KR101261305B1

KR101261305B1 - 히스톤 디아세틸라제의 신규한 저해제로의 치환된 인돌릴알킬 아미노 유도체

Info

Publication number: KR101261305B1
Application number: KR1020077003650A
Authority: KR
Inventors: 마르크 구스타프 셀린 베르돈크; 패트릭 르네 앙기바우드; 브루노 루스; 이사벨 노엘 콘스탄스 필라테; 홀테 페터 텐; 자닌 아츠; 에메렌 크리스토프 판
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2004-07-28
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2013-05-08
Also published as: US20110136841A1; CA2572833C; AR050272A1; NZ552865A; NO20071125L; US8524728B2; MY147316A; TW200612913A; HRP20120327T1; EP1781639A1; US20130324568A1; US20120220615A1; MX2007001120A; BRPI0512676B8; AR092490A2; JP2008508235A; US8592441B2; US20150342950A1; EA010652B1; IL180960A0

Abstract

본 발명은 R¹, R², R³, X 및 Y가 정의된 의미를 가진, 히스톤 디아세틸라제 저해 효소 활성을 갖는 화학식 (I)의 신규한 화합물, 그들의 제조, 그들을 함유한 조성물 및 이들의 약제로의 용도를 포함한다.

Description

히스톤 디아세틸라제의 신규한 저해제로의 치환된 인돌릴 알킬 아미노 유도체 {SUBSTITUTED INDOLYL ALKYL AMINO DERIVATIVES AS NOVEL INHIBITORS OF HISTONE DEACETYLASE}

본 발명은 히스톤 디아세틸라제 (HDAC)를 저해하는 효소 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 제조방법, 이를 포함하는 조성물, 및 시험관 내 및 생체 내에서 HDAC를 저해하고, 약제, 예를 들면 암 및 건선 등의 증식 상태를 저해하는 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

핵히스톤은 유전자 전사, 및 복제, 수복, 재조합 및 염색체 분리 등의 다른 DNA 주형 프로세스를 조절하는데 관여하는 기관의 필수적인 강력한 성분이다. 이들은 아세틸화, 인산화, 메틸화, 유비퀴틴화, 및 ADP 리보실화 등의 번역후 변형의 대상이다.

본 명세서에서 "HDACs"로 명명되는 히스톤 디아세틸라제는 코어 뉴클레오솜 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 등의 단백질의 리신 잔기에 대한 아세틸 변형의 제거를 촉진시키는 효소이다. 본 명세서에서 "HATs"로 명명되는 히스톤 아세틸트란스페라 제와 함께, HDACs는 히스톤의 아세틸화 레벨을 조절한다. 뉴클레오솜 히스톤의 아세틸화의 밸런스는 많은 유전자의 전사에서 중요한 역할을 한다. 히스톤의 하이포아세틸화는 유전자 전사의 억제를 가져오는 응축 크로마틴 구조와 관련되어 있는데 반해, 아세틸화된 히스톤은 더욱 개방된 크로마틴 구조 및 전사 활성화에 관련되어 있다.

구조적으로 관련이 있는 11개의 HDACs가 기재되어, 2개의 부류로 나뉘어져 있다. 부류 I HDACs는 HDAC 1, 2, 3, 8 및 11로 구성되는 반면에, 부류 II HDACs는 HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10으로 구성된다. 제 3 부류의 HDACs 멤버는 부류 I 및 부류 II HDACs에 구조적으로 관련되어 있지 않다. 부류 I/II HDACs는 아연 의존성 메카니즘에 의해 작용하고, 부류 III HDACs은 NAD 의존성을 나타낸다.

히스톤 이외에, 다른 단백질도 아세틸화의 기질, 특히 p53, GATA-1 및 E2F 등의 전사 인자; 글루코코르티코이드 수용체, 티로이드 수용체, 에스트로겐 수용체 등의 핵내 수용체; 및 pRb 등의 세포 주기 조절 단백질이다. 단백질의 아세틸화는p53 안정화 등의 단백질 안정화, 보인자 채용 및 증대된 DNA 결합과 관련되어 있다. p53는 DNA 손상 등의 각종 스트레스 신호에 응답하여 세포 주기 정지 또는 아폽토시스를 유발할 수 있는 종양 억제 인자이다. p53로 유발된 세포 주기 정지에 대한 주된 대상은 p21 유전자인 것 같다. p53, p21에 의한 이의 활성화 다음에, 사이클린/사이클린 의존성 키나제 복합체와 협력하여 동정하면, G1 및 G2 상에서 세포 주기 정지 , 노화 시의 상방 조절, 및 증식성 세포핵 항원과의 상호작용을 가져온다.

