ES2307553T3 - Composiciones y procedimientos para estabilizar moleculas biologicas tras liofilizacion. - Google Patents

Abstract

Un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo, al menos un tampón amorfo, y al menos un inmunógeno del meningococo C (MenC).

Description

Composiciones y procedimientos para estabilizar moléculas biológicas tras liofilización.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para estabilizar moléculas biológicas tras una liofilización, y a procedimientos para liofilizar moléculas biológicas.

Antecedentes de la invención

Las vacunas se utilizan con amplitud para la prevención y/o terapia de muchas enfermedades diferentes. La meningitis meningocócica es una de estas enfermedades para la cual se puede proporcionar prevención y/o terapia a través de una vacuna.

La vacuna de la meningitis meningocócica utilizan el polisacárido meningocócico (PS) que tiene una inmunogenicidad relativamente baja. Para solucionar la inmunogenicidad relativamente baja del polisacárido meningocócico, las vacunas de PS se conjugan con vehículos proteicos para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar una protección a largo plazo en niños pequeños. Una de estas vacunas (MenC-CRM 197) contra el meningococo C (MenC) se ha preparado utilizando CRM 197 como vehículo proteico (Constantino et al., Vaccine, 1992, vol. 10, nº 10:691-698).

Sin embargo, existen algunos problemas asociados con el uso de la vacuna de polisacárido meningocócico conjugada MenC-CRM 197 y, en efecto, con las vacunas que contienen proteínas en general. Para aumentar la caducidad de las vacunas, las formulaciones con frecuencia se liofilizan. Sin embargo, la liofilización de MenC-CRM 197 puede conducir a la agregación de las proteínas durante la congelación y la conservación. En el caso de MenC-CRM 197, los agregados representan multímeros de MenC-CRM 197, unidos de forma no covalente, que parece que se asocian a través de interacciones hidrófobas. El uso de las actuales formulaciones de tampón de disolución, es decir, que contienen fosfato de sodio 10 mM (pH 7,2) como tampón y manitol al 1,5% como excipiente puede producir una agregación tan alta como 9,5% al 10%. A medida que aumenta la agregación, disminuye la concentración de inmunógeno disponible. Por tanto, existe la necesidad de composiciones y procedimientos que solucionen el problema de la agregación estabilizando las moléculas biológicas frente a la agregación durante la liofilización.

La vacuna 197 está compuesta por dos fragmentos, A y B, unidos covalentemente entre sí. Se ha descubierto que el fragmento A es estable y muy resistente frente a la desnaturalización. Sin embargo, el fragmento B es muy sensible a la desnaturalización y es sometido a una degradación proteolítica durante la liofilización. A medida que aumenta la degradación proteolítica, disminuye la concentración de inmunógeno funcional disponible. Por tanto, también existe la necesidad de composiciones y procedimientos para la preparación de moléculas biológicas que minimicen la degradación durante la liofilización y la conservación.

Aunque existen diversas teorías que buscan explicar y minimizar la agregación y/o la degradación de moléculas biológicas tras una liofilización, hasta la fecha no existen técnicas satisfactorias. Orii et al. han indicado que el glicerol y los azúcares protegen a los materiales biológicos frente a los daños provocados por la congelación y descongelación, probablemente minimizando los cambios de pH (Orii et al., J. Biochem., 1977, 81:163-168).

Arakawa et al. evaluaron la estabilización de proteínas en disoluciones acuosas utilizando diversos azúcares (Arakawa et al., Biochemistry, 1982, 21:6536-6544). Arakawa et al. relacionan la protección de los componentes proteicos en una disolución acuosa con la fuerza cohesiva de los azúcares que es responsable del aumento en la tensión superficial del agua. Sin embargo, este factor no es relevante en disoluciones liofilizadas. Arakawa et al. no solucionan el problema de la estabilización de disoluciones liofilizadas. Además, Arakawa et al. Informan que la sacarosa presente en soluciones acuosas, en realidad, disminuye la actividad de algunas encimas.

Pikal et al. indican que los excipientes deben permanecer al menos parcialmente amorfos para que sean eficaces para estabilizar una proteína, pero advirtieron que un excipiente amorfo no es condición suficiente para que se potencie la estabilidad y, en efecto, observaron que la adición de excipientes amorfos a disoluciones de proteínas en realidad puede desestabilizar la proteína por medio de interacciones moleculares entre el excipiente y la proteína (Pikal et al., Biopharm., 1990, 3, 26-29). Pikal et al. indican que deben evitarse unos altos niveles de tampón puesto que es probable que éstos conduzcan a la cristalización de uno de los componentes del tampón y a un posterior desplazamiento grande del pH durante la congelación, y que incluso los tampones que permanecen amorfos no resultan adecuados a niveles altos, puesto que esto normalmente disminuye la temperatura de colapso y la temperatura de transición vítrea del material secado. Los autores indican que, por su experiencia, un nivel bajo de tampón hace que tienda a permanecer amorfo pero no afecta de forma espectacular a la temperatura de colapso ni a la temperatura de transición vítrea. Sin embargo, Pikal et al. no definen los niveles altos o bajos de tampón. No obstante, en un informe posterior, Pikal et al. indican que, basándose en una HPLC de fase inversa, la agregación alcanzó un máximo a tampón fosfato 1,69 mM, mientras que la descomposición fue mínima (Pikal et al., Pharm. Res., 1991, 8:427-436). Por tanto, los autores concluyen que el nivel de fosfato no parece ser un factor relevante.

