도메인으로 대체하여 다양한 생물학적 활동과 특성을 가진 새로운 SAR을 생성할 수 있다. 따라서, 생성된 SAR 이 원래 SAR의 생물학적 활동 중 (예를들어, 항원 결합, 세포 신호전달등) 적어도 하나 이상을 보유한다면 하나의 SAR의 세포외 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인은 다른 SAR의 세포외 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인으로 대체될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원은 새로운 모듈(공동-자극 도메인)이 SAR에 삽입될 수 있음을 제공한다. 한실시형태에서, 본원은 하나의 자연 발생 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 도메인에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공하며, 이는 다시 상이한 자연 발생 수용체의 막관통 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된다. 예시적인 실시형태에서, CD16A 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 SAR의 세포외 도메인은 CD20 vHH 도메인, CD64 세포외 도메인, CD16A 막관통 도메인 및 CD16A 세포질 도메인을 포함하는 새로운 SAR (서열번호 4722)을 생성하기 위해 CD64의 세포외 도메인으로 대체된다.
한 실시형태에서, SAR의 상이한 도메인은 단일 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SAR의 상이한 도메인은 둘 이상의 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SAR은 하나의 자연 발생 수용체의 부분 또는 전체 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 상이한 수용체로부터 유래된 힌지, 막관통- 및 세포질-도메인 및 이의 변이체 또는 단편에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 N 내지 C 말단에서 CD19 scFv, CD16 항원 결합 도메인 (D1 및 D2), CD8 힌지 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 아미노산 서열은 서열번호10836에 제시되어 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, SAR은 N 내지 C 말단에서 CD19 scFv, CD16A 항원 결합 도메인 (D1 및 D2), CD16A 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 공동자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, SAR은 N 내지 C 말단에서 CD19 scFv, CD64 항원 결합 도메인, CD16A 힌지 도메인, CD16A 막관통 도메인, CD16A 세포질 도메인을 포함한다. 이러한 SAR의 아미노산 서열은 서열번호10832로 제시된다.
한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체의 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 힌지, 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 모두 단일 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SIR을 포함하는 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인은들 단일 자연 발생 신호전달 수용체 (예를 들어, CD16A) 또는 신호전달 어댑터 (예를 들어, CD3ζ) 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된다. 대안적인 실시형태에서, SIR을 포함하는 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 둘 이상의 자연 발생 신호전달 수용체(예를 들어, CD16A의 힌지 및 막관통 도메인은 NKp30 등의 세포질 도메인에 조작적으로 연결된다.) 또는 신호전달 어댑터(예를 들어, CD16A의 힌지 및 막관통 도메인은 FcRγ 등의 세포질 도메인에 작동적으로 연결된다.) 로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 신호전달 수용체의 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 힌지, 막관통 도메인 및 세포질 도메인은 둘 이상의 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된다.
한 실시형태에서, 본원은 아미노 (N) 내지 카르복시 (C) 말단으로부터 하기 화학식 2개 이상의 사슬을 포함하는 비천연 단백질 (즉, 합성 단백질)을 생성하는 방법을 제공한다:
체인 1: SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
체인 2: SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
여기서 SP1 및 SP2는 성숙한 폴리펩티드 사슬로부터 절단되는 선택적인 신호 펩티드이고; A1 및 A2는 서로 상호작용할 수 있는 2개의 단백질 도메인이고, L1 및 L2는 선택적 링커고, H1 및 H2는 선택적인 힌지 또는 스페이서 도메인이고, M1 및 M2는 막-고정 또는 막관통 도메인이고, C1 및 C2는 선택적인 세포질 도메인이다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 항체로부터 유래되지 않는다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 항체 단편이 아니다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 M1 및 M2 도메인과 이종성이며, 즉, A1 및 M1 도메인은 상이한 단백질로부터 유래되고, 유사하게 A2 및 M2 도메인은 상이한 단백질로부터 유래된다. 예시적인 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 TCR (예를 들어, TCR의 Vα 및 Vβ 도메인)로부터 유래되고, M1 및 M2 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 자율 도메인이 아니다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 비관련 단백질에 대한 친화도보다 큰 서로에 대한 친화도를 갖는다. 한 실시형태에서, A1 및 A2 도메인은 항원 결합 도메인을 생성하기 위해 서로 회합할 수 있다. 한 실시형태에서, 비천연 단백질은 합성 항원 수용체이다. 한 실시형태에서, L1 및 L2 링커는 긴 링커이다. 한 실시형태에서, L1 및 L2 링커는 Ig 유사 링커이다. 한 실시형태에서, L1 및 L2 링커는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 접합된다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 막관통 도메인이다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 동일한 단백질 (예를 들어, CD3ζ)로부터 유래된다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 상이한 단백질 (예를 들어, CD3ζ 및 FcRγ)로부터 유래된다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 서열이 동일하거나 및/또는 70% 초과 (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 등) 아미노산 서열 상동성을 보유한다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 서로 회합된다. 한 실시형태에서, M1 및 M2 도메인은 디설파이드 결합에 의해 접합된다. 한 실시형태에서, M1 및/또는 M2 도메인은 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, C1, C2 도메인은 세포 신호전달 도메인(예를 들어, 활성화 도메인 또는 공동자극 도메인 등)이다. 한 실시형태에서, 각각의 사슬은 둘 이상의 세포질 도메인을 보유할 수 있다. 한 실시형태에서, 두 사슬은 A1-L1-H1 및 A2-L2-H2 세그먼트들이 세포외 측에 위치하는 세포 표면 상에서 발현된다. 본원은 핵산, 합성 단백질을 코딩하는 아미노산 서열, 합성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 벡터 및 합성 단백질을 발현하는 세포를 제공한다.
본원은 또한 이중사슬SAR(예: 단리된 이중사슬 SAR)을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 세포외 도메인, 막관통 도메인 선택적 세포질 도메인 및 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 적어도 하나의 모듈에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 비-TCR 신호전달 수용체이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다.
한 실시형태에서, 본원은 두 개의 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공하며, 이 사슬의 각각은 선택적 펩티드 링커 (예: IgCL, IgCH1 등)을 통해 신호전달 수용체(예를 들어, CD3ζ, FcRγ) 또는 신호전달 어댑터 (예를 들어, vL, vβ, Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 등)의 막관통 도메인 또는 막관련 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 막관련 모듈(MAM)에 작동적으로 연결하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, vβ, Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 등)을 포함한다. 일부 실시형태에서, MAM 은 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 세포외 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 세포질 도메인 및/또는 신호전달 어댑터의 힌지/및 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 비-TCR 신호전달 수용체이다. 한 실시형태에서, 모듈은 NTCRM이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터 (즉, NCAM)이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 한 실시형태에서, MAM은 TCRα,β, γ, δ, preTCRα, CD3ζ, CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모듈 (예를 들어, Fv 또는 Fc-TCR)을 형성하기 위해 제1 사슬의 적어도 하나의 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, Vα, 또는 Vγ)은 제2 사슬의 적어도 하나의 상보적 항원 결합 도메인 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ)과 회합한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커와 제2 펩티드 링커는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 약 5 내지 약 500 아미노산 길이이다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상보적 사슬 (예를 들어, vL 및 vH, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인(AABD)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예시적인 실시형태에서, 표적 항원은 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다. 예시적인 실시형태에서, 세포 표면 항원은 비제한적으로 하기의 그룹으로부터 선택된다: CD2, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD70, CD123, CD138, CD179b, CLL-1, FLT3, Claudin 18.2, BCMA, GCC, MPL, SLAMF7, ROR1, ROR2, GPRC5D, FCRL5, MSLN, EGFR, EGFRviii, PSMA, PSCA, KLK2, IL13Ra2, TROP2, PTK7, DLL3, Muc1, Muc16 또는 Her2. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 포함하는 복합체이다. 예시적인 실시형태에서, 펩티드 항원은 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다. 예시적인 실시형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 NY-ESO-1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE4, WT1, AFP, TERT, MART-1, pp66-CMV, HPV16-E7, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, PSA 또는 gp100 중 하나 이상으로부터 유래된 펩티드를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 2개의 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 사슬의 각각은 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 힌지, 막관통, 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 모듈에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 2개의 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 사슬의 각각은 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 모듈에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 2개읠 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 사슬의 각각은 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 도메인 및 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 모듈에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 2개읠 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 사슬의 각각은 신호전달 수용체, 신호전달 어댑터의 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 모듈에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 비-TCR 신호전달 수용체이다. 한 실시형태에서, 모듈은 NTCRM이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터 (즉, NCAM)이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다.
한 실시형태에서, 본원은 각 사슬이 신호전달 수용체 (예를 들어, 천연 수용체), 신호전달 어댑터 (예를 들어, NTCRM)에 의해NCAM)의 세포외, 막관통, 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 모듈 (예를 들어, NTCRM)에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 신호전달 수용체 및 신호전달 어댑터는 자연적으로 발생한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 신호전달 수용체 및 신호전달 어댑터는 비-자연 발생성이다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 신호전달 수용체 및 신호전달 어댑터는 비-T 세포 수용체 및 비-CD3 어댑터이다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 신호전달 수용체 및 신호전달 어댑터는 자연적으로 발생하는 비-T 세포 수용체 및 비-CD3 어댑터이다.
한 실시형태에서, 본원은 자연 발생 신호전달 수용체 (예를 들어, CD16A), 신호전달 어댑터 (예를 들어, FcRγ)의 세포외, 막관통 또는 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 적어도 하나의 모듈 (예를 들어, NTCRM)에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)에 융합된 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 구축물 (예: 단리된 구축물)을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, NTCRM은 다음의 비-TCR 수용체 중 하나 이상으로부터 유래되지만 이에 한정되지 않는다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2.
일부 실시형태에서, SAR은 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 표적 항원 및 비-T 세포 수용체 모듈 (NTCRM)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터 (즉, NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 MHC 단백질 (예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 또는 MHC 클래스 II 단백질)을 포함하는 복합체이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 세포-표면 항원이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)이 제공되며, 여기서 SAR은 a) vL, Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제1 막 관련 모듈(MAM); 및 b) vH, Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고, 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(non-T cell receptor module, NTCRM)을 형성하고, 상기 NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCRα로부터 선택된 TCR 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 또는 제2 MAM은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCRα로부터 선택된 TCR 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, NTCRM은 i) TCRα 및 TCRβ, ii) TCRγ 및 TCRδ, 또는 iii) preTCRα 및 TCRβ로부터 선택된 2개의 TCR 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ζ로부터 선택된 CD3 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 TCR 사슬 및 CD3 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 CD3ζ의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 예시적인 실시형태에서, NTCRM은 다음의 비-TCR 수용체 중 하나 이상으로부터 유래되지만 이에 한정되지 않는다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및/또는 DAP12 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터(NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원-결합 도메인과 제1 MAM 사이의 제1 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인과 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 약 5 내지 약 500 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 개별적으로, 유래된 면역글로불린(예: 서열번호 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호3560; TCRa-Ig3, 서열번호3562; TCRg-Ig3, 서열번호3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호3568 등) 또는 이의 변이체 또는 이의 단편으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, vL 도메인은 IgCL 링커에 부착되고, vH 도메인은 IgCH1 링커에 부착된다. 일부 실시형태에서, vL 도메인은 IgCH1 링커에 부착되고, vH 도메인은 IgCL 링커에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vα 도메인은 Cα-유래된 링커 (예를 들어, TCRa-Ig3)에 부착되고, Vβ 도메인은 Cβ 유래된 링커 (예를 들어, TCRb-Ig3)에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vβ 도메인은 Cα-유래된 링커 (예를 들어, TCRa-Ig3)에 부착되고, Vα 도메인은 Cβ 유래된 링커 (예를 들어, TCRb-Ig3)에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 Cγ유래된 링커 (예를 들어, TCRg-Ig3)에 부착되고, Vδ 도메인은 Cδ 유래된 링커 (예를 들어, TCRd-Ig3)에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 Cδ-유래된 링커 (예를 들어, TCRd-Ig3)에 부착되고, Vδ 도메인은 Cγ 유래된 링커 (예를 들어, TCRg-Ig3)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 가변 도메인 및 링커의 다른 구성이 구상된다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현, 친화성 및 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상보적 사슬 (예를 들어, vL 및 vH, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, AABD는 단일 vH 도메인 (SVH), 단일 vL 도메인 (SVL), vHH 도메인, 단일 도메인 항체, TCR의 단일 가변 도메인 (svd-TCR), 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체의 리간드-결합 도메인, 리간드의 수용체-결합 도메인 중 하나 이상으로부터 선택되고, 자가항원, 어댑터 결합 도메인, Fc 결합 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 하나 이상 선택되나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 예시적인 실시형태에서, 표적 항원은 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 CD2, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD70, CD123, CD138, CD179b, CLL-1, FLT3, Claudin 18.2, BCMA, GCC, MPL, SLAMF7, ROR1, ROR2, GPRC5D, FCRL5, MSLN, EGFR, EGFRviii, PSMA, PSCA, KLK2, IL13Ra2, TROP2, PTK7, DLL3, Muc1, Muc16 또는 Her2 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 포함하는 복합체이다. 예시적인 실시형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 NY-ESO-1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE4, WT1, AFP, TERT, MART-1, pp66-CMV, HPV16-E7, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, PSA 또는 gp100 중 하나 이상으로부터 유래된 펩티드를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존적 방식으로 세포내 펩티드를 인식할 수 있는 TCR 모방 항체로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SAR의 Vα 및 Vβ 도메인은 세포 표면 단백질을 인식할 수 있는 HLA-비의존적 TCR로부터 유래된다. 한 실시형태에서, SAR은 이중특이성 또는 다중특이성이다. 한 실시형태에서, 본원은 MHC가 제한되는 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 MHC 제한 및/또는 MHC-비-제한인 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 Fv 또는 TCR-Fv 도메인을 통해 펩티드/MHC 복합체에 결합할 수 있고, 이의 vL 및 vH, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착된 하나 이상의 svd-TCR을 통해 하나 이상의 펩티드/MHC 복합체들에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 Fv, TCR-Fv 도메인 및/또는 svd-TCR 도메인을 통해 하나 이상의 펩티드/MHC 복합체에 결합할 수 있고, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 하나 이상의 AABD (예를 들어, vHH, FHVH, 센티린 등)를 통해 하나 이상의 표면 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상술한 SAR 들(예를 들어, 단리된 SAR) 중 어느 하나에 따르면, 제1 폴리펩티드는 제1 MAM (예를 들어, 막관통 도메인)에 대한 제1 힌지 도메인 (또는 연결 펩티드) 또는 이의 단편 N-말단 (예를 들어, 막관통 도메인)을 추가로 포함하고, 및/또는 제2 MAM 은 추가로 제2 MAM(예를 들어, 막관통 도메인)에 대한 제2 힌지 도메인 (또는 연결 펩티드) 또는 이의 단편 N-말단 (예를 들어, 막관통 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, SAR은 제1 MAM 내의 잔기와 제2 MAM 사이의 이황화 결합 및/또는 제1 힌지 도메인 내의 잔기와 제2 힌지 도메인 내의 잔기 사이의 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상술한 SAR (예를 들어, 단리된 SAR) 중 어느 하나에 따르면, 제1 MAM은 제1 힌지 도메인에 제1 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고/하거나 제2 폴리펩티드는 제2 힌지 도메인에 대한 제2 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 2개의 상동성 항원 결합 도메인은 2개의 힌지 도메인과 동일한 비-T 세포 수용체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 제1 MAM은 제1 막관통 도메인에 제1 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 MAM은 제2 막관통 도메인에 제2 세포질 도메인C-말단을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 세포질 도메인은 하나 이상의 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인이다. 일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)에 따르면, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상술한 SAR (예를 들어, 단리된 SAR) 중 어느 하나에 따르면, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 막관통 도메인에 대한 둘 이상의 공동자극 도메인 C-말단을 포함하고/하거나 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 막관통 도메인에 대한 둘 이상의 공동자극 도메인 C-말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원 결합 도메인에 대한 제1 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인에 대한 제2 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 MAM 및 NTCRM은 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 MAM 및 NTCRM은 모두 단일 비-T 세포 수용체 및/또는 단일 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다. 예시적인 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 모두 CD3ζ로부터 유래된 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬은 모두 FcRγ 또는 CD16A로부터 유래된 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 MAM 및 NTCRM은 하나 이상의 상이한 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는선택적 세포외 도메인으로 구성된다. 예시적인 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은CD3ζ 힌지 도메인, CD3ζ 막관통 도메인 및 FcRγ 세포질 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬은 DAP10 힌지 도메인, 41-BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 세포질 도메인에 부착된 DAP 10 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인은 서열이 동일하고, 동일한 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인은 서열이 다르고 및/또는 상이한 단백질로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인은 서열이 상이하고/있거나 상이한 단백질로부터 유래된다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 하나 이상의 선택적 링커를 통해 신호전달 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 사슬; 및 b) 하나 이상의 선택적 링커를 통해 제2 신호전달 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 사슬을 포함하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 하나 또는 둘 모두의 신호전달 수용체는 자연 발생이다. 한 실시형태에서, 하나 또는 둘 모두의 신호전달 수용체는 자연 발생 비-T 세포 수용체이다. 한 실시형태에서, 제1 사슬상에 존재하는 적어도 하나의 이종 항원 결합 도메인 (예를 들어, vL, Vα, 또는 Vγ 등)은 제2 사슬 상에 존재하는 적어도 하나의 이종 항원 결합 도메인(예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ 등)과 회합하여 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모듈(예를 들어, Fv 또는 TCR-Fv 등)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 MHC 단백질 (예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 또는 MHC 클래스 II 단백질)을 포함하는 복합체이다. 일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커와 제2 펩티드 링커는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 내의 제1 선택적 링커 내의 잔기와 제2 폴리펩티드 사슬 내의 제2 선택적 링커 내의 잔기 사이에 디설파이드 결합이 존재한다. 일부 실시형태에서, 제1 링커 및/또는 제2 링커는 개별적으로, 약 5 내지 약 500개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 면역글로불린(예: 서열번호 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 변이체 또는 이의 단편으로부터 유래된Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 신호전달 수용체는 적어도 하나의 신호전달 어댑터 (예를 들어, CD3ζ 또는 NCAM 등)를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈 (NTCRM)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및/또는 DAP12로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 링커를 작동적으로 연결되는 vL (항체의 경사슬의 가변 도메인), Va (TCRa 또는 Vα의 가변 도메인) 또는 Vg (TCRg 또는 Vγ의 가변 도메인) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합도메인; 및 b) 제2비-TCR신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 링커를 작동적으로 연결되는 vH(항체의 중사슬의 가변 도메인), Vb(TCRb 또는 Vβ의 가변 도메인) 또는 Vd(TCRd 또는 Vδ의 가변 도메인) 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 제2 항원 결합 도메인의 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 vL 도메인을; 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 vH 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하며, 여기서 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존성 및/또는 MHC-비의존적 방식으로 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 Vα 도메인; 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해조작적으로 연결되는 Vβ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하며, 여기서 Vα 및 Vβ 도메인은 MHC 의존적 방식으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 Vγ 도메인; 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 Vδ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vγ 및 Vδ 도메인은 MHC-의존성 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 예시적인 실시형태에서, 비-TCR 신호전달 수용체는 다음 중 하나 이상에 한정되지 않는 것으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 면역글로불린(예: 서열번호 3536-3551)으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 변이체 또는 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vL (항체의 경사슬의 가변 도메인), Va (TCRa 또는 Vα의 가변 도메인), Vg (TCRg 또는 Vγ의 가변 도메인) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인; 및 b) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vH (항체의 중사슬의 가변 도메인), Vb (TCRb 또는 Vβ의 가변 도메인), Vd 도메인 (TCRd 또는 Vδ의 가변 도메인)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 제2 항원 결합 도메인의 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결된 vL 도메인; 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vH 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존성 및/또는 MHC-비의존적 방식으로 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 Vα 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vβ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vα 및 Vβ 도메인은 MHC 의존적 방식으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 Vγ; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vδ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vγ 및 Vδ 도메인은 MHC-의존적 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 예시적인 실시형태에서, 비-TCR 신호전달 수용체는 다음 중 하나 이상에 한정되지 않는 것으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린(예: 서열번호 3536-3551)으로부터 유래된 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호3560; TCRa-Ig3, 서열번호3562; TCRg-Ig3, 서열번호3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호3568 등) 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변형체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vL (항체의 경사슬의 가변 도메인), Va (TCRa 또는 Vα의 가변 도메인), 또는 Vg (TCRg 또는 Vγ의 가변 도메인) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인 및b) 제2비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변형체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vH(항체의 중사슬의 가변 도메인), Vb(TCRb 또는 Vβ의 가변 도메인) 또는Vd (TCRd 또는 Vδ의 가변 도메인)도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원을 특이적으로 결합시키는 이중사슬 SAR을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vL 도메인 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적인 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 vH 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합시키는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존성 및/또는 MHC-비의존적 방식으로 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다.한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결된 Vα 도메인; 및 b)제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 Vβ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vα 및 Vβ 도메인은 MHC 의존적 방식으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 Vγ 도메인 및 b) 제2 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 Vδ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vγ 및 Vδ 도메인은 MHC-의존성 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 예시적인 실시형태에서, 비-TCR 신호전달 수용체는 다음 중 하나 이상에 한정되지 않는 것으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린(예: 서열번호 3536-3551) 으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 인의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 비-TCR 신호전달 수용체 사슬 또는 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결되는 제1 항원 결합 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 비-TCR 신호전달 수용체 사슬 또는 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 조작적으로 연결되는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 그들 각각의 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 항원 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두 자율 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, 예를 들어, vHH, FHVH, SVH, 센티린, DARPIN, svd-TCR, 어댑터, 어댑터 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인 등)이다. 실시형태에서, 항원 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab), scFv, TCR 또는 scTCR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 하나 이상의 자율 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 신호전달 사슬은 활성화 도메인 및 선택적인 공동자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 본래의 신호전달 수용체 (예를 들어, 비-T 세포 수용체)의 전체 또는 부분적 결합 특성을 보유하고, 또한 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 특성을 획득한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 본래의 신호전달 수용체의 전체 또는 부분적 결합 특성을 보유한다. 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 하나 이상의 이종성 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 특성을 추가적으로 획득한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 2개의 신호전달 수용체의 신호전달 특성을 보유한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 단독으로 활성화될 때 2개의 신호전달 수용체 중 어느 하나에 의해 나타내지 않는 새로운 신호전달 특성을 획득한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 단독으로 활성화될 때 2개의 신호전달 수용체의 신호전달 특성에 부가적인 새로운 신호전달 특성을 획득한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 단독으로 활성화될 때 2개의 신호전달 수용체의 신호전달 특성의 상승작용을 하는 새로운 신호전달 특성을 획득한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 개의 사슬을 포함하는 신호전달 수용체는 단일 막관통 도메인을 갖는 I형 막 단백질이다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 자연적으로 발생된 신호전달 수용체이다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 비-TCR 신호전달 수용체이다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 신호 어댑터(예를 들어, CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12 등)을 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 활성화 도메인을 포함하는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 하나 이상의 ITAM들을 포함하는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 하나 이상의 ITIM을 포함하는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 공동자극 도메인을 포함하는 신호 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 자연적으로 발생한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-자연적으로 발생한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 세포내 신호전달 경로 (예를 들어, NFAT, NF-κB, ERK, PI3K 등)을 활성화시키는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 세포내 신호전달 경로 (예를 들어, NFAT, NF-κB, ERK, PI3K 등)를 억제하는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 공동자극 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 활성화 도메인 및 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 신호전달 어댑터로부터 유래된 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12로부터 유래된 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬에 존재하는 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM들을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는 하나 이상의 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는2개 이상의 ITAM 모티프를 함유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬은 단일 ITAM을 함유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는ITAM이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, SAR의 이중사슬의 하나 또는 두 사슬 모두는 티로신계 모티프(YINM)를 함유하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두들는 PI3K 및/또는 Grb2의 p85 서브 유닛을 모집하는 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두 사슬 모두는NFAT, PI3K, NF-κB 및/또는 ERK 신호전달 경로 중 하나 이상을 활성화시키는 활성화 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 세포내 억제 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 PD1로부터 유래된 세포내 억제 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR의 억제 도메인은 하나 이상의 ITIM 모티프를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및 DAP12의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원은 적어도 하나는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 2개의 폴리펩티드 사슬에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 각각 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 2개의 폴리펩티드 사슬에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 하나 또는 두 개 모두 폴리펩티드는 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 적어도 하나의 폴리펩티드는 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 두 폴리펩티드 모두 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩티드는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 두 폴리펩티드 모두 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 적어도 하나는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 2개의 폴리펩티드 사슬에 선택적 링커를 통하여 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 세포내 활성화 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 적어도 하나는 세포내 활성화 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결하는 하나 이상의 이종성 항원 결합 도메인을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-TCR/CD3 신호전달 어댑터이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 TCR/CD3 신호전달 복합체의 성분이 아니다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비천연 신호전달 어댑터; 즉, 자연에 존재하지 않는다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 하나 이상의 ITAM들을 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 하나 이상의 ITIM들을 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 디설파이드 연결된 이량체 단백질이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 I형 막관통 단백질이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 신호전달 단백질, 예를 들어, 단백질 키나제, 예를 들어, ZAP70을 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 하나 이상의 세포 신호전달 경로, 예를 들어, NFAT, NF-κB, ERK, PI3K 등을 활성화시킬 수 있다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 사슬을 포함하는 2개의 비-TCR 신호전달 수용체 사슬은 동일한 유형 및 서열이다. (예를 들어, 두 신호전달 사슬 모두 CD16A, NKp46 또는 NKp30 등의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.) 예시적인 이러한 이중사슬 SAR은 서열번호 6383-6293, 4675, 4696 및 8344로 표시된다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 신호전달 사슬은 상이한 유형이다. (예를 들어, 제1 사슬은 CD16A의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 제2 사슬은NKp30의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하거나 CD16A의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 제2 사슬은 CD3ζ의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다 등.) 예시적인 이러한 SAR는 서열번호 4695 및 4670으로 표시된다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 신호전달 사슬은 동일한 수용체로부터 유래된다 (예를 들어, 두 사슬 모두 CD16A로부터 유래된다). 예시적인 이러한 SAR은 서열번호 4676으로 표시된다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 신호전달 사슬은 상이한 수용체로부터 유래된다 (예를 들어, 제1 사슬은NKp44로부터 유래되고, 제2 사슬은 NKp30으로부터 유래된다.) 이러한 예시적인 SAR은 서열번호 4713으로 표시된다.
한 실시형태에서, 본원은 비-TCR 수용체 신호전달 사슬 (예를 들어, CD16A)로부터 유래되는 제1 사슬 및 신호전달 어댑터로부터 유래되는 제2 사슬 (예를 들어, CD3ζ 또는 FcRγ)로부터 유래되는 제2 사슬을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 이러한 SAR의 예시는 서열번호 4670으로 표시된다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 비-TCR 수용체 신호전달 사슬 (예를 들어, CD16A)로부터 유래되는 제1 사슬 및 TCR 신호전달 사슬로부터 유래되는 제2 사슬 (예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, preTCRα 또는 이의 변이체 또는 이의 단편)로부터 유래되는 제2 사슬을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원은 하나의 비-TCR 모듈(또는 NTCRM) 및 하나의 TCR 모듈(또는 TCRM)을 포함하는 이중사슬 SAR을 제공한다. 예시적인 이러한 SAR는 서열번호 4708-4710으로 표시된다.
한 실시형태에서, 이종 항원 결합 도메인의 vL/vH, Vα/Vβ, Vγ/Vδ 사슬 및 비-TCR 신호전달 사슬 사이의 선택적인 링커는 표 13에 나타내어지는 Ig 유사 링커 (서열번호(DNA) 1142-1175 및 서열번호(PRT) 3536-3569)이다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 구축에 사용되는 신호전달 수용체는 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 임의의 수용체이다. 한 실시형태에서, 신호전달 수용체는 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 자연 발생 신호전달 수용체의 신호전달 사슬이다. 예시적인 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 과립구 및 B 세포로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 본원의 이중사슬 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 신호전달 수용체는 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, Siglec3, Siglec-7 및 Siglec-9 등 또는 이의 변이체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 자율항원 결합 도메인 (예를 들어, 완전 인간 vH 도메인, vHH, 단일사슬 TCR 등), 비면역글로불린 항원 결합 도메인(예를 들어, 센티린, 아피바디 등), 리간드 (예를 들어, APRIL, TPO, NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA 등), 및 수용체의 세포외 도메인(예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, CD16A 등), 어댑터 바인딩 도메인(예: EZip, RZip, E4, R4 등)은 SAR에 대한 추가의 항원 결합 능력을 부여하기 위해 SAR의 vL, vH, Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 사슬의 아미노 말단 또는 그 근처에 작동적으로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)이 제공되며, 여기서 SAR은 a) vL, Vα 또는 Vγ 도메인 및 제1 막 관련 모듈 (MAM)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) vH, Vβ 또는 Vδ 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인 및 제2 항원 결합 도메인의 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및/또는 상기 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(non-T cell receptor module, NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, SAR은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 MAM은 다음의 신호전달 어댑터: CD3ζ, FcRγ. DAP10 또는 DAP12 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상으로부터 유도되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, NTCRM은 다음의 신호전달 어댑터: CD3ζ, FcRγ. DAP10 또는 DAP12 중 하나 이상으로 구성되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터(NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원-결합 도메인과 제1 MAM 사이의 제1 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인과 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커와 제2 펩티드 링커는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 약 5 내지 약 500 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이들의 친화도 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 개별적으로, 면역글로불린(예, 서열번호 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예, TCRb-Ig3, 서열번호3560; TCRa-Ig3, 서열번호3562; TCRg-Ig3, 서열번호3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호3568 등) 또는 이의 단편으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상보적 사슬 (예를 들어, vL 및 vH, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 예시적인 실시형태에서, 표적 항원은 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD70, CD123, CD138, CLL-1, FLT3, Claudin 18.2, BCMA, GCC, MPL, SLAMF7, ROR1, ROR2, GPRC5D, FCRL5, MSLN, EGFR, EGFRviii, PSMA, PSCA, KLK2, IL13Ra2, TROP2, PTK7, DLL3, Muc1, Muc16 또는 Her2 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 포함하는 복합체이다. 예시적인 실시형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 NY-ESO-1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE4, WT1, AFP, TERT, MART-1, pp66-CMV, HPV16-E7, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, PSA 또는 gp100 중 하나 이상으로부터 유래된 펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상술한 SAR(예: 단리된SAR)들 중 어느 하나에 따르면, 제1 MAM은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 힌지 도메인 또는 그 단편 N-말단을 더 포함하고, 제2 MAM은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 힌지 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NTCRM은 제1 힌지 도메인 내의 잔기와 제2 힌지 도메인 내의 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 MAM은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 MAM은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 세포질 도메인C-말단을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 세포질 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함하는 활성화 도메인이다. 일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)에 따르면, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원 결합 도메인에 대한 제1 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인에 대한 제2 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 vL (항체의 경사슬의 가변 도메인), Va (TCRa 또는 Vα의 가변 도메인) 또는 Vg (TCRg 또는 Vγ의 가변 도메인) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 제1항원 결합 도메인; 및 b) 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인에 선택적 펩티드 링커를 통해 조작적으로 연결된 vH(항체의 중사슬의 가변 도메인), Vb(TCRb 또는 Vβ의 가변 도메인) 또는Vd 도메인(TCRd 또는 Vδ의 가변 도메인)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 vL 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 vH 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR제공하고, 여기서 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존성 및/또는 MHC-비의존적 방식으로 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 Vα 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vβ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vα 및 Vβ 도메인은 MHC 의존적 방식으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vγ 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vδ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR포함하고, 여기서 Vγ 및 Vδ 도메인은 MHC-의존적 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 다음 중: CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP10 또는 이의 변이체 또는 이의 단편 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터(NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 개별적으로, 면역글로불린(예, 서열번호 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예, TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 변이체 또는 이의 단편으로 부터 유래된Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 면역글로불린(예: 서열 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예, TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호3562; TCRg-Ig3, 서열번호3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호3568 등) 또는 이의 단편으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 vL, Vα, 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원 결합; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 작동적으로 연결되는 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 제1 항원-결합 도메인의 vL, Vα 또는 Vγ 도메인 및, 제2 항원 결합 도메인의 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 vL 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 vH 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 vL 및 vH 도메인은 MHC-의존성 및/또는 MHC-비의존적 방식으로 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결된 Vα 도메인; 및 b) 선택적 펩티드 링커를 통해 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 Vβ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vα 및 Vβ 도메인은 MHC 의존적 방식으로 펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 한 실시형태에서, 본원은 a) 선택적 펩티드 링커를 통해 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인에 조작적으로 연결된 Vγ 도메인; 및 b) 제2 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 막관통/막고정 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 펩티드 링커를 통해 작동적으로 연결되는 Vδ 도메인을 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 이중사슬 SAR을 제공하고, 여기서 Vγ 및 Vδ 도메인은 MHC-의존성 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 다음 중 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12 또는 이의 변이체 또는 단편 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터(NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 면역글로불린(예: 서열 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예, TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 a) 신호전달 어댑터 (또는 신호전달 사슬)의 사슬 또는 이의 변이체의 아미노-말단 또는 아미노-말단 근처에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인; 및 b) 제2신호전달 어댑터 (또는 신호전달 사슬)의 제2사슬 또는 이의 변이체의 아미노-말단 또는 아미노-말단 근처에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 이러한 SAR은 본래의 신호전달 어댑터(또는 신호전달 사슬)의 신호전달 능력을 보유한다. 실시형태에서, SAR은 또한 이종 항원 결합 도메인에 의해 부여된 결합 능력을 획득한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 세포 (예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포)의 원형질막 상에서 발현될 수 있는 임의의 신호전달 어댑터 (또는 신호전달 사슬)이다. 예시적인 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 과립구 또는 B 세포로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서의 SAR의 구축을 위해 사용될 수 있는 예시적인 신호전달 어댑터(또는 신호전달 체인)는 CD3z (CD3ζ), FcRγ (FcεRIγ), DAP10 및 DAP12 등 또는 이의 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원은 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인이 신호전달 어댑터의 하나 이상의 사슬의 세포외 도메인(예를 들어, 힌지 또는 스페이서 도메인)에 조작적으로 연결된 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 TCR 복합체(예를 들어, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3ε 등)의 성분인 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 TCR 복합체의 TCRα, β, γ 및/또는 δ 사슬과 상호작용하는 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 TCR 복합체의 TCRα, β, γ 및/또는 δ 사슬과 상호작용하지 않는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 막관통 영역 또는 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 내의 양전하를 띤 잔기(라이신 또는 아르기닌)와 상호작용하는 이의 막관통 도메인 내에 보존된 아스파르트산 잔기를 갖는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 막관통 도메인에서 보존된 아스파르트산 잔기가 결여된 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 TCR 복합체의 성분이 아닌 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 신호전달 어댑터(NCAM)이다. 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ 또는 이의 변이체가 아니다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 SAR(예: 단리된 SAR)에 따르면, SAR은 세포 신호전달을 활성화시키는 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 세포 신호전달을 억제하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 하나 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 신호 어댑터(예를 들어 CD3ζ)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 2개 이상의 ITAM 모티프를 소유하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 단일 ITAM 모티프를 소유하는 신호전달 어댑터 (예를 들어, FcRγ)를 포함한다. 실시예에서, SAR은 ITAM 모티프가 결여된 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 티로신-기반 모티프 (YINM)를 포함하는 신호전달 어댑터 (예를 들어, DAP10)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 PI3K 및/또는 Grb2의 p85 서브 유닛을 모집하는 신호전달 어댑터(예를 들어, DAP10)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 천연 형태의 디설파이드 링커 이량체인 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 이의 천연 형태의 디설파이드 링커 이량체가 아니다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 천연 상태에서 이의 막관통 영역에 위치하는 사슬간 디설파이드 결합을 함유하는 신호전달 어댑터 (예를 들어, CD3ζ)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 본래 상태에서 이의 막관통 영역에 위치하지 않는 사슬간 디설파이드 결합을 함유하는 신호전달 어댑터(예를 들어, DAP10 및 DAP12)를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 이의 천연 상태에서 이의 세포외 영역에 위치하는 사슬간 디설파이드 결합을 함유하는 신호전달 어댑터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 SAR (단리된 SAR)에 따르면, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 길이가 10개 미만이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 길이가 8개 미만이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 10개 이상의 아미노산 길이이다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터의 세포외 도메인은 15개 이상의 아미노산 길이이다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 SAR (예를 들어, 단리된 SAR)에 따르면, SAR은 단백질 인산화를 유도하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 단백질 탈인산화를 유도하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 Zap70과 상호작용하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 Zap70과 상호작용하지 않는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 사슬은 동일한 신호 어댑터(예를 들어, CD3ζ 및 CD3ζ)를 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 사슬은 동일하지 않은 신호전달 어댑터 (예를 들어, CD3ζ 및 FcRγ 또는 CD3ζ 및 DAP10 또는 DAP10 및 DAP12 등)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상술한 신호전달 어댑터(예: 단리된 SAR)를 포함하는 임의의 이중사슬 SAR에 따르면, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두개 모두의 사슬은 공동자극 도메인(예를 들어, 4-1BB, CD28, 2B4, OX40 등으로부터 유래된 공동자극 도메인)을 포함하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 두개 모두의 사슬은 활성화 도메인(예: CD3ζ 활성화 도메인) 작동적으로 연결되어 있는 공동자극 도메인 (예를 들어, 4-1BB, CD28, 2B4, OX40 등으로부터 유래된 공동자극 도메인)을 포함하는 신호전달 어댑터를 포함한다. CD28 및 4-1BB의 공동자극 도메인에 연결된 이러한 예시적인 CD3ζ 신호전달 어댑터는 각각 서열번호 3493 및 3494에 제시되어 있다. CD3ζ의 활성화 도메인에 융합된 OX40의 공동자극 도메인을 포함하는 예시적인 SAR은 서열번호 4460 및 4479로 표시된다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 하나 또는 둘 개 모두의 사슬은 2개의 상이한 신호전달 어댑터의 세포질 도메인의 융합체를 포함하는 신호전달 어댑터를 포함한다. DAP10과 CD3ζ의 세포질 도메인의 융합체를 포함하는 사슬을 포함하는 예시적인 이러한 SAR은 서열번호 4460으로 표시된다. 한 실시형태에서, SAR은 사슬간 디설파이드 결합을 폐지하는 돌연변이를 운반하는 CD3z (또는 CD3ζ), FcRγ, DAP10 및 DAP12의 돌연변이체를 포함하는 신호전달 어댑터를 포함한다. 예시적인 이러한 신호전달 어댑터는 서열번호 3747, 3753, 3760, 3817 및 3820으로 표시된다. 한 실시형태에서, 신호전달 사슬은 이의 ITAM 모티프에 하나 이상의 돌연변이를 운반하는 CD3z, FcRγ, DAP10 및 DAP12의 돌연변이체 (예를 들어, CD3z의 IXX 돌연변이체)를 포함한다. 예시적인 이러한 신호전달 어댑터는 서열번호 9824로 표시된다.
본원의 이중사슬 SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 항원 결합 도메인은 항체의 가변 도메인 (예를 들어, vL, vH), TCR의 가변 도메인 (예를 들어, Va, Vb, Vg 또는 Vd 사슬 등), 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab2), 자율적 항원 결합 도메인 (예를 들어, 완전 인간 vH 도메인, vHH, 단일사슬 TCR, svd-TCR 등), scFv, 비면역글로불린 항원 결합 도메인(예를 들어, 센티린, 아피바디, ZIP 도메인, 어댑터 등), 리간드, 및 수용체의 세포외 도메인, 자가항원, TCR, HLA 비의존성 TCR, TCR의 가변 도메인(예를 들어, Va, Vb, Vg, Vd 등) 또는 이의 단편을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 자율항원 결합 도메인 (예를 들어, 완전 인간 vH 도메인, vHH, 단일사슬 TCR 등), 비면역글로불린 항원 결합 도메인(예를 들어, 센티린, 아피바디 등), 리간드 (예를 들어, APRIL, TPO, NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA 등), 및 수용체의 세포외 도메인(예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, CD16A 등), 어댑터 바인딩 도메인(예: EZip, RZip, E4, R4 등)은 SAR에 대한 추가의 항원 결합 능력을 부여하기 위해 SAR의 vL, vH, Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 사슬의 아미노 말단 또는 그 근처에 작동적으로 연결될 수 있다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 신호 어댑터는 동일한 유형이다. (예를 들어, 두 사슬 모두 CD3ζ로부터 유래된다.) 예시적인 이러한 SAR은 서열번호 4702로 표시된다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 2개의 신호전달 어댑터는 상이한 타입이다. (예를 들어, 하나의 신호전달 어댑터는 CD3ζ로부터 유래되고, 제2 어댑터는 FcRγ로부터 유래된다.) 이러한 SAR의 예시는 서열번호 6733으로 표시된다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 비-TCR 수용체 신호전달 사슬 (예를 들어, CD16A)로부터 유래된 하나의 사슬 및 신호전달 어댑터로부터 유래된 또 다른 사슬 (예를 들어, CD3ζ 또는 FcRγ)를 포함할 수 있다. 이러한 SAR의 예시는 서열번호 4670으로 표시된다.
한 실시형태에서, 이중사슬 SAR은 신호 어댑터(예를 들어, CD3ζ)를 포함하는 하나의 사슬 및 TCR 불변 사슬(예를 들어, TCRα-T48C)을 포함하는 또 다른 사슬을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 선택적인 링커는 긴 링커이다. 한 실시형태에서, 이종 항원 결합 도메인의 vL/vH, Vα/Vβ, Vγ/Vδ 사슬 및 비-TCR 신호전달 사슬 사이의 선택적인 링커는 표 13에 나타내어지는 Ig 유사 링커 (서열번호(DNA) 1142-1175 및 서열번호(PRT) 3536-3569)이다.
일부 실시형태에서, 본원은 T 세포가 아닌 세포에 T 세포의 표적 인식 특성 및 기능을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 개시물은 T 세포가 아닌 (즉, 비-T 세포) 세포를 제공하며, 이 세포에 T 세포 수용체 유사 대상 인식 및/또는 신호 전달을 부여하는 수용체를 발현한다. 한 실시형태에서, 본원은 T세포가 아닌 (즉, 비-T세포)세포를 제공하며, 이 세포에 T세포 수용체 유사 표적 인식 및/또는 신호전달을 부여하는 이중사슬 또는 다중사슬 수용체를 발현한다. 실시형태에서, 이중사슬 또는 다중사슬 수용체는 2개 이상의 막관련도메인 (예를 들어, 막관통 도메인 또는 막고정 도메인)을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 또는 다중사슬 수용체는 적어도 2개의 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, T 세포 수용체 유사 인식은 MHC 분자에 의해 제시된 펩티드 표적에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 T 세포 사슬의 발현이 결여되어 있고/있거나 기능적 TCR 사슬의 발현이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 기능적 TCR/CD3 복합체의 발현이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상의 발현이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 사슬 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상을 외인성으로 발현하도록 조작되지 않는다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 TCR 사슬 또는 변이체 또는 단편 중 하나 이상을 외인성으로 발현하도록 조작되지 않는다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 CD3 작용제 항체에 의해 활성화되지 않는다. 한 실시형태에서, T 세포가 아닌 세포 (즉, 비-T 세포)는 OKT3 항체에 의해 활성화되지 않는다.
한 실시형태에서, 본원은 NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC-유래된 NK 세포, iPSC-유래된 T 세포, B 세포, 대식세포/단핵구, 과립구, 수지상 세포, 불멸화된 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주 또는 그 유도체로부터 생성된T 세포 수용체 유사 표적 인식을 갖는 비-T 세포를 제공한다. 한 실시 형태에서, 본원은 기능적 T 세포가 아닌 세포 내로 단일 수용체의 도입에 이어 생성되는 T 세포 수용체 유사 표적 인식을 갖는 비-T 세포를 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 기능적 T 세포가 아닌 세포 내로 4개의 CD3 사슬, 즉 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ의 이소성 발현을 수반하는 유전자 변형 없이 생성되는 T 세포 수용체 유사 표적 인식을 갖는 비-T 세포를 제공한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 수용체 (예를 들어, SAR, 예를 들어, uTCR-SAR)를 발현하는 비-T 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합할 때 하나 이상의 신호전달 어댑터의 모집을 초래한다. 한 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합 시 이중사슬 수용체를 발현하는 비-T 세포는 하나 이상의 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 경로는 NFAT, NF-κB, PI3K 또는 ERK 경로의 그룹으로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다. 한 실시형태에서, 표적 항원에 결합 시 이중사슬 수용체를 발현하는 비-T 세포는 하나 이상의 생물학적 활성의 활성화를 초래한다. 한 실시형태에서, 생물학적 활성은 비제한적으로 세포 활성화, 증식, 미분, 사이토카인 분비, 포식작용, 이동 또는 세포독성의 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본원은 주요 조직적합성 복합체(MHC)-제한된 항원-특이적 세포독성을 갖는, 자연 살해(NK) 세포와 같은, 변형된 세포를 제공한다. MHC는 MHC-클래스 I, MHC-클래스 II, 및 MHC-유사 분자 중 임의의 것일 수 있다. MHC 유사 분자의 비제한적인 예는 HLA-E이다.
추가의 측면에서, 본원은 2개의 막관통/막관련 도메인 및 TCR 유사 항원 인식을 갖는 이중사슬 수용체를 발현하는 변형된 세포를, 예를 들어, 제한되지 않으나, 자연 살해(NK) 세포, 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포 또는 대식세포)를 제공하고, 항원 특이적 수용체를 TCR 유사 결합 특성으로 발현하도록 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 수정된 셀은 임의의 셀이 될 수 있다. 통상적으로 사용되는 비제한적인 예는 NK-92 세포, YTS 세포, 및 일차 인간 NK 세포이다.
또 다른 실시형태에서, 본원은 임의의 세포 유형에서 발현될 수 있는 TCR 유사 결합 특성을 갖는 SAR의 부류를 제공한다. 결합 특성 및 범용 발현과 같은 TCR을 갖는 이러한 SAR은 Universal TCR-SAR 또는 uTCR-SAR 또는 uTCR로 지정된다. 본원에는 T 세포뿐만 아니라 NK 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 과립구, 내피세포 및 상피세포 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 세포에서도 발현될 수 있는 TCR(예를 들어, Va/Vα, Vb/Vβ, Vg/Vγ, Vd/Vδ 등)의 가변 항원 결합 도메인을 포함하는 단일사슬 및 다중사슬 (예를 들어, 이중사슬) uTCR-SAR이 제공된다. 한 실시형태에서, uTCR을 발현하는 세포는 증가된 세포 증식, 활성화, 사이토카인 분비 및 세포독성에 의해 그들의 항원을 발현하는 표적 세포에 반응한다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 MHC 복합체의 일부로서 제시되는 펩티드이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 지질이다. uTCR은 또한 TCR 결합 도메인이 HLA 비의존성 TCR로부터 유래된 경우 MHC 제한 항원에 반응할 수 있다. 한 실시형태에서, 본원은 MHC 복합체에 의해 제시될 때 세포내 펩티드에 결합하는 특성을 포함하는 TCR 유사 결합 특성을 갖는 이중사슬 수용체를 기능적으로 발현하는 T 세포가 아닌 세포를 제공한다.
본원은 비-TCR 신호전달 수용체의 전체 또는 부분 세포외 도메인에 선택적 링커를 통해 조작적으로 연결된 scTCR, svd-TCR 또는 TCR 모방 scFv 또는 이의 단편을 포함하는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 단일사슬 uTCR-SAR을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 scTCR, svd-TCR 또는 TCR 모방체 scFv를 포함하는 단일사슬 SAR이 TCR-유사 결합 능력 (예를 들어, 펩티드/MHC 복합체에 결합하는 능력)을 획득하고, T 세포가 아니거나 TCR 사슬을 발현하는 세포를 포함하는 임의의 세포에서 발현될 수 있음을 제공한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)이 제공되며, 여기서 uTCR-SAR은 a) 제1 항원-결합 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 제2 항원-결합 도메인 및 제2 막 연관 모듈(MAM)을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원-결합 도메인 및 상기 제2 항원-결합 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원-결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다.
한 실시형태에서, uTCR-SAR의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 TCR의 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 MHC 분자에 의해 제시된 펩티드에 특이적으로 결합하는 TCR의 항원 결합 도메인으로 구성된다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 TCR의 가변 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 TCR의 Vα, Vβ, Vγ 및 Vδ 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인은 Vα 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 Vβ 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인은 Vγ 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 Vδ 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인은 preTCRα 또는 이의 변이체 또는 단편의 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 Vβ 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드/MHC 복합체이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR에 의해 인식되는 펩티드는 세포내 펩티드이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 표적 항원은 MHC-비의존성 항원이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 지질이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 HLA-비의존적 TCR의 가변 도메인을 포함하고, 이의 표적 항원은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시형태에서, uTCR-SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편으로부터 유래되지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 변이체 또는 단편의 가변 도메인이 아니다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 항체의 vL 및 vH 도메인이 아니다. 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 TCR 모방 항체의 vL 및 vH 도메인이 아니다.
한 실시형태에서, TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원-결합 모듈은 MHC 분자에 의해 제시된 펩티드에 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원-결합 모듈은 MHC 분자에 의해 제시되지 않는 항원 (예를 들어, HLA-비의존성 항원)에 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원-결합 모듈은 지질 항원에 특이적으로 결합한다.
한 실시예에서, uTCR-SAR의 MAM 중 적어도 하나는 신호전달 어댑터의 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 MAM은 모두 신호 어댑터의 막관통 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 MAM 중 적어도 하나는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 신호전달 수용체의 막관통 도메인/막 관련 도메인으로 구성된다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 MAM은 모두 신호 어댑터를 모집할 수 있는 신호 수용체의 막관통 도메인/막 관련 도메인으로 구성된다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)이 제공되며, 여기서 uTCR-SAR은 a) Vα 또는 Vγ 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및; 및 b) Vβ 또는 Vδ 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 Vα 또는 Vγ 도메인 및 제2 항원 결합 도메인의 상보적 Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원 결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드/MHC 복합체이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)이 제공되며, 여기서 uTCR-SAR은 a) Vα 도메인 (TCRα 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) Vβ 도메인(TCRβ 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제2 막 결합 모듈(MAM)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 Vα 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인의 Vβ는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원 결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(non-T cell receptor module, NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드/MHC 복합체이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 MHC(HLA)-비의존성 항원이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)이 제공되며, 여기서 uTCR-SAR은 a) Vγ 도메인 (TCRγ 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) Vδ 도메인(TCRδ 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제2 막 결합 모듈(MAM)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 Vγ 도메인 및 제2 항원 결합 도메인의 Vδ는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원 결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드/MHC 복합체이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 MHC(HLA)-비의존성 항원이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 지질이다.
일부 실시형태에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)이 제공되며, 여기서 uTCR-SAR은 a) V-preTCRα 도메인 (preTCRα 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) Vβ 도메인(TCRβ 사슬로부터 유래된 가변 도메인) 및 제2 막 결합 모듈(MAM)을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인의 Vα 도메인 및 제2 항원 결합 도메인의 Vβ는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-유사 (예를 들어, TCR-Fv) 항원 결합 모듈을 형성하고, 여기서 제1 MAM 및 제2 MAM은 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다. 한 실시형태에서, NTCRM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드/MHC 복합체이다.
한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCRα로부터 선택된 TCR 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 또는 제2 MAM은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCRα로부터 선택된 TCR 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ζ로부터 선택된 CD3 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 TCR 사슬 및 CD3 사슬의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시형태에서, 제1 MAM 및 제2 MAM은 CD3ζ의 막관통 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, uTCR-SAR의 제1 및 제2 MAM은 신호전달 어댑터의 막관통 또는 막 관련 도메인으로 이루어진다. 한 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및/또는 DAP12 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 비-CD3 어댑터(NCAM)이다. 일부 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ가 아니다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 MAM은 비-TCR 수용체를 포함한다. 한 실시형태에서, 비TCR은 다음 중 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160 및 ILT2. NKp46 및 CD16 및 NKp30의 힌지 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩티드에 부착된 NY-ESO-1 TCR의 가변 도메인을 포함하는 예시적인 uTCR-SAR은 각각 서열번호 10467 및 10468로 표시된다. NKp30의 세포외 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩티드에 부착된 NY-ESO-1 TCR의 Va 및 Vb 도메인을 포함하는 예시적인 uTCR-SAR은 서열번호 10469로 표시된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원-결합 도메인과 제1 MAM 사이의 제1 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인과 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 제1 펩티드 링커 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로, 약 5 내지 약 500 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 링커는 개별적으로, 면역글로불린(예, 서열번호 3536-3551) 또는 TCR-Ig 유사 링커(예: TCRb-Ig3, 서열번호 3560; TCRa-Ig3, 서열번호 3562; TCRg-Ig3, 서열번호 3566; 또는 TCRd-Ig3, 서열번호 3568 등) 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 유래된 Ig 유사 링커 (예를 들어, IgCL, IgCH1 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 이의 발현, 친화성 및 사슬 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상보적 사슬 (예를 들어, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 제1 (예를 들어, vL, Vα 또는 Vγ) 및/또는 제2 (예를 들어, vH, Vβ 또는 Vδ) 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (AABD)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 포함하는 복합체이다. 예시적인 실시형태에서, 펩티드/MHC 복합체는 NY-ESO-1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE4, WT1, AFP, TERT, MART-1, pp66-CMV, HPV16-E7, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, PSA 또는 gp100 중 하나 이상으로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, uTCR은 세포 표면 항원을 표적화할 수 있는 HLA 비의존성 TCR이다. 한 실시형태에서, 표적 항원은 세포 표면 항원이다. 예시적인 실시형태에서, 표적 항원은 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 세포 표면 항원은 단백질, 탄수화물 및 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 항원은 CD2, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD70, CD123, CD138, CD179b, CLL-1, FLT3, Claudin 18.2, BCMA, GCC, MPL, SLAMF7, ROR1, ROR2, GPRC5D, FCRL5, MSLN, EGFR, EGFRviii, PSMA, PSCA, KLK2, IL13Ra2, TROP2, PTK7, DLL3, Muc1, Muc16 또는 Her2 중 하나 이상이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 이중특이성 또는 다중특이성이다. 한 실시형태에서, 본원은 MHC가 제한되는 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 uTCR을 제공한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 MHC 제한 및/또는 MHC-비-제한인 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 이의 TCR-Fv 도메인을 통해 펩티드/MHC 복합체에 결합할 수 있고, 이의 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착된 하나 이상의 svd-TCR을 통해 하나 이상의 펩티드/MHC 복합체에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 이의 TCR-Fv 도메인 및 svd-TCR 도메인을 통해 하나 이상의 펩티드/MHC 복합체에 결합할 수 있고, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 하나 이상의 AABD (예를 들어, vHH, FHVH, 센티린 등)를 통해 하나 이상의 표면 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상술한 uTCR-SAR(예: 격리된 uTCR-SAR) 중 어느 하나에 따르면, 제1 MAM은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 힌지 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 더 포함하고, 및/또는 제2 MAM은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 힌지 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, NTCRM은 제1 힌지 도메인 내의 잔기와 제2 힌지 도메인 내의 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상술한 uTCR-SAR(예: 단리된 uTCR-SAR)들 중 임의의 것에 따르면, 제1 MAM은 제1 힌지 도메인에 대한 제1 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고/하거나 제2 MAM은 제2 힌지 도메인에 대한 제2 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 MAM은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 MAM은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 세포질 도메인은 하나 이상의 ITAM을 포함하는 활성화 도메인이다. 일부 실시형태에서, uTCR-SAR은 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 표적 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상술한 임의의 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)에 따르면, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 막관통 도메인에 대한 제1 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 막관통 도메인에 대한 제2 공동자극 도메인 C-말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상술한 임의의 uTCR-SAR (예를 들어, 단리된 uTCR-SAR)에 따르면, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 막관통 도메인에 대한 둘 이상의 공동자극 도메인 C-말단을 포함하고/하거나 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 막관통 도메인에 대한 둘 이상의 공동자극 도메인 C-말단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 항원 결합 도메인에 대한 제1 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 항원 결합 도메인에 대한 제2 신호전달 펩티드 N 말단을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 비T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드에 융합된TCR 가변 도메인 (예를 들어, Va/Vα, Vb/Vβ, Vg/Vγ, Vd/Vδ 등)을 포함하는 항원 (예를 들어, 펩티드/MHC 복합체)을 특이적으로 표적화하는 이중사슬 uTCR-SAR 구축물 (예를 들어, 단리된 구축물)을 제공한다. 일부 실시형태에서, SAR은 표적 항원 (예를 들어, 펩티드/MHC 복합체 또는 지질 항원)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 TCR 가변 도메인 및 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈 (NTCRM)을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 펩티드 및 MHC 단백질 (예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 또는 MHC 클래스 II 단백질)을 포함하는 복합체이다.
한 실시형태에서, uTCR-SAR은 세포의 표면 상에서 발현된다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 T 세포가 아닌 세포의 표면 상에서 발현된다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, preTCRα 사슬 또는 이의 변이체 또는 단편의 발현이 결여된 세포의 표면 상에서 발현된다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 CD3ε, Cd3γ 및 CD3δ 사슬 또는 이의 변이체 또는 단편의 발현이 결여된 세포의 표면 상에서 발현된다. 한 실시형태에서, TCR-유사 특성을 갖는 uTCR-SAR은 T 세포에서 발현될 때 기능적으로 활성이다 (즉, 세포 증식, 사이토카인 분비 또는 세포독성을 유도할 수 있는). 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 T 세포가 아닌 세포에서 발현될 때(즉, NK 세포, 대식세포, 과립구 수지상 세포 등에서 발현될 때) 기능적으로 활성이다(즉, 세포 증식, 사이토카인 분비 또는 세포독성을 유도할 수 있는). 한 실시형태에서, SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα 사슬 또는 변이체 또는 단편 중 하나 이상의 발현이 결여된 세포에서 발현되고 기능적으로 활성이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα 사슬 또는 이의 변이체의 발현 및/또는 기능이 결여된 세포에서 발현되고 기능적으로 활성이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 CD3ε, Cd3γ 및 CD3δ 사슬 또는 이의 변이체의 발현 및/또는 기능이 결여된 세포에서 발현되고 기능적으로 활성이다.
한 실시형태에서, uTCR-SAR은 T 세포에 TCR-유사 항원 인식을 부여한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 T 세포 이외의 세포 (예를 들어, NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, CIK, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 상피 세포, iPSC 유래 NK 세포 등)에 TCR-유사 항원 인식을 부여한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 MHC (HLA) 의존적 방식으로 펩티드 항원을 결합할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, uTCR-SAR을 발현하는 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 대식세포)는 MHC (HLA)-의존적 방식으로 세포내 펩티드 항원을 인식할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, uTCR-SAR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 대식세포)는 MHC (HLA)-의존적 방식으로 세포내 펩티드 항원을 인식하고, 하나 이상의 세포 신호전달 경로 (예를 들어, NFAT, PI3K, NF-κB 경로 등)를 활성화시킬 수 있다. 예시적인 실시형태에서, uTCR-SAR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 대식세포)는 MHC (HLA)-의존적 방식으로 세포내 펩티드 항원을 인식하고, 하나 이상의 세포 신호전달 경로 (예를 들어, NFAT, PI3K, NF-κB 경로 등)를 차단할 수 있다. 한 실시형태에서, uTCR/SAR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, T 세포 또는 대식세포)는 세포 활성화, 증식, 사이토카인 분비 (예를 들어, IFNγ, TNFα 및 IL2의 분비) 및/또는 이의 표적 펩티드 항원 결합시 세포독성을 유도하는 능력을 보유한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, NK 세포, T 세포 또는 대식세포)는 세포 활성화, 증식, 사이토카인 분비 (예를 들어, IFNγ, TNFα 및 IL2의 분비) 및/또는 이의 표적 펩티드 항원 결합시 세포독성을 차단하는 능력을 보유한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 활성화 수용체이다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 억제성 수용체이다.
한 실시형태에서, uTCR-SAR은 TCR의 가변 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, Va/Vα, Vb/Vβ, Vg/Vγ, Vd/Vδ 및 preTCRα)을 포함하고, 2개의 사슬을 갖는다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 Va/Vα 및 Vb/Vβ 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 Vg/Vγ 및 Vd/Vδ 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 preTCRα 및 Vb/Vβ 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR SAR의 2개의 가변 도메인은 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 한 실시형태에서, uTCR SAR의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 펩티드/MHC 복합체 결합 도메인)을 포함하는 2개의 가변 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬의 일부가 아니다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR의 2개의 가변 도메인은 링커를 통해 작동적으로 연결되지 않으며, 즉, uTCR은 단일사슬 TCR(scTCR)이 아니다.
한 실시형태에서, uTCR의 하나 또는 두 사슬은 막관통 도메인 또는 막고정 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR SAR의 하나 또는 두 개 모두 사슬은 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR SAR의 하나 또는 두 개 모두 사슬은 신호전달 단백질 또는 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 uTCR SAR의 하나 또는 둘 다 사슬은 하나 이상의 세포질 활성화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 uTCR SAR의 하나 또는 둘 다 사슬은 그들의 세포질 도메인에서 하나 이상의 ITAM을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이중사슬 uTCR SAR의 하나 또는 둘 다 사슬은 1, 2 또는 3개의 ITAM을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, uTCR SAR의 한 사슬은 단일 ITAM을 갖는 세포질 도메인을 포함하는 반면, 제2 사슬은 3개의 ITAM을 갖는 세포질 도메인을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 하나의 사슬은 단일 1 ITAM을 갖는 세포질 도메인을 포함하는 반면, 제2 사슬은 2 또는 3 ITAM을 갖는 세포질 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 이중 uTCR SAR의 하나 또는 둘 다 사슬은 하나 이상의 억제 모티프, 예를 들어, ITIM을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 1개 이상의 ITAM이 돌연변이되는 CD3ζ 사슬로부터 유래된 세포질 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, uTCR-SAR은 1개 이상의 ITAM의 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 돌연변이되는 CD3ζ 사슬로부터 유래된 세포질 활성화 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 또한 신호전달 사슬(어댑터) 및/또는 비-TCR 수용체의 세포외 도메인에 작동적으로 연결되고 공동자극 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인으로서 가변 도메인(예를 들어, Vα, Vβ, Vγ 및 Vδ 등)을 포함하는 uTCR-SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, TCR-유사 결합 특성을 갖는 이중사슬 uTCR SAR의 하나 또는 두 개 모두 사슬은 선택적으로 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 하나 또는 양쪽 사슬의 인접막 영역에 위치한다. 예시적인 실시형태에서, 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, CD27, CD81, OX40, 2B4 또는 CD2 등의 세포질 도메인으로부터 유래된다. CD28 및 4-1BB의 공동자극 도메인을 포함하는 예시적인 이러한 CD3ζ 신호전달 사슬은 각각 서열번호 3493 및 3494에 제시되어 있다. SAR은 형식이 모듈식이기 때문에 새로운 uTCR-SAR을 생성하기 위해 CD28 및 4-1BB의 공동자극 도메인은 다른 공동자극 수용체(예: OX40, 2B4, CD2, CD81 등) 및 그 변이체로부터 유래된 공동자극 도메인으로 대체될 수 있다. 유사하게, 하나 또는 둘 모두의 CD3ζ 신호전달 사슬은 신규한 uTCR-SAR을 생성하기 위해 FcRγ, DAP10 및 DAP10의 신호전달 사슬 및 이의 변이체에 기초하고 상이한 공동자극 도메인을 포함하는 다른 신호전달 사슬로 대체될 수 있다. 예시적인 이러한 uTCR-SAR 표적 NY-ESO1 펩티드/MHC 복합체는 서열번호 10481-10530으로 표시된다.
한 실시형태에서, TCR-유사 결합 특성을 갖는 uTCR SAR은 단일특이성이다. 한 실시형태에서, TCR-유사 결합 특성을 갖는 uTCR SAR은 이중특이성이다. 한 실시형태에서, TCR-유사 결합 특성을 갖는 uTCR SAR은 이중파라토프성이다. 한 실시형태에서, TCR-유사 결합 특성을 갖는 uTCR SAR은 다중특이성이다. 한 실시형태에서, 본원은 MHC 복합체에 의해 제시될 때 2개 이상의 별개의 세포내 펩티드에 결합할 수 있는 TCR과 유사한 결합 특성을 갖는 uTCR SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 세포내 펩티드 및 세포 표면 발현(또는 세포외) 단백질(예를 들어, CD19, CD20 등)에 결합할 수 있는 TCR과 유사 결합 특성을 갖는 uTCR SAR을 제공한다. NY-ESO-1 펩티드/MHC 복합체 및 CD20 둘 다를 표적으로 하는 예시적인 이러한 uTCR-SAR은 서열번호 10478로 표시된다. 이 구축물에서, CD20을 표적으로 하는 vHH 도메인은 작은 링커를 통해 NY-ESO-1 펩티드를 표적으로 하는 Vb 도메인의 N-말단에 부착된다. CD20 vHH 도메인은 다른 표면 항원 또는 펩타이드/MHC 복합체를 표적으로 하는 다른 AABD로 대체될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, CD20 vHH 도메인은 MAGE-A3 펩티드/HLA-A2 복합체를 표적으로 하는 단일 가변 도메인 TCR로 대체되어, NY-ESO-1 및 MAGE-A3 펩티드 모두를 표적으로 할 수 있는 이중특이성 uTCR-SAR을 생성한다. AABD는 또한 uTCR의 Va 도메인에 연결하여 이중특이성 SAR을 생성하거나 Vb 및 Va 도메인 모두에 연결하여 다중특이성 uTCR-SAR을 생성할 수 있다. 또한, 둘 이상의 AABD(예를 들어, vHH, FHVH, 센티린, svd-TCR)가 uTCR-SAR의 가변 도메인의 각각의 N-말단에 부착될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원은 MHC(또는 HLA)-의존성 및 MHC(HLA)-비의존적 방식으로 그들의 표적 항원(들)에 결합할 수 있는 TCR과 유사한 결합 특성을 갖는 uTCR SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, TCR 결합 특성을 갖는 uTCR SAR은 펩타이드/MHC 복합체에 결합하는 단편 가변 TCR(TCR-Fv)을 형성하기 위해 서로 결합하는 2개의 가변 도메인 (예를 들어, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 등)을 포함한다. 한 실시형태에서, TCR 결합 특성을 갖는 SAR은 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (예를 들어, vHH, FHVH, svd-TCR 등)을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인 (예를 들어, vHH, FHVH, svd-TCR 등) 선택적 링커를 통해 TCR 가변 도메인(예를 들어, Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 등) 중 하나 또는 두 개 모두의 N-말단 또는 N-말단 부근에 작동적으로 연결된다. 예시적인 실시형태에서, 본원은 이의 Vα/Vβ 도메인을 통해 MHC와 복합체 중의 NY-ESO-1 펩티드를 인식하고, NY-ESO-1 또는 MAGE-A3 또는 CD20 또는 BCMA 등을 표적으로 하는 vHH 또는 FHVH 도메인을 공동-발현하는 이중사슬 SAR을 제공한다. NY-ESO-1 펩티드/MHC 복합체, CD20 및 BCMA를 표적으로 하는 예시적인 uTCR-SAR은 서열번호 10479로 표시된다.
