KR102598042B1 - 중대가리풀 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물은, 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물을 포함하는 것으로, 30%미만의 알코올로 추출한 중대가리풀 추출물을 포함함에 따라 항염 및 자가면역 질환의 예방 및 치료에 효과적이면서 현저하게 낮은 세포독성 및 부작용을 가지는 장점이 있다.

Description

중대가리풀 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물 및 이의 제조 방법{COMPOSITION HAVING CENTIPEDA MINIMA EXTRACTS FOR ANTI-INFLAMMATORY, PREVENTING AND CURING AUTOIMMUNE DISEASE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

항염은 염증 또는/및 염증 관련 질환을 예방, 억제, 저해, 개선 또는/및 치료하는 효능을 의미하는 것으로서, 염증은 체액이 조직 세포 사이에 증가하여 나타나는 부종, 혈관 확장에 따른 충혈, 발열 물질과 혈관 확장에 의한 발열, 아라키돈산 대사산물에 의한 통증 등과 같은 증상 또는 징후로 나타나고, 시간에 따라 급성, 아급성, 만성 염증질환으로 분류할 수 있고, 병태 생리에 따라 감염성, 알레르기성, 자가면역성, 독성, 대사성, 외상성 염증질환으로 분류할 수 있다.

예를 들어, 상기 염증은 비염, 부비동염, 중이염, 비인두염, 후두염, 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐섬유화증 등의 호흡기계 염증질환; 구강염, 식도염, 위염, 소화성궤양, 과민성장증후군, 염증성장질환, 담낭염, 담도염, 췌장염, 간염 등의 소화기계 염증질환; 여드름, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 아토피 피부염, 건선 등의 피부 염증질환; 심내막염, 심근염, 심낭염, 혈관염, 동맥경화증, 패혈증 등의 심혈관계 염증질환; 갑상선염, 부갑상산염, 당뇨병 등의 내분비계 염증질환; 사구체신염, 신병증, 간질성 신질환, 고환염, 난소염, 자궁내막염, 질염 등의 비뇨생식계 염증질환; 류마티스관절염, 척추관절병증, 골관절염, 통풍, 전신성홍반성루프스, 전신성경화증, 근병증, 쇼그렌증후군, 베체트병, 항인지질증후군 등의 근골격계 염증질환; 혈관성치매, 알츠하이머병, 퇴행성뇌질환, 우울증, 정신분열증 등의 신경정신계 염증질환 등일 수 있다.

자가면역 질환은 면역세포가 자기 몸의 장기나 조직을 공격하여 발생하는 질환으로서, 면역 불균형 또는 자기 항원에 대한 내성 상실로 야기된다. 자가 면역 질환은 체액성 면역, 세포성 면역 또는 양쪽 모두에 의해 세포나 조직에 손상을 초래하는 것으로, 이처럼 면역계의 자가 항원(autoantigen)에 대한 부적절한 반응을 자가 면역이라고 한다. 자가 면역 질환은 자가 면역 반응이 표적으로 삼는 수많은 분자, 세포 및 조직들과 관련이 있으며, 표적 항원의 분포에 따라 전신성이거나 특정 장기에 특이적으로 나타날 수 있다. 예를 들면, 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus; SLE), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 그리고 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS)은 전신성 자가 면역질환이다. 또한, 원형탈모(alopecia areata)는 전세계적으로 성별, 나이, 머리카락 색깔을 가리지 않고, 고르지 못한 탈모를 나타나는 자가면역 질환 질환으로, 원형탈모는 전세계적으로 약 0.1 내지 0.2%의 유병율을 나타낸다.

자가면역계 질환에 대한 면역억제제로 토파시티닙이 널리 사용되고 있다.

토파시티닙 {3-((3R,4R)-4-메틸-3-(메틸(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)아미노)피페리딘-1-일)-3-옥소프로판나이트릴}은 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다. 상기 토파시티닙은 국제특허공개공보 제2001/042246호에 최초로 개시되어 있다.

토파시티닙은 합성 JAK(janus kinase) 억제제로서, 야누스 인산화효소(Janus kinase, JAK)는 인산기의 전이를 촉매하는 효소 중 한 종류이다. 면역 세포가 분비하는 단백질인 싸인토카인은 싸이토카인 수용체와 결합하면서 신호전달이 세포내로 전해지는데, 싸이토카인 수용체는 TYK2, JAK1, JAK2와 JAK3과 같은 야누스 인산화효소와 결합한다.

싸이토카인이 싸이토카인 수용체와 결합하면 JAK에서 인산화 반응이 일어나고 STAT(signal transducer and activator of transcription)을 활성화시키며, 조혈 작용, 염증 반응, 면역 반응을 나타나도록 신호전달이 이어지는데, 싸이토카인 과잉 생산에 따른 과면역 반응이 발생하는 자가면역계 질환에 있어서, 싸이토카인이 결합하는 싸이토카인의 수용체의 인산화 효소를 억제하는 것이 JAK 억제제이다.

다만, 토파시티닙 뿐만 아니라 동일 계열의 JAKI, JAK 억제제들은 합성의약품으로 원재료의 확인된 수많은 부작용으로 인하여 안전성을 담보할 수 없으며, 전문의약품으로 개발되어 환자 접근성이 떨어지며 의약품 용도로만 한정되어 있고 경구투여로 한정되며 장기간 복용시 면역저하에 따른 심각한 감염증(코인두염, 위장염, 상기도 감염) 및 장 천공이 발생하며, 콜레스테롤 수치 상승, 두통, 발진, 대상포진, 빈혈 등이 발생하는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 토파시티닙은 1일 처방향 10mg/day 기준으로 국내 건강보험이 미적용시 한달에 약 600만원으로 고비용이 발생하게 되는 문제가 있다.

