KR101282833B1

KR101282833B1 - 신규한 히스톤 디아세틸라제 저해제로서의 치환된프로페닐피페라진 유도체

Info

Publication number: KR101282833B1
Application number: KR1020077001641A
Authority: KR
Inventors: 브란트 스벤 프란시스커스 애너 반; 이멜런 크리스토프 반; 패트릭 르네 앙지바우드; 로렌스 프랑스와즈 바나뎃 마르코넷-디크레인; 자닌 아츠
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2004-07-28
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2013-07-08
Also published as: MY142831A; ATE432274T1; TW200616998A; WO2006010749A2; DK1776358T3; ES2327253T3; WO2006010749A3; EA200700143A1; NZ552758A; HRP20090439T1; TWI394752B; SI1776358T1; AU2005266311B2; CA2572971C; BRPI0513891B1; EP1776358A2; EA011932B1; JP5279268B2; PL1776358T3; AU2005266311A1

Abstract

본 발명은 히스톤 디아세틸라제 (HDAC)를 저해하는 효소 활성을 갖는 일반식 (I)의 신규한 화합물, 이의 제조방법, 이를 함유하는 조성물, 및 약제로서의 이의 용도를 포함한다:

상기식에서, R¹, R², R³, R⁴ 및 X는 청구의 범위의 제 1 항에 정의한 바와 같다.

Description

신규한 히스톤 디아세틸라제 저해제로서의 치환된 프로페닐피페라진 유도체 {Substituted propenyl piperazine derivatives as novel inhibitors of hitone deacetylase}

본 발명은 히스톤 디아세틸라제 (HDAC)를 저해하는 효소 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 제조방법, 이를 포함하는 조성물, 및 시험관 내 및 생체 내에서 HDAC를 저해하고, 약제, 예를 들면 암 및 건선 등의 증식 상태를 저해하는 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

핵히스톤은 유전자 전사, 및 복제, 수복, 재조합 및 염색체 분리 등의 다른 DNA 주형 프로세스를 조절하는데 관여하는 기관의 필수적인 강력한 성분이다. 이들은 아세틸화, 인산화, 메틸화, 유비퀴틴화, 및 ADP 리보실화 등의 변역후 변형의 대상이다.

본 명세서에서 "HDACs"로 명명되는 히스톤 디아세틸라제는 코어 뉴클레오솜 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 등의 단백질의 리신 잔기에 대한 아세틸 변형의 제거를 촉진시키는 효소이다. 본 명세서에서 "HATs"로 명명되는 히스톤 아세틸트란스페라제와 함께, HDACs는 히스톤의 아세틸화 레벨을 조절한다. 뉴클레오솜 히스톤의 아세틸화의 밸런스는 많은 유전자의 전사에서 중요한 역할을 한다. 히스톤의 하이포 아세틸화는 유전자 전사의 억제를 가져오는 응축 크로마틴 구조와 관련되어 있는데 반해, 아세틸화된 히스톤은 더욱 개방된 크로마틴 구조 및 전사 활성화에 관련되어 있다.

구조적으로 관련이 있는 11개의 HDACs가 기재되어, 2개의 부류로 나뉘어져 있다. 부류 I HDACs는 HDAC 1, 2, 3, 8 및 11로 구성되는 반면에, 부류 II HDACs는 HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10으로 구성된다. 제 3 부류의 HDACs 멤버는 부류 I 및 부류 II HDACs에 구조적으로 관련되어 있지 않다. 부류 I/II HDACs는 아연 의존성 메카니즘에 의해 작용하고, 부류 III HDACs은 NAD 의존성을 나타낸다.

히스톤 이외에, 다른 단백질도 아세틸화의 기질, 특히 p53, GATA-1 및 E2F 등의 전사 인자; 글루코코르티코이드 수용체, 티로이드 수용체, 에스트로겐 수용체 등의 핵내 수용체; 및 pRb 등의 세포 주기 조절 단백질이다. 단백질의 아세틸화는p53 안정화 등의 단백질 안정화, 보인자 채용 및 증대된 DNA 결합과 관련되어 있다. p53는 DNA 손상 등의 각종 스트레스 신호에 응답하여 세포 주기 정지 또는 아폽토시스를 유발할 수 있는 종양 억제 인자이다. p53로 유발된 세포 주기 정지에 대한 주된 대상은 p21 유전자인 것 같다. p53, p21에 의한 이의 활성화 다음에, 사이클린/사이클린 의존성 키나제 복합체와 협력하여 동정하면, G1 및 G2 상에서 세포 주기 정지 , 노화 시의 상방 조절, 및 증식성 세포핵 항원과의 상호작용을 가져온다.

HDACs의 저해제를 연구 조사한 결과, 이들은 세포 주기 정지, 세포 분화, 아폽토시스 및 전환 형질의 역전에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

저해제 트리코스타틴 A (TSA)는 예를 들면 G1 및 G2 상에서의 세포 주기 정지를 일으키고, 상이한 세포주의 전환 형질을 복귀하여, 프렌드 백혈병 세포 및 다른 것들의 분화를 유도시킨다. TSA (및 수베로일아닐리드 히드록삼산 SAHA)은 세포 증식을 저해하고 말단 분화를 유도하여, 마우스에 있어서의 종양 생성을 저지시키는 것으로 보고되어 있다 (참조 문헌: Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).

트리코스타틴 A는 또한 섬유증, 예를 들면 간섬유증 및 간경변의 치료에 유용한 것으로 보고되어 있다 (참조 문헌: Geerts et al., European Patent Application EP 0 827 742, published 11 March, 1998).

HDAC 저해제에 대한 약리작용단은 HDACs의 아연 함유 활성 부위와 상호 작용하는 금속 결합 도메인, 링커 도메인, 및 활성 부위의 림의 잔기와 상호 작용하는 표면 인식 도메인 또는 캡핑 영역으로 구성되어 있다.

HDACs의 저해제는 또한 p21 유전자 발현을 유도하는 것으로 보고되어 있다. 이들 저해제에 의한 p21 유전자의 전사 활성화는 크로마틴 리모델링 다음에, p21 프로모터 영역에서의 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화에 의해 향상된다. p21의 활성화는 p53 비의존성 패션으로 일어나므로, HDAC 저해제는 다수의 종양의 특징인 돌연변이 p53 유전자를 갖는 세포에서 작용한다.

또한, HDAC 저해제는 숙주 면역 반응의 증강 및 종양 혈관신생의 저해 등의 간접 활성을 가질 수 있으므로, 원발 종양 증식을 억제하여 전이를 방해할 수 있다 (참조 문헌: Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25. 261-309).

상술한 사항을 고려하면, HDAC 저해제는 돌연변이 p53 유전자를 갖는 종양 등의 세포 증식 질환 또는 상태의 치료에 있어서 큰 잠재력을 가질 수 있다는 것이다.

2003년 8월 14일자로 공개된 특허 출원 제EP1472216호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서의 비사이클릭 히드록사메이트를 개시하고 있다.

그 중에서도 특히, 2003년 9월 18일자로 공개된 특허 출원 제EP1485099호, 제EP1485348호, 제1485353호, 제EP1485354호, 제EP1485364호, 제EP1485365호, 제EP1485370호 및 제EP1485378호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 피페라지닐피리미디닐히드록삼을 개시하고 있고, 또한 제EP1485365호는 R306465를 개시하고 있다.

2003년 10월 9일자로 공개된 특허 출원 제EP1492534호는 HDAC 저해제로서 피페라진 결합을 포함하는 카르밤산을 개시하고 있다.

2003년 10월 23일자로 공개된 특허 출원 제EP1495002호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 피페라지닐페닐벤즈아미드 화합물을 개시하고 있다.

2004년 1월 29일자로 공개된 특허 출원 제WO04/009536호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 아릴기와 히드록사미드 사이에 알킬 링커를 함유하는 유도체를 개시하고 있다.

2004년 2월 12일자로 공개된 특허 출원 제EP1525199호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 (헤테로)아릴알케닐 치환된 비사이클릭 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2004년 7월 29일자로 공개된 제WO04/063146호는 항염증 활성 및 항종양 활성을 갖는 N-히드록시-벤즈아미드 유도체를 개시하고 있다.

2004년 7월 29일자로 공개된 특허 출원 제WO04/063169호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 아릴히드록사메이트 유도체를 개시하고 있다.

2004년 8월 26일자로 공개된 특허 출원 제WO04/072047호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 인돌, 벤즈이미다졸 및 나프티미다졸을 개시하고 있다.

2004년 9월 30일자로 개시된 특허 출원 제WO04/082638호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 비방향족 복소환계에 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2004년 10월 28일자로 공개된 특허 출원 제WO04/092115호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 히드록사메이트 유도체를 개시하고 있다.

2005년 3월 31일자로 공개된 특허 출원 제WO05/028447호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 벤즈이미다졸을 개시하고 있다.

2005년 4월 7일자로 공개된 특허 출원 제WO05/030704호 및 제WO05/030705호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 벤즈아미드를 개시하고 있다.

2005년 5월 6일자로 공개된 특허 출원 제WO05/040101호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로소 아크릴우레아 및 술포닐우레아가 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2005년 5월 6일자로 공개된 특허 출원 제WO05/040161호는 또한 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 비아릴이 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

본 발명의 화합물은 구조상, 약리학적 활성 및/또는 약리학적 효과 면에서 종래기술과 상이하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체이용성 및/또는 생체 내 효능을 증대시킨 고 효소 활성 및 세포 활성을 갖는 히스톤 디아세틸라제 저해제를 제공하는 것이다.

본 발명의 신규한 화합물은 상술한 과제를 해결한다. 본 발명의 화합물은 히스톤 디아세틸라제를 저해하는 우수한 효소 활성 및 세포 활성을 나타낸다. 이들은 세포 및 생체 내 레벨로 p21 유전자를 활성화시키는 고 능력을 갖는다. 이들은 바람직한 약물 동태 프로파일 및 P450 효소에 대한 저친화성을 가지므로, 유해한 약물 상호작용을 줄여, 안전 마진을 더욱 넓힐 수 있다.

본 화합물의 유리한 특성은 대사적 안정성, 용해도 및 p21 유도 능력이다. 특히, 본 발명의 화합물은 래트 간세포에서 증대된 반감기를 갖고, 수용액 중에서의 증대된 용해도/안정성을 가지고/가지거나 향상된 생체 내 p21 프로모터 유도 능력을 갖는다.

본 발명은 일반식 (I)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 입체화학적 이성질체에 관한 것이다:

상기식에서, 각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

R¹은 페닐, 나프탈레닐 또는 헤테로사이클릴이며;

상기 각각의 페닐 또는 나프탈레닐은 임의로 1 또는 2개의 치환기로 치환되고, 각 치환기는 독립적으로 할로, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시, 폴리할로C₁ _- ₆알킬, 아릴, 히드록시, 시아노, 아미노, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노, 히드록시카보닐, C₁ _- ₆알킬옥시카보닐, 히드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시메틸, 아미노메틸, C₁ _- ₆알킬아미노메틸, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노메틸, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노메틸, 아미노술포닐, C₁ _- ₆알킬아미노술포닐 또는 헤테로사이클릴 중에서 선택되고;

R²는 수소, -CH₂-R⁵, 트리플루오로메틸, -C(=O)-R⁶, 또는 -CH₂-NR⁷R⁸이며;

각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬옥시, C₁ _- ₆알킬카보닐옥시, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 이미다졸릴 또는 트리아졸릴 중에서 선택되고;

각각의 R⁶은 독립적으로 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, 아미노 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노, C₁ _- ₆사이클로알킬아미노, 히드록시C₁ _- ₆알킬아미노, 피페라지닐, 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노C₁ _- ₆알킬아미노, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐 중에서 선택되며;

각각의 R⁷ 및 R⁸은 독립적으로 수소, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카보닐, C₁ _- ₆알킬술포닐, 또는 모노- 또는 디(C_1-4알킬)아미노술포닐 중에서 선택되고;

R³은 수소, 히드록시메틸, 아미노메틸 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노메틸이며;

R⁴는 수소 또는 C₁ _- ₆알킬이고;

상기 아릴은 페닐 또는 나프탈레닐이며;

상기 각각의 페닐 또는 나프탈레닐은 임의로 1 또는 2개의 치환기로 치환되고, 각 치환기는 독립적으로 할로, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시, 트리플루오로메틸, 시아노 또는 히드록시카보닐 중에서 선택되며;

상기 헤테로사이클릴은 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피롤리닐, 피롤리디닐, 디옥솔릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피라졸릴, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 피라닐, 피리디닐, 피페리디닐, 디옥사닐, 모르폴리닐, 디티아닐, 티오모르폴리닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피페라지닐, 트리아지닐, 트리티아닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 인돌리닐, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 푸리닐, 퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐 또는 나프티리디닐이고;

상기 각각의 헤테로사이클은 임의로 1 또는 2개의 치환기로 치환되며, 각 치환기는 독립적으로 할로, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시, 시아노, 아미노, 또는 모노- 또는 디(C_1-4알킬)아미노 중에서 선택된다.

용어 "히스톤 디아세틸라제 저해제" 또는 "히스톤 디아세틸라제의 저해제"는 히스톤 디아세틸라제와 상호작용하여, 이의 활성, 보다 상세하게는 이의 효소 활성을 저해할 수 있는 화합물을 정의하는 것으로 사용된다. 히스톤 디아세틸라제의 효소 활성을 저해한다는 것은 히스톤으로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 디아세틸라제의 능력을 감소시킴을 의미한다. 바람직하게는, 그러한 저해는 특이적이며, 즉, 히스톤 디아세틸라제 저해제는 일부 다른 비관련된 생물학적 효과를 산출하는데 요구되는 저해제의 농도보다 낮은 농도에서 히스톤으로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 디아세틸라제의 능력을 감소시킨다.

상술한 정의 및 이하에서 사용된 바와 같이, 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 총칭하고; C₁ _- ₄알킬은 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 1-메틸에틸, 2-메틸프로필 등의 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소 라디칼을 정의하며; C₁ _- ₆알킬은 C₁ _- ₄알킬 및 예를 들면, 펜틸, 2-메틸부틸, 헥실, 2-메틸펜틸 등의 5 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 이의 고급 동족체를 포함하고; 폴리할로C₁ _- ₆알킬은 예를 들면 트리플루오로메틸 등의 3개의 동일하거나 상이한 할로 치환체를 포함하는 C₁ _- ₆알킬을 정의하며; C₃ _- ₆사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐 등의 3 내지 6의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소기를 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 부가염은 약제학적으로 허용가능한 산부가염 및 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염을 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 산부가염은 일반식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료학적 활성인 무독성 산부가염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 염기 특성을 갖는 일반식 (I)의 화합물은 상기 염기 형태를 적당한 산으로 처리함으로써 약제학적으로 허용가능한 산부가염으로 전환될 수 있다. 적당한 산은 염산 예를 들면, 할로겐화수소산 (예를 들면, 염산 또는 브롬화수소산); 황산; 질산; 인산 등의 무기산; 또는 예를 들면, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로판산, 히드록시아세트산, 락트산, 피브루산, 옥살산, 말론산, 숙신산 (즉, 부탄디오산), 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 시클람산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 등의 유기산을 포함한다.

산 특성을 갖는 일반식 (I)의 화합물은 상기 산 형태를 적당한 유기 또는 무기 염기로 처리함으로써 이의 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염으로 전환될 수 있다. 적당한 염기 염 형태는 예를 들면, 암모늄 염, 알칼리 및 알칼리 토금속 염 (예를 들면, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 염 등), 유기 염기를 갖는 염 (예를 들면, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염, 및 아미노산을 갖는 염 (예를 들면, 아르기닌, 리신 등)을 포함한다.

