FR2962908A1 - Formulation d'anticorps anti-cd20 - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique, comprenant un anticorps anti-CD20, un détergent comme le polysorbate, un tampon et un agent d'osmolalité non-ionique, comme du manitol ou de la glycine. La composition possède un pH compris entre 5,0 et 7,0.

Description

L'invention concerne une formulation pharmaceutique stable d'anticorps anti-CD20. L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire présente sur les pré-lymphocytes B ainsi que sur les lymphocytes B matures. L'antigène CD20 est présent à la surface de plus de 90% des lymphocytes B périphériques et des organes lymphoïdes. On le retrouve sur les lymphocytes B normaux et tumoraux. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur plus de 90% des cellules de lymphomes non-Hodgkinien et est absent des cellules souches hématopoïétiques, des pro- lymphocytes B, des cellules du plasma ou des autres tissus sains. Le rôle de CD20 dans la prolifération et/ou la différenciation des lymphocytes B est mal connu, cependant il représente une cible intéressante de thérapie ciblée pour contrôler et tuer 10 les lymphocytes B impliquées dans des cancers ou des maladies auto-immunes. IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S a développé un anticorps monoclonal anti-CD20 chimérique désigné le Rituximab et commercialisé sous le nom de Rituxan® ou MabThera®. Cet anticorps est maintenant utilisé classiquement dans le traitement des lymphomes non-Hodgkiniens et a de nombreuses applications dans le traitement des maladies 15 immunologiques médiées par les lymphocytes B, comme par exemple les tumeurs malignes, telles que la leucémie lymphoïde chronique, les maladie-auto-immunes impliquant un anticorps comme l'anémie hémolytique auto-immune et purpura thrombocytopénique idiopathique et les maladies inflammatoires telles que l'arthrite rhumathoïde chronique ou la sclérose en plaques. 20 Plusieurs formulations d'anticorps anti-CD20 ont été décrites (WO 2009/080541, WO 2005/044859, WO 98/56418). La demande WO 2009/080541 décrit notamment une formulation contenant un anticorps anti-CD20, de l'histidine, du thréalose et du polysorbate 20. La formulation commerciale du Rituxan® contient un anticorps anti-CD20, un tampon 25 citrate, du chlorure de sodium et du polysorbate 80. Selon la notice qui résume des caractéristiques du produit (RCP), la formulation du Rituxan® est stable 30 mois conservée au réfrigérateur à 2-8°C et à l'abri de la lumière. Par ailleurs après dilution dans une solution NaCl 0.9% ou une solution de glucose 5% , la solution de Rituxan® prête à être perfusée reste physiquement et chimiquement stable pendant 24 heures à 2-8°C et pendant 12 heures à 15- 30 25°C (Information professionnelle du Compendium Suisse des Médicaments® MabThera® Roche, 2009). En particulier, la formulation de Rituxan® reste sensible aux stress de température, d'agitation et d'oxydation pouvant provoquer une dégradation précoce du produit. Il serait donc avantageux de disposer d'une formulation contenant un anticorps anti-CD20 5 présentant de meilleures caractéristiques de stabilité, rendant son utilisation moins contraignante, notamment en augmentant la température de conservation à 25°C au lieu de 2- 8°C pour la formulation commerciale Rituxan®. Résumé de l'invention L'invention fournit une composition pharmaceutique liquide, comprenant un anticorps anti- 10 CD20, un détergent, qui est de préférence un polysorbate, un tampon et un agent d'osmolalité non-ionique, qui est de préférence du mannitol ou de la glycine. La composition possède un pH compris entre 5,0 et 7,0. Avantageusement, la composition de l'invention est dépourvue de chlorure de sodium. Description détaillée de l'invention 15 La composition pharmaceutique de l'invention fournit des compositions d'anticorps anti-CD20 possédant une stabilité chimique et physique à température ambiante supérieure à la composition d'anticorps anti-CD20 actuellement commercialisée (Rituxan®). Notamment, la nouvelle composition pharmaceutique sous forme liquide de l'invention supporte mieux les conditions de stress, en particulier les conditions de stress de température 20 et d'oxydation que la composition de référence (Rituxan®). La composition est moins sensible au phénomène de dégradation de l'anticorps anti-CD20 et bénéficie donc d'une utilisation moins contraignante pour les utilisateurs. Le terme « composition pharmaceutique » fait référence aux préparations permettant l'activité biologique des ingrédients actifs et ne contenant aucun composant additionnel 25 toxique pour les sujets auxquels la composition est administrée. Le terme « anticorps anti-CD20 » comprend toutes les formes d'anticorps se liant spécifiquement à l'antigène CD20. Ceci inclut mais n'est pas limité aux anticorps humains, anticorps humanisés, anticorps modifiés génétiquement comme les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques, les anticorps recombinants, les anticorps transgéniques tout comme les fragments de tels anticorps tant que les propriétés de liaison spécifique à l'anticorps anti-CD20 sont présentes. Selon un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CD20 utilisé est l'anticorps EMAB603 tel que décrit dans la demande de brevet W02006/064121. Cet anticorps est produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Le terme « fragments d'anticorps » comprend une portion d'un anticorps entier, généralement au moins la portion liant l'antigène ou la région variable de celle-ci. Les exemples de fragments d'anticorps inclus les diacorps, les molécules d'anticorps simple chaîne, les immunotoxines et les anticorps multispécifiques formés à partir des fragments d'anticorps. Le terme « anticorps monoclonal » tel qu'utilisé dans la définition précédente se rapporte à un anticorps obtenu d'une population d'anticorps substantiellement homogène, i.e., chacun des anticorps de la population sont identiques, ils peuvent présenter des mutations naturelles présentes en quantité mineure. Les anticorps monoclonaux sont hautement spécifiques, car ils sont dirigés contre un seul site antigénique. De plus, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui incluent différents anticorps dirigés contre différents déterminants (épitopes), chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul déterminant antigénique. Le terme « monoclonal » employé ici indique le caractère de l'anticorps à être obtenu d'une population d'anticorps substantiellement homogène et ne définit pas la méthode de production de l'anticorps. Ainsi, l'anticorps définit peut être produit par n'importe quelle méthode décrite dans l'art antérieur.

