KR19990029676A - 서열화를 위해 변경시킨 열안정성 디엔에이폴리머라제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광계 염료로 표지된 것과 같은 비통상적인 뉴클레오티드를 결합시키기 위해 향상된 효율성을 갖는 개질된 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공한다. 이러한 개질된 열안정성 DNA 폴리머라제는 재조합 DNA 기법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제는 DNA 서열화, 표지된 DNA의 합성 및 표지된 프라이머 연장 생성물의 생산과 같은 다수의 시험관내 DNA 합성 용도에 유리하다. 상기 폴리머라제 효소는 특히 쇄 종결 핵산 서열화 방법에 유용하다. 본 발명의 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 핵산 뿐만 아니라 이를 포함하는 벡터 및 숙주세포를 또한 제공한다. 본 발명의 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 본 발명의 폴리머라제 및 방법은 DNA 서열화에 대해 상당한 비용 및 효율성의 잇점을 제공한다.
Description
본 발명은 형광계 염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 결합하기 위한 향상된 효율성을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 변경 폴리머라제의 분리 및 생성수단을 제공한다. 본 발명의 효소는 분자 생물학의 다수의 용도에 유용하고, 특히 핵산 서열화에 유리하다.
형광염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 결합은 다수의 시험관내 DNA 합성용도에 있어서 중요하다. 예를 들면, 염료-종결자 DNA 서열화 반응은 종결 및 표지화를 위해 형광 디데옥시뉴클레오티드 동족체의 결합을 요구한다. 또한, 표지된 생성물의 시험관내 합성은 형광 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 동족체의 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 고정화된 탐침의 미세배열을 사용하는 하이브리드화 분석에 형광적으로 표지된 DNA가 사용된다(크로닌 등의 1996년Human Mutation7:244 참조).
DNA 복재의 신뢰성을 위해서, DNA 폴리머라제는 본원에서 통상적인 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)로 지칭되는 통상적인 기질, 및 형광염료로 표지된 dNTP 및 dNTP 동족체를 포함하는 비통상적인 dNTP의 결합에 대해서 매우 강한 편차를 갖는다. 세포에서, 이 특성은 성장하는 DNA 스트랜드에서 dUTP와 같은 이상 염기의 결합을 약화시킨다. 시험관내에서, 이 특성은 통상적이고 비통상적인 형광적으로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 둘 모두가 존재하는 경우, 예를 들어 염료-종결자를 이용하는 디데옥시 쇄 종결 방법의 일환을 사용하는 DNA 서열반응에서 특히 명백하다(리 등의 1992년 Nuc. Acids.Res. 20:2471, 이는 본원에 참고로 인용되어 있다).
염료-종결자 방법을 위한 시판 DNA 사이클 서열화 키트는 로다민계의 형광염료로 표지된 쇄 종결자 ddNTP를 사용한다.
그러나, 로다민 염료는 양쪽이온성 전하이고, 이들 염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 검출을 위해 서열화 생성물의 분리에 사용되는 전기영동 겔에서 변칙적으로 이동한다. 로다민계 염료의 특성은 전기영동 이전에 dITP 및 부가적인 처리단계의 사용을 포함하는 표준 서열화 프로토콜을 변형시키는 것이 필요하다.
이와 대조적으로, 음으로 대전된 형광염료(예, 형광계 염료)는 1) 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 표지된 프라이머 연장 생성물사이의 양호한 분리, 및 2) 중성 또는 양으로 대전된 형광염료보다 표지된 서열화 생성물의 양호한 전기영동적 이동을 허용한다. 따라서, 형광계 염료의 사용은 로다민계 염료의 사용에서 요구되는 추가의 처리단계에 대한 필요성을 배제시킨다. 그러나, 이들 염료로 표지된 ddNTP가 이들 포맷을 사용하는 서열화 생성물과 효율적으로 결합되지 않기 때문에 이용가능한 형광계 염료는 현재 시판중인 DNA 사이클 서열화 포맷에 사용하기에는 이상적이지 않다. 결국, 통상적이고, 형광 표지된 뉴클레오티드 모두와 효율적으로 결합할 수 있는 시판가능한 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시키기 위해 제공한다. 더우기, 본 발명의 돌연변이 효소의 예기치 않은 특성은 상응하는 야생형 효소에 비해 증가된 프라이머 연장 속도이다. 다른 예기치 않은 특성은 자동화 DNA 서열 분석에 다양한 종결자 뉴클레오티드의 증가된 결합 균일성이다.
도 1은 Taq DNA 폴리머라제 유전자의 도시적 개략도이다. 제한 위치는 실시예 1 및 본원에 제공된 추가의 돌연변이 및 발현 벡터를 제조하는 방법의 설명과 관련하여 도시된다.
본 발명은 이전에 특성화된 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 주형-의존성 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다. 이들 효소는 통상적인 열안정성 효소보다 더 효율적으로 형광계 염료로 표지된 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 및 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP)와 같은 염기 동족체를 포함하는 뉴클레오티드와 결합한다. 또한 본 발명은 이들 효소를 암호화하는 유전자를 제공하고, 다량의 정제된 효소를 제공하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제내의 중요한 영역은 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 결합시키는 폴리머라제의 능력에 영향을 미치고, 동시에 천연 뉴클레오티드를 신뢰성있게 결합시키는 능력을 보유하는 것이다. 상기 중요한 영역 또는 중요한 동기를 본 발명의 잇점을 제공하기 위해 부위-특이적인 변이 유발과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 유전자내로 도입시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 상응하는 야새형 효소와 비교하여, 중요한 동기를 생성하기 위해 돌연변이되고, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다.
이 양태에서, 본 발명은 a) 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열(한 문자 코드로 나타냄) LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호: 1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)를 포함하고, b) 상기 서열 위치 4의 X는, X가 E로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고, C) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(서열 식별 번호:1)(여기서, 서열 위치 3, 4, 6, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산 잔기이고, 서열 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
다른 양태에서, 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제는 a) 폴리머라제의 천연 형태가 아미노산 서열 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(서열 식별 번호:2)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고; b) 상기 서열 위치 4의 X는, X가 E로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고; c) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 한다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:2)(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다)로 나타낸다. 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSQXLAIPYEE(서열 식별 번호:3)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:3)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Lys이다.
또다른 양태에서, 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제는 a) 폴리머라제의 천연 형태가 아미노산 서열 LSVXLG(V/I)PVKE(서열 식별 번호:4)를 포함하고, b) 상기 서열 위치 4의 X는, X가 E로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고; C) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 한다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(서열 식별 번호:4)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)로 나타낸다. 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGVPVKE(서열 식별 번호:5)(여기서, 위치 4의 X는 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(서열 식별 번호:5)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다. 다른 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGIPVKE(서열 식별 번호:6)(여기서, 위치 4의 X는 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(서열 식별 번호:6)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)으로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 중요한 특정 영역은 rNTPs 및 ddNTPs와 같은 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하는 것으로 공지된 폴리머라제 유전자의 다른 영역의 동기와 결합될 수 있다. 본원에서 예시된 바와 같이, 2개의 돌연변이를 함유하는 재조합체인 서무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq)DNA 폴리머라제 효소를 제작한다. 제 1 돌연변이는 본 발명의 중요한 동기의 위치 4의 X 잔기의 E에서 K로의 돌연변이였다. 제 2 돌연변이는 F667Y 돌연변이로서 공지된 ddNTPs를 보다 효율적으로 결합시키는 돌연변이이다. 이 돌연변이는 Taq DNA 폴리머라제의 위치 667의 페닐알라닌에서 티로신으로의 돌연변이이다(본 발명에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 5,614,365 호 및 미국 특허 제 8/448,223 호에 기술되어 있다). 형광염료계로 표지된 ddNTPs를 서열화 반응에 사용할때, E681K F667Y 이중 돌연변이 효소는 판독가능한 서열화 사다리를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 한 양태에서, 디데옥시뉴클레오티드에 대해 감소된 차별을 부여하는 동기는 표지 및 비표지된 ddNTPs 모두의 증가된 결합 효율성을 갖는 효소를 제공하기 위해 본 발명의 중요한 동기와 결합된다.
또한, E681K F667Y 돌연변이 효소는 뜻밖에도 F667Y 돌연변이만을 갖는 효소에 비해 상당히 증가된 연장 속도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 중요한 동기의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소로의 도입은 단독으로 또는 다른 동기와 결합하여, 증가된 연장 속도를 갖는 효소를 생성한다. 이중 돌연변이 효소는 또한 뜻밖에도 로다민 표지된 종결자를 사용하는 염료-종결자 디데옥시 서열화에서 보다 균일한 피크 높이를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 또다른 양태에서, 중요한 동기의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소로의 도입은 로다민 염료계 표지된 종결자를 사용하는 DNA 서열화 방법에서 보다 균일한 피크 높이를 나타내는 효소를 생성한다.
다른 양태에서, Taq DNA 폴리머라제의 위치 615에서 글루탐산에서 글리신으로의 돌연변이, 또는 E615G 돌연변이와 같은 rNTPs의 보다 효율적인 결합을 허용하는 돌연변이(유럽 특허원 제 823 479 호에 기술되어 있으며, 이는 본 발명에 참고로 인용되어 있다)는 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드의 증가된 결합 효율성을 갖는 효소를 제공하기 위해 본 발명의 중요한 동기와 결합된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 폴리머라제를 암호화하는 유전자를 또한 제공한다. 상세하게, 본 발명의 중요한 동기를 포함하는 재조합 열안정성 폴리머라제를 암호화하는 유전자를 제공한다. 이 양태중에 또한 포함되는 것은 본 발명의 중요한 동기를 생성하는 돌연변이를 포함하는 둘이상의 돌연변이의 조합물을 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 또한 저농도의 형광염료계 표지된 ddNTPs를 사용할 수 있는 개선된 DNA 서열화 방법을 제공함으로써, 반응 실행비용을 절감시킨다. 본 발명의 개선된 방법은 또한 형광염료계 표지된 ddNTPs 대 dNTPs의 낮은 비율의 사용을 허용한다. 이들 방법의 사용은 보다 효율적인 중합, 보다 저농도의 주형 핵산 필요성을 반응 혼합물내로의 감소된 억제제 도입 가능성을 포함하는 많은 잇점을 낳는다. 이들 잇점은 또한 긴 주형의 서열화를 용이하게 한다. 본 발명은 또한 개선된 서열화 방법을 제공하고, 이때 서열화 반응은 중간 정제없이 연속적인 전기영동을 위한 서열화 겔상에서 바로 실행할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 a) 본 발명의 중요한 동기를 생성하는 위치 4의 돌연변이, 및 b) 상응하는 야생형 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 재조합 효소를 사용하는 표적 핵산의 서열을 결정하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 범위내에 호열성 유전자로부터 유래된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 사용하는 개선된 서열화 방법이고, 이때 효소는 본 발명의 중요한 동기를 형성하는 천연 서열 변형물을 함유한다. 이들 천연 효소는 또한 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 제공할 수 있다. 이 양태에서, 본 발명은 a) 본 발명의 중요한 동기를 갖고(여기서, 위치 4의 아미노산은 Glu가 아니다), b) 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 천연 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하는 개선된 서열화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 범위내에 형광계 염료로 표지된 개선된 DNA 생성방법이 포함된다. 본 발명의 효소는 형광계 염료로 다양한 위치에서 표지된 증폭된 생성물을 생성하는 폴리머라제 연쇄반응 방법에서 형광 표지된 dNTPs를 효율적으로 결합시킨다. 따라서, 한 양태에서, 개선된 DNA 표지화 방법은 a) 형광계 염료 및 본 발명의 효소로 표지된 dNTPs를 포함하는 반응 혼합물을 제공하고, b) 핵산 증폭반응을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 효소 및 이들 효소를 암호화하는 유전자는 본 발명의 재조합 효소를 포함하고, 음으로 대전된 형광 유전자결자 화합물을 추가로 포함할 수 있는 DNA 서열화 키트를 제공한다. DNA 서열화를 위한 다른 키트는 a) 음으로 대전된 형광 유전자결자 화합물 및 b) 본 발명의 천연 효소를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 효소를 포함하는 표지된 DNA를 생성하기 위한 키트를 제공한다. 표지된 DNA를 생성하기 위한 다른 키트는 a) 음으로 대전된 형광 뉴클레오사이드 트리포스페이트 화합물 및 b) 본 발명의 천연 효소를 포함한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어를 하기에 정의한다.
