JP2008523793A - Ｂ型リンパ球様造血増殖に対する細胞傷害性抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも７０％同一性を有する配列によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも７０％同一性を有する配列によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。本発明はまた、免疫エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化するため、および特に白血病またはリンパ腫の治療用の薬物を製造するための、前記抗体の使用に関する。

Description

本発明は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも７０％配列同一性を共有する配列によってコードされ、その重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも７０％同一性を共有する配列によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域であり、ならびに免疫エフェクター細胞中のＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化するための、および特に白血病またはリンパ腫の治療用の、薬物の製造のための、このような抗体の使用に関する。

イントロダクションおよび先行技術
ＣＤ２０抗原は、成熟Ｂリンパ球の表面に存在する３５〜３７ｋＤａの分子量を有する疎水性膜貫通蛋白質である（Valentine et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(22): 8085-8089；Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem., 264(19): 11282-11287）。それは、初期プレＢ段階（early pre-B stage）からプラズマ細胞への分化（この段階で、この発現は消失する）のＢリンパ球細胞（Ｂ細胞）の発達の間、発現される。ＣＤ２０抗原は、正常なＢリンパ球および悪性のＢ細胞の両方に存在する。より詳細には、ＣＤ２０抗原は、大抵の表現型のＢリンパ腫（８０％リンパ腫）において発現され：例えば、それは、９０％超の非ホジキンＢ細胞リンパ腫（non-Hodgkin’s B-cell lymphomas）（ＮＨＬ）および９５％超のＢ型慢性リンパ性白血病（B-type Chronic Lymphocytic Leukaemia）（Ｂ−ＣＬＬ）において発現される。ＣＤ２０抗原は、造血幹細胞およびプラズマ細胞において発現されない。

ＣＤ２０の機能は、まだ完全には解明されていないが、それは、カルシウムチャネルとして機能し得、そしてＢリンパ球分化（Golay et al. (1985) J. Immunol. 135(6): 3795-3801）および増殖（Tedder et al. (Aug 1986) Eur. J. Immunol. 16(8): 881-887）の第１段階の調節に関与し得る。

したがって、Ｂ細胞の活性化および増殖におけるその役割に関して、いくらかの不明確が存在するままであるが、ＣＤ２０抗原は、その局在のため、ＣＤ２０を特異的に認識する抗体を使用しての、腫瘍性Ｂ細胞が関与するコンディション（例えば、ＮＨＬまたはＢ−ＣＬＬ等）の治療についての重要な標的である。さらに、この抗原は、発現調節または多型が知られていない膜蛋白質であるので、理想的な標的である。

非放射性物質で標識された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、リツキサン（Rituxan）（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）だけが、Ｂ細胞リンパ腫の治療について現在市販されている。それは、ＮＨＬを有する患者において、化学療法と組み合わせた場合、有望な臨床結果を示している。しかし、その有効性は、それが単独で使用される場合、可変性かつしばしばあまり高くないままである（Teeling et al. (2004) Blood 104(6): 1793-1800）。

さらに、リツキサン（登録商標）は、Ｂ−ＣＬＬにおいてＢ細胞に対してあまり高くない効果しか有さない。この有効性の低い程度は、種々の現象と関連付けられている：一方で、Ｂ−ＣＬＬ Ｂ細胞は、比較的少ない量でしかＣＤ２０を発現せず、そして他方で、リツキサン（登録商標）は、インビトロで、これらの細胞に対して非常に低いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity））活性レベルを誘発するだけである。これらの２つの観察は、腫瘍におけるＣＤ２０の発現レベル（定量的フローサイトメトリーで）と治療に対する応答との間に観察された相関関係を説明するかもしれない。

Ｂ−ＣＬＬは、西洋諸国において白血病の最も一般的な形態であり、そして高用量化学療法治療は、時々、不十分であると判り、かつ、造血形成不全（haematopoietic aplasia）および免疫不全へ導く副作用を伴うので、モノクローナル抗体は、革新的なアプローチであるようである。したがって、ＣＤ２０抗原を特異的に標的化することができ、かつ、限られた程度でしかこの抗原を発現しない腫瘍細胞（例えば、Ｂ−ＣＬＬ）が破壊されることを可能にする、抗体を開発することは、最重要である。

Ｂ−ＣＬＬの治療のためにＧｅｎｍａｂ（Teeling et al. (2004) Blood 104(6): 1793-1800）によって提案された、抗体２Ｆ２および７Ｄ８は、リツキサン（登録商標）によって誘発されたそれよりも大きい、補体を活性化する能力を有する。しかし、これらの抗体は、リツキサン（登録商標）のそれと類似する、低ＡＤＣＣ活性を有する。しかし、何人かの臨床医は、前記抗体は、広範囲の非特異的活性（炎症、アレルギーまたは血管反応等）を有する分子（特に、アナフィラトキシン）の産生へと導く活性化システムを誘発するので、前記補体活性化は有害な副作用の原因であることを示した。さらに、これらの抗体は、未だ研究段階にあり、そしてそれらの臨床効果は依然として評価されなければならない。

出願ＦＲ０３／０２７１３（ＷＯ２００４／０２９０９２）において、本出願人は、ＹＢ２／０系において産生され得、かつ、リツキサン（登録商標）と比較して高ＡＤＣＣ活性およびジャーカット−ＣＤ１６細胞による高レベルのＩＬ−２産生を誘発するその能力のために選択された、抗ＣＤ２０抗体を記載している。現在入手可能な免疫療法を使用して治療されるＢ細胞疾患の範囲が拡大されることを可能にする、新規の抗ＣＤ２０抗体についての顕著な必要性が存在し；このことは、ＣＤ２０抗原が、関与するＢ細胞の集団において低い程度に発現され、そして満足のいく免疫治療が存在しないＢ細胞疾患について、特にそうである。

この目的を持って、本出願人は、リツキサン（Rituxan）（登録商標）と比較して特に高いＡＤＣＣ活性を示す新規のＣＤ２０抗体を開発した。

説明
したがって、本発明の第１目的は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体に関し、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも７０％同一性を共有する配列によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも７０％同一性を共有する配列によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。

抗体は、ジスルフィド結合によって共に連結された重鎖および軽鎖から作製される。各鎖は、Ｎ末端位における、該抗体が指向される（directed against）抗原に対して特異的な可変領域（またはドメイン）（軽鎖については再構成されたＶ−Ｊ遺伝子および重鎖についてはＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によってコードされる）と、Ｃ末端位における、定常領域（軽鎖については単一のＣＬドメインまたは重鎖についてはいくつかのドメインから作製される）とから作製される。

本発明の目的のために、表現「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、同一かつ独特の特異性を有する抗体分子の調製物を指す。

軽鎖および重鎖における可変領域が軽鎖および重鎖の定常領域のそれとは異なる種由来である、本発明に従う抗体は、「キメラ」抗体と呼ばれる。

マウス核酸配列（配列番号５および配列番号７）は、それぞれ、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）において番号ＡＣＣ ４７４で入手可能な、マウスハイブリドーマＣＡＴ−１３．６Ｅ１２によって産生される抗体の軽鎖の各々の可変ドメインおよび重鎖の各々の可変ドメインをコードする。このハイブリドーマは、ＣＤ２０に対するマウスＩｇＧ２ａ，κ−タイプモノクローナル抗体を産生する。

これらのマウス配列は、本発明に従う抗体の可変領域の配列を得るために選択され、何故ならば、ＣＤ２０抗原（該抗原は、リツキサン（登録商標）によっても認識される）についてのＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の特異性のためである。本発明に従う抗体の可変領域は、配列（配列番号５および配列番号７）と少なくとも７０％同一性を共有し、この配列同一性は、本発明に従う抗体に、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体のそれと同一である特異性を提供する。好ましくは、この配列同一性はまた、本発明に従う抗体に、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体のそれと同一である標的に対する親和性を提供する。

さらに、本出願人は、驚くべきことに、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体のエクトドメインを発現するジャーカット−ＣＤ１６細胞（Jurkat-CD16 cells）の存在下でＩＬ−２の分泌を誘発する能力を有することを示し（図１１に示される通り）、これは、該マウス抗体とヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）との強力な結合を示し、このことも、本出願人がした選択を動機付けた。

さらに、本発明に従う抗体において、軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来である。この点において、全ての非マウス哺乳動物種（species）および科（families）、特に、ヒト、サル、マウス（murine）（ネズミ（mice）以外）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌならびにトリが使用され得る。

本発明に従う抗体は、当業者に周知の、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、そしてより具体的には、例えばMorrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855（ここで、組換えＤＮＡ技術は、非ヒト哺乳動物由来の抗体における重鎖の定常領域および／または軽鎖の定常領域を、ヒト免疫グロブリンにおける対応の領域で置換するために使用されている）に記載される、「キメラ」抗体作製技術を使用して、作製され得る。１つの特定の実施形態を以下に例示する。

有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも８０％同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも８０％同一性を共有する配列によってコードされる。

有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９０％同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９０％同一性を共有する配列によってコードされる。

有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９５％同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９５％同一性を共有する配列によってコードされる。

