CN107961367A

CN107961367A - 使免疫原性组合物中的LP2086(fHBP)亚族B多肽的效力稳定化的方法

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Publication number: CN107961367A
Application number: CN201711292342.5A
Authority: CN
Inventors: L·汉德科; R·阿鲁穆加姆; B·劳恩
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: EP4417216A1; MX350142B; RU2013105726A; JP5945538B2; US9556240B2; CN107913396B; CA2808975A1; PL3831406T3; SI3246044T1; FI3831406T3; PL3246044T5; WO2012025873A3; PT2608805T; HUE034544T2; JP2013540705A; EP3831406A1; AU2016201346A1; SI3831406T1; BR112013004236A2; HK1254329A1

Abstract

本发明涉及使免疫原性组合物中的LP2086(fHBP)亚族B多肽的效力稳定化的方法。本发明还涉及保持脑膜炎奈瑟氏菌rLP2086抗原的构象的方法，以及测定脑膜炎奈瑟氏菌rLP2086抗原的效力的方法。

Description

使免疫原性组合物中的LP2086(fHBP)亚族B多肽的效力稳定化的方法

本申请是2011年8月22日提交的发明名称为“脑膜炎萘瑟氏菌rLP2086抗原的稳定制剂”的中国专利申请201180050859.8的分案申请。

技术领域

本发明涉及本文所述的免疫原性组合物形式的脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseriameningitidis)rLP2086亚族B抗原的制剂。本发明还涉及保持脑膜炎奈瑟氏菌rLP2086抗原的构象的方法，以及测定脑膜炎奈瑟氏菌rLP2086抗原的效力的方法。

发明背景

rLP2086是一种诱发针对多种脑膜炎奈瑟氏菌株的交叉反应性细菌抗体的28kDa重组脂蛋白。基于推定的氨基酸序列同源性，鉴定出了两个不同的rLP2086亚族：A和B。这两个亚族用于配制具有不同聚山梨酯80(PS-80)水平的在10mM组氨酸(pH 6.0)、150mM NaCl和0.5mg/mL铝中含有20μg/mL、60μg/mL、120μg/mL和200μg/mL各亚族的MnB-rLP2086疫苗样品。聚山梨酯80也称为TWEEN 80，是一种衍生自山梨醇的非离子型表面活性剂和乳化剂，并且作为乳化剂、增溶剂和稳定剂被频繁用于药物制剂中。聚山梨酯80在MnB rLP2086免疫原性组合物中的存在被认为会阻止在配制、加工、过滤、填充和运输过程中的聚集，减少滤膜吸收，并减少管吸收。

发明概述

在一些实施方案中，本发明提供了一种稳定的免疫原性组合物，其中LP2086亚族B多肽的效力被维持至少约1-12个月、约6-18个月、约12-24个月、约24-36个月或者约36-48个月。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含LP2086亚族A多肽。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5:1至约10:1、约1:1至约5:1或者约1.4:1至4.2:1。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约2.8:1。在一些实施方案中，洗涤剂的量足以减少多肽与容器例如注射器或者小瓶中的硅的结合。在一些实施方案中,所述洗涤剂为非离子型洗涤剂例如聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯-80。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子为钙或者铝。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含磷酸钙。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝或明矾形式的铝。在一些实施方案中，铝的浓度为约0.1mg/mL至1.0mg/mL。在一些实施方案中，铝的浓度为约0.5mg/mL。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含组氨酸。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM至约20mM，或者约5mM至约15mM。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约10mM。在一些实施方案中，组氨酸的pH为约5.0至约8.0，或者约5.8至约6.0。在一些实施方案中,组氨酸的浓度为10mM，pH为6.0。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含琥珀酸盐。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM至约10mM，或者约3mM至约7mM。在一些实施方案中,琥珀酸盐的浓度为约5mM。在一些实施方案中，琥珀酸盐的pH为约5.0至约8.0，或者约5.8至约6.0。在一些实施方案中,琥珀酸盐的浓度为5mM，pH为6.0。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是冻干的。在一些实施方案中，所述冻干组合物被重悬于包含铝的缓冲液中。在一些实施方案中，铝以磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝或明矾的形式存在。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mL rLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mL rLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。

另一方面，本发明提供了一种通过以下方式将免疫原性组合物中的LP2086亚族B多肽的效力稳定化的方法：将LP2086亚族B多肽保存在洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5:1至10:1、约1:1至约5:1或者约1.4:1至约4.2:1的缓冲液中。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约2.8:1。在一些实施方案中，洗涤剂的量足以减少多肽与容器例如注射器或小瓶中的硅的结合。在一些实施方案中，所述洗涤剂为非离子型洗涤剂，例如聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯-80。

在一些实施方案中，所述缓冲液还包含多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子为钙或铝。在一些实施方案中，所述缓冲液包含磷酸钙。在一些实施方案中，所述缓冲液包含磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝或明矾形式的铝。在一些实施方案中，铝的浓度为约0.1mg/mL至1.0mg/mL。在一些实施方案中，铝的浓度为约0.5mg/mL。

在一些实施方案中，所述缓冲液还包含组氨酸。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM至约20mM或约5mM至约15mM。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约10mM。在一些实施方案中，组氨酸的pH为约5.0至约8.0或约5.8至约6.0。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为10mM，pH为6.0。

在一些实施方案中，所述缓冲液还包含琥珀酸盐。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM至约10mM或约3mM至约7mM。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约5mM。在一些实施方案中，琥珀酸盐的pH为约5.0至约8.0或约5.8至约6.0。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为10mM，pH为6.0。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物是冻干的。在一些实施方案中，所述冻干组合物被重悬于包含铝的缓冲液中。在一些实施方案中，所述铝以磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝或明矾的形式存在。

在一些实施方案中，所述缓冲液基本由与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mMNaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mLLP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。

在一些实施方案中，所述缓冲液基本由与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mLLP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。

在另一方面，本发明提供了一种通过下述方式将免疫原性组合物中的LP2086亚族A多肽和LP2086亚族B多肽的效力稳定化的方法：将所述LP2086亚族A多肽和所述LP2086亚族B多肽保存在含有约0.1mg/mL至约10mg/mL的铝并且洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5:1至10:1的缓冲液中。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1:1至约5:1，或约1.4:1至约4.2:1。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约2.8:1。在一些实施方案中，洗涤剂的量足以减少多肽与容器例如注射器或小瓶中的硅的结合。在一些实施方案中，所述洗涤剂为非离子型洗涤剂，例如聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，所述铝以磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝或明矾的形式存在。在一些实施方案中，铝的浓度为约0.5mg/mL。

在一些实施方案中，所述缓冲液基本由与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mMNaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mLLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mMpH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。

在一些实施方案中，所述缓冲液基本由与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本由200ug/mLLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mMpH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。

另一方面，本发明提供了一种测定rLP2086亚族A多肽和/或rLP2086亚族B多肽的效力的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使识别各亚族蛋白质上的构象表位的第一和第二功能性单克隆抗体与所述免疫原性组合物结合，并(b)对与所述多肽结合的抗体进行定量。在一些实施方案中，所述定量通过电化学发光进行。在一些实施方案中，对呈现出被两种抗体识别的表位的多肽进行定量。在一些实施方案中，将所述第一抗体与某种标记例如生物素缀合。在一些实施方案中，由与缀合标记例如链霉亲和素珠或者链霉亲和素柱结合的化合物分离所述第一抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体与定量标记结合。在一些实施方案中，将免疫原性组合物的效力与参照物质的效力相比较。

附图简述

图1：具有不同聚山梨酯80浓度的制剂中的亚族B的稳定性。

图2：具有不同聚山梨酯80浓度的亚族B的加速稳定性。

图3：200μg/mL的亚族B在28天内的效力。

图4：20μg/mL的亚族B在28天内的效力。

图5：具有不同摩尔比的200μg/mL的效力结果。

图6：具有不同摩尔比的20μg/mL的效力结果。

图7：蛋白质与磷酸铝在pH 6.5下的结合。

图8：作为pH的函数的MnB rLP2086亚族A和B的结合。

图9：pH、缓冲液和蛋白质浓度对rLP2086亚族A和B的结合的影响。

图10：不含磷酸铝的rLP2086制剂的外观。

图11：对于2-8℃的外观样品的OD测量。

图12：含和不含AlPO₄的制剂的亚族A的效力结果。

图13：含和不含AlPO₄的制剂的亚族B的效力结果。

图14：含有0.5mg/mL铝的rLP2086安慰剂中的聚山梨酯80结果。

图15：亚族A的聚山梨酯80结果。

图16：亚族B的聚山梨酯80结果。

图17：亚族B的效力与结合摩尔比(bound molar ratio)的相关性。

图18：亚族A的摩尔比结果。

图19：亚族B的摩尔比结果。

图20：400μg/mL的rLP2086制剂的摩尔比结果。

图21：不同时间点的rLP2086药品的聚山梨酯80结果。

图22：不同时间点的rLP2086药品的结合摩尔比结果。

图23：亚族A的效力和结合摩尔比结果。

图24：亚族B的效力和结合摩尔比结果。

图25：亚族A与AlPO₄在琥珀酸盐和组氨酸缓冲液中的结合。

图26：亚族B与AlPO₄在琥珀酸盐和组氨酸缓冲液中的结合。

图27：琥珀酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲液中的结合比较。

图28：亚族A与AlPO₄的pH依赖性结合。

图29：亚族B与AlPO₄的pH依赖性结合。

发明详述

除非另外限定，本文所用的全部科技术语均具有本发明所属技术领域的常规技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料均可用于实施或者测试本发明，但是下文还是描述了合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅作示例，而并非意图进行限制。本文所提及的所有出版物、专利和其他文献均全文援引加入本文。

