KR20160139632A

KR20160139632A - 생리활성을 가지는 달래추출물

Info

Publication number: KR20160139632A
Application number: KR1020150074854A
Authority: KR
Inventors: 주동조; 배은영; 이준원
Original assignee: 배재대학교 산학협력단; 주동조
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2016-12-07

Abstract

본 발명은 달래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항염 또는 항암 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 본 발명은 달래 추출물을 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물을 물, 에틸아세테이트, 헥산 등의 각기 다른 극성의 용매로 분획추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 달래 추출물은 항산화활성이 우수하고, 동시에 암세포의 세포 증식을 억제하여 암을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있어 이를 이용한 의약부외품, 화장료 제조 및 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

생리활성을 가지는 달래추출물{Allium monanthum extracts of biological activity}

본 발명은 항산화 및 항암 효과를 갖게 제조되는 특징으로 하는 달래추출물 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법으로 제조된 달래 추출물 및 달래 추출물을 이용하여 제조된 화장료 조성물에 관한 것이다.

종양은 자율적인 과잉 증식을 나타내는 세포의 집합으로서, 죽음에 이르게 할 가능성이 있는 악성종양과 그렇지 않은 양성종양으로 구별된다. 특히, 암은 발암유전자(oncogene) 및 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)와 같은 유전자에 변이(mutation)가 일어나서 발생하는 유전적 질환이며, 세포 차원에 원인이 있는 질환이다. 암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다.

악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다. 지금까지 수술법, 화학요법제 및 방사선조사법 등과 같은 암치료법들이 연구되어 왔으며, 5-풀루오로우라실(fluorouracil; 5-FU)는 수용성 불소치환 피리딘 유도체(water-soluble fluorinated pyrimidine analog)로서 항종양제로서 널리 사용되고 있는 약물이다(Kim et al., 2012). 이는 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등과 같은 고형암에 단독 또는 류코보린(leucovorin; LV)와의 조합으로 암치료에 사용되고 전신순환으로 혈장 반감기가 10 내지 20분인 약물로서(Kanetaka et al., 2012) 골수 쇠약, 위장관 반응, 백혈구감소증 및 혈소판 감소증 등과 같은 부작용을 유발할 수 있다(Wettergren et al., 2012).

현재 전 세계적으로 면역력 증강을 통해 건강을 증진시키고자 많은 천연물이 사용되고 있다. 천연물 유래의 약품은 질병의 예방과 치료를 위한 활성성분에 초점이 맞추어져 왔다. 동의보감 등 과거 한의학 서적에 천연물들에 대한 효능은 언급되어 있지만, 문헌에 의한 정보가 현재의 특정 질병이나 증상과 접목돼 있는 것은 아니다. 또한 천연물의 성분 중 어느 성분이 직접적인 효과를 내는지는 밝혀지지 않았다. 동의보감이나 중의학 대사전에 수록된 천연물들 중 면역증강효과가 있는 것으로 알려져 있는 천연물들을 직접 생약으로 이용하기보다는 식물 중에 함유된 생리활성작용을 나타내는 물질을 분리 추출하여 사용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 천연물 중에 생리활성을 나타내는 물질로 토고페롤, 페놀성 물질, Maillard 형 갈변 생성물, 아미노산, 펩타이드 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

달래(Allium monanthum Max.)는 백합과(Liliacase)의 파속(Allium)에 속하는 다년생 초본식물로, 한국, 일본, 중국 및 몽고 등 동북아시아 지방에 널리 분포하고 있는 야생식물이다. 달래가 함유하고 있는 일반 성분으로는 전초에서 칼슘, 인, 철 등 무기질, 아니노산은 구에서 14종이, 뿌리에서 15종 및 잎에서 9종이 분리되어 확인되었다. 또한, 잎과 구에서 과당(fructose), 포도당(glucose), 자당(sucrose)과 맥아당(maltose) 등 당과 비타민 등이 보고되었다.