有利には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９９％同一性を共有する配列によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９９％同一性を共有する配列によってコードされる。

有利には、本発明はまた、前記重鎖および軽鎖の可変領域が、１以上のアミノ酸の１以上の置換、挿入または欠失を含む任意の抗体に関し、但し、これらの配列修飾は、標的に対する抗体の特異性または親和性に影響を与えること無しに、上記で規定した配列同一性パーセンテージレベルに適合する。

本発明の抗体はまた、ＦＲ（フレームワーク）領域（「骨格（backbone）」領域としても公知の、可変領域の高度に保存された領域）と結合された、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）を含む任意の抗体である。このような抗体は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体のそれと非常に類似している、そして好ましくは同一である、親和性および特異性を有する。

好ましくは、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）またはマウス核酸配列（配列番号２５）によってコードされ、そして本発明に従う抗体の重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）によってコードされる。

したがって、本発明の１実施形態において、本発明に従う抗体は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体であり、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。

したがって、第２の実施形態において、本発明に従う抗体は、ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体であり、ここで、軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号２５）によってコードされ、重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）によってコードされ、そして軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である。

両方の実施形態において、抗体は、それらのヌクレオチド配列において、単一ヌクレオチド異なる：それぞれシトシンおよびアデニンに対応する、配列番号５および配列番号２５における３１８位に局在するヌクレオチド。

これらの実施形態に従う本発明の抗体は、標的抗原ＣＤ２０について特異性および親和性を有し、これらは、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体のそれらに匹敵しており、そして好ましくは同一である。

好ましくは、本発明に従う抗体の軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域は、ヒト定常領域である。本発明のこの好ましい実施形態において、抗体の免疫原性は、ヒトにおいて減少され、そしてしたがって、該抗体の有効性は、ヒトに対する治療投与の際に改善される。

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体の軽鎖の各々の定常領域は、κタイプのものである。任意のアロタイプ、例えば、Ｋｍ（１）、Ｋｍ（１、２）、Ｋｍ（１、２、３）またはＫｍ（３）が本発明の実施に好適であり、しかし好ましいアロタイプはＫｍ（３）である。

別のさらなる実施形態によれば、本発明に従う抗体の軽鎖の各々の定常領域は、λタイプのものである。

本発明の１つの特定の局面によれば、そして特に、本発明に従う抗体の軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域がヒト領域である場合、該抗体の重鎖の各々の定常領域は、γタイプのものである。この実施形態（alternative）によれば、該抗体の重鎖の各々の定常領域は、γ１、γ２またはγ３タイプのもの（これら３つの定常領域タイプは、ヒト補体に結合するという特徴を示す）、あるいはγ４タイプのものでさえあり得る。重鎖の各々についてγタイプ定常領域を有する抗体は、ＩｇＧクラスに属する。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって共に連結された、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成されたヘテロ二量体である。各鎖は、Ｎ末端位においては、抗体が指向される抗原に特異的な可変領域またはドメイン（軽鎖については再構成されたＶ−Ｊ遺伝子および重鎖についてはＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によってコードされる）から、そしてＣ末端においては、定常領域（軽鎖については単一のＣＬドメインから、あるいは重鎖については３つのドメイン（ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）から構成される）から、構成されている。可変ドメインならびに重鎖のＣＨ_１ドメインおよび軽鎖のＣＬドメインを結合させることにより、Ｆａｂフラグメントが構成され、これらは、高度にフレキシブルなヒンジ領域を介してＦｃ領域へ連結されており、各Ｆａｂフラグメントをその抗原標的へ結合させ、一方、抗体のエフェクター特性についてのメディエーターである、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ受容体等のエフェクター分子へアクセス可能な状態のままである。ＣＨ_２球状ドメインおよびＣＨ_３球状ドメインの両方から構成されるＦｃ領域は、ＣＨ_２ドメインでグリコシル化されており、Ａｓｎ２７９へ連結されたラクトサミン型二分岐Ｎ−グリカン（lactosamine-type biantennary N-glycan）が、前記２つの鎖の各々に存在している。

好ましくは、前記抗体の重鎖の各々の定常領域はγ１タイプのものであり、何故ならば、このような抗体は、最も多数の（ヒト）個体においてＡＤＣＣ活性を誘発する能力を示すためである。この点で、任意のアロタイプ、例えば、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１、２、１７）、Ｇ１ｍ（１、１７）またはＧ１ｍ（１、３）が、本発明の実施のために好適である。好ましくは、アロタイプはＧ１ｍ（１、１７）である。

本発明の１つの特定の局面によれば、前記抗体の重鎖の各々の定常領域は、γ１タイプのものであり、そしてヒト核酸配列（配列番号２３）によってコードされ、軽鎖の各々の定常領域は、ヒト核酸配列（配列番号２１）によってコードされる。したがって、このような抗体は、マウス可変領域と、γ１タイプ重鎖を含むヒト定常領域とを含む。したがって、この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスに属する。本発明に従う抗体の該実施形態によれば、該抗体は、２つの軽鎖［これらの可変ドメインは、マウス核酸配列（配列番号５）またはマウス核酸配列（配列番号２５）によってコードされ、これらのヒト定常領域は、核酸配列（配列番号２１）によってコードされる］、ならびに２つの重鎖［これらの可変ドメインは、マウス核酸配列（配列番号７）によってコードされ、そしてこれらの定常領域は、ヒト核酸配列（配列番号２３）によってコードされる］を有する。

優先的には、本発明に従う抗体の軽鎖の各々は、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）またはマウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）によってコードされる。前記抗体の軽鎖の各々をコードするマウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）は、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号５）を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２１）に融合することによって得られる。

前記抗体の軽鎖の各々をコードするマウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）は、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号２５）を、前記抗体の軽鎖の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２１）に融合することによって得られる。

前記抗体の重鎖の各々をコードするマウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）は、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号７）を、前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２３）に融合することによって得られる。

本発明の特定の局面によれば、前記抗体の軽鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）によってコードされ、そして重鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）によってコードされる場合、核酸配列（配列番号１３）から推定される軽鎖の各々のペプチド配列は、配列（配列番号１４）であり、そして核酸配列（配列番号１９）から推定される重鎖の各々のペプチド配列は、配列（配列番号２０）である。

本発明のさらに特定の局面によれば、前記抗体の軽鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）によってコードされ、そして重鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）によってコードされる場合、核酸配列（配列番号２７）から推定される軽鎖の各々のペプチド配列は、配列（配列番号２８）であり、そして核酸配列（配列番号１９）から推定される重鎖の各々のペプチド配列は、配列（配列番号２０）である。

ペプチド配列（配列番号１４および配列番号２８）は、これら２つの配列上の１０６位に存在するアミノ酸だけが異なる。１０６位に局在するアミノ酸は、配列（配列番号２８）においてはリシン（Ｋ）であり；それは、配列（配列番号１４）においてはアスパラギン（Ｎ）である。

本発明はまた、マウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる軽鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）と少なくとも７０％相同性または同一性を共有し、そして、マウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる重鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）と少なくとも７０％相同性または同一性を共有する、抗体に関し、これらの修飾は、該抗体特異性にも、あるいはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）活性）等のそのエフェクター活性（effector activities）にも悪影響を与えない。

特に有利な様式において、本発明の抗体は、ラットハイブリドーマ細胞株によって産生される。本発明に従う抗体を産生する該株は、重要な特徴であり、何故ならば、それは、その特定の性質の確認（certain）を該抗体に提供するからである。実際に、抗体の発現方法は、翻訳後修飾、特にグリコシル化修飾（これは、細胞系ごとに変化し得る）を誘発し、そしてしたがって、同一の一次構造を有する抗体に異なる機能的特性を提供する。

好ましい実施形態において、抗体は、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６２でAmerican Type Culture Collectionにおいて登録された、細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）において産生される。この株は、例えばＣＨＯ細胞において産生される同一の一次構造を有する抗体と比較して改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生するその能力のために、選択された。

特定の実施形態によれば、本発明に従う好ましい抗体は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）において、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３３１４で、２００４年１１月８日に登録された、クローンＲ５０９によって産生された、抗体ＥＭＡＢ６である。ＥＭＡＢ６抗体の軽鎖の各々は、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス−ヒトキメラ核酸（配列番号１９）によってコードされる。このキメラ抗体は、ＣＤ２０に結合することにおいて、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と拮抗し、そしてリツキサン（登録商標）のそれよりも遥かに高い細胞傷害活性を有し、これは、これらの抗体の重鎖のＮ−グリカンの特異的なグリコシル化に一部寄与し得る（実施例４を参照のこと）。実際に、Ｒ５０９クローンの特徴は、０．６未満のフコース／ガラクトース比を有するＥＭＡＢ６抗体組成をそれが産生することであり、これは、特許出願ＦＲ ０３ １２２２９において、強力なＡＤＣＣ活性を該抗体に提供するに最適であると示された。したがって、この抗体は、標的化される細胞がＣＤ２０を発現するコンディションの処置のための治療ツールとして特に興味深い。