HDACs의 저해제를 연구 조사한 결과, 이들은 세포 주기 정지, 세포 분화, 아폽토시스 및 변환 형질의 역전에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

저해제 트리코스타틴 A (TSA)는 예를 들면 G1 및 G2 상에서의 세포 주기 정지를 일으키고, 상이한 세포주의 변환 형질을 복귀하여, 프렌드 백혈병 세포 및 다른 것들의 분화를 유도시킨다. TSA (및 수베로일아닐리드 히드록삼산 SAHA)은 세포 증식을 저해하고 말단 분화를 유도하여, 마우스에 있어서의 종양 생성을 저지시키는 것으로 보고되어 있다 (참조 문헌: Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).

트리코스타틴 A는 또한 섬유증, 예를 들면 간섬유증 및 간경변의 치료에 유용한 것으로 보고되어 있다 (참조 문헌: Geerts et al., European Patent Application EP 0 827 742, published 11 March, 1998).

HDAC 저해제에 대한 약리작용단은 HDACs의 아연 함유 활성 부위와 상호 작용하는 금속 결합 도메인, 링커 도메인, 및 활성 부위의 림의 잔기와 상호 작용하는 표면 인식 도메인 또는 캡핑 영역으로 구성되어 있다.

HDACs의 저해제는 또한 p21 유전자 발현을 유도하는 것으로 보고되어 있다. 이들 저해제에 의한 p21 유전자의 전사 활성화는 크로마틴 리모델링 다음에, p21 프로모터 영역에서의 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화에 의해 향상된다. p21의 활성화는 p53 비의존성 패션으로 일어나므로, HDAC 저해제는 다수의 종양의 특징인 돌연변이 p53 유전자를 갖는 세포에서 작용한다.

또한, HDAC 저해제는 숙주 면역 반응의 증강 및 종양 혈관신생의 저해 등의 간접 활성을 가질 수 있으므로, 원발 종양 증식을 억제하여 전이를 방해할 수 있다 (참조 문헌: Mai et al., Medicinal Research Reviews, 25. 261-309).

상술한 사항을 고려하면, HDAC 저해제는 돌연변이 p53 유전자를 갖는 종양 등의 세포 증식 질환 또는 상태의 치료에 있어서 큰 잠재력을 가질 수 있다는 것이다.

2003년 8월 14일자로 공개된 특허 출원 제EP1472216호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서의 비사이클릭 히드록사메이트를 개시하고 있다.

그 중에서도 특히, 2003년 9월 18일자로 공개된 특허 출원 제EP1485099호, 제EP1485348호, 제1485353호, 제EP1485354호, 제EP1485364호, 제EP1485365호, 제EP1485370호 및 제EP1485378호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 피페라지닐피리미디닐히드록삼을 개시하고 있고, 또한 제EP1485365호는 R306465를 개시하고 있다.

2003년 10월 9일자로 공개된 특허 출원 제EP1492534호는 HDAC 저해제로서 피페라진 결합을 포함하는 카르밤산 화합물을 개시하고 있다.

2003년 10월 23일자로 공개된 특허 출원 제EP1495002호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 피페라지닐페닐벤즈아미드 화합물을 개시하고 있다.

2004년 1월 29일자로 공개된 특허 출원 제WO04/009536호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 아릴기와 히드록사메이트 사이에 알킬 링커를 함유하는 유도체를 개시하고 있다.

2004년 2월 12일자로 공개된 특허 출원 제EP1525199호는 히스톤 디아세틸라 제 저해제로서 (헤테로)아릴알케닐 치환된 비사이클릭 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2004년 7월 29일자로 공개된 제WO04/063146호는 항염증 활성 및 항종양 활성을 갖는 N-하이드록시-벤즈아미드 유도체를 개시하고 있다.

2004년 7월 29일자로 공개된 특허 출원 제WO04/063169호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 치환된 아릴히드록사메이트 유도체를 개시하고 있다.

2004년 8월 26일자로 공개된 특허 출원 제WO04/072047호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 인돌, 벤즈이미다졸 및 나프티미다졸을 개시하고 있다.

2004년 9월 30일자로 개시된 특허 출원 제WO04/082638호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 비방향족 복소환계에 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2004년 10월 28일자로 공개된 특허 출원 제WO04/092115호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 히드록사메이트 유도체를 개시하고 있다.

2005년 3월 31일자로 공개된 특허 출원 제WO05/028447호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 벤즈이미다졸을 개시하고 있다.

