KR20130054384A

KR20130054384A - 네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제

Info

Publication number: KR20130054384A
Application number: KR1020137007288A
Authority: KR
Inventors: 락쉬미 칸드케; 라사파 아루무감; 보운톤 로운
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2013-05-24
Also published as: EP4417216A1; MX350142B; RU2013105726A; JP5945538B2; US9556240B2; CN107961367A; CN107913396B; CA2808975A1; PL3831406T3; SI3246044T1; FI3831406T3; PL3246044T5; WO2012025873A3; PT2608805T; HUE034544T2; JP2013540705A; EP3831406A1; AU2016201346A1; SI3831406T1; BR112013004236A2

Abstract

본 발명은 면역원성 조성물 중의 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) rLP2086 서브패밀리 B 항원의 안정한 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 네이세리아 메닌기티디스 rLP2086 항원의 입체형태를 보존하는 방법 및 네이세리아 메닌기티디스 rLP2086 항원의 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제{STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS}

본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 중의 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) rLP2086 서브패밀리 B 항원의 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 네이세리아 메닌기티디스 rLP2086 항원의 입체형태를 보존하는 방법 및 네이세리아 메닌기티디스 rLP2086 항원의 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다.

rLP2086은 다수의 네이세리아 메닌기티디스 균주에 대한 교차 반응성 박테리아 항체를 유도하는 재조합 28 kDa 지단백질이다. 추론된 아미노산 서열 상동성에 기초하여, rLP2086의 상이한 두 서브패밀리, A 및 B가 확인되었다. 이들 두 서브패밀리는 다양한 수준의 폴리소르베이트 80 (PS-80)과 함께 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 150 mM NaCl, 및 0.5 mg/mL 알루미늄 중 각각 20, 60, 120, 및 200 ㎍/mL씩으로 함유하는 MnB-rLP2086 백신 샘플 제제 중에 사용되었다. 트윈 80(TWEEN 80)으로도 알려져 있는 폴리소르베이트 80은 소르비톨로부터 유도된 비-이온성 계면활성제 및 유화제이며, 이는 빈번하게는 유화제, 가용화제 및 안정화제로서 제약 제제 중에 사용된다. MnB rLP2086 면역원성 조성물 중의 폴리소르베이트 80의 존재는 제제화, 공정, 여과, 충전, 및 운송 동안의 응집을 막아주고, 필터 막 흡착을 감소시켜 주며, 배관 흡착을 감소시켜 주는 것으로 여겨진다.

발명의 개요

일부 실시양태에서, 본 발명은 LP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능이 약 1-12개월 이상, 약 6-18개월 이상, 약 12-24개월 이상, 약 24-36개월 이상, 또는 약 36-48개월 이상 동안 유지되는 것인, 안정한 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 LP2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 디터전트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5:1 내지 약 10:1; 약 1:1 내지 약 5:1; 또는 약 1.4:1 내지 4.2:1이다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 2.8:1이다. 일부 실시양태에서, 디터전트의 양은 용기, 예컨대, 시린지 또는 바이알 중 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양이 된다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트, 예컨대, 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 다가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 양이온은 칼슘 또는 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 인산칼슘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 알루미늄, 예컨대, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 또는 알룸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알루미늄의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄의 농도는 약 0.5 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 히스티딘을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 10 mM (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 숙시네이트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 7 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 5 mM (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 동결건조된다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 알루미늄을 포함하는 완충제 중에 재현탁된다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 또는 알룸으로서 존재한다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL rLP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL rLP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약 0.5:1 내지 10:1; 약 1:1 내지 약 5:1; 또는 약 1.4:1 내지 약 4.2:1의 몰비로 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제 중에서 LP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 보관함으로써 면역원성 조성물 중 LP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능을 안정화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 2.8:1이다. 일부 실시양태에서, 디터전트의 양은 용기, 예컨대, 시린지 또는 바이알 중 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양이 된다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트, 예컨대, 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 다가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 양이온은 칼슘 또는 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 인산칼슘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 알루미늄, 예컨대, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 또는 알룸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알루미늄의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄의 농도는 약 0.5 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 히스티딘을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 10 mM (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 숙시네이트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 7 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 10 mM (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 완충제는 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 알루미늄, 및 약 0.5:1 내지 10:1의 몰비로 디터전트 대 단백질을 포함하는, 완충제 중 LP2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및 LP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 보관함으로써 면역원성 조성물 중 LP2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및 LP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능을 안정화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1:1 내지 약 5:1; 또는 약 1.4:1 내지 약 4.2:1이다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 2.8:1이다. 일부 실시양태에서, 디터전트의 양은 용기, 예컨대, 시린지 또는 바이알 중 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양이 된다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트, 예컨대, 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 알루미늄은 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 또는 알룸으로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 알루미늄의 농도는 약 0.5 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 히스티딘을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 pH 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 10 mM (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 완충제는 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 각 서브패밀리 단백질 상의 입체형태적 에피토프를 인식하는 제1 및 제2 기능적 모노클로날 항체를 면역원성 조성물에 결합시키는 단계; 및 (b) rLP2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및/또는 rLP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드에 결합한 항체를 정량화하는 단계를 포함하는, rLP2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및/또는 rLP2086 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 정량화는 전기화학발광에 의해 수행한다. 일부 실시양태에서, 상기 두 항체에 의해 인식되는 에피토프를 나타내는 폴리펩티드를 정량화한다. 일부 실시양태에서, 제1 항체를 표지, 예컨대, 비오틴에 접합시킨다. 일부 실시양태에서, 접합된 표지, 예컨대, 스트렙타비딘 비드 또는 스트렙타비딘 칼럼에 결합하는 화합물에 의해 제1 항체를 단리시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 항체를 정량적 표지에 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 효능을 참조 물질의 효능과 비교한다.

도 1: 다양한 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 제제 중의 서브패밀리 B의 안정성.
도 2: 다양한 농도의 폴리소르베이트 80에 의한 서브패밀리 B의 가속화된 안정성.
도 3: 28일 동안의 200 ㎍/mL의 서브패밀리 B의 효능.
도 4: 28일 동안의 20 ㎍/mL의 서브패밀리 B의 효능.
도 5: 상이한 몰비에서의 200 ㎍/mL에 대한 효능 결과.
도 6: 상이한 몰비에서의 20 ㎍/mL에 대한 효능 결과.
도 7: pH 6.5에서의 단백질의 인산알루미늄에의 결합.
도 8: pH의 함수로서의 MnB rLP2086 서브패밀리 A 및 B의 결합.
도 9: pH, 완충제 및 단백질 농도가 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 결합에 미치는 효과.
도 10: 인산알루미늄을 포함하지 않는 rLP2086 제제의 시각적 외관.
도 11: 2-8℃에서의, 출현 샘플의 OD 측정.
도 12: AlPO₄를 포함하는 제제 및 포함하지 않는 제제에 대한 서브패밀리 A의 효능 결과.
도 13: AlPO₄를 포함하는 제제 및 포함하지 않는 제제에 대한 서브패밀리 B의 효능 결과.
도 14: 0.5 mg/mL 알루미늄을 포함하는 rLP2086 위약에서의 폴리소르베이트 80 결과.
도 15: 서브패밀리 A에 대한 폴리소르베이트 80의 결과.
도 16: 서브패밀리 B에 대한 폴리소르베이트 80의 결과.
도 17: 서브패밀리 B에 대한 효능과 결합 몰비의 상관 관계.
도 18: 서브패밀리 A에 대한 몰비 결과.
도 19: 서브패밀리 B에 대한 몰비 결과.
도 20: 농도 400 ㎍/mL의 rLP2086 제제에 대한 몰비 결과.
도 21: 상이한 시점에서의 rLP2086 약물 생성물에 대한 폴리소르베이트 80의 결과.
도 22: 상이한 시점에서의 rLP2086 약물 생성물에 대한 결합 몰비 결과.
도 23: 서브패밀리 A에 대한 효능 및 결합 몰비 결과.
도 24: 서브패밀리 B에 대한 효능 및 결합 몰비 결과.
도 25: 숙시네이트 및 히스티딘 완충제 중에서의 서브패밀리 A와 AlPO₄의 결합.
도 26: 숙시네이트 및 히스티딘 완충제 중에서의 서브패밀리 B와 AlPO₄의 결합.
도 27: 숙시네이트, 히스티딘, 및 포스페이트 완충제 중에서의 결합의 비교.
도 28: 서브패밀리 A와 AlPO₄의 pH 의존성 결합.
도 29: 서브패밀리 B와 AlPO₄의 pH 의존성 결합.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 숙련자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명을 실시하거나 시험하는 데 사용될 수는 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기술되는 것과 같다. 물질, 방법 및 일례는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 다른 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)" 또는 파생어, 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"이라는 용어는 언급된 정수 또는 정수로 이루어진 군을 포함하는 것을 암시하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수로 이루어진 군을 제외한다는 것을 암시하는 것은 아님을 이해할 것이다.

정의

본원에 사용되는 바, 단수 형태인 "하나"("a," "an") 및 "상기"("the")라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대, "상기 방법"이라고 언급한 것은 본원에 기술된 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함하고/거나, 본 개시내용 등의 판독시 당업자에게는 자명해질 것이다.

본원에 사용되는 바, 복수 형태는 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 단수 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대, "상기 방법들"이라고 언급한 것은 본원에 기술된 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함하고/거나, 본 개시내용 등의 판독시 당업자에게는 자명해질 것이다.

본원에 사용되는 바, "약"이란 예컨대, 언급된 농도 범위, 시간 프레임, 분자량, 온도, pH와 같은 값이 통계적으로 유의적인 범위 내에 포함되어 있음을 의미한다. 그러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 10자리 수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 및 더욱더 전형적으로 5% 이내에 속할 수 있다. "약"이라는 용어에 의해 포괄되는 허용가능한 차이는 연구 중인 특정 시스템에 따라 좌우되며, 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다. 본 출원에서 범위가 언급될 때에는 언제든, 상기 범위내 포함된 모든 범자연수 또한 본 발명의 실시양태로서 주시된다.

"아주반트"라는 용어는 본원에 추가로 기술되어 있고 예시되어 있는 바와 같은, 면역 반응을 증진시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 본 발명의 백신 중에 사용될 수 있는 아주반트의 비제한적인 예로 RIBI 아주반트 시스템 (리비 인크.(Ribi Inc.: 미국 몬타나주 해밀턴)), 알룸, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트(Freund's) 완전 및 불완전 아주반트, 블록 공중합체 (CytRx: 미국 조지아주 애틀랜타), QS-21 (케임브리지 바이오테크 인크.(Cambridge Biotech Inc.: 미국 매사추세츠주 케임브리지)), SAF-M (키론(Chiron: 미국 캘리포니아주 에머리빌)), 암피겐(AMPHIGEN)® 아주반트, 사포닌, 퀼(Quil) A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 아브리딘 지질-아민 아주반트를 포함한다.

"알루미늄의 단백질에의 결합"이라는 용어는 알루미늄에 결합된, 조성물 중의 단백질 분자의 백분율을 의미한다. 알루미늄의 단백질에의 결합은 본원에 개시되어 있거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에 사용되는 바, "면역원성 유효량"이라는 용어는 척추동물 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 rLP2086 단백질의 면역원성 유효량은 척추동물 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 양이다. 특정의 "면역원성 유효 투여량 또는 유효량"은 숙주의 연령, 체중, 및 의학적 상태 뿐만 아니라, 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 적합한 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

본원에 사용되는 바, "몰비"라는 용어는 조성물 중 상이한 두 요소의 몰수의 비를 의미한다. 일부 실시양태에서, 몰비는 디터전트의 몰수 대 단백질의 몰수인 비이다. 일부 실시양태에서, 몰비는 폴리소르베이트 80의 몰수 대 단백질의 몰수인 비이다. 단백질 및 폴리소르베이트 80 농도에 기초하여, 몰비는 하기 식을 사용함으로써 계산된다:

예를 들어, 0.01% 폴리소르베이트 80 및 200 ㎍을 포함하는 조성물은 10.8:1 [(0.01/0.2) x 216]의 디터전트 대 단백질의 몰비를 가진다. 3몰의 폴리소르베이트 80 대 2몰의 단백질의 비는 PS80 대 단백질 = 3:2의 몰비로서 표현될 수 있다. 추가로, 몰비가 단일 수치로 언급되었다면, 이는 상기 수치 대 1인 비를 의미하는 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트 80 대 단백질의 비가 0.5, 2, 및 10이라는 것은 각각 비가 0.5:1, 2:1 및 10:1이라는 것을 의미하는 것이다. 본원에 사용되는 바, "디터전트 대 단백질"의 몰비 및 "폴리소르베이트 80 대 단백질"의 몰비라는 용어는 일반적으로 디터전트 (또는 폴리소르베이트 80) 대 단백질 항원, 특히, P2086 항원의 몰비를 의미하는 것이다. 본원에 개시된 교시에 기초하여, 당업자는 다른 디터전트에 대한 몰비 및 다른 디터전트를 포함하는 제제에 대한 최적의 몰비를 계산하는 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본원에 사용되는 바, "낮은" 몰비란 일반적으로 "높은" 몰비보다 작은, 면역원성 조성물 중의 디터전트 대 단백질 항원의 몰비를 의미하는 것이다. "높은" 몰비란 일반적으로 "낮은" 몰비보다 큰, 면역원성 조성물 중의 디터전트 대 단백질 항원의 몰비를 의미하는 것이다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의의 "높은 몰비"란 몰비가 10:1 초과인 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 "낮은" 몰비란 몰비가 0.5:1 내지 10:1인 것을 의미한다.