용어 "산 또는 염기 부가염"은 또한 일반식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 수화물 및 용매 부가 형태를 포함한다. 그러한 형태의 예로는 예를 들면, 수화물, 알콜레이트 등이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "일반식 (I)의 화합물의 입체화학적 이성질체"는 동일한 순서의 결합에 의해 결합되는 동일한 원자로 구성되나, 교환가능하지 않은 상이한 삼차구조를 갖는 일반식 (I)의 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 화합물을 정의한다. 달리 언급하거나 지적하지 않는다면, 화합물의 화학적 명칭은 상기 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 입체화학적 이성질체의 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물은 상기 화합물의 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머 및 에난티오머를 포함할 수 있다. 순수한 형태 또는 혼합물 형태의 일반식 (I)의 화합물의 모든 입체화학적 이성질체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

일반식 (I)의 화합물의 N-옥사이드 형태는 하나 또는 수개의 질소 원자가 소위 N-옥사이드, 특히 하나 이상의 피페리딘-, 피페라진 또는 피리다지닐-질소가 N-산화된 이들 N-옥사이드로 산화된 이들 일반식 (I)의 화합물을 포함하는 것을 의미한다.

일부 일반식 (I)의 화합물은 또한 이의 토토머 형태로 존재할 수 있다. 상기 일반식에 명백하게 나타나 있지 않더라도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

이하 어떤 경우에도, 용어 "일반식 (I)의 화합물"은 또한 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 모든 입체 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "히스톤 디아세틸라제" 및 "HDAC"는 히스톤의 N-말단에서 리신 잔기의 ε-아미노기로부터 아세틸기를 제거하는 효소의 패밀리 중 임의의 하나를 말하는 것으로 의도된다. 이와 관련해서 달리 언급하지 않는다면, 용어 "히스톤"은 임의의 종의 H1, H2A, H2B, H3, H4, 및 H5를 포함하는 임의의 히스톤 단백질을 말하는 것으로 의미된다. 사람 HDAC 단백질 또는 유전자 산물로는 이들에 제한되는 것은 아니나, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 및 HDAC-11을 들 수 있다. 히스톤 디아세틸라제는 또한 원생동물 또는 균류 공급원으로부터 유도될 수도 있다.

목적으로 하는 화합물의 제 1 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) R¹은 페닐 또는 나프탈레닐이고;

상기 각각의 페닐 또는 나프탈레닐은 임의로 1 또는 2개의 치환기로 치환되고, 각 치환기는 독립적으로 C₁ _- ₆알킬술포닐아미노, 히드록시카보닐, C₁ _- ₆알킬옥시메틸, C₁ _- ₆알킬아미노메틸, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노메틸, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노메틸, 아미노술포닐 또는 C₁ _- ₆알킬아미노술포닐 중에서 선택되며; 또는

b) R²는 -CH₂-R⁵, 트리플루오로메틸, -C(=O)-R⁶, 또는 -CH₂-NR⁷R⁸이고;

c) R⁴는 C₁ _- ₆알킬이다.

목적으로 하는 화합물의 제 2 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) R¹은 페닐, 나프탈레닐 또는 헤테로사이클릴이고;

상기 각각의 페닐은 1 또는 2개의 치환기로 치환되고, 각 치환기는 독립적으로 아릴, 히드록시, 아미노, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노, C₁ _- ₆알킬옥시카보닐, 히드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시메틸, 아미노메틸, C₁ _- ₆알킬아미노메틸, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노메틸, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노메틸, 아미노술포닐, C₁ _- ₆알킬아미노술포닐 또는 헤테로사이클릴 중에서 선택되며; 또는

c) R⁴는 C₁ _- ₆알킬이다.

목적으로 하는 화합물의 제 3 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) R¹은 페닐, 나프탈레닐 또는 헤테로사이클릴이고;

상기 각각의 페닐 또는 나프탈레닐은 1 또는 2개의 치환기로 치환되고, 각 치환기는 독립적으로 C₁ _- ₆알킬술포닐아미노, C₁ _- ₆알킬옥시메틸, 아미노메틸, C₁ _- ₆알킬아미노메틸, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노메틸, C₁ _- ₆알킬술포닐아미노메틸, 아미노술포닐 또는 C₁ _- ₆알킬아미노술포닐 중에서 선택되며; 또는

c) R⁴는 C₁ _- ₆알킬이다.

목적으로 하는 화합물의 제 4 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 이미다졸릴 또는 트리아졸릴 중에서 선택되고;

b) 각각의 R⁶은 독립적으로 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, 아미노 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노, C₁ _- ₆사이클로알킬아미노, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐 중에서 선택되며;

c) R⁴는 수소이다.

목적으로 하는 화합물의 제 5 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 X는 N이고;

b) R¹은 페닐, 또는 할로, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시, 폴리할로C₁ _- ₆알킬 또는 아릴로 임의로 치환된 페닐이며;

c) R²는 -CH₂-R⁵ 또는 -C(=O)-R⁶이고;

d) 각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬옥시, C₁ _- ₆알킬카보닐옥시, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 이미다졸릴 중에서 선택되며;

e) 각각의 R⁶은 독립적으로 C₁ _- ₆알킬아미노, C₁ _- ₆사이클로알킬아미노, 히드록시C_1- ₆알킬아미노, 디(C_1-6알킬)아미노C₁ _- ₆알킬아미노 또는 모르폴리닐 중에서 선택되고;

f) R³은 수소이며;

g) R⁴는 수소 또는 C₁ _- ₆알킬이다.

목적으로 하는 화합물의 제 6 그룹은 하기 제한이 적용되는 이들 제 5 그룹의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 R⁶은 독립적으로 C₁ _- ₆알킬아미노, C₁ _- ₆사이클로알킬아미노, 디(C₁ _- ₆알킬)아미노C₁ _- ₆알킬아미노 또는 모르폴리닐 중에서 선택된다.

목적으로 하는 화합물의 제 7 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 X는 N이고;

b) R¹은 페닐, 또는 할로로 치환된 페닐이며;

c) R²는 -CH₂-R⁵이고;

d) 각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시 또는 C₁ _- ₆알킬카보닐옥시 중에서 선택되며;

e) R³은 수소이고;

f) R⁴는 수소이다.

바람직한 화합물의 그룹은 각각의 X가 N이고; R¹이 페닐, 또는 할로, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시, 폴리할로C₁ _- ₆알킬 또는 아릴로 임의로 치환된 페닐이며; R²가 -CH₂-R⁵ 또는 -C(=O)-R⁶이고; 각각의 R⁵가 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시, C_1-6알킬옥시C₁ _- ₆알킬옥시, C₁ _- ₆알킬카보닐옥시, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 이미다졸릴 중에서 선택되며; 각각의 R⁶이 독립적으로 C₁ _- ₆알킬아미노, C₁ _- ₆사이클로알킬아미노, 히드록시C₁ _- ₆알킬아미노, 디(C_1-6알킬)아미노C₁ _- ₆알킬아미노 또는 모르폴리닐 중에서 선택되고; R³가 수소이며; R⁴가 수소 또는 C₁ _- ₆알킬인 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다.

바람직한 화합물의 또 하나의 그룹은 R²가 -CH₂-R⁵, 트리플루오로메틸, -C(=O)-R⁶, 또는 -CH₂-NR⁷R⁸인 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다.

보다 바람직한 화합물의 그룹은 각각의 X가 N이고; R¹이 페닐, 또는 할로로 치환된 페닐이며; R²가 -CH₂-R⁵이고; 각각의 R⁵가 독립적으로 수소, 히드록시, C₁ _- ₆알킬옥시 또는 C₁ _- ₆알킬카보닐옥시 중에서 선택되며; R³가 수소이고; R⁴가 수소인 이들 일반식 (I)의 화합물로 구성된다.

가장 바람직한 화합물은 화합물 번호 1, 화합물 번호 8, 화합물 번호 11, 화합물 번호 9, 화합물 번호 33, 화합물 번호 34, 화합물 번호 7 및 화합물 번호 25이다.

Compound No.: 화합물 번호 enantiomer: 에난티오머

일반식 (I)의 화합물, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, N-옥사이드 및 입체화학적 이성질체는 통상적인 방식으로 제조될 수 있다. 출발 물질 및 일부 중간체는 시판되거나, 또는 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 통상적인 반응절차에 따라 제조될 수 있다.

다수의 제조방법은 하기에서 더욱 상세히 기술될 것이다. 일반식 (I)의 최종 화합물을 얻기 위한 다른 방법은 실시예에 기재되어 있다.

a) 일반식 (I)의 히드록삼산은 일반식 (II)의 중간체를 트리플루오로아세트산 등의 적절한 산과 반응시켜 제조될 수 있다. 상기 반응은 적절한 용매, 예를 들면, 메탄올 또는 디클로로메탄 중에서 행해진다.

b) 일반식 (II)의 중간체는 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민, 일염산염 (EDC) 및 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 (HOBT) 등의 적절한 시약의 존재하에서 일반식 (III)의 중간체를 일반식 (IV)의 중간체와 반응시켜 제조될 수 있다. 상기 반응은 디클로로메탄과 테트라히드로푸란의 혼합물 등의 적절한 용매 중에서 트리에틸아민 등의 염기의 존재하에 행해질 수 있다.

c) 다른 방법에 있어서, R⁴가 수소인 일반식 (II)의 중간체 (본 명세서에서 일반식 (II-a)의 중간체로 명명됨)는 알콜 (예를 들면, 에탄올) 등의 적절한 용매 중에서, 일반식 (XI)의 중간체를 1,4-디옥산-2,5-디올 및 일반식 (VII)의 적절한 보론산과 반응시켜 일단계로 제조될 수 있다.

d) 일반식 (III)의 중간체는 알콜 (예를 들면, 에탄올 또는 프로판올) 등의 적절한 용매 중에서, 일반식 (V)의 중간체를 적절한 산성 용액 (예를 들면, 염산) 또는 염기성 용액 (예를 들면, 브롬화수소 또는 수산화나트륨)과 반응시켜 제조될 수 있다.

상기식에서, R¹은 상술한 바와 같다.

본 발명은 또한 일반식 (V)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 입체화학적 이성질체에 관한 것이다:

상기식에서, 각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

R¹은 페닐, 나프탈레닐 또는 헤테로사이클릴이며;

R⁴는 수소 또는 C₁ _- ₆알킬이고;

상기 아릴은 페닐 또는 나프탈레닐이며;

목적으로 하는 바람직하거나, 더욱 바람직하거나 가장 바람직한 화합물의 그룹은 일반식 (I)의 화합물에 대하여 정의된 기에 따라, 일반식 (V)의 화합물에 대하여 정의될 수 있다.

일반식 (V)의 신규한 중간체는:

a) 당해 기술분야에 공지된 반응 또는 작용기 변환을 통해, R²가 -CH₂-OH이고 R⁴가 수소인 일반식 (V)의 중간체 (본 명세서에서 일반식 (V-a)의 중간체로 명명됨)를, R²가 -CH₂-OH 이외의 것인 일반식 (V)의 중간체 (본 명세서에서 일반식 (V-b)의 중간체로 명명됨)로 전환함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 일반식 (V-a)의 알콜은 아민, 에스테르 및 에테르로 전환될 수 있다. 아민은 대응하는 아미드로 변환될 수 있고, 일차 아민은 이차 또는 삼차 아민으로 전환될 수 있다.

b) 일반식 (V-a)의 신규한 중간체는 알콜 (예를 들면, 에탄올) 등의 적절한 용매 중에서, 일반식 (VI)의 중간체를 1,4-디옥산-2,5-디올 및 일반식 (VII)의 적절한 보론산과 반응시켜 일단계로 제조될 수 있다.

c) 일반식 (V-b)의 신규한 중간체는 적절한 용매 (예를 들면, 1,2-디클로로에탄) 중에서, 테트라키스(에탄올라토)티타늄 또는 소듐 보로하이드라이드 등의 적절한 시약의 존재하에 일반식 (VI)의 중간체를 일반식 (VIII)의 적절한 케톤과 반응시켜 제조될 수 있다.

d) R²가 -COOH인 일반식 (V)의 신규한 중간체 (본 명세서에서 일반식 (V-c)의 화합물로 명명됨)는 적절한 용매 (예를 들면, 1,2-디클로로메탄) 중에서, 일반식 (VI)의 중간체를 2-옥소-프로판산 및 일반식 (VII)의 적절한 보론산과 반응시켜 일단계로 제조될 수 있다.

당해 기술분야에 공지된 반응 또는 작용기 변환, 예를 들면 아민 및 아미드로의 전환을 통해, R²가 COOH인 일반식 (V-c)의 중간체는 R²가 -C(=O)-R⁶인 일반식 (V)의 중간체로 전환될 수 있다.

상기식에서, R¹은 상술한 바와 같다.

일반식 (XI)의 중간체는 적절한 용매 (예를 들면, 디클로로메탄) 중에서, 일반식 (IX)의 중간체를 피페리딘과 반응시켜 제조될 수 있다.

일반식 (IX)의 중간체는 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민, 일염산염 (EDC) 및 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 (HOBT) 등의 적절한 시약의 존재하에서 일반식 (X)의 중간체를 일반식 (IV)의 중간체와 반응시켜 제조될 수 있다. 상기 반응은 디클로로메탄과 테트라히드로푸란의 혼합물 등의 적절한 용매 중에서 트리에틸아민 등의 염기의 존재하에 행해질 수 있다.

일반식 (X)의 중간체는 테트라히드로푸란 등의 적절한 용매 중에서 수산화나트륨의 존재하에 일반식 (VI)의 중간체를 일반식 (XII)의 중간체와 반응시킨 다음, 염산으로 중화하고 탄산나트륨을 첨가하여 제조될 수 있다.

일반식 (I)의 화합물 및 일부 중간체는 이의 구조 내에 적어도 하나의 입체 중심을 가질 수 있다. 이 입체 중심은 R 또는 S 배위로 존재할 수 있다.

상술한 프로세스에서 제조된 일반식 (I)의 화합물은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 분할 과정에 따라 서로 분리될 수 있는 에난티오머의 라세미 혼합물이다. 일반식 (I)의 라세미 화합물은 적당한 키랄 산과 반응시킴으로써 대응하는 디아스테레오머 염으로 전환될 수 있다. 상기 디아스테레오머 염 형태는 예를 들면, 선택적 결정화 또는 분별 결정에 의해 순차적으로 분리되고, 에난티오머는 알칼리로 유리된다. 일반식 (I)의 화합물의 에난티오머를 분리시키는 다른 방식은 키랄 고정상을 이용하는 액체 크로마토그래피를 포함한다. 상기 순수한 입체화학적 이성질체는 반응이 입체특이적으로 일어난다면, 적당한 출발 물질의 대응하는 순수한 입체화학적 이성질체로부터 유도될 수도 있다. 바람직하게는 특이적 입체이성체를 원한다, 상기 화합물은 입체특이적 제조 방법에 의해 합성된다. 이들 방법은 유리하게도 에난티오머적으로 순수한 출발 물질을 사용할 것이다.

일반식 (I)의 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 산부가염 및 입체 이성질체는 이들이 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 저해 효과를 갖는다는 점에서 유용한 약리학적 특성을 갖는다.