2005년 4월 7일자로 공개된 특허 출원 제WO05/030704호 및 제WO05/030705호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 벤즈아미드를 개시하고 있다.

2005년 5월 6일자로 공개된 특허 출원 제WO05/040101호는 히스톤 디아세틸라제 저해제로서 아크릴우레아 및 설포닐우레아가 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

2005년 5월 6일자로 공개된 특허 출원 제WO05/040161호는 또한 히스톤 디아 세틸라제 저해제로서 비아릴이 결합된 히드록사메이트를 개시하고 있다.

본 발명의 화합물은 구조상, 약리학적 활성 및/또는 약리학적 효과 면에서 종래기술과 상이하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체이용성 및/또는 생체 내 효능을 증대시킨 고 효소 활성 및 세포 활성을 갖는 히스톤 디아세틸라제 저해제를 제공하는 것이다.

본 발명의 신규한 화합물은 상술한 과제를 해결한다. 본 발명의 화합물은 히스톤 디아세틸라제를 저해하는 우수한 효소 활성 및 세포 활성을 나타낸다. 이들은 세포 및 생체 내 레벨로 p21 유전자를 활성화시키는 고 능력을 갖는다. 이들은 바람직한 약물 동태 프로파일 및 P450 효소에 대한 저친화성을 가지므로, 유해한 약물 상호작용을 줄여, 안전 마진을 더욱 넓힐 수 있다.

본 화합물의 유리한 특성은 대사적 안정성, 용해도 및 p21 유도 능력이다. 특히, 본 발명의 화합물은 래트 간세포에서 증대된 반감기를 갖고, 수용액 중에서의 증대된 용해도/안정성을 가지고/가지거나 향상된 생체 내 p21 프로모터 유도 능력을 갖는다.

본 발명은 화학식 (I)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 입체화학적 이성질체에 관한 것이다:

상기식에서,

각각의 n은 값 0, 1 또는 2인 정수이고, n이 0일 때, 직접 결합을 의미하며;

각각의 m은 값 1 또는 2인 정수이고;

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

각각의 Y는 독립적으로 O, S 또는 NR⁴이며;

여기에서 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬, C₃ _-6사이클로알킬메틸, 페닐C₁ _- ₆알킬, -C(=O)-CHR⁵R⁶ 또는 -S(=O)₂-N(CH₃)₂이고;

여기에서, 각각의 R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 수소, 아미노, C₁ _- ₆알킬 또는 아미노C_1- ₆알킬이며;

Y는 NR⁴이고, R²는 인돌릴의 7-위치상에 있을 때, R² 및 R⁴는 함께 이가 라디칼

-(CH₂)₂- (a-1), 또는

-(CH₂)₃- (a-2)을 형성할 수 있고;

R¹은 수소, C₁ _- ₆알킬, 하이드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬설포닐, C₁ _- ₆알킬카보닐 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노설포닐이며;

R²은 수소, 하이록시, 아미노, 할로, C₁ _- ₆알킬, 시아노, C₂ _- ₆알케닐, 폴리할로C_1- ₆알킬, 니트로, 페닐, C₁ _- ₆알킬카보닐, 하이드록시카보닐, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노, C₁ _- ₆알킬옥시, 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노이고;

R³은 수소, C₁ _- ₆알킬, 또는 C₁ _- ₆알킬옥시이며;

R² 및 R³이 인접한 탄소 원자상에 있을 때, 이들은 이가 라디칼 -0-CH₂-O-를 형성할 수 있다.

치환체로부터 이환계로 그려진 선은 결합이 이환계의 적절한 환원자에 임의로 부착될 수 있음을 나타낸다.

용어 "히스톤 디아세틸라제 저해제" 또는 "히스톤 디아세틸라제의 저해제"는 히스톤 디아세틸라제와 상호작용하여, 이의 활성, 보다 상세하게는 이의 효소 활성을 저해할 수 있는 화합물을 정의하는 것으로 사용된다. 히스톤 디아세틸라제의 효소 활성을 저해한다는 것은 히스톤으로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 디아세틸라제의 능력을 감소시킴을 의미한다. 바람직하게는, 그러한 저해는 특이적이며, 즉, 히스톤 디아세틸라제 저해제는 일부 다른 비관련된 생물학적 효과를 산출하는데 요구되는 저해제의 농도보다 낮은 농도에서 히스톤으로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 디아세틸라제의 능력을 감소시킨다.