본원에 사용되는 바, "ORF2086"이라는 용어는 네이세리아 종 박테리아로부터 유래된 오픈 리딩 프레임 2086을 의미한다. 네이세리아 ORF2086, 그로부터 코딩된 단백질, 상기 단백질의 단편, 및 상기 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 US 20060257413 및 US 20090202593 (이들 각각은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. "P2086"이라는 용어는 일반적으로 ORF2086에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. 본 발명의 P2086 단백질은 지질화되거나, 또는 비-지질화된 것일 수 있다. "LP2086" 및 "P2086"은 전형적으로 각각 지질화 및 비-지질화된 형태의 2086 단백질을 의미한다. 본 발명의 P2086 단백질은 재조합인 것일 수 있다. "rLP2086" 및 "rP2086"은 전형적으로 각각 지질화 및 비-지질화된 형태의 재조합 2086 단백질을 의미한다.

본원에 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 인간 또는 다른 척추동물 숙주에게로의 투여와 상용성인, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제, 및 항진균체, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 한다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체는 연방 정부, 주 정부의 규제 기관, 또는 다른 규제 기관에 의해 승인받은 것이거나, 인간 뿐만 아니라, 인간이 아닌 포유동물용으로서 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있는 것인 담체이다. "담체"라는 용어는 제약 조성물과 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 비히클을 의미한다. 상기 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대, 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 비롯한 오일일 수 있다. 물, 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 액체 담체로서, 특히 주사 용액용으로서 사용될 수 있다. 적합한 제약 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 소맥분, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 최소량의 습윤제, 벌크화제, 유화제, 또는 pH 완충화제도 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 액제, 현탁제, 에멀젼, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 제제는 투여 방식에 적합하여야 한다. 적절한 담체는 당업자에게 분명할 것이며, 대부분 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

"효능"이라는 용어는 면역원성 반응을 유발하는 항원의 능력을 의미한다. 일부 실시양태에서, 효능은 항체에 결합할 수 있는 에피토프 능력에 의해 측정된다. 효능은 항원 또는 에피토프 무결성의 상실, 또는 항원 또는 에피토프 입체형태의 변화에 기인하여 시간 경과에 따라 상실되거나, 감소될 수 있다. 효능은 광, 온도, 냉동/해동 주기, 교반, 및 pH를 포함하나, 이에 한정되지 않는 인자들에 기인하여 상실되거나, 감소될 수 있다. 효능은 본원에 개시된 방법에 의해, 및 당업계에 공지된 검정에 의해 측정될 수 있다. 그러한 효능 측정 검정으로는 동물 백신화 모델, 혈청 살박테리아 검정 (SBA), 유동 세포측정법, 및 시험관내 효능 검정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 효능 측정 방법은 SBA 및 시험관내 효능 검정이다. 더욱 바람직한 효능 측정 방법은 SBA이다. 일부 실시양태에서, 효능은 면역 반응에 관여하는 1종 이상의 에피토프에 대한 1종 이상의 모노클로날 항체를 사용함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험 샘플의 효능을 참조 표준의 효능과 비교한다. 일부 실시양태에서, 참조 표준은 T₀에서의 시험 샘플이다. 일부 실시양태에서, 참조 표준은 디터전트를 포함하지 않는 면역원성 조성물이다. 일부 실시양태에서, 참조 표준은 디터전트 대 단백질의 몰비가 10:1보다 높은 것인 면역원성 조성물이다.

"방어" 면역 반응이란, 대상체를 감염으로부터 방어하는 역할을 하는, 체액성 또는 세포 매개성인 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 능력을 의미한다. 제공되는 방어가 절대적일 필요는 없는데, 즉, 대상체의 대조군 집단, 예컨대, 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받지 않은 감염된 동물과 비교하였을 때, 통계학상 유의적으로 개선되었다면, 감염이 전체적으로 예방되거나 근절되어야 할 필요는 없다. 방어는 감염 증상의 중증도 또는 그 증상 발병의 급속도를 완화시키는 것으로 제한될 수 있다. 일반적으로, "방어 면역 반응"은 각 항원에 대한 측정가능한 기능적 항체 반응의 일부 수준을 비롯한, 대상체의 50% 이상에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 증가 유도를 포함할 것이다. 특정 상황하에서, "방어 면역 반응"은 각 항원에 대한 측정가능한 기능적 항체 반응의 일부 수준을 비롯한, 대상체의 50% 이상에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 2배 증가 또는 항체 수준의 4배 증가 유도를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 옵소닌화 항체는 방어 면역 반응과 관련이 있다. 따라서, 방어 면역 반응은 예를 들어, 하기 기술하는 것과 같은, 옵소닌 식세포작용 검정에서 박테리아 계수의 감소율(%)을 측정함으로써 검정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 부재하에서의 박테리아 계수와 비교하였을 때, 박테리아 계수는 적어도 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 감소한다.

"단백질," "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 의미하며, 생성물의 최소 길이에 대해 제한은 없다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 본 정의에 포함된다. 전장의 단백질 및 그의 단편, 이 둘 모두 본 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 바람직하게는 단백질이 단백질을 투여받은 동물 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 유지할 수 있도록, 천연 서열에의 변형, 예컨대, 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 자연 그대로는 보존적 치환이지만, 비-보존적 치환일 수도 있다)을 포함한다. 발현 후 변형, 예컨대, 당화, 아세틸화, 지질화, 인산화 등 또한 포함한다.

본원에 사용되는 바, "재조합"이라는 용어는 유전 공학 방법에 의해 제조된 임의의 단백질, 폴리펩티드, 또는 관심의 대상이 되는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드과 관련하여 사용되는 "재조합"이라는 용어는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 단백질은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 유전 공학 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 사용되는 바, "재조합"은 추가로 그의 기원에 의해 또는 조작에 의해서 자연 그대로는 그와 회합되어 있는 폴리뉴클레오티드 모두 또는 그의 일부와 회합되어 있지 않은 상태의 핵산 분자를 기술한다. 숙주 세포와 관련하여 사용되는 "재조합"이라는 용어는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 의미한다.

"안정한" 및 "안정성"이라는 용어는 일정 기간 동안 면역원성을 유지할 수 있는 항원의 능력을 의미한다. 안정성은 시간 경과에 따른 효능으로 측정될 수 있다. "안정한" 및 "안정성"이라는 용어는 추가로 면역원성 조성물의 물리적, 화학적, 및 입체형태적 안정성을 의미한다. 단백질 조성물의 불안정성은 단백질 분자의 화학적 분해 또는 단백질 분자의 응집을 통한 고차 중합체 형성에 의해, 이종이량체의 단량체로의 해리, 탈당화, 당화 변형, 또는 본 발명에 포함된 단백질 조성물의 1 이상의 생물학적 활성을 감소시키는 임의의 다른 구조적 변형에 의해 유발될 수 있다. 안정성은 샘플의 광 산란, 광의 겉보기 감쇠 (흡광도, 또는 광학 밀도), 크기 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피에 의한 것), 시험관내 또는 생체내 생물학적 활성 및/또는 시차 주사 열량법 (DSC)에 의한 특성을 비롯한, 당업계에 주지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 다른 안정성 평가 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 안정한 제제 중의 항원은 참조 표준과 비교하여 효능을 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월, 또는 60개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상으로 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 안정한 제제 중의 항원은 참조 표준과 비교하여 효능을 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 이상 동안 50% 이상으로 유지할 수 있다. "안정한" 및 "안정성"이라는 용어는 또한 일정 기간 동안 에피토프 또는 면역반응성을 유지할 수 있는 항원의 능력을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 안정한 제제 중의 항원은 참조 표준과 비교하여 그의 에피토프 또는 면역반응성을 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월, 또는 60개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상으로 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정성은 환경 조건과 관련하여 측정된다. 환경 조건의 비제한적인 예로 광, 온도, 냉동/해동 주기, 교반, 및 pH를 포함한다. 당업자는 본원에 개시된 방법 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 항원성 에피토프 또는 면역반응성의 존재를 측정할 수 있을 것이다. 예컨대, 문헌 [McNeil et al. Vaccine. 27: 3417-3421 (2009)]를 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원의 안정성은 그의 제조일부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 항원의 안정성은 그의 보관 조건 변경일부터 측정된다. 보관 조건 변경에 관한 비제한적인 예로 냉동에서 냉장으로부터의 변경, 냉동에서 실온으로부터 변경, 냉장에서 실온으로의 변경, 냉장에서 냉동으로의 변경, 실온에서 냉동으로의 변경, 실온에서 냉장으로의 변경, 명에서 암으로의 변경, 또는 교반 도입을 포함한다.

"안정화제"라는 용어는 일정 기간 동안 항원에 결합하여 항원의 에피토프 또는 면역반응성을 유지시켜 주는 화합물을 의미한다. 안정화제는 당업계에 공지되어 있다. 안정화제의 예로는 다가 양이온, 예를 들어, 칼슘 또는 알루미늄을 포함한다.

"대상체"라는 용어는 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 임의의 다른 동물을 의미한다. "대상체"라는 용어는 또한 인간을 포함한다. "대상체"라는 용어는 또한 가정용 애완 동물을 포함한다. 가정용 애완 동물의 비제한적인 예로 개, 고양이, 돼지, 토끼, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 기니아 피그, 페렛, 조류, 뱀, 도마뱀, 어류, 거북이, 및 개구리를 포함한다. "대상체"라는 용어는 가축 동물을 포함한다. 가축 동물의 비제한적인 예로 알파카, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 말, 라마, 노새, 당나귀, 양, 염소, 토끼, 순록, 야크, 닭, 거위, 및 칠면조를 포함한다.

"백신" 또는 "백신 조성물"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 1 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 제약 조성물을 의미한다.

일반 설명

rLP2086 서브패밀리 A 항원이 아닌, rLP2086 서브패밀리 B 항원은 2가 백신 제제 중에서 시간 경과에 따라 효능을 상실하고, 따라서 불안정하다는 신규한 발견으로부터 본 발명이 이루어졌다. 2가 제제 중의 성분들을 달리함으로써, 2가 백신 제제 중 디터전트 대 단백질의 몰비가 높으면 rLP2086 서브패밀리 B 항원 특이 불안정성이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 시간 경과에 따른 효능 유지 측정에 따르면, 2가 및 1가 제제 중 디터전트 대 단백질의 몰비를 감소시키자, rLP2086 서브패밀리 A 항원의 안정성에는 어떤 영향도 미치지 않으면서, rLP2086 서브패밀리 B 항원의 안정성은 증가하였다. 이러한 결과는 놀랍게도 지단백질이 전형적으로는 정제된 상태이고, 그의 소수성 지질 모이어티의 응집을 막기 위해 디터전트를 고농도로 사용하여 보관되기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 rLP2086 서브패밀리 B 항원 및 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제 중에서 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 보관하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 중에서 rLP2086 서브패밀리 B 항원의 안정성을 유지시키는 방법을 제공한다.

낮은 몰비의 제제로 인해 낮은 몰비의 면역원성 조성물 교반시에 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 항원이 응집되었다는 것이 추가 연구를 통해 밝혀졌다. 그러나, 낮은 몰비의 조성물 중에서 알루미늄의 농도를 증가시키자, rLP2086 서브패밀리 A 및 B 항원의 응집은 심지어 교반시에도 방지되었다. 또한, rLP0286 서브패밀리 A 항원은 알루미늄 부재하에서 낮은 몰비의 디터전트의 효과에 더 큰 감수성을 가지고 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 rLP2086 서브패밀리 A 항원, rLP2086 서브패밀리 B 항원, 고농도의 알루미늄 및 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 고농도의 알루미늄 및 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제 중에서 rLP2086 서브패밀리 A 항원 및 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 보관하는 단계를 포함하는 면역원성 조성물 중에서 rLP2086 서브패밀리 A 항원 및 rLP2086 서브패밀리 B 항원의 안정성을 유지시키는 방법을 제공한다.