본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써, 형질전환 세포를 포함하여, 세포의 이상 증식을 저해하기 위한 방법을 제공한다. 세포의 이상 증식이라 함은 정상 조절 메카니즘 (예를 들면, 접촉 저지의 감소)과는 관계 없는 세포 증식을 말한다. 이는 직접적으로는 성장 정지, 말단 분화 및/또는 암세포 자멸사를 일으키고, 간접적으로는 종양의 혈관신생을 저해함으로써 종양 증식의 저해를 포함한다.

본 발명은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 대상, 예를 들며, 포유류 (및 특히 사람)에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써 종양 증식을 저해하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써 종양 증식을 저해하기 위한 방법을 제공한다. 저해되는 종양의 예로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 폐암 (예를 들면, 선암 및 비소세포 폐암 등), 췌장암 (예를 들면, 외분비 췌장암 등의 췌장암), 결장암 (예를 들면, 결장선암 및 결장선종 등의 결장 직장암), 진행 질환을 포함한 전립선암, 림프계 조혈성 종양 (예를 들면, 급성 림프성 백혈병, B 세포 림프종, 버킷 림프종), 골수성 백혈병 (예를 들면, 급성 골수 백혈병 (AML)), 갑상선 여포암, 골수이형성증후군 (MDS), 간엽에 유래하는 종양 (예를 들면, 섬유육종 및 횡문근육종), 흑색종, 기형종, 신경아세포종, 신경교종, 피부 양성 종양 (예를 들면, 각화극세포종), 유방암 (예를 들면, 진행성 유방 암), 신장암, 난소암, 방광암 및 표피암을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 다른 치료 목적, 예를 들면:

a) 암 치료를 위한 종양의 방사선 치료 전, 치료 시, 또는 치료 후에 본 발명의 화합물을 투여함으로써 방사선 치료법에 종양 감작 (sensitisation);

b) 류머티스성 관절염, 골관절염, 청소년 관절염, 통풍, 다발성 관절염, 건성성 관절염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 난창 등의 관절병 및 골병적 상태의 치료;

c) 혈관증식증, 아테롬성 동맥 경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

d) 궤양성 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 대숙주성 이식편병 (graft versus host disease), 결막염, 천식, ARDS, 베체트병, 이식 거부 반응, 유티카리아 (uticaria), 알레르기성 피부염, 원형탈모증, 피부경화증, 발진, 습진, 피부근염, 여드름, 당뇨병, 전신 홍반성 난창, 가와사키병, 다발성 경화증, 폐기종, 낭포성 섬유증 및 만성 기관지염 등의 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

e) 자궁 내막증, 자궁 근증, 기능 부전성 자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

f) 망막 및 맥락막 혈관을 해치는 혈관 장애를 포함하는 안구 혈관신생의 치료;

g) 심 기능 이상의 치료;

h) HIV 감염 치료 등의 면역억제 증상의 저해;

i) 신 기능 장애의 치료;

j) 내분비 장애의 억제;

k) 포도당 신합성 기능 장애의 저해;

l) 예를 들면 파킨슨병과 같은 신경병리학 증상 또는 예를 들면 알츠하이머병 또는 폴리글루타민 연관 신경성 질환과 같은 인식력 장애를 가져오는 신경병리학 증상의 치료;

m) 예를 들면, 정신 분열증, 쌍극성 장애, 우울증, 불안 신경증 및 정신병 등의 정신 장애의 치료;

n) 예를 들면, 근위축성 측삭 경화증 등의 신경근 병상의 저해;

o) 척수성 근위축증의 치료;

p) 유전자 발현을 증강함으로써 치료할 수 있는 다른 병적 상태의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지질 생성의 저해; 및

s) 말라리아 등의 기생충의 치료에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 의약용으로서의 일반식 (I)의 화합물 및 하나 이상의 상술한 증상의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 이들 일반식 (I)의 화합물의 용도를 개시하고 있다.

일반식 (I)의 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 산부가염 및 입체 이성질체는 표지 화합물 및 HDAC 간의 복합체 형성을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서의 HDAC의 검출 또는 동정을 위해 사용될 수 있다는 점에서 유용한 진단학적 특성을 가질 수 있다.

검출 또는 동정하는 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등의 표지 시약으로 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 방사선 동위원소의 예로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H 및 ¹⁴C를 들 수 있다. 효소는 통상 적절한 기질의 컨쥬게이션, 그리고 나서 검출 반응을 촉매함으로써 검출가능하게 된다. 이의 예로는 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 및 말산 탈수소 효소, 바람직하게는 양고추냉이 퍼옥시다제를 들 수 있다. 발광물질은 예를 들면, 루미놀 (luminol), 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿼린 및 루시페라제를 들 수 있다.

생물학적 샘플은 챙체 조직 또는 체액으로 정의될 수 있다. 체액의 예로는 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 가래, 침 등을 들 수 있다.

이의 유용한 약리학적 특성에 비추어, 대상 화합물은 투여 목적을 위해 다양한 약제학적 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위해, 활성성분으로서의 유효량의 특정 화합물은 염기 또는 산 부가염 형태로, 투여를 위해 필요한 제제의 형태에 따라 다종 다양한 형태를 취할 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체와 친밀히 혼합된다. 이들 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구, 직장, 경피 또는 주사제로 투여하기에 적합한 단위 제형인 것이 바람직하다. 예를 들면, 경구 제형의 조성물을 제조함에 있어서, 예를 들면, 현탁제, 시럽, 엘릭시르 및 용액 등의 경구 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 또는 분제, 환약, 캡슐 및 정제의 경우에는 전분, 당, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등의 고체 담체와 같은 통상의 약제학적 매질 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

이들의 투여 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구용 단위 투약 형태를 나태내고, 이 경우에 고체 약제학적 담체가 두드러지게 사용된다. 비경구 조성물에 대해서는, 담체는 예를 들면 용해성을 돕기 위해 다른 성분이 포함될 수도 있으나, 통상적으로 적어도 대부분은 멸균수를 포함할 것이다. 예를 들면, 주사제는 담체가 식염수, 글루코스 용액, 또는 식염수와 글루코스 용액의 혼합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 주사 현탁액도 제조될 수 있고, 이 경우에 적당한 액체 담체, 현탁제 등이 사용될 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물에 있어서, 임의로 어떤 성질을 갖는 적절한 첨가제와 소량의 비율로 혼합된 침투촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 포함하고, 상기 첨가제는 피부에 심각한 악영향을 끼치지 않는다. 상기 첨가제는 피부에의 투여를 용이하게 하고/하거나 원하는 조성물을 제조하는데 유용할 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방법, 예를 들면 경피 패치, 스팟 온 (spot-on) 또는 연고로서 투여될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 단일성을 위해 상술한 약제학적 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 투약 단위 형태는 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위이며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 협력하여 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성성분을 함유한다. 이러한 투여량 단위 형태의 예로는 정제 (분할정 또는 코팅정을 포함), 캡슐, 환약, 분말 패킷, 웨이퍼, 주사제 또는 주사용 현탁액, 티스푼펄 (teaspoonful), 테이블스푼펄 (tablespoonful) 등, 및 이들의 분리된 다중회분이 있다.

이하에 나타내는 시험 결과로부터 당업자는 유효량을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로 치료학적 유효량은 0.005 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중, 특히 0.005 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중으로 예상된다. 하루에 걸쳐 적당한 간격을 두고 2, 3, 4 이상의 아-투여량으로 필요한 투여량을 투여하는 것이 적당하다. 상기 아-투여량은 예를 들면, 단위 투약 형태 당 0.5 내지 500 mg, 특히 10 mg 내지 500 mg의 활성성분을 포함하는 단위 투약 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면으로서, 구체적으로는 암 또는 관련질환의 치료시에 특히 의약으로서의 사용을 위해, HDAC 저해제와 다른 항암제의 조합이 예기된다.

상기 증상의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 약제, 특히 다른 항암제와 병용하여 사용될 수 있다. 항암제의 예로는:

- 백금 배위 화합물, 예를 들면 시스플라틴, 카보플라틴 또는 옥살리플라틴;

- 탁산 화합물, 예를 들면 파클리탁셀 또는 도세탁셀;

- 캄프토테신 화합물 등의 토포이소메라제 I 저해제, 예를 들면 이리노테칸 또는 토포테칸;

- 항종양 포도필로톡신 유도체 등의 토포이소메라제 II 저해제, 예를 들면 에토포사이드 또는 테니포사이드;

- 항종양 빈카 알칼로이드, 예를 들면 빈플라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈;

- 항종양 뉴클레오시드 유도체, 예를 들면 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 카페시타빈;

- 니트로겐 머스타드 또는 니트로소우레아 등의 알킬화제, 예를 들면 사이클로포스파미드, 클로람부실, 카르무스틴 또는 로무스틴;

- 항종양 안트라사이클린 유도체, 예를 들면 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신 또는 미톡산트론;

- HER2 항체, 예를 들면 트라스투주맙;

- 에스트로겐 수용체 길항제 또는 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 예를 들면 타목시펜, 토레미펜, 드롤록시펜, 파슬로덱스 또는 랄록시펜;

- 엑세메스탄, 아나스트로졸, 렉트라졸 및 보로졸 등의 아로마타제 저해제;

- 레티노이드, 비타민 D 및 레티노산 대사 차단약 (RAMBA) 등의 분화제, 예를 들면 아큐탄;

- DNA 메틸 트란스페라제 저해제, 예를 들면 아자사이티딘;

- 키나제 저해제, 예를 들면 플라보페리돌, 이마티닙메실레이트또는 제피티닙;

- 파네실트란스페라제 저해제;

- 기타 HDAC 저해제;

- 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 저해제, 예를 들면 벨카드 (Velcade); 또는

- 욘델리스를 들 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "백금 배위 화합물"은 이온 형태의 백금을 제공하는 임의의 종양세포 증식을 저해하는 백금 배위 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "탁산 화합물"은 탁산환계를 갖고, 주목을 포함한 주목과의 특정 종의 추출물에 관련 또는 이로부터 유도된 화합물의 계열을 지칭한다.

용어 "토포이소메라제 저해제"는 진핵세포의 DNA 토폴로지를 변화시킬 수 있는 효소를 지칭하는 것으로 사용된다. 이들은 중요한 세포 기능 및 세포 증식에 대해 결정적이다. 진핵세포에는 두 종류의 토포이소메라제, 즉 I형 및 II형이 있다. 토포이소메라제 I은 약 100,000 분자량의 단량체 효소이다. 이 효소는 DNA에 결합하여 일시적인 1본쇄 절단을 도입하여, 이중 나선을 풀고 (또는 풀 수 있고), 그 후에 DNA 쇄로부터 분리되기 전에 절단을 다시 봉한다. 토포이소메라제 II는 DNA 쇄 절단 또는 자유 라디칼의 형성의 유도를 포함하는 유사한 작용 메카니즘을 갖는다.

용어 "캄프토테신 화합물"은 중국산 나무 캄프토테신 아큐미나타 (Chinese tree Camptothecin acuminata) 및 인도산 나무 노타포다이트 포에티다 (Indian tree Nothapodytes foetida)로부터 유도된 수불용성 알칼로이드인 모 캄포테신 화합물과 관련되거나 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "포도필로톡신 화합물"은 맨드레이크 식물로부터 추출된 모 포도필로톡신과 관련되거나 또는 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "항종양 빈카 알칼로이드"는 페리윙클 식물 (Vinca rosea (일일초))의 추출물과 관련되거나 또는 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "알킬화제"는 생리 조건 하에서, DNA 등의 생물학적으로 중대한 거대분자에 알킬기를 주는 능력을 가진 일반적인 특징을 갖는 다양한 그룹의 화학물질을 포함한다. 니트로겐 머스타드 및 니트로소우레아와 같은 대부분의 보다 중요한 약제와 함께, 활성 알킬화 부분은 그 중 일부가 효소로, 복합체 분해 반응 후에 생체 내에서 생성된다. 알킬화제의 가장 중요한 약리 작용은 세포 증식, 특히 DNA 합성 및 세포 분열에 관련된 기초적인 메카니즘을 방해하는 것이다. 빠르게 증식하는 조직내에서의 DNA 기능 및 완전성을 방해하는 알킬화제의 능력은 그의 치료학적 적용 및 다수의 그의 독성에 대한 기초를 제공한다.

용어 "항종양 안트라사이클린 유도체"는 글리코시드 결합에 의해 결합된, 이상 (unusual) 당, 다우노사민과 함께 테트라사이클린 환 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 균류 스트렙 페우티쿠스 바 카에시우스 (Strep. peuticus var. caesius)로부터 얻은 항생제 및 그의 유도체를 포함한다.

원발성 유암에서의 사람 상피 증식 인자 수용체 2 단백질 (HER 2)의 증폭은 특정 환자에 대한 낮은 임상 예후와 관련된다는 것이 보여져왔다. 트라스투주맙은 HER2 수용체의 세포외 도메인에 고 친화성 및 특이성을 갖고 결합하는 고도로 정제된 재조합 DNA-유도 사람화된 모노클로날 IgG1 카파 항체이다.

많은 유방암은 에스트로겐 수용체를 가지며, 이들 종양의 성장은 에스트로겐에 의해 자극될 수 있다. 용어 "에스트로겐 수용체 길항제" 및 "선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터"는 에스트로겐 수용체 (ER)에 결합하는 에스트라디올의 경쟁적 저해제를 지칭하는 것으로 사용된다. 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터는 ER에 결합될 때에 수용체의 삼차원 형상에 있어서의 변화를 유도하여, DNA상의 에스트로겐 응답 배열 (estrogen responsive element, ERE)에 대한 이의 결합을 모듈레이트한다.

폐경후의 여성에서, 순환 에스트로겐의 중요한 공급원은 말초 조직에서의 아로마타제 효소에 의한 부신 및 난소의 안드로겐 (안드로스테네디온 및 테스토스테론)의 에스트로겐 (에스트론 및 에스트라디올)로의 전환으로부터이다. 아로마타제 저해 또는 불활성화를 통한 에스트로겐 제거는 호르몬 의존성 유방암에 걸린 일부 폐경후의 환자들에 대해 효과적이며 선택적인 치료이다.

용어 "항에스트로겐제"는 에스트로겐 수용체 길항제 및 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터 뿐만 아니라, 상술한 아로마타제 저해제를 포함하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.

용어 "분화제"는 다양한 방식으로, 세포 증식을 저해하고 분화를 유도할 수 있는 화합물을 포함한다. 비타민 D 및 레티노이드는 다종 다양한 정상 및 악성 세포 종류의 성장 및 분화를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 레티노산 대사 차단제 (RAMBA's)는 레티노산의 시토크롬 P450-매개 이화작용을 저해함으로써 내인성 레티노산의 레벨을 증가시킨다.

DNA 메틸화 변화는 사람 종양 형성에서의 가장 일반적인 이상이다. 선택된 유전자의 프로모터 내에서의 과잉 메틸화는 대개 관련된 유전자의 불활성화와 연관되어 있다. 용어 "DNA 메틸 트란스페라제 저해제"는 DNA 메틸 트란스페라제의 약리학적 저해 및 종양 억제 유전자 발현의 재활성화를 통해 작용하는 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "키나제 저해제"는 세포 주기 진행 및 프로그램된 세포사 (자멸사)에 포함된 키나제의 강력한 저해제를 포함한다.

용어 "파네실트란스페라제 저해제"는 라스 (Ras) 및 기타 세포내 단백질의 파네실화를 방해하도록 디자인된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다. 그들은 악성 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 것으로 보여져왔다.