さらなる特定の実施形態によれば、本発明に従う別の好ましい抗体は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France）において、登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で、２００５年１１月２９日に登録された、クローンＲ６０３によって産生された、抗体ＥＭＡＢ６０３である。ＥＭＡＢ６０３抗体の軽鎖の各々は、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）によってコードされ、そして重鎖の各々は、マウス−ヒトキメラアミノ酸配列（配列番号１９）によってコードされる。このキメラ抗体は、ＣＤ２０に結合することにおいて、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と拮抗し、そしてリツキサン（登録商標）のそれよりも遥かに高い細胞傷害活性を有し、これは、これらの抗体の重鎖のＮ−グリカンの特異的なグリコシル化に一部寄与し得る（実施例３を参照のこと）。実際に、Ｒ６０３クローンの特徴は、０．６未満のフコース／ガラクトース比を有するＥＭＡＢ６０３抗体組成物をそれが産生することであり（実施例４を参照のこと）、これは、特許出願ＦＲ ０３ １２２２９において、強力なＡＤＣＣ活性を該抗体に提供するに最適であると示された。したがって、この抗体は、標的化される細胞がＣＤ２０を発現するコンディションの処置のための治療ツールとして特に興味深い。

本発明の別の目的は、配列（配列番号１２）を有する、本発明に従う抗体の軽鎖の発現のためのベクターｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｋに関する。このベクターは、本発明に従う抗体を発現させるベクターであり、この軽鎖は核酸配列（配列番号１３）によってコードされ、この推定ペプチド配列は配列（配列番号１４）である。このベクターは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号５）および前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードする核酸配列（配列番号２１）が、宿主細胞中に導入されそして維持されるように挿入されている核酸分子である。それは、この発現に必須である配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を有しているので、外来核酸フラグメントを宿主細胞中で発現させることを可能にする。このようなベクターは、当業者に周知であり、そして、暗黙の限定無しに、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミドまたはバクテリオファージであり得る。さらに、任意の哺乳動物細胞、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えば、ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫまたはＣＯＳが、宿主細胞として、即ち、本発明に従う抗体を発現する細胞として使用され得る。

本発明の別の目的は、配列（配列番号１８）を有する、本発明に従う抗体の重鎖の発現のためのベクターｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈに関する。このベクターは、本発明に従う抗体を発現させるベクターであり、この重鎖は核酸配列（配列番号１９）によってコードされ、この推定ペプチド配列は配列（配列番号２０）である。このベクターは、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号７）および前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２３）が、宿主細胞中に導入されそして維持されるように挿入されている核酸分子である。それは、この発現に必須である配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を有しているので、これらの外来核酸フラグメントを宿主細胞中で発現させることを可能にする。ちょうど前述したように、該ベクターは、例えば、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルスまたはバクテリオファージであり得、そして該宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えば、ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＢＨＫまたはＣＯＳであり得る。

ＹＢ２／０細胞中においてｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−ＫおよびｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈベクターを共発現させることによって産生される抗体は、クローンＲ５０９（ＣＮＣＭにおいて登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３３１４で登録された）によって産生された、抗ＣＤ２０ ＥＭＡＢ６抗体によって例示される。この抗体は、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来の細胞（この上にＣＤ２０抗原がより低レベルで発現される）、およびモデルとして使用されるＲａｊｉ細胞（これは、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来の細胞と比較してより高い密度でＣＤ２０を発現する）の両方において、リツキサン（登録商標）によって誘発されるそれよりも大きい細胞傷害性を誘発する。さらに、ＥＭＡＢ６抗体は、ジャーカット−ＣＤ１６細胞（Jurkat-CD16 cells）においてＩＬ−２（インターロイキン２）の分泌を誘発し、これは、リツキサン（登録商標）よりも遥かに高いレベルである。ＥＭＡＢ６抗体は、上述のベクターが発現されるのを可能にする培養培地中および条件下でＲ５０９クローンを増殖させることによって産生され得、したがって、それは、ＣＤ２０抗原が関与するＢ細胞疾患（より具体的には、Ｂ−ＣＬＬ）の診断および治療を促進するため、ならびにこの分野における研究のための非常に興味深いツールである。

本発明の特定の目的は、本発明に従う抗体を発現する安定細胞株である。

有利には、本発明に従う抗体を発現する安定細胞株は、以下からなる群から選択される：ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫、例えば、Ｎａｍａｌｗａ、あるいはヒト起源の任意の他の細胞、例えば、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ株、特に、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、あるいは以下から選択される他の株：Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ^６Ｈ^６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３。

使用される株は、好ましくは、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株である。この株は、例えばＣＨＯ細胞において産生される同一の一次構造を有する抗体に対して改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生するその能力のために、選択された。

本発明の１つの特定の局面によれば、本発明に従う抗体を発現しそしてより詳細には上述の群から選択される安定細胞株は、前述の２つのｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−ＫおよびｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ発現ベクターを組み込んでいる。

本発明の１つの特定の局面は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３３１４で登録された、クローンＲ５０９に関する。

本発明の１つの特定の局面は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣ Ｉ−３５２９で登録された、クローンＲ６０３に関する。

本発明の別の目的は、本発明に従う抗体の重鎖をコードする配列（配列番号１９）を有するＤＮＡフラグメントに関する。マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）は、前記抗体の重鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号７）を、前記抗体の重鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２３）へ融合することによって得られる。

本発明の別の特定の目的は、本発明に従う抗体の軽鎖をコードする配列（配列番号１３）を有するＤＮＡフラグメントに関する。マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）は、前記抗体の軽鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号５）を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２１）へ融合することによって得られる。

本発明の別の特定の目的は、本発明に従う抗体の軽鎖をコードする配列（配列番号２７）を有するＤＮＡフラグメントに関する。マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）は、前記抗体の軽鎖の各々をコードする。それは、前記抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードするマウス核酸配列（配列番号２５）を、前記抗体の軽鎖の各々の定常領域をコードするヒト核酸配列（配列番号２１）へ融合することによって得られる。

本発明の１つの特定の目的は、エフェクター免疫細胞（effector immune cells）のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体をインビボまたはインビトロで活性化するための、本発明に従う抗体の使用に関する。実際に、本発明の抗体は、細胞傷害性であるという特徴および利点を有する。したがって、それらは、それらのＦｃ領域でＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化する能力を示す。これはかなり興味深く、何故ならば、この受容体は、「エフェクター細胞（effector cells）」として公知の細胞の表面において発現されるからである：該エフェクター細胞によって行われる該抗体のＦｃ領域のその受容体への結合は、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の活性化、および標的細胞の破壊を生じさせる。エフェクター細胞は、例えば、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球、または肥満細胞である。

１つの特定の局面において、本発明の抗体は、薬物として使用される。有利には、このような薬物は、標的細胞がＣＤ２０を発現する細胞であるコンディション（例えば、悪性Ｂ細胞リンパ腫）の処置に意図される。

１つの有利な局面によれば、本発明に従う抗体は、白血病またはリンパ腫の治療用の薬物を製造するために使用される。

本発明の１つの特定の目的は、以下からなる群から選択される病状の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である：急性Ｂリンパ芽球性白血病（acute B lymphoblastic leukaemia）、Ｂ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）、成熟Ｂ細胞リンパ腫（mature B-cell lymphoma）、例えば、Ｂ型慢性リンパ性白血病（B-type Chronic Lymphocytic Leukaemia）（Ｂ−ＣＬＬ）、小細胞性Ｂ細胞リンパ腫（small B-cell lymphoma）、Ｂ細胞前リンパ性白血病（B-cell prolymphocytic leukaemia）、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫（lymphoplasmocytic lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、辺縁層ＭＡＬＴ型リンパ腫（marginal zone MALT-type lymphoma）、単球様Ｂ細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫（lymph node marginal zone lymphoma with or without monocytoid B cells）、脾性辺縁層リンパ腫（絨毛性リンパ球を含むまたは含まない）（splenic marginal zone lymphoma (with or without villous lymphocytes)）、トリコロイコサイティック白血病（tricholeucocytic leukaemia）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma）、バーキットリンパ腫（Burkitt’s lymphoma）、ならびに自己免疫疾患を含む、Ｂリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患。

本発明の別の目的は、リンパ性白血病の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。

本発明の別の目的は、Ｂ型慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。さらに、本発明に従う抗体は、ＣＤ２０がＢ細胞においてあまり強く発現されていないコンディション、そして好ましくは、Ｂ−ＣＬＬ（Ｂ型慢性リンパ性白血病）の治療に特によく適している。この点において、本発明に従う抗体は、白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のために、１以上のさらなる抗体、例えば、リンパ系細胞（lymphoid cells）において発現される１以上のさらなる抗原（例えば、抗原 ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ８０、ＣＤ３２およびＣＤ５２等）に対するモノクローナル抗体、と組み合わせて使用され得る。したがって、リンパ系細胞上で多量に発現される分子、ＣＤ５２抗原を標的にし、そしてホストエフェクター機構（host effector mechanisms）（補体結合、抗体依存性細胞傷害性）を動員することによって細胞溶解を誘発するヒト化抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標）（アレンツズマブ（alentuzumab）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈＲ（登録商標））が、ＣＬＬの治療において使用される（Moreton P., Hillmen P. (2003) Semin. Oncol. 30(4): 493-501；Rawstron A.C. et al, (2004) Blood 103(6): 2027-2031；Robak T. (2004) Leuk. Lymphoma 45(2): 205-219；Stanglmaier M. et al, (2004) Ann. Hematol. 83(10): 634-645）。臨床試験はまた、ＣＬＬを有する患者における抗原ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０を標的にする抗体または免疫毒素（immunotoxins）を評価しているところである（Mavromatis B.H., Cheson B.D. (2004) Blood Rev. 18(2): 137-148；Mavromatis B., Cheson B.D. (2003) J. Clin. Oncol. 21(9): 1874-1881, Coleman M. et al, (2003) Clin. Cancer Res. 9: 3991S-3994S；Salvatore G. et al, (2002) Clin. Cancer Res. 8: 995-1002）。