Izutsu et al. indican que si se mantiene el manitol en un estado amorfo se estabiliza la \beta-galactosidasa (Izutsu et al., Pharm. Res., 1993, vol. 10, nº 8, 1232-1237). Isutzu et al. indican que en tampón fosfato de sodio 200 mM, el manitol a 200-500 mM es amorfo y actúa para estabilizar la \beta-galactosidasa. En tampón fosfato 10 y 50 mM, el manitol al 50-100 nM es amorfo y muestra un efecto estabilizante. Izutsu et al. también indican que la glucosa en el tampón fosfato de sodio protege la actividad enzimática, pero no proporcionan ningún dato sobre las concentraciones de glucosa adecuadas para lograr este efecto.

Bush et al. describen una formulación de factor IX recombinante liofilizada estable que contiene histidina 10 mmol/l, glicina 0,26 mol/l, sacarosa al 1% y polisorbato 80 al 0,005% (Bush et al., Seminars is Hematology, 1998, vol. 35, nº 2, supl. 2, 18-21).

También se ha ensayado el efecto protector de aminoácidos seleccionados sobre disoluciones de enzimas liofilizadas (Seguro et al., Cryobiology, 1990, 27:70-79). Se evaluaron los efectos protectores del glutamato de monosodio (MSG) y el clorhidrato de lisina (Lys-HCl) durante la liofilización utilizando lactato deshidrogenasa en disolución. Seguro et al. indican que la adición de MSG o de Lys-HCl a la disolución enzimática reduce la pérdida de actividad enzimática en aproximadamente 40% (control utilizando agua desionizada) a 20-25% (utilizando MSG o Lys-HCl). Los autores sugieren que ni la concentración salina ni la fuerza iónica son importantes para la estabilización de la enzima disuelta. Seguro et al. indican que el factor más importante en la desnaturalización producida en la congelación es la terminación del fenómeno de superenfriamiento producido por los aditivos o el cambio de fase de agua a hielo.

Se han descrito procedimientos para la liofilización de diversas composiciones en varias referencias bibliográficas (DeLuca, J. Vac. Sci. Technol., 1977, vol. 14, nº 1, 620-629; DeLuca et al., J. Pharm. Sci., 1965, vol. 54, nº 4, 617-624; Pikal et al., Biopharm., 1990, 3, 26-29). Los procedimientos para liofilizar descritos en estas referencias bibliográficas incluyen una serie de ciclos.

DeLuca et al. (1965) indican que la temperatura eutéctica de un producto es un factor importante en el diseño de los ciclos de liofilización, y que las temperaturas eutécticas para diversas sales orgánicas e inorgánicas son similares (tabla I). Los autores indican que otros factores importantes en el diseño de los ciclos de liofilización incluyen el efecto de superenfriamiento y la propiedad conductora térmica de la masa congelada. DeLuca et al. indican que ni el manitol ni la sacarosa ejercen un efecto significativo sobre la solubilidad de sales orgánicas o la temperatura eutéctica del sistema. DeLuca et al. (1977) indican que el punto eutéctico del aditivo no debe ser menor que el del fármaco, puesto que esto afectará a los tiempos de los ciclos, y sugieren añadir fosfato mono- y dibásico y cloruro de sodio para mejorar las características de la torta terminada. Los autores concluyen que es posible optimizar el tiempo del ciclo determinando las temperaturas eutécticas y las propiedades de superenfriamiento del producto.

Existe una necesidad de composiciones y procedimientos para estabilizar moléculas biológicas tras una liofilización.

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Sumario de la invención

La presente invención surge del sorprendente descubrimiento de que es posible estabilizar moléculas biológicas frente a la agregación y la degradación durante y después, es decir, "tras" una liofilización, utilizando un tampón de disolución que comprende un excipiente amorfo y un tampón amorfo.