용어 "기타 HDAC 저해제"는 이하의 것을 들 수 있으니, 이들에 제한되는 것은 아니다:

- 카르복실레이트, 예를 들면, 부티레이트, 4-페닐부티레이트 또는 발프로산;

- 히드록삼산, 예를 들면, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), SAHA 유사체를 함유하는 피페라진, 비아릴히드록사메이트 A-161906 및 이의 카보졸릴에테르 유사체, 테트라히드로피리딘 유사체 및 테트라론 유사체, 비사이클릭 아릴-N-히드록시카복사미드, 피록사미드, CG-1521, PXD-101, 술폰아미드 히드록삼산, LAQ-824, LBH-589, 트리코스타틴 A (TSA), 옥삼플라틴, 스크립타이드, 스크립타이드 관련된 트리사이클릭 분자, m-카복시신남산 비스히드록삼산 (CBHA), CBHA형 히드록삼산, 트라폭신-히드록삼산 유사체, R306465 및 관련된 벤조일- 및 헤테로아릴-히드록삼산, 아미노수베레이트 및 말로닐디아미드;

- 사이클릭 테트라펩티드, 예를 들면, 트라폭신, 아피디신, 뎁시펩티드, 스피루초스타틴 관련 화합물, RedFK-228, 술프히드릴 함유 사이클릭 테트라펩티드 (SCOPs), 히드록삼산 함유 사이클릭 테트라펩티드 (CHAPs), TAN-174s 및 아줌아미드;

- 벤즈아미드, 예를 들면, MS-275 또는 CI-994, 또는

- 데푸데신을 들 수 있다.

용어 "유비퀴틴-프로테아솜 경로의 저해제"는 세포 주기 조절 단백질을 포함하는 프로테아솜에 있어서의 세포 단백질의 타겟된 파괴를 저해하는 화하물을 동정하는데 사용된다.

암을 치료하기 위해, 본 발명의 화합물은 방사선 조사와 병행하여 상기 기술된 바와 같은 환자에게 투여될 수 있다. 방사선 치료는 특히 오늘날 일반적으로 사용되는 선형 가속기 또는 방사성 핵종에 의해 방출되는 이온화 방사선, 특히 감마 방사선을 의미한다. 방사성 핵종에 의한 종양의 방사선 치료는 외용 또는 내복용일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 HDAC 저해제와 항암제의 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 예를 들면 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 약물 요법에 사용하는 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 유효량의 배합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 피검자의 종양세포의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 유효량의 배합물을 투여함으로써, 형질전환 세포를 포함하는 세포의 이상 증식을 저해하기 위한 방법을 제공한다.

기타 약제 및 HDAC 저해제가 동시에 (예를 들면, 분리 또는 단위 조성물) 또는 각 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 두 화합물은 유리하거나 상승 효과가 달성되는 것을 확보하는 충분한 기간, 양 및 방식으로 투여될 것이다. 바람직한 방법, 투여의 순서, 각각의 투여량 및 조성물의 각 성분에 대한 처방은 투여되는 특정의 다른 약제 및 HDAC 저해제, 이들의 투여 경로, 치료할 특정 종양 및 치료할 특정의 숙주에 따라 결정될 것이다. 최적의 방법, 투여의 순서, 투여량 및 요법은 통상적인 방법을 사용하여, 그리고 본 명세서에 상세히 기술한 정보에 비추어 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

백금 배위 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 1 내지 500 mg (mg/m²), 예를 들면 50 내지 400 mg/m²의 투여량으로, 특히 시스플라틴에 대해서는 약 75 mg/m²의 투여량으로, 카보플라틴에 대해서는 약 300 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

탁산 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 50 내지 400 mg (mg/m²), 예를 들면 75 내지 250 mg/m², 특히 파클리탁셀에 대해서는 약 175 내지 250 mg/m²의 투여량으로, 도세탁셀에 대해서는 약 75 내지 150 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

캄프토테신 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 0.1 내지 400 mg (mg/m²), 예를 들면 1 내지 300 mg/m²의 투여량으로, 특히 이리노테칸에 대해서는 약 100 내지 350 mg/m²의 투여량으로, 토포테칸에 대해서는 약 1 내지 2 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 포도필로톡신 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 30 내지 300 mg (mg/m²), 예를 들면 50 내지 250 mg/m²의 투여량으로, 특히 에토포사이드에 대해서는 약 35 내지 100 mg/m²의 투여량으로, 테니포사이드에 대해서는 약 50 내지 250 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 빈카 알칼로이드는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 2 내지 30 mg (mg/m²)의 투여량으로, 특히 빈블라스틴에 대해서는 약 3 내지 12 mg/m²의 투여량으로, 빈크리스틴에 대해서는 약 1 내지 2 mg/m²의 투여량으로, 비노렐빈에 대해서는 약 10 내지 30 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 뉴클레오시드 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 200 내지 2500 mg (mg/m²), 예를 들면 700 내지 1500 mg/m²의 투여량, 특히 5-FU에 대해서는 약 200 내지 500 mg/m²의 투여량으로, 젬시타빈에 대해서는 약 800 내지 1200 mg/m²의 투여량으로, 카페시타빈에 대해서는 약 1000 내지 2500mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

니트로겐 머스타드 또는 니트로소우레아 등의 알킬화제는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 100 내지 500 mg (mg/m²)의 투여량, 예를 들면 120 내지 200 mg/m², 특히 사이클로포스파미드에 대해서는 약 100 내지 500 mg/m²의 투여량으로, 클로람부실에 대해서는 약 0.1 내지 0.2 mg/m²의 투여량으로, 카르무스틴에 대해서는 약 150 내지 200 mg/m²의 투여량으로, 로무스틴에 대해서는 약 100 내지 150 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 안트라사이클린 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 10 내지 75 mg (mg/m²), 예를 들면 15 내지 60 mg/m²의 투여량, 특히 독소루비신에 대해서는 약 40 내지 75 mg/m²의 투여량으로, 다우노루비신에 대해서는 약 25 내지 45 mg/m²의 투여량으로, 이다루비신에 대해서는 약 10 내지 15 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

트라스투주맙은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 1 내지 5 mg (mg/m²), 특히 2 내지 4 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항에스트로겐제는 특정 약제 및 치료할 증상에 따라 매일 약 1 내지 100 mg 의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다. 타목시펜은 치료 효과를 달성하고 유지하기에 충분한 시간 동안 치료를 계속하면서, 하루에 두번 약 5 내지 50 mg의 투여량으로, 바람직하게는 10 내지 20 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 토레미펜은 치료 효과를 달성하고 유지하기에 충분한 시간 동안 치료를 계속하면서, 하루에 한 번 약 60 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 아나스트로졸은 하루에 한 번 약 1 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 드롤록시펜은 하루에 한 번 약 20 내지 100 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 랄록시펜은 하루에 한 번 약 60 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 에세메스탄은 하루에 한 번 약 25 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다.

이들 투여량은 예를 들면, 치료 코스당 1 회, 2 회 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 이는 7, 14, 21 또는 28일마다 반복될 수 있다.

이들의 유용한 약리학적 특성에 비추어, 본 발명에 따른 조성물의 성분, 즉 다른 약제 및 HDAC 저해제는 투여 목적에 따라 다양한 약제학적 제형으로 제형화될 수 있다. 성분들은 개개의 약제학적 조성물로 분리되거나 양 성분을 함유하는 단위 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적 담체와 함께 다른 약제 및 HDAC 저해제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적 담체와 함께 본 발명의 HDAC 저해제 및 항암제를 포함하는 약제학적 조성물 형태의 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 배합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 동시적, 분리적 또는 순차적 사용을 위한 복합 제제로서, 제 1 활성성분으로서의 본 발명의 HDAC 저해제 및 제 2 활성성분으로서의 항암제를 함유하는 약제에 관한 것이다.

실험적 부분

하기 실시예는 설명하기 위해 제공된다.

이하, "EDC"는 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민, 일염산염, "DCM"은 디클로로메탄, "DIPE"는 디이소프로필에테르, "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드, "EtOAc"는 에틸아세테이트, "EtOH"는 에탄올, "HOBT"는 1-히드록시-1H-벤조트리아졸, "MeOH"는 메탄올, "TFA"는 트리플루오로아세트산, "THF"는 테트라하이드로푸란으로 정의된다.

A. 중간 화합물의 제조

실시예 A1

a) 중간체 1의 제조

EtOH (250 ml) 중의 2-(1-피페라지닐)-5-피리미딘카르복실산에틸 에스테르 (0.016 mol)와, (2-페닐에테닐)-보론산 (0.016 mol)과, 1,4-디옥산-2,5-디올 (0.016 mol)의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음에, 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔사를 DCM 및 물에 취하고, 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 (15 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 97/1). 순수한 분획을 증발시켜, 중간체 1 (융점: 128℃) 4 g (61%)을 수득하였다. 중간체 1에 대응하는 에스테르를 키랄 크로마토그래피로 분리할 수 있다.

b) 중간체 2의 제조

수산화나트륨 1 N (10 ml) and THF (20 ml) 중의 중간체 1 (0.0007 mol)의 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하였다. 염산 1 N (10 ml)을 가하였다. 용매를 증발시켰다. 침전물을 여과하고, 수세한 다음, DIPE로 세정하여 건조시켜서, 중간체 2를 0.2 g (융점: 232℃) 수득하였다.

c) 중간체 3의 제조

트리에틸아민 (0.012 mol), N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민 (0.00593 mol), 1-히드록시-lH-벤조트리아졸 (0.00593 mol) 및 O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.00593 mol)을, DCM (70 ml)과 THF (70 ml)의 혼합물 중의 중간체 2 (0.00395 mol)의 혼합물에 가한 다음에, 반응 혼합물을 실온에서 3일간 교반하였다. H₂O를 가하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (그레디언트 용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 생성물 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 3을 1.5 g (84%) 수득하였다.

실시예 A2

a) 중간체 4의 제조

EtOH (100 ml) 중의 2-(1-피페라지닐)-5-피리미딘카르복실산에틸 에스테르 (0.0042 mol)와, 1,4-디옥산-2,5-디올 (0.0042 mol)과, (E) [2-(4-클로로페닐)에테닐]-보론산 (0.0042 mol)의 혼합물을 실온에서 72 시간 교반하여, 물에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (1.8 g)를 실리카 겔 (15 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 2개의 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, F1 (오일)을 0.85 g, F2를 0.25 g 수득하였다 (전체 수율: 63%). F1을 2-프로판온/DIPE으로 결정화하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 중간체 4 (융점: 110℃)를 0.6 g 수득하였다.

b) 중간체 5의 제조

메탄술포닐클로라이드 (0.0012 mol)를 N₂ 기류하에서 THF (15 ml) 중의 중간체 4 (0.0006 mol) 및 트리에틸아민 (0.0024 mol)의 용액에 5℃에서 가하였다. 혼합물을 실온에 이르게 한 다음, 1 시간 교반하여 빙수에 부었다. 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켜, 중간체 5를 0.3 g 수득하였다. 이 생성물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

c) 중간체 6의 제조

아세토니트릴 (30 ml) 중의 중간체 5 (0.0006 mol), 모르폴린 (0.0009 mol) 및 탄산칼륨 (0.0018 mol)의 혼합물을 80℃에서 15 시간 교반하여, 물에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.27 g)를 실리카 겔 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOHH 100/0 내지 90/10). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 6을 0.085 g (29%) 수득하였다.

d) 중간체 7의 제조

수산화나트륨 1 N (1.5 ml) 및 THF (3 ml) 중의 중간체 6 (0.0002 mol)의 혼합물을 실온에서 72 시간 교반하였다. 염산 1 N (1.5 ml)을 가하였다. 혼합물을 증발 건조시켜, 중간체 7를 수득하였다. 이 생성물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

e) 중간체 8의 제조

DCM/THF (10 ml) 중의 중간체 7 (0.0002 mol), O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0002 mol), EDC (0.0002 mol), HOBT (0.0002 mol) 및 트리에 틸아민 (0.0002 mol)의 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하여, 물에 부은 다음, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.095 g)를 실리카 겔 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 8을 0.04 g (41%) 수득하였다.

실시예 A3

a) 중간체 11의 제조

티타늄에틸레이트 (0.0085 mol)를, N₂ 기류하에서 실온에서 1,2-디클로로에탄 (45 ml) 중의 2-(1-피페라지닐)-5-피리미딘카르복실산에틸 에스테르 (0.0042 mol) 및 4-페닐-3-부텐-2온 (0.0051 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 교반하였다. NaBH(OAc)₃ (0.0085 mol)를 가하였다. 혼합물을 5 시간 교반하여, 빙수에 부었다. DCM을 가하였다. 혼합물을 셀라이트로 여과하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (1.16 g)를 크로마실 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 100/0 내지 95/5). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 11을 0.12 g (8%) 수득하였다.

b) 중간체 12의 제조

EtOH (15 ml) 중의 중간체 11 (0.0003 mol) 및 수산화나트륨 (0.0013 mol)의 혼합물을 교반하여, 3 시간 환류시킨 다음, 실온으로 냉각시켜 증발 건조시켰다. 잔사를 디에틸에테르에 취하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 중간체 12 (융점: > 260℃)를 0.12 g (100%) 수득하였다.

c) 중간체 13의 제조

EDC (0.0006 mol) 및 HOBT (0.0006 mol)를, N₂ 기류하에서 실온에서 THF (15 ml) 및 DCM (15 ml) 중의 중간체 12 (0.0003 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 15 분간 교반하였다. O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0006 mol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하여, 빙수에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.25 g)를 크로마실 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 100/0 내지 95/5)). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 13을 0.1 g (70%) 수득하였다.

실시예 A4

a) 중간체 14의 제조

THF (300 ml) 및 수산화나트륨 1 N (300 ml) 중의 2-(1-피페라지닐)-5-피리미딘카르복실산에틸 에스테르 (0.059 mol)의 혼합물을 실온에서 하룻밤 정치시킨 다음, 교반시켰다. 염산 1 N (300 ml)을 가해, 혼합물을 10 분간 교반시켰다. 탄산나트륨 (0.178 mol)을 가해, 얻어진 혼합물 실온에서 10 분간 교반한 다음, 1-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]옥시]-2,5-피롤리딘디온 (0.059 mol)을 조금씩 가해, 반응 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하였다. 혼합물을 진한 HCl로 산성화하고 침전물을 여과하고 진공하에 건조하여, 중간체 14 (융점: 218.5 내지 221.2℃)를 22.5 g (90 %) 수득하였다.

b) 중간체 15의 제조

트리에틸아민 (0.069 mol), 이어서 EDC (0.0303 mol) 및 HOBT (0.0303 mol), 다음에 O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0303 mol)을, DCM/THF (500 ml) 중의 중간체 14 (0.0233 mol)의 혼합물에 가해, 반응 혼합물 실온에서 18 시간 교반하였다. 혼합물을 DCM으로 희석하여 수세하였다. 유기층을 분리하여, 10% 탄산나트륨 용액으로 세정하였다. 분리된 유기층을 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 100/0 내지 97.5/2.5 (100 분간). 생성물 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 15를 8.4 g (68 %) 수득하였다.

c) 중간체 16의 제조

피리딘 (0.040 mol) and DCM (200 ml) 중의 중간체 15 (0.016 mol)의 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하여, 반응 혼합물을 물로 추출한 다음, 수층을 농축시켜 아세토니트릴로 동시 증발시켰다. 잔사 (3.5 g)를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₃ 95/5/0.5). 생성물 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 16 (융점: 70.8 내지 93.9℃)을 2.5 g (50 %) 수득하였다.

d) 중간체 17의 제조

EtOH (25 ml) 중의 중간체 16 (0.002 mol), (E) [2-(4-플루오로페닐)에테닐]-보론산 (0.002 mol) 및 1,4-디옥산-2,5-디올 (0.002 mol)의 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하여, 얼음에 부은 다음, NaHCO₃를 가하였다. 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.68 g)를 크로마실 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 100/0 내지 90/10). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 17 (융점: 9O℃)을 0.27 g (29%) 수득하였다.