한 실시형태에서, 본원은 TCR의 Va (Vα) 도메인이 선택적 링커 (예를 들어, TCRa-Ig3, 서열번호 3562)를 통해 하나의 막고정된 폴리펩티드 사슬의 세포외 도메인에 조작적으로 연결되고, Vb(Vβ) 도메인이 선택적 링커 (예를 들어, TCR 유사 링커, 예를 들어, TCRb-Ig3; 예를 들어, 서열번호 3560)를 통해 제2 막고정된 폴리펩티드 사슬의 세포외 도메인에 조작적으로 연결되는 이중사슬 uTCR SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR을 포함하는 하나 또는 둘 다의 막 고정 폴리펩티드 사슬은 막관통 단백질이다.
예시적인 실시형태에서, 본원은 TCR로부터 유래된 Va(Vα) 도메인이 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP12 등)의 한 사슬의 세포외 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 선택적 링커(예를 들어, TCRa-Ig3, 서열번호 3562)를 통해 조작적으로 연결되고, Vb(Vβ) 도메인이 선택적 링커(예를 들어, TCR-유사 링커, 예를 들어, TCRb-Ig3; 예를 들어, 서열번호 3560)를 통해 신호전달 어댑터의 제2 사슬의 세포외 힌지 도메인 또는 이의 변이체에 조작적으로 연결되는 uTCR-SAR을 제공한다. 세포(예: T 세포, NK 세포, 대식세포등)에서 발현할 때NY-ESO-1 펩타이드/HLA-A*02:01 복합체를 인식하는 예시적인 uTCR-SAR은 서열번호(DNA) 9355 및 서열번호(PRT) 10447로 제시된다. SAR은 형식이 모듈식이기 때문에 이 SAR의 하나 또는 둘 다의 CD3ζ 신호 사슬은 FcRγ, DAP10 및 DAP10의 신호전달 사슬 또는 그 변이체를 포함하는 다른 신호전달 사슬/어댑터로 대체될 수 있다. 또한, 링커 도메인은 다른 링커 도메인으로 대체될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 상기 Ig 유사 링커 TCRa-Ig3 (서열번호 3562)는 IgCL 링커 (서열번호 3536)로 대체되고, 링커 TCRb-Ig3 (서열번호 :3560)은 IgG-CH1 (서열번호 3537), IgG2-0C-CH1 (서열번호 3544), IgG3-CHI1 (서열번호 3544), IgG3-CHI1 (서열번호 3545), IgG4-CHI1 (서열번호 3546), IgAI-CHI1 (서열번호 3547), IgA2-CHI1, IgD-CHI1, IgE-CHI1 또는 IgM-CHI1 (서열번호 3551)는 대체된다. NY-ESO-1 펩티드/MHC 복합체를 표적으로 하는 예시적인 이러한 uTCR-SAR 구축물은 서열번호 9357-9365로 표시된다.
일부 실시형태에서, Vα 도메인은 IgCL 링커에 부착되고, Vβ 도메인은 IgCH1 링커에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vβ 도메인은 IgCH1 링커에 부착되고, Vα 도메인은 IgCL 링커에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vα 도메인은 Cα-유래된 링커 (예를 들어, TCRa-Ig3)에 부착되고, Vβ도메인은 Cβ 유래된 링커 (예를 들어, TCRb-Ig3)에 부착된다. 일부 실시형태에서, Vβ 도메인은 Cα-유래된 링커 (예를 들어, TCRa-Ig3)에 부착되고, Vα 도메인은 Cβ 유래된 링커 (예를 들어, TCRb-Ig3)에 부착된다. 예시적인 이러한 구축물은 서열번호 10448로 표시된다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 Cγ-유래된 링커 (예를 들어, TCRg-Ig3)에 부착되고, Vδ 도메인은 Cδ 유래된 링커 (예를 들어, TCRd-Ig3)에 부착된다. 예시적인 이러한 구축물은 서열번호 10694이다. 이 구성에는 Vd2 및 Vg9 변수 도메인이 있다. 일부 실시형태에서, Vγ 도메인은 Cδ-유래된 링커 (예를 들어, TCRd-Ig3)에 부착되고, Vδ 도메인은 Cγ 유래된 링커 (예를 들어, TCRg-Ig3)에 부착된다. 이와 같은 예시적인 작제물은 서열번호 10693으로 표시된다. 일부 실시형태에서, 가변 도메인 및 링커의 다른 구성이 구상된다.
예시적인 실시형태에서, TCRγ 및 TCRδ의 가변 도메인을 포함하는 uTCR-SAR의 경우, Vγ 단편은 TCRγ(예를 들어, TCRg-Ig3, 서열번호 3566)를 통해 유래된 Ig-유사 링커를 통해 신호전달 어댑터(예를 들어, CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP10 등)의 하나의 사슬에 부착되고, Vδ단편은 TCRδ사슬(예를 들어, TCRd-Ig3, 서열번호 3568)을 통해 유래된 Ig 유사 링커를 통해 신호전달 어댑터의 제2 사슬에 부착된다. TCRg-Ig3 및 TCRg-Ig3 링커 도메인은 다른 링커 도메인으로 대체될 수 있다. 본원은TCRγ 및 TCRδ의 가변 도메인을 포함하는 SAR을 제공하고 여기서 Ig (예를 들어, IgCL 및 IgG-CH1) 또는 TCRα/β (예를 들어, TCRa-Ig3 및 TCRb-Ig3)로부터 유래된 링커는 TCRγ (예를 들어, TCRg-Ig3, 서열번호 3566) 및 TCRδ 사슬 (예를 들어, TCRd-Ig3, 서열번호 3568)로부터 유래된 하나 또는 둘 모두를 대체할 수 있다.
본원은 2개의 신호전달 사슬이 상이한 유형(예를 들어, CD3ζ 및 FcγR, CD3ζ 및 DAP10, CD3ζ 및 DAP12, FcRγ 및 DAP10 등)인 항원 결합 도메인으로서 TCR의 가변 도메인을 포함하는 이종이량체 이중사슬 uTCR-SAR을 제공한다. 본원은 하나 또는 두 개의 신호전달 사슬이 막관통 및 선택적 자연 발생 신호전달 수용체, 예를 들어, CD16A, NKp30, NKp44, NKp44 등의 세포질 도메인을 포함하는 이종이량체 이중사슬 uTCR-SAR을 제공한다. 이러한 uTCR-SAR의 하나 또는 둘 모두의 사슬은 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다. NY-ESO-1 펩티드/HLA-A*02:01 및 MAGE-A3 펩티드/HLA-A*02:01 복합체를 표적으로 하고 상이한 결합 도메인, 링커, 활성화 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 예시적인 uTCR-SAR 구축물은 각각 서열번호(PRT) 10447-10530 및 10531-10610으로 표시된다. 다수의 암 유형을 인식하는 HLA-비의존성 TCR인 MC.7.G5의 가변 도메인을 포함하는 예시적인 uTCR-SAR 구축물은 서열번호(PRT) 10620-10692 및 서열번호(DNA) 9528-9600으로 표시된다.
본원은 CD16 (FcγRIII)의 일부 또는 전체 영역을 포함하는, 단일사슬, 이중사슬 및 이중사슬 이종이량체 SAR을 제공한다. 본원은 생물학적 활성을 보유하면서 본원에 기재된 임의의 CD16 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 CD16 또는 이의 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 전장 CD16 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호(DNA) 1415-1417 및 서열번호(PRT) 3809-3811 또는 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 원숭이 등으로부터의 등가 잔기 (즉, 상동체)로 제공된다. 본원의 CD16 SAR의 구축에 사용될 수 있는 CD16 단편은 가출원의 표 25-30에 제공된다. CD16 SAR은 이의 서열이 표 25-30에 또는 비인간종으로부터의 동등한 잔기로 제공되는CD16 단편의 변이체를 사용하여 구축될 수 있다. 본원의 예시적인 단일사슬, 이중사슬 및 이중사슬 이종이량체SAR은 가출원의 표 32, 34 및 36-39에 제공된다.
CD16은 세포외 및 막관통 도메인에서 서열 상동성을 갖는 CD16a 및 CD16b의 두 가지 이소형을 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, CD16은 CD16a (FcyRIIIa) 및 CD16b (FcyRIIIb) 이소형 둘 다 및 인간 또는 비인간 종으로부터의 임의의 다른 대안적으로 접합된 변이체를 지칭한다. 그러나, CD16b 이소형은 세포질 도메인이 결여되어 있기 때문에, CD16 세포질 도메인에 관한 임의의 설명은 CD16a 이소형 및 비-인간 종으로부터의 동등한 잔기에만 관련된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD16 SAR의 구축에 사용될 수 있는 CD16 서열은 면역글로불린 Fc 영역 (예를 들어, CD16A-F158V; 서열번호 1415)에 대한 CD16의 친화도를 증가시키고 추가로 세포 표면(예를 들어, CD16A-F158V-S197P; 서열번호 1453)으로부터 이의 절단을 방지하는 돌연변이체 및 변이체를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, SAR 분자의 핵산 서열은 서열번호 1415-1417에 제시된 바와 같은 인간 CD16의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, SAR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3809-3811의 아미노산 서열의 적어도 1개, 5개 또는 10개의 변형을 갖지만 20개 이하의 변형을 갖는 CD16의 아미노산 서열 또는 서열번호 3809-3811의 아미노산 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, SAR 분자는 서열번호 3809-3811의 아미노산 서열 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 CD16의 일부 또는 전체 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 단일사슬 CD16 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 CD16 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 CD16 SAR을 제공한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 세포외 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1496-1509 및 서열번호(PRT) 3890-3903 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기 (즉, 상동체)로 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 CD16 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 CD16 SAR을 제공한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 힌지 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1545-1547 및 서열번호(PRT) 3939-3941 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기 (즉, 상동체)로 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 CD16 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 CD16 SAR을 제공한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1528-1530 및 서열번호(PRT) 3922-3924 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기 (즉, 상동체)로 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 CD16 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 CD16 SAR을 제공한다. 본 명세서의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1556-1558 및 서열번호(PRT) 3950-3952 또는 비인간 종으로부터의 등가 잔기 (즉, 상동체)로 제공된다. 본원은 또한 동일성 또는 상동성을 갖는 야생형 CD16의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 CD16의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D1 및 D2) 모두를 포함하는 CD16 세포외 도메인을 포함한다. BCMA를 표적으로 하는 예시적인 이러한 CD16 SAR은 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SpeXba-PAC (서열번호(DNA) 1638 및 서열번호(PRT) 4032)로 표시된다. scFv, FHVH, vHH 및 상이한 항원을 표적으로 하는 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 포함하는 추가의 예시적인 이러한 SAR은 서열번호(DNA) 4851-5121에 제공된다. 이러한 CD16 SAR은 또한 항체, 항체 단편 또는 이중특이성/삼중특이성 참여제의 Fc 영역에 결합하고 항체 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 보유한다. 따라서, SAR CD8SP-BCMA-FHVH-33-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 5062)를 발현하는 면역 세포(예: T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 호중구 등)는 BCMA FCVH 영역을 통해 BCMA 발현 표적 세포를 표적으로 할 수 있다. 또한, 이러한 면역 세포는 허셉틴(Herceptin)의 존재 하에서 표적 Her2 발현 표적 세포로 리디렉션될 수 있다. 대안적으로, 이러한 면역 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)는 리툭시맙(Rituxima)의 존재 하에 표적세포를 발현하는 표적화된 CD20으로 리디렉션될 수 있다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16의 제1 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D1)이 결여된 부분적인 CD16 세포외 도메인을 함유한다. 이러한 CD16 SAR은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 D1 및 D2 도메인 및 2차 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D2) 사이의 링커 영역을 포함한다. BCMA를 표적으로 하는 예시적인 이러한 CD16 SAR은 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-D2TMCPv1-F-P2A-SpeXba-PAC (서열번호(DNA) 1664 및 서열번호(PRT) 4058)로 표시된다. 이러한 CD16-SAR은 CD16의 D2 도메인만을 포함하고 D1 도메인이 없기 때문에 항체에 결합하는 능력이 부족하다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 CD16 D2 도메인을 포함한다. 이러한 CD16-SAR은 CD16의 D2 도메인만을 포함하고 D1 도메인이 없기 때문에 항체에 결합하는 능력이 부족하다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 부분적 또는 전체 CD16 힌지 도메인을 포함한다. BCMA를 표적으로 하는 예시적인 이러한 CD16 SAR은 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-Hinge-TM-CP-v1-F-P2A-SpeXba-PAC (서열번호(DNA) 1690 및 서열번호(PRT) 4084)로 나타난다. 이러한 CD16-SAR은 D1 및 D2 도메인이 모두 없기 때문에 항체에 결합하는 능력이 부족하다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16의 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, 또는 AABD)과 힌지 도메인 사이에 존재하는 이종 힌지 (spacer) 도메인을 포함한다. 예시적인 CD16 SAR 표적 CD19는 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-CD8-hinge-CD16A-Hinge-TM-CP-V158-F-P2A-PAC (서열번호(DNA) 7693 및 서열번호(PRT) 8385)로 표시된다. 이 구축물은 CD8-힌지를 통해 CD16A-힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 단편에 조작적으로 연결된 CD19 표적 hu-mROO5-1 scFv를 포함한다. 대안적인 실시형태에서, CD8 힌지 영역은 CD16A 막관통 및 세포질 도메인에 직접 연결된다. SAR이 설계에서 모듈화되므로, 상기 구축물 내의 CD19-hu-mROO5-1-scFv는 다른 항원을 표적으로 하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, AABD 등)에 의해 대체될 수 있다. 또한, CD8 힌지 도메인은 상이한 힌지 도메인으로 대체될 수 있다. CD8 힌지 대신에 CD28 힌지를 포함하는 예시적인 이러한 작제물은 CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-CD28-Ig-113-137-CD16A-v158-Hinge-TM-CP-v2-F-F2A-PAC (서열번호(DNA) 7683; 서열번호(PRT) 8375) (표 46).
한 실시형태에서, CD16 SAR은 선택적 개입 링커(예: Gly4-Ser 링커)를 사용하여D2 도메인과 CD16의 힌지 도메인 사이에 삽입하는 AABD (예를 들어, vHH, FHVH, chVH, 센티린, 아피바디 등)을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 아미노로부터 카르복시-말단까지 이러한 CD16 SAR의 상이한 도메인은 N-말단 신호 펩티드, CD16-D1 도메인, CD16-D2 도메인, 선택적 링커, AABD (예를 들어, vHH, FHVH, 센티린, 아피바디 등), 선택적 링커, CD16-힌지 도메인, CD16-막관통 도메인 및 CD16-세포질 도메인을 포함한다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 CD16 도메인 (즉, 세포외, D1, D2, 힌지, 막관통 및 세포질)은 도메인이 이의 기능적 특성 중 하나 이상을 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. CD16 도메인은 이의 야생형 서열 또는 고친화성 (예를 들어, F158V) 또는 고친화성 비-절단 가능 (예를 들어, F158V/S197P 또는 F158V/S197R) 변이체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, CD16 SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, Va, Vb, Vg, Vd, TCR-Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 단일사슬 TCR (scTCR), 단일 가변 도메인 TCR (svd-TCR), 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 (예를 들어, APRIL) 또는 수용체의 세포외 도메인 (예를 들어, PD1, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 등)을 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬 CD16 SAR의 사슬은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 CD16 SAR은 하기 화학식의 분자를 포함한다:
AABD(n)-선택적 CD16 D1 도메인-선택적 CD16 링커 도메인-선택적-CD16 D2 도메인, CD16 힌지 도메인-CD16 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-선택적 CD16 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1 이상이다. 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)은 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 대상에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
한 실시형태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 이의 단편; 수용체의 세포외 도메인 (예를 들어, NKG2D), 리간드 (예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)) 등이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD16 SAR은 하기 화학식의 분자를 포함한다:
scFv(n)-선택적 CD16 D1-선택적 CD16 링커 도메인-선택적-CD16 D2 도메인, CD16 힌지 도메인-CD16 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-선택적 CD16 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1 이상이다.
또 다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 CD16-SAR의 CD16 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등(표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966)의 공동자극 도메인을 포함한다. 종합적으로, 위의 결과는 현재 세대 CAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 CARs에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
상이한 항원을 표적으로 하는 scFv 단편과 융합된 전체 CD16A를 포함하는 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호(DNA) 4851-5039 및 서열번호(PRT) 5151-5339로 표시된다. scFv 단편 및 이의 표적 항원의 순서는 표 3에 나타낸 scFv 및 표적 항원의 순서와 동일하다. 이들 CD16 기반 SAR 구축물의 전체 명칭은 또한 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 가출원의 표 36에 제공된다. 상이한 scFv, 단일 도메인 항체, 어댑터 또는 scTCR에 부착된 CD16 전장 시퀀싱을 포함하는 추가의 SAR은 서열번호(PRT) 10043-10323에 제시되어 있다. CD16 전장 서열을 포함하고, CD19를 표적으로 하는 scFv에 부착된 vHH 단편 또는 FHVH 단편을 포함하는 예시적인 SAR은서열번호 10324-10326으로 표시된다. CD16 전장 서열을 포함하고, 어댑터 (서열번호 10331-32) 또는 scTCR (서열번호 10329-10330)을 포함하는 예시적인 SAR이 또한 제공된다.
상이한 항원을 표적으로 하는 vHH 및 FHVH 단편과의 융합에서 전체 CD16A를 포함하는 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호(DNA) 5040-5108 및 서열번호(PRT) 5340-5408로 표시된다. 이들 SAR의 명칭 및 표적 항원은 가출원의 표 37에 제공된다. 상이한 항원을 표적으로 하는 비면역글로불린 항원 결합 도메인과 융합하여 전체 CD16A를 포함하는 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호(DNA)5110-5121 및 서열번호(PRT)5410-5421로 표시된다. 이들 SAR의 명칭 및 표적 항원은 가출원의 표 38에 제공된다. 수용체, 어댑터 및 사이토카인의 세포외 항원 결합 도메인과 융합된 전체 CD16A를 포함하는 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호(DNA) 5123-5129 및 서열번호(PRT) 5423-5429로 표시된다. 이들 SAR의 명칭 및 표적 항원은 가출원의 표 39에 제공된다.
이 개시의 상이한 SAR는 모듈식으로 설계되어 있다. 따라서, CD16A-F158V-FL-v1을 암호화하는 서열 (서열번호 1415)은 상이한 신호전달 모듈 (예를 들어, 서열번호 9635-9740; 9813-9851)을 암호화하는 서열로 대체될 수 있다. 예시적인 이러한 CD16-F158V-D2TMCPv1 (서열번호 1450), CD16-F158V-Hinge-TM-CP (서열번호 1451), NKp30-ECDTMCP-opt1 (서열번호1369), NKp30-Hinge-TMCP-opt1 (서열번호 1370), NKp44-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1382), NKp44-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1383), NKp46-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1395), NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1396), NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1397), and NKp46-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1398)을 포함한다. CD16A-F158V-FL-v1 모듈 중 하나 이상이 상이한 신호전달 모듈로 대체되는 예시적인 SAR는 서열번호(PRT) 9860-10042 및 서열번호(DNA) 8768-8950으로 표시된다. 다양한 예시적인 구축물의 명칭 및 서열 ID는 또한 본원에 그 전체가 참조로 포함되는, 가출원의 표 33에 제시되어 있다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 자연 발생 수용체의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호(PRT) 9633-9668에 제공된다. 예시적인 SAR은 서열번호 9860-9895로 제시되어 있다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 자연 발생 수용체의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호(PRT) 9669-9704에 제공된다. 이들 폴리펩티드 및 CD28의 힌지 도메인에 부착된 CD19 scFv를 포함하는 예시적인 CD19 SAR은 서열번호 9896-9931에 제시되어 있다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 자연 발생 수용체의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호(PRT) 9705-9740에 제공된다. 이들 폴리펩티드 및 CD28의 힌지 도메인에 부착된 CD19 scFv를 포함하는 예시적인 CD19 SAR은 서열번호 9957-9992에 제시되어 있다. 상기 SAR 중 임의의 것에서 CD19 scFV 도메인은 새로운 SAR을 생성하기 위해 상이한 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, FHVH, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, scTCR, scv-TCR, 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드 또는 어댑터의 수용체 결합 도메인 등)으로 대체될 수 있다. 예시적인 항원 결합 도메인은 가출원의 표 3-10에 제시되어 있다. SAR은 또한 자연 발생 수용체에 부착된 2개의 이종 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, CD16 SAR은 CD16의 전체 세포외 도메인을 포함하고, 하기 화학식을 갖는다:
AABD(n)-CD16 D1-CD16 링커 도메인-CD16 D2 도메인-CD16 힌지 도메인-CD16 막관통 도메인-CD16 세포내 도메인, 여기서 n은 1 이상이고, 여기서 AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인을 포함한다.
CD16 세포외 도메인은 F158V 및 S197P 돌연변이를 보유할 수 있다. CD16의 전체 세포외 도메인을 포함하고 상이한 항원을 표적으로 하는 예시적인 CD16 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호(DNA) 4851-5129 및 8951-9244 및 서열번호5151-5429 및 10043-10336 및 가출원의 표 36-39에 제공된다. 서열번호 5151-5429, 8951-9244의 SAR 작제물의 항원 결합 도메인의 조성 및 순서는 표 3에 나타낸 서열번호 2924-3160을 갖는 scFv의 순서와 동일 하다. 서열번호 9140-9153 및 9188-9215 표적 BCMA를 갖는 구축물, 서열번호 9216-9222 표적 PSMA를 갖는 구축물, 및 서열번호 9223-9231을 갖는 구축물은 메조텔린을 표적으로 한다. 서열번호 9232 및 9234를 갖는 구축물은 CD19 및 BCMA 둘 다를 표적으로 하는 이중특이성 CD16-SAR인 반면, 서열번호 9233을 갖는 구축물은 CD20 및 CD19를 표적으로 하는 이중특이성 CD16 SAR이다. 서열번호 9237 및 9238을 갖는 구축물은 표적 항원으로서 NY-ESO-1 펩티드 (서열번호 10880) 및 MAGE-A3 펩티드 (112-120) (서열번호 10879) 펩티드를 표적으로 하는 scTCR을 포함하는 반면, 서열번호 9241을 갖는 SAR 구축물은 MAGE-A3 펩티드-270-279 (서열번호 10878)를 표적으로 하는 단일 가변 도메인 TCR (svd-TCR)을 포함한다. 서열번호 9239 및 9240를 갖는 구축물은 항원 결합 도메인으로서 Rzip 및 EZip 어댑터를 포함한다. 최종적으로 서열번호 9242-9244를 갖는 구축물은 다른 어댑터를 포함한다.
동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 T 세포는 NFAT 신호전달을 활성화하고, IL2 생산을 유도하고, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시예에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 NK 세포는 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 단핵구/대식세포는 표적 세포의 포식작용을 유도할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 과립구 (예를 들어, 호중구)는 표적 세포의 포식작용을 유도할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원은 2개의 사슬을 함유하는, CD16-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16의 일부 또는 전체 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 세포외 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1496-1509 및 서열번호(PRT) 3890-3903에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 힌지 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1545-1547 및 서열번호(PRT) 3939-3941에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1528-1530 및 서열번호(PRT) 3922-3924에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각각의 사슬은 CD16 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1556-1558 및 서열번호(PRT) 3950-3952에 제공된다.
본원은 항체의 vL 단편이 2개의 CD16 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 CD16 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-CD16 및 vH-CD16)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 세포 신호를 전달할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 CD16-SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하고, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 CD16-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 이러한 CD16-SAR을 발현하는 단핵구/대식세포는 표적 세포의 식작용을 유도할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 단핵구/대식세포는 표적 세포의 포식작용을 유도할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 동족 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 단일사슬 CD16-SAR을 발현하는 과립구 (예를 들어, 호중구)는 표적 세포의 포식작용을 유도할 수 있다.
이중사슬 CD16-SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 CD16 단편 사이에 링커를 통합함으로써 추가로 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 CD16 단편 사이에 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D1 및 D2) 둘 다를 포함하는 CD16 세포외 도메인을 포함한다. CD20 및 BCMA를 표적으로 하는 이러한 이중사슬 SAR의 예시적인 CD16은 SAR CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-Apa-BCMA917-vHH-E59D-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-PAC (서열번호(DNA) 1633 및 서열번호(PRT) 4027)로 표시된다. 이 SAR에서, CD20 vHH 도메인은 IgCL 링커를 통해 하나의 CD16 사슬에 부착되고, BCMA vHH는 IgG1-CH1 링커를 통해 두 번째 CD16 사슬에 부착된다. 이 이중사슬 CD16 SAR의 두 사슬은 중간에 P2A 절단 가능한 링커가 있는 단일 벡터에서 발현한다. 이 SAR 구축물은 또한 퓨로마이신 내성 카세트(PAC)를 발현하며, 이는 선택적이다. CD19를 표적으로 하는 또 다른 예시적인 이중사슬 CD16 SAR은 CD8SP-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-K13-opt (서열번호(DNA) 1628 및 서열번호(PRT) 4022)로 표시된다. 이 SAR에서, hu-mROO5-1 vL 도메인은 IgCL 링커를 통해 하나의 CD16 사슬에 부착되고, hu-mROO5-1 vH 도메인은 IgG1-CH1 링커를 통해 두 번째 CD16 사슬에 부착된다. hu-mROO5-1 vL 및 vH 단편은 결합하여 인간 CD19에 결합할 수 있는 Fv를 형성한다. 이 이중사슬 CD16 SAR의 두 사슬은 중간에 P2A 절단 가능한 링커가 있는 단일 벡터에서 발현된다. 이 SAR 구축물은 또한 인간 헤르페스 바이러스 8로부터의 코돈 최적화된 vFLIP K13 모듈을 포함하는 부속 모듈을 발현하며, 이는 선택적이다. 서열번호(DNA) 1629 및 서열번호(PRT) 4023으로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 K13 모듈이 전염성 연체동물바이러스로부터 MC159 모듈로 대체된다는 점을 제외하고는, 서열번호(DNA) 1628 및 서열번호(PRT) 4022로 표시되는 SAR 구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1630 및 서열번호(PRT) 4024로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 K13 모듈이 퓨로마이신 내성 유전자에 의해 대체된다는 점을 제외하고는, 서열번호(DNA) 1628 및 서열번호(PRT) 4022로 표시되는 SAR 구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1625 및 서열번호(PRT) 4020으로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 IgCL 및 IgG1-CH1 링커 도메인이 누락되고 hu-mROO5-1 vL 및 vH 단편이 2개의 CD16 사슬에 직접 부착된다는 점을 제외하고는, 서열번호(DNA) 1630 및 서열번호(PRT) 4024로 표시되는 SAR 구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1631 및 서열번호(PRT) 4025로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 인간 CD20을 표적으로 하는 vHH 도메인이 짧은 Gly4Serx2 링커(서열번호(DNA) 1024)를 통해 hu-mROO5-1 vL 영역의 아미노말단에 부착된다는 점을 제외하고는 서열번호(DNA) 1630 및 서열번호(PRT) 4024로 표시되는 SAR 구축물과 유사하다. 이 구축물은 CD19 및 CD20 모두를 표적으로 할 수 있다. 서열번호(DNA) 1632 및 서열번호(PRT) 4026으로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 인간 BCMA를 표적으로 하는 vHH 도메인이 짧은 G4Sx3linker (서열번호(DNA) 40)를 통해 hu-mROO5-1 vH 영역의 아미노 말단에 부착된다는 점을 제외하고는, 서열번호(DNA) 1631 및 서열번호(PRT) 4025로 표시되는 SAR 구축물과 유사하다. 이 구축물은 CD19, CD20 및 BCMA를 표적으로 할 수 있다. 서열번호(DNA) 1634 및 서열번호(PRT) 4028로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 IgCL 및 IgG1-CH1 링커 도메인이 각각 TCRb-ECD (TCRb-wt-opt-8ECD; 서열번호 1166) 및 TCRa-ECD (TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD; 서열번호 1168) 링커 도메인으로 대체되는 점을 제외하고 서열번호(DNA) 1630 및 서열번호(PRT) 4024로 표시되는 SAR구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1635 및 서열번호(PRT) 4029로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 IgCL 및 IgG1-CH1 링커 도메인이 각각 TCRb-ECD (TCRb-wt-opt-8ECD; 서열번호 1166) 및 TCRa-ECD (TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD; 서열번호 1168) 링커 도메인으로 대체되는 점을 제외하고 서열번호(DNA) 1631 및 서열번호(PRT) 4025로 표시되는 SAR구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1636 및 서열번호(PRT) 4030로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 IgCL 및 IgG1-CH1 링커 도메인이 각각 TCRb-ECD (TCRb-wt-opt-8ECD; 서열번호 1166) 및 TCRa-ECD (TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD; 서열번호 1168) 링커 도메인으로 대체되는 점을 제외하고 서열번호(DNA) 1632 및 서열번호(PRT) 4026로 표시되는 SAR구축물과 유사하다. 서열번호(DNA) 1637 및 서열번호(PRT) 4031로 표시되는 이중사슬 CD16 SAR은 IgCL 및 IgG1-CH1 링커 도메인이 각각 TCRb-ECD (TCRb-wt-opt-8ECD; 서열번호 1166) 및 TCRa-ECD (TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD; 서열번호 1168) 링커 도메인으로 대체되는 점을 제외하고 서열번호(DNA) 1633 및 서열번호(PRT) 4027로 표시되는 SAR구축물과 유사하다.
한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 D1 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 D2 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 각 사슬은 CD16 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D1 및 D2) 모두를 포함하는 CD16 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 또한 항체, 항체 단편 또는 이중특이성/삼중특이성 참여제의 Fc 영역에 결합하고 항체 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 보유한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 CD16 힌지 도메인을 통해 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되는 제2 면역글로불린 유사 도메인 (즉, D2)을 포함하는 부분적인 CD16 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이러한 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 CD16의 D2 도메인만을 함유하고 D1 도메인이 결여되어 있기 때문에 항체 또는 항체 단편의 Fc 부분에 결합하는 능력이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 CD16 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인에 부착되어 있는 부분적 또는 전체 CD16 힌지 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이러한 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 D1 및 D2 도메인 둘 다를 결여하기 때문에 항체 또는 항체 단편의 Fc 부분에 결합하는 능력이 결여된다.
한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 하나 이상의 사슬은, CD16의 D2 도메인과 힌지 도메인 사이에 선택적 개입 링커(예: 글리신-세린 링커)를 삽입하는 AABD (예를 들어, vHH, FHVH, chVH, 센티린, 아피바디 등)를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 아미노로부터 카르복시-말단까지의 이중사슬 CD16 SAR을 포함하는 이러한 사슬의 상이한 도메인은 N-말단 신호 펩티드, CD16-D1 도메인, CD16-D2 도메인, 선택적 링커, AABD (예를 들어, vHH, FHVH, 센티린, 아피바디 등), 선택적 링커, CD16-힌지 도메인, CD16-막관통 도메인 및 CD16-세포질 도메인을 포함한다.
상이한 CD16 도메인 (즉, 세포외, D1, D2, 힌지, 막관통 및 세포질 등)이 있는 것으로 이해되어야 한다. 이중사슬 CD16의 구축에 사용될 수 있는 SAR)은 그 도메인의 기능적 특성을 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실, 돌연변이 또는 변이체를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 하나 또는 두 사슬의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체의 세포외 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 두 사슬은 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 사슬 중 단 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 사슬 중 하나는 비-천연 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체의 세포외 도메인)을 포함하고, 제2 사슬은 CD16 세포외 도메인을 통해 항체 또는 항체 단편의 Fc 부분 또는 이중특이성/삼중특이성 결합자에 결합한다.
한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 한 사슬은 vL 도메인으로 구성된 항원 결합 도메인을 포함하고, 이중사슬 CD16 SAR의 제2 사슬은 vH 도메인으로 구성된 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 두 사슬은 동일한 부류의 항원 결합 도메인 (즉, scFv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체 등)을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각 사슬은 vHH 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 각각의 사슬은 FHVH 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 두 사슬은 상이한 부류의 항원 결합 도메인 (즉, scFv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체 등)을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이중사슬 CD16 SAR의 한 사슬은 vHH 도메인으로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 반면, 제2 사슬은 FHVH 도메인으로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함한다.
이중사슬 CD16 SAR의 2개의 사슬은 동일한 항원 (예를 들어, CD19) 또는 상이한 항원 (예를 들어, CD19 및 CD20)을 표적으로 할 수 있다. 이중사슬 CD16 SAR의 2개의 사슬은 단일 항원 (예를 들어, CD19) 또는 2개의 상이한 항원 (예를 들어, CD19 및 CD20)의 2개의 상이한 에피토프를 표적으로 할 수 있다. 이중사슬 SAR의 각 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. CD16 SAR의 이중사슬의 각각의 사슬은 어댑터 (예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 이중사슬 CD16-SAR의 CD16 사슬(들) 중 하나 또는 둘 다에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등의 (표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966) 공동자극 도메인을 포함한다. 종합적으로, 위의 결과는 CAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 SAR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 CD16A-SAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 CD16A-SAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 CD16A-SAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 CD16A-SAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. CD16-SAR을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (또한 신호 펩티드로 공지됨)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, CD16A-SAR의 각각의 작용 단위 (예를 들어, CD3z 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 접합된 항원 결합 도메인)는 유형 I 막관통 단백질로서 CD16A-SAR을 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 한 실시형태에서, CD16-SAR의 항원-결합 도메인은 세포외-대면이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열 (3-9 핵산)은 CD16A-SAR의 상이한 서브 유닛 사이, 예를 들어 신호 서열과 CD16-SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 CD16 사슬 사이에 위치한다.
본원의 상이한 SAR는 모듈식으로 설계되어 있다. 따라서, CD16A-F158V-FL-v1 (서열번호 1415) 및 CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3 (서열번호 1417)을 암호화하는 서열은 상이한 신호전달 모듈을 암호화하는 서열로 대체될 수 있다 (표 25). 예시적인 이러한 모듈은 CD16-F158V-D2TMCPv1 (서열번호 1450), CD16-F158V-Hinge-TM-CP (서열번호 1451), NKp30-ECDTMCP-opt1 (서열번호1369), NKp30-Hinge-TMCP-opt1 (서열번호 1370), NKp44-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1382), NKp44-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1383), NKp46-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1395), NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1396), NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1397), and NKp46-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1398), 41BB-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1573), CD28-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1575), OX40-ECDTMCP-opt1(서열번호 1577), 2B4-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1579), CD32-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1581) and CD64-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1583) 포함한다. CD16A-F158V-FL-v1 및 CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3 모듈 중 하나 이상이 상이한 신호전달 모듈로 대체되는 예시적인 SAR의 서열번호가 가출원의 표 33에 제시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본원은CD16의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 2개의 사슬을 함유하는, CD16-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 CD16 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본 명세서의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 세포외 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1496-1509 및 서열번호(PRT) 3890-3903에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 CD16 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 힌지 도메인 서열은 서열번호(DNA) 1545-1547 및 서열번호(PRT) 3939-3941에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 CD16 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 이중사슬 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1528-1530 및 서열번호(PRT) 3922-3924에 제공된다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 CD16 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 CD16 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 본원의 CD16-SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD16 막관통 서열은 서열번호(DNA) 1556-1558 및 서열번호(PRT) 3950-3952에 제공된다.
본원은 항체의 vL 단편이 CD16 사슬에 접합될 수 있고, vH 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, NKp30, NKp44, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있음을 제공한다. 대안적으로, 본원은 항체의 vH 단편이 CD16 사슬에 접합될 수 있고, vL 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, NKp30, NKp44, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-CD16 및 vH-CD3z)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 CD16-hererodimeric SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 때 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 CD16-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 때 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. CD16-헤테로다이머 SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 CD16 및 다른 신호 사슬(예: CD3z, FcRγ, NKp30, NKp44, NKp46 등) 사이의 링커를 통합함으로써 추가로 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 CD16 단편 사이에 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569)와 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
본원의 상이한 SAR는 모듈식으로 설계되어 있다. 따라서, CD16A-F158V-FL-v1 (서열번호 1415)을 암호화하는 서열은 가출원의 표 25에 제시된 상이한 신호전달 모듈을 암호화하는 서열로 대체될 수 있다. 예시적인 이러한 모듈은 CD16-F158V-D2TMCPv1 (서열번호 1450), CD16-F158V-Hinge-TM-CP (서열번호 1451), NKp30-ECDTMCP-opt1 (서열번호1369), NKp30-Hinge-TMCP-opt1 (서열번호 1370), NKp44-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1382), NKp44-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1383), NKp46-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1395), NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1396), NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1397), NKp46-Hinge-TM-CP-opt1 (서열번호 1398), 41BB-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1573), CD28-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1575), OX40-ECDTMCP-opt1(서열번호 1577), 2B4-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1579), CD32-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1581) and CD64-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1583)을 포함한다. CD16A-F158V-FL-v1 모듈 중 하나 이상이 상이한 신호전달 모듈로 대체되는 예시적인 SAR의 서열번호가 표 33에 제시되어 있다.
또한 본원에는 본원에서 고려되고 기술된 다른 편집 중에서도 CD16 SAR을 포함하도록 유전적으로 조작된 클론 iPSC가 제공된다. 한 실시형태에서, CD16 SAR은 고친화성 CD16 SAR 또는 고친화성 비절단 가능한 CD16 SAR (hnCD16-SAR)이다. 유전자 조작된 iPSC는 iPSC에 도입된 CD16-SAR(예: 고친화성 CD16 SAR 또는 hnCD16-SAR)을 포함하는 이펙터 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시형태에서, CD16-SAR을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, CD16-SAR을 포함하는 유래된 이펙터 세포는 T 세포이다. 한 실시형태에서, iPSC 또는 이의 유도체 세포에서 발현된 CD16-SAR (예를 들어, 고친화성 CD16SAR 또는 hnCD16-SAR)은 ADCC 항체 또는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 CD16 SAR의 CD16 또는 CD64 세포외 결합 도메인을 인식하는 이중-, 삼중-, 또는 다중특이성 결합제 또는 결합제에 결합한다. 이와 같이, 본원은 병태, 질환의 치료에 치료적 용도에 충분한 양으로 유도체 이펙터 세포 상에 발현된 CD16-SAR의 세포외 도메인과의 결합을 통해 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체를 미리 로딩된 유도체 이펙터 세포 또는 이의 세포 집단을 제공하며, 여기서 상기 CD16-SAR은 또는 FI76V 및 S197P를 갖는CD64, 또는 CD16의 세포외 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-SAR의 항원 결합 도메인은 AABD, scFv, Fv, 수용체의 세포외 도메인, 리간드, 또는 다른 비면역글로불린 항원 결합 모듈을 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-SAR은 CD16 또는 CD64의 Fc 결합 도메인의 N-말단 또는 그 근처에 부착된 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-SAR은 D16 또는 CD64의 Fc 결합 도메인의 N-말단에 부착되거나 그 근처에 부착되는 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, 예를 들어, FHVH, chVH, aVH, vHH, Darpin, centyrin, affibody 등)을 추가로 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, CD16-SAR의 천연 CD16 막관통 및/또는 세포내 도메인 (예를 들어, 고친화성 CD16 SAR 또는 hnCD16-SAR)은 키메라 Fc-SAR (CFc-SAR)이 비-천연성 막관통 도메인, 비-천연성 자극 도메인 및/또는 비-천연성 신호전달 도메인을 포함하도록 생성되도록 추가로 변형 또는 대체된다. 본원에 사용된 용어 "비천연(non-native)" 또는 "비천연의(non-natural)"은 막관통, 자극 또는 신호전달 도메인이 세포외 도메인을 제공하는 수용체 이외의 다른 수용체로부터 유래되는 것을 의미한다. 여기의 그림에서, CD16 또는 이의 변이체에 기초한 CFc-SAR은 CD16으로부터 유래된 막관통, 자극 또는 신호전달 도메인을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16 기반 CFc-SAR은 CD3D, CD3E, CD3G, CD3z, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, 0X40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL-7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DSI, MKp30, MKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, T 세포 수용체 폴리펩티드로부터 유래된 비천연 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD16 기반 CFc-SAR은 CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP 12, CTLA-4, 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비천연 자극성/억제 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 CD16 기반 CFc-SAR은 CD3z, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (4IBB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, 또는 NKG2D 폴리펩티드로부터 유래된 비천연 신호전달 도메인을 포함한다. CD16-SAR의 한 실시형태에서, 제공된 키메라 수용체는 IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, 및 NKG2D 폴리펩티드 중 하나로부터 유래된 막관통 도메인 및 신호전달 도메인 둘 다를 포함한다. CD16 기반 CFc-SAR의 한 특정 실시형태는 NKG2D의 막관통 도메인, 2B4의 자극 도메인, 및 CD3z의 신호전달 도메인을 포함하고; 상기 CD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전체 길이 또는 부분 서열로부터 유래되고, 여기서 CD16의 세포외 도메인은 F176V (또는 158V) 및 S197P (또는 S197R)를 포함한다.
CD16 기반 키메라 Fc-SAR의 또 다른 실시형태는 CD3z의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 CD16의 세포외 도메인은 CD64 또는 CD16의 세포외 도메인의 전장 또는 부분 서열로부터 유래되고, 여기서 CD16의 세포외 도메인은 FI 76V 및 S197P를 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-키메라 Fc SAR의 항원 결합 도메인은 AABD (예를 들어, FHVH, vHH 등), scFv, Fv, 리간드, 수용체의 세포외 도메인, 또는 다른 비면역글로불린 항원 결합 모듈을 포함한다. 한 실시형태에서, CD16-키메라 Fc SAR은 CD16 또는 CD64의 Fc 결합 도메인의 N 말단 또는 그 근처에 부착된 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, hnCD16-키메라 Fc SAR은 CD16 또는 CD64의 Fc 결합 도메인의 N-말단에 부착되거나 그 근처에 부착되는 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, 예를 들어, FHVH, chVH, aVH, vHH, Darpin, centyrin, affibody 등)을 추가로 포함한다.
상술한 바와 같은 CD16 기반 키메라 Fc SAR의 다양한 실시형태는 항체의 Fc영역 또는 이의 단편; 또는 이중, 삼중 또는 다중 특이성 인게이저 또는 바인더의 Fc 영역에 결합할 수 있다. 또한, CD16 기반 키메라 Fc SAR은 이의 항원 결합 도메인 (즉, AABD, scFv, Fv 등)에 의해 특정된 항원에 결합할 수 있다. 따라서, BCMA-FHVH에 기초한 항원 결합 도메인을 갖는 CD16 기반 키메라 Fc SAR은 BCMA에 결합하는 능력을 갖는 동시에 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있다. 결합 시, CD16-CFc SAR의 자극 및/또는 신호전달 도메인은 이펙터 세포의 활성화 및 사이토카인 분비를 가능하게 하고, Fc영역 뿐만이 아니라 항체 또는 이의 항원 결합 도메인(예를 들어, AABD, scFv, Fv 등) 또는종양 항원 결합 성분을 갖는 상기 이중-, 삼중- 또는 다중- 특이성 인게이저 또는 바인더에 표적화된 종양 세포의 사멸을 가능하게 한다. 이론에 의해 제한되지 않고, 키메라 Fc수용체 기반의 CD16의 비천연 막관통, 자극 및/또는 신호 도메인을 통해 또는 엑토도메인에 대한 인게이저 결합을 통해 통해 CFc-SAR은 이펙터 세포의 증식 및/또는 확장 가능성을 증가시키면서 이펙터 세포의 사멸 능력에 기여할 수 있다. 항체와 인게이저는 CFc-SAR을 발현하는 항원과 이펙터 세포를 발현하는 종양세포를 근접하게 할 수 있으며 이는 또한 종양 세포의 향상된 사멸에 기여한다. 예시적인 종양 항원에 대한 이중-, 삼중-, 다중특이성 인게이저 또는 바인더는 이에 제한되지 않으며 B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC 12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-cadherin 및 ROR1을 포함한다. 공격 종양 세포에서 CFc-SAR기반 CD16을 발현하는 이펙터 세포와 결합하기에 적합한 일부 비제한적인 예시적인 이중-, 삼중-특이성 인게이저 또는 바인더는CD16 (또는 CD64)-CD30, CD16 (또는 CD64)-BCMA, CD16 (또는 CD64)-IL15-EPCAM, 및 CD16 (또는 CD64)-IL15-CD33을 포함한다.
NK 세포 활성화 후 세포 표면에서 절단되는 일차 NK 세포에 의해 발현되는 내인성 CD16 수용체와 달리, 유도체 NK의 CD16-SAR의 절단되지 않는 버전(예: hnCD16-SAR)은 CD16 흘림을 방지하고 지속적인 발현을 유지한다. 유도체 NK 세포에서, 절단할 수 없는 CD16-SAR은 개선된 세포 기능을 나타내는 TNFa 및 CD107a의 발현을 증가시킨다. 절단할 수 없는 CD16은 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 이중-, 삼중- 또는 다중특이성 관여제의 결합을 향상시킨다. ADCC는 항체가 코팅된 표적 세포에 CD16의 결합을 통한 NK 세포 매개 용해의 메커니즘이다. 유래된 NK 세포에 도입된 hnCD16-SAR의 추가적인 높은 친화성 특성은 또한 세포 요법이 필요한 대상에게 세포를 투여하기 전에 CD16을 통해 NK 세포에 ADCC 항체의 시험관 내 로딩을 가능하게 한다. 제공된 바와 같이, hnCD16-SAR은 F176V(또는 158V) 및 S197P(또는 S197R)를 포함할 수 있다. 개시된 바와 같이, 본원은 또한 병태, 질환 또는 감염의 치료에 치료적 용도에 충분한 양으로 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체를 미리 로드하는, 유도체 NK 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원의 CD16-SAR은 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, scFv, Fv 등)에 이의 N-말단 또는 그 부근에 부착된 야생형 CD16 서열을 포함한다. 따라서, 본원의 CD16-SAR은 hnCD16 또는 야생형 CD16 코딩 영역을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 CD16-SAR은 CD16의 막관통 및 세포내 도메인 또는 이의 변이체에 프레임에 융합된 CD32 또는 CD64의 Fc 결합 영역을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 이러한 CD16 SAR에서 상이한 모듈의 순서는 NH2 내지 C-말단으로부터 다음을 포함할 수 있다:
항원 결합 도메인(n)-CD32-Fc 결합 도메인-CD16 막관통 도메인-CD16-세포내 도메인; 여기서 n = 1, 2, 3, 또는 그 이상이다.
예시적인 실시형태에서, 이러한 CD16 SAR에서 상이한 모듈의 순서는 NH2 내지 C-말단을 포함할 수 있다: 여기서 n=1, 2, 3, 또는 그 이상이다.
항원 결합 도메인(n)-CD64-Fc 결합 도메인-CD16 막관통 도메인-CD16-세포내 도메인
CD64의 세포외 도메인 및 CD16의 막관통 및 세포내 도메인에 융합된 CD20 vHH 도메인을 함유하는 예시적인 CD20-표적화된 SAR 구축물은 서열번호(DNA) 2328 및 서열번호(PRT) 4722로 표시된다. 다른 항원을 표적으로 하는 추가의 SAR 구축물은 CD20 vHH 도메인을 다른 항원을 표적으로 삼는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, FHVH, 센티린 등)으로 대체함으로써 생성할 수 있다.
1차 NK 세포와 달리, 1차 공급원(즉, 말초 혈액, 제대혈 또는 기타 공여 조직과 같은 천연/천연 공급원)의 성숙 T 세포는 CD16을 발현하지 않는다. 외인성 CD16-SAR 구축물을 발현하는 성숙 T 세포가 CD16 SAR의 세포 표면 발현을 나타내고 표적 항원 발현 세포에 노출될 때 세포 신호(예를 들어, NFAT 신호전달)를 전달할 수 있다는 것은 예상치 못한 일이었다.
또한 발현된 외인성 CD16-SAR을 포함하는 iPSC가 T 세포 발달 생물학을 손상시키지 않고 외인성 CD16-SAR을 발현할 뿐만 아니라 후천적 ADCC 메커니즘을 통해 기능을 수행할 수 있는 기능적 유도체 T 세포로 분화할 수 있다는 것도 예상치 못한 일이었다. 유도체 T 세포에서 이러한 획득된 ADCC는 이중 표적화 및/또는 CAR-T 세포 요법에서 종종 발생하는 항원 탈출을 구출하기 위한 접근법으로 추가적으로 사용될 수 있으며, 여기서 종양은 CAR-T 표적 항원 발현 또는 CAR(키메라 항원 수용체)에 의한 인식을 피하기 위해 돌연변이된 항원의 발현이 감소되거나 손실된다. 상기 유도체 T 세포가 외인성 CD16-SAR 발현을 통해 획득된 ADCC를 포함하는 경우, 그리고 항체가 SAR에 의해 표적화된 것과 다른 종양 항원을 표적으로 하는 경우, 항체는 SAR-T 항원 탈출을 구출하고 CAR-T 치료에서 종종 나타나는 표적 종양의 재발 또는 재발을 감소시키거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 이중 표적화를 달성하면서 항원 탈출을 감소 및/또는 방지하기 위한 이러한 전략은 하나 이상의 SAR을 발현하는 NK 세포에도 동일하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본원은 외인성 CD16-SAR을 포함하는 유도체 T 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, CD16-SAR은 CD16의 야생형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도체 T 세포에 포함되는 hnCD16은 F176V(158V) 및 S197R(또는 S197P)을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유도체 T 세포에 포함되는 hnCD16은 CD64로부터 유래된 전체 또는 부분 엑토도메인을 포함하거나, 비천연 막관통 도메인, 자극 도메인 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 설명된 바와 같이, 이러한 유도체 T 세포는 항체의 치료 효과를 향상시키기 위해 ADCC에 의해 명상된 단일클론 항체로 종양을 표적화하는 후천적 메카니즘을 갖는다. 개시된 바와 같이, 본원은 또한 병태, 질환 또는 감염의 치료에 치료적 용도에 충분한 양으로 하나 이상의 미리 선택된 ADCC 항체를 미리 로딩하는, 유도체 T 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
일차 NK 및 T 세포 이외에도, 본 개시내용의 CD16 SAR는 불멸화된 세포주에서 발현될 수 있다. 본원의 CD16 SAR의 발현에 적합한 예시적인 불멸화 세포주에는 NK92 및 NK92MI 세포주가 포함된다. 추가로, 본원의 CD16 SAR은 만능 조혈 줄기 세포 (예를 들어, CD34+ 줄기 세포)에서 발현될 수 있고, 이는 상이한 계통에 속하는 CD16 SAR 발현 혈액 세포를 생성하도록 분화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp30 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp30-SAR로 지정된, 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
NKp30 SAR의 구축에 사용될 수 있는 NKp30 사슬의 핵산 서열은 서열번호 1395 내지 1414에 제공된다 (가출원의 표 25). 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3789 내지 3808로 제공된다.
한 실시형태에서, 본원은 NKp30의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp30 SAR을 제공한다. 대안적인 실시형태에서, 본원은 NKp30 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp30 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp30 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp30 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp30 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp30 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp30 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp30 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, NKp30 SAR은 NKp30 힌지 도메인을 통해 NKp30 막관통 도메인 및 NKp30 세포질 도메인에 부착되는 NKp30 Ig 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, NKp30 SAR은 NKp30 막관통 도메인 및 NKp30 세포질 도메인에 부착되어 있는 NKp30 힌지 도메인을 포함한다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 NKp30 도메인 (즉, 세포외, Ig 도메인, 힌지, 막관통 및 세포질)은 도메인이 이의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실 돌연변이 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
한 실시형태에서, 상기 NKp30 SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체를 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬NKp30 SAR의 사슬은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 NKp30 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
AABD(n)-선택적 NKp30 Ig 도메인, NKp30 힌지 도메인-NKp30 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-NKp30 세포내 신호전달 도메인(여기서 n은 1개 이상). 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)는 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 표적에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
한 실시형태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디(affibody), ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, NKp30, CD16-F158V, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)) 등이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 NKp30 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
scFv(n)-NKp30 Ig 도메인-NKp30 힌지 도메인-NKp30 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-선택적 NKp30 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1개 이상이다. 특정 실시형태에서, 본원은 2개의 NKp30 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp30-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
본원은 항체의 vL 단편이 2개의 NKp30 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 NKp30 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp30 및 vH-NKp30)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T, NK 세포 또는 대식세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp30-SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 NKp30-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NK 세포 증식을 촉진하고, NK 세포 활성화를 촉진하며, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp30-SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKP30 단편 사이에 링커를 통합함으로써 더욱 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp30 단편 사이의 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 NKp30-SAR의 NKp30 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등의 공동자극 도메인을 포함한다. (표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966). 종합적으로, 위의 결과는 SAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 SAR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 NKp30-SAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 NKp30-SAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 NKp30-SAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 NKp30-SAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. NKp30-SAR을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (또한 신호 펩티드로 공지됨)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, NKp30-SAR의 각각의 작용 단위 (예를 들어, CD3z 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 접합된 항원 결합 도메인)는 유형 I 막관통 단백질로서 NKp30-SAR을 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 한 실시형태에서, NKp30-SAR의 항원 결합 도메인은 세포외를 향한다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열 (3-9 핵산)은 NKp30-SAR의 상이한 서브 유닛들 사이, 예를 들어, 신호 서열과 NKp30-SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 NKp30 사슬 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp30의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 2개의 사슬을 함유하는, NKp30-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 본원은 이중사슬 NKp30 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp30 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 NKp30 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp30 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp30 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp30 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp30 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp30 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다.
본원은 항체의 vL 단편이 NKp30 사슬에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp44, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있다는 것을 제공한다. 대안적으로, 본원은 항체의 vH 단편이 NKp30 사슬에 접합될 수 있고, vL 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp44, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp30 및 vH-CD3z)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp30-hererodimeric SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 NKp30-SAR을 발현하는 NK 세포는 상기 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp30-이종이량체SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKp30 및 다른 신호전달 사슬(예: CD3z, FcRγ, NKp30, NKp44, NKp46 등) 사이의 링커를 통합함으로써 더욱 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp30 단편 사이의 유용한 링커로서 작용한다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp44 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp44-SAR로 지정된, 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다. NKp44 SAR의 구축에 사용될 수 있는 NKp44 사슬의 핵산 서열은 서열번호 1381 내지 1394로 제공된다. 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3775 내지 3788로 제공된다.
한 실시형태에서, 본원은 NKp44의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp44 SAR을 제공한다. 대안적인 실시형태에서, 본원은 NKp44 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp44 SAR를 제공한다. 실시예에서, 본원은 NKp44 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp44 SAR을 제공한다. 실시형태에서, 본원은 NKp44 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp44 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp44 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp44 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, NKp44 SAR은 NKp44 힌지 도메인을 통해 NKp44 막관통 도메인 및 NKp44 세포질 도메인에 부착되는 NKp44 Ig 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, NKp44 SAR은 NKp44 막관통 도메인 및 NKp44 세포질 도메인에 부착되어 있는 NKp44 힌지 도메인을 포함한다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 NKp44 도메인 (즉, 세포외, Ig 도메인, 힌지, 막관통 및 세포질)은 도메인이 이의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
한 실시형태에서, 상기 NKp44 SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체를 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬 NKp44 SAR의 사슬은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 NKp44 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
AABD(n)-선택적 NKp44 Ig 도메인, NKp44 힌지 도메인-NKp44 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-NKp44 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1개 이상이다. 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)는 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 표적에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
한 실시형태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디(affibody), ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, NKp44, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)) 등이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 NKp44 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
scFv(n)-NKp44 Ig 도메인-NKp44 힌지 도메인-NKp44 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-선택적 NKp44 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1개 이상이다.
특정 실시형태에서, 본원은 2개의 NKp44 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp44-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다. 본원은 항체의 vL 단편이 2개의 NKp44 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 NKp44 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp44 및 vH-NKp44)이 동일한 세포에서 공동-발현될 때, vL 및 vH 단편은 그들의 동족 항원에 결합하고 T 또는 NK 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp44-SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T세포 증식을 촉진하고, T세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 NKp44-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NK 세포 증식을 촉진하고, NK 세포 활성화를 촉진하며, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp44-SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKP30 단편 사이에 링커를 통합함으로써 더욱 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp44 단편 사이에 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA)1168-1175 및 서열번호(PRT)3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 NKp44-SAR의 NKp44 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등의 공동자극 도메인을 포함한다. (표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966). 종합적으로, 위의 결과는 SAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 SAR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 NKp44-SAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 NKp44-SAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 분리된 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 NKp44-SAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 NKp44-SAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. NKp44-SAR을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (또한 신호 펩티드로 공지됨)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, NKp44-SAR의 각각의 작용적 단위 (예를 들어, CD3z 사슬에 결합된 항원 결합 도메인 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커)는 NKp44-SAR을 유형 I 막관통 단백질로서 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 한 실시형태에서, NKp44-SAR의 항원-결합 도메인은 세포외-대향(extracellular-facing)이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열 (3-9 핵산)은 NKp44-SAR의 상이한 서브 유닛 사이, 예를 들어, 신호 서열과 NKp44-SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 NKp44 사슬 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp44의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 2개의 사슬을 함유하는, NKp44-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 본원은 이중사슬 NKp44 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp44 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 NKp44 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp44 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp44 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp44 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp44 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 상기 사슬 중 하나는 NKp44 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다.
본원은 항체의 vL 단편이 NKp44 사슬에 접합될 수 있고, vH 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp30, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있다는 것을 제공한다. 대안적으로, 본원은 항체의 vH 단편이 NKp44 사슬에 접합될 수 있고, vL 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp30, NKp46, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp44 및 vH-CD3z)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp44-hererodimeric SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 때 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 이러한 NKp44-SAR을 발현하는 NK 세포는 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp44-헤테로다임체 SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKp44 및 다른 신호 사슬(예: CD3z, FcRγ, NKp44, NKp44, NKp46 등) 사이의 링커를 통합함으로써 추가로 증가할 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp44 단편 사이에 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp46 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp46-SAR로 지정된, 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
NKp46 SAR의 구축에 사용될 수 있는 NKp46 사슬의 핵산 서열은 서열번호 1381 내지 1394에 제공된다(표 25). 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3775 내지 3788에 제공된다 (표 25).
한 실시형태에서, 본원은 NKp46의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp46 SAR을 제공한다. 대안적인 실시형태에서, 본원은 NKp46 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 NKp46 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp46 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp46 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp46 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp46 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp46 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 NKp46 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, NKp46 SAR은 NKp46 힌지 도메인을 통해 NKp46 막관통 도메인 및 NKp46 세포질 도메인에 부착되는 NKp46 Ig 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, NKp46 SAR은 NKp46 막관통 도메인 및 NKp46 세포질 도메인에 부착되어 있는 NKp46 힌지 도메인을 포함한다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 NKp46 도메인 (즉, 세포외, Ig 도메인, 힌지, 막관통 및 세포질)은 도메인이 이의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 한 그들의 전체 서열 또는 결실 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
한 실시형태에서, 상기 NKp46 SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체를 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬 NKp46 SAR의 체인은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 NKp46 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
AABD(n)-선택적 NKp46 Ig 도메인, NKp46 힌지 도메인-NKp46 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-NKp46 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1개 이상이다. 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)는 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 표적에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
한 실시형태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, NKp44, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)) 등이다.
일부 실시형태에서, 본원의 NKp46 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
scFv(n)-NKp46 Ig 도메인-NKp46 힌지 도메인-NKp46 막관통 도메인-선택적-세포내 공동자극 도메인(n)-선택적 NKp46 세포내 신호전달 도메인, 여기서 n은 1개 이상이다.
특정 실시형태에서, 본원은 2개의 NKp46 사슬의 전체 또는 부분 서열을 함유하는, NKp46-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다. 본원은 항체의 vL 단편이 2개의 NKp46 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 NKp46 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp46 및 vH-NKp46)이 동일한 세포에서 공동-발현될 때, vL 및 vH 단편은 그들의 동족 항원에 결합하고 T 또는 NK 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp46-SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T세포 증식을 촉진하고, T세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 구체예로서, 이러한 NKp46-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NK 세포 증식을 촉진하고, NK 세포 활성화를 촉진하며, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp46-SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKP30 단편 사이에 링커를 통합함으로써 더욱 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp46 단편 사이의 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 NKp46-SAR의 NKp46 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등의 공동자극 도메인을 포함한다. (표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966). 종합적으로, 위의 결과는 SAR의 설계 한계들 중 일부를 극복하고 SAR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 NKp46-SAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 NKp46-SAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 NKp46-SAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기재된 NKp46-SAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. NKp46-SAR을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (신호 펩티드로도 알려짐)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, NKp46-SAR의 각각의 작용적 단위 (예를 들어, CD3z 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 접합된 항원 결합 도메인)는 NKp46-SAR을 유형 I 막관통 단백질로서 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 일 실시형태에서, NKp46-SAR의 항원 결합 도메인은 세포외-대향(extracellular-facing)이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열 (3-9 핵산)은 NKp46-SAR의 상이한 서브 유닛들 사이, 예를 들어, 신호 서열과 NKp46-SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 NKp46 사슬 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 본원은 NKp46의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 2개의 사슬을 함유하는, NKp46-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다.
대안적인 실시형태에서, 본원은 이중사슬NKp46 SAR을 제공하며, 여기서 상기 사슬 중 하나는 NKp46 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 이중사슬 NKp46 SAR을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp46 힌지 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp46 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp46 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 NKp46 SAR 이중사슬을 제공하며, 여기서 사슬 중 하나는 NKp46 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함한다.
본원은 항체의 vL 단편이 NKp46 사슬에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp30, NKp44, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있다는 것을 제공한다. 대안적으로, 본원은 항체의 vH 단편이 NKp46 사슬에 접합될 수 있고, vL 단편이 또 다른 신호전달 사슬, 예컨대 CD3z, FcRγ, CD16, NKp30, NKp44, TCRα 불변 사슬, TCRβ 불변 사슬, TCRγ 불변 사슬 또는 TCRδ 불변 사슬 등에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-NKp46 및 vH-CD3z)이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 NKp46-hererodimeric SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 이러한 NKp46-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 IL2 생산을 유도하거나, NK 세포 증식을 촉진하거나, NK 세포 활성화를 촉진하거나, 세포독성을 발휘할 수 있다. NKp46-헤테로다임체 SAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 NKp46 및 다른 신호 사슬(예: CD3z, FcRγ, NKp46, NKp46, NKp46 등) 사이의 링커를 통합함으로써 추가로 증가할 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 NKp46 단편 사이의 유용한 링커로서 작용한다.
본원은 또한 공동자극 수용체(서열번호 9860-9993)를 포함하는 다른 NK 수용체의 세포외, 막관통 및 세포질 도메인에 기초한 SAR을 제공한다. SAR은 형식이 모듈화되어 있기 때문에, 이들 구축물에서 CD19를 표적으로 하는 hu-mROO5-scFv는 표 3-7에 기재된 다른 항원 결합 도메인으로 전환되어 새로운 단일특이성 및 이중특이성 SAR을 생성할 수 있다.
NKG2D는 N-말단이 세포 내에 위치한 유형II 단백질이다. NKG2D의 단편에 기초한 CAR이 당업계에 기재되어 있지만, 이들은 NKG2D 세포질 및 막관통 도메인의 천연 구성이 결여되어 있다. 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, AABD, scFv)을 포함하는 폴리페타이드의 N-말단이 선택적 링커를 통해 N-말단으로부터 C-말단까지NKG2D 또는 유형 II막 단백질의 세포내, 막관통 및 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 프레임에서 융합되는 SAR을 제공한다. 이러한 구성물의 개략도는 도 12에 제공된다. 예시적인 이러한 SAR는 서열번호 7686-7687에 제공된다. 또한, ATG 시작 코돈과 어댑터(예를 들어, CD3z)의 세포질 도메인의 N-말단은 NKG2D의 N-말단에 융합되어 SAR에 활성화 도메인을 제공할 수 있다. 본원은 또한 항원 결합 도메인의 N-말단 도메인이 NKG2C, NKG2A, NKG2E 및 NKG2F 수용체의 세포외 도메인에 융합되는 SAR을 제공한다. 이러한 반응식은 항원 결합 도메인을 포함하는 유형 I 단백질을 포함하는 임의의 유형 I 단백질 및 유형II 단백질사이의 융합 단백질을 생성하는데 사용할 수 있다. 이러한 반응식은 또한 유형 II수용체의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인만을 포함하고 이의 세포외 도메인이 결여된 융합체를 생성하는데 사용될 수 있다.
마지막으로, 본원은 또한 하나의 항원 결합 도메인이 하나의 수용체 사슬의 C-말단에 부착되고, 제2 항원 결합 도메인이 제2 이단이량체 사슬의 C-말단에 부착되는 유형 II 단백질에 기초한 이종이량체 SAR을 생성하는 방법을 제공한다. NKG2E 및 CD94를 포함하는 예시적인 이러한 수용체는 서열번호 10341에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본원은 2개의 CD3z 사슬로부터 유래된 부분 또는 전체 서열을 포함하는 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼이 내인성 TCR 사슬이 결여된 면역 세포, 예컨대 NK 세포, NK92 세포주, 단핵구/대식세포 및 호중구에서 기능적으로 발현될 수 있음을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본원은 iPSC 세포, 배아 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포에서 발현될 수 있는 2개의 CD3z 사슬로부터 유래된 부분적 또는 전체 서열을 포함하는 SAR의 신규한 플랫폼을 제공하고, 이는zSAR을 발현하는 면역 세포, 예컨대 NK 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 생성하도록 분화될 수 있다. zSAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 CD3z 사슬의 핵산 서열은 서열번호 1090 및 1096에 제공된다. 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3484 및 3490에 제공된다. 본원은 항체의 vL 단편이 2개의 CD3z 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 CD3z 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-CD3z 및 vH-CD3z )이 동일한 세포에서 공동-발현되는 경우, vL 및 vH 단편은 이의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 zSAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 증가된 증식, 활성화 및 세포 독성을 발휘할 수 있다. zSAR의 발현 및 활성은 vL/vH와 CD3z 단편 사이에 링커를 통합함으로써 더욱 증가될 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 CD3z 단편 사이의 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 zSAR의 CD3z 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB 및 CD28의 공동자극 도메인을 포함한다. 41BB 및 CD28 공동자극 도메인을 함유하는 CD3z 사슬은 각각 서열번호 1100, 1102 및 1099 및 1101에 제시되어 있다. 41BB 및 CD28 공동자극 도메인을 대체할 수 있는 다른 예시적인 공동자극 도메인 (예를 들어, OX40 및 2B4)은 가출원의 표 30에 제공된다. 종합적으로, 상기 결과는 CAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 SIR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 zSAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 zSAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기술된 zSAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기술된 zSAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. zSAR을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (신호 펩티드로도 공지됨)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, zSAR의 각각의 작용 단위 (예를 들어, CD3z 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 접합된 항원 결합 도메인)는 유형 I 막관통 단백질로서 zSAR을 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 한 실시형태에서, zSAR의 항원-결합 도메인은 세포외-대향(extracellular-facing)이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열 (3-9 핵산)은 zSAR의 상이한 서브 유닛 사이, 예를 들어 신호 서열과 zSAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 CD3z 사슬 사이에 위치한다.