Le terme « anticorps chimérique » se rapporte à un anticorps monoclonal comprenant une région variable, i.e., une région de liaison, d'une source ou d'une espèce et au moins une portion d'une région constante dérivée d'une source ou d'une espèce différente, préparé généralement par des techniques d'ADN recombinant. Les anticorps chimériques comprenant une région variable murine et une région constante humaine sont préférés.

Les« anticorps transgénique » sont des anticorps monoclonaux produits à partir d'animaux transgéniques. Les demandes WO1995017085 et WO2007048077 décrivent notamment des anticorps transgéniques et des méthodes de préparation d'anticorps transgéniques. Les « anticorps humanisé » sont des anticorps chimériques contenant une séquence minimale dérivée d'immunoglobuline non humaine. Les anticorps humanisés sont, en grande partie, des immunoglobulines humaines dans lesquelles des résidus des régions hypervariables sont remplacées par des résidus des régions hypervariables d'immunoglobulines d'espèces non humaines telles que les souris, rats, lapin ou primates non humains possédant une spécificité, une affinité et une capacité désirées.

Les «régions hypervariables » mentionnées ci-dessus, renvoient aux résidus d'acides aminés d'un anticorps qui sont responsables de la liaison de l'anticorps-antigène. Le terme « anticorps humain » inclut les anticorps ayant des régions variables et des régions constantes dérivées de séquences d'immunoglobulines de lignées germinales humaines. L'expression « anticorps recombinant humain» inclut tous les anticorps humains préparés, exprimés, créés ou isolés par des moyens recombinants, tels que des anticorps isolés de cellules hôtes telles que les cellules NSO, CHO ou YB2/0 ou d'un animal (par exemple une souris) transgénique pour les gènes d'immunoglobulines humaines ou des anticorps exprimés grâce à un vecteur d'expression recombinant transfecté dans une cellule hôte. De tels anticorps recombinants possèdent des régions variables et des régions constantes dérivées de séquences d'immunoglobulines de lignées germinales humaines dans une forme réarrangée. Les anticorps recombinants humains peuvent être sujets à des hypermutations somatiques in vivo. Ainsi, les séquences en acides aminés des régions VH et VL, bien que dérivées ou apparentées à des séquences VH et VL de lignées germinales humaines, peuvent ne pas exister dans le répertoire de lignées germinales d'anticorps humain in vivo.