면역원성 조성물

네이세리아 메닌기티디스 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 면역원성 조성물은 미국 특허 출원 공개 번호 US 20060257413 및 US 20090202593 (이들 출원은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 것을 포함한다. 본원에 기술된 상기와 같은 면역원성 조성물은 ORF2086 단백질로서 확인된, 살박테리아 활성을 보이는 단백질, 그의 면역원성 일부, 및/또는 그의 생물학적 등가물을 포함한다. ORF2086 단백질이란 네이세리아 종의 오픈 리딩 프레임 2086에 의해 코딩된 단백질을 의미한다.

단백질은 재조합 단백질이거나, 또는 천연 네이세리아 종으로부터의 단리된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 네이세리아 ORF2086 단백질은 박테리아 균주로부터 단리될 수 있으며, 예로는 네이세리아 메닌기티디스 (혈청군 A, B, C, D, W-135, X, Y, Z, 및 29E), 네이세리아 고노호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 및 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica) 균주를 비롯한 네이세리아 종의 것 뿐만 아니라, 상기 단백질의 면역원성 일부 및/또는 생물학적 등가물이 있다.

ORF2086 단백질은 2086 서브패밀리 A 단백질 및 서브패밀리 B 단백질, 그의 면역원성 일부, 및/또는 그의 생물학적 등가물을 포함한다. ORF2086 단백질 또는 그의 등가물은 지질화되거나, 또는 비-지질화된 것일 수 있다. 바람직하게, 네이세리아 ORF2086 단백질은 지질화된 것이다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질에 대하여 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 단리된 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질에 대하여 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질에 대하여 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B01 변이체이다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질에 대하여 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 단리된 단백질, 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질에 대하여 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 서브패밀리 A 단백질 대 서브패밀리 B 단백질의 비가 1:1인 것을 포함한다.

면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 등가물을 면역원성 조성물 중의 단일 활성 면역원으로서 포함한다. 별법으로, 면역원성 조성물은 다른 네이세리아 속 면역원성 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 다른 미생물 병원체 (예컨대, 제한없이, 바이러스, 프리온, 박테리아, 또는 진균)의 면역학상 활성인 단백질, 또는 캡슐 폴리사카라이드를 비롯한, 활성 면역원을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 선택된 적응증에 대해 원하는 바에 따라 하나 이상의 원하는 단백질, 단편 또는 제약 화합물을 포함한다.

임의의 다중-항원 또는 다가 면역원성 조성물이 본 발명에 의해 주시된다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 원하는 투여, 예컨대, 점막 전달에 적합한 형태로 2개 이상의 ORF2086 단백질의 조합, ORF2086 단백질과 하나 이상의 Por A 단백질의 조합, ORF2086 단백질과 메닌고코쿠스(meningococcus) 혈청군 A, C, Y 및 W-135 폴리사카라이드 및/또는 폴리사카라이드 접합체의 조합, ORF2086 단백질과, 메닌고코쿠스 및 뉴모코쿠스(pneumococcus) 조합의 조합, 또는 상기 중 임의 것의 조합을 포함할 수 있다. 당업자는 상기와 같은 다중-항원 또는 다가 면역 조성물을 쉽게 제제화할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 병원체에 대하여 유용한 임의의 조성물이 본 발명의 조성물과 함께 또는 그 안에서 조합될 수 있는 다중-면역화 요법을 고려한다. 예를 들어, 제한없이, 환자는 다중-면역화의 일부로서 본 발명의 면역원성 조성물 및 인간 유두종바이러스 바이러스 (HPV)에 대해 면역화시키기 위한 또 다른 면역 조성물, 예컨대, HPV 백신 가다실(GARDASIL)®을 투여받을 수 있다. 당업자는 다중-면역화 요법을 개발하고 시행하기 위한 목적으로 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 면역원성 조성물을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.

수개의 혈청형에 대하여 및/또는 수개의 질환에 대하여 면역원성 특성을 가진 조성물을 생성하기 위해 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드가 담체에 접합되어 있는 접합체 면역원성 조성물의 일부로서 ORF2086 폴리펩티드, 단편 및 등가물이 사용될 수 있다. 별법으로, ORF2086 폴리펩티드 중 하나가 다른 면역원성 폴리펩티드에 대한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역원성 조성물 제제는 당업자에게 주지되어 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 적합한 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제로는 임의의 및 모든 통상적 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅제, 항박테리아제 및 항균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 제약상 허용되는 담체로는 예를 들어, 물, 염수, 포스페이트 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라, 그의 조합 중 하나 이상을 포함한다.

제약상 허용되는 담체는 추가로 항체의 저장 수명 또는 효능을 증진시켜주는 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제를 최소량으로 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체의 제조법 및 용도는 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 면역원성 조성물 중에서의 그의 용도가 고려된다.

면역원성 조성물은 비경구적으로, 예컨대, 주사에 의해 피하로 또는 근육내로든, 뿐만 아니라, 경구적으로 또는 비내로 투여될 수 있다. 근육내 면역화 방법은 문헌 [Wolff et al. Biotechniques;11(4):474-85. (1991)] 및 [Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994)]에 기술되어 있다. 다른 투여 방식은 예를 들어, 제한없이, 경구용 제제, 폐용 제제, 좌제, 및 경피 적용을 포함한다. 경구용 제제는 예를 들어, 상기와 같이 일반적으로 사용되는 부형제, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 아주반트를 포함할 수 있다. 예시적인 아주반트로는 수산화알루미늄; 인산알루미늄; 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21 (애퀼라 바이오파마슈티칼즈, 인크.(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.: 미국 매사추세츠주 프레이밍햄)); MPL™ (3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, 코릭사(Corixa: 미국 몬타나주 해밀턴 코릭사)), 529 (아미노 알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물, 코릭사(미국 몬타나주 해밀턴)), IL-12 (제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute: 미국 매사추세츠주 케임브리지)); GM-CSF (이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.: 미국 워싱턴주 시애틀)); N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 이는 노르-MDP로도 지칭된다); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시-에틸아민) (CGP 19835A, 이는 MTP-PE로도 지칭된다); 및 콜레라 독소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 아주반트는 QS-21이다.

추가의 예시적인 아주반트로는 콜레라 독소의 A 서브유닛을 비롯한, 콜레라 독소의 비독성 유도체, 및/또는 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) 폴리펩티드와 콜레라 독소 또는 그의 B 서브유닛 ("CTB")의 접합체 또는 유전 공학처리된 융합물, 프로콜레라제노이드, 쉬조필란을 비롯한 진균 폴리사카라이드, 뮤라밀 디펩티드, 뮤라밀 디펩티드 ("MDP") 유도체, 포르볼 에스테르, 이. 콜라이(E. coli)의 이열성 독소, 블록 공중합체 또는 사포닌을 포함한다.

인산알루미늄은 1상 임상 시험에서 아주반트로서 미연방 규정집(US Code of Federal Regulations) [610.15(a)]에 명시된 0.85 mg/용량이라는 한도보다 훨씬 더 낮은 0.125 mg/용량이라는 농도로 사용되어 왔다. 알루미늄 함유 아주반트는 근육내 또는 피하로 투여될 때 항원의 면역 반응을 강화시키기 위해서는 인간에서 광범위하게 사용된다.

특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 점막 아주반트를 포함하는, 경구 투여용 면역원성 조성물 중에 사용되고, 인간 숙주에서 엔. 메닌기티디스 감염의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 점막 아주반트는 콜레라 독소일 수 있지만; 그러나, 바람직하게, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 콜레라 독소 이외의 점막 아주반트로는 A 서브유닛이 돌연변이된 것인 콜레라 홀로톡신의 비독성 유도체, 화학적으로 변형된 콜레라 독소, 또는 콜레라 독소 아미노산 서열의 변형에 의해 생산된 관련 단백질을 포함한다. 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하는 데 특히 유용할 수 있는 구체적인 콜레라 독소에 관해서는 국제 출원 공보 WO 00/18434 (이는 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 개시되어 있는 바와 같은 돌연변이체 콜레라 홀로톡신 E29H를 참조한다. 이는 본 발명의 폴리펩티드에 첨가될 수 있거나, 또는 접합될 수 있다. 같은 기법이 점막 아주반트 또는 전달 특성을 가진 다른 분자, 예컨대, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 독소 (LT)에 적용될 수 있다. 점막 아주반트 또는 전달 활성을 가진 다른 화합물, 예컨대, 담즙; 폴리양이온, 예컨대, DEAE-덱스트란 및 폴리오르니틴; 디터전트, 예컨대, 나트륨 도데실 벤젠 술포네이트; 지질 접합된 물질; 항생제, 예컨대, 스트렙토마이신; 비타민 A; 및 점막 표면의 구조적 또는 기능적 무결성을 변경시키는 다른 화합물이 사용될 수 있다. 다른 점막 활성 화합물로는 미생물 구조 유도체, 예컨대, MDP; 아크리딘 및 시메티딘을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 스티뮬론™ QS-21, MPL, 및 IL-12 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 ISCOMS (면역 자극 복합체), CTB를 함유하는 ISCOMS, 리포솜의 형태로 전달될 수 있거나, 화합물, 예컨대, 아크릴레이트 또는 폴리(DL-락티드-코-글리코시드)에 캡슐화되어 흡수에 적합한 크기의 마이크로스피어를 형성할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 오일성 에멀젼 내로 혼입될 수 있다.

환자에게 투여되는 면역원성 조성물의 양 (즉, 용량)은 특정 항원, (존재할 경우) 아주반트, 특정 환자의 연령, 성별, 체중, 종, 상태, 및 투여 경로를 고려하여, 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 결정될 수 있다.

예를 들어, 청소년인 인간 환자에 대한 투여량은 네이세리아 ORF2086 단백질 0.1 ㎍, 1 ㎍, 10 ㎍, 또는 50 ㎍ 이상, 및 최대 네이세리아 ORF2086 단백질 80 ㎍, 100 ㎍, 150 ㎍, 또는 200 ㎍인 것을 포함할 수 있다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값의 조합을 통해 적합한 범위를 정의할 수 있다.

시험관내 효능 검정

효능은 rLP2086 참조 물질에 대한 입체형태-특이 모노클로날 항체를 사용하여 면역원성 조성물 중 서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 단백질 중의 기능적 에피토프를 정량화함으로써 측정된다. 효능은 생체내에서 면역 반응을 유도하여 살박테리아 항체를 생성하는 서브패밀리 A 또는 서브패밀리 B rLP2086 단백질 중의 기능적 에피토프의 정량적 측량에 의해 측정된다. 정량적 기술은 선택된 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하는 효능 검정에 사용된다. 면역원성 조성물 중의 각 서브패밀리 rLP2086 단백질에 대해 입체형태적이고, 비-중복성인 두 기능적 모노클로날 항체를 선택한다. 정제된 두 모노클로날 항체 사이에서, 제1 항체는 rLP2086 단백질 분자를 포획하는 데 사용되는 것인 제1 태그에 접합된다. 일부 실시양태에서, 제1 태그는 비오틴, 글루타티온-S 트랜스퍼라제 (GST), 6xHis 태그, 또는 비드 (예컨대, 카르복실화 폴리스티렌 비드 또는 상자성 비드)이다. 일부 실시양태에서 제1 태그는 스트렙타비딘 비드, 스트렙타비딘 칼럼, 니켈 비드, 니켈 칼럼, 원심분리로, 또는 자기장으로 포획된다. 제2 항체는 정량가능한 것인 제2 태그에 접합된다. 일부 실시양태에서, 제2 태그는 비오틴, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 형광단 또는 방사성표지이다. 일부 실시양태에서, 제2 태그는 형광단 또는 HRP에 접합된 스트렙타비딘으로, 전기화학발광, 형광 검출, 또는 방사능 검출에 의해 검출된다. 각 면역원성 조성물 중에서 두 mAb에 의해 인식되는 두 에피토프 모두를 보이는 단백질만이 측정될 것이다. 단백질의 임의의 한 에피토프 또는 두 에피토프 모두의 변화가 반영될 것이다. 샘플의 효능은 참조 물질의 효능에 대해 상대적인 값으로 기록된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 2086 단백질의 효능을 측정하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 (1) 제1 모노클로날 Ab 및 제2 mAb를, 2086 단백질을 포함하는 면역원성 조성물과 함께 인큐베이션시키는 단계이며, 여기서, 제1 mAb가 상기 mAb를 포획시키는 데 사용되는 제1 태그에 접합되어 있고, 제2 mAb가 검출가능한 제2 태그에 접합되어 있으며, 여기서, 제1 및 제2 mAb가 2086 참조 단백질 상의 상이한 입체형태의 에피토프에 대한 것인 단계; (2) 제1 태그를 사용하여 제1 mAb-결합된 2086 단백질을 포획하는 단계; 및 (3) 포획된 제2 mAb-결합된 2086 단백질을 제2 태그를 사용하여 검출하고 그의 양을 정량하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2086 단백질은 서브패밀리 A 단백질이다. 일부 실시양태에서, 2086 단백질은 서브패밀리 B 단백질이다. 일부 실시양태에서, 2086 단백질은 지질화된 것이다. 일부 실시양태에서, 2086 단백질은 비-지질화된 것이다. 일부 실시양태에서, 2086 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제1 태그는 비오틴, 6xHis 태그, 또는 비드 (예컨대, 카르복실화 폴리스티렌 비드 또는 상자성 비드)이다. 일부 실시양태에서, 제1 태그는 스트렙타비딘 비드, 스트렙타비딘 칼럼, 글루타티온 비드, 글루타티온 칼럼, 니켈 비드, 니켈 칼럼, 원심분리로, 또는 자기장으로 포획된다. 일부 실시양태에서, 제2 태그는 비오틴, HRP, 형광단 또는 방사성표지이다. 제2 태그는 형광단 또는 HRP에 접합된 스트렙타비딘으로, 전기화학발광, 형광 검출, 또는 방사능 검출에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 다중 2086 단백질 변이체를 포함한다.