在通篇说明书中，词语“包含”或其变化形式例如“包括”或者“含有”会被理解为暗示包含所提及的整数或者整数组，但不排除任何其他整数或者整数组。

定义

除非上下文中另外明确指明，本文所用的单数英文形式“a”、“an”和“the”包括复数指代对象。因此，例如在提及“所述方法”时，包括一种或者多种本文描述的以及/或者本领域普通技术人员在阅读本发明时会明了的方法和/或步骤类型等。

除非上下文中另外明确指明，本文所使用的复数形式包括单数指代对象。因此，例如在提及“所述方法”时，包括一种或者多种本文描述的以及/或者本领域普通技术人员在阅读本发明时会明了的方法和/或步骤类型等。

本文所使用的“约”意为在有统计学意义的数值范围以内，例如述及的浓度范围、时间范围(time frame)、分子量、温度或pH。这样的范围可以在给定数值或者范围的一个数量级以内，通常在20％以内，更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”涵盖的允许变化(allowable variation)会取决于所研究的具体系统，并且可为本领域普通技术人员所容易地理解。每当在本申请中述及某个范围时，该范围以内的每一个整数也被认为是本发明的一个实施方案。

术语“佐剂”是指增强对如本文进一步描述和示例的抗原的免疫应答的化合物或混合物。可用于本发明的疫苗中的佐剂的非限制性示例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton，Mont.)、明矾、矿物凝胶例如氢氧化铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge BiotechInc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、佐剂、皂苷、Quil A或其他皂苷成分、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)和阿夫立定脂质-胺佐剂(Avridine lipid-amine adjuvant)。

术语“铝与蛋白质的结合”是指组合物中与铝结合的蛋白质分子的百分比。铝与蛋白质的结合可使用本文公开的方法或者本领域已知的方法测定。

本文所使用的术语“有效免疫原性量(effective immunogenic amount)”是指在脊椎动物宿主中有效引发免疫应答的多肽或者包含多肽的组合物的量。例如，有效免疫原性量的本发明的rLP2086蛋白质是在脊椎动物宿主中有效引发免疫应答的量。具体的“有效免疫原性剂量或者量”会取决于宿主的年龄、体重和医疗情况，并且还取决于给药方法。合适的剂量很容易由本领域技术人员确定。

本文所使用的术语“摩尔比”是指组合物中两个不同成分的摩尔数之比。在一些实施方案中，摩尔比是洗涤剂的摩尔数与蛋白质的摩尔数之比。在一些实施方案中，摩尔比是聚山梨酯80的摩尔数与蛋白质的摩尔数之比。基于蛋白质和聚山梨酯80的浓度，使用以下等式计算摩尔比：

例如，包含0.01％的聚山梨酯80和200μg蛋白质的组合物的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为10.8:1[(0.01/0.2)x 216]。3摩尔聚山梨酯80与2摩尔蛋白质之比可表示为PS80与蛋白质的摩尔比为3:2。另外，如果摩尔比被表述为一个单独的数，则它是指该单独的数与1之比。例如，0.5、2和10的聚山梨酯80与蛋白质之比分别指0.5:1、2:1和10:1的比率。本文所使用的术语“洗涤剂与蛋白质”的摩尔比和“聚山梨酯80与蛋白质”的摩尔比通常是指洗涤剂(或聚山梨酯80)与蛋白质抗原(特别是P2086抗原)的摩尔比。基于本文公开的教导，本领域技术人员能够确定如何计算其他洗涤剂的摩尔比以及含有其他洗涤剂的制剂的最佳摩尔比。本文所使用的“低”摩尔比通常是指免疫原性组合物中低于“高”摩尔比的洗涤剂与蛋白质抗原的摩尔比。“高”摩尔比通常指免疫原性组合物中高于“低”摩尔比的洗涤剂与蛋白质抗原的摩尔比。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的“高摩尔比”是指高于10:1的摩尔比。在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的“低摩尔比”是指0.5:1至10:1摩尔比。

本文使用的术语“ORF2086”是指来源于奈瑟氏菌(Neisseria)种细菌的可译框2086。奈瑟氏菌ORF2086、由其编码的蛋白质、那些蛋白质的片段以及包含这些蛋白质的免疫原性组合物是本领域已知的，并且记载于例如美国专利申请公开文本US 20060257413和US 20090202593(其各自全文援引加入本文)。术语“P2086”通常指由ORF2086编码的蛋白质。本发明的P2086蛋白质可以是脂质化的(lipidated)或者非脂质化的。通常，“LP2086”和“P2086”分别指脂质化和非脂质化形式的2086蛋白质。本发明的P2086蛋白质可以是重组的。通常，“rLP2086”和“rP2086”分别指脂质化和非脂质化形式的重组2086蛋白质。

本文使用的术语“药学可接受的载体”旨在包括任一和全部与对人或者其他脊椎动物宿主给药相容的溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，药学可接受的载体是联邦政府、州政府的管理机构或者其他管理机构许可的，或者美国药典或其他普遍被认可的药典列出的用于动物(包括人以及非人哺乳动物)的载体。术语“载体”是指与所述药物组合物一起给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油。水、盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液可用作液体载体、特别是注射用溶液的液体载体。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可包含少量的润湿剂、填充剂、乳化剂或pH缓冲液。这些组合物可以为溶液剂、混悬剂、乳剂、缓释制剂等形式。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin著的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。所述制剂应适合给药模式。合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且会大大地取决于给药途径。

术语“效力”是指抗原引发免疫原应答的能力。在一些实施方案中，通过表位与抗体结合的能力测量效力。由于抗原或表位完整性的丧失，或者抗原或表位构象的改变，效力可能会随时间推移而丧失或者减少。效力可因为以下因素而丧失或者减少，所述因素包括但不限于：光、温度、冻融循环、搅拌和pH。可通过本文公开的方法以及本领域已知的测试来测量效力。这样的效力测定测试包括但不限于动物接种模型、血清杀菌测试(SBA)、流式细胞术和体外效力测试。优选的用于测定效力的方法是SBA和体外效力测试。更优选的用于测定效力的方法是SBA。在一些实施方案中，可使用针对至少一种参与免疫应答的表位的至少一种单克隆抗体来测定效力。在一些实施方案中，将测试样品的效力与参照标准品的效力相比较。在一些实施方案中，参照标准品是T₀时的测试样品。在一些实施方案中，参照标准品是没有洗涤剂的免疫原性组合物。在一些实施方案中，参照标准品是洗涤剂与蛋白质的摩尔比高于10:1的免疫原性组合物。

“保护性”免疫应答是指免疫原性组合物引发免疫应答(包括体液介导的和细胞介导的免疫应答)的能力，其起到保护个体免于感染的作用。如果与对照个体群(例如没有给药该疫苗或者免疫原性组合物的受感染动物)相比，有统计学上显著的改进，则所提供的保护不必是绝对的，即感染不必被完全地预防或者消除。保护可以局限于缓解感染症状发作的严重度或者速度。通常，“保护性免疫应答”包括在至少50％的个体中引发对特定抗原具有特异性的抗体水平(包括针对每一抗原的一些可测量的功能性抗体应答水平)的增加。在具体情形下，“保护性免疫应答”可以包括在至少50％的个体中引发对特定抗原具有特异性的抗体水平(包括针对每一抗原的一些可测量的功能性抗体应答水平)的二倍或者四倍的增加。在某些实施方案中，调理素化(opsonizing)抗体与保护性免疫应答相关。因此，可以通过在调理吞噬测试(例如下文描述的那些测试)中测量细菌计数的下降百分比来测试保护性免疫应答。在一些实施方案中，与不存在免疫原性组合物下的细菌计数相比，细菌计数有至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的下降。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”是指氨基酸残基的聚合物，并且对该产品的最短长度没有限制。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等均包括在该定义内。全长蛋白质及其片段两者均包括在该定义内。该术语还包括对天然序列的修饰例如缺失、添加和置换(通常在性质上是保守性的，但也可以是非保守性的)，优选使得所述蛋白质在其所给药的动物中保持引发免疫应答的能力。同样还包括表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、脂质化、磷酰化等。

本文使用的术语“重组体”是指通过基因工程方法产生的任意蛋白质、多肽或表达目标基因的细胞。就蛋白质或多肽而言，所用的术语“重组体”是指通过表达重组多核苷酸产生的多肽。本发明的蛋白质可以自天然来源分离获得，也可以通过基因工程方法产生。本文使用的“重组体”还描述这样的核酸分子，即：由于其来源或者操作，该核酸分子与在自然界与之相关的全部或者部分的多核苷酸不相关。就宿主细胞而言，所用的术语“重组体”是指包含重组多核苷酸的宿主细胞。

术语“稳定的”和“稳定性”是指抗原在一段时间内维持免疫原性的能力。可以测量效力随时间的稳定性。术语“稳定的”和“稳定性”还指免疫原性组合物的物理、化学和构象稳定性。蛋白质组合物的不稳定性可能由以下原因所致：该蛋白质分子发生化学降解或者聚集以形成更高级的聚合物；异二聚体解离成单体；去糖基化；糖基化修饰；或者降低本发明包括的蛋白质组合物的至少一种生物学活性的任意其他结构上的修饰。可以通过本领域公知的方法评估稳定性，包括测量样品的光散射、光的视衰减(apparent attenuation)(吸光度或光密度)、尺寸(例如通过尺寸排阻色谱法)、体外或者体内生物学活性和/或性质(通过差示扫描量热法(DSC))。其他评估稳定性的方法也是本领域已知的，并且也可以根据本发明使用。