유전자란 용어는 회수가능한 생활성 폴리펩티드 또는 전구체의 생성에 필요한 대조용 및 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 효소 활성이 유지되는 한 전체 길이의 유전자 서열 또는 임의의 암호화 서열화의 일부에 의해 암호화될 수 있다.
천연이란 용어는 천연 공급원으로부터 분리되는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 이 용어는 또한 천연 형태와 동일한 아미노산 서열을 갖는 분자 생물학 기법에 의해 생성되는 천연 단백질의 재조합 형태를 지칭한다.
돌연변이체란 용어는 천연 또는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하여 변경된 작용 특성을 가질 수 있는 유전자 생성물을 생성시키는, 핵산 서열화가 변경된 유전자, 또는 아미노산 서열화가 변경된 유전자 생성물을 지칭한다. 이러한 변경은 위치 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함한다.
숙주세포(들)란 용어는 세균, 효모, 및 세포 배양물중에서 성장시 고등 식물 또는 고등 동물로부터 방선균 및 단일 세포와 같은 단세포성 원핵 및 진핵 유기체를 지칭한다.
발현 시스템이란 용어는 작동가능한 결합중에 목적하는 암호화 서열화 및 비교용 서열을 함유하여 이들 서열로 형질 전환된 숙주세포가 암호화된 단백질을 생성할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 형질 전환을 수행하기 위해, 발현 시스템은 벡터상에 포함될 수 있지만, 관련 DNA를 또한 숙주 염색체에 결합시킬 수도 있다.
올리고뉴클레오티드란 용어는 2개 이상, 바람직하게 3개 이상, 보통 10개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성되는 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 궁극적인 기능 또는 올리고뉴클레오티드의 용도를 비롯한, 다수의 인자에 의존할 것이다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 적합한 서열화의 클로닝 및 제한, 및 본 발명에 참고로 인용되고 있는 나랑(Narang) 등의 문헌[1979, Meth. Enzymol. 68:90-99]의 포스포트리에스테르 방법; 브라운(Brown) 등의 문헌[1979, Meth. Enzymol. 68:109-151]의 포스포디에스테르 방법; 뷰케이지(Beaucage) 등의 문헌[1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 마튜치(Matteucci) 등의 문헌[1981, J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191]의 트리에스테르 방법 또는 자동 합성방법; 및 미국 특허 제 4,458,066 호의 고형물 지지 방법에 의한 직접 화학 합성을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 프라이머란 용어는 천연이나 합성에 관계없이 프라이머 연장이 개시되는 조건하에 위치될때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 바람직하게 단일 가닥의 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머의 적합한 길이는 프라이머의 의도하는 용도에 의존하지만 전형적으로 15 내지 35 뉴클레오티드의 범위이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 함께 충분히 안정한 히브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 시원한 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만 프라이머 연장을 발생시키기 위한 주형과의 하이브리드화를 위해 충분히 상보적이어야 한다.
프라이머는 경우에 따라 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 탐지가능한 표지를 결합시킴으로써 표지될 수 있다. 예를 들면, 유용한 표지는32P, 형광염료, 전자 밀집 제제, 효소(ELISA 분석에 보통 사용됨), 비오틴 또는 헵텐을 포함하고, 항혈청 또는 모노클론 항체를 얻을 수 있는 단백질이 포함된다.
열안정성 폴리머라제란 용어는 열 안정성이고, 내열성이고, 후속의 프라이머 연장 반응에 충분한 활성을 유지하고, 이중 가닥 핵산의 변성에 필요한 시간동안 승온시 비가역적으로 변성(비활성)되지 않는 효소를 지칭한다. 핵산 변성에 필요한 열 조건은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 본 발명에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 4,683,202 호 및 제 4,683,195 호에 예시되어 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 열안정성 폴리머라제는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)과 같은 온도 주기반응에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 목적을 위한 비가역적인 변성은 효소 활성의 영구적이고 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 폴리머라제의 경우에, 효소활성은 주형 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하기 위해 적절한 방식으로 뉴클레오티드 조합의 촉매화를 지칭한다.
핵산 염기, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 뉴클레오티드를 지칭할때 통상적인 또는 천연적인이란 용어는 기술된 폴리뉴클레오티드중에서 천연적으로 발생하는 것을 지칭한다(즉, DNA에 있어서 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP이다). 추가로, dGTP 대신에 dITP 및 7-데아자-dGTP가 자주 사용되고, 7-데아자-dATP는 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성반응에서 dATP 대신에 사용될 수 있다. 이들을 일괄적으로 dNTPs로 지칭할 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오티드를 지칭할때 비통상적인 또는 개질된이란 용어는 특정 폴리뉴클레오티드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오티드의 개질물, 유도체 또는 동족체를 포함한다. 우라실의 데옥시리보뉴클레오티드 형태는 비통상적이거나 개질된 DNA(dUMP) 염기인 반면에, 우라실의 리보뉴클레오티드 형태는 통상적인 RNA(UMP) 염기이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 비통상적인 뉴클레오티드는 핵산 서열화를 위한 유전자결자로서 사용된 화합물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖고, 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트로 지칭되는 화합물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP를 일괄적으로 ddNTP로 지칭한다. 다른 비통상적인 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 dNTP([α-S]dNTP), 5'-α-보라노-dNTP, α-메틸-포스포네이트 dNTP 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(rNTP)를 포함한다. 비통상적인 염기를32P,33P 또는35S와 같은 방사성 동위원소; 형광 표지; 화학 발광성 표지; 생발광성 표지; 합텐표지(예, 비오틴); 또는 효소 표지(예, 스트렙타비딘 또는 아비딘)로 표지할 수 있다. 형광성 표지는 음으로 대전된 염료(예, 형광계 염료), 중성으로 대전된 염료(예, 로다민계 염료) 또는 양으로 대전된 염료(예, 시아닌계 염료)를 포함할 수 있다. 형광계 염료는 예컨대 FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민계 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G 및 TAMRA는 페르킨-엘머(캘리포니아주 포스터 시티소재)에 의해 시판되고, 텍사스 레드는 몰러큘라 프로브스(Molecular Probes)에 의해 시판된다. 시아닌족 염료는 Cy2, Cy3, Cy5 및 Cy7을 포함하고, 아머샴(영국 버킹검셔 리틀 샬폰트 아머샴 플레이스)에 의해 시판된다.
DNA 합성반응이란 용어는 PCR, 가닥 치환 증폭, 전사 매개된 증폭, 프라이머 연장 및 역 전사를 포함하는 DNA 복사물의 생산 방법을 지칭하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 추가로 돕기 위해, 특정한 열안정성 DNA 폴리머라제 효소 및 형광염료가 본 발명을 예시하기 위해 본 명세서에 걸쳐 지칭되어 있고, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 열안정성 DNA 폴리머라제인 신규하고 개선된 조성물을 제공한다. 본 발명의 효소는 상응하는 야생형 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 보다 충분히 결합시키는 재조합 폴리머라제를 포함한다. 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제는 선행 기술의 폴리머라제보다 DNA 서열화 및 표지된 생성물의 시험관내 합성과 같은 방법에 사용하기에 보다 적합하고 바람직하다. 본 발명의 개선된 DNA 서열화 방법은 이들 재조합 폴리머라제의 용도 뿐만 아니라 이전에 특성화된 효소보다 형광계 염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 보다 효율적으로 결합시키는 천연 효소의 용도를 포함한다. 이들 효소를 암호화하는 DNA 서열화 및 단백질 발현 벡터가 또한 제공된다.
본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제는 효소의 폴리머라제 활성 영역의 아미노산 서열내에 중요한 영역을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 열안정성 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열내의 중요한 영역은 통상적인 단일 문자의 아미노산 코드를 사용하여 하기에 나타낸다(본원에 참고로 인용되고 있는 레닝거 바이오케미스트리, 뉴욕주 뉴욕 워스 퍼블리셔즈 인코포레이티드, 1970, 페이지 67).
서열 식별 번호: 7LSXXLX(V/I)PXXE, 여기서 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산을 나타내고, 이 서열은 아미노산의 세 문자 코드에서 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(서열 식별 번호:7)로 나타내고, 위치 3, 6, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 이 서열 위치 4의 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu)를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다. 중요한 영역은 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 효율적으로 결합하는 능력을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다.
예를 들면, 위치 46(G46D)의 글리신에서 아스파르트산으로의 돌연변이 및 F667Y 돌연변이를 이미 함유하는 서무스 아쿠아티쿠스(Taq) DNA 폴리머라제 유전자의 유도체에서, 전체 길이의 Taq DNA 폴리머라제 서열화의 나머지 681 서열화에서 글루탐산에 대한 코돈의 제 1 위치에서(중요한 동기의 위치 4에 상응함) G를 A로 돌연변이 시킨 결과 중요한 동기를 갖는 효소가 생성된다. 이 효소는 1) 통상적인 뉴클레오티드의 존재하에서 PCR을 매개하는 효소 능력의 손상없이 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 2 내지 10배의 결합 효율성의 증가, 및 2) 3 내지 4.3배의 연장비율의 증가를 나타낸다. Taq DNA 폴리머라제에서, 이 특정 돌연변이는 E(글루탐산)에서 K(리신)로의 아미노산 변화를 일으킨다.
이 특정한 아미노산 변화는 중요한 동기를 생성시키고, 비통상적인 뉴클레오티드를 결합시키는 효소 능력을 상당히 변경시키지만, K에서 E로의 특정한 변화는 중요한 영역내에서 확인된 위치만큼 본 발명에서 중요하지는 않다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명은 a) 천연 형태에서, 상기 폴리머라제는 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고; b) 상기 서열 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않는 것을 제외하고 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고, c) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 X는 K, R 또는 H와 같은 양전하를 갖는 아미노산, 또는 Q 또는 N과 같은 극성 아미노산으로 치환된다. 가장 바람직한 양태에서, 위치 4의 X는 K로 치환된다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 효소(a)가 형광 염료족 표지된 뉴클레오티드에 대해 감소된 차별을 갖고, (b) 아미노산 서열 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(여기서, X는 임의의 아미노산이다)(서열 식별 번호:2)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 하기와 같이 나타낸다: LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 형광염료계 표지된 뉴클레오티드에 대한 감소된 차별을 갖는 효소는 아미노산 서열 LSQXLAIPYEE(여기서, X는 임의의 아미노산이다(서열 식별 번호:3))을 포함한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)으로 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에서, X는 K 잔기이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 형광염료계 표지 뉴클레오티드에 대한 감소된 차별을 갖는 효소는 아미노산 서열 LSVXLG(V/I)PVKE(여기서, X는 임의의 아미노산이다(서열 식별 번호:4))을 포함한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)으로 나타낸다.
본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 형광염료계 표지 뉴클레오티드에 대한 감소된 차별을 갖는 효소는 아미노산 서열 LSVXLGVPVKE(여기서, X는 임의의 아미노산이다(서열 식별 번호:5))을 포함한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)으로 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에서, X는 R 잔기이다.
본 발명의 다른 보다 바람직한 양태에서, 형광염료계 표지 뉴클레오티드에 대한 감소된 차별을 갖는 효소는 아미노산 서열 LSVXLGIPVKE(여기서, X는 임의의 아미노산이다(서열 식별 번호:6))을 포함한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)으로 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에서, X는 R 잔기이다.
본원에 기술된 E681K 돌연변이의 특징은 음으로 대전된 형광 뉴클레오티드와 반응하는 폴리머라제의 능력에 영향을 주는 DNA 폴리머라제 유전자의 영역을 확인한다. 헬릭스 O에 원위인 이 위치는 폴리머라제의 Oa헬릭스의 끝 및 Ob헬릭스의 시작이다(김(Kim) 등의 1995,Nature,376: 612). 당해분야에 잘 공지된 분자 모델 원칙을 기준으로 위치 681에서 E에서 K로의 Oa-Ob의 구조의 변화는 또한 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 식별하는 폴리머라제의 능력의 변화를 생성시킬 것으로 예상된다. 따라서, 위치 4의 X 잔기이외의 중요한 동기의 위치에서 돌연변이도 또한 본 발명의 범위내에 있다. 이 양태에서, 본 발명은 (a) 천연 형태에서, 폴리머라제는 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (b) 재조합 폴리머라제는 위치 4의 X가 E로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 아미노산 서열내에 하나이상의 돌연변이를 포함하고, (c) 상기 효소는 상응하는 천연 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대한 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공한다.
