KR20120023177A

KR20120023177A - Ｂ형 림프성 조혈 증식에 대항하는 세포독성 항체

Info

Publication number: KR20120023177A
Application number: KR1020127000194A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 데 로메우프; 크리스틴 카우체르; 쟌-루크 테일라우드; 쟌-프란코이스 프로스트
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date: 2004-12-15
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2012-03-12
Also published as: BRPI0519044A2; FR23C1038I1; FR2879204B1; WO2006064121A3; AU2005315534B2; CN101115772A; IL183947A0; US9873745B2; NL301242I2; KR20070102513A; FR23C1038I2; AU2005315534A1; DK1824887T3; KR101418695B1; CN101115772B; US20090053233A1; EP2949674A1; JP2012126724A; EP1824887A2; JP5693440B2

Abstract

본 발명은 CD20 항원에 대한 단클론 항체에 관계하는데, 여기서 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 번호: 5와 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 번호: 7과 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역이다; 또한, 본 발명은 면역 효과 세포 내에서 FcγRIIIA 수용체의 활성화 및 약제, 특히 백혈병 또는 림프종의 치료를 위한 약제의 제조에서 이런 항체의 용도에 관계한다.

Description

Ｂ형 림프성 조혈 증식에 대항하는 세포독성 항체{CYTOTOXIC ANTIBODY DIRECTED AGAINST TYPE-B LYMPHOID HAEMATOPOIETIC PROLIFEEATIONS}

본 발명은 CD20 항원에 대한 단클론 항체에 관계하는데, 여기서 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역이다; 또한, 본 발명은 면역 효과 세포 내에서 FcγRIIIA 수용체의 활성화 및 약제, 특히 백혈병 또는 림프종의 치료를 위한 약제의 제조에서 이런 항체의 용도에 관계한다.

CD20 항원은 성숙 B 림프구의 표면 상에 존재하는 35-37 kDa의 분자량을 갖는 소수성 막통과 단백질이다(Valentine et al . (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84(22): 8085-8089; Valentine et al . (1989) J. Biol . Chem., 264(19): 11282-11287). 이는 초기 프리-B 단계와 같은 B 림프구 세포(B 세포)의 발달 동안 발현되는데, 이러한 발현은 형질세포(plasmocyte)로의 분화 시점에서 소멸된다. CD20 항원은 정상 B 림프구와 악성 B 세포 모두에 존재한다. 더욱 구체적으로, CD20 항원은 대부분의 표현형-B 림프종(80% 림프종)에서 발현된다: 가령, 이는 90% 이상의 비-호지킨 B-세포 림프종(NHL) 및 95% 이상의 B형 만성 림프구 백혈병(B-CLL)에서 발현된다. CD20 항원은 조혈 줄기 세포 및 혈장세포에서 발현되지 않는다.

CD20의 기능은 아직 분명하지 않지만, 칼슘 채널(calcium channel)로서 기능하고 B 림프구 분화의 첫 번째 단계의 조절(Golay et al . (1985) J. Immunol. 135(6):3795-3801) 및 증식(Tedder et al . (Aug 1986) Eur . J. Immunol. 16(8): 881-887)에 관여하는 것으로 보인다.

이런 이유로, B 세포의 활성화와 증식에서 역할과 관련하여 일부 불확실한 부분이 남아있긴 하지만, CD20 항원은 CD20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한, 종양 B 세포, 예를 들면, NHL 또는 B-CLL과 연관된 질환의 치료에서 위치적으로 중요한 표적이다. 더 나아가, 이러한 항원은 발현 조절 또는 다형성이 알려져 있지 않은 막 단백질이라는 점에서, 이상적인 표적이다.

단지 비-방사성 표지된 항-CD20 단클론 항체, Rituxan？(Genentech)만 B-세포 림프종의 치료를 위하여 현재 상업적으로 구입가능하다. 이는 화학요법과 복합되는 경우에, NHL 환자에서 고무적인 임상적 결과를 나타낸다. 하지만, 이의 효능은 단독으로 사용되는 경우에, 가변적이고 경미하다(Teeling et al . (2004) Blood 104 (6): 1793-1800).

이에 더하여, Rituxan？은 B-CLL에서 B 세포에 대해 경미한 효과를 나타낸다. 이러한 낮은 수준의 효능은 다양한 현상과 상관하였다: 한편으로, B-CLL B 세포는 상대적으로 적은 양으로 CD20을 발현하고, 다른 한편으로, Rituxan？은 시험관내에서 이들 세포에 대한 매우 낮은 ADCC(항체-의존성 세포-매개된 세포독성) 활성을 유도한다. 이들 2가지 관찰 결과는 종양에서 CD20의 발현 수준(정량적 유세포분석에서) 및 치료에 대한 반응 사이에 관찰되는 상관관계를 설명할 수 있다.

B-CLL이 서구 국가에서 백혈병의 가장 일반적인 형태이고, 고용량 화학요법 치료가 때때로, 불충분하고 조혈 형성 부전(haematopoietic aplasia)과 면역결핍(immunodeficiency)을 유발하는 부작용을 수반하기 때문에, 단클론 항체는 혁신적인 방식인 것으로 생각된다. 이런 이유로, CD20 항원을 특이적으로 표적할 수 있고, 이러한 항원을 제한된 수준을 발현하는 B-CLL과 같은 종양 세포를 파괴할 수 있는 항체를 개발하는 것이 매우 중요하다.

B-CLL의 치료를 위한, Genmab(Teeling et al. (2004) Blood 104(6): 1793-1800)에 의해 제안된 항체 2F2와 7D8은 보체를 활성화하는 능력에서, Rituxan？보다 우월하다. 하지만, 이들 항체는 Rituxan？에서와 유사하게, 낮은 ADCC 활성을 나타낸다. 일부 임상의는 보체 활성이 유해 부작용의 원인임을 발견하였는데, 그 이유는 이들 항체가 넓은 스펙트럼의 비-특이적 활성(염증 반응, 알레르기 반응 또는 혈관 반응 등)을 나타내는 분자(특히, 아나필라톡신(anaphylatoxin))의 생산을 유발하는 활성화 시스템을 유인하기 때문이다. 이에 더하여, 이들 항체는 여전히 연구 단계에 있고, 임상적 효능이 아직 평가되지 않았다.

출원 FR03/02713(WO 2004/029092)에서는 YB2/0 세포주에서 생산될 수 있고, Rituxan？과 비교하여, Jurkat-CD16 세포에 의한 높은 ADCC 활성과 높은 수준의 IL-2 생산을 유도할 수 있는 능력에 대하여 선별된 항-CD20 항체를 기술한다. 현재 구입가능한 면역치료제를 이용하여 치료될 수 있는 B-세포의 범위를 확대할 수 있는 새로운 항-CD20 항체가 현저하게 요구된다; 이러한 항체는 관련된 B 세포의 개체군에서 CD20 항원이 소량으로 발현되고 만족스런 면역치료제가 현재하지 않는 B-세포 질환에서 특히 요구된다.

이런 이유로, 본 발명의 첫 번째 목적은 CD20 항원에 대한 단클론 항체에 관계하는데, 여기서 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역이다.

이들 항체는 이황화 결합으로 서로 연결된 중쇄와 경쇄로 구성된다. 각 사슬은 N-말단 위치에서, 항체가 지향하는 항원에 특이적인 가변 영역(또는 도메인)(경쇄의 경우에 재정렬된 V-J 유전자 및 중쇄의 경우에 V-D-J 유전자에 의해 인코딩되는) 및 C-말단 위치에서, 경쇄의 경우에 단일 CL 도메인, 또는 중쇄의 경우에 여러 도메인의 불변 영역으로 구성된다.

본 발명에서, “단클론 항체” 또는 “단클론 항체 조성물”은 동일하고 독특한 특성을 갖는 항체 분자의 제조물을 의미한다.

경쇄와 중쇄에서 가변 영역이 경쇄와 중쇄의 불변 영역이 유래된 종으로부터 상이한 종으로부터 유래되는 본 발명에 따른 항체는 “키메라” 항체라고 한다.

뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 SEQ ID No. 7은 각각, 수탁 번호 ACC 474하에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)에서 입수가능한 뮤린 하이브리도마 CAT-13.6E12에 의해 생산되는 항체의 각 경쇄의 가변 도메인과 각 중쇄의 가변 도메인을 코딩한다. 상기 하이브리도마는 CD20에 대한 뮤린 IgG2a,κ-타입 단클론 항체를 생산한다.

이들 뮤린 서열은 CD20 항원에 대한 CAT-13.6E12 뮤린 항체의 특이성으로 인하여, 본 발명에 따른 항체의 가변 영역의 서열을 얻기 위하여 선택되었는데, 상기 항원은 Rituxan？에 의해서도 인식되었다. 본 발명에 따른 항체의 이들 가변 영역은 서열 SEQ ID No. 5와 SEQ ID No. 7과 적어도 70% 동일성을 보유하는데, 이러한 서열 동일성은 CAT-13.6E2 뮤린 항체의 특이성과 동일한 특이성을 갖는 본 발명에 따른 항체를 제공한다. 적절하게는, 이러한 서열 동일성은 CAT-13.6E12 뮤린 항체의 표적과 동일한 표적에 대한 친화성을 갖는 본 발명에 따른 항체를 생산한다.

이에 더하여, 본 출원인들은 놀랍게도, CAT-13.6E12 뮤린 항체가 FcγRIIIA 수용체의 엑토도메인(ectodomain)을 발현하는 Jurkat-CD16 세포의 존재에서 IL-2의 분비를 유도하는 능력을 보유한다는 것을 발견하였는데(도 11), 이는 뮤린 항체와 인간 CD16(FcγRIIIA) 사이에 강한 결합을 지시하고, 이러한 결합은 본 출원인에 의한 선택의 동기가 되었다.

이에 더하여, 본 발명에 따른 항체에서, 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래된다. 이와 관련하여, 모든 비-뮤린 포유동물 종과 과, 특히, 인간, 원숭이, 뮤린(생쥐와 별개), 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 조류가 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 당업자에게 널리 공지된 표준 재조합 DNA 기술, 더욱 구체적으로, 예로써, Morrison et al .(1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855에 기술된 “키메라” 항체 작제 기술을 이용하여 작제될 수 있는데, 여기서 항체 내에 비-인간 포유동물로부터 중쇄의 불변 영역 및/또는 경쇄의 불변 영역을 인간 면역글로불린 내에서 상응하는 영역으로 대체하는데 재조합 DNA 기술이 이용된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 80% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 본 발명에 따른 항체의 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 80% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 90% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 본 발명에 따른 항체의 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 90% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 95% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 본 발명에 따른 항체의 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 95% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 본 발명에 따른 항체의 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩된다.