면역 세포를 발생시킬 수 있는 면역 세포(예: NK 세포, 단핵구/대식세포, 호중구, NK92 세포주 등) 또는 줄기 세포(예: iPSC, 조혈 줄기 세포 등)에서 발현되는 CD19를 표적으로 하는 예시적인 zSAR는CD8SP-hu-mROO5-1-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP (서열번호 2306)이다. NK 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 CD19를 표적으로 하는 추가의 예시적인 zSAR은 서열번호(DNA) 2287-2291에 제시되어 있다.
본원은 또한 TCR의 Va, b, g, d 도메인이 항원 결합 도메인으로서 사용되는 zSAR을 제공한다. 이러한 SAR은 uTCR-SAR처럼 작동한다.
zSAR 내의 하나 또는 두 개 모두의 CD3 도메인은 다른 신호전달 어댑터, 예컨대 DAP10, DAP12 또는 FcRγ 또는 이들의 단편 또는 변이체로 대체되어 이들 어댑터를 포함하는 새로운 SAR을 생성할 수 있다.
본원은 DAP10 (서열번호(DNA) 1349-1350)의 일부 또는 전체 영역을 포함하는, 단일사슬, 이중사슬 및 이중사슬 이종이량체 SAR을 제공한다. 본원의 예시적인 단일사슬, 이중사슬 및 이중사슬 이종이량체 DAP10 SAR는 가출원의 표 32 및 33에 제공된다.
한 실시형태에서, 본원은 DAP10의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 DAP10 SAR을 제공한다. 대안적인 실시형태에서, 본원은 CD16 세포외 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 DAP10 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 DAP10 막관통 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 DAP10 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 DAP10 세포질 도메인의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 DAP10 SAR을 제공한다. DAP10을 포함하는 예시적인 SAR는 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-DAP10-opt1-F-P2A-SpeXba-PAC이고, 서열번호(DNA) 2002 및 서열번호(PRT) 4396으로 표시된다.
한 실시형태에서, 본원은 활성화 도메인을 암호화하는 서열에 대한 이의 C-말단에서 프레임에 융합되는 DAP10의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 DAP10 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 활성화 도메인은 CD3z(서열번호(DNA) 1562-1564 및 서열번호(PRT) 3956-3958)의 세포질 도메인으로부터 유래된다. CD3z 활성화 도메인에 융합된 DAP10을 포함하는 예시적인 SAR는 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-DAP10-opt1-Spe-CD3zCP-opt1-F-P2A-SpeXba-PAC (서열번호(DNA) 2037 및 서열번호(PRT) 4431)이다.
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 DAP10 도메인은 도메인이 이의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실 돌연변이 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
한 실시형태에서, DAP10 SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체를 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬 CD16 SAR의 사슬은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 DAP10 SAR은 하기 화학식의 분자를 포함한다:
AABD(n)-DAP10 힌지 도메인-DAP10 막관통 도메인-DAP10-세포내 신호전달 도메인-선택적 활성화 도메인, 여기서 n은 1이상이다. 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)는 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 표적에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
한 실시형태에서, AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein) 또는 이의 단편; 수용체(예를 들어, NKp44, NKG2D), 리간드(예를 들어, APRIL, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)) 등이다.
특정 실시형태에서, 본원은 2개의 DAP10 사슬을 함유하는, DAP10-SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다. 본원은 항체의 vL 단편이 2개의 DAP10 사슬 중 하나에 접합될 수 있고, vH 단편이 다른 DAP10 사슬에 접합될 수 있음을 제공한다. 2개의 이러한 사슬 (예를 들어, vL-DAP10 및 vH-DAP10)이 동일한 세포에서 공동-발현될 때, vL 및 vH 단편은 그들의 동족 항원에 결합하고 T 세포 신호를 전달할 수 있다. 특히, 이러한 DAP10-SAR을 발현하는 T 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NFAT 신호전달을 활성화시키고, IL2 생산을 유도하며, T 세포 증식을 촉진하고, T 세포 활성화를 촉진하고, 세포독성을 발휘할 수 있다. 다른 실시형태로서, 이러한 DAP10-SAR을 발현하는 NK 세포는 동족 표적 항원을 발현하는 세포주에 노출될 경우 NK 세포 증식을 촉진하고, NK 세포 활성화를 촉진하며, 세포독성을 발휘할 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호(DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 DAP10 단편 사이에 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 표 13; 서열번호(DNA)1168-1175 및 서열번호(PRT)3562-3569), 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
다른 실시형태에서, 공동자극 도메인은 또한 DAP10-SAR의 DAP10 사슬(들)에 혼입된다. 예시적인 공동자극 도메인은 41BB, CD28, OX40 및 2B4 등의 (표 30; 서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966) 공동자극 도메인을 포함한다. 종합적으로, 위의 결과는 SAR의 설계 한계 중 일부를 극복하고 SAR에 대한 보완적인 접근 방식을 제공하는 입양 세포 치료를 위한 새로운 플랫폼을 제공한다.
본원에 기재된 DAP10-SAR의 2개의 사슬은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있으며, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. 본원에 기재된 DAP10-SAR의 2개의 사슬은 2개의 별개의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있고, 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기술된 DAP10-SAR의 2개의 사슬은 단일 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 본원에 기술된 DAP10-SAR의 2개의 사슬은 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화될 수 있다. DAP10-SAR을 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 리더 서열 (또한 신호 펩티드로 공지됨)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, DAP10-SAR의 각각의 작용 단위 (예를 들어, CD3z 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 접합된 항원 결합 도메인)는 유형 I 막관통 단백질로서 DAP10-SAR을 세포 표면으로 향하게 하는 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 한 실시형태에서, DAP10-SAR의 항원-결합 도메인은 세포외-대향(extracellular-facing)이다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 서열번호 31 내지 34 중 어느 하나의 핵산 서열 및 서열번호 2425 내지 2428의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제한 효소 부위를 포함하는 짧은 핵산 서열(3-9 핵산)은 DAP10-SAR의 상이한 서브 유닛들 사이, 예를 들어, 신호 서열과 DAP10-SAR의 항원 결합 도메인 사이 또는 항원 결합과 CD3z 사슬 사이에 위치한다.
본원의 상이한 SAR은 모듈식으로 설계되어 있다. 따라서, DAP10 모듈을 암호화하는 서열(서열번호 1349)은 서로 다른 신호전달 모듈을 암호화하는 서열로 대체될 수 있다(표 25). 예시적인 이러한 모듈에는 DAP12-ECDTMCP-opt1 (서열번호1362), DAP12-C35S-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1366), CD3z-ECDTM-opt1 (서열번호 1351), mutCD3z-ECDTM-opt1 (서열번호 1353), CD3z-ECDTM-OX40-opt1 (서열번호 1357), FcRy-C24S-ECDTMCP-opt1 (서열번호 1423), FcRy-ECDTMCP-opt1(서열번호 1419), mutCD3z-ECDTM-2B4CP-opt1 (서열번호 1426), CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt1 (서열번호 1430), mutCD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-1 (서열번호 1438)을 포함한다. DAP10 모듈 중 하나 이상이 상이한 신호전달 모듈로 대체되는 예시적인 SAR의 서열번호는 가출원의 표 33에 제시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본원은 4-1BB, CD28, OX40 및 2B4를 포함하나 이에 제한되지 않는 공동자극 수용체의 전체 또는 부분 서열을 포함하는, 공동자극 SAR로 지정된 합성 항원 수용체의 신규한 플랫폼을 제공한다. 공동자극 SAR의 구축에 사용될 수 있는 공동자극 수용체 사슬의 핵산 서열은 서열번호 1573 내지 1580에 제공된다 (표 25). 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 3967 내지 3974로 제공된다. 예시적인 공동자극 수용체의 전체 또는 부분 서열을 포함하는 예시적인 단일사슬, 이중사슬 및 이중사슬 이종이량체 SAR은 가출원의 표 41 및 42에 제공된다.
한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 4-1BB의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 4-1BB SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 CD28의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 CD28 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 OX40의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 OX40 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 2B4의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 단일사슬 2B4 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 4-1BB의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 4-1BB SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 CD28의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 CD28 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 OX40의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 OX40 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 2B4의 일부 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 2B4 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 4-1BB의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 이종이량체4-1BB SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 CD28의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 이종이량체 CD28 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 OX40의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 이종이량체 OX40 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 항원 결합 도메인에 부착된 2B4의 부분 또는 전체 영역을 포함하는 이중사슬 이종이량체 2B4 SAR을 제공한다.
이중사슬 이종이량체 SAR의 경우, 다른 사슬은 활성화 신호를 전달할 수 있는 수용체(예를 들어, CD16)를 포함할 수 있으면서, 사슬 중 하나는 공동자극 수용체(예를 들어, 4-1BB, CD28, OX40, 2B4 등)로 구성될 수 있다는 점에 유의해야 한다
SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 공동자극 수용체 도메인은 도메인이 이의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 한 이의 전체 서열 또는 결실 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
한 실시형태에서, 공동자극SAR의 항원 결합 도메인은 scFv, vL, vH, Fv, vHH, FHVH, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 리간드 또는 수용체를 포함한다. 단일사슬 SAR의 사슬은 하나의 항원 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 2, 3, 4 등)에 결합할 수 있다. 단일사슬 공동자극 수용체 SAR의 사슬은 하나 이상의 어댑터(예를 들어, RZIP, EZIP, NKG2D-YA, NKG2D-FA 등)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 공동자극성 SAR은 하기 일반식의 분자를 포함한다:
AABD(n)- 공동-자극 수용체 힌지 도메인-공동-자극 수용체 막관통 도메인-공동-자극 수용체- 세포내 신호전달 도메인-선택적 활성화 도메인, 여기서 n은 1 이상이다. 한 실시형태에서, n은 적어도 2, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5이다. AABD(자율 항원 결합 도메인)는 항원 결합 도메인을 형성하며 세포에서 발현될 때 세포외 측면에 위치한다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vH 도메인 또는 인간화 vH 도메인이다. 실시형태에서, AABD는 완전 인간 단일 VH (SVH) 도메인 또는 인간화 SVH 도메인이다. 자율 vH 도메인이라고도 하는 SVH 도메인은 vL 도메인이 없는 경우 표적에 결합할 수 있다.
한 실시형태에서, AABD는 완전 인간 vHH 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
SAR을 암호화하는 벡터는 일반적으로 SAR을 암호화할 수 있는 제한된 용량을 갖는다. 예를 들어, SAR 폴리뉴클레오티드의 크기는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터의 역가에 영향을 미친다. 따라서 크기가 작은 SAR이 바람직하다. 한 측면에서, 본원은 2개의 신호 펩티드 및 1765개 뉴클레오티드 미만, 1770개 뉴클레오티드 미만, 1780개 뉴클레오티드 미만, 1790개 뉴클레오티드 미만, 1800개 뉴클레오티드 미만, 1820개 뉴클레오티드 미만의 크기를 갖는 중재 2A 링커를 포함하는 단일특이성 이중사슬 SAR을 기술한다. 한 측면에서, 본원은 신호 서열이 없는 사슬 중 하나가 815개 뉴클레오티드, 820개 뉴클레오티드, 825개 뉴클레오티드 또는 850개 뉴클레오티드 이하이고, 신호 서열이 없는 제2 사슬이 790개 뉴클레오티드, 800개 뉴클레오티드, 810개 뉴클레오티드, 815개 뉴클레오티드, 820개 뉴클레오티드, 825개 뉴클레오티드 또는 850개 뉴클레오티드 이하인 단일특이성 이중사슬 SAR을 설명한다. 한 측면에서 SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, εTFP, γTFP, δTFP, αβTFP, γδTFP 또는 TCR의 골격을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 SIR의 중추를 갖는다. 한 측면에서 SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬을 갖는 TCR의 골격을 갖는다. 한 측면에서SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, γδTFP 또는 TCRγ 및 TCRδ 불변 사슬을 갖는 TCR의 골격을 갖는다.
본원은 또한 SIR 및 cTCR 골격에 기초한 SIR들 및 cTCR 및 SAR의 구축에 사용될 수TCRα (서열번호(DNA) 7172-7271; 서열번호(PRT) 7863-7963), TCRβ(서열번호(DNA) 7273-7398; 서열번호(PRT) 7965-8090), TCRγ(서열번호(DNA) 7400-7499; 서열번호(PRT) 8092-8191) 및 TCRδ(서열번호(DNA) 7501-7600; 서열번호 (PRT) 8193-8292) (표 45)의 불변 사슬의 신규한 결실 돌연변이체를 제공한다. TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ의 불변 사슬의 결실 돌연변이체를 사용하면 SIR/SAR 구축물의 크기를 줄이고 바이러스 벡터로의 패키징을 개선하여 바이러스 벡터 역가 및 형질도입 효율을 개선하는 데 도움이 된다. 본원에 설명된 TCRα, TCRβ(β1 또는 β2), TCRγ 및 TCRδ 사슬의 불변 사슬의 결실 돌연변이는 전장 불면 사슬로 구성된 SAR과 비교하면 다양한 발현, 결합 친화도 및 활성을 갖는 SAR을 구성하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 여기에 기술된 TCRα, TCRβ (β1 또는 β2), TCRγ 및 TCRδ 사슬의 불변 사슬의 결실 돌연변이체는 전장 불변 사슬로 구성된 SAR과 비교하여 증가된 발현, 결합 친화도, 신호전달 활성, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 갖는 SAR을 구축하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 TCRα, TCRβ (β1 또는 β2), TCRγ 및 TCRδ 사슬의 불변 사슬의 결실 돌연변이체는 전장 불변 사슬로 구성된 SAR과 비교하여 감소된 발현, 결합 친화도, 신호전달 활성, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 갖는 SAR을 구축하기 위해 사용될 수 있다. 전장 불변 사슬로 구성된 SAR과 비교하여 증가된 발현, 결합 친화도, 신호전달 활성, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 갖는 SAR 구축물은 표적 항원의 낮은 수준의 발현을 갖는 병든 세포(예를 들어, 종양 세포)를 표적화하는 데 유용할 수 있다. 전장 불변 사슬로 구성된 SAR과 비교하여 감소된 발현, 결합 친화도, 신호 활성, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 갖는 SAR 구축물은 표적 항원(들)의 높은 수준의 발현을 갖는 종양 세포를 선택적으로 표적화하는데 유용할 수 있으며, 표적 항원의 낮은 수준의 발현을 발현하는 정상 건강한 세포를 보존한다.
한 측면에서, 본원은 TCRα 불변 사슬 단편이 길이가 370, 380, 390, 400, 410 또는 421개 뉴클레오티드 미만이고, TCRβ 불변 사슬 단편이 490개 뉴클레오티드 미만, 500개 뉴클레오티드 미만, 510개 뉴클레오티드 미만, 520개 뉴클레오티드 미만, 530개 뉴클레오티드 미만 또는 540개 뉴클레오티드 미만인 이중 사슬 SAR을 설명한다. 한 측면에서 SAR은 SIR, cTCR, Ab-TCR, AABD-TCR, αβTFP, 또는 TCR의 골격을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 SIR의 중추를 갖는다. 한 측면에서, SAR은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 또는 TCRγ 및 TCRδ 불변 사슬을 갖는 SIR의 골격을 갖는다. 한 측면에서, SAR은 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 또는 TCRγ 및 TCRδ 불변 사슬을 갖는 cTCR의 골격을 갖는다. 한 측면에서, TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 단편은 그들의 사슬-쌍을 향상시키고, 내인성 TCRαβ 사슬과의 사슬 쌍을 감소시키는 돌연변이를 운반한다. 한 측면에서, TCRα 및 TCRβ 불변 사슬 단편은 두 사슬 사이에 여분의 시스테인 결합(이중 결합)을 초래하는 돌연변이를 운반한다.
한 측면에서, 본원은 서열번호 7864-7963으로 표시되는 TCRα 불변 사슬 중 어느 하나 또는 서열번호 7864-7963으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된 TCRα 불변 사슬 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 7864-7963 중 임의의 것 또는 상보적 TCRβ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRα 불변 사슬 단편을 포함하는SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 7864-7963 중 임의의 것 또는 TCR/CD3 복합체 내로 혼입하고, TCR 신호전달 모듈을 모집하고/하거나 표적 항원의 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유한 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는TCRα 불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRα 불변 사슬 결실 돌연변이 및 기능적 변이체.
한 측면에서, 본원은 서열번호 7965-8090으로 표시되는 TCRβ 불변 사슬 중 어느 하나 또는 서열번호 7965-8090으로 표시되는 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된 TCRβ 불변 사슬 결실 돌연변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 7965-8090중 임의의 것 또는 상보적인 TCRα 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRβ 불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호7965-8090 중 임의의 것 또는 TCR/CD3 복합체 내로 혼입하고, TCR 신호전달 모듈을 모집하고/하거나 표적 항원의 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRβ 불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRβ 불변 사슬 결실 돌연변이 및 기능적 변이체.
한 측면에서, 본원은 서열번호 8092-8191로 표시되는 TCRγ 불변 사슬 중 어느 하나 또는 서열번호 8092-8191로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된 TCRγ 불변 사슬 결실 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 8092-8191중 임의의 것 또는 상보적 TCRδ 불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 8092-8191중 임의의 것 또는 TCR/CD3 복합체 내로 혼입하고, TCR 신호전달 모듈을 모집하고/하거나 표적 항원의 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRγ불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRγ불변 사슬 결실 돌연변이 및 기능적 변이체.
한 측면에서, 본원은 서열번호 8193-8292로 표시되는 TCRδ 불변 사슬 중 어느 하나 또는 서열번호 8193-8292로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된 TCRδ불변 사슬 결실 변이체를 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 8193-8292중 임의의 것 또는 상보적 TCRγ불변 사슬과 쌍을 이루는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRγ 불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 측면에서, 본원은 서열번호 8193-8292중 임의의 것 또는 TCR/CD3 복합체 내로 혼입하고, TCR 신호전달 모듈을 모집하고/하거나 표적 항원의 결합 시 T 세포 신호전달을 유도하는 능력을 보유하는 그들의 결실 돌연변이체 또는 기능적 변이체를 포함하는 TCRδ불변 사슬 단편을 포함하는 SAR을 제공한다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 추가 TCRδ불변 사슬 결실 돌연변이 및 기능적 변이체.
본원에 기재된 임의의 SAR의 일부 실시형태에서, 이종성 항원-결합 도메인은 다음의 그룹으로부터 선택된다: 항체, 항체 단편 (vL, vH, Fab 등).) scFv, (scFv)2, VHH 도메인, FHVH(완전 인간 vH 도메인), 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드(예를 들어, 센티린, 아피바디, ZIP 도메인, 어댑터 등), VNAR 도메인, 리간드, TCR, TCR의 가변 도메인(Va, Vb, Vg, Vd) 및 수용체. 본원에 기재된 임의의 SAR의 일부 실시형태에서, 이종성 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다.
본원의 SAR의 항원 결합 도메인은 HLA 비의존적 TCR, 단일 도메인 TCR, 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 어댑터 또는 이의 단편일 수 있다.
한 측면에서, 본원은 합성 항원 수용체 (SAR)의 신규한 조성물을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 SAR의 신규한 구성/아키텍처들을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 SAR에 유용한 생물학적 특성(예를 들어, 발현, 결합 친화도, 이펙터 기능 등)을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 하나 또는 둘 이상의 항원에 결합할 수 있는 SAR을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본원은 항원의 하나 또는 둘 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 SAR을 제공한다.
한 측면에서, 본원은 둘 이상의 (즉, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상) 항원 결합 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체 (SAR)를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본원은 둘 이상의 항원 또는 둘 이상의 항원의 에피토프에 결합 및/또는 반응할 수 있는 SAR을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 둘 이상의 항원 또는 항원의 둘 이상의 에피토프에 결합 및/또는 반응할 수 있는 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR을 제공한다. 다른 측면에서, 본원은 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR의 구축을 위한 유용한 항원 결합 도메인을 제공한다. 다른 양상에서, 본 개시물은 이중특이성 및/또는 다중특이성 SAR에 대한 유용한 구성(즉, 상이한 도메인의 위치)을 제공한다. 이 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NKT 세포 또는 NK 세포 등)에서 발현될 때 본원의 이중특이성 및 다중특이성 SAR은 동일한 항원 또는 이들 항원의 동일한 에피토프를 표적으로 하는 둘 이상의 단일특이성 SAR과 비교하여 거의 동일한 효능 또는 더 큰 효능을 갖는 둘 이상의 항원 또는 둘 이상의 항원의 에피토프에 결합 및/또는 반응할 수 있는 능력을 부여한다.
이중특이성 또는 다중특이성 SAR에서 둘 이상의 항원 결합 도메인의 존재는 입체 장애, 비특이적 응집, 불량한 발현, 단백질 풀림 및/또는 항원 결합 간섭을 초래할 수 있다. 또한, 생성된 수용체에 의한 신호전달을 최적화하기 위해 SAR의 막관통 도메인에 대한 항원 결합 도메인(들)의 위치를 최적화해야 한다. 둘 이상의 scFv를 혼입하는 이중특이성 및 다중특이성 CAR이 당업계에 기재되어 있다. 그러나, 본원은 SAR에서 하나 초과의 scFv (즉, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 존재가 종종 입체 장애, 비특이적 응집, 긴장-신호전달, 불량한 발현, 단백질 풀림, 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인 생산, 세포독성 등)을 초래하는 항원 결합 간섭을 초래한다는 것을 확인한다. 따라서, 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 생성에 있어서의 주요 과제는 입체 장애, 비특이적 응집, 긴장 신호전달, 발현 불량, 단백질 풀림 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능을 유발할 수 있는 항원 결합 간섭(예: 사이토카인 생성, 세포 독성 등)을 줄이기 위해 이러한 SAR에 통합되어야 하는 유용한 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, Fv, Fab, vHH, FHVH, 센티린, 아피바디, 사이토카인, 수용체, svd-TCR 등)을 결정하는 것이다.
두 번째 과제는 이중특이성 및 다중특이성 SAR을 구성하는 다양한 항원 결합 도메인의 유용한 구성을 결정하는 것이다. 예를 들어, SAR(예를 들어, 힌지 도메인, 막관통 도메인 등)의 다른 성분에 대하여 및 서로에 대하여 다양한 항원 결합 도메인의 최적 순서는 비특이적 응집, 긴장 신호전달, 불량한 발현, 단백질 풀림 및/또는 불량한 신호전달 및 이펙터 기능(예: 사이토카인 생성, 세포 독성 등)을 초래하는 항원 결합 간섭을 줄이기 위해 결정되어야 한다. 이는 모든 SAR에 대한 중요한 과제이며, 특히 본원에 기술된 것과 같은 이의 항원 결합 도메인은 2개의 상이한 단편 (예를 들어, vL 및 vH, Va 및 Vb 또는 Vg 및 Vd 등)으로 구성되는 다중사슬 SAR(예를 들어, 이중사슬 CD16 SAR, 이중사슬 Dap10 SAR, 이중사슬 NKp30 SAR 등)에 대한 중대한 도전이다. 예를 들어, 2개의 별개의 CD16 사슬에 작동 가능하게 연결되지만 CD19에 결합하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL 및 vH 단편을 통해 CD19에 결합하는 이중사슬 SAR에 대한 제2 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv 또는 vHH 도메인)의 부착은 잠재적으로 vL 및 vH 단편 사이의 상호작용을 방해하여 CD19에 결합할 수 있는 기능적 Fv를 형성할 수 없게 할 수 있다.
항원 결합 도메인과 세포막 사이의 거리를 결정하는 힌지 도메인의 길이는 키메라 항원 수용체를 통한 신호전달에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 이 분야의 또 다른 과제는 다중 항원 결합 도메인의 부착이 표적 항원과 세포막 사이의 거리를 증가시켜 SAR을 통한 효과적인 면역학적 시냅스 및 신호전달의 형성에 악영향을 미칠 수 있는지 여부가 현재로서는 알려져 있지 않다는 것이다.
SAR에서 다중 항원 결합 도메인의 융합은 입체 장애 및 부적절한 접힘을 초래할 수 있다. 이 분야의 또 다른 과제는 이중특이성/다중특이성 SAR의 서로 다른 항원 결합 도메인 사이에 링커 도메인이 필요한지 여부가 현재 알려져 있지 않다는 것이다. 링커 도메인의 길이 및 성질 또한 알려져 있지 않다. 이는 이중 사슬 SAR(예: 이중 사슬 CD16 SAR, 이중 사슬 NKp30 SAR, 이중 사슬 NKp44 SAR, 이중 사슬 Dap10 SAR 등)의 경우 부적절한 링커의 추가는 잠재적으로 두 사슬 사이의 상호 작용 또는 기능적 Fv의 형성을 방해할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한 링커(들)은 표적 항원과 세포막 사이의 거리를 증가시켜 SAR을 통한 효과적인 면역학적 시냅스 및 신호전달의 형성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
한 측면에서, 본원은 상기 문제점들에 대한 해결책을 제공한다.
한 측면에서, 본원은 SA들s에 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 막관통 도메인을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 개시물은 이중특이성 및 다중특이성 SAR의 구축을 위한 유용한 항원 결합 도메인을 제공한다.
본원은 상이한 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 링커 도메인, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 활성화 도메인, 공동자극 도메인, 부속 모듈 및 치료 대조군들 등을 포함하는 몇 가지 예시적인 SAR을 제공한다. 본원의 몇몇 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호(DNA) 1600-2328, 4851-5129, 5451-6282, 7160-7170, 7601-7747, 8768-9602, 10817-10830 및 서열번호(PRT) 3994-4722, 5151-5429, 6283-7114, 7852-7862, 8293-8439, 9860-10694에 제공된다. 본원의 예시적인 SAR의 명칭 및 구성은 본원에 참조로 그 전체가 포함되어 있는 가출원의 표 32-34 및 36-42에 제공된다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 성분의 서열번호(DNA) 및 서열번호(PRT)는 서열번호(DNA) 31-1243, 1308-1572 및 8535 내지 8767 및 서열번호(PRT) 2425-3637, 3702-3966 및 9627-9859, 10832-10841, 및 12304-12311에 제공된다. 본원의 SAR의 구축에 사용될 수 있는 상이한 SAR 성분 및 보조 시약의 명칭은 본원에 참조로 그 전체가 포함되는 가출원의 표 1-31에 제공된다. 표적 항원(들), SAR의 구성 및 조성은 BLAST와 같은 프로그램을 사용하여 그들의 성분 모듈에 대한 서열 상동성 탐색을 수행함으로써 본원에서 제공된 그들의 핵산 서열 및 아미노산 서열로부터 추론될 수 있다. 대안적으로, ApE ([https://]jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)와 같은 소프트웨어는 핵산 서열이 본 개시내용에서 제공되는 상이한 SAR 구축물의 조성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, 본 개시내용의 상이한 SAR의 구성 및 구성은 당업자에 의해 그들의 명칭으로부터 추론될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원은 본원에 제공된 임의의 예시적인 SAR에 의해 표현되는 구조 및/또는 구성과 함께 신규한 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 본원에 제공된 예시적인 SAR 또는 이의 기능적 변형의 임의의 조성을 갖는 신규한 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 본원에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규한 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 선택적인 부속 모듈을 제외하고 본원에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규한 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 본원에 제공된 임의의 예시적인 SAR의 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 상동성(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 상동성)을 갖는 신규한 SAR을 그들의 항원 결합 도메인(들) 및 신호전달 사슬(들) (예를 들어, CD16 사슬)을 포함하는 영역에서 제공한다.
한 측면에서, 본원은 유리한 항원 결합 도메인을 갖는 SAR을 만들기 위한 빌딩 블록으로서 인간 VH 도메인, 일반적으로 다수의 인간 VH 도메인을 포함하는 자율적 항원 결합 도메인(AABD)의 사용에 관한 것이다.
본원은 한 측면에서 자율 항원 결합 도메인 (AABD)에 관한 것으로서, 합성 항원 수용체 및 잠재적으로 항체 치료제들의 구축을 위한 이러한 도메인의 용도 및 이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 한 실시형태에서, AABD 도메인은 향상된 안정성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, AABD 도메인은 개선된 열 안정성을 갖는다. 다른 실시형태에서, AABD 도메인은 향상된 용해도를 갖는다. 다른 실시형태에서, AABD 도메인은 자기응집에 대한 경향이 적다. 다른 실시형태에서, AABD 도메인은 N-말단 신호 펩티드를 갖는 포유동물 세포에서 발현될 때 세포외 공간에서 분비되는 능력이 향상된다.
한 측면에서, AABD는 단일 도메인 항체 또는 항체 단편이다. 한 측면에서, AABD는 가변 경사슬 (VL 또는 VL) 도메인의 부재 하에 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 중사슬 (VH 또는 vH) 도메인 (SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 다른 측면에서, AABD는 vL 도메인의 부재 하에 가용성 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 중사슬 (VH) 도메인 (또는 SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 다른 측면에서, AABD는 N-말단 분비 신호에 접합될 때 vL 도메인의 부재 하에 분비된 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 중사슬 (VH) 도메인 (또는 SVH 도메인) 또는 이의 단편이다. 본원의 특정 실시형태는 제2 도메인의 부재 하에 제1 AABD가 항원에 특이적으로 결합하는 제1 AABD를 포함하는 SAR에 관한 것이다.
한 측면에서, AABD는 가변 중사슬 (VH 또는 vH) 도메인의 부재 하에서 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 경사슬 (VL 또는 vL) 도메인 또는 SVL 도메인 또는 이의 단편이다. 다른 측면에서, AABD는 vH 도메인의 부재 하에 가용성 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 경사슬 (VL) 도메인 (또는 SVL 도메인) 또는 이의 단편이다. 또 다른 측면에서, AABD는 N-말단 분비 신호에 접합될 때 vH 도메인의 부재 하에 분비된 단백질로서 발현될 수 있는 단일 가변 경사슬 (VL) 도메인 (또는 SVL 도메인) 또는 이의 단편이다.
일부 실시형태에서, AABD는 비-scFv 기반 항원 결합 도메인, 카멜리드 vHH 도메인, 인간화 vHH 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 사이토카인 또는 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 단일 가변 도메인 T 세포 수용체 (TCR), 자가항원 또는 이의 단편이다.
한 실시형태에서, AABD는 어댑터 도메인, 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 도메인은 RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-YA, NKG2D-AF, D 도메인 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "단일 도메인 항체, 가변 단일 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (ISV)(single domain antibody, variable single domain or immunoglobulin single variable domain (ISV))"은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 표적 항원에 결합하는 항체의 단일 가변 단편을 기술한다. 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 본원의 다양한 측면의 실시형태는 상이한 항원, 예컨대 CD19, CD20, CD22, BCMA, CD38, MPL, CD123, CD33, 메조텔린, Her2, CS1/SLAMF7, CD30, GD2, GD3, FLT3, ROR1, CD79b, Lym1, CD1, CD30, GD2, GD3, FLT3, ROR1, CD79b, Lym1, CD1, CD20, CD22, BCMA, CD33, Lym2, PSCA, PSMA, ALK, CD138, CEA, FAP, TAJ, CD229, IL13Ra2, CD32b, GPC3, Muc16 및 KIR3DL2에 결합하는 단일 중사슬 가변 도메인, 항체/면역글로불린 중사슬 가면 도메인, 지정된 SVH도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 인간 중사슬 단일 가변 도메인 항체가 일반적으로 사용된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 단일 도메인 항체로 포함하거나 구성되는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 단일 인간 중사슬 가변 도메인 (SVH)이다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용의 SAR은 VL 도메인이 결여된 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시물의 SAR은 단일 도메인을 포함하거나 항체로 구성되는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 카멜리드 vHH (또는 VHH) 도메인 또는 인간화 vHH 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, VH 도메인은 인간 VH 도메인 또는 비인간 VH 도메인이다.
SVH 도메인은 12-14 kDa의 작은 분자들로, SAR의 다가 또는 다중특이성 항원 결합 도메인을 제공하기 위해 상이한 형식들로 결합될 수 있다. SVH 도메인은 견고하며 혈청에서 높은 친화력과 안정성을 특징으로 한다. SVH 도메인은 또한 혈청에서 높은 용해도와 응집의 부족을 특징으로 한다.
각각의 단일 VH 도메인 (SVH) 항체는 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 따라서, 본원의 한 실시형태에서, 도메인은 하기 화학식 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 갖는 인간 가변 중사슬 (VH) 도메인이다.
한 실시형태에서, 본원은 카바트(Kabat) 시스템에 따라 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 사용할 수 있는 단일사슬 및 다중사슬 SAR 들(예를 들어, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, Dap10 등)을 제공한다. W103R 치환을 갖는CD19를 표적으로 하는 예시적인SVH는 CD19-FHVH-354이고, 서열번호(DNA) 836 및 서열번호(PRT) 3230으로 표시된다. 다른 실시형태에서, 본원은 Kabat 시스템에 따라 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 포함하는 이중특이성, 2가 또는 이중파라토프성 항원 결합 모이어티를 갖는 다중사슬 SAR을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본원은 카바트 시스템에 따라 W103R 치환을 갖는 SVH 도메인을 포함하는 다중특이성, 다가 또는 다중파라토픽 항원 결합 잔기를 갖는 다중사슬 SAR을 제공한다. AABD는 본질적으로 모듈식이므로 AABD는 다른 항원을 표적으로 하는 다른 AABD로 대체되어 해당 항원을 표적으로 하는 SAR을 개발할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원은 카바트 시스템에 따라 W103R 치환을 갖는 SVH를 포함하는 이중특이성, 2가 또는 이중파라토프성 항원 결합 잔기를 갖는 단일사슬 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 있는 비정준 시스테인의 도입에 의해 안정화된 SVH를 사용하여 구성될 수 있는 단일사슬 및 다중사슬 SAR을 제공하고, 이는 적절한 조건 하에서 이황화 결합을 형성할 수 있고 및/또는 이황화 가교를 형성할 수 있다. 비정준 시스테인을 포함하는 예시적인 SVH는 CEA-300-aVH이고, 서열번호(DNA) 954 및 서열번호(PRT) 3348로 제공된다. 추가의 예시적인 이러한 SVH는 WO2019149715에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
한 실시형태에서, 본원은 SVH를 포함하는 단일사슬 SAR을 제공함으로써 기존의 입양 세포 요법의 단점들을 완화하는 것을 목표로 하며, 여기서 SVH 도메인은 카바트 넘버링에 따라 위치 (i) 52a 및 71 또는 (ii) 33 및 52에 치환 시스테인을 함유하고, 여기서 상기 시스테인은 적절한 조건들 하에서 디설파이드 결합을 형성할 수 있고 및/또는 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
본원의 실시형태에서, SAR을 제조하기 위해 사용되는 SVH 도메인은 카바트 넘버링에 따라 44E, 45E, 45R, (101-1)Y 및 101D로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함한다. 특히, SVH는 카바트 넘버링에 따른 치환 44E, 45E 또는 45R, (101-1)Y 및 101D를 포함한다. 한 실시형태에서, SVH 도메인은 카바트 넘버링에 따라 G44E, T45E, T45R, F(101-l)Y 및 A101D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치환을 포함한다. 한 실시형태에서, SVH 도메인은 카바트 넘버링에 따른 치환 G44E, T45E, T45R, F(101-1)Y 및 A101D를 포함한다.
본원의 실시형태에서, SAR은 카바트 넘버링에 따라 44E, 45E 및 (101-l)Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치환을 갖는 SVH를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 카바트 넘버링에 따라 치환 44E, 45E, 및 (101-1)Y를 갖는 SVH 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SVH 도메인은 SVH 도메인에 존재하는 경우, 카바트 넘버링에 따라 G44E, T45E 및 F(101-l)Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 카바트 넘버링에 따른 치환 G44E, T45E, 및 F(101-1)Y를 포함하는 SVH 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 SVH 도메인은 서열번호 21411, 21412, 21413 및 21414의 아미노산 서열에 대해 각각 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열번호 4819-4822의 아미노산 서열에 대해 적어도85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열번호 4823-4826의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
본원의 실시형태에서, SAR의 SVH 도메인은 각각 서열번호 4827-4830의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
본원의 실시형태에서, SVH 도메인은 각각 서열번호 4831-4834의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
본원의 실시형태에서, SVH 도메인은 각각 서열번호 4835-4838의 아미노산 서열에 대해 적어도85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
한 실시형태에서, SVH 도메인은 각각 서열번호 4839-4842의 아미노산 서열에 대해 적어도85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
한 실시형태에서, SVH 도메인은 각각 서열번호 4843-4846의 아미노산 서열에 대해 적어도85% 이상의 서열 동일성을 갖는 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 vH 프레임워크를 포함한다.
SVH 도메인은 서열번호 4819-4650에 따른 FR1-4가 인간에서 면역원성이 아니기 때문에 SAR의 구축에 특히 유용하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 SAR 구축물은 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 예컨대 항원 같은 관심있는 표적 단백질 인식하는 인간 SVL 도메인 (일반적으로 다수의 인간 SVL 도메인)을 포함한다. 본원에 사용된 용어 SVL 도메인은 단일 인간 VL 도메인 항체 (VL sdAb)를 지칭한다. 따라서 이러한 용어는 상호 교환적으로 사용된다. SVL이라는 용어는 독립적인 vL 도메인 또는 자율적인 vL 도메인과 같은 의미로 사용되기도 한다. SVL은 AABD의 한 유형이다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 카멜리드 vHH 도메인이다. 본원은 또한 다수의 vHH 도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 본원은 또한 인간화 vHH 도메인을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 개시된 SAR 및 그들의 표적 항원의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 vHH 도메인은 표 5에 제시되어 있다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 예컨대 DARPIN, 아필린(affilin), 아드넥틴(adnectin), 아피틴(affitin), 오바디(obodies), 리페바디(repebody), 피노머(fynomer), 알파바디(alphabody), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 센티린(centyrin), 프로넥틴(pronectin), 안티칼린(anticalin), 쿠니츠 도메인(kunitz domain), 아르마딜로 반복 단백질(Armadillo repeat protein), D 도메인 또는 이의 단편이다. 본원은 또한 다중 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드를 포함하는 SAR에 관한 것이다. 개시된 SAR 및 그들의 표적 항원의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 표 7-9에 제시되어 있다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 어댑터 결합 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, NKG2D-AF, NKG2D-YA, 또는 D 도메인 등)이다. 본원에는 다수의 어댑터에 결합되는 SAR도 포함된다. 한 실시형태에서, 어댑터 결합 도메인은 류신 지퍼 도메인이다(leucine zipper domain). 한 측면에서, SAR의 AABD는 어댑터 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인, 스트렙태그(Streptag), FITC, 비오틴(Biotin), ULBP2R, ULBP2-S3 등)에 결합한다. 당업자는 어댑터 및 어댑터 결합 단백질이 서로 치환될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, SAR은 EZIP 모듈을 포함하는 SAR 어댑터에 결합하는 RZIP 모듈을 포함할 수 있다. 대안적으로, SAR은 EZIP 모듈을 포함할 수 있는 반면, SAR 어댑터는 RZIP 모듈을 포함할 수 있다. 본원에는 다수의 어댑터에 결합되는SAR도 포함된다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 수용체 또는 리간드의 세포외 도메인 또는 이의 단편이다. 본원은 또한 수용체의 다수의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 리간드 또는 사이토카인의 세포외 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 본원은 또한 리간드 또는 사이토카인의 다수의 세포외 수용체 결합 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 자가항원이다. 본원에는 다수의 자가항원을 포함하는 SAR도 포함된다. SAR의 구축에 사용될 수 있는 예시적인 자가항원은 Dsg3 또는 이의 단편이다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 T 세포 수용체 (svd-TCR)의 단일 가변 도메인이다. 본원은 또한 T 세포 수용체의 다수의 단일 가변 도메인을 포함하는 SAR을 포함한다. svd-TCR 도메인을 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 PCT/US2021/022641의 서열번호(DNA) 21563-21564 및 WO2021030182에 제공되며, 이는 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 세포 표면 상에서 발현된 항원에 결합할 수 있는 임의의 단일 도메인 단백질이다.
SAR의 다중 AABD는 상이한 조합(예: 2개의 센티린, 1개의 센티린 및 1개의 vHH 도메인, vHH 도메인 및 SVH 도메인 및 1개의 센티린 등)으로 존재할 수 있다.
한 측면에서, SAR의 AABD는 센티린(Centyrin)이다. 본원은 또한 다수의 센티린들을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 한 측면에서, SAR의 AABD는 DARPINS이다. 본원은 또한 다수의 DARPIN들을 포함하는 SAR에 관한 것이다. 유사하게, 본원은 다수의 비면역글로불린 항원 결합 도메인, 예컨대 아피바디, 아필린, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리페바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질을 함유하는 SAR에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, SAR은 다수의 AABD들을 함유한다. 한 실시형태에서, 제1 AABD는 제2 AABD에 연결되고, 여기서 제1 및 제2 AABD는 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, SAR에 의해 인식되는 항원은 MHC 복합체에 결합하는 펩티드 항원이다. 일부 실시형태에서, SAR의 2개 이상의 AABD는 동일한 항원을 인식한다. 다른 실시형태에서, SAR의 2개 이상의 AABD는 상이한 항원을 인식한다.
2세대 CARs과 같은 SAR에 일반적으로 사용되는 scFv는 원치 않는 응집, 클러스터 형성 및 면역원성의 가능성이 있는 반면, AABD(자율 항원 결합 도메인)의 사용은 면역원성, 비특이적 응집 또는 풀림에 대한 가능성이 상당히 감소된 안정적인 형식을 제공한다. 이는 이중특이성, 2가 또는 이중파라토프성 항원 결합 모이어티를 갖는 SAR을 설계할 때 특히 유용하다. 본원의 발명자들에 의해 입증된 바와 같이, 다수의 AABD 도메인은 이러한 다량체 포맷으로 용이하게 사용될 수 있으며, 따라서 둘 이상의 표적 항원 또는 둘 이상의 항원의 에피토프의 동시 표적화를 가능하게 하는 다중특이성 SAR의 생성을 용이하게 한다.
한 실시형태에서, 본원은 하나 또는 둘 이상의 항원 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 항원)을 표적화할 수 있는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 또는 둘 이상의 에피토프 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 에피토프)를 표적으로 할 수 있는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 하나 또는 둘 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 항원 결합 도메인)을 포함하는 SAR을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원은 각각의 사슬이 막관통 도메인, 선택적 활성화 도메인 및 선택적 공동자극 도메인에 작동작으로 연결된 0 또는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 각각의 사슬을 가지는 하나 이상의 사슬을 포함하는 SAR을 제공한다. 한 실시형태에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 암호화한다.
한 실시형태에서, 본원은 (a) 하나 이상의 항원-특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 막관통 도메인, (d) 선택적 공동-자극 도메인 및 (e) 선택적인 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 합성 항원 수용체를 제공하고, 여기서 하나의 항원-특이적 표적화 영역은 항원-특이적 단일사슬 Fv (scFv) 단편, 및 AABD를 포함하는 제2 항원 특이적 표적화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈 (예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, Centyrin, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등이다.
한 실시형태에서, 본원은 (a) 적어도 2개의 항원-특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 막관통 도메인, (d) 선택적인 공동-자극 도메인 및 (e) 선택적인 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 합성 항원 수용체를 제공하고, 여기서 하나의 항원-특이적 표적화 영역은 항원-특이적 단일사슬 Fv (scFv) 단편 및 AABD를 포함하는 제2 항원 특이적 표적화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈 (예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, Centyrin, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등)이다. CD38 및 BCMA를 표적으로 하는 2개의 AABD를 포함하는 예시적인 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD38-717-vHH-Ecoil-BCMA-346-vHH-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호(DNA) 5100; 서열번호(PRT) 5400)이다. 한 실시형태에서, 본원은 하기 화학식 (AABD)n-선택적 링커 도메인-scFv-힌지 도메인-막관통 도메인-선택적 하나 이상의 공동자극 도메인-활성화 도메인; 여기서 n=0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상이고, 여기서 활성화 도메인은 하나 이상의 ITAM 모티프를 함유할 수 있다. 예시적인 이러한 SAR은 IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-scFv-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3 (서열번호(DNA) 7160 및 서열번호(PRT) 7853)에 의해 표시된다. 이 SAR은 CD19를 표적으로 하는 인간화 hu-mROO5-1 scFv로 표시되는 하나의 항원 결합 도메인과 CD20을 표적으로 하는 CD20-vHH-2HCD26으로 표시되는 제2 항원 결합 도메인을 갖는다. 2개의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser(G4Sx3v2) 가요성 링커를 통해 연결된다. 이러한 SAR 구축물은 또한 CD16 세포외 도메인 (CD16 D1 및 D2 도메인 포함), CD16 힌지 및 막관통 도메인 및 CD16 세포질 도메인을 포함한다. 다른 예시적인 이중특이성 SAR은 서열번호 7161-7170으로 표시된다.
다른 예시적인 이중특이성 SAR은 IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-scFv-CD28-Hinge-CD16-F158V-S197P-Hinge-TM-CP-v3 (서열번호 7164)로 표시된다. 이러한 구축물은 CD16 D1 및 D2 도메인이 결여되고 CD28 힌지 도메인을 포함한다는 점을 제외하고는, 상기 기재된 서열번호 7160을 갖는 구축물과 유사하다.
한 실시형태에서, 본원은 각각의 사슬이 막관통 도메인에 작동 가능하게 연결된 0, 1, 2 또는 그 이상의 항원 결합 도메인을 포함하지만 활성화 도메인이 결여된 사슬을 가지는 하나 이상의 사슬을 포함하는 SAR을 제공하며, 이러한 SAR은 활성화 도메인을 암호화하는 단백질(들)을 포함하는 신호전달 모듈의 모집에 의해 신호전달이 가능하다. 이러한 SAR에 의해 모집될 수 있는 신호전달 단백질의 예에는 CD3z, DAP10 또는 DAP12가 포함된다. 예시적인 이러한 SAR은 CD16 SAR, NKp30 SAR, NKp44 SAR 또는 NKp46 SAR의 골격에 기초한다. 예시적인 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 AABD가 이중 사슬 SAR의 하나 또는 양쪽 사슬의 N-말단에 부착되거나 N-말단 근처에 부착되는 SAR을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 본원은 SAR의 하나 또는 양쪽 사슬을 포함하는 vL 또는 vH 단편의 N-말단 또는 N-말단 근처에 하나 이상의 AABD가 부착되는 SAR을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 본원은 하나 이상의 AABD가 TCR의 하나 또는 양쪽 사슬을 포함하는 Va, Vb, Vg 또는 Vd 단편의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 SAR을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 모듈 (예를 들어, SVH, vHH, FHVH, SVL, svd-TCR, Centyrin, DARPIN, CD16A, CD64, CD32, NKG2D, NKG2D-AF, NKG2D-YA, RZIP, EZIP, E4, K4, D 도메인 등이다.
한 실시형태에서, 본원은 상기 일반식: (AABD)n-선택적 링커 도메인-scFv-선택적 링커-TCR 불변 사슬을 갖는 제1 사슬; 및 (AABD)n-선택적 링커 도메인-CD16/NKp30/NKp44/Nkp46 불변 사슬을 갖는 제2 사슬을 포함하는 갖는 하나의 사슬을 포함하는 1 및 반사슬 SAR 또는 이중 사슬 SAR을 제공하며, 여기서 n=0, 1, 2, 3, 4, 5 이상이다. CD16/NKp30/NKp44/Nkp46 불변 사슬은 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 등)에 신호를 직접 전달할 수 있거나 면역 세포에 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 신호 단백질을 모집할 수 있는 전장 CD16/NKp30/NKp44/Nkp46 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 돌연변이 또는 변이체를 포함한다. 전달된 신호는 세포 증식, 활성화, 사이토카인 분비 및/또는 세포독성을 자극하는 신호를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원은 2개의 사슬을 포함하는 이중사슬 이중특이성 합성 항원 수용체를 제공하며, 각각의 사슬은 (a) 하나 이상의 이종 항원-특이적 표적화 영역, (b) 적어도 하나의 세포외 링커 도메인, (c) 적어도 하나의 막관통 도메인, (d) 선택적인 공동자극 도메인 및 (e) 선택적인 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 하나의 항원-특이적 표적화 영역은 단편 변수 (Fv)를 생성하기 위해 제2 사슬 상에 존재하는 vH 및/또는 vL 단편을 결합할 수 있는 vL 및/또는 vH 단편, 및 AABD (예를 들어, vHH, SVH, 센티린, 아피바디 등)를 포함하는 제2 항원 특이적 표적화 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, Fv는 항원에 결합한다. 다른 실시형태에서, Fv는 항원에 결합하지 않는다. 한 실시형태에서, Fv는 AABD를 포함하는 제2 항원 특이적 표적화 도메인의 부착을 위한 스캐폴드로서 기능한다. 한 실시형태에서, AABD는 비-scFv 항원 결합 도메인이다.
2개의 사슬을 포함하는 예시적인 이중사슬 이중특이성 SAR은 CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-Kpn-G4S-EcoR1-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-NKp30-ECDTMCP-opt1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC이고, 서열번호(DNA) 1605 및 서열번호(PRT) 3999로 표시된다. SAR 구축물의 한 사슬은 IgCL 링커를 통해 NKp30 세포외, 막관통 및 세포질 도메인에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vL 단편을 포함하고, SAR의 다른 사슬은 IgG1-CH1 링커를 통해 NKp30 세포외, 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 제2 사슬에 융합된 인간화 hu-mROO5-1 vH 단편을 포함한다. SAR의 hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 함께 CD19를 표적으로 하는 Fv를 형성한다. CD20(CD20-USC1-vHH-2HCD26; 서열번호 841)을 표적으로 하는 vHH 단편은 Glycine-Serine 링커를 통해 hu-mROO5-1 vH 단편의 N 말단에 융합된다. 따라서 SAR은 hu-mROO5-1 Fv를 통해 CD19를 표적으로 하고 CD20-USC1-vHH-2HCD26을 통해 CD20을 표적으로 한다. SAR은 형식이 모듈식이라는 점에 유의해야 한다. 따라서 SAR의 한 모듈을 다른 모듈로 교체할 수 있다. 예를 들어, hu-mROO5-1 vL 및 hu-mROO5-1 vH 단편은 상이한 항원을 표적으로 하는 vL/vH 단편으로 대체될 수 있다. 유사하게, CD20-USC1-vHH-2HCD26 모듈은 상이한 항원을 표적으로 하는 또 다른 AABD로 대체될 수 있다. IgCL 및 IgG1-CH1 링커는 서열번호 1142-1175 (표 13)에 제공된 다른 적합한 Ig 유사 링커로 대체될 수 있다. 마지막으로, NKp30 단편 중 하나 또는 둘 다 NKp44, NKp46, CD16, CD3z 또는 DAP10으로부터 유래된 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다로 대체될 수 있다.
NKp30 ECDTMCP 사슬 중 하나가 CD16-F158V-S197P-FL-TMCP 사슬로 대체되는 예시적인 구축물은 CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-Kpn-G4S-EcoR1-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-NKp30-ECDTMCP-opt1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-PAC (서열번호(DNA) 1618 서열번호(PRT) 4012)로 표현된다. 다른 예시적인 단일특이성, 이중특이성 및 삼중특이성 SAR 구축물은 가출원의 표 32에 제공된다.
예시적인 CD19, CD20 및 BCMA를 표적으로 하는 삼중특이성 이중사슬 구축물은 서열번호 (DNA) 1714 및 서열번호(PRT) 4108로 표시된다. CD19, CD20 및 BCMA를 표적으로 하는 또 다른 예시적인 삼중특이성 이중사슬 구축물은 서열번호(DNA) 1619 및 서열번호(PRT) 4013으로 표시된다.
일부 실시형태에서, 본원의SAR은 하나의, 일반적으로 둘 이상의 vH (VH)도메인, 즉, 하나 이상의 vH 단일 도메인 항체를 포함하고, 경사슬이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, SAR적어도 2개의 vH 단일 도메인 (SVH) 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 하나의, 일반적으로 둘 이상의 VHH도메인, 즉, 하나 이상의 VHH 단일 도메인 항체를 포함하고, 경사슬이 결여되어 있다. 실시형태에서, SAR적어도 2개의 VHH 단일 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 하나의, 일반적으로 둘 이상의 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 즉 DARPIN, 아피바디, ZIP 도메인 (예를 들어, RZIP, EZIP, E4, R4 등), 아필린, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리페바디, 피노머, 알파바디, 에이비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질 또는 그 단편으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 2개의 AABD를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 Fv(즉, Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편) 및 적어도 하나의 AABD를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 하나 이상의 항원을 표적으로 하는 적어도 2개의 AABD (예를 들어, 2개의 SVH 도메인 또는 2개의 VHH 도메인 또는 1개의 SVH 및 1개의 VHH 도메인 등)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원의 SAR은 하나 이상의 항원을 표적으로 하는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 대해 특이적인 2개 또는 적어도 2개의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하고, 따라서 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 대해 특이적이지만 상기 항원의 다른 에피토프에 결합하는 2개 또는 적어도 2개AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 즉, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)및 제2 에피토프에 결합하는 제2 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)을 포함한다. 에피토프를 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프성이고, 본원의 범위는 이중파라토프성SAR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 동일한 항원에 대해 특이적이며 상기 항원의 동일한 에피토프에 결합하는2개의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 항원 결합 도메인은 Fv (예를 들어, 상이한 신호전달 사슬에 부착되어 있고 단일 사슬 단편 가변 포맷 또는 scFv 포맷으로 존재하지 않는 vL단편 및 vH단편) 및 Fv에 결합된 것과 동일한 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하고, 따라서 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 Fv 및 Fv와 동일한 항원에 대해 특이적이지만 상기 항원의 다른 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 즉, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 Fv및 제2 에피토프에 결합하는 제2 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 에피토프는 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프성이고, 본원의 범위는 이중파라토프성SAR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 Fv 및 동일한 항원에 대해 특이적이며 상기 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 Fv 및 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하고, 여기서, Fv 단편은 유의한 친화도를 갖는 임의의 특정 항원에 결합하지 않거나, 또는 유의하지 않은 친화력으로 결합하고, 단지 하나 이상의 AABD의 부착을 위한 스캐폴드로서 기능한다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 항원 결합 도메인은 TCR-Fv (예를 들어, 상이한 신호전달 사슬에 부착되어 있고 단일 사슬 TCR 포맷 또는 scTCR 포맷으로 존재하지 않는 Vα/Vβ 단편 또는 Vγ/Vδ 단편) 및 TCR-Fv에 의해 결합된 것과 동일한 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하며, 따라서 2가 결합 분자를 제공한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 TCR-Fv (예를 들어, Va/Vb 또는 Vg/Vd) 및 TCR-Fv와 동일한 항원에 대해 특이적이지만 상기 항원의 다른 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 즉, 항원 결합 도메인은 제1 에피토프에 결합하는 TCR-Fv 및 제1 에피토프에 결합하는 제2 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 에피토프는 중첩될 수 있다. 따라서, 항원 결합 도메인은 이중파라토프성이고, 본원의 범위는 이중파라토프성SAR을 포함한다. 또 다른 한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 TCR-Fv 및 동일한 항원에 대해 특이적이며 상기 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함한다. 또 다른 한 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 TCR-Fv 및 적어도 하나의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하고, 여기서 TCR-Fv 단편은 유의한 친화도를 갖는 임의의 특정 항원에 결합하지 않거나 또는 유의하지 않은 친화력으로 결합하고, 단지 하나 이상의 AABD의 부착을 위한 스캐폴드로서 기능한다.
다른 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 2개의 상이한 항원에 대해 특이적인 2개의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)를 포함하고, 따라서 이중특이성 항원 결합 도메인을 제공한다. 즉, 항원 결합 도메인은 제1표적에 결합하는 제1 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등) 및 제2표적에 결합하는 제2 AABD(예: SVH, VHH, 센티린 등)을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본원은 이중특이성 SAR에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "이중특이성 SAR(bispecific SAR)" 또는 "이중특이성 항원 결합 도메인(bispecific antigen binding domain)"은 따라서 제1 표적 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 본원에 기재된 결합 분자를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 항원 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 제2 폴리펩티드 도메인을 지칭하며, 즉, 이중특이성 결합 분자는 2개의 표적들에 대한 특이성을 갖는다. 제1 표적 및 제2 표적은 동일하지 않다, 즉, 상이한 표적들이다, 예를 들어, 단백질; 둘 다 세포표면에 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 이중특이성 결합 분자는 제1 표적 및 제2 표적을 발현하는(또는 이의 세포 표면 상에 표시하는) 세포에 선택적으로 그리고 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 결합 분자는 다중특이성 결합 분자를 제공하는 3개 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 다중특이성 항원-결합 도메인은 추가로 제1 표적을 이외에 하나 이상의 추가 표적에 결합할 수 있고, 즉, 다중특이성 폴리펩티드는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그 이상의 표적에 결합할 수 있고, 여기서 다중특이성 폴리펩티드 작용제는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그 이상의 표적 결합 부위를 각각 가진다.
따라서, 3개 이상의 AABD(예: SVH, VHH, Centyrin 등)을 포함하는 항원 결합 도메인도 개시의 범위 내에 있다.
한 측면에서, 본원은 2개 이상의 항원을 표적화하기 위한 본원의SAR의 최적 구성을 기술한다. 한 측면에서, 본원은 하나 이상의 항원의 2개 이상의 에피토프를 표적화하기 위한 본원의 SAR의 최적 구성을 설명한다.
본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 내인성 TCRα, TCRβ, TCR 및/또는 TCRδ 유전자들의 발현이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 감소 또는 제거된 T 세포에서 발현될 수 있다. 내인성 기능적 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 이러한 T 세포는 동종 세포 치료의 목적으로 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 본원에 참조로 그 전체가 포함되는, PCT/US2018/053247에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 T 세포 내의 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 유전자좌를 표적화 할 수 있다. SAR의 삽입에 의해 내인성 TRAC, TRBC, TRGC 및/또는 TRDC 유전자좌가 파괴되는 이러한 T 세포는 동종 세포 치료의 목적으로 사용될 수 있다.
본원은 또한 동종이계 SAR-T 세포를 생성할 목적으로 TRAC 및/또는 TRBC 유전자좌에 이중특이성 및 다중특이성SAR을 표적화하기 위한 조성물들 및 방법들을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 호중구 등에서 발현되는 하나 이상의 유전자를 암호화하는 내인성 유전자좌를 표적으로 할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 NK 세포에서 발현되는 하나 이상의 유전자들을 암호화하는 내인성 유전자좌를 표적화 할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DS4, DAP10, DAP12, FcRγ, CD3z, NKG2D, NKG2A 및 DNAM1의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자들을 암호화하는 내인성 유전자좌를 표적으로 할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DS4, DAP10, DAP12, FcRγ, CD3z, NKG2D, NKG2C 및 DNAM1 유전자들 중 하나 이상을 암호화하는 내인성 유전자좌를 표적으로 하여, SAR의 항원 결합 도메인(들)이 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, DAP12, FcRγ, CD3z, NKG2D, NKG2C 및 DNAM1 유전자들의 부분적 또는 전체 세포외 도메인, 힌지 도메인 및/또는 막관통 도메인과 함께 프레임에서 발현되도록 한다.
한 실시형태에서, 본원의 단일사슬 및 이중사슬 SAR은 CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DS4, DAP10, DAP12, FcRγ, CD3z, 및 DNAM1유전자들 중 하나 이상을 암호화하는 내인성 유전자좌를 표적으로 하여, SAR의 항원 결합 도메인(들)이 CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DS4, DAP10, DAP12, FcRγ, CD3z 및 DNAM1 유전자들을 암호화하는 신호 펩티드와 함께 하류 및 프레임내 삽입되도록 한다.
게놈 조작된 iPSC의 유도 분화에 의해 T 및 NK 세포를 포함하는 면역 세포를 생성하는 방법은 WO2020117526, WO2020210398, WO2019126748, WO2019112899, WO2019018603 및 US10370452를 비롯한 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 측면에서, SAR의 신규 항원 결합 도메인은 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 항원에 결합한다. 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 예시적인 항원은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CS1, CD33, MPL, CD138, CD38 및 CD123이다. 한 측면에서, SAR의 신규 항원 결합 도메인은 비조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 항원에 결합한다. 비조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 예시적인 항원은 메조텔린 (MSLN), Her2, EGFR, PSMA, PSCA, GPC3 등이다. 한 측면에서, SAR은 2개 이상의 신규한 항원 결합 도메인을 발현하며, 여기서 신규 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 조혈 계통 세포 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 항원에 결합하고, 신규 항원 도메인 중 적어도 하나는 비-조혈 계통 세포 상에서 발현된 항원에 결합한다.
본원은 SAR의 2개 이상의 AABD (예를 들어, SVH, VHH, 센티린 등)이 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 또한 Fv 또는 TCR-Fv와 AABD를 포함하는 vL 및/또는 vH 도메인 사이에 존재할 수 있다. 링커를 포함하는 적합한 링커는 예를 들어 GS 잔기들, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n=1 내지 10, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 예시적인 링커는 서열번호 (DNA) 1024-1028 및 서열번호(PRT) 3418-3422로 제공된다.
링커는 또한 SAR의 Fv 또는 TCR-Fv를 포함하는 vL 및 vH 도메인과 vL 및 vH 도메인이 부착된 TCR 불변 사슬 연결 펩타이드 사이에 존재할 수 있다. 특히, 항체로부터 유래된 IgCL (서열번호 (DNA) 1142 및 서열번호(PRT) 3536) 및 IgCH 도메인 (서열번호(DNA) 1143-1157 및 서열번호(PRT) 3537-3551)은 vL/vH 및 신호전달 사슬 사이에서 유용한 링커로서 작용한다. 추가의 Ig 유사 도메인은 당업계에 공지되어 있으며 (예를 들어, 서열번호 (DNA) 1168-1175 및 서열번호(PRT) 3562-3569) 본원의 대안적인 실시형태에서 유용한 링커로서 기능할 수 있다.
일부 실시형태에서, SAR의 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 AABD는 개입하는 vL/vH 단편 없이 신호전달 사슬에 부착된다. 이러한 구축물에서, 링커는 또한 SAR의 AABD와 AABD가 부착된 신호전달 사슬 사이에 존재할 수 있다. 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 AABD 중 하나는 링커 IgCL (서열번호 1142)에 부착되고, 다른 AABD는 링커 IgG1-CH1 (서열번호 1143)에 부착된다. 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 AABD 중 하나는 링커 IgCL (서열번호 1142)에 부착되고, 다른 AABD는 링커 IgG4-CHI1 (서열번호 1152)에 부착된다. 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 AABD 중 하나는 링커 TCRa-wt-opt-6ECD (서열번호 1158)에 부착되고, 다른 AABD는 링커 TCRb-wt-opt-6ECD (서열번호 1160)에 부착된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 공동으로 특정 항원에 결합하는 단편 변수 (Fv)를 구성하기 위해 2개의 신호전달 사슬 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD16A, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, DAP12 등, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체)의 NH2-말단 또는 근처에 별도로 부착되는 항체의 vL 및 vH 도메인으로부터 유래되거나 포함한다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 공동으로 MHC 분자와 회합하여 특정 펩티드 항원에 결합하는 단편 변수-TCR (TCR-Fv)을 구성하기 위해2개의 신호전달 사슬(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD16A, NKp30, NKp44, NKp46, CD3z, DAP10, DAP12 등, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체)의 NH2-말단 또는 NH2-말단 근처에 개별적으로 부착되는 TCR의 Vα 및 Vβ 도메인으로부터 유래되거나 포함한다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 공동으로 구성하여 특정 펩타이드 항원/MHC 또는 지질 항원에 결합하는 단편 변수-TCR(TCR-Fv)을 구성하기 위해 2개의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은CD16A, NKp30, NKp44, NKp46, CD3z, DAP10, DAP12 등, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체)의 NH2-말단 또는 NH2-말단 근처에 개별적으로 부착되는 TCR의 Vγ 및 Vδ 도메인으로부터 유래되거나 포함한다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드는 단일사슬 가변 단편 (scFv)으로서 발현되고, 신호전달 사슬도메인 (예를 들어, 또는 본원에 기재된 바와 같은CD16A, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, DAP12 등, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 )의 NH2-말단 또는 NH2-말단 근처에 작동적으로 연결된 항원 결합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 폴리펩티드 사슬의 AABD는 구조가 유사하다 (예를 들어, 둘 다 AABD는 SVH 또는 카멜리드 VHH 도메인 또는 아피바디 또는 센티린이다). 한 실시형태에서, 이중사슬 SAR의 2개의 폴리펩티드 사슬의 AABD는 구조가 유사하지 않다 (예를 들어, 제1 항원 결합 도메인은 SVH이고, 제2 항원 결합 도메인은 카멜리드 VHH이다).