이와 유사하게, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)인 중요한 동기와 유사하지만 동일하지는 않은 중요한 동기를 포함하는 열안정성 DNA 폴리머라제는 본 발명의 범위내에 있다. 구체적으로, 한 양태에서, 중요한 동기는 아미노산 서열 LXXXXXXXXXE(서열 식별 번호:8)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(서열 식별 번호:8)(여기서, 위치 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에서 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)이다.
다른 양태에서, 중요한 동기는 아미노산 서열 L(S/A)XX(L/I)XXXXXE(서열 식별 번호:9)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(서열 식별 번호:9)(여기서, 위치 3, 6, 7, 8, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 2의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 5의 Xaa는 Leu 또는 Ile이다.
다른 양태에서, 중요한 동기는 아미노산 서열 LSXXLXXXXXE(서열 식별 번호:10)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaGlu(서열 식별 번호:10)(여기서, 위치 3, 6, 7, 8, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)이다.
형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 효율적으로 결합하는 본 발명의 효소의 능력은 ddNTP 결합 분석으로 측정한다. 이러한 분석은 주형을 제한하는 조건하에 수행되는 프라이머 연장 경쟁 분석이다. 이 분석에서, M13mp18 주형에 결합된 프라이머 DG48(5'-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC)(서열 식별 번호:11)(이니스(Innis) 등의 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436)은 [α-33P]dCTP 및 다양한 양의 형광적으로 표지된 ddNTP, Zowie-ddCTP를 갖는 과량의 효소의 존재하에서 연장된다. ddCTP 잔기의 결합은 연장반응을 종결시키기 때문에, DNA 폴리머라제가 ddCTP를 연장된 프라이머로 보다 쉽게 결합될수록 [α-33P]dCTP는 적게 결합될 수 있다. 따라서, 형광적으로 표지된 ddCTP 결합의 효율성이 증가함에 따라, DNA 합성의 억제정도가 증가한다. 또한 다양한 정도의 비표지된 ddCTP를 사용하여 반응을 실행하였다. 50%의 억제를 위해 필요한 ddCTP 및 Zowie-ddCTP의 농도를 계산 및 비교하여 형광적으로 표지된 뉴클레오티드를 결합하는 효소의 능력을 상대적으로 측정하였다. ddNTP 결합 분석의 상세한 설명은 실시예 2에 기술하고 있다.
따라서, 본 발명의 양태에서, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별의 특성은 실시예 2에 기술된 형광 ddNTP 결합 분석으로 측정한다. 바람직한 양태에서, 50%의 DNA 합성 억제를 위해 필요한, 형광염료로 표지된 ddCTP, Zowie-ddCTP의 농도는 야생형 효소에 비해 본 발명의 돌연변이 효소에 대해 3배 이상으로 감소한다. 보다 바람직한 양태에서, 농도는 5배 이상으로 감소한다. 가장 바람직한 양태에서, 농도는 10배 이상으로 감소한다. 다른 양태에서, 감소된 차별의 특성은 형광 dNTP 결합을 측정함으로써 분석한다.
본 발명의 다른 양태에서, 열안정성 DNA 폴리머라제 유전자 서열화 및 효소는 다양한 호열성 유전자로부터 유도된다. 한 양태에서, 폴리머라제 유전자 서열화 및 효소는 서무스속의 종이다. 본 발명의 다른 양태에서, 유전자 서열화 및 효소는 서무스이외의 호열성 종이다. 다수의 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 전체 핵산 및 아미노산 서열화가 입수가능하다. Taq, 서무스 서모필루스(Thermus thermopilus)(Tth), 서무스 스피시즈(Thermus species) Z05, 서무스 스피시즈(Thermus species) sps17, 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima)(Tma) 및 서모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus)(Taf) 폴리머라제의 각각의 서열은 본 발명에 참고로 인용되고 있는 1992년 4월 16일자의 PCT WO 제 92/06200 호로 공개된 PCT/US 91/07035에 개시되어 있다. 서무스 플라부스(Thermus flavus), 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax) 및 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 DNA 폴리머라제에 대한 서열은 본 발명에 참고로 인용되고 있는 아크메트자노브 및 바크히토브의 1992년Nucleic Acids Research 20(21):5839, 1993년의 웨모리 등의J.Biochem.113:401-410 및 NG: New GenBank database로부터 BSU23149.ng 각각에 개시되어 있다. 서무스 칼도필루스(Thermus caldophilus)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제의 서열은 EMBL/GenBank 기탁번호 제 U62584 호로 알려져 있다. 서무스 필리포르미스(Thermus filiformis)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제의 서열은 미국 특허 제 4,889,818 호에 제공된 방법 뿐만 아니라 표 1에 제공된 서열 정보를 사용하여 ATCC 수탁번호 제 42380 호로부터 회수할 수 있다. 서모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) DNA 폴리머라제의 서열은 GeneSeq Patent Data Base로부터 기탁번호 제 R98144 호(또한 PCT WO 97/09451 호에 개시되어 있다)로부터 입수할 수 있다.
| 미생물 | 중요한 동기 | 중요한 아미노산 위치 |
| 교감작용 | L S/a--L/i-----E | |
| 서무스 아쿠아티쿠스 | L S Q E L A I P Y E E | 681 |
| 서무스 플라부스 | L S G E L S I P Y E E | 679 |
| 서무스 서모필루스 | L S Q E L A I P Y E E | 683 |
| 서무스 스페시 Z05 | L S Q E L A I P Y E E | 683 |
| 서무스 스페시 에스피에스17 | L S Q E L S I P Y E E | 679 |
| 서무스 칼도필루스 | L S Q E L A I P Y E E | 683 |
| 서무스 필리포르미스 | L S Q E L S I P Y E E | 679 |
| 서모토가 마리티마 | L S V R L G V P V K E | 744 |
| 서모토가 네아폴리타나 | L S V R L G V P V K E | 744 |
| 서모시포 아프리카누스 | L S K R I G L S V S E | 743 |
| 바실러스 칼도테낙스1 | L A Q N L N I S R K E | 725,724 |
| 바실러스 스테아로서모필루스2 | L A Q N L N I T R K E | 724,727,802 |
| 1. 제 D12982 호로부터의 웨모리 티, 이시노 와이, 후지타 케이, 아사다 케이, 카토 아이의 Cloning of the DNA ploymerase gene of Bacillus caldotenax and charaterization of the gene productJ.Biochem. 113:401(1993).서열중의 중요한 잔기는 725이다. 거의 동일한 단백질 서열은 제 R45155 호 및 WPI 93-408323/51중의 추정 Bacillus stearothermophilus DNA 폴리머라제로서 제공된다. 이 서열중의 중요한 잔기는 724이다.2. GeneBank 또는 SwissProt/PIR 데이타베이스의 바실러스 스테아로서모필루스 DNA 폴리머라제에 대한 몇가지 서열 제출물이 있다. 이들 서열은 고도로 관련되어 있지만 몇가지는 서로 다르고, 각각은 동일한 L(S/X)XX(L/I)XXXXXE(서열 식별 번호:9) 동기를 함유하고, 여기서 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(서열 식별 번호:9)(여기서, 위치 3, 6, 7, 8, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 2의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 5의 Xaa는 Leu 또는 Ile이다)이다. |
상기 표에서, 위치 724의 중요한 동기중의 중요한 잔기를 포함하는 단백질 서열은 일본 특허 공개 제 J 05 304 964A 호, 유럽 특허 제 699,760 호 및 기탁번호 제 U33536 호로 제공된다. 다른 고도로 관련되어 있지만 다소 상이한 단백질 서열화가 문헌[Gene 163:65-68(1995)]에 공개되어 있고, 위치 727의 중요한 동기에 중요한 잔기를 함유한다. 다른 고도로 관련되어 있지만 다소 상이한 Bst DNA 폴리머라제에 대한 단백질 서열 기탁 번호 제 U23149 호는 위치 802에서 중요한 동기에 중요한 잔기를 함유한다.
각각의 호열성 종들의 DNA 폴리머라제가 독특하기 때문에, 중요한 영역의 아미노산 위치는 각각의 효소에 대해 차별된다. 아미노산 및 핵산 서열 배열 프로그램은 쉽게 이용가능하고, 본 발명에서 확인된 특정 영역을 제공하고, 본 발명의 정확한 서열 영역의 확인에 도움을 준다. 이러한 서열 배열 프로그램은 위스콘신주 마디손 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 입수가능하다. 본원에 확인된 주어진 특정 동기인 GAP, BESTFIT 및 PILEUP를 포함하는 이들 프로그램은 중요한 동기의 편재화를 돕기 위해 제공한다. 중요한 영역의 위치는 전형적인 호열성 종으로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제에 대해 표 1에 나타낸다.
열안정성 DNA 폴리머라제의 폴리머라제 영역내에 중요한 동기 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)의 정확한 위치에 관계없이 상기 동기의 존재는 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 효율적으로 결합하는 능력을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공한다. 따라서, 중요한 동기를 생성하기 위해 서무스 플라부스(Glu679), 서무스 서모필루스(Glu683), 서무스 스피시즈 Z05(Glu683), 서무스 스피시즈 sps17(Glu679), 서무스 칼도필루스(Glu683), 서무스 필리포르미스(Glu679)의 열안정성 DNA 폴리머라제의 보호된 글루탐산의 돌연변이는 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 효율적으로 결합하는 폴리머라제의 능력을 향상시킨다.
또한, 본 발명에서 확인된 중요한 동기의 고도로 보호된 특성 면에서, 신규한 열안정성 DNA 폴리머라제는 예컨대 표 1의 Taq DNA 폴리머라제 또는 다른 DNA 폴리머라제의 서열에 대한 그들의 유사성을 기준으로 확인될 수 있다(예를 들면, 본원에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 5,618,711 호 및 제 5,624,833 호를 참조한다). 본원에 기술된 방법에 의해 측정된 바와 같이, 펩티드 서열화가 Taq 폴리머라제 아미노산 서열에 45% 이상 및 가장 바람직하게 80% 이상 유사한한, 이러한 폴리머라제는 본 발명의 범위내에 있다. 결과적으로, 본 발명은 예컨대 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함하는 효소 부류 및 본원에 참고로 인용되고 있는 서무스 오시마이(Thermus oshimai)(윌리암스 알에이 등, 1996,Int J SystBacteriol 46(2):403-408); 서무스 실바누스(Thermus silvanus) 및 서무스 클리아로필루스(Thermus chliarophilus)(텐네이로 에스 등, 1995,Int.J.Syst.Bacteriol45(4):633-639); 서무스 스코토덕터스(Thermus scotoductus)(텐네이로 에스 등, 1995, Res. Microbiol 146(4):315-324); 서무스 러버(Thermus ruber) ATCC 35948(L.G. 로지노바, 1984,Int.J.Syst.Bacteriol34:498-499); 및 서무스 브로키아누스(Thermus brockianus)(먼스터 엠 제이, 1986,J.Gen.Microbiol 132:1677)로부터의 상응하는 유전자 및 발현 벡터에 관한 것이다.
당해분야의 숙련자들은 형광 표지된 뉴클레오티드에 대해 향상된 결합 효율성을 갖는 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 부위-지향성 변이 유발과 같은 재조합 DNA 기법에 의해 가장 쉽게 제작되는 것을 이해할 것이다. 예컨대 본원에 참고로 인용되고 있는 샘브룩 등의Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 제 2판, 15.51, Oligonucleotide-mediated mutagenesis를 참조한다. 이 기법은 당해분야에서 표준이고, 유전자중의 임의의 측정 위치에서 염기쌍 변화의 모든 가능한 부류를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 목적하는 돌연변이를 나타내는 제한된 부조화를 제외하고는 돌연변이되는 단일 스트랜드 파아지 또는 플라스미드 DNA에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행한다. 간략하게, 합성 올리고뉴클레오티드는 파아지 또는 플라스미드에 상보적인 스트랜드의 직접 합성을 위한 프라이머로서 사용되고, 생성된 이중 스트랜드 DNA는 파아지- 또는 플라스미드-지지 숙주 세균내로 형질 전환된다. 생성된 세균은 예컨대 목적하는 돌연변이 유전자 서열을 수반하는 이들 플라크 또는 군락을 확인하기 위해 DNA 서열 분석 또는 탐침 하이드리드화에 의해 분석할 수 있다.