중대가리풀(Centipeda minima, 토방풀)은 국화과에 딸린 한해살이풀이다. 중국에서는 민간에서 만성비염을 비롯한 콧병·눈병 및 두통 치료에 사용한다. 또한 잎과 줄기를 그대로 비벼서 콧구멍에 넣고 하룻밤을 지내면 만성 말라리아에 효과가 있다. 인도에서는 눈병·콧병 및 치통에 사용한다. 한국·일본·중국·인도·오스트레일리아·시베리아 동부·북아메리카 등지에 분포한다. 중대가리풀을 원료로 하는 항염, 자가면역 질환 및 비알코올성 지방간 질환에 대한 효능에 대하여 알려진 바가 없으며 연구가 필요한 실정이다.

천연 원료로부터 천연 유효 성분은 추출되어 선별되는데, 일반적인 추출 방법으로 원료가 고체인 경우 고-액 추출 방법을 사용하며, 원료가 액체인 경우 액-액 추출 방법을 사용한다. 액-액 추출 방법(liquid-liquid extraction; LLE)은 용질을 함유하고 있는 액체 혼합물에 용제를 작용시켜 혼합물 중의 특정 성분을 다른 성분들로부터 분리하는 것이다.

일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매는 독성이 매우 강하며, 반복적인 여러 추출 과정 그리고 비극성 용매 제거를 위한 건조 과정에 의하여 추출 과정이 매우 비효율적이고 복잡하며 공정이 길고, 추출 효율이 낮고 공정이 길어짐에 따라 높은 생산 단가를 나타내는 문제점이 있다.

예를 들어, 중대가리풀(Centipeda minima)로부터 Brevilin A를 추출하기 위한 과정은, 원료를 메탄올로 복수 회에 걸쳐 추출하고, 추출액에 헥산을 혼합하여 분획 복수 회, 클로로포름을 혼합하여 분획 복수 회, 에틸아세테이트를 혼합하여 분획 복수 회, 부틸알코올을 혼합하여 분획 복수 회를 통하여 추출하며, 추출시 중대가리풀 건조 중량 300g에서 Brevilin A는 25mg 정도 추출되어 그 추출량이 극미량으로 효율이 매우 낮다(비특허문헌1).

이에 따라, 극미량의 유효 성분에 대한 추출량을 극대화시킬 수 있는 최적의 추출 방법이 요구되며, 이는 본 출원인의 출원인 대한민국 특허공개공보 제10-2020-0085024호의 추출법에 의하여 추출될 수 있다.

이에 본 발명자는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 연구하던 중, 중대가리풀을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물이 부작용이 적으면서 항염 및 자가면역 질환 등에 효과가 있음을 알게 되어 발명을 완성하였다.

특허문헌 1: 대한민국 특허공개공보 제10-2020-0085024호

비특허문헌 1: Arch Pharm Res Vol 29, No 1, 64-66, 2006.

본 발명은 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물은 중대가리풀(Centipeda minima)의 30% 미만의 알코올 추출물을 포함한다.

본 발명에서 상기 중대가리풀의 추출물은 5 내지 25%의 알코올로 추출되는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질알코올, 이소프로필알코올, 세테아릴알코올, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 라우릴알코올, 미리스틸알코올 및 베헤닐알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 중대가리풀의 추출물은 중대가리풀 원료를 30% 미만의 알코올로 추출하여 1차 추출액을 제조하고, 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하고, 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출된 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Medium-chain　triglycerides, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 중대가리풀의 추출물은 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하며, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제하며, 상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 조절하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 중대가리풀 추출물은, 30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A; 0 내지 40중량%의 상기 아르니콜라이드 D; 0 내지 20중량%의 상기 아르니콜라이드 C; 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 자가면역 질환은 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명의 실시예들은 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 기존 합성의약품인 자가면역 질환 치료제인 토파시티닙 대비 천연 추출물을 이용하는 것으로 원재료의 안전성을 담보할 수 있을 뿐만 아니라, 기존에 중대가리풀 추출물로 알려진 브레빌린 A의 단독 처방 대비하여 부작용 없이 항염 및 자가면역 질환에 있어서 더 뛰어난 효과를 나타낸다.

또한, 기존 합성의약품은 경구투여로 한정되나, 천연 조성물을 활용하는 본 발명의 실시예들은 합성의약품 대비 부작용이 적거나 거의 없으며, 의약품뿐만 아니라 화장품, 식품 등에 적용이 용이하다.

도 1 내지 6은 실험예 1에 따른 피부이상반응 결과 이미지이다.
도 7 및 8는 실험예 2-1에 따른 피부독성 및 발모효과를 나타낸 그래프이다.
도 9 및 10은 실험예 2-2에 따른 세포독성 및 항염효과를 나타낸 그래프이다.
도 11 내지 14는 실험예 2-3에 따른 세포독성 및 단백질발현을 나타낸 그래프이다.
도 15 내지 22은 실험예 3에 따른 추출물의 이미지이다.
도 23 내지 30은 실험예 3에 따른 추출물의 불순물 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 비극성 천연물질의 추출 방법, 이에 따라 추출된 천연물질 및 이의 용도 등에 대하여 설명하기로 한다.

그에 앞서, 본 명세서에 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 그리고, 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '포함' 또는 '함유'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 또는 성분의 부가를 제외시키는 것은 아니다.

본 발명에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용되며, 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 실시예에 따른 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물은 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물을 포함한다.