달래는 식용뿐만 아니라 약용으로도 널리 이용되어 있고, 주요 약효로는 살균, 지혈, 보혈, 신경안정 등의 효능이 있는 것으로 알려진 것으로는 마늘, 양파(Allium sativum)의 알리인 분해효소 작용으로 양파 냄새가 나는 식물성분인 알리인(alliin)이 있으며, 이것은 3-(2-프로페닐설피닐)-L-알라닌, S-알릴-L-시스테인 황산화물로 불리기도 한다. 또한, 메틸알리인(methyl alliin), 스코로도오스(scorodose)가 항균 활성이 있는 성분으로서 보고된 바 있다(Shanghai Science & Technology Press (1985) In "Encyclopedia of Chinese Drugs",pp. 226, Shogakukan, Tokyo, Japan.).

달래에 관한 주된 연구로는 분류학적 연구와 재배연구 및 살균작용에 대한 연구 등이 있으며, 달래를 장기간 투여했을 때 흰쥐의 혈청의 지질, 당 및 단백질 함량에 영향을 미친다는 보고가 있다. 또한 달래의 성분 중, 다수의 글리코실글리세리드(glycosylglyceride)의 화합물은 항암, 고지혈증 개선과 관련된 연구 등이 있다. 그러나 아직까지 달래의 산업적 유용성을 보다 증대시키기 위해 달래로부터 추출물 수득과정에서 항염 활성 및 항암 활성을 최대화할 수 있는 달래의 분획추출물에 대한 내용은 보고된 바 없다.

한편 달래의 유효성분 분석만을 확인하기 위한 안 등(J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. Vol. 43, No. 4, pp. 314~316 (2000))의 연구에서는, 달래를 100%의 메탄올을 이용하여 폴리페놀을 1차 추출하고, 이를 5% 염산/메탄올 용액을 이용하여 산가수분해 한 후 중화제를 이용하여 중화하였고, 이후 감압, 농축과정을 거친 추출물로부터 2종의 플라보노이드 배당체 성분을 실리카겔 칼럼추출을 통하여 유효성분을 추출할 수 있었던 것으로 확인된 달래의 n-부탄올 분획추출법 및 분석에 관한 연구보고가 있었을 뿐, 달래 추출물에 있어서 항산화 효과에 부가하여 현저한 항암효과를 갖는 보고는 없었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1211937호 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0084209호

"식용 식물자원으로부터 활성물질의 탐색-III. 달래(Allium monanthum Max.)로부터 flavonoid 배당체의 분리", J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. Vol. 43, No. 4, pp. 314~316 (2000).

면역기능의 저하는 외부로부터 항원에 대한 처리기능의 저하로 인해 생체의 균형을 유지하는 항상성을 깨트리면서 악성 종양을 비롯한 다양한 질병의 원인이 된다고 알려져 있다. 특히, 나이가 들수록 이러한 현상의 심각성은 한층 더 두드러지게 나타나 다가오는 고령화 사회에 많은 문제점을 제시하고 있다. 생체의 면역응답에 대한 능력은 노화 (aging)되어 갈수록 저하되어 간다는 것은 잘 알려져 있다. 또한 나이가 들수록 암에 걸릴 확률도 점차로 높아지며 특히 간장 및 호흡기 계통의 암의 발생 빈도가 크게 증가하고 있다고 보고되고 있다.

암은 발견시 이미 병이 진행되어서 수술로 완치가 불가능한 경우가 많으며, 이러한 경우 항암제 치료나 방사선 치료 등을 시도하지만 그 효과가 좋지 않고 부작용 또한 적지 않아 만족할 만한 치료법이 되지 못하고 있다. 따라서 항암제와 함께 사용되어 항암제의 부작용을 줄이거나 항암효과를 증가시켜 치료효과를 높이고 생물학적 반응을 조절할 수 있는 보조약제에 대한 연구가 필요하다.