적절하게는, 본 발명은 표적에 대한 항체의 특이성 또는 친화성에 영향을 주지 않으면서, 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 하나이상의 아미노산의 하나이상의 치환, 삽입 또는 결실을 보유하는 임의의 항체에 관계하는데, 이들 서열 변형은 앞서 정의된 서열 동일성 비율 수준을 준수한다.

또한, 본 발명의 항체는 FR(구조) 영역(가변 영역의 고도로 보존된 영역, 또는 “골격” 영역)과 결합된, CAT-13.6E12 항체의 CDR(상보성 결정 영역, Complementary Determining Region)을 보유하는 임의의 항체이다. 이들 항체는 CAT-13.6E12 뮤린 항체의 친화성과 특이성에 거의 필적하는, 바람직하게는, 동일한 친화성과 특이성을 갖는다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5 또는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25에 의해 인코딩되고, 본 발명에 따른 항체의 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7에 의해 인코딩된다.

이런 이유로, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 CD20 항원에 대한 단클론 항체이고, 여기서 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역이다.

이런 이유로, 두 번째 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 CD20 항원에 대한 단클론 항체이고, 여기서 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역이다.

이들 양쪽 구체예에서, 항체는 뉴클레오티드 서열 내에서 단일 뉴클레오티드: 각각, 시토신과 아데닌에 해당하는, SEQ ID No. 5와 SEQ ID No. 25 내에서 318번 뉴클레오티드에 의해 구별된다.

이들 구체예에 따른 본 발명의 항체는 표적 항원 CD20에 대하여, CAT-13.6E12 뮤린 항체의 특이성과 친화성에 필적하는, 바람직하게는 동일한 특이성과 친화성을 갖는다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄와 각 중쇄의 불변 영역은 인간 불변 영역이다. 본 발명의 이러한 바람직한 구체예에서, 항체의 면역원성이 인간에서 감소되고, 결과적으로, 이들 항체의 효능이 인간에 치료적 투여이후 개선된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역은 κ 타입이다. 임의의 동종이형, 예를 들면, Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) 또는 Km(3)이 본 발명의 실행에 적합하긴 하지만, 바람직한 동종이형은 Km(3)이다.

다른 구체예에 따라, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄의 불변 영역은 λ 타입이다.

본 발명의 특정 측면에서, 특히, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄와 각 중쇄의 불변 영역은 인간 영역이고, 이러한 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 γ 타입이다. 이의 대안에서, 이러한 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 γ1, γ2 또는 γ3 타입이고, 이들 3가지 불변 영역 타입은 인간 보체에 결합하는 특이적인 특징을 나타내고, 또는 γ4 타입이다. 각 중쇄에서 γ-타입 불변 영역을 보유하는 항체는 IgG 집합에 속한다. 면역글로불린 G(IgG)는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성되는 이형이량체(heterodimer)이다. 각 사슬은 N-말단 위치에서, 항체가 지향하는 항원에 특이적인 가변 영역(또는 도메인)(경쇄의 경우에 재정렬된 V-J 유전자 및 중쇄의 경우에 V-D-J 유전자에 의해 인코딩되는) 및 C-말단 위치에서, 경쇄의 경우에 단일 CL 도메인, 또는 중쇄의 경우에 3개의 도메인(CH₁, CH₂, CH₃)의 불변 영역으로 구성된다. 가변 도메인 및 중쇄와 경쇄의 CH1과 CL 도메인을 결합시키면 Fab 단편이 만들어지는데, 이들 단편은 각 Fab 단편이 항원 표적에 결합할 수 있도록 하는 고도로 유연한 힌지 영역(hinge region)을 통하여 Fc 영역에 연결되고, 상기 항체의 효과 특성(effector property)의 매개인자인 상기 Fc 영역은 FcγR과 C1q 수용체와 같은 효과 분자(effector molecule)에 여전히 접근가능하다. CH₂와 CH₃ 구형 도메인으로 구성되는 Fc 영역은 CH₂ 도메인에서 당화되는데, Asn 297에 연결된 락토사민-타입 비안테나리(biantennary) N-글리칸이 2개의 사슬 각각에 존재한다.

적절하게는, 이러한 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 γ1 타입인데, 그 이유는 이런 항체가 최대치의 (인간)개체에서 ADCC 활성을 유도하는 능력을 나타내기 때문이다. 이와 관련하여, 임의의 동종이형, 예를 들면, G1m(3), G1m(1, 2, 17), G1m(1, 17) 또는 G1m(1, 3)이 본 발명의 수행에 적합하다. 적절하게는, 동종이형은 G1m(1, 17)이다.

본 발명의 특정 측면에서, 이러한 항체의 각 중쇄의 불변 영역은 γ1 타입이고, 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 23에 의해 인코딩되고, 각 경쇄의 불변 영역은 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 의해 인코딩된다. 따라서, 이런 항체는 뮤린 가변 영역과 인간 불변 영역 및 γ1-타입 중쇄를 보유한다. 따라서, 이러한 항체는 IgG1 부분집합에 속한다. 본 발명에 따른 항체의 이러한 구체예에서, 상기 항체는 2개의 경쇄를 보유하고, 이들의 가변 도메인은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5 또는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25에 의해 인코딩되고 이들의 인간 불변 영역은 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 의해 인코딩되고, 또한, 2개의 중쇄를 보유하고, 이들의 가변 도메인은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7에 의해 인코딩되고 이들의 불변 영역은 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 23에 의해 인코딩된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체의 각 경쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13 또는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27에 의해 인코딩되고, 각 중쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩된다. 이러한 항체의 각 경쇄를 코딩하는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13은 상기 항체의 각 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5를 상기 항체의 각 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 융합함으로써 획득된다.

이러한 항체의 각 경쇄를 코딩하는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27은 상기 항체의 각 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25를 상기 항체의 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 융합함으로써 획득된다.

이러한 항체의 각 중쇄를 코딩하는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19는 상기 항체의 각 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7을 상기 항체의 각 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 23에 융합함으로써 획득된다.

본 발명의 특정 측면에서, 이러한 항체의 각 경쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13에 의해 인코딩되고, 각 중쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩되는 경우에, 핵산 서열 SEQ ID No. 13으로부터 추론된 각 경쇄의 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 14이고, 핵산 서열 SEQ ID No. 19로부터 추론된 각 중쇄의 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 20이다.

본 발명의 다른 특정 측면에서, 이러한 항체의 각 경쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27에 의해 인코딩되고, 각 중쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩되는 경우에, 핵산 서열 SEQ ID No. 27로부터 추론된 각 경쇄의 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 28이고, 핵산 서열 SEQ ID No. 19로부터 추론된 각 중쇄의 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 20이다.

이들 펩티드 서열 SEQ ID No. 14와 SEQ ID No. 28은 이들 2개의 서열 각각에서 106번 위치에 존재하는 아미노산에 의해서만 구별된다. 106번 위치에 존재하는 아미노산은 서열 SEQ ID No. 28에서 리신(K)이고, 서열 SEQ ID No. 14에서 아스파라긴(N)이다.

또한, 본 발명은 뮤린-인간 키메라 핵산 서열에 의해 인코딩되는 각 경쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13과 적어도 70% 상동성 또는 동일성을 공유하고, 뮤린-인간 키메라 핵산 서열에 의해 인코딩되는 각 중쇄가 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19와 적어도 70% 상동성 또는 동일성을 공유하는 항체에 관계하는데, 이들 변형은 상기 항체의 특이성 및 이의 효과 활성, 예를 들면, ADCC(항체-의존성 세포-매개된 세포독성) 활성에 부정적인 영향을 주지 않는다.

특히 바람직한 방식에서, 본 발명의 항체는 쥐 하이브리도마 세포주에 의해 생산된다. 본 발명에 따른 항체를 생산하는 이러한 세포주는 중요한 특징인데, 그 이유는 상기 세포주가 일정한 특성을 갖는 항체를 생산하기 때문이다. 실제로, 이러한 항체의 발현 방법은 번역후 수식, 특히, 당화 변형을 유도하는데, 이는 각 세포주마다 상이하고, 이런 이유로, 상이한 기능적 특성의 동일한 일차 구조를 보유하는 항체를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 이러한 항체는 쥐 하이브리도마 YB2/0 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1662 하에 the American Type Culture Collection에 기탁된 세포YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20)에서 생산된다. 상기 세포주는 예로써, CHO 세포에서 생산되는 동일한 일차 구조를 보유하는 항체와 비교하여 개선된 ADCC 활성을 갖는 항체를 생산하는 능력으로 인하여, 선택되었다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 바람직한 항체는 2004년 1월 8일자로, 등록 번호 CNCM I-3314하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 등록된 클론 R509에 의해 생산되는 항체 EMAB6이다. 상기 EMAB6 항체의 각 경쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13에 의해 인코딩되고, 각 중쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩된다. 이러한 키메라 항체는 CD20과의 결합에서 CAT-13.6E12 뮤린 항체와 경쟁하고, Rituxan？의 세포독성 활성보다 훨씬 높은 세포독성 활성을 나타내는데, 이는 이들 항체의 중쇄의 N-글리칸의 특이적인 당화에 부분적으로 기인한다(실시예 4 참조). 실제로, R509 클론의 특이적인 특징은 0.6 이하의 푸코스(fucose)/갈락토오스 비율을 갖는 EMAB6 항체 조성물을 생산한다는 점인데, 상기 비율은 특허 출원 FR 03 12229에서, 강한 ADCC 활성을 갖는 항체를 생산하는데 최적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 항체는 표적되는 세포가 CD20을 발현하는 질환의 치료를 위한 치료 도구로서 특히, 주목된다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 다른 바람직한 항체는 2005년 11월 29일자로, 등록 번호 CNCM I-3529 하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 등록된 클론 R603에 의해 생산되는 항체 EMAB603이다. EMAB603 항체의 각 경쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27에 의해 인코딩되고, 각 중쇄는 뮤린-인간 키메라 아미노산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩된다. 이러한 키메라 항체는 CD20과의 결합에서 CAT-13.6E12 뮤린 항체와 경쟁하고, Rituxan？의 세포독성 활성보다 훨씬 높은 세포독성 활성을 나타내는데, 이는 이들 항체의 중쇄의 N-글리칸의 특이적인 당화에 부분적으로 기인한다(실시예 3 참조). 실제로, R603 클론의 특이적인 특징은 0.6 이하의 푸코스(fucose)/갈락토오스 비율을 갖는 EMAB603 항체 조성물을 생산하다는 점인데(실시예 4 참조), 상기 비율은 특허 출원 FR 03 12229에서, 강한 ADCC 활성을 갖는 항체를 생산하는데 최적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 항체는 표적되는 세포가 CD20을 발현하는 질환의 치료를 위한 치료 도구로서 특히, 주목된다.