상기 '중대가리풀(Centipeda minima)'은 속씨식물로 쌍떡잎식물 초롱꽃목에 속하고 한국, 일본, 중국, 인도, 오스트레일리아, 시베리아 동부 및 북아메리카등지의 길가나 밭 또는 논둑 근처에서 서식한다. 다른 말로 아불식초라고도 불리는 중대가리 풀은 통상적으로 여름철 꽃이 필 때 전초를 채취하여 물에 씻어 햇볕에 말려 사용하는데 맛은 맵고 성질은 따뜻하여 감기, 인후염, 백일해, 아메바성 적리, 학질, 축농증, 각막백탁, 옴, 타박상 등에 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명에서 상기 중대가리풀의 추출물은 5 내지 25%의 알코올로 추출될 수 있다.

예를들어, 중대가리풀의 추출물을 5%미만 농도의 알코올로 추출할 경우 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 유효성분이 목적하는 ?t량 만큼 추출되지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 25%를 초과한 농도의 알코올로 추출할 경우 피부의 갈라짐 또는 각질발생과 같은 피부 이상반응이 나타나는 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명에서 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질알코올, 이소프로필알코올, 세테아릴알코올, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 라우릴알코올, 미리스틸알코올 및 베헤닐알코올로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있고, 적합하게는 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "추출된 물질" 또는 "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

또한, 추출물의 건조는 채취한 천연물질로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 식물의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.

또한, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있으나 적합하게는 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)으로 지칭하며, 용해-유화 추출법에 따르면, 천연물 원료 내 비극성 천연물질을 추출하여 상분리 조성물을 혼합하여 용해 및 유화시킨 후, 상분리를 통하여 비극성 천연물질을 추출한다.

본 발명에서 상기 중대가리풀의 추출물은 중대가리풀 원료를 30% 미만의 알코올로 추출하여 1차 추출액을 제조하고, 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하고, 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출할 수 있다.

구체적으로, 중대가리풀 원료에서 천연물질을 추출하여 1차 추출액을 제조하는 것으로, 알코올을 사용하였으며 적합하게는 에탄올을 사용할 수 있다.

예를 들어, 추출은 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 추가적으로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있다.

예를 들어, 천연물 원료를 차가운 알코올에 담궈 냉침 추출할 수 있다.

예를 들어, 천연물 원료는 중대가리풀 자체를 사용하거나, 이를 분쇄한 분말을 사용할 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 추출은 중대가리풀 원료를 알코올에 담궈 60

이상의 온도에서 약 3시간 정도 열수 추출할 수 있으며, 알코올은 약 5% 내지 29%의 알코올을 사용할 수 있다.

다음으로, 상기 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가하여 혼합한다.

상기 상분리 조성물은 친유성 가용화제 및 물을 더 포함할 수 있고 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상분리 조성물은, 1차 추출액에 함유 되어 있는 지표물질(Brevilin-A)의 총량 대비 친유성 가용화제 10 내지 50배의 친유성 가용화제; 및 잔부의 물을 포함할 수 있고, 비이온성 계면활성제를 40 중량% 이하로 포함할 수 있고, 별도의 공정으로 비이온성 계면활성제를 완전히 제거할 수 있으며, 이에 따라 목적하는 농도의 지표물질을 함유할 수 있다.

또한, 1차 추출액이 상기 상분리 조성물과 혼합하게 되면 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C, 즉 비극성 천연물질이 비이온성 계면활성제 내지 친유성 가용화제에 추출 및 용해되는데, 이때 추가로 고속 혼합을 하면 혼합물 내 계면활성제 및 가용화제의 표면적이 증가하면서 추출 내지 용해되지 않은 일부 비극성 천연물질이 대부분이 용해되어 순간적인 한계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 상태가 되며, 이때, 혼합액의 온도가 증가함에 따라 클라우드 포인트(cloud point)에 다다르게 되면, 이온성 계면활성제와 달리 비이온성 계면활성제는 온도의 증가에 따라 용해도가 감소하므로, 혼합액의 상분리가 보다 더 명확히 나타날 수 있다.

또한, 상기 상분리 조성물이 비이온성 계면활성제를 포함하는 경우, 상기 상분리 조성물을 혼합하는 단계에서, 승온시키는 과정을 포함하여 보다 명확한 상분리를 할 수 있다. 예를 들어, 1차 추출액에 상분리 조성물을 혼합한 혼합물을 30 내지 50

의 온도를 유지하면서 5 내지 20분간 교반할 수 있으며, 적합하게는 35 내지 45

의 온도를 유지하면서 7 내지 13분간 교반할 수 있다.

상기와 같이 1차 추출액을 상분리 조성물과 혼합함에 따라 중대가리풀 원료 내에 함유된 비극성 천연물질인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C는 친유성 가용화제와 하나의 층에, 그리고 나머지 물 및 기타 성분은 다른 층에 함유되어 상분리가 일어날 수 있다.

또한, 상기 열수추출에 따른 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가한 혼합물을 이용하여 바로 다음 단계로 넘어가더라도 본 발명의 목적을 달성하는데 차이는 없지만, 보다 명확한 상분리 및 효율적인 추출을 위한 측면에서 상기 열수 추출에 따른 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가한 혼합물을 감압 농축하여 알코올 성분을 제거하는 단계를 선택적으로 진행함에 따라 불필요한 알코올 성분을 제거하는 것이 적합하다. 예를들어, 특정 층을 제거하거나 특정 알콜 조성을 이용하여 비중의 변화로 분리 층의 상하를 조정할 수 있고, 미량의 지표성분을 최대로 추출하기 위한 경우에는 알코올 성분을 제거하여 수분을 줄임으로서 친유성 가용화제 층에 지표성분만을 염석(salting out)시킬 수 있다. 이후 상분리된 상층액을 2차 추출액으로 사용할 수 있다.

다음으로, 상분리 조성물이 혼합된 1차 추출액은 헥산(Hexane)을 포함하여 불순물을 제거하는 필터 단계를 더 포함한 후 2차 추출액으로 사용할 수 있다.