일부 실시형태에서, 암호화된SAR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 상응하는 야생형 서열 또는 비야생형 서열 항체, 단일 도메인 항체 (SDAB), VH 도메인, VL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 또는 비-면역글로불린 스캐폴드, 예컨대 DARPINs, affibodies, affilins, adnectins, affitins, obodies, repebodies, fynomers, alphabodies, avimers, atrimers, centyrins, pronectins, anticalins, kunitz 도메인, 아르마딜로 반복 단백질,자가 항원, 수용체 또는 리간드에 의해 의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 2440 내지 2676의 경사슬 가변 도메인 (vL 또는 VL) 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 2440 내지 2676의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 2440 내지 2676의 상보성 결정 영역 (CDR's)에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 10736 내지 10972의 3개의 상보성 결정 영역 각각에서 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열로 대체된다. 표 3은 본원에서 사용된 scFv의 표적 항원, 이름, 서열번호(DNA), 서열번호(PRT), 서열번호 (PRT)를 나타낸다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 2682-2918의 중사슬 가변 도메인 (vH 또는 VH) 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 2682-2918의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열로 대체된다. 일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 2682-2918의 중사슬 가변 도메인 (vH 또는 VH) 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 2682-2918의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열 2682-2918의 상보성 결정 영역 (CDR's)에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 2682-2918의 3개의 상보성 결정 영역 중 어느 하나에서 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열로 대체된다. 표 3은 본 개시에서 사용된 표적 항원, scFv의 예시적인 vH 도메인의 이름, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT), 서열번호 (PRT)를 나타낸다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 3253-3296의 카멜리드 단일 도메인 항체 (vHH 또는 VHH) 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 3253-3296의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 3253-3296의 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 중 어느 하나에서 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 3366-3377의 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호3366-3377의 아미노산 서열에 대해 70-99% 동일성을 갖는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 3378-3395의 수용체 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호3378-3395의 아미노산 서열에 대해 70-99.9% 동일성을 갖는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호3391의 자가항원 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 최대 19개의 아미노산 잔기 그러나 20개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 3391의 아미노산 서열에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 분자의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 3396-3406의 리간드 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 20개의 아미노산 잔기 그러나 21개 이하의 아미노산은 서열번호3396-3406의 아미노산 서열에 대해 70-100% 동일성을 갖는 임의의 다른 아미노산 잔기 또는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 서열번호 2924-3160의 scFv 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 최대 40개의 아미노산 잔기 그러나 41개 이하의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기, 또는 서열번호 2924-3160의 아미노산 서열에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열 또는, 각각의 서열번호 2924-3160의 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 대해 70-100% 동일성을 갖는 서열 또는 각각의 서열번호 2924-3160의 6 개의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나에서 최대 3 개의 치환을 갖는 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 이러한 항원을 표적으로 하는 vL 및 vH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR 중 임의의 하나 이상, 또는 표 3에 열거된 vL 및 vH 단편의 임의의 CDR에서 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 도메인을 포함한다. 표 3에 열거된 vL 및 vH 단편의 CDR1-3의 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, SAR 폴리펩티드의 암호화된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 이러한 항원을 표적으로 하는 vHH 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 항원 결합 도메인은 이러한 표적 항원에 결합하는 것으로 알려진 수용체의 항원 결합 부분이다.
다른 실시형태에서, 본원은 본원의 임의의 SAR과 상이한 표적 상의 동일한 에피토프에 결합하는 SAR을 제공한다(즉, 본원의 임의의 SAR과 상이한 표적에 결합하기 위해 교차 경쟁할 수 있는 능력을 갖는 SAR). 일부 실시형태에서, 이들 SAR의 항원 특이적 도메인은 SAR의 성분으로서 사용된 항체의 vL 단편, vH 단편 및/또는 scFv 단편으로부터 결정될 수 있었다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차경쟁 연구를 위한 참조 항체는 본원에 기재된 vL, vH, scFvs, SVH, vHH, 비면역글로불린 항원 결합 도메인이다. 예시적인 실시형태에서, 서열번호 3027로 표시되는 참조 scFv hu-mROO5-1은 본원의 hu-mROO5-1-기반 SAR에 의해 인식되는 표적 에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁 연구에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차경쟁 연구를 위한 참조 AABD 단편은 여기에 기술된 AABD 단편이다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁연구를 위한 참조 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드-기반AABD이다. 일부 실시형태에서, 본원의 SAR에 의해 인식되는 표적-에피토프를 결정하기 위한 교차-경쟁연구를 위한 참조-리간드는 리간드이다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 친화도와 비교할 때 본원의 이중특이성 SAR은 각각의 표적항원에 대한 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 친화도를 나타낸다. 결합 친화도는 Topanga Assay와 같은 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 신호전달 활성과 비교할 때 본원의 이중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 신호전달 활성을 나타낸다. 신호전달 활성은 Jurkat-NFAT-GFP 세포 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 사이토카인 생산을 비교할 때 본원의 이중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등) 생산을 나타낸다. 생산된 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)은 ELISA와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 세포독성 활성에 대한 본원의 이중특이성 SAR은 30% 초과(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸다. 세포독성 활성은 Matador또는 방사성 크롬 방출 분석법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 생체내 활성에 대한 본원의 이중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 생체내 활성을 나타낸다. 한 실시형태에서, 생체내 활성은 면역결핍 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 측정된다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 친화도와 비교할 때 본원의 다중특이성 SAR은 각각의 표적항원에 대한 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 친화도를 나타낸다. 결합 친화도는 Topanga Assay와 같은 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 신호전달 활성과 비교할 때 본원의 다중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 신호전달 활성을 나타낸다. 신호전달 활성은 Jurkat-NFAT-GFP 세포 분석과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 세포독성 활성에 대한 본원의 다중특이성 SAR은 30% 초과(예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸다. 세포독성 활성은 Matador또는 방사성 크롬 방출 분석법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 사이토카인 생산을 비교할 때 본원의 다중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등) 생산을 나타낸다. 생산된 사이토카인(예를 들어, TNFα, IFNγ, IL-2 등)은 ELISA와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기술된 다른 실시형태에서, 이펙터 세포에서 발현하고 유사한 조건하에서 비교할 때의 각각의 상응하는 단일특이성 SAR의 생체내 활성에 대한 본원의 다중특이성 SAR은 30% 초과 (예를 들어, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 99% 등) 각각의 표적 항원 발현 세포에 대한 생체내 활성을 나타낸다. 한 실시형태에서, 생체내 활성은 면역결핍 마우스에서 이종이식 모델을 사용하여 측정된다.
일부 실시형태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 이의 동족 항원에 대한 이중특이성 SAR의 Fv 또는 TCR-Fv(즉, vL/vH, Vα/Vβ 또는 Vγ/Vδ 단편)에 의해 구성되는 항원 결합 도메인의 결합 친화도는vL, vH, Vα, Vβ, Vγ 또는 Vδ 단편의 N-말단 영역에 부착되어 있는 하나 이상의 AABD에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 한 실시형태에서, SAR은 단일 사슬 SAR이다. 한 실시형태에서, SAR은 이중사슬 SAR이다.
일부 실시형태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 상기 SAR의 vL, vH, Vα, Vβ, Vγ 및/또는 Vδ 단편의 N-말단 부근에 부착되는 하나 이상의 AABD를 포함하는 이의 동적항원에 의해 구성되는 이중특이성 SAR의 Fv 또는 TCR-Fv(즉, vL/vH, Vα/Vβ 또는 Vγ/Vδ 단편)에 의해 구성되는 항원 결합 도메인의 결합 친화도는 vL, vH, Vα, Vβ, Vγ 및/또는 Vδ 단편의 N-말단 부근에 부착되지 않는 하나 이상의 AABD의 경우의 단일특이성 SAR의 항원 결합 도메인의 항원 결합 친화도의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 실시형태에서, SAR의 상기 제2사슬의 존재 하에 SAR의 상기 제1사슬의 항원 결합 도메인이 이의 동족 항원에 대한 결합은 SAR의 상기 제2사슬의 부재 하에서 이의 동족 하원에 대한 SAR의 상기 제1사슬의항원 결합 도메인의 결합의70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 실시형태에서, SAR의 상기 제2사슬 (또는 CAR)의 존재 하에 SAR의 상기 제1사슬의 항원 결합 도메인이 이의 동족 항원에 대한 결합은 SAR의 상기 제2사슬 (또는 CAR)의 부재 하에서 이의 동족 항원에 대한 상기 제1사슬의 항원 결합 도메인의 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
한 실시형태에서, VH 도메인은 서열번호 3210-3252와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 다른 변형을 갖고, 이는 서열번호 3210-3252로부터 선택되고, 이는 단일 도메인 항체의 생물학적 기능을 보유한다.
다른 실시형태에서, VH 도메인은 서열번호 3210-3252 중 하나로부터 선택되지만, 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 1 내지 20, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 프레임워크 영역에 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 CDR에 있다. 한 실시형태에서, 아미노산 치환은 프레임워크 및 CDR 서열에 있다.
본원은 또한 본원에 기재된 단일 도메인 항체의 서열 최적화된 변이체를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 BCMA에 대한 이중파라토프성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 BCMA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체) 및 BCMA의 제2 에피토프에 결합하는 AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 상기 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 CD22에 대한 이중파라토프성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD22의 제1 에피토프에 결합하는 제1 VH 단일 도메인 항체 및 CD22의 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 단일 도메인 항체를 포함한다. 상기 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 CD38에 대한 이중파라토프성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CD38의 제1 에피토프에 결합하는 제1 VH 단일 도메인 항체 및 CD38의 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 단일 도메인 항체를 포함한다. 상기 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 CEA에 대한 이중파라토프성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 CEA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 VH 단일 도메인 항체 및 CEA의 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 단일 도메인 항체를 포함한다. 상기 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 PSMA에 대한 이중파라토프성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 PSMA의 제1 에피토프에 결합하는 제1 VH 단일 도메인 항체 및 PSMA의 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 단일 도메인 항체를 포함한다. 상기 제1 및 제2 에피토프는 중첩될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR의 결합 도메인은 이중특이성 표적화를 제공한다. 따라서, 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 VH 단일 도메인 항체 및 제2 표적을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 제2 결합 모이어티는 항체 단편, 일반적으로VH 단일 도메인 항체, 센티린, 아피바디 또는 vHH 도메인일 수 있다. 제2 표적은 CD19, CD20, CD22, BCMA, PSCA, CS1, GPC3, CSPG4, EGFR, 5T4, L1 CAM, MUC16, ROR1, cKit, ROR1, mesothelin, IL3Ra, c-Met, EGFRvlll, GD-2, NY-ESO-1 TCR 또는 MAGE A3 TCR, HER2, Wilm's tumor gene 1 (WT1), carcinoembryonic antigen (CEA), mucin 16, MUC1, immuno checkpoint 표적 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 통상의 기술자는 다른 종양 항원이 또한 개시내용의 범위 내에 있는 잠재적인 조합 표적이라는 것을 이해할 것이다. 단일 사슬 SAR의 경우, 2개의 결합 도메인은 어느 순서로든 존재할 수 있다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은BCMA에 결합하는AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등) 및 CD38을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.
한 실시형태에서, SAR의 하나의 결합 도메인은 BCMA에 결합하는AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등)및 CD19를 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 BCMA에 결합하는AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등)및 CD22를 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 vL/vH 단편 및 이의 표적 항원은 표 3에 제공된다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv (또는 TCR-Fv)를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다. 예시적인 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편 및 이의 표적 항원은 표 4에 제공된다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 BCMA에 결합하는 AABD (예를 들어, VH 단일 도메인 항체 또는 SVH, vHH 또는 센티린 등)및 CD20을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD22에 결합하는 AABD 및 CD20을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD22에 결합하는 AABD 및 CD19를 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD20을 표적화하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD38을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 CD123을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다.
한 실시형태에서, SAR의 제1 결합 도메인은 CD19에 결합하는 AABD 및 BAFF-R을 표적으로 하는 제2 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 특정 항원을 표적으로 하는 Fv를 형성하기 위해 결합하는 vL/vH 단편을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 상이한 항원을 표적으로 하는 TCR-Fv를 형성하기 위해 결합하는 Va/Vb 또는 Vg/Vd 단편을 추가로 포함한다.
상기에서 상세히 기술된 바와 같은 결합 도메인 외에, 본원의 SAR은 하나 이상의 신호전달 사슬 또는 이의 단편 및 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 신호전달 사슬 및 단편은 서열번호(DNA) 1349-1584 및 8541 내지 8767 (새로운 사슬) 및 서열번호(PRT) 3743-3966, 3385, 3394, 7818-7822, 9633-9859에 제공된다. 본원은 또한 신호전달 사슬의 예시적인 성분, 예컨대 세포외 도메인, 세포외 및 막관통 도메인, 막관통 도메인, 힌지 도메인 (서열번호(DNA) 1535-1549 및 서열번호(PRT) 3929-3943), 세포질 도메인 (서열번호 (DNA) 1550-1564 및 서열번호(PRT) 3944-3958) 및 공동자극 도메인 (서열번호(DNA) 1565-1572 및 서열번호(PRT) 3959-3966)을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, SAR의 구축을 위한 신호전달 사슬 및 단편은 서열번호3743-3966, 3385, 3394, 7818-7822, 9633-9859 로 표시되는 폴리펩티드 또는 그에 대해 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 상동성을 갖는 단편 또는 기능적 변이체 또는 비인간종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 원숭이 등으로부터의 동등한 잔기(즉, 상동체)를 포함한다. 다른 포유동물 종으로부터의 신호전달 사슬 및 단편은 본원의 SAR을 만들기 위해 개시된 방법에서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 인간 및 다른 포유동물 종으로부터 유래된 신호전달 사슬 및 단편의 하이브리드인 신호전달 사슬 및 단편은 본원의 SAR을 만들기 위해 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 마지막으로, 기술된 신호전달 사슬의 대안적으로 접합된 이소형 및 단편은SAR를 만들기 위해 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
본원의SAR은 하나 이상의 막관통 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 "막관통 도메인(transmembrane domain)" (TMD)은 원형질막을 가로지르고, 소포체 신호전달 도메인 및 항원 결합 도메인에 연결되고, 후자의 경우 임의로 힌지 도메인 또는 연결 펩티드를 통해 연결되는 SAR의 영역을 지칭한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR의 막관통 도메인은 유형 I 또는 유형 II의 막관통 단백질, 또는 이의 인공 소수성 서열 또는 조합의 막관통 영역이다. 한 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD16, CD64, CD32, KIR2DS4, CD3z, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DAP10, DAP12, CD28 및 CD8로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다. 다른 막관통 도메인은 당업자에게 자명할 것이며, 본원의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 개시 범위 내에 서열번호3914-3928로 제시된 TMD 서열이 있다.
본원의SAR은 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. "세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)", "세포질 도메인(cytoplasmic domain)" 또는 "엔도도메인(endodomain)"은 활성화 신호를 T 세포에 전달하고 세포가 이의 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 도메인이다. 구체적으로 본원의 범위 내에는 서열번호 3944-3958로 제시된 세포내 신호전달 도메인 서열이 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR은 항원 특이적 결합 후 SAR-T 세포 활성을 향상시키기 위해 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함한다. 다중 공동자극 도메인은 다중 신호전달 경로를 모집하기 위해 단일 SAR에 포함될 수 있다. 구체적으로 본원의 범위 내에는 서열번호 3959-3966을 갖는 공동자극 도메인 서열이 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR은 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인을 연결하는 힌지 또는 스페이서 영역을 추가로 포함한다. 이 힌지 또는 스페이서 영역은 결과 SAR의 다양한 길이와 유연성을 달성하는 데 사용할 수 있다. 본원에 따라 사용될 수 있는 힌지 또는 스페이서 영역의 예로는, 이에 제한되지 않으나, 항체의 Fc 단편 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 힌지 영역 또는 이의 단편 또는 유도체, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, CD8A 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CD16 힌지 도메인, CD16 힌지 도메인, CD16 힌지 도메인, CD16 힌지 도메인, NKp30 힌지 도메인, NKp44 힌지 도메인, NKp46 힌지 도메인 및 인공 스페이서 서열, 예를 들어 펩티드 서열, 또는 이들의 조합이 있다. 다른 힌지 또는 스페이서 영역은 당업자에게 자명할 것이며, 본원의 대안적인 실시예와 관련하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 개시 범위 내에는 서열번호 3592-3598 및 3929-3943에 제시된 힌지 서열이 있다. TCR 연결 펩티드 (서열번호 3571-3579)는 또한 힌지 도메인으로서 작용할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR은 SAR의 상이한 도메인을 연결하는 "링커 도메인(linker domain)" 또는 "링커 영역(linker region)"을 추가로 포함한다. 이 도메인은 약 1 내지 500개 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 포함한다. 적합한 링커는 당업자에게 자명할 것이며, 본 개시내용의 대안적인 실시형태와 관련하여 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 "리더 서열(leader sequence)"을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 리더 서열은 CD8A 도메인이다. 구체적으로, 개시 범위 내에는 서열번호 2425-2430을 갖는 리더 서열이 있다.
일부 측면에서, 본원의 SAR은 억제 신호를 전달하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 본원의 SAR은 가용성 폴리펩티드 어댑터 또는 태그에 결합할 수 있게 하는 어댑터 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 어댑터 및 어댑터 결합 도메인은 서열번호 3407-3435로 제공된다. 예시적인 실시형태에서, SAR을 암호화하는 RZIP은 CD19-발현 세포를 표적화하기 위해 CD19를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 함유하는 EZIP 암호화 폴리펩티드 (서열번호 3409)와 함께 사용될 수 있다. 유사하게, SAR을 암호화하는 NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF (예를 들어, 서열번호 5481)를 ULBP2R 암호화 폴리펩티드 (예를 들어, CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2R, 서열번호 5131)와 조합하여 BCMA를 표적으로 삼을 수 있다. 대안적인 실시형태에서, SAR을 암호화하는 NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA (예를 들어, 서열번호 5482)를 ULBP2-S3 암호화 폴리펩티드 (예를 들어, CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2-S3, 서열번호 5132)와 조합하여 사용하여 BCMA를 표적으로 삼을 수 있다. 유사하게, 스트렙태그(Streptag) (서열번호 4970) 또는 FITC (예를 들어, 서열번호 4963-4964)를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 암호화하는 SAR을 스트렙태그-표지된 또는 FITC-표지된 항체/항체 단편과 조합하여 후자에 의해 결합된 항원을 표적화할 수 있다. 다른 어댑터는 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, WO2019099440 및 Diana Darowski et al., MABS, 2019, VOL. 11, NO. 4, 621-631) 본 개시내용의 대안적인 실시예에서 사용될 수 있다.
SAR은 형광 라벨 또는 다른 태그와 같은 라벨, 예를 들어 영상화를 용이하게 하는 라벨을 더 포함할 수 있다. 이는 예를 들어 종양 결합을 영상화하는 방법에 사용될 수 있다. 표지는 항원 결합 도메인에 접합될 수 있다.
본원에 기재된 SAR은 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성될 수 있다. 이 실시형태에서, 항원-특이적 표적화 영역은 N-말단에 있고, 나란히 배열되어 있으며, 링커 펩티드에 의해 분리된다.
다른 측면에서, 본원은 본원에 기재된 바와 같이 항원에 결합하고, 하나 이상의 신호전달사슬에 접합되는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함하는 단리된 SAR 폴리펩티드 분자를 제공한다.
일부 실시형태에서, SAR은 단일 신호전달 사슬 (클래스 1)의 NH2-말단에 접합된 단일 항원 결합 도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드를 포함하거나 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, SAR은 기능적 SAR (클래스 2)을 만들기 위해 조립되는 2개의 폴리펩티드를 포함하거나 구성된다. 이러한 이중사슬 클래스 2 SAR의 폴리펩티드 각각은 신호전달 사슬을 함유하고(클래스 2A에서와 같이) 또는 (클래스 2B에서와 같이) 하나 이상의 항원 결합 도메인을 함유하지 않는다. 클래스 2A SAR에서, 각각의 항원 결합 도메인은 별개의 신호전달 사슬의 N-말단에 결합된다. 예를 들어, 항원 결합 도메인 1 (예를 들어, 항체의 vL 단편)은 하나의 DAP10사슬에 접합되어 기능성 폴리펩티드 유닛 1을 구성하고, 항원 결합 도메인 2 (항체의 vH 단편)는 두 번째 DAP10 사슬에 접합되어 기능성 폴리펩티드 단위 2를 구성한다. 이러한 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 동일한 세포에서 공동 발현되고 서로 쌍을 이루어 기능적으로 활성이 된다. 각각의 항원 결합 도메인은 차례로 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있으며, 이에 따라 클래스 2 SAR이 2개 이상의 항원을 표적화할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
일부 실시형태에서, 클래스 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 유닛은 상이한 벡터를 사용하여 세포에서 공동 발현된다. 일부 실시형태에서, 클래스 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 클래스 2 SAR의 2개의 기능성 폴리펩티드 유닛을 암호화하기 위해 2개의 개별적인 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 사용하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동 발현된다. 본원은 제2 폴리펩티드 단위 또는 제3 부속 모듈을 발현하는데 사용될 수 있는 작은 프로모터가 EFS 프로모터, EFS2 프로모터 또는 RSV 프로모터임을 제공한다. 일부 실시형태에서, 클래스 2 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위는 SAR의 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 단편을 분리하는 IRES 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 단일 프로모터를 고용하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동 발현된다. 일부 실시형태에서, 클래스 2 SAR의 2개의 기능성 폴리펩티드 유닛은 절단가능한 링커(예를 들어, F2A, T2A, E2A, P2A 등)를 함유하는 단일 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 단일 프로모터를 고용하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동 발현된다. 생성된 mRNA는 단일 폴리펩티드를 암호화하고, 이는 후속적으로 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위를 생성한다. 일부 실시형태에서, 클래스 2 SAR의 2개의 기능성 폴리펩티드 유닛은 양쪽 기능성 폴리펩티드 유닛 모두를 암호화하는 단일 mRNA 서열의 형질감염을 사용하여 공동 발현되는 반면, 다른 실시형태에서, 2개의 기능성 폴리펩티드 유닛은 각각 하나의 기능성 폴리펩티드 단위를 암호화하는 2개의 상이한 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동 발현된다. 일부 실시형태에서, SAR을 암호화하는 벡터 또는 mRNA는 추가의 유전자/단백질(치료 대조군, 억제 분자, 부속 모듈 등)을 암호화할 수 있고, 이는 별도의 프로모터(예를 들어, EFS, EFS2 또는 RSV 프로모터) 또는 이들의 조합을 사용하여 발현되는IRES 또는 절단가능한 링커에 의해 SAR 암호화 서열로부터 분리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료적 대조군 또는 부속 모듈 또는 둘 모두는 별개의 벡터 또는 mRNA를 사용하여 SAR이 발현되는 세포에서 발현될 수 있다. 치료적 조절 또는 부속 모듈은 SAR의 기능에 필수적인 것은 아니며, 실시 형태의 임의의 SAR은 치료적 제어 또는 부속 모듈 없이 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 항생제 내성 카세트, 예컨대 PAC(puromycin resistance gene)는 SAR의 기능을 손상시키지 않으면서 본원의 SAR 암호화 벡터로부터 제거될 수 있다.
또한 본원에 기술된 SAR의 기능적 변이체가 제공되며, 이는 모 SAR과 실질적 또는 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 가지며, 이 기능적 변이체는 변이체인 SAR의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 변이체는 예를 들어, 모 SAR과 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 SAR의 변이체(모 SAR)를 포함한다. 모 SAR과 관련하여, 기능적 변이체는 예를 들어, 모 SAR과 아미노산 서열에서 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열일 수 있다.
기능적 변이체는, 예를 들어, 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 SAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모 SAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 일반적이다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 강화 시킬 수 있고, 이에 따라 기능적 변이체의 생물학적 활성이 모 CAR과 비교하여 증가된다.
SAR(또는 기능적 부분 또는 이의 기능적 변이체)가 생물학적 활성, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고, 포유동물에서 병든 세포를 검출하고, 또는 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방한다면, SAR(기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)는 임의의 길이일 수 있고, 즉 아미노산의 어떤 수를 포함할 수 있다. 예를 들어, SAR은 길이가 약 300 내지 약 5000개, 예컨대 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 상기 정의된 바와 같은 SAR을 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 단리된 핵산 구축물에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 핵산은 표 B에 열거된 표적 중 하나를 표적으로 하는 단백질을 암호화한다.
또한 본원의 범위 내에는 본원에 기재된 임의의 SAR 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 상동성을 갖는 서열이 있다. SAR은 설계상 모듈형이므로, 본원에 기술된 SAR의 모듈 중 하나 이상을 상이한 모듈로 대체함으로써 추가적인 SAR이 생성될 수 있다. 예를 들어, SAR의 항원 결합 도메인 (즉, vL, vH, scFv, vHH, FHVH, 센티린 등)은 다른 항원을 표적으로 하는 항원 결합 도메인으로 대체될 수 있다.
용어 "핵산(nucleic acid)", "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 또는 DNA 또는 RNA의 조합을 지칭한다. RNA는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하고; 본원에 기재된 바와 같은 SAR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 서열을 포함한다. 핵산은 자살 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 구축물은 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태일 수 있다.
한 실시형태에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 발현벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al.] (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013)에 기재되어 있다. 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스, 예컨대, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 한 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 이 내용은 예제로 나와 있다. 본원은 또한 전술한 SAR을 포함하는 바이러스에 관한 것이다.
본원은 또한 세포 내로 직접 형질 감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질 감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하기 위한 방법은 특별히 설계된 프라이머를 갖는 주형의 시험관내 전사 (IVT)를 수반하고, 이어서 폴리 A 첨가를 수반하여, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR") (예를 들어, 본원에 기술된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡 (예를 들어, 본원에 기술된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (예를 들어, 본원에 기술된 IRES), 발현되는 핵산, 및 폴리 A 테일, 일반적으로50-2000 염기 길이(서열번호 13-16)를 함유하는 구축물을 생성한다. 이렇게 생산된 RNA는 여러 종류의 세포를 효율적으로 형질 감염시킬 수 있다. 한 실시형태에서, 템플릿은 SAR에 대한 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, RNA SAR 벡터는 전기천공에 의해 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 iPSC 내로 형질 도입된다. 다른 실시형태에서, RNA SAR 벡터는 마이크로유체 장치를 사용하여 세포막에서 일시적인 섭동을 일으킴으로써 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 내로 형질 도입된다. SAR의 상이한 사슬 (또는 기능적 폴리펩티드 단위)은 또한 하나 또는 하나 이상의 벡터, 상이한 벡터 또는 기술의 조합을 사용하여 세포에 도입될 수 있다.
다른 실시형태에서, SAR의 한 사슬 또는 기능적 폴리펩티드 단위는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입될 수 있는 반면, 다른 기능성 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입될 수 있다. 다른 측면에서, 하나의 기능성 폴리펩티드 유닛은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되는 반면, 다른 기능성 폴리펩티드 유닛은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 도입된다. 또 다른 측면에서, 하나의 기능성 폴리펩티드 유닛은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 도입되고, 다른 기능성 폴리펩티드 유닛은 RNA 형질감염을 사용하여 도입된다. 또 다른 측면에서, 하나의 기능성 폴리펩티드 단위는 당업계에 공지된 유전자 표적화 기술을 사용하여 내인성 TCR 사슬 유전자좌에서 유전자 재조합에 의해 세포에서 생산되는 반면, 다른 기능성 폴리펩티드 단위는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 도입된다.
RNA는 다수의 상이한 방법들, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 방법은 전기천공, 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 생물학적 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총(gene guns)" (예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al.] Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)), 또는 마이크로유체 장치를 사용하여 세포막에서 일시적인 섭동을 유발함으로써 (예를 들어, 특허 출원 WO 2013/059343 A1 및 PCT/US2012/060646 참조)을 포함하고 이에 제한되지 않는 중 임의의 것을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비바이러스성 방법은 트랜스포존 (또한 전치가능한 요소로 지칭됨)의 사용을 포함한다.
트랜스포존을 이용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템 (SBTS) 및 피기백(piggyBac)(PB) 트랜스포존 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, T, NK, NKT, 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포는 SBTS를 이용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제를 이용한 유전자 편집의 조합을 사용하여 본원에 기재된 SAR을 발현하는 것을 생성한다 (예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 호밍 엔도뉴클레아제).
일부 실시형태에서, 비바이러스성 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어, T, NK, NKT, 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포의 재프로그래밍을 허용하고, 세포를 대상체 내로 직접 주입하는 것을 허용한다.
추가의 측면에서, 본원은 또한 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 구축물을 포함하는 단리된 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 세포는 따라서 본원의 SAR 핵산 구축물을 발현하도록 유전적으로 변형되었다. 따라서, 본원은 본원의 SAR 핵산 구축물을 포함하고, 안정적으로 발현하는 유전자 조작된 세포를 제공한다. 한 실시형태에서, 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포, 세포독성 T 림프구 (CTL), 조절 T 세포, 조혈 줄기 세포 및/또는 만능 배아/유도 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. T 세포는 본원의 SAR 핵산 구조체로 형질 감염을 위해 환자로부터 단리될 수 있다.
예를 들어, 세포는 생체외에서 개시된 핵산으로 형질 감염될 수 있다. 다양한 방법은 본원의 SAR를 발현하는 안정된 형질감염체를 생산한다. 한 실시형태에서, 세포를 안정되게 형질 감염시키고 재지향시키는 방법은 네이키드 DNA를 사용한 전기천공에 의한 것이다. 본원의 SAR을 암호화하는 네이키드 DNA를 사용하여 세포를 유전적으로 조작하기 위한 추가의 방법은 화학적 형질 전환 방법(예를 들어, 인산칼슘, 덴드리머, 리포솜 및/또는 양이온성 중합체 사용), 비화학적 형질 전환 방법(예를 들어, 전기천공, 광학 변환, 유전자 전기전달 및/또는 유체역학적 전달) 및/또는 입자-기반 방법(예를 들어, 유전자 총 및/또는 마그네토펙션(magnetofection)을 사용한 임페일펙션(impalefection))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 통합된 재배열되지 않은 벡터의 존재 및 SAR의 발현을 입증하는 형질 감염된 세포는 생체 외에서 확장될 수 있다. 바이러스 형질도입 방법은 또한 본원의 SAR을 발현하는 재방향 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원의 벡터는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예로는, 예를 들어, EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-lα 프로모터, MNDU3 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 코어-프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase) (PGK) 프로모터가 포함된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 추가의 실시형태에서, EF-1 프로모터는 서열 7을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 RNA 핵산이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
다른 측면에서, 본원은, SAR, 예를 들어 본원에 기술된 SAR을 암호화하는 핵산 또는 SAR 모듈, 예를 들어 본원에 기술된 SAR 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여 세포, 예를 들어, 본원에 기술된T, NK, NK 세포주, 대식세포, NKT, 줄기 세포, iPSC또는 합성 T세포에 도입(예를 들어, 형질 도입)시키는 것을 포함하는 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포 또는 이의 집단)을 만드는 방법을 제공한다.
세포는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포, 또는 이의 조합) 또는 면역 이펙터 세포 또는 합성 T 세포를 발생시킬 수 있는 줄기/전구 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 불멸화된 세포주, 예컨대 NK92, NK92MI 또는 이의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 세포는 내인성 T 세포 수용체 α, β1, β2, pre-TCRα, γ 또는 δ의 불변 사슬 또는 이의 조합이 결핍된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 세포는 HLA 항원이 결핍된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 세포는 β2 마이크로글로불린이 결핍된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법에서 세포는 SAR의 표적 항원의 발현이 결핍된다. 예를 들어, 경우 SAR 발현 T 세포는SAR이 CD5에 대해 지시될 때 내인성 CD5, SAR이 TCR-베타1 불변 사슬에 대해 지시될 때 TCR-베타1 불변 사슬, SAR이 TCR-베타2에 대해 지시될 때 TCR-베타2불변 사슬, SAR이 CS1에 대해 지시할 때 CS1이 결핍된다.
일부 실시형태에서, SAR을 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 단계는 SAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 형질 도입하는 것, 또는 SAR을 암호화하는 핵산 분자를 형질 주입하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 시험관내 전사된 RNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 SAR의 2개 이상의 성분들을 암호화하고, 하나 초과의 벡터로 세포를 형질 도입시키거나 SAR의 상이한 서브 유닛을 암호화하는 2개 이상의 핵산 분자들로 형질 주입함으로써 도입된다. 예를 들어, 세포는 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 유닛들 중 하나를 각각 암호화하는 2개의 별개의 벡터로 형질 도입될 수 있다. 유사하게, 세포는 SAR의 2개의 기능적 폴리펩티드 단위 중 하나를 각각 암호화하는 2개의 별개의 시험관내 전사된 RNA들로 형질 도입될 수 있다. SAR의 기능적 폴리펩티드 유닛들에 추가로, 각 RNA는 서로 다른 선택 마커 또는 리포터(예를 들어, tEGFR, tBCMA, 또는 CD34 또는 CNB30 또는 돌연변이 DHFR)를 운반할 수 있으며, 이로써 두 RNA를 통해 전달된 세포를 선택하고, 따라서 SAR의 기능적인 폴리펩티드 단위들을 모두 발현하는 데 사용할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR은 내인성 유전자의 조절 요소들을 사용하여 발현될 수 있다. 한 실시형태에서, SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 암호화하는 발현 카세트는 자연 발생 신호전달 수용체 또는 신호전달 어댑터의 유전적 유전자좌를 표적으로 한다. 한 실시형태에서, SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 천연 수용체 또는 신호전달 어댑터의 전체 또는 부분 세포외 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 mRNA와 융합하여 전사된다. 실시형태에서, SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 천연 수용체 또는 신호전달 어댑터의 힌지 도메인 및 세포질 도메인을 코딩하는 mRNA와 융합하여 전사된다. 한 실시형태에서, SAR의 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인은 천연 수용체 또는 신호전달 어댑터의 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 mRNA와 융합하여 전사된다. 한 실시형태에서, SAR은 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터의 프로모터 및 전사 조절 요소 하에서 발현된다. 한 실시형태에서, 내인성의 유전적 유전자좌에 대한 SAR의 표적화는 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터의 발현의 중단을 초래한다.
유전자를 임의의 특정 유전자좌로 표적화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN의 사용을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR 발현 카세트를 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1 및 CD161의 그룹으로부터 선택된 원래 수용체의 유전자좌를 표적으로 한다. 한실시형태에서, SAR 발현 카세트는 CD3, FcRγ, DAP10 또는 DAP12의 유전자좌를 표적으로 한다. 한 실시형태에서, SAR 발현 카세트는 TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자의 유전자좌를 표적으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 b) 집단으로부터 T 조절 세포를 제거하여, T 조절성 고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함하고; 여기서 단계 a) 및 b)는 SAR을 암호화하는 핵산을 집단에 도입하기 전에 수행된다.
한 실시형태에서, 세포는 인간 T 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 개 세포이다.
한 실시형태에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬이 결핍되어 있다. 본원에 따른 기능적 TCR의 발현이 안정적으로 결여된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 사슬을 표적으로 하는 Zn 핑거 뉴클레아제(ZFN), CRISP/Cas9 및 shRNA의 사용과 같은 다양한 접근법을 사용하여 제조될 수 있다.
기능적 내인성 TCR이 결여된 T 세포는, 예를 들어, 그 표면 상에 어떠한 기능적 내인성 TCR도 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 내인성 TCR을 구성하는 하나 이상의 서브 유닛(예를 들어, 내인성 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 프리-TCRα의 불변 사슬)을 발현하지 않도록 조작되거나, 또는 그 표면 상에 매우 적은 기능적 내인성 TCR을 생성하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어, TCR의 서브 유닛 중 하나 이상의 돌연변이 또는 절두된 형태의 발현에 의해, 실질적으로 손상된 내인성 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR(substantially impaired TCR)"은 이러한 TCR이 숙주에서 불리한 면역 반응을 유도하지 않는다는 것을 의미한다.
본원은 NK 세포에서 발현되고 신호전달 활성을 나타낼 뿐만 아니라 단핵구/대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함한 T 세포 및 기타 면역 계통에서도 발현 및 신호전달 활성을 나타낼 수 있는 새로운 사슬(예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, CD3z, NKG2D 및 CD16 등)에 기초한 SAR을 제공한다. 본원은 비-T 세포 상에서, TCR 유사 결합 특성, 즉, 펩티드/MHC 복합체에 결합하는 능력의 보편적인 방법을 제공한다. 따라서, 본원은TCR과 같은 결합 특성을 갖는 비-T 세포를 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 T 세포가 아닌 세포가 본원의 SAR을 발현함으로써 TCR과 유사한 결합 특성을 부여받을 수 있으며, 여기서 SAR은 TCR의 가변 도메인을 포함하지만 TCR 모듈이 결여된 uTCR-SAR이다. 한 실시형태에서, 본원은 다중 유전자 조작을 필요로 하지 않고 임의의 세포에 TCR과 같은 결합 특성을 부여하는 간단한 1단계 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 세포에서 uTCR-SAR의 이소성 발현을 수반하고, 다중 CD3 서브 유닛의 이소성 발현 및 고발현 클론의 선택에 필요한 추가 단계 및 시간 소비를 필요로 하지 않는다. 따라서, 상기 방법은 일차 NK 세포, 조혈 줄기 세포 또는 iPSC와 같은 일차 세포를 포함하는 임의의 세포에 결합 및 신호전달과 같은 T 세포를 부여하는 데 적합하다. 상기 방법은 또한 NK 세포주 (예를 들어, NK92, NK92MI, NKG 및 YTS 세포주)와 같은 불멸화 세포주 상에서 항원 및/또는 TCR과 같은 신호전달 및 세포독성에 대한 T 세포 유사 결합 (즉, 펩티드 항원에 대한 HLA-의존성 결합)을 부여하는 데 사용될 수 있다.
본원의 SAR(예: uTCR-SAR, CD16-SAR 등)로서는T 셀이 아닌 임의의 셀에서 발현될 수 있으며, 본원의 방법은 생리학적 T 세포 수용체 복합체를 통한 신호전달에 의존하는 SIR, AbTCR 등과 같은 다른 차세대 CAR 플랫폼에 비해 뚜렷한 이점을 갖는다. 본원은 여러 조직과 계통에서 활성인 프로모터 (예를 들어, EF1α, MNDU3, 유비퀴틴 등) 하에서 발현되는 SAR을 제공한다. 본원은 본원의 SAR이 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 iPSC)에서 발현될 수 있고, 줄기 세포의 분화는 NK, T, 대식세포, 호염기구, 호중구, B 세포, 과립구 및 수지상 세포를 포함하는 다중 계통에서 SAR의 기능적 발현을 초래하여, SAR에 의해 표적화된 항원에 대해 강한 면역 반응을 초래한다는 것을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 생체 내에서 조혈 줄기 세포에서 발현되고 상이한 혈액 계통으로의 분화는 생체 내에서 일어난다. 본원의 대안적인 실시형태에서, SAR은 시험관내에서 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)에서 발현되고, 상이한 혈액 계통으로의 분화는 시험관내에서 일어난다. 이어서, 시험관내 분화 및 다수의 계통의 확장된 혈액 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원은 일차 세포(예를 들어, 일차 NK 세포, g-NK 세포, CIK, 기억 유사 NK 세포, 대식세포, 수지상 세포, 호중구, B 세포, 과립구 등), 세포주, 조혈모세포, iPSC 세포, HLA 결핍 iPSC 세포, HLA 결핍 NK 세포, HLA 결핍 NK 세포주등의 군에서 선택한 비-T 세포에 TCR과 유사한 결합 특성 및/또는 신호전달 활동을 제공한다.
상기에 비추어, 본 명세서는 적어도 하나의SAR을 포함하는 iPSC, iPS 세포주, 또는 이로부터의 유도체 세포를 제공하고, 여기서 유도체 세포는 SAR을 포함하는 iPSC의 분화로부터 획득된 기능성 이펙터 세포이다. 일부 실시형태에서, 유도체 세포는 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 확정적HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구체 (MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 조혈 세포이다. 일부 실시형태에서, 기능성 유도체 조혈 세포는 이펙터 세포, 예컨대 T, NK 및 조절 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, iPSC 또는 SAR을 포함하는 이로부터의 유도체 세포는 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 및 IL21 중 하나 이상을 포함하는 외인성 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체를 추가로 포함한다.
추가적으로 제공되는 iPSC, iPS 세포주, 또는 SAR 발현을 포함하는 이로부터의 유도체 세포는 적어도 하나의 외인성 사이토카인 및/또는 이의 수용체 (IL)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여, 세포 활성화, 생존, 지속성 및/또는 확장에 기여하는 사이토카인 신호전달을 가능하게 하고, 상기 iPSC 라인은 향상된 활성화, 생존, 지속성, 확장 및 이펙터 세포 기능을 갖는 기능적 유도체 조혈 세포를 생산하기 위해 유도 분화가 가능하다. 외인성으로 도입된 시토킨 신호전달(들)은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, 및 IL21 중 임의의 하나 또는 둘 이상의 신호전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시토킨 신호전달은 구성적으로 활성화된다. 일부 실시형태에서, 시토킨 신호전달의 활성화는 유도 가능하다. 일부 실시형태에서, 시토킨 신호전달의 활성화는 일시적 및/또는 시간적이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 사이토카인/사이토카인 수용체의 일시적/시간적 발현은 레트로바이러스, 센다이(Sendai) 바이러스, 아데노바이러스, 에피솜, 미니서클, 또는 mRNA를 포함하는 RNA를 통해 이루어진다. 일부 실시형태에서, SAR 과발현된 iPSC 또는 이의 유도체 세포에 포함된 외인성 세포 표면 사이토카인 및/또는 수용체는 IL7, IL10, IL15, IL18 또는 IL21 신호전달을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL2, IL15, IL7 등의 막고정 형태이다. hIL2의 막고정 형태를 암호화하는 예시적인 구축물은 서열번호 1330으로 표시된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 다목적 스위치의 일부이다.
또한, iPSC, 변형된 HLA-결핍 iPCS, iPS 세포주 세포, 또는 SAR 및 과발현된 NKG2C, CD94, DAP12, DAP10, BiKE, TriKE, hnCD16, CAR, IL, B2M 낙아웃 및/또는 CITA 낙아웃을 포함하는 유도체 세포 및 선택적으로 HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 여기서 iPSC는 기능성 유도체 조혈 세포를 생산하기 위해 유도된 분화를 할 수 있다. iPSC 및 이의 유도체 NK 또는 T 세포의 한 실시형태에서, 세포는 다른 게놈 편집 중에서도 B2M-/-CIITA-/-를 포함하고, HLA-I 및 HLA-II 둘 다 결핍되고, 여기서 iPSC 및 이의 유도체 이펙터 세포는 개선된 지속성 및/또는 생존을 갖는다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 생체내에서 증가된 지속성 및/또는 생존을 갖는다.
이와 같이, 본원에 제공되는 것은 SAR, 외인성 사이토카인/수용체, B2M 낙아웃 및 CIITA 낙아웃을 포함하는 iPSC를 포함하고, 여기서 B2M이 녹아웃될 때, HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 선택적으로 도입되고, 여기서 상기 iPSC는 기능성 유도체 조혈 세포를 생산하기 위해 유도된 분화가 가능하다. 또한 본원에는 과발현된 SAR, 외인성 사이토카인/수용체, B2M 낙아웃 및 CIITA 낙아웃을 포함하는 기능성 iPSC 유도체 조혈 세포가 포함되고, 여기서B2M이 낙아웃될 때, HLA-G를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 선택적으로 도입되고, 상기 유도체 조혈 세포는 이에 제한되지 않으나 확정적 조혈 내피세포(HE) 퍼텐셜을 갖는 중배엽 세포, 확정적 HE, CD34 조혈 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 조혈 다능성 전구체(MPP), T 세포 전구체, NK 세포 전구체, 골수 세포, 호중구 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 호중구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다.
SAR을 포함하는 상기 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포의 집단의 한 실시형태에서, 세포는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (i) BiKE 또는 TriKE; (ii) B2M 널(null) 또는 낮음(low); (iii) CIITA 널(null) 또는 낮음(low); (iv) HLA-G 또는 절단 불가능한 HLA-G의 도입된 발현; (v) 키메라 항원 수용체 (CAR); (vi)세포 표면에서 발현되는 외인성 사이토카인의 부분 또는 전체 펩타이드 또는 그 수용체; (vii) 다목적 스위치를 암호화하는 부속 모듈; (viii) B2M, TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역의 임의의 유전자 중 적어도 하나에서의 결실 또는 감소된 발현; 및 (ix) HLA-E, 41BBL, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12, CD4, CD8, CD16, CD47, CD94, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, Fc 수용체, 인게이저, 또는 이중- 또는 다중특이성 또는 보편적인 인게이저와 결합하기 표면 유발 수용체 중 적어도 하나에서 발현이 도입되거나 증가된 경우.
uTCR-SAR에 대한 대안적인 접근법에서, 본원은 또한 SIR, AbTCR, cTCR 및 비-T 세포, 예를 들어, NK 세포 또는 NK 세포주에서 발현되는 내인성 TCR 신호전달에 의존하는 다른 유사한 플랫폼상에서 SAR을 발현하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 세포는 면역 세포(예를 들어, NK, 단핵구, 대식세포, 호중구, NK92 세포주 등), 또는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)이고, 상기 면역 세포 또는 줄기 세포는 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ 또는 이의 변이체 중 하나 이상을 이소성적으로 발현하도록 조작된다. 한 실시형태에서, 세포는 면역 세포 또는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)이고, 면역 세포 (예를 들어, NK, 단핵구, 대식세포, 호중구 등) 또는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)는 하나 이상의 CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ 또는 이의 변이체를 이소성적으로 발현하도록 조작된다. 한 실시형태에서, CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ를 이소성적으로 발현하도록 조작된 세포는 또한 본원의 하나 이상의 SAR을 발현한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR은 하나 이상의 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편 (예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 등의 불변 사슬)을 포함한다. 하나 이상의 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 예시적인 SAR은 SIR (서열번호 2305), cTCR, Ab-TCR (서열 2309 및 2310), STAR, HIT, TFP 및 TFPαβ 및 TFPγδ를 포함한다. 한 실시형태에서, 세포에서 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및/또는 CD3ζ의 발현은 하나 이상의 TCR 불변 사슬 또는 단편을 포함하는 SAR의 기능적 발현을 촉진한다.
한 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이고, 줄기 세포는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬이 결핍되어 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이고, 여기서 SAR의 하나 이상의 표적 항원 (예를 들어, MPL, CD33, CD123, CD19 등)이 SAR에 의해 더 이상 인식되지 않은 형식으로 삭제되거나 변형되어 있다. 예를 들어, CD19를 표적으로 하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19가 결핍된 줄기세포에서 발현되어 이러한 줄기세포에 의해 생성된 B 세포가 CD19 표적 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, 내인성 CD19가 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 SAR에 의해 표적화되지 않은 형태로 돌연변이 된 줄기 세포에서 CD19를 표적으로 하는 SAR을 발현되어, 이러한 줄기 세포에 의해 생성된 B 세포가 CD19 표적 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 다른 실시형태에서, SAR은 면역 이펙터 세포에서 발현되고, 자가 또는 동종이계 공여자로부터의 줄기 세포는 SAR-표적 항원의 발현이 결여되거나 SAR에 의해 인식되지 않는 SAR 표적 항원의 돌연변이 된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 예를 들어, CD19를 표적으로 하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD19가 결핍된 자가 또는 동종 조혈 줄기 세포와 함께 환자에게 주입된 T 세포에서 발현되므로 이러한 줄기 세포에 의해 생성된 B 세포는 CD19 표적 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, CD19를 표적으로 하는 SAR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 CD19가 SAR에 의해 표적화되지 않은 형태로 돌연변이된 자가 또는 동종 조혈 줄기 세포와 함께 환자에게 주입된 T 세포에서 발현되어 이러한 줄기 세포에 의해 생성된 B 세포가 CD19 표적 SAR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 유사한 접근법은 이러한 항원이 질병 관련 또는 질병 유발 세포에서 발현되는 특정 질병의 치료를 위해 이러한 항원을 표적으로 하는 SAR-T 세포를 투여받는 피험자에서shRNA, CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 뉴클레아제를 사용하는 줄기 세포에서 다른 내인성 항원(예: MPL, CD33, CD123 등)을 돌연변이 시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다.
면역 세포(예: T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 호중구 등) 또는 줄기세포가 대상체로부터 획득될 수 있다. 용어 "대상체(subject)"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이들의 형질전환 종을 포함한다. 면역 세포(예: T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 호중구 등)은 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 한 실시형태에서, 면역 세포는 CXCR4 길항제 (예를 들어, Plerixafor)와 같은 동원제를 투여받은 대상체로부터 획득된다. 면역 세포는 SAR의 발현 전에 시험관 내에서 배양 및 확장될 수 있는 조직 상주 감마-델타 T 세포일 수 있다.
면역 세포(예: T 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포, 호중구 등)는 줄기세포의 시험관내 분화에 의해 얻어진다. 한 실시형태에서, 면역 세포는 iPSC의 시험관내 분화에 의해 얻어진다.
SAR을 발현하기 위해 사용되는 면역 세포는 자가 또는 동종 면역 세포일 수 있다.
본원의 SAR을 발현하는 세포는 uTCR-SAR을 포함하여, 질환의 치료에 사용된다.
따라서, 본원은 본원에 기재된 SAR을 포함하는 세포 또는 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암과 같은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서의 세포 및/또는 약학적 조성물의 약학적 활성량을 투여하는 단계를 포함한다.
본원은 또한 SAR, 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 SAR을 포함하는 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 본원은 또한 암 치료에 사용하기 위한 SAR 또는 본원에 기재된 SAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. 본원은 또한 암 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기재된 SAR 또는 SAR을 포함하는 세포의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본원은 대상체의 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것으로서, 본원의 SAR을 발현하는 세포 또는 세포 집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항원 결합 도메인은 표적 세포 집단 또는 조직을 특이적으로 인식하도록 선택된다.
다른 측면에서, 본원은 대상체에서 항종양 면역을 제공하는 방법에 관한 것으로서, 상기 개시물의 SAR을 발현하도록 유전자적으로 변형된 세포 또는 세포 집단의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항종양 면역을 제공한다.
다른 측면에서, 본원은 본원의 SAR 핵산 구축물을 상기 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 것을 포함하는 유전자 변형 세포 또는 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA; 본원에 기재된 바와 같은 SAR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 서열)을 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, RNA는 SAR 폴리펩티드를 일시적으로 발현한다. 한 실시형태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포, 또는 세포 집단)이다. 이러한 방법에 의해 제조된 세포도 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
다른 측면에서, 본원은 상기 세포를 상기 개시물의 SAR로 변형시키는 것을 포함하는, 적응성 면역치료에 사용하기 위한 세포 집단을 생성하기 위한 생체외 방법에 관한 것이다.
본원의 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포는 피콜™(Ficoll™) 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 채취한 혈액의 단위로부터 획득될 수 있다. 한 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분 채집술(apheresis)에 의해 얻어진다. 한 측면에서, 세포는 작용제의 투여에 의해 T 및/또는 NK 세포가 활성화된 대상체로부터 수집된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 면역 세포를 수집하기 전에 CXCR4 길항제 (예를 들어, 플레릭사포(Plerixafor)), 사이토카인 (예를 들어, G-CSF, GM-CSF 또는 사르그라모스팀(sargramostim), 뉴라스타 (Neulasta)또는 페그필가스트림(Pegfilgastrim)), 베타2 작용제 (예를 들어, 에피네프린(epinephrine)), 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙(dasatinib)), 화학요법 약물(들) (예를 들어, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin) 등)을 단독으로 또는 조합하여 투여받은 공여자로부터 수집된다. 일부 실시형태에서, 공여자는 자가 공여자인 반면, 다른 실시형태에서, 공여자는 동종이계 공여자이다.
성분채집술 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, NK 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 한 측면에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고, 임의로, 세포를 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 배치하기 위해 세척될 수 있다. 한 실시형태에서, 세포는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안적인 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, 모든 2가 양이온이 아니라면 많이 부족할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 SAR-발현 이펙터 세포는 SAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 억제성 분자를 억제하는 것이다. 억제성 분자의 비제한적인 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시형태에서, 억제성 분자를 억제하는 작용제는 세포, 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이들의 조합 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타 신호전달 도메인)에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드와 회합 된 제1 폴리펩티드, 예를 들어, scFv 또는 VHH 또는 수용체, 또는 억제성 분자에 결합하는 수용체 또는 리간드 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 억제성 분자를 억제하는 작용제는 본원에 기재된 신호전달 사슬(예를 들어, CD16, NKp30, NKp44, 및 NKp46 등)과 회합하는 제1 폴리펩티드, 예를 들어, scFv 또는 VHH 단편 또는 억제성 분자에 결합하는 수용체 또는 리간드 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 SAR-발현 세포는 부속 모듈, 예를 들어, SAR-발현 세포의 활성을 조절하는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. SAR-발현 세포의 활성을 향상시키거나 조절할 수 있는 작용제로 구성되는 부속 모듈의 몇 가지 예가 서열번호 3702-3725에 제공된다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 작용제는 CD3ζ, CD3δ, CD3ε, CD3γ 또는 이들의 조합의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 작용제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 SAR 발현 세포에 공동자극 신호를 제공하는 작용제(예를 들어, vFLIP K13, vFLIP MC159, cFLIP-L, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, 41BB 또는 CD28)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 SAR 발현 세포에 유도 가능한 방식으로 공동자극 신호를 제공하는 작용제(예를 들어, FKBPx2-K13, Myr-MYD88-CD40-Fv'-Fv 등)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 SAR-발현 세포의 증식 또는 지속성을 촉진하는 사이토카인 또는 케모카인 (예를 들어, CD40L, IL2, IL-7, IL-15, IL12f 또는 IL-21)일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 작용제는 인간 IL2의 막고정 형태이다 (서열번호(DNA) 1330 및 서열번호(PRT) 3724).
본원은 또한 "다목적 스위치(multi-purpose switch)"의 역할을 하는 치료적 제어/부속 모듈을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 다목적 스위치는 세포에서 이소성으로 발현될 때 입양 세포 치료의 목적을 위한 생사 스위치로서 작용한다. 한 실시형태에서, 다목적 스위치는 킬 스위치(kill-switch)로서 기능하는 제2 모듈 및 막고정 모듈로서 기능하는 제3 모듈에 대한 수용체-결합 도메인을 포함하는 제1 모듈의 프레임내 융합을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈은 세포 표면 상에서 발현되는 수용체에 결합하고, 즉, 수용체의 세포외 도메인에 결합한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈은 수용체에 결합하고, 수용체는 결합될 때 세포에 생존 및/또는 증식 신호를 전달한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈은 시스에서 수용체에 결합한다(즉, 분자 스위치를 발현하는 세포와 동일한 세포 상에서 발현된 수용체에 결합한다). 한 실시형태에서, 제1 모듈은 트랜스에서 수용체에 결합한다 (즉, 분자 스위치를 발현하는 세포 이외의 세포 상에서 발현된 수용체에 결합한다). 한 실시형태에서, 제1 모듈은 시스 및 트랜스의 수용체에 결합한다. 한 실시형태에서, 제2 및 제3 모듈은 동일한 내인성 단백질로부터 유래된다. 한 실시형태에서, 제2 및 제3 모듈은 상이한 내인성 단백질로부터 유래된다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 내인성 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 작용제에 의해 결합될 때 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 상기 제2 모듈에 결합할 때 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하는 작용제는 항체, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 농축 또는 고갈시키는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 작용제에 의해 결합될 때 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 제2 모듈에 결합할 때 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키기 위해 사용될 수 있는 작용제는 항체, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 분자 스위치는 생체 외에서 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 분자 스위치는 생체내에서 세포를 선택적으로 고갈시키기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 분자 스위치를 발현하는 세포를 검출, 고갈 또는 농축시키는데 사용되는 작용제(즉, 항체, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인 또는 이의 단편)는 FDA에 의해 인간 투여에 대해 승인되었다. 인간 투여를 위해 FDA에 의해 승인된 예시적인 작용제는 당업계에 공지되어 있으며, 리툭시맙(Rituximab), 허셉틴(Herceptin), 에르비트룩스(Erbitrux), 아드세트리스(adcetris), 엔브렐(Enbrel)등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 실시형태에서, 분자 스위치를 발현하는 세포를 검출, 고갈 또는 농축하기 위해 사용되는 작용제는 생체외 임상 사용을 위해 FDA에 의해 승인된다. 예시적인 이러한 작용제는 임상적으로 승인된 CliniMACS CD34 시스템 (Miltenyi)과 함께 사용되도록 FDA에 의해 승인된 CD34에 대한 항체이다. 예시적인 다목적 스위치는 Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter (서열번호(DNA) 7152 및 서열번호(PRT) 7843) 및 BCMA의 세포외 도메인 및 막관통 도메인에 융합된 IL2의 IL2 수용체 결합 도메인을 포함한다. 이러한 다용도 스위치는 면역 세포(예: T 세포 또는 NK 세포 등)에서 발현될 때 IL2를 포함하는 N 말단 모듈을 통해 IL2 수용체에 결합하여 생존 신호를 제공한다. 이 다목적 스위치의 제2모듈은 BCMA-결합제(예: BCMA 항체)에 의해 인식되고 이식유전자(예: SAR) 발현 세포의 검출, 선택적 고갈 및/또는 농축에 사용될 수 있는 BCMA의 세포외 도메인을 포함한다. 제2 모듈을 포함하는 BCMA의 세포외 도메인은 또한 BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 항체 약물-접합체와 같은 BCMA-표적화된 작용제의 사용에 의해 도입유전자 (예를 들어, SAR) 발현 세포의 선택적 자살을 위해 사용될 수 있다. 이 분자 스위치의 세 번째 모듈은 BCMA의 힌지 및/또는 막관통 도메인으로 구성되며 스위치를 세포막에 고정하는 역할을 한다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 에피토프 또는 미모토프의 하나 이상의 카피를 포함하는 합성 모듈이다. 한 실시형태에서, 에피토프는 내인성 단백질의 세포외 도메인에 존재한다. 한 실시형태에서, 미모토프는 내인성 단백질의 세포외 도메인에 존재하는 에피토프를 모방한다. 에피토프 또는 미모토프의 하나 이상의 카피를 포함하는 예시적인 합성 모듈은 CD34 에피토프 및 2개의 CD20 미모토프를 보유하는 모듈인 RQR8이다. RQR8 모듈을 사용하면 임상적으로 승인된 CliniMACS CD34 시스템(Miltenyi)으로 선택할 수 있다. 또한, 상기 구축물은 널리 사용되는 약제학적 항체 리툭시맙에 결합하여, 도입유전자-발현 세포의 선택적 결실을 초래한다. 추가의 예시적인 다목적 분자 스위치는 IL2 또는 이의 변이체 및 tBCMA (서열번호(DNA) 7151-7155), IL15 또는 이의 변이체 및 tBCMA (서열번호(DNA) 7156-7157), IL2 및 이의 변이체 및 tHer2, IL2 및 이의 변이체 및 tEGFR, IL2 및 이의 RQR8 등을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 다목적 스위치는 모듈식 형식이므로 하나의 모듈을 다른 모듈로 교체할 수 있다. 따라서, IL2 모듈은 상이한 사이토카인(예를 들어, IL15, IL18, IL21 등)으로 대체될 수 있다. 이들 다목적 단백질은 이의 사이토카인 모이어티 (예를 들어, IL2, IL15, IL18, IL21 등)를 통해 생존 촉진 신호를 제공하나, 제2 모듈(예를 들어, RQR3, tBCMA, tHer2, tEGFR, tCD19 등)에 결합하는 작용제(예를 들어, 항체) 사용에 의해 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있어서, 독성에 직면하여 투여된 T 세포의 선택적 결실을 허용하는 자살 유전자로 작용한다. 제2 모듈(예를 들어, RQR3, tBCMA, tHer2, tEGFR, tCD19 등)은 또한 형질도입의 측정을 위한 마커로서 사용될 수 있고 형질 도입된 세포의 선택을 허용한다.
다른 실시형태에서, 작용제는 억제성 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자들, 예를 들어, PD1은 일부 실시형태에서, 면역 이펙터 반응을 탑재하는 SAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 작용제는 PD1 또는 CTLA4를 표적으로 하는 scFV일 수 있다. 한 실시형태에서, 작용제는 제1 폴리펩티드, 예를 들어, 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타, 또는 이들 중 임의의 단편 (예를 들어, 이들 중 임의의 세포외 도메인의 적어도 일부) 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인인 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함함)을 포함한다. 한 실시형태에서, 작용제는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 이의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인의 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기재된 SAR-발현 이펙터 세포는 동일하거나 상이한 표적에 상이한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있는 제2 SAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 SAR은 제1 SAR과 동일하거나 상이한 세포 유형을 표적으로 할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원에 기재된 SAR-발현 이펙터 세포는 동일하거나 상이한 항원 결합 도메인, 선택적으로 동일하거나 상이한 표적을 갖는 제2 SAR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 SAR은 제1 SAR과 동일하거나 상이한 세포 유형을 표적으로 할 수 있다. 두 SAR은 동일한 골격 또는 다른 골격을 가질 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 두 SAR은 CD16 SAR의 골격을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 하나의 SAR은 SIR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16 SAR의 골격을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 하나의 SAR은 Ab-TCR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16 SAR의 골격을 가질 수 있다. 상이한 골격 상의 몇몇 예시적인 SAR의 핵산 및 아미노산 서열은 가출원의 표 32 및 34에 제시되어 있다. 한 실시형태에서, SAR은 질환 관련 항원과 동일한 질환 세포 유형 (예를 들어, 암) 상에서 발현되는 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 제1 항원을 표적으로 하는 제1 SAR 및 제2, 상이한 항원을 표적으로 하는 제2 SAR (또는 제2세대 CAR)을 포함하고, 1차 신호전달 도메인은 없지만 공동자극 신호전달 도메인을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 이론에 얽매이기를 바라지는 않지만, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD27, 2B4 또는 OX40을 SAR (예를 들어, 2세대 CAR) 상에 배치하는 것은 세포에 대한 SAR활성을 조절할 수 있고, 여기에서 두 표적들은 모두 발현된다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 1 또는 2개의 신호전달 사슬을 포함하는 제1 질환 관련 항원 SAR (예를 들어, CD16 SAR), 및 ii) 상이한 표적 항원 (예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 질환 관련(예를 들어, 암)세포 유형상에서 발현되는 항원)을 표적으로 하고, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 1차 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR 또는 TFPε을 포함한다. 다른 실시형태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 SAR (예를 들어, CD16 SAR) 및 1 또는 2개의 신호전달 사슬 및 ii) 제1 표적 항원 이외의 항원 (예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 질환 관련(예를 들어, 암)세포 유형상에서 발현된 항원)을 표적으로 하고, 항원, 막관통 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인에 특이적인 항원 결합도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 이 CAR 구성물에는 CD3z 도메인이 없다. 다른 실시형태에서, SAR 발현 세포는 i) 본원에 기재된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 1 또는 2개의 신호전달 사슬을 포함하는 제1 질환 관련 항원 SAR (예를 들어, CD16 SAR), 및ii) 상이한 표적 항원 (예를 들어, 제1표적 항원과 동일한 질환 관련 (예를 들어, 암)세포 유형상에서 발현되는 항원)을 표적으로 하고, 공동자극 도메인을 제외하고 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다.
다른 예시적인 실시형태에서, 면역 세포는 2개의 SAR을 발현할 수 있으며, 그 중 하나는 공동자극 신호를 제공하는 반면, 다른 하나는 1차 활성화 신호를 제공한다. 한 실시형태에서, 하나의 SAR은 4-1BB-기반 SAR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16-기반 SAR의 골격을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 하나의 SAR은 CD28-기반 SAR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16-기반 SAR의 골격을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 하나의 SAR은 OX40-기반 SAR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16-기반 SAR의 골격을 가질 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 하나의 SAR은 2B4 SAR의 골격을 가질 수 있는 반면, 제2 SAR은 CD16-기반 SAR의 골격을 가질 수 있다.
SAR은 활성화 신호를 면역 이펙터 세포에 전달할 수 있지만, 활성화 도메인을 함유하는 ITAM을 갖지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 SAR은 활성화 도메인을 함유하는 ITAM을 갖는 단백질을 모집할 수 있다. 활성화 도메인을 함유하는 ITAM이 결여된 예시적인 SAR은 CD16의 골격을 갖는 SAR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 실시형태에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 41BB, CD27, 2B4, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이의 조합으로부터 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 이에 제한되지 않으나, CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR-발현 이펙터 세포는 본원에 기재된 SAR 및 억제성 CAR을 포함한다. 한 실시형태에서, 억제성 CAR은 정상 세포 상에서 발견되지만 암 세포에서는 발견되지 않는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 억제성 CAR은 억제성 분자의 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PDl, PD-Ll, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타 중 임의의 하나의 세포내 도메인일 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 SAR 분자의 항원 결합 도메인은 (예를 들어, CD16SAR, NKp30SAR, NKp44SAR, NKp46SAR 또는 DAP10SAR 등) scFv를 포함하고 및 제2 SAR 분자(예를 들어, CD16 SAR, NKp30 SAR, NKp44 SAR, NKp46 SAR 또는 DAP10 SAR 등)의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다. 예를 들어, 제1 SAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 제2 SAR 분자의 항원 결합 도메인은 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원은 본원에 기재된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포), 및 PD1 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 CAR을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 inhKIR 세포질 도메인을 포함하는 억제 분자; 막관통 도메인, 예를 들어, KIR 막관통 도메인; 및 억제제 세포질 도메인, 예를 들어, ITIM 도메인, 예를 들어, inhKIR ITIM 도메인을 포함하는 억제성 분자를 추가로 포함한다.
본원은 또한 SAR 분자, SAR 분자를 발현하는 세포 또는 SAR 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 대상체는 본원에 기재된 장애, 예를 들어, 대상체는 본원에 기재된 표적 항원을 발현하는 암, 감염성 질환, 알레르기성 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는다. 또 하나의 실시형태에서, 대상체는 본원에 기재된 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 표적 항원을 발현하는 암, 감염성 질환, 알레르기성 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환의 위험이 증가된 위험을 갖는다. 한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 동물이다. 또 다른 한 실시형태에서, 대상체는 개와 같은 반려 동물이다.
한 실시형태에서, 본원은 이를 필요로 하는 대상에게 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 표적화된 X-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는 줄기 세포를 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 질환 관련 항원을 나타내고, 또한 여기서 상기 질환 유발 또는 질환 관련 세포가 상기 X 항원을 발현한다. 표 49는 상이한 항원 및 이들 항원을 표적으로 하는 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 사용하여 예방, 억제 또는 치료될 수 있는 예시적인 질환의 리스트를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본원은 본원에 기재된 X-표적화된 SAR (또는 X-표적화된 SAR)을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 암 세포는 항원 표적 "X"를 발현한다. 한 실시형태에서, X는 정상 세포 및 암 세포 둘 다에서 발현되지만, 정상 세포 상에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. 한 실시형태에서, 본원의 검정에 의해 결정된 바처럼, 상기 방법은 X-표적화된 SAR가X를 발현하지만 X를 발현하는 정상 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 미만을 발현하는 암 세포에 결합하여 사멸시킬 수 있도록 하는 친화도로 X에 결합하는 SAR를 선택하는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 글루크 방출 세포독성 검정은 예를 들어, 암 세포를 표적으로 하는 X-표적화된 SAR을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 선택된 SAR은 표적 항원에 대해 약 10-4 M 내지 10-8 M, 더욱 일반적으로 약 10-5 M 내지 10-7 M, 및 일반적으로 약 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 한 실시형태에서, 선택된 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 항체보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 미만의 결합 친화도를 가지며, 이로부터 SAR의 결합 도메인이 유도된다.