본 발명의 다른 목적은 서열 SEQ ID No. 12를 보유하는, 본 발명에 따른 항체의 경쇄의 발현을 위한 벡터 pEF-EMAB6-K에 관계한다. 이러한 벡터는 경쇄가 핵산 서열 SEQ ID No. 13에 의해 인코딩되고, 추론된 펩티드 서열이 서열 SEQ ID No. 14인 본 발명에 따른 항체가 발현될 수 있도록 하는 벡터이다. 상기 벡터는 이러한 항체의 각 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5 및 상기 항체의 각 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 SEQ ID No. 21이 삽입되어 숙주 세포 내에 도입되고 유지되는 핵산 분자이다. 상기 벡터는 외래 핵산 단편이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있도록 하는데, 그 이유는 상기 벡터가 이러한 발현에 필수적인 서열(프로모터, 폴리아데닐화 서열, 선별 유전자)을 보유하기 때문이다. 이들 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 암시적인 제한 없이, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 또는 박테리오파지일 수 있다. 이에 더하여, 임의의 포유동물 세포, 예를 들면, YB2/0, CHO, CHO dhfr-(가령, CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lec13, SP2/0, NSO, 293, BHK 또는 COS가 숙주 세포, 다시 말하면, 본 발명에 따른 항체를 발현하는 세포로서 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 서열 SEQ ID No. 18을 보유하는, 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 발현을 위한 벡터 pEF-EMAB6-H에 관계한다. 이러한 벡터는 중쇄가 핵산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩되고, 추론된 펩티드 서열이 서열 SEQ ID No. 20인 본 발명에 따른 항체가 발현될 수 있도록 하는 벡터이다. 상기 벡터는 이러한 항체의 각 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7 및 상기 항체의 각 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 SEQ ID No. 23이 삽입되어 숙주 세포 내에 도입되고 유지되는 핵산 분자이다. 상기 벡터는 외래 핵산 단편이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있도록 하는데, 그 이유는 상기 벡터가 이러한 발현에 필수적인 서열(프로모터, 폴리아데닐화 서열, 선별 유전자)을 보유하기 때문이다. 앞서 지적된 바와 같이, 이들 벡터는 예로써, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 또는 박테리오파지이고, 숙주 세포는 임의의 포유동물 세포, 예를 들면, YB2/0, CHO, CHO dhfr-(가령, CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lec13, SP2/0, NSO, 293, BHK 또는 COS이다.

YB2/0 세포 내에서 pEF-EMAB6-K와 pEF-EMAB6-H 벡터를 동시-발현함으로써 생산된 항체는 클론 R509(등록 번호 CNCM I-3314 하에 CNCM에 등록됨)에 의해 생산되는 항-CD20 EMAB6 항체로 예시된다. 상기 항체는 B-CLL 환자로부터 유래된 세포(CD20 항원이 더욱 낮은 수준으로 발현된다) 및 B-CLL 환자로부터 유래된 세포와 비교하여 더욱 높은 밀도로 CD20을 발현하는 모형으로서 이용되는 Raji 세포 모두에서, Rituxan？에 의해 유도되는 것보다 높은 세포독성을 유도한다. 더 나아가, EMAB6 항체는 Jurkat-CD16 세포에서, Rituxan？보다 훨씬 높은 수준에서 IL-2(인터루킨 2)의 분비를 유도한다. 이러한 EMAB6 항체는 앞서 기술된 벡터가 발현될 수 있도록 하는 조건 하에 배양 배지 내에서 R509 클론을 성장시킴으로써 생산될 수 있기 때문에, CD20 항원이 관여하는 B-세포 질환, 더욱 구체적으로, B-CLL의 치료와 진단을 진전시키고 이러한 분야를 연구하기 위한 매우 유망한 도구이다.

본 발명의 특정 목적은 본 발명에 따른 항체를 발현하는 안정한 세포주이다.

적절하게는, 본 발명에 따른 항체를 발현하는 안정한 세포주는 SP2/0, YB2/0, IR983F, 인간 골수종, 예를 들면, Namalwa, 또는 인간 기원의 임의의 다른 세포, 예를 들면, PERC6, CHO 세포주, 특히, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-(CHO DX B11, CHO DG44), 또는 Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H⁶, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653에서 선택되는 다른 세포주로 구성되는 군에서 선택된다.

적절하게는, 이용되는 세포주는 쥐 하이브리도마 YB2/0 세포주이다. 상기 세포주는 예로써, CHO 세포에서 생산되는 동일한 일차 구조를 보유하는 항체와 비교하여 개선된 ADCC 활성을 갖는 항체를 생산하는 능력으로 인하여, 선택되었다.

본 발명의 특정 측면에서, 본 발명에 따른 항체를 발현하고 앞서 기술된 군에서 선택되는 안정한 세포주는 앞서 기술된 바와 같이, pEF-EMAB6-K 발현 벡터와 pEF-EMAB6-H 발현 벡터를 통합한다.

본 발명의 특정 측면은 등록 번호 CNCM I-3314하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 등록된 클론 R509에 관계한다.

본 발명의 특정 측면은 등록 번호 CNCM I-3529하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 등록된 클론 R603에 관계한다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 서열 SEQ ID No. 19를 보유하는 DNA 단편에 관계한다. 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19는 이러한 항체의 각 중쇄를 코딩한다. 이는 상기 항체의 각 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7을 상기 항체의 각 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 23에 융합함으로써 획득된다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 서열 SEQ ID No. 13을 보유하는 DNA 단편에 관계한다. 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13은 이러한 항체의 각 경쇄를 코딩한다. 이는 상기 항체의 각 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5를 상기 항체의 각 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 융합함으로써 획득된다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 서열 SEQ ID No. 27을 보유하는 DNA 단편에 관계한다. 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27은 이러한 항체의 각 경쇄를 코딩한다. 이는 상기 항체의 각 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25를 상기 항체의 각 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 융합함으로써 획득된다.

본 발명의 특정 목적은 생체내 또는 시험관내에서, 효과 면역 세포의 FcγRIIIA 수용체를 활성화시키기 위한, 본 발명에 따른 항체의 용도에 관계한다. 실제로, 본 발명의 항체는 이러한 특이적인 특징 및 세포독성의 이점을 제공한다. 이런 이유로, 이들 항체는 그들의 Fc 영역으로 FcγRIIIA 수용체를 활성화시키는 능력을 나타낸다. 이는 상기 수용체가 “효과 세포(effector cell)”로서 알려져 있는 세포의 표면 상에서 발현된다는 점에서 상당히 흥미롭다; 효과 세포가 보유하는 수용체에 이러한 항체의 Fc 영역의 결합은 FcγRIIIA 수용체의 활성화 및 표적 세포의 파괴를 유도한다. 효과 세포는 예로써, NK(자연 킬러)세포, 대식세포, 호중구, CD8림프구, Tγδ림프구, NKT세포, 호산구, 호염기구 또는 비대세포(mastocyte)이다.

특정 측면에서, 본 발명의 항체는 약제로서 사용된다. 적절하게는, 이런 약제는 표적 세포가 CD20을 발현하는 세포, 예를 들면, 악성 B-세포 림프종인 질환의 치료에 의도된다.

바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 항체는 백혈병 또는 림프종의 치료를 위한 약제의 제조에 사용된다.

본 발명의 특정 목적은 자가-면역 질환을 비롯한 B 림프성 세포와 관련된 면역 기능장애 질환뿐만 아니라, B형 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, B형 만성 림프구 백혈병(B-CLL)을 비롯한 성숙 B-세포 림프종, 소형 B-세포 림프종, B-세포 프로림프구 백혈병, 림프형질세포(lymphoplasmocytic) 림프종, 외투 세포 림프종, 여포형 림프종, 변연부 MALT-타입 림프종, 림프절 변연부 림프종(단구양 B 세포를 포함하거나 포함하지 않음), 비장형 변연부 림프종(융모성 림프구를 포함하거나 포함하지 않음), 모발성세포(tricholeucocytic) 백혈병, 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종에서 선택되는 병리의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 다른 목적은 림프성 백혈병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 다른 목적은 B형 만성 림프성 백혈병(B-CLL)의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 더 나아가, 본 발명에 따른 항체는 CD20이 B 세포 상에서 적게 발현되는 질환, 바람직하게는, B-CLL(B형 만성 림프성 백혈병)의 치료에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 항체는 백혈병 또는 림프종의 치료를 위한 약제의 제조에서, 하나이상의 다른 항체, 예를 들면, 항원 HLA-DR, CD19, CD23, CD80, CD22, CD32, CD52와 같은, 림프성 세포 상에서 발현되는 항원과의 조합으로 사용된다. 따라서, 림프성 세포 상에서 많이 발현되는 분자, CD52 항원을 표적하고, 숙주 효과 기전(host effector mechanism)(보체 결합, 항체-의존성 세포독성)을 동원함으로써 세포 용해를 유도하는 인간화된 항체 Campath-1H？(alentuzumab, MabCampathR？)가 CLL의 치료에 사용된다(Moreton P., Hillmen P. (2003) Semin . Oncol. 30(4): 493-501; Rawstron A.C. et al, (2004) Blood 103(6): 2027-2031; Robak T. (2004) Leuk. Lymphoma 45(2): 205-219; Stanglmaier M. et al, (2004) Ann . Hematol. 83(10): 634-645). CLL 환자에서 항원 sHLA-DR, CD22, CD23, CD80을 표적하는 항체 또는 면역독소(immunotoxin)를 평가하기 위한 임상 검사 역시 진행 중에 있다. (Mavromatis B.H., Cheson B.D. (2004) Blood Rev. 18(2): 137-148; Mavromatis B., Cheson B.D. (2003) J. Clin . Oncol. 21(9): 1874-1881, Coleman M. et al, (2003) Clin . Cancer Res. 9: 3991S-3994S; Salvatore G. et al, (2002) Clin . Cancer Res. 8: 995-1002).

다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 FcγRs, 예를 들면, NK 세포, NKT(자연 킬러 T) 세포, Tγδ 림프구, 대식세포, 단핵구 또는 수상돌기 세포를 발현하는 세포와 조합으로, 다시 말하면, 세포 치료제와 조합으로 사용된다(Peller S., Kaufman S. (1991) Blood 78: 1569, Platsoucas C.D. et al, (1982) J. Immunol. 129: 2305; Kimby E. et al, (1989) Leukaemia 3(7): 501-504; SoorskaarD. et al, Int . Arch . Allery Appl. Immunol . 87(2): 159-164; Ziegler H.W. et al, (1981) Int . J. Cancer 27(3): 321-327; Chaperot L. et al, (2000) Leukaemia 14(9): 1667-1677; Vuillier F., Dighiero G. (2003) Bull . Cancer. 90(8-9): 744-750).