상기 불순물은 페놀유도체 또는 플라보노이드계열일 수 있다. 예를 들어 페놀유도체는 벤조산(Benzoic acid), 시나핀산(Sinapic acid), 시링산(Syringic acid) 또는 테트라코산산(Tetracosanoic acid)일 수 있고, 페놀유도체의 단백질 분해효과로 인한 피부염 또는 화상을 유발하는 부작용이 나타날 수 있다. 또한, 플라보노이드계열은 니코티플로린(Nicotiflorin), 루테올린(Luteolin), 아피제닌(Apigenin), 히스피둘린(Hispidulin) 또는 케르세틴-3메틸 에테르(Quercetin-3-methyl ether)일 수 있고, 플라보노이드계열은 호흡기 자극 및 급성 독성을 유발하는 부작용이 나타날 수 있다.

따라서, 상기 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 경우 본 발명의 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물의 부작용을 최소화할 수 있다.

다음으로, 2차 추출액을 상분리하여 비극성 천연물질을 수득할 수 있다.

또한, 상기의 추출 방법에 따라 추출된 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C을 포함하는 상분리층에 상기 상분리 조성물의 범위를 벗어난, 마이크로 에멀전 범위의 에멀전화 조성물을 추가로 혼합하여, 에멀전화된 제품을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예들에 따라 추출된 천연물질 및 이를 포함하는 조성물 등의 제품은 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 단계별 반복적인 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계 없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 마이크로 에멀전화 또는 한계미셀농도(CMC)로 인하여 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

일반적으로 계면활성제의 사용은 계면활성제의 CMC를 이용하여 화합물의 용해도를 높여 흡수율을 증가시키게 되며, 마이크로 에멀전도 용해도 높이는것 뿐만 아니라 흡수시키려는 물질의 사이즈를 감소시켜 흡수 사이트에서의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Medium-chain triglycerides, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제로서 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 및 Tefose 63로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있디.

본 발명에서 상기 중대가리풀 추출물은 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.

브레빌린 A는 하기 화학식으로 표현된다.

브레빌린 A는 CAS number 16503-32-5로, C20H26O5의 분자식, 분자량은 346.42이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.), 헬레니움종(Helenium sp.)으로부터 유래한다.

중대가리풀(아불식초, Centipeda minima)에 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌은 다수 발견되었으며, 일부 문헌에 샴푸트리(Litsea glutinous)에도 Brevilin A가 함유되어 있다고 보고한 문헌이 존재한다. 뿐만 아니라, Arnica 속 식물(Arnica longifolia, Arctium lappa, Arnica chamissonis subsp. Foliosa, Arnica chamissonis Less.) 및 Helenium 속 식물(Helenium autumnale L, Helenium alternifolium, Helenium pinnatifidum, Helenium vernale, Helenium brevifolium, and Helenium flexuosum)에도 일부 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌이 발견되었다.

아르니콜라이드 D는 하기 화학식으로 표현된다.

아르니콜라이드 D는 CAS number 34532-68-8로, C19H24O5의 분자식, 분자량은 332.40이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.)으로부터 유래한다.

아르니콜라이드 C는 하기 화학식으로 표현된다.

아르니콜라이드 C는 CAS number 34532-68-7로, C16H26O5의 분자식, 분자량은 334.41이며, 아르나카종(Arnica sp.), 센티페다종(Centipeda sp.)으로부터 유래한다.

마이크로헬레닌 C는 하기 화학식으로 표현된다.

마이크로헬레닌 C는 CAS number 63569-07-3로, C20H26O5의 분자식, 분자량은 346.4이며, 센티페다종(Centipeda sp.), 헬레니움종(Helenium sp.)으로부터 유래한다.

예를 들어, 상기 중대가리풀 추출물은 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C 중 어느 하나 이상을 포함하는데, 예를 들어, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C, 마이크로헬레닌 C를 단독으로 포함하거나, 브레빌린 A 및 아르니콜라이드 D의 조합, 브레빌린 A 및 아르니콜라이드 C의 조합, 브레빌린 A 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C의 조합, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 조합으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하며, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제하며, 상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 조절할 수 있다.

상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C 각각의 작용기전을 살펴보면,

상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정(JAK-STAT signaling pathway)을 저해 또는 억제하는 것으로, 구체적으로 천연물질인 브레빌린 A는 천연물질로서, 암세포에서 JAK(janus kinase activity)를 저해하고, STAT3 신호 전달을 억제하는 것은 널리 알려져 있다(PLoS One 8 (5) (2013) e63697). 또한, JAK-STAT(signal transducers and activators of transcription) 경로의 억제를 통해 강력한 염증반응과 다양한 염증 관련 표적들을 억제하여 자가면역질환의 일종인 원형탈모치료에 효과가 있다.

상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK(mitogen-activated protein kinase) signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제가 가능하다.

또한, 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 또는 상기 마이크로헬레닌 C를 포함하는 상기 중대가리풀은 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 조절할 수 있는데 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway) 동물의 초기발생 또는 형태형성에는 필수적인 것이다. 구체적으로, Wnt는 분자량이 약 4만인 분비성 단백질인데, 19종류인 Wnt가 아과를 형성하여 각각이 세포막의 7회막관통형수용체 Frizzled가 공역수용체인 1회 막관통형 LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)과 결합한다. Wnt와 수용체의 결합으로 활성화하는 세포내 신호전달경로에는 β카테닌경로, 평면세포극성경로, Ca2＋경로인 3종류가 존재한다. β카테닌경로에서는 β카테닌의 안정성을 조절하여, 여러 가지 표적유전자의 발현조절을 한다. 이 경로는 세포의 증식 또는 분화를 조절하고 있음으로, 이 부분에 이상이 발생하면 암이 발생할 수 있다. Wnt가 세포를 자극하지 않았을 때, casein kinase I과 GSK3β가 Axin과 APC protein complex 내에서 cytoplasmic β-catenin을 인산화 한하고, β-TrCP E3 ubiquitin ligase가 인산화 된 β-catenin을 인식하여 uniquitination/proteasome pathway를 통해서 분해된다. 이 과정을 거쳐 세포질 내에서의 β-catenin level이 낮게 유지가 된다. Wnt에 자극이 발생하면 Axin이 complex에서 빠져 나가고 GSK3β의 활성이 저해되어 β-catenin의 인산화가 억제됨에 따라 세포질 내에서의 β-catenin level이 증가하고, β-catenin이 핵 내로 이동하여 T cell factor 또는 Lymphoid Enhancer-Binding factor와 결합한다. 이 결합을 통해 유전자의 발현을 조절이 된다. 따라서 Wnt/β-catenin pathway 조절에 이상이 생기면 암이 유발될 수 있다.