PCR의 발명에 이어서, 프라이머-지향성 돌연변이(본원에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 4,683,195 호) 및 Overlap PCR(히구치 1989,PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press, New York, NY, pp.61-70)은 유전자의 임의의 위치에서 임의의 돌연변이를 도입하는 통상적인 수단이 되고 있다.
돌연변이 DNA는 통상적인 수단에 의해 플라스미드, 파스미드, 파아지 또는 증폭 반응으로부터 회수할 수 있고, 생성된 효소의 연속 배양 및 정제를 위해 발현 벡터내로 연결된다. 다수의 클로닝 및 발현 벡터가 예컨대 삼브룩 등의 1989년 상기 참조에 기술된 바와 같이 포유류 및 세균계를 포함하는 본 발명의 실행에 적합하다. 편의상, 본 발명은 람다 유도된 PL프로모터(시마타케 등 1981년Nature 292:128)를 이용하여 예시된다. 이 프로모터의 용도는 본 발명에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 4,711,845 호 및 제 5,079,352 호에 특정하게 기술되어 있다.
플라스미드 pCS1은 1997년 8월 28일자로 ATCC에 기탁번호 제 98521 호로 기탁되어 있다. 이 플라스미드는 글루탐산이 생성된 폴리펩티드에서 리신으로 치환되고, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 결합하기 위한 향상된 효율성을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하도록 681위치의 코톤이 돌연변이된, 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자를 함유한다. 실시예 1은 다른 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 생성하기 위해 E681K 돌연변이를 서브클로닝하는데 적합한 측면 제한 부위의 용도를 예시한다. 이와 다르게, 다수의 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 완전한 유전자 서열화가 공지되어 있기 때문에, ATCC 기탁물 및 본원에 제공된 서열 정보의 이용성을 갖는 제한 절단 및 단편 치환과 같은 E681K 돌연변이를 도입하기 위한 다른 수단은 당해 분야의 숙련자들에게 쉽게 이용가능하다.
본 발명의 돌연변이 또는 천연 효소, 또는 이들 효소의 유도체 또는 동족체중의 하나를 생성하기를 원할때 효소의 생성은 전형적으로 발현 벡터를 갖는 숙주 세포의 현질전환 및 발현이 일어나도록 하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포의 배양을 포함한다. 형질전환 및 상기 형질전환된 숙주 세포의 배향수단은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 샘브룩 등의 1989년 상기참조에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제는 야생형 또는 개질된 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자에 작동적으로 결합된 발현 벡터로 형질전환된 이 콜라이 균주 DG116(1987년 4월 7일자로 ATCC 53606로 기탁됨)로부터 일반적으로 정제된다. 열안정성 DNA 폴리머라제의 정제방법은 예컨대 실시예 1 및 본원에 참고로 인용되고 있는 로여 등의 1993년PCR Methods and Applications 2:275-87)에 기술되어 있다.
본 발명의 열안정성 효소는 상기와 같은 효소활성이 필요하거나 요구되는 임의의 목적으로 사용될 수 있다. 사용예는 DNA 서열화, DNA 표지화 및 프라이머 연장 생성물의 표지화를 포함한다. 상거 디데옥시뉴클레오티드 방법에 의한 DNA 서열화(상거 등, 1977,Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463)는 본 발명에 의해 특히 개선된다. 기본 상거 등의 방법의 진보로 신규한 벡터(야니시-페론 등의 1985년 Gene 33:103-119) 및 기본 동족체(밀스 등의 1979년Proc.Natl.Acad.Sci.76:2232-2235 및 바르 등의 1986년Biotechniques 4:428-432)가 제공되었다. 일반적으로, DNA 서열화는 쇄 종결 염기 동족체의 존재하에서, 주형 의존성 프라이머 연장을 요구하고, 그 결과 후속적으로 크기에 의해 분리되는 부분 단편의 분포를 생성한다. 기본적인 디데옥시 서열화 절차는 (i) 주형에 선택적으로 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하고; (ii) 비표지된 dNTP, 선택적으로 표지된 ddNTP와 같은 제한량의 하나의 쇄 종결제의 혼합물을 함유하는 4개의 분리반응에서 DNA 폴리머라제로 프라이머를 연장하고, (iii) 높은 분해능의 변성 폴리아크릴아미드/우레아 겔상에서 반응 생성물의 4개의 세트를 분해하는 것을 포함한다. 반응 생성물은 사용된 표지에 의존하는 방사선 사진 또는 형광 탐지에 의해 겔중에서 탐지될 수 있고, 뉴클레오티드 서열을 추론하기 위해 상을 조사할 수 있다. 이들 방법은 이 콜라이 Pol I 또는 개질된 T7 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편과 같은 DNA 폴리머라제를 이용한다.
Taq DNA 폴리머라제와 같은 내열성 폴리머라제의 이용가능성은 열안정성 DNA 폴리머라제(이니스 등의 1988년 상기참조) 및 이들의 변형물의, 사이클 서열화(뮤레이의 1989년Nuc Acids Res.17:8889)로 지칭되는 개선된 서열화 방법을 생성시킨다. 기본적인 디데옥시 서열화에 대한 대안으로서, 사이클 서열화는 쇄 종결자의 존재하에서 주형 서열에 상보적인 목표 서열화의 선형, 비대칭성 증폭이다. 단일 주기는 모든 가능한 길이의 연장 생성물족을 생성한다. DNA 주형으로부터 연장 반응 생성물의 변성에 따라 프라이머 어닐링 및 프라이머 연장의 다중 주기는 ddNTP와 같은 종결자의 존재하에서 발생한다. 사이클 서열화는 통상적인 쇄 종결 서열보다 더 적은 주형의 DNA를 요구한다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 사이클 서열화에서 다음의 몇가지 잇점을 갖는다: 이들은 핵산 목표에 대한 프라이머의 특정 하이브리드화에 대해 요구되는 엄격한 어닐링온도 뿐만 아니라 각주기에 발생하는 고온 변성의 다중 사이클 즉 90 내지 95℃에서 견딘다. 이런 이유로, 상표명(AmpliTaq) DNA 폴리머라제 및 그의 유도체 및 강하제는 코넥티컷주 노르워크 소재의 페리킨-엘머 캄파니로부터 시판되는 Taq 사이클 서열화 키트에 포함된다.
쇄 종결 서열화 방법의 2가지 변형은 염료-프라이머 서열화 및 염료-종결자 서열화이다. 염료-프라이머 서열화에서, ddNTP 종결자는 비표지되고, 표지된 프라이머는 연장 생성물을 탐지하기 위해 이용된다(스미스 등의 1986년Nature 32:674-679). 염료-종결자 DNA 서열화에서, DNA 폴리머라제는 dNTP 및 DNA 프라이머의 말단상에 형광적으로 표지된 ddNTP를 결합하는데 사용된다(리등의 상기 참조). 이 방법은 염료 표지된 프라이머를 합성하지 않아도 된다는 잇점을 갖는다. 더우기, 염료 종결자 반응은 모든 4개의 반응이 동일한 튜브에서 수행될 수 있다는 점에서 보다 편리하다.
염료-프라이머 및 염료-종결자 방법은 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스에 의해 생성된 자동화된 서열 기구를 사용하여 자동화될 수 있다(본원에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 5,171,534 호). 이 기구를 사용할때, 완성된 서열화 반응 혼합물은 기구에 설치된 변성 폴리아크릴아미드 겔상에 분별화된다. 기구의 기부에서 레이저는 겔을 통과하는 크기에 따라 전기영동됨에 따라 형광 생성물을 탐지한다.
형광염료의 두가지 형태는 염료 종결자 서열화-음으로 대전되고 양쪽이온성인 형광염료에 대해 사용되는 종결자를 표지하기 위해 보통 사용된다. 음으로 대전된 형광염료는 형광 및 BODIPY 계를 포함한다. BODIPY 염료(4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센)는 본원에 참고로 인용되고 있는 WO 97/00967 호에 기술되어 있다. 양쪽이온성 형광염료는 로다민계 염료를 포함한다. 시판가능한 사이클 서열화 키트는 로다민 유도체로 표지된 종결자를 사용한다. 그러나, 로다민 표지된 종결자는 다소 비싸고, 생성물을 서열화 생성물과 함께 이동하기 때문에 겔상에 채워지기 전에 비결합된 염료-ddNTP로부터 분리시켜야 한다. 로다민 염료계 종결자는 GC가 풍부한 영역에서 헤어핀 구조를 안정화시키는 것으로, 이는 생성물을 변칙적으로 이동시킨다. 이는 2차 구조를 이완시키는 dITP의 사용을 필요로 할 뿐만 아니라 종결자의 결합 효율성에 영향을 미친다.
이와 대조적으로, 형광 표지된 종결자는 서열 생성물보다 큰 네트 음전하 및 빠른 이동을 갖기 때문에 겔 하중이전에 분리 단계를 제거한다. 또한, 형광 표지된 서열 생성물은 로다민으로 표지된 서열 생성물보다 양호한 전기영동 이동을 갖는다. 야생형 Taq DNA 폴리머라제는 형광계 염료로 표지된 종결자를 충분히 결합하지 않고, 이는 본원에 제공된 개질된 효소의 용도에 의해 효율적으로 성취될 수 있다.
따라서, 본 발명의 범위는 중요한 동기를 갖는 효소를 사용하여 신규한 디데옥시 서열화 방법 뿐만 아니라 상기 방법을 수행하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 서열화 방법은 a) i) 상기 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, ii) 상기 서열중의 위치 4의 X는, X가 E로 돌연변이 되지 않는 것을 제외하고는 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고, iii) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제는 상기 효소의 천연형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공하고; 및 b) 염료 종결자 서열반응을 수행하는 것을 포함한다.
상기 방법의 바람직한 양태에서, 쳔연 형태 효소는 아미노산 서열 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(서열 식별 번호:2)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 갖는다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:2)(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다. 보다 바람직한 양태에서, 천연 형태 아미노산 서열은 LSQXLAIPYEE(서열 식별 번호:3)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:3)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)으로 나타낸다. 가장 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Lys이다.
상기 기술한 바와 같이, 열안정성 DNA 폴리머라제를 갖는 DNA 서열화는 연장 생성물의 개체군이 수백 기본의 거리에 대해 모든 가능한 분획 길이를 나타내는 것을 확신하는 규정된 농도의 비에서 쇄 종결자 및 통상적인 뉴클레오티드로서 작용하는 비통상적인 기본 동족체의 혼합물을 요구한다. 야생형 Taq 폴리머라제와 같은 서열에 대해 이미 사용되는 몇가지 열안정성 DNA 폴리머라제는 통상적이고 비통상적인 뉴클레오티드의 혼합물의 존재하에서 우선적으로 통상적인 뉴클레오티드를 결합하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 어느정도 최근에 기술된 열안정성 DNA 폴리머라제는 비통상적인 기본 동족체 대 통상적인 기본의 비가 백 내지 수백배 또는 천배이상으로 감소되는 것을 허용한다.
이러한 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제의 F667Y 돌연변이이다. 다른 이러한 돌연변이는 F667Y 돌연변이 및 글리신 잔기를 아스파르트산 잔기(G46D) 돌연변이로 변화시키는 위치 46의 돌연변이를 갖는 Taq DNA 폴리머라제이다. AmpliTaq, FS로 공지되어 있는 이 돌연변이 폴리머라제는 호프만-라 롯슈에 의해 제조되고, 페르킨-엘머에 의해 시판된다. F730YTma30 DNA 폴리머라제는 이러한 폴리머라제의 다른것이다. 이 돌연변이 폴리머라제는 1) G46D 돌연변이를 암호화하기 위해 개질된 Taq DNA 폴리머라제 및 2) 위치 323의 알라닌 돌연변이에 아스파르트산, 위치 325에서 알라닌 돌연변이에 글루탐산 및 위치 730에서 티로신 돌연변이에 페닐알라닌을 암호화하기 위해 개질된 Tma DNA 폴리머라제의 뉴클레오티드 571-2679(본원에 참고로 인용되고 있는 미국 특허원 제 60/052065 호 및 유럽 특허원 제 98112327.6 호)의 조합물이다. 비통상적인 기본 동족체를 결합하는 다른 폴리머라제는 Thermotoga neapolitana로부터 F730Y 돌연변이 DNA 폴리머라제이다(본원에 참고로 인용되고 있는 WO 96/10640, WO 96/41014 및 WO 97/09451). 주어진 dNTP 농도에 대해 이들 효소를 사용하여 로다민-ddNTP 농도는 이미 이용가능한 열안정성 DNA 폴리머라제와 비교하여 약 50 내지 수백배로 감소될 수 있다.