在一些实施方案中，与参照标准品相比，本发明的稳定制剂中的抗原可以在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月、54个月或60个月内维持至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的效力。在一些实施方案中，与参照标准品相比，本发明的稳定制剂中的抗原可以在至少1年、2年、3年、4年或5年内维持至少50％的效力。术语“稳定的”和“稳定性”还指抗原在一段时间内维持表位或者免疫反应性的能力。例如，与参照标准品相比，本发明的稳定制剂中的抗原可以在至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月、54个月或60个月内维持其至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的表位或者免疫反应性。在一些实施方案中，根据环境条件测量稳定性。环境条件的非限制性实例包括光、温度、冻融循环、搅拌和pH。本领域技术人员使用本文公开的方法或者本领域已知的其他方法能够确定抗原性表位或免疫反应性的存在。参见McNeil等人，Vaccine,27:3417-3421(2009)。在一些实施方案中，自抗原的配制之日测量其稳定性。在一些实施方案中，自抗原的保存条件改变之日测量其稳定性。保存条件改变的非限制性实例包括从冷冻变为冷藏、从冷冻变为室温、从冷藏变为室温、从冷藏变为冷冻、从室温变为冷冻、从室温变为冷藏、从有光变为无光或者引入搅拌。

术语“稳定剂”是指与抗原结合并在一段时间内维持该抗原的表位或免疫反应性的化合物。稳定剂是本领域已知的。稳定剂的实例包括多价阳离子，例如钙或铝。

术语“个体”是指哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物类或任意其他动物。术语“个体”还包括人类。术语“个体”还包括家养宠物。家养宠物的非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、龟和蛙。术语“个体”还包括畜养动物。畜养动物的非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、骆马、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅和火鸡。

术语“疫苗”或“疫苗组合物”互换使用，是指包含至少一种在个体中诱导免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。

一般性描述

本发明是基于以下新发现而作出的：rLP2086亚族B抗原而非rLP2086亚族A抗原在二价疫苗制剂中随时间推移而失去效力，因此不稳定。通过改变该二价制剂中的组分，确定在所述二价疫苗制剂中，洗涤剂与蛋白质的高摩尔比导致rLP2086亚族B抗原特异的不稳定性。降低二价和单价制剂中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比在不影响rLP2086亚族A抗原的稳定性的情况下导致rLP2086亚族B抗原的稳定性增加(通过效力随时间的维持而测定)。这一结果是令人惊讶的，因为脂蛋白通常是使用高洗涤剂浓度来纯化和保存的，目的是防止其疏水脂质部分的聚集。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种包含rLP2086亚族B抗原和与蛋白质低摩尔比的洗涤剂的免疫原性组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种维持免疫原性组合物中的rLP2086亚族B抗原的稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：将所述rLP2086亚族B抗原保存在包含与蛋白质低摩尔比的洗涤剂的缓冲液中。

进一步研究表明，低摩尔比的制剂导致在搅拌该低摩尔比的免疫原性组合物时，使rLP2086亚族A和B抗原聚集。但是，增加低摩尔比的组合物中的铝浓度防止rLP2086亚族A和B抗原的聚集，即便是在搅拌的情况下也是如此。另外，在不存在铝的情况下，rLP2086亚族A抗原对低洗涤剂摩尔比的影响更为敏感。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含rLP2086亚族A抗原、rLP2086亚族B抗原、高浓度的铝和与蛋白质低摩尔比的洗涤剂。在一些实施方案中，本发明提供维持免疫原性组合物中的rLP2086亚族A抗原和rLP2086亚族B抗原的稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：将所述rLP2086亚族A抗原和rLP2086亚族B抗原保存在包含高浓度的铝和与蛋白质低摩尔比的洗涤剂的缓冲液中。

免疫原性组合物

包含由脑膜炎萘瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的蛋白质的免疫原性组合物是本领域已知的。示例性免疫原性组合物包括在美国专利申请公开文本US 20060257413和US20090202593中公开的那些，这两份文本全文援引加入本文。其中描述的这样的免疫原性组合物包含被称为ORF2086蛋白质的表现出杀菌活性的蛋白质、其免疫原性部分和/或其生物学等价物。所述ORF2086蛋白质是指由奈瑟氏菌种的可译框2086编码的蛋白质。

该蛋白质可以是重组蛋白质，或者从天然奈瑟氏菌种分离的蛋白质。例如，奈瑟氏菌ORF2086蛋白质可以分离自细菌菌株，例如奈瑟氏菌种的那些菌株，包括脑膜炎萘瑟氏菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)的菌株，以及所述蛋白质的免疫原性部分和/或生物学等价物。

ORF2086蛋白质包括2086亚族A蛋白质和亚族B蛋白质、其免疫原性部分和/或其生物学等价物。ORF2086蛋白质或其等价物等可以是脂质化或者非脂质化的。优选地，奈瑟氏菌ORF2086蛋白质是脂质化的。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含与由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的分离蛋白质。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含与由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族A蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的分离蛋白质。优选地，所述免疫原性组合物包含由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的分离亚族A蛋白质。

在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含与由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族B蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的分离蛋白质。优选地，所述免疫原性组合物包含由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的分离亚族B蛋白质。在一些实施方案中，所述ORF2086亚族B蛋白质是B01变体。

在又一实施方案中，所述免疫原性组合物包含与由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族A蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的分离蛋白质，以及与由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族B蛋白质具有至少95％氨基酸序列同一性的分离蛋白质。优选地，所述免疫原性组合物包含由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族A蛋白质和由来自奈瑟氏菌ORF2086的核苷酸序列编码的亚族B蛋白质。

在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含比率为1:1的亚族A蛋白质与亚族B蛋白质。

所述免疫原性组合物可以包含由来自奈瑟氏菌ORF2086、多核苷酸或其等价物的核苷酸序列编码的蛋白质，作为所述免疫原性组合物中唯一的活性免疫原。或者，所述免疫原性组合物还可以包含活性免疫原，包括其他奈瑟氏菌种的免疫原性多肽或者一个或者多个其他微生物病原体(如病毒、朊病毒、细菌或真菌，但不限于此)的免疫活性蛋白质，或者荚膜多糖。针对所选适应症的需要，该组合物可以包含一种或者所需蛋白质、片段或者药物化合物。

本发明包括任意多抗原或多价免疫原性组合物。例如，所述免疫原性组合物可以包含两种或者多种ORF2086蛋白质的组合、ORF2086蛋白质与一种或者多种Por A蛋白质的组合、ORF2086蛋白质与脑膜炎球菌(meningococcus)血清群A、C、Y和W135多糖和/或多糖缀合物的组合、ORF2086蛋白质与脑膜炎球菌和肺炎球菌(pneumococcus)组合的组合，或者其形式适合所需给药(如用于粘膜递送)的任一前述组合的组合。本领域技术人员能够容易地配制这样的多抗原或者多价免疫组合物。

本发明还包括多重免疫(multi-immunization)方案，其中任何用于对抗病原体的组合物均可联合于其中，或者与本发明的组合物联合。例如但非限制地，可以向患者给药本发明的免疫原性组合物和用于对人乳头瘤病毒(HPV)免疫的另一免疫学组合物(例如HPV疫苗)，作为多免疫方案的一部分。本领域技术人员能够容易地选择与本发明的免疫原性组合物联合使用的免疫原性组合物，以开发和实施多免疫方案。

ORF2086多肽、片段和等价物可以用作缀合免疫原性组合物的一部分，其中一种或者多种蛋白质或多肽与载体缀合，以生成对数个血清型和/或数种疾病具有免疫原性的组合物。或者，可以将ORF2086多肽之一用作其他免疫原性多肽的载体蛋白质。这样的免疫原性组合物的制剂是本领域技术人员所熟知的。

本发明的免疫原性组合物优选包含药学可接受的载体。合适的药学可接受的载体和/或稀释剂包括任一和全部的常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包覆剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等等。合适的药学可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或者多种，以及它们的组合。

药学可接受的载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂、乳化剂，防腐剂或缓冲剂，它们会延长抗体的保质期或有效性。药学可接受的载体的制备和使用为本领域所熟知。除非到了任何常规介质或试剂与活性成分不相容的程度，否则就考虑在本发明的免疫原性组合物中使用它们。

免疫原性组合物可以经由肠胃外(例如通过注射(皮下或者肌内))以及口服或鼻内给药。肌内免疫的方法描述于Wolff等人的Biotechniques；11(4):474-85,(1991)和Sedegah等人的PNAS Vol.91，pp.9866-9870,(1994)中。例如，其他给药模式采用口服制剂、肺用制剂、栓剂和经皮施用，但不限于此。例如，口服制剂包括这样的常用赋形剂，例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等，但不限于此。优选地，所述免疫原性组合物经肌内给药。

本发明的免疫原性组合物可以包含一种或者多种佐剂。示例性佐剂包括但不限于氢氧化铝；磷酸铝；STIMULON^TMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham，Mass.)；MPL^TM(3-O-脱酰的单磷酰脂质A；Corixa,Hamilton,Mont.)、529(一种氨基烷基葡糖胺磷酸化合物，Corixa,Hamilton,Mont.)、IL-12(Genetics Institute,Cambridge,Mass.)；GM-CSF(Immunex Corp.,Seattle,Wash.)；N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰(theronyl)-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine,CGP 11637，被称为正-MDP)；N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基-乙胺)(CGP 19835A，被称为MTP-PE)；和霍乱毒素。在某些优选的实施方案中，所述佐剂是QS-21。

其他的示例性佐剂包括霍乱毒素的无毒衍生物，包括其A亚基，和/或脑膜炎萘瑟氏菌多肽与霍乱毒素或其B亚基(“CTB”)的缀合物或基因工程化融合物、类霍乱原前体(procholeragenoid)、真菌多糖(包括裂裥菌素)、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波酯、大肠杆菌(E.coli)的不耐热毒素、嵌段聚合物或皂苷。

磷酸铝在1期临床试验中已被用作佐剂，其浓度为0.125mg/剂，远低于美国联邦法规[610.15(a)]规定的限值，即0.85mg/剂。含铝佐剂广泛用于人中，以在肌内或皮下给药时增强抗原的免疫应答。