이에 더하여, 본 발명에 따른 항체는 환자에 투여되는 용량을 감소시킬 수 있다; 적절하게는, 환자에 투여되는 항체 용량은 Rituxan？의 용량보다 2 배, 5 배, 10 배, 25 배, 50 배, 또는 특히 바람직하게는, 100 배 적다. 적절하게는, 환자에 투여되는 항체 용량은 Rituxan？의 용량보다 2 내지 5 배, 5 내지 10 배, 5 내지 25 배, 5 내지 50 배, 또는 심지어 5 내지 100 배 적다. 따라서, 본 발명에 따른 항체, 예를 들면, EMAB6 항체는 바람직하게는, 187.5 ㎎/㎡, 75 ㎎/㎡, 37.5 ㎎/㎡, 15 ㎎/㎡, 7.5 ㎎/㎡ 이하, 또는 특히 바람직하게는, 3.75 ㎎/㎡ 이하이다_. 적절하게는, 투여되는 용량은 187.5 ㎎/㎡ 내지 75 ㎎/㎡, 또는 75 ㎎/㎡ 내지 37.5 ㎎/㎡, 75 ㎎/㎡ 내지 15 ㎎/㎡, 75 ㎎/㎡ 내지 7.5 ㎎/㎡, 또는 심지어 75 ㎎/㎡ 내지 3.75 ㎎/㎡이다.

따라서, 본 발명은 표적 세포가 CD20을 발현하는 세포인 질환, 예를 들면, 악성 B-세포 림프종을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물의 효과량을 환자에 투여하는 단계로 구성된다. 더욱 구체적으로, 이러한 치료 방법은 백혈병 또는 림프종의 치료에 특히 적합하다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 자가-면역 질환을 비롯한 B 림프성 세포와 관련된 면역 기능장애 질환뿐만 아니라, B형 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, B형 만성 림프구 백혈병(B-CLL)을 비롯한 성숙 B-세포 림프종, 소형 B-세포 림프종, B-세포 프로림프구 백혈병, 림프형질세포(lymphoplasmocytic) 림프종, 외투 세포 림프종, 여포형 림프종, 변연부 MALT-타입 림프종, 림프절 변연부 림프종(단구양 B 세포를 포함하거나 포함하지 않음), 비장형 변연부 림프종(융모성 림프구를 포함하거나 포함하지 않음), 모발성세포(tricholeucocytic) 백혈병, 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종에서 선택되는 병리를 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 항체 조성물의 효과량을 환자에 투여하는 단계로 구성된다.

본 발명의 특정 목적은 수용자의 B 세포와 관련된 증상을 치료하기 위한, 만성 이식편-숙주 질환의 치료용 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

최종적으로, 본 발명의 마지막 목적은 장기, 특히, 신장 이식 거부반응의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

최근의 연구(Ratanatharathorn et al, (Aug 2003) Biol . Blood Marrow Transplant 9(8): 505-511; Becker et al, (Jun 2004) Am . J. Transplant. 4(6): 996-1001)에서, 이들 질환의 치료에서 항-CD20 항체의 이점이 입증되었다.

본 발명의 다른 측면과 이점은 아래의 실시예에서 기술되는데, 이들 실시예는 예시적 실시예로서 간주되고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

이러한 목적을 염두에 두고, 본 출원인들은 Rituxan？과 비교하여, 특히 높은 ADCC 활성을 나타내는 새로운 CD20 항체를 개발하였다.

도 1: 항체 EMAB6과 EMAB603의 경쇄 카파의 키메라화(chimerisation)에 이용되는 CKHu 벡터의 개요도.
도 2: 항체 EMAB6의 생산에 이용되는 경쇄 pEF-EMAB6-K 발현 벡터의 개요도.
도 3: 항체 EMAB6과 EMAB603의 중쇄의 키메라화에 이용되는 G1Hu 벡터의 개요도.
도 4: 항체 EMAB6의 생산에 이용되는 중쇄 pEF-EMAB6-H 발현 벡터의 개요도.
도 5: CAT-13.6E12(CAT13)에 의해 생산된 뮤린 항체의 Raji 세포 상에서 발현된 CD20에 결합에 대한 키메라 EMAB6 항체에 의한 경쟁.
도 6: Raji 세포에 대한 항-CD20 항체의 보체-의존성 세포독성 활성. (A) Rituxan？:열린 삼각형, EMAB6: 닫힌 마름모꼴. 세포 용해는 상층액 내로 방출된 세포내 LDH를 측정함으로써 평가된다. 결과는 Rituxan？(5,000 ng/㎖ 항-CD20 항체에서)로 획득된 수치를 100%로 하는 용해 비율(lysis percentage)로서 표시된다. 5회 검사의 평균. (B) EMAB6(닫힌 마름모꼴)과 EMAB603(열린 마름모꼴)의 보체-의존성 세포독성 활성의 비교.
도 7: Raji 세포의 존재에서 항-CD20 항체에 의해 유도된 ADCC 활성. (A) Rituxan？:열린 삼각형, EMAB6: 닫힌 마름모꼴. 세포 용해는 상층액 내로 방출된 세포내 LDH를 측정함으로써 평가된다. 결과는 Rituxan？(250 ng/㎖ 항-CD20 항체에서)로 획득된 수치를 100%로 하는 용해 비율로서 표시된다. 3회 검사의 평균. (B) EMAB6(닫힌 마름모꼴)과 EMAB603(열린 마름모꼴)에 의해 유도된 ADCC의 비교.
도 8: B-CLL 환자로부터 유래된 B 림프구의 존재에서 항-CD20 항체에 의해 유도된 ADCC 활성. Rituxan？:열린 삼각형, EMAB6: 닫힌 마름모꼴. E/T 비율 = 15. 세포 용해는 상층액 내로 방출된 칼세인(calcein)을 측정함으로써 평가된다. 결과는 Rituxan？(500 ng/㎖ 항-CD20 항체에서)로 획득된 수치를 100%로 하는 용해 비율로서 표시된다. 4명의 서로 다른 환자에 대응하는 4회 실험의 평균.
도 9: Raji 세포의 존재에서 항-CD20 항체에 의해 유도된 CD16(FcγRIIIA)의 활성화. (A) Rituxan？:열린 삼각형, EMAB6: 닫힌 마름모꼴. 결과는 Rituxan？(2,500 ng/㎖ 항-CD20 항체에서)로 획득된 수치를 100%로 하여, ELISA를 이용하여 상층액 내에서 측정된, IL-2의 비율로서 표시된다. 4회 검사의 평균. (B) EMAB6(닫힌 마름모꼴)과 EMAB603(열린 마름모꼴)에 의해 유도된, CD16(FcγRIIIA)의 활성화의 비교.
도 10: B-CLL 환자로부터 유래된 B 림프구의 존재에서 항-CD20 항체에 의해 유도된 CD16(FcγRIIIA)의 활성화. Rituxan？:열린 삼각형, EMAB6: 닫힌 마름모꼴. 결과는 Rituxan？(2,500 ng/㎖ 항-CD20 항체에서)로 획득된 수치를 100%로 하여, ELISA를 이용하여 상층액 내에서 측정된, IL-2의 비율로서 표시된다. 12명 환자의 평균.
도 11: Jurkat-CD16 세포(FcγRIIIA)의 존재에서 CAT-13.6E12 뮤린 항체에 의해 유도된 IL-2의 생산.
도 12: 항체 EMAB603의 생산에 이용되는 중쇄와 경쇄 pRSV-HL-EMAB603 발현 벡터의 개요도.

실시예 1: 항- CD20 키메라 항체 EMAB6 과 EMAB603 에 대한 발현 벡터의 작제

A. CAT -13.6 E12 뮤린 항체의 가변 영역의 서열 결정

IgG2a,κ-타입 면역글로불린을 생산하는 뮤린 하이브리도마 CAT-13.6E12 세포(공급자: DSMZ, ref. ACC 474)로부터 전체 RNA를 분리하였다(RNAeasy 키트, Qiagen ref. 74104). 역전사이후, CAT-13.6E12 항체의 경쇄(Vκ)와 중쇄(VH)의 가변 도메인은 5'RACE 기술(Rapid Amplification of cDNA Ends)(GeneRacer 키트, Invitrogen ref. L1500-01)을 이용하여 증폭하였다. 이들 두 단계에 이용되는 프라이머는 아래와 같다:

1. 역전사 프라이머

a. 뮤린 카파 특이적인 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 1)

b. 뮤린 G2a 특이적인 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 2)

2. 5'RACE PCR 프라이머

a. 뮤린 카파 특이적인 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 3)

b. 뮤린 G2a 특이적인 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 4)

생성되는 VH와 Vκ PCR 산물은 벡터 pCR4Blunt-TOPO(Zero blunt TOPO PCR 클로닝 키트, Invitrogen, ref. K2875-20) 내로 클론하고 염기서열분석하였다. 뮤린 CAT-13.6E12 항체의 Vκ 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 SEQ ID No. 5로서 도시되고, 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 6이다. 이러한 Vκ 유전자는 Vκ4 집합에 속한다[Kabat et al . (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest". NIH Publication 91-3242].

CAT-13.6E12의 VH 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 SEQ ID No. 7이고, 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 8이다. 이러한 VH 유전자는 VH1 집합에 속한다[Kabat et al . (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest". NIH Publication 91-3242].

B. 키메라 항체 EMAB6 과 EMAB603 에 대한 중쇄와 경쇄 발현 벡터의 작제

1. 경쇄 카파 벡터

1.1. 항체 EMAB6에 대한 경쇄 벡터

pCR4Blunt-TOPO 염기서열분석 벡터 내로 클론된 Vκ 서열은 아래의 클로닝프라이머를 이용하여 증폭하였다:

a) Vκ 센스 프라이머(SEQ ID No. 9)

5’- CTCAGTACTAGT GCCGCCACC ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG - 3’

밑줄로 표시된 서열은 SpeI 제한 부위에 해당하고, 굵은 대문자로 표시된 서열은 Kozak 일치 서열에 해당하고, ATG 개시인자는 이탤릭체로 표시된다.

b) Vκ 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 10)

5’- TGAAGA CACTTGGTG CAGCCACAGT CCGGTTTATTTCCAGCCTGGT - 3’

상기 프라이머는 뮤린 Vκ 서열(이탤릭체)을 인간 불변 영역(Cκ)(굵은 글씨체)에 연결한다. 밑줄로 표시된 서열은 DraIII 제한 부위에 해당한다.