본 발명의 E681K 돌연변이를 실시예 4에 기술된 서열화 반응에 사용된 이중 돌연변이 Taq DNA 폴리머라제 효소를 생성하기 위해 F667Y 돌연변이를 갖는 방법으로 재조합 DNA 방법을 사용하여 혼합하였다. 이중 돌연변이는 형광 표지된 종결자와 염료 종결자 서열화 반응에 사용하였다. 실시예 4에 기술된 결과는 효소가 서열화 반응중에 형광-표지된 염료 종결자를 결합하고, 자동화된 서열 기구중에 정확히 판독할 수 있는 서열 사다리를 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예기치 않게, 또한 실시예 3에 기술된 분석에 의해 측정한 바와 같이, E681K 및 F667Y 돌연변이의 조합은 F667Y 돌연변이만을 갖는 효소에 비해 3 내지 4배 증가된 연장비로 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 생성하기 위해 발견되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명에서 확인된 중요한 동기는 표지되고 비표지된 ddNTPs의 결합의 증가된 효율성을 갖는 폴리머라제를 생성하기 위해 ddNTPs에 대해 감소된 차별을 수여하는 동기로 혼합될 수 있다. 이들 폴리머라제는 DNA 서열화 방법에서 유용하다. 본 발명의 한 양태에서, 본원에서 정의된 중요한 동기를 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제는 또한 미국 특허원 제 08/448,223 호에 기술된 F667Y 돌연변이를 포함하는 중요한 동기를 포함한다. 이 양태에서, 열안정성 DNA 폴리머라제는 i) 폴리머라제는 천연형태에서, 제 1 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, ii) 제 1 아미노산 서열 위치 4의 X는, X가 E로 돌연변이 되지 않는 것을 제외하고는 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고, iii) 열안정성 DNA 폴리머라제는 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, iv) 폴리머라제는 제 2 아미노산 서열 MRRXXKXXNYXXXYG(서열 식별 번호:12)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, v) 열안정성 DNA 폴리머라제는 또한 효소의 천연 형태와 비교하여 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 한다. 세 문자 코드에서, 제 2 아미노산 서열은 MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly(서열 식별 번호:12)(여기서, 위치 4,5,7,8,11,12 및 13의 Xaa는 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 바람직한 양태에서, 제 1 아미노산 서열 위치 4의 Xaa는 Lys로 돌연변이된다. 보다 바람직한 양태에서, 효소는 Taq DNA 폴리머라제이고, 이는 E681K 및 F667Y를 포함한다. 또한 본 발명의 범위는 상기 폴리머라제를 사용하는 서열화 방법이다.
또한 본 발명의 범위는 돌연변이에 의해 유도되지 않지만 천연 변형물로서 존재하는 중요한 동기를 갖는 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 수행된 본 발명의 개선된 서열화 방법이다. 이 양태에서, 호열성 세균 부류의 DNA 폴리머라제는 위치 4의 잔기가 Glu가 아닌 중요한 동기를 갖는다. 예를 들면, 서모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제에서, 동기 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)중의 위치 4의 X는 아르기닌 잔기이다. 따라서, 본 발명은 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(SWQ ID NO:7)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 포함하는 천연 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하는 개선된 DNA 서열화 방법을 제공한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 3,6,9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)로 나타낸다. 이 양태에서, 본 발명의 서열화 방법은 a) i) 상기 폴리머라제가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 포함하고, ii) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제는 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고; b) 형광계 염료로 표지된 염료 종결자를 제공하고; c) 염료 종결자 서열반응을 수행하는 것을 포함한다.
보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 서열화 방법은 a) a) i)상기 폴리머라제가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 포함하고, ii) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고; iii) 상기 폴리머라제가 제 2 아미노산 서열 MRRXXKXXNYXXXYG(서열 식별 번호:12)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, iv) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고; b) 형광계 염료로 표지된 염료 종결자를 제공하고, c) 염료 종결자 서열반응을 수행하는 것을 포함한다.
다른 바람직한 양태에서, 효소는 아미노산 서열 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(서열 식별 번호:13)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 포함한다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산은 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (서열 식별 번호:13)(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 이 아미노산 서열은 LSQXLAIPYEE(서열 식별 번호:14)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:14)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)로 나타낸다.
또다른 바람직한 양태에서, 효소는 아미노산 서열 LSVXLG(V/I)PVKE(서열 식별 번호:15)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 갖는다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(서열 식별 번호:15)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGVPVKE(서열 식별 번호:16)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(서열 식별 번호:16)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 가장 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다. 다른 보다 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGIPVKE(서열 식별 번호:17)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다. 세 문자 코드에서, 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(서열 식별 번호:17)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 가장 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다.
본 발명의 다른 양태에서, 서열화 방법은 실시예 2에 기술된 바와 같은 ddNTP 결합 분석을 사용하여 양이 측정되는 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드에 대해 차별의 감소된 양을 갖는 천연 효소를 사용하여 수행한다. DNA 합성의 50% 억제를 위해 요구되는 ddCTP의 농도는 50%의 억제를 위해 필요한 Zowie-ddCTP의 농도와 같이 측정한다. Zowie-ddCTP에 대한 농도 대 ddCTP에 대한 농도비를 계산한다. 바람직한 양태에서, 비율은 10이하이다. 보다 바람직한 양태에서, 비율은 4이하이다. 가장 바람직한 양태에서, 비율은 1.2이하이다.
본원에 제공된 실례는 형광계 염료로 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 사용하지만, 다른 비통상적인 뉴클레오티드 및 형광계 염료의 사용이 또한 본 발명의 범위내에 있다. 다른 비통상적인 뉴클레오티드는 DNA 합성의 생성물을 표지하기 위해 사용될 수 있는 형광적으로 표지된 dNTPs 및 프라이머 연장 생성물을 표지하기 위해 사용될 수 있는 형광적으로 표지된 rNTPs를 포함한다. 다른 염료는 형광과 구조적으로 및 화학적으로 유사한 BODIPY와 같은 기타 음으로 대전된 형광염료를 포함한다. 다른 염료는 또한 시아닌 염료를 포함한다. 시아닌 표지된 dNTPs를 E681K 돌연변이(및 G64D 돌연변이)를 갖는 Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 표준 PCR 반응에 가했다. 시아닌 표지된 dNTPs를 넓은 형태의 효소보다 더 높은 정도에서 증폭 생성물로 결합되는 것을 예기치 않게 발견하였다. 따라서, 이 양태에서, 본 발명의 표지 DNA 방법은 음으로 대전된 형광염료나 시아닌 염료로 표지된 뉴클레오티드와 혼합하여 본 발명의 천연 또는 돌연변이 폴리머라제를 사용한다. 한 양태에서, 본 발명의 DNA 표지방법은 a) i) 상기 폴리머라제는 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, ii) 상기 폴리머라제는 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고, b) 음으로 대전된 형광염료로 표지된 뉴클레오티드를 제공하고; c) DNA 합성반응을 수행하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 DNA 표지방법은 a) i) 상기 폴리머라제는 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, ii) 상기 폴리머라제는 비통상적인 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고, b) 시아닌 염료로 표지된 뉴클레오티드를 제공하고; c) DNA 합성반응을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 열안정성 DNA 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제의 위치 615에서 글리신 돌연변이에 글루탐산 및 본 발명의 중요한 동기와 같은 rNTPs의 보다 효과적인 결합을 허용하는 돌연변이를 혼합하여 제공된다. 생성된 효소는 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드의 결합의 증가된 효율성을 갖는 것으로 예상된다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 (1) 천연형태가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (2) 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않도록 X는 돌연변이되고, (3) 또한 아미노산 서열 SQIXLR(V/I)(서열 식별 번호:18)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (4)는 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드의 효과적인 결합을 가능하게하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공한다. 세 문자 코드에서, 문자의 서열은 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)로 나타낸다.
E615G 및 E681K 돌연변이를 함유하는 Taq에 대한 바와 같이 돌연변이 폴리머라제 영역은 형광계 염료로 표지된 프라이머 연장 생성물의 개선된 생성방법에 유용하다. 예를 들면, PCR와 같은 프라이머 연장반응에서, 형광계 염료로 표지된 rNTPs는 4개의 표준 dNTPs중의 하나에 대해 일부이상에서 치환되고, E681K E615G Taq DNA 폴리머라제와 같은 이중 돌연변이 폴리머라제가 포함된다. 돌연변이 폴리머라제는 그의 길이를 따라 다양한 위치에서 형광 표지된 리보뉴클레오티드 잔기를 갖는 프라이머 연장 생성물을 합성한다. 열 또는 알칼리 처리에 따라, 프라이머 연장 생성물은 말단 표지된 분획의 개체군을 생성하는 각각의 리보뉴클레오티드 잔기에서 분획된다. 균일하게 표지된 분획의 개체군은 프라이머 연장 생성물의 길이를 따라 형광 표지의 분포를 나타낸다. 이들 특성의 표지된 분획은 크로닌 등 (상기 참조)의 규소 칩에 의거한 핵산 탐지 포맷에 유용하다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 (1) (a) 그의 천연 형태가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다), (b) 위치 4의 X가 E로 돌연변이되지 않도록 위치 4의 X가 돌연변이되고, (c) 또한 아미노산 서열 SQLXLR(V/I)(서열 식별 번호:18)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (d) 형광 및/또는 시아닌 족 염료의 효과적인 결합이 가능한 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고, (2) 프라이머 연장반응을 수행하는 것을 포함하는 프라이머 연장 생성물의 표지방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명의 중요한 동기를 갖는 효소는 E681K F667Y 돌연변이에 대한 실시예 4에 나타낸 바와 같이 넓은 형태 효소에 비해 증가된 연장비를 나타낸다. 한 양태에서, 효소는 (1) 그의 천연형태에서, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)를 포함하고, (2) 아미노산 서열화가 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않도록 위치 4의 돌연변이되고, (3) 넓은 형태의 효소에 비해 증가된 연장비를 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직한 양태에서, 효소는 (1) 그의 천연형태에서, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)를 포함하고, (2) 아미노산 서열화가 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않도록 위치 4의 돌연변이되고, (3) 아미노산 서열 MRRXXKXXNYXXXYG(서열 식별 번호:12)(여기서, X는 임의의 아미노산이다) 및 (4) 증가된 연장비를 특징으로 한다. 보다 바람직한 양태에서, 효소는 (1) 그의 천연형태에서, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)를 포함하고, (2) 아미노산 서열화가 위치 4의 X가 K로 돌연변이 되도록 위치 4의 돌연변이되는 것을 특징으로 한다. 가장 바람직한 양태에서, 효소는 Taq DNA 폴리머라제이고, E681K 돌연변이 및 F667K 돌연변이를 함유한다. 또한 이 양태에 포함된 것은 증가된 연장비를 갖는 폴리머라제 뿐만 아니라 이를 위한 키트를 사용하는 DNA의 서열화 및 표지방법이다.
본 발명에 따르는 바람직한 DNA 서열화 방법에서, 열안정성 피로포스파타제는 반응 혼합물에 포함된다. 피로포스파타제는 유럽 특허원 EP-A-763 599 및 미국 특허 제 5,665,551 호에 기술된 돌연변이 열안정성 DNA 폴리머라제 뿐만 아니라 중온성을 사용하여 서열 데이타를 향상시키는 것으로 나타난다.
예시된 양태에서, 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제는 또한 뉴클리즈 작용을 크게 부여하는 5'-뉴클리즈 영역중에 돌연변이를 함유한다. Taq 폴리머라제의 개질된 형태는 1992년 4월 16일자로 공개된 PCT WO 92/06200 및 미국 특허 제 5,466,591 호에 기술되어 있다.
상기 발명의 한 양태에서, 아미노산 위치 46의 글리신 잔기에 대한 코돈은 아스파르트산에 대한 코돈으로 치환되어진다(G46D 돌연변이). 생성된 효소는 감소된 5'-뉴클리즈 작용 때문에 사이클 서열반응중에 향상된 이용성을 갖는다. 폴리머라제 영역 아미노산 서열화 및 폴리머라제 작용은 넓은 형태의 효소에 비해 G46D 돌연변이의 변화가 없다.