さらなる実施形態において、本発明に従う抗体は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞、Ｔγδリンパ球、マクロファージ、単球または樹状細胞等の、ＦｃγＲｓを発現する細胞と組み合わせて、即ち、細胞性治療（cellular therapy）と組み合わせて、使用され得る（Peller S., Kaufman S. (1991) Blood 78: 1569, Platsoucas C.D. et al, (1982) J. Immunol. 129: 2305；Kimby E. et al, (1989) Leukaemia 3(7): 501-504；Soorskaar D. et al, Int. Arch. Allery Appl. Immunol. 87(2): 159-164; Ziegler H.W. et al, (1981) Int. J. Cancer 27(3): 321-327；Chaperot L. et al, (2000) Leukaemia 14(9): 1667-1677；Vuillier F., Dighiero G. (2003) Bull. Cancer. 90(8-9): 744-750）。

さらに、本発明に従う抗体は、有利なことに、患者へ投与される用量を減少させる：有利なことに、患者へ投与される抗体用量は、リツキサン（登録商標）の用量よりも、２倍、５倍、または１０倍、２５倍、５０倍、または特に有利なことに１００倍少ない。有利なことに、患者に投与される抗体用量は、リツキサン（登録商標）の用量よりも、２〜５倍、５〜１０倍、５〜２５倍、５〜５０倍、または５〜１００倍少ない。したがって、本発明に従う抗体、例えばＥＭＡＢ６抗体は、有利には、１８７．５ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２、３７．５ｍｇ／ｍ^２、１５ｍｇ／ｍ^２、７．５ｍｇ／ｍ^２未満、または特に有利には、３．７５ｍｇ／ｍ^２未満の用量で投与され得る。投与される用量は、有利には、１８７．５ｍｇ／ｍ^２〜７５ｍｇ／ｍ^２、または７５ｍｇ／ｍ^２〜３７．５ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２〜１５ｍｇ／ｍ^２、７５ｍｇ／ｍ^２〜７．５ｍｇ／ｍ^２、あるいは７５ｍｇ／ｍ^２〜３．７５ｍｇ／ｍ^２である。

したがって、本発明はまた、本発明に従う抗体を含む有効量の組成物を患者へ投与することを含む、標的細胞がＣＤ２０を発現する細胞である疾患（例えば、悪性Ｂ細胞リンパ腫）を治療するための方法に関する。より詳細には、該治療法は、特に、白血病またはリンパ腫の治療に適している。なおより詳細には、それは、有効量の本発明に従う抗体または抗体組成物を投与することを含む、以下から選択される病状を治療するための方法である：急性Ｂリンパ芽球性白血病（acute B lymphoblastic leukaemia）、Ｂ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）、成熟Ｂ細胞リンパ腫（mature B-cell lymphoma）、例えば、Ｂ型慢性リンパ性白血病（B-type Chronic Lymphocytic Leukaemia）（Ｂ−ＣＬＬ）、小細胞性Ｂ細胞リンパ腫（small B-cell lymphoma）、Ｂ細胞前リンパ性白血病（B-cell prolymphocytic leukaemia）、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫（lymphoplasmocytic lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、辺縁層ＭＡＬＴ型リンパ腫（marginal zone MALT-type lymphoma）、単球様Ｂ細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫（lymph node marginal zone lymphoma with or without monocytoid B cells）、脾性辺縁層リンパ腫（絨毛性リンパ球を含むまたは含まない）（splenic marginal zone lymphoma (with or without villous lymphocytes)）、トリコロイコサイティック白血病（tricholeucocytic leukaemia）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma）、バーキットリンパ腫（Burkitt’s lymphoma）、ならびに自己免疫疾患を含む、Ｂリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患。

本発明の特定の目的は、受容者のＢ細胞が関与する症状を治療するための、慢性移植片対宿主病（chronic graft-versus-host disease）の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。

最後に、本発明の最後の目的は、臓器（特に、腎臓）移植片拒絶の治療用の薬物の製造のための、本発明に従う抗体の使用である。

最近の研究（Ratanatharathorn et al, (Aug 2003) Biol. Blood Marrow Transplant 9(8): 505-511；Becker et al, (Jun 2004) Am. J. Transplant. 4(6): 996-1001）は、実際に、このようなコンディションの治療における抗ＣＤ２０抗体の利点を示した。

本発明のさらなる局面および利点は、例示的な例として理解されるべきでありかつ本発明の範囲を限定しない下記の実施例において説明される。

実施例
実施例１：抗ＣＤ２０キメラ抗体ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３のための発現ベクターの構築
Ａ．ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の可変領域の配列の決定
マウスハイブリドーマＣＡＴ−１３．６Ｅ１２細胞（供給業者：ＤＳＭＺ、ｒｅｆ．ＡＣＣ４７４）（これは、ＩｇＧ２ａ，κ型免疫グロブリンを産生する）由来のトータルＲＮＡを、単離した（ＲＮＡｅａｓｙキット、Ｑｉａｇｅｎ ｒｅｆ．７４１０４）。逆転写後、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体の軽鎖（Ｖκ）および重鎖（ＶＨ）の可変ドメインを、５’ＲＡＣＥ技術（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）（ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｆ．Ｌ１５００−０１)を使用して増幅した。前記２つの工程のために使用したプライマーは、以下であった：
１．リバース転写プライマー
ａ．マウスカッパ（Kappa）特異的アンチセンスプライマー（配列番号１）

ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２）

２．５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー
ａ．マウスカッパ特異的アンチセンスプライマー（配列番号３）

ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号４）

得られるＶＨおよびＶκＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中へクローン化し（Ｚｅｒｏ ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ．Ｋ２８７５−２０）、そして配列決定した。マウスＣＡＴ−１３．６Ｅ１２抗体のＶκ領域のヌクレオチド配列は、配列（配列番号５）のように示され、そして推定されるペプチド配列は、配列（配列番号６）である。該Ｖκ遺伝子は、Ｖκ４クラスに属する［Kabat et al. (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”. NIH Publication 91-3242］。

ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２のＶＨ領域のヌクレオチド配列は、配列（配列番号７）であり、そして推定されるペプチド配列は、配列（配列番号８）である。該ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１クラスに属する［Kabat et al. (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”. NIH Publication 91-3242］。

Ｂ．キメラ抗体ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３のための重鎖および軽鎖発現ベクターの構築
１．軽鎖カッパベクター
１．１．抗体ＥＭＡＢ６についての軽鎖ベクター
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯシークエンシングベクターにクローン化したＶκ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した：
ａ）Ｖκセンスプライマー（配列番号９）

下線が引かれた配列はＳｐｅＩ制限部位に対応し、太字で記載の配列はＫｏｚａｋコンセンサス配列に対応し、ＡＴＧイニシエータ（initiator）はイタリック体である。

ｂ）Ｖκアンチセンスプライマー（配列番号１０）

このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体）を、ヒト定常領域（Ｃκ）（太字）へ連結している。下線が引かれた配列は、ＤｒａＩＩＩ制限部位に対応する。

得られるＶκＰＣＲ産物は、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の天然シグナルペプチドをコードする配列を含む。次いで、このＶκＰＣＲ産物を、ヒト定常領域Ｃκ［その核酸配列は、配列（配列番号２１）であり、そしてその推定ペプチド配列は、配列（配列番号２２）である］の５’で、配列（配列番号１１）に対応する軽鎖キメラ化ベクター（light chain chimerisation vector）（図１）のＳｐｅＩ部位およびＤｒａＩＩＩ部位の間にクローン化した。ＤｒａＩＩＩ制限部位を作製しマウスＶκ配列のクローニングが起こることを可能にするために、このキメラ化ベクターのヒトＣκ配列は、サイレント突然変異（silent mutagenesis）によって予め修飾されている。このキメラ化ベクターは、ＲＳＶプロモータおよびｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列ならびにｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）選択遺伝子を含む。

このベクターによってコードされるキメラＥＭＡＢ６抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１３として示され、そして推定ペプチド配列（配列番号１４）に対応する。

１．２．抗体ＥＭＡＢ６０３についての軽鎖ベクター
プロトコルは、下記のＶκアンチセンスプライマー以外、ＥＭＡＢ６抗体のための軽鎖ベクターについてと同一である（実施例１、Ｂ−１．１を参照のこと）：
ｂ’）Ｖκアンチセンスプライマー（配列番号２９）