L'expression « liaison spécifique » utilisée précédemment, réfère à un anticorps liant spécifiquement l'antigène CD20. Préférentiellement, l'affinité de liaison a une valeur de KD de 10-9 mol/L ou inférieure (de préférence 10-10 mol/L), préférentiellement avec une valeur de KD de 10-10 mol/L ou inférieure (de préférence 10-12 mol/L). L'affinité de liaison est déterminée avec un essai de liaison standard, tel que la technique de résonnance plasmonique de surface (Biacore®).

Le terme « CD20 » ou « antigène CD20 » fait référence à tous les variants, isoformes et homologues d'espèce du CD20 humain naturellement exprimés par les cellules ou exprimés par des cellules transfectées par le gène du CD20. La liaison d'un anticorps de l'invention à l'antigène CD20 entraine la mort des cellules exprimant CD20 (telle qu'une cellule tumorale) en inactivant le CD20. Le terme « composition stable » signifie ici que la formation d'agrégats (insolubles ou solubles) est minimisée, et/ou que la dégradation chimique est réduite, le pH est maintenu et la conformation de l'anticorps n'est pas substantiellement modifiée pendant la production ou la conservation des compositions de l'invention, de telle sorte que l'activité biologique et la stabilité de l'anticorps soient conservées. Différentes techniques analytiques mesurant la stabilité d'une protéine sont disponibles dans l'art antérieur et sont regroupées dans Peptide and Protein Drug Deivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Pubs (1991) et Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 : 29-90 (1993) par exemple. La stabilité peut être mesurée à une température donnée pendant un temps donné.

Le terme « stabilité physique » de l'anticorps anti-CD20 se réfère à la réduction ou l'absence de formation d'agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques de l'anticorps anti-CD20, à la réduction ou l'absence de toute dénaturation structurale de la molécule, ainsi qu'à la réduction ou l'absence de toute précipitation de la molécule. Les signes d'agrégation, de dénaturation et/ou de précipitation sont repérables visuellement par la couleur et/ou la clarté de la solution, ou mesurés par l'absorbance à 400 nm, par filtration sur membrane 0,22 µm, par mesure de la diffusion dynamique de la lumière, par chromatographie d'exclusion stérique, par SDS PAGE ou par microcalorimétrie. Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l'absence de toute modification chimique de l'anticorps anti-CD20 pouvant modifier son activité biologique pendant le stockage, dans une formulation liquide ou solide, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d'hydrolyse, déamination, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L'oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité chimique peut être évaluée en détectant et quantifiant les formes altérées chimiquement de l'anticorps. Les altérations chimiques peuvent entrainer des modifications de la taille et de charge de l'anticorps pouvant être évaluées, notamment, par chromatographie d'exclusion stérique, échangeuse d'ions, SDS PAGE ou isofocalisation électrique (IEF).

La composition pharmaceutique de l'invention comprend un anticorps anti-CD20, un polysorbate, un tampon et du mannitol et/ou de la glycine et possède un pH compris entre 5,0 et 7,0. De préférence le pH de la composition est maintenu entre 5,5 et 7,0, de préférence entre 6,0 et 7,0, de préférence encore entre 6,2 et 6,7, de préférence encore à environ 6,5. Dans un mode de réalisation préféré, la teneur en anticorps anti-CD20 dans la composition de l'invention peut être la suivante: entre 5 et 20 g/L, de préférence entre 8 et 12 g/L, préférentiellement entre 9 et 11 g/L et préférentiellement environ 10 g/L. Le terme « détergent » inclut notamment le Pluronic F68 et les polysorbates, notamment le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane (synonyme de polysorbate 20, vendu sous la marque Tween 20TM) et monooléate de polyoxyéthylène de sorbitane (synonyme de polysorbate 80, vendu sous la marque Tween 80TM). Ces détergents peuvent être utilisés à des concentrations allant de 70 à 1000 ppm, préférentiellement à une concentration de 100 ppm à 800 ppm, de préférence de 300 à 800 ppm, de préférence de 500 à 800 ppm et encore préférentiellement à une concentration d'environ 700 ppm. De manière préférée, le polysorbate 80 est utilisé. Le terme « tampon » comprend un tampon pharmaceutiquement acceptable. Un tampon pharmaceutiquement acceptable comprend, sans y être limité, les tampons histidine ou de préférence un sel d'un métal alcalin ou alcalinoterreux, ou d'un métal de transition. Les sels sont de préférence sous forme citrate, succinate, acétate ou phosphate. Par exemple, on peut utiliser un citrate trisodique ou un phosphate de sodium. Préférentiellement, le tampon utilisé est un tampon citrate. Le tampon peut également, de manière préférée, être un tampon phosphate de sodium. L'histidine, peut être ajoutée de manière préférentielle, comme excipient en plus faible proportion que le tampon principal qui est de préférence un citrate trisodique ou un phosphate de sodium. Les concentrations en tampon peuvent être comprises entre 1 et 100 mM, préférentiellement entre 5 mM et 50 mM et toujours préférentiellement à environ 25 mM. Indépendamment du tampon utilisé, le pH est ajusté à une valeur comprise entre 5,0 et 7,0 et préférentiellement à environ 6,5 en ajustant avec une base ou un acide connus dans l'art antérieur ou en utilisant des mélanges de composants tampons adéquats ou les deux.