다른 실시형태에서, 본원은 본원에 기재된 이중특이성 SAR (또는 AxB-표적화된 SAR)을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 A 및 B는 SAR에 의해 표적화된 2개의 상이한 항원을 나타낸다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 CD22이고 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD19이고 항원 B는 CD20이고 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD19이고, 항원 B는 BCMA이고, 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD19이고, 항원 B는 CD38이고, 질환은 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 BCMA이고 항원 B는 CD38이고, 질환은 형질세포 장애 또는 원발성 삼출 림프종(PEL)이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 BCMA이고, 항원 B는 CS1/SLAMF7이고, 질환은 형질세포 장애 또는 원발성 삼출성 림프종 (PEL)이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD123이고 항원 B는 MPL이고, 상기 질환은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 장애 또는 골수섬유증이다. 한 실시형태에서, 항원 A는 CD123이고 항원 B는 CD33이고 질환은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 또는 골수증식성 장애이다. 한 실시형태에서, 항원 A 및 B 둘 모두는 혈액 세포 상에서 발현된다. 한 실시형태에서, 하나의 항원은 혈액 계통 세포 (예를 들어, 정상 B 세포 또는 림프종 세포) 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현되는 반면, 다른 항원은 비-혈액 세포 (예를 들어, 전립선암 세포) 상에서 우선적으로 또는 배타적으로 발현된다. 예시적인 실시형태에서, 항원 A는 PSMA이고 항원 B는 CD19이고 질환은 전립선암이다. 이러한 작제물에서 CD19의 표적화는 PSMA의 표적화와 함께 정상 B 세포 상에서 발현된 CD19의 표적화에 의해 SAR 세포에 증식성 신호를 제공하여 전립선암 세포의 사멸을 유도한다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는CD19xC20 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들어 낼 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 CD19 및 CD20을 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 CD19xC22 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들어 낼 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 CD19 및 CD22를 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 CD19xC22xCD20 삼중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들어 낼 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 세포 또는 질환 관련 세포는 CD19를 발현하고, CD22 및 CD20. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 급성 B 세포 백혈병, 만성 B 세포 백혈병, 또는 B 세포 림프종이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는BCMAxCD38 이중특이성 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들어 낼 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 BCMA 및 CD38을 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 형질모세포 장애(예를 들어, 형질세포 백혈병, 골수종)이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 CD5-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들어 낼 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 세포 또는 질환 관련 세포는 CD5를 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역성 갑상선염이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 TCRB1-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 세포 또는 질환 관련 세포는 TCRB1 (T 세포 수용체 베타1 사슬)을 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역성 갑상선염이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는TCRB2-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 TCRB2 (T 세포 수용체 베타2 SAR)를 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역성 갑상선염이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 T 세포 수용체 감마-델타-SIR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 질환 유발 세포 또는 질환 관련 세포는 T 세포 수용체 감마-델타를 발현한다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방하고자 하는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 한 실시형태에서, 치료 또는 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역성 갑상선염이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 CD4-DC-SIGN을 암호화하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 치료되거나 예방될 질환은 HIV1/AIDS이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 자가항원 또는 이의 단편을 암호화하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 자가면역 질환은 진성 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 부신생물성 천포창, 사구체신염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 크론병이다. 한 측면에서, 질환은 심상성 천포창이고, SAR의 항원 결합 도메인은 데스모글린 3 (Dsg3)의 세포외 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원은 SAR을 포함하는 자연 발생 수용체에 결합하고, 또한 질환 관련 세포에서 발현되는 항원에 결합하는 하나 이상의 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율적 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저 또는 BiTE, 이중특이성 킬러 인게이저 또는 BiKE, 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저또는 TriKE 등)와 함께, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T또는 NK세포) 또는 자연 발생 수용체세포(예를 들어, CD16, CD64, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 등)의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터를 만들 수 있는 줄기 세포를 제공함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR은 Fc 수용체 (예를 들어, CD16 또는 CD69 등)의 세포외 도메인을 포함하고SAR-발현 세포는 Fc 수용체에 결합하는 하나 이상의 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 단편 또는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인)와 함께 투여된다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 자연 발생 수용체 (예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D 또는 NKG2C)의 세포외 도메인을 포함하고, SAR-발현 세포는 자연 발생 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 하나 이상의 작용제 (예를 들어, BiKE, TRiKE, BiTE)와 함께 투여된다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 NKp46의 세포외 도메인을 포함하고, CD19-발현 세포를 표적화하도록 NKp46 및 CD19에 결합하는 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE) 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)와 함께 투여된다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 NKp46의 세포외 도메인을 포함하고, 메조텔린-발현 세포를 표적화하기 위해 NKp46 및 메조텔린에 결합하는 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE)와 함께 투여된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
한 측면에서, 작용제 (예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)는 SAR 세포를 대상체에게 투여하기 전에 생체 외에서 SAR 발현 세포에 결합한다. 한 측면에서, 작용제 (예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)는 생체내에서 투여된다. 한 측면에서, 작용제 (예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)는 SAR 발현 세포의 주입 전, 동시에 또는 주입 후에 투여된다. 한 측면에서, 작용제의 단일 투여량이 투여되는 반면, 다른 측면에서는 작용제(예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)의 다중 투여량이 투여된다. 한 측면에서, 다수의 유형의 작용제가 투여된다. 한 측면에서, 작용제 (예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)는 단일 항원을 표적으로 한다. 한 측면에서, 하나 이상의 작용제 (예를 들어, 항체, BiKE, TRiKE 또는 이의 단편)는 다중 항원을 표적으로 한다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 NKp44의 세포외 도메인을 포함하고, SAR 발현 세포는 CD19-발현 세포를 표적화하도록 NKp46 및 CD19에 결합하는 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE) 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)와 함께 투여된다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 NKp44의 세포외 도메인을 포함하고, SAR 발현 세포는 CD19-발현 종양 세포를 표적화하고 사멸시키도록 종양 세포 상의 SAR-발현 이펙터 세포 및 CD19 상의 NKp46 및 공동-자극 수용체 (예를 들어, CD28 또는 4-1BB)에 결합하는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)와 함께 투여된다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 NKp46 및 CD16 둘 다의 세포외 도메인을 포함하고, SAR 발현 세포는 증가된 효능으로 메조텔린-발현 세포를 표적화하기 위해 NKp46, CD16 및 메조텔린에 결합하는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)와 함께 투여된다. 예시적인 BiKE 및 TRiKE는 문헌 [Gauthier L et al, CELL, (2019), 117, 1701]에 기재되어 있다. 다른 BiKE 및 TRiKE는 당업계에 공지되어 있으며, 본원의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 질환 관련 세포에서 발현되는 SAR및 항원의 CD16도메인에 결합하는 항체 또는 항체 단편과 함께 면역 이펙터 세포(예를 들어, T또는 NK세포) 또는CD16 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이 단편을 암호화하는 범용SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 또는 면역글로불린 결합 수용체(예를 들어, CD16, CD64 등)또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이 단편을 암호화하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. SAR-발현 면역 이펙터 세포는 SAR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 항체는 SAR 세포를 대상체에게 투여하기 전에 생체외에서 SAR 발현 세포에 결합한다. 한 측면에서, 항체는 생체내에서 투여된다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 SAR-발현 세포의 주입 전, 동시에 또는 주입 후에 투여된다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편의 다중 투여량이 투여된다. 한 측면에서, 다수의 유형의 항체 또는 항체 단편이 투여된다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 단일 항원을 표적으로 한다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 다수의 항원을 표적으로 한다. 예시적인 항체는 리툭시맙, 허셉틴, 에르비트룩스 등이다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포) 또는 본원에 기재된 신호전달 사슬(예를 들어, 서열번호: 3914-3958)에 접합된 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이체 단편 및 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, vL, vH, 또는 비면역글로불린 항원 결합 도메인, BiTE, BiKE, TRiKE)을 모두 암호화하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. SAR-발현 면역 이펙터 세포는 SAR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 질환 관련 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 SAR 세포를 대상체에게 투여하기 전에 생체 외에서 SAR 발현 세포에 결합한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 생체내에서 투여된다. 한 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 SAR-발현 세포의 주입 전, 동시에 또는 주입 후에 투여된다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인의 다중 투여량이 투여된다. 한 측면에서, 다수의 유형의 항원 결합 도메인이 투여된다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 단일 항원을 표적으로 한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 다수의 항원을 표적으로 한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 및/또는 대식세포 등) 또는 질환 관련 세포 상에서 발현되는 상기의 수용체 및 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 또는 항체 단편에 따라 면역글로불린 수용체 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이 단편을 암호화하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T, NK 세포 및/또는 대식세포) 또는 T 세포 수용체 불변 사슬에 접합된CD16또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이체(예를 들어, F158V 돌연변이체)단편을 암호화하는 범용SAR 또는 T 세포 수용체 불변 사슬에 접합된 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, vL, vH, 또는 비면역글로불린 항원 결합 도메인)을 암호화하는 범용SAR을 모두를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. SAR-발현 면역 이펙터 세포는 SAR의 CD16 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원과 함께 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다. 한 실시형태에서, 항체는 생체내에서 투여된다. 한 실시형태에서, 항체는 생체 외에서 CD16-SAR 세포에 결합한다. 실시형태에서, 항체의 다중 주입이 투여된다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, NK 또는 T 세포) 또는 질환 관련 세포 상에서 발현되는 SAR 및 하나 이상의 항체 또는 항체 단편의 CD16도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편에 따라 CD16 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이체 단편 (예를 들어, F158V 돌연변이)을 암호화하는 범용 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 NKG2D 수용체 또는 이의 결실- 또는 점-돌연변이체 단편(예를 들어, 서열번호 3407 및 3435)를 암호화하는 SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, NK 또는 T 세포)를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 NKG2D 변이체는 NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF (서열번호 3407)이다. 한 실시형태에서, 상기 NKG2D 변이체는 NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA (서열번호 3435)이다. 한 실시형태에서, 대상체는 ULBP2R과 융합되는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)을 포함하는 단백질과 함께 NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AF (서열번호3407)를 발현하는 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 투여한다. ULBP2R과의 융합하는 BCMA-93-FHVH를 포함하는 예시적인 단백질은 서열번호 5431에 제시되어 있다. 다른 실시형태에서, 대상체는 ULBP2-S3와 융합되는 항원 결합 도메인 (예를 들어, scFv, vHH, FHVH 등)을 포함하는 단백질과 함께 NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA (서열번호 3435)를 발현하는 SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 투여한다. ULBPP2-S3과의 융합체로 BCMA-93-FHVH를 포함하는 예시적인 단백질은 서열번호 5432로 제시된다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, NK 또는 T 세포) 또는 CD20-TARGETED-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 상기 질환은 면역 또는 알레르기성 질환이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, NK 또는 T 세포)또는 CD22-TARGETED-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 상기 질환은 면역 또는 알레르기성 질환이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 FITC-표지된 항체 또는 항체 단편 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비면역글로불린 스캐폴드와 함께 FITC-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포 또는 B 세포 또는 T 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 질환 관련 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하는 또는 비오틴-표지된 항체 또는 항체 단편 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비면역글로불린 스캐폴드와 함께 아비딘-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포) 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 스트렙태그를 포함하는 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비면역글로불린 스캐폴드와 함께 스트렙태그-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 만들 수 있는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 또는 형질 세포이다.
다른 실시형태에서, 본원은 IgE-SAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)를 이를 필요로 하는 대상에게 제공함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이의 항원 결합 도메인은 IgE에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, 상기 질환은 면역 또는 알레르기성 질환이다.
다른 실시형태에서, 본원은 암성 종양의 성장이 억제되도록 PD1-SAR (즉, 이의 항원 결합 도메인으로서 PD1의 세포외 도메인을 함유하는 SAR)을 사용하여 생체내에서 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. PD1-SAR은 암성 종양의 성장을 억제하기 위해 단독으로 사용할 수 있다. 대안적으로, PD1-SAR은 다른 SAR, CAR, 면역원성제, 표준 암 치료제, 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 대상체는 본원에 기재된 PD1-SAR 및 X-SAR로 치료된다. 다른 실시형태에서, PD1-SAR은 본원에 기재된 다른 SAR 또는 CAR, 예를 들어, SAR 또는 CAR, 및 키나제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 키나제 억제제와 함께 사용된다.
다른 실시형태에서, 본원은 암성 종양의 성장이 억제되도록 X-SAR 및 PD1-CAR 또는 CTL4-CAR을 사용하여 생체내에서 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 대상체는 본원에 기술된 PD1-CAR 또는 CTLA4-CAR 및 X-SAR로 치료된다.
면역계의 특정 세포는 특정 표적 세포에 대한 세포 독성 활성을 나타낸다. 세포독성 T-림프구는 MHC 클래스 I 분자에 결합된 항원 유래 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포 수용체(TcR)를 발현한다. 대조적으로, 자연 살해(NK) 세포는 MHC 제한이 없으며 사멸 효과를 발휘하기 위해 MHC 분자에 의한 항원 제시가 필요하지 않다. 그들은 펩타이드가 로딩된 MHC가 없을 때 스트레스를 받은 세포를 인식하고 MHC가 없는 세포를 죽일 수 있다. 따라서 NK 세포는 선천성 면역에 중요한 역할을 하는데, 이러한 "비MHC(non-MHC)" 세포는 다른 면역 세포에 의해 검출 및 파괴되지 않기 때문이다.
NK 세포('거대 과립 림프구'라고도 함)는 일반적인 림프 전구체(B 림프구 및 T 림프구도 생성함)에서 분화된 세포 계통을 나타낸다. T 세포와 달리 NK 세포는 원형질막에서 자연적으로 CD3를 구성하지 않는다. 중요하게도, NK 세포는 TCR을 발현하지 않으며 일반적으로 다른 항원 특이적 세포 표면 수용체(TCR 및 CD3뿐만 아니라)부족하며, 면역글로불린 B 세포 수용체도 발현하지 않고 대신 일반적으로 CD16 및 CD56을 발현한다. 따라서 NK 세포는 CD3-, CD56+ 표현형에 의해 분화된다. NK 세포의 세포독성 활성은 감작을 필요로 하지 않지만 IL-2를 포함한 다양한 사이토카인에 의한 활성화에 의해 강화된다. NK 세포는 일반적으로 항원 수용체 매개 신호전달에 필요한 적절하거나 완전한 신호전달 경로가 부족한 것으로 생각되며, 따라서 항원 수용체 의존성 신호전달, 활성화 및 확장이 가능한 것으로 생각되지 않는다.
암 치료를 위한 다수의 T 세포 기반 치료법이 개발되었다. TCR 기반 세포 치료 접근법은 일부 연구에서 가능성을 보였지만 MHC 제한의 단점, 즉 사용된 TCR이 환자의 면역 유형과 일치해야 한다는 단점이 있다. TCR과 달리 CAR은 수신자와 MHC 매칭할 필요가 없다. 그러나, CAR에 적합한 표적으로서 사용될 수 있는 암-특이적 표면 항원은 지금까지 거의 확인되지 않았으며, 따라서 암 치료에서 CAR의 사용은 현재 제한되어 있다. TCR 또는 CAR을 사용한 T 세포의 변형을 포함하는 모든 입양 세포 치료 접근법은 환자 또는 조직 유형 일치 기증자로부터 T 세포의 분리 및 변형을 필요로 하며, 이는 절차의 제조 및 비용에 필요한 시간을 증가시킨다. ACT의 상기 한계를 극복하기 위한 대안적 방법은 예를 들어 WO 98/49268에 기재된 바와 같이 세포독성 NK 세포를 이용한다. 그러나 NK 세포는 CD3ε, γ, δ 사슬의 발현이 부족하고 원래 상태에서 TCR을 발현하지 않는다. 이소성 CD3ε, γ, δ 및 ζ사슬을 발현하도록 조작된 NK92 세포주는 TCR 발현을 지원하는 것으로 나타났다. 그러나 이 방법은 번거롭다.
본원은 범용 TCR(또는 uTCR-SAR)로 지정된 새로운 TCR을 제공한다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 발현을 위해 CD3 사슬에 의존하지 않고, 임의의 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시형태에서, uTCR-SAR은 2개의 사슬을 소유한다는 점에서 생리학적 TCR과 유사하다. 한 실시형태에서, uTCR의 항원 결합 도메인은 TCR로부터 유래된 가변 도메인(Va/Vα 및 Vb/Vβ 또는 Vg/Vγ 및 Vd/Vδ)을 포함한다. 한 실시형태에서, uTCR은 완전한 TCR 불변 사슬이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, uTCR의 하나 또는 두 사슬 모두는 TCR 불변 사슬의 막관통 및/또는 세포질 도메인이 결여되어 있다. 한 실시형태에서, uTCR의 하나 또는 두 사슬 모두에는 TCR 불변 사슬의 힌지, 막관통 및/또는 세포질 도메인이 결여되어 있다.
본원은 NK 세포에 기초한 암 특이적 킬러 세포를 보편적인 용도로 제공하는 것을 목표로 하며, 이는 현재 T 세포 기반 요법에 요구되는 바와 같이, 세포가 치료될 대상체의 면역 유형과 일치할 필요는 없지만, 그럼에도 불구하고 필요에 따라 대상체의 특정 면역 및 암 유형에 맞춰질 수 있음을 의미한다. 따라서, 보편적인 킬러 세포는 개인화된 의학을 위해 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 대상체는 본원의 SAR을 발현하는 상이한 세포를 투여 받는다. 한 실시형태에서, SAR은 SAR 발현 세포의 다수의 상이한 계통 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등)으로 분화되는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 iPSC)에서 발현된다. 천연 T 세포 수용체 및 여러 차세대 CAR 플랫폼(예: SIR, Ab-TCR, HIT 또는 TFP 등)은 T 세포에서만 기능적으로 발현될 수 있다. 본원의 uTCR-SAR의 장점은 모든 세포 유형에서 발현될 수 있다는 것이다. 한 실시형태에서, SAR (예를 들어, uTCR-SAR)은 uTCR-SAR 발현 세포의 다수의 상이한 계통 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등)으로 생체 외에서 분화되는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 iPSC)에서 발현된다. 이어서, 대상체에게 SAR(예를 들어, uTCR-SAR) 발현 세포의 집단을 투여한다. 대안적인 실시형태에서, SAR (예를 들어, uTCR-SAR)은 조혈 줄기 세포에서 발현되고, 이어서 대상체에게 투여된다. SAR 발현 조혈 줄기 세포는 생체 내에서 SAR 발현 면역 세포의 여러 계통(예: T 세포, NK 세포, 대식세포, 과립구, 수지상 세포 등)으로 분화한다.
본원은 또한 SIR, cTCR, Ab-TCR, TFPαβ 및 TFPγδ와 같은 차세대 키메라 수용체가 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 및 호중구에서 불량하거나 무시할 수 있는 발현을 나타낸다는 것을 제공한다. 본원은 NK 세포, NK 세포주 (예를 들어, NK92 및 이의 유도체), 단핵구/대식세포, 단핵구 세포주, 및 호중구에서 SIR, cTCR, Ab-TCR, TFPαβ 및 TFPγδ를 발현시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 및 호중구에서 CD3 복합체의 하나 이상의 사슬의 이소성 발현을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 상기 방법은 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 및 호중구를 생성하도록 분화할 수 있는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC, 배아 줄기 세포, 만능 줄기 세포 등)에서 CD3 복합체의 하나 이상의 사슬의 이소성 발현을 포함한다. 한 실시형태에서, NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호중구 및 줄기 세포에서 이소성적으로 발현될 수 있는 CD3 복합체의 사슬은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ를 포함한다. SIR, cTCR, Ab-TCR, TFPαβ 및 TFPγδ의 기능적 발현을 촉진하기 위해 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호중구 및 줄기 세포에서 이소성적으로 발현될 수 있는 예시적인 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ 사슬의 서열번호가 상기 임시 출원의 표 18에 제공된다. 한 실시형태에서, CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ 사슬은 SIR, cTCR, Ab-TCR, TFPαβ 및 TFPγδ의 기능적 발현을 촉진하기 위해 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호중구 및 줄기 세포에서 이소성으로 발현된다. 대안적인 실시형태에서, CD3ε, CD3γ, 및 CD3δ 사슬은 SIR, cTCR, Ab-TCR, TFPαβ 및 TFPγδ의 기능적 발현을 촉진하기 위해 NK 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포 및 호중구 세포에서 이소성적으로 발현된다. 한 실시형태에서, CD3 복합체의 하나 이상의 사슬은 단일 벡터를 사용하여 발현된다. 예시적인 벡터는 서열번호 1331 및 1332로 표시된다. 대안적인 실시형태에서, CD3 복합체의 하나 이상의 사슬은 하나 이상의 벡터를 사용하여 발현된다.
일부 측면에서, SAR 발현 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포, 줄기 세포 또는 iPSC 등)는 상이한 CAR-변형된 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT, g-NK, CIK 세포, 대식세포, 수지상 세포, 과립구, 줄기 세포, iPSC 등)의 생성을 위해 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 입양 세포치료제 제품의 제조 및 투여를 위한 당업계에 공지된 기술은 SAR-암호화 벡터의 생성, SAR-암호화 벡터에 의한 유전자 변형을 위한 상이한 세포 유형의 수확, 분리 및 배양, SAR-발현 세포의 확장, 저장, 수송, 해동, 효능 검정, 무균 시험 및 투여를 위해 사용될 수 있다.
SAR은 생체 외 및/또는 생체 내로 표적 세포(예: T 세포, NK 세포, 조혈 세포 등)에 도입될 수 있다. SAR 발현 이펙터 세포는 대상체에게 투여하기 전에 생체 외에서 확장될 수 있다. 한 실시형태에서, SAR 발현 이펙터 세포는 대상체에게 투여하기 전에 2-30일의 기간 동안 생체 외에서 확장될 수 있다. 본원은 SAR-발현 세포가 무확장 프로토콜(expansion-free protocol)을 사용하여 제조될 수 있음을 제공한다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 1일 또는 2일의 기간에 걸쳐 제조된다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 15일, 21일 또는 30일 미만의 기간에 걸쳐 제조된다. SAR 발현 이펙터 세포는 저장을 위해 냉동 보존된 후 투여 전에 해동될 수 있다.
본원의 다른 측면에서, SAR 또는 본원에 따른 SAR을 포함하는 단리된 세포 또는 세포 집단 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본원의 유전자 변형 세포 또는 약학 조성물은 비경구 투여를 포함하는 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 비강내, 직장내, 방광내, 피내, 국소 또는 피하 투여를 포함한다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있다.
SAR 발현 면역 세포는 세포의 절대 수에 의해 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체에게 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사, 예를 들어, 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 1 x l08, 1 x l07, 5 x 107, 1 x 106, 5 x l06, 1 x l05, 5 x l05, 1 x l04, (등) 주입당 SAR 세포, 또는 임의의 두 숫자 사이의 임의의 범위, 종점 포함하여 투여할 수 있다.다른 실시형태에서, SAR 발현 세포는 상대적인 세포 수에 의해 이러한 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램 당 약 1000 세포 내지 약 100억 세포까지, 예를 들어 1 x l08, 1 x 107, 5 x 107, 1 x l06, 5 x 106, 1 x 105, 5 x l05, 1 x 104세포는 개체의 킬로그램 당 또는 임의의 두 숫자 사이의 임의의 범위, 종점을 포함한다. SAR 세포는 또한 다수의 SAR 세포와 상기 환자에서 종양의 크기 사이의 대략적인 비에 따라 이러한 환자에게 투여될 수 있다. 종양의 크기는 통상적인 영상화 방법, 예컨대 X선, 초음파 영상화 등에 의해 결정되거나 추정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 총 선량은m2 당 1 x 108, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 106을 포함하는 체표면적의 m2로 계산될 수 있다. 평균 사람은 1.6-1.8 m2이다.
SAR 발현 면역 세포(예를 들어, NK92 세포주)는 투여 전에 조사될 수 있다. SAR 발현 면역 세포는 대상체에게 투여하기 전에 이들을 복제-무능하게 만드는 작용제 (예를 들어, 미토마이신-C(Mitomycin-C))로 치료될 수 있다.
SAR-발현 세포, 및 선택적으로 다른 항종양제는 환자에게 1회 투여될 수 있거나, 또는 여러 번 투여될 수 있으며, 예를 들어, 치료동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다 1회, 또는1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 주마다 또는 숫자 중 임의의 두 가지 사이의 범위, 종점을 포함한다.
SAR 발현 세포는 당업계에 공지된 다양한 경로, 예를 들어 정맥내, 복강내, 흉막내, 척수강내, 뇌실내, 피피내, 종양내, 병변내, 간내 경로 등으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, SAR-발현 세포는 종래의 요법, 예컨대 화학요법, 방사선요법, 생물학적 요법, 항체 요법 또는 호르몬 요법을 포함하는 다른 요법과 조합하여 투여된다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 대상체가 림프구 고갈 화학요법을 받은 후에 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 대상체가 림프구 고갈 및 골수 고갈 화학요법 둘 다를 받은 후에 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, SAR 발현 세포는 대상체가 에토포시드를 포함하는 화학요법을 받은 후에 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, SAR-발현 세포는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 작용제와 함께 투여된다: 단백질 포스파타제 억제제, 키나제 억제제(예를 들어, src 키나제 억제제), SAR-발현 이펙터 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원 및 표적 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 항원에 결합하는 작용제 (예를 들어, 항체, 항체 단편, BiTE, BiKE, TRiKE 등); 사이토카인(예를 들어, IL2, IL15 등); 면역 억제 분자의 억제제 (예를 들어, PD1 또는 PDL1 억제제); TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 작용제 (예를 들어, 라파마이신(rapamycin)); SAR-변형된 세포(예를 들어, IL2, IL15, IL18, IL21 등)의 증식 및/또는 지속성을 증가시키는 작용제; 케모카인(chemokine); SAR의 발현을 증가시키는 작용제; SAR의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작용제; SAR-변형된 세포의 생존 및/또는 지속성을 제어할 수 있는 작용제; SAR 변형 세포(예: 토실리주맙(Tocilizumab), 아나킨라(Anakinra), 스테로이드(steroid), 다사티닙(dasatinib), 이브루티닙(ibrutinib) 등)의 부작용을 조절하는 작용제); Brd4 억제제; 질환의 부위에 치료제 또는 예방제를 전달하는 작용제; SAR이 지시되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제 (예를 들어, BCMA 표적 SAR과 함께 사용되는 경우 γ 세크레타제 억제제); SAR과 함께 발현되는 다목적 스위치에 결합하는 작용제(예: 리툭시맙, 허셉틴 또는 ); 면역 공격으로부터 동종이계 SAR 세포를 보호하는 작용제(예: CD52 항체) 및 아데노신 A2a 수용체 길항제.
한 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 SAR 분자를 발현하는 세포를 SAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 작용제는 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, 또는 이들의 조합이다. 사이토카인은 예를 들어, SAR-발현 세포의 투여와 동시에 또는 직후에 조합하여 전달될 수 있다. 대안적으로, 사이토카인은 SAR-발현 세포의 투여 후 연장된 기간 후에, 예를 들어, SAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 사이토카인은 청구항143항 내지 제161항 중 세포의, 세포 또는 세포 집단의 투여와 동시에 (예를 들어, 동일일에 투여) 또는 투여 직후에 (예를 들어, 투여 직후) (예를 들어, 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일째에 투여되는) 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 세포 또는 세포 집단의 투여 후 연장된 기간 (예를 들어, 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주 또는 그 이상) 후에, 또는 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 대상체에게 투여된다.
본원은 본원의 SAR의 활성을 제어할 수 있는 Src 억제제 (예를 들어, Lck 억제제, 예를 들어, 다사티닙(Dasatinib), 포나티닙(ponatinib) 등)를 제공한다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 CD3z, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 또는 NKG2D 등의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함하는 SAR의 활성을 조절할 수 있다. 한 실시형태에서, 본원은 본원의 신규한 SAR 발현 세포의 부작용을 치료하기 위해 투여될 수 있는 작용제가 Src 억제제 (예를 들어, Lck 억제제, 예를 들어, 다사티닙)임을 제공한다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 SAR-발현 세포의 활성을 조절하거나 종결시키기 위해 SAR-발현 세포의 투여 후에 환자에게 투여된다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 SAR-발현 세포에 의해 유발된 사이토카인 방출 증후군 (CRS)을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 SAR-발현 세포에 의해 유발된 신경학적 합병증을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 SAR 발현 세포로 인한 CRS 및 신경학적 합병증을 예방 및/또는 치료하기 위해 다른 작용제(예를 들어, 스테로이드, 토실리주맙, 아나킨라 등)와 조합하여 사용된다.
한 실시형태에서, 다사티닙은 적어도 10 mg/일, 20 mg/일, 40mg/일, 60mg/일, 70mg/일, 90 mg/일, 100mg/일, 140mg/일, 180mg/일, 210mg/일, 250mg/일 또는 280mg/일의 용량으로 경구 투여된다. 한 실시형태에서, 본원은 본원의 신규한 SAR 발현 세포의 부작용을 치료하기 위해 투여될 수 있는 작용제가 포나티닙(Ponatinib)임을 제공한다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 CAR-발현 세포의 활성을 조절하거나 종결시키기 위해 CAR-발현 세포의 투여 후에 환자에게 투여된다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 적어도 15 mg/일, 30 mg/일, 45mg/일, 60mg/일의 용량으로 경구 투여된다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 SAR-발현 세포에 의해 유발된 사이토카인 방출 증후군 (CRS)을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 SAR-발현 세포에 의해 유발되는 신경학적 합병증을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 SAR 발현 세포로 인한 CRS 및 신경학적 합병증을 예방 및/또는 치료하기 위해 다른 작용제(예를 들어, 스테로이드, 토실리주맙, 아나킨라 등)와 조합하여 사용된다.
한 실시형태에서, 본원은 티로신 키나제 억제제가 신규한 신호전달 도메인으로 본원의 SAR 발현 세포의 지속성을 연장시키기 위해 사용될 수 있음을 제공한다. 한 실시형태에서, 본원은 티로신 키나제 억제제가 SAR-발현 세포의 지속성을 신규한 신호전달 도메인으로 연장하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 SAR은 CD3z, CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 NKG2D 등의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원은 티로신 키나제 억제제가 SAR-발현 세포의 고갈을 지연/역전시키기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 SAR은 CD3z, CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 NKG2D 등의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 티로신 키나제 억제제는 Src 키나제 억제제이다. 한 실시형태에서, Src 키나제 억제제는 Lck 억제제이다. 한 실시형태에서, Lck 억제제는 다사티닙(Dasatinib) 또는 포나티닙(Ponatinib)이다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 본원의 SAR-발현 세포의 고갈을 방지/지연시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 CD3z, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 NKG2D 등의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 본 개시물의 SAR 발현 세포의 고갈을 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, SAR은 CD3z, CD16A, CD16B, NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 NKG2D 등의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 SAR-발현 세포를 간헐적으로 투여받은 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 대상체는 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙)의 다중 사이클을 받는다. 한 실시형태에서, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙 또는 포나티닙)를 사용한 치료는 본원의 SAR 발현 세포의 세포자멸사를 방지한다. 한 실시형태에서, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙 또는 포나티닙)는 PD1, TIM-3, 및 LAG-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 T 또는 NK 세포 고갈 마커의 발현을 감소시킨다. 한 실시형태에서, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙 또는 포나티닙)를 사용한 치료는 SAR-발현 세포 상에서 CD62L 또는 CCR7의 발현을 증가시킨다. 한 실시형태에서, 치료는 SAR 발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 적어도 부분적 기능을 회복시키기에 충분한 시간 동안 지속된다. 한 실시형태에서, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 다사티닙 또는 포나티닙)는 SAR-발현 세포를 연속적으로 투여받은 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 다사티닙은 약 10 mg/일 내지 240 mg/일의 투여량으로 투여된다 (예를 들어, 10mg/일, 20mg/일, 40mg/일, 50mg/일, 70mg/일, 80mg/일, 100mg/일, 110mg/일, 120mg/일, 140mg/일, 180mg/일, 210mg/일, 240mg/일 또는 300mg/일).
한 실시형태에서, 포나티닙은 본원의 SAR 발현 세포의 지속성을 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 본원의 SAR 발현 세포의 고갈을 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 SAR-발현 세포를 간헐적으로 투여받은 대상체에게 투여된다. 한 실시형태에서, 포나티닙은 SAR-발현 세포를 연속적으로 투여받은 대상체에게 투여된다.
본원의 조성물은 액체, 예를 들어, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 주사, 주입 (예를 들어, IV 주입) 또는 피하로 전달하는데 유용할 수 있다. 본원의 액체 조성물은, 이들이 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이든지 상관없이, 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 물, 식염수, 일반적으로 생리 식염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 고정 오일, 예컨대 합성 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 그리고 토닉 조절을 위한 작용제로서의 염화 나트륨 또는 덱스트로스. 조성물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 또는 다른 재료로 만들어진 다중 용량 약병에 포함될 수 있다.
특정 장애 또는 병태의 치료에 효과적/활성인 본원의 약제학적 조성물의 양은 장애 또는 병태의 성질에 의존할 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내 분석은 최적 투여량 범위를 식별하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 조성물에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 질환 또는 질환의 중증도에 따라 달라지며, 개업의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
본원의 조성물은 적절한 투여량이 얻어지도록 유효량의 본원의 결합 분자를 포함한다. 화합물의 정확한 투여량은 특정 제형, 적용 방식, 및 이의 특정 부위, 숙주 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이다. 연령, 체중, 성별, 식단, 투여 시간, 배설 속도, 숙주의 상태, 약물 조합, 반응 민감도 및 질병의 중증도와 같은 기타 요인을 고려해야 한다. 투여는 최대 허용 용량 내에서 연속적으로 또는 주기적으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 이 양은 조성물의 중량 기준으로 본원의 결합 분자의 약 0.01% 이상이다.
본원의 일반적인 조성물은 비경구 투여 단위가 본원의 결합 분자의 중량의 약 0.01% 내지 약 2%를 함유하도록 제조된다.
정맥내 투여의 경우, 조성물은 동물 체중의 약 전형적으로 약 0.1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 일반적으로 동물 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 및 더욱 일반적으로는 동물 체중의 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg을 포함할 수 있다.
본 조성물은 적합한 담체, 예컨대 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 또는 사용하기에 적합한 임의의 다른 형태의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 다른 예는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다.
약학 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법론을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물은 용액을 형성하도록 개시물의 결합 분자를 물과 조합해서 제조될 수 있다. 계면활성제는 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위해 첨가될 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 다른 치료제, 예를 들어 항암제, 화학요법 약물, 수술 또는 방사선과 함께 투여될 수 있다.
한 실시형태에서, 암은 혈액학적 암 또는 악성 종양 또는 고형 종양으로부터 선택된다. 일 한 실시형태에서, 암은 전이성이다. 한 실시형태에서 암은 임의의 기관 또는 조직의 임의의 암이다. 본원의 SAR에 의해 표적화된 예시적인 질환 및 항원이 표 49에 제시되어 있다. 예시적인 실시형태에서, SAR은 BCMA 및 CD38을 표적으로 하는 데 사용되고, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD38에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 다른 예시적인 실시형태에서, SAR은 BCMA 및 CD22를 표적으로 삼기 위해 사용되고, 림프성 장애 및 형질 세포 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출성 림프종 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 CD19, CD22, BCMA 및 CD20을 표적으로 하는 데 사용되고, 형질 세포, 림프성 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19, CD22, BCMA 및 CD20에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, SAR은 PSMA 및 CD19를 표적으로 하고 전립선암을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD19 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하기 위해 사용된다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR은 임의의 질환(예를 들어, 감염, 알레르기, 자가면역, 퇴행성 질환 등)을 치료하기 위해 사용된다.
한 실시형태에서, SAR은 BCMA 및 CD19를 표적으로 삼기 위해 사용되고, 림프성 장애 및 형질 세포 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 BCMA, CD38 및 CD22를 표적으로 하는 데 사용되고, 림프성, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 BCMA, CD38 및 CD19를 표적으로 삼기 위해 사용되고, 림프성, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 BCMA, CD38, CD22 및 CD19를 표적으로 삼기 위해 사용되고, 림프성, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 BCMA, CD38, CD22 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 BCMA, CD38, CD22, CD20 및 CD19를 표적으로 삼기 위해 사용되고, 림프성, 형질 세포 및 자가면역 장애, 예컨대 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병, 원발성 삼출 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B-ALL, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 BCMA, CD38, CD22, CD20 및 CD19에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 CD19 및 CD22를 표적으로 하는 데 사용되고, 림프종 및 자가면역 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 CD19 및 CD20을 표적으로 하는 데 사용되고, 림프종 및 자가면역 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 CD19, CD22 및 CD20을 표적으로 하는 데 사용되고, 림프종 및 자가면역 장애, 예컨대 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 CD19, CD20 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 PSMA를 표적으로 하고 전립선암을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 실시형태에서, SAR은 PSMA 및 CD22를 표적으로 하고 전립선암을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD22에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD22 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하기 위해 사용된다.
한 실시형태에서, SAR은 PSMA 및 CD20을 표적으로 하고 전립선암을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 CD20에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. CD20 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하기 위해 사용된다.
한 실시형태에서, SAR은 PSMA 및 BCMA를 표적으로 하고 전립선암을 치료하기 위해 사용된다. 이러한 SAR은 본원에 기재된 바와 같이 PSMA 및 BCMA에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함한다. BCMA 특이적 항원 결합 도메인은 주로 SAR의 활성화, 증식 및 확장을 자극하기 위해 사용된다.
한 실시형태에서, 본원의 SAR 또는 SAR을 포함하는 세포는 기존의 요법 또는 치료제, 예를 들어 항암 요법과 조합하여 사용된다. 따라서, 다른 측면에서, 본원은 또한 SAR-T 또는 SAR-NK 및/또는 SAR-대식세포 또는 본원의 약제학적 조성물의 투여와 항암 요법을 포함하는 병용 요법에 관한 것이다. 상기 항암 요법은 치료제 또는 방사선 요법을 포함할 수 있으며, 유전자 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 골수 이식, 나노 요법, 표적 항암 요법 또는 종양 용해제를 포함한다. 다른 치료제의 예로는 다른 체크포인트 억제제, 항신생물제, 면역원성제, 약독화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포, 예를 들어 종양 유래 항원 또는 핵산으로 펄싱된 수지상 세포, 면역 자극 사이토카인 (예를 들어, IL-2, IFNa2, GM-CSF), 표적화된 소분자 및 생물학적 분자 (예를 들어, 신호전달 경로의 성분, 티로신 키나제의 조절제 및 수용체 티로신 키나제의 억제제, 및 EGFR 길항제를 비롯한 종양 특이적 항원에 결합하는 작용제), 항염증제, 세포독성제, 방사선독성제, 또는 면역억제제 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포 (예를 들어, GM-CSF), 화학요법을 포함한다. 한 실시형태에서, 본원의 SAR-T 또는 SAR-NK 및/또는 SAR-T 및/또는 SAR-대식세포 제약 조성물은 수술과 조합하여 사용된다. 본원의 SAR-T 또는 SAR-NK 약학 조성물은 다른 요법과 동시에 또는 상이한 시간에, 예를 들어, 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
면역 세포(예: NK, T 세포 등) 생존 및 이에 따른 세포독성은 사이토카인 지원을 필요로 한다. 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-2의 발현은 비분비성, 막 결합 형태로 NK 및 T 세포 성장을 유지하고 세포 독성을 개선하는 것으로 알려져 있다.
본원은 IL-2 및/또는 IL-15의 저친화성 변이체의 전부 또는 기능적 부분을 발현하는 면역 세포를 생산하는 방법을 제공한다. IL-2 및/또는 IL-15의 전부 또는 일부는 막-결합 폴리펩티드, 분비된 폴리펩티드 또는 이들의 조합으로서 발현될 수 있다. 상기 방법은 IL-2 또는 IL-15의 저친화성 변이체의 전부 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 핵산을 하나 이상의 면역 세포 (예를 들어, NK 세포) 내로 도입하는 것을 포함한다. 한 측면에서, IL-2 또는 IL-15의 저친화성 변이체의 전부 또는 기능적 부분을 암호화하는 핵산은 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 연결(예를 들어, 융합)된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, IL-2 또는 IL-15 변이체의 전부 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 핵산이 면역 세포 (예를 들어 NK 세포) 내로 도입된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, IL-2 또는 IL-15 변이체의 전부 또는 기능적 부분 및 IL-2 또는 IL-15 변이체의 전부 또는 기능적 부분을 암호화하는 핵산이 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합되어 면역 세포에 도입되는 측면에서, 이러한 핵산을 면역 세포(예를 들어, NK 세포)로 도입하는 것은, 단일 핵산 또는 다중(예를 들어, 분리; 2개) 핵산을 사용하여 수행될 수 있다. NK 또는 T 세포는 IL-15 또는 IL-2의 전부 또는 기능적 부분이 막-결합 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 발현되는 조건 하에서 유지되어, 막-결합 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 IL-15 또는 IL-2의 전부 또는 기능적 부분을 발현하는 NK 또는 T 세포를 생성한다. 특정 측면에서, IL-15 또는 IL-2의 전부 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 핵산은 CD8a의 신호 펩티드에 융합되고, CD8a의 막관통 도메인의 전부 또는 일부가 NK 세포 내로 도입된다.
또 다른 측면에서, 본원은 NK 세포의 확장 및/또는 생존을 향상시키는 방법에 관한 것이다(예를 들어, 시험관내, 생체외, 및/또는 생체내). 상기 방법은 IL-15 또는 IL-2의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. IL-15의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 (예를 들어, 야생형 IL-15) 및/또는 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 IL-15의 전부 또는 기능적 부분을 암호화하는 핵산을 NK 세포 내로 도입할 수 있다. 따라서, NK 세포는 IL-15의 전부 또는 기능적 부분을 세포막 결합 폴리펩티드, 분비 폴리펩티드 또는 이들의 조합으로 발현할 수 있다. NK 세포는 IL-15의 전부 또는 일부가 막결합 폴리펩티드, 분비된 폴리펩티드 또는 이들의 조합으로 발현되고 NK 세포가 증식하는 조건에서 유지된다. 특정 측면에서, IL-15의 전부 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 핵산은 CD8a의 신호 펩티드에 융합되고 CD8a의 막관통 도메인의 전부 또는 일부가 NK 세포 내로 도입된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 막-결합된 IL-15 및/또는 분비된 IL-15를 포함하는 NK 세포를 IL-2와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, IL-2의 농도는 약 10 IU/ml 내지 약 l000 IU/ml이다. 다른 측면에서, IL-2의 농도는 약 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980 IU/ml이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 핵산을 도입하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다.
또한 당업자에게 명백한 것은 (i) IL-15의 전부 또는 기능적 부분이 막-결합 폴리펩티드로 및/또는 분비된 폴리펩티드로 발현되고/되거나 (ii) 막-결합된 IL-15 및/또는 분비된 IL-15를 포함하는 NK 세포가 증식하는 조건하에서 면역 세포(예를 들어 NK 세포)를 유지하는 다양한 방법이 사용될 수 있다는 것이다. 상기 방법은 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 하나 이상의 NK 세포를 단리 또는 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 또한, 상기 방법은 하나 이상의 NK 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, NK 세포주가 생산된다.
본원은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 (하나 이상의) 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주, 및 본원에 제공된 NK 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 측면에서, 조성물은 본원에서 제공되는 하나 이상의 NK 세포 또는 세포주를 포함하는 약학 조성물이다. 약학 조성물은 IL-2의 전부 또는 기능성 부분 (예를 들어, (하나 이상의) IL-2 단백질의 전부 또는 기능성 부분; IL-2의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산)을 추가로 포함할 수 있다.
본원은 IL2 및/또는 IL15 신호전달을 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, NK-T 세포)에 제공하는데 사용될 수 있는 IL2 및 IL15의 막 고정 형태 및 이들의 저친화성 변이체 (표 43)를 제공하며, 이는 본원의 SAR를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, 서열 8428)를 포함한다. 대표적인 저친화성 IL2 변이체의 서열번호: 7834-7837로 제공된다. 대표적인 저친화성 IL15 변이체의 서열번호 7839-7841로 제공된다. 막 고정된 IL2 및/또는 IL15의 저친화성 변이체는 변이체가 발현되는 세포에 선택적으로 생존 신호를 제공하고, 이웃 세포에서 IL2 및/또는 IL15 신호전달을 자극하지 않는 이점을 갖는다. 따라서, 막 고정된 IL2 및/또는 IL15의 낮은 친화성 변이체는 개선된 치료 지수의 이점을 갖는다. 차세대 SAR 구조의 기술적 과제는 검출, 분리, 정제 또는 고갈을 위한 쉬운 방법이 없다는 것이다. SAR 구축물 상의 에피토프 태그의 첨가가 기술되었지만, 이의 표적 항원에 대한 SAR 결합 및/또는 비표적 신호전달을 방해하는 문제를 겪는다. 출원인은 에피토프 태그가 이들의 결합 및 신호전달 활성을 방해하지 않으면서 사이토카인(예를 들어, IL2 및 1L15)의 막 고정 형태에 첨가될 수 있다는 것을 발견하였다. 본원은 IL2 및 IL15의 막 고정 형태 및 이들의 저친화성 변이체를 제공하며, 또한 SAR 발현 세포를 포함하여 이를 발현하는 세포의 검출, 단리, 정제 및/또는 고갈에 사용할 수 있는 하나 이상의 에피토프 태그 (예를 들어, 세툭시맙 미모토페, 리툭시맙 태그, 허셉틴 미모토페, MYC 태그, 스트렙태그II 등)를 포함한다. 예시적인 에피토프 태그는 PCT/US2021/022641의 표 37을 포함하는 문헌에 공지되어 있으며, 이는 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 이러한 에피토프 태그는 PCT/US2021/022641에 기재된 방법을 사용하여 면역 세포(예: SAR 발현 NK 또는 T 세포)의 검출, 분리, 정제 및/또는 고갈에 사용할 수 있다.
입양 면역 요법의 효능 증가는 CRS, 신경독성, 이식편대숙주병(GvHD), 림프증식 및 삽입 돌연변이 유발과 같은 심각한 단기 및 장기 부작용의 보고와 관련이 있다. 조작된 T 세포는 투여 후 수년 동안 확장 및 지속될 수 있기 때문에 독성에 직면하여 입양적으로 주입된 T 세포의 선택적 결실을 허용하는 안전 메커니즘을 포함하는 것이 바람직하다. 자살 유전자는 생체 내에서 형질 도입된 세포의 선택적 결실을 가능하게 한다. HSV-TK와 iCasp9의 두 가지 자살 유전자가 임상 테스트 중이다.
입양 세포 치료의 효율을 극대화하기 위해서는, 형질도입 효율을 모니터링하고 형질 도입된 세포를 선택하기 위한 메카니즘을 갖는 것이 바람직하다. 이어서, 형질 도입된 세포의 정제된 집단을 환자에게 투여할 수 있다.
차세대 CAR 구축물(예: SIR, zSIR, Ab-TCR 등)의 발현을 포함한 일부 T 세포 조작 전략은 쉽게 검출할 수 있는 표면 단백질의 형질전환 발현을 초래하지 않을 수 있다. 이러한 경우 말초 혈액에서 세포의 형질 도입 및 추적의 측정이 어렵다. 또한, 일부 환경에서, 예를 들어 GvHD 유전자-요법 프로토콜에서 형질 도입된 T-세포만을 투여하는 것이 필수적이다. 여기서, 임상 등급 분류를 가능하게 하는 마커가 필요하다.
퓨로마이신 내성 유전자(PAC), tEGFR, CD20 및 저친화성 신경 성장 인자 수용체와 같은 여러 마커 유전자가 설명되어있다. 보다 최근에, 절단된 CD34 및 RQR8이 마커로서 사용되었다. 이들은 CD34 Miltenyi CliniMACS 선택 시스템이 임상 등급 분류에 쉽게 사용할 수 있다는 장점이 있다.
마커 및 자살 유전자들(예: HSV-TK, iCaspase 9, tEGFR 등)은 긴 암호화 서열을 갖고 이들 단백질을 마커 유전자로 포함시키는 것은 벡터 패키징 용량 및 전사 효율성을 부과할 가능성이 있다. 마지막으로, 상술한 자살 및/또는 마커 유전자들 중 어느 것도 면역 세포에 생존 신호를 제공할 수 없다. 자살, 마커 및 생존 기능이 2개 이상의 유전자들을 포함시킴으로써 제공될 수 있지만, 이는 벡터 패키징 용량 및 전사 효율성에 추가적인 부담을 줄 가능성이 있다. 따라서 자살, 생존 및 마커 기능들을 제공할 수 있는 다목적 유전자 스위치가 필요하다.
본원은 자살, 생존 및 마커 기능을 제공하는 다목적 유전자 스위치들을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 다목적 스위치는 세포에서 이소성으로 발현될 때 입양 세포 치료의 목적을 위한 생사(또는 생존-자살) 스위치로서 작용한다. 한 실시형태에서, 다목적 스위치는 다음의 공식을 갖는다: SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4; 여기서 SP는 다목적 스위치의 세포 표면 수송을 허용하고 성숙한 펩티드를 수득하기 위해 절단되는 선택적 신호 펩티드이고, D1은 세포 생존을 촉진하는 수용체에 결합하는 수용체 결합 도메인이고, D2는 마커/자살 도메인이고, D3은 D1 및 D2 도메인이 표적 세포의 표면으로부터 멀리 투사될 수 있도록 하는 힌지 도메인/줄기 도메인이고, D4는 분자 스위치를 세포막에 고정하는 막관련 도메인 (예를 들어, 막관통 도메인 또는 막고정 도메인)이고, L1, L2 및 L3은 선택적 링커 도메인이다.
한 실시형태에서, 다목적 스위치는 마커/자살 스위치로서 기능하는 제2 모듈(D2) 및 힌지/줄기 도메인으로서 기능하는 제3 모듈(D3) 및 막관련 도메인으로서 기능하는 제4 모듈(D4)에 대한 수용체 결합 도메인을 포함하는 제1 모듈(D1)의 프레임내 융합을 포함한다. 한 실시형태에서, D2, D3 및 D4 모듈은 동일한 내인성 단백질로부터 유래된다. 한 실시형태에서, D2, D3 및 D4 모듈은 상이한 내인성 단백질로부터 유래된다. 한 실시형태에서, D3 및 D4는 동일한 내인성 단백질로부터 유래된다. 한 실시형태에서, D3 및 D4는 상이한 내인성 단백질로부터 유래된다.
한 실시형태에서, 제1 모듈(D1)은 세포 표면 상에서 발현되는 수용체에 결합하고, 즉, 수용체의 세포외 도메인에 결합한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈(D1)은 수용체에 결합하고, 수용체는 결합될 때 세포에 생존 및/또는 증식 신호를 전달한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈은 시스에서 수용체에 결합한다(즉, 분자 스위치를 발현하는 세포와 동일한 세포 상에서 발현된 수용체에 결합한다). 한 실시형태에서, 제1 모듈은 트랜스에서 수용체에 결합한다 (즉, 분자 스위치를 발현하는 세포 이외의 세포 상에서 발현된 수용체에 결합한다). 한 실시형태에서, 제1 모듈은 시스 및 트랜스의 수용체에 결합한다. 한 실시형태에서, 제1 모듈(D1)은 사이토카인, 케모카인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 예시적인 시토킨, 케모카인 및 리간드는 다음 중 하나를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL18, IL-19, IL20, IL-21, IL-22, IL-23, IL27, IL-28, CD40L, 4-1BBL, CD30L, OX40L, FLT3-L, APRIL, BAFF, Rantes, MIP, 에리트로포이에틴(Erythropoietin), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin), SCF (줄기 세포 인자), G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF 등. 한 실시형태에서, 제1 모듈은 항체, 항체 단편 (예를 들어, scFv, vL, vH, Fab 등), 단일 도메인 항체 (예를 들어, vHH, FHVH 등) 또는 수용체에 결합할 수 있는 비-면역글로불린 항원 결합 모듈이다. 예시적인 실시형태에서, 수용체는 다음 중 하나로부터 선택된다: IL-1R, IL2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-18R, IL-19R, IL-20R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-27R, IL-28R, CCR1, CCR3, CCR5, MIP-1R, PF4 수용체, 에리트로포이에틴(Erythropoeitin)-수용체 (Epo-R), TPO-R/MPL, GSF-R, c-Kit, 및 M-CSF 수용체.
한 실시형태에서, 제2 모듈(D2)은 내인성 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, D2는 하기 내인성 단백질의 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD38, CD52, CD171; CS1 (SLAMF7, CD319); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3; BCMA; Tn 항원 (Tn Ag); 전립선 특이 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 티로신 키나제3 (FLT3); 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 발암배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-beta); 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAlX); 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 시알루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3; 고분자량-흑색종 관련 항원(HMWMAA); o- 아세틸 -GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글리코세라미드(GloboH)의 globoH 헥사당 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 안드로겐 수용체; T 세포 3(SART3)에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원; CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl), MPL, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Sialyl Lewis 항원); Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1/CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL11Ra, IL13Ra2, IL-17R, CD179b-IGLl1, TCRgamma-delta, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGFbetaR2, Lews Ag, TCR-beta1 사슬, TCR-beta2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 류텐화 호르몬 수용체(LHR), 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR), 성선 자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1(TF1), GPRC5D, Claudin18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, 저전도도 염화물 채널(LCCC), TAJ/TROY, MPL(TPO-R), KIR3DL2, CD32b, CD229, Toso, PD-1, PD-L1, PD-L2, TNFR1, TRAIL-R1(DR4), TRAIL-R2(DR5), CTLA4, IL-36R, CD25, LAG3, VEGF-A, MASP-2, 흉선 기질 림프포이에틴, 조직 인자, IFNAR1, IL5, IL-6, IL-12, IL-23, IL-17A, IL-13, 안지오포이에틴 유사 3, CGRP, IL-23p19, vWF, C5, IFNγ, CD4, CD8, CD7, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, PDGRFα, α4β7 인테그린, α4 인테그린, VEGF, GPIIb/IIIa PCSK9, Blys 및 BAFF-R.
한 실시형태에서, 제2 모듈(D2)은 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 모듈(D2)은 작용제에 의해 결합될 때 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 상기 제2 모듈에 결합할 때 분자 스위치를 발현하는 세포의 사멸을 유도하는 작용제는 항체, 항체 단편, scFv, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체 또는 이의 단편 또는 세포(예를 들어, CAR-T, SAR-T, SAR-NK 세포 등)이다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 농축 또는 고갈시키는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 제2 모듈은 작용제에 의해 결합될 때 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 제2 모듈에 결합할 때 분자 스위치를 발현하는 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키기 위해 사용될 수 있는 작용제는 항체, 단일 도메인 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 분자 스위치는 생체 외에서 세포를 선택적으로 검출, 농축 및/또는 고갈시키기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 분자 스위치는 생체내에서 세포를 선택적으로 고갈시키기 위해 사용된다. 한 실시형태에서, 분자 스위치를 발현하는 세포를 검출, 고갈 또는 농축시키는데 사용되는 작용제(즉, 항체, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체, 비면역글로불린 항원 결합 도메인 또는 이의 단편)는 FDA에 의해 인간 투여에 대해 승인되었다. FDA에 의해 승인되었거나 인간 투여에 대해 FDA 승인을 계류 중인 예시적인 작용제는 당업계에 공지되어 있으며, 리툭시맙(Rituximab), 허셉틴(Herceptin), 에르비트룩스(Erbitrux), 아드세트리스(Adcetris), 엔브렐(Enbrel), 트레멜리무맙(Tremelimumab), 모수네투주맙(Mosunetuzumab), 테클리스타맙(Teclistamab), 도나네맙(Donanemab), 스페솔리맙(Spesolimab), 파리시맙(Faricimab), 티스렐리주맙(Tislelizumab), 벨란타맙 마포도틴(belantamab mafodotin) 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab) 및 큐벤드(Qbend) 등을 포함한다. 항체를 사용하여 세포를 선택적으로 고갈시키거나 농축하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, WO 2018/178378). 한 실시형태에서, 분자 스위치를 발현하는 세포를 검출, 고갈 또는 농축하기 위해 사용되는 작용제는 생체외 임상 사용을 위해 FDA에 의해 승인된다. 예시적인 이러한 작용제는 임상적으로 승인된 CliniMACS CD34 시스템 (Miltenyi)과 함께 사용되도록 FDA에 의해 승인된 CD34에 대한 항체이다.
본원의 분자 스위치는 힌지/줄기 서열 (D3)을 포함하는데, 이는 폴리펩티드가 표적 세포의 표면에서 발현될 때, D1 및 D2 도메인이 표적 세포의 표면으로부터 멀리 돌출되게 한다.
줄기 서열 (D3)은 D1 및 D2가 세포 표면으로부터 충분히 멀리 떨어져 있게 하여, 예를 들어 D1과 D1의 수용체 및/또는 항체를 D2 도메인에 결합시키는 것을 용이하게 한다.
줄기 서열 (D3)은 세포 표면으로부터 D1-D2 도메인을 상승시킨다.
줄기 서열은 실질적으로 선형 아미노산 서열일 수 있다. 줄기 서열은 D1 및 D2 도메인을 표적 세포의 표면으로부터 멀어지게 하기에 충분히 길지만, 이의 암호화 서열이 벡터 패키징 및 형질도입 효율을 손상시킬 정도로 길지는 않을 수 있다. 줄기 서열은 예를 들어 20 내지 100 아미노산 길이일 수 있다. 줄기 서열은 대략 40-50 아미노산 길이일 수 있다.
줄기 서열은 고도로 글리코실화될 수 있다.
줄기 서열은 서열번호 (DNA) 7132 및 서열번호(PRT) 7824로 표시되는 서열과 길이가 거의 동일할 수 있다.
줄기/힌지 서열은 선택적으로 세포내 고정 서열과 함께 막관통 도메인(D4)에 작동적으로 연결된다. 막관통 도메인 및 세포내 고정 서열은 줄기 서열의 세포외 부분과 동일한 단백질로부터 유래될 수 있거나, 또는 그것/이들은 상이한 단백질로부터 유래될 수 있다. 줄기/힌지 및 막관통 도메인 및 세포내 고정 서열은 CD8로부터 유래가능할 수 있다. 예시적인 CD8 힌지 및 막관통 서열은 서열번호 (PRT) 3603으로 제공된다.
분자 스위치는 L1, L2 및 L3이 동일하거나 상이할 수 있는 선택적 링커(또는 스페이서) 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 링커는 서열번호 3418-3434로 제공된다. 분자 스위치는 또한 아미노 말단에서 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 신호 펩티드는 서열번호 2425-2428로 제공된다. 폴리펩티드가 표적 세포에 의해 발현되면 신호 펩티드가 절단되어 성숙한 펩티드 생성물이 생성된다.
예시적인 다목적 스위치는 Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter (서열번호(DNA) 7152 및 서열번호(PRT) 7843) 이고 BCMA의 세포외 도메인 및 막관통 도메인에 프레임에 융합된 IL2의 IL2 수용체 결합 도메인을 포함한다. 이러한 다용도 스위치는 면역 세포(예: T 세포 또는 NK 세포 등)에서 발현될 때 IL2의 IL-2R 결합 도메인을 포함하는 N 말단 D1 모듈을 통해 IL2 수용체에 결합하여 생존 신호를 제공한다. 이 다목적 스위치의 제2 모듈(D2)은 BCMA-결합제(예: BCMA 항체)에 의해 인식되고 이식유전자(예: SAR) 발현 세포의 검출, 선택적 고갈 및/또는 농축에 사용될 수 있는 BCMA의 세포외 도메인을 포함한다. 제2 (D2) 모듈을 포함하는 BCMA의 세포외 도메인은 또한 BCMA-표적화된 작용제, 예를 들어 항체 또는 항체 약물-접합체(예를 들어, 벨란타맙 마포도틴(belantamab mafodotin))를 사용하여 이식유전자 (예를 들어, SAR) 발현 세포의 선택적 자살을 위해 사용될 수 있다. 이 분자 스위치의 세 번째(D3) 및 네 번째(D4) 모듈은 BCMA의 힌지/줄기 및 막관통 도메인으로 구성되며 스위치를 세포막에 고정하는 역할을 한다.
분자 스위치는 형식이 모듈식이기 때문에 결과 스위치가 생물학적 활성(예: 생존 스위치 또는 자살 스위치 등의 역할을 하는 능력)중 하나 이상을 유지하는 한 다른 모듈로 대체될 수 있다. 따라서, IL2 모듈은 상이한 사이토카인(예를 들어, IL15, IL18, IL21 등)으로 대체될 수 있다. 이들 다목적 단백질은 이의 사이토카인 모이어티 (예를 들어, IL2, IL15, IL18, IL21 등)를 통해 생존 촉진 신호를 제공하고, 제2 모듈(예를 들어, RQR3, tBCMA, tHer2, tEGFR, tCD19, tCD30 등)에 결합하는 작용제(예를 들어, 항체)를 사용하여 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있으나, 독성에 직면하여 투여된 T 세포의 선택적 결실을 허용하는 자살 유전자로 작용한다. 제2 모듈(예를 들어, RQR3, tBCMA, tHer2, tEGFR, tCD19, tCD30 등)은 또한 형질 도입의 측정을 위한 마커로서 사용될 수 있고 형질 도입된 세포의 선택을 허용한다.
예시적인 실시형태에서, IL2 모듈은 저친화성 IL2 변이체, IL15 또는 IL15 변이체로 대체될 수 있다. tBCMA에 융합된 저친화성 IL2 변이체를 포함하는 예시적인 다목적 스위치들은 서열번호(DNA) 7152-7155 및 서열번호(PRT) 7844-7847로 제공된다. IL-15 및 tBCMA에 융합된 이의 저친화성 변이체를 포함하는 예시적인 다목적 스위치들은 서열번호(DNA) 7156-7157 및 서열번호(PRT) 7848-7849로 제공된다. 다른 예시적인 실시형태에서, tBCMA 모듈은 다른 모듈로 대체될 수 있다. 예시적인 다목적 스위치는 서열번호(DNA) 7158 및 서열번호(PRT) 7850으로 제공되는 tCD30에 융합된 IL2를 포함한다. tEGFR 및 다른 표면 단백질(예를 들어, Her3, CD19, PD1, PDL1, CD40 등)에 융합된 사이토카인을 포함하는 예시적인 다목적 스위치들은 유사하게 구성될 수 있고 본원의 대안적인 실시형태에서 사용될 수 있다.
다목적 스위치 발현 카세트들은 크기가 작으며 바이러스 벡터로 쉽게 포장할 수 있다. 이들은 개별 마커, 자살 및 생존 유전자를 암호화하는 발현 카세트들보다 훨씬 더 관리하기 쉬운 크기이며, 이는 별도의 프로모터를 필요로 한다. 이들은 생존, 자살 및 마커 유전자 요소들을 포함하는 추가적인 이점을 가지며, 적어도 개별 유전자들에 의해 입증된 것과 동일한 민감도를 갖는다.
한 실시형태에서, 제2 모듈(D2)은 에피토프 또는 미모토페의 하나 이상의 카피를 포함하는 합성 모듈이다. 한 실시형태에서, 에피토프는 내인성 단백질의 세포외 도메인에 존재한다. 한 실시형태에서, 미모토페는 내인성 단백질의 세포외 도메인에 존재하는 에피토프를 모방한다. 예시적인 내인성 단백질은 앞 섹션에 제시되어 있다. 에피토프 또는 미모토프의 하나 이상의 카피를 포함하는 예시적인 합성 모듈은 RQR8 (서열번호 9619)이고, 이는 CD34 에피토프 및 2개의 CD20 미모토프를 보유하는 모듈이고, WO/2013/153391에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. RQR8 모듈을 사용하면 임상적으로 승인된 CliniMACS CD34 시스템(Miltenyi)으로 선택할 수 있다. 또한, 상기 구축물은 널리 사용되는 약제학적 항체 리툭시맙에 결합하여, 도입유전자-발현 세포의 선택적 결실을 초래한다. 추가의 예시적인 다용도 분자 스위치들은 IL2 또는 이의 변이체 및 tBCMA(서열번호(DNA) 7151-7155), IL15 또는 이의 변이체 및 tBCMA(서열번호(DNA) 7156-7157), IL2 및 이의 변이체 및 tHer2, IL2 및 이의 변이체 및 tEGFR, IL2 및 이의 RQR8, IL2 및 이의 변이체 및 CD30(서열번호 7850) 등을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 다목적 스위치는 모듈식 형식이므로 하나의 모듈을 다른 모듈로 교체할 수 있다.
본원의 다목적 스위치들을 암호화하는 폴리펩티드는 서열번호 7843-7850 및 9621-9625로 제시된 서열의 변이체를 포함하거나 구성될 수 있으며, 이는 서열번호 7843-7850 및 9621-9625 폴리펩티드의 기능적 활성을 보유하는 한, 서열번호 7843-7850 및 9621-9625로 제시된 서열과 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는다. 예를 들어, 서열번호 7843-7847의 변이체는 (i) IL-2R에 결합하고; (ii) BCMA 항체 (예를 들어, J6M0 또는 벨란타맙 마포도틴)에 결합하고 (iii) 세포의 표면 상에서 발현될 때, J6M0 또는 벨란타맙 마포도틴의 존재 하에 세포의 사멸을 유도한다. J6M0은 US9273141B2에 기술되어 있다.
상동성 비교는 눈으로 또는 GCG Wisconsin Bestfit 패키지와 같이 쉽게 사용할 수 있는 서열 비교 프로그램들의 도움으로 수행할 수 있다. 본원의 다목적 분자 스위치들은 융합 단백질의 형태일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드는 관심있는 단백질 (POI)에 융합된다. 융합 단백질은 다용도 스위치를 코딩하는 폴리펩티드와 관심있는 단백질 사이의 자가절단 펩타이드(예를 들어, P2A 또는 F2A)를 포함할 수 있다.
관심 단백질은 표적 세포의 표면에서 발현되는 분자이다. 상기 POI는 표적 세포가 생체 내에 있을 때 치료 또는 예방 효과를 발휘할 수 있다. 상기 POI는 SAR(예를 들어, CAR, SIR, zSIR, HIT, STAR, cTCR, Ab-TCR, TFP, TAC, 재조합 TCR 등) 또는 내인성 TCR이다.
본원은 또한 본원의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 다목적 스위치를 암호화할 수 있는 핵산 서열을 제공한다.
핵산은, 표적 세포에 의해 발현될 때, 암호화된 다목적 스위치 폴리펩티드가 표적 세포의 세포-표면에서 발현되도록 한다. 핵산이 다목적 스위치 폴리펩티드 및 POI 둘 다 (예를 들어 융합 단백질로서) 둘 다를 암호화하는 경우, 개시된 폴리펩티드 및 POI 둘 다가 표적 세포의 표면에서 발현되도록 해야 한다.