このプライマーは、マウスＶκ配列（イタリック体）を、ヒト定常領域（Ｃκ）（太字）へ連結している。下線が引かれた配列は、ＤｒａＩＩＩ制限部位に対応する。

このプライマーはまた、突然変異ＡＡＣ→ＡＡＡ（アンチセンスプライマー配列（配列番号２９）において囲まれているヌクレオチド）を導入し、これは、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２の天然Ｖκ配列（配列番号５および配列番号６を参照のこと）に対しての突然変異Ｎ１０６Ｋに対応する（ヌクレオチド配列および推定ペプチド配列（配列番号２５および配列番号２６）を参照のこと）。

このベクターによってコードされるキメラＥＭＡＢ６０３抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号２７として示され、そして推定ペプチド配列（配列番号２８）に対応する。

２．重鎖ベクター
同様のアプローチを、ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のキメラ化に適用した。

先ず、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローン化されたＶＨ配列を、下記のクローニングプライマーを使用して増幅した：
ａ）ＶＨセンスプライマー（配列番号１５）

下線が引かれた配列は制限部位ＳｐｅＩに対応し、太字で記載の配列はＫｏｚａｋコンセンサス配列に対応し、ＡＴＧイニシエータはイタリック体である。

ｂ）ＶＨアンチセンスプライマー（配列番号１６）

このプライマーは、マウスＶＨ配列（イタリック体）を、ヒトＧ１定常領域（太字）へ連結している。下線が引かれた配列は、ＡｐａＩ制限部位に対応する。

増幅したＶＨフラグメントは、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の天然シグナルペプチドをコードする配列を含む。次いで、このＶＨ ＰＣＲ産物を、γ１ヒト定常領域［その核酸配列は、配列（配列番号２３）であり、そしてその推定ペプチド配列は、配列（配列番号２４）である］の５’で、配列（配列番号１７）に対応する重鎖キメラ化ベクター（図３）のＳｐｅＩ部位およびＡｐａＩ部位の間へクローン化した。このキメラ化ベクターは、ＲＳＶプロモータおよびｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列ならびにｎｅｏ選択遺伝子を含む。

このベクターによってコードされるキメラＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１９として、そして推定ペプチド配列については配列番号２０として示される。

３．最終発現ベクター
３．１．ＥＭＡＢ６抗体発現ベクター
ＥＭＡＢ６抗体の発現のために、カッパ軽鎖キメラ化ベクター（実施例１、Ｂ−１．１を参照のこと）のＲＳＶプロモータを、ヒトＥＦ−１アルファプロモータで置換した。最終軽鎖ｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｋ発現ベクターは、図２に示され、そして配列（配列番号１２）に対応する。

このベクターによってコードされるキメラＥＭＡＢ６抗体の軽鎖配列は、ヌクレオチド配列については配列番号１３として示され、そして推定ペプチド配列（配列番号１４）に対応する。

ＥＭＡＢ６抗体の発現のために、重鎖キメラ化ベクター（実施例１、Ｂ−２を参照のこと）のＲＳＶプロモータを、ヒトＥＦ−１アルファプロモータで置換した。このようにして得られた最終重鎖ｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ発現ベクターは、図４に示され、そして配列（配列番号１８）に対応する。

３．２．ＥＭＡＢ６０３抗体発現ベクター
軽鎖転写単位およびｄｈｆｒ遺伝子を含む前記軽鎖ベクターのＢｇＩＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを前記重鎖ベクターのＸｈｏＩ部位へサブクローン化することによって、抗ＣＤ２０ ＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖転写単位および軽鎖転写単位の両方を含む独特な発現ベクターを２つの軽鎖および重鎖キメラ化ベクター（それぞれ、実施例１、Ｂ−１．２およびＢ２を参照のこと）から構築した。このｐＲＳＶ−ＨＬ−ＥＭＡＢ６０３発現ベクターは、２つの選択遺伝子、即ち、ｎｅｏ（ネオ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ）およびｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ならびにＲＳＶプロモータの制御下にある２つの重鎖および軽鎖転写単位を含む（図１２）。

実施例２：抗ＣＤ２０キメラＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体を産生するＹＢ２／０株由来の細胞株の製造
ラットＹＢ２／０細胞株（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−１６６２）を、５％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．１２１０７）を含有するＥＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．０４１−９５１８１Ｍ）において培養した。トランスフェクションのために、５百万個の細胞を、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地（Ｅｑｕｉｂｉｏ，ｒｅｆ．ＥＫＩＴＥ １）において、ＥＭＡＢ６抗体の発現については２５μｇの軽鎖ベクターｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｋ（図２）（ＡａｔＩＩで線形化）および２７μｇの重鎖ベクターｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ（図４）（ＳｃａＩで線形化）で、あるいはＥＭＡＢ６０３抗体の発現についてはベクターｐＲＳＶ−ＨＬ−ＥＭＡＢ６０３で、エレクトロポレーションした（Ｂｉｏｒａｄエレクトロポレーター、モデル１６５２０７７）。適用したエレクトロポレーション条件は、０．５−ｍＬキュベット中、２３０ボルトおよび９６０マイクロファラッドであった。次いで、各エレクトロポレーションキュベットを、５，０００細胞／ウェルの密度で、５ Ｐ９６プレート上に分配した。

５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０６０３−０１７）、５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０１３１−０２７）および２５ｎＭメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）を含有する選択的ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ ２１８７５−０３４）中に、トランスフェクションの３日後に、配置した。

前記耐性トランスフェクションウェル（resistant transfection wells）からの上澄みを、ヒトＩｇ配列に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを適用することによって、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在についてスクリーニングした。

最大量の抗体を産生する１０個のトランスフェクタントを、Ｐ２４プレート上で増幅し、そしてそれらの上澄みを、ＥＬＩＳＡを使用して再アッセイし、それらの生産力を評価し、そして限られた希釈（limited dilution）（４０細胞／プレート）によって、クローニングに最適な３つのプロデューサを選択した。

クローニング後、Ｒ５０９．６Ａ４クローン（Ｒ５０９−３３９０３／０４６−６Ｈ１（１）６Ａ４、生産力：１７μｇ／１０^６細胞）（以後、「Ｒ５０９」と呼ぶ）、ならびにＲ６０３クローンを、それぞれキメラＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の産生のために選択し、そしてこれらはＣＤハイブリドーマ産生培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ．１１２７９−０２３）に次第に順化した。

キメラＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の産生は、７５−ｃｍ^２および１７５−ｃｍ^２バイアル中３×１０^５細胞／ｍＬへの希釈そして次いでローラーフラスコ（roller flasks）中４．５×１０^５細胞／ｍＬへの希釈によって得られた順化培養を、ＣＤハイブリドーマ培地において、拡大することによって、達成された。いったん最大容量（１Ｌ）が達成されると、細胞生存能（cell viability）が２０％だけになるまで、培養を継続した。産生後、キメラＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し（ＨＰＬＣは、純度＜９５％と評価した）、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によってチェックした。

実施例３：キメラ抗体ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３の機能活性のキャラクタライゼーション
Ａ．特異性
Ｒａｊｉ細胞によって発現されたＣＤ２０抗原に結合することについての、マウス抗体ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２（ＣＡＴ１３）との拮抗を研究することによって、キメラＥＭＡＢ６抗体の抗原認識の特異性を評価した。

その目的のために、ＥＭＡＢ６抗体（０．５〜５０μｇ／ｍＬで１０μＬ）を、Ｒａｊｉ細胞（４×１０^６細胞／ｍｌで５０μＬ）の存在下で、２０分間、固定量のＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体（５μｇ／ｍＬで１０μＬ）と共に、４℃でインキュベートした。洗浄後、フィコエリトリン（ＰＥ）へ結合されたマウス抗ＩｇＧ抗体を、前記Ｒａｊｉ細胞へ添加し、ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体の結合を特異的に検出した。種々の濃度のＥＭＡＢ６の存在下で得られたメジアン蛍光強度（Median Fluorescence Intensities）（ＭＦＩ）をパーセンテージに変換し、ここで、１００％は、ＥＭＡＢ６抗体の非存在下でのＣＡＴ−１３．６Ｅ１２細胞への結合に対応する。

増加する濃度のＥＭＡＢ６の存在下におけるＲａｊｉ細胞へのＣＡＴ−１３．６Ｅ１２（ＣＡＴ１３）抗体の結合についての阻害曲線をこのようにして得る（図５）。

この研究により、前記キメラ化プロセスは、Ｒａｊｉ細胞の表面に発現されるＣＤ２０への結合について親（parental）ＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体と拮抗する、ＥＭＡＢ６抗体の特異性に悪影響を与えていないことが実証される。

ＥＭＡＢ６０３抗体の抗原認識特異性は、ＥＭＡＢ６抗体のそれと匹敵する。

Ｂ．補体依存性細胞傷害活性
ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の補体依存性細胞傷害活性を、補体の供給源としての若いウサギ血清の存在下で、Ｒａｊｉ細胞を用いて試験した；比較のために、抗ＣＤ２０キメラ抗体リツキサン（登録商標）を、１つの試験に含めた。