달래(Allium monanthum)는 백합과(Lillium) 에 속하는 다년생 알뿌리 식물로 독특한 향기와 맛으로 예로부터 널리 이용되어왔으며 살균, 지 혈, 신경안정, 해독, 건위, 건뇌 작용으로 식용뿐 만이 아니라 약용으로도 이용되어 왔고, 달래를 흰쥐에 투여했을 때 흰쥐의 식이효율과 HDL-콜레스테롤 및 인지질을 증가시키고, 혈청 총 콜레스테롤과 혈당을 감소시켜, 동맥경화증이나 당뇨병 등의 성인병 예방에 효과가 있음이 증명된 바 있다. 하진만 다양한 달래의 성분을 포함하는 달래의 분획추출물에 대한 항산화 효과와 항암효과에 대한 연구결과가 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 달래 추출물을 활성성분으로 포함하는 항산화 및 항암효과를 가지는 추출물을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 화합물은, 건조된 달래 바람직하게는 달래를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 15배의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올로, 상온(20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 30℃) 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 20시간 내지 30 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후 감압 농축하여 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 물에 현탁한 후, 에틸 아세테이트 및 물로 각각 추출하는 제 2단계의 제조 공정을 통해 본 발명의 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 항암효과를 가지는 달래 추출물에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 달래를 유효성분으로 함유한 추출물에 대한 간암, 대장암, 전립선암의 항암 효과 활성을 가지는 추출물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 물층의 세포활성도 실험(cell viability, CCK-8 assay)을 나타내는 그래프
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 에틸아세테이드층의 세포활성도 실험(cell viability, CCK-8 assay)을 나타내는 그래프
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 헥산층의 세포활성도 실험(cell viability, CCK-8 assay)을 나타내는 그래프
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 달래 추출 분획물의 항암효과를 나타내는 DMEM 세포배양 배지 이미지

<실시예 1> 본 발명에 따른 달래 추출물의 제조

본 실험에 사용된 건조된 달래를 예산에서 2.4kg을 구입하여 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh)이하가 되도록 분쇄하였다. 이것을 15ℓl의 80% 메탄올 용액에 가한 다음 상온(24℃)에서 24 시간 동안 환류 냉각하여 1차 추출하였다. 상기 잔재를 동일한 방법으로 이후 2회 추가 추출한 후 1차 추출물에 첨가하여 최종 추출물로 하였다. 상기의 최종 추출액을 여과 및 동결 건조하여 달래 조추출물(137 g)을 수득하였다. 천연물연구의 초기단계인 추출 및 분리과정에 있어서 미지의 신규 물질 검색 등의 다소 학문적인 접근과 기존의 이미 그 생리활성 등이 익히 알려진 천연물성분에 대한 생산 및 산업화 관련 연구 및 생산 측면에서의 추출 및 분리법이 있다. 일반적으로 흔히 사용하는 계통적 추출법은 석유 ether, Et₂O, CHCl₃, MeOH, EtOH, H₂O의 순으로 추출한다. 그러면 식물재료에 들어 있는 유기화합물 중에서 비극성물질로부터 차차 극성이 큰 물질 순으로 추출되어 나온다. 용매 추출은 비극성 및 극성 용매를 사용할 수 있는데, 비극성의 대표적인 용매는 헥산 (n-hexane)이 있고, 극성 용매로는 알코올 (보통 methyl alcohol이나 ethyl alcohol), 중간 정도로는 아세트산에틸(ethyl acetate)이 있다. 메탄올(methyl alcohol)은 일반적으로 식물체에서 생리활성 물질 추출에 가장 많이 사용하는 용매로써, 다양한 성분의 추출에 용이할 뿐만 아니라, 추출 후 분리 정제하는 것이 용이하다. 따라서, 어떤 시료에 대해서 생리활성을 검정하고자 할 때는, 통상 메탄올로 추출한 후, 다음 단계로 진행한다. 메탄올 추출물은 바로 농축하여, 동결건조를 하면 메탄올 추출 건조 분말을 얻을 수 있다.