Según un aspecto, la presente invención proporciona un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo, al menos un tampón amorfo, y al menos un inmunógeno de MenC.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para estabilizar uno o más inmunógenos de MenC tras una liofilización. El procedimiento comprende disolver el inmunógeno de MenC en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y después liofilizar la mezcla.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para conservar uno o más inmunógenos de MenC. El procedimiento comprende disolver el inmunógeno de MenC en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y después liofilizar la mezcla.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la liofilización de un inmunógeno de MenC. El procedimiento comprende disolver el inmunógeno de MenC en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, cargar la mezcla de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 20ºC bajo aproximadamente 1000 Pa a aproximadamente 2000 Pa de presión, congelar la mezcla durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas hasta una temperatura de aproximadamente -70ºC a aproximadamente -50ºC bajo aproximadamente 1000 Pa a aproximadamente 2000 Pa de presión, secar la mezcla durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 30 horas a una temperatura de aproximadamente
-50ºC a aproximadamente -35ºC bajo una presión de aproximadamente 5 Pa a aproximadamente 10 Pa, y secar la mezcla durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas a una temperatura de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 20ºC bajo una presión de aproximadamente 5 Pa a aproximadamente 10 Pa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la liofilización de un inmúnógeno de MenC. El procedimiento comprende disolver el inmunógeno de MenC en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, cargar la mezcla a aproximadamente 10ºC bajo 1000 Pa de presión, congelar la mezcla durante aproximadamente 2 horas hasta una temperatura de aproximadamente -50ºC bajo 1000 Pa de presión, secar la mezcla durante aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente -35ºC bajo una presión de aproximadamente 5 Pa, y secar la mezcla durante aproximadamente 8 horas a una temperatura de aproximadamente 20ºC bajo una presión de aproximadamente 5 Pa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para estabilizar una vacuna de MenC tras una liofilización. El procedimiento comprende disolver el inmunógeno de MenC en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y liofilizar la mezcla.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un cromatograma de MenC-CRM 197 obtenido mediante una cromatografía de exclusión molecular (SEC). El pico principal se observa entre 19 y 24 minutos. Un pico que representa los productos de la agregación se obseva a aproximadamente 15-17 minutos, y un pico que representa los productos de la fragmentación se observa a más de 24 minutos.

Las figuras 2A-C muestran diagramas de calorimetría de barrido diferencial (BSC) de un tampón de manitol (A), un tampón de manitol-sacarosa (B), y un tampón de sacarosa (C). La sustitución del 25% del manitol por sacarosa en el tampón produjo una disminución del pico de recristalización y un desplazamiento en las temperaturas de transición vítrea.

La figura 3 muestra los efectos de la temperatura de congelación y la presencia de sacarosa sobre la estabilidad de una formulación de MenC-CRM 197 tras una liofilización, según se determina mediante el porcentaje de recuperación de MenC. La MenC-CRM 197 muestra mayor estabilidad en presencia de sacarosa al 5,0% cuando se compara con formulaciones sin sacarosa.

Las figuras 4A-B muestran el efecto de una composición de excipiente-tampón sobre la agregación de MenC-CRM 197, según se determina mediante una cromatografía de exclusión molecular. La figura 4A muestra el uso de un tampón fosfato de sodio 10 mM que contiene cantidades variables de manitol y/o sacarosa. La figura 4B muestra el uso de un tampón fosfato de sodio 5 mM que contiene cantidades variables de manitol y/o sacarosa. A medida que aumenta la cantidad de excipiente amorfo, en este caso sacarosa, en la formulación, disminuye la agregación de MenC-CRM 197.

La figura 5 muestra el efecto del estrés (37ºC) sobre la agregación de MenC-CRM 197, según se determina mediante una cromatografía de exclusión molecular. Las formulaciones con tampones amorfos (histidina o imidazol) demuestraron menos agregación tras una incubación prolongada a 37ºC que las formulaciones con tampones no amorfos (tampón fosfato de sodio).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones tampón, composiciones de moléculas biológicas, y procedimientos para la preparación y estabilización de moléculas biológicas reduciendo la agregación y la degradación de las moléculas biológicas tras una liofilización. Las composiciones y procedimientos implican sustituir los tampones y excipientes cristalizables (no amorfos) por tampones y excipientes completa o parcialmente amorfos.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "tampón de disolución" se refiere a la disolución en la que la proteína o proteínas se disuelven para la liofilización. El "tampón de disolución" comprende al menos un excipiente amorfo y al menos un tampón amorfo. En una realización preferida, el tampón de disolución comprende también un inmunógeno de MenC. En una realización más preferida, el tampón de disolución comprende también MenC-CRM 197.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "molécula biológica" incluye, pero no se limita a proteínas, ácido nucleicos y sacáridos. Las moléculas biológicas pueden utilizarse de forma individual o en combinación con otras moléculas biológicas. En una realización preferida de la presente invención, la molécula biológica es un inmunógeno. En una realización más preferida, la molécula biológica es un inmunógeno de MenC. En una realización aún más preferida, la molécula biológica es MenC-CRM 197.

Tal como se emplea en la presente, el término "proteína" se refiere a polipéptidos, péptidos y sus análogos. "Proteína" también incluye polipéptidos y péptidos que están conjugados con otras moléculas biológicas. En una realización preferida de la presente invención, la proteína es un inmunógeno.

Tal como se emplea en la presente, el término "inmunógeno" se refiere a cualquier compuesto capaz de producir una respuesta inmunológica celular y/o humoral cuando entra en contacto con una célula e incluye, sin limitación, vacunas y composiciones que comprenden inmunógenos. Preferiblemente, se produce una respuesta de anticuerpos y una respuesta de células T. Se espera que estos inmunógenos sean útiles en aplicaciones profilácticas y terapéuticas, así como para aplicaciones de investigación, incluyendo la generación de anticuerpos.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "ácido nucleico" se refiere a oligonucleótidos y polinucleótidos, e incluye ADN y ARN.