この試験のために、Ｒａｊｉ細胞を、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium））５％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）中、６×１０^５細胞／ｍＬに調整した。抗体をＩＭＤＭ＋０．５％ＦＣＳで希釈した。反応混合物を、５０μＬ抗体、５０μＬの若いウサギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ＣＬ ３４４１試薬の１／１０ ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＣＳ希釈）、５０μＬ標的細胞、および５０μＬ ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＣＳ培地から作製した。最終抗体濃度は、５，０００、１，２５０、２５０、および５０ｎｇ／ｍＬであった。抗体を含まないコントロールを、試験に含ませた。５％ＣＯ_２雰囲気中３７℃で１時間インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄みへ放出された細胞内ＬＤＨのレベルを、特定の試薬（細胞傷害性検出キット（Cytotoxicity Detection Kit）１ ６４４ ７９３）を使用して評価した。

それぞれ１００、５０、２５および０％溶解に対応するｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（２％）を使用して溶解された種々の希釈の標的細胞を使用して得られた較正範囲を使用して、パーセンテージ溶解（percentage lysis）を評価した。

図６（Ａ）において示された結果は、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）は両方とも、Ｒａｊｉ細胞の補体依存性溶解を誘発することを実証する。にもかかわらず、ＥＭＡＢ６補体活性は、リツキサン（登録商標）のそれよりも僅かに低いようであった。この差異は、この試験において使用した低濃度の抗体でより大きい。したがって、５０および２５０ｎｇ／ｍＬの濃度について、ＥＭＡＢ６の活性は、リツキサン（登録商標）のそれの４５％のオーダーのものである。この差異は、抗体濃度が増加されるにつれて小さくなり、ＥＭＡＢ６抗体の％補体依存性細胞傷害活性は、試験した最高濃度（即ち、５，０００ｎｇ／ｍＬ）でリツキサン（登録商標）のそれの９２％を示す。

リツキサン（登録商標）のそれと比較してＥＭＡＢ６抗体のこのより低い補体依存性傷害活性は、利点とみなされ得、何故ならば、それは、リツキサン（登録商標）と比較して、ＥＭＡＢ６の潜在的インビボ毒性（これは、従来の補体経路の活性化に付随し、これは、望まれない炎症、アレルギーおよび血管活性を有する種々の分子の産生へと導く）を制限するためである。

ＥＭＡＢ６０３抗体の補体活性を図６（Ｂ）に示す。

Ｃ．ＡＤＣＣ活性
キメラＥＭＡＢ６抗体の細胞傷害性を、Ｒａｊｉ細胞またはＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球の存在下で評価した。抗ＣＤ２０キメラ抗体リツキサン（登録商標）を、比較のために試験に含めた。

使用したカルセイン標識ＡＤＣＣ測定技術は、以下の通りであった：
Ｍｙｌｔｅｎｙｉからの磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）における分離技術を使用して、ＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。該細胞を、ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳ（４５×１０^５細胞／ｍＬ）において、洗浄しそして再懸濁させた。該エフェクター細胞および標的細胞を、１５／１の比率で使用した。Ｆｉｃｏｌｌ処理後に得られたＢ−ＣＬＬを有する患者由来のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）（＞９５％Ｂ細胞）またはＲａｊｉ細胞を、カルセインで予め標識し（ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳ＋２０μＬカルセイン（２０μＭ）中３×１０^６細胞／ｍＬで１ｍＬ細胞、３７℃で２０分インキュベーション、次いでＨＢＳＳ（ハンクス緩衝生理食塩水溶液（Hank's Buffered Saline Solution））で洗浄）、そしてＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳ中において３×１０^５細胞／ｍＬに調整した。抗体を、ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＣＳ（最終濃度：５００；５０；５；０．５；０．００５および０．００５ｎｇ／ｍＬ）で希釈した。

反応混合物を、Ｐ９６マイクロタイトレーションプレート中、５０μＬ抗体、５０μＬエフェクター細胞、５０μＬ標的細胞、および５０μＬ ＩＭＤＭ培地から作製した。２つの陰性コントロールを使用した：
− ＮＫ無しでの溶解：ＮＫエフェクター細胞をＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳで置換した。
− 抗体（Ａｂ）無しでの溶解：抗体をＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳで置換した。

５％ＣＯ_２雰囲気において３７℃で４時間インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄みと関連する蛍光を、蛍光光度計（励起：４８５ｎｍ、放出：５３５ｎｍ）を使用して測定した。

それぞれ１００、５０、２５および０％溶解に対応するＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（２％）を使用して溶解された種々の希釈の標的細胞を使用して得られた較正範囲を使用して、パーセンテージ溶解を評価した。

結果を、先ず、下記の式：
％溶解＝（抗体およびＮＫでの％溶解）−（抗体無しでの％溶解）−（ＮＫ無しでの％溶解）
を使用して算出し、次いで相対的パーセンテージとして表し、ここで、１００％は、最高濃度のリツキサン（登録商標）で得られた値である。

図７（Ａ）において示されたＲａｊｉ系細胞に対してのＥＭＡＢ６抗体について得られた結果は、試験される濃度に関係なく、ＥＭＡＢ６抗体によって誘発された細胞傷害性はリツキサン（登録商標）によって誘発されたそれよりも大きいことを実証する。この差異は、特に、低抗体濃度で大きい。したがって、０．５ｎｇ／ｍＬで、溶解パーセンテージは、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）について、それぞれ、９６％および４％であった。用量を５００倍（２５０ｎｇ／ｍＬ）増加させることによって、差異は依然として明らかであり、何故ならば、ＡＤＣＣの相対的パーセンテージは、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）について、それぞれ、１６４％および１００％であるからである。図式評価（graphical estimation）（ｎｇ／ｍＬ）ならびにリツキサン（登録商標）およびＥＭＡＢ６が同一のＥ Ｍａｘに達すると想定することによって、ＥＣ５０［Ｅ最大値（最高抗体濃度およびプラトーで得られる最大有効性）の５０％に対応する抗体濃度］を算出すると、この試験におけるリツキサン（登録商標）ＥＣ５０／ＥＭＡＢ６ ＥＣ５０比は、３００に等しくなった。

キメラＥＭＡＢ６０３抗体の細胞傷害性を、ＥＭＡＢ６抗体についてのものと同一の手順を使用して、Ｒａｊｉ細胞の存在下で評価した。その活性は、ＥＭＡＢ６抗体のそれと匹敵した（図７（Ｂ）を参照のこと）。

Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のリンパ球で、得られた結果（図８に示す）は、試験される濃度に関係なく、ＥＭＡＢ６抗体によって誘発された細胞傷害性はリツキサン（登録商標）によって誘発されたそれよりも大きいことを実証している。Ｒａｊｉ細胞について既に観察されたように、この差異は、特に、低抗体濃度で大きい。０．５ｎｇ／ｍＬ ＥＭＡＢ６の濃度は、５００ｎｇ／ｍＬ リツキサン（登録商標）（即ち、１，０００の濃度比）と同一のパーセンテージ溶解を誘発する。５ｎｇ／ｍＬで、溶解パーセンテージは、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）について、それぞれ、２６９％および９％である。試験した最大用量（５００ｎｇ／ｍＬ）で、差異は依然として非常に大きく、何故ならば、ＡＤＣＣの相対的パーセンテージが、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）について、それぞれ、３５０％および１００％あるためである。興味深い結果は、５０％溶解を生じる濃度に対応する。この試験において、リツキサン（登録商標）ＥＣ５０／ＥＭＡＢ６ ＥＣ５０比は、１０，０００と評価された（リツキサン（登録商標）およびＥＭＡＢ６は同一のＥ Ｍａｘに達すると想定しての、ＥＣ５０についてのｎｇ／ｍＬでの図式評価）。

したがって、これらの試験において、ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３の細胞傷害活性は、リツキサン（登録商標）のそれよりも遥かに高い。

Ｄ．ＣＤ１６の活性化（ＩＬ−２分泌）
キメラＥＭＡＢ６抗体によって誘発されるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の活性化を、Ｒａｊｉ細胞またはＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球の存在下で測定した。この試験は、ジャーカット−ＣＤ１６細胞上において発現されるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）受容体へ結合しそしてＩＬ−２の分泌を誘発する前記抗体の能力を評価した。抗ＣＤ２０キメラ抗体リツキサン（登録商標）を、比較のために試験に含める。

ＣＤ１６活性化の測定を、Ｒａｊｉ細胞またはＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球の存在下、ジャーカット−ＣＤ１６細胞株に対して、下記の様式で行った。