상기의 방법으로 수득한 달래 조추출물(137g)을 물 (2ℓ)에 현탁한 후 분액 깔대기에 넣어 세 가지 층의 분액추출을 진행하였다. 분액 추출은, 헥산과 에틸아세테이트를 2회에 걸쳐 2l씩 가한 다음 진탕 한 후 각각의 추출액에 의해 분리된 가용부를 얻었다. 각각의 가용부를 감압농축기로 농축하였다. 상기의 방법으로 수득한 달래의 헥산 가용 추출물은 약 30g 이었고, 에틸 아세테이트 가용 추출물은 약 30 g 이었으며 물 가용 추출물은 약 80g 이었다.

상기의 방법으로 항산화 효과를 가지는 추출물은 총 중량에 대하여 0.1 ~ 30% 중량으로 함유되는 것을 특징으로 하며, 나머지 70%의 성분에는 탄닌과 폴리사카라이드 및 페논컴파운드 성분 등이 포함된다.

<실시예 2> 본 발명에 따른 달래 추출물에 대한 항산화 시험

상기 실시예 1에서 수득된 헥산과 에틸아세테이트 및 물에 의해 추출된 달래 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화 측정법은 DPPH, ABTS, FRAP 측정법, 총 폴리페놀 화합물 함량 분석법을 이용하였다.

<2-1> DPPH 라디칼 소거 활성 분석

체내에서 생성되는 활성산소의 양을 직접 측정하거나 활성산소(oxygen free radical) 흡수 능력을 평가하는 방법이 활성산소 소거 능력을 측정할 수 있는 가장 이상적인 방법이지만, 이러한 방법들은 대부분 특별한 장비와 고도의 기술 그리고 많은 시간이 요구되므로, 많은 시료의 활성을 측정하는데에는 한계가 있다. 이러한 측면에서 DPPH (1,1-diphenyl-picrylhdrazyl) 라디칼 소거활성 측정법은 빠르고, 간단하며 가장 경제적으로 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법으로 잘 알려져 있다. DPPH 라디칼 소거활성법은 시료의 자유 라디칼(free radical) 소거 능력이나 수소 공여능력을 평가하는 방법으로서 식품을 비롯한 여러 분야에서 널리 이용되고 있다. 대부분의 라디칼은 반응성이 켜서 매우 불안정하지만, DPPH 라디칼은 안정한 자유 라디칼로써 517 nm에서 강한 흡수를 가지는 진한 보라색의 화합물이다. 하지만, 자유 라디칼을 소거할 수 있는 항산화제로부터 수소를 공여 받아 DPPHn이 되면 노란색으로 변화되어 517nm에서 흡광도가 감소되므로 이러한 원리를 이용하여 시료의 항산화 활성을 간단하게 측정할 수 있다. 항산화 활성은 DPPH를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하는 Blois 법(Blois, 1958)을 활용하였다.

각 추출물을 농도별로 제조한 시료 1 mL에 0.2 mM DPPH 용액 1 mL를 가한 뒤 볼텍스 믹서로 10초간 진탕하고 암실에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기존의 항산화제인 BHA를 대조구로 사용하여 비교하였다.

(E : 실험군, B: 블랭크, C : 대조군)

시 료		DPPH (%)
달 래	물 추출물	38.3±0.7
	에틸아세테이트 추출물	52.3±0.4
	헥산 추출물	37.6±0.2
BHA		90.8±0.5

DPPH 법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과 표1에서와 같이, 달래의 추출물들의 자유라디칼 소거율이 기존 항산화제인 BHA에 비해 높은 값을 나타내지는 않으나, 에탄올 추출물에서 약 14% 정도 높은 값을 나타냄으로써 에틸아세테이트 추출에의한 추출물이 달래의 추출성분 중 항산화 성분을 비교적 높게 나타낸 것으로 확인되었다.

<2-2> ABTS 라디칼 소거 활성 분석

총 항산화력 측정은 ABTS 라디칼 소거능 측정방법에 따라서 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS와 140 mM 과황화칼륨(potassium persulfate) 용액을 혼합 하여 하루 동안 어두운 곳에 방치하여 ABTS·+를 형성시켰다. 이후 이 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 0.7 ±0.02 가 될 수 있도록 에탄올로 희석하였다. 희석된 ABTS·+ 용액 1 mL에 methanol로 20 mg/mL의 농도로 희석된 추출액 50 ㎕를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 3분 후에 측정하였다.