상기 핵산 서열은 RNA 또는 DNA, 예컨대 cDNA일 수 있다.
본원은 또한 다목적 분자 스위치의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 또한 관심있는 도입 유전자, 즉 POI를 암호화하는 유전자 (예를 들어, SAR)를 포함할 수 있다.
벡터는 표적 세포를 형질 주입 또는 형질 도입할 수 있어야 하며, 이들이 다용도 스위치 및 선택적으로 관심있는 단백질을 암호화하는 폴리펩티드를 발현하도록 한다. 벡터는 플라스미드와 같은 비바이러스성 벡터일 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 POI를 포함하는 핵산을 별개의 엔티티로서, 또는 단일 뉴클레오티드 서열로서 포함할 수 있다. 이들이 단일 뉴클레오티드 서열로서 존재하는 경우, 이들은 다운스트림 서열이 번역될 수 있게 하기 위해 2개의 암호화하는 부분 사이에 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 다목적 분자 스위치 및 POI는 별개의 프로모터를 사용하여 단일 벡터로부터 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 다목적 스위치 및 상기 POI는 별개의 벡터로부터 표현될 수 있다.
본원은 또한 본원의 다용도 스위치 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제공한다. 세포는 세포 표면에서 다목적 스위치 폴리펩티드 및 POI(예를 들어, SAR)를 공동 발현할 수 있다. 본원은 또한 본원의 다용도 스위치 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 본원에 따라 벡터로 형질 도입 또는 형질 감염되었을 수 있다. 상기 세포는 입양 세포 요법에 적합할 수 있다. 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구 (CTL)일 수 있다. T 세포는 기존의 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)-특이적 T 세포일 수 있다. 상기 세포는 NK 세포, NKT 세포, iPSC 유래 T 세포 또는 합성 T 세포일 수 있다. 상기 세포는 환자로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 세포는 환자로부터 제거된 다음, 본원에 따라 벡터로 생체외에서 형질 도입되었을 수 있다. ACT에 적합한 T 세포 집단은 다음을 포함한다: 벌크 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), CD8+ 세포 (예를 들어, CD4-고갈된 PBMC); T-조절 세포(Treg)가 선택적으로 고갈된 PBMC; 격리된 중앙 기억 (Tcm) 세포; EBV 특이적 CTLs; 및 트라이 바이러스 관련 CTLs.
본원은 또한 본원에 따른 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 세포 집단은 본원에 따라 벡터로 형질 도입되었을 수 있다. 세포 집단의 세포 중 일부는 세포 표면에서 개시에 따른 다목적 스위치 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 세포 집단의 세포 중 일부는 세포 표면에서 다목적 스위치 폴리펩티드 및 POI(예를 들어, SAR)를 공동-발현할 수 있다. 상기 세포군은 생체외 환자 유래 세포집단일 수 있다.
본원은 관심있는 도입유전자(관심있는 단백질 POI, 예를 들어, SAR을 암호화하는)을 갖는 형질도입을 측정하는 방법을 제공하며, 이는 본원의 다목적 스위치 폴리펩티드 및 관심있는 단백질 (예를 들어, SAR)을 공동 발현하는 벡터로 세포 집단을 형질 도입하는 단계 및 세포 표면 상에서 다목적 스위치(BCMA, QBEnd10 결합 에피토프 등)의 발현을 검출하는 단계를 포함하고, 본원의 다목적 스위치 폴리펩티드를 발현하는 세포의 비율은 관심있는 도입 유전자로 형질 도입된 세포의 비율에 상응한다.
본원은 또한 다음의 단계들을 포함하는 POI(예를 들어, SAR)를 발현하는 세포를 선택하기 위한 방법을 제공한다.
(i) POI (예를 들어, SAR)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원의 벡터로 형질 감염 또는 형질 도입된 세포의 표면 상에서 다목적 스위치 (예를 들어, BCMA-, Her2-, 또는 QBEnd10-결합 에피토프)의 발현을 검출하는 단계; 및
(ii) 다목적 스위치 (예를 들어, BCMA-, Her2-, 또는 QBEnd10-결합 에피토프)를 발현하는 것으로 확인되는 세포를 선택하는 단계.
세포는 FACS 또는 Miltenyi cliniMACS 시스템과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 식별 및/또는 분류될 수 있다.
본원은 또한 전술한 방법을 사용하여 세포 집단으로부터 POI(예를 들어, SAR)를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 POI(예를 들어, SAR)를 발현하는 세포에 대해 농축된 세포의 정제된 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 본원은 또한 이러한 방법에 의해 제조된 POI 발현 세포의 정제된 집단을 제공한다. 세포의 정제된 집단에서, 세포의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 POI (및 본원에 따른 다목적 스위치 폴리펩티드)를 발현할 수 있다.
본원은 또한 세포 표면에서 본원의 폴리펩티드의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 생체내에서 형질 도입된 세포를 추적하는 방법을 제공한다. 세포는 생체 발광 영상화와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 생체내에서 추적될 수 있다. 이러한 적용을 위해, 본원의 폴리펩티드는 루시페라제(luciferas)와 같은 검출가능한 단백질과 함께 동시 발현되도록 조작될 수 있다.
본원은 또한 다용도 스위치 폴리펩티드에 결합하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 본원에 따른 벡터에 의해 형질 도입된 세포를 결실시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 작용제는 다목적 스위치 폴리펩티드의 D2 도메인에 결합한다. 한 실시형태에서, 작용제는 항체 (예를 들어, 리툭시맙, 에르티브트룩스 또는 J6M0)이고, 세포가 보체의 존재 하에 항체에 노출된다. 한 실시형태에서, 작용제는 항체 약물 접합체 (예를 들어, 벨란타맙 마포도틴(belantamab mafodotin), T-DM1 또는 엔허투(Enhertu)등)이다. 한 실시형태에서, 상기 다목적스위치는 tBCMA 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 상기 작용제는J6M0 또는 벨란타맙 마포도틴이다. 한 실시형태에서, 상기 다목적스위치는 tHer2 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하며, 상기 작용제는 허셉틴, T-DM1 또는 엔허투이다. 한 실시형태에서, 상기 다목적스위치는 RQR8 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 상기 작용제는 리툭시맙이다. 한 실시형태에서, 상기 다용도 스위치는 tEGFR 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 상기 작용제는 Erbitrux이다.
본원의 다용도 스위치 폴리펩티드가 세포의 표면에서 발현되는 경우, 폴리펩티드의 D2 도메인에 대한 작용제 (예를 들어, 리툭시맙)의 결합은 세포의 용해를 야기한다. 하나 초과의 작용제(예를 들어, 리툭시맙)의 분자는 세포 표면에서 발현되는 다용도 스위치마다 결합할 수 있다.
세포의 결실은 생체 내에서 발생할 수 있으며, 예를 들어 작용제(예를 들어, 리툭시맙, 허셉틴, 에르비트룩스, J6M0, 벨란타맙 마포도틴, T-DM1 또는 엔허투 등)을 환자에게 투여함으로써 발생할 수 있다. 전사된 세포를 삭제하기로 한 결정은 이식된 세포에 기인하는 환자에서 검출되는 바람직하지 않은 효과로부터 발생할 수 있다. 예를 들어, 허용할 수 없는 수준의 독성이 검출될 수 있다. 상이한 작용제의 투여량, 투여 경로 및 빈도는 당업계에 공지되어 있으며, 작용제 및 대상체의 임상 상태에 따라 달라질 것이다. 한 실시형태에서, 1회 이상의 투여량의 작용제가 투여된다.
유전자 변형 T 세포의 입양 이식은 항종양 면역 반응과 같은 바람직한 면역 반응을 생성하기 위한 매력적인 접근법이다.
본원은 상기 개시내용에 따른 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 세포의 집단은 상기 기재된 방법을 사용하여 관심있는 도입유전자를 발현하는 세포에 대해 농축될 수 있다.
이 방법에는 다음 단계가 포함될 수 있다.
o (i) 환자로부터 혈액 샘플과 같은 세포 샘플을 채취하는 단계,
o (ii) 상기 T 세포를 추출하는 단계,
o (iii) 관심있는 다용도 스위치 및 이식유전자(예를 들어, SAR)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본원의 벡터로 T 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키는 단계,
o (iv) 생체 외에서 형질 도입된 세포를 확장하는 단계;
o (v) 세포를 환자에게 복귀시키는 단계.
형질 도입된 세포는 강화된 종양 특이적 표적화 및 사멸과 같은 원하는 치료 특성을 보유할 수 있다.
차세대 SAR 구조(예: SIR, zSIR, Ab-TCR, HIT, STAR 등)에 대한 기술적 과제는 이들의 검출, 격리, 정제 또는 고갈을 위한 용이한 방법의 결여이다. CAR 구축물에 킬 스위치를 추가하는 것이 설명되었지만 표적 항원에 대한 SAR 결합 및/또는 표적 이탈 신호전달을 방해하는 문제를 겪고 있다. 출원인은 결합 및 신호전달 활성을 방해하지 않으며 막 고정 형태의 분자(예를 들어, BCMA, CD30 등)에 프레임으로 융합시킬 수 있는 사이토카인(예를 들어, IL2 및 1L15 등)을 발견하였다. 본원은 사이토카인(예를 들어, IL2 및 IL15 등) 및, 막 고정 분자 (예를 들어, BCMA 또는 CD30)에 융합되는 이들의 저친화성 변이체를 제공한다. BCMA 및 CD30(예: Adcetris)에 대해 사용할 수 있는 FDA 승인 항체 및 항체 약물 접합체가 있기 때문에 이러한 분자는 독성이 있는 경우 이를 발현하는 세포(예: SAR 세포)를 박멸하기 위한 킬 스위치로 사용할 수 있다.
융합 구축물은 또한 SAR 발현 세포를 포함하여 이를 발현하는 세포의 검출, 단리, 정제 및/또는 고갈에 사용할 수 있는 하나 이상의 에피토프 태그 (예를 들어, 세툭시맙 미모토페, 리툭시맙 태그, 허셉틴 미모토페, MYC 태그, 스트렙태그II 등)를 포함할 수 있다. 예시적인 에피토프 태그는 문헌에 공지되어 있다 (예를 들어, 서열번호 3423-3434). 이러한 에피토프 태그는 PCT/US2021/022641에 설명된 방법을 사용하여 면역 세포(예: SAR 발현 NK 또는 T 세포)의 검출, 분리, 정제 및/또는 고갈에 사용할 수 있다.
제조품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 개시물의 SAR을 그 표면 상에 제시하는 이펙터 세포이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 상태를 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 SAR 이펙터 세포 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 조합 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
패키지 삽입물은 해당 치료 제품의 사용에 관한 지침, 사용법, 복용량, 투여법, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 패키지 삽입물은 조성물이 표적 항원 양성 암(예컨대 부신피질 암종, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 결장직장암, 식도암, 교모세포종, 신경교종, 간세포 암종, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 췌장암, 갈색세포종, 형질세포종, 신경모세포종, 난소암, 전립선암, 육종, 위암, 자궁암 또는 갑상선암)을 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 패키지 삽입물은 조성물이 표적 항원 양성 바이러스 감염 (예를 들어 CMV, EBV, HCV 등에 의한 감염)을 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다.
추가적으로, 제조품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 더 포함할 수 있다.
키트는 또한 다양한 목적, 예를 들어, 본원에 기재된 표적 항원 양성 질환 또는 장애의 치료에 유용한, 선택적으로 제조 물품과 조합하여 제공된다. 본원의 키트는 SAR 이펙터 세포 조성물 (또는 단위 투여 형태 및/또는 제조품)을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하고, 일부 실시형태에서, 또 다른 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 작용제) 및/또는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다.
본원의 키트에 제공된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 쓰여진 지침이지만, 기계 판독가능 지침(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 운반되는 지침)도 허용된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 키트는 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물, 및 b) 적어도 하나의 다른 작용제의 유효량을 포함하고, 여기서 다른 작용제는 MHC 단백질의 발현을 증가시키고/하거나 MHC 단백질 (예를 들어, IFNy, IFNP, IFNa, 또는 Hsp90 억제제)에 의한 펩티드의 표면 제시를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 키트는a) 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물, 및 b) 표적 항원 양성 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 감염)을 치료하기 위해SAR 이펙터 세포 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물, b) 적어도 하나의 다른 작용제의 유효량, 여기서 다른 작용제는 MHC 단백질의 발현을 증가시키고/하거나 MHC 단백질에 의한 펩티드의 표면 제시를 향상시키고, c) 표적 항원 양성 질환(암 또는 바이러스 감염으로)의 치료를 위해 SAR 이펙터 세포 조성물 및 다른 작용제(들)를 개체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다. SAR 이펙터 세포 조성물 및 다른 작용제(들)는 별개의 용기 내에 또는 단일 용기에 존재할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나의 별개의 조성물 또는 2개 이상의 조성물을 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 SAR 이펙터 세포를 포함하고, 다른 조성물은 다른 작용제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 포함하는 조성물, 및 b) 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 형성하기 위해 SAR을 이펙터 세포(예를 들어, 개체로부터 유래된 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 또는 자연 살해 세포)를 조합하기 위한 및, 표적 항원 양성 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 감염)의 치료를 위해 SAR 이펙터 세포 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 포함하는 조성물, 및 b) 이펙터 세포 (예: 세포독성 세포)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 포함하는 조성물, b) 이펙터 세포 (예: 세포독성 세포), 및 c) 그 표면 상에 SAR을 제시하는 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 형성하기 위해 SAR을 이펙터 세포를 조합하기 위한 및, 표적 항원 양성 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 감염)의 치료를 위해 SAR 이펙터 세포 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 SAR을 암호화하는 핵산 (또는 핵산의 세트)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 암호화하는 핵산 (또는 핵산 세트), 및 b) 핵산 (또는 핵산 세트)을 발현하는 숙주 세포 (또는 핵산 세트)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 암호화하는 핵산 (또는 핵산의 세트), 및 b) i) 숙주 세포 (예를 들어, 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포)에서 SAR을 발현하고, ii) SAR을 발현한 숙주세포를 포함하는 조성물을 제조하고, iii) 표적 항원 양성 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 감염)의 치료를 위해 SAR을 발현한 숙주세포를 포함한 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 개체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 키트는 a) SAR을 암호화하는 핵산 (또는 핵산 세트), b) 핵산 (또는 핵산 세트)을 발현하는 숙주 세포 (또는 핵산 세트)를 발현하기 위한 숙주 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 c) i) 숙주 세포에서 SAR을 발현하고, ii) SAR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하고, 및 iii) 표적 항원 양성 질환 (예를 들어, 암 또는 바이러스 감염)을 치료하기 위해 SAR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침들을 포함한다.
본원의 키트는 적절한 포장으로 되어 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 항아리, 유연 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 비닐 봉지) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 키트는 선택적으로 버퍼 및 해석 정보와 같은 추가 구성 요소들을 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알(예: 밀봉된 바이알), 병, 항아리, 가요성 포장 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
SAR 이펙터 세포 조성물들의 사용에 관한 지침들은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기들은 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 서브-단위 용량일 수 있다. 예를 들어, 키트들은 연장된 기간 동안, 예컨대 일주일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월 이상의 임의동안, 개체의 효과적인 치료를 제공하기 위해 본원에 개시된 SAR 이펙터 세포의 충분한 투여량을 포함할 수 있다. 키트들은 또한 SAR 및 약학 조성물의 다중 단위 투여량 및 사용 지침을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 포장될 수 있다.
본원은 열 충격 단백질 70 (Hsp70)의 막 노출 에피토프를 표적으로 하는 vL, vH 및 scFv를 제공한다 (표 47). 본원은 또한 Hsp70을 표적으로 하는 이들 vL, vH 및 scFv 폴리펩티드에 기초하여 Hsp70을 표적으로 하는 SAR을 제공한다. Hsp70을 표적으로 하는 예시적인 SAR의 서열 ID (서열번호(DNA) 7754-7808 및 서열번호(PRT) 8446-8500)에 제공되어 있다. SAR 면역 세포(예: T 세포 및 NK 세포 등)에서 발현되며, 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하고, 본원에 기재된 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 Hps70 발현 다우디 세포에 대한 세포독성에 대해 시험하였다.
다양한 골격을 가진 SAR의 생체 내 전달은 급성 림프구성 백혈병 환자에서 테스트된다. 렌티바이러스 매개 유전자 전달 및 바이러스 유사 입자를 사용한 유전자 전달을 포함하여 여러 전달 방법이 시도된다. SIR, cTCR 및 Ab-TCR의 골격을 갖는 SAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPζ, CD16-SAR, NKp30-SAR, NKp44-SAR, NKp46-SAR, DAP10-SAR 또는 NKG2D SAR의 골격을 갖는 SAR과 비교하여 생체내 유전자 전달에 더 안전한 것으로 관찰된다. SIR, acTCR 및 Ab-TCR의 골격을 갖는 CD19-SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터는 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPζ, CD16-SAR, NKp30-SAR, NKp44-SAR, NKp46-SAR, DAP10-SAR 또는 NKG2D SAR의 골격을 가진SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터와 비교하여 순환하는 CD19-발현 B-ALL 세포에 덜 빈번하게 삽입되는 것으로 관찰된다. 또한 삽입 시에도 SIR, acTCR 및 Ab-TCR의 골격을 갖는 SAR은 순환하는 CD19 발현 B-ALL 세포에서 발현되지 않는 반면, 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPζ, CD16-SAR, NKp30-SAR, NKp44-SAR, NKp46-SAR, DAP10-SAR 또는 NKG2D SAR의 골격을 가진 SAR은 순환하는 B-ALL 세포에서 관찰된다. 또한 SAR의 우발적 삽입으로 인한 B-ALL의 재발 위험은 1세대 CAR, 2세대 CAR, 3세대 CAR, TFPε, TFPγ, TFPδ, TFPζ, CD16-SAR, NKp30-SAR, NKp44-SAR, NKp46-SAR, DAP10-SAR 또는 NKG2D SAR의 골격을 가진 SAR과 비교하여 SIR, cTCR 및 Ab-TCR의 골격을 가진 SAR에서 더 낮다는 점에 유의한다.
고형 종양상에서 발현되는 항원(예: 메조텔린, PSMA 등)을 표적으로 하는 CAR-T 세포 환자에게 주입 시 확대가 미흡함을 보인다. 본원은 혈액 세포 상에서 발현되는 항원(예를 들어, CD19, BCMA, CD20 등)을 표적화할 수 있는 SAR을 제공함으로써 이러한 문제에 대한 해결책을 제공한다. 이러한 SAR은 고형 종양을 표적으로 하는 SAR과 함께 면역 세포에서 동시 발현되어 고형 종양을 표적으로 하는 SAR-T 세포에 증식 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, CD19를 표적으로 하는 SAR (서열번호 7660)은 PSMA를 표적으로 하는 SAR (서열번호 7617) 또는 Her2를 표적으로 하는 SAR과 함께 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)에서 공동 발현될 수 있다. PSMA SAR을 발현하고 또한 CD19 SAR을 공동 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 PSMA SAR 단독으로 발현하는 면역 세포에 비해 더 큰 증식 및 생체내 지속성을 나타내는 것으로 관찰된다. 이중특이성 또는 다중특이성 면역 세포(예를 들어, 이중특이성 또는 다중특이성 CAR-T 또는 CAR-NK 세포)를 생성하기 위한 현재 본원의 SAR의 독특한 이점은 1세대 또는 2세대 CARs에 비해 상대적으로 작은 크기에 기초한다. 따라서, 이들은 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터)로 용이하게 패키징될 수 있다. 또한, 본원의 SAR은 많은 상이한 신호전달 사슬(예를 들어, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, DAP10, NKG2D, CD3z 등)을 포함한다. 상이한 신호전달 사슬(즉, 골격)을 갖는 SAR은 신호전달 단백질에 대해 서로 경쟁하지 않는 다양한 이중특이성 및 다중특이성SAR을 생성하도록 결합될 수 있다. 따라서, 본원의 SAR는 다양한 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있다.
앞서 언급했듯이 렌티바이러스 삽입물의 크기에는 포장 제한이 있다. 본원은 세포 요법 및 다른 유전 조작 응용을 위한 유전자의 발현을 위한 인간 헤르페스 바이러스 8 (카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 또는 KSHV)로부터의 내부 리보솜 진입 서열 (IRES)의 용도를 설명한다. 다른 공지된 IRES와 비교하여, KSHV IRES (서열번호 7116)는 크기가 비교적 작고, 따라서 바이러스 벡터로 용이하게 패키지될 수 있다. 본 발명자들은 이중사슬 SIR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 생성하였고, 여기서 tBCMA는 중간에 KSHV IRES 서열을 사용하여 SIR 카세트 이후에 발현되었다. 우리는 렌티바이러스 벡터에 감염된 T 세포에서 tBCMA의 효과적인 발현을 관찰하였다. 우리는 또한 표준 패키징 믹스를 사용하여 293FT 세포에 패키징할 때 생성된 렌티바이러스 벡터의 우수한 역가를 관찰했다. 우리는 또한 T 세포에서 SIR의 높은 수준의 발현을 관찰하였으며, 이는 KSVH IRES의 존재가 상류 SIR의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 상기 구축물로 감염된 T 세포에서 SIR 및 tBCMA의 발현 둘 모두는 렌티바이러스 벡터로 감염된 T 세포에서의 이들의 발현과 비교하여 유리하게 F2A 리보솜 스킵 서열을 사용하여 tBCMA를 발현시켰다.
본원은 다음의 예시적인 발명 측면들을 고려한다.
측면 1. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 합성 항원 수용체(SAR)로서, 상기 SAR은, (i) 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 모듈; a) 항체; b) 항체 단편; c) 항체의 중사슬 가변 영역 (VH 도메인) 또는 이의 단편; d) 항체의 경사슬 가변 영역 (vL 도메인) 또는 이의 단편; e) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; f) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편; g) vHH 도메인 또는 이의 단편; h) 항체의 단량체 가변 영역; i) 단일 vH 도메인 (SVH) 또는 이의 단편; j) 단일 vL 도메인(SVL) 또는 이 단편; k) DARPIN, 아피바디, 아피리스, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리페바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥티, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, D 도메인, 및 전술한 이들 중 임의의 단편으로부터 선택된 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; l) 리간드-결합 도메인 수용체 또는 이의 단편; m) 리간드의 수용체 결합 도메인; n) 이중특이성-항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; o) 자가항원 또는 이의 단편; p) 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편; q) Fc 결합 도메인 또는 이의 단편; r) TCR 또는 HLA-비의존성 TCR 또는 이의 단편; 그리고s) TCR의 Va, Vb, Vg 또는 Vd 단편 또는 이의 단편이고, (ii) 적어도 하나의 막관련 도메인을 포함하는 제2 모듈로서, 상기 막관련 도메인은 막관통 도메인 또는 막고정 도메인일 수 있고; 및 (iii) 하나 이상의 세포질 도메인을 포함하는 선택적인 제3 모듈로서 여기서 제1, 제2 및 제3모듈은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결된다.
측면 2. 제1의 단일사슬 SAR로서, 여기서 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 상기 제1 모듈은 선택적 링커를 통해 (1) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 선택적 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 (2) 자연 발생 수용체의 상기 힌지 도메인, 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 (3) 자연 발생 수용체의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 (4) 자연 발생 수용체의 상기 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 (5) 신호전달 어댑터의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 도메인, 상기 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다.
측면 3. 측면2의 SAR에 있어서, a) 상기 자연 발생 수용체는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 T 세포 수용체를 포함하지 않고; 및/또는 b) 상기 자연 발생 수용체는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하지 않고; 및/또는 c) 상기 신호전달 어댑터는 CD3ζ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 CD3 어댑터가 아니고; 및/또는 d) 상기 신호전달 어댑터는 FcRγ가 아니다.
측면 4. 측면2 또는 측면3의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체는 N-말단 세포외 도메인을 갖는 유형I 막 단백질이고 하나 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단은 선택적 링커를 통해 a) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 선택적 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 b) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 c) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 d) 상기 자연 발생 수용체의 세포질 도메인은 폴리펩티드 사슬 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드의 상기N-말단 또는 상기 N-말단 부근에 조작적으로 연결된다.
측면 5. 측면4의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체 유형 I 막 단백질은 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, LAIR1, 이의 변이체 및 단편으로부터 구성된 그룹으로부터 선택된다.
측면 6. 측면2 또는 측면3의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체가 C-말단 세포외 도메인을 갖는 유형 II막 단백질이고 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 암호화하는 폴리펩티드의 N-말단은 선택적 링커를 통해 a) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 임의적인 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 임의적인 세포질 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 b) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 c) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는 d) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 상기 C-말단 또는 상기 C-말단 부근에 조작적으로 연결된다.
측면 7. 측면6의 SAR에 있어서, 상기 제2형 막 단백질의 상기N-말단에 작동적으로 연결된 신호전달 어댑터의 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 상기 N-말단을 더 포함한다.
측면 8. 측면7의 상기SAR에 있어서, 상기 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP10의 그룹으로부터 선택된다.
측면 9. 측면8의 상기SAR에 있어서, 상기 신호전달 어댑터의 상기 세포질 도메인의 상기 N-말단에 조작적으로 연결된 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 상기N-말단을 더 포함한다.
측면 10. 측면9의 상기SAR에 있어서, 상기 하나 이상의 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 및 ICOS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 11. 측면10의 상기SAR에 있어서, DAP10을 포함하는 부속 모듈과 함께 발현된다.
측면 12. 측면6항 내지 측면10의 임의의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체 유형II 막 단백질 이 NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, KLRG1, CD94, CD161, 이의 변이체 및 이의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 13. 측면3의 SAR 있어서, 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인은 모두 단일 자연 발생 수용체로부터 유래되고, 하나의 연속적인 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다.
측면 14. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인이 2개 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된다.
측면 15. 측면14의 SAR에 있어서, 이는 a) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인에 조작적으로 연결되고; 또는 b) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 및 상기 선택적 힌지 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인에 조작적으로 연결되고; 또는 c) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 및 막관통 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 세포질 도메인에 조작적으로 연결된다.
측면 16. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인을 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인을 포함한다.
측면 17. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인을 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인이 결여된다.
측면 18. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및/또는 DAP10의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집한다.
측면 19. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인이 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다.
측면 20. 측면2의 상기 SAR에 있어서, 상기 하나 이상의 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM, ICOS, 이의 변이체 및 이의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 21. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 공동자극 도메인이 결여된다.
측면 22. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 상기 막관통 도메인과 상기 활성화 도메인 사이에 위치하는 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다.
측면 23. 측면2의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체가 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 이의 변이체 및 이의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
측면 24. 측면2항 및 제3의 SAR 있어서, 상기 SAR은 상기 자연 발생 수용체의 상기 세포외 항원 결합 도메인의 항원 결합 특성을 부분적으로 또는 완전히 보유하고, 상기 제1 모듈에 위치하는 상기 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인의 항원 결합 특이성을 획득한다.
측면 25. 측면1의 SAR에 있어서, 세포 표면 상에서 발현될 때 상기 세포 상에서 MHC(또는 HLA)-의존성 및/또는 MHC(또는 HLA)-비의존성 항원 인식을 부여할 수 있고, 여기서 a) 상기SAR의 상기 항원 결합 도메인은 단일 연속 폴리펩티드 사슬로 구성되지 않고; 및/또는 b) 상기SAR의 상기 항원 결합 도메인(들)은 항체 또는 항체 단편으로부터 유래되지 않고; 및/또는 c) 상기SAR은 T 세포 수용체 모듈을 포함하지 않는다.
측면 26. 측면25의 SAR에 있어서, 상기 SAR의 상기 항원 인식 도메인은 TCR의 적어도 2개의 가변 도메인으로부터 유도된다.
측면 27. 측면26의 SAR에 있어서, 상기2개의 가변 도메인은 Vα, Vβ, Vγ, Vδ 및 preTCRα로부터 선택되는 2개 이상의 가변 도메인의 이종이량체를 포함한다.
측면 28. 측면27의 SAR에 있어서, 상기 2개의 가변 도메인은 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ이다.
측면 29. 측면28의 SAR에 있어서, 상기 2개의 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 연결되지 않는다.
측면 30. 측면29의 SAR에 있어서, 이는 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이 아니다.
측면 31. 측면25의 SAR에 있어서, 이는 2개의 사슬을 가지고 및 하나 이상의 사슬은 막 회합이다.
측면 32. 측면31의 SAR에 있어서, 상기 두 사슬은 모두 막 회합이다.
측면 33. 측면25의 SAR에 있어서, 이는 MHC(HLA) 분자와 복합체 내의 펩티드에 결합할 수 있다.
측면 34. 측면25의 SAR에 있어서, 이는 세포 표면에서 발현될 때 펩티드/MHC 복합체에 결합될 때 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 능력을 부여한다.
측면 35. 측면25의 SAR에 있어서, 이는 세포 표면에서 발현될 때 펩티드/MHC 복합체에 결합될 때 적어도 하나의 신호전달 경로를 개시할 수 있는 능력을 부여한다.
측면 36. 측면25의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
측면 37. 측면36의 SAR에 있어서, 이는 기능적 CD3 복합체의 발현이 결여된 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
측면 38. 측면37의 SAR에 있어서, 이는CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
측면 39. 측면36의 SAR에 있어서, 이는 T 세포 유사 항원 인식을 비-T 세포에 부여할 수 있다.
측면 40. 측면36의 SAR에 있어서, 이는CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 T 세포에 T 세포 유사 항원 인식을 부여할 수 있다.
측면 41. 측면36의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에 대한 항원 인식 시 T 세포 유사 신호전달을 부여할 수 있다.
측면 42. 측면36의 SAR에 있어서, 이는CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 T 세포에 신호전달 유사 T 세포를 부여할 수 있다.
측면 43. 측면22의 SAR에 있어서, 이는 임의의 세포에T 세포 유사 항원 인식을 부여할 수 있다.
측면 44. 측면1의 SAR에 있어서, 적어도 2개의 사슬을 포함하고, 여기서 a) 제1 폴리펩티드 사슬은 vL, Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 및 b) 제2 폴리펩티드 사슬은 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 여기서, 상기 제1 항원 결합 도메인의 상기 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상기 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv- 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고; 및 여기서, 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다.
측면45. 측면44의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 항원-결합 도메인과 상기 제1 MAM 사이에 제1 펩티드 링커를 더 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 항원-결합 도메인과 상기 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 더 포함한다.
측면 46. 측면45의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
측면 47. 측면46의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
측면 48. 측면46의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
측면 49. 측면44 또는 측면45의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다.
측면 50. 측면45의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현, 친화성 및/또는 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다.
측면 51. 측면45의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 서열번호 3536-3569 및 9627-9631 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
측면 52. 측면44의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 MAM에 대한 제1 힌지 도메인 또는 이의 단편 N 말단을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM에 대한 제2 힌지 도메인 또는 이의 단편의 N-말단을 추가로 포함한다.
측면 53. 측면44의 SAR에 있어서, 상기 제1 MAM과 상기 제2 MAM 내의 잔기 및/또는 상기 제1 힌지 도메인 내의 잔기 및 상기 제2 힌지 도메인 내의 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함한다.
측면 54. 측면44의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 상기 제1 힌지 도메인에 제1 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고/하거나 상기 제2 폴리펩티드가 상기 제2 힌지 도메인에 제2 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고, 여기서 상기 2개의 상동성 항원 결합 도메인은 상응하는 상기 힌지 도메인과 동일한 자연 발생 비-T 세포 수용체로부터 유래된다.
측면 55. 측면44의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 상기 제1 MAM을 포함하는 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 선택적 활성화 도메인 C-말단을 포함하는 제1 세포질 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 선택적 활성화 도메인 C-말단을 포함하는 제2 세포질을 추가로 포함한다.
측면 56. 측면44의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 MAM의 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제1 부속 세포내 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 여기서 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제2 부속 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
측면 57. 측면56의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인이 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 선택된다.
측면 58. 측면44의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
측면59. 측면58의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 모두 단일 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 상기 막관통/막 고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
측면 60. 측면58의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 상이한 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 상기 막관통/막 고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
측면 61. 측면58의 SAR에 있어서, 상기2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인이 서열적으로 동일하고, 동일한 단백질로부터 유래된다.
측면 62. 측면58의 SAR에 있어서, 상기 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인이 서열이 상이하고 및/또는 상이한 단백질로부터 유래된다.
측면63. 측면58의 SAR에 있어서, a) 상기 비T 세포 수용체는 자연 발생 수용체이고, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 전술한 임의의 변형체, 및 이의 단편; 및 b) 상기 신호전달 어댑터는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: CD3ζ, FcRγ, DAP10, 전술한 임의의 변형체 또는 이의 단편.
측면64. 측면44의 상기SAR에 있어서, a) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ζ로부터 선택된 CD3 사슬의 상기 막관통 도메인 및 선택적 상기 세포질 도메인을 포함하지 않고; 및/또는 b) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 TCR 사슬 및 CD3 사슬의 상기 막관통 도메인을 포함하지 않고; 및/또는 c) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 CD3ζ의 상기 막관통 도메인을 포함하지 않는다.
측면65. 측면44의 SAR에 있어서, 상기MAM 중 단 하나가 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 T 세포 수용체로부터 유래된다.
측면66. 측면1의 SAR에 있어서, 적어도2개의 사슬을 포함하고, a) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 vL 도메인 및 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 또는 이의 변이체로부터 선택된 제1 TCR 불변 사슬을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하고; 그리고 b) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 vH, 도메인 및 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 또는 이의 변이체로부터 선택된 제2 TCR 불변 사슬을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고; 여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRα의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRβ의 불변 사슬이거나, 여기서 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRβ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRα의 불변 사슬이거나, 여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRγ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRδ의 불변 사슬이거나, 여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRδ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRγ의 불변 사슬이거나, 여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬 및/또는 상기 제2 TCR 불변 사슬은 이의 N-말단 영역에서 아미노산 잔기가 결여되어 있고, 상기 vL 및 vH 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고; 그리고 상기 제1 TCR 불변 사슬 및 상기 제2 TCR 불변 사슬은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다.
측면67. 측면66의 SAR에 있어서, a) 상기 TCRα 불변 사슬은 서열번호(PRT) 7863-7963을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및 b) 상기 TCRβ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 7964-8089을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및 c) 상기 TCRγ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 8091-8191을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및 d) 상기 TCRδ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 8192-8292를 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시된다.
측면 68. 측면44 또는 측면66의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬이 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인(AABD)을 추가로 포함한다.
측면69. 측면68의 상기SAR에 있어서, 상기 AABD가 단일 vH 도메인 (SVH), 단일 vL 도메인 (SVL), vHH 도메인, 단일 도메인 항체, TCR의 단일 가변 도메인 (svd-TCR), 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체의 리간드-결합 도메인, 리간드의 수용체-결합 도메인자가항원, 어댑터 결합 도메인, Fc 결합 도메인, 이의 단편 및/또는 이의 변이체 중 하나 이상으로부터 선택된다.
측면 70. 측면1의 상기 SAR에있어서, 상기 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 상기 모듈이 a) 세포 표면 단백질 항원, b) 펩티드/MHC 복합체 및 c) 지질 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
측면 71. 측면1의 상기 SAR에 있어서, 표적 항원이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되어 진다: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3; TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원((Tn Ag); 전립선특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종에서는 발현되지만 조혈 전구체에서는 발현되지 않는 당화된 CD43 에피토프, 비조혈성 암에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프, 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); 키트(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-beta); 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 연신율 2 돌연변이 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAlX); 프로테아좀(Prosome, Macropain) 서브유닛, 베타형, 9(LMP2); 당단백질 100 (GPL00); 브레이크포인트 클러스터 영역(BCR) 및 Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1(Abl)(bcr-abl)로 구성된 종양유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3; 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원(HMWMAA); o- 아세틸 -GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글리코세라미드(GloboH)의 globoH 헥사당 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ES0-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p(ETV6-AML)에 위치한 MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, PRAME, PSA, ETS 전좌 변이체 유전자 6; 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 살아남은; 텔로머라아제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1(MelanA 또는 MARTI)에 의해 인식되는 흑색종 항원; 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단 점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (transmembrane protease, serine 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N- 아세틸 글루코 사미 닐 트랜스퍼 라제 V (NA17); 짝을 이루는 상자 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-MYC 조류 골수세포종증 바이러스성 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB1 (CYPlB1); CCCTC-결합 인자 (징크 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절자의 형제), T 세포 3 (SART3)에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원; 짝을 이루는 상자 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); 앵커 단백질 4 키나제(AKAP-4); 활막 육종, X 중단점 2(SSX2); 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1 (RUl); 신장 유비쿼터스 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라아제; 열 쇼크 단백질 70-2 돌연변이 (MUT HSP70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 태그, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCRgamma-delta, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tn ag, CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-beta1 사슬, TCR-beta2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 류텐화 호르몬 수용체(LHR), 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR), 융모막 성선 자극 호르몬 수용체(CGHR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, 인플루엔자 A 헤마글루티닌(HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 시클라제 C(GCC), 데스모글레인 3에 대한 자동 항체(Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자가항체(Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1(TF1), AFP, GPRC5D, claudin18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널 및 SARS-CoV2 스파이크 단백질.
측면72. 측면1의 상기 SAR에 있어서, 상기 암호화된 SAR 폴리펩티드는 다음 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다: (i) 서열번호 2682-2918중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 80% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 기재된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 각각 11593-11829, 11830-12066, 12067-12303에 제시되고 vH에 속하는 CDR1, CDR2 및 CDR3에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 중사슬 가변 영역 (vH); ii) 서열번호 2440-2676 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 80% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 12440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 중 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 VL에 속하고 각각 10882-11118, 11119-11355 및 11356-11592에 제시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 경사슬 가변 영역 (vL); (iii) 서열번호 2924-3160 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 6개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열의 6개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 단일 사슬 가변 단편 scFV를 포함하는 vH에 속하고 각각 11593-11829, 11830-12066, 12067-12303에 제시된CDR1, CDR2 및 CDR3에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 단일 사슬 가변 단편 scFV를 포함하는 vL에 속하고 각각 10882-11118, 11119-11355 및 11356-1159에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv); (iv) 서열 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 중 3개 이상의 CDR에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 도메인 항체, vHH 도메인, SVH 및/또는 FHVH 도메인; (v) 서열번호 3366-3377 중 어느 하나에 기재된 임의의 서열 또는 서열번호 3366-3377 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3366-3377 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열에 의해 암호화되는 비면역글로불린 스캐폴드; (vi) 서열번호 3378-3395, 3880, 3882, 3886, 3893, 3896, 3897 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고 이의 동족에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 수용체의 리간드 결합; (vii) 서열번호 3396-3406, 10786-10787 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 리간드의 수용체 결합 도메인; (viii) 서열번호 3407-3435, 10771-10780 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 어댑터에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 어댑터 결합 도메인; (ix) 서열번호 10788-10791 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 자가항체 또는 자가항체 생산 세포에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 자가항원; (x) 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 임의의 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개 이상의 CDR에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 TCR 가변 영역 (Va, Vb, Vg 또는 Vd); (xi) 서열번호 9613-9614 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호9613-9614 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열 또는 임의의 하나에 기재된 서열의 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 9613-9614 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 가변 TCR 도메인 (svd-TCR).
측면73. 측면2또는 측면58의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터 또는 이의 단편은 서열번호 3743-3966, 3385, 3394, 7818-7822, 9633-9859로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면74. 측면2또는 측면58의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터의 상기 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9669-9704, 3813, 8721, 8733 및 8746으로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면75. 측면1, 측면2 또는 측면58의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터의 막관련 도메인은 서열번호 3914-3928, 9741-9776, 9852-9855로부터 선택된 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면 76. 측면1, 측면2 또는 측면58의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 세포질 도메인은 서열번호 3944-3958, 9777-9812, 9856-9859로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면 77. 측면16또는 측면55의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 활성화 도메인은 서열번호 9856-9859 및 9777로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면78. 측면9, 측면48및 측면56의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인이 서열번호 9807-9810으로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
측면 79. 측면1의 상기SAR에 있어서, 각 사슬의 N 말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호전달 펩타이드를 더 포함하고, 선택적으로 서열번호 2425-2430으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
측면80. 측면1의 상기 단리된 SAR폴리펩티드에 있어서, 상기 SAR이 SAR 이종이량체를 포함한다.
측면81. 측면1또는 측면80의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 폴리펩티드는 절단가능한 링커에 의해 연결되는 2개의 SAR 사슬을 포함한다.
측면82. 측면81의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 자가절단가능한 링커이다.
측면 83. 측면82의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는2A 링커, 2A 유사 링커 또는 이의 기능적 동등물 중 어느 하나 이상이다.
측면84. 측면83의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는T2A링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 동등물 중 어느 하나 이상이다.
측면85. 측면84의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 서열번호 3627-3632 중 어느 하나 이상의 서열을 포함한다.
측면86. 측면84의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 선택적으로 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이의 기능적 등가물에 의해 선행된다.
측면 87. 측면86의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 상기 퓨린 절단 부위는 서열번호3635-3636 중 어느 하나 이상의 서열을 포함한다.
측면88. 측면86-87의 어느 한 항에서의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 가요성 링커에 선행된다.
측면89. 측면88의 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 가요성 링커는 Ser-Gly 링커 또는 이의 기능적 등가물 중 하나 이상을 암호화한다.
측면90. 측면89의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 가요성 링커는 서열번호 3633-3634의 서열을 포함한다.
측면91. 측면88-90의 어느 하나에서의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 퓨린 절단 부위 다음에는 가요성 링커가 뒤따르고, 그 뒤에는 절단가능한 링커가 뒤따르도록 하여 순서가 퓨린 절단 부위-가요성 링커-절단 가능한 링커이다.
측면92. 측면1또는 측면80의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 SAR은 선택된 항원에 대해 원하는 결합 친화도를 갖도록 설계된다.
측면93. 측면1의 SAR에 있어서, 다음의 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 부속 모듈을 추가로 발현한다. a) 사이토카인 또는 이의 변이체; b) 막고정 사이토카인; c) 에피토프 태그를 갖는 막고정 사이토카인; d) 자살, 생존 및 마커 기능을 수행하는 다목적 스위치; e) 신호전달 어댑터 분자; 그리고 f) 킬 스위치.
측면 94. 측면93의 부속 모듈에 있어서, a) 상기 사이토카인은 서열번호 7833-7842를 갖는 서열 또는 이에 대해 최대70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 및 b) 상기 막고정 사이토카인은 서열번호 7825-7832를 갖는 서열 또는 이에 대해 최대 70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, c) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7843-7850을 갖는 서열 또는 이에 대해 70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, d) 상기 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및 DAP12 그룹에서 선택된다.
측면 95. 하기 화학식을 갖는 측면94의 다목적 스위치를 포함하는 폴리펩티드: SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4; SP는 상기 다목적 스위치의 세포 표면 수송을 허용하고 상기 성숙한 펩티드를 수득하기 위해 절단되는 선택적인 신호 펩티드이며, D1은 세포 생존을 촉진하는 수용체에 결합하는 수용체 결합 도메인이며, D2는 마커/자살 도메인이고, D3는 상기 D1 및 D2 도메인이 타겟 셀의 표면으로부터 멀리 투영될 수 있도록 하는 힌지 도메인/줄기 도메인이고, D4는 상기 다용도 스위치를 상기 세포막에 고정시키는 막회합 도메인이고, L1, L2 및 L3은 선택적 링커이다.
측면 96. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 다용도 스위치 폴리펩티드는 제1 모듈 (D1), (D2), (D3) 및 (D4)의 프레임내 융합체를 포함한다.
측면97. 측면96의 폴리펩티드에 있어서, a) D3 및 D4 모듈은 동일한 내인성 단백질에서 파생되고; 또는 b) D2, D3 및 D4 모듈은 상이한 내인성 단백질로부터 유래되고; 또는 c) D3 및 D4는 동일한 내인성 단백질로부터 유래되고; 또는 d) D3 및 D4는 상이한 내인성 단백질로부터 유래된다.
측면98. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈(D1)은 세포 표면 상에서 발현되는 수용체에 결합한다.
측면 99. 측면98의 폴리펩티드에 있어서, 상기 수용체가 결합될 때 상기 세포에 생존 및/또는 증식 신호를 전달한다.
측면100. 측면98의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈이 시스 내의 상기 수용체에 결합하고/하거나 상기 제1 모듈이 트랜스 내의 상기 수용체에 결합한다.
측면 101. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈(D1)은 사이토카인, 케모카인, 리간드, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 상기 수용체 결합 도메인을 포함한다.
측면 102. 측면101의 다용도 스위치에 있어서, 상기 D1은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, CD40L, 4-1BBL, CD30L, OX40L, FLT3-L, APRIL, BAFF, 란테스, MIP, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, SCF (줄기 세포 인자), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 전술한 임의의 것의 변이체 및 임의의 전술한 것의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 사이토카인, 케모카인, 리간드의 수요체 결합 도메인을 포함한다.
측면 103. 측면101의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D1은 서열번호 7833 내지 7842로 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
측면 104. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D1은 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일사슬 항체, scFv, 또는 수용체에 결합할 수 있는 비면역글로불린 항원 결합 모듈을 포함한다.
측면 105. 측면95및 제104의 폴리펩티에 있어서, 상기 D1은 IL2R, IL6R, IL7R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL15R, IL18, IL21 CCR1, CCR3, CCR5, MIP-1R, PF4 수용체, 에리스로포에이틴-수용체 (Epo-R), TPO-R/MPL, GSF-R, c-Kit, 및 M-CSF 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용체에 결합한다.
측면106. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 비내인성 폴리펩티드를 포함한다.
측면 107. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 내인성 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
측면108. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 하기 내인성 단백질 중 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD38, CD52, CD171; CS1 (SLAMF7, CD319); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3; 비씨마; Tn 항원 (Tn Ag); 전립선 특이 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); 티로신 키나제 3 (FLT3)와 같은 Fms; 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 발암배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); 키트(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-beta); 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAlX); 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 시알루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3; 고분자량-흑색종 관련 항원(HMWMAA); o- 아세틸 -GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글리코세라미드(GloboH)의 globoH 헥사당 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 안드로겐 수용체; T 세포 3(SART3)에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원; CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl), MPL, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Sialyl Lewis 항원); Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1/CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL11Ra, IL13Ra2, IL-17R, CD179b-IGLl1, TCRgamma-delta, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGFbetaR2, Lews Ag, TCR-beta1 사슬, TCR-beta2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 류텐화 호르몬 수용체(LHR), 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR), 성선 자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1(TF1), GPRC5D, Claudin18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, 저전도도 염화물 채널(LCCC), TAJ/TROY, MPL(TPO-R), KIR3DL2, CD32b, CD229, Toso, PD-1, PD-L1, PD-L2, TNFR1, TRAIL-R1(DR4), TRAIL-R2(DR5), CTLA4, IL-36R, CD25, LAG3, VEGF-A, MASP-2, 흉선 기질 림프포이에틴, 조직 인자, IFNAR1, IL5, IL-6, IL-12, IL-23, IL-17A, IL-13, 안지오포이에틴 유사 3, CGRP, IL-23p19, vWF, C5, IFNγ, CD4, CD8, CD7, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, PDGRFα, α4β7 인테그린, α4 인테그린, VEGF, GPIIb/IIIa PCSK9, Blys 및 BAFF-R.
측면 109. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 상기 다목적스위치를 발현하는 세포를 검출, 농축 및/또는 사멸시키는데 사용될 수 있는 작용제에 의해 결합될 수 있다.
측면 110. 측면109의 폴리펩티드에 있어서, 상기 작용제는 항체, 항체 단편, scFv, 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체 또는 이의 단편 또는 세포 중 하나 이상으로부터 선택된다
측면 111. 측면110의 폴리펩티드에 있어서, D2에 결합하는 상기 작용제가 생체내 또는 생체외 인간 임상용으로 승인된다.
측면 112. 측면111의 상기 폴리펩티드에 있어서, 상기 작용제는 리툭시맙, 허셉틴, 엔허투, 에르비트룩스, 아세트리스, 엔브렐, 트레멜리무맙, 모수네투주맙, 테클리스타맙, 도나네맙, 스페솔리맙, 파리시맙, 벨란타맙 마포도틴, 티스렐리주맙, 론카스툭시맙 테시린, 타파시타맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 큐벤드10으로부터 선택된다.
측면 113. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D3은 5-100개 아미노산 길이의 줄기(hinge domain) 서열을 포함한다.
측면 114. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호(PRT) 7843-7850, 서열번호(PRT) 9625 및 서열번호 9620-9624로 표시되는 아미노산 서열 또는 이에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
측면 115. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 7843-7849로 제시된 서열, 또는 서열번호 7843-7849로 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고, (i) J6M0에 결합하고; (ii) 벨란타맙 마포도틴에 결합하고 및 (iii) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 벨란타맙 마포도틴의 존재 하에 세포의 사멸을 유도한다.
측면 116. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 9620-9624로 제시된 서열, 또는 서열 9620-9624로 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고(i) QBEND10에 결합하고; (ii) 리툭시맙에 결합하고, (iii) T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 리툭시맙의 존재 하에 세포의 보체 매개 사멸을 유도한다.
측면 117. 측면95의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 9625로서 제시된 서열 또는 서열번호 9625로서 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고 (i) 허셉틴에 결합하고; (ii) 엔허투에 결합하고 (iii)는 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 허셉틴 또는 에네헤르투의 존재 하에 세포의 사멸을 유도한다.
측면 118. 측면1의 SAR의 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬 및/또는 측면93의 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 재조합 핵산(들).
측면 119. 측면118의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템으로서, 부속 함께 동시 발현되고, 상기 부속 모듈은 절두된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR), 절두된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절두된CD30(tCD30), 절두된BCMA(tBCMA), 절두된CD19(tCD19), CD34, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9(icaspase9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코스 산화효소, 데옥시리보뉴클레오시드 키나제, 홀스래디시-퍼옥시다제(HRP)/인돌-3-아세트산(IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나제 키메라, 독스-의존성 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나제(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 선택 마커, 다목적 스위치, vFLIP-K13, vFLIP-MC159, 4-1BBL-CD40L, DAP10, DAP12, NKG2C, CD94, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, 디하이드록시폴레이트 수용체(DHFR), 돌연변이 DHFR, 메틸화-DNA-단백질-시스테인 메틸트랜스퍼라제, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 II(IMDHP2), 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC), 블라스티시딘 내성 유전자, 돌연변이 칼시뉴에린 a/b(Can/b), CNa12, CNb30 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
측면 120. 측면119의 상기 재조합 발현 시스템에 있어서, 상기SAR의 1개 또는 2개의 사슬 또는 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 선택적 가요성 링커, 선택적 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 및 절단가능한 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된다.
측면 121. 측면120의 상기 재조합 발현 시스템에 있어서, 상기SAR의 1개 또는 2개의 사슬 및 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 i) 하나 이상의 프로모터; ii) 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES); iii) 하나 이상의 절단 가능한 링커; iv) I, II 및 III의 어떤 조합을 사용하여 발현된다.
측면 122. 측면121의 재조합 발현 시스템에 있어서, a) 상기 프로모터는 MNDU3 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터(서열번호 8505), EFS2 프로모터(서열번호 8506), RSV 프로모터(서열번호 8507), 또는 mutRSV 프로모터(서열번호 8508) 또는 이에 대해 70% 동일성을 갖는 서열이고; 그리고 b) 상기 IRES는 K-IRES (서열번호 8504) 또는 이에 대해 70% 동일성을 갖는 서열이다.
측면 123. 측면118의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및 측면119의 상기 재조합 발현 시스템을 포함하는 적어도 하나의 벡터로서, 상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터, 및 피기백 트랜스포존 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 124. 측면123의 상기 벡터에 있어서, 하나 이상의 구성적 프로모터 또는 조절가능한 프로모터를 포함한다.
측면 125. 측면104의 상기 벡터에 있어서, 상기 프로모터는 MNDU3 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터 (서열 8505), EFS2 프로모터 (서열 8506), RSV 프로모터 (서열 8507), 또는 mutRSV 프로모터 (서열 8508), CMV IE 유전자 프로모터, EF-1a 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, MSCV LTR 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 또는 합성 노치 (SynNotch) 프로모터로부터 선택된다.
측면 126. 측면123의 상기 벡터에 있어서, 상기 벡터가 시험관내 전사된 벡터이거나, 또는 상기 벡터가 폴리(A) 테일 또는 3'UTR을 추가로 포함한다.
측면 127. 측면1의 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드 또는 이종이량체, 측면118의 핵산, 측면119의 선택적 부속 모듈, 재조합 발현 시스템, 및 측면123의 벡터를 포함하는 이펙터 세포 또는 줄기 세포.
측면 128. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 세포는 복수의 단일 또는 이중사슬 SAR 폴리펩티드를 포함한다.
측면 129. 측면128의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 단일 또는 이중사슬 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드보다 상이한 항원을 표적으로 한다.
측면 130. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 동일한 항원을 표적으로 한다.
측면 131. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 항원에 대해 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드보다 상이한 결합 친화도를 포함한다.
측면 132. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드와는 상이한 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터를 포함한다.
측면 133. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드와는 상이한 세포외 도메인, 막관통 도메인, 세포질 도메인을 갖는다.
측면 134. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드는 억제성 수용체이다.
측면 135. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 활성화 수용체거나 또는 복수의 상기SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 억제성 수용체다.
측면 136. 측면127의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 상이한 신호전달 어댑터를 모집하고/하거나 상이한 신호전달 경로를 활성화시킨다.
측면 137. 측면127-136의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 α/β T 세포, γ/δ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, T 줄기 세포, Treg 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, iNKT(선천적 자연 살해 세포), NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, iPSC 유래 T 세포, B 세포, 대식세포/단핵구, 과립구, 수지상 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포 또는 그 유도체이다.
측면 138. 측면127-136의 어느 하나의 이펙터 세포의 집단에 있어서, 상기 세포의 집단이 복수의 다양한 SAR 폴리펩티드를 포함한다.
측면 139. 측면138의 상기 면역 또는 이펙터 세포의 집단에 있어서, 상기 복수의 다양한 SAR 폴리펩티드는 상이한 서열을 포함하지만 동일한 표적 항원 또는 상이한 항원에 결합한다.
측면 140. 측면127의 SAR-발현 이펙터 세포를 제조하는 방법에 있어서, 상기 SAR 폴리펩티드 및 상기 선택적 부속 모듈이 발현되도록 하는 조건 하에서, 측면123의 적어도 하나의 벡터 또는 측면118의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 이펙터 세포, 세포주, 조혈 줄기 세포, 전구 세포 또는 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는IPSC 내로 도입하는 것을 포함한다.
측면 141. 측면127의 상기 이펙터 세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 기능적 TCR, 기능적 HLA, β2 마크로글로불린, TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자에서 발현이 부족하거나 낮은 발현을 하고; 및/또는 HLA-E, 41BBL, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12, CD4, CD8, CD16, CD47, CD94, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, Fc 수용체, 인게이저, 또는 이중- 또는 다중특이성 또는 보편적인 결합제와 결합하기 위한 표면 유발 수용체 중 적어도 하나에서 도입되거나 증가된 발현이 있다.
측면 142. 측면127의 상기 이펙터 세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 제1 내인성 TCR 서브 유닛 및/또는 제2 내인성 TCR 서브 유닛의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
측면 143. 측면127의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ를 발현하지 않고, 비TCR 항원-인식 도메인 및 T 세포 수용체 모듈 (TCRM)을 포함하는 재조합 이중 사슬 SAR을 발현하도록 재조합 발현에 의해 변형되고, 여기서 상기 세포는CD3 사슬 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ, 및 CD3 사슬을 발현하고, 상기 SAR은 세포의 표면에 위치한 기능적 CD3-SAR 복합체를 형성한다.
측면 144. 측면127의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는T 세포 수용체 (TCR)를 발현하지 않는 및/또는 CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ를 발현하지 않고, 재조합 발현에 의해 변형되어 상기 세포에 외인성 재조합 이중사슬 TCR을 발현하고, 여기서 상기 재조합 이중사슬 TCR은 a) Vα 및 Vβ 도메인 또는 b) Vγ 및 Vδ 도메인 및 비-T 세포 수용체 모듈 (NTCRM)을 포함하는 TCR항원 인식 도메인을 포함하는 SAR이다.
측면 145. 측면144의 상기 이펙터 세포에 있어서, 비-T 세포 수용체 및/또는 신호 어댑터로부터 유래된 제1 MAM 및 제2 MAM를 포함하는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 TCR 항원 인식 모티프를 포함하고, 선택적인 세포질 공동자극 도메인을 추가로 포함한다.
측면 146. 측면143-145의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, B 세포, 과립구, 대식세포/단핵구, 수지상 세포, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ 사슬중 하나 이상이 결핍된 T 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 147. 측면127의 이펙터 세포를 생성하는 방법에 있어서, 체외 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포 집단 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 상기 RNA 또는 RNA들은 측면118의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
측면 148. 대상체에서 항질병 면역을 제공하는 방법으로서, 면역 이펙터 세포 또는 측면127-146항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는 줄기 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포는 자가 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가 NK 세포 또는 동종이계 NK 세포이고, 또는 자가 대식세포 또는 동종 대식세포, 또는 자가 과립구 또는 동종 과립구, 또는 자가 수지상 세포 또는 동종 수지상 세포, 또는 자가 조혈 줄기 또는 동종 조혈 줄기 세포 또는 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는 자가 또는 동종 iPSC이다.
측면 149. 측면148의 상기 방법에 있어서,상기 동종 T, NK, 대식세포, 과립구, 수지상 세포, 조혈 줄기세포 또는 iPSC는 기능적 TCR, 기능적 HLA, β2 마크로글로불린, TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자에서 발현이 부족하거나 낮은 발현을 하고; 및/또는 HLA-E, 41BBL, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12, CD4, CD8, CD16, CD47, CD94, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, Fc 수용체, 인게이저, 또는 이중- 또는 다중특이성 또는 보편적인 결합제와 결합하기 위한 표면 유발 수용체 중 적어도 하나에서 도입되거나 증가된 발현이 있다.
측면 150. 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는 방법에서, 상기 표적세포를 측면127의 이펙터 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 SAR은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
측면 151. 측면150의 방법에 있어서, SAR-발현 이펙터 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원 및 표적 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 작용제와 표적 세포를 접촉시키는 것을 더 포함한다.
측면152. 측면151의 방법에 있어서, 상기 작용제가 SAR-발현 이펙터 세포를 상기 작용제에 의해 표적화된 항원을 발현하는 표적 세포로 리디렉션할 수 있다.
측면 153. 측면151의 방법에 있어서, 상기 작용제가 항체, 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE) 또는 이의 조합이다.
측면 154. 측면151의 방법에 있어서, 상기 이펙터 세포는 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인을 포함하는 SAR을 발현한다.
측면 155. 측면154의 방법에 있어서, 상기 SAR은CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1 및 CD161으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인을 포함한다.
측면 156. 측면151의 방법에 있어서, 상기 작용제는 상기SAR을 포함하는 상기 자연 발생 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 특징적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TriKE) 이다.
측면 157. 측면151 또는 측면156의 방법에 있어서, 상기 작용제는 a) SAR을 포함하는 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편; 및/또는 b) SAR의 일부가 아닌 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인에 결합한다.
측면 158. 측면151또는 측면157의 방법에 있어서, 상기 작용제는 하나 이상의 자연 발생 공동자극 수용체의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
측면 159. 측면151또는 측면157의 방법에 있어서, 상기 작용제는 하나 이상의 자연 발생 활성화 수용체의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
측면 160. 측면151또는 측면157의 방법에 있어서, 상기 작용제는 공동자극 도메인을 포함하는 SAR의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
측면 161. 측면151또는 측면157의 방법에 있어서, 상기 작용제는 활성화 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 SAR의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
측면 162. 측면154또는 측면155의 방법에 있어서, 상기SAR이 Fc 수용체의 상기 세포외 도메인을 발현하고, 상기 작용제는 Fc 도메인을 포함하는 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)이다.
측면 163. 측면162의 방법에 있어서, 상기 Fc 수용체는 CD16A, CD16B, CD64, CD32 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상이다.
측면 164. 측면151의 방법에 있어서, 상기 표적 항원이 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다.
측면 165. 측면148 또는 측면149의 방법에 있어서, 상기 대상체는 면역 세포의 생존, 증식, 분화 및/또는 효능을 조절하는 작용제와 조합된 합성 항원 수용체 (SAR) 분자를 포함하는 측면123-146 중 하나의 면역 이펙터 세포의 유효량을 투여받고, 여기서 작용제는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 단백질 포스파타제 억제제; b) 키나제 억제제; c) Lck 키나제 억제제; d) SAR-발현 이펙터 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원 및 표적 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원에 결합하는 작용제; e) 사이토카인; f) 면역 억제 분자의 억제제; g) TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 작용제; h) SAR-변형된 세포의 증식 및/또는 지속성을 증가시키는 작용제; i) 케모카인; j) SAR의 발현을 증가시키는 작용제; k) SAR의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작용제; l) SAR-변형된 세포의 생존 및/또는 지속성을 제어할 수 있는 작용제; m) SAR-변형된 세포의 부작용을 조절하는 작용제; n) Brd4 억제제; o) 질환의 부위에 치료제 또는 예방제를 전달하는 작용제; p) SAR이 지시되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 작용제; q) 상기 SAR과 공동 발현된 다목적 스위치에 결합하는 작용제; 및 r) 아데노신 A2a 수용체 길항제.
측면 166. 측면1의 SAR 폴리펩티드 분자, 측면118의 폴리뉴클레오티드, 측면119의 벡터, 측면127-146항 중 어느 한 항의 세포, 및/또는 측면151항 및 측면165의 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
측면 167. 측면166의 약학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 표적 항원 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
측면 168. 측면167의 상기 방법에 있어서, 상기 표적 항원 관련 질환은 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 면역질환, 알레르기성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환 및 비-암 관련 적응증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
측면 169. 측면168의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 원발성 삼출 림프종(PEL), 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 백혈병 전단계의 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암이다.
측면 170. 측면168의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 암은 결장암, 직장암, 신장세포암종, 간암, 폐의 비소세포암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암이고, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형암, 방광암, 신장암, 요관암, 신장 골반암, 중추신경계(CNS) 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피양암, 편평세포암, T세포 림프종, 환경유발암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
측면 171. 측면168의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 질환이 코로나바이러스, SARS-CoV2 및 변이체, HIV1, HIV2, HTLV1엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 아데노 바이러스, 아데노관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, 메르스 및 사르스 코로나 바이러스, 크리미안 콩고 출혈 열 바이러스, 라이노 바이러스, 엔테로 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 라이노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2, 수두 및 포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 밸리 열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스로 구성된 바이러스에 의한 감염, 또는 결핵균, 비전형 결핵균 종, 폐종균, 톡소플라즈마증, 리케치아, 노카르디아, 아스페르질루스, 뮤코르 또는 칸디다와 감염과 관련이 있다.
측면 172. 측면168의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 질환은 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 강직성 척추염, 호시모토 갑상선염, SLE, 사르코이드증, 경피증, 혼합성 결합 조직 질환, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 또는 퇴행성 질환이다.
측면 173. 측면93의 다목적스위치 및 SAR을 암호화하는 벡터의 형질 도입 효율을 조사하기 위한 방법에 있어서, 상기 벡터로 형질 주입 또는 형질 도입되는 세포의 표면상에서 상기 다목적 스위치의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
측면 174. 측면95의 SAR을 발현하는 세포를 선택하는 방법에 있어서, 다음의 단계를 포함한다: i) 측면140항에 따라 벡터로 형질 주입 또는 형질 도입된 세포의 표면 상의 상기 다용도 스위치의 발현을 검출하는 단계; 및 ii) 상기 다목적 스위치를 발현하는 것으로 식별되는 세포를 선택하는 단계.
측면 175. SAR을 발현하는 세포에 대해 농축된 세포의 정제된 집단을 준비하는 방법으로서, 측면174에 따른 방법을 사용하여 세포 집단으로부터 SAR을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
측면 176. 측면175의 방법에 있어서, 다음의 단계들을 포함한다: i) 환자로부터 외부에서 분리된 세포의 집단을 측면140항에 따라 벡터로 형질 도입 또는 형질 주입하는 단계; 및 ii) 측면174에 따른 방법에 의해 형질 도입/형질 감염된 세포 집단으로부터 상기SAR을 발현하는 세포를 선택하는 단계.
측면 177. 세포집단으로서, 이는 측면94-117의 다목적 스위치 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 농축되고, 따라서 SAR을 발현하는 세포에 대해 농축된다.
측면 178. 생체 내에서 형질 도입된 세포를 추적하는 방법으로서, 세포 표면에서 측면173의 어느 하나에 따른 다용도 스위치 폴리펩티드의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
측면 179. 측면127의 세포를 삭제하는 방법으로서, 상기 세포를 상기 다목적 스위치를 포함하는 부속 모듈에 결합하는 제제에 노출시키는 단계를 포함하는 세포를 삭제하는 방법.
측면 180. 측면179의 방법에 있어서, a) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7843-7850을 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 벨란타맙 마포도틴이고; b) 상기 다목적 스위치는 서열번호9620-9624을 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 리툭시맙 또는 CD20 항체이고; c) 상기 다용도 스위치는 서열번호 9625를 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 허셉틴, 엔허투 또는 Her2 표적 항체이고; 및 d) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7850 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 아드세트리스 또는 CD30 표적 항체이다.
측면 181. 적어도 하나의 측면1의 SAR 폴리펩티드 분자, 측면93의 부속 모듈, 측면94의 다목적 스위치, 측면118의 재조합 폴리뉴클레오티드, 측면119의 재조합 발현 시스템, 측면123의 벡터 또는 측면127의 세포, 측면151항 및/또는 측면165의 작용제 및 측면166의 조성물을 포함하는 키트.
측면 182. 측면140의 방법에 있어서, a) 생체 외; b) 생체 내; 또는 c) 생체 외 및 생체 내에서 수행된다.
측면 183. 측면1의 SAR에 있어서, 적어도2개 이상의 사슬을 포함하고, a) 제1 폴리펩티드 사슬은 Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 및 b) 제2폴리펩티드 사슬은Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 상기 제1 항원 결합 도메인의 상기 Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상기 상보적 Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하는 단계; 그리고 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다.
측면 184. 측면183의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 항원 결합 도메인과 상기 제1 MAM 사이에 제1 펩티드 링커를 더 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 항원 결합 도메인과 상기 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 더 포함한다.
측면 185. 측면184의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다.
측면 186. 측면183의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 MAM을 포함하는 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 제1 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 제2 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다.
측면187. 측면183의 상기SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 MAM의 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제1 부속 세포내 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제2 부속 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
측면 188. 측면187의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 선택된다.