Tal como se emplea en la presente, el término "sacáridos" incluye oligosacáridos y polisacáridos.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "excipiente amorfo" se refiere a un excipiente que permanece amorfo tras una liofilización. Se incluyen los excipientes que permanecen amorfos bajo ciertas condiciones pero que pueden cristalizar bajo otras condiciones. Las condiciones que mantienen la naturaleza amorfa del excipiente se incluyen en la presente invención. Los excipientes amorfos son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, azúcares, incluyendo sacarosa, lactosa y, bajo las condiciones descritas en la presente, manitol. Los excipientes amorfos también pueden incluir, bajo condiciones muy conocidas por los expertos en la técnica, sin limitación, celulosas, en especial sorbitol. Los excipientes amorfos pueden utilizarse de forma individual o como una mezcla que contenga dos o más excipientes amorfos diferentes. En una realización preferida, el excipiente amorfo es sacarosa. En una realización más preferida, la concentración final de sacarosa en el tampón de disolución es de aproximadamente 1,5% a aproximadamente 5%.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "vacuna de MenC" se refiere a una vacuna que comprende al menos un inmunógeno de MenC. En una realización preferida, la vacuna de MenC comprende MenC-CRM 197.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "tampones amorfos" se refieren a tampones que permanecen amorfos tras una liofilización, por ejemplo, tampones orgánicos. Se incluyen los tampones que permanecen amorfos bajo ciertas condiciones pero que pueden cristalizar bajo otras condiciones. Las condiciones que mantienen la naturaleza amorfa del tampón también se incluyen. Los tampones amorfos son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, tampón imidazol y tampón histidina, piperidina y diisopropiletilamina. En una realización preferida, el tampón amorfo es tampón imidazol. En otra realización preferida, el tampón amorfo es tampón imidazol y tiene una concentración de aproximadamente 10 mM.

Tal como se emplea en la presente, el término "estabilizar" se utiliza como sinónimo de inhibir, reducir, suprimir, disminuir, mermar y decrecer la agregación y/o la degradación. La presente invención incluye procedimientos que inhiben sustancialmente la agregación y/o la degradación de moléculas biológicas. Una inhibición sustancial de la agregación o degradación se refiere a una reducción de la agregación o degradación de aproximadamente 25% a aproximadamente 100% comparada con controles que emplean tampones y/o excipientes cristalizables. Preferiblemente, la agregación o la degradación se inhibe en aproximadamente 50%, más preferiblemente en aproximadamente 75%, y aún más preferiblemente en aproximadamente 100%.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "tras una liofilización" se refiere al periodo durante la liofilizacón de las moléculas biológicas y durante la posterior conservación de las moléculas biológicas liofilizadas.

Tal como se emplea en esta descripción y en las reivindicaciones adjuntas, los artículos en forma singular "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia a los artículos en forma plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un inmunógeno" incluye una mezcla de dos o más de estos inmunógenos.

Según la presente invención, también se proporcionan procedimientos para la liofilización de moléculas biológicas. Los procedimientos comprenden disolver la molécula biológica en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y después liofilizar la muestra. En una realización de la invención, la liofilización incluye cargar las muestras a 20ºC, congelar las muestras hasta aproximadamente
-50ºC durante aproximadamente 2 horas, y secar a aproximadamente -35ºC durante aproximadamente 24 horas bajo una presión de vacío de aproximadamente 25 micras y una velocidad de la pendiente de aproximadamente 25ºC por hora. En una realización preferida, la molécula biológica es un inmunógeno de MenC. En una realización más preferida, la molécula biológica es MenC-CRM 197. A través de la práctica de la presente invención, la molécula biológica se estabiliza frente a la agregación y la degradación.

Esta invención satisface una necesidad, sentida desde hace tiempo, de composiciones y procedimientos para preparar moléculas biológicas que reducen la agregación y minimizan la degradación tras una liofilización. Mediante la sustitución de excipientes no amorfos y tampones no amorfos en el tampón de disolución por excipientes amorfos y tampones amorfos se logra una reducción de la agregación y la degradación durante la liofilización y la posterior conservación.

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Materiales y procedimientos

Se utilizaron los siguientes materiales y procedimientos a menos que se indique lo contrario.

El polisacárido meningocócico del grupo C (MenC) es un homopolímero del ácido siálico (ácido N- acetilneuramínico) con enlace 2-9, parcialmente O-acetilado en la posición C7 y/o C8. El CRM 197 es un mutante de la toxina de la difteria de tipo salvaje (Constantino et al., Vaccine, 1992, vol. 10, nº 10:691-698). La sustitución de la glicina presente en la posición del aminoácido 52 por ácido glutámico conduce a la pérdida total de la actividad enzimática. Para preparar el conjugado, el polisacárido capsular de Neisseria meningitidis del grupo C se hidroliza, y el oligosacárido (OS) resultante se acopla a CRM 197. El acoplamiento de CRM 197 al polisacárido capsular se basa en la activación selectiva de grupo de reducción terminal del oligosacárido y el posterior acoplamiento de la proteína a través de un espaciador especial (Constantino et al., Vaccine, 1992, vol. 10, nº 10:691-698). La proporción de ácido siálico a CRM 197 en el conjugado es de aproximadamente 0,6. La longitud media de los oligosacáridos se estima que es 14,2, mediante una cromatografía de intercambio iónico (análisis Mono-Q, elución sobre Q Sepharose FF^{TM}). La K_{d} del oligosacárido es de entre 0,33 y 0,41, y la concentración de sacárido libre es de aproximadamente 2,5%.