在某些优选的实施方案中，本发明的蛋白质用于供口服给药的包含粘膜佐剂的免疫原性组合物，并且用于治疗或预防人宿主中的脑膜炎奈瑟氏菌感染。该粘膜佐剂可以是霍乱毒素，但是，优选地，可根据本发明使用的除了霍乱毒素之外的其他粘膜佐剂包括霍乱全毒素的无毒衍生物，其中A亚基是经诱变的、化学修饰的霍乱毒素，或者通过修饰霍乱毒素的氨基酸序列而产生的相关蛋白质。对于可以特别用于制备本发明的免疫原性组合物的特定的霍乱毒素，参见公开于公布的国际申请WO 00/18434(全文援引加入本文)中的突变霍乱全毒素E29H。这些物质可以添加到本发明的多肽中或者与之缀合。相同的技术可以应用于具有粘膜佐剂或递送性质的其他分子，例如大肠杆菌不耐热毒素(LT)。可以使用其他具有粘膜佐剂或递送活性的化合物，例如胆汁；聚阳离子例如DEAE-葡聚糖和多鸟氨酸；洗涤剂例如十二烷基苯磺酸钠；脂质缀合的材料；抗生素例如链霉素；维生素A；和改变粘膜表面的结构或功能完整性的其他化合物。其他具有粘膜活性的化合物包括微生物结构的衍生物，例如MDP、吖啶和西咪替丁。如上所述，还可以使用STIMULON^TMQS-21、MPL和IL-12。

本发明的免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)、含有CTB的ISCOMS、脂质体的形式递送，或者包封在诸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-乙交酯)的化合物中，以形成尺寸适合吸收的微球。还可以将本发明的蛋白质掺入油性乳液中。

向患者给药的免疫原性组合物的量(即剂量)可以依据本领域普通技术人员已知的标准技术确定，同时考虑诸如具体的抗原、佐剂(如果存在)、具体患者的年龄、性别、体重、物种、身体状况以及给药途径等因素。

例如，针对青年患者的剂量可以包含至少0.1μg、1μg、10μg或50μg的奈瑟氏菌ORF2086蛋白质和至多80μg、100μg、150μg或200μg的奈瑟氏菌ORF2086蛋白质。可结合任一最小值和任一最大值以限定合适的范围。

体外效力测试

通过使用针对rLP2086参照物质的构象特异的单克隆抗体对免疫原性组合物中的亚族A和亚族B蛋白质中的功能性表位进行定量，从而测定效力。通过对会在体内引发免疫应答从而产生杀菌抗体的亚族A或亚族BrLP2086蛋白质中的功能性表位进行定量测量，从而测定效力。使用所选的单克隆抗体(mAb)来将定量技术用于效力测试。对于免疫原性组合物中的各亚族rLP2086蛋白质而言，选出构象的和非重叠的两种功能性单克隆抗体。在这两种纯化的单克隆抗体中，第一抗体与第一标记缀合，其中所述第一标记用于俘获rLP2086蛋白质分子。在一些实施方案中，所述第一标记是生物素、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、6×His标记或珠(例如羧化聚苯乙烯珠或顺磁珠)。在一些实施方案中，用链霉亲和素珠、链霉亲和素柱、镍珠、镍柱、通过离心或用磁场俘获所述第一标记。所述第二抗体与第二标记缀合，其中所述第二标记是可计量的。在一些实施方案中，所述第二标记是生物素、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光团或放射性标记。在一些实施方案中，所述第二标记用与荧光团或HRP缀合的链霉亲和素、通过电化学发光、荧光检测或者放射性检测来进行检测。仅测量各免疫原性组合物中呈现出被所述两种单克隆抗体识别的两个表位的蛋白质。反映所述蛋白质的任一或两个表位的变化。相对于参照物质的效力报道样品的效力。

在一些实施方案中，本发明包括一种测定2086蛋白质的效力的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)将第一单克隆抗体和第二mAb与包含2086蛋白质的免疫原性组合物一起孵育，其中所述第一mAb与用于俘获所述mAb的第一标记缀合，所述第二mAb与可检测的第二标记缀合，并且其中所述第一和第二mAb针对2086参照蛋白质上的不同构象表位；(2)使用所述第一标记俘获与所述第一mAb结合的2086蛋白质；以及(3)使用所述第二标记对俘获的与第二mAb结合的2086蛋白质的量进行检测和定量。在一些实施方案中，所述2086蛋白质是亚族A蛋白质。在一些实施方案中，所述2086蛋白质是亚族B蛋白质。在一些实施方案中，所述2086蛋白质是脂质化的。在一些实施方案中，所述2086蛋白质是非脂质化的。在一些实施方案中，所述2086蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述第一标记是生物素、6xHis标记或珠(如羧化聚苯乙烯珠或顺磁珠)。在一些实施方案中，用链霉亲和素珠、链霉亲和素柱、谷胱甘肽柱、镍珠、镍柱、通过离心或用磁场俘获所述第一标记。在一些实施方案中，所述第二标记是生物素、HRP、荧光团或放射性标记。在一些实施方案中，所述第二标记用与荧光团或HRP缀合的链霉亲和素、通过电化学发光、荧光检测或者放射性检测来进行检测。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含多个2086蛋白质变体。

rLP2086亚族B抗原效力的稳定性

在一些实施方案中，本发明提供了用于使rLP2086亚族B抗原随时间维持稳定的免疫原性组合物，所述组合物包含具有低洗涤剂与蛋白质摩尔比的缓冲液。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5至约10。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1至约5。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1.4至约4.2。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10。在一些实施方案中，所述洗涤剂为非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子为钙或铝。在一些实施方案中，所述铝以AlPO₄、Al(OH)₃、Al₂(SO₄)₃和明矾中的一种或者多种的形式存在。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含约0.1mg/mL至约1mg/mL、约0.25mg/mL至约0.75mg/mL或约0.4mg/mL至约0.6mg/mL的铝。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.25mg/mL、约0.3mg/mL、约0.35mg/mL、约0.4mg/mL、约0.45mg/mL、约0.5mg/mL、约0.55mg/mL、约0.6mg/mL、约0.65mg/mL、约0.7mg/mL、约0.75mg/mL、约0.8mg/mL、约0.85mg/mL、约0.9mg/mL、约0.95mg/mL或约1mg/mL的铝。在一些实施方案中，铝与蛋白质有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的结合。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含含有组氨酸的缓冲液。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM至约20mM、约5mM至约15mM或约8mM至12mM。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含含有琥珀酸盐的缓冲液。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM至约20mM、约2mM至约10mM或约3mM至7mM。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物的pH为约5.0至约8.0、约5.5至约7.0或约5.8至约6.0。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物的pH为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族B蛋白质抗原免疫原性组合物的制剂是10mMpH 6.0的组氨酸缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族B蛋白质抗原免疫原性组合物的制剂是5mMpH 6.0的琥珀酸盐缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，本发明提供了一种使rLP2086亚族B抗原随时间维持稳定的方法，其包括将所述抗原保存在具有低洗涤剂与蛋白质摩尔比的缓冲液中。

在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5至约10。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1至约5。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1.4至约4.2。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10。在一些实施方案中，所述洗涤剂为非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯-80。

在一些实施方案中，缓冲液还包含多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子为钙或铝。在一些实施方案中，所述铝以AlPO₄、Al(OH)₃、Al₂(SO₄)₃和明矾中的一种或者多种的形式存在。在一些实施方案中，缓冲液中的稳定剂为约0.1mg/mL至约1mg/mL、约0.25mg/mL至约0.75mg/mL或约0.4mg/mL至约0.6mg/mL的铝。在一些实施方案中，缓冲液中的稳定剂为约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.25mg/mL、约0.3mg/mL、约0.35mg/mL、约0.4mg/mL、约0.45mg/mL、约0.5mg/mL、约0.55mg/mL、约0.6mg/mL、约0.65mg/mL、约0.7mg/mL、约0.75mg/mL、约0.8mg/mL、约0.85mg/mL，0.9mg/mL、约0.95mg/mL或约1mg/mL的铝。在一些实施方案中，铝与蛋白质有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的结合。

在一些实施方案中，缓冲液还包含组氨酸。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM至约20mM、约5mM至约15mM或约8mM至12mM。在一些实施方案中，组氨酸的浓度为约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

在一些实施方案中，缓冲液还包含琥珀酸盐。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM至约20mM、约2mM至约10mM或约3mM至7mM。在一些实施方案中，琥珀酸盐的浓度为约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM。

在一些实施方案中，缓冲液的pH为约5.0至约8.0、约5.5至约7.0或约5.8至约6.0。在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族B蛋白质抗原保存于其中的缓冲液是10mMpH 6.0的组氨酸缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族B蛋白质抗原保存于其中的缓冲液是5mM pH6.0的琥珀酸盐缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

rLP2086亚族A和B抗原效力的稳定性

在一些实施方案中，本发明提供一种用于使rLP2086亚族A和/或rLP2086亚族B抗原随时间维持稳定的免疫原性组合物，所述组合物包含具有高稳定剂浓度和低洗涤剂与蛋白质摩尔比的缓冲液。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子为钙或铝。在一些实施方案中，所述铝以AlPO₄、Al(OH)₃、Al₂(SO₄)₃和明矾中的一种或者多种的形式存在。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含约0.1mg/mL至约1mg/mL、约0.25mg/mL至约0.75mg/mL或约0.4mg/mL至约0.6mg/mL的铝。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.25mg/mL、约0.3mg/mL、约0.35mg/mL、约0.4mg/mL、约0.45mg/mL、约0.5mg/mL、约0.55mg/mL、约0.6mg/mL、约0.65mg/mL、约0.7mg/mL、约0.75mg/mL、约0.8mg/mL、约0.85mg/mL，0.9mg/mL、约0.95mg/mL或约1mg/mL的铝。在一些实施方案中，铝与蛋白质有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的结合。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族A和B蛋白质抗原的制剂是10mM pH 6.0的组氨酸缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族B蛋白质抗原免疫原性组合物的制剂为5mMpH 6.0的琥珀酸盐缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，本发明提供一种使rLP2086亚族A和/或rLP2086亚族B抗原随时间维持稳定的方法，其包括将所述抗原保存在具有高稳定剂浓度和低洗涤剂与蛋白质摩尔比的缓冲液中。