상술한 정의 및 이하에서 사용된 바와 같이, 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 총칭하고; 1 또는 2개의 탄소 원자를 갖는 C₁ _- ₂알킬 직쇄 포화 탄화수소 라디칼, 예를 들어 메틸 또는 에틸; C₁ _- ₆알킬은 C₁ _- ₂알킬 및 예를 들면, 프로필, 부틸, 1-메틸에틸, 2-메틸프로필, 펜틸, 2-메틸-부틸, 헥실, 2-메틸펜틸 등의 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소 라디칼을 정의하며; 폴리할로C₁ _- ₆알킬은 예를 들면 트리플루오로메틸 등의 3개의 동일하거나 상이한 할로 치환체를 포함하는 C₁ _- ₆알킬을 정의하며; C₂ _- ₆알케닐은 하나의 이중결합을 포함하고, 예를 들어 에테닐, 2-프로페닐, 3-부테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 3-메틸-2-부테닐 등의 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 라디칼을 정의하며; C₃ _- ₆사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐 등의 3 내지 6의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소기를 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 부가염은 약제학적으로 허용가능한 산부가염 및 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염을 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 산부가염은 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료학적 활성인 무독성 산부가염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 염기 특성을 갖는 화학식 (I)의 화합물은 상기 염기 형태를 적당한 산으로 처리함으로써 약제학적으로 허용가능한 산부가염으로 변환될 수 있다. 적당한 산은 예를 들면, 할로겐화수소산 (예를 들면, 염산 또는 브롬화수소산); 황산; 질산; 인산 등의 무기산; 또는 예를 들면, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로판산, 하이드록시아세트산, 락트산, 피브루산, 옥살산, 말론산, 숙신산 (즉, 부탄디오산), 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시클람산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 등의 유기산을 포함한다.

산 특성을 갖는 화학식 (I)의 화합물은 상기 산 형태를 적당한 유기 또는 무기 염기로 처리함으로써 이의 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염으로 변환될 수 있다. 적당한 염기 염 형태는 예를 들면, 암모늄 염, 알칼리 및 알칼리 토금속 염 (예를 들면, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 염 등), 유기 염기를 갖는 염 (예를 들면, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염, 및 아미노산을 갖는 염 (예를 들면, 아르기닌, 리신 등)을 포함한다.

용어 "산 또는 염기 부가염"은 또한 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 수화물 및 용매 부가 형태를 포함한다. 그러한 형태의 예로는 예를 들면, 수화물, 알콜레이트 등이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화학식 (I)의 화합물의 입체화학적 이성질체"는 동일한 순서의 결합에 의해 결합되는 동일한 원자로 구성되나, 교환가능하지 않은 상이한 삼차구조를 갖는 화학식 (I)의 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 화합물을 정의한다. 달리 언급하거나 지적하지 않는다면, 화합물의 화학적 명칭은 상기 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 입체화학적 이성질체의 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물은 상기 화합물의 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머 및/또는 에난티오머를 포함할 수 있다. 순수한 형태 또는 혼합물 형태의 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체화학적 이성질체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

화학식 (I)의 화합물의 N-옥사이드 형태는 하나 또는 수개의 질소 원자가 소위 N-옥사이드, 특히 하나 이상의 피페리딘-, 피페라진 또는 피리다지닐-질소가 N-산화된 이들 N-옥사이드로 산화된 이들 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 것을 의미한다.

일부 화학식 (I)의 화합물은 또한 이의 토토머 형태로 존재할 수 있다. 상기 화학식에 명백하게 나타나 있지 않더라도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

이하 어떤 경우에도, 용어 "화학식 (I)의 화합물"은 또한 약제학적으로 허용가능한 부가염 및 모든 입체 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "히스톤 디아세틸라제" 및 "HDAC"는 히스톤의 N-말단에서 리신 잔기의 ε-아미노기로부터 아세틸기를 제거하는 효소의 패밀리 중 임의의 하나를 말하는 것으로 의도된다. 이와 관련해서 달리 언급하지 않는다면, 용어 "히스톤"은 임의의 종의 H1, H2A, H2B, H3, H4, 및 H5를 포함하는 임의의 히스톤 단백질을 말하는 것으로 의미된다. 사람 HDAC 단백질 또는 유전자 산물로는 이들에 제한되는 것은 아니나, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 및 HDAC-11을 들 수 있다. 히스톤 디아세틸라제는 또한 원생동물 또는 균류 공급원으로부터 유도될 수도 있다.

목적으로 하는 화합물의 제 1 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬메틸, -C(=O)-CHR⁵R⁶ 또는 -S(=O)₂-N(CH₃)₂이고;

b) R¹은 수소, C₁ _- ₆알킬, 하이드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬설포닐, 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노설포닐이거나;

c) R³은 수소이다.