이에 따라 본 발명에서와 같이 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 또는 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)을 포함하는 중대가리풀의 추출물을 이용할 경우 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)을 조절하여 항염 및 자가면역 질환에 예방 및 치료가 가능하다.

본 발명에서 상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 1.5배 이상일 수 있다.

상기 브레빌린 A는 자가면역 질환, 예를 들어, 발모 및 탈모, 그리고 항염증에 대하여 가장 주요한 구성 성분으로 다른 유도체들인 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 많은 것이 바람직하며, 원료 물질인 중대가리풀의 주요 비극성 천연물질의 주성분이 상기 브레빌린 A이다.

상기 브레빌린 A은 자가면역 질환의 주요 작용기전인 JAK-STAT 신호전달과정에 가장 연관되어 있으며, 다른 유도체들인 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C와 함께 작용하는 경우 자가면역 질환에 대하여 상승 작용을 일으켜 각 성분들을 단독으로 함유하는 경우보다 자가면역 질환, 예를 들어 탈모 예방 및 항염에 더 효과가 우수하다.

본 발명에서, 상기 중대가리풀 추출물은, 30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A, 0 내지 40중량%의 상기 아르니콜라이드 D, 0 내지 20중량%의 상기 아르니콜라이드 C 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함할 수 있다.

상기 브레빌린 A는 30 내지 90중량%로 포함되며, 30중량% 미만이거나 90중량% 초과인 경우, JAK-STAT 신호전달과정에 가장 연관되어 있는 성분이 적어 항염 효능이 저하되고 다른 성분들과의 상승 작용이 저하되어 자가면역 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다.

상기 아르니콜라이드 D는 0 내지 40중량%로 포함되며, 40중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C와의 상승 작용이 저하되어 자가면역 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 아르니콜라이드 D는 15 내지 30중량%로 포함된다.

상기 아르니콜라이드 C는 0 내지 20중량%로 포함되며, 20중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 마이크로헬레닌 C와의 상승 작용이 저하되어 자가면역 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 아르니콜라이드 C는 2 내지 20중량%로 포함된다.

상기 마이크로헬레닌 C는 0 내지 15중량%로 포함되며, 15중량% 초과인 경우, 다른 성분들인 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D 및 아르니콜라이드 C와의 상승 작용이 저하되어 자가면역 질환의 충분한 예방 및 치료가 어려운 문제점이 있다. 바람직하게는, 상기 마이크로헬레닌 C는 1 내지 15중량%로 포함된다.

따라서, 상기 브레빌린 A, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C 각 성분들의 함량 범위를 벗어나는 경우 항염 효능을 달성할 수 없다.

본 발명에서 상기 자가면역 질환은 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클랜징폼, 헤어오일, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어젤, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 헤어스프레이 등의 제품, 피부외용제로서 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제와 카타플라즈마제 등의 제형으로 제조될 수 있고, 액상, 고체상, 기체상으로 적절히 활용될 수 있다.

또한, 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있고, 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 각각통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.

이하, 보다 구체적인 설명을 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

제조예 1.

천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하여 추출한 중대가리풀 추출물을 사용하였다.

구체적으로 중대가리풀 건초 100mg을 알코올 10mL에서 48시간동안 침전시킨 후 알코올 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이때 추출물질에 따른 중대가리풀의 추출률을 평가하기 위하여 알코올의 종류로 이소프로필알코올, 에탄올 및 부틸알콜을 이용하였고 증류수를 이용하였다.

다음으로, 1차 추출액의 지표성분(Brevilin-A)의 함량을 구하여 추출용매별 추출률을 평가 한 측정값을 하기 표 1에 나타내었다. (지표성분(Brevilin-A)의 함량은 3mg/mL이다.)

추출물질	추출률(%)
이소프로필알코올	95
에탄올	96
부틸알코올	75
증류수	5

상기 표 1을 참조하면. 중대가리풀을 에탄올에서 추출하였을 경우 가장 우수하게 추출이 되는 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 하기의 실험예에서는 에탄올 추출물을 이용하기로 하였다.

제조예2.

중대가리풀 건초 1,000g을 하기 표 2에 따른 농도를 가진 에탄올 10L에 48시간 동안 침전시켜 알코올 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후 1차 추출액에 함유되어 있는 지표 성분의 함량을 확인하고, 친유성 가용화제로 Labrafac을 지표물질(Brevilin-A) 대비 20 배의 비율로 혼합한 후, 감압 농축하여 알콜의 조성을 줄여 지표성분의 염석(salting out)을 유도하였다. 다음으로, 분별 펀넬에서 60분간 방치한 후, 상분리된 상층액인 2차 추출액을 분리하여 사용하였다.

상분리된 추출물은 지표성분의 함량을 확인하여, 브레빌린 A, 아르니콜라이드 D, 아르니콜라이드 C 및 마이크로헬레닌 C의 함량을 동일한 조건으로 유지하도록 하여 시험을 진행하였다.