rLP2086 서브패밀리 B 항원 효능의 안정성

일부 실시양태에서, 본 발명은 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제를 포함하는, 시간 경과에 따라 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 안정화시키는 면역원성 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1.4 내지 약 4.2이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 또는 약 10이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 다가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 양이온은 칼슘 또는 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 알룸 중 하나 이상으로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL; 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL, 또는 약 0.4 mg/mL 내지 약 0.6 mg/mL의 알루미늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.1 mg/mL, 약 0.15 mg/mL; 약 0.2 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.35 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.45 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.55 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.65 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.75 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.85 mg/mL, 0.9 mg/mL, 약 0.95 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL의 알루미늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%로 단백질에 결합한다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 히스티딘을 포함하는 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM; 약 5 mM 내지 약 15 mM, 또는 약 8 mM 내지 12 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM 또는 약 20 mM이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 숙시네이트를 포함하는 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM; 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 3 mM 내지 7 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM 또는 약 20 mM이다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0; 약 5.5 내지 약 7.0; 또는 약 5.8 내지 약 6.0인 pH를 가진다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 pH는 pH 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5를 가진다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 B 단백질 항원 면역원성 조성물의 제제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 B 단백질 항원 면역원성 조성물의 제제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 5 mM 숙시네이트 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제 중에 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 보관하는 단계를 포함하는, 시간 경과에 따라 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 안정화시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1.4 내지 약 4.2이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 또는 약 10이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 다가 양이온을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 양이온은 칼슘 또는 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 알룸 중 하나 이상으로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 안정화제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL; 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL, 또는 약 0.4 mg/mL 내지 약 0.6 mg/mL의 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 안정화제는 약 0.1 mg/mL, 약 0.15 mg/mL; 약 0.2 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.35 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.45 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.55 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.65 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.75 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.85 mg/mL, 0.9 mg/mL, 약 0.95 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL의 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%로 단백질에 결합한다.

일부 실시양태에서, 완충제는 히스티딘을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM; 약 5 mM 내지 약 15 mM, 또는 약 8 mM 내지 12 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘의 농도는 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM 또는 약 20 mM이다.

일부 실시양태에서, 완충제는 숙시네이트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM 내지 약 20 mM; 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 3 mM 내지 7 mM이다. 일부 실시양태에서, 숙시네이트의 농도는 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM 또는 약 20 mM이다.

일부 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0; 약 5.5 내지 약 7.0; 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 5.0, 약 5.1 , 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5이다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 B 단백질 항원이 보관되는 완충제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 B 단백질 항원이 보관되는 완충제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 5 mM 숙시네이트 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

rLP2086 서브패밀리 A 및 B 항원 효능의 안정성

일부 실시양태에서, 본 발명은 고농도의 안정화제 및 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제를 포함하는, 시간 경과에 따라 rLP2086 서브패밀리 A 및/또는 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 안정화시키는 면역원성 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0; 약 5.5 내지 약 7.0; 또는 약 5.8 내지 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 pH는 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5이다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질 항원의 제제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 고농도의 안정화제 및 낮은 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 완충제 중 rLP2086 서브패밀리 A 및/또는 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 보관하는 단계를 포함하는, 시간 경과에 따라 rLP2086 서브패밀리 A 및/또는 rLP2086 서브패밀리 B 항원을 안정화시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 디터전트 대 단백질의 몰비는 10:1 미만이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 1.4 내지 약 4.2이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 디터전트 대 단백질의 몰비는 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1 , 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 또는 약 10이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 비-이온성 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 디터전트이다. 일부 실시양태에서, 디터전트는 폴리소르베이트 80이다.

일부 실시양태에서, 완충제 중 안정화제는 다가 양이온이다. 일부 실시양태에서, 다가 양이온은 칼슘 또는 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 알룸 중 하나 이상으로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 안정화제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL; 약 0.25 mg/mL 내지 약 0.75 mg/mL, 또는 약 0.4 mg/mL 내지 약 0.6 mg/mL의 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 안정화제는 약 0.1 mg/mL, 약 0.15 mg/mL; 약 0.2 mg/mL, 약 0.25 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.35 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.45 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.55 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.65 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.75 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.85 mg/mL, 0.9 mg/mL, 약 0.95 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL의 알루미늄이다. 일부 실시양태에서, 알루미늄은 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%로 단백질에 결합한다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질 항원이 보관되는 완충제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

일부 실시양태에서, MnB rLP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질 항원이 보관되는 완충제는 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄, 및 2.8의 몰비의 폴리소르베이트 80:단백질을 함유하는 5 mM 숙시네이트 완충된 염수 (pH 6.0)이다.

본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예를 기술한다. 본 실시예는 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.

본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 본원에서 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1: 실험 절차

알루미늄 결합 측정

알루미늄 및 1 이상의 단백질 항원을 포함하는 조성물을 원심분리함으로써 알루미늄을 펠릿화하였다. 알루미늄 흡착된 단백질을 원심분리시키는 것은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Egan et al., Vaccine, Vol. 27(24): 3175-3180 (2009)]을 참조할 수 있다. 알루미늄 결합된 단백질 또한 펠릿화된 반면, 비-알루미늄 결합된 단백질은 상청액에 그대로 남아있었다. 상청액 및 펠릿 중의 전체 단백질은 로우리(Lowry) 검정으로 측정하였다. 상청액 중 전체 단백질을 조성물에 첨가된 전체 단백질로 나누고, 이에 100%를 곱하여 결합된 단백질의 백분율을 계산하였다. 유사하게, 상청액 중 전체 단백질을 조성물에 첨가된 전체 단백질로 나누고, 이에 100%를 곱하여 비결합된 단백질의 백분율을 계산하였다.

서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 항원, 둘 모두를 포함하는 조성물의 경우, 상청액 중 개개의 서브패밀리 A 및 B 단백질 농도는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 강 음이온 칼럼 및 높은 염 농도 용리제를 사용하여 서브패밀리 A 및 B 단백질의 분리 및 용리를 수행하였다. 여기 = 280 nm 및 방출 = 310 nm으로 설정된 형광 검출기를 사용하여 서브패밀리 A 및 B 단백질, 둘 모두를 검출하고, 정량화하였다. 서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 단백질은 별개의 체류 시간에서 용리되었고, rLP2086 단백질 참조 물질에 대하여 작성된 표준 곡선을 사용하여 정량화하였다. 상청액 중 전체 단백질을 조성물에 첨가된 전체 단백질로 나누고, 이에 100%를 곱하여 비결합된 단백질의 백분율을 계산하였다. 100%에서 비결합된 단백질의 백분율을 감산하여 결합된 단백질의 백분율을 계산하였다.

시험관내 효능 검정

rLP2086 효능 검정은 rLP2086 약물 물질의 단일 단백질 분자 상의 입체형태적이고 비-중복성인 에피토프를 인식하는 두 기능적 모노클로날 항체에 의존하는 균질 포획 검정 또는 샌드위치 검정이다. 한 정제된 모노클로날 항체는 포획 항체 (mAb)로서의 역할을 하고, 독특한 칼라 코드 식별자를 카르복실화 폴리스티렌 비드에 화학적으로 접합시킨다. 제2 항체는 비오티닐화되고, 형광단 R-피코에리트린 (SA-PE)에 접합된 스트렙타비딘에 후속하여 결합하게 되는 검출 항체로서의 역할을 한다. 바이오플렉스(BioPlex) 검출기의 유체소자는 개체 마이크로스피어 및 그의 관련 SA-PE 신호를 정량화한다. 마이크로스피어와 관련된 R-피코에리트린으로부터의 형광 신호는 오직 비드-접합된 항체, 항원, 및 검출 항체 사이의 3원 복합체 형성에 의해서만 검출될 것이며, 이는 rLP2086 샘플 중 기능적 에피토프의 개수에 비례할 것이다. 참조 표준과 비교하여, 형광 상실을 초래하는 한 에피토프 또는 두 에피토프 모두의 변화가 효능 상실을 시사하게 될 것이다.

시약

· (루미넥스 마이크로플렉스(Luminex MicroPlex) 마이크로스피어 비드 영역 #12에, 또는 비드 영역 #66에 접합된) 모노클로날 항체 접합된 마이크로스피어.

· 비오티닐화된 모노클로날 항체.

· rLP2086 참조 물질, 서브패밀리 A 및 B, 2 mg/ml. -70℃에서 보관.

· rLP2086 서브패밀리 A 및 B 2가 대조군.

· 스트렙타비딘, R-피코에리트린 접합형, 동결건조됨.

완충제

· 10 mM 히스티딘, 150 mM NaCl (pH 6.0)

· 0.85% w/v 염수 중 5% w/v 폴리소르베이트 80 (PS-80).

· 매트릭스 완충제 (10 mM 히스티딘, 0.02% 폴리소르베이트 80, 150 mM NaCl (pH 6.0)).

· 검정용 완충제 (0.1% BSA, 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.1% 아지드를 포함하는 PBS (pH 7.4)).

· 100x 스트렙타비딘, R-피코에리트린-접합형 (SA-PE) - 동결건조된 스트렙타비딘, R-피코에리트린으로 된 바이알을 개봉하고, 증류수 1 mL를 첨가함. 완전하게 용해될 때까지 와동시킴.

절차

200 ㎕의 서브패밀리 A 단백질 및 200 ㎕의 서브패밀리 B 단백질을 600 ㎕의 매트릭스 완충제에 각 서브패밀리의 농도가 400 ㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 원액을 검정용 완충제 중에 희석시킴으로써 8개의 농도 (3333-1.5 ng/mL)로 이루어진 표적 곡선을 작성하였다.

200 ㎕의 2가 대조군을 800 ㎕의 매트릭스 완충제에 각 서브패밀리의 농도가 400 ㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 100, 50, 및 12.5 ng/mL의 작업 농도를 만들기 위해 400 ㎍/mL 원액을 검정용 완충제 중에서 희석시켰다. 100 및 12.5 ng/mL가 각각 고농도 대조군 (CH) 및 저농도 대조군 (CL)를 대표하였다.

시험 샘플을 매트릭스 완충제 중에 희석시켜 농도가 400 ㎍/mL가 되도록 만들었다. 400 ㎍/mL 원액으로부터 100, 50, 및 12.5 ng/mL의 작업 용액을 제조하였다.

검정용 완충제 중 2 x 10⁵개의 비드/mL 농도의 접합된 비드 및 30 ㎍/mL 농도의 검출용 항체를 사용하여 균질 검정용 혼합물을 제조하였다. 0.4 mL의 표준, 대조군, 샘플 또는 블랭크를 2 mL 96-웰 딥 웰 플레이트에 첨가함으로써 샘플 플레이트를 제조하였다. 100 ㎕의 검정용 완충제를 첨가하여 96-웰 멀티스크린_HTS-BV(MultiScreen_HTS-BV) 필터 플레이트의 필터를 미리 습윤화시킨 후, 진공 흡입에 의해 필터를 통해 인출하였다. 제조된 균질 검정용 혼합물 25 ㎕를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 표준, 대조군, 샘플 또는 블랭크 용액 각각을 25 ㎕씩 96-웰 필터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 진탕시키면서 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.