목적으로 하는 화합물의 제 2 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 n은 값 0 또는 1을 가진 정수이고 ;

b) 각각의 X는 독립적으로 N이며;

c) 각각의 R⁴는 수소 또는 C₁ _- ₆알킬이고;

d) R¹은 수소, C₁ _- ₆알킬 또는 하이드록시C₁ _- ₆알킬이거나;

e) R²는 수소, 할로, C₁ _- ₆알킬 또는 C₁ _- ₆알킬옥시이다.

목적으로 하는 화합물의 제 3 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 n은 값 0 또는 1을 갖는 정수이고;

b) 각각의 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬 또는 페닐C₁ _- ₆알킬이며;

c) R¹은 수소, C₁ _- ₆알킬, 하이드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카보닐 또는 C₁ _- ₆알킬설포닐이거나;

d) R²는 수소, 할로, C₁ _- ₆알킬, 시아노, 니트로 또는 C₁ _- ₆알킬옥시이다.

목적으로 하는 화합물의 제 4 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 n은 값 0 또는 1을 갖는 정수이고;

b) 각각의 m은 값 1을 갖는 정수이며;

c) 각각의 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬 또는 페닐C₁ _- ₆알킬이고;

c) R¹은 수소, 하이드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카보닐 또는 C₁ _- ₆알킬설포닐이며;

d) R²는 수소, 할로, 시아노, 니트로 또는 C₁ _- ₆알킬옥시이거나;

e) R³은 C₁ _- ₆알킬옥시이거나;

f) R² 및 R³은 인접한 탄소 원자상에 있을 때, 이들은 이가 라디칼을 형성할 수 있다.

목적으로 하는 화합물의 제 5 그룹은 하나 이상의 하기 제한이 적용되는 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다:

a) 각각의 n은 값 1을 갖는 정수이고;

b) 각각의 m은 값 1을 갖는 정수이며;

c) 각각의 X는 독립적으로 N이고;

d) 각각의 Y는 독립적으로 NR⁴이며;

e) 각각의 R⁴는 C₁ _- ₆알킬이고;

f) R¹은 수소이며;

g) R²는 수소 또는 할로이거나;

h) R³은 수소이다.

바람직한 화합물의 그룹은 각각의 n이 값 0 또는 1인 정수이고; 각각의 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬 또는 페닐C₁ _- ₆알킬이며; R¹은 수소, C₁ _- ₆알킬, 하이드록시C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬카보닐 또는 C₁ _- ₆알킬설포닐이고; R²는 수소, 할로, C₁ _- ₆알킬, 시아노, 니트로, 폴리할로C₁ _- ₆알킬 또는 C₁ _- ₆알킬옥시인 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다.

보다 바람직한 화합물의 그룹은 각각의 n이 값 1인 정수이고; 각각의 m이 값 1의 정수이며; 각각의 X는 독립적으로 N이고; 각각의 Y는 독립적으로 NR⁴이며; 각각의 R⁴는 C₃ _- ₆알킬이고; R¹은 수소이며; R²는 수소 또는 할로이고; R³은 수소인 이들 화학식 (I)의 화합물로 구성된다.

가장 바람직한 화합물은 화합물 번호 1a, 화합물 번호 30, 화합물 번호 39, 및 화합물 번호 50이다.

화학식 (I) 및 (II)의 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 N-옥사이드 및 입체화학적 이성질체는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 시작물질 및 일부 중간체는 알려진 화합물이고, 상업적으로 입수 가능하거나, 해당 분야에 일반적으로 알려진 통상적인 반응 방법에 따라서 또는 특허 출원 EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, 및 EP1485378에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 일부 제조 방법은 이후 보다 상세히 기술될 것이다. 화학식 (I)의 최종 화합물을 수득하는 다른 방법은 실시예에서 기술되었다.

a) 화학식 (I)의 히드록삼산은 여기에서 화학식 (II-a)의 중간체로 명명되는, Q가 테트라하이드로피라닐옥시아미노카보닐인 화학식 (II)의 중간체를 적절한 산, 예를 들어 트리플루오로 아세트산과 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 반응은 적절한 용매, 예를 들어 메탄올 또는 디클로로메탄중 수행된다.

b) 택일적으로, 화학식 (I)의 히드록삼산은 여기에서 화학식 (II-c)의 중간체로 명명되는, Q가 C₁ _- ₂알킬옥시카보닐인 화학식 (II)의 중간체를 예를 들어 수산화나트륨과 같은 염기의 존재하에서 하이드록실아민과 반응하여 제조될 수 있다. 상기 반응은 적절한 용매, 예를 들어 메탄올중 수행된다.