Le terme « agent d'osmolalité non-ionique » inclut notamment des sucres comme les polyols et le saccharose, et les acides aminés non-ioniques à pH 5-7, comme la proline, la glycine, l'alanine, la cystéine, l'isoleucine, la leucine, la sérine, la valine, la phénylalanine, la méthionine, l'asparagine, la tyrosine et la thréonine. De préférence, l'agent d'osmolalité non- ionique est le mannitol ou la glycine. Le mannitol est de préférence utilisé en quantité d'environ 25 à 500 mM, de préférence, entre 200 et 400 mM, préférentiellement entre 270 et 330 et encore préférentiellement d'environ 300 mM. La glycine est de préférence utilisée en quantité d'environ 25 à 500 mM, de préférence, entre 200 et 400 mM, préférentiellement entre 270 et 330 et encore préférentiellement d'environ 300 mM. Dans un mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique de l'invention est dépourvue de chlorure de sodium. De préférence le détergent (de préférence le polysorbate 80), le tampon (de préférence citrate ou phosphate) et l'agent d'osmolalité non-ionique (de préférence le mannitol ou la glycine) sont les seuls excipients de la formulation (qui comprend aussi l'anticorps, et de l'eau). Dans un exemple de réalisation, la composition peut comprendre : - un anticorps anti-CD20 ; - du polysorbate 80 ; - du citrate trisodique ; - du mannitol.

Dans un autre exemple de réalisation, la composition peut comprendre : - un anticorps anti-CD20 ; - du polysorbate 80 ; - du citrate trisodique ; - de la glycine.

Selon un autre exemple, la composition peut comprendre : - un anticorps anti-CD20 ; - du polysorbate 80 ; - du phosphate de sodium; - du mannitol ou de la glycine.

Plus particulièrement, la composition peut comprendre : - 8 à 12 g/L d'anticorps anti-CD20 ; - 100 à 1000 ppm de polysorbate 80 ; - 1 à 100 mM de citrate trisodique ou 1 à 100 mM de phosphate de sodium; - 25 à 500 mM de mannitol ou 25 à 500 mM de glycine ; à un pH de 5,0 à7,0.

Préférentiellement, la composition pharmaceutique comprend : - 10 g/L d'anticorps anti-CD20 ; - 700 ppm de polysorbate 80 ; - 25 mM de citrate trisodique ou 25 mM de phosphate de sodium ; - 300 mM de mannitol ou 300 mM de glycine ; à un pH de 6,5. Les concentrations sont déterminées vis à vis des compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable La composition à usage pharmaceutique ne comprend pas de chlorure de sodium, ingrédient pourtant utilisé de manière usuelle comme agent d'osmolalité dans les formulations pharmaceutiques comprenant un anticorps anti-CD20. Le remplacement du chlorure de sodium par un agent d'osmolalité non-ionique, de préférence du mannitol ou de la glycine, offre plusieurs avantages. D'une part, la nette augmentation de turbidité observée après chauffage dans une formulation contenant du chlorure de sodium est évitée lorsqu'il est remplacé par du mannitol ou de la glycine, de manière plus avantageuse avec du mannitol. La présence de mannitol ou de glycine dans la solution d'anticorps anti-CD20 prévient l'agrégation des protéines. Le mannitol et la glycine améliorant la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 vis-à-vis des phénomènes thermiques.