실시예 A5

a) 중간체 18의 제조

2-옥소-프로판산 (0.0169 mol), 이어서 2-(1-피페라지닐)-5-피리미딘카르복실산에틸 에스테르 (0.0169 mol)을, DCM (150 ml) 중의 [2-(4-플루오로페닐)에테닐]-보론산 (0.0169 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하였다. 2-옥소-프로판산 (0.4 eq) 및 [2-(4-플루오로페닐)에테닐]-보론산 (O.1 eq)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하였다. 유기층을 수세, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (7.7 g)를 실리카 겔 (15 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 92/8/0.1). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 이 잔사 (6 g)를 HCl 3 N에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 2 시간 교반하였다. 침전물을 여과, 수세 (최소량), 건조하여, 중간체 18을 2.8 g (36%) 얻었다.

b) 중간체 19의 제조

HOBT (0.0022 mol), 이어서 EDC (0.0022 mol)를, DCM/THF (40 ml) 중의 중간체 18 (0.0015 mol), N-메틸-메탄아민 (0.0022 mol) 및 트리에틸아민 (0.0075 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 교반하여, 물에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 DIPE에 취하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 중간체 19 (융점: 195℃)를 O.58 g (85%) 수득하였다.

c) 중간체 20의 제조

THF (20 ml) 및 물 (10 ml) 중의 중간체 19 (0.0011 mol) 및 수산화리튬 (0.0023 mol)의 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하였다. HCl 3 N을 가하였다. THF를 증발시켰다. 침전물을 여과하고, 수세한 다음, 디에틸에테르로 세정하고, 건조하여, 중간체 20을 0.45 g (82%) 수득하였다.

d) 중간체 21의 제조

HOBT (0.0014 mol), 이어서 EDC (0.0014 mol)를, 실온에서 DCM/THF (50/50) (75 ml) 중의 중간체 20 (0.0009 mol), O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0014 mol) 및 트리에틸아민 (0.0043 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하고, 물에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.7 g)를 실리카 겔 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 99/1/0.1 내지 94/6/0.6). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 21을 0.38 g (75%) 수득하였다.

실시예 A6

a) 중간체 22의 제조

수소화나트륨 60% (0.0085 mol)을, N₂ 기류하에서 5℃에서 THF (60 ml) 중의 중간체 1 (0.0065 mol)의 용액에 부분적으로 가하였다. 혼합물을 5℃에서 15 분간 교반하였다. THF (5 ml) 중의 요오도메탄 (0.0078 mol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 5℃에서 1 시간 교반한 다음에, 실온에서 5 시간 교반하여, 얼음에 부은 다음, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (1.75 g)를 실리카 겔 (15 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH 99/1). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 22를 0.87 g (34%) 수득하였다.

b) 중간체 23의 제조

THF (40 ml) 및 물 (20 ml) 중의 중간체 22 (0.0027 mol) 및 수소화리튬 일수화물 (0.0055 mol)의 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하여, HCl 1 N로 산성화하였다. THF를 증발시켰다. 침전물을 여과, 최소량의 물로 세정한 다음, 건조시켜, 중간체 23을 0.91 g (83%) 수득하였다.

c) 중간체 24의 제조

HOBT (0.0033 mol), 이어서 EDC (0.0033 mol)를, N₂ 기류하에서 실온에서 DCM/THF (90 ml) 중의 중간체 23 (0.0022 mol), O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0033 mol) 및 트리에틸아민 (0.01 mol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하여, 물에 부은 다음, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사 (1.3 g)를 실리카 겔 (15 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켜, 중간체 24를 0.93 g (89%) 수득하였다.

실시예 A7

a) 중간체 25의 제조

EtOH (200 ml) 중의 2-(1-피페라지닐)-5-피리딜카르복실산에틸 에스테르 (0.0085 mol), 1,4-디옥산-2,5-디올 (0.0093 mol) 및 (E)-[2-(4-플루오로페닐)에테닐]-보론산 (0.0042 mol)의 혼합물을 실온에서 15 시간 교반한 다음에, 여과하였다. 여액을 증발시켰다. 잔사를 EtOAc에 취하였다. 유기층을 포화 NaCl로 세정하고, 건조하고 (MgSO₄), 여과한 다음, 용매를 증발시켰다. 잔사 (3.3 g)를 디에틸에테르에 용해시키고, 이소프로판올 (2 ml) 중의 HCl 5 내지 6 N을 5℃에서 적가하여 산성화시켰다. 침전물을 여과하고, 디에틸에테르로 세정하여, 건조시켰다. 이 분획을 물에 취하고, K₂CO₃를 가하여, 혼합물을 DCM로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켜, 중간체 25를 2.7 g (79%) 수득하였다.

b) 중간체 26의 제조

물 (20 ml) 및 THF (40 ml) 중의 중간체 25 (0.002 mol) 및 수산화리튬 (0.004 mol)의 혼합물을 실온에서 15 시간 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다. 염산 3 N을 가하였다. 침전물을 여과하고, 수세한 다음, 디에틸에테르로 세정하여, 건조시켜서, 중간체 26을 0.52 g (63%) 수득하였다.

c) 중간체 27의 제조

트리에틸아민 (0.0057 mol), N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민 (0.0019 mol), 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 (0.0019 mol) 및 O-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-히드록실아민 (0.0019 mol)을, DCM (50 ml)과 THF (50 ml)의 혼합물 중의 중간체 26 (0.0012 mol)의 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 교반한 다음, H₂O에 부어, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리, 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (그레디언트 용리제: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2). 생성물 분획을 수집하고 유기 용매를 증발시켜, 0.55 g (91 %) 수득하였다. 이 잔사를 디에틸에테르에 취하고, 침전물을 여과, 건조하여, 중간체 27 (융점: 133℃)을 0.5 g 수득하였다.

실시예 A8

중간체 28 및 29의 제조

무수 아세트산 (0.014 mol)을, 5℃에서 DCM (14 ml) 중의 중간체 3 (0.0014 mol), 4-N,N-디메틸아미노피리딘 (0.0095 g) 및 피리딘 (2.5 ml)의 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 교반하고 농축시켜, 물에 취한 다음에, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 건조 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 (5 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (그레디언트 용리제: DCM/MeOH 95/5). 순수한 분획을 수집하고 유기 용매를 증발시켜서, 중간체 28을 0.48 g (58%) 수득하였다. 옥살산염을 분획 상에 제조하여, 2-프로판온/디에틸에테르로 결정화하였다. 침전물을 여과, 건조하여, 중간체 29 (융점: 154℃)를 0.042 g 수득하였다.

표 F-I은 상기 일실시예에 따라 제조된 중간체를 기재한다.

표 F-1 (중간체)

Interm.: 중간체 enantiomer: 에난티오머

B. 최종 화합물의 제조

실시예 B1

화합물 1의 제조

TFA (2.5 ml) and MeOH (50 ml) 중의 중간체 3 (0.00121 mol)의 혼합물을 48 시간 교반한 다음, 용매를 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 리크로프렙 (LiChroprep)^® NH₂ (25 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/H₂O 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 잔사를 디에틸에테르에 취한 다음, 침전물을 여과하고 진공하에 5O℃에서 건조시켜서, 화합물 1 (융점: 187℃)을 0.26 g (64%) 수득하였다.

실시예 B2

화합물 2의 제조

트리플루오로아세트산 (0.2 ml) 및 MeOH (4.5 ml) 중의 중간체 8 (0.00007 mol)의 혼합물을 실온에서 96 시간 교반하였다. 용매를 증발 건조시켰다. 잔사를 디에틸에테르/2-프로판온으로 결정화하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 화합물 2 (융점: 135℃)를 0.025 g (57%) 수득하였다.

실시예 B3

화합물 7의 제조

TFA (0.5 ml) 및 MeOH (10 ml) 중의 중간체 13 (0.0002 mol)의 혼합물을 실온에서 48 시간 교반한 다음, 증발 건조시켰다. 잔사를 디에틸에테르로 결정화하였다. 침전물을 여과, 건조하여, 화합물 7 (융점: 161℃) 0.044 g (44%)을 수득하였다.

실시예 B4

화합물 8의 제조

TFA (1.2 ml) 및 MeOH (24 ml) 중의 중간체 17 (0.0005 mol)의 혼합물을 실온에서 5 일간 교반하였다. 용매를 증발 건조시켰다. 잔사 (0.26 g)를 실리카 겔 리크로프렙 (LiChroprep)^? NH₂ (25 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/H₂O 70/30/3). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.16 g)를 디에틸에테르로 결정화하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 화합물 8 (융점: 180℃)을 0.13 g (66%) 수득하였다.

실시예 B5

화합물 9의 제조

TFA (1 ml) 및 MeOH (20 ml) 중의 중간체 28 (0.0004 mol)의 혼합물을 실온에서 96 시간 교반한 다음, 증발시켰다. 잔사 (0.23 g)를 실리카 겔 리크로프렙 (LiChroprep)^? NH₂ (25 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/H₂O 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 잔사 (0.106 g)를 디에틸에테르/DIPE로 결정화하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 화합물 9 (융점: 161℃)를 0.067 g (34%) 수득하였다.

실시예 B6

화합물 10의 제조

TFA (1.9 ml)를, 5℃에서 MeOH (38 ml) 중의 중간체 21 (0.0007 mol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 교반한 다음, 증발 건조시켰다. 잔사를 디에틸에테르/CH₃CN으로 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 디에틸에테르로 세정하여 건조시켜서, 화합물 10 (융점: 146℃)을 0.24 g (62%) 수득하였다.

실시예 B7

화합물 11의 제조

TFA (4.4 ml) 및 MeOH (87 ml) 중의 중간체 24 (0.0018 mol)의 혼합물을 실온에서 4 일간 교반한 다음, 증발 건조시켰다. 잔사 (1.05 g)를 실리카 겔 리크로프렙 (LiChroprep)^? NH₂ (25 내지 40 ㎛) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리제: DCM/MeOH/H₂O 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 이 분획 (0.634 g)을 디에틸에테르에 취하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 화합물 11 (융점: 212℃)을 0.43 g 수득하였다.

실시예 B8

화합물 31의 제조

트리플루오로아세트산 (3 ml) 및 MeOH (60 ml) 중의 중간체 27 (0.0011 mol)의 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하였다. 용매를 증발 건조시켰다. 잔사를 디에틸에테르로 결정화하였다. 침전물을 여과하고 건조하여, 화합물 31 (융점: 145℃)을 0.515 g (89%) 수득하였다.

표 F-2는 상기 일실시예에 따라 제조된 중간체를 기재한다. 하기 약어를 표 에 사용하였다: C₂HF₃O₂는 트리플루오로에세테이트를 나타낸다.

표 F-2 (최종 화합물)

Co. No.: 화합물 번호 enantiomer: 에난티오머

C. 약리학적 실시예:

히스톤 디아세틸라제의 저해에 대한 시험관 내 분석에서 (실시예 C.1 참조) 일반식 (I)의 화합물로부터 얻은 HDAC 효소 활성의 저해를 측정한다.

일반식 (I)의 화합물의 세포 활성은 세포 독성 또는 생존에 대한 측색적 분석을 이용하여 A2780 종양 세포 상에서 결정된다 (Mosmann Tim, Journal of Immunological method 65: 55-63,1983) (실시예 C.2 참조).

화합물의 용해도는 용액 중에 잔류하는 화합물의 능력을 측정한다. 제 1 방법에 있어서, 희석 시에 수용액 중에 잔류하는 화합물의 능력 (실시예 C.3.a 참조)을 측정한다. DMSO-스톡 용액은 3 개의 연속적인 단계에서 단일한 수성 완충 용매로 희석된다. 모든 희석 탁도는 비탁계로 측정된다.

제 2 방법에 있어서, 상이한 pH에서의 화합물의 용해도는 화학발광 질소 검출기를 사용하여 측정될 수 있다 (실시예 C.3.b 참조).

약물 투과성은 한 배지로부터 다른 배지로 또는 다른 배지를 통해 이동하는 이의 능력을 표현한다. 구체적으로는 장관막을 통해 혈류 및/또는 혈류로부터 표적으로 이동하는 그의 능력이다. 투과성 (실시예 C.4 참조)은 필터 고정화 인공막 인지질 이중층의 형성을 통해 측정될 수 있다. 필터 고정화 인공막 분석에서, "샌드위치"가 96 웰 마이크로타이터 플레이트 및 96 웰 필터 플레이트로 형성되어, 각각의 복합 웰은 시스템이 완충 수용액과 접촉할 때에 다층 이중층이 필터 채널 내부에 형성되는 조건하에서, 디올레오일포스파티딜콜린의 2% (wt/v) 도데칸용액으로 코팅된 125 ㎛ 마이크로필터 디스크 (0.45 ㎛ 구멍)에 의해 분리되는 저부의 공여체 용액과 상부의 수용체 용액을 가진 2개의 챔버로 분리된다. 이 인공막을 통한 화합물의 투과성은 cm/s로 측정된다. 목적은 상이한 pH: 4.0 및 7.4에서의 평행 인공막을 통한 약물의 투과를 조사하는 것이다.

화합물 검출은 250과 500 nm 사이의 최적 파장에서 자외 분광법으로 행해진다.

약물의 대사는 지용성 생체 이물 또는 생물체 내생 화합물이 (a) 극성, 수용성 및 분비가능한 대사 산물로 효소 변환된다.

약물 대사의 주요 기관은 간이다. 대사 산물은 종종 모약물 보다 덜 활성적이거나 불활성이다. 그러나, 일부 대사 물질은 향상된 활성 또는 독성 효과를 갖는다. 따라서, 약물 대사는 "해독" 및 "중독" 과정을 포함할 수 있다. 약물 및 화학 물질을 다루는 유기체의 능력을 결정하는 주요 효소계 중 하나는 NADPH 의존성 효소인 시토크롬 P450 모노옥시게나제로 나타낸다. 화합물의 대사적 안정성은 인간 세포내 조직을 사용한 시험관 내에서 결정될 수 있다 (실시예 C.5.a 참조). 여기에서 화합물의 대사적 안정성은 마이크로솜을 사용한 이들 화합물의 배양을 15분 후의 대사된 약물의 %로서 나타낸다. 화합물의 정량은 LC-MS 분석에 의해 결정된다. 화합물의 대사적 안정성은 또한 래트 간세포 중의 화합물의 반감기를 계산함으로써 측정될 수 있다 (실시예 C.5.b 참조).