화학식 (I)의 화합물은 또한, 공지된 반응 또는 작용기 치환을 통해 서로 변환될 수 있다. 다수의 이러한 치환은 이미 상기 기술되었다. 다른 예는, 카복실 에스테르의 상응하는 카복실산 또는 알콜로의 가수분해; 아미드의 상응하는 카복실산 또는 아민으로의 가수분해; 니트릴의 상응하는 아미드로의 가수분해; 이미다졸상의 아미노기 또는 페닐을 알려진 디아조화 반응에 의해 수소로 치환하고, 이어서 디아조기를 수소로 치환할 수 있고; 알콜은 에스테르 및 에테르로 변환될 수 있고; 일차 아민은 이차 또는 삼차 아민으로 변환될 수 있고; 이중결합은 상응하는 단일결합으로 수소화될 수 있으며; 페닐기상의 아이오도 라디칼은 적절한 팔라듐 촉매의 존재하에서, 일산화탄소 삽입에 의해 에스테르기로 변환될 수 있다.

본 발명은 또한 화학식 (II)의 중간체, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 염 및 입체화학적 이성질체에 관한 것이다:

상기식에서,

각각의 n은 값 0, 1 또는 2를 가진 정수이고, n은 0일 때, 직접 결합을 의미하고;

각각의 m은 값 1 또는 2를 가진 정수이며;

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

각각의 Y는 독립적으로 O, S, 또는 NR⁴이며;

여기에서, 각 R⁴는 수소, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬옥시C₁ _- ₆알킬, C₃ _- ₆사이클로알킬, C_3-6사이클로알킬메틸, 페닐C₁ _- ₆알킬, -C(=O)-CHR⁵R⁶ 또는 -S(=O)₂-N(CH₃)₂이고;

여기에서, 각각의 R⁵ 및 R⁶는 독립적으로 수소, 아미노, C₁ _- ₆알킬 또는 아미노C_1- ₆알킬이며;

-(CH₂)₂- (a-1), 또는

-(CH₂)₃- (a-2)을 형성할 수 있고;

R²는 수소, 하이드록시, 아미노, 할로, C₁ _- ₆알킬, 시아노, C₂ _- ₆알케닐, 폴리할로C_1- ₆알킬, 니트로, 페닐, C₁ _- ₆알킬카보닐, 하이드록시카보닐, C₁ _- ₆알킬카보닐아미노, C₁ _- ₆알킬옥시, 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노이고;

R³은 수소, C₁ _- ₆알킬, 또는 C₁ _- ₆알킬옥시이며;

R² 및 R³이 인접한 탄소 원자상에 있을 때, 이들은 이가 라디칼 -0-CH₂-O-를 형성할 수 있고;

Q는 C₁ _- ₂알킬옥시카보닐, 하이드록시카보닐 또는 테트라하이드로피라닐옥시아미노카보닐이다.

목적으로 하는, 바람직한, 보다 바람직한, 및 가장 바람직한 화합물은 화학식 (I)의 화합물에 정의된 그룹에 따라, 화학식 (II)의 화합물에 정의될 수 있다.

a) 화학식 (III)의 중간체를, 여기에서 화학식 (II-b)의 중간체로 명명되는, 화학식 (II)의 중간체와 예를 들어 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민, 모노하이드로클로라이드(EDC) 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸(HOBT)과 같은 적절한 반응제의 존재하에서 반응시켜 제조할 수 있다. 반응은 트리에틸아민과 같은 염기의 존재하에서, 적절한 용매 예를 들어 디클로로메탄 및 테트라하이드로퓨란의 혼합물중 수행될 수 있다.

b) 화학식 (II-a)의 중간체는 또한, 화학식 (VI)의 중간체를 화학식 (V)의 적절한 카복스알데히드와 적절한 시약, 예를 들어 소듐 보로하이드라이드의 존재하에서, 적절한 용매 예를 들어 디클로로에탄 또는 메탄올중에서 반응시켜 제조할 수 있고, 여기에서 t는 값 0 또는 1을 갖는 정수이고, t가 0일 때, 직접 결합을 의미한다.