항원-항체 인큐베이션 후, 진공 흡인에 의해 완충제를 필터를 통해 제거하였다. 각 웰의 필터를 100 ㎕의 검정용 완충제로 3회에 걸쳐 세척한 후, 진공 흡인을 실시하였다. 최종 세척 후, 50 ㎕의 1x SA-PE를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 타이터에서 진탕시키면서 실온하에 10분 동안 인큐베이션시켰다.

SA-PE 인큐베이션 후, 75 ㎕의 검정용 완충제를 총 125 ㎕의 부피로 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 즉시 플레이트를 바이오-플렉스 200 시스템(Bio-Plex 200 System) 상에서 판독하였다.

혈청 살박테리아 검정

전세포 ELISA에 의해서 찰스 리버 캐나다(Charles River Canada: 캐나다 퀘벡주 세인트 콘스탄트)로부터 입수한, 2.5-3.0 kg의 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼를 사전에 스크리닝하여 상이한 두 메닌고코쿠스 균주 (각 P2086 서브패밀리로부터 하나씩)에 대해 반응성이 낮은 것을 확인하였다. 일반적으로, 상기 토끼는 매우 낮은 배경을 가졌으며, 사용하기 위해 가장 낮은 값을 가진 것을 선택하였다. 0, 4, 및 9주째에 1가 rLP2086-A05, 1가 rLP2086-B01 또는 2가 rLP2086-A05 + B01 백신을 근육내로 투여하여 토끼를 백신화하였다. 각 용량은 1가 백신의 경우, 단백질 100 ㎍, 및 2가 백신의 경우, 각 단백질을 100 ㎍씩 함유하였고, 10 mM 히스티딘 완충제 (pH 6.0), 150 mM NaCl, 0.02% 폴리소르베이트 80 및 250 ㎍ AlPO₄ 중에서 제제화하였다. 백신을 우측 뒷다리 근육내에 주사하였다 (0.5 ml/용량). 대조군으로서, 1군의 토끼에는 완충제만을 단독으로 포함하는 제제로 백신화하였다. 분석을 위해 면역 이전 (0주째) 및 면역 (10주째) 혈청 샘플을 수득하였다. 동물 프로토콜은 모두 확립된 실험 동물 사용 관리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인을 고수하였다.

rLP2086 백신으로 면역화된 토끼에서의 혈청 살박테리아 항체는 인간 보체를 이용하는 SBA를 사용하여 측정하였다. 토끼 면역 혈청을 열로 불활성화시켜 고유한 보체 활성을 제거하고, 이어서, 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중 Ca2+ 및 Mg2+ (D-PBS)를 함유하는 둘베코 PBS 중에서 1:2로 연속 희석시켜 엔. 메닌기티디스 균주에 대한 혈청 살박테리아 활성을 시험하였다. 본 검정에 사용되는 박테리아를 켈로그 보충제(Kellogg's supplement) (GCK)로 보충된 GC 배지에서 성장시키고, 650 nm에서의 광학 밀도에 의해 모니터링하였다. 0.50-0.55의 최종 OD₆₅₀에서 검정에 사용하기 위한 박테리아를 수거하고, D-PBS 중에서 희석하고, 20% 인간 보체를 포함하는 검정용 혼합물에 1,000-3,000 CFU를 첨가하였다.

살박테리아 활성의 검출이 불가능한 것인 인간 혈청을 외인성 보체 공급원으로서 사용하였다. 각각의 개별 시험 균주에 대한 적합성에 대하여 보체 공급원을 시험하였다. 면역 혈청이 첨가되지 않은 대조군 중에서 살아있는 박테리아의 개수가 >75%인 경우에만 보체 공급원을 사용하였다. 본 연구에서 기술된 SBA를 수행하기 위해서는 10개의 독특한 보체 공급원이 필요하였다.

5% CO₂하에 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션한 후, D-PBS를 반응 혼합물을 첨가하고, 50% GCK 배지로 충전된 마이크로필터 플레이트로 분취량을 옮겨 놓았다. 마이크로필터 플레이트를 여과하고, 5% CO₂하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 미세콜로니를 염색하고, 정량화하였다. 혈청 살박테리아 역가는 면역 혈청이 첨가되지 않은 대조군 웰에서의 CFU와 비교하였을 때, CFU를 50% 감소시키는 보간된 혈청 희석률의 역수로서 정의되었다. SBA 역가는 37℃에서 30 min 동안의 인큐베이션 후, 박테리아 계수를 50% 감소시키는 보간된 시험 혈청 희석률의 역수로서 정의된다. 상응하는 면역 이전의 혈청과 비교하였을 때, P2086 면역 혈청에 대한 SBA 역가가 4배 이상으로 상승하였다면, P2086 면역 혈청을 이용한 사멸에 대한 감수성은 확립된 것으로 하였다. 토끼 혈청에 대한 검출 한도는 역가 8이었다. 출발 희석률에서 검정 균주에 대해 음성을 띠는 혈청을 검정용 검출 한도의 절반값인 역가 (즉, 토끼의 경우, 4)로 지정하였다.

유동 세포측정법

MnB 세포를 0.45-0.55의 OD₆₅₀까지 성장시킨 후, 10 min 동안 1 X PBS 중 1% (v/v) 파라포름알데히드 중에서 고정시켰다. 100 ㎕/웰의 박테리아를 96-웰 U-바닥 폴리스티렌 플레이트내에 플레이팅하고, 스핀 다운시키고, 1 x PBS 중 1% (w/v) BSA 중에서 1회에 걸쳐 세척하였다. 항-LP2086 모노클로날 항체를 박테리아 펠릿에 첨가하고, 재현탁시키고, 얼음상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 1% BSA/PBS 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG (하위부류 1 + 2a + 2b + 3) (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))를 세포 펠릿에 첨가하고, 재현탁시키고, 얼음상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 스트렙타비딘-PE (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에 재현탁시키고, 얼음상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 1% BSA/PBS 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포 펠릿을 1% 파라포름알데히드 중에 재현탁시켰다. 마우스 IgG는 음성 대조군으로서 포함시켰다. BD LSR II 유동 세포측정기 상에서 웰당 2만개 (20,000)의 이벤트를 획득하고, 플로우조 v7(FlowJo v7) 소프트웨어 (트리스타(Treestar: 미국 오레곤주 애실런드))를 사용하여 분석하였다. 로그 FSC 대 SSC 도트 플롯에서 박테리아 세포에 대해 게이팅한 후, 각 샘플에 대한 PE 채널의 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. MFI가 대조군 마우스 IgG MFI의 것에 3배가 되는 경우, MFI는 양성인 것으로 간주되었다.

실시예 2 : 폴리소르베이트 80의 rLP2086 단백질에의 결합

폴리소르베이트 80의 각 rLP2086 단백질 A 및 B에의 결합의 안정성을 이해하기 위해, 알루미늄 (Al)과 함께 200 ㎍/mL 서브패밀리 A로 제제화된 rLP2086 샘플, 및 200 ㎍/mL 서브패밀리 B로 제제화된 또 다른 rLP2086 샘플 둘 모두를 2-8℃ 및 25℃에서 보관하고, 5개월 후에 그의 단백질 및 폴리소르베이트 80의 함량에 대하여 시험하였다. 위약 (단백질없이, 완충제 + Al) 또한 분석하였다. 위약 중의 폴리소르베이트 80 분포는 도 14에 제시되어 있고, 서브패밀리 A 및 B 단백질에 대한 폴리소르베이트 80 분포는 각각 도 15 및 도 16에 제시되어 있다. 도 17에 제시되어 있는 바와 같이, 서브패밀리 B에 대한 상대적인 효능(%)을 결합 몰비와 비교하였다.

결과

도 14에 제시되어 있는 바와 같이, 폴리소르베이트 80의 총 비율(%) 및 상청액 중 폴리소르베이트 80의 비율(%)은 동일하였는데 (0.017%), 이는 폴리소르베이트 80이 알루미늄에 결합하지 않았다는 것, 또는 펠릿에 포획되지 않았다는 것을 시사하는 것이었다. 추가로, 폴리소르베이트 80은 2-8℃ 및 25℃ 둘 모두에서 5개월 후에도 안정하였다.

rLP2086 서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 샘플에 대한 결합된 (펠릿), 비결합된 (상청액), 및 전체의 폴리소르베이트 80의 분포는 각각 도 15 및 도 16에 제시되어 있다. 서브패밀리 A에 대한 상청액 및 펠릿 중 폴리소르베이트 80의 비율(%)은 2-8℃ 및 25℃에서의 5개월째 되는 시점에서 어떤 변화도 없었다. 그러나, 서브패밀리 B에 대한 펠릿 중, 25℃에서의 5개월째 되는 시점에서 더 많은 폴리소르베이트 80이 관찰되었다. 2-8℃ 및 25℃에서 상청액 및 펠릿 중 폴리소르베이트 80의 농도가 상이함에도 불구하고, 두 서브패밀리 모두에 대하여 질량 균형이 달성되었다. 상기 매트릭스에서 rLP2086 단백질이 인산알루미늄에 100%로 결합하기 때문에, 펠릿 중에 회합된 폴리소르베이트 80은 단백질에 분자에 결합되었을 가능성이 가장 컸다.

단백질 A 및 B 둘 모두 폴리소르베이트 80에 결합하는 반면, 단백질 A 결합은 2-8℃ 및 25℃에서 보관된 샘플에 대하여 동일하였고, 단백질 B 결합은 2-8℃에서 보관된 샘플과 비교하였을 때, 25℃에서 보관된 샘플이 거의 2배에 달했다. 서브패밀리 B에 대한 상대적인 효능은 2-8℃ 및 25℃ 둘 모두에서 T₀ 및 5개월째 되는 시점에서 측정하였고, 도 17에 제시되어 있는 바와 같이, 효능은 결합 몰비와 역반응을 보이는 것으로 밝혀졌다. 효능 (%)은 T₀에서의 120으로부터 5M/25℃에서의 16%로 하락한 반면, 결합 몰비는 동일 기간에서 5.3에서 13.9로 증가하였다.

실시예 3: 임계 몰비 연구

rLP2086 안정성을 위해 요구되는 폴리소르베이트 80의 임계 농도를 측정하기 위해, 하기 표 1에 기술되어 있는 바와 같이 상이한 농도의 폴리소르베이트 80과 함께, 서브패밀리 A만을, 서브패밀리 B만을, 및 서브패밀리 A 및 B 둘 모두를 200 ㎍/mL 및 400 ㎍/mL로 함유하는 사십 (40)개의 rLP2086 제제를 제조하였다. 2-8℃ 및 25℃ 둘 모두에서 0시점 (T₀), 14일째, 및 1개월째에 각 샘플에 대하여 전체 단백질 및 결합된 단백질을 측정할 뿐만 아니라, 전체, 상청액, 및 펠릿 중의 폴리소르베이트 80의 비율(%)도 측정하였다. 본 연구로부터 얻은 결과는 도 18 내지 도 24에 제시되어 있다.

결과

인산알루미늄을 포함하는 40개의 rLP2086 제제 샘플 모두에 대해 상청액, 펠릿, 및 전체 폴리소르베이트 80 농도를 측정하였다. 서브패밀리 A 및 B, 둘 모두에 대한 전체 및 결합 몰비를 측정하였는데, 이는 각각 도 18 및 도 19에 제시되어 있는 바와 같이, 0.005% (5.4 몰비) 이하의 폴리소르베이트 80을 함유하는 200 ㎍/mL의 두 서브패밀리 모두에 대해 유사하게 나타났다. 그러나, 서브패밀리 B에 대한 전체 몰비가 0.0065% (7.0 몰비) 이상의 폴리소르베이트 80을 함유하는 샘플에 대한 결합 몰비보다 훨씬 더 높았다. 각각 400 ㎍/mL의 서브패밀리 A, 서브패밀리 B, 및 서브패밀리 A+B에 대한 전체 및 결합 몰비에 대한 데이터는 또한 도 20에 제시되어 있는 바와 같이, 0.008% (8.6 몰비) 이하의 폴리소르베이트 80을 함유하는 제제에 대한 것과 유사하였지만, 전체 몰비는 0.017% 폴리소르베이트 80 (18.4 몰비)을 함유하는 제제에 대한 결합 몰비보다 훨씬 더 높았다.