표 2에 50%의 ABTS 라디칼 소거능(ABTS IC₅₀)을 나타내는 값을 구하였으며 상기의 방법으로 대표적 항산화제인 비타민 C와 비교한 ABTS 검출양 결과를 나타내었다.

시 료		ABTS (IC₅₀mg/mL)
달 래	물 추출물	2.8±0.1
	에틸아세테이트 추출물	0.50±0.1
	헥산 추출물	5.54±0.1
비타민 C		0.05±0.1

ABTS 라디칼 소거능에서는 비극성 용매인 헥산으로 달래의 활성성분을 추출하였을 때가 극성인 물의 추출물 보다 약 2배 이상의 높은 항산화 특성을 보여 주고 있으며, 이 값은 대조군 시료인 비타민 C보다 약 100배의 높은 값을 보여주고 있다.

<2-3> FRAP 소거 활성 분석

FRAP(The Ferric Reducing Ability of Plasma) assay에 사용된 시약은 0.3 M 아세테이트 완충액(pH 3.6)과 40 mM 염산(HCl)로 용해시킨 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-S-triazine) 용액, 그리고 20 mM 염화제이철(FeCl₃ ₎ 용액을 사용하였다. 미리 제조된 초산나트륨(sodium acetate) 완충용액과, TPTZ 용액 및 염화제이철(FeCl₃)용액을 각각 10 : 1 : 1 (부피비 , v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃에서 10 분간 배양시켜서 FRAP 시료를 준비하였다. FRAP 시료 900 ㎕를 메탄올을 이용하여 20 mg/mL의 농도로 맞춘 시료 30 ㎕와 증류수 90 ㎕를 볼텍스 믹서를 이용하여 혼합한다. 이후 37℃에서 10 분간 방치한 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 결과를 표 3에 나타내었다.

시 료		FRAP (mM)
달 래	물 추출물	125.8±5.3
	에틸아세테이트 추출물	458.8±5.9
	헥산 추출물	319.1±2.9
비타민 C		68,137.5±6.2

FRAP 시험방법을 통하여 달래의 항산화력을 측정한 결과, 에틸아세테이트를 이용한 달래의 추출물이 헥산의 추출물이 나타내는 항산화력 보다 경미한 차이를 보였고, 이는 가장 높은 값을 나타내고 있는 대조군인 비타민 C와 큰 차이를 갖는 것이 었다.

총 폴리페놀 화합물 함량(TPC)은 Folin-Ciocalteu의 방법을 사용하여 분석하였다. 각 추출물 및 분획물을 메탄올로 희석한 시료 0.1 mL에 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.2 mL을 첨가하고 23℃에서 1분간 유지시켰다. 그 후 5% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 3 mL을 가하여 23℃에서 1시간 방치 후 분광 광도계 (UV-1800, Shimadzu Co.,Kyoto, Japan)을 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 탄닌 성분을 포함하는 갈산(gallic acid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산하여 표 4에 나타내었다.

시 료		TPC(mM)
달 래	물 추출물	92.5±2.2
	에틸아세테이트 추출물	69.7±1.6
	헥산 추출물	26.5±0.9

건조된 달래의 물을 이용한 추출물은 에틸아세테이트나 헥산 추출물과 비교하여 높은 폴리페놀 함량을 갖는 것으로 나타났다. 이것은 폴리페놀 성분이 극성이 강한 물에서 더 잘 추출되는 특성을 보여 주는 것으로 극성이 약한 헥산 추출물의 3배 이상의 추출 함량을 나타내었다.

달래의 분획별 항산화 유효성분의 평가 방법으로서 사용된 DPPH, ABTS, FRAP assay, TPC의 분획별 검출 결과를 통하여 에틸아세테이트를 이용한 달래의 추출방법으로는 DPPH와 FRAP assay 법에서 가장 높은 빈도의 항산화 활성을 갖는 결과를 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 본 발명에 따른 항암 활성 분석

<3-1> 암세포주 배양

본 발명의 실시예 1에서 분획한 본 발명에 따른 달래 추출분획물에 대해 항암 활성이 있는지를 조사하기 위해 4가지 암세포에 대한 암세포 증식 억제 효과를 분석하였다.