c) 화학식 (II-b)의 중간체는, 여기에서 화학식 (II-c)의 중간체로 명명된, Q가 메틸- 또는 에틸옥시카보닐(C_1-2알킬)인 화학식 (II)의 중간체와 적절한 산성 용액, 예를 들어 염산, 또는 염기성 용액, 예를 들어 수소 브로마이드 또는 수산화나트륨과 함께, 적절한 용매, 예를 들어 에탄올 또는 프로판올과 같은 알콜중 반응시켜 제조할 수 있다.

d) 화학식 (II-c)의 중간체는 화학식 (IV)의 카복실산 에틸 에스테르를 화학식 (V)의 적절한 카복스알데히드와 소듐 보로하이드라이드와 같은 적절한 시약, 예를 들어 소듐 테트라하이드로보레이트의 존재하에서, 알콜과 같은 적절한 용매, 예를 들어 메탄올중 반응시켜 제조할 수 있다.

e) 동일한 방법으로, 화학식 (II-c)의 중간체는, 소듐 보로하이드라이드와 같은 적절한 시약, 예를 들어 소듐 테트라하이드로보레이트의 존재하에서, 알콜과 같은 적절한 용매, 예를 들어 메탄올의 존재하에서 화학식 (XV)의 적절한 중간체와 함께 반응하여 제조될 수 있다.

f) 화학식 (II-c)의 중간체는, 화학식 (X)의 중간체를, W는 할로와 같은 적절한 이탈기, 예를 들어 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도이거나, 또는 설포닐옥시 라디칼, 예를 들어 메틸설포닐옥시, 4-메틸페닐설포닐옥시 등인 화학식 (XI)의 중간체와 반응시켜 제조할 수 있다. 반응은 알콜과 같은 반응-비활성 용매, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 2-메톡시-에탄올, 프로판올, 부탄올 등; 에테르, 예를 들어 4,4-디옥산, l,l'-옥시비스프로판 등; 케톤, 예를 들어 4-메틸-2-펜타논; 또는 N,N-디메틸포름아미드, 니트로벤젠, 아세토니트릴 등중에서 수행될 수 있다. 적절한 염기, 예를 들어 알칼리 또는 알칼리 토금속 카보네이트 또는 수소 카보네이트, 예를 들어, 트리에틸아민 또는 탄산나트륨의 첨가는, 반응 과정중 유리된 산을 회수하는데 이용될 수 있다. 소량의 적절한 금속 요오드화물, 예를 들어 나트륨 또는 칼륨 요오드화물이 첨가되어 반응을 촉진시킬 수 있다. 교반은 반응 속도를 향상시킬 수 있다. 반응은 실온 및 반응 혼합물의 환류 온도 사이의 온도에서 편리하게 수행될 수 있고, 필요하다면, 반응은 증진된 압력하에서 수행될 수 있다.

g) 이상적인 방법으로, 화학식 (II-c)의 중간체는, 화학식 (XII)의 중간체를 W가 상기 기술된 바와 같이 적절한 이탈기인 화학식 (XIII)의 중간체와 반응하여 제조될 수 있다.

화학식 (VI)의 중간체는 화학식 (VII)의 중간체를 적절한 용매, 예를 들어, 디클로로메탄중 피페리딘과 반응하여 제조될 수 있다 .

화학식 (VII)의 중간체는 화학식 (VIII)의 중간체를 화학식 (III)의 중간체와, 적절한 시약, 예를 들어 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-l,3-프로판디아민, 모노하이드로클로라이드 (EDC) 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 (HOBT)의 존재하에서 반응시켜 제조될 수 있다. 반응은 트리에틸아민와 같은 염기의 존재하에서, 적절한 용매, 예를 들어 디클로로메탄 및 테트라하이드로퓨란의 혼합물중 수행될 수 있다.

화학식 (VIII)의 중간체는 화학식 (IX)의 중간체를 화학식 (IV-a)의 중간체로 나타낸, R¹이 수소인 화학식 (IV)의 중간체와 수산화나트륨의 존재하에서, 적절한 용매, 예를 들어 테트라하이드로퓨란중에서 반응시키고, 이어서, 염산 및 탄산나트륨의 첨가로 중화시켜 제조될 수 있다.

화학식 (I)의 화합물 및 일부의 중간체는 그들의 구조내에 적어도 하나의 입체중심을 가질 수 있다. 이러한 입체중심은 R 또는 S 배열로 존재할 수 있다.