본 발명의 시판 양태에서, 본 발명의 사용으로 개선된 실행방법에 대한 키트는 본 발명의 추가의 양태로 간주된다. DNA 서열에 대한 이러한 키트는 a) i) 상기 폴리머라제가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다)를 포함하고, ii) 상기 폴리머라제는 형광계 염료로 표지되는 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제, 및 b) 음으로 대전된 형광염료로 표지된 염료-종결자 및 추가로 dNTP, 열안정성 피로포스파타제 및 적합한 완충제와 같은 DNA 서열에 대한 다른 제제를 포함할 수 있는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 키트중의 효소는 아미노산 서열 LSVXLG(V/I)PVKE(서열 식별 번호:15)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 갖는다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(서열 식별 번호:15)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)로 나타낸다. 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGVPVKE(서열 식별 번호:16)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다, 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(서열 식별 번호:16)(여기서, 위치 4의 Xaa는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다. 다른 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSVXLGVPVKE(서열 식별 번호:17)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)이다, 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(서열 식별 번호:17)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Arg이다.
DNA 서열에 대한 다른 키트는 a) 천연 형태에서, 상기 폴리머라제가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있다)를 포함하고, b) 상기 아미노산 서열화가 위치 4의 X가 E로 돌연변이된 것을 제외하고 위치 4의 돌연변이되고, c) 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 효소의 천연 형태와 비교하여 형광계 염료로 표지되는 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 추가로 쇄 종결 화합물, dNTPs, 열안정성 피로포스파타제 및 적합한 완충제와 같은 DNA 서열에 대한 제제를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. 종결자가 표지될때, 바람직한 표지는 형광염료이고, 보다 바람직한 표지는 음으로 대전된 형광염료 또는 시아닌 염료이고, 가장 바람직한 표지는 형광계 염료이다. 바람직한 양태에서, 키트중의 효소는 아미노산 서열 LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(서열 식별 번호:2)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 갖는다. 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:2)(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다)로서 나타낸다. 보다 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 LSQXLAIPYEE(서열 식별 번호:3)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)이다, 세 문자 코드에서, 이 아미노산 서열은 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(서열 식별 번호:3)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)로 나타낸다. 가장 바람직한 양태에서, 위치 4의 Xaa는 Lys이다.
DNA를 표지하기 위한 키트는 (a) 천연 형태에서, 폴리머라제가 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (b) 상기 서열중의 위치 4의 X는, 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않는 것을 제외하고 상기 천연 형태와 비교하여 돌연변이되고, c) 효소는 상응하는 넓은 형태의 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 추가로 dNTPs 및 적합한 완충제를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. 바람직한 양태에서, 위치 4의 X는 K로 돌연변이된다. 표지된 DNA를 생성하기 위한 다른 키트는 a) 음으로 대전된 형광 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 동족체 및 b) 하기의 중요한 동기를 갖는 쳔연 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다:
LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산일 수 있고, 상기 폴리머라제는 형광 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 추가로 dNTPs 및 적합한 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 위치 4의 X는 K이다. 다른 바람직한 양태에서, 위치 4의 X는 R이다.
프라이머 연장 생성물을 표지하기 위한 키트는 (a) 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:1)(여기서, X는 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (b) 상기 서열중의 위치 4의 X는, 위치 4의 X가 E로 돌연변이 되지 않는 것을 제외하고 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고, c) 폴리머라제는 또한 제 2 아미노산 서열 SQIXLR(V/I)(서열 식별 번호:18)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, d) 효소는 상응하는 넓은 형태의 효소와 비교하여 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 추가로 음으로 대전된 형광 화합물 또는 시아닌 화합물, dNTPs 및 적합한 완충제로 표지된 리보튜클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 동족체를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리머라제는 E681K 돌연변이 및 E615G 돌연변이를 함유한다.
표지된 프라이머 연장 생성물을 생성하기 위한 다른 키트는 a) 음으로 대전된 형광 화합물 또는 시아닌 화합물로 표지된 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 동족체 및 b) (i) 아미노산 서열 LSXXLX(V/I)PXXE(서열 식별 번호:7)(여기서, 위치 4의 X는 E를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다)의 중요한 동기를 포함하고, (ii) 제 2 아미노산 서열 SQIXLR(V/I)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)을 포함하고, (iii) 형광 표지된 리보뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 추가로 dNTPs 및 적합한 완충제를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 천연 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. 바람직한 양태에서, 제 1 아미노산 서열화에서, 위치 4의 X는 K이고, 제 2 아미노산 서열화에서, X는 G이다. 다른 바람직한 양태에서, 제 1 아미노산 서열화에서, 위치 4의 X는 R이고, 제 2 아미노산 서열화에서, X는 G이다.
하기의 실시예는 단지 예시를 목적으로 하는 것이고, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드에 대한 감소된 차별을 갖는 개질된 Taq 폴리머라제 유전자의 발현
Taq DNA 폴리머라제의 C-종결 아미노산 부분은 폴리머라제 활성 위치 영역을 포함한다(본원에 참고로 인용되고 있는 로여 등의 1993년PCR Methods and Applications2:275-287, 프리몬트등의 1986년Proteins: Structure, Function and Genetics 1:66-73). 이 영역을 함유하는 DNA 단편을 전체 길이의 Taq 유전자로부터 분리하였고, 망간의 존재하에서 PCR 증폭에 의해 돌연변이시켰다(렁 등의 1989년Technique 1(1):11-15). 이 실시예에서, 모든 제한 효소를 메사추세츠주 베벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩으로부터 입수하였다. 돌연변이된 분획을 PstI 및 BglII로 절단시켰고, Taq 발현 플라스미드로 클로닝시켰고, pLK102를 PstI 및 BglII로 절단시켰다. 플라스미드 pLK102는 pLK101의 유도체이고, 여기서 900bp PstI-BglII 단편을 짧은 PstI-BglII 결합제로 치환시켰다. 플라스미드 pLK101은 pSYC1578의 형태로 개질되고(로여 등의 1993년 상기참조 및 미국 특허 제 5,079,352 호), 여기서 폴리머라제 코드 영역 3'에 위치된 작은 HincII/EcoRV 단편을 삭제하였다.
생성된 발현 플라스미드를 이 콜라이 균주 N1624로 형질전환시키고(예일 유니버시티에서 이 콜라이 제네틱 스톡 센터로부터 균주번호 CGSC #5066으로 입수가능함), 생성된 형질변환체를 야생형 효소와 비교하여 [α-32P]Tet-dCTP을 보다 효율적으로 결합하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 이 절차를 사용하여 돌연변이 CS1을 [α-32P]Tet-dCTP을 보다 효율적으로 결합하는 능력을 갖는 것으로서 확인하였다. 변이 유발된 돌연변이 CS1의 Taq 발현 플라스미드를 HindIII/NheI로 절단시켰고, 생성된 제한 단편을 pLK101의 야생형 유전자 서브클로닝시켰고, 비변이 유발된 HindIII/NheI 단편을 대체하여 돌연변이된 Taq 폴리머라제 종의 일부를 측정하기 위해 변경된 표현형에 대해 책임이 있었다. HindIII/NheI 제한 단편을 함유하는 서브클론은 야생형 효소상에 변경된 표현형을 부여하였고, 이는 이 단편내에 돌연변이가 있음을 나타내었다. 후속의 서브클론 분석은 돌연변이가 265bp BamHI-NheI 단편에 위치하는 것을 결정하였다.
265NheI-BamHI 단편의 DNA 서열 분석은 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스 및 어플라이드 바이오시스템스 모델 프리즘 377DNA 시퀀싱 시스템으로부터 TaqFS DyeDeoxy 종결자 사이클 서열 키트를 사용하여 pCS1상에서 수행하였다.
서열 분석은 글루탐산(E) 잔기가 아미노산 위치 681에서 리신(K) 잔기에 의해 치환되는 Taq 폴리머라제 중의 미스센스 돌연변이를 확인하였다. 넘버링은 본원에 참고로 인용되고 있는 미국 특허 제 5,079,352 호에서 성숙 단백질의 제 1 메티오닌 잔기를 암호화하는 코돈에서 시작한다. 돌연변이, E681K는 특히 코돈 서열중의 GAG 에서 AAG로의 변화에 의해 초래되었다. 플라스미드 pCS1을 1997년 8월 28일자로 ATCC에 기탁번호 제 98521 호로 기탁하였다.
플라스미드 pCS1은 Taq 폴리머라제에 대한 암호화 서열에 추가의 돌연변이를 함유할 수 있지만, 추가의 서브클로닝 실험에 의해, E681K 돌연변이는 형광염료로 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 결합의 증가된 효율성에 단독적으로 책임이 있는 것으로 결정되었다. 이 점 돌연변이는 도 1에 도시된 265 염기쌍의 BamHI-NheI DNA 단편에 위치한다. 265bpDNA 단편내에, E681K 돌연변이는 야생형 Taq 폴리머라제 유전자 서열의 유일한 변화이다.
뉴클레오티드 동족체의 결합 효율성의 추가 분석 및 정량화에서, 플라스미드 pCS1의 265bp BamHI-NheI 단편을 폴리머라제 영역, pRDA3-2내에 야생형 서열을 함유하는 Taq 발현 벡터로 클로닝하였다. 클론 3-2로 지칭되는 플라스미드 pRDA3-2는 본원에 참고로 인용되고 있는 PCT WO 92/06200 호에 기술되어 있다. E681K 돌연변이 뿐만 아니라 F667Y 돌연변이를 암호화하는 제 2 클론을 프라이머 지향성 돌연변이 및 플라스미드 pRDA3-2의 BamHI-NheI 위치로 돌연변이를 함유하는 PCR 생성물의 연속 클로닝에 의해 생성시켰다.
발현 벡터 pRDA3-2는 람다 파아지 PL프로모터에 작동적으로 결합된 전체 길이의 Taq DNA 폴리머라제 유전자를 함유한다. 벡터 pRDA3-2에서, Taq DNA 폴리머라제 유전자의 5'-뉴클레아제 영역은 5'-뉴클레아제 활성을 감소시키는 위치 46에서 글리신을 암호화하는 코돈의 점 돌연변이(G46D 돌연변이)를 함유한다. 그러나, 발현 벡터 pRDA3-2의 폴리머라제 영역내의 유전자 서열은 야생형 Taq DNA 폴리머라제 유전자 서열과 동일하다. 플라스미드, pRDA3-2, pCS1 및 E681K F667Y PCR 생성물을 BamHI 및 NheI로 절단시켰고, 플라스미드 pCS1 또는 PCR 생성물로부터 265bpDNA 단편을 통상적인 수단으로 pRDA3-2로 연결시켰다. 생성된 플라스미드, pLK112 및 pLK113 각각을 이 콜라이 균주 DG116(ATCC 제 53606 호)내로 형질전환시켰다. 이들 플라스미드는 G46D E681K Taq 및 G46D E681K F667Y Taq 각각으로 본원에서 지칭되는 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. 발현된 열안정성 DNA 폴리머라제 단백질 G46D E681K F667Y Taq를 로여 등의 1993년 상기 참조에 의해 기술된 방법에 따라 정제하였다.
G46D E681K Taq 효소를 하기의 유사하지만 소규모의 제법을 사용하여 정제하였다: 다른 규정이 없는 한 모든 단계를 4℃에서 수행하였다. 475ml 배양물로부터 세포를 30ml의 완충제로 재현탁시켰다(50mM Tris-Hcl, pH 7.5, 10mM EDTA, pH 8.0, 0.5mM Pefabloc SC, 0.5㎍/ml 류펩틴, 0.1mM Nα-p-토실-L-리신 클로로메틸 케톤, 1mM DTT). 세포를 총효율 50%의 주기로 초음파 처리하고, 1분동안 5회 세팅하였고, 1분동안 얼음상에 냉각시켰다. 이 단계를 2회 더 반복하였다. 이어서 1.5ml의 4.0M 황산암모늄을 가했고, 혼합물을 15분동안 75℃의 수욕에서 가열한다음 얼음상에서 냉각시켰다. 폴리에틸렌이민을 0.6%로 가했고, 혼합물을 10분동안 얼음상에서 배양하였다. 혼합물을 16,000xg에서 30분동안 원심분리시켰다. 상등액을 50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM EDTA, pH8.0, 1mM DTT, 0.2M(NH4)2SO4의 용액으로 평형화시킨 1.8ml용적의 페닐-세파로스 칼럼(바이오-래드 폴리프렙 크로마토그래피 칼럼)상에 채웠다. 칼럼을 6ml의 각각의 3개의 용액으로 세척하였다: 1) 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mMDTT, 0.2M(NH4)2SO4, 2) 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT 및 3) 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT, 20%의 에틸렌 글리콜. 폴리머라제를 6ml의 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT, 20%의 에틸렌 글리콜, 2.5M 우레아로 용출하였다. 3M KCl을 사용하여 폴리머라제 제제를 100mM KCl로 조절한 후에, 혼합물을 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT, 100mM KCl중에서 평형화된 헤파린-세파로스 칼럼(1.8ml 용적, 바이오-래드 폴리-프렙 칼럼)상에 채웠다. 동일한 완충제로 세척한후에, 시료를 25mM Tris-HCl, 1mM DETA, pH7.5, 1mM DTT, 400mM KCl의 완충제로 용출시켰다.