El lote bruto 1 de MenC-CRM 197 ("MenC bruto") consiste en CRM 197 aproximadamente 1,045 mg/l, y antígeno de MenC aproximadamente 0,636 mg/ml (medido mediante el contenido en ácido siálico) en tampón fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,2), y se conserva a 4ºC. Todas las disoluciones de MenC-CRM 197 descritas en la presente se filtraron a través de filtros Millipore^{TM} de 0,22 \mum estériles antes del ensayo. La disolución bruta se diluye antes de la liofilización.

El antígeno liofilizado de la vacuna conjugada de MenC (MenC-CRM 197) obtenida en Siena tiene la siguiente composición: 12 \mug (medidos mediante el contenido en ácido siálico) del antígeno de oligosacárido meningocócico C (Siena, Italia) conjugados con 19,7 \mug de CRM 197, 9 mg de manitol, y tampón fosfato 10 mM, pH 7,2. Antes de la administración, el antígeno liofilizado se solubiliza con 0,6 ml de adyuvante de hidróxido de aluminio. De esta disolución se inyectan 0,5 ml.

DSC (calorimetría de barrido diferencial): Se empleó el instrumento SII Seiko con un sistema operativo de Hewlett-Packard para calcular la DSC analizando la cristalinidad aditiva. Muestras de disoluciones de las disoluciones de excipientes se congelaron con una velocidad de pendiente de 10ºC/minuto hasta una temperatura de aproximadamente -50ºC. Utilizando nitrógeno seco como atmósfera, se controlaron los cambios térmicos mientras se calentaban las muestras con diversas velocidades de pendiente (de 0,625ºC/minuto a 10ºC/minuto). Se evaluó el efecto de la composición del excipiente sobre el cambio térmico.

La diálisis del MenC bruto se realizó utilizando una membrana Spectra/Por® (Spectrum Laboratories, Laguna
Hills, CA) con un límite de exclusión de 10.000 PM para sustituir el tampón de fosfato de sodio por los diversos tampones ensayados en la presente. Tras la diálisis, la disolución bruta de MenC se diluyó con diversos volúmenes de tampón y las cantidades apropiadas de excipientes para producir una concentración de proteínas deseada de 1,045 mg/ml. En las formulaciones se emplearon fosfato de sodio, clorhidrato de histidina, y clorhidrato de imidazol, todos a pH 7,2. Las concentraciones de los tampones variaban de 5 a 10 mM. Los excipientes utilizados fueron manitol, mezclas de manitol y sacarosa, o sacarosa. Las concentraciones de excipientes fueron de 1,5%, 3% o 5%. En algunas formulaciones también se añadió Tween-80®. Después de su preparación, todas las disoluciones de MenC bruto formuladas se filtraron a través de filtros Millipore de 0,22 \mum estériles y se conservaron a 4ºC.

Liofilización: El producto final se preparó mediante la liofilización del MenC bruto. El ciclo de congelación-secado incluía varias etapas diferentes y fue distinto para las formulaciones de manitol (A*), manitol y sacarosa (B), y sacarosa (C) (véase la tabla 1).

Análisis HPSEC (cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento): Se emplearon columnas TSK
GEL^{R}G4000SW_{XL} (30 cm x 7,8 mm de diámetro interno) (TosoHaas, Montgomeryville, PA), columnas de geles hidrófilos de partículas pequeñas para la separación SEC (cromatografía de exclusión molecular) en una fase móvil acuosa, para el análisis de la vacuna MenC-CRM 197 después de la liofilización y la solubilización. Según las instrucciones suministradas por el fabricante, el número de placas teóricas era mayor que 16.000 y el factor de asimetría era de 0,7 a 1,6.

Los análisis HPSEC demostraron unos tiempos de retención de 18,3 minutos y 22,8 minutos para MenC-CRM 197 (Siena) y el MenC bruto, respectivamente. La recuperación de MenC, medida con el detector de fluorescencia, era de aproximadamente 95% (valor calculado a partir de 5 medidas para unos volúmenes de inyección de 10 \mul). El aumento del volumen de inyección condujo a un aumento proporcional en el área de los picos principales. La reproductibilidad de las inyecciones era alta con un error estándar (desviación estándar x 100/área media de los picos) menor que 1%. La precisión de 10 inyecciones (cada una de 20 \mul) de diferentes viales también era alta (valor medio = 19,83 \mul, desviación estándar = 0,085 \mul). Se descubrió que el volumen mínimo de inyección (desviación estándar = 0,1 \mul de 20 \mul) era de 35 \mul.