위 중대가리풀 추출물은 CMX(CM-2019-001)로 명명하여 경성대학교 식물표본실(herbarium)에 보관하였으며, 국제화장품원료집(INCI, International Nomenclature Cosmetic Ingredient) 원료 번호는 33,849이다.

구분	에탄올 농도(%)
실시예 1	5
실시예 2	25
비교예 1	30
비교예 2	50
비교예 3	75
비교예 4	95

실험예 1. 피부독성실험

상기 표 2의 에탄올 농도에 따른 중대가리풀 추출물(CMX)의 피부독성평가를 실시하였다.

구체적으로, 온도 23±3°C, 상대습도 50±10% 및 12시간 조명주기 조건에서 7일간 적응시킨 C57BL/6 암컷 마우스를 각 군당 2마리씩 사용하였고, 제모제(니크린, 일동제약)를 사용하여 등 부위의 털이 제모된 피부를 사용하였다. 또한, 상기 표 2에 따른 추출액에 지표성분이 1~3mg/mL 농도로 포함되도록 제조하여 등판 피부에 5일동안 매일 50ul씩 두번 도포 한 후, 5일째 되는 날의 피부변화를 육안으로 관찰하였다.

관찰 결과, 실시예 1 및 2에 따른 추출물을 사용한 경우 피부에 독성이 발생하지 않으면서 대조군과 대비하여 현저하게 빠른 발모효과가 나타나는 것을 알 수 있었고, 실시예 1에 대비하여 실시예 2에서 조금 더 우수한 발모효과가 나타나는 것을 알 수 있었다. 이에 대하여, 대조군으로 DMSO를 사용하여 관찰한 경우인 도 1 및 실시예 2에 따른 추출물을 사용하여 관찰한 경우인 도 2를 참조하면 피부에 이상반응이 나타나지 않는 것을 관찰 할 수 있었다.

도 3 내지 6은 비교예 1 내지 4에 따른 추출물을 사용하여 관찰한 경우로, 1차추출액(원료)의 에탄올 농도가 높아질 수록 사용한 추출물이 피부에 흡수되는 양이 줄어들고, 가려움 및 각질의 부작용이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 에탄올의 농도가 75%이상의 원료를 사용한 추출물일 경우 피부에 갈라짐이 발생하고 이에 따라 상처가 발생하는 것을 관찰할 수 있었다.

따라서, 본원발명에 따라 30% 미만의 알코올로 중대가리풀을 1차 추출하는 경우, 피부에 이상반응이 나타나지 않고 부작용이 발생하지 않는 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 농도에 따른 효과

2-1.발모효과

실시예 2 및 비교예 4의 추출물(CMX)에서 지표성분(Brevilin-A)의 농도에 따른 피부독성 및 발모효과를 평가하여 therapeutic window 기법으로 도 7 및 8에 나타내었다.

구체적으로 온도 23±3°C, 상대습도 50±10% 및 12시간 조명주기 조건에서 7일간 적응시킨 C57BL/6 암컷 마우스를 각 농도당 2마리씩 사용하였고, 제모제(니크린, 일동제약)를 사용하여 등 부위의 털을 제모한 피부를 사용하였다. 또한, 실시예 2 및 비교예 4에 따른 추출물(CMX)의 지표성분(Brevilin-A)을 0 내지 4mg/g의 농도로 도포하였고, 독성평가는 피부 이상반응을 관찰하여 점수로 매겨 백분율로 나타내었으며, 발모효과는 대조군(0mg/g) 대비 발모 개수를 백분율로 나타내었다. 대조군은 DMSO를 사용하였다(피부 이상반응 점수는 건조함:0.5, 각질:1, 가려움:2, 피부흡수율 저조:3점으로 측정하였고, 6.5점 만점을 기준으로 계산하였다).

도 7 및 8을 참조하면 실시예 2 및 비교예 4 모두 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 0.4mg/g으로 도포시부터 발모효과가 나타났으며, 2mg/g이상 도포시 발모효과가 50%이상 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

피부독성에 관하여 실시예 2에 따른 추출물(CMX25)을 사용한 도 7을 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 3mg/g으로 도포시부터 피부에 독성이 발생하기 시작하였고, 비교예 4에 따른 추출물(CMX95)을 사용한 도 8을 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 1.2mg/g으로 도포시부터 피부에 독성이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예 2에 따른 추출물은 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 0.4mg/g 내지 3mg/g 도포할 경우, 피부에 이상반응 또는 독성이 발생하지 않으면서 발모효과 또한 우수한 것을 알 수 있었으나, 비교예 4에 따른 추출물을 사용할 경우 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 0.4mg/g 내지 1.2mg/g에서 피부 이상반응 또는 독성이 발생하지 않음으로, 실시예 2는 비교예 4에 대비하여 지표성분(Brevilin-A)을 고농도로 사용이 가능하여 현저하게 우수한 발모효과를 가질 수 있음을 알 수 있었다.

2-2.항염효과

TNF-α발현억제를 통한 항염효과는 건선치료에 효과적으로 사용된다.

실시예 2 및 비교예 4의 추출물(CMX)에서 지표성분(Brevilin-A)의 농도에 따른 건선치료효과를 알아보기 위하여 Raw 264.7cell(마우스 대식세포)을 이용한 세포독성 및 항염효과를 평가하였으며 그 결과를 therapeutic window 기법으로 도 9 및 10에 나타내었다.