정제시킨후, 개질된 효소의 활성을 본원에 참고로 인용되고 있는 로여 등의 1989년J. Biol. Chem. 264:6427-6437에 기술된 활성 분석으로 측정하였다. 정제된 효소의 활성을 하기와 같이 계산하였다: 효소 1단위는 30분동안 합성된 생성물 10nmole에 상응한다. DNA 폴리머라제 활성은 결합된 80 내지 100pmoles dCMP이하의 효소 농도에 거의 비례한다(0.024-0.03units/㎕). 정제된 효소를 실시예 2 내지 4에 기술된 결합 및 서열화 반응에 이용하였다.
실시예 2
ddNTP의 결합 효율성의 비교 분석
형광염료계 표지된 ddCTP를 결합하기 위한 G46D F667Y Taq, G46D F667Y E681K Taq 및 F730Y Tma30 DNA 폴리머라제의 상대적인 능력을 제한 주형, 프라이머 연장 경쟁 분석을 사용하여 비교하였다. F730Y Tma30 DNA 폴리머라제를 본원에 참고로 인용되고 있는 1997년 7월 9일자로 제출된 미국 특허원 제 60/052065 호 및 유럽 특허원 제 98112327.6 호에 기술되어 있다. 이 경쟁 분석에서, ddCTP의 결합으로 연장반응이 종결되기 때문에 폴리머라제가 연장된 프라이머로 ddCTP를 보다 쉽게 결합할 수록 [α-33P]dCTP는 더 적게 결합될 수 있다. 따라서, ddCTP 결합의 효율성이 증가함에 따라 DNA 합성의 억제 정도가 증가한다. 이어서 ddCTP의 결합의 효율성을 형광적으로 표지된 ddCTP의 결합 효율성과 비교하여 주어진 효소에 대해 형광적으로 표지된 ddNTP의 결합 효율성의 상대적인 측정을 얻는다.
하기의 변형을 포함하는 전술한 바와 같이 분석하였다(로여 등의 1989년J.Biol. Chem. 264:6427). 분석 혼합물은 최종 농도가 50mM Bicine pH8.3, 25℃, 2.5mM MgCl2, 1mM β-메르캅토에탄올, 20μM 각각의 dATP, dATP, dGTP 및 dTTP(페르킨-엘머), 20μM dCTP(페르킨-엘머) 및 [α-33P]dCTP이 되도록 구성되었다(메사추세츠주 보스톤 뉴 잉글랜드 뉴클리어). M13mp18(페르킨-엘머)를 프라이머 DG48,(서열 식별 번호:10)에 어닐링하였고, 어닐링된 주형의 0.085pmoles의 당량을 각각의 반응에 대한 분석 혼합물에 가했다. 주형 DNA를 갖는 분석 혼합물 35㎕를 각각의 380.5ml 에펜도르프 튜브에 가했다. 각각의 10㎕를 반응 튜브에 가했을때 Zowie-ddCTP의 최종 농도가 3, 1, 0.5, 0.25, 0.125 또는 0.0625㎛가 되도록 25mM CAPSO 완충액(pH 9.6)중의 Zowie-ddCTP의 희석액을 제조하였다. G46D F667Y Taq DNA 폴리머라제에 대해 각각 두개의 튜브 3, 1, 0.5, 0.25, 0.125㎛ Zowie-ddCTP를 제조하였다. G46D F667Y E681K Taq 및 F730Y Tma30 DNA 폴리머라제에 대해 각각의 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.0625㎛ Zowie-ddCTP의 두개의 튜브를 제조하였다. 나머지 8개 반응 튜브는 10㎕의 25mM CAPSO 완충제(pH 9.6)를 흡수하였다. 따라서, 각각의 38개의 튜브는 35㎕의 분석 혼합 및 10㎕의 25mM CAPSO 완충제(pH 9.6)나 Zowie-ddCTP 희석제중의 하나를 함유하였다.
시험되는 각각의 효소에 대해, 5㎕의 효소를 사용하여 각각의 Zowie-ddCTP 희석제중에 1개의 튜브 및 CAPSO 완충제만을 함유하는 2개의 튜브중에서 중합을 시작하였다. 분석중에 기재의 양에 대한 과량의 효소를 측정하기 위한 효소의 농도를 사용하였다: 실시예 1에서 제조된 2.5 단위의 F667Y G46D Taq DNA 폴리머라제; 실시예 1에서 제조된 1.25단위의 G46D, F667Y, E681K Taq DNA 폴리머라제; 또는 2단위의 F730Y Tma30 DNA 폴리머라제. 배경의 정도에 대한 조절로서, 나머지 음성 조절을 폴리머라제보다 효소 희석 완충제로 시작하였다. 모든 반응 튜브를 즉시 간략하게 선회하였고, 10분동안 75℃에서 배양하였다. 반응을 10㎕의 60mM EDTA의 첨가로 정지시켰고, 0℃에서 저장하였다.
유사한 실험에서, 10㎕의 각각의 희석제를 반응 튜브에 가할때 최종 농도가 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 또는 0.0312㎛가 되도록 ddCTP를 25mM CAPSO 완충제, pH 9.6중에 희석시켰다. 전술한 바와 같이, 10㎕의 각각의 희석을 35㎕의 분석 혼합물을 함유하는 각각의 3개의 0.5ml의 에펜도르프 튜브로 피펫하였다. 35㎕의 분석 혼합물과 10㎕의 25mM CAPSO 완충제(pH 9.6)를 함유하는 4개의 튜브를 또한 제조하였다. 따라서, 각각의 19개의 튜브는 35㎕의 분석 혼합 및 10㎕의 25mM CAPSO, pH 9.6이나 ddCTP 희석제중의 하나를 함유하였다.
2.5단위의 G46D F667Y TaqDNA 폴리머라제, 1.25단위의 G46D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제 또는 2단위의 F730Y Tma30 DNA 폴리머라제를 갖는 각각의 ddCTP 희석제중의 1개의 튜브 및 CAPSO 완충제의 1개의 튜브중에서 중합을 시작하였다. CAPSO 함유 나머지 튜브를 음성 조절용으로서 폴리머라제 함유 완충제보다 효소 희석제 완충제로서 시작하였다. 모든 반응을 즉시 선회하였고, 10분동안 75℃에서 배양하였다. 반응을 10㎕의 60mM EDTA의 첨가로 정지시켰고, 0℃에서 저장하였다.
각각의 반응에서, 60㎕ 반응의 50㎕ 정제를 1ml의 2mM EDTA, 담체로서 50㎍/ml의 전단된 연어 경랍 DNA로 희석하였다. DNA를 표준 절차를 사용하여 TCA로 침전하였고, GF/C 여과기 디스크(와트만)상에서 수집하였다. 결합된 [α-33P]dCTP의 양을 각각의 시료에 대해 측정하였고, ddNTP(0% 억제)없이 CAPSO 시료로 표준화하였다. ddCTP 또는 50%의 억제를 위해 필요한 Zowie-ddCTP의 농도를 각각의 시료에 대해 계산하였고, 표 2에 나타낸다. 합성 50%를 억제하기 위해 필요한 ddCTP의 양과 특정 효소에 대한 50%의 합성을 억제하기 위해 요구되는 Zowie-ddCTP의 양의 비교는 형광적으로 표지된 동족체를 결합하기 위한 각각의 효소의 상대적인 능력을 나타낸다. 이들 데이타는 G46D F667Y Taq DNA 폴리머라제가 시험되는 3가지 효소의 최소한 효율성으로 Zowie-ddCTP를 결합하는 것을 나타낸다(Zowie-ddCTP 대 ddCTP의 50% 억제에 대한 농도비는 25이다). F730Y Tma30 DNA 폴리머라제는 G46D F667Y Taq DNA 폴리머라제보다 보다 효율적으로 표지된 동족체를 결합하는 반면(Zowie-ddCTP 대 ddCTP에 의한 50% 억제에 대한 농도비는 4이다), G46D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제는 거의 동등한 효율성을 갖는 표지된 및 비표지된 ddCTP를 결합한다(Zowie-ddCTP 대 ddCTP에 의한 50% 억제에 대한 농도비는 1.2이다).
| DNA 폴리머라제 | Zowie-ddCTP | ddCTP | Zowie-ddCTP/ddCTP |
| G46D F667Y Taq | 1.4 | 0.056 | 25 |
| G46D F667Y E681K Taq | 0.14 | 0.116 | 1.2 |
| F730Y Tma30 | 0.236 | 0.057 | 4 |
실시예 3
연장비 분석
연장비 분석을 사용하여 G46D F667Y Taq 및 G46D F667Y E681K Taq의 연장비를 측정하였다. 이 실험에서, 효소를 사용하여 [α-33P]dCTP의 존재하에서 M13 주형으로 어닐링된 프라이머를 연장하였다. 연장반응을 변성시키고, 아가로스 겔 전기영동을 변성시킴으로써 생성물을 분석하였다.
전술한 바와 같이 하기의 변형을 포함하는 분석을 수행하였다(로여 등의 1989년 J.Biol,Chem.264:6427). 분석 혼합물을 구성함으로써 최종 농도는 50mM Bicine pH8.3, 25℃, 2.5mM MgCl2, 1mM β-메르캅토에탄올, 200μM 각각의 dATP, dATP, dGTP 및 dTTP(페르킨-엘머), [α-33P]dCTP를 함유하는 100μM dCTP(페르킨-엘머) 이었다(메사추세츠주 보스톤 뉴 잉글랜드 뉴클리어). M13mp18(페르킨-엘머)를 프라이머 DG48,(서열 식별 번호:11)으로 어닐링하였고, 어닐링된 주형의 0.085pmoles의 당량을 각각의 반응에 대한 분석 혼합물에 가했다. 주형 DNA를 갖는 분석 혼합물 45㎕를 각각의 14개의 0.5ml 에펜도르프 튜브에 가했다. 폴리머라제 반응의 시작이전에 각각의 튜브를 75℃에서 30초 이상동안 예비배양하였다.
5㎕의 G46D F667Y Taq DNA 폴리머라제(2.5단위) 또는 G64D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제(1.25단위)를 갖는 14분석 튜브의 6개중에서 중합을 시작하였다. 효소를 실시예 1과 같이 제조하였고, 사용된 농도는 분석중에 기재의 양에 대한 소정의 효소 과량을 나타낸다. 배경 정도에 대한 조절로서, 나머지 음성 조절을 폴리머라제보다 효소 희석제로 시작하였다. 모든 반응 튜브를 75℃에서 즉시 간략하게 선회하였고, 배양하였다. G46D F667Y Taq DNA를 함유하는 6튜브의 2개는 3분, 6분동안 2개 및 10분동안 2개 배양하였다. 이와 유사하게, G46D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제로 시작된 2개의 튜브를 30초동안, 1분동안 2개 및 2분동안 2개 배양하였다. 조절 튜브를 3분동안 배양하였다. 반응을 10㎕의 60mM EDTA를 첨가하여 정지시켰고, 0℃에서 저장하였다.
각각의 반응에서, 60㎕ 반응의 25㎕ 정제를 1ml의 2mM EDTA, 담체로서 50㎍/ml의 전단된 연어 경랍 DNA로 희석하였다. DNA를 표준 절차를 사용하여 TCA로 침전하였고, GF/C 여과기 디스크(와트만)상에서 수집하였다. 결합된 [α-33P]dCMP의 양을 각각의 시료에 대해 측정하였다.