９６ウェルプレート中の混合物：５０μＬ抗体溶液（Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球については、ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳで１０，０００、１，０００、１００および１０ｎｇ／ｍＬへ希釈、そしてＲａｊｉ細胞については、１０，０００、２，０００、１，０００、２００、１００、５０および２５ｎｇ／ｍＬに希釈）、５０μＬ ＰＭＡ（ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳで４０ｎｇ／ｍＬへ希釈した、ホルボールミリステートアセテート（Phorbol Myristate Acetate））、５０μＬ ＲａｊｉまたはＦｉｃｏｌ処理後に得られるＢ−ＣＬＬを有する患者由来のＰＢＭＣ（＞９５％ Ｂ細胞）（ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳで６×１０^５／ｍＬまで希釈）、ならびに５０μＬ ジャーカット−ＣＤ１６細胞（ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳ中２０×１０^６／ｍＬ）。抗体を含まないコントロールを、すべての試験において含めた。３７℃で一晩インキュベーション後、前記プレートを遠心分離し、そして上澄み中に含まれるＩＬ−２を、市販のキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｒ／Ｄ）を使用して評価した。ＯＤ読み取りは、４５０ｎｍで行った。

結果を、初めに、抗体濃度（０〜２５０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）の関数としてのＩＬ−２レベルとして表し、次いで、相対的パーセンテージとして表し、ここで、１００％は、最高試験濃度でリツキサン（登録商標）を用いて得られた値である。

図９（Ａ）において示されるＲａｊｉ系細胞で得られた結果は、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）の存在下で、ジャーカット−ＣＤ１６細胞がＩＬ−２を分泌することを実証し、これは、ＣＤ１６への前記抗体のＦｃ部分の結合を介しての細胞活性化を示す。しかし、ＥＭＡＢ６抗体は、リツキサン（登録商標）抗体よりも遥かに強力な誘発活性（inductive activity）を有する。したがって、６．２５ｎｇ／ｍＬで、ＩＬ−２パーセンテージは、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）について、それぞれ、１１２％および２１％であった。５０ｎｇ／ｍＬで、差異は依然として大きく、ＩＬ−２のパーセンテージは、それぞれ、１１２％および６５％であった。この差異は、濃度が増加するにつれて小さくなり、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）についてのＩＬ−２のそれぞれのパーセンテージは、２，５００ｎｇ／ｍＬで１２４％および１００％である。この試験において、リツキサン（登録商標）ＥＣ５０／ＥＭＡＢ６ ＥＣ５０比は、１５と評価される（リツキサン（登録商標）およびＥＭＡＢ６が同一のＥ Ｍａｘに達すると想定しての、ＥＣ５０についてのｎｇ／ｍＬでの図式評価）。

これらの結果は、ＡＤＣＣ結果を確認し、両方ともＣＤ１６依存性である。それらは、ＥＭＡＢ６抗体のＦｃ部分によってＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）へ結合することは、強力な細胞活性化が伴い、これは、エフェクター機能の誘導へ導く。

Ｒａｊｉ細胞の存在下でキメラＥＭＡＢ６０３抗体によって誘発されるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の活性化は、ＥＭＡＢ６抗体によって誘発されるそれに匹敵する。

Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のリンパ球で、得られた結果（図１０に示す）は、抗ＣＤ２０リツキサン（登録商標）およびＥＭＡＢ６の存在下において、ジャーカット−ＣＤ１６細胞は、ＩＬ−２を分泌することを実証し、これは、ＣＤ１６への前記抗体のＦｃ部分の結合を介しての細胞活性化を示す。しかし、ＥＭＡＢ６抗体は、リツキサン（登録商標）抗体よりも遥かに高い誘発力（inductive ability）を有する。実際に、リツキサン（登録商標）のＩＬ−２分泌誘発活性は、２．５および２５ｎｇ／ｍＬの濃度でベースラインに付近であり、一方、ＥＭＡＢ６抗体のそれは顕著である。したがって、２５ｎｇ／ｍＬで、ＩＬ−２パーセンテージは、ＥＭＡＢ６およびリツキサン（登録商標）についてそれぞれ１３２％および３４％であった。最高濃度（２，５００ｎｇ／ｍＬ）で、ＩＬ−２パーセンテージは、それぞれ、１４８％および１００％であった。この試験におけるリツキサン（登録商標）ＥＣ５０／ＥＭＡＢ６ ＥＣ５０比は、１００よりも大きく；それは、３００と評価される（リツキサン（登録商標）およびＥＭＡＢ６が同一のＥ Ｍａｘを達成すると想定しての、ＥＣ５０についてのｎｇ／ｍＬでの図式評価）。

結論として、Ｒａｊｉ細胞において行った全ての試験は、ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体は、リツキサン（登録商標）とは異なって、非常に細胞傷害性であり、そしてＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現する細胞の活性化を、特に抵抗体濃度で、誘発することを実証する。他方、同一条件下で、ＥＭＡＢ６の補体依存性細胞傷害活性は、リツキサン（登録商標）のそれと比較して約５０％減少する。

これらの結果は、Ｂ−ＣＬＬを有する患者から単離された細胞を使用して行った研究によって確認され、ＥＭＡＢ６抗体が、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球へ対して、リツキサン（登録商標）よりも遥かに細胞傷害性であることを示唆している。２つの抗体間の差異は、Ｒａｊｉ細胞でよりも、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のリンパ球で、より顕著であり、これは、このコンディションについて、リツキサン（登録商標）と比較してＥＭＡＢ６の顕著な治療利益を実証する。

この増加した差異の理由は、中でも、Ｒａｊｉ細胞と比較して、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球においてはＣＤ２０がより低く抗原発現されるためであるかもしれない。

Ｒａｊｉ細胞から類推して、Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のリンパ球に対するＥＭＡＢ６抗体の補体依存性細胞傷害活性は、リツキサン（登録商標）によって誘発されるものよりも低くなければならないことが示唆され得、したがって、従来の補体経路の強力な活性化に付随する望ましくない効果の結果として、インビボにおいて毒性がより低いという利点を示す。

実施例４：ＨＰＣＥ−ＬＩＦによるＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３グリカンの分析
ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体の重鎖のＮ−グリカン構造を、ＨＰＣＥ−ＬＩＦを使用して分析した。リツキサン（登録商標）の重鎖のＮ−グリカン構造もまた、比較のために分析した。

その目的のために、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において脱塩し、エバポレートし、そして５０ｍＭ β−メルカプトエタノールの存在下で、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｇｌｙｋｏ）の加水分解緩衝液中に再懸濁した。３７℃で１６時間インキュベーション後、蛋白質分画を、無水エタノールを添加することによって沈殿させ、そして上澄み（これは、Ｎ−グリカンを含有した）をエバポレートした。得られたオリゴ糖を、蛍光色素：ＡＰＴＳ（１−アミノ−ピレン−３，６，８−トリスルホネート）を使用して直接標識したか、あるいは特定のエキソグリコシダーゼ（exoglycosidases）の作用に供し、その後ＡＰＴＳで標識した。得られた標識化オリゴ糖を、Ｎ−ＣＨＯキャピラリーへ注入し、レーザー誘起蛍光検出（laser-induced fluorescence detection）（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）を備えるキャピラリー電気泳動によって分離および定量した。

フコースレベルの評価を、単離フコシル化形態を加えることによってか、あるいはより詳細には、ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびＮ−アセチルヘキソサミニダーゼの同時作用後に行い、これらは、電気泳動図において得られた、フコシル化または非フコシル化五糖［ＧｌｃＮａｃ２−Ｍａｎ３］に対応する２つのピークを生じた：

フコースレベル（％として表される）を、下記式を使用して算出した：

ガラクトースレベル（％として表される）を、ノイラミニダーゼおよびフコシダーゼの作用後に得られたガラクトースを含有するオリゴ糖形態のパーセンテージを加えることによって、算出した。使用した式は、下記の通りである：
ガラクトースレベル＝（Ｇ１＋Ｇ１Ｂ）＋２×（Ｇ２＋Ｇ２Ｂ）
フコース／ガラクトース比を、上述のように算出される、ガラクトースレベルでフコースレベルを割ることによって得る。

この分析から（表１を参照のこと）、ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３抗体は、リツキサン（登録商標）（％フコース＝９３％）と比較してほとんどフコシル化されていない（％フコース＜２５％）ようである。さらに、ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３についてのＦｕｃ／Ｇａｌ比（フコース／ガラクトース比）は、リツキサン（登録商標）（Ｆｕｃ／Ｇａｌ比＝１．６３）等のＣＨＯ細胞において発現される抗体とは異なり、低い（Ｆｕｃ／Ｇａｌ比＜０．６）。