구체적으로 60mm 플레이트(plate)에 2Х10⁶cells/dish density로 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시킨 RAW 264.7 세포에 LPS(100ng/ml)를 처리한 후, 실시예 2 및 비교예 4에 따른 추출물의 지표성분(Brevilin-A)을 0 내지 96ug/ml의 농도로 처리한 다음, 24시간 배양 후 세포독성 및 항염효과를 평가하였다. 세포독성은 Cytotoxicity assay(세포독성시험)를 통하여 평가하였으며, 항염효과는 TNF-α발현억제효과로 평가하였으며 대조군 대비 TNF-α발현의 감소율을 백분율로 계산하였다. 대조군은 0ug/ml 농도의 위약을 사용한 것이다.

도 9 및 10을 참조하면 실시예 2 및 비교예 4 모두 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 0.5ug/ml에서부터 TNF-α발현억제효과가 나타났으며, 2ug/ml이상에서는 TNF-α발현억제효과가 90%이상 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

세포독성에 관하여 실시예 2에 따른 추출물(CMX25)을 사용한 도 9를 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 12ug/ml처리시부터 세포의 독성이 발생하기 시작하였고, 비교예 4(CMX95)에 따른 추출물을 사용한 도 10을 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 1.5ug/ml처리시부터 세포의 독성이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예 2에 따른 추출물은 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 0.5ug/ml 내지 12ug/ml로 처리될 경우, 세포에 독성이 발생하지 않으면서 TNF-α발현억제효과 또한 우수한 것을 알 수 있었으나, 비교예 4에 따른 추출물을 사용할 경우 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 0.5ug/ml 내지 1.5ug/ml에서 세포 독성이 발생하지 않음으로, 실시예 2는 비교예 4에 대비하여 지표성분(Brevilin-A)을 고농도로 사용이 가능하고 현저하게 우수한 항염효과를 가질 수 있음을 알 수 있었고 이에 따라 건선치료에도 효과가 있음을 알 수 있었다.

2-3.관절염 치료효과

wnt/β-catenin 신호전달계 조절 여부 및 세포 성장 인자의 발현은 관절염 치료에 효과적으로 작용한다.

실시예 2 및 비교예 4의 추출물(CMX)에서 지표성분(Brevilin-A)의 농도에 따른 관절염 치료효과를 알아보기 위하여 인간 유래 모유두 세포주(Dermal Papilla:DCP)세포를 사용하여 세포독성과 wnt/β-catenin 신호전달계 활성화 여부 및 세포 성장 인자의 발현 촉진 여부를 분석하였다.

구체적으로, 60mm 플레이트(plate)에 2Х10⁶cells/dish density로 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시킨 DCP세포에 LPS(100ng/ml)를 처리한 후, 실시예 2 및 비교예 4에 따른 추출물(CMX)의 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 0 내지 50ug/ml로 처리한 다음, 12시간 배양 후 세포독성과 wnt/β-catenin 신호전달계 활성화 여부 및 세포 성장 인자의 발현정도를 평가하였다.

먼저 세포독성은 Cytotoxicity assay(세포독성시험)를 통하여 평가하여 도 11 및 12에 나타내었으며, 대조군(control)은 CMX를 포함하지 않는 DMSO를 사용하였다.

실시예 2에 따른 추출물(CMX25)을 사용한 도 11을 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 25ug/ml처리시부터 세포의 독성이 발생하기 시작하였다. 반면, 비교예 4에 따른 추출물(CMX95)을 사용한 도 12를 참조하면, 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 6.25ug/ml처리시부터 약 20%이상의 세포 독성이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 2에서 세포 독성이 발생하기 시작한 지표성분(Brevilin-A)의 농도지점인 25ug/ml에서 비교예 4는 약 60%의 세포독성이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예 2에 따른 추출물은 지표성분(Brevilin-A)의 농도를 3.13ug/ml 내지 12.5ug/ml로 처리할 경우, 세포에 독성이 발생하지 않는 것을 알 수 있으나, 비교예 4에 따른 추출물을 사용할 경우 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 6.25ug/ml 미만으로 처리시에서만 세포 독성이 발생하지 않음으로, 실시예 2는 비교예 4에 대비하여 지표성분(Brevilin-A)을 고농도로 사용이 가능함을 알 수 있었다.

다음으로, wnt/β-catenin 신호전달계 활성화 여부 및 세포 성장 인자의 발현정도는 실시예 2의 추출물(CMX25) 농도에 따른 β-Catenin 및 성장인자 VEGF의 단백질 발현량을 웨스턴 블럿법으로 분석하여 하기 표 3과 도 13 및 14에 나타내었다.

구분 (kDa)	0μg/mL	1.56μg/mL	3.13μg/mL	6.25μg/mL	12.5μg/mL	25μg/mL	35μg/mL	40μg/mL	45μg/mL	50μg/mL
β-Catenin	1	0	1.1	1.2	1.5	2	2.5	3	4	5
VEGF	1	2	3	6	13	25	35	40	45	50

상기 표 3과 도 13 및 14를 참조하면 실시예 2에 따른 추출물(CMX25)에서 지표성분(Brevilin-A)의 농도에 의존적으로 β-Catenin 및 VEGF 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예 2에 따른 추출물(CMX25)은 지표성분(Brevilin-A)의 농도가 증가됨에 따라 β-Catenin 및 VEGF의 단백질 발현량을 증가시킬 수 있고, Wnt/catenin 신호전달계 단백질량이 증가함에 따라 분화에 관여하는 ERK의 인산화(활성화)가 증가하게 됨으로 스트레스에 의해 활성화되는 단백질인 p38의 인산화는 억제되는 것을 알 수 있었다.

이에 따라, 실시예 2에 따른 추출물(CMX25)의 지표성분(Brevilin-A)농도를 3.13ug/ml 내지 12.5ug/ml로 사용할 경우 세포에 독성을 발생시키지 않으며 wnt/β-catenin 신호전달계를 조절하고 세포 성장 인자의 발현을 촉진시킬 수 있음으로 관절염 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, 치료 대상에 따라 적절한 농도로 사용할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었다.