在一些实施方案中，洗涤剂与蛋白质的摩尔比小于10:1。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5至约10。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1至约5。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约1.4至约4.2。在一些实施方案中，缓冲液中的洗涤剂与蛋白质的摩尔比为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10。在一些实施方案中，所述洗涤剂为非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，缓冲液中的稳定剂是多价阳离子。在一些实施方案中，所述多价阳离子是钙或铝。在一些实施方案中，所述铝以AlPO₄、Al(OH)₃、Al₂(SO₄)₃和明矾中的一种或者多种的形式存在。在一些实施方案中，缓冲液中的稳定剂为约0.1mg/mL至约1mg/mL、约0.25mg/mL至约0.75mg/mL或约0.4mg/mL至约0.6mg/mL的铝。在一些实施方案中，缓冲液中的稳定剂为约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.25mg/mL、约0.3mg/mL、约0.35mg/mL、约0.4mg/mL、约0.45mg/mL、约0.5mg/mL、约0.55mg/mL、约0.6mg/mL、约0.65mg/mL、约0.7mg/mL、约0.75mg/mL、约0.8mg/mL、约0.85mg/mL，0.9mg/mL、约0.95mg/mL，或约1mg/mL的铝。在一些实施方案中，铝与蛋白质有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的结合。

在一些实施方案中，缓冲液的pH为约5.0至约8.0、约5.5至约7.0或约5.8至约6.0。在一些实施方案中，缓冲液的pH为约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族A和B蛋白质抗原保存于其中的缓冲液是10mM pH 6.0的组氨酸缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

在一些实施方案中，MnB rLP2086亚族A和B蛋白质抗原保存于其中的缓冲液是5mMpH 6.0的琥珀酸盐缓冲盐水，其含有0.5mg/mL磷酸铝形式的铝以及与蛋白质的摩尔比为2.8的聚山梨酯80。

为了更好地理解本发明，给出了以下的实施例。这些实施例仅仅出于示例目的，而不应被解释为限制本发明的范围。

本文引用的所有参考文献均援引加入本文。

实施例

实施例1：实验操作

铝结合的测定

将包含铝和至少一种蛋白质抗原的组合物离心，从而使铝沉淀(pelleted)。本领域已知对吸收铝的蛋白质的离心。参见例如Egan等人，vaccine，Vol.27(24):3175-3180(2009)。铝结合蛋白质也发生沉淀，但是非铝结合蛋白质则保留在上清液中。通过Lowry测试来测定上清液和沉淀中的总蛋白质。通过用上清液中的总蛋白质除以加入到组合物中的总蛋白质并乘以100％来计算结合蛋白质的百分比。同样地，通过用上清液中的总蛋白质除以加入到组合物中的总蛋白质并乘以100％来计算未结合蛋白质的百分比。

对于包含亚族A和亚族B抗原两者的组合物，通过离子交换色谱法测定上清液中的各亚族A和B蛋白质浓度。使用强阴离子柱和高盐浓度洗脱剂来分离和洗脱亚族A和B蛋白质。使用设置为激发＝280run和发射＝310run的荧光检测器来检测和定量亚族A和B蛋白质两者。亚族A和亚族B蛋白质在不同的保留时间洗脱，并使用针对rLP2086蛋白质参照物质生成的标准曲线进行定量。通过用上清液中的总蛋白质除以加入到组合物中的总蛋白质并乘以100％来计算未结合蛋白质的百分比。通过从100％中减去未结合蛋白质的百分比来计算结合蛋白质的百分比。

体外效力测试

rLP2086效力测试是一种有赖于两种功能性单克隆抗体的均相俘获测试或者夹心式测试，所述功能性单克隆抗体识别rLP2086药物的单一蛋白质分子上的构象表位和非重叠表位。一种经纯化的单克隆抗体用作俘获抗体(mAb)，其与具有独有的颜色编码的鉴定物的羧化聚苯乙烯珠化学缀合。第二抗体被生物素化，并用作随后被与荧光团R-藻红蛋白缀合的链霉亲和素(SA-PE)结合的检测抗体。Bio-Plex检测仪的流控技术量化各微球及其相关的SA-PE信号。仅通过与珠缀合的抗体、抗原和检测抗体之间的三元复合物的形成来检测来自与微球相关的R-藻红蛋白的荧光信号，并且该信号与rLP2086样品中的功能性表位的数目成比例。一个或者两个表位的改变导致相对于参照标准品的荧光丧失，这表明效力的丧失。

试剂

·与微球缀合(与Luminex MicroPlex Microsphere珠区#12或与珠区#66缀合)的单克隆抗体。

·生物素化的单克隆抗体。

·rLP2086参照物质，亚族A和B，2mg/ml。保存于-70℃。

·rLP2086亚族A和B二价对照

·与R-藻红蛋白缀合的冻干链霉亲和素

缓冲液

·10mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.0

·0.85％w/v盐水中的5％w/v聚山梨酯80(PS-80)。

·基质缓冲液(10mM组氨酸，0.02％聚山梨酯80，150mM NaCl，pH 6.0)。

·测试缓冲液(PBS，pH 7.4，含有0.1％的BSA、0.02％的聚山梨酯80，0.1％的叠氮化物)。

·100×与R-藻红蛋白缀合的链霉亲和素(SA-PE)–打开含有冻干的链霉亲和素、R-藻红蛋白的小瓶，并加入1mL蒸馏水。涡旋直至完全溶解。

操作

将200μL的亚族A蛋白质和200μL的亚族B蛋白质加入600μL的基质缓冲液中，使每个亚族的浓度均为400μg/ml。通过将该储备溶液稀释于测试缓冲液中来生成八个浓度(3333-1.5ng/mL)的标准曲线。

将200μL的二价对照加入800μL的基质缓冲液中，使每个亚族的浓度为400μg/mL。将用于配制100ng/mL、50ng/mL和12.5ng/mL工作浓度的该400μg/mL储备溶液稀释于测试缓冲液中。100ng/mL和12.5ng/mL分别代表高(CH)和低(CH)对照。

将测试样品稀释于基质缓冲液中，使得浓度为400μg/mL。由该400μg/mL储备溶液制备100ng/mL、50ng/mL和12.5ng/mL的工作溶液。

使用2x 10⁵个珠/mL的缀合珠浓度和30μg/mL的检测抗体浓度，在测试缓冲液中制备均相测试混合物。通过将0.4mL的标准品、对照、样品或空白加入2mL的96孔深孔板中来制备样品板。通过加入100μL的测试缓冲液来预先润湿96孔MultiScreen_HTS-BV过滤板的滤器，然后通过真空抽吸来抽出。将25μL制得的均相测试混合物加入96孔板中。将标准品、对照、样品或者空白溶液各25μL加入该96孔过滤板的各孔中。将该板在室温下振摇孵育1小时。

在抗原-抗体孵育之后，通过真空抽吸经滤器除去缓冲液。用100μL的测试缓冲液将每个孔的滤器洗涤三次，然后进行真空抽吸。在最后一次洗涤之后，将50μL的1x SA-PE加入各孔中。将该板于室温下避光在滴定板摇床(titer)上振摇孵育10分钟。

SA-PE孵育之后，将75μL的测试缓冲液加入该板的各孔中，使总体积为125μL。立即在Bio-Plex 200系统上读板。

血清杀菌测试

通过全细胞ELISA预筛选获自Charles River Canada(St.Constant，QC，Canada)的新西兰雌性白兔(2.5–3.0kg)，以鉴定出对两个不同的脑膜炎球菌株(每个P2086亚族一个)反应性低的那些白兔。一般来说，兔具有非常低的本底，并选择使用那些具有最低值的兔。使用单价rLP2086-A05、单价rLP2086-B01或二价r LP2086-A05+B01疫苗在第0、第4和第9周以肌内方式对兔接种。单价疫苗的每一剂包含100μg的蛋白质，并且二价疫苗的每一剂包含100μg的各蛋白质，它们被配制于10mM pH 6.0的组氨酸缓冲液、150mM NaCl、0.02％聚山梨酯80和250μg AlPO₄中。将该疫苗肌内注射至右后肢(0.5ml/剂)。作为对照，将一组兔仅以配制缓冲液接种。获得了供分析的免疫前(第0周)和免疫(第10周)血清样品。所有的动物操作均遵照已经制定的实验动物护理和使用委员会的指导。

使用SBA和人补体来测定用rLP2086疫苗免疫的兔中的血清杀菌抗体。将兔免疫血清热灭活，以除去固有的补体活性，随后在96孔微滴定板中以1:2连续稀释于含有Ca²⁺和Mg² ⁺的Dulbecco’s PBS(D-PBS)中，以检测对脑膜炎奈瑟氏菌株的血清杀菌活性。在本测试中使用的细菌在补充有Kellogg添加物的GC培养基(GCK)中生长，并通过650nm的光密度监控。收集最终的OD₆₅₀为0.50-0.55的细菌用于本测试中，将该细菌稀释于D-PBS中，并将1000-3000CFU加如至含有20％人补体的测试混合物中。

将不具有可检测杀菌活性的人血清用作外源性补体源。测试补体源对各检测菌株的适用性。仅在没有加入免疫血清的对照中存活的细菌数>75％的情况下使用补体源。需要加入十种独特的补体源来进行本研究中描述的SBA。