본 발명에 사용한 암세포주는 먼저, 인체 상피 세포주인 HaCaT(Kera tinocyte) 세포와 인체 간암 세포주인 HePG2(Hepatocarcinoma)과 인체 대장암 세포주인 HCT 116(Colon carcinoma) 및 인체 전립선암 세포주인 CP3(Prostatic carcinoma) 이용하였다.

HaCaT 세포와 HCT 116 세포와 및 PC3 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. HepG2 (Hepatocarcinoma)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에서 분양 받아 사용하였다.

분주 받은 각각의 세포주를 10% FBS (fetal bovine serum)과 100 units/mL 의 페니실린(penicillin)과 10 ㎍/ml의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM (Invitrogen, Carlsbad. CA) 배지를 사용하여 5% CO₂ 를 함유한 37℃ 배양기에서 배양하였다. 2주 이상 계대 배양하여 배양환경에 충분히 적응시킨 후 세포 밀도가 70 ~ 80 % 정도로 포화되면 0.05% trypsin-EDTA 용액을 사용하여 5분간 처리후 계대배양하면서 분석을 실시하였다.

<3-2> CCK -8 assay 를 이용한 암세포주 성장 억제효과 측정

추출물의 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위한 세포생존율(cell viability) 측정을 위한 방법중 유기화합물의 호흡 반응에 필요한 산화환원 반응의 촉매로서 탈수소효소(dehydrogenase)를 분석하여 미생물 활성의 측정에 의한 이용하기 위해 세포수 측정 키트인 CCK-8(Dojindo, Kumamoto, Japan)을 실시하였다. CCK-8은 무색에 가까운 테트라졸리움염(tetrazolium salt, WST-8*)을 이용한 것으로 96-well plate에서 48시간 동안 배양된 HaCaT, HepG2, HCT116, PC3 세포에 분획한 시료를 각각 50, 100, 250 ㎍/ml으로 처리하고 48시간동안 배양한 후 각 well에 CCK-8을 가하고 1 시간동안 추가로 배양한 후에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

상기와 같은 방법으로 측정된 암세포 억제효과를 달래 추출물의 함량변화에 따른 결과를 물 추출물과 에틸아세테이트 추출물 및 헥산 추출물로 구분하여 도 1에서 3에 나타내었다.

각각의 분획 추출물의 농도별 첨가결과, 시료의 농도가 증가할수록 모든 암세포주에서 증식 억제효과가 증가하는 것이 확인되었다.

달래 추출물의 물 가용 추출물을 이용한 경우 250 ㎍/ml로 처리량을 증가시켰을 경우 대장암 세포주인 HCT 116에서 현저한 억제 효과를 나타내었다.

물 가용 추출물에 의한 세포억제 효과와 비교하여 도 2의 에틸아세테이트 가용 추출물의 경우, 각각의 암세포주에 100 ㎍/ml 이상 처리하였을 때 암세포 생존율을 25% 감소하는 것으로 나타났고, 250 ㎍/ml 를 처리하였을 때 모든 암세포주에서 현저한 암세포 생존율 저하 효과를 나타내었다. 특히, 대장암 세포주인 HCT116의 경우는 50%의 세포 생존율 저하를 보여줌으로써 달래의 에틸아세테이트 가용 추출물의 현저한 항암효과를 나타내었다.

달래의 물 및 에틸아세테이트 가용추출물의 암세포주 처리효과와 비교하여 달래의 헥산 가용추출물의 경우는 100 ㎍/ml 이상 처리하였을 경우 모든 암세포주의 생존율 저하에 현저한 효과를 나타내었으며, 특히 대장암 세포주인 HCT 116에의 처리 결과에서는 100 ㎍/ml 이상 처리한 것 만으로 30% 미만의 세포 생존율을 보임으로서 높은 항암 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 250 ㎍/ml 이상의 달래의 헥산 가용추출물의 처리결과에서는 HepG2, HCT116, PC3에의 처리 결과에서 모두 50% 이하의 낮은 세포 생존율을 나타내었고, 특히 대장암 세포인 HCT116과 전립선암 세포주인 PC3에의 처리 결과에서 25%의 세포 생존율을 나타냄으로써, 이들 암세포주의 성장억제에 효과적인 특징을 나타내었다.