생성되는 Vκ PCR 산물은 CAT-13.6E12 뮤린 항체의 고유 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 보유한다. 이후, 상기 Vκ PCR 산물은 서열 SEQ ID No. 11에 해당하는 경쇄 키메라화 벡터(도 1)의 SpeI과 DraIII 부위 사이에 인간 불변 영역 Cκ에서 5'에 클론하였는데, 이의 핵산 서열은 서열 SEQ ID No. 21이고, 이의 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 22이다. 이러한 키메라화 벡터의 인간 Cκ 서열은 뮤린 Vκ 서열의 클로닝이 가능하도록 하는 DraIII 제한 부위를 발생시키기 위하여, 침묵 돌연변이(silent mutation)로 미리 변형하였다. 이러한 키메라화 벡터는 dhfr(디하이드로폴레이트 환원효소) 선별 유전자와 함께, RSV 프로모터와 bGH(소 성장 호르몬) 폴리아데닐화 서열을 보유한다.

상기 벡터에 의해 인코딩되는, 키메라 EMAB6 항체의 경쇄 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우에 SEQ ID No. 13으로서 도시되고, 추론된 펩티드 서열 SEQ ID No. 14에 상응한다.

1.2. 항체 EMAB603에 대한 경쇄 벡터

프로토콜은 Vκ 안티센스 프라이머를 제외하고, EMAB6 항체에 대한 경쇄 벡터에서와 동일하다(실시예 1, B-1.1 참조):

b') Vκ 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 29)

5’- TGAAGA CACTTGGTG CAGCCACAGT CCGTTTTATTTCCAGCCTGGT - 3’

상기 프라이머는 또한, CAT-13.6E12의 고유 Vκ 서열(SEQ ID No. 5와 SEQ ID No. 6 참조)과 비교하여, 돌연변이 N106K에 해당하는 돌연변이 AAC -> AAA(안티센스 프라이머 서열 SEQ ID No. 29에서 음영된 뉴클레오티드)를 도입한다(뉴클레오티드 서열과 추론된 펩티드 서열 SEQ ID No. 25와 SEQ ID No. 26 참조).

상기 벡터에 의해 인코딩되는, 키메라 EMAB603 항체의 경쇄 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우에 SEQ ID No. 27로서 도시되고, 추론된 펩티드 서열 SEQ ID No. 28에 해당한다.

2. 중쇄 벡터

EMAB6과 EMAB603 항체의 중쇄의 키메라화에 유사한 방식이 적용되었다.

pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 클론된 VH 서열은 먼저, 아래의 클로닝 프라이머를 이용하여 증폭하였다:

a) VH 센스 프라이머(SEQ ID No. 15)

5’- CTCAGTACTAGT GCCGCCACC ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC - 3’

밑줄로 표시된 서열은 제한 부위 SpeI에 해당하고, 굵은 글씨체로 표시된 서열은 Kozak 일치 서열에 해당하고, ATG 개시인자는 이탤릭체로 표시된다.

b) VH 안티센스 프라이머(SEQ ID No. 16)

5’- GACCGAT GGGCCC TTGGTGGAGGC TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC - 3’

상기 프라이머는 뮤린 VH 서열(이탤릭체)을 인간 G1 불변 영역(굵은 글씨체)에 연결한다. 밑줄로 표시된 서열은 ApaI 제한 부위에 해당한다.

이러한 증폭된 VH 단편은 CAT-13.6E12 뮤린 항체의 고유 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 보유한다. 상기 VH PCR 산물은 이후, 서열 SEQ ID No. 17에 해당하는 중쇄 키메라화 벡터(도 3)의 SpeI과 ApaI 부위 사이에 γ1 인간 불변 영역의 5'에 클론하였는데, 이의 핵산 서열은 서열 SEQ ID No. 23이고, 이의 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 24이다. 이러한 키메라화 벡터는 neo 선별 유전자와 함께, RSV 프로모터와 bGH(소 성장 호르몬) 폴리아데닐화 서열을 보유한다.

상기 벡터에 의해 인코딩되는, 키메라 EMAB6과 EMAB603 항체의 중쇄 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우에 SEQ ID No. 19 및 추론된 펩티드 서열의 경우에 SEQ ID No. 20으로서 도시된다.

3. 최종 발현 벡터

3.1. EMAB6 항체 발현 벡터

EMAB6 항체의 발현을 위하여, 카파 경쇄 키메라화 벡터(실시예 1, B-1.1 참조)의 RSV 프로모터는 인간 EF-1 알파 프로모터로 치환하였다. 최종 경쇄 pEF-EMAB6-K 발현 벡터는 도 2에 도시되고, 서열 SEQ ID No. 12에 해당한다.

상기 벡터에 의해 인코딩되는, 키메라 EMAB6 항체의 경쇄 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우에 SEQ ID No. 13으로서 도시되고, 추론된 펩티드 서열 SEQ ID No. 14에 해당한다.

EMAB6 항체의 발현을 위하여, 중쇄 키메라화 벡터(실시예 1, B-2 참조)의 RSV 프로모터는 인간 EF-1 알파 프로모터로 치환하였다. 이렇게 획득된 최종 중쇄 pEF-EMAB6-H 발현 벡터는 도 4에 도시되고, 서열 SEQ ID No. 18에 해당한다.

3.2. EMAB603 항체 발현 벡터

경쇄 전사 단위와 dhfr 유전자를 보유하는 경쇄 벡터의 BglII-PvuII 단편을 중쇄 벡터의 XhoI 부위 내로 서브-클로닝함으로써, 2개의 경쇄와 중쇄 키메라화 벡터(각각, 실시예 1, B-1.2, B2 참조)로부터 항-CD20 EMAB603 항체의 중쇄와 경쇄 전사 단위를 모두 보유하는 특이적인 발현 벡터를 작제하였다. 이러한 pRSV-HL-EMAB603 발현 벡터는 RSV 프로모터의 통제 하에 2개의 중쇄와 경쇄 전사 단위와 함께, 2개의 선별 유전자, 다시 말하면, neo(네오-포스포트랜스퍼라아제 II)와 dhfr(디하이드로폴레이트 환원효소)를 보유한다(도 12).

실시예 2: 항- CD20 키메라 EMAB6 과 EMAB603 항체를 생산하는 YB2 /0 계통으로부터 유래된 세포주의 생산

쥐 YB2/0 세포주(ATCC # CRL-1662)는 5% 소 태아 혈청(JRH Biosciences, ref. 12107)을 포함하는 EMS 배지(Invitrogen, ref. 041-95181M)에서 배양하였다. 형질감염(transfection)을 위하여, EMAB6 항체의 경우에 AatII로 선형화된 25 ㎍의 경쇄 벡터 pEF-EMAB6-K(도 2)와 ScaI로 선형화된 27 ㎍의 중쇄 벡터 pEF-EMAB6-H(도 4), 또는 EMAB603 항체의 경우에 벡터 pRSV-HL-EMAB603을 포함하는 Optimix 배지(Equibio, ref. EKITE 1) 내에서 5 백만 개의 세포를 전기천공(electroporation)하였다(Biorad 전기천공기, 모델 1652077). 적용된 전기천공 조건은 0.5-㎖ 큐벳 내에서 230 볼트와 960 마이크로패럿(microFarad)이었다. 이후, 각 전기천공 큐벳은 5,000개 세포/웰의 밀도로 5개의 P96 평판 위에 분산시켰다.

5% 투석된 혈청(Invitrogen, ref. 10603-017), 500 ㎍/㎖ G418(Invitrogen, ref. 10131-027), 25 nM 메토트렉세이트(Sigma, ref. M8407)를 포함하는 선별적 RPMI 배지(Invitrogen, ref 21875-034)에 배치는 형질감염이후 3일 시점에 수행하였다.

저항성 형질감염 웰로부터 상층액은 인간 Ig 서열에 특이적인 ELISA 검사법을 적용함으로써 키메라 면역글로불린(Ig)의 존재를 조사하였다.

최대량의 항체를 생산하는 10개의 형질감염체(transfectant)는 P24 평판에서 증폭시키고, 이들의 상층액은 ELISA를 이용하여 재-검사하여 생산력(productivity)을 평가하고, 제한 희석(limited dilution)(40개 세포/평판)으로, 클로닝을 위한 3개의 최적 생산자를 선별하였다.

클로닝이후, 각각, 키메라 EMAB6과 EMAB603 항체의 생산을 위한 R509.6A4 클론(R509-33903/046-6H1(1)6A4, 생산력: 17 ㎍/10⁶개 세포)(이후, "R509")과 R603 클론을 선별하고, CD 하이브리도마 생산 배지(Invitrogen, ref. 11279-023)에 점진적으로 적응시켰다.

키메라 EMAB6과 EMAB603 항체의 생산은 75-㎠와 175-㎠ 바이알에서 3x10⁵개 세포/㎖로의 희석, 이후, 롤러 플라스크(roller flask)에서 4.5x10⁵개 세포/㎖로의 희석으로 획득되는 적응된 배양액을 CD 하이브리도마 배지 내에서 확대함으로써 달성하였다. 최대 부피(1 ℓ)가 달성되면, 세포 생존능이 20%가 될 때까지 배양을 지속하였다. 생산이후, 키메라 EMAB6과 EMAB603 항체는 단백질-A 친화성 크로마토그래피(HPLC 평가된 순도 < 95%)를 이용하여 정제하고, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 검사하였다.

실시예 3: 키메라 항체 EMAB6 과 EMAB603 의 기능적 활성의 특성화

A. 특이성

키메라 EMAB6 항체의 항원 인식(antigen recognition)의 특이성은 Raji 세포에 의해 발현되는 CD20 항원에 대한 결합에서 뮤린 항체 CAT-13.6E12(CAT13)와의 경쟁을 조사함으로써 평가하였다.

이를 위하여, EMAB6 항체(0.5 내지 50 ㎍/㎖에서 10 ㎕)는 Raji 세포(4x10⁶개 세포/㎖에서 50 ㎕)의 존재에서 20분간 고정된 양의 CAT-13.6E12 뮤린 항체(5 ㎍/㎖에서 10 ㎕)와 함께 4℃에서 배양하였다. 세척이후, CAT-13.6E12 뮤린 항체의 결합을 특이적으로 검출하기 위하여, 피코에리스린(phycoerythrin, PE)에 결합된 생쥐 항-IgG 항체를 Raji 세포에 추가하였다. 다양한 농도의 EMAB6의 존재에서 획득된 중간 형광 강도(Median Fluorescence Intensity, MFI)는 EMAB6 항체의 부재에서 CAT-13.6E12 세포에 결합을 100%로 하여, 백분율로 변환시켰다.