Un cromatograma típico de MenC-CRM 197 (liofilizado) se presenta en la figura 1, y muestra un pico ancho, no simétrico, entre 19-24 minutos (pico principal). Después de estresar la muestra aparecieron dos picos más: uno relacionado con el producto con un mayor peso molecular (un producto de la agregación) con un tiempo de retención entre 15-17 minutos, y otro con un peso molecular menor (producto de la fragmentación) con un tiempo de retención mayor que 24 minutos.

Para la cromatografía en columna, el caudal era de 0,5 ml/min, la presión era de entre 2.413,16-2.757,90 kPa, la fase móvil era tampón fosfato 100 mM (pH = 7,2) con (NH_{4})_{2}SO_{4} 200 mM (calidad HPLC, Bio-Rad), a temperatura ambiente. Se detectaron las emisiones de las muestras con el detector de UV a 214 nm y el detector de fluorescencia a 280 nm de excitación y 340 nm de emisión. Se empleó como patrón un patrón de filtración en gel que contenía gamma-globulina, ovoalbúmina, mioglobina y vitamina B-12 (Bio-Rad). El análisis se realizó utilizando un sistema de HPLC Waters 510 con dos bombas, que consistía en un controlador de gradiente automático Waters y bombas modelo 510, un detector de la absorbancia ajustable Waters 486, un sistema de inyección Waters 712 WISP, y un detector L-7480 Hitachi F1 con una lámpara de Xe.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no deben considerarse que limiten la invención de ninguna manera. Los expertos en la técnica reconocerán las modificaciones que están dentro del espíritu y el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Experimento de congelación con indicador de pH

Se prepararon 18 formulaciones diferentes para estudiar la influencia de la composición de la disolución sobre el cambio en el pH durante la congelación. La tabla 2 muestra las variaciones en las concentraciones del tampón fosfato, las concentraciones de excipientes, y la proporción de manitol-sacarosa en estas formulaciones. El valor inicial de pH para todas las formulaciones era de pH 7,2. El experimento de congelación se realizó en una cámara de liofilización e incluía varias etapas. Las muestras se cargaron en la cámara de liofilización y se mantuvieron durante 0,2 horas a 20ºC. Las muestras entonces se enfriaron hasta -50ºC con una velocidad de pendiente de 60ºC/minuto, y después se mantuvieron a -50ºC durante 0,5 horas. Después, las muestras se calentaron hasta -20ºC con una velocidad de pendiente de 60ºC/minutos, y se mantuvieron a -20ºC durante 0,5 horas. Las muestras se enfriaron hasta -50ºC con una velocidad de pendiente de 60ºC/minuto, y después se calentaron hasta -20ºC con una velocidad de pendiente de 60ºC/minuto.

Después de la liofilización se tomaron medidas de pH en diversos momentos del tiempo y temperaturas. El experimento se realizó con un indicador de pH universal que cambia de color con el cambio de pH. Cada color se relaciona con el pH pertinente. Las medidas de pH se tomaron en el tiempo cero a 20ºC (momento 1), después de 3 horas a -20ºC (momento 2), después de 4 horas a -50ºC (momento 3), y después de 5 horas a -20ºC (momento 4). Las muestras se mantuvieron a -20ºC durante la noche y las siguientes medidas se tomaron a -20ºC después de 34,5 horas (momento 5). Un estudio estadístico de 144 viales que contenían diversas formulaciones (8 viales para cada formulación; 18 formulaciones) se realizó a -20ºC después de 34,5 horas.

Se sabe que los tampones fosfato cambian el pH durante el congelamiento desde una temperatura de 20ºC (2) hasta -20ºC (4). Las formulaciones que contienen manitol o la mezcla de manitol y sacarosa mostraron menos cambios en el pH (véase la tabla 2). A -50ºC, el pH estaba entre aproximadamente 5 y 5,5, y a -20ºC, el pH estaba entre aproximadamente 6 a 6,5. No se observaron cambios significativos en el pH de las diversas formulaciones durante las 5 horas iniciales. Sin embargo, se produjeron ciertos cambios de color después de 34,5 horas, concretamente la aparicición de manchas naranjas y rojas en la interfase del sólido amarillo y naranja. El área de las manchas rojas aumentó con el tiempo. Esta observación demuestra que la cristalización de las sales fosfato era un proceso lento y aleatorio. Además, dos sales, el fosfato de monosodio y el fosfato de disodio, tenían diferentes puntos de cristalización, -9,7ºC y -0,5ºC, respectivamente.

El estudio estadístico de los cambios en el pH durante la congelación indicó que las observaciones podían dividirse en tres grupos:

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El porcentaje de las muestras que pertenecen a cada grupo se calculó utilizando el fórmula: % = n x 100/N, en la que n es el número de muestras en cada grupo, y N es el número total de muestras analizadas (en este caso N = 8) (véase la tabla 2).