상기의 분석결과, 달래 추출물의 분획별 항암효과를 나타내기 위해 각각의 추출물을 250 ㎍/ml 씩 배양된 HaCaT, HepG2, HCT116, PC3 세포주에 처리한 세포배양 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 현미경으로 관찰하여 도 4에 나타내었다. 도 4로 부터, 달래의 헥산 가용 추출물의 경우 대장암 세포주인 HCT 116과 전립선암 세포주인 PC3에 대하여 암세포 소거가 대조군에 비하여 현저하게 나타나고 있는 것을 확인 할 수 있었고, 달래의 물과 에틸아세테이트 가용 추출물의 처리에 있어서도 대조군과 비교하여 암세포 소거에 있어서 대별되는 차이를 확인할 수 있었다.

이상의 메탄올 80%로 추출한 달래의 조추출물을 이용한 물과 에틸아세테이트, 헥산의 가용 추출물에 대한 항암효과를 분석한 결과 달래의 항암효과를 확인할 수 있었고, 각각의 분획 추출물로부터 유효성분의 효과적인 추출이 진행되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 본 발명에 따른 달래 추출물을 이용한 화장류의 제조

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 각종 공지의 성분 등을 추가하여 영양화장수, 유연화장수, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 워터, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 팩, 스프레이, 파우더의 제형 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔, 팩인 경우, 공지의 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀롤로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더인 경우, 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 비방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 스르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀롤로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 세정제인 경우, 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이 외에도 본 발명의 화장료 조성물은 통상적인 공지된 성분인 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등이 이용할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있고, 사용 대상에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

<4-1>달래추출물을 이용한 영양화장수 제조

제형의 일예로서 하기 표5의 조성 및 하기 제조방법으로 실시예 1의 달래 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수 제제예를 제조하였다. 표5의 10, 11, 13 및 16을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하고 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 12를 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 표제의 화장품을 수득하였다.

성분	원료	함량(중량%)
1	달래 추출물 (실시예 1)	20.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량
17	물	-

<4-2> 달래추출물을 이용한 유연화장수 제조

제형의 일예로서 유연화장수는 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기 표6의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

성분	원료	함량(중량%)
1	달래 추출물	5.0
2	에탄올	5.0
3	베타인	3.0
4	디엘 판테놀	3.0
5	세붐-A	1.0
6	알부틴 페이스트	2.0
7	아네노신	2.0
8	에코검	0.03
9	글리세린	4.0
10	콜라겐	1.0
11	식물추출물	5.0
12	방부제	미량
13	정제수	잔량

<4-3> 달래추출물을 이용한 영양크림 제조

제형의 일예로서 영양크림은 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기 표7의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

성분	원료	함량(중량%)
1	달래 추출물 (실시예1)	10.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트 /글리세릴스테아레이트 /폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카플릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	칼르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량

<4-4> 달래추출물을 이용한 마사지 크림 제조

제형의 일예로서 영양크림은 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기 표8의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

성분	원료	함량(중량%)
1	달래 추출물	5.0
2	밀납	10.0
3	폴라솔베이트	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.8
5	유동파라핀	40.0
6	스쿠알란	5.0
7	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
8	글리세린	5.0
9	부틸렌글리콜	3.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	트리에탄올아민	0.2
12	방부제	미량
13	색소	미량
14	향료	미량
15	정제수	잔량

<실시예 5> 본 발명에 따른 달래 추출물을 이용한 식품의 제조

<5-1> 식품 제형예 1 : 연질캅셀제

제형의 일예로서 연질캅셀의 건강기능식품은 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

달래 추출물 300mg, L-카르니틴 80mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1캡슐당 400mg씩 충진하여 연질캅셀을 제조하였다.