Par ailleurs, la glycine joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'oxydation de la solution d'anticorps anti-CD20. On observe une dégradation plus marquée avec une solution contenant 8 du chlorure de sodium. Ainsi, la solution d'anticorps anti-CD20 formulée avec de la glycine en tant qu'agent d'osmolalité subit moins de dégradation. La glycine améliore la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 vis-à-vis des phénomènes d'oxydation. La composition de l'invention peut être obtenue en utilisant toute technique usuelle.

Notamment la composition de l'invention peut être obtenue en mettant en oeuvre un procédé comprenant le mélange de l'anticorps anti-CD20 avec une solution tampon, ajustement du pH si nécessaire, filtration pour l'obtention d'une forme liquide, La composition selon l'invention peut être avantageusement soumise à une méthode d'élimination ou d'inactivation des agents infectieux, par exemple par traitement pH acide ou 10 nano filtration. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures La Figure 1 est une photo montrant l'aspect des solutions F1, F2 et F3 après chauffage à 57°C. On observe l'influence de l'agent d'osmolalité sur la turbidité des solutions d'anticorps 15 anti-CD20. La Figure 2 représente des thermogrammes montrant les valeurs de température de transition de dénaturation et d'enthalpie des solutions d'anticorps anti-CD20 en environnement citrate/NaC1, citrate/mannitol ou citrate/glycine. EXEMPLES : 20 Exemple 1 : Préparation des solutions et analyses à TO 1.1 Préparation des solutions De l'anticorps anti-CD20 LFB-R603 (décrit dans la demande W02006064121) à une concentration approximative de 10g/L a été formulé avec du tampon citrate de sodium à 25 mM pH 6.5, avec 700 ppm de Tween 80 et avec un agent d'osmolalité ionique, à savoir le 25 NaCl (formulation Fl) à 9 g/L ou un agent d'osmolalité neutre, à savoir le mannitol à 300 mM (formulation F2) ou la glycine à 300 mM (formulation F3). Ces trois formulations ont ensuite été filtrées sur Milex Durapore 0,22 µm. Puis les valeurs d'osmolalité et de pH ont été vérifiées et ont été regroupées dans le tableau 1. Tableau 1: Caractéristiques des solutions test Composition Composition Fl Composition F2 Composition F3 Anticorps anti-CD20 (g/1) - 10 - 10 - 10 (DO à 280 nm) NaCl (g/L) 9 / / Glycine (mM) / / 300 Mannitol (mM) / 300 / Citrate (mM) 25 25 25 Polysorbate 80 (ppm) 700 700 700 pH final 6,33 6,50 6,59 Osmolalité (mOsm/kg) 383 391 415 1.2 Mesures de la concentration exacte en anticorps anti-CD20 La détermination de la concentration totale en anticorps anti-CD20 a été réalisée pour chaque formulation par une mesure de l'absorbance à 280 nm. Le coefficient d'extinction molaire pour l'anticorps anti-CD20 est de 1,61 L.g'.com'. Les concentrations en protéines totales des trois solutions ont été mesurées et correspondent aux valeurs attendues (Fl : 9,50 g/L, F2 : 9,35 g/L et F3 : 9,42 g/L). 1.3 Mesures de la turbidité La turbidité des solutions a été évaluée par mesure de la DO à 400 nm, c'est une mesure indirecte de l'intensité diffusée qui permet de suivre les phénomènes d'agrégation macroscopique. Les valeurs de turbidité obtenues sont faibles pour les trois formulations (Fl : 0,015, F2 : 0,016 et F3 : 0,015), ce qui signifie une absence d'agrégat. 1.4 Mesures de DLS (Dynamic Light Scattering) La mesure de diffusion dynamique de la lumière permet de mesurer les rayons hydrodynamiques des protéines et des agrégats présents en solution. Cette mesure permet de suivre les phénomènes d'agrégation à des stades précoces de formation, puisque les tailles des objets détectés vont du nanomètre ou micron. Le pourcentage de la population principale, composée essentiellement de monomères, peut être reporté. Il s'agit de relevés non quantitatifs, l'intensité de diffusion ne dépendant pas uniquement de la concentration des objets mais aussi de leur taille. Les résultats ont montré que les solutions F1, F2 et F3 sont toutes exemptes d'agrégats, même submicroniques, à TO. 1.5 Conclusion L'ensemble des analyses à TO confirme que les trois solutions sont équivalentes vis-à-vis du pH, de l'osmolalité, de la concentration et de l'état d'agrégation initial. Exemple 2 : Stress de température 2.1 Conditions de stress Un stress thermique est utilisé pour accélérer les phénomènes de dégradation chimique et physique et permet de confronter la stabilité des différentes formulations. Le stress thermique a été réalisé par un chauffage en bain marie à 57° C. Pour chaque formulation, le stress a été réalisé sur 1 mL de solution dans un tube à hémolyse bouché hermétiquement pour limiter l'évaporation, pendant 1 heure (ou 45 minutes) et 3 heures. 2.2 Observations visuelles Tout changement macroscopique de la solution, tel que l'apparition de microbulles, la modification de la couleur, l'apparition de filaments ou de particules, peut être repéré par observation visuelle. En ce qui concerne le suivi des phénomènes d'agrégation, seuls les objets de taille supérieure à 50 µm sont détectés visuellement.