실시예 4 : 시간 경과에 따른 폴리소르베이트 80 결합

AlPO₄를 포함하는 서브패밀리 A 및 B 제제 샘플에 대한 상청액 및 펠릿 중 폴리소르베이트 80의 백분율 (%)을 T₀, 14일/25 ℃, 1개월/4℃, 및 1개월/25℃에서 측정하였다. 두 서브패밀리 A 및 B 제제 샘플 모두에 대한 상청액 중의 폴리소르베이트 80의 비율 (%)은 각각 2-8℃에서 보관된 샘플에 대한 것과 동일하였다. 그러나, 상청액 중의 폴리소르베이트 80의 비율 (%)은 심지어 단지 14일이 경과한 후에도 25℃에서 보관된 샘플에 대해 급격하게 감소하였다. 서브패밀리 A 및 B 둘 모두에 대한 펠릿 중의 폴리소르베이트 80의 비율 (%)은 T₀/5℃ 및 1개월/5℃에서 상대적으로 유사하였다. 그러나, 상청액 중 폴리소르베이트 80의 비율 (%)은 구체적으로, 25℃에서 보관된 샘플에 대해, 특히 0.008% (8.6 몰비) 이상의 폴리소르베이트 80을 함유하는 서브패밀리 B에 대해, 현저하게 증가하였다. AlPO₄를 포함하는 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 제제에 대한 상청액 및 펠릿 중 폴리소르베이트 80의 비율 (%) 또한 T₀, 14일/25℃, 1개월/4℃, 및 1개월/25℃에서 측정하였다. 도 21에 제시되어 있는 바와 같이, 0.008%를 함유하는 샘플에 대한 폴리소르베이트 80의 농도는 대략 4개의 시점 모두에 대하여 동일하였다. 그러나, 폴리소르베이트 80의 농도는 25℃에서 보관된, 0.017% 폴리소르베이트 80을 함유하는 샘플의 경우에는 증가하였다. 0.008% 이하의 폴리소르베이트 80을 함유하는 샘플의 상청액 중에서는 어떤 폴리소르베이트 80도 관찰되지 않았다. 도 22에 제시되어 있는 바와 같이, 0.008% 이하의 폴리소르베이트 80을 함유하는 샘플의 경우, 4개의 시점 모두에서 결합 몰비는 안정하였다. 그러나, 결합 몰비는 25℃에서 보관된, 0.017% 폴리소르베이트 80을 함유하는 샘플의 경우에는 증가하였다.

AlPO₄를 포함하는 서브패밀리 A 및 B 제제 샘플에 대한 효능을 T₀, 및 14일/25℃에서 측정하였다 (각각 도 23 및 도 25). 도 23에 기술되어 있는 바와 같이, 상이한 전체 몰비에서 서브패밀리 A에 대한 효능은 5℃ 및 25℃, 둘 모두에서 91 내지 102 범위였다. 결합 몰비 결과는 또한 어느 온도에서든 상대적으로 동일한 반면, 전체/결합 몰비가 증가함에 따라 효능이 약간 증가한 것으로 관찰되었다.

5℃ 샘플의 경우, 서브패밀리 B에 대한 효능은 전체 몰비 최대 9.0까지는 약 95%였다. 그러나, 전체 몰비가 18.1까지 증가함에 따라 서브패밀리 B 효능은 79%로 감소하였다. 추가로, 전체 몰비가 18.1인 샘플은 다른 샘플과 비교하였을 때,더 높은 결합 몰비를 가졌다. 25℃에서 서브패밀리 B 효능은 전체 몰비가 5.3에서 18.1로 증가함에 따라 83%에서 5%로 현저히 하락한 것으로 나타났다. 25℃ 샘플의 경우, 결합 몰비는 전체 몰비가 증가함에 따라 5.3에서 13.8로 증가하였다. 따라서, 서브패밀리 B에 대한 효능은 결합 몰비와는 반비례한다.

서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 단백질 둘 모두 폴리소르베이트 80에 결합하였다. 서브패밀리 A 결합은 2-8℃ 및 25℃에서 보관된 샘플이 동일하였지만, 서브패밀리 B 결합은 25℃에서 보관된 샘플의 것이 거의 2배에 달했다. 추가로, 임계 몰비 연구는 전체 몰비가 4.2 이하인 것에 등가인 0.008% 이하의 폴리소르베이트 80을 함유할 때, 200 ㎍/mL 제제 샘플이 안정하였다는 것을 나타내었다.

실시예 5: 디터전트 농도 및 rLP2086 서브패밀리 B 항원 효능

다양한 농도의 폴리소르베이트 80을 이용한 추가의 안정성 연구를 통해 효능 유지를 위한 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비의 임계성을 입증하였다. 한 실험에서, 0.5 mg/mL 알루미늄 (인산알루미늄으로서)을 포함하고, (폴리소르베이트 80 대 rLP2086 단백질의 몰비가 5.3, 10.7, 26.7 및 53.4인 것에 상응하는) 0.01%, 0.02%, 0.05% 또는 0.1% 폴리소르베이트 80으로 스파이킹된 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (HBS) 중에 200 ㎍ 투여량 (총 단백질 농도 400 ㎍/mL)으로 면역원성 조성물을 제제화하였다. 제제화된 샘플을 25℃에서 인큐베이션하고, 대조군 샘플을 2-8℃에서 보관하였다. 시점 "0"에서 폴리소르베이트 80 농도가 최대 0.1%까지는 효능에 있어 어떤 유의적인 변화는 없었다. 그러나, 2-8℃ 및 25℃에서 보다 장기간인 경우에는 온도 및 폴리소르베이트 80의 농도 함수에 따른 효능 감소가 관찰되었다. 면역원성 조성물 중 폴리소르베이트 80의 농도가 0.01%에서 0.1%로 증가함에 따라, 3개월 시점에서 안정성은 서브패밀리 B 단백질의 효능이 25℃ 및 2-8℃에서 각각 10% 미만 및 25% 미만으로 감소하였다는 것을 입증하였다 (도 1).

최종 농도가 (몰비가 3.3, 26.7 및 53.4인 것에 상응하는) 0.06, 0.5 및 1%로 폴리소르베이트 80으로 스파이킹된, HBS 중 농도가 4 mg/mL인 서브패밀리 B 단백질을 평가하는 추가의 안정성 연구 (도 2)를 수행하였다. 대조군은 0.09% 폴리소르베이트 80을 함유하였다. 0.06% 폴리소르베이트 80 (몰비의 3.3) 중의 서브패밀리 B 단백질은 안정하였다. 함유하는 폴리소르베이트 80의 농도가 0.5% 및 1% (몰비가 각각 26.7 및 53.4)로 증가된 동일 샘플은 불안정하였다. 400 ㎍/mL 면역원성 조성물 제제의 경우, 함유하는 폴리소르베이트 80의 농도가 0.01% (몰비 5.3) 이상인 제제들 모두에서 서브패밀리 B 단백질은 불안정한 것으로 관찰되었다. 그러나, 4 mg/mL 단백질 및 폴리소르베이트 80 농도 0.06%에서의 효능 감소는 없었는데, 그 이유는 폴리소르베이트 80 대 단백질의 비 (3.3)가 400 ㎍/mL 단백질 + 폴리소르베이트 80 농도 0.01% (몰비 5.3)인 것보다 낮기 때문이다. 따라서, 폴리소르베이트 80에 의한 서브패밀리 B 단백질의 효능 감소는 매트릭스 중 폴리소르베이트 80의 절대 농도가 아닌, 폴리소르베이트 80 디터전트 대 단백질의 몰비와 연관성이 있다.

따라서, 백신 중에서 및 2-8℃에서 차후에 보관하는 동안 서브패밀리 B 단백질의 안정성을 유지시키기 위해서는 면역원성 조성물 중 폴리소르베이트 80 농도를 감소시켜야 한다. 20 및 200 ㎍ 용량에서의, 다양한 몰비 (0, 1.1, 2.7 및 5.3)의 폴리소르베이트 80을 포함하는 면역원성 조성물에 대한 가속화된 28일 동안의 안정성 연구를 디자인하였다 (도 3 및 도 4). 0.5 mg/mL의 인산알루미늄으로서의 알루미늄을 포함하며, 폴리소르베이트 80의 농도가 다양한, 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0) 중 2가 (서브패밀리 A 및 서브패밀리 B) 제제를 제조하였다. 2-8℃에서의 대조군과 함께 샘플을 25℃에서 인큐베이션시켰다. 0, 7, 14 및 28일째에 샘플을 효능에 대해 분석하였다. 함유하는 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비가 5.3 미만인 모든 군의 경우, 서브패밀리 A (데이터는 제시되지 않음) 및 B 단백질, 둘 모두 안정하였다. 효능값이 80% 초과인 것을 검정 변수 범위 내에 포함되는 것으로 간주하였다. 몰비가 5.3일 때, 25℃ 샘플의 경우, 서브패밀리 B 단백질 효능은 감소하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다.

가속화된 보관 안정 조건하에서 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비를 달리하여 제제화된 모든 잠재적인 임상 투여량 (20, 60, 120 및 200 ㎍ 투여량)을 종합 연구를 통해 평가함으로써 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비가 MnB rLP2086 단백질의 안정성에 미치는 효과를 조사하였다. 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비를 대략 1.4 내지 10.7의 범위로 하여 제제화된 2가 MnB rLP2086 면역원성 조성물을 사용하였다. 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비를 증가시키면서 (1.4, 2.4, 3.4, 3.9, 4.3, 4.7 및 10.7) 제제화되는 면역원성 조성물을 생성하기 위해, 폴리소르베이트 80을 첨가함으로써 면역원성 조성물을 제제화하는 동안 추가의 폴리소르베이트 80이 필요하지 않도록 하여 항원을 가변적인 몰비로 조정하였다. 본 연구에는 2 세트의 항원 로트가 사용되었다. 한 세트의 서브패밀리 A 및 B 로트는 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비를 1.4로 하여 생성하고, 다른 한 세트는 2.4로 하여 생성하였다. 몰비가 2.4인 단백질 세트를 사용하여 추가의 폴리소르베이트 80으로 스파이킹함으로써 몰비를 3.4, 3.9, 4.3, 및 10.7로 조정하였다. 면역원성 조성물의 최종 매트릭스는 폴리소르베이트 80 대 단백질의 몰비는 상기 언급된 바와 같은, 10 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0, 0.5 mg/mL 인산알루미늄이었다. 특정 간격을 두고 2-8℃ 또는 25℃에서 보관한 후, 시험하기 24시간 전 로커를 사용하여 완만하게 혼합하였다. IEX-HPLC, 효능, 외관, 상청액 분획의 320 nm에서의 광학 밀도 및 pH에 의해 전체 단백질을 시험하였다.

200 및 20 ㎍ 용량의 효능 결과는 각각 도 5 및 도 6에 제시되어 있다. 본 효능 검정은 본 연구에 사용된 다른 시험보다 더 민감하였다. 전반적으로, 몰비가 4.3 이하인 모든 용량의 초기 시점과 비교하였을 때, 서브패밀리 A 또는 B 항원의 유의적인 효능 감소는 관찰되지 않았다. 몰비가 4.7인 제제는 25℃에서 보관된 서브패밀리 B 단백질에 대한 효능이 약간 감소하였는 바, 중요하지 않은 것으로 간주되었다. 몰비가 10.7인 제제의 경우, 서브패밀리 B 항원의 효능 결과는 2-8℃에서 보관된 것보다 25℃에서 보관된 샘플의 경우에 유의적으로 더 낮았다.

실시예 6 : 알루미늄 농도 및 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 항원 효능

서브패밀리 A 및 B 단백질 둘 모두의 95% 초과의 확실한 결합을 위한 최적의 인산알루미늄 수준을 측정하기 위해 다수의 실험을 수행하였다. 초기 연구는 pH 6.5에서 제제를 최적화하는 것에 중점을 두고 수행되었다. 0.02% 폴리소르베이트 80 및 0.25 또는 0.5 mg/mL 알루미늄 (인산알루미늄으로서)을 포함하는 10 mM 히스티딘 완충제 (pH 6.5) 중 서브패밀리 A 및 B 단백질로부터의 각 단백질의 표적 투여량을 200 ㎍/mL로 하여 제제를 제조하였다. 서브패밀리 B 단백질은 서브패밀리 A 단백질보다 더 낮은 정도로 인산알루미늄에 결합하였다 (도 7). 알루미늄 함량을 0.25 mg/mL에서 0.5 mg/mL로 증가시키자, 서브패밀리 B 단백질의 결합은 >80%로 증가하였다. 단백질과 알루미늄 현탁액 사이의 결합 기전은 대개 이온성 상호작용이기 때문에, 현탁액의 pH가 결합에 영향을 미칠 수 있는 인자가 된다.