<5-2> 식품 제형예 2 : 정제

제형의 일예로서 정제의 건강기능식품은 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

달래 추출물 300mg, 갈락토올리고당 150mg, 유당 100mg 및 맥아당 150mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester)를 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하여 정제를 제조하였다.

<5-3> 식품 제형예 3 : 과립제

제형의 일예로서 과립제의 건강기능식품은 실시예 1의 달래 추출물을 함유한 하기의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

달래추출물 300mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 450mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.

<5-4> 식품 제형예 4 : 드링크제

제형의 일예로서 드링크제의 건강기능식품은 실시예1의 달래 추출물을 함유한 하기의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

달래 추출물 300mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 충진한다. 병에 충진한 후 130℃ 에서 4~5 초간 살균하여 음료를 제조하였다.

<5-5> 식품 제형예 5 : 캬라멜제 제형

제형의 일예로서 캬라멜제의 건강기능식품은 실시예 1의 달래 추출물을 함유한 하기의 조성 및 하기 제조방법으로 제조하였다.

달래추출물 10g, 옥수수 시럽(corn syrup) 1.8g, 탈지우유 1.0g, 대두 레시틴 1.0g, 버터 0.6g, 식물성 경화유 0.4g, 설탕 1.4g, 마가린 0.58g, 및 식염 20mg을 혼합하여 캬라멜 성형을 하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

달래 추출물을 유효성분으로 포함하고,
건조된 달래를 분쇄하는 공정;
분쇄된 달래와 용매를 혼합; 상기의 혼합된 용액을 온도와 시간을 조절하여
추출;
상기의 추출된 용액을 감압 농축; 동결건조하는 것으로 구성된 달래조추출물
을 제조하는 공정;
상기의 달래조추출물을 물에 현탁하는 공정;
상기의 현탁된 달래조출물을 용매로 분획추출하는 과정으로 구성된 방법으로
제조된 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 달래조추출물을 제조하는 과정에서 달래 건조 중량과 물의 비율이 1:20의 중량비에서 1:3 사이의 값의 비율로 물과 혼합하여 달래조추 출물을 얻는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효성분으로 하는 조성물의 제 조 방법.
제 1항에 있어서, 달래와 용매의 혼합용액을 제조하는 과정에서 알코올과 물 의 중량비가 1:15에서 4:5 사이의 값의 비율로 달래와 혼합하여 달래조출물 을 얻는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효성분으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 달래와 용매의 혼합용액을 20℃에서 100℃사이의 추출온도 에서 추출하는 과정으로 구성된 달래조추출물을 얻는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효성분으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 달래와 용매의 혼합용액을 1시간에서 10일 사이의 기간동안 추출하는 과정으로 구성된 달래조추출물을 얻는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효성분으로 하는 조성물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 달래와 용매의 혼합용액을 냉침 추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 중의 하나로 구성된 달래조추출물을 얻는 방법으로 제 조된 달래 추출물을 유효성분으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 달래와 용매의 혼합용액을 추출하는 방법에 있어서 1회에 서 10회 사이의 추출 회수로 추출하는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효 성분으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 물과 현탁된 달래조추출물을 에틸 아세테이트, 헥산 및 물 중 하나의 용매로 분획추출하는 방법으로 제조된 달래 추출물을 유효성분으 로 하는 조성물의 제조 방법.
달래 추출물을 0.1 ~ 30% 중량% (전체 조성물 총량을 100 중량% 기준으로 할 때) 함유하는 항염 개선 효능이 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 추출물을 포함한 화장료 조성물은 유연화장수, 영양 화장수, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 워터, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 팩, 스프레이, 파우더의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
달래 추출물을 0.1 ~ 30% 중량% (전체 조성물 총량을 100 중량% 기준으로 할 때) 함유하는 간암, 대장암, 전립선암의 예방 효능이 있는 것을 특징으로 하 는 식품 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 추출물을 포함한 식품 조성물은 연질캅셀제, 정제, 과립제, 드링크제 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 식품 조성물