Au bout d'une heure de chauffage, une nette augmentation de la turbidité a été observée pour la solution F1. Les solutions F2 et F3 sont très légèrement turbides. Après 3 heures de chauffage, la tendance est confirmée pour la solution F1 qui demeure turbide. La solution F3 apparaît légèrement plus dégradée que la solution F2 (voir Figure 1). 2.3 Mesure de la turbidité Les valeurs présentées dans le tableau 2 confirment les observations visuelles. La valeur de turbidité permet d'établir un classement des agents d'osmolalité suivant leur impact sur la stabilité de la solution. La formulation F2 est plus stable que la formulation F3, elle-même nettement plus stable que la formulation Fi. Tableau 2 : Valeurs de DO à 400 nm - Mesure de la turbidité Formulations DO 400 nm T 1 heure DO 400 nm T 3 heures Fl 2,21 saturé F2 0,08 1,82 F3 1,15 1,93 2.4 Détermination du pourcentage de protéines agrégées 10 Matériels et méthodes La détermination de la quantité de protéines agrégées a été effectuée après filtration sur membrane 0,22 µm de la solution chauffée. Cette étape permet d'enlever les agrégats de plus de 220 nm. Un dosage des protéines totales effectué dans le filtrat a ensuite été réalisé et comparé à TO. Lors d'un chauffage à 57°C, un phénomène d'évaporation apparaît, celui-ci est 15 à prendre en compte dans l'interprétation de la concentration obtenue après chauffage et filtration. Ce phénomène a pour conséquence de sous-estimer le pourcentage en protéines agréées. La valeur obtenue prend en compte les protéines agrégées qui ont été retenues sur la membrane lors de la filtration, mais aussi l'évaporation de la solution lors du stress et la quantité de protéines non agrégées sur la membrane. 20 Résultats Les valeurs de concentration en protéines obtenues après 1 h ou 3h de chauffage sont parfois plus élevées qu'à TO ce qui révèle une forte évaporation lors du stress. Si on prend l'hypothèse que l'évaporation est la même pour toutes les solutions, il est possible de les comparer entre elles à un temps T et non par rapport à TO. Après 1 heure et 3 heures de chauffage, la présence de mannitol ou de glycine (formulations F2 et F3) prévient l'agrégation des protéines. La solution contenant du NaCl (formulation Fl) 5 est, quant à elle, la plus agrégée avec près de 33% de protéines agrégées (Tableau 3). Tableau 3 : Concentration d'anticorps anti-CD20 après filtration des agrégats - Influence de l'agent d'osmolalité Formulation [Ac anti-CD20] [Ac anti-CD20] [Ac anti-CD20] % de protéines TO T 1 heure T 3 heures agrégées T 3h F1 9,50 g/L 8,21 g/L 6,32 g/L - 33% F2 9,42 g/L 12,57 g/L 10,99 g/L - 0% F3 9, 35 g/L 10,16 g/L 8,83 g/L - 5% Le mannitol et la glycine se révèlent être des agents d'osmolalité qui favorisent la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 dans des conditions de stress thermique. 10 Exemple 3 : Stress d'oxydation 3.1 Conditions de stress Le stress d'oxydation permet de mesurer la stabilité d'une solution de protéine par rapport au processus de dégradation que représente l'oxydation. Ainsi, un oxydant fort, le peroxyde d'hydrogène, a été ajouté aux solutions d'anticorps anti- CD20 à une concentration de 30 15 mM. Les mélanges ont été incubés pendant 24 heures à 37°C. 3.2 Analyse SDS-PAGE Matériels et méthodes La technique d'électrophorèse SDS-PAGE sépare les protéines selon leur poids moléculaire. Elle permet de savoir si le stress effectué fragmente la protéine ou conduit à des agrégats 20 covalents. L'analyse a été effectuée en conditions réductrices et non réductrices avec une coloration en bleu de Coomassie. Les solutions oxydées ont été comparées aux solutions à TO.