在37℃以5％CO₂孵育30分钟后，将D-PBS加入反应混合物中，并将等分试样转移到装有50％GCK培养基的微量过滤板中。过滤该微量过滤板，将其在37℃以5％CO₂孵育过夜，并将小菌落染色和定量。血清杀菌效价被定义为：与没有免疫血清的对照孔中的CFU相比，CFU减少50％的内插血清稀释度的倒数(interpolated reciprocal serum dilution)。SBA效价被定义为：于37℃孵育30分钟后引起细菌计数50％减少的测试血清的内插稀释度的倒数。如果P2086免疫血清的SBA效价相对于相应免疫前血清具有4倍或者大于4倍的升高，则确定对P2086免疫血清杀伤的敏感性。兔血清的检测限是效价为8。为在初始稀释度下对测试菌株没有作用的血清指定测试检测限的一半的效价(即，对于兔为4)。

流式细胞术

使MnB细胞生长至OD₆₅₀为0.45-0.55，随后将其在1×PBS中的1％(v/v)多聚甲醛中固定10分钟。将一百微升/孔的细菌接种至96孔U底聚苯乙烯板，离心，并用1×PBS中的1％(w/v)BSA洗涤一次。将抗-LP2086单克隆抗体加入该细菌沉淀中，使其重悬并在冰上孵育30分钟。在1％BSA/PBS中洗涤两次后，将生物素化的山羊抗小鼠IgG(子类1+2a+2b+3)(Jackson Immunoresearch)加入该细胞沉淀中，使其重悬并在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤两次，重悬于链霉亲和素-PE(BD Biosciences)中，并在冰上孵育30分钟。在1％BSA/PBS中洗涤两次后，将细胞沉淀重悬于1％多聚甲醛中。引入小鼠IgG作为阴性对照。在BD LSRII流式细胞仪上获得了两万(20,000)个事件/孔，使用FlowJo v7软件(Treestar，Ashland，Oregon)对其进行分析。在对对数FSC对SSC的点图中的细菌细胞设门(gate)之后，测定每个样品的PE通道的平均荧光强度(MFI)。如果MFI是对照小鼠IgG MFI的三倍，则认为该MFI为正。

实施例2:聚山梨酯80与rLP2086蛋白质的结合

为了理解聚山梨酯80与各rLP2086蛋白质A和B结合的稳定性，用200μg/mL亚族A和铝(Al)配制一个rLP2086样品，并用200μg/mL亚族B配制另一个rLP2086样品，这两个样品均保存在2-8℃和25℃下，并在五个月后检测这两个样品的蛋白质和聚山梨酯80含量。还分析了安慰剂(缓冲液+Al，无蛋白质)。聚山梨酯80在安慰剂中的分布示于图14，而对于亚族A和B蛋白质，聚山梨酯80的分布分别示于图15和图16。将亚族B的相对效力(％)与结合摩尔比相比较，如图17所示。

结果

如图14所示，总的聚山梨酯80百分比和聚山梨酯80在上清液中的百分比是相同的(0.017％)，这表明聚山梨酯80并不与铝结合或者被困于沉淀中。另外，聚山梨酯80在2-8℃和25℃下在五个月后是稳定的。

聚山梨酯80在结合的(沉淀)、未结合的(上清液)和总的rLP2086亚族A和亚族B样品中的分布分别示于图15和图16。对于亚族A，在五个月的时间点、2-8℃和25℃下的上清液和沉淀中的聚山梨酯80的百分比并没有变化。但是，对于亚族B样品，在五个月的时间点、25℃下在沉淀中观察到更多的聚山梨酯80。尽管在2-8℃和25℃下，聚山梨酯80在上清液和沉淀中的浓度不同，但是两个亚族均达到了精确的质量平衡。由于rLP2086蛋白质与该基质中的磷酸铝百分之百地结合，因此与沉淀有关的聚山梨酯80最有可能与蛋白质分子结合。

尽管蛋白质A和B均与聚山梨酯80结合，但是对于保存在2-8℃和25℃下的样品来说，蛋白质A的结合是相同的，而对于保存在25℃下的样品，蛋白质B的结合几乎是保存在2-8℃下的样品的两倍。在T₀和五个月的时间点在2-8℃和25℃下测定亚族B的相对效力，发现其相对效力的表现与结合摩尔比相反，如图17所示。效力百分比从T₀时的120下降至5M/25℃时的16％，而在相同的时间段，结合摩尔比从5.3升高至13.9。

实施例3：临界摩尔比研究

为了测定rLP2086稳定性所需的聚山梨酯80的临界浓度，制备四十(40)种rLP2086制剂，这些制剂仅包含亚族A、仅包含亚族B，以及包含亚族A和B两者(200μg/mL和400ug/mL)，具有不同的聚山梨酯80浓度，如表1所示。测定每个样品的总蛋白质和结合蛋白质，以及在时间点零(T₀)、14天和1个月，在2-8℃和25℃下，聚山梨酯80在整个样品、上清液和沉淀中的百分比。该研究的结果示于图18至图24。

表1

结果

测定聚山梨酯80在含有磷酸铝的全部40个rLP2086制剂样品的上清液、沉淀和整个样品中的浓度。测定亚族A和B两者的总摩尔比和结合摩尔比，对于含有0.005％(摩尔比为5.4)或更少聚山梨酯80的200μg/mL的两个亚族，上述摩尔比似乎是相似的，分别如图18和19所示。但是，对于含有0.0065％(摩尔比为7.0)或者更多的聚山梨酯80的样品，亚族B的总摩尔比远高于结合摩尔比。对于含有0.008％(摩尔比为8.6)或更少的聚山梨酯80的制剂，各400μg/mL的亚族A、亚族B以及亚族A+B的总摩尔比和结合摩尔比的数据也很接近，但是，对于含有0.017％(摩尔比为18.4)聚山梨酯80的制剂，总摩尔比要比结合摩尔比高得多，如图20所示。

实施例4:聚山梨酯80随时间的结合

在T₀、14天/25℃、1个月/4℃和1个月/25℃下测定聚山梨酯80在含有AlPO₄的亚族A和B制剂样品的上清液和沉淀中的百分比(％)。对于保存在2-8℃下的样品，聚山梨酯80在亚族A和B两种制剂样品的上清液中的百分比相对而言是相同的。但是，对于保存在25℃下的样品，即便是在仅14天后，聚山梨酯80在上清液中的百分比急剧减少。在T₀/5℃和1个月/5℃下，聚山梨酯80在亚族A和B两者的沉淀中的百分比相对而言是相似的。但是，对于保存在25℃下的样品，特别是对于含有0.008％(摩尔比为8.6)或者更多的聚山梨酯80的亚族B，聚山梨酯80在上清液中的百分比显著增加。还测定了在T₀、14天/25℃、1个月/4℃和1个月/25℃下，聚山梨酯80在含有AlPO₄的rLP2086亚族A和B制剂的上清液和沉淀中的百分比。如图21所示，对于含有0.008％的样品，聚山梨酯80的浓度在所有四个时间点是大致相同的。但是，对于含有0.017％的聚山梨酯80并保存在25℃下的样品，聚山梨酯80的浓度升高。在含有0.008％或者更少的聚山梨酯80的样品的上清液中，没有发现聚山梨酯80。如图22所示，在所有四个时间点，对于含有0.008％或更少的聚山梨酯80的样品，结合摩尔比是稳定的。但是，对于含有0.017％的聚山梨酯80并保存在25℃下的样品，结合摩尔比增加。

测定含有AlPO₄的亚族A和B制剂样品在T₀和14天/25℃下的效力(分别参见图23和图25)。如图23所示，不同总摩尔比的亚族A在5℃和25℃下的效力是91-102。尽管结合摩尔比结果在任一温度下相对而言也是相同的，但是随着总摩尔比/结合摩尔比增加，观察到效力的略微增加。

对于总摩尔比高达9.0的亚族B的5℃样品，效力为约95％。但是，随着总摩尔比增加至18.1，亚族B效力降低至79％。另外，总摩尔比为18.1的样品具有比其他样品更高的结合摩尔比。在25℃下，随着总摩尔比从5.3增加至18.1，亚族B的效力表现出从83％至5％的显著下降。随着总摩尔比增加，25℃样品的结合摩尔比值从5.3增加至13.8。因此，亚族B的效力与结合摩尔比呈反比。

亚族A和亚族B蛋白质两者均与聚山梨酯80结合。对于保存在2-8℃和25℃的样品，亚族A的结合是相同的，但是对于保存在25℃下的样品，亚族B的结合几乎是两倍。另外，临界摩尔比研究表明，当含有0.008％或者更少的聚山梨酯80时(等价于4.2或者更少的总摩尔比)，200μg/mL制剂样品是稳定的。

实施例5:洗涤剂浓度和rLP2086亚族B抗原效力

采用不同浓度的聚山梨酯80的另一稳定性研究证明用于维持效力的聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比的临界状态。在一个实验中，用含有0.5mg/mL铝(磷酸铝形式)的10mM组氨酸缓冲盐水(HBS)制备剂量为200μg的免疫原性组合物(pH 6.3，总蛋白质浓度为400μg/mL)，并掺入0.01％、0.02％、0.05％或0.1％的聚山梨酯80(聚山梨酯80与rLP2086蛋白质的相应摩尔比为5.3、10.7、26.7和53.4)。将所配制的样品于25℃下孵育，并将对照样品保存在2-8℃下。在时间为“0”、聚山梨酯80浓度高达0.1％时，效力没有显著变化。但是，在2-8℃和25℃下持续较长时间，观察到效力作为温度和聚山梨酯80浓度的函数而下降。随着免疫原性组合物中的聚山梨酯80的浓度从0.01％升高至0.1％，三个月稳定点证明，亚族B蛋白质的效力在25℃和2-8℃下分别减少至小于10％和25％(图1)。