El análisis estadístico presentado en la tabla 2 muestra que, en gran medida, las formulaciones que contenían manitol pertenecen a los grupos 2 y 3, mientras que las formulaciones con un alto contenido en sacarosa pertenecen al grupo 1. Por tanto, la sustitución de una parte del manitol por sacarosa produjo menos cambios en el pH. Cuanta más sacarosa estaba presente en la formulación, más pequeño resultó el cambio en el pH. Los resultados más notables se obtuvieron con excipientes al 1,5% (con manitol al 80%, 90% o 100%) en tampón fosfato 10 mM, y con excipientes al 5% (con manitol al 80% o 90%) que contenían sacarosa en tampón fosfato 5 mM, cada uno de los cuales provocó que 100% de las muestras se englobaran en el grupo amarillo.

La adición de compuestos orgánicos inertes, tales como manitol y sacarosa, disminuye los cambios en el pH del tampón fosfato. Este efecto de los aditivos puede estar relacionado con la mayor viscosidad de la formulación, que puede inhibir el crecimiento de cristales y la precipitación de las sales fosfato. Debido a que las propiedades viscoeslásticas de la disolución pueden afectar a la temperatura de cristalización (5), las propiedades evitaron la cristalización de la sal tras el enfriamiento, lo cual produce un líquido superenfriado disperso en un red de cristales de hielo.

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Ejemplo 2 Efecto de la selección del tampón sobre la recristalización

Se ha indicado que el manitol en agua muestra una pico exotérmico a aproximadamente -25ºC debido a la cristalización del manitol (Gatlin et al., J. Parent. Drug. Assoc., 1980, 344:398-408). En presencia de tampón fosfato de sodio, la temperatura del pico exotérmico es diferente de la de la disolución acuosa (Williams et al., J. Parent. Sci. Tech., 1991, 45:94-100; Seguro et al., Cryobiology, 1990, 27:70-79). Las diferencias en el comportamiento térmico pueden estar relacionadas con los cambios en la cristalinidad (Izutsu et al., Pharm. Res., 1993, 10, nº 8, 1232-1237).

El diagrama de DSC en las figuras 2A-C muestra que una disolución de manitol al 3% en tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, provocó una recristalización exotérmica a -23,5ºC (\DeltaH = -7735,2 mJ/mg) y una transición vítrea endotérmica a -32ºC (\DeltaCp = 351 mJ/grados.mg) y -30,1ºC (\DeltaCp = 442 mJ/grados.mg) (figuras 2a y 2b). La sustitución del 25% de manitol por sacarosa produjo una disminución del pico de recristalización (\DeltaH = -2572 mJ/mg) y un desplazamiento de las temperaturas de transición vítrea hasta -41,4ºC (\DeltaCp = 6,7 mJ/grados.mg) y -31,0ºC (\DeltaCp = 93 mJ/grados.mg). El análisis térmico de la disolución de sacarosa (figura 2C) en tampón fosfato de sodio mostró sólo la transición vítrea a -29,2ºC (\DeltaCp = 289,8 mJ/grados.mg). Por tanto, la adición de sacarosa a la disolución de manitol cristalizable produjo la formación de manitol amorfo durante el enfriamiento y evitó la cristalización.

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Ejemplo 3 Estabilización del MenC bruto con sacarosa

Se demostró la estabilización del MenC bruto con sacarosa en un experimento de congelación (figura 3). Se prepararon catorce formulaciones de MenC bruto como se describió anteriormente con diversas composiciones de excipientes amorfos y concentraciones de tampón fosfato (tabla 3). Las formulaciones se liofilizaron según el procedimiento B (véase la tabla 1). La liofilización incluyó el congelamiento con asociación como anteriormente fue desarrollado en Siena, Italia (Carpenter et al., 1988, 25:244-255). La supresión de la agregación durante la liofilización, según se determina mediante cromatografía de exclusión molecular, se empleó para calibrar la estabilización. Tal como se muestra en la figura 4, se descubrió que la supresión de la agregación estaba directamente relacionada con el contenido en sacarosa.

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Ejemplo 4 La sustitución del tampón fosfato de sodio por tampón amorfo aumenta la estabilidad de las formulaciones de MenC bruto

Se emplearon disoluciones de clorhidrato de histidina-histidina y clorhidrato de imidazol-imidazol, ambas a pH 7,2, como tampones. Se utilizó sacarosa pura sin manitol para estabilizar las proteínas. Se ensayaron diversas formulaciones para intentar estabilizar el MenC bruto. Estas formulaciones se liofilizaron según el procedimiento C (véase la tabla 1).

El ciclo de liofilización incluyó una única congelación sin asociación y un secado primario a -35ºC, una temperatura menor que la temperatura de transición vítrea de la sacarosa. Debido al estado amorfo del excipiente durante la liofilización, el tiempo total del ciclo de congelación aumentó, así como la presión de vacío. Los resultados presentados en la tabla 3 demuestran que se evitó completamente la agregación durante la liofilización. En experimentos control, es decir, con tampones y/o excipientes no amorfos, la agregación fue mayor que la observada con las disoluciones de ensayo. Por ejemplo, la agregación fue de 3,3% en tampón fosfato de sodio 10 mM con sacarosa, y de 9,5% en tampón fosfato de sodio 10 mM con manitol. La agregación fue de 0% en tampón imidazol 10 mM con sacarosa al 1,5%, y de 0,78% en tampón histidina 10 mM con sacarosa al 1,5%.