La quantité de protéines par puits a été fixée à 2 µg, Le marqueur de taille utilisé est le Mark 12. Résultats L'analyse des gels d'électrophorèse montre que : - A TO, les différentes solutions testées présentent un profil électrophorétique en conditions non réductrices, comprenant une bande majoritaire à 150 kDa et deux groupes de bandes vers 130 kDa et 110 kDa. - Après 24 heures d'oxydation, on observe l'apparition de bandes à environ 105, 75 et 45 kDa en conditions non réductrices et une intensification des bandes à 70 et 25 kDa environ. La proportion de ces bandes est plus importante pour les solutions d'anticorps anti-CD20 oxydés contenant du NaCl (Fl) et du mannitol (F2). En conditions réductrices, la solution contenant de la glycine (F3) a un profil électrophorétique comparable à celui observé à TO, alors que les solutions contenant du NaCl ou du mannitol (F1 et F2), on observe une augmentation significative de la proportion de la bande à 125 kDa (7%).

Les résultats d'analyse SDS-PAGE montrent que la glycine joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'oxydation avec une dégradation moins marquée que pour les solutions contenant du NaCl ou du mannitol (Fl et F2). 3.3 HP-SEC Matériels et méthodes La chromatographie d'exclusion stérique en phase liquide permet de séparer les objets suivant leur rayon hydrodynamique. La détection est réalisée par mesure de DO à 280 nm. L'intégration du chromatogramme UV permet de déterminer les pourcentages de monomères, dimères, polymères et fragments. Résultats Le tableau 4 présente les résultats. Les proportions de chaque entité obtenues pour les échantillons à TO sont comparables quel que soit l'agent d'osmolalité considéré. En condition de stress d'oxydation, on remarque une dégradation de l'anticorps anti-CD20 en présence de NaCl et de mannitol (Fl et F2), correspondant à l'apparition de nouvelles entités (pic 4 et pic 6) et une augmentation des fragments. La solution F3 apparaît moins dégradée après oxydation, où seule une légère augmentation du taux de fragments est observée. Tableau 4 : Résultats d'HP-SEC pour les échantillons à TO oxydés - Résultats d'intégration des chromatogrammes UV - Influence de l'agent d'osmolalité Formulations Polymères Dimères Monomères Pic 4 Fragments Pic 6 (fragments) (fragments) F1 TO 0,07 % 1,33 % 98,33 % / 0,27 % / F2TO 0,08% 1,37% 98,36% / 0,19% / F3 TO 0,07 % 1,22 % 98,44 % / 0,27 % / F1 oxydé 0,10 % 0,88 % 95,22 % 0,50 % 3,26 % 0,05 % F2 oxydé 0,33 % 0,94 % 95,31 % 0,44 % 2,96 % 0,02 % F3 oxydé 0,17 % 0,93 % 97,78 % / 1,12 % / Les résultats des analyses SDS-PAGE et HP-SEC indiquent qu'en condition de stress d'oxydation, la solution d'anticorps anti-CD20 formulée avec de la glycine en tant qu'agent d'osmolalité subit moins de dégradation après 24 heures à 37°C. Exemple 4 : Microcalorimétrie Matériels et méthodes Les essais de microcalorimétrie ont été réalisés sur l'appareil Microcal VP-DSC. L'analyse consiste à mesurer le flux de chaleur dégagée au cours d'un balayage contrôlé en température dans l'échantillon contenant la protéine comparativement à son tampon de formulation. Ce flux de chaleur traduit les changements d'états de la protéine et renseigne donc sur sa dénaturation. Les différences de profils des thermogrammes nous renseignent sur la stabilité thermique relative de la protéine dans différents environnements de formulation. Résultats Les thermogrammes d'anticorps anti-CD20 des solutions F2 et F3, présentés en Figure 2, montrent les mêmes transitions indiquant que la dénaturation de la protéine se déroule suivant le même mécanisme découplé en 4 transitions. L'enthalpie totale nécessaire pour dénaturer complètement la protéine est équivalente pour ces deux formulations (952 Kcal/mol pour F3 vs 950 Kcal/mol pour F2). Le profil du thermogramme d'anticorps anti-CD20 en formulation citrate/NaC1 est sensiblement différent avec l'apparition d'une transition supplémentaire, une diminution de la température de début de dénaturation et une diminution de l'enthalpie totale de dénaturation (866 Kcal/mol). Ces éléments signifient que l'anticorps anti-CD20 en milieu citrate/NaC1 est moins stable thermiquement dans cette formulation. Exemple 5 : Stabilité des compositions Pour étudier la stabilité d'une formulation d'anticorps anti-CD20 selon l'invention à une concentration de 10 mg/ml, des lots ont été placés, à l'abri de la lumière, dans des enceintes à température contrôlée à + 5°C ± 3°C et à + 25°C ± 2°C pour une durée de 24 mois (tableau 5).