进行另一项评估亚族B蛋白质的稳定性研究(图2)，该亚族蛋白质在HBS中的浓度为4mg/mL，并且掺入有终浓度为0.06％、0.5％和1％(相应的摩尔比为3.3、26.7和53.4)的聚山梨酯80。对照含有0.09％的聚山梨酯80。亚族B蛋白质在0.06％聚山梨酯80(摩尔比为3.3)中是稳定的。含有浓度增加至0.5％和1％(摩尔比分别为26.7和53.4)的聚山梨酯80的相同样品是不稳定的。对于400μg/mL免疫原性组合物制剂，在含有0.01％(摩尔比为5.3)或者更高的聚山梨酯80浓度的全部制剂中，观察到亚族B蛋白质的不稳定性。但是，在4mg/mL蛋白质和0.06％的聚山梨酯80浓度下，效力并没有下降，原因在于聚山梨酯80与蛋白质之比(3.3)比400μg/mL蛋白质+0.01％聚山梨酯80浓度下的摩尔比(5.3)低。因此，聚山梨酯80所致的亚族B蛋白质的效力下降与聚山梨酯80洗涤剂与蛋白质的摩尔比相关，而与聚山梨酯80在基质中的绝对浓度无关。

因此，免疫原性组合物中的聚山梨酯80的浓度必须减少，以维持亚族B蛋白质在疫苗中以及在随后的2-8℃下保存期间的稳定性。针对剂量为20μg和200μg的含有不同摩尔比的聚山梨酯80(0、1.1、2.7和5.3)的免疫原性组合物设计28天加速稳定性研究(图3和图4)。在具有不同聚山梨酯80浓度的10mM pH 6.0的组氨酸缓冲盐水、0.5mg/mL磷酸铝形式的铝中制备二价(亚族A和亚族B)制剂。将样品与2-8℃对照组一起在25℃下孵育。在第0、7、14和28天分析样品的效力。对于所有含有与蛋白质的摩尔比小于5.3的聚山梨酯80的组，亚族A(数据未显示)和B蛋白质两者都是稳定的。大于80％的效力值被认为在测试可变性范围内。在摩尔比为5.3时，观察到25℃样品的亚族B蛋白质的效力有下降的趋势。

一项全面研究评估了在加速保存稳定性条件下以不同的聚山梨酯80与蛋白质摩尔比配制的全部可能的临床剂量(20μg、60μg、120μg和200μg剂量)，以研究聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比对MnB rLP2086蛋白质的稳定性的影响。使用以聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比为约1.4至10.7配制的二价MnB rLP2086免疫原性组合物。为了生成以增加的聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比(1.4、2.4、3.4、3.9、4.3、4.7和10.7)配制的免疫原性组合物，通过加入聚山梨酯80来将抗原调节至可变的摩尔比，使得在免疫原性组合物配制期间不需要加入额外的聚山梨酯80。在本研究中使用了两个系列的抗原批次。生成聚山梨酯80与蛋白质摩尔比为1.4的一个系列的亚族A和B批次，而另一个系列则为2.4。摩尔比为2.4的蛋白质系列用于通过掺入另外的聚山梨酯80来将摩尔比调整为3.4、3.9、4.3和10.7。免疫原性组合物的最终基质是10mM组氨酸、150mM NaCl，pH 6.0、0.5mg/mL磷酸铝，并且具有上述的聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比。在2-8℃或25℃下保存具体时间间隔后，用振荡器温和地混合24小时，然后进行测试。测试上清液部分的总蛋白质(通过IEX-HPLC)、效力、外观、320nm的光密度以及pH。

200μg和20μg剂量的效力结果分别示于图5和图6。该效力测试比本研究中使用的其他检测更为灵敏。总而言之，与摩尔比为4.3和更低的所有剂量的初始时间点相比，没有观察到亚族A或B抗原两者的效力的显著下降。由于保存于25℃的亚族B蛋白质的效力有轻微下降，因此摩尔比为4.7的制剂被认为是临界制剂。对于保存在25℃下的样品，摩尔比为10.7的制剂的亚族B抗原的效力结果显著低于保存在2-8℃下的那些样品。

实施例6:铝浓度和rLP2086亚族A和B抗原效力

进行了许多的实验来确定最佳磷酸铝水平，以确保亚族A和B蛋白质二者均有大于95％的结合。最初的研究聚集于优化pH 6.5的制剂。在含有0.02％的聚山梨酯80以及0.25mg/mL或0.5mg/mL铝(磷酸铝形式)的10mM组氨酸缓冲液(pH 6.5)中，由亚族A和B蛋白质来制备每种蛋白质的目标剂量为200μg/mL的制剂。亚族B蛋白质与磷酸铝的结合程度较亚族A蛋白质低(图7)。将铝含量从0.25mg/mL增加至0.5mg/mL，使亚族B蛋白质的结合增加至＞80％。由于蛋白质与铝悬浮液之间的结合机制主要是离子相互作用，因此，悬浮液的pH是影响结合的一个因素。

优化制剂pH，以确保亚族B蛋白质有超过90-95％的结合。检查A和B蛋白质各200μg/mL、pH 5.6至6.5并具有不同批次的免疫原性组合物的多个制剂(图8)。在pH为5.6至6.4的制剂中出现了两种蛋白质超过90-95％的结合。随着制剂的pH升高至6.5以及以上，亚族B蛋白质的结合显著下降。推荐的目标pH是6.0，以确保亚族A和B蛋白质有超过90％的结合。

还通过改变pH、缓冲液、蛋白质和聚山梨酯80浓度来评估在制剂变量和/或限值下的制剂的稳定性(robustness)(图9)。尽管在总蛋白质浓度高达500μg/mL(每种蛋白质250μg/mL)时，亚族A蛋白质的结合始终较高(≥95％)，但是亚族B蛋白质的结合对蛋白质浓度和pH更加敏感。由于使用了剂量为200μg的商购制剂，因此这一实验的结果进一步支持pH为6并且含有0.5mg/mL磷酸铝的推荐制剂。

对含和不含磷酸铝的制剂进行评估，以研究提供这样的稳定制剂的可行性，所述制剂不含磷酸铝，并且聚山梨酯80的浓度低至足以维持亚族B蛋白质的稳定性。在具有0至5.3摩尔比的聚山梨酯80浓度的组氨酸缓冲盐水缓冲液中配制剂量为20μg和200μg的免疫原性组合物。将一半样品用脉冲模式(开2秒，关1秒)下设置为500rpm的数字多管涡旋器搅拌24小时，然后进行检测。采用这一条件来模拟通常在免疫原性组合物的最后运输包装阶段进行的ISTA检测(国际安全运输协会)，以模拟运输条件期间极端的振动。

在搅拌下，不含磷酸铝的制剂发生沉淀，最终导致亚族A和B抗原两者的效力丧失。外观测试(图10)和λ＝320nm的吸光度测量(图11)表明，在不含磷酸铝的制剂被搅拌时形成了聚集物和/或沉淀。对这些样品的效力检测(图12和图13)表明，在所有检测时间点，亚族A和B蛋白质两者的效力有着显著的丧失。效力丧失在含有少量聚山梨酯80的制剂中最为显著。由于少量的聚山梨酯80是维持亚族B蛋白质稳定所必需的，因此要求制剂中包含磷酸铝，以保持稳定性。rLP2086免疫原性组合物可以用磷酸铝配制，磷酸铝将起到增强效力稳定性的作用，效力稳定性通过体外效力测试进行测量。

实施例7:作为缓冲液的琥珀酸盐和组氨酸

制备了一系列制剂，以比较rLP2086亚族A和B蛋白质在琥珀酸盐和组氨酸中的结合，以及pH、聚山梨酯80和MgCl₂对结合的影响(表2)。通过改变pH、缓冲液、蛋白质和聚山梨酯80浓度来评估制剂变量和/或限值下的制剂的稳定性(图25和26)。铝与亚族A和亚族B蛋白质的结合是相似的，不管所使用的缓冲液(组氨酸或琥珀酸盐)为何。

表2:用于评估组氨酸和琥珀酸盐缓冲液、MgCl₂、聚山梨酯80和pH 5.6-6.0对rLP2086与AlPO₄ ¹的结合的影响的制剂

¹表2中所示出的所有制剂均含有0.5mg Al/mL。

用三种常用的缓冲盐来评估缓冲盐和混合时间对铝结合的影响，选择这三种缓冲盐是因为其pKa在生理范围内，并且因为这些盐通常被认为是安全的。用pH适合每一种盐的pKa的以下三种缓冲盐之一来配制rLP2086亚族A和B蛋白质：5mM琥珀酸盐、10mM组氨酸或10mM磷酸盐，以测定在每个条件的结合程度。通过在测量结合蛋白质的量之前使样品混合5分钟或120分钟来评估完成结合所需的时间。

如图27所示，在pH 6.8时，磷酸盐缓冲液中的亚族B蛋白质表现出减少的结合，而在相同条件下，亚族A蛋白质并没有受到显著影响。在用组氨酸或琥珀酸盐配制的样品中，与铝结合的蛋白质的量是相似的。因此，选择这两种缓冲盐进行进一步评估。尽管不希望受理论束缚，但是磷酸盐缓冲液中结合的减少，可能是由于与加入的磷酸根离子竞争AlPO₄上的结合位点所致。

在蛋白质和AlPO₄的这些条件和浓度下，在室温混合五分钟后完成结合，这与混合2小时后获得的结果相似。

为了进一步检查亚族B蛋白质在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中的结合减少是否是由于pH或缓冲盐之间的差异所致，测量了5.3至7.0的pH范围内的组氨酸或琥珀酸盐缓冲制剂中的结合。制备了含有0.2mg/mL各亚族蛋白质(总蛋白质为0.4mg/mL)、0.02％PS80、0.5mgAl/mL和150mM NaCl的二价制剂。在10mM组氨酸或5mM琥珀酸盐中制备样品，以比较缓冲盐的影响。配制之后，逐个核查每个样品的pH。