측면 189. 측면183의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 비-T 세포 수용체의 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
측면 190. 제189의 SAR에 있어서, a) 상기 비T 세포 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 전술한 이들 중 어느 하나의 변이체 및 이의 단편; 및/또는 b) 상기 신호전달 어댑터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3ζ, FcRγ, DAP10, 전술한 이들 중 어느 하나의 변이체 및 이의 단편.
측면 191. 측면183의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에서 발현될 때, T 세포 수용체 유사 표적 결합 인식 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터의 모집 및/또는 적어도 하나의 신호전달 경로의 활성화를 부여한다.
측면 192. 측면167의 방법에 있어서, 상기 대상체에게 a) SAR 발현 이펙터 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여로 인한 독성을 예방 또는 역전시키기 위해; 및/또는 b) SAR 발현 이펙터 세포의 고갈을 방지하거나 역전시키기 위해 치료 유효량의 티로신 키나제 억제제를 추가로 투여된다.
측면 193. 측면192의 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 Lck 억제제이다.
측면 194. 측면192의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 다사티닙 또는 포나티닙이다.
측면 195. 측면192의 상기 방법에 있어서, 치료는 상기 대상체에서 T 세포에 의한 IL-2의 분비를 증가시킨다.
측면 196. 측면192의 상기 방법에 있어서, 치료는 상기 대상체에서 T 세포의 아폽토시스를 감소시킨다.
측면 197. 측면192의 상기 방법에 있어서, 치료는 PD-1, TIM-3, 및 LAG-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 고갈 마커의 발현을 감소시킨다.
측면 198. 측면192의 상기 방법에 있어서, 치료는 CD62L 또는 CCR7의 발현을 증가시킨다.
측면 199. 측면192의 상기 방법에 있어서, 다중 주기의 치료가 상기 대상체에게 투여된다.
측면 200. 측면192의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 간헐적으로 투여된다.
측면 201. 측면192의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 적어도 부분적인 T 세포 기능을 회복시키기에 충분한 기간 동안 투여된 후 중단된다.
측면 202. 측면192의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 경구로 투여된다.
측면 203. 측면192의 상기 방법에 있어서, 대상체에게 투여된 유전자 조작 T 세포와 관련된 상기 독성은 사이토카인 방출 증후군이다.
측면 204. 측면192의 상기 방법에 있어서, 대상체에게 투여된 유전자 조작 T 세포와 관련된 상기 독성은 온-타겟 오프 종양 독성 또는 오프-타겟 오프-종양 독성이다.
측면 205. 측면192의 상기 방법에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
측면 206. T 세포의 표적 인식 특성 및 기능을 갖는 T 세포가 아닌 세포로서, 상기 세포는 a) TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCR의 그룹으로부터 선택된 하나 또는 모든 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편의 발현이 결여되고; 및/또는 b) CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CD3 사슬의 발현이 결여되고; 및/또는 c) 기능적 TCR 모듈(TCRM)을 형성하는 능력이 부족하다.
측면 207. 측면206의 세포에 있어서, 이는 TCRM을 포함하는 이중사슬 수용체를 발현하고 T 세포의 세포 표적 인식 특성을 부여한다.
측면 208. 측면207의 세포에 있어서, 이는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 항원 결합 모듈을 형성할 수 있는 수용체를 세포 표면 상에서 발현할 수 있다.
측면 209. 측면208의 수용체에 있어서, 여기서 상기TCR-Fv를 포함하는 상기2개의 가변 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬의 일부가 아니다.
측면 210. 측면206의 세포에 있어서, 여기서 상기 TCR-Fv를 포함하는 상기 2개의 가변 도메인은 a) Vα 및 Vβ, 또는 b) Vγ 및 Vδ이다.
측면 211. 표적 항원을 나타내는 표적 세포를 사멸하는 방법은 상기 표적 세포를 측면206의 상기 이펙터 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 세포는 상기 표적 항원을 특이적으로 인식한다.
측면 212. 측면210의 세포에 있어서, 이는 이의 표적 펩티드 항원을 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.
측면 213. 측면206의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
측면 214. 측면206의 세포 또는 측면213의 약학적 조성물을 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 표적 항원 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
측면 215. T 세포 수용체 유사 항원을 갖는 측면206의 비T 세포를 제조하는 방법.
측면 216. 측면215의 방법에 있어서, TCR 유사 항원을 갖는 비-T 세포는 a) TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα 사슬, 또는 b) TCRα 및 TCRβ 사슬의 이량체, 또는 c) TCRγ 및 TCRδ 사슬의 이량체, 또는 d) preTCRα 및 TCRβ 사슬의 이량체를 발현하지 않는다.
측면 217. 측면215의 방법에 있어서, 상기 방법은 a) TCR 사슬의 외인성 발현, 또는 b) CD3ε, CD3γ 및 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 CD3 사슬의 외인성 발현을 수반하지 않는다.
측면 218. 측면215의 방법에 있어서, 상기 방법은 단일 유전자 변형을 수반한다.
측면 219. 측면215의 방법에 있어서, 상기 방법은 이중사슬 수용체를 암호화하는 1 또는 2개의 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 수반한다.
측면 220. 측면210의 세포에 있어서, 이는 NK 세포, iNKT(선천적 자연 살해 세포), g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, B 세포, 대식세포/단핵구, 과립구, 수지상 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포주, NKG 세포주 또는 이의 유도체이다.
측면 221. 유형 II 막관통 단백질과 유형 I 막관통 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질 사이의 단리된 융합 단백질.
측면 222. 측면221의 단리된 융합 단백질에 있어서, 유형II단백질의 상기 세포질, 막관통 및 부분적인 또는 전체 세포외 도메인이 유형I 막관통 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질의 상기 세포외 도메인에 융합하는 것을 포함한다.
측면 223. 측면221의 단리된 융합 단백질에 있어서, 여기서 상기 유형I막 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드의 상기 N-말단은 N-말단에서 C-말단 배향에 있는 II형 단백질의 상기 C-말단에 조작적으로 연결된다.
측면 224. 측면221의 융합 단백질을 만드는 방법에 있어서, a) 상기 유형 I막 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 유형II단백질의 상기 부분 또는 전체 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클리오티드의 3' 말단에 프레임에 융합시키는 단계; 및 b) 상기 융합 단백질의 발현을 허용하도록 적합한 세포에 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함한다.
측면 225. 측면221의 융합 단백질을 만드는 방법에 있어서, 여기서 상기 융합 단백질은 특정 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 또는 합성 항원 수용체를 암호화한다.
측면 226. 측면224항에 의해 제조된 세포, 측면221의 융합 단백질을 발현하는 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
측면 227. 측면226의 조성물을 이용한 치료 방법.
측면 228. 서열번호 1600-2328, 4851-5129, 5451-6282, 7160-7170, 7601-7747, 8768-9602로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열 또는 상기 중 어느 하나에 제시된 합성 면역 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 합성면역 수용체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드
측면 229. 서열번호 3994-4722, 5151-5429, 6283-7114, 7852-7862, 8293-8439, 9860-10694, 10832-10841, 12304-12311로 이루어진 그룹 또는 상기 중 어느 하나에 기재된 합성 면역 수용체를 암호화하는 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 아미노산 서열
예제
상이한 세포 표면 및 세포내 항원을 표적으로 하는 상이한 구축물의 세포독성을 측정하기 위해 루시페라제(luciferases) (예를 들어, GLuc 또는 NLuc)를 발현하도록 조작된 세포주가 표 A에 제공된다. 이들 실험에 사용된 세포주, 세포주상의 표적 항원 및 이의 성장 배지는 다음 표 A와 같다. 세포는 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양되었다. 세포주는 ATCC, NIH AIDS 시약 프로그램으로부터 입수하거나 실험실에서 입수할 수 있었다.
NFAT-의존성 EGFP(또는 GFP) 리포터 유전자로 조작되고 JNG로 명명된 Jurkat 세포주(클론 E6-1)는 샌프란시스코 캘리포니아 대학(University of California San Francisc)의 Arthur Weiss 박사의 선물이었으며 CAR-신호전달을 연구하는 것으로 설명되었다((Wu, CY et al., Science 350: 293-302,2015). Jurkat 세포는 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지되었다. NK92MI 세포는 ATCC로부터 입수하였고, 제공된 지침에 따라 유지하였다. NK92 세포는 또한 ATCC로부터 얻었고, 20% FBS 및 200 U/mL의 hIL2와 함께 RPMI 배지에서 유지되었다. T2 세포는 ATCC로부터 제공되었다.
SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터의 생성
SAR 구축물은 렌티바이러스, 레트로바이러스 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터에서 복제되었다. 예시적인 벡터는 서열번호 1 내지 6으로 제공된다. 본원의 SAR을 생성하기 위해 사용될 수 있는 다른 벡터는 당업계에 공지되어 있다. psPAX2 벡터는 디디에 트로노(Addgene 플라스미드 #12260)로부터 선물받았다. pLP/VSVG 외피 플라스미드 및 293FT 세포는 Invitrogen(ThermoFisher Scientific)으로부터 입수하였다. 레트로바이러스 전달 벡터 MSCVneo, MSCVhygro 및 MSCVpac 및 패키징 벡터 pKAT는 이전에 설명되었다(PCT/US2018/53247). SAR 생성 방법(예: 2세대 CAR, SIR, Ab-TCR 및 TFP 등), GGS-NLuc 융합 단백질의 생성 및 사용, 및 루시페라아제의 생성 및 사용 (예를 들어, GLuc 및 Luc146-1H2), Matador검정을 이용한 세포독성의 측정을 위한 리포터 세포주 (PCT/US2017/024843, PCT/US2017/025602, PCT/US2017/052344, PCT/US2017/064379 및 PCT/US2018/53247)가 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 그 전체가 포함된다.
SAR의 항원 결합 도메인을 포함하는 서열은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 (예: ThermoFisher 또는 IDT) 및 상용 공급 업체 (예: IDT)를 사용하여 코돈 최적화되고 인위적으로 합성된다. 생성된 단편은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 상이한 SIR 골격을 함유하는 상이한 벡터에서 PCR 증폭 및 복제된다. 일반적으로, SAR 구축물은 전형적으로 렌티바이러스 벡터에 복제된다. SIR 구축물의 서열은 자동 시퀀싱을 사용하여 확인된다.
예시적인 SAR 작제물 암호화 벡터는 pCCLc-MNDU3-Nhe-CD8SP-R1-NY-ESO-IG4-Vb-Xho-TCRβECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-NY-ESO-IG4-Va-Mlu-TCRαECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-Xba-PAC-Sal-ΔWPRE (서열번호 9366)이다. 이 구축물은 pCCLc-MNDU3-델타-WPRE 렌티바이러스 벡터 골격(서열번호 6)에 복제된다. 상기 벡터는CD8 신호펩티드(서열번호 31), EcoR I 사이트, NY-ESO-1 을 표적으로 하는TCR (IG4) 의 Vβ/Vb 도메인(서열번호966), Xho I 사이트, TCRβECD 링커 (또는 TCRβ-Ig3; S서열번호1166) , BamH I 제한 사이트, 인간 CD3z의 세포외, 막관통, 세포질 도메인을 포함하는CD3zECDTMCP-opt 신호전달 사슬(서열번호1089) , Furine 절단 사이트, P2A 절단가능한 링커, Spe I 제한 사이트, 신호 펩티드, Bst I 제한 사이트, NY-ESO-1 peptide/HLA-A2을 표적으로 하는 TCR (IG4)의 Vα/Va 도메인(서열번호966), Mlu I 사이트, TCRαECD 링커(또는TCRa-Ig3; 서열번호1168), Kpn I 제한 사이트, 인간 CD3z의 세포외, 막관통, 세포질 도메인을 포함하는 제2 CD3zECDTMCP-opt2 신호전달 모듈(서열번호10816), Furine 절단 사이트, F2A 절단가능한 링커, Xba I 제한 사이트, 푸로모이신 내성(PAC) 카세트 및Sal I 절단 사이트를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는SAR 구축물의 발현을 구동하는 MNDU3 프로모터를 포함한다. 발현 카세트는 항원 결합 도메인 단편 (예를 들어, Vb, Va, vL 및 vH 도메인), 링커 (예를 들어, TCRβECD, TCRαECD, IgCL 또는 IgG-CHI), 또는 신호전달 사슬 (예를 들어, CD3zECDTMCP-opt 및 opt2)을 포함하는 상이한 모듈을 절단하고, 상이한 모듈로 대체할 수 있도록 많은 편리한 제한 부위를 갖는다. 따라서, 당업자는 임의의 다른 새로운 항원을 표적으로 하고 상이한 링커 및 신호전달 사슬을 포함하는 SAR을 생성하기 위해 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체의 vL 및 vH 도메인)의 이러한 벡터 및 서열을 사용할 수 있다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터
렌티바이러스는 이전에 기술된 (Natarajan et al, Scientific Reports, 10:2318) 및 PCT/US2018/53247 본질적으로 폴리에틸렌 아민 (PEI)을 사용하여 상이한 SAR 구축물 및 2세대 또는 3세대 패키징 플라스미드를 암호화하는 전달 플라스미드의 형질 감염에 의해 293FT 세포에서 만들어졌다. 293FT 세포는 10% FCS(이로써 DMEM-10으로 지칭됨)와 함께 DMEM에서 성장하였다. 형질 감염 후 약 48-72시간 후, 모든 배지를 수집, 풀링 및 1000rpm에서 1분 동안 원심 분리하여 세포 파편 및 비부착성 세포를 제거했다. 무세포 상청액을 0.45 μm 시린지 필터로 여과하였다. 일부 경우에, 상청액을 4℃에서 2시간 동안 18500rpm에서 원심 분리하여 추가로 농축하였다. 바이러스 펠릿을 XVIVO 배지에서 초기 부피의 1/10로 재현탁시켰다. 바이러스는 표적 세포를 감염시키기 위해 신선하게 사용되거나 -80℃에서 분취량으로 냉동 보관되었다.
T 세포, NK 세포 및 PBMC의 감염
백혈구 연층 세포(Buffy coat cells)는 로스앤젤레스 아동 병원의 혈액 은행에서 비식별된 건강한 성인 기증자로부터 얻었고 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하는 데 사용되었다. PBMC는 그 자체로 사용되거나 자성 마이크로비드(Miltenyi Biotech)를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 T 세포 또는 NK 세포를 분리하는 데 사용되었다. PBMC 또는 분리된 T 세포를 10 ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2로 대체된 XVIVO 배지(Lonza)에 재현탁시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양되었다. 세포는 렌티바이러스 벡터로 감염되기 전에 1일 동안 상기 배지에서 활성화되었다. 일반적으로, 일차 세포(예를 들어, T 세포)는 8 μg/ml의 폴리브렌(Polybrene®(시그마, 카탈로그 번호 H9268)의 존재 하에 XVIVO 배지에 재현탁된 300μl의 농축된 바이러스와 함께 37℃에서 90분 동안 1800rpm을 사용하여 아침에 감염되었다. 저녁에 매체를 교체하고 이틀 더 감염을 반복하여 총 3건의 감염을 가했다. 3차 감염 후, 세포를 펠릿화하고 10ng/ml CD3 항체, 10ng/ml CD28 항체 및 100IU 재조합 인간-IL2를 포함하는 신선한 XVIVO 배지에 재현탁하고 각각의 항생제(지시된 경우)를 보충하고 달리 명시되지 않는 한 선택을 위해 세포 배양 플라스크에 넣었다. 세포 배양을 상기 배지에서 10-15일 동안 배양하였는데, 약물 선택을 사용하지 않은 경우에는 20-30일 동안 배양하였다. JNG 및 암 세포주의 감염을 위해, 대략 500,000개의 세포를 폴리브렌(Polybrene®(시그마, 카탈로그 번호 H9268)으로 총 부피 3 ml의 비농축 바이러스 상청액 2 ml로 감염시켰다. 이어서, 다음날 아침, 세포를 펠릿화하고, 적절한 경우 각각의 항생제와 함께 배지에 재현탁시키고, 선택을 위해 세포 배양 플라스크에 넣었다. 1차 NK 세포는 폴리브렌®이 없는 농축된 렌티바이러스 벡터로 감염되기 전에 24-96시간 동안 NK 활성화 비드(Miltenyi Biotech)로 자극되었다. 세포는 분석 전에 NK 배지에서 IL-2를 포함하는 배지에서 확장되었다.
건강한 기증자의 혈액을 NK 세포 분리 키트(Miltenyi)를 사용하여 NK 세포를 분리하는 데 사용했다. NK92 세포는 ATCC로부터 입수하였다. NK Primary 및 NK92 세포는 20% 소 태아 혈청, 0.2mM 이노시톨, 0.1mM 2-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 1.5g/L 중탄산나트륨, 0.02mM 엽산이 보충된 리보뉴클레오시드와 디옥시 리보뉴클레오시드가 없는 최소 필수 배지(MEM) 알파에서 배양되었다. NK92 세포의 경우, 배지에 200 IU/ml IL2를 추가로 보충하였다. NK 일차 세포는 감염 전 7일 동안 500IL/ml의 IL2로 배양 및 활성화되었다. 렌티바이러스 감염은 6-웰 플레이트에서 스핀 감염에 의해 농축된 렌티바이러스 상청액으로 수행되었다. 1차 NK 세포의 경우, 500 IU/ml IL2가 보충된 1.5 ml 배양 배지에 약 400만 개의 NK 세포가 폴리브렌 없이 500μl 농축 바이러스에 감염되었다. NK92 세포의 경우 6ug/ml 폴리브렌을 사용했다. 플레이트를 2,800rpm에서 90분 동안, 32℃에서 5시간 동안 원심 분리하였다. 배지는 5시간 후에 교체하였고, 감염은 다음날 반복하였다.
렌티바이러스 벡터 생산을 위해 상술한 바와 본질적으로 유사한 절차를 레트로바이러스 벡터의 생성에 사용하였는데, 293FT 세포가 일반적으로 10 μg의 레트로바이러스 구조체, 4μg의 pKAT 및 2μg의 VSVG 플라스미드를 사용하여 10 ml의 DMEM-10 배지 중의 10 cm 조직 배양 플레이트에 형질 감염되었다. 표적 세포의 바이러스 수집 및 감염은 렌티바이러스 벡터에 대해 본질적으로 전술한 바와 같이 수행되었다.
항체, 펩타이드 및 약물
NY-ESO1 (서열번호 10880), MAGE-A3-270-270 (서열번호 10878) 및 MAGE-A3-112-120 (서열 10879) 펩티드를 Genscript에 의해 합성하였다. 디지토닌은 Sigma(Cat. no D141)에서 구입하여 DMSO에서 100mg/ml의 원액을 만들었다. PBS에서 1mg/ml의 희석된 스톡을 만들었다. 세포 용해에 사용된 디지토닌의 최종 농도는 달리 명시되지 않는 한 30μg/ml였다.
ELISA
인간 IL2, IFNγ, IL6 및 TNFα는 R&D systems(미네소타주 미니애폴리스)와 BD Biosciences로부터 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 사용하여 24 내지 96시간 동안 특정 표적 세포주와 공동 배양된 CAR-발현 Jurkat-NFAT-GFP 이펙터 세포 또는 T 세포의 세포 배양 상청액에서 측정되었으며, 제조사의 권고에 따랐다.
SAR의 발현 검출을 위한 FACS 분석
마우스 항-인간 c Myc APCconjugated Monoclonal 항체 (카탈로그 # IC3696A)는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 받았다. 비오티닐화 단백질 L은 GeneScript(Piscataway, NJ)에서 구입하여 1mg/ml의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 재구성하고 4℃에서 보관했다. 스트렙타비딘-APC(SA1005)는 ThermoFisher Scientific으로부터 구입하였다. APC 표지 NY-ESO-1/HLA-A2 및 MAGE-A3(270-279)-HLA-A2 사량체는 에모리 대학의 NIH 사량체 시설에서 얻었다. 이들은 NY-ESO1 (서열번호 10880) 및 MAGE-A3-270-279 (서열번호 10878) 펩타이드를 표적으로 한다.
사량체를 사용한 SAR 검출을 위해 1 × 106 세포를 수확하고 4% 소 혈청 알부민(BSA) 세척 완충액을 함유하는 얼음처럼 차가운 1 × PBS 3ml로 3회 세척했다. 세척 후, 세포를 10 μl의 APC-접합 사량체를 함유하는 0.1 ml의 빙냉 세척 완충액에 재현탁시키고, 1시간 동안 암실에서 인큐베이션한 후, FACS에 의해 분석하기 전에 빙냉 세척 완충액으로 2회 세척하였다.
단백질 L 염색을 사용하여 SAR을 검출하기 위해 1 × 106 세포를 수확하고 4% 소 혈청 알부민(BSA) 세척 완충액을 함유하는 얼음처럼 차가운 1 × PBS 3ml로 3회 세척했다. 세척 후, 세포를 4℃에서 1시간 동안 단백질 L 1μg을 함유하는 빙냉 세척 완충액 0.1ml에 재현탁시켰다. 세포를 얼음-찬 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 30분 동안 세척 완충액 0.1 ml 중 APC-접합 스트렙타비딘 10μl와 함께 (암실에서) 배양한 후, 빙냉 세척 완충액으로 2회 세척하였다. FACS는 BD Biosciences의 FACSVerse 분석기를 사용하여 수행되었다.
세포 사멸 분석
세포 사멸을 측정하기 위해 PCT/US2017/052344 "비방사성 세포독성 분석"에 설명된 대로 Gluc, NLuc 또는 내열성 비틀 루시페라아제(beetle luciferase)(LucPPe 또는 Luc146-1H2)의 이소성 세포질 발현을 기반으로 하는 Matador 분석을 활용했다. 달리 지시되지 않는 한, 상이한 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 표적 세포를 표적 세포를 성장시키는데 사용되는 배지의 384 웰 플레이트에 삼중으로 도말하였다. 현탁액에서 성장하는 표적 세포는 일반적으로 웰 당 2-3 x 10 4의 농도로 도말한 반면, 부착성 단층으로 성장하는 표적 세포는 웰 당 1-2 x 104의 농도로 도말하였다. 달리 나타내지 않는 한, 표적 세포를 유전자 변형된(즉, SAR을 발현하는) 이펙터 세포(예를 들어, T 및 NK 세포 또는 세포주(NK92, NK92MI 또는 THP 세포)와 4시간 내지 96시간 동안 1:1 내지 10:1로 변하는 이펙터: 표적 (E: T) 비로 공동 배양하였다. 표적 세포가 부착 세포(예를 들어, HeLa 세포)로서 성장하는 경우, T 세포가 첨가되기 전에 밤새 웰의 바닥에 부착되도록 하였다. GLuc 발현 표적 세포의 경우, 이펙터 세포 매개 표적 세포의 용해 유도는 천연 코엘로엔트라진(coeloentrazine)(Nanaolight)을 함유하는 0.5 x CTZ 분석 완충액을 직접 주입하여 BioTek synergy 플레이트 리더로 측정한 루시페라아제 활성의 증가에 의해 분석되었다. D-루시페린은 Luc146-1H2를 발현하는 표적 세포의 기질로 사용하였다. 배지 단독(Med)을 포함하는 웰 및 SAR 구조에 감염되지 않은(UI) 이펙터 세포와 함께 표적 세포를 배양한 웰에서 루시페라아제 활성을 대조군으로 사용했다.
표적 세포에서 항원의 발현을 검출하고 SAR의 구축에 사용되는 다양한 항원 결합 모이어티의 항원 결합 활성을 결정하기 위한 분석
표적 세포에 대한 항원의 발현은 PCT/US2017/025602에 기술된 바와 같이 항체를 사용한 면역염색 또는 고감도 항원 검출 분석과 조합된 생물정보학에 의해 결정되었으며 그 전체가 본원에 참조로 포함되었다.
SAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 다음 분석에서 테스트하여 기능적 SAR을 확인한다.
(A) Topanga Assay (NLuc binding assay): 대조군 벡터 및 SAR 발현 Jurkat-NFAT-GFP, T 세포 또는 NK 세포를 표적 CD19-Nluc 융합 단백질로 염색하고 표적 항원에 결합하는 능력을 Topanga Assay를 사용하여 Nluc 활성을 측정하여 분석한다. 다음 도에 나타낸 바와 같이, CD19 단일 클론 hu-mROO5-1의 vL 및 vH 단편이 IgCL 및 IgG-CH1 링커를 통해 DAP10의 힌지, 막관통 및 세포질 도메인에 부착된 새로운 차세대 SAR(서열번호 2275)을 발현하는 NK92MI 세포는 대조군 모 세포와 비교하여 CD19-Nluc Topanga 시약에 대한 증가된 결합을 보여준다. 2세대 CAR(서열번호 5141)은 양성 대조군 역할을 한다.
실험은 다른 차세대 SAR을 발현하는 NK92MI 세포로 반복된다. 아래 도에 나타낸 바와 같이, SAR(서열번호 2277)을 발현하는 NK92MI 세포는Topanga Assay에서 CD19-Nluc 융합 단백질에 매우 높은 결합력을 보였다. DAP10-SAR (서열번호 2275)을 발현하는 NK92MI 세포는 또한 적당한 CD19-결합을 나타내었다.
시험관 내 세포독성 활성에 대한 분석. 감염되지 않은 NK92 또는 T 세포 또는 대조군 벡터 또는 SAR을 발현하는 세포는 루시페라아제(예: GLuc, NLuc, Turboluc 16 등) 비분비 형태를 발현하는 표적 세포주와4-96시간 동안 공동 배양되고, PCT/US17/52344에 기재된 바와 같이 루시페라아제 활성을 측정하여 세포 용해 유도를 조사하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, SAR(서열번호 2277)을 발현하는 NK92MI 세포는 Matador Assay로 측정한 결과 가장 높은 세포독성을 보였다. DAP10-SAR (서열번호 2275)을 발현하는 NK92MI 세포도 적당한 세포독성을 나타내었다.
NF-κB 활성화 분석
Jurkat 세포는 NF-κB 반응성 프로모터 하에서 반딧불이 루시페라아제 cDNA(Luc)를 발현하도록 조작되었다. 세포는 후속적으로 상이한 SAR을 안정적으로 발현하는 세포를 생성하기 위해 다음의 SAR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. 서로 다른 SAR을 발현하는 Jurkat-NF-κB 세포를 RAJI-wt(CD19+ve) 또는 RAJI-CD19-KO(CD19-null) 세포와 24시간 동안 공동 배양하여 루시페라아제 활성을 측정했다.
표 53
첨부된 표 53은 서열번호 2275 및 2277을 갖는 SAR을 발현하는 Jurkat 세포에 의한 NF-κB 활성의 유도를 보여준다. 서열번호 1860의 NKp46 SAR에 의한 NF-κB 유도는 없었다.
NFAT 프로모터 유도 GFP 발현. Jurkat-NFAT-GFP(JNG) 세포는 상이한 SAR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터에 감염되고 퓨로마이신으로 선택된다. 대조군 JNG 세포와 SAR 발현 JNG 세포는 동족 항원(들)을 발현하는 서로 다른 표적 세포주와 약 24시간 동안 공동 배양된다. 따라서, CD19를 표적으로 하는 SAR을 발현하는 JNG 세포는 CD19 항원 발현 세포주 RAJI와 공동 배양되고, 표적 항원에 결합하고 세포 신호전달을 유도하는 능력은 유세포분석을 이용하여 GFP 발현의 유도를 측정함으로써 분석된다. CD19가 결핍된 RAJI 세포(RAJI-CD19-KO)는 음성 대조군으로 사용된다. GFP 발현의 유도는 1+, 2+, 3+ 등으로 정량화된다. 대조군 세포에 대해 GFP를 유도하는 SAR 발현 세포의 %에 따라 다르다. 따라서 1.6+는 SAR을 발현하는 JNG 세포의 약 16%가 대조군 JNG 모 세포에서 볼 수 있는 수준 이상의 표적 세포와 공동 배양 시 GFP 유도를 나타냈다는 것을 의미한다. 다음 표의 결과를 대부분의 단일 사슬 및 이중 사슬 SAR 구축물의 발현 시 NFAT 유도 GFP 발현의 활성화를 보여준다. 결과는 또한 서열번호 2276, 2280, 2314-2316, 2319-2326으로 표시되는 SAR과 같은 이중사슬 이종이합체 SAR 구축물에 의한 NFAT의 유도를 보여준다. 결과는 또한 CD16A의 완전한 세포외 도메인을 갖는 적어도 하나의 사슬을 발현하는 SAR 구축물이 이의 항원 결합 도메인 (예를 들어, BCMA-FHVH)에 의해 표적화된 항원(들)을 발현하는 세포에 반응할 뿐만 아니라, 또한 상이한 항원을 표적으로 하는 항체의 Fc 영역에 결합하는 능력을 보유한다는 것을 보여준다. 따라서, 예시적인 실시형태에서, SAR 구축물을 발현하는 JNG세포 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-CD16A-F158V-FL-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD16A-F158V-FL-v2-F2A-XBA-PAC (서열번호 2283)은 각각 이의 항원 결합 도메인 BCMA-FHVH93 및 CD20-VHH-USC1-2HC2D6을 통해 RAJI (CD19+ 및 BCMA+) 및 L363 (CD19-ve/BCMA+) 세포주와 공동 배양될 때 NFAT-유도 GFP를 유도한다. 더욱 중요한 것은, 이러한 SAR구축물을 발현하는 JNG 세포(서열번호 2283)은 Her2-발현 SKOV3 세포와 공동 배양될 때 GFP를 유도하는 데 실패한다는 것이다. 그러나 이 SAR을 발현하는 JNG 세포가 이 SAR 구조를 구성하는 두 개의 CD16A-F158V-FL 사슬 중 하나에 결합할 수 있는 허셉틴(1μg/ml)의 존재 하에 SKOV3 세포와 함께 배양될 때 GFP의 강력한 유도가 관찰된다. SAR 구축물을 발현하는 JNG 세포 CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-CD16A-V158A-FL-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 2314)로 실험을 반복할 때 본질적으로 유사한 결과가 얻어진다. 이 구축물은 하나의 신호전달 사슬이 CD16A-V158A-FL로 구성되고 다른 신호전달 사슬이 [hTCRa-T48C-opt]로 구성되는 이중사슬 이종이합체 SAR이다. 대조적으로, 첫 번째 Ig 유사 도메인이 결여된 CD16A 사슬(CD16-V158A-D2TMCP-v1)을 포함하는 서열번호 2315 및 2316으로 표시되는 SAR 구축물은 허셉틴의 존재 하에 SKOV3 세포와 공동 배양할 때 GFP를 유도하는데 실패한다. 그러나, 이들 SAR 구축물은 RAJI 세포와의 공동 배양 시 여전히 GFP를 활성화할 수 있으며, 이는 이 구축물에 존재하는 CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa-T48C-opt] 사슬에 의한 기능적 신호전달을 시사한다. 반면에, 이 SAR을 발현하는 JNG 세포는 L363 세포와의 공동 배양 시 GFP를 유도하지 못하며, 이는 BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP 사슬이 발현되지 않거나 기능적으로 활성화되지 않음을 시사한다. 유사하게, 구축물을 발현하는 JNG 세포는CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197P-D2TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC (서열 2322) RAJI 또는 L363 세포와 공동 배양될 때 GFP를 유도하는 데 실패한다. 또한, 이들 세포는 허셉틴의 존재 하에 SKOV3 세포와 공동 배양될 때 GFP를 유도하지 못한다. 이러한 결과는 BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1 또는 CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197P-D2TMCP-v3 사슬이 기능적으로 발현되지 않음을 시사한다.
결과는 두 개의 개별 사슬에 부착된 vL 및 vH 단편을 포함하는 다수의 이중 사슬 구축물을 발현하는 JNG 세포가 동족 항원 발현 세포와 공동 배양할 때 GFP를 유도할 수 있음을 추가로 입증한다. 예시적인 이러한 구축물은 2275-2278, 2280-2282, 2319, 2321, 2300, 2323-2326으로 표현된다. 이러한 결과는 vL 및 vH 단편이 2개의 별개의 사슬에 부착된 경우에도 동족 항원에 결합하고 신호를 전달할 수 있는 기능적 Fv를 형성하기 위해 조립될 수 있음을 입증한다. 이것은 두 사슬이 구조적으로 구별되고 헤테로 또는 호모 이량체화에 알려지지 않았을 때 관찰된다. 예시적인 이러한 이중사슬 이종이량체 구축물은 서열번호 2276, 2280, 2323-2326으로 표시된다.
결과는 CD16의 전체 세포외, 막관통 및 세포질 도메인(예를 들어, 서열번호3843, 3853 및 3863)을 암호화하는 하나 또는 두 개의 사슬을 포함하는 SAR 구축물이 CD16의 첫 번째 Ig 도메인이 결여된 CD16 사슬을 암호화하는 SAR 구축물(예를 들어, 서열번호 3844, 3854, 및 3864)과 비교하여 NFAT-유도 GFP의 강력한 유도를 나타낸다는 것을 추가로 입증한다. 또한, CD16의 전체 세포외, 막관통 및 세포질 도메인(예를 들어, 서열 3843, 3853 및 3863)을 암호화하는 CD16 1개 또는 2개의 사슬을 포함하는 SAR 구축물은 일반적으로 NFAT-유도 GFP의 더 강한 유도를 나타낸다. 유사하게, 서열번호 3763 또는 3769로 표시되는 NKp30의 전체 세포외, 막관통 및 세포질 도메인(예: NKp30-ECDTMCP-opt1 또는 opt2)을 포함하는 SAR 구축물(예: 서열번호 2297)을 발현하는 JNG 세포는 동족 항원 발현 세포주와 공동 배양할 때 NFAT 기반 GFP의 강력한 유도를 나타낸다.
결실된 TCRα, β, γ 및 δ 사슬을 갖는 다수의 이중사슬 SIR을 JNG 세포에서 구성하고, 발현시켰다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도, 결실된 TCRα, β, γ 또는 δ사슬을 갖는 SIR (서열번호 7619-7625) 은 JNG 세포에서 발현될 때 강한 NFAT-GFP 활성을 나타내었다. 따라서, 결실된 TCRα, β, γ 또는 δ사슬은 다양한 면역 반응을 발생시키기 위해 다양한 발현 및 신호전달 활성을 갖는 SIR의 다양한 패널을 생성하는데 사용될 수 있다.
표 55
NFAT 프로모터 유도 GFP 발현. Jurkat-NFAT-GFP(JNG) 세포는 항원 결합 도메인으로서 scFv 또는 vHH 도메인 및 신호전달 사슬로서 CD16A-F158V-S197P-FL-v3를 포함하는 상이한 CD16-SAR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 감염된다. 세포는 약물 선택없이 4 일 동안 확장된다. 대조군 JNG 세포와 SAR 발현 JNG 세포는 동족 항원을 발현하는 서로 다른 표적 세포주와 약 24시간 동안 공동 배양된다. 따라서, CD19를 표적으로 하는 SAR을 발현하는 JNG 세포는 CD19 항원 발현 세포주 RAJI와 공동 배양되고, 표적 항원에 결합하고 세포 신호전달을 유도하는 능력은 유세포분석을 이용하여 GFP 발현의 유도를 측정함으로써 분석된다. 결과는 표적 항원을 발현하는 세포주와 함께 배양할 때 다른 SAR을 발현하는 JNG 세포에 의한 NFAT 기반 GFP 발현의 유도를 보여준다. 본질적으로 유사한 결과가 실험이 가출원의 표 36-38에 열거된 다른 CD16 SAR 구축물로 반복될 때 얻어진다.
상이한 SAR 구축물을 발현하는 JNG 및 NK92 세포를 생성하고, 이전 섹션에 기재된 바와 같이 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여 NFAG-GFP 분석 및 세포독성 분석(Matador assay)을 위해 시험하였다. 이의 서열번호 및 표적 항원으로 표현되는 상이한 SAR 구축물의 결과의 요약이 아래에 제공된다. Matador 분석에서 배수 유도는 대조군 NK92 세포와의 공동 배양 시 관찰된 루시페라아제 활성과 비교하여 SAR 발현 NK92 세포와 표적 세포의 공동 배양 시 루시페라아제 활성의 증가로 계산되었다. 공동 배양 분석은 0.3:1에서 1:1 사이의 E: T 비율에서 2시간 동안 수행되었다.
CD19 표적 SAR을 발현하는 NK92 세포는 CD19 발현 NALM6 및 RAJI 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
NK92 세포는 지시된 CD19-TARGETED SAR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. 세포는 퓨로마이신에서 선택되었다. 모 NK92 세포 또는 SAR-발현 NK92 세포를 4시간 동안 0.25:1의 Effector:Target(E:T) 비율로 Gluc를 안정적으로 발현하는 지시된 표적 세포주와 공동 배양하였다. 공동 배양 기간의 끝에서, Gluc 활성은 CTZ 분석 완충액의 첨가에 이어 Matador 분석에 의해 측정되었다. 결과는 다른 CD19 표적 SAR을 발현하는 NK92 세포와 공동 배양 시 Nalm6-Gluc 및 RAJI-Gluc 세포를 포함하는 배양에서 Gluc 활성의 특이적 증가를 보여준다. 대조적으로, CD19 발현이 결여된 RAJI-CD19-KO, U927 및 THP-1 세포를 함유하는 배양물에서는 GLuc 활성의 유의한 증가가 없다. 이것은 분석의 특이성을 보여준다. 종래의 2세대 CAR(서열번호 5441)을 발현하는 NK92 세포는 Nalm6 및 RAJI 세포에 대해 가장 높은 세포독성을 나타내었지만 RAJI-CD19-KO, U937 및 THP-1 세포에 대해서도 비특이적 세포독성을 보였다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 RS4;11-Gluc 표적 세포를 발현하는 모 NK92및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 결과는 도 6에 나타나 있으며 서열번호 7695, 7692 및 7607을 갖는 SAR에 의한 세포사멸의 효과적인 유도를 보여준다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 RS4;11-Gluc 표적 세포를 발현하는 모NK92및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 결과는 도 7에 나타나 있으며 서열번호 7679의 SAR에 의한 효과적인 세포사멸 유도를 보여준다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 L363-Gluc 표적 세포를 발현하는 모NK92및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 결과는 도 8에 나타나 있으며 서열번호 7679의 SAR에 의한 효과적인 세포사멸 유도를 보여준다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 RS4;11-Gluc 표적 세포를 발현하는 모NK92및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 두 SAR 구축물 모두 hu-mROO5-1-scFv, CD28 힌지 영역 및 NKp44-Hinge-TMCP 또는 NKp46-Hinge-TMCP를 포함하는 효과적인 세포사멸을 유도하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 RS4;11-Gluc 표적 세포를 발현하는 모NK92및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 결과는 그림 10에 나와 있다.
MATADOR분석
표시된 SAR 및 L363-Gluc 표적 세포를 발현하는 모NK92 및 NK92 세포는 0.3:1 및 1:1의 E: T 비율로 공동 배양되었으며, 이는 각 경우에 5,000:15,000 세포 및 15,000:15,000 세포이다. NK92 및 NK92-SAR 세포는 또한 IL2의 막고정 형태 (서열번호 7133)를 공동-발현하였다. 2시간 배양 후, coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 결과는 도 11에 나타내었다.
MATADOR분석
NK92 세포는 SAR 구축물NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her2-47D5-vHH-Mlu-F-F2A-Xba-PAC (서열 7696) 및 NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her3-21F06-vHH-Mlu-F-F2A-Xba-PAC (서열번호 7697)를 발현하도록 조작되었다. SAR을 발현하는 모NK92및 NK92 세포는 1:1의 E: T 비율로 SKOV3-Gluc 표적 세포와 공동 배양된다. 세포 사멸은 coeleleterazine을 첨가하여 Matador 분석을 사용하여 측정하였다. 결과는 서열번호 7696 및 7697을 갖는 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포와의 공동 배양 시 Gluc 활성의 증가를 보여주며, 이는 세포 사멸의 유도를 반영한다.
SAR-NK 세포
NY-ESO1(157-165) 펩티드(서열번호 10880)를 표적으로 하는 NY-ESO1-Tetramer-APC(HLA-A*02:01 human NY-ESO1 157-165 C165V APC-Labeled Tetramer)를 NIH 사량체 시설로부터 입수하였다. NY-ESO1-SIR로 감염된 JNG 세포(061621-SCjJ7; 서열번호9366)를 사용하여 퓨로마이신을 선택하였다. 안정한 세포를 NY-ESO1-Tetramer-APC(HLA-A*02:01 human NY-ESO1 157-165 C165V APC-Labeled Tetramer)로 실온의 암실에서 30분 동안 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다. NY-ESO1 SAR을 발현하는 JNG 세포는 JNG-UI 세포(1.42%)에 비해 APC 양성(10%)이었다. 유사하게, 293FT 세포는 NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 서열번호9366) 및 NY-ESO1-tetramer-APC로 염색한 293FT의 비-형질 주입된 세포(0.97%)에 비해 52.3% APC 양성이었다. SAR의 Va 도메인이 상이한 Va 도메인(서열번호 8514)으로 대체된 구축물로 실험을 반복하였다. 이 SAR 구성물로 형질 감염된 293FT 세포는 NY-ESO1-tetramer-APC로 >70% 염색을 나타내어 플랫폼이 TCR과 유사한 결합 능력으로 다른 SAR을 구성하고 다른 가변 도메인을 포함하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 다음으로, 링커 도메인(즉, TCRa-Ig3 및 TCRb-Ig3) 및 신호전달 모듈(예를 들어, CD3zECDTMCP-opt 및 CD3zECDTMCP opt2)을 NY-ESO1-SIR (061621-SCjJ7; 서열번호 9366) 구축물을 상이한 링커 (예를 들어, IgCL, IgG-CHI 등)로 대체하였다.) 및 상이한 신호전달 어댑터 및 이의 변이체 및 단편을 포함하는 신호전달 모듈을 포함할 수 있다. 생성된 SAR 구축물은 서열번호 9427-9434로 표시된다. 구축물은 293FT 세포에 형질 감염되었을 때 NY-ESO1-tetramer-APC로 증가된 염색을 나타내었다. NY-ESO1을 표적으로 하고 상이한 백본을 포함하는 다른 예시적인 구축물은 서열번호 9356-9426으로 표시되고, 유사하게 시험된다. MAGE-A3(112-120)/HLA-A2(서열번호 9439-9506, 9517-9518)를 표적으로 하는 uTCR-SAR 구축물은 NIH 사량체 시설로부터 입수한 MAGE-A3(112-120)-사량체-APC를 사용하여 유사하게 시험한다.
THP-1 세포는 uTCR-SAR NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호 9366) 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 안정적으로 전이시켰다. 세포는 NY-ESO1-tetramer-APC로 염색이 증가하고 표면 NY-ESO1/HLA-A2 복합체가 발현되는 표적 세포의 식균 작용이 증가한다.
NY-ESO1-SAR을 암호화하는 농축 렌티바이러스 벡터(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)을 이용하여 NK92 세포주, 일차 T 세포 및 일차 NK 세포를 감염시켰다. 감염 후, 세포를 위와 같이 NY-ESO1-tetramer-APC로 염색하였다. NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)에 따르면 NK92 세포주에서 APC+ ve 세포가 4.93%에서 84.06%로, 일차 NK 세포가 3.3%에서 10.98%로, 일차 T 세포가 29%에서 59.3%로 증가했다. 이러한 결과는 NY-ESO1-SAR이 T 세포 및 비-T 세포 모두를 포함하는 다양한 세포주에서 기능적으로 발현될 수 있고 이들 세포에 TCR 유사 결합 능력을 부여할 수 있음을 입증한다.
NK92, 일차 NK 및 NY-ESO1-SAR을 발현하는 일차 T 세포(061621-SCjJ7; 서열번호9366)를 50 IU/ml IL2가 보충된 XVIVO 배지에서 1일 동안 성장시켰다. NYESO 펩타이드(10μM), CD28 작용제 항체(1μg/ml), NY-ESO-1 펩타이드+CD28 항체의 존재 유무 하에 GLuc를 발현하는 T2- 세포와 공동 배양을 수행했다. T2 세포는 37C에서 30분 동안 NY-ESO1 펩타이드를 로딩하였다. 또한, NY-ESO-1 코딩 서열과 함께 외인성 HLA-A2 코딩 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터(020122-BBjV1)로 감염된 T2 세포를 대조군으로 포함시켰다. 또한, Gluc는 L363 (NY-ESO1+/HLA-A2+) 및 U266 (NY-ESO1+/HLA-A2+) 세포를 발현한다. 020122-BBjV1 벡터로 형질 도입된 L363 및 U266 세포가 포함되었다. 모든 표적 및 이펙터 세포는 보충제 없이 XVIVO 배지에서 4시간 동안 흰색 384웰 플레이트에서 E: T 비율 1:1로 도말되었다. 표적 세포는 30μl의 배지에서 10,000 cells/well로 사용되었다. Matador 분석은 자동 디스펜서를 사용하여 웰 모드에서 PBS에 1:100 CTZ 분석 버퍼 15μl를 주입한 후 수행되었다. 발광을 5초 동안 판독하였다. 그 결과, N92, 일차 NK 및 NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호9366)을 감염되지 않은 대조군 세포와 비교하였다. Gluc 활성은 NK92 배양에서 23356개에서 NY-ESO1-SAR을 발현하는 NK92에서 334646개로 증가했다. Gluc 활성은 1차 NK 세포의 배양에서 17788에서 NY-ESO1-SAR을 발현하는 1차 NK에서 162764로 증가했다. Gluc 활성은 일차 T 세포의 배양물에서 2183에서 NY-ESO1-SAR을 발현하는 일차 T 세포에서 491493로 증가하였다. 유사하게, NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 서열번호 9366)에서 NK92, 일차 NK 및 일차 T 세포는 감염되지 않은 대조군 세포에 비해 020122-BBjV1 벡터로 안정적으로 형질 도입된 L363 세포 및 L363 세포에 대해 증가된 세포독성을 나타내었다. 마지막으로, NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)에서 NK92 및 일차 NK 세포는 펩타이드가 로딩된 T2 세포에 비해 NY-ESO1 펩타이드가 로딩된 T2 세포에 대해 증가된 세포독성을 보였다.
NY-ESO1 펩타이드가 로딩된 대조군 T2 세포 또는 T2 세포를 96웰 U 바닥 플레이트의 100μl 배양 배지에서 50K 세포/웰로 도말했다. 렌티바이러스 벡터(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)을 1:1의 E: T 비율로 첨가하였다. 24시간 후, ELISA를 위해 상청액을 수집하였다. 그 결과 NK92 세포 및 NY-ESO1-SAR(061621-SCjJ7; 서열번호 9366)을 발현하는 일차 T 세포와 함께 배양하였을 때, 감염되지 않은 대조군 세포와 비교할 때, NY-ESO1 펩타이드가 로딩된 T2 세포에서 IFNγ 및 TNFα 생산이 증가한 것으로 나타났다 (도 13). 이 효과는 NY-ESO1 펩타이드가 로딩된 T2 세포에 특이적이었고 NY-ESO1 펩타이드가 로딩되지 않은 T2 세포에서는 동일한 크기로 나타나지 않았다.
NK92, 일차 NK 및 일차 T 세포는 HLA-A2와 복합체 중의 MAGE-A3 펩티드(112-120)를 표적으로 하는 uTCR-SAR CD8SP-MAGE-A3-112-120-Vb-TCRb-S57C-ECD-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-MAGE-A3-112-120-Va-TCRa-T48C-ECD-CD3zECDTMCP-opt2(서열번호 9450)를 발현하는 렌티바이러스 구조체에 감염된다. MAGE-A3 펩타이드(서열번호 10879)가 로딩된 T2 세포를 이용하여 위와 같이 실험을 반복한다. uTCR-SAR 발현 세포와의 공동 배양은 형질 도입되지 않은 세포와의 공동 배양과 비교하여 세포 독성 및 사이토카인(IFNγ 및 TNFα) 생산의 증가를 초래하는 것으로 나타났다. 펩타이드가 로드되지 않은 T2 세포는 음성 대조군 역할을 한다.
본질적으로 상기와 같은 유사한 접근법을 사용하여 NY-ESO1, MAGE-A3 및 다른 세포내 펩티드 항원을 표적으로 하는 uTCR-SAR을 발현하는 1차 대식세포를 생성할 수 있다.
본질적으로 상술한 바와 유사한 접근법을 사용하여 다른 펩티드 항원을 표적으로 하는 uTCR-SAR을 생성하고 테스트할 수 있다. NY-ESO1, MAGE-A3, MC7을 표적으로 하는 TCR의 가변 도메인을 포함하는 몇 가지 추가의 예시적인 단일특이성 및 이중특이성 uTCR-SAR 구축물의 서열 ID. G5 (HLA-비의존적 TCR) 및 Vd2/Vg9 (γδ TCR)는 서열번호 9355-9602로 제시되어 있다. 이들 구축물은 일차 NK 세포, 일차 T 세포, NK 세포주, iPSC 세포, 조혈 세포 및 다른 이펙터 세포 (예를 들어, CIK, 기억 유사 NK, g-NK 수지상 세포 등)에서 발현될 수 있고, 공지된 기술을 사용하여 활성에 대해 시험하였다.
THP-1 세포에서 CD19-TARGETED SAR의 발현
ATCC로부터 얻어진 THP-1 (단핵구) 세포는 CD19를 표적으로 하는 지시된 SAR 구축물을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었다. 세포는 퓨로마이신에서 선택되었다. CD19 표적 SAR 발현 THP-1 세포가 CD19 세포외 도메인에 결합하는 능력은 이전에 설명된 바와 같이(Gopalakrishnan, R et al, Sci. Reports, 9:1957, 2019) FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5(서열번호 3675)를 사용하여 Topanga 분석에 의해 테스트되었다. 상기 결과는 모 THP-1 세포와 비교하여 서열번호 2312, 2291, 5138, 2313으로 표시되는 SAR을 발현하는 THP-1 세포에 대한 CD19 Topanga 시약의 증가된 결합을 보여준다. 이러한 결과는 이러한 SAR이 단핵구 계통의 THP-1 세포 표면에서 기능적으로 발현될 수 있고 CD19 표적 항원에 대한 증가된 결합을 보여줄 수 있음을 보여준다.
CD19-TARGETED SAR을 발현하는 THP-1 세포는 CD19+ RAJI 세포의 증가된 식균 작용을 보여준다.
CD19 및 THP-1모세포에 대해 표시된 SAR 구조를 발현하는 7.5 x 104 THP-1 세포는 RPMI에서 1ng/mL의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 사용하여 단핵구/대식세포 계통으로 분화되었으며 RPMI에서 10% FBS와 함께 48시간 동안 두 세트로 세 번 분화되었다. 세포는 부착되어 2회 세척되었다. 이어서, 7.5 x 110 4 RAJI-Nluc 및 RAJI-CD19-KO-Nluc 세포를 표적 세포에 3-4시간 동안 적절한 웰에 첨가하였다. 현탁 세포를 제거하고, 플레이트를 2회 세척하였다. PBS에 500μL의 EDTA를 첨가하고 37oC에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 긁어내어 튜브에 넣고 4oC에서 5분 동안 1000rpm으로 회전시켰다. PBS를 제거하고 100μL 1x Renilla Luciferase Assay Lysis Buffer (Promega)를 튜브에 첨가하고 10분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 12,000에서 회전시켰다. 25μL의 상층액을 25μL의 CTZ(Coelentrazine) 분석 완충액과 함께 삼중으로 수집하고, 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정하였다. 하기 표 60에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2291 및 5138을 갖는 SAR를 발현하는 THP-1 세포는 RAJI 세포와의 공동 배양시 THP-1 모 세포에 비해 더 높은 NLuc 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 THP-1 세포를 발현하는 CD19-TARGETED-SAR에 의한 CD19-발현 RAJI 세포의 증가된 식균 작용을 입증한다. 대조적으로, 서열번호 2291 및 5138을 갖는 SAR을 발현하는 THP-1 세포는 CD19 발현이 결여된 RAJI-CD19-KO 세포와의 공동 배양시 THP-1 모 세포에 비해 NLuc 활성의 증가를 나타내지 않았다.
다목적 스위치의 발현
NK92 세포는 SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터와 상이한 막 고정 사이토카인 또는 다목적 스위치를 포함하는 공동 발현 부속 모듈로 안정적으로 형질 도입되다. Synth-IL2-tBCMA-L24 다목적 스위치를 발현하는 예시적인 구축물은 서열번호 8509-8512로 표시된다. NK92 세포는 감염 후 IL2로부터 회수되었다. 서열번호 7133-7137, 7151-7157 및 8529-8534로 표시되는 부속 모듈의 동시 발현은 IL2가 결핍된 배지에서 성장했을 때 NK92 세포의 생존을 초래한 반면, 형질 도입되지 않은 대조군 NK92 세포는 사망했다. 상이한 SAR 구축물을 발현하는 NK92 세포는 Matador 분석에 의해 측정된 바와 같이 SAR의 강력한 발현 및 활성을 나타내었다. IL2-tHer2 (서열번호 8533), IL2-RQR8 (서열번호 8529) 및 IL2-tBCMA(서열번호 7151)를 각각 Herceptin, Rituximab 및 J6MO 항체로 염색하여 양성 염색을 보이는 NK92 세포를 확인하였다. 또한, IL2-RQR8 (서열번호 8529)을 발현하는 NK92 세포도 CD34에 결합하는 QBEND-10 항체로 염색을 보인다. 상기 다목적스위치를 발현하는 JNG 세포는 또한 상술한 항체를 이용하여 검출하였을 때 다목적스위치의 세포 표면 발현을 나타낸다. 이러한 결과는 SAR 발현 세포가 다목적 스위치에 결합하는 항체로 염색한 후 세포 분류(예: 유동 분류 또는 자기 분류)에 의해 검출, 분리 및 정제될 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 SAR 발현 세포가 다목적 스위치에 결합하는 항체로 염색한 후 세포 분류(예: 유동 분류 또는 자기 분류)를 사용하여 음성 선택에 의해 제거될 수 있음을 추가로 보여준다. 또한, 다목적 스위치를 발현하는 세포는 허셉틴, 리툭시맙, J6M0 또는 BCMA-ADC와 같은 스위치에 결합하는 항체로 처리하여 사멸시킨다.
또한, 부속 모듈이 짧은 내부 프로모터(예를 들어, EFS, EFS2, RSV 등)를 사용하여 발현되는 구축물에서 SAR 및 부속 모듈의 우수한 발현을 보여준다. 이것은 특히 두 개의 사슬을 갖는 SAR 구조의 경우에 나타났다.
입양 세포 치료를 위해 여러 항원을 표적으로 하는 자가 SAR-T 세포의 사용. 감염성 질환 (예: HIV1, EBV, CMV, HTLV1 등), 퇴행성 질환 (예: 알츠하이머병), 자가면역 질환 (예: 심상성 천포창), 알레르기성 질환 (예: 만성 특발성 두드러기) 및 다양한 종류의 암을 포함한 다양한 질병을 앓고 있는 환자들이 다른 질병 원인 또는 질병 관련 항원을 표적으로 하는 입양 이식된 자가 SAR-T 세포를 사용한 면역 요법의 IRB 승인 1상 임상 시험에 참여하였다. 상이한 질환에 대한 SAR은 질환 유발 또는 질환 관련 세포에서 그들의 표적 항원의 공지된 발현에 기초하여 선택된다. 가능한 경우, SAR의 항원 결합 도메인이 유연한 링커를 통해 비분비 형태의 NLuc 단백질에 융합된 ABD-GGS-NLuc 융합 단백질과 결합하여 질병 유발 또는 질병 관련 세포에 대한 SAR 표적의 발현을 확인한다. 대안적으로, 시판되는 항체를 이용한 면역조직화학 또는 유세포 분석은 질환 유발 또는 질환 관련 세포에 대한 SAR 표적의 발현을 확인하기 위해 사용된다. T 세포는 백혈구 성분채집술을 사용하여 피험자로부터 수집되고, 적절한 SAR 암호화 렌티바이러스 벡터로 형질 도입되고, CD3/CD28 비드를 사용하여 생체 외로 확장된다. 생성된 세포 제품은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 후 냉동 보존된다. 한편, 연구 참가자는 림프구 화학 요법(30mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500mg/m2/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 후 1일 후, 연구 참가자는 형질 도입된 림프구를 정맥 주사한 후 고용량(720,000 IU/kg) IL-2(Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA) 8시간마다 허용 오차안에서 제공한다. 이전에 보관된 SAR-T 세포 생성물은 환자의 침대 옆에서 운반, 해동 및 주입된다. SAR-T 제품의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 10 4 SAR+ve CD3 세포/kg에서 5 x 10 9 SAR+ve CD3 세포/kg까지 다양하다. SAR-T 제품은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 최소 30분 전에 15mg/kg의 아세트아미노펜 PO(최대 650mg) 및 디펜히드라민 0.5-1mg/kg I.V.(최대 용량 50mg)를 사전 투약할 수 있다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2를 매일 주사할 수 있다. 임상 및 실험실 상관 추적 연구는 의사의 재량에 따라 수행될 수 있다.
입양 세포 치료를 위한 동종이계 SAR-T 세포의 사용. 재발성 급성 림프구성 백혈병 또는 고위험 중간 등급 B 세포 림프종 환자가 동종 골수 이식을 받은 환자는 입양 이식된 동종이계 SAR-T 세포로 면역 요법을 받을 수 있다. 기증자(동종 이식에 사용된 것과 동일한 기증자)로부터 수집된 백혈구 성분채집술 제품은 Miltenyi Biotec의 CliniMACS Prodigy® System을 사용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 CD3 양성 T 림프구를 선택한다. TRAC 및 β2M의 발현은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 CRISP9 매개 낙아웃에 의해 제거되고, TCR/CD3 복합체 및 HLA의 세포 표면 발현이 결여된 T 세포가 선택된다. 세포는 CD3 및 CD28 자성 비드-기재 인공 항원 제시 세포를 사용하여 활성화시키고, 임상 등급 CD20-표적화된 SAR 바이러스 (예를 들어, CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 5047)로 형질 도입시킨다. 세포는 폐쇄 시스템에서 9-12 일 동안 확장된다. 생성된 세포 제품은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 후 냉동 보존된다. 한편, 연구 참가자는 림프구 화학 요법(30mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500mg/m2/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 후 1일 후, 연구 참가자는 형질 도입된 림프구를 정맥 주사한 후 고용량(720,000 IU/kg) IL-2(Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA) 8시간마다 허용 오차를 제공한다. SAR-T 세포 제품은 환자의 침대 옆에서 운반, 해동 및 주입된다. SAR-T 제품의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 10 4 SAR+ve CD3 세포/kg에서 5 x 10 9 SAR+ve CD3 세포/kg까지 다양할 수 있다. SAR 생성물은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 SAR-T 세포 주입 최소 30분 전에 15mg/kg의 아세트아미노펜 PO(최대 650mg) 및 디펜히드라민 0.5-1mg/kg I.V.(최대 용량 50mg)를 사전 투약할 수 있다. 임상 및 실험실 상관 추적 연구는 의사의 재량에 따라 수행될 수 있으며 CD20 발현 ALL/림프종 세포 및/또는 입양 이식 T 세포의 존재에 대한 정량적 RT-PCR 연구, FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질병 특이적 병리학적 평가를 위한 골수 검사; 림프절 생검; 및/또는 유전자 전달 연구에 적용되는 FDA의 생물학적 반응 수정자 자문 위원회(Biologic Response Modifiers Advisory Committee)에서 정한 지침에 따른 장기 추적 관찰을 포함할 수 있다. 면역 억제제의 사용도 의사의 재량에 달려 있다. 본질적으로, 유사한 접근법이 개시물의 SAR을 발현하는 동종이계 면역 세포 (예를 들어, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 SAR은 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원 또는 항원을 표적으로 한다. 본질적으로 유사한 프로토콜이 표 36-38에 나열된 다른 SAR 구축물을 테스트하는데 사용된다.
SAR을 발현하는 자가 또는 동종 NK 세포의 사용
기증자(동종 이식에 사용된 것과 동일한 기증자)로부터 수집한 백혈구 성분채집술 제품은 Miltenyi Biotec의 CliniMACS Prodigy® System을 사용하고 제조업체의 권장 사항에 따라 NK 세포를 선택한다. NK 세포를 3-5일 동안 hIL2를 사용하여 활성화시킨 다음, CD20-표적화된 SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열 5047)로 형질 도입시킨다. 렌티바이러스는 또한 IL2의 막 고정 형태(서열번호 1330)를 암호화한다. NK 세포는 hIL-2의 50 units/mL로 인간 CD20을 발현하는 인공 항원 제시 K562 세포(aAPC)의 존재 하에 15일 동안 생체 외에서 확장된다. 생성된 세포 제품은 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 후 냉동 보존된다. 한편, 연구 참가자는 림프구 화학 요법(30mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500mg/m2/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법 완료 후 하루 후, 연구 참가자는 형질 도입된 NK 세포를 정맥 주사한 후 내성에 따라 8시간마다 고용량(720,000IU/kg) IL-2를 투여 받는다. SAR-NK 세포 제품은 환자의 침대 옆에서 운반, 해동 및 주입된다. SAR-NK 제품의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 104 SAR+ve NK 세포/kg에서 5 x 109 SAR+ve NK 세포/kg까지 다양할 수 있다. SAR-NK 제품은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다.
SAR을 발현하는 iPSC 유래 NK 세포의 생성
CD19 표적 SAR 구조체 CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(서열번호 5042)은 두 개의 상이한 탯줄 줄기세포 유래 iPSC 세포주(606A1, NCRM-1) 및 말초 혈액 유래 iPSC 세포주(648A1)에서 발현될 것이다. anti-FLAG-FITC를 사용하여 Topanga 시약 및 FACS와 결합하여 결정된 SAR을 발현하는 단일 세포 클론은 분리, 확장 및 QC 분석(예: 염색체 무결성, 다능성, 동일성 확인, 마이코플라스마 및 불임)을 거친 것이다. 각 iPSC 세포주에서 파생된 여러 독립 클론은 액체 질소에서 동결되어 마스터 세포 은행 역할을 한다.
iPSCs 및 SAR 형질 감염된 iPSC로부터 NK 세포의 유도는 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 수행될 것이다. 간단히 말해서, 3,000개의 TrypLE 적응 iPSC를 40ng/ml 인간 줄기 세포 인자(SCF), 20ng/ml 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 20ng/ml 재조합 인간 뼈 형태 형성 단백질 4(BMP-4)를 포함하는 APEL 배양과 함께 96웰 둥근 바닥 플레이트에 파종된다. 조혈 분화 11일 후, CD34+/CD43+ 및 CD34+/CD45+에 대한 유세포 분석에 의해 조혈 전구 세포에 대해 세포를 평가할 것이다.
스핀 배아체(EB)는 NK 세포 배양 조건에서 코팅되지 않은 24웰 플레이트의 각 웰로 직접 옮겨진다. 그런 다음 세포는 28-32일 동안 5ng/mL IL-3(첫 주에만 해당), 10ng/mL IL-15, 20ng/mL IL-7, 20ng/mL SCF 및 10ng/mL flt3 리간드를 사용하여 NK 세포로 추가로 분화된다. 하프 미디어 변경은 매주 수행된다. NK 세포는 hIL-2의 50단위/mL가 있는 상태에서 인간 CD19를 발현하는 인공 항원을 제시하는 인공 항원을 발현하는 방사선 조사된 mbIL-21을 사용하여 확장을 위해 수확된다. Matador 분석을 사용한 시험관 내 효능 테스트 후, 세포는 NSG 마우스에서 NALM6 이종이식 모델을 사용한 생체 내 연구에 사용될 것이다. 추가 불임 및 효능 분석 후, 세포는 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 및 미만성 거대 B 세포 림프종을 발현하는 CD19 환자의 치료를 위한 인간 임상 시험에 사용될 것이다.
본질적으로 유사한 절차가 당업계에 공지된 T 세포로의 iPSC의 분화를 위한 프로토콜을 사용하여 개시된 SAR을 발현하는 iPSC 유래 T 세포의 생성에 사용될 것이다.
SAR을 발현하는 NK92 세포의 생성 및 사용
cGMP 등급 NK92 세포는 CD20-표적화된 SAR (예를 들어, CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 5047))을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질 도입될 것이다. 렌티바이러스는 또한 IL2의 막 고정 형태(서열번호 1330)를 암호화한다. NK92 세포는 인간 CD20 및 50 units/mL의 hIL-2를 발현하는 인공 항원 제시 K562 세포(aAPCs)의 존재 하에 15일 동안 생체 외에서 확장된다. 세포는 γ -조사된다. 생성된 세포 제품이 품질 관리 테스트(무균 및 종양 특이적 시험관 내 및 생체 내 세포 독성 테스트 포함)를 거친 후 세포는 냉동 보존된다. 한편, 연구 참가자는 림프구 화학 요법(30mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500mg/m2/일 시클로포스파미드 x 3일)을 시작한다. 림프구 고갈 요법이 완료된 지 하루 후, 연구 참가자는 형질 도입된 NK92 세포를 정맥 주사로 받는다. SAR-NK 제품의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 x 104 SAR+ve NK92 cells/kg에서 5 x 109 SAR+ve NK92 cells/kg까지 다양할 수 있다. SAR-NK92 제품은 단일 주입 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다.
SAR을 발현하도록 조작된 조혈 줄기 세포의 생성
CD34 양성 조혈 줄기 세포를 G-CSF 동원 백혈구 성분채집술 산물로부터 정제하고, CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 5042)로 표시되는 CD19-표적 SAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질 도입한다. 조혈 줄기 세포에서 내인성 CD19의 발현은 US10660919에 기재된 기술을 사용하여 임의로 제거된다. 피험자는 골수 파괴 화학 요법을 받은 후 유전자 변형 줄기 세포를 주입한다. 본질적으로 유사한 접근법이 조혈 줄기 세포에서 내인성 CD33의 제거와 조합하여 CD33-표적화된 SAR (예를 들어, 서열번호 4871)을 발현하기 위해 사용된다. 본질적으로 유사한 접근법이 조혈 줄기 세포에서 내인성 MPL의 제거와 함께 MPL-표적화된 SAR (예를 들어, 서열번호 4919)을 발현하기 위해 사용된다.
SAR 발현 대식세포/단핵구의 생성 및 사용
CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (서열번호 5042)으로 대표되는 CD19-표적 SAR은 대식세포/단핵구에서 발현되고, WO2019152781에 기재된 방법을 사용하여 CD19-발현 림프종의 치료에 사용된다.
SAR-T/NK 세포 간 동맥 주입. 정맥 주입 외에도 SAR-T 및 SAR-NK 세포를 동맥 내 주입하여 질병과 관련된 국소 영역 또는 기관에 고농도의 SAR 발현 세포를 제공할 수 있다.
SAR-T/NK 세포의 복강내 투여. SAR-T/NK 세포는 Koneru M et al(Journal of Translational Medicine; 2015; 13:102)에 설명된 대로 본질적으로 복강 내 투여할 수도 있다.