Tableau 5 : Formulations mises en stabilité Composition lot 1 lot 2 lot 3 Anticorps anti-CD20 (g/1) - 10 - 10 - 10 (DO à 280 nm) NaC1(g/L) 9 / / Glycine (mM) / 240 240 Citrate (mM) 25 25 25 Polysorbate 80 (ppm) 700 700 400 pH final 6,5 6 6 Les paramètres suivants sont évalués: l'aspect visuel, la pureté, la distribution de taille moléculaire (monomères, polymères, dimères et fragments), le profil d'isoformes, le pH, l'étude de l'absorption éventuelle du Polysorbate 80 sur le bouchon, l'étude de la migration éventuelle de l'aluminium à partir du conditionnement primaire, les chaînes Kappa « libres » et la concentration en protéines totales. L'activité fonctionnelle de l'anticorps est évaluée au cours du temps. L'activité fonctionnelle est déterminées par des méthodes classiques connues de l'homme du métier, par exemple en mesurant 1'ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), la liaison au récepteur CD16. Les résultats montrent que les lots d'anticorps anti-CD20 à 10 mg/ml sont stables 18 mois à + 20 5°C ± 3°C et 12 mois à + 25°C ± 2°C.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Composition liquide pharmaceutique comprenant : a. un anticorps anti-CD20 ; b. un détergent ; c. un tampon ; d. un agent osmolalitéd'osmolalité non-ionique ; et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
2. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas de chlorure de sodium.
3. 3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, dans laquelle le détergent est du polysorbate, de préférence du polysorbate 80.
4. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'agent d'osmolalité non-ionique est du mannitol ou de la glycine.
5. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le tampon est un tampon citrate ou phosphate.
6. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 1 et 100 mM de citrate trisodique ou de phosphate de sodium.
7. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce 25 qu'elle comprend entre 8 et 12 g/L d'anticorps anti-CD20.
8. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 100 et 1000 ppm de polysorbate comme détergent. 30
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 25 et 500 mM de mannitol ou de glycine comme agent d'osmolalité non-ionique.20
10. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant : a. l0g/L d'anticorps anti-CD20 ; b. 700 ppm de polysorbate 80 ; c. 25 mM de citrate trisodique ; d. 300 mM de mannitol ; et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
11. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant : a. l0g/L d'anticorps anti-CD20 ; b. 700 ppm de polysorbate 80 ; c. 25 mM de citrate trisodique ; d. 300 mM de glycine ; et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
12. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le pH est d'environ 6,5.
13. 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle l'anticorps anti-CD20 est un anticorps monoclonal produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15).
14. 14. Composition pharmaceutique solide susceptible d'être obtenue par dessication d'une composition liquide selon l'une des revendications 1 à 13.25