다종 다양한 항종양제가 DNA 손상제 및 히스톤 디아세틸라제 저해제를 포함하는 p21 단백질을 활성화시티는 것으로 알려져 있다. DNA 손상제는 종양 억제자 p53를 통해 p21 유전자를 활선화시키는 반면, 히스톤 디아세틸라제 저해제는 전사 인자 Sp1를 통해 p21 유전자를 전사적으로 활성화시킨다. 그리하여, DNA 손상제는 p53 응답 배열을 통해 p21 프로모터를 활성화시키는데 반해, 히스톤 디아세틸라제 저해제는는 sp1 부위 (TATA 박스에 대하여 -60bp 내지 +40bp 영역에 위치함)를 통해 p21 프로모터를 활성화시키며, DNA 손상제 및 히스톤 디아세틸라제 저해제는 p21 단백질의 증대된 발현을 가져온다. 세포 중의 p21 프로모터가 p53 응답 배열을 포함하지 않는 p21 1300 bp 프로모터 프레그먼트로 구성되면, 따라서 DNA 손상제에 대하여 비반응성을 나타낸다. p21을 유도하는 화합물의 능력은 여러가지 방법으로 평가될 수 있다. 제 1 방법은 목적으로 하는 화합물을 사용하여, 세포의 용해 후에 종양 세포를 처리하여, p21 효소면역측정법 (종양 유전자의 WAF1 ELISA)으로 p21 유도를 검출한다. p21 분석은 마우스 모노클로날 및 래빗 폴리클로날을 사용하는 "샌드위치" 효소면역측정법이다. 인간 p21 단백질에 특이적인 래빗 폴리클로날 항체는 키트에 제공되는 플라스틱 웰의 표면에 고정화되어 있다. 분석할 샘플에 존재하는 p21은 포획 항체에 결합할 것이다. 비오틴화 검출 모노클로날 항체는 또한 인간 p21 단백질을 인지하고, p21에 결합되어, 포획 항체에 의해 유지된다. 그 다음에, 검출 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘에 의해 결합된다. 양고추냉이 퍼옥시다제는 무색 용액에서 청색 용액 (또는 정지 시약의 첨가 후에 황색)으로의 발색 기질 테트라메틸벤지딘의 전환을 촉진시키며, 이의 세기는 플레이트에 결합된 p21 단백질의 양에 비례한다. 착색된 반응 생성물은 분광광도계를 이용하여 정량화된다. 정량화는 기지 농도의 p21 (동결건조)을 사용하여 표준곡선을 구축하여 달성된다. 이러한 분석은 DNA 손상의 결과 또는 히스톤 디아세틸라제 저해의 결과로서 p21 유도를 측정할 수 있다 (실시예 C.6.a 참조).

또 하나의 방법은 세포 레벨에서의 HDAC 저해의 결과로서 p21을 유도하는 화합물의 능력을 테스트한다. 세포는 p53 응답 배열을 포함하지 않고, 수용체 유전자 발현의 증가로, 대조군 레벨과 비교하여, 화합물을 p21 유도 능력을 갖는 것으로서 동정되는 p21 1300bp 프로모터 프레그먼트를 함유하는 발현 벡터로 안정하게 도입될 수 있다. 수용체 유전자는 형광 단백질이고, 수용체 유전자의 발현은 방출된 형광량으로서 측정된다 (실시예 C.6.b 참조). 최종 방법은 마우스가 화합물의 약제 활성을 스크리닝하는데 사용되는 생체 내 방법이다. 상술한 안정하게 도입된 종양 세포는 종양을 형성시키는데 충분한 양으로 마우스에 투여될 수 있다. 종양 세포가 종양을 형성하는데 충분한 시간을 가진 후에, 잠재 활성을 지닌 화합물은 동물에 투여될 수 있고, 종양 세포에 대한 상기 화합물의 효과는 수용체 유전자의 발현을 측정함으로써 평가된다. 약제 활성을 지닌 화합물로 배양하면, 대조군 레벨에 비교하여, 수용체 유전자 발현의 증가를 가져올 것이다 (실시예 C.6.c 참조).

특이성 HDAC 저해제는 풍부한 CYP P450 단백질과 같이, 다른 효소를 저해하지 않는다. CYP P450 (E. coli 발현된) 단백질 3A4, 2D6 en 2C9는 이의 특이적 기질을 형광분자로 전환한다. CYP3A4 단백질은 7-벤질옥시-트리플루오로메틸 쿠마린 (BFC)을 7-히드록시-트리플루오로메틸 쿠마린로 전환한다. CYP2D6 단백질은 3-[2-(N,N-디에틸-N-메틸아미노)에틸]-7-메톡시-4-메틸쿠마린 (AMMC)을 3-[2-(N,N-디에틸아미노)에틸]-7-히드록시-4-메틸쿠마린 하이드로클로라이드로 전환하고, CYP2C9 단백질은 7-메톡시-4-트리플루오로메틸 쿠마린 (MFC)을 7-히드록시-트리플루오로메틸 쿠마린으로 전환한다. 효소 반응을 저해하는 화합물은 형광 신호의 감소를 가 져올 것이다 (실시예 C.7 참조).

실시예 C.1: 히스톤 디아세틸라제의 저해에 대한 시험관 내 분석:

바이오몰 (Biomol)의 HDAC 형광 활성 분석/약물 디스커버리 키트 (cat. No: AK-500-0001)를 사용한다. HDAC 형광 활성 분석은 플루오르 디 리스 (Fluor de Lys (Fluorgenic Histone deAcetylase Lysyl)) 기질 및 현상제 조합에 기초한다. 플루오르 디 리스 기질은 아세틸화 리신 측쇄를 포함한다. 기질의 디아세틸화는 제 2 단계에서 플루오르 디 리스 기질로 처리하여, 형광 프로브를 산출하도록 기질을 감작시킨다.

HeLa 핵 추출물 (공급자: Biomol)을 75 μM의 기질을 사용하여 60 ㎍/ml로 배양하였다. 플루오르 디 리스 기질을 pH 7.4에서 25 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl 및 1 mM MgCl₂·6H₂O을 함유하는 완충액에 가하였다. 30분 후에, 1 체적의 현상제를 가하였다. 형광 프로브를 355 nm 광으로 여기하여, 방출된 광 (450 nm)을 형광 플레이트 리더에서 검출하였다.

각 실험에 대하여, 대조군 (HeLa 핵 추출물 및 완충액 함유), 블랭크 배양 (완충액을 함유하나 HeLa 핵 추출물을 함유하지 않음) 및 샘플 (DMSO 중에 용해되고 완충액으로 희석된 화합물 및 HeLa 핵 추출물 함유)을 병행하여 진행시켰다. 첫번째 예에서, 화합물은 10^-5M의 농도에서 테스트되었다. 화합물이 10^-5M에서 활성을 나타낼 때, 농도 반응 곡선이 작성되며, 여기에서 화합물은 10^-5M과 10^-9M 사이의 농도에서 테스트되었다. 각각의 시험에서, 블랭크 값을 대조군 및 샘플 값에서 뺐 다. 대조군 샘플은 100%의 기질 디아세틸화를 나타냈다. 각각의 샘플에서 형광성은 대조군의 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 적당한 IC₅₀ 값 (대사물질의 양을 대조군의 50%로 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 등급화된 데이터에 대한 프로빗 분석을 이용하여 계산하였다. 여기에서 시험 화합물의 효과는 pIC₅₀ (IC₅₀값의 음의 로그 값)으로 나타낸다 (표 F-3 참조).

실시예 C.2: A2780 세포에 대한 항증식 활성의 측정

시험된 모든 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 추가로 배지에서 희석을 행하였다. 최종 DMSO 농도는 세포 증식 분석 중에서 0.1 % (v/v)를 초과하지 않았다. 대조군은 화합물 없이 DMSO 및 A2780 세포를 함유하였으며, 블랭크는 세포 없이 DMSO를 함유하였다. MTT를 PBS 중에서 5 mg/ml로 용해시켰다. NaOH (1N)로 pH 10.5로 완충된 0.1 M 글리신 및 0.1 M NaCl을 포함하는 글리신 완충액이 제조되었다 (모든 시약은 Merck사 제임).

인간 A2780 난소 암세포 (Dr. T. C. Hamilton의 기증 [Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, USA])를 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/ml 겐타마이신 및 10 % 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 내에서 배양했다. 세포는 보통 37℃에서 습기가 있는 5% C0₂ 분위기 중에서 단층 배양으로서 유지되었다. 세포를 1:40의 분할 비율에서의 트립신/EDTA 용액을 이용하여 1주에 1회 통과시켰다. 모든 배지 및 보충물은 라이프 테크놀러지 (Life Technologies)사로부터 얻었다. 젠-프로브 미코플라즈마 조직 배양 키트 (Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture kit) (공급자: BioMerieux)를 이용하여 측정된 것으로서, 세포는 미코플라즈마 오염이 없었다. 세포를 NUNC^TM 96웰 배양 플레이트 (공급자: Life Technologies)에 파종하여, 하룻밤 플라스틱에 부착시켰다. 플레이팅에 사용된 농도는 총 체적 200 ㎕ 배지에서 웰당 1500개의 세포이었다. 플레이트에의 세포 부착 후, 배지를 바꾸고, 약물 및/또는 용매가 최종 체적 200 ㎕까지 가해졌다. 4 일간 배양 후, 배지를 200 ㎕의 신선한 배지로 교체하고, 세포 밀도 및 생존율을 MTT 베이스 분석을 사용하여 측정했다. 각각의 웰에, 25 ㎕의 MTT 용액을 가하고 세포를 추가로 2 시간 동안 37℃에서 배양했다. 그 후, 배지를 조심스럽게 뽑아내고, 청색 MTT-포르마잔 산물을 25 ㎕ 글리신 완충액, 이어서 100 ㎕ DMSO의 첨가에 의해 가용화하였다. 마이크로테스트 플레이트를 10분 동안 마이크로플레이트 셰이커에서 진탕하고, 540 nm에서의 흡광도를 Emax 96웰 분광광도계 (공급자: Sopachem)로 측정하였다. 실험 중에서, 각각의 실험적 조건에 대한 결과는 3개의 복제 웰의 평균이다. 최초의 스크리닝 목적을 위해, 화합물은 단일 고정된 10^-6 M의 농도에서 테스트되었다. 활성 화합물에 대해, 실험은 완전한 농도 반응 곡선을 확증하도록 반복되었다. 각각의 실험에 대해, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)이 동시에 진행되었다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값으로부터 뺐다. 각각의 샘플에 대해, 세포 증식의 평균값 (흡광도 단위로)을 대조군의 세포 증식에 대한 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 적절한 경우에, IC₅₀값 (대조군의 50%로 세포 증식을 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 등급화된 자료에 대한 프로빗 분석을 이용하여 측정했다 (Finney, D. J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). 여기에서 시험 화합물의 효과는 pIC₅₀ (IC₅₀의 음의 로그값)으로서 나타낸다 (표 F-3 참조).

실시예 C.3: 용해도/안정성

C.3.a. 수성 배지 중에서의 동적 용해도

첫번째 희석 단계에서는 DMSO (5 mM) 중에 가용화된 활성 화합물의 10 ㎕의 농축 스톡 용액을 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4에 가해, 혼합하였다. 두번째 희석 단계에서는 첫번째 희석 단계의 일정 분량 (20 ㎕)를 추가로 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4에 분배하여 혼합하였다. 최종적으로, 세번째 희석 단계에서는 두번째 희석 단계의 샘플 (20 ㎕)을 추가로 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4 중에 희석시켜 혼합하였다. 모든 희석은 96웰 플레이트에서 행해졌다. 최종 희석 단계 후 즉시, 3개의 연속 희석 단계의 탁도를 비탁계로 측정했다. 희석은 우발적인 과실을 배제하기 위해 각각의 화합물에 대해 삼중으로 행해졌다. 탁도 측정에 기초하여, 랭킹은 3개의 부류로 행해진다. 높은 용해도를 지닌 화합물은 스코어 3을 얻었으며, 이들 화합물에 대한 첫번째 희석액은 맑다. 중간 용해도를 지닌 화합물은 스코어 2를 얻었다. 이들 화합물에 대한 첫번째 희석액은 맑지 않고, 두번째 희석액이 맑다. 낮은 용해도를 지닌 화합물은 스코어 1을 얻었으며, 이들 화합물에 대한 첫번째, 두번째 희석액 모두 맑지 않다 (표 F-3 참조).

C.3.b. 용해도

상이한 pH에서의 화합물의 용해도는 또한 화학발광 질소 검출기를 사용하여 측정될 수 있다 (표 F-3 참조).

실시예 C.4: 평행 인공막 투과성 분석

스톡 샘플 (100% DMSO 중의 5 mM의 스톡 용액의 10 ㎕의 일정 분량)을 2 ml의 수성 완충계 pH 4 또는 pH 7.4을 함유하는 딥웰 (deep-well) 또는 프리-믹스 (Pre-mix) 플레이트에서 희석시켰다 (PSR4계 농축액 (pION)).

샘플을 기준 플레이트에 가하기 전에, 150 ㎕의 완충액을 웰에 가하고, 블랭크 UV 측정을 행하였다. 그 후, 완충액을 제거하고, 그 플레이트를 기준 플레이트로 사용했다. 모든 측정은 자외선 저항성 플레이트에서 행해졌다 (공급자: Costar 또는 Greiner).

기준 플레이트의 블랭크 측정 후, 150 ㎕의 희석 샘플이 기준 플레이트에 가해졌고, 200 ㎕의 희석 샘플이 도너 플레이트 (donor plate) 1에 가해졌다. 어셉터 필터 플레이트 (acceptor filter plate) 1 (공급자: Millipore, 종류: MAIP N45)을 4 ㎕의 인공막 형성 용액 (0.1% 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀을 함유하는 도테칸 중의 1,2-디올레오일-sn-글리세르-3-포스포콜린)로 코팅되고, "샌드위치"를 형성하기 위해 도너 플레이트 1의 상부에 놓였다. 완충액 (200 ㎕)을 상부의 어셉터 웰로 분배했다. "샌드위치"는 덮개로 덮고, 18시간 동안 어두운 곳에서 실온에서 저장되었다.

어셉터 플레이트 2의 블랭크 측정은 150 ㎕의 완충액을 웰에 가하고, 자외선 측정을 행함으로써 수행되었다. 어셉터 플레이트 2의 블랭크 측정 후, 완충액을 제거하고, 150 ㎕의 어셉터 용액을 어셉터 필터 플레이트 1에서 어셉터 플레이트 2로 옮겼다. 그리고 나서, 어셉터 필터 플레이트 1을 "샌드위치"로부터 제거했다. 도너 플레이트 2의 블랭크 측정 후 (상기 참조), 150 ㎕의 도너 용액을 도너 플레이트 1로부터 도너 플레이트 2로 옮겼다. 도너 플레이트 2, 어셉터 플레이트 2 및 기준 플레이트 웰의 UV 스펙트럼들이 스캔되었다 (SpectraMAX 190 사용). 모든 스펙트럼이 PSR4p 코맨드 소프트웨어 (PSR4p Command Software)로 투과성을 계산하기 위해 처리되었다. 모든 화합물이 삼중으로 측정되었다. 카바마제핀, 그리세오풀빈, 아사이클로구아니신, 아테놀롤, 푸로세미드 및 클로로티아지드가 각 실험에서 표준물질로서 사용되었다. 화합물이 낮은 투과성 (평균 효과 < 0.5 × 10^-6 cm/s; 스코어 1), 중간 투과성 (1 × 10^-6 cm/s > 평균 효과 ≥ 0.5 × 10^-6 cm/s; 스코어 2) 또는 높은 투과성(≥ 1 × 10^-6 cm/s; 스코어 3)을 갖는 것으로서 3 개의 카테고리로 분류되었다.