이러한 방식으로, 증가하는 농도의 EMAB6의 존재에서 Raji 세포에 CAT-13.6E12(CAT13) 항체의 결합에 대한 저해 곡선(inhibition curve)을 획득하였다(도 5).

본 연구는 키메라화 과정이 Raji 세포의 표면 상에서 발현된 CD20에 대한 결합에서 부모 CAT-13.6E12 뮤린 항체와 경쟁하는 EMAB6 항체의 특이성에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 입증한다.

EMAB603 항체의 항원 인식 특이성은 EMAB6 항체의 이와 같은 특이성에 필적한다.

B. 보체 -의존성 세포독성 활성

EMAB6과 EMAB603 항체의 보체-의존성 세포독성 활성은 보체의 공급원으로서 어린 토끼 혈청의 존재에서 Raji 세포로 검사하였다; 비교를 위하여, 항-CD20 키메라 항체 Rituxan？이 검사에 포함되었다.

이러한 검사를 위하여, Raji 세포는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 5% FCS(소 태아 혈청) 내에서 6x10⁵개 세포/㎖로 조정하였다. 이들 항체는 IMDM+0.5% FCS로 희석하였다. 반응 혼합물은 50 ㎕의 항체, 50 ㎕의 어린 토끼 혈청(Cedarlane CL 3441 반응물의 1/10 IMDM+0.5% FCS 희석), 50 ㎕의 표적 세포, 50 ㎕의 IMDM+0.5% FCS 배지로 구성되었다. 최종 항체 농도는 5,000, 1,250, 250, 50 ng/㎖이었다. 항체 없는 대조가 검사에 포함되었다. 5% CO₂ 대기 하에 37℃에서 1시간 배양이후, 이들 평판은 원심분리하고, 상층액 내로 방출된 세포내 LDH의 수준은 특이적인 반응물(세포독성 검출 키트 1 644 793)을 이용하여 평가하였다.

용해(lysis) 비율은 각각, 100, 50, 25, 0% 용해에 해당하는, Triton X100(2%)을 이용하여 용해된 표적 세포의 다양한 희석액을 이용하여 획득된 측정 범위(calibration range)를 이용하여 평가하였다.

도 6(A)에 도시된 결과는 EMAB6과 Rituxan？둘 모두 Raji 세포의 보체-의존성 용해를 유도한다는 것을 입증한다. 그럼에도 불구하고, EMAB6 보체 활성은 Rituxan？의 보체 활성에 미치지 못하는 것으로 보인다. 이러한 차이는 상기 검사에 이용된 낮은 항체 농도에서 더욱 현저하다. 따라서, 50과 250 ng/㎖의 농도에서, EMAB6의 활성은 Rituxan？의 활성의 45% 크기이다. 이러한 차이는 항체 농도가 증가함에 따라 줄어드는데, 검사된 최대 농도, 다시 말하면, 5,000 ng/㎖에서 EMAB6 항체의 보체-의존성 세포독성 활성 %는 Rituxan？의 이와 같은 활성 %의 92%에 육박한다.

Rituxan？과 비교하여 AMAB6 항체의 이와 같은 낮은 보체-의존성 세포독성 활성은 이점으로서 간주될 수 있는데, 그 이유는 이러한 활성이 Rituxan？과 비교하여, 원치 않는 염증 활성, 알레르기 활성, 혈관 활성을 나타내는 다양한 분자의 생산을 유발하는 통상적인 보체 경로(complement pathway)의 활성화와 연관된 EMAB6의 잠재적 생체내 독성을 제한하기 때문이다.

EMAB603 항체의 보체 활성은 도 6(B)에 도시된다.

C. ADCC 활성

키메라 EMAB6 항체의 세포독성은 Raji 세포, 또는 CLL 환자로부터 유래된 B 림프구의 존재에서 평가하였다. 비교를 위하여, 항-CD20 키메라 항체 Rituxan？이 검사에 포함되었다.

이용된 칼세인(calcein)-표지화(labelling) ADCC 측정 기술은 아래와 같다:

자석 비드 상에서 분리(MACS) 기술(Myltenyi)을 이용하여 PBMC로부터 NK 세포를 분리하였다. 이들 세포는 세척하고 IMDM+5% FCS(45x10⁵개 세포/㎖) 내에 재현탁시켰다. 효과 세포와 표적 세포는 15/1의 비율로 이용되었다. Raji 세포, 또는 Ficoll 처리(> 95% B 세포)이후 획득된, B-CLL 환자로부터 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell, 말초혈 단핵 세포)는 칼세인(IMDM+5% FCS+20 ㎕ 칼세인(20 μM) 내에 3x10⁶개 세포/㎖에서 1 ㎖ 세포, 37℃에서 20분간 배양, 이후 HBSS(Hank's Buffered Saline Solution)로 세척)으로 미리 표지하고 IMDM+5% FCS 내에서 3x10⁵개 세포/㎖로 조정하였다. 이들 항체는 IMDM+0.5% FCS로 희석하였다(최종 농도: 500, 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 ng/㎖).

반응 혼합물은 P96 마이크로역가 평판 내에서 50 ㎕의 항체, 50 ㎕의 효과 세포, 50 ㎕의 표적 세포, 50 ㎕의 IMDM 배지로 구성되었다. 2가지 음성 대조(negative control)가 이용되었다:

- NK 없는 용해: NK 효과 세포가 IMDM+0.5% FCS로 대체되었다.

- 항체(Ab) 없는 용해: 항체가 IMDM+0.5% FCS로 대체되었다.

5% CO₂ 대기 하에 37℃에서 4시간 배양이후, 이들 평판은 원심분리하고, 상층액과 연관된 형광은 형광분석기(fluorimeter)(여기: 485 nm, 방출: 535 nm)를 이용하여 측정하였다.

용해 비율은 각각, 100, 50, 25, 0% 용해에 해당하는, Triton X100(2%)을 이용하여 용해된 표적 세포의 다양한 희석액을 이용하여 획득된 측정 범위를 이용하여 평가하였다.

이들 결과는 먼저, 아래의 공식을 이용하여 산정하였다:

용해 % = (항체와 NK와 함께 용해%) - (항체 없는 용해%) - (NK 없는 용해%)

이후, 이들 결과는 최대 농도의 Rituxan？에서 획득된 수치를 100%로 하여 상대적 비율로서 표시하였다.

도 7(A)에 도시된, Raji 세포주에서 EMAB6 항체에 대하여 획득된 결과는 검사된 농도에 상관없이, EMAB6 항체에 의해 유도된 세포독성이 Rituxan？에 의해 유도된 세포독성보다 크다는 것을 입증한다. 이러한 차이는 낮은 항체 농도에서 특히 현저하다. 따라서, 0.5 ng/㎖에서, EMAB6과 Rituxan？에 대한 용해 비율은 각각, 96%와 4%이었다. 용량을 500-배(250 ng/㎖) 증가시키는 경우에도 이러한 차이는 여전히 상당한데, 그 이유는 EMAB6과 Rituxan？에 대한 ADCC의 상대적 비율이 각각, 164%와 100%이기 때문이다. 그래프 평가로 EC50(최대 항체 농도에서와 고원기(plateau)에서 획득된 최대 효능, E Max의 50%에 해당하는 항체 농도)(ng/㎖)을 산정하고 Rituxan？과 EMAB6이 동일한 E Max를 달성한다고 가정하는 경우에, 이러한 검사에서 Rituxan？ EC50/EMAB6 EC50 비율은 300이었다.

키메라 EMAB603 항체의 세포독성은 EMAB6 항체에서와 동일한 절차를 이용하여 Raji 세포의 존재에서 평가하였다. 이의 활성은 EMAB6 항체의 활성에 필적하였다(도 7(B) 참조).

도 8에 도시된, B-CLL 환자로부터 림프구에서 획득된 결과는 검사된 농도에 상관없이, EMAB6 항체에 의해 유도된 세포독성이 Rituxan？에 의해 유도된 세포독성보다 크다는 것을 입증한다. Raji 세포에서 이미 관찰된 바와 같이, 이러한 차이는 낮은 항체 농도에서 특히 현저하다. 0.5 ng/㎖ 농도의 EMAB6은 500 ng/㎖ Rituxan？과 동일한 용해 비율을 유도한다(즉, 1,000의 농도 비율). 5 ng/㎖에서, EMAB6과 Rituxan？에 대한 용해 비율은 각각, 269%와 9%이었다. 검사된 최대 용량(500 ng/㎖)에서도 이러한 차이는 여전히 상당한데, 그 이유는 EMAB6과 Rituxan？에 대한 ADCC의 상대적 비율이 각각, 350%와 100%이기 때문이다. 흥미로운 결과는 50% 용해를 유도하는 농도에 대응한다. 이러한 검사에서, Rituxan？ EC50/EMAB6 EC50 비율은 10,000으로 산정되었다(Rituxan？과 EMAB6이 동일한 E Max를 달성한다는 가정 하에, EC50에 대한 그래프 평가(ng/㎖)).

이런 이유로, 이들 검사에서, EMAB6과 EMAB603의 세포독성 활성은 Rituxan？의 세포독성 활성보다 훨씬 높다.

D. CD16 의 활성화( IL -2 분비)

키메라 EMAB6 항체에 의해 유도된 CD16(FcγRIIIA)의 활성화는 Raji 세포, 또는 CLL 환자로부터 B 림프구의 존재에서 결정하였다. 본 검사는 Jurkat-CD16 세포에서 발현된 CD16(FcγRIIIA) 수용체에 결합하고 IL-2의 분비를 유도하는 항체의 능력을 평가하였다. 비교를 위하여 항-CD20 키메라 항체 Rituxan？이 검사에 포함되었다.

CD16 활성화의 측정은 Raji 세포, 또는 CLL 환자로부터 B 림프구의 존재에서 Jurkat-CD16 세포주에서 아래의 방식으로 수행하였다.

96-웰 평판 내에 혼합물: 50 ㎕ 항체 용액(B-CLL 환자로부터 B 림프구의 경우에 IMDM+5% FCS에 의해 10,000, 1,000, 100, 10 ng/㎖로 희석 및 Raji 세포의 경우에 10,000, 2,000, 1,000, 200, 100, 50, 25 ng/㎖로 희석); 50 ㎕ PMA(Phorbol Myristate Acetate, IMDM+5% FCS에 의해 40 ng/㎖로 희석됨); IMDM+5% FCS에 의해 6x10⁵/㎖로 희석된 50 ㎕ Raji, 또는 Ficoll 처리(> 95% B 세포)이후 획득된 B-CLL 환자로부터 50 ㎕ PBMC; 50 ㎕ Jurkat-CD16 세포(IMDM+5% FCS에서 20x10⁶/㎖). 항체 없는 대조가 모든 검사에 포함되었다. 37℃에서 하룻밤동안 배양이후, 이들 평판은 원심분리하고, 상층액 내에 포함된 IL-2는 상업적 키트(Quantikine, R/D)를 이용하여 산정하였다. OD는 450 nm에서 판독하였다.