서브패밀리 B 단백질의 90-95%의 확실한 결합을 위해 제제의 pH를 최적화하였다. 상이한 면역원성 조성물 로트를 포함하는, pH가 5.6부터 6.5 범위이고, 각 A 및 B 단백질이 200 ㎍/mL인 다중 제제를 조사하였다 (도 8). pH 범위가 5.6 내지 6.4인 제제에서 두 단백질 모두 90-95% 초과로 결합하는 것으로 나타났다. 제제의 pH가 6.5 이상으로 증가하였을 때, 서브패밀리 B 단백질의 결합은 유의적으로 감소하였다. 권고되는 표적 pH는 서브패밀리 A 및 B 단백질 둘 모두가 90% 초과로 확실하게 결합할 수 있도록 하는 것인 6.0이다.

pH, 완충제, 단백질, 및 폴리소르베이트 80 농도를 달리함으로써 제제 변수 및/또는 한도하에 제제의 완건성 또한 평가하였다 (도 9). 각 단백질의 농도가 최대 500 ㎍/mL일 경우 (각 단백질 250 ㎍/mL), 서브패밀리 A 단백질의 결합은 일관되게 높은 반면 (≥95%), 서브패밀리 B 단백질 결합은 단백질 농도 및 pH에 대하여 더 큰 감수성을 지녔다. 200 ㎍ 투여량의 시판용 제제를 사용하였는 바, 상기 실험으로부터 얻은 결과는, 권고되는 제제는 0.5 mg/mL 인산알루미늄, pH 6.0이라는 것을 추가로 입증하였다.

서브패밀리 B 단백질 안정성에 충분한, 저농도의 폴리소르베이트 80하에 인산알루미늄을 포함하지 않는 안정한 제제를 제공할 수 있는지 그 가능성을 조사하기 위해 인산알루미늄을 포함하는 제제 및 포함하지 않는 제제를 평가하였다. 폴리소르베이트 80의 농도 범위를 0 내지 5.3 몰비로 하여, 히스티딘 완충된 염수 완충제 중 20 및 200 ㎍ 투여량으로 면역원성 조성물을 제제화하였다. 시험하기 전 24시간 동안 펄스 모드하에 (작동하에 2초 및 비작동하에 1초) 500 rpm으로 설정된 디지털 다중튜브 교반기를 사용하여 샘플의 절반을 교반시켰다. 전형적으로는 수송 조건 동안의 극도한 진동을 모방하기 위해 최종 면역원성 조성물 수송 패키지 단계에서 수행되는 ISTA 시험 (국제 수송 안전 협회(International Safe Transit Association))을 시뮬레이션하기 위해 상기 조건을 채택하였다.

교반시, 인산알루미늄을 포함하지 않는 제제에서는 침전이 일어났고, 이는 결국 서브패밀리 A 및 B 항원 둘 모두의 효능 상실을 가져왔다. 외관 검사 (도 10) 및 λ= 320 nm에서의 흡광도 측정 (도 11)을 통해 인산알루미늄을 포함하지 않는 제제 교반시에는 응집물 및/또는 침전물이 형성된다는 것이 입증되었다. 상기 샘플에 관한 효능 시험 (도 12 및 도 13)을 통해 시험된 모든 시점에서 서브패밀리 A 및 B 단백질 둘 모두의 효능이 유의적으로 상실되었다는 것이 입증되었다. 효능 상실은 소량의 폴리소르베이트 80을 함유하는 제제에서 가장 두드러졌다. 서브패밀리 B 단백질 안정화를 유지시키는 데에는 소량의 폴리소르베이트 80이 필수적이기 때문에, 안정성을 보존하기 위해서는 제제 중에 인산알루미늄을 포함하여야 한다. 시험관내 효능 검정에 의해 측정된 바, 효능 안정성을 증진시키는 작용을 하게 되는 인산알루미늄을 사용하여 rLP2086 면역원성 조성물을 제제화할 수 있다.

실시예 7 : 완충제로서의 숙시네이트 및 히스티딘

숙시네이트 및 히스티딘 중 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질의 결합 뿐만 아니라, pH, 폴리소르베이트 80, 및 MgCl₂가 결합에 미치는 효과를 비교하기 위해 일련의 제제를 제조하였다 (표 2). pH, 완충제, 단백질, 및 폴리소르베이트 농도를 달리함으로써 제제 변수 및/또는 한도하에 제제의 완건성을 평가하였다 (도 25 및 26). 알루미늄의 서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 단백질에의 결합은 사용된 완충제 (히스티딘 또는 숙시네이트)와 상관없이 유사하였다.

염의 pKa가 생리학적 범위내에 있기 때문에, 그리고 이들 염은 일반적으로 안전하다고 간주된다는 이유에서 선택된, 보편적으로 사용되는 3가지 완충제 염을 이용하여 완충제 염 및 혼합 시간이 알루미늄 결합에 미치는 효과를 평가하였다. 각 조건의 결합 정도를 측정하기 위해서 각 염의 pKa에 적합한 pH에서 3가지 완충제 염: 5 mM 숙시네이트, 10 mM 히스티딘, 또는 10 mM 포스페이트 중 하나를 이용하여 rLP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질을 제제화하였다. 단백질 결합량을 측정하기 전에 샘플을 5 또는 120 min 동안 혼합함으로써 완전하게 결합되는 데 소요되는 시간을 평가하였다.

도 27에 제시된 바와 같이, 서브패밀리 B 단백질은 포스페이트 완충제 중 pH 6.8에서 결합이 감소한 것으로 나타난 반면, 동일 조건하에서 서브패밀리 A 단백질은 어떤 유의적인 영향도 받지 않았다. 히스티딘 또는 숙시네이트를 이용하여 제제화된 샘플에서 알루미늄에의 단백질 결합량은 유사하였다. 따라서, 추가 평가를 위해 이 두 완충제 염을 선택하였다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 포스페이트 완충제 중에서의 결합 감소는 AlPO₄ 상의 결합 부위와 첨가된 포스페이트 이온과의 경쟁 때문일 가능성이 있다.

2시간 동안의 혼합 후 유사한 결과를 얻었는 바, 이러한 조건 및 단백질 및 AlPO₄ 농도에서는 실온에서 5 min 동안의 혼합 후, 결합은 완료되었다.

pH 6.8의, 포스페이트 완충제 중에서의 서브패밀리 B 단백질의 결합 감소가 pH 또는 완충제 염 사이의 차이에 기인하는 것인지 여부를 추가로 조사하기 위해, 히스티딘- 또는 숙시네이트 완충된 제제 중 pH 5.3 내지 7.0 범위에서 결합을 측정하였다. 0.2 mg/mL의 각 서브패밀리 단백질 (0.4 mg/mL 전체 단백질), 0.02% PS80, 0.5 mg Al/mL, 및 150 mM NaCl을 함유하는 2가 제제를 제조하였다. 완충제 염의 효과를 비교하기 위해 10 mM 히스티딘 또는 5 mM 숙시네이트 중에서 샘플을 제제화하였다. 제제화한 후, 각 샘플의 pH를 개별적으로 확인하였다.

pH 5.3 내지 7.0에서의 결합 프로파일은 서브패밀리 A 단백질에 대한 것은 도 28에, 및 서브패밀리 B 단백질에 대한 것도 도 28에 제시되어 있다. 서브패밀리 A 단백질의 경우, 단백질의 결합량에는 거의 변화가 없었는데, 결합은 시험된 pH 범위 전역에 걸쳐 95% 초과로 유지되었다. 표적 pH 7.0인 히스티딘을 함유하는 제제의 pH는 6.8이 되었다. 단백질 또는 AlPO₄에 미칠 수 있는 효과를 피하기 위해 pH를 7.0으로 조정 (예컨대, 염기 첨가를 통한 조정)하지 않았고, 따라서, 이 데이터점에 대한 결과는 이용불가능하였다.

(도 29에 제시된) 서브패밀리 B 단백질의 결합 프로파일은 pH에 의존하는 경향을 보였다. 그러나, 결합이 히스티딘 또는 숙시네이트 완충된 제제 중에서 수행되든지 간에, 알루미늄에의 단백질 결합량은 유사하였다. 결합은 완충화 염 이외에도 제제의 pH에 의존하였다. 결합은 최대 pH 6.5까지 95%로 유지되었지만 (히스티딘 중에서 94%, 숙시네이트 중에서 95%), pH가 6.5를 초과할 경우에는 감소하였다. pH 7.0에서 결합은 약 82%로 감소하였고, 완충화 염 간에는 작은 차이가 있었다.

상기 농도에서 서브패밀리 B 단백질과 AlPO₄의 완건한 결합을 위해서는 pH가 6.5 이하인 것이 바람직하다.

실시예 8 : 안전성, 내성 및 면역원성 연구

0 및 2개월; 0, 2, 및 6개월; 0 및 2개월, 이어서 12개월 추가 용량인 요법에 따라 건강한 청소년 집단에 투여된 rLP2086 백신의 안전성, 내성 및 면역원성을 평가하는 연구를 수행하였다.

면역원성 조성물은 (재조합 지질화된) rLP2086 백신이었다. 면역원성 조성물은 에스케리키아 콜라이에서 발현되고, 한 서브패밀리 A 균주의 rLP2086과 한 서브패밀리 B 균주의 rLP2086으로 구성된 2가 백신으로 제제화된, 엔. 메닌기티디스 혈청군 B 재조합 ORF2086 단백질을 포함하였다. 특히, 면역원성 조성물은 60 ㎍, 120 ㎍, 또는 200 ㎍의 각각의 정제된 서브패밀리 A 및 정제된 서브패밀리 B rLP2086 단백질, 2.8 몰비의 폴리소르베이트 80, 및 0.25 mg의 AlPO₄로서의 Al³ ⁺, 10 mM 히스티딘 완충된 염수 (pH 6.0)를 함유하도록, 0.5 mL 용량으로 제제화하였다. 대조군 조성물은 0.5 mL 용량으로 생리식염수 (0.9% 염화나트륨)를 포함하였다.

대상체를 5개의 군으로 무작위로 배정하였다. 하기 표 3을 참조할 수 있다. 대상체를 2개의 연령군, ≥11세 내지 <14세, 및 ≥14세 내지 <19세로 계층화하였다.

활성 대조군으로서의 역할을 할 수 있는 것으로서, 안전하고, 면역원성을 가지며, MnB에 대해 효과적인 것은 입증된 백신이 없기 때문에 염수를 위약으로서 사용하였다.

표 3에 따라 각 백신화 방문 시점마다 (예컨대, 1, 2, 4, 및 6차 방문) 대상체는 1 용량의 rLP2086 백신 또는 염수를 투여받았다. 표준 백신화 관행을 준수하였고, 백신을 혈관내로 주사하지는 않았다. 0.5 mL를 상삼각근 내로 주사함으로써 rLP2086 백신을 근육내로 투여하였다. 염수를 상삼각근 내로 근육내 투여하였다.

A. 1차 방문

1차 방문, 1일째, 1차 백신화에서 먼저 대상체로부터 채혈을 하고, 대상체는 백신화를 받았다. 1차 방문 채혈 및 1차 백신화는 같은 날 수행되었다. 백신화 전, 대상체로부터 (대략 20 mL)의 혈액 샘플을 수집하였다. 1, 2, 3, 및 4군으로 무작위로 배정된 대상체에 대해, 단일의 0.5 mL rLP2086 백신을 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다. 5군의 대상체에 대해서는 단일의 0.5 mL 염수를 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다.

B. 2차 방문 (1차 방문 후 42 내지 70일째), 2차 백신화

1, 2, 및 3군에 대해, 단일의 0.5 mL rLP2086 백신을 상삼각근 내로 주사함으로써 투여하였다. 4 및 5군의 대상체에 대해서는 단일의 0.5 mL 염수를 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다.

C. 3차 방문 (2차 방문 후 28 내지 42일째), 2차 백신화 후 채혈

대상체로부터 (대략 20 mL)의 혈액 샘플을 수집하였다.

D. 4차 방문 (2차 방문 후 105 내지 126일째), 3차 백신화

2, 4, 및 5군에 대해, 단일의 0.5 mL rLP2086 백신을 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다. 1 및 3군의 대상체에 대해서는 단일의 0.5 mL 염수를 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다.

E. 5차 방문 (4차 방문 후 28 내지 42일째), 3차 백신화 후 채혈

대상체로부터 (대략 20 mL)의 혈액 샘플을 수집하였다.

F. 6차 방문 (4차 방문 후 161 내지 175일째), 4차 백신화

6차 방문시, 먼저 대상체로부터 채혈을 하고, 대상체는 백신화를 받았다. 6차 방문 채혈 및 4차 백신화는 같은 날 수행되었다. 백신화 전, 대상체로부터 (대략 20 mL)의 혈액 샘플을 수집하였다. 3 및 5군에 대해, 단일의 0.5 mL rLP2086 백신을 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다. 1, 2, 및 4군에 대해 단일의 0.5 mL 염수를 상삼각근 내로 근육내 주사함으로써 투여하였다.

G. 7차 방문 (6차 방문 후 28 내지 42일째), 4차 백신화 후 채혈

대상체로부터 (대략 20 mL)의 혈액 샘플을 수집하였다.