Ejemplo 5 Estudio de estabilidad

Muestras sólidas de MenC-CRM 197, después de una liofilización, se estresaron a 4ºC, 25ºC o 37ºC en un incubador durante un periodo de 3 meses. En momentos del tiempo seleccionados, las muestras se retiraron del incubador, se reconstituyeron con 0,6 ml de agua destilada, y se analizaron mediante HPSEC. Todas las formulaciones fueron estables a 4ºC, es decir, no mostraron un aumento en la agregación tras su conservación.

Las muestras de MenC-CRM 197 (Siena) mostraron mayor agregación durante el ensayo de estrés que las formulaciones que contenían tampones imidazol o histidina (figura 5). El uso de tampones histidina o imidazol en la formulación de MenC-CRM 197 aumentó la estabilidad de la vacuna. Aunque los inventores no pretenden limitarse a este mecanismo, se piensa que la estabilización puede ser debida a la interacción del triptófano de CRM 197 con el anillo de imidazol, estructuralmente similar.

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TABLA 1 Proceso de liofilización para las formulaciones de MenC-CRM 197

1

TABLA 2

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Cambios en el pH durante el experimento de congelación con el indicador de pH

3

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TABLA 3

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Agregación de una formulación de imidazol e histidina de la vacuna MenC-CRM 197 sometida a liofilización

5

Claims (18)

1. Un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo, al menos un tampón amorfo, y al menos un inmunógeno del meningococo C (MenC).

2. El tampón de disolución de la reivindicación 1, en el que el tampón amorfo es un tampón orgánico.

3. El tampón de disolución de la reivindicación 2, en el que el tampón orgánico se selecciona del grupo que consiste en tampón imidazol y tampón histidina.

4. El tampón de disolución de la reivindicación 1, en el que el excipiente amorfo es un azúcar.

5. El tampón de disolución de la reivindicación 4, en el que el azúcar es sacarosa.

6. El tampón de disolución de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inmunógeno del meningococo C (MenC) es MenC-CRM 197.

7. Un procedimiento para estabilizar uno o más inmunógenos del meningococo C (MenC) tras una liofilización, que comprende:

(a) disolver el inmunógeno del meningococo C (MenC) en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y

(b) liofilizar la mezcla.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el inmunógeno del meningococo C (MenC) es MenC-CRM 197.

9. Una composición liofilizada estabilizada según el procedimiento de la reivindicación 7, que comprende al menos un excipiente amorfo, al menos un tampón amorfo, y al menos un inmunógeno del meningococo C (MenC).

10. Un procedimiento para conservar uno o más inmunógenos del meningococo C (MenC), que comprende:

(a) disolver el inmunógeno del meningococo C (MenC) en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y

(b) liofilizar la mezcla.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el inmunógeno del meningococo C (MenC) es MenC-CRM 197.

12. Un procedimiento para la liofilización de un inmunógeno del meningococo C (MenC), que comprende:

disolver un inmunógeno del meningococo C (MenC) en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla;

cargar la mezcla de 10ºC a 20ºC bajo 1000 Pa a 2000 Pa de presión;

congelar la mezcla durante 1 hora a 4 horas hasta una temperatura de -70ºC a -50ºC bajo 1000 Pa a 2000 Pa de presión;

secar la mezcla durante 18 horas a 30 horas a una temperatura de -50ºC a -35ºC bajo una presión de 5 Pa a 10 Pa; y

secar la mezcla durante 2 horas a 12 horas a una temperatura de 10ºC a 20ºC bajo una presión de 5 Pa a 10 Pa.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el inmunógeno del meningococo C (MenC) es MenC-CRM 197.

14. Un procedimiento para la liofilización de un inmunógeno del meningococo C (MenC), que comprende:

disolver un inmunógeno del meningococo C (MenC) en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla;

cargar la mezcla a 10ºC bajo 1000 Pa de presión;

congelar la mezcla durante 2 horas hasta una temperatura de -50ºC bajo 1000 Pa de presión;

secar la mezcla durante 24 horas a una temperatura de -35ºC bajo una presión de 5 Pa; y

secar la mezcla durante aproximadamente 8 horas a una temperatura de 20ºC bajo una presión de aproximadamente 5 Pa.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el inmunógeno es MenC-CRM 197.

16. Un procedimiento para estabilizar una vacuna de meningococo C (MenC) tras una liofilización, que comprende:

(a) disolver la vacuna de meningococo C (MenC) en un tampón de disolución que comprende al menos un excipiente amorfo y un tampón amorfo para formar una mezcla, y

(b) liofilizar la mezcla.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la vacuna de meningococo C (MenC) es MenC-CRM 197.

18. Una vacuna de meningococo C (MenC) estabilizada según el procedimiento de la reivindicación 16, que comprende al menos un excipiente amorfo y al menos un tampón amorfo.