각각의 복재된 나머지 35㎕를 혼합하였고, 70㎕의 시료를 에탄올 침전시키고, 건조시켰고, 50mM NaOH, 1mM EDTA중에 재현탁시켰다. 같은 수의 [α-33P]가 각각으로부터 얻어지도록 이들 시료로부터 정제를 제거하였다. 전술한 바와 같이 이들 정제를 0.9%의 알칼리 아가로스 겔상에 채웠고, 전기영동시키고, 건조시켰고, 방사선 사진 촬영하였다(마니아티스 등의 1982년 InMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 세균페이지 람브다 DNA를 억제 효소 HindIII(BRL)로 절단하였고, [32P]으로 표지된 5' 말단을 분자량 표준으로서 사용하였다.
각각의 시료의 연장 생성물의 염기쌍의 길이를 람브다 DNA 크기 표준에 의해 이동된 거리로 각각의 시료의 이동 거리의 비교로 측정하였다. 각각의 생성물중에 염기쌍의 수를 하기에 나타낸 연장비를 얻기 위해 배양된 각각의 제 2 연장반응의 수로 나누었다.
| DNA 폴리머라제 | 시간 | 염기쌍/초 |
| G46D F667Y Taq | 3분 | 12.5 |
| G46D F667Y Taq | 6분 | 12.2 |
| G46D F667Y Taq | 10분 | 11.8 |
| G46D F667Y E681K Taq | 30초 | 36.7 |
| G46D F667Y E681K Taq | 1분 | 41.7 |
| G46D F667Y E681K Taq | 2분 | 52.9 |
이들 결과는 E681K 돌연변이의 존재가 G46D F667Y 효소의 연장비를 3 내지 4.3배 증가시키는 것을 나타낸다.
실시예 4
G46D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제 및 형광 표지된 ddNTPs로 사이클 서열
이 실시예는 1㎛이하의 ddNTP 및 1:100 이상의 ddNTP:dNTP의 비를 이용하는 형광염료 표지된 디데옥시 종결자 사이클 서열에 본 발명의 개질된 폴리머라제를 적용하는 것을 나타낸다. 형광염료 표지된 디데옥시 종결자는 어플라이드 바이오시스템스 프리즘 세쿼나스 종결자 서열 키트로부터의 제제이고(커넥티컷주 노르워크 페르킨-엘머), 세쿼나스 DNA 폴리머라제 및 알파-티오 dNTP로 사용하기에 적합하였다. 사이클 서열 반응을 50mM Tris-HCl(pH 8.8), 2.0mM MgCl2, 100μM 각각의 dATP, dCTP 및 dTTP(코넥티컷주 노르워크 페르킨-엘머), 500㎛ dITP(뉴저지주 피스카타웨이 파마시아 바이오테크), 0.2㎍의 M13mp18 단일 스트랜드 DNA 주형(페르킨-엘머), 0.15㎛ LacZ 포워드 프라이머(페르킨-엘머), 5단위의 G46D F667Y E681K Taq DNA 폴리머라제, 20단위의 rTth 열안정성 피로포스파타제(유럽특허원 제 763 599 호 및 미국 특허 제 5,665,551 호), 0.05㎛의 세쿼나스 A Dye 터미네이터, 0.80㎛의 세쿼나스 C Dye 터미네이터, 0.08㎛의 세쿼나스 G Dye 터미네이터 및 1.0㎛의 세쿼나스 T Dye 터미네이터를 함유하는 20㎕중에 형성하였다. 모든 4개의 세쿼나스 Dye 터미네이터를 페르킨-엘머로부터 시판하였다. 반응을 예열된(75℃) 페르킨-엘머 GeneAmp PCR 시스템 9600 열순환기에 위치시켰고, 25주기의 10초동안 96℃, 5초동안 50℃ 및 4분동안 60℃로 처리하였다. 염료 표지된 단편을 제조자의 지시에 따라 센트리-셉(Centri-Sep) 칼럼스로 정제하였고(뉴저지주 아델피아 프린세톤 세파라티온스), 진공 원심분리하여 건조시켰다. 펠렛을 6㎕의 탈이온화 포름아미드:50mg/ml 블루 덱스트란(25mM EDTA, pH8.0) 5:1(v/v)중에 재현탁시켰고, 90℃에서 3분동안 가열하였고, 예비전기영동된 4%의 폴리아크릴아미드/6M의 우레아 겔로 바로 채웠고, 제조자의 지시(ABI PRISM 377 DNA Sequencer User's Manual)에 따라서 페르킨-엘머 ABI PRISM 377DNA Sequencer상에서 전기영동 및 분석하였다. 페르킨-엘머 ABI PRISM 377 DNA Sequencer 분석 소프트웨어에 의해 자동화 기본을 450 기본(프라이머로부터 기본에 대해 6오차 +10 내지 +460)에 대한 98.5% 이상의 정확도를 얻었다.
형광계 염료로 표지된, 비통상적인 뉴클레오티드를 결합하기 위한 향상된 효율성을 갖는 개질된 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공한다.
서열목록
(1) 일반 정보
(i) 출원인
(A) 성명: 에프 호프만-라 롯슈 리미티드
(B) 주소: 그렌짜헤르스트라세 124
(C) 도시: 바즐
(D) 주: BS
(E) 국가: 스위스
(F) 우편번호(ZIP): 체하 4070
(G) 전화번호: (0) 61 688 24 03
(H) 텔레팩스: (0) 61 688 13 95
(I) 텔렉스: 962292/965512 hlr ch
(ii) 발명의 명칭: 서열화를 위해 변경시킨 열안정성 DNA 폴리머라제
(iii) 서열수: 18
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매질 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 휴대용
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: patentIn Release #1.0, 버젼 #1.30(EPO)
(vi) 우선권 데이타
(A) 출원번호: US 60/052,065
(B) 출원일: 1997년 7월 9일
(2) 서열 식별 번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 7번 위치의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:1:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:2:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 3..6
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 3번 위치의 Xaa는 Gln 또는 Gly이다. 6번 위치의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:2:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:3:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:3:
Leu Ser Gln Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:4:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 7번 위치의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:4:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:5:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:5:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:6:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:6:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:7:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4..7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 임의의 아미노산이지만 글루탐산 잔기는 아니다. 7번 위치의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:7:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:8:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:8:
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:9:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 2..5
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 2번 위치의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다. 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다. 5번 위치의 Xaa는 Leu 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:9:
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:10:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:10:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:11:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: DNA(지놈)
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:11:
GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC
(2) 서열 식별 번호:12:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:12:
Met Arg Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Tyr Gly
1 5 10 15
(2) 서열 식별 번호:13:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 3..6
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 3번 위치의 Xaa는 Gln 또는 Gly이다. 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다. 6번 위치의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:13:
Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:14:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:14:
Leu Ser Gln Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:15:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4..7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다. 7번 위치의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:15:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:16:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:16:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:17:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:17:
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu
1 5 10
(2) 서열 식별 번호:18:에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(ix) 형태:
(A) 명칭/검색표: 영역
(B) 위치: 4..7
(D) 기타 정보: /label= Xaa
/note= 4번 위치의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이다. 7번 위치의 Xaa는 Val 또는 Ile이다.
(xi) 서열 설명: 서열 식별 번호:18:
Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa
1 5
Claims (27)
- a) 폴리머라제가 천연 형태에서, 아미노산 서열 LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(서열 식별 번호:1)(여기서, 서열 위치 3, 4, 6, 9 및 10의 Xaa는 임의의 아미노산 잔기이고, 서열 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)를 포함하고;b) 위치 4의 Xaa가 Glu로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 위치 4의 Xaa가 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고;c) 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 폴리머라제의 천연형태와 비교하여, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별 정도를 갖는 것을 특징으로 하는재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 1 항에 있어서,뉴클레오티드가 디데옥시뉴클레오티드이고, 차별 정도가 폴리머라제의 천연형태보다 3배 이상 낮은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 2 항에 있어서,DNA 합성의 50% 억제에 대해 요구되는, 형광염료로 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 농도를 측정함으로써 차별 정도가 측정되는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 2 항에 있어서,폴리머라제가 서모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax) 및 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 호열성 종으로부터의 것인 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 2 항에 있어서,폴리머라제가 서무스(Thermus) 종으로부터의 것인 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 5 항에 있어서,a) 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열 LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (서열 식별 번호:2)(여기서, 위치 3의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이고, 위치 6의 Xaa는 Ser 또는 Ala이다)를 포함하고;b) 위치 4의 Xaa가 Glu로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 위치 4의 Xaa가 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고;c) 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 폴리머라제의 천연형태와 비교하여, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별 정도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 6 항에 있어서,a) 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열 LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu (서열 식별 번호:3)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산이다)를 포함하고;b) 위치 4의 Xaa가 Glu로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 위치 4의 Xaa가 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고;c) 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 폴리머라제의 천연형태와 비교하여, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별 정도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 7 항에 있어서,위치 4의 Xaa가 Lys로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 2 항에 있어서,폴리머라제가 서모토가(Thermotoga) 종으로부터의 것인 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 9 항에 있어서,a) 폴리머라제가 천연형태에서, 아미노산 서열 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (서열 식별 번호:4)(여기서, 위치 4의 Xaa는 임의의 아미노산, 바람직하게 Arg이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)를 포함하고;b) 위치 4의 Xaa가 Glu로 돌연변이되지 않는 것을 제외하고는 위치 4의 Xaa가 상기 천연 서열과 비교하여 돌연변이되고;c) 열안정성 DNA 폴리머라제가 상기 폴리머라제의 천연형태와 비교하여, 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별 정도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 핵산 서열.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주세포.
- (a) 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제의 발현을 촉진시키는 조건하에서 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주세포를 배양하고;(b) 상기 숙주세포 또는 배지로부터 상기 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 분리시키는 것을 포함하는제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제의 제조방법.
- 제 14 항에 청구된 바와 같은 방법에 의해 제조된 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제.
- a) 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고;b) 음으로 대전된 형광염료로 표지된 염료 종결자를 제공하고;c) 염료 종결자 서열화 반응을 수행하는 것을 포함하는 DNA 서열화 방법.
- 제 16 항에 있어서,재조합 열안정성 DNA 폴리머라제가 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별정도를 갖고, 뉴클레오티드가 디데옥시뉴클레오티드이고, DNA 합성의 50% 억제를 위해 요구되는 형광염료로 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 농도대 상기 50% 억제를 위해 요구되는 비표지된 디데옥시뉴클레오티드의 농도의 비를 측정함으로서 차별 정도를 측정하는 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 비가 4이하인 방법.
- a) 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고;b) 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드를 제공하고;c) DNA 합성반응을 수행하는 것을 포함하는 표지된 DNA의 제조방법.
- a) i) 폴리머라제가 아미노산 서열 LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(서열 식별 번호:4)(여기서, 위치 4의 Xaa는 Glu를 제외한 임의의 아미노산이고, 위치 7의 Xaa는 Val 또는 Ile이다)를 포함하고;ii) 상기 폴리머라제가 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별정도를 갖고;iii) 상기 폴리머라제가 또한 제 2 아미노산 서열 SQIXLR(V/I)(서열 식별 번호:18)(여기서, X는 E를 제외한 임의의 아미노산이다)를 포함하고,iv) 상기 폴리머라제가 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖는, 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제를 제공하고;b) 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드를 제공하고;c) 프라이머 연장반응을 수행하는 것을 포함하는표지된 프라이머 연장 생성물의 제조방법.
- DNA 서열화, 표지된 DNA의 합성 및 표지된 프라이머 연장 생성물의 제조와 같은 시험관내 DNA 합성 분야에 있어서, 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제의 용도.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 열안정성 DNA 폴리머라제 및 음으로 대전된 형광염료로 표지된 종결자를 포함하는 DNA 서열화용 키트.
- 제 22 항에 있어서,재조합 열안정성 DNA 폴리머라제가 형광계 염료로 표지된 뉴클레오티드의 결합에 대해 감소된 차별을 갖고, 상기 감소된 차별정도가 비표지된 ddNTP에 대한, DNA 합성의 50% 억제를 위해 요구되는 형광계 염료로 표지된 ddNTP의 농도비를 측정함으로써 측정되고, 상기 비가 4이하인 키트.
- 제 23 항에 있어서,차별정도가 폴리머라제의 천연형태보다 5배 이상 낮은 키트.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 및 음으로 대전된 형광염료로 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 표지된 DNA 제조용 키트.
- 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한항에 청구된 바와 같은 재조합 열안정성 DNA 폴리머라제 및 형광계 염료로 표지된 리보뉴클레오티드를 포함하는 표지된 프라이머 연장 생성물 제조용 키트.
- 상술한 바와 같은 발명.
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