亚族A蛋白质的pH 5.3至7.0的结合性质示于图28，而亚族蛋白质B的示于图29。亚族A蛋白质的结合蛋白质的量几乎没有变化，并且在所测试的pH范围内，结合保留超过95％。含有组氨酸且目标pH为7的制剂得到6.8的pH。不将该pH调整为7.0(如通过加入碱)，以避免对蛋白质或AlPO₄可能的影响，因此这一数据点的结果不可获知。

亚族B蛋白质的结合性质(示于图29)表现出pH依赖的趋势。但是，不管结合是在组氨酸还是在琥珀酸盐缓冲制剂中进行，与铝结合的蛋白质的量是相似的。结合依赖于制剂的pH，而非缓冲盐。结合保持在95％，一直到pH为6.5(组氨酸中为94％，琥珀酸盐中为95％)，但是当pH大于6.5时，结合下降。在pH为7.0时，结合下降至约82％，在缓冲盐之间有细微的差异。

为了获得这些浓度下的亚族B蛋白质与AlPO₄的强力结合，优选6.5或者更低的pH。

实施例8:安全性、耐受性和免疫原性研究

进行研究来评估在健康的青年群体中所给药的rLP2086疫苗的安全性、耐受性和免疫原性，所依据的方案是0和2个月；0、2和6个月；0和2个月，之后12个月加强剂量。

免疫原性组合物是rLP2086疫苗(经重组且脂质化的)。所述免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏菌血清组B的重组ORF2086蛋白质，该蛋白质在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达，并被配制为包含rLP2086的一个亚族A菌株和一个亚族B菌株的二价疫苗。具体而言，该免疫原性组合物的剂量为0.5mL，其被配制以包含60μg、120μg或200μg的各纯化亚族A和纯化亚族B rLP2086蛋白质、摩尔比为2.8的聚山梨酯80和0.25mg的Al³⁺(AlPO₄形式)、10mM组氨酸缓冲盐水(pH 6.0)。对照组合物包含剂量为0.5mL的生理盐水溶液(0.9％氯化钠)。

将个体随机地分派到5个组中。参见表3。将个体分为两个年龄组：≥11岁至<14岁；和≥14岁至<19岁。

将盐水用作安慰剂，原因在于没有针对能够起到活性对照作用的MnB的被证实是安全的、具有免疫原性和有效的疫苗。

按照表3，个体在每次接种就诊(如第1、2、4和6次就诊)时接受一剂rLP2086疫苗或盐水。遵照标准的接种实践，不将该疫苗注射到血管中。以肌内方式将0.5mL注射到上三角肌来给予rLP2086疫苗。以肌内方式将盐水给予上三角肌。

A.第1次就诊

在第1次就诊，第1天，第1次接种时，首先对个体抽血，然后对其进行接种。第1次就诊抽血和第1次接种发生在同一天。接种前，从个体收集血样(大约20mL)。对于随机分到第1、2、3和4组的个体，将单次0.5mL rLP2086疫苗肌内注射剂给予上三角肌。对于第5组的个体，将单次0.5mL盐水肌内注射剂给予上三角肌。

B.第2次就诊(第1次就诊后42至70天)，第2次接种

对于第1、2和3组，将单次0.5mLr LP2086疫苗肌内注射剂给予上三角肌。对于第4和5组，将单次0.5mL盐水肌内注射剂给予上三角肌。

C.第3次就诊(第2次就诊后28至42天)，第2次接种后抽血

从个体收集血样(大约20mL)。

D.第4次就诊(第2次就诊后105至126天)，第3次接种

对于第2、4和5组，将单次0.5mL rLP2086疫苗肌内注射剂给予上三角肌。对于第1和3组，将单次0.5mL盐水肌内注射剂给予上三角肌。

E.第5次就诊(第4次就诊后28至42天)，第3次接种后抽血

从个体收集血样(大约20mL)。

F.第6次就诊(第4次就诊后161至175天)，第4次接种

在第6次就诊时，首先对个体抽血，然后对其进行接种。第6次就诊抽血和第4次接种发生在同一天。接种前，从个体采集血样(大约20mL)。对于第3和5组，将单次0.5mLrLP2086疫苗肌内注射剂给予上三角肌。对于第1、2和4组的个体，将单次0.5mL盐水肌内注射剂给予上三角肌。

G.第7次就诊(第6次就诊后28至42天)，第4次接种后抽血

从个体收集血样(大约20mL)。

免疫原性结果

本研究的主要目的是评估60μg、120μg和200μg rLP2086疫苗通过用表达LP2086亚族A和B蛋白质的MnB菌株进行SBA测量的免疫原性。

本研究的第二个目的是评估60μg、120μg和200μg rLP2086疫苗通过对与rLP2086疫苗亚族A和B蛋白质结合的Ig定量而测定的免疫原性。

使用3个亚族A菌株和3个亚族B菌株评估SBA活性，如表4所示。表4:对SBA效价达到第1次给药前的≥4倍升高的个体(mITT群体)的分析(研究6108A1-2001-WW/B1971005)

表4:对SBA效价达到第1次给药前的≥4倍升高的个体(mITT群体)的分析(研究6108A1-2001-WW/B1971005)

缩写:CI＝置信区间；SBA＝血清杀菌测试。

注：测试检验支持亚族A菌株1＝9和亚族B菌株1＝10的定量下限(LLQQ)。高于LLQQ的SBA效价被认为是准确的，并报道其定量值。低于LLQQ或者被表示低于LLQQ的值被设定为0.5*LLOQ，以进行分析。

表5给出了效价达到规定水平的个体比例。对于两个亚族，第3次给药后达到规定SBA效价水平的个体比例要高于第2次给药后的。

免疫原性数据表明，该疫苗可以生成对MnB的亚族A和亚族B菌株有显著SBA活性的抗体。对于亚族A菌株2，在第2次给药后，SBA应答率是88.9％至90.9％，在第3次给药后，SBA应答率是90.0％至97.4％。对于亚族A菌株1变体，在第2次给药和第3次给药后，100.0％的个体都对60μg和120μg剂量水平的这一变体有SBA应答。在200μg剂量水平，在第2次给药和第3次给药后分别有96.5％和99.0％的个体具有SBA应答。对于亚族A菌株1变体，SBA应答率在第2次给药后是85.0％至96.3％，在第3次给药后是95.2％至97.4％。

对于亚族B菌株1变体，在第2次给药后，SBA应答率是76.2％至81.0％，第3次给药后，该SBA应答率是89.5％至92.0％。对于第2次给药后的亚族B菌株2变体，具有SBA应答率的个体百分比是21.1％至33.3％。但是，在第3次给药后，在60μg、120μg和200μg剂量水平下分别有53.3％、75.6％和67.9％的个体具有SBA应答。对于亚族B菌株3变体，SBA应答率在第2次给药后是61.9％至70.8％，在第3次给药后是76.2％至88.7％。

总之，有较高比例的个体以≥LLOQ的SBA效价应答，而不管测试的是亚族A菌株还是亚族B菌株。hSBA数据表明，在60μg至200μg的剂量下有强的免疫应答，但是没有清楚的剂量-应答关系。不管检测的分析如何，在120μg组，应答频率在数值上是最高的。200μg组并没有高于120μg剂量水平的提高的免疫应答。

Claims

1.使免疫原性组合物中的脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)血清群BLP2086(fHBP)亚族B多肽的效力稳定化的方法，所述方法包括步骤(a)：将所述LP2086(fHBP)亚族B多肽与脑膜炎萘瑟氏菌血清群B LP2086(fHBP)亚族A多肽、聚山梨酯80、浓度为约0.25mg/mL至0.5mg/mL的AlPO₄形式的铝、以及浓度为约5mM至约15mM的组氨酸或浓度为约3mM至约7mM的琥珀酸盐配制成组合物，其中聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比为约1:1至约5:1；多于95％的所述亚族B多肽与所述铝结合；pH为约5.8至6.0；并且所述组合物不是冻干的。

2.权利要求1的方法，其中至少50％的所述LP2086(fHBP)亚族B多肽的效力被维持至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月、54个月或60个月。

3.权利要求1的方法，其中所述聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比为约1.4:1至约4.2:1。

4.权利要求3的方法，其中所述聚山梨酯80与蛋白质的摩尔比为约2.8:1。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中聚山梨酯80的量足以减少多肽与容器中的硅的结合。

6.权利要求5的方法，其中所述容器为注射器或小瓶。

7.权利要求1的方法，其中铝的浓度为约0.5mg/ml。

8.权利要求1的方法，其中琥珀酸盐的浓度为约5mM。

9.权利要求1的方法，其中组氨酸的浓度为约10mM，pH为6.0。

10.权利要求1的方法，其中所述组合物包含与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl。

11.权利要求1的方法，其中所述组合物基本由200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。

12.权利要求1的方法，其中所述组合物基本由200ug/mL rLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mLAlPO₄形式的铝、10mM pH 6.0的组氨酸和150mM NaCl组成。

13.权利要求1或2的方法，其中所述组合物包含与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl。

14.权利要求1的方法，其中所述组合物基本由200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mL AlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。

15.权利要求1的方法，其中所述组合物基本由200ug/mL rLP2086(fHBP)亚族A多肽、200ug/mL LP2086(fHBP)亚族B多肽、与蛋白质的摩尔比为约2.8:1的聚山梨酯80、0.5mg/mLAlPO₄形式的铝、5mM pH 6.0的琥珀酸盐和150mM NaCl组成。