실시예 C.5: 대사적 안정성

조직의 기계적 균질화 후 원심분리에 의해 문헌 [참조: Gorrod et al., Xenobiotica 5: 453-462, 1975)에 따라 세포내 조직을 준비했다. 간 조직을 아이스 콜드 0.1 M 트리스-HCl (pH 7.4) 완충액으로 린스하여 과량의 혈액을 세척했다. 그 후, 조직을 건조시키고 (blot dry), 중량을 재고, 수술용 가위를 사용하여 굵게 잘랐다. 조직 조각을 테플론 페슬 (Teflon pestle)을 갖춘 포터-에스 (Potter-S (Braun, 이탈리아)) 또는 소르발 옴니-믹스 균질화기 (Sorvall Omni-Mix homogeniser)를 이용하여, 7 × 10 sec 동안 3개의 체적의 아이스 콜드 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 균질화시켰다. 모든 경우에서, 용기는 균질화 과정 동안 얼음 안/상에 놓여졌다.

조직 호모지네이트를 9000 × g로 20 분간 4℃에서 소르발 원심분리기 (Sorvall centrifuge) 또는 벡만 초원심분리기 (Beckman Ultracentrifuge)를 사용하여 원심분리했다. 생성된 상청액을 -80℃로 보존하고, 'S9'로 지칭한다.

S9 분획을 추가로 100,000 × g로 60 분간 (4℃) 벡만 초원심분리기를 이용하여 원심분리했다. 생성된 상청액을 조심스럽게 뽑아내고, 나누고 (aliquoted), '시토졸 (cytosol)'로 지칭한다. 펠릿을 최초 조직 중량 0.5 g 당 1 ml의 최종 체적으로 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에 재현탁시키고, '마이크로솜'으로 지칭한다.

모든 세포내 분획을 나누고, 즉시 액체 질소 중에서 동결시켜 사용할 때까지 -80℃로 저장했다.

테스트 샘플에 대해, 배양 혼합물은 PBS (0.1 M), 화합물 (5 μM), 마이크로솜 (1 mg/ml) 및 NADPH 생성계 (0.8 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.8 mM 염화마그네슘 및 0.8 유닛의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제)를 함유했다. 대조군 샘플은 동일한 물질을 함유했으나, 마이크로솜은 가열 불활성화한 (섭씨 95도에서 10분간) 마이크로솜으로 대체되었다. 대조군 샘플 내에서의 화합물의 회수는 항상 100%이었다.

혼합물을 섭씨 37도에서 5분 동안 전배양했다. 반응은 시점 0 (t = 0)에서 0.8 mM NADP의 첨가에 의해 시작되었으며, 샘플은 15 분 (t = 15) 동안 배양되었다. 반응은 2개의 체적의 DMSO의 첨가에 의해 종료되었다. 그리고 나서, 샘플을 10분 동안 900 × g로 원심분리하고, 상청액을 분석 전에 실온에서 24 시간 이하 동안 보관했다. 모든 배양은 이중으로 수행되었다. 상청액에 대한 분석은 LC-MS 분석으로 수행되었다. 샘플의 용리는 엑스테라 (Xterra) MS C18 (50 × 4.6 mm, 5㎛, Waters, US) 상에서 수행되었다. 얼라이언스 (Alliance) 2790 (공급자: Waters, US) HPLC 시스템이 사용되었다. 용리는 완충액 A (H₂0/아세토니트릴 (95/5) 중의 25 mM 아세트산암모늄 (pH 5.2)), 아세토니트릴인 용매 B, 메탄올인 용매 C로 2.4 ml/min의 유량으로 이루어졌다. 사용된 그레디언트는 유기상 농도를 5분내의 50% B 및 50% C에서 0%로부터, 1분내에 100% B로 선형으로 증가시키고, 유기상의 농도를 추가 1.5분 동안 고정시켰다. 샘플의 총 주입량은 25 ㎕이었다.

쿼트로 (Quattro) (공급자: Micromass, Manchester, UK) 삼중 사중극자 질량 분석계를 설비하고, ESI 소스를 검출기로서 사용했다. 소스 및 탈용매화 온도를 각각 120 및 350℃로 설정했으며, 질소가 네불리저 (nebuliser) 및 건조 가스로 사용되었다. 데이터는 포지티브 스캔 모드로 얻었다 (단일 이온 반응). 콘 전압 (Cone voltage)은 10 V로 설정하고, 체류시간은 1초이었다.

대사적 안정성은 활성 마이크로솜 (E(act))의 존재하에서의 15 분간의 배양 후의 화합물의 대사 %로 나타냈다 (% 대사 = 100% - (t = 15에서의 E(act)의 총 이온 흐름 (TIC) / t = 0에서의 E(act)의 TIC) × 100)). 20 % 미만의 퍼센트 대사를 갖는 화합물은 고도의 대사적 안정성으로 정의된다. 20%와 70% 사이의 대사를 갖는 화합물은 중간적 안정성으로 정의되며, 70% 이상의 대사를 갖는 화합물은 낮은 대사적 안정성으로 정의된다. 3개의 기준 화합물은 대사적 안정성 스크리닝이 행해질 때마다 항상 포함되었다. 베라파밀 (Verapamil)이 낮은 대사적 안정성을 지닌 화합물로서 포함되었다 (% 대사 = 73 %). 시사프리드 (Cisapride)가 중간적 대사 안정성을 지닌 화합물로서 포함되었으며 (% 대사 = 45%), 프로판올이 중간 내지 높은 대사적 안정성을 지닌 화합물로서 포함되었다 (25% 대사). 이들 기준 화합물이 대사적 안정성 분석을 확인하는데 사용되었다.

C.5.b: 래트 간세포 세포 배양을 이용한 대사적 안정성

래트 간세포는 수컷 스프라크 다울리 (Sprague Dowley) 래트에서 분리되었다. 화합물을 100% DMSO 중의 5 mM 스톡 용액으로 용해시키고, 24웰 플레이크를 이용하여 래트 간세포 세포 배양 (50만 생존세포/0.5 ml)으로 0, 15, 30, 60 및 120 분간 5 μM의 최종 농도로 배양하였다. 샘플을 2개의 체적의 DMSO를 가해 LC-MS에 대하여 준비하였다. 샘플을 충분히 진탕시키고, 이어서 10분간 900 × g으로 원심분리하였다 (실온). 모든 실험을 삼중으로 행하였다. 얻어진 상청액 중, 50 ㎕를 LC-MS로 분석하였다.

LC-MC에 대해서는, 샘플 용리를 하이퍼실 (Hypersil) C18 컬럼 (50 × 4.6 mm, 5 ㎛, Thermohypersil, UK)에서 행하였다. HPLC 시스템은 서베이어 (Surveyor) 오토샘플러 장치를 갖춘 서베이어 운반 시스템 (Surveyor Inc., San Jose, US)으로 구성되었다. 용리는 완충액 A (H₂0/아세토니트릴 (95/5) 중의 10 mM 아세트산암모늄 (pH 6.9)) 및 용매 B (아세토니트릴)로 1.2 ml/min의 유량으로 이 루어졌다. 사용된 그레디언트는 개시 상태로서 0.5 분간 용매 A로 하고, 유기상 농도를 2분간에 걸쳐서 0% 내지 95%로 선형으로 증가시켰다. 이 상은 추가로 2 분간 고정되었고, 다시 0.5분 이내에 0% B로 감소되었다.

샘플의 총 주입량은 50 ㎕이었다. 컬럼 오븐 온도를 40℃로 유지하였다. LC 유량을 MS에 대하여 분할하고 0.1 ml를 소스로 넣었다. ESI 소스를 장착한 삼중 사중극자 질량 분석계로서의 TSQ 퀀텀 (Quantum) (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA) 질량 분석계를 검출을 위해 사용하였다. 소스 전압을 3800 볼트로 설정하고, 모세관 온도를 300℃로 설정하였다. 질량 분석계를 정량화 용도를 위해 1 Da의 스캔 폭을 이용하여, M+H의 질량으로 조정된 SIM에서 양이온 모드로 작동시켰다. 엑스칼리버 (Xcalibur) 소프트웨어 (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)를 이용하여, 측정기 제어, 데이터 수집 및 프로세싱을 행하였다. 래드 간세포의 대사적 안정성을 시험관 내 반감기로서 나타내었다.

기준으로서, 화합물 R306465 (WO03/76422)을 사용하였다 (시험관 내 반감기: 8 분). 본 출원의 화합물 4를 테스트한 결과, 23분의 시험관 내 반감기를 가졌다.

실시예 C.6: p21 유도 능력

실시예 C.6.a: p21 효소면역측정법

하기 프로토콜이 사람 A2780 난소 암세포 내의 p21 단백질 발현량을 측정하기 위해 적용되었다. A2780 세포 (20000개의 세포/180 ㎕)가 2 mM L-글루타민, 50㎍/ml 겐타마이신 및 10 % 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중의 96 마이크로웰 플레이트에 파종되었다. 세포 용해 24 시간 전에, 화합물을 최종 농도 10^-5, 10^-6, 10^-7및 10^-8M로 가했다. 시험된 모든 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 추가로 희석을 배지에서 행하였다. 화합물 첨가 후 24 시간 후, 상청액을 세포로부터 제거했다. 세포를 200 ㎕ 아이스 콜드 PBS로 세척했다. 웰을 뽑아내고, 30 ㎕의 용해 완충액 (50 mM 트리스.HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% Nonidet p40 및 10 % 글리세롤)을 가했다. 플레이트를 -70℃에서 하룻밤 배양했다.

적당한 수의 마이크로타이터 웰을 포일 파우치 (foil pouch)로부터 제거하여, 빈 웰 홀더 (well holder)에 놓았다. 세척 완충액 (Wash Buffer) (20× 플레이트 세척 농축액: PBS와 계면활성제의 100 ml의 20배 농축액. 2% 클로로아세트아미드를 함유)의 희석 표준용액 (1×)을 준비했다. 동결건조된 p21WAF 표준물질을 증류수로 용해시키고, 추가로 샘플 희석제 (키트 내에 제공)로 희석하였다.

샘플 희석제 중에 1:4로 희석시켜 샘플을 제조하였다. 샘플 (100 ㎕) 및 p21WAF1 표준물질 (100 ㎕)을 적당한 웰에 피펫하고, 실온에서 2 시간 동안 배양했다. 웰을 1× 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 100 ㎕의 검출 항체 시약 (비오틴화 모노클로날 p21WAF1 항체의 용액)을 각각의 웰에 피펫하였다. 웰을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 1× 세척 완충액으로 3회 세척했다. 400× 컨쥬게이트 (퍼옥시다제 스트렙타비딘 컨쥬게이트: 400배 농축액)를 희석하고, 100 ㎕의 1× 용액을 웰에 가했다. 웰을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 1× 세척 완충액으로 3회, 증류수로 1회 세척했다. 기질 용액 (발색 기질) (100 ㎕)을 웰에 가하고, 웰을 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양시켰다. 정지액을 이전에 가한 기질 용액과 동일한 순서로 각 웰에 가했다. 각 웰에서의 흡광도를 분광광도계 플레이트 리더 를 사용하여 450/595 nm의 이파장에서 측정했다.

각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)을 동시에 진행시켰다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대하여, p21WAF1 유도에 대한 값 (흡광도 단위로)은 대조군에 존재하는 p21WAF1에 대한 값의 퍼센트로서 나타냈다. 130% 이상의 퍼센트 유도가 유의한 (significant) 유도로 정의되었다. 4개의 화합물이 테스트되고, 모두 유의한 유도를 나타냈다.

실시예 C.6.b: 세포 방법

A2780 세포 (ATCC)를 5% C0₂를 갖는 습기가 있는 인큐베이터에서 37℃에서 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 1640 배지 내에서 배양하였다. 모든 세포 배양액은 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD)에 의해 제공된다. ㄷ다다른 물질은 Nunc에 의해 제공된다.

게놈 DNA을 증식하는 A2780 세포로부터 추출하여, p21 프로모터의 네스티드 (nested) PCR 분리에 대한 주형으로서 사용하였다. 주형으로서 게놈 DNA를 갖는 올리고뉴클레오티드쌍, GAGGGCGCGGTGCTTGG 및 TGCCGCCGCTCTCTCACC을 이용하여, 55℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 제 1 증폭을 행하였다. TATA 박스에 대하여 -4551 내지 +88 프레그먼트를 포함하는 얻어진 4.5 kb 프레그먼트를, 4.5 kb 프레그먼트를 산출하는 88℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 올리고뉴클레오티드 TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG 및 ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC로, 계속해서 TATA 박스에 대하여 -1300 내지 +88 프레그먼트를 포함하는 1.3 kb 프레그먼트를 산출하는 88℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 올리고뉴클레오티드쌍 TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC 및 ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC로 재증폭하였다. 올리고뉴클레오티드에 존재하는 제한 효소 인식 부위 Xhol 및 Kpnl를 서브클로닝을 위해 사용하였다.

루시페라제 리포터를 pGL3 기저 벡터로부터 제거하여, Xhol 및 Kpnl 제한 효소 인식 부위에서 ZsGreen 리포터 (pZsGreen1-N1 플라스미드)로 교체하였다. Xhol 및 Kpnl 부위에서 상술한 인간 p21 프로모터의 1.3 kb 프레그먼트를 pGL3 기저-ZsGreen으로 삽입함으로써, pGL3 기저-ZsGreen-1300을 구축하였다. 제한 효소는 베리어 맨하임 (Boehringer Manheim (Germany))에 의해 제공된다. A2780 세포를 2 × 10⁵ 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 플레이트하고, 24 시간 배양하여, 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Brussels, Belgium)을 이용하여 2 ㎍의 pGL3-basic-ZsGreen-1300 및 0.2 ㎍의 pSV2neo 벡터를 도입하였다. 트랜스펙트 세포를 G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 이용하여 10일간 선택하여, 단일 세포 현탁액을 성장시켰다. 3주 후에, 단일 클론을 얻었다.

A2780 선택된 클론을 확대하여, 웰당 10000개의 세포로 96웰 플레이트에 ㅍ파종하였다. 파종 24 시간 후에, 추가 24 시간 세포를 화합물 (근접한 p21 프로모터 영역의 sp1 부위에 영향을 줌)로 처리하였다. 그 후에, 세포를 4% PFA로 30분간 고정시키고, 훽스트 (Hoechst) 색소로 대비염색하였다. ZsGreen 생산, 그리하여 형광을 가져오는 p21 프로모터 활성화를 아센트 플루오로스칸 (Ascent Fluoroskan) (Thermo Labsystems, Brussels, Belgium)으로 모니터하였다.

각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)을 동시에 진행시켰다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대하여, p21 유도에 대한 값은 대조군에 존재하는 p21에 대한 값의 퍼센트로서 나타냈다. 130% 이상의 퍼센트 유도가 유의한 (significant) 유도로 정의되었다. 26개의 화합물이 테스트되고, 모두 유의한 유도를 나타냈다.

실시예 C.6.c.: 생체 내 방법

선택된 클론을 벌거벗은 마우스의 옆구리로 피하 주사 (10⁷ 세포/200 ㎕)하고, 캘리퍼스로 측정할 수 있는 종양을 12일 후에 얻었다. 12일째에, 용매 및 20 내지 40 mpk 화합물을 동물에게 6일간 매일 경구 또는 정맥내 투여를 행하였다 (각각 4 내지 10 마리의 동물). 인하우스 디벨롭트 오토메이티드 호울 보디 이미징 시스템 (in-house developed Automated Whole Body Imaging System; 내쇼날 인스트루먼츠 (National Instruments)^® 제의 IMAQ 비젼 소프트웨어에 기초한 소프트 패키지에 의해 제어되는 CCD 카메라 타입 JAI^® CV-M90에 결합되고 GFP 필터를 갖춘 형광 입체 현미경 타입 올림푸스 (Olympus)^® SZX12))에 의해 형광에 대하여 종양을 평가하였다. 기준으로서, 화합물 R306465 (WO03/76422)을 사용하였다. 화합물을 R306465 보다 불활성 (형광 측정불가능), 약하고, 동일하거나 우수한 것으로 분류하였다. 화합물 1을 테스트한 결과, 경구 투여 후에 R306465 보다 우수하였다.