면역원성 결과

본 연구의 1차 목적은 LP2086 서브패밀리 A 및 B 단백질을 발현하는 MnB 균주를 사용하여 수행되는 SBA에 의해 측정되는 바, 60 ㎍, 120 ㎍, 및 200 ㎍ rLP2086 백신의 면역원성을 평가하고자 하는 것이었다.

본 연구의 2차 목적은 Ig의 rLP2086 백신 서브패밀리 A 및 B 단백질에의 결합 정량화에 의해 측정되는 바, 60 ㎍, 120 ㎍, 및 200 ㎍ rLP2086 백신의 면역원성을 평가하고자 하는 것이었다.

하기 표 4에 제시되어 있는 바와 같이, 3개의 서브패밀리 A 및 3개의 서브패밀리 B 균주를 사용하여 SBA 활성을 평가하였다.

정의된 수준을 달성한 역가를 가진 대상체의 비율이 하기 표 5에 제시되어 있다. 두 서브패밀리 모두에서, 정의된 SBA 역가 수준을 달성한 대상체의 비율은 2차 투약 이후보다 3차 투약 이후에 더 컸다.

면역원성 데이터는 백신이 MnB의 서브패밀리 A 및 서브패밀리 B 균주에 대해 유의적인 SBA 활성을 가진 항체를 생성할 수 있다는 것으로 보여준다. 서브패밀리 A 균주 2의 경우, 2차 투약 후, SBA 반응률은 88.9% 내지 90.9% 범위였고, 3차 투약 후, SBA 반응률은 90.0% 내지 97.4% 범위였다. 서브패밀리 A 균주 1 변이체의 경우, 2차 투약 및 3차 투약 후 둘 모두, 100.0%의 대상체가 60 ㎍ 및 120 ㎍의 두 용량 수준 모두에서 상기 변이체에 대해 SBA 반응을 하였다. 200 ㎍의 용량 수준에서, 2차 투약 및 3차 투약 후에는 각각 96.5% 및 99.0%의 대상체가 SBA 반응을 하였다. 서브패밀리 A 균주 1 변이체의 경우, 2차 투약 후, SBA 반응률은 85.0% 내지 96.3% 범위였고, 3차 투약 후에는 95.2% 내지 97.4% 범위였다.

서브패밀리 B 균주 1 변이체의 경우, 2차 투약 후, SBA 반응률은 76.2% 내지 81.0% 범위였고, 3차 투약 후, SBA 반응률은 89.5% 내지 92.0% 범위였다. 서브패밀리 B 균주 2 변이체의 경우, 2차 투약 후, SBA 반응률을 가진 대상체의 비율은 21.1% 내지 33.3% 범위였다. 그러나, 3차 투약 후, 60 ㎍, 120 ㎍, 및 200 ㎍의 용량 수준에서 각각 53.3%, 75.6%, 및 67.9%의 대상체가 SBA 반응을 하였다. 서브패밀리 B 균주 3 변이체의 경우, 2차 투약 후, SBA 반응률은 61.9% 내지 70.8% 범위였고, 3차 투약 후에는 76.2% 내지 88.7% 범위였다.

전반적으로, 시험된 서브패밀리 A 또는 서브패밀리 B 균주와는 상관없이 높은 비율의 대상체가 ≥LLOQ인 SBA 역가로 반응하였다. hSBA 데이터를 통해 용량과 반응 사이의 어떤 밀접한 관계없이 60 ㎍ 내지 200 ㎍의 용량에서 완건한 면역 반응이 있는 것으로 나타났다. 조사된 분석과는 상관없이 반응 빈도는 수치상으로 120 ㎍ 군에서 가장 높았다. 200 ㎍ 군은 120 ㎍ 용량 수준에 비하여 개선된 면역 반응을 갖지는 못했다.

Claims

LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능이 시간이 경과함에 따라 안정하도록 제제화된 LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
10:1 미만인 디터전트 대 단백질의 몰비로 디터전트 및 LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드 효능의 50% 이상이 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 42개월, 48개월, 54개월, 또는 60개월 이상 동안 유지되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 디터전트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 0.5:1 내지 약 10:1인 면역원성 조성물.
제6항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1:1 내지 약 5:1인 면역원성 조성물.
제7항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1.4:1 내지 약 4.2:1인 면역원성 조성물.
제8항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 2.8:1인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트의 양이 용기 중에서 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양인 면역원성 조성물.
제10항에 있어서, 용기가 시린지 또는 바이알인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트가 비-이온성 디터전트인 면역원성 조성물.
제12항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 디터전트인 면역원성 조성물.
제13항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 80인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제15항에 있어서, 다가 양이온이 칼슘 또는 알루미늄인 면역원성 조성물.
제16항에 있어서, (Ca)₃(PO₄)₂를 포함하는 면역원성 조성물.
제16항에 있어서, 알루미늄의 농도가 약 0.1 mg/ml 내지 약 1 mg/ml인 면역원성 조성물.
제18항에 있어서, 알루미늄의 농도가 약 0.5 mg/ml인 면역원성 조성물.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 알룸 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제21항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 2 mM 내지 약 20 mM인 면역원성 조성물.
제22항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 5 mM 내지 약 15 mM인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 숙시네이트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제24항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 2 mM 내지 약 10 mM인 면역원성 조성물.
제25항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 3 mM 내지 약 7 mM인 면역원성 조성물.
제25항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 5 mM인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 면역원성 조성물.
제28항에 있어서, pH가 약 5.8 내지 6.0인 면역원성 조성물.
제29항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 10 mM (pH 6.0)인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 면역원성 조성물.
제31항에 있어서, 동결건조된 조성물이 알루미늄을 포함하는 완충제 중에 재현탁되어 있는 것인 면역원성 조성물.
제32항에 있어서, 완충제가 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 알룸을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl을 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 본질적으로 200 ug/mL rLP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl을 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 본질적으로 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 본질적으로 200 ug/mL rLP2086 (fHBP) 서브패밀리 A 폴리펩티드, 200 ug/mL LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드, 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 면역원성 조성물.
(a) 약 0.5:1 내지 약 10:1의 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 조성물 중에 LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드를 제제화하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 중에서 LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능을 안정화시키는 방법.
제40항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1:1 내지 약 5:1인 방법.
제41항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1.4:1 내지 약 4.2:1인 방법.
제42항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 2.8:1인 방법.
제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트의 양이 용기 중에서 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양인 방법.
제44항에 있어서, 용기가 시린지 또는 바이알인 방법.
제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트가 비-이온성 디터전트인 방법.
제46항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 디터전트인 방법.
제47항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 80인 방법.
제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 다가 양이온을 추가로 포함하는 것인 방법.
제49항에 있어서, 다가 양이온이 칼슘 또는 알루미늄인 방법.
제50항에 있어서, 조성물이 (Ca)₃(PO₄)₂를 포함하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 알루미늄의 농도가 약 0.1 mg/ml 내지 약 1 mg/ml인 방법.
제52항에 있어서, 알루미늄의 농도가 약 0.5 mg/ml인 방법.
제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 알룸을 포함하는 것인 방법.
제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘을 추가로 포함하는 방법.
제55항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 2 mM 내지 약 20 mM인 방법.
제56항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 5 mM 내지 약 15 mM인 방법.
제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 숙시네이트를 추가로 포함하는 방법.
제58항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 2 mM 내지 약 10 mM인 방법.
제59항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 3 mM 내지 약 7 mM인 방법.
제40항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 방법.
제61항에 있어서, pH가 약 5.8 내지 6.0인 방법.
제62항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 10 mM (pH 6.0)인 방법.
제62항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 5 mM (pH 6.0)인 방법.
제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 면역원성 조성물을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제65항에 있어서, (c) 동결건조된 조성물을 알루미늄을 포함하는 완충제 중에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제66항에 있어서, 완충제가 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 알룸을 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 서브패밀리 B 단백질이, 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 조성물 중에 제제화되는 것인 방법.
제40항에 있어서, 서브패밀리 B 단백질이, 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 조성물 중에 제제화되는 것인 방법.
(a) LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드를, 약 0.1 mg/ml 내지 약 1 mg/ml의 알루미늄, 및 약 0.5:1 내지 약 10:1의 몰비의 디터전트 대 단백질을 포함하는 조성물 중에 제제화하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 중에서 LP2086 (fHBP) 서브패밀리 B 폴리펩티드의 효능을 안정화시키는 방법.
제70항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1:1 내지 약 5:1인 방법.
제71항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 1.4:1 내지 약 4.2:1인 방법.
제72항에 있어서, 디터전트 대 단백질의 몰비가 약 2.8:1인 방법.
제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트의 양이 용기 중에서 폴리펩티드의 규소에의 결합을 감소시키기에 충분한 양인 방법.
제74항에 있어서, 용기가 시린지 또는 바이알인 방법.
제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 디터전트가 비-이온성 디터전트인 방법.
제76항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 디터전트인 방법.
제77항에 있어서, 디터전트가 폴리소르베이트 80인 방법.
제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 알루미늄의 농도가 약 0.5 mg/ml인 방법.
제70항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 알룸을 포함하는 것인 방법.
제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 히스티딘을 추가로 포함하는 방법.
제81항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 2 mM 내지 약 20 mM인 방법.
제82항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 5 mM 내지 약 15 mM인 방법.
제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 숙시네이트를 추가로 포함하는 방법.
제84항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 2 mM 내지 약 10 mM인 방법.
제85항에 있어서, 숙시네이트의 농도가 약 3 mM 내지 약 7 mM인 방법.
제70항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 방법.
제87항에 있어서, pH가 약 5.8 내지 6.0인 방법.
제88항에 있어서, 히스티딘의 농도가 약 10 mM (pH 6.0)인 방법.
제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 면역원성 조성물을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제90항에 있어서, (c) 동결건조된 조성물을 알루미늄을 포함하는 완충제 중에 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제91항에 있어서, 완충제가 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 알룸을 포함하는 것인 방법.
제70항에 있어서, 서브패밀리 B 단백질이, 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 10 mM 히스티딘 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl로 이루어진 조성물 중에 제제화되는 것인 방법.
제70항에 있어서, 서브패밀리 B 단백질이, 본질적으로 약 2.8:1 몰비의 폴리소르베이트 80 대 단백질, 0.5 mg/mL의 AlPO₄로서의 알루미늄, 5 mM 숙시네이트 (pH 6.0), 및 150 mM NaCl을 포함하는 조성물 중에 제제화되는 것인 방법.
(1) 제1 모노클로날 Ab 및 제2 mAb를, 2086 단백질을 포함하는 면역원성 조성물과 함께 인큐베이션시키는 단계이며, 여기서, 제1 mAb가 상기 mAb를 포획시키는 데 사용되는 제1 태그에 접합되어 있고, 제2 mAb가 검출가능한 제2 태그에 접합되어 있으며, 여기서, 제1 및 제2 mAb가 2086 참조 단백질 상의 상이한 입체형태의 에피토프에 대한 것인 단계; (2) 제1 태그를 사용하여 제1 mAb-결합된 2086 단백질을 포획하는 단계; 및 (3) 포획된 제2 mAb-결합된 2086 단백질을 제2 태그를 사용하여 검출하고 그의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물 중의 2086 (fHBP) 폴리펩티드의 효능을 측정하는 방법.
제95항에 있어서, 제1 태그가 비오틴, GST, 6xHis 태그, 또는 비드인 방법.
제96항에 있어서, 비드가 카르복실화 폴리스티렌 비드 또는 상자성 비드인 방법.
제96항에 있어서, 제1 태그가 스트렙타비딘 비드, 스트렙타비딘 칼럼, 글루타티온 비드, 글루타티온 칼럼, 니켈 비드, 니켈 칼럼, 원심분리로, 또는 자기장으로 포획되는 것인 방법.
제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 태그가 비오틴, HRP, 형광단 또는 방사성표지인 방법.
제99항에 있어서, 제2 태그가 형광단 또는 HRP에 접합된 스트렙타비딘으로, 전기화학발광, 형광 검출, 또는 방사능 검출에 의해 검출되는 것인 방법.
제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 2086 폴리펩티드가 서브패밀리 A 폴리펩티드인 방법.
제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 2086 폴리펩티드가 서브패밀리 B 폴리펩티드인 방법.
제95항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 2086 폴리펩티드가 지질화된 것인 방법.
제95항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 2086 폴리펩티드가 비-지질화된 것인 방법.
제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 2086 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드인 방법.
제95항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두 항체 모두에 의해 인식되는 에피토프를 나타내는 폴리펩티드가 정량화될 수 있는 것인 방법.
제95항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 효능이 참조 물질의 효능과 비교되는 것인 방법.