3. 농도에 따른 독성물질 평가

상기 표 2에 따른 실시예 2 및 비교예 1 내지 4에 따른 추출물에 헥산(Hexane)을 1:1의 비율로 혼합한 후 3시간 동안 교반 추출시킨 다음 상등액을 분리 수득 하여 480nm의 HPLC분석으로 불순물이 검출되는지 실험하였다.

검출하고자 하는 불순물은 Phenol유도체 또는 flavonoids계의 일종을 포함하는 것으로, 단백질 분해 효과를 가져 피부 또는 점막을 부식시킬 수 있고 이에 따라 피부염 또는 화상을 발생할 수 있다. 또한 호흡기를 자극할 수 있고 급성독성물질을 발생할 수 있는 부작용이 있다. 이러한 불순물들은 끈적임과 악취를 발생시킨다.

도 15 내지 18을 참조하면 실시예 2 및 비교예 2 내지 4에 따른 추출액에서 헥산을 첨가하기 전 모습으로, 에탄올의 농도가 높아질수록 탁해지는 색상과 악취가 발생하는 것을 확인할 수 있었고, 이에 따라 추출물의 성상에서 난용성 또는 불용성 물질을 포함하는 색상과 독한 냄새의 차이를 확인할 수 있었다.

도 19 내지 22를 참조하면, 실시예 2 및 비교예 2 내지 4에 따른 추출액에서 헥산을 첨가한 후 모습으로, 에탄올의 농도가 높아질수록 상등액이 탁해지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 2에 따른 추출물은 색상이 맑고 냄새가 없으며, 건조시 끔적거림이 없어 농축단계에서 필터하기에 용이하다는 평가가 있었다.

그러나, 비교예 3 및 4에 따른 추출물의 경우 색상에 녹색층이 많이 껴있고 악취가 존재할 뿐만 아니라 건조시 끈적거림이 심하여 농축단계에서 필터가 어려웠다는 평가가 있었다.

도 23 내지 26은 실시예 2, 비교예 1, 3 및 4에 따른 추출액에 대한 불순물을 분석한 것이고, 도 27 내지 30은 실시예 2, 비교예 1, 3 및 4에 따른 추출액에서 헥산을 첨가한 후 추출물의 상등액에 포함되어 있는 불순물을 분석한 것이다.

구체적으로 실시예 2에 대한 도 23 및 27을 참조하면 불순물이 전혀 나오지 않는 것을 확인할 수 있고, 비교예 3에 대한 도 25 및 29와 비교예 4에 대한 도 26 및 30을 참조하면 불순물이 현저하게 많은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 23 내지 30을 참조하면, CMX의 추출물을 필터하는 공정에서 헥산을 첨가하는 단계를 포함할 경우 추출물에서 불순물을 추가적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본원발명에 따라 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 에탄올로 추출한 경우, 피부 또는 세포에 독성이 발생하지 않을 뿐만 아니라 추출물에 불순물이 전혀 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, TNF-α발현억제 또는 항염효과를 가지고, wnt/β-catenin 신호전달계를 조절 또는 활성화하고 세포 성장 인자 발현 촉진효과뿐만 아니라 발모효과가 있는 것을 확인할 수 있었고 이에 따라 항염 및 자가면역 질환의 예방 또는 치료가 가능한 것을 알 수 있었다. 또한, 고농도로 사용이 가능함으로, 치료대상에 따라 적절한 농도로 사용하여 항염 및 자가면역 질환의 예방 또는 치료의 효과를 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 바에 있어서, 본 발명의 예시적인 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 다음에 기재하는 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (10)

1. 중대가리풀(Centipeda minima)을 30% 미만의 알코올로 추출한 추출물을 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 중대가리풀의 추출물은 5 내지 25%의 알코올로 추출되는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질알코올, 이소프로필알코올, 세테아릴알코올, 세틸알코올, 스테아릴알코올, 라우릴알코올, 미리스틸알코올 및 베헤닐알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상인 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 중대가리풀의 추출물은 중대가리풀 원료를 30% 미만의 알코올로 추출하여 1차 추출액을 제조하고, 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하고, 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 추출 방법에 따라 추출된 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Medium-chain　triglycerides, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG), Vitamin E TPGS, Miglyol 812 및 captax 355로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 중대가리풀의 추출물은 브레빌린 A(Brevilin A), 아르니콜라이드 D(Arnicolide D), 아르니콜라이드 C(Arnicolide C) 및 마이크로헬레닌 C(Microhelenin C)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 브레빌린 A는 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하며, 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호 작용(cytokine-cytokine receptor interaction), MAPK 신호 경로(MAPK signaling pathway) 및 PI3K-AKT 신호 경로(PI3K-AKT signaling pathway)를 저해 또는 억제하며, 상기 중대가리풀 추출물은 WNT 신호전달경로(WNT/β-catenin pathway)를 조절하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
8. 제6항에 있어서,
   상기 브레빌린 A의 함량은 상기 아르니콜라이드 D, 상기 아르니콜라이드 C 및 상기 마이크로헬레닌 C의 총함량보다 1.5배 이상인 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
9. 제6항에 있어서,
   상기 중대가리풀 추출물은,
   30 내지 90중량%의 상기 브레빌린 A;
   0 내지 40중량%의 상기 아르니콜라이드 D; 0 내지 20중량%의 상기 아르니콜라이드 C; 및 0 내지 15중량%의 상기 마이크로헬레닌 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
10. 제1항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 탈모, 원형탈모, 류마티스 관절염, 건선, 아토피, 습진, 지루성 피부염, 피부경화증, 피부면역 과민증, 다발성 경화증, 루푸스, 베체트병, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 크론병 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 자가면역 질환 예방 및 치료용 조성물.