抗体ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３の軽鎖カッパのキメラ化のために使用したＣＫＨｕベクターの概略図。 抗体ＥＭＡＢ６の産生のために使用した軽鎖ｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｋ発現ベクターの概略図。 抗体ＥＭＡＢ６およびＥＭＡＢ６０３の重鎖のキメラ化のために使用したＧ１Ｈｕベクターの概略図。 抗体ＥＭＡＢ６の産生のために使用した重鎖ｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ発現ベクターの概略図。 Ｒａｊｉ細胞上に発現されるＣＤ２０へのＣＡＴ−１３．６Ｅ１２（ＣＡＴ１３）によって産生されたマウス抗体の結合についての、キメラＥＭＡＢ６抗体による拮抗。 Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体の補体依存性細胞傷害活性。（Ａ）リツキサン（登録商標）：白三角、ＥＭＡＢ６：黒菱形。上澄みへ放出された細胞内ＬＤＨを測定することによって、細胞溶解を評価する。結果をパーセンテージ溶解として表し、ここで、１００％は、リツキサン（登録商標）（５，０００ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ２０抗体）で得られた値である。５回の試験の平均値。（Ｂ）ＥＭＡＢ６（黒菱形）およびＥＭＡＢ６０３（白菱形）の補体依存性細胞傷害活性の比較。 Ｒａｊｉ細胞の存在下で抗ＣＤ２０抗体によって誘発されたＡＤＣＣ活性。（Ａ）リツキサン（登録商標）：白三角、ＥＭＡＢ６：黒菱形。上澄みへ放出された細胞内ＬＤＨを測定することによって、細胞溶解を評価する。結果をパーセンテージ溶解として表し、ここで、１００％は、リツキサン（登録商標）（２５０ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ２０抗体で）で得られた値である。３回の試験の平均値。（Ｂ）ＥＭＡＢ６（黒菱形）およびＥＭＡＢ６０３（白菱形）によって誘発されたＡＤＣＣの比較。 Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球の存在下で抗ＣＤ２０抗体によって誘発されるＡＤＣＣ活性。リツキサン（登録商標）：白三角、ＥＭＡＢ６：黒菱形。Ｅ／Ｔ比＝１５。上澄みへ放出されたカルセインを測定することによって、細胞溶解を評価する。結果をパーセンテージとして表し、ここで、１００％は、リツキサン（登録商標）（５００ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ２０抗体で）で得られた値である。４人の異なる患者に対応する４回の試験の平均値。 Ｒａｊｉ細胞の存在下で抗ＣＤ２０抗体によって誘発されたＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の活性化。（Ａ）リツキサン（登録商標）：白三角、ＥＭＡＢ６：黒菱形。結果をＩＬ−２のパーセンテージとして表し（ＥＬＩＳＡを使用して上澄みにおいて測定する）；ここで、１００％は、リツキサン（登録商標）（２，５００ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ２０抗体）で得られた値である。４回の試験の平均値。（Ｂ）ＥＭＡＢ６（黒菱形）およびＥＭＡＢ６０３（白菱形）によって誘発されたＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の活性化間の比較。 Ｂ−ＣＬＬを有する患者由来のＢリンパ球の存在下で抗ＣＤ２０抗体によって誘発されるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の活性化。リツキサン（登録商標）：白三角、ＥＭＡＢ６：黒菱形。結果をＩＬ−２のパーセンテージとして表し（ＥＬＩＳＡを使用して上澄みにおいて測定する）；ここで、１００％は、リツキサン（登録商標）（２，５００ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ２０抗体で）で得られた値である。１２人の患者の平均値。 ジャーカット−ＣＤ１６細胞（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の存在下でＣＡＴ−１３．６Ｅ１２マウス抗体によって誘発されたＩＬ−２の産生。 抗体ＥＭＡＢ６０３の産生のために使用された重鎖および軽鎖ｐＲＳＶ−ＨＬ−ＥＭＡＢ６０３発現ベクターの概略図。

Claims (39)

1. ＣＤ２０抗原に対するモノクローナル抗体であって、ここで、その軽鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも７０％同一性を共有する配列によってコードされ、その重鎖の各々の可変領域は、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも７０％同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその軽鎖および重鎖の定常領域は、非マウス種由来の定常領域である、抗体。
2. その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも８０％同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも８０％同一性を共有する配列によってコードされる、請求項１に記載の抗体。
3. その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９０％同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９０％同一性を共有する配列によってコードされる、請求項１または２に記載の抗体。
4. その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９５％同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９５％同一性を共有する配列によってコードされる、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
5. その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号５）と少なくとも９９％同一性を共有する配列によってコードされ、そしてその重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号７）と少なくとも９９％同一性を共有する配列によってコードされる、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
6. その軽鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号５）またはマウス核酸配列（配列番号２５）によってコードされ、その重鎖の各々の可変領域が、マウス核酸配列（配列番号７）によってコードされ、そしてその軽鎖および重鎖の定常領域が、非マウス種由来の定常領域である、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
7. その軽鎖の各々および重鎖の各々の定常領域がヒト定常領域である、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
8. その軽鎖の各々の定常領域がκタイプのものである、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
9. その重鎖の各々の定常領域がγタイプのものである、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
10. その重鎖の各々の定常領域がγ１タイプである、請求項９に記載の抗体。
11. その重鎖の各々の定常領域がγ１タイプのものであり、そしてヒト核酸配列（配列番号２３）によってコードされ、そしてその軽鎖の各々の定常領域がヒト核酸配列（配列番号２１）によってコードされる、請求項１０に記載の抗体。
12. その軽鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１３）またはマウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号２７）によってコードされ、そしてその重鎖の各々が、マウス−ヒトキメラ核酸配列（配列番号１９）によってコードされる、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
13. 配列（配列番号１３）からの推定ペプチド配列が、配列（配列番号１４）であり、そして配列（配列番号１９）からの推定ペプチド配列が、配列（配列番号２０）である、請求項１２に記載の抗体。
14. 配列（配列番号２７）からの推定ペプチド配列が、配列（配列番号２８）であり、そして配列（配列番号１９）からの推定ペプチド配列が、配列（配列番号２０）である、請求項１２に記載の抗体。
15. ラットハイブリドーマ細胞株によって産生された、前記請求項のいずれかに記載の抗体。
16. ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６２でAmerican Type Culture Collectionにおいて登録された、細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）において産生された、請求項１５に記載の抗体。
17. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３３１４で登録されたクローンＲ５０９によって産生されたＥＭＢＡ６抗体である、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体。
18. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で登録されたクローンＲ６０３によって産生されたＥＭＢＡ６０３抗体である、請求項１〜１２および１４のいずれかに記載の抗体。
19. 配列（配列番号１２）を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の軽鎖のｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｋ発現ベクター。
20. 配列（配列番号１８）を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の重鎖のｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ発現ベクター。
21. 請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体を発現する安定細胞株。
22. ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ株、特に、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４、およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からなる群から選択される、請求項２１に記載の安定細胞株。
23. 請求項１９および２０に記載のｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−ＫおよびｐＥＦ−ＥＭＡＢ６−Ｈ発現ベクターの両方が組み込まれている、請求項２１または２２に記載の安定細胞株。
24. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３３１４で登録された、クローンＲ５０９。
25. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）において登録番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５２９で登録された、クローンＲ６０２。
26. 請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の重鎖をコードする、配列（配列番号１９）を有するＤＮＡフラグメント。
27. 請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体の軽鎖をコードする、配列（配列番号１３）を有するＤＮＡフラグメント。
28. 請求項１〜１２および１４のいずれかに記載の抗体の軽鎖をコードする、配列（配列番号２７）を有するＤＮＡフラグメント。
29. 免疫エフェクター細胞中のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体のインビトロ活性化のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
30. 薬物としての使用のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体。
31. 白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
32. 急性Ｂリンパ芽球性白血病（acute B lymphoblastic leukaemia）、Ｂ細胞リンパ腫（B-cell lymphoma）、成熟Ｂ細胞リンパ腫（mature B-cell lymphoma）、例えば、Ｂ型慢性リンパ性白血病（B-type Chronic Lymphocytic Leukaemia）（Ｂ−ＣＬＬ）、小細胞性Ｂ細胞リンパ腫（small B-cell lymphoma）、Ｂ細胞前リンパ性白血病（B-cell prolymphocytic leukaemia）、リンパ球プラズマ細胞性リンパ腫（lymphoplasmocytic lymphoma）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma）、辺縁層ＭＡＬＴ型リンパ腫（marginal zone MALT-type lymphoma）、単球様Ｂ細胞を含むまたは含まないリンパ節辺縁層リンパ腫（lymph node marginal zone lymphoma with or without monocytoid B cells）、脾性辺縁層リンパ腫（絨毛性リンパ球を含むまたは含まない）（splenic marginal zone lymphoma (with or without villous lymphocytes)）、トリコロイコサイティック白血病（tricholeucocytic leukaemia）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma）、バーキットリンパ腫（Burkitt’s lymphoma）、ならびに自己免疫疾患を含む、Ｂリンパ系細胞が関与する任意の免疫不全疾患からなる群から選択される病状の治療用の薬物を製造するための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
33. リンパ性白血病の治療用の薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
34. Ｂ型慢性リンパ性白血病（B-type Chronic Lymphoid Leukaemia）（Ｂ−ＣＬＬ）の治療用の薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
35. 慢性移植片対宿主病の治療用の薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
36. 臓器（特に、腎臓）移植片拒絶の治療用の薬物の製造のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
37. 白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、リンパ系細胞において発現される１以上のさらなる抗原に対する１以上のさらなる抗体と組み合わせての、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。
38. リンパ系細胞において発現される前記抗原が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ２２、ＣＤ３２およびＣＤ５２から選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の抗体の使用。
39. 白血病またはリンパ腫の治療用の薬物の製造のための、ＦｃγＲｓを発現する細胞、例えば、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞、Ｔγδリンパ球、マクロファージ、単球または樹状細胞と組み合わせての、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体の使用。

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