실시예 C.7: P450 저해 능력

시험된 모든 화합물을 DMSO (5 mM) 중에 용해시키고, 추가로 5 × 10^-4 M로의 희석이 아세토니트릴 중에서 이루어졌다. 추가의 희석이 분석 완충액 (0.1M NaK 포스페이트 완충액 pH 7.4) 중에서 이루어졌으며, 최종 용매 농도는 2% 보다 결코 높지 않았다.

CYP3A4 단백질에 대한 분석물은 웰당 15 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 1.3 mM NADP 및 3.3 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃에서 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 150 μM의 형광 프로브 기질 BFC의 첨가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 30분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종료시켰다. 형광 조사는 405 nm의 여기 파장 및 535 nm의 발광 파장에서 수행되었다. 케토코나졸 (IC₅₀값 = 3 × 10^-8M)이 이 실험에서 기준 화합물로서 포함되었다.

CYP2D6 단백질에 대한 분석물은 웰당 6 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 0.41 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 0.0082 mM NADP 및 0.41 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃ 에서의 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 3 μM의 형광 프로브 기질 AMMC의 첨가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 45분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종료시켰다. 형광 조사는 405 nm의 여기 파장 및 460 nm의 발광 파장에서 수행되었다. 퀴니딘 (IC₅₀값 < 5 × 10^-8M)이 이 실험에서 기준 화합물로서 포함되었다.

CYP2C9 단백질에 대한 분석물은 웰당 15 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 1.3 mM NADP 및 3.3 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃에서의 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 200 μM의 형광 프로브 기질 MFC의 첨가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 30분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종결시켰다. 형광 조사는 405 nm의 여기 파장 및 535 nm의 발광 파장에서 수행되었다. 술파페나졸 (IC₅₀값 = 6.8 × 10^-7M)이 이 실험에서 기준 화합물로서 포함되었다.

초기 스크리닝 목적을 위해, 화합물을 단일 고정 농도 1 × 10^-6 M에서 시험했다. 활성 화합물에 대해, 실험은 완전한 농도 반응 곡선을 확증하도록 반복되었다. 각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (효소 또는 약물 비함유)이 동시에 진행되었다. 모든 화합물은 4중으로 분석되었다. 블랭크 값을 모든 대 조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대해, 샘플의 P450 활성의 평균값은 (상대적인 형광 유닛으로) 대조군의 P450 활성의 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 퍼센트 저해는 100% 마이너스 샘플의 P450 활성의 평균값으로서 나타냈다. 적절한 경우에, IC₅₀값 (대조군의 50%로 세포 증식을 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 계산했다.

표 F-3: 실시예 C.1, C.2, C.3.a. 및 C.3.b.에 따라 시험된 화합물의 결과를 나열한 것이다.

화합물 번호	효소 활성 pIC50 C.1.	세포 활성 pIC50 C.2.	용해도 C.3.b. pH = 2.3 mg/ml	용해도 C.3.a.
1	8.2	7.9		3
2	7.4	6.5		3
3	8.1	7.5		3
4	8.2	7.5		3
5	7.9	7.4		1
6	7.6	7.4		3
7	> 9	7.5	2.0
8	8.8	7.9	2.9
9	9.4	7.6
10	8.4	7.5	3.0
11	9.4	8.0	3.1
12	9.0	7.5	2.1
13	8.8	7.0	3.7
14	8.5	7.4	2.8
15	7.6	7.0		3
16	7.4	7.1	2.8
17	8.8	6.7	2.2
18	8.5	7.0	3.6
19	8.4	6.3	2.6
20	7.7	7.3
21	7.9	6.8	2.1
22	7.9	6.8	4.2
23	8.0	6.6
24	8.8	7.5	4.0
25	7.9	7.6	3.4
26	8.3	7.2	3.5
27	> 9	7.5
28	> 9	7.5
31	8.5	7.4
32	> 9	> 7.5
33	> 9	8.2
34	8.8	7.9
35	9.6	7.8

D. 조성물 실시예 : 필름 코팅 정제

정제 코어의 제조:

일반식 (I)의 화합물 100 g, 락토스 570 g 및 전분 200 g의 혼합물을 잘 혼합한 후, 약 200 ml의 물 중의 소듐도데실술페이트 5 g 및 폴리비닐-피롤리돈 10 g의 용액으로 습윤화시켰다. 습윤 분말 혼합물을 체질하고, 건조시켜, 다시 체질했 다. 그 다음에, 미결정성 셀룰로스 100 g 및 경화 식물유 15 g을 가했다. 전체를 잘 혼합하고, 정제로 압축시켜, 각각이 일반식 (I)의 화합물 10 mg을 포함하는 10,000 개의 정제를 얻었다.

코팅:

변성 에탄올 75 ml 중의 메틸 셀룰로스 10 g의 용액에 디클로로메탄 150 ml중의 에틸셀룰로스 5g을 가했다. 그 다음에, 디클로로메탄 75 ml 및 1,2,3-프로판트리올 2.5 ml를 가하고, 폴리에틸렌글리콜 10 g을 디클로로메탄 75 ml 중에 용융 용해시켰다. 후자의 용액을 전자에 가한 후, 마그네슘옥타데카노에이트 2.5 g, 폴리비닐피롤리돈 5 g 및 농축 착색 현택액 30 ml를 가하고, 전체를 균질화시켰다. 정제 코어를 이렇게 하여 얻어진 혼합물로 코팅 장치 내에서 코팅했다.

Claims

일반식 (I)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 또는 입체화학적 이성질체:

상기 식에서,

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

R¹은 페닐이며, 상기 페닐은 할로, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시, 폴리할로C_1-6알킬 또는 페닐로부터 각각 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환되고;

R²는 수소, -CH₂-R⁵, 트리플루오로메틸 또는 -C(=O)-R⁶이며;

각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬카보닐옥시, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 이미다졸릴 또는 트리아졸릴 중에서 선택되고;

각각의 R⁶은 독립적으로 히드록시, C_1-6알킬옥시, 아미노 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노, C_1-6사이클로알킬아미노, 히드록시C_1-6알킬아미노, 피페라지닐, 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노C_1-6알킬아미노, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐 중에서 선택되며;

R³은 수소이며;

R⁴는 수소 또는 C_1-6알킬이다.
제1항에 있어서, 각각의 X가 N이고; R¹이 페닐, 또는 할로, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시, 폴리할로C_1-6알킬 또는 페닐로 치환된 페닐이며; R²가 -CH₂-R⁵ 또는 -C(=O)-R⁶이고; 각각의 R⁵가 독립적으로 수소, 히드록시, C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬카보닐옥시, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 이미다졸릴 중에서 선택되며; 각각의 R⁶이 독립적으로 C_1-6알킬아미노, C_1-6사이클로알킬아미노, 히드록시C_1-6알킬아미노, 디(C_1-6알킬)아미노C_1-6알킬아미노 또는 모르폴리닐 중에서 선택되고; R³이 수소이며; R⁴가 수소 또는 C_1-6알킬인 화합물.
제1항에 있어서, 각각의 X가 N이고; R¹이 페닐, 또는 할로로 치환된 페닐이며; R²가 -CH₂-R⁵이고; 각각의 R⁵가 독립적으로 수소, 히드록시, C_1-6알킬옥시 또는 C_1-6알킬카보닐옥시 중에서 선택되며; R³가 수소이고; R⁴가 수소인 화합물.
제1항에 있어서, 화합물 번호 1, 화합물 번호 8, 화합물 번호 11, 화합물 번호 9, 화합물 번호 33, 화합물 번호 34, 화합물 번호 7 또는 화합물 번호 25인 화합물.

Compound No.: 화합물 번호 enantiomer: 에난티오머
약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는,

a) 종양 증식 저해;

b) 암 치료를 위한 방사선 요법에 종양을 감작(sensitisation);

c) 류머티스성 관절염, 골관절염, 청소년 관절염, 통풍, 다발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 전신 홍반성 낭창을 포함하는 관절병 및 골병적 상태의 치료;

d) 혈관증식증, 아테롬성 동맥 경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

e) 궤양성 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 대숙주성 이식편병(graft versus host disease), 결막염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 베체트병, 이식 거부 반응, 유티카리아(uticaria), 알레르기성 피부염, 원형탈모증, 피부경화증, 발진, 습진, 피부근염, 여드름, 당뇨병, 전신 홍반성 낭창, 가와사키병, 다발성 경화증, 폐기종, 낭포성 섬유증 및 만성 기관지염을 포함하는 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

f) 자궁 내막증, 자궁 근증, 기능 부전성 자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

g) 망막 및 맥락막 혈관을 해치는 혈관 장애를 포함하는 안구 혈관신생의 치료;

h) 심장 기능장애의 치료;

i) HIV 감염의 치료;

l) 포도당 신합성 기능장애의 저해;

m) 파킨슨병, 인지장애 및 알츠하이머병을 포함하는 신경병리학 증상의 치료;

n) 정신 분열증, 쌍극성 장애, 우울증, 불안 신경증 및 정신병을 포함하는 정신 장애의 치료;

o) 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경근 병상의 저해;

p) 척수성 근위축증의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지질 생성의 저해; 또는

s) 말라리아를 포함하는 기생충 치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물을 긴밀하게 혼합하는 것을 포함하는,

a) 종양 증식 저해;

b) 암 치료를 위한 방사선 요법에 종양을 감작(sensitisation);

c) 류머티스성 관절염, 골관절염, 청소년 관절염, 통풍, 다발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 전신 홍반성 낭창을 포함하는 관절병 및 골병적 상태의 치료;

d) 혈관증식증, 아테롬성 동맥 경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

e) 궤양성 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 대숙주성 이식편병(graft versus host disease), 결막염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 베체트병, 이식 거부 반응, 유티카리아(uticaria), 알레르기성 피부염, 원형탈모증, 피부경화증, 발진, 습진, 피부근염, 여드름, 당뇨병, 전신 홍반성 낭창, 가와사키병, 다발성 경화증, 폐기종, 낭포성 섬유증 및 만성 기관지염을 포함하는 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

f) 자궁 내막증, 자궁 근증, 기능 부전성 자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

g) 망막 및 맥락막 혈관을 해치는 혈관 장애를 포함하는 안구 혈관신생의 치료;

h) 심장 기능장애의 치료;

i) HIV 감염의 치료;

l) 포도당 신합성 기능장애의 저해;

m) 파킨슨병, 인지장애 및 알츠하이머병을 포함하는 신경병리학 증상의 치료;

n) 정신 분열증, 쌍극성 장애, 우울증, 불안 신경증 및 정신병을 포함하는 정신 장애의 치료;

o) 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경근 병상의 저해;

p) 척수성 근위축증의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지질 생성의 저해; 또는

s) 말라리아를 포함하는 기생충 치료용 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는,

a) 종양 증식 저해;

b) 암 치료를 위한 방사선 요법에 종양을 감작(sensitisation);

c) 류머티스성 관절염, 골관절염, 청소년 관절염, 통풍, 다발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 및 전신 홍반성 낭창을 포함하는 관절병 및 골병적 상태의 치료;

d) 혈관증식증, 아테롬성 동맥 경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

e) 궤양성 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 대숙주성 이식편병(graft versus host disease), 결막염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 베체트병, 이식 거부 반응, 유티카리아(uticaria), 알레르기성 피부염, 원형탈모증, 피부경화증, 발진, 습진, 피부근염, 여드름, 당뇨병, 전신 홍반성 낭창, 가와사키병, 다발성 경화증, 폐기종, 낭포성 섬유증 및 만성 기관지염을 포함하는 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

f) 자궁 내막증, 자궁 근증, 기능 부전성 자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

g) 망막 및 맥락막 혈관을 해치는 혈관 장애를 포함하는 안구 혈관신생의 치료;

h) 심장 기능장애의 치료;

i) HIV 감염의 치료;

l) 포도당 신합성 기능장애의 저해;

m) 파킨슨병, 인지장애 및 알츠하이머병을 포함하는 신경병리학 증상의 치료;

n) 정신 분열증, 쌍극성 장애, 우울증, 불안 신경증 및 정신병을 포함하는 정신 장애의 치료;

o) 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경근 병상의 저해;

p) 척수성 근위축증의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지질 생성의 저해; 또는

s) 말라리아를 포함하는 기생충 치료용 약제.
항암제 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제를 포함하는 암 치료용 배합물.
일반식 (II)의 중간체를 산과 반응시켜 일반식 (I)의 히드록삼산을 얻는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물을 제조하는 방법:
일반식 (V)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 또는 입체화학적 이성질체:

상기 식에서,

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

R¹은 페닐이며, 상기 페닐은 할로, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시, 폴리할로C_1-6알킬 또는 페닐로부터 각각 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 치환체로 임의로 치환되고;

R²는 수소, -CH₂-R⁵, 트리플루오로메틸 또는 -C(=O)-R⁶이며;

각각의 R⁵는 독립적으로 수소, 히드록시, C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬옥시, C_1-6알킬카보닐옥시, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 이미다졸릴 또는 트리아졸릴 중에서 선택되고;

각각의 R⁶은 독립적으로 히드록시, C_1-6알킬옥시, 아미노 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노, C_1-6사이클로알킬아미노, 히드록시C_1-6알킬아미노, 피페라지닐, 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노C_1-6알킬아미노, N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐 중에서 선택되며;

R³은 수소이며;

R⁴는 수소 또는 C_1-6알킬이다.
당해 기술분야에 공지된 반응 또는 작용기 변환을 통해, R²가 -CH₂-OH이고 R⁴가 수소인 일반식 (V)의 화합물(여기서, 일반식 (V-a)의 화합물로 명명됨)을, R²가 -CH₂-OH 이외의 것인 일반식 (V)의 화합물(여기서, 일반식 (V-b)의 화합물로 명명됨)로 전환시키는 것을 특징으로 하는 제11항의 화합물을 제조하는 방법:

상기 식에서, X, R¹및 R³은 제11항에 정의된 바와 같다.
일반식 (VI)의 중간체를 1,4-디옥산-2,5-디올 및 일반식 (VII)의 보론산과 반응시켜 단일(single) 단계로 일반식 (V-a)의 화합물을 제조하는 것을 특징으로 하는 제11항의 화합물을 제조하는 방법:

상기 식에서, X, R¹및 R³은 제11항에 정의된 바와 같다.
일반식 (VI)의 중간체를 일반식 (VIII)의 케톤과 반응시켜 일반식 (V-b)의 화합물을 제조하는 것을 특징으로 하는 제11항의 화합물을 제조하는 방법:

상기 식에서, X, R¹, R² 및 R³은 제11항에 정의된 바와 같다.
용매 중에서, 일반식 (VI)의 중간체를 2-옥소-프로판산 및 일반식 (VII)의 보론산과 반응시켜, R²가 -COOH인 일반식 (V)의 화합물(여기서, 일반식 (V-c)의 화합물로 명명됨)을 단일 단계로 제조하고, 당해 기술분야에 공지된 반응 또는 작용기 변환을 통해 R²가 -C(=O)-R⁶인 일반식 (V)의 중간체로 추가로 전환시키는 것을 특징으로 하는 제11항의 화합물을 제조하는 방법:

상기 식에서, X, R¹, R³, R⁴ 및 R⁶은 제11항에 정의된 바와 같다.