종양내 주입을 위한 SAR-T/NK 세포의 사용. SAR-T/NK 세포는 또한 Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072에 기술된 바와 같이, 본질적으로 종양 내로 투여될 수 있다.
서로 다른 SAR 발현 세포의 조합
환자는 하나 또는 하나 이상의 항원을 표적으로 하는 상이한 SAR 발현 세포의 조합을 받을 수 있다. 예를 들어, 환자는 CD19-표적화된 SAR-T 및 CD20-표적화된 SAR-NK 및 CD22-표적화된 SAR-대식세포를 받을 수 있다. 대안적으로, 대상체는 CD19-표적화된 SAR-T, CD19-표적화된 SAR-NK 세포 및 CD19-표적화된 SAR-대식세포를 받을 수 있다.
SAR의 조합은 면역 반응을 미세 조정하여 역치 효과가 달성된 경우에만 신호전달이 트리거되도록 할 수 있다. 따라서, 서열번호 7601을 갖는 BCMA를 표적으로 하는 SAR 및 서열번호 7607을 갖는 CD19를 표적으로 하는 SAR을 발현하는 NK 세포는 BCMA 및 CD19를 모두 발현하는 세포에 노출될 때 상가적 또는 상승 효과를 나타낼 수 있다. 첨가제/상승 효과는 상이한 항원(예: BCMA 및 CD19)을 표적화함으로써 달성할 수 있다. 부가/시너지 효과를 달성하기 위한 또 다른 접근 방식은 동일한 항원을 표적화하지만 서로 다른 신호 사슬을 구성하는 서로 다른 SAR 수용체를 통해 표적화하는 것이다. 예를 들어, 서열번호 7607 (CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)을 갖는 CD19-SAR을 발현하는 NK 세포는 또한 서열번호 7676 (CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC)을 갖는 또 다른 CD19-SAR을 공동-발현할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 2개의 SAR은 동일한 항원의 상이한 에피토프를 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 7607을 갖는 CD19-SAR (CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)을 갖는 NK 세포는 또한 서열번호 7660 (FMC64-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC) 또는 서열번호 7668을 갖는 또 다른 CD19-SAR (hCD19-Bu12-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC)을 갖는 또 다른 CD19-SAR을 공동-발현할 수 있다.
다른 실시형태에서, CD16 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 NKp30, NKp44, NKp44, NKG2D, Dap10 및/또는 CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승적 효과를 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, NKp30 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp44, NKp46, NKG2D, Dap10 및/또는 CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다. 유사하게, NKp44 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp30, NKp46, NKG2D, Dap10 및/또는 CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다. 유사하게, NKp46 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp30, NKp44, NKG2D, Dap10 및/또는 CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다. 유사하게, DAP10 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, 및/또는 CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다. 유사하게, CD3z 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D 및/또는 DAP10 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다. 유사하게, NKG2D 신호전달 사슬을 포함하는 SAR은 CD16, NKp30, NKp44, NKp46, CD3z 및/또는 DAP10 신호전달 사슬을 포함하는 SAR과 조합되어 부가적/상승 효과를 가질 수 있다.

Claims (245)

  1. 표적 항원에 특이적으로 결합하는 합성 항원 수용체(SAR)로서, 상기 SAR은,
    (i) 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 모듈;
    a) 항체;
    b) 항체 단편;
    c) 항체의 중사슬 가변 영역 (VH 도메인) 또는 이의 단편;
    d) 항체의 경사슬 가변 영역 (vL 도메인) 또는 이의 단편;
    e) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
    f) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편;
    g) vHH 도메인 또는 이의 단편;
    h) 항체의 단량체 가변 영역;
    i) 단일 vH 도메인 (SVH) 또는 이의 단편;
    j) 단일 vL 도메인(SVL) 또는 이의 단편;
    k) DARPIN, 아피바디, 아피리스, 아드넥틴, 아피틴, 오바디, 리페바디, 피노머, 알파바디, 아비머, 아트리머, 센티린, 프로넥티, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아르마딜로 반복 단백질, D 도메인, 및 전술한 이들 중 임의의 단편으로부터 선택된 비면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
    l) 리간드-결합 도메인 수용체 또는 이의 단편;
    m) 리간드의 수용체 결합 도메인;
    n) 이중특이성-항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드;
    o) 자가항원 또는 이의 단편;
    p) 어댑터 결합 도메인 또는 이의 단편;
    q) Fc 결합 도메인 또는 이의 단편;
    r) TCR 또는 HLA-비의존성 TCR 또는 이의 단편; 그리고
    s) TCR의 Va, Vb, Vg 또는 Vd 단편 또는 이의 단편이고,
    (ii) 적어도 하나의 막관련 도메인을 포함하는 제2 모듈로서, 상기 막관련 도메인은 막관통 도메인 또는 막고정 도메인일 수 있고; 및
    (iii) 하나 이상의 세포질 도메인을 포함하는 선택적인 제3 모듈로서
    여기서 제1, 제2 및 제3모듈은 하나 이상의 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결된다.
  2. 제1항의 단일사슬 SAR로서, 여기서 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 상기 제1 모듈은 선택적 링커를 통해
    (1) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 선택적 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    (2) 자연 발생 수용체의 상기 힌지 도메인, 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    (3) 자연 발생 수용체의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    (4) 자연 발생 수용체의 상기 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    (5) 신호전달 어댑터의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 도메인, 상기 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 세포질 도메인 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을
    포함하는 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다.
  3. 제2항의 SAR에 있어서,
    a) 상기 자연 발생 수용체는 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 T 세포 수용체를 포함하지 않고; 및/또는
    b) 상기 자연 발생 수용체는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하지 않고; 및/또는
    c) 상기 신호전달 어댑터는 CD3ζ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 CD3 어댑터가 아니고; 및/또는
    d) 상기 신호전달 어댑터는 FcRγ가 아니다.
  4. 제2항 또는 제3항의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체는 N-말단 세포외 도메인을 갖는 유형I 막 단백질이고 하나 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단은 선택적 링커를 통해
    a) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 선택적 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    b) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    c) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    d) 상기 자연 발생 수용체의 세포질 도메인은 폴리펩티드 사슬 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드의 상기N-말단 또는 상기 N-말단 부근에 조작적으로 연결된다.
  5. 제4항의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체 유형 I 막 단백질은 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, LAIR1, 이의 변이체 및 단편으로부터 구성된 그룹으로부터 선택된다.
  6. 제2항 또는 제3항의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체가 C-말단 세포외 도메인을 갖는 유형 II막 단백질이고 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 암호화하는 폴리펩티드의 N-말단은 선택적 링커를 통해
    a) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 임의적인 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 임의적인 세포질 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    b) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 힌지 도메인, 막관통/막관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    c) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 막관통/막 관련 도메인 및 선택적 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체; 또는
    d) 상기 자연 발생 수용체 폴리펩티드 사슬의 상기 세포질 도메인 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 상기 C-말단 또는 상기 C-말단 부근에 조작적으로 연결된다.
  7. 제6항의 SAR에 있어서, 상기 제2형 막 단백질의 상기 N-말단에 작동적으로 연결된 신호전달 어댑터의 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 상기 N-말단을 더 포함한다.
  8. 제7항의 상기 SAR에 있어서, 상기 신호전달 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 또는 DAP10의 그룹으로부터 선택된다.
  9. 제8항의 상기 SAR에 있어서, 상기 신호전달 어댑터의 상기 세포질 도메인의 상기 N-말단에 조작적으로 연결된 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 상기N-말단을 더 포함한다.
  10. 제9항의 상기 SAR에 있어서, 상기 하나 이상의 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 및 ICOS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  11. 제10항의 상기 SAR에 있어서, DAP10을 포함하는 부속 모듈과 함께 발현된다.
  12. 제6항 내지 제10항의 임의의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체 유형 II 막 단백질이 NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, KLRG1, CD94, CD161, 이의 변이체 및 이의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  13. 제3항의 SAR 있어서, 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인은 모두 단일 자연 발생 수용체로부터 유래되고, 하나의 연속적인 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다.
  14. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인이 2개 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된다.
  15. 제14항의 SAR에 있어서, 이는
    a) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 상기 선택적 힌지 도메인, 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인에 조작적으로 연결되고; 또는
    b) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인 및 상기 선택적 힌지 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 상기 막관통 도메인 및 상기 선택적 세포질 도메인에 조작적으로 연결되고; 또는
    c) 자연 발생 수용체의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 항원 결합 도메인, 상기 선택적 힌지 및 막관통 도메인은 하나 이상의 상이한 자연 발생 수용체로부터 유래된 세포질 도메인에 조작적으로 연결된다.
  16. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인을 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인을 포함한다.
  17. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인을 ITAM들을 포함하는 활성화 도메인이 결여된다.
  18. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및/또는 DAP10의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집한다.
  19. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인이 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다.
  20. 제2항의 상기 SAR에 있어서, 상기 하나 이상의 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM, ICOS, 이의 변이체 및 이의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  21. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 공동자극 도메인이 결여된다.
  22. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 세포질 도메인은 상기 막관통 도메인과 상기 활성화 도메인 사이에 위치하는 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다.
  23. 제2항의 SAR에 있어서, 상기 자연 발생 수용체가 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 이의 변이체 및 이의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
  24. 제2항 및 제3항의 SAR 있어서, 상기 SAR은 상기 자연 발생 수용체의 상기 세포외 항원 결합 도메인의 항원 결합 특성을 부분적으로 또는 완전히 보유하고, 상기 제1 모듈에 위치하는 상기 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인의 항원 결합 특이성을 획득한다.
  25. 제1항의 SAR에 있어서, 세포 표면 상에서 발현될 때 상기 세포 상에서 MHC(또는 HLA)-의존성 및/또는 MHC(또는 HLA)-비의존성 항원 인식을 부여할 수 있고, 여기서
    a) 상기 SAR의 상기 항원 결합 도메인은 단일 연속 폴리펩티드 사슬로 구성되지 않고; 및/또는
    b) 상기 SAR의 상기 항원 결합 도메인(들)은 항체 또는 항체 단편으로부터 유래되지 않고; 및/또는
    c) 상기 SAR은 T 세포 수용체 모듈을 포함하지 않는다.
  26. 제25항의 SAR에 있어서, 상기 SAR의 상기 항원 인식 도메인은 TCR의 적어도 2개의 가변 도메인으로부터 유도된다.
  27. 제26항의 SAR에 있어서, 상기 2개의 가변 도메인은 Vα, Vβ, Vγ, Vδ 및 preTCRα로부터 선택되는 2개 이상의 가변 도메인의 이종이량체를 포함한다.
  28. 제27항의 SAR에 있어서, 상기 2개의 가변 도메인은 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ이다.
  29. 제28항의 SAR에 있어서, 상기 2개의 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 연결되지 않는다.
  30. 제29항의 SAR에 있어서, 이는 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이 아니다.
  31. 제25항의 SAR에 있어서, 이는 2개의 사슬을 가지고 및 하나 이상의 사슬은 막 회합이다.
  32. 제31항의 SAR에 있어서, 상기 두 사슬은 모두 막 회합이다.
  33. 제25항의 SAR에 있어서, 이는 MHC(HLA) 분자와 복합체 내의 펩티드에 결합할 수 있다.
  34. 제25항의 SAR에 있어서, 이는 세포 표면에서 발현될 때 펩티드/MHC 복합체에 결합될 때 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 능력을 부여한다.
  35. 제25항의 SAR에 있어서, 이는 세포 표면에서 발현될 때 펩티드/MHC 복합체에 결합될 때 적어도 하나의 신호전달 경로를 개시할 수 있는 능력을 부여한다.
  36. 제25항의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
  37. 제36항의 SAR에 있어서, 이는 기능적 CD3 복합체의 발현이 결여된 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
  38. 제37항의 SAR에 있어서, 이는 CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 세포에서 기능적으로 발현될 수 있다.
  39. 제36항의 SAR에 있어서, 이는 T 세포 유사 항원 인식을 비-T 세포에 부여할 수 있다.
  40. 제36항의 SAR에 있어서, 이는 CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 T 세포에 T 세포 유사 항원 인식을 부여할 수 있다.
  41. 제36항의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에 대한 항원 인식 시 T 세포 유사 신호전달을 부여할 수 있다.
  42. 제36항의 SAR에 있어서, 이는 CD3γ 및 CD3δ 및 CD3ε 사슬의 기능적 발현이 결여된 T 세포에 신호전달 유사 T 세포를 부여할 수 있다.
  43. 제22항의 SAR에 있어서, 이는 임의의 세포에 T 세포 유사 항원 인식을 부여할 수 있다.
  44. 제1항의 SAR에 있어서, 적어도 2개의 사슬을 포함하고, 여기서
    a) 제1 폴리펩티드 사슬은 vL, Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 및
    b) 제2 폴리펩티드 사슬은 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고;
    여기서, 상기 제1 항원 결합 도메인의 상기 vL, Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상기 상보적 vH, Vβ 또는 Vδ 도메인은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv- 또는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고; 및
    여기서, 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다.
  45. 제44항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 항원-결합 도메인과 상기 제1 MAM 사이에 제1 펩티드 링커를 더 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 항원-결합 도메인과 상기 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 더 포함한다.
  46. 제45항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
  47. 제46항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 CH1, CH2, CH3, CH4 또는 CL 항체 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
  48. 제46항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 개별적으로 Cα, Cβ, Cγ, 또는 Cδ TCR 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
  49. 제44항 또는 제45항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된다.
  50. 제45항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현, 친화성 및/또는 쌍을 증가시키는 돌연변이를 포함한다.
  51. 제45항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 서열번호 3536-3569 및 9627-9631 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
  52. 제44항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 MAM에 대한 제1 힌지 도메인 또는 이의 단편 N 말단을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM에 대한 제2 힌지 도메인 또는 이의 단편의 N-말단을 추가로 포함한다.
  53. 제44항의 SAR에 있어서, 상기 제1 MAM과 상기 제2 MAM 내의 잔기 및/또는 상기 제1 힌지 도메인 내의 잔기 및 상기 제2 힌지 도메인 내의 잔기 사이의 디설파이드 결합을 포함한다.
  54. 제44항의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 상기 제1 힌지 도메인에 제1 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고/하거나 상기 제2 폴리펩티드가 상기 제2 힌지 도메인에 제2 상동 항원 결합 도메인 또는 이의 단편 N-말단을 추가로 포함하고, 여기서 상기 2개의 상동성 항원 결합 도메인은 상응하는 상기 힌지 도메인과 동일한 자연 발생 비-T 세포 수용체로부터 유래된다.
  55. 제44항의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드가 상기 제1 MAM을 포함하는 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 선택적 활성화 도메인 C-말단을 포함하는 제1 세포질 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 여기서 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 선택적 활성화 도메인 C-말단을 포함하는 제2 세포질을 추가로 포함한다.
  56. 제44항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 MAM의 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제1 부속 세포내 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 여기서 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제2 부속 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
  57. 제56항의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인이 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 선택된다.
  58. 제44항의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
  59. 제58항의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 모두 단일 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 상기 막관통/막 고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
  60. 제58항의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 상이한 비-T 세포 수용체 및/또는 신호전달 어댑터 또는 이의 변이체로부터 유래된 상기 막관통/막 고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
  61. 제58항의 SAR에 있어서, 상기 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인이 서열적으로 동일하고, 동일한 단백질로부터 유래된다.
  62. 제58항의 SAR에 있어서, 상기 2개의 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 공동자극 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인이 서열이 상이하고 및/또는 상이한 단백질로부터 유래된다.
  63. 제58항의 SAR에 있어서,
    a) 상기 비T 세포 수용체는 자연 발생 수용체이고, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 전술한 임의의 변형체, 및 이의 단편; 및
    b) 상기 신호전달 어댑터는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: CD3ζ, FcRγ, DAP10, 전술한 임의의 변형체 또는 이의 단편.
  64. 제44항의 상기 SAR에 있어서,
    a) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ζ로부터 선택된 CD3 사슬의 상기 막관통 도메인 및 선택적 상기 세포질 도메인을 포함하지 않고; 및/또는
    b) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 TCR 사슬 및 CD3 사슬의 상기 막관통 도메인을 포함하지 않고; 및/또는
    c) 상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 CD3ζ의 상기 막관통 도메인을 포함하지 않는다.
  65. 제44항의 SAR에 있어서, 상기 MAM 중 단 하나가 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 T 세포 수용체로부터 유래된다.
  66. 제1항의 SAR에 있어서, 적어도 2개의 사슬을 포함하고,
    a) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 vL 도메인 및 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 또는 이의 변이체로부터 선택된 제1 TCR 불변 사슬을 포함하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하고; 그리고
    b) 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 vH, 도메인 및 TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 또는 이의 변이체로부터 선택된 제2 TCR 불변 사슬을 포함하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하고;
    여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRα의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRβ의 불변 사슬이거나,
    여기서 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRβ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRα의 불변 사슬이거나,
    여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRγ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRδ의 불변 사슬이거나,
    여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬은 TCRδ의 불변 사슬이고, 상기 제2 TCR 불변 사슬은 TCRγ의 불변 사슬이거나,
    여기서, 상기 제1 TCR 불변 사슬 및/또는 상기 제2 TCR 불변 사슬은 이의 N-말단 영역에서 아미노산 잔기가 결여되어 있고,
    상기 vL 및 vH 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하고; 그리고
    상기 제1 TCR 불변 사슬 및 상기 제2 TCR 불변 사슬은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다.
  67. 제66항의 SAR에 있어서,
    a) 상기 TCRα 불변 사슬은 서열번호(PRT) 7863-7963을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및
    b) 상기 TCRβ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 7964-8089을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및
    c) 상기 TCRγ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 8091-8191을 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시되고; 및
    d) 상기 TCRδ 불변 사슬은 서열번호(PRT) 8192-8292를 갖는 아미노산 서열 또는 그에 대해 80-99% 상동성을 갖는 서열로 표시된다.
  68. 제44항 또는 제66항의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬이 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인의 N-말단 또는 N-말단 근처에 부착되는 하나 이상의 자율적 항원 결합 도메인(AABD)을 추가로 포함한다.
  69. 제68항의 상기 SAR에 있어서, 상기 AABD가 단일 vH 도메인 (SVH), 단일 vL 도메인 (SVL), vHH 도메인, 단일 도메인 항체, TCR의 단일 가변 도메인 (svd-TCR), 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체의 리간드-결합 도메인, 리간드의 수용체-결합 도메인자가항원, 어댑터 결합 도메인, Fc 결합 도메인, 이의 단편 및/또는 이의 변이체 중 하나 이상으로부터 선택된다.
  70. 제1항의 상기 SAR에있어서, 상기 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함하는 상기 모듈이 a) 세포 표면 단백질 항원, b) 펩티드/MHC 복합체 및 c) 지질 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
  71. 제1항의 상기 SAR에 있어서, 표적 항원이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되어 진다: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24로도 지칭됨); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3; TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원((Tn Ag); 전립선특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); FmsLike 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종에서는 발현되지만 조혈 전구체에서는 발현되지 않는 당화된 CD43 에피토프, 비조혈성 암에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프, 암배아 항원(CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); 키트(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-beta); 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 연신율 2 돌연변이 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAlX); 프로테아좀(Prosome, Macropain) 서브유닛, 베타형, 9(LMP2); 당단백질 100 (GPL00); 브레이크포인트 클러스터 영역(BCR) 및 Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1(Abl)(bcr-abl)로 구성된 종양유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3; 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종 관련 항원(HMWMAA); o- 아세틸 -GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글리코세라미드(GloboH)의 globoH 헥사당 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ES0-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p(ETV6-AML)에 위치한 MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, PRAME, PSA, ETS 전좌 변이체 유전자 6; 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 살아남은; 텔로머라아제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCT A-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1(MelanA 또는 MARTI)에 의해 인식되는 흑색종 항원; 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라아제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단 점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (transmembrane protease, serine 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N- 아세틸 글루코 사미닐 트랜스퍼라제 V (NA17); 짝을 이루는 상자 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-MYC 조류 골수세포종증 바이러스성 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 lB1 (CYPlB1); CCCTC-결합 인자 (징크 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절자의 형제), T 세포 3 (SART3)에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원; 짝을 이루는 상자 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); 앵커 단백질 4 키나제(AKAP-4); 활막 육종, X 중단점 2(SSX2); 최종당화산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1 (RUl); 신장 유비쿼터스 2 (RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라아제; 열 쇼크 단백질 70-2 돌연변이 (MUT HSP70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl), MPL, 비오틴, c-MYC 에피토프 태그, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시알릴 루이스 항원) Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK TCRgamma-delta, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tn ag, CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGFbetaR2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-beta1 사슬, TCR-beta2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 류텐화 호르몬 수용체(LHR), 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR), 융모막 성선 자극 호르몬 수용체(CGHR), CCR4, GD3, SLAMF6, SLAMF4, HIV1 외피 당단백질, HTLV1-Tax, CMV pp65, EBV-EBNA3c, 인플루엔자 A 헤마글루티닌(HA), GAD, PDL1, 구아닐릴 시클라제 C(GCC), 데스모글레인 3에 대한 자동 항체(Dsg3), 데스모글레인 1에 대한 자가항체(Dsg1), HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직 인자 1(TF1), AFP, GPRC5D, claudin18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, LIV1, NECTIN-4, CRIPTO, GPA33, BST1/CD157, 낮은 전도도 염화물 채널 및 SARS-CoV2 스파이크 단백질.
  72. 제1항의 상기 SAR에 있어서, 상기 암호화된 SAR 폴리펩티드는 다음 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이종 항원 결합 도메인을 포함한다:
    (i) 서열번호 2682-2918 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 80% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 기재된 서열의 3개의 CDR에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 각각 11593-11829, 11830-12066, 12067-12303에 제시되고 vH에 속하는 CDR1, CDR2 및 CDR3에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2682-2918 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 중사슬 가변 영역 (vH);
    (ii) 서열번호 2440-2676 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 80% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 12440-2676 중 어느 하나 이상에 제시된 서열 중 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 VL에 속하고 각각 10882-11118, 11119-11355 및 11356-11592에 제시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2440-2676 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 경사슬 가변 영역 (vL);
    (iii) 서열번호 2924-3160 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 6개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열의 6개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 단일 사슬 가변 단편 scFV를 포함하는 vH에 속하고 각각 11593-11829, 11830-12066, 12067-12303에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 단일 사슬 가변 단편 scFV를 포함하는 vL에 속하고 각각 10882-11118, 11119-11355 및 11356-1159에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 2924-3160 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv);
    (iv) 서열 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대해 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 적어도 70% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 중 3개 이상의 CDR에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 3210-3353, 10695-10713 중 어느 하나 이상에 기재된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 도메인 항체, vHH 도메인, SVH 및/또는 FHVH 도메인
    (v) 서열번호 3366-3377 중 어느 하나에 기재된 임의의 서열 또는 서열번호 3366-3377 중 어느 하나 이상에 제시된 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3366-3377 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열에 의해 암호화되는 비면역글로불린 스캐폴드;
    (vi) 서열번호 3378-3395, 3880, 3882, 3886, 3893, 3896, 3897 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고 이의 동족에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 수용체의 리간드 결합;
    (vii) 서열번호 3396-3406, 10786-10787 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 리간드의 수용체 결합 도메인;
    (viii) 서열번호 3407-3435, 10771-10780 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 어댑터에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 어댑터 결합 도메인;
    (ix) 서열번호 10788-10791 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이의 자가항체 또는 자가항체 생산 세포에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 자가항원;
    (x) 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 임의의 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에서 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 어느 하나 이상에 제시된 서열의 3개 이상의 CDR에 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 3357-3364, 9606-9614, 10781-10782 중 임의의 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 TCR 가변 영역 (Va, Vb, Vg 또는 Vd);
    (xi) 서열번호 9613-9614 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 9613-9614 중 어느 하나 이상에 기재된 서열에 대한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 70-99% 동일성을 갖는 서열 또는 임의의 하나에 기재된 서열의 3개 미만의 치환을 갖는 서열 또는 서열번호 9613-9614 중 어느 하나 이상에 제시된 서열과 동일한 표적 항원 또는 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하는 서열을 포함하고 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 단일 가변 TCR 도메인 (svd-TCR).
  73. 제2항 또는 제58항의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터 또는 이의 단편은 서열번호 3743-3966, 3385, 3394, 7818-7822, 9633-9859로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  74. 제2항 또는 제58항의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터의 상기 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 9669-9704, 3813, 8721, 8733 및 8746으로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  75. 제1항, 제2항 또는 제58항의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 상기 신호전달 어댑터의 막관련 도메인은 서열번호 3914-3928, 9741-9776, 9852-9855로부터 선택된 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  76. 제1항, 제2항 또는 제58항의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 세포질 도메인은 서열번호 3944-3958, 9777-9812, 9856-9859로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  77. 제16항 또는 제55항의 SAR에 있어서, 자연 발생 수용체 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 활성화 도메인은 서열번호 9856-9859 및 9777로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  78. 제9항, 제48항 및 제56항의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인이 서열번호 9807-9810으로부터 선택되는 서열 또는 이에 대한 서열과 70% 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
  79. 제1항의 상기 SAR에 있어서, 각 사슬의 N 말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호전달 펩타이드를 더 포함하고, 선택적으로 서열번호 2425-2430으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
  80. 제1항의 상기 단리된 SAR 폴리펩티드에 있어서, 상기 SAR이 SAR 이종이량체를 포함한다.
  81. 제1항 또는 제80항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 폴리펩티드는 절단가능한 링커에 의해 연결되는 2개의 SAR 사슬을 포함한다.
  82. 제81항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 자가절단가능한 링커이다.
  83. 제82항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는2A 링커, 2A 유사 링커 또는 이의 기능적 동등물 중 어느 하나 이상이다.
  84. 제83항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는T2A링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 동등물 중 어느 하나 이상이다.
  85. 제84항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 서열번호 3627-3632 중 어느 하나 이상의 서열을 포함한다.
  86. 제84항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 선택적으로 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이의 기능적 등가물에 의해 선행된다.
  87. 제86항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 상기 퓨린 절단 부위는 서열번호 3635-3636 중 어느 하나 이상의 서열을 포함한다.
  88. 제86-87항의 어느 한 항에서의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 가요성 링커에 선행된다.
  89. 제88항의 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 가요성 링커는 Ser-Gly 링커 또는 이의 기능적 등가물 중 하나 이상을 암호화한다.
  90. 제89항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 절단가능한 링커에 선행하는 가요성 링커는 서열번호 3633-3634의 서열을 포함한다.
  91. 제88-90항의 어느 한 항에서의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 퓨린 절단 부위 다음에는 가요성 링커가 뒤따르고, 그 뒤에는 절단가능한 링커가 뒤따르도록 하여 순서가 퓨린 절단 부위-가요성 링커-절단 가능한 링커이다.
  92. 제1항 또는 제80항의 상기 단리된 합성 항원 수용체(SAR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체에 있어서, 상기 SAR은 선택된 항원에 대해 원하는 결합 친화도를 갖도록 설계된다.
  93. 제1항의 SAR에 있어서, 다음의 그룹으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 부속 모듈을 추가로 발현한다.
    a) 사이토카인 또는 이의 변이체;
    b) 막고정 사이토카인;
    c) 에피토프 태그를 갖는 막고정 사이토카인;
    d) 자살, 생존 및 마커 기능을 수행하는 다목적 스위치;
    e) 신호전달 어댑터 분자; 그리고
    f) 킬 스위치.
  94. 제93항의 부속 모듈에 있어서,
    a) 상기 사이토카인은 서열번호 7833-7842를 갖는 서열 또는 이에 대해 최대70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 및
    b) 상기 막고정 사이토카인은 서열번호 7825-7832를 갖는 서열 또는 이에 대해 최대 70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고,
    c) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7843-7850을 갖는 서열 또는 이에 대해 70%의 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하고,
    d) 상기 어댑터는 CD3ζ, FcRγ, DAP10 및 DAP12 그룹에서 선택된다.
  95. 하기 화학식을 갖는 제94항의 다목적 스위치를 포함하는 폴리펩티드:
    SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4;
    SP는 상기 다목적 스위치의 세포 표면 수송을 허용하고 상기 성숙한 펩티드를 수득하기 위해 절단되는 선택적인 신호 펩티드이며,
    D1은 세포 생존을 촉진하는 수용체에 결합하는 수용체 결합 도메인이며,
    D2는 마커/자살 도메인이고,
    D3는 상기 D1 및 D2 도메인이 타겟 셀의 표면으로부터 멀리 투영될 수 있도록 하는 힌지 도메인/줄기 도메인이고,
    D4는 상기 다용도 스위치를 상기 세포막에 고정시키는 막회합 도메인이고,
    L1, L2 및 L3은 선택적 링커이다.
  96. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 다용도 스위치 폴리펩티드는 제1 모듈 (D1), (D2), (D3) 및 (D4)의 프레임내 융합체를 포함한다.
  97. 제96항의 폴리펩티드에 있어서,
    a) D3 및 D4 모듈은 동일한 내인성 단백질에서 파생되고; 또는
    b) D2, D3 및 D4 모듈은 상이한 내인성 단백질로부터 유래되고; 또는
    c) D3 및 D4는 동일한 내인성 단백질로부터 유래되고; 또는
    d) D3 및 D4는 상이한 내인성 단백질로부터 유래된다.
  98. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈(D1)은 세포 표면 상에서 발현되는 수용체에 결합한다.
  99. 제98항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 수용체가 결합될 때 상기 세포에 생존 및/또는 증식 신호를 전달한다.
  100. 제98항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈이 시스 내의 상기 수용체에 결합하고/하거나 상기 제1 모듈이 트랜스 내의 상기 수용체에 결합한다.
  101. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 제1 모듈(D1)은 사이토카인, 케모카인, 리간드, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 상기 수용체 결합 도메인을 포함한다.
  102. 제101항의 다용도 스위치에 있어서, 상기 D1은 IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21, CD40L, 4-1BBL, CD30L, OX40L, FLT3-L, APRIL, BAFF, 란테스, MIP, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, SCF (줄기 세포 인자), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 전술한 임의의 것의 변이체 및 임의의 전술한 것의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 사이토카인, 케모카인, 리간드의 수요체 결합 도메인을 포함한다.
  103. 제101항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D1은 서열번호 7833 내지 7842로 표시되는 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
  104. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D1은 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일사슬 항체, scFv, 또는 수용체에 결합할 수 있는 비면역글로불린 항원 결합 모듈을 포함한다.
  105. 제95항 및 제104항의 폴리펩티에 있어서, 상기 D1은 IL2R, IL6R, IL7R, IL9R, IL10R, IL11R, IL12R, IL15R, IL18, IL21 CCR1, CCR3, CCR5, MIP-1R, PF4 수용체, 에리스로포에이틴-수용체 (Epo-R), TPO-R/MPL, GSF-R, c-Kit, 및 M-CSF 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용체에 결합한다.
  106. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 비내인성 폴리펩티드를 포함한다.
  107. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 내인성 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
  108. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 하기 내인성 단백질 중 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD38, CD52, CD171; CS1 (SLAMF7, CD319); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRviii); 강글리오사이드 G2 (GD2); 강글리오사이드 GD3; 비씨마; Tn 항원 (Tn Ag); 전립선 특이 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); 티로신 키나제 3 (FLT3)와 같은 Fms; 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 발암배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); 키트(CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-beta); 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산 수용체 알파 (FRa 또는 FR1); 엽산 수용체 베타(FRb); 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 접착 분자 (NCAM); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAlX); 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 시알루이스 접착 분자 (sLe); 강글리오사이드 GM3; 고분자량-흑색종 관련 항원(HMWMAA); o- 아세틸 -GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); 글리코세라미드(GloboH)의 globoH 헥사당 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 안드로겐 수용체; T 세포 3(SART3)에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원; CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl), MPL, CD34, LAMP1 TROP2, GFRalpha4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; Sialyl Lewis 항원); Fucosyl-GM1, PTK7, gpNMB, CDH1/CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL11Ra, IL13Ra2, IL-17R, CD179b-IGLl1, TCRgamma-delta, NKG2D, CD32(FCGR2A), Tim1-/HVCR1, CSF2RA(GM-CSFR-알파), TGFbetaR2, Lews Ag, TCR-beta1 사슬, TCR-beta2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 류텐화 호르몬 수용체(LHR), 난포 자극 호르몬 수용체(FSHR), 성선 자극 호르몬 수용체(CGHR 또는 GR), CCR4, SLAMF6, SLAMF4, CD99, Ras G12V, 조직 인자 1(TF1), GPRC5D, Claudin18.2(CLD18A2 또는 CLDN18A.2), P-당단백질, STEAP1, Liv1, Nectin-4, Cripto, gpA33, BST1/CD157, 저전도도 염화물 채널(LCCC), TAJ/TROY, MPL(TPO-R), KIR3DL2, CD32b, CD229, Toso, PD-1, PD-L1, PD-L2, TNFR1, TRAIL-R1(DR4), TRAIL-R2(DR5), CTLA4, IL-36R, CD25, LAG3, VEGF-A, MASP-2, 흉선 기질 림프포이에틴, 조직 인자, IFNAR1, IL5, IL-6, IL-12, IL-23, IL-17A, IL-13, 안지오포이에틴 유사 3, CGRP, IL-23p19, vWF, C5, IFNγ, CD4, CD8, CD7, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, PDGRFα, α4β7 인테그린, α4 인테그린, VEGF, GPIIb/IIIa PCSK9, Blys 및 BAFF-R.
  109. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D2는 상기 다목적스위치를 발현하는 세포를 검출, 농축 및/또는 사멸시키는데 사용될 수 있는 작용제에 의해 결합될 수 있다.
  110. 제109항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 작용제는 항체, 항체 단편, scFv, 단일 도메인 항체, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, 항체 약물 접합체, 이중특이성 항체 또는 이의 단편 또는 세포 중 하나 이상으로부터 선택된다
  111. 제110항의 폴리펩티드에 있어서, D2에 결합하는 상기 작용제가 생체내 또는 생체외 인간 임상용으로 승인된다.
  112. 제111항의 상기 폴리펩티드에 있어서, 상기 작용제는 리툭시맙, 허셉틴, 엔허투, 에르비트룩스, 아세트리스, 엔브렐, 트레멜리무맙, 모수네투주맙, 테클리스타맙, 도나네맙, 스페솔리맙, 파리시맙, 벨란타맙 마포도틴, 티스렐리주맙, 론카스툭시맙 테시린, 타파시타맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙 및 큐벤드10으로부터 선택된다.
  113. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 상기 D3은 5-100개 아미노산 길이의 줄기(hinge domain) 서열을 포함한다.
  114. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호(PRT) 7843-7850, 서열번호(PRT) 9625 및 서열번호 9620-9624로 표시되는 아미노산 서열 또는 이에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
  115. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 7843-7849로 제시된 서열, 또는 서열번호 7843-7849로 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고, (i) J6M0에 결합하고; (ii) 벨란타맙 마포도틴에 결합하고 및 (iii) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 벨란타맙 마포도틴의 존재 하에 세포의 사멸을 유도한다.
  116. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 9620-9624로 제시된 서열, 또는 서열 9620-9624로 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고(i) QBEND10에 결합하고; (ii) 리툭시맙에 결합하고, (iii) T 세포 또는 NK 세포의 표면에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 리툭시맙의 존재 하에 세포의 보체 매개 사멸을 유도한다.
  117. 제95항의 폴리펩티드에 있어서, 서열번호 9625로서 제시된 서열 또는 서열번호 9625로서 제시된 서열과 80% 이상의 동일성의 변이체를 포함하고 (i) 허셉틴에 결합하고; (ii) 엔허투에 결합하고 (iii)는 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현될 때, 생존을 촉진하고; (v) T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 경우, 허셉틴 또는 에네헤르투의 존재 하에 세포의 사멸을 유도한다.
  118. 제1항의 SAR의 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬 및/또는 제93항의 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 재조합 핵산(들).
  119. 제118항의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템으로서, 부속 함께 동시 발현되고, 상기 부속 모듈은 절두된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR), 절두된 표피 성장 인자 수용체 viii(tEGFRviii), 절두된CD30(tCD30), 절두된BCMA(tBCMA), 절두된CD19(tCD19), CD34, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 니트로리덕타제, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 인간 카스파제 8, 인간 카스파제 9, 유도성 카스파제 9(icaspase9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/글루코스 산화효소, 데옥시리보뉴클레오시드 키나제, 홀스래디시-퍼옥시다제(HRP)/인돌-3-아세트산(IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/티미딘 키나제 키메라, 독스-의존성 카스파제-2, 돌연변이 티미딘 키나제(HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체(CCR), 선택 마커, 다목적 스위치, vFLIP-K13, vFLIP-MC159, 4-1BBL-CD40L, DAP10, DAP12, NKG2C, CD94, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, 디하이드록시폴레이트 수용체(DHFR), 돌연변이 DHFR, 메틸화-DNA-단백질-시스테인 메틸트랜스퍼라제, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 II(IMDHP2), 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC), 블라스티시딘 내성 유전자, 돌연변이 칼시뉴에린 a/b(Can/b), CNa12, CNb30 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
  120. 제119항의 상기 재조합 발현 시스템에 있어서, 상기 SAR의 1개 또는 2개의 사슬 또는 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 선택적 가요성 링커, 선택적 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 및 절단가능한 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된다.
  121. 제120항의 상기 재조합 발현 시스템에 있어서, 상기 SAR의 1개 또는 2개의 사슬 및 하나 이상의 부속 모듈을 암호화하는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는
    i) 하나 이상의 프로모터;
    ii) 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES);
    iii) 하나 이상의 절단 가능한 링커;
    iv) I, II 및 III의 어떤 조합
    을 사용하여 발현된다.
  122. 제121항의 재조합 발현 시스템에 있어서,
    a) 상기 프로모터는 MNDU3 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터(서열번호 8505), EFS2 프로모터(서열번호 8506), RSV 프로모터(서열번호 8507), 또는 mutRSV 프로모터(서열번호 8508) 또는 이에 대해 70% 동일성을 갖는 서열이고; 그리고
    b) 상기 IRES는 K-IRES (서열번호 8504) 또는 이에 대해 70% 동일성을 갖는 서열이다.
  123. 제118항의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및 제119항의 상기 재조합 발현 시스템을 포함하는 적어도 하나의 벡터로서, 상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터, 및 피기백 트랜스포존 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  124. 제123항의 상기 벡터에 있어서, 하나 이상의 구성적 프로모터 또는 조절가능한 프로모터를 포함한다.
  125. 제104항의 상기 벡터에 있어서, 상기 프로모터는 MNDU3 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터 (서열 8505), EFS2 프로모터 (서열 8506), RSV 프로모터 (서열 8507), 또는 mutRSV 프로모터 (서열 8508), CMV IE 유전자 프로모터, EF-1a 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, MSCV LTR 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 또는 합성 노치 (SynNotch) 프로모터로부터 선택된다.
  126. 제123항의 상기 벡터에 있어서, 상기 벡터가 시험관내 전사된 벡터이거나, 또는 상기 벡터가 폴리(A) 테일 또는 3'UTR을 추가로 포함한다.
  127. 제1항의 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드 또는 이종이량체, 제118항의 핵산, 제119항의 선택적 부속 모듈, 재조합 발현 시스템, 및 제123항의 벡터를 포함하는 이펙터 세포 또는 줄기 세포.
  128. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 세포는 복수의 단일 또는 이중사슬 SAR 폴리펩티드를 포함한다.
  129. 제128항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 단일 또는 이중사슬 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드보다 상이한 항원을 표적으로 한다.
  130. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 동일한 항원을 표적으로 한다.
  131. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 항원에 대해 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드보다 상이한 결합 친화도를 포함한다.
  132. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드와는 상이한 자연 발생 수용체 또는 신호전달 어댑터를 포함한다.
  133. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드와는 상이한 세포외 도메인, 막관통 도메인, 세포질 도메인을 갖는다.
  134. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SAR 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, 적어도 하나의 다른 SAR 폴리펩티드는 억제성 수용체이다.
  135. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 활성화 수용체거나 또는 복수의 상기SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 억제성 수용체다.
  136. 제127항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 복수의 SAR 폴리펩티드 중 2개 이상의 SAR 폴리펩티드는 상이한 신호전달 어댑터를 모집하고/하거나 상이한 신호전달 경로를 활성화시킨다.
  137. 제127-136항의 상기 이펙터 세포 또는 줄기세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 α/β T 세포, γ/δ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 기억 T 세포, 나이브 T 세포, T 줄기 세포, Treg 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, iNKT(선천적 자연 살해 세포), NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, iPSC 유래 T 세포, B 세포, 대식세포/단핵구, 과립구, 수지상 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포 또는 그 유도체이다.
  138. 제127-136항의 어느 한 항의 이펙터 세포의 집단에 있어서, 상기 세포의 집단이 복수의 다양한 SAR 폴리펩티드를 포함한다.
  139. 제138항의 상기 면역 또는 이펙터 세포의 집단에 있어서, 상기 복수의 다양한 SAR 폴리펩티드는 상이한 서열을 포함하지만 동일한 표적 항원 또는 상이한 항원에 결합한다.
  140. 제127항의 SAR-발현 이펙터 세포를 제조하는 방법에 있어서, 상기 SAR 폴리펩티드 및 상기 선택적 부속 모듈이 발현되도록 하는 조건 하에서, 제123항의 적어도 하나의 벡터 또는 제118항의 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 이펙터 세포, 세포주, 조혈 줄기 세포, 전구 세포 또는 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는IPSC 내로 도입하는 것을 포함한다.
  141. 제127항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 기능적 TCR, 기능적 HLA, β2 마크로글로불린, TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자에서 발현이 부족하거나 낮은 발현을 하고; 및/또는 HLA-E, 41BBL, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12, CD4, CD8, CD16, CD47, CD94, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, Fc 수용체, 인게이저, 또는 이중- 또는 다중특이성 또는 보편적인 결합제와 결합하기 위한 표면 유발 수용체 중 적어도 하나에서 도입되거나 증가된 발현이 있다.
  142. 제127항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 상기 이펙터 세포는 제1 내인성 TCR 서브 유닛 및/또는 제2 내인성 TCR 서브 유닛의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다.
  143. 제127항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ를 발현하지 않고, 비TCR 항원-인식 도메인 및 T 세포 수용체 모듈 (TCRM)을 포함하는 재조합 이중 사슬 SAR을 발현하도록 재조합 발현에 의해 변형되고, 여기서 상기 세포는 CD3 사슬 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ, 및 CD3 사슬을 발현하고, 상기 SAR은 세포의 표면에 위치한 기능적 CD3-SAR 복합체를 형성한다.
  144. 제127항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하지 않는 및/또는 CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ를 발현하지 않고, 재조합 발현에 의해 변형되어 상기 세포에 외인성 재조합 이중사슬 TCR을 발현하고, 여기서 상기 재조합 이중사슬 TCR은 a) Vα 및 Vβ 도메인 또는 b) Vγ 및 Vδ 도메인 및 비-T 세포 수용체 모듈 (NTCRM)을 포함하는 TCR 항원 인식 도메인을 포함하는 SAR이다.
  145. 제144항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 비-T 세포 수용체 및/또는 신호 어댑터로부터 유래된 제1 MAM 및 제2 MAM를 포함하는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)에 선택적 링커를 통해 작동적으로 연결되는 TCR 항원 인식 모티프를 포함하고, 선택적인 세포질 공동자극 도메인을 추가로 포함한다.
  146. 제143-145항의 상기 이펙터 세포에 있어서, 이는NK 세포, g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, B 세포, 과립구, 대식세포/단핵구, 수지상 세포, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ 사슬중 하나 이상이 결핍된 T 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  147. 제127항의 이펙터 세포를 생성하는 방법에 있어서, 체외 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포 집단 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 상기 RNA 또는 RNA들은 제118항의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
  148. 대상체에서 항질병 면역을 제공하는 방법으로서, 면역 이펙터 세포 또는 제127-146항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는 줄기 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포는 자가 T 세포 또는 동종이계 T 세포, 또는 자가 NK 세포 또는 동종이계 NK 세포이고, 또는 자가 대식세포 또는 동종 대식세포, 또는 자가 과립구 또는 동종 과립구, 또는 자가 수지상 세포 또는 동종 수지상 세포, 또는 자가 조혈 줄기 또는 동종 조혈 줄기 세포 또는 이펙터 세포를 발생시킬 수 있는 자가 또는 동종 iPSC이다.
  149. 제148항의 상기 방법에 있어서, 상기 동종 T, NK, 대식세포, 과립구, 수지상 세포, 조혈 줄기세포 또는 iPSC는 기능적 TCR, 기능적 HLA, β2 마크로글로불린, TAPI, TAP2, 타파신, NLRC5, CIITA, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, TCRα 또는 β 불변 영역, NKG2A, NKG2D, CD38, CD5, CD52, CD33, CD123, CLL-1, CIS, CBL-B, SOCS2, PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, 또는 염색체 6p21 영역 내의 임의의 유전자에서 발현이 부족하거나 낮은 발현을 하고; 및/또는 HLA-E, 41BBL, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, FcRγ, DAP10, DAP12, CD4, CD8, CD16, CD47, CD94, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, Fc 수용체, 인게이저, 또는 이중- 또는 다중특이성 또는 보편적인 결합제와 결합하기 위한 표면 유발 수용체 중 적어도 하나에서 도입되거나 증가된 발현이 있다.
  150. 표적 항원을 제시하는 표적 세포를 사멸시키는 방법에서, 상기 표적세포를 제127항의 이펙터 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 SAR은 상기 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
  151. 제150항의 방법에 있어서, SAR-발현 이펙터 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원 및 표적 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원에 결합하는 하나 이상의 작용제와 표적 세포를 접촉시키는 것을 더 포함한다.
  152. 제151항의 방법에 있어서, 상기 작용제가 SAR-발현 이펙터 세포를 상기 작용제에 의해 표적화된 항원을 발현하는 표적 세포로 리디렉션할 수 있다.
  153. 제151항의 방법에 있어서, 상기 작용제가 항체, 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE) 또는 이의 조합이다.
  154. 제151항의 방법에 있어서, 상기 이펙터 세포는 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인을 포함하는 SAR을 발현한다.
  155. 제154항의 방법에 있어서, 상기 SAR은 CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1 및 CD161으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인을 포함한다.
  156. 제151항에의 방법에 있어서, 상기 작용제는 상기 SAR을 포함하는 상기 자연 발생 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편에 특징적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TriKE) 이다.
  157. 제151항 또는 제156항의 방법에 있어서, 상기 작용제는
    a) SAR을 포함하는 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인 또는 이의 변이체 또는 단편; 및/또는
    b) SAR의 일부가 아닌 하나 이상의 자연 발생 수용체의 상기 세포외 도메인
    에 결합한다.
  158. 제151항 또는 제157항의 방법에 있어서, 상기 작용제는 하나 이상의 자연 발생 공동자극 수용체의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
  159. 제151항 또는 제157항의 방법에 있어서, 상기 작용제는 하나 이상의 자연 발생 활성화 수용체의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
  160. 제151항 또는 제157항의 방법에 있어서, 상기 작용제는 공동자극 도메인을 포함하는 SAR의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
  161. 제151항 또는 제157항의 방법에 있어서, 상기 작용제는 활성화 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 SAR의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
  162. 제154항 또는 제155항의 방법에 있어서, 상기 SAR이 Fc 수용체의 상기 세포외 도메인을 발현하고, 상기 작용제는 Fc 도메인을 포함하는 항체, 항체, 항원 결합 도메인, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인 단편, 자율 항원 결합 도메인, 이중특이성 인게이저, 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 킬러 인게이저(BiKE), 삼중특이성 인게이저, 삼중특이성 T 세포 인게이저, 또는 삼중특이성 킬러 인게이저(TRiKE)이다.
  163. 제162항의 방법에 있어서, 상기 Fc 수용체는 CD16A, CD16B, CD64, CD32 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상이다.
  164. 제151항의 방법에 있어서, 상기 표적 항원이 표 B에 열거된 항원 중 하나 이상이다.
  165. 제148항 또는 제149항의 방법에 있어서, 상기 대상체는 면역 세포의 생존, 증식, 분화 및/또는 효능을 조절하는 작용제와 조합된 합성 항원 수용체 (SAR) 분자를 포함하는 제123-146 항 중 하나의 면역 이펙터 세포의 유효량을 투여받고, 여기서 작용제는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다:
    a) 단백질 포스파타제 억제제;
    b) 키나제 억제제;
    c) Lck 키나제 억제제;
    d) SAR-발현 이펙터 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원 및 표적 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원에 결합하는 작용제;
    e) 사이토카인;
    f) 면역 억제 분자의 억제제;
    g) TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 작용제;
    h) SAR-변형된 세포의 증식 및/또는 지속성을 증가시키는 작용제;
    i) 케모카인;
    j) SAR의 발현을 증가시키는 작용제;
    k) SAR의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작용제;
    l) SAR-변형된 세포의 생존 및/또는 지속성을 제어할 수 있는 작용제;
    m) SAR-변형된 세포의 부작용을 조절하는 작용제;
    n) Brd4 억제제;
    o) 질환의 부위에 치료제 또는 예방제를 전달하는 작용제;
    p) SAR이 지시되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 작용제;
    q) 상기 SAR과 공동 발현된 다목적 스위치에 결합하는 작용제; 및
    r) 아데노신 A2a 수용체 길항제.
  166. 제1항의 SAR 폴리펩티드 분자, 제118항의 폴리뉴클레오티드, 제119항의 벡터, 제127-146항 중 어느 한 항의 세포, 및/또는 제151항 및 제165항의 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  167. 제166항의 약학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 표적 항원 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  168. 제167항의 상기 방법에 있어서, 상기 표적 항원 관련 질환은 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 면역질환, 알레르기성 질환, 퇴행성 질환, 감염성 질환 및 비-암 관련 적응증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  169. 제168항의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 원발성 삼출 림프종(PEL), 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 백혈병 전단계의 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암이다.
  170. 제168항의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 암은 결장암, 직장암, 신장세포암종, 간암, 폐의 비소세포암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암이고, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형암, 방광암, 신장암, 요관암, 신장 골반암, 중추신경계(CNS) 신생물, 원발성 중추신경계 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피양암, 편평세포암, T세포 림프종, 환경유발암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
  171. 제168항의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 질환이 코로나바이러스, SARS-CoV2 및 변이체, HIV1, HIV2, HTLV1엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로 바이러스 (CMV), 아데노 바이러스, 아데노관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 독감 바이러스, 메르스 및 사르스 코로나 바이러스, 크리미안 콩고 출혈 열 바이러스, 라이노 바이러스, 엔테로 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 라이노 바이러스, 수두 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1 및 2, 수두 및 포진 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 밸리 열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스로 구성된 바이러스에 의한 감염, 또는 결핵균, 비전형 결핵균 종, 폐종균, 톡소플라즈마증, 리케치아, 노카르디아, 아스페르질루스, 뮤코르 또는 칸디다와 감염과 관련이 있다.
  172. 제168항의 상기 사용 또는 방법에 있어서, 상기 질환은 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 강직성 척추염, 호시모토 갑상선염, SLE, 사르코이드증, 경피증, 혼합성 결합 조직 질환, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 또는 퇴행성 질환이다.
  173. 제93항의 다목적스위치 및 SAR을 암호화하는 벡터의 형질 도입 효율을 조사하기 위한 방법에 있어서, 상기 벡터로 형질 주입 또는 형질 도입되는 세포의 표면상에서 상기 다목적 스위치의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
  174. 제95항의 SAR을 발현하는 세포를 선택하는 방법에 있어서, 다음의 단계를 포함한다:
    i) 제140항에 따라 벡터로 형질 주입 또는 형질 도입된 세포의 표면 상의 상기 다용도 스위치의 발현을 검출하는 단계; 및
    ii) 상기 다목적 스위치를 발현하는 것으로 식별되는 세포를 선택하는 단계.
  175. SAR을 발현하는 세포에 대해 농축된 세포의 정제된 집단을 준비하는 방법으로서, 제174항에 따른 방법을 사용하여 세포 집단으로부터 SAR을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
  176. 제175항의 방법에 있어서, 다음의 단계들을 포함한다:
    i) 환자로부터 외부에서 분리된 세포의 집단을 제140항에 따라 벡터로 형질 도입 또는 형질 주입하는 단계; 및
    ii) 제174항에 따른 방법에 의해 형질 도입/형질 감염된 세포 집단으로부터 상기SAR을 발현하는 세포를 선택하는 단계.
  177. 세포집단으로서, 이는 제94-117항의 다목적 스위치 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 농축되고, 따라서 SAR을 발현하는 세포에 대해 농축된다.
  178. 생체 내에서 형질 도입된 세포를 추적하는 방법으로서, 세포 표면에서 제173항 어느 하나에 따른 다용도 스위치 폴리펩티드의 발현을 검출하는 단계를 포함한다.
  179. 제127항의 세포를 삭제하는 방법으로서, 상기 세포를 상기 다목적 스위치를 포함하는 부속 모듈에 결합하는 제제에 노출시키는 단계를 포함하는 세포를 삭제하는 방법.
  180. 제179항의 방법에 있어서,
    a) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7843-7850을 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 벨란타맙 마포도틴이고;
    b) 상기 다목적 스위치는 서열번호9620-9624을 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 리툭시맙 또는 CD20 항체이고;
    c) 상기 다용도 스위치는 서열번호 9625를 갖는 서열 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 허셉틴, 엔허투 또는 Her2 표적 항체이고; 및
    d) 상기 다목적 스위치는 서열번호 7850 또는 이에 대해 80% 상동성을 갖는 변이체를 포함하고, 상기 작용제는 아드세트리스 또는 CD30 표적 항체이다.
  181. 적어도 하나의 제1항의 SAR 폴리펩티드 분자, 제93항의 부속 모듈, 제94항의 다목적 스위치, 제118항의 재조합 폴리뉴클레오티드, 제119항의 재조합 발현 시스템, 제123항의 벡터 또는 제127항의 세포, 제151항 및/또는 제165항의 작용제 및 제166항의 조성물을 포함하는 키트.
  182. 제140항의 방법에 있어서, a) 생체 외; b) 생체 내; 또는 c) 생체 외 및 생체 내에서 수행된다.
  183. 제1항의 SAR에 있어서, 적어도2개 이상의 사슬을 포함하고,
    a) 제1 폴리펩티드 사슬은 Vα 또는 Vγ 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고; 및
    b) 제2 폴리펩티드 사슬은 Vβ 또는 Vδ 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 및 제2 막 관련 모듈(MAM)을 포함하고;
    상기 제1 항원 결합 도메인의 상기 Vα 또는 Vγ 도메인과 상기 제2 항원 결합 도메인의 상기 상보적 Vβ 또는 Vδ 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 유사 항원 결합 모듈을 형성하는 단계; 그리고
    상기 제1 MAM 및 상기 제2 MAM은 적어도 하나의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있는 비-T 세포 수용체 모듈(NTCRM)을 형성한다.
  184. 제183항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 항원 결합 도메인과 상기 제1 MAM 사이에 제1 펩티드 링커를 더 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 항원 결합 도메인과 상기 제2 MAM 사이에 제2 펩티드 링커를 더 포함한다.
  185. 제184항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩티드 링커는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서브 유닛으로부터의 불변 도메인 또는 이의 단편을 개별적으로 포함한다.
  186. 제183항의 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 제1 MAM을 포함하는 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 제1 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 제2 세포질 도메인 C-말단을 추가로 포함한다.
  187. 제183항의 상기 SAR에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 상기 제1 MAM의 상기 제1 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제1 부속 세포내 도메인을 추가로 포함하고; 및/또는 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 상기 제2 MAM을 포함하는 상기 제2 막관통/막고정 도메인에 대한 공동자극 도메인 서열 C-말단을 포함하는 제2 부속 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
  188. 제187항의 SAR에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX40, 2B4, CD27, CD81, CD2, CD5, BAFF-R, CD30, CD40, HVEM 또는 ICOS, 또는 이의 변이체 또는 단편으로부터 선택된다.
  189. 제183항의 SAR에 있어서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 MAM 및 상기 NTCRM은 비-T 세포 수용체의 및/또는 신호전달 어댑터의 상기 막관통/막고정 도메인, 선택적 세포질 도메인, 선택적 힌지 도메인 및/또는 선택적 세포외 도메인으로 구성된다.
  190. 제189항의 SAR에 있어서,
    a) 상기 비T 세포 수용체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD16A, CD16B, CD64, CD32, NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL4, KIR2DL4, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DS1, NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKG2E, NKG2F, DNAM-1, 2B4, OX40, CD28, 4-1BB, CD27, CD81, CD2, CD5, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, CRTAM, TIGIT, CD96, SLAMF6, SLAMF7, CD100, CD160, CEACAM, ILT2, KLRG1, LAIR1, CD161, 전술한 이들 중 어느 하나의 변이체 및 이의 단편; 및/또는
    b) 상기 신호전달 어댑터는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CD3ζ, FcRγ, DAP10, 전술한 이들 중 어느 하나의 변이체 및 이의 단편.
  191. 제183항의 SAR에 있어서, 이는 비-T 세포에서 발현될 때, T 세포 수용체 유사 표적 결합 인식 및/또는 적어도 하나의 신호전달 어댑터의 모집 및/또는 적어도 하나의 신호전달 경로의 활성화를 부여한다.
  192. 제167항의 방법에 있어서, 상기 대상체에게
    a) SAR 발현 이펙터 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여로 인한 독성을 예방 또는 역전시키기 위해; 및/또는
    b) SAR 발현 이펙터 세포의 고갈을 방지하거나 역전시키기 위해
    치료 유효량의 티로신 키나제 억제제를 추가로 투여된다.
  193. 제192항의 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 Lck 억제제이다.
  194. 제192항의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 다사티닙 또는 포나티닙이다.
  195. 제192항의 상기 방법에 있어서, 치료는 상기 대상체에서 T 세포에 의한 IL-2의 분비를 증가시킨다.
  196. 제192항의 상기 방법에 있어서, 치료는 상기 대상체에서 T 세포의 아폽토시스를 감소시킨다.
  197. 제192항의 상기 방법에 있어서, 치료는 PD-1, TIM-3, 및 LAG-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 T 세포 고갈 마커의 발현을 감소시킨다.
  198. 제192항의 상기 방법에 있어서, 치료는 CD62L 또는 CCR7의 발현을 증가시킨다.
  199. 제192항의 상기 방법에 있어서, 다중 주기의 치료가 상기 대상체에게 투여된다.
  200. 제192항의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 간헐적으로 투여된다.
  201. 제192항의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 적어도 부분적인 T 세포 기능을 회복시키기에 충분한 기간 동안 투여된 후 중단된다.
  202. 제192항의 상기 방법에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제가 경구로 투여된다.
  203. 제192항의 상기 방법에 있어서, 대상체에게 투여된 유전자 조작 T 세포와 관련된 상기 독성은 사이토카인 방출 증후군이다.
  204. 제192항의 상기 방법에 있어서, 대상체에게 투여된 유전자 조작 T 세포와 관련된 상기 독성은 온-타겟 오프 종양 독성 또는 오프-타겟 오프-종양 독성이다.
  205. 제192항의 상기 방법에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
  206. T 세포의 표적 인식 특성 및 기능을 갖는 T 세포가 아닌 세포로서, 상기 세포는
    a) TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 또는 preTCR의 그룹으로부터 선택된 하나 또는 모든 TCR 불변 사슬 또는 이의 단편의 발현이 결여되고; 및/또는
    b) CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CD3 사슬의 발현이 결여되고; 및/또는
    c) 기능적 TCR 모듈(TCRM)을 형성하는 능력이 부족하다.
  207. 제206항의 세포에 있어서, 이는 TCRM을 포함하는 이중사슬 수용체를 발현하고 T 세포의 세포 표적 인식 특성을 부여한다.
  208. 제207항의 세포에 있어서, 이는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 TCR-Fv 항원 결합 모듈을 형성할 수 있는 수용체를 세포 표면 상에서 발현할 수 있다.
  209. 제208항의 수용체에 있어서, 여기서 상기 TCR-Fv를 포함하는 상기 2개의 가변 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬의 일부가 아니다.
  210. 제206항의 세포에 있어서, 여기서 상기 TCR-Fv를 포함하는 상기 2개의 가변 도메인은
    a) Vα 및 Vβ, 또는
    b) Vγ 및 Vδ,
    이다.
  211. 표적 항원을 나타내는 표적 세포를 사멸하는 방법은 상기 표적 세포를 제206항의 상기 이펙터 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 세포는 상기 표적 항원을 특이적으로 인식한다.
  212. 제210항의 세포에 있어서, 이는 이의 표적 펩티드 항원을 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.
  213. 제206항의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  214. 제206항의 세포 또는 제213항의 약학적 조성물을 유효량으로 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 표적 항원 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  215. T 세포 수용체 유사 항원을 갖는 제206항의 비T 세포를 제조하는 방법.
  216. 제215항의 방법에 있어서, TCR 유사 항원을 갖는 비-T 세포는
    a) TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα 사슬, 또는
    b) TCRα 및 TCRβ 사슬의 이량체, 또는
    c) TCRγ 및 TCRδ 사슬의 이량체, 또는
    d) preTCRα 및 TCRβ 사슬의 이량체.
    를 발현하지 않는다.
  217. 제215항의 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) TCR 사슬의 외인성 발현, 또는
    b) CD3ε, CD3γ 및 CD3δ의 그룹으로부터 선택된 CD3 사슬의 외인성 발현.
    을 수반하지 않는다.
  218. 제215항의 방법에 있어서, 상기 방법은 단일 유전자 변형을 수반한다.
  219. 제215항의 방법에 있어서, 상기 방법은 이중사슬 수용체를 암호화하는 1 또는 2개의 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 수반한다.
  220. 제210항의 세포에 있어서, 이는 NK 세포, iNKT(선천적 자연 살해 세포), g-NK 세포, 기억 유사 NK 세포, 사이토카인 유도 킬러 세포(CIK), iPSC, 변형된 HLA 결핍 iPSC, iPSC 유래 NK 세포, B 세포, 대식세포/단핵구, 과립구, 수지상 세포, 불멸화 세포주, 불멸화 NK 세포주, NK92 세포주, NK92MI 세포주, YTS 세포주, NKG 세포주 또는 이의 유도체이다.
  221. 유형 II 막관통 단백질과 유형 I 막관통 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질 사이의 단리된 융합 단백질.
  222. 제221항의 단리된 융합 단백질에 있어서, 유형II 단백질의 상기 세포질, 막관통 및 부분적인 또는 전체 세포외 도메인이 유형I 막관통 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질의 상기 세포외 도메인에 융합하는 것을 포함한다.
  223. 제221항의 단리된 융합 단백질에 있어서, 여기서 상기 유형 I 막 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질의 상기 전체 또는 부분적인 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드의 상기 N-말단은 N-말단에서 C-말단 배향에 있는 II형 단백질의 상기 C-말단에 조작적으로 연결된다.
  224. 제221항의 융합 단백질을 만드는 방법에 있어서,
    a) 상기 유형 I 막 단백질 또는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 분비된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 유형 II 단백질의 상기 부분 또는 전체 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클리오티드의 3' 말단에 프레임에 융합시키는 단계; 및
    b) 상기 융합 단백질의 발현을 허용하도록 적합한 세포에 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계
    를 포함한다.
  225. 제221항의 융합 단백질을 만드는 방법에 있어서, 여기서 상기 융합 단백질은 특정 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 또는 합성 항원 수용체를 암호화한다.
  226. 제224항에 의해 제조된 세포, 제221항의 융합 단백질을 발현하는 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  227. 제226항의 조성물을 이용한 치료 방법.
  228. 서열번호 1600-2328, 4851-5129, 5451-6282, 7160-7170, 7601-7747, 8768-9602로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열 또는 상기 중 어느 하나에 제시된 합성 면역 수용체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 합성면역 수용체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드
  229. 서열번호 3994-4722, 5151-5429, 6283-7114, 7852-7862, 8293-8439, 9860-10694, 10832-10841, 12304-12311로 이루어진 그룹 또는 상기 중 어느 하나에 기재된 합성 면역 수용체를 암호화하는 아미노산 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 아미노산 서열
  230. 아미노 (N)부터 카르복시 (C) 말단까지의 다음과 같은 화학식 두 개 이상의 연사슬을 포함하는 비천연 단백질 (즉, 합성 단백질)을 생성하는 방법
    사슬1: SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
    사슬 2: SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
    상기 SP1 및 SP2는 성숙한 폴리펩티드 사슬로부터 절단되는 선택적인 신호 펩티드이고; A1 및 A2는 서로 상호작용할 수 있는 2개의 단백질 도메인이고, L1 및 L2는 선택적 링커이고, H1 및 H2는 선택적인 힌지 또는 스페이서 도메인이고, M1 및 M2는 막-고정 또는 막관통 도메인이고, C1 및 C2는 선택적인 세포질 도메인이다.
  231. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 A1 및 A2 도메인은 항체로부터 유래되지 않고, 항체 단편이 아니다.
  232. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 A1 및 A2 도메인은 M1 및 M2 도메인과 이종성이다.
  233. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 A1 및 A2 도메인은 자율 도메인이 아니다.
  234. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 A1 및 A2 도메인은 비관련 단백질에 대한 친화도보다 큰 서로에 대한 친화도를 갖는다.
  235. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 A1 및 A2 도메인이 서로 회합하여 항원 결합 도메인을 생성할 수 있다.
  236. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 L1 및 L2 링커는 a) 긴 링커; b) Ig 유사 링커; 또는 c) 면역글로불린으로부터 유래된 링커; d) TCR 불변 사슬로부터 유래된 링커.이다.
  237. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 L1 및 L2 링커는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 접합된다.
  238. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 M1 및 M2 도메인은 막관통 도메인이다.
  239. 제238항의 방법에 있어서, 여기서 상기 M1 및 M2 도메인은 a) 동일한 단백질; b) 상이한 단백질로부터 유래되고; 또는 c) 서열이 동일하거나 70% 이상의 아미노산 서열 상동성을 보유한다.
  240. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 M1 및 M2 도메인은 서로 회합한다.
  241. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 M1 및 M2 도메인은 디설파이드 결합에 의해 접합된다.
  242. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 M1 및/또는 M2 도메인은 하나 이상의 신호전달 어댑터를 모집할 수 있다.
  243. 제242항의 방법에 있어서, 여기서 C1 및 C2 도메인이 적어도 하나의 신호 어댑터를 모집할 수 있고 및/또는 적어도 하나의 신호전달 경로를 개시할 수 있다.
  244. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 두 사슬은 세포 표면 상에 발현된다.
  245. 제230항의 방법에 있어서, 여기서 상기 A1-L1-H1 및 A2-L2-H2 세그먼트는 세포외 측에 위치한다.
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