이들 결과는 처음에, 항체 농도(0 내지 250 ng/㎖ 최종 농도)의 함수로서 IL-2 수준으로 표시하고, 이후 최대 검사 농도의 Rituxan？에서 획득된 수치를 100%로 하여 상대적 비율로서 표시하였다

도 9(A)에 도시된, Raji 세포주로 획득된 결과는 EMAB6과 Rituxan？의 존재에서, Jurkat-CD16 세포가 IL-2를 분비한다는 것을 입증하는데, 이는 CD16에 이들 항체의 Fc 영역의 결합을 통한 세포 활성화를 지시한다. 하지만, EMAB6 항체는 Rituxan？ 항체보다 훨씬 강한 유도 활성(inductive activity)을 나타낸다. 따라서, 6.25 ng/㎖에서, EMAB6과 Rituxan？에 대한 IL-2 비율은 각각, 112%와 21%이었다. 50 ng/㎖에서도 이러한 차이는 여전히 상당한데, IL-2 비율이 각각, 112%와 65%이었다. 이러한 차이는 농도가 증가함에 따라 감소하는데, EMAB6과 Rituxan？에 대한 IL-2의 개별 비율이 2,500 ng/㎖에서 124%와 100%이었다. 이러한 검사에서, Rituxan？ EC50/EMAB6 EC50 비율은 15로 산정되었다(Rituxan？과 EMAB6이 동일한 E Max를 달성한다는 가정 하에, EC50에 대한 그래프 평가(ng/㎖)).

이들 결과는 상기한 ADCC 결과가 둘 모두 CD16-의존성임을 입증한다. 이들은 EMAB6 항체의 Fc 영역에 의한 CD16(FcγRIIIA)에 결합이 효과 기능의 유도를 결과하는 강한 세포 활성화를 선행한다는 것을 입증한다.

Raji 세포의 존재에서 키메라 EMAB603 항체에 의해 유도된 CD16(FcγRIIIA)의 활성화는 EMAB6 항체에 의해 유도된 이와 같은 활성화에 필적한다.

도 10에 도시된, B-CLL 환자로부터 림프구에서 획득된 결과는 항-CD20 Rituxan？과 EMAB6의 존재에서, Jurkat-CD16 세포가 IL-2를 분비한다는 것을 입증하는데, 이는 CD16에 이들 항체의 Fc 영역의 결합을 통한 세포 활성화를 지시한다. 하지만, EMAB6 항체는 Rituxan？ 항체보다 훨씬 강한 유도 활성(inductive activity)을 나타낸다. 실제로, Rituxan？의 IL-2 분비 유도 활성은 2.5와 25 ng/㎖의 농도에서 기준선(base line)에 근접하는 반면, EMAB6 항체의 이와 같은 활성은 현저하다. 따라서, 25 ng/㎖에서, EMAB6과 Rituxan？에 대한 IL-2 비율은 각각, 132%와 34%이었다. 최대 농도(2,500 ng/㎖)에서, IL-12 비율은 각각, 148%와 100%이었다. 이러한 검사에서, Rituxan？ EC50/EMAB6 EC50 비율은 100 이상이었다: 이는 300로 산정되었다(Rituxan？과 EMAB6이 동일한 E Max를 달성한다는 가정 하에, EC50에 대한 그래프 평가(ng/㎖)).

결론적으로, Raji 세포에서 수행된 모든 검사는 EMAB6과 EMAB603 항체가, Rituxan？과 달리, 강한 세포독성을 나타내고, 특히 낮은 항체 농도에서, CD16(FcγRIIIA)을 발현하는 세포의 활성화를 유도한다는 것을 입증한다. 대조적으로, 동일한 조건 하에, EMAB6의 보체-의존성 세포독성 활성은 Rituxan？의 이와 같은 활성과 비교하여 대략 50% 감소한다.

이들 결과는 B-CLL 환자로부터 분리된 세포를 이용하여 수행된 연구에 의해 뒷받침되는데, 이는 EMAB6 항체가 B-CLL 환자로부터 B 림프구에 대하여, Rituxan？보다 훨씬 강한 세포독성을 나타낸다는 것을 암시한다. 이들 두 항체 사이에 이러한 차이는 Raji 세포에서보다 B-CLL 환자로부터 림프구에서 더욱 현저한데, 이는 Rituxan？과 비교하여, 상기 질환에 대한 EMAB6의 유의한 치료적 이익을 증명한다.

이런 증가된 차이의 이유는 특히, Raji 세포와 비교하여, B-CLL 환자로부터 B 림프구에서 CD20의 감소된 항원 발현이다.

Raji 세포에서와 유사하게, B-CLL 환자로부터 림프구에 대한 EMAB6 항체의 보체-의존성 세포독성 활성은 Rituxan？에 의해 유도된 이와 같은 활성보다 낮고, 따라서, 통상적인 보체 경로(complement pathway)의 강한 활성화와 연관된 원치 않는 효과의 결과인 생체내 독성이 제한되는 이점을 제공한다.

실시예 4: HPCE - LIF 에 의한 EMAB6 과 EMAB603 글리칸

EMAB6과 EMAB603 항체의 중쇄의 N-글리칸 구조는 HPCE-LIF를 이용하여 분석하였다. 비교를 위하여, Rituxan？의 중쇄의 N-글리칸 구조 역시 분석하였다.

이를 위하여, 항-CD20 단클론 항체는 Sephadex G-25 칼럼(HiTrap Desalting, Amersham Biosciences)에서 탈염하고, 증발시키고, 50 mM β-멀캡토에탄올의 존재에서 PNGase F(Glyko)의 가수분해 완충액 내에 재-현탁시켰다. 37℃에서 16시간 배양이후, 단백질 분획물은 절대 에탄올을 추가함으로써 침전시키고, N-글리칸을 포함하는 상층액은 증발시켰다. 생성되는 올리고당은 형광색소(fluorochrome): APTS (1-아미노-피렌-3,6,8-트리설포네이트)를 이용하여 직접 표지하거나, 또는 APTS로 표지화에 앞서 특이적인 엑소글리코시다아제(exoglycosidase)의 작용에 노출시켰다. 생성되는 표지된 올리고당은 N-CHO 모세관에 주입하고, 분리하고, 레이저-유도된 형광 검출을 동반한 모세관 전기영동(HPCE-LIF)으로 정량하였다.

푸코스 수준의 산정은 분리된 푸코실화된 형태의 추가로, 또는 더욱 구체적으로, 전기영동도(electrophoretogram)에서 획득되는, 푸코실화되거나 푸코실화되지 않은 5당류(pentasaccharide)[GlcNac2-Man3]에 상응하는 2개의 피크를 발생시키는 뉴라미니다아제, β-갈락토시다아제, N-아세틸헥소사미니다아제의 동시 작용이후, 수행하였다.

항-CD20 EMAB603과 Rituxan？ N-글리칸의 분석
항-CD20	푸코스 %	갈락토오스 %	Fuc/Gal
EMAB603	15	37	0.4
Rituxan？	93	57	1.63

%로서 표시되는 푸코스 수준은 아래의 공식을 이용하여 산정하였다:

푸코스 수준 =

%로서 표시되는 갈락토오스 수준은 뉴라미니다아제(neuraminidase)와 푸코시다아제(fucosidase)의 작용이후 획득된 갈락토오스를 포함하는 올리고당 형태의 비율을 추가함으로써 산정하였다. 이용된 공식은 아래와 같다:

갈락토오스 수준 = (G1+G1B) + 2x(G2+G2B)

푸코스/갈락토오스 비율은 앞서 기술된 바와 같이 산정된, 푸코스 수준을 갈락토오스 수준으로 나눗셈함으로써 획득된다.

이러한 분석 결과(표 1 참조)로부터, EMAB6과 EMAB603 항체가 Rituxan？(푸코스 % = 93%)에 비하여, 거의 푸코실화되지 않는다는 것을 확인할 수 있다(푸코스 % < 25%). 이에 더하여, EMAB6과 EMAB603(Fuc/Gal 비율 < 0.6)은 Rituxan？(Fuc/Gal 비율 = 1.63)과 같은, CHO 세포에서 발현되는 항체와 달리, Fuc/Gal 비율(푸코스/갈락토오스 비율)이 낮다.

CNCM

I-3314

20041108

CNCM

I-3529

20051129

SEQUENCE LISTING <110> Laboratoire Francis du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) <120> Monoclonal antibody directed against the CD20 antigen <130> Anti-CD20 <160> 29 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 actgccatca atcttccact tgac 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctgagggtgt agaggtcaga ctg 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttgttcaaga agcacacgac tgaggcac 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gagttccagg tcaaggtcac tggctcag 28 <210> 5 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctttcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg acttttaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaggctgg aaataaaccg g 321 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Asn Arg 100 105 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 caggcttatc tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120 cctagacagg gcctggaatg gattggaggt atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtaggca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagatatgac 300 tacaactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctcagtacta gtgccgccac catggatttt caagtgcaga ttttcag 47 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tgaagacact tggtgcagcc acagtccggt ttatttccag cctggt 46 <210> 11 <211> 5289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 11 gatctcccga tcccctatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 60 gccagtatct gctccctgct tgtgtgttgg aggtcgctga gtagtgcgcg agcaaaattt 120 aagctacaac aaggcaaggc ttgaccgaca attgcatgaa gaatctgctt agggttaggc 180 gttttgcgct gcttcgcgat gtacgggcca gatatacgcg tatctgaggg gactagggtg 240 tgtttaggcg aaaagcgggg cttcggttgt acgcggttag gagtcccctc aggatatagt 300 agtttcgctt ttgcataggg agggggaaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg 360 caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg 420 ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct 480 gacatggatt ggacgaacca ctgaattccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta 540 gctcgataca ataaacgcca tttgaccatt caccacattg gtgtgcacct ccaagcttgg 600 taccgagctc ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct ggaattctgc agatatccat 660 cacactggcg gccgctggct gcaccaagtg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 720 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 780 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 840 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 900 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 960 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtctagagc tcgctgatca gcctcgactg 1020 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1080 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1140 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1200 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 1260 ccagctgggg ctcgactgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc 1320 ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag 1380 tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 1440 atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 1500 ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 1560 gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 1620 gggggggggg acagctcagg gctgcgattt cgcgccaaac ttgacggcaa tcctagcgtg 1680 aaggctggta ggattttatc cccgctgcca tcatggttcg accattgaac tgcatcgtcg 1740 ccgtgtccca agatatgggg attggcaaga acggagacct accctggcct ccgctcagga 1800 acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc agtggaaggt aaacagaatc 1860 tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg 1920 acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc accacgagga gctcattttc 1980 ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca accggaattg gcaagtaaag 2040 tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg aatcaaccag 2100 gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac acgtttttcc 2160 cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc ctctctgagg 2220 tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa gactaacagg 2280 aagatgcttt caagttctct gctcccctcc taaagctatg catttttata agaccatggg 2340 acttttgctg gctttagatc gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg tgtgacataa 2400 ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt tttaagtgta 2460 taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac ctatggaact 2520 gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg ctcagaagaa 2580 atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attctactcc tccaaaaaag 2640 aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt tttgagtcat 2700 gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa ggaaaaagct 2760 gcactgctat acaagaaaat tatggaaaaa tattctgtaa cctttataag taggcataac 2820 agttataatc ataacatact gttttttctt actccacaca ggcatagagt gtctgctatt 2880 aataactatg ctcaaaaatt gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg ggttaataag 2940 gaatatttga tgtatagtgc cttgactaga gatcataatc agccatacca catttgtaga 3000 ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa 3060 tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3120 catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3180 actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ccgcgtatgg tgcactctca gtacaatctg 3240 ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 3300 acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 3360 catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat 3420 acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 3480 ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 3540 gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 3600 tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 3660 tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 3720 acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 3780 cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 3840 ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 3900 ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 3960 atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 4020 cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 4080 tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 4140 gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 4200 ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 4260 ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 4320 tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 4380 cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 4440 ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 4500 tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 4560 gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 4620 caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 4680 accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 4740 ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 4800 aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 4860 accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 4920 gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 4980 ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 5040 gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 5100 gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 5160 ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 5220 aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 5280 ggctcgaca 5289 <210> 12 <211> 6275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 12 tcgaggagac ctgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 60 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 120 cacatcgccc acagtccccg agaagttgtg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 180 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 240 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 300 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 360 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 420 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc 480 cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 540 ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 600 ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 660 tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 720 gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 780 gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 840 ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 900 cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 960 gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac 1020 ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc 1080 tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac 1140 tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt 1200 tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1260 ggtgtcgtga ggaattagct tggtacaaac agcaaagctt aaggtactag tgccgccacc 1320 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 1380 agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 1440 gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 1500 ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 1560 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttattctt tcacaatcag cagagtggag 1620 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggactt ttaacccacc cacgttcgga 1680 ggggggacca ggctggaaat aaaccggact gtggctgcac caagtgtctt catcttcccg 1740 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 1800 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 1860 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 1920 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1980 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagtc tagagctcgc 2040 tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 2100 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 2160 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 2220 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 2280 tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctcg actgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 2340 aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 2400 aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 2460 caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 2520 cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 2580 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 2640 cttttgcaaa aagctttatc cccgctgcca tcatggttcg accattgaac tgcatcgtcg 2700 ccgtgtccca agatatgggg attggcaaga acggagacct accctggcct ccgctcagga 2760 acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc agtggaaggt aaacagaatc 2820 tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg 2880 acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc accacgagga gctcattttc 2940 ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca accggaattg gcaagtaaag 3000 tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg aatcaaccag 3060 gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac acgtttttcc 3120 cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc ctctctgagg 3180 tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa gactaacagg 3240 aagatgcttt caagttctct gctcccctcc taaagctatg catttttata agaccatggg 3300 acttttgctg gctttagatc gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg tgtgacataa 3360 ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt tttaagtgta 3420 taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac ctatggaact 3480 gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg ctcagaagaa 3540 atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attctactcc tccaaaaaag 3600 aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt tttgagtcat 3660 gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa ggaaaaagct 3720 gcactgctat acaagaaaat tatggaaaaa tattctgtaa cctttataag taggcataac 3780 agttataatc ataacatact gttttttctt actccacaca ggcatagagt gtctgctatt 3840 aataactatg 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caccatggcc tgaaataacc tctgaaagag gaacttggtt aggtaccttc tgaggcggaa 3360 agaaccagct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 3420 gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 3480 gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 3540 cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 3600 atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat 3660 tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag cttgattctt 3720 ctgacacaac agtctcgaac ttaaggctag agccaccatg attgaacaag atggattgca 3780 cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 3840 aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 3900 tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 3960 gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 4020 aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 4080 tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 4140 ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 4200 ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 4260 cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 4320 tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 4380 ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 4440 tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 4500 tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact 4560 ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgatg gccgcaataa 4620 aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagcgataag 4680 gatcgatcct ctagctagag tcgatcgacc tgcagggatc cgcgtatggt gcactctcag 4740 tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga 4800 cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 4860 cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg 4920 cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 4980 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 5040 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 5100 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 5160 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 5220 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 5280 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 5340 ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 5400 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 5460 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 5520 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 5580 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 5640 caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 5700 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 5760 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 5820 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 5880 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 5940 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 6000 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 6060 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 6120 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 6180 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 6240 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 6300 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 6360 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 6420 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 6480 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 6540 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 6600 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 6660 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 6720 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 6780 tgctcacatg gctcgacaga tccgacggat cgggagatcc tagc 6824 <210> 19 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 caggcttatc tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120 cctagacagg gcctggaatg gattggaggt atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtaggca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagatatgac 300 tacaactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaa 1344 <210> 20 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 21 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 actgtggctg caccaagtgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 22 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 23 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 24 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctttcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg acttttaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaggctgg aaataaaacg g 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 27 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctttcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg acttttaacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaggctgg aaataaaacg gactgtggct gcaccaagtg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtga 645 <210> 28 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tgaagacact tggtgcagcc acagtccgtt ttatttccag cctggt 46

Claims

CD20 항원에 대한 단클론 항체에 있어서, 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5와 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7과 적어도 99% 동일성을 공유하는 서열에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 1 항에 있어서, 각 경쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 5 또는 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 25에 의해 인코딩되고, 각 중쇄의 가변 영역은 뮤린 핵산 서열 SEQ ID No. 7에 의해 인코딩되고, 이들 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 비-뮤린 종으로부터 유래되는 불변 영역인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 1 항에 있어서, 각 경쇄와 각 중쇄의 불변 영역은 인간 불변 영역인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 2 항에 있어서, 각 경쇄의 불변 영역은 κ 타입인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 1 항에 있어서, 각 중쇄의 불변영역은 γ 타입인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 5 항에 있어서, 각 중쇄의 불변영역은 γ1 타입인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 6 항에 있어서, 각 중쇄의 불변영역은 γ1 타입이고 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 23에 의해 인코딩되며, 각 경쇄의 불변 영역은 인간 핵산 서열 SEQ ID No. 21에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 4 항에 있어서, 각 경쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 13 또는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 27에 의해 인코딩되고, 각 중쇄는 뮤린-인간 키메라 핵산 서열 SEQ ID No. 19에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 8 항에 있어서, 서열 SEQ ID No. 13으로부터 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 14이고, 서열 SEQ ID No. 19로부터 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 20인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 8 항에 있어서, 서열 SEQ ID No. 27로부터 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 28이고, 서열 SEQ ID No. 19로부터 추론된 펩티드 서열은 서열 SEQ ID No. 20인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
청구항 1 항에 있어서, 쥐 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 11항에 있어서, 쥐 하이브리도마 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC 수탁 번호 CRL-1662 하에 the American Type Culture Collection에 기탁된 세포 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20)에서 생산되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 1항에 있어서, 등록 번호 CNCM I-3314 하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 기탁된 클론 R509에 의해 생산된 EMBA6 항체인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
제 1항에 있어서, 등록 번호 CNCM I-3529 하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 기탁된 클론 R603에 의해 생산된 EMAB603 항체인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
서열 SEQ ID No. 12를 보유하고, 제 1항에 따른 항체의 경쇄의 pEF-EMAB6-K 발현 벡터.
서열 SEQ ID No. 18을 보유하고, 제 1항에 따른 항체의 중쇄의 pEF-EMAB6-H 발현 벡터.
제 1항에 따른 항체를 발현하는 안정한 세포주.
제 17항에 있어서, SP2/0, YB2/0, IR983F, Namalwa 인간 골수종, PERC6, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안정한 세포주.
제 17항에 있어서, 제 19항과 20항에 따른 pEF-EMAB6-K와 pEF-EMAB6-H 벡터 모두가 세포에 진입되는 것을 특징으로 하는 안정한 세포주.
등록 번호 CNCM I-3314 하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 기탁된 클론 R509.
등록 번호 CNCM I-3529 하에 the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)에 기탁된 클론 R603.
서열 SEQ ID No. 19를 보유하고, 제 1항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 DNA 단편.
서열 SEQ ID No. 13을 보유하고, 제 1항에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편.
서열 SEQ ID No. 27을 보유하고, 제 1항에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편.
면역 효과 세포 내에서 FcγRIIIA 수용체의 시험관내 활성화를 위한 제 1항 에 따른 항체를 포함하는 조성물.
백혈병 또는 림프종의 치료용으로, 제 1항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
자가-면역 질환을 비롯한 B 림프성 세포와 관련된 면역 기능장애 질환뿐만 아니라, B형 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, B형 만성 림프구 백혈병(B-CLL)을 비롯한 성숙 B-세포 림프종, 소형 B-세포 림프종, B-세포 프로림프구 백혈병, 림프형질세포(lymphoplasmocytic) 림프종, 외투 세포 림프종, 여포형 림프종, 변연부 MALT-타입 림프종, 림프절 변연부 림프종(단구양 B 세포를 포함하거나 포함하지 않음), 비장형 변연부 림프종(융모성 림프구를 포함하거나 포함하지 않음), 모발성세포(tricholeucocytic) 백혈병, 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종에서 선택되는 병리의 치료용으로 제 1항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
제 27 항에 있어서, 림프성 백혈병의 치료를 약학 조성물.
제 28 항에 있어서, B형 만성 림프성 백혈병(B-CLL)의 치료를 약학 조성물.
백혈병 또는 림프종의 치료를 위한, 림프성 세포 상에서 발현되는 하나이상의 다른 항원에 대한 하나이상의 다른 항체와 함께, 제 1항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
제 37항에 있어서, 림프성 세포 상에서 발현되는 항원은 HLA-DR, CD19, CD23, CD80, CD22, CD32, CD52에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
백혈병 또는 림프종의 치료를 위한, FcγRs를 발현시키는 NK(자연 킬러) 세포, NKT(자연 킬러 T) 세포, Tγδ 림프구, 대식세포, 단핵구 또는 수상돌기 세포와 함께 제 1항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.