상기 기술된 방법으로 제조되었듯이 화학식 (I)의 화합물은 일반적으로 에난티오머의 라세미 혼합물이고, 이는 하기의 알려진 분해 방법으로 분리될 수 있다. 화학식 (I)의 라세미 화합물은 적절한 키랄 산과의 반응으로 상응하는 디아스테레오머 염 형태로 변환될 수 있다. 상기 디아스테레오머 염 형태는 그 후 분리되고, 예를 들어 선택적 또는 분획 결정화에 의해 분리되고, 에난티오머는 알칼리에 의해 그로부터 유리된다. 화학식 (I)의 화합물의 에난티오머 형태를 분리하는 택일적인 방법은, 키랄 정지상을 사용하는 액체 크로마토그래피를 포함한다. 상기 순수한 입체화학적 이성질체는 또한 적절한 시작 물질의 상응하는 순수한 입체화학적 이성질체로부터 유도될 수 있고, 단, 반응은 입체특이적으로 발생한다. 바람직하게, 만약 특이 입체이성질체를 원한다면, 상기 화합물은 입체특이적 제조 방법으로 합성된다. 이들 방법은 에난티오적으로 순수한 시작 물질을 유리하게 사용한다.

화학식 (I)의 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염 및 입체이성질체는 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 저해제 효과를 갖는다는 점에서 중요한 약리학적 특성을 갖는다.

본 발명은 본 발명의 유효량의 화합물을 투여함으로서, 변형된 세포를 포함하는 세포의 비정상적인 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 세포의 비정상적인 성장은 정상적인 조절 메카니즘 (예를 들어, 접촉 억제의 손실)과 관계 없는 세포 성장을 의미한다. 이는 암 세포의 성장 정지, 종단 분화 및/또는 세포소멸을 일으켜 직접적으로 및, 종양의 신생혈관증식을 저해하여 간접적으로도 종양 성장을 저해하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 대상, 예를 들어, 포유류 (및, 보다 특별하게는 인간)에게 본 발명의 화합물의 유효량을 투여함으로서 종양 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 화합물의 유효량을 투여함으로서 종양의 성장을 제한하는 방법을 제공한다. 저해되는 종양의 예는, 제한없이, 폐암 (예를 들어, 생암종 및 비소세포 폐암종 포함), 췌장암 (예를 들어 외분비 췌장암종과 같은 췌장암종), 결장암 (예를 들어, 결장직장암종, 예를 들어 췌장 생암종 및 결장샘종), 진행성 질환을 포함하는 전립선 암, 림프구계의 조혈성 종양 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, Burkitt's 림프종), 골수성 백혈병 (예를 들어, 급성 골수성 백혈병 (AML)), 갑상선 여포암, 골수이형성증후군 (MDS), 중간엽 유래의 종양 (예를 들어, 섬유육종 및 횡문근육종), 흑색종, 기형암종, 신경모세포종, 신경아교종, 피부의 양성 종양 (예를 들어, 각질가시세포종), 유방암 (예를 들어,진행성 유방암), 신장암, 난소암, 방광암 및 표피암이다.

본 발명에 따른 화합물은 다른 치료적 목적으로도 사용될 수 있으며, 예를 들면 하기와 같다:

a) 암 치료를 위해 종양의 조사 전, 조사 중, 또는 조사 후에 따라 본 발명에 따른 화합물을 투여함으로서 방사선치료에 대한 종양의 민감화;

b) 관절병증 및 골 병리학적 상태, 예를 들어 류마티스 관절염, 골관절염, 연소성 관절염, 통풍, 다발관절염, 건성 관절염, 강직척추염 및 전신홍반루푸스의 치료;

c) 혈관 증식성 질환(vascular proliferative disorders), 죽경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

d) 예를 들어, 궤양 대장염, Crohn's 질환, 알레르기성 비염, 이식편대숙주 질환, 결막염, 천식, ARDS, Behcets 질환, 이식 거부, 두드러기, 알레르기성 피부염, 원형 탈모증, 공피증, 발진, 습진, 피부근육염, 여드름, 당뇨병, 전신홍반루푸스, Kawasaki's 질환, 다발경화증, 폐기종, 낭성 섬유증 및 만성기관지염과 같은 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

e) 자궁내막증, 자궁근종, 기능장애자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

f) 망막 및 맥락막 혈관에 침범하는 혈관병증을 포함하는 안혈관화(ocular vascularisation)의 치료;

g) 심기능 장애의 치료;

h) HIV 감염의 치료와 같은 면역 억제 상태의 저해;

i) 신장기능장애의 치료;

j) 내분비 장애의 억제;

k) 글루코스신합성 장애의 저해;

1) 신경병리학, 예를 들어 Parkinson's 질환의 치료, 또는 Alzheimer's 질환 또는 폴리글루타민 연관 신경세포성 질환과 같은 인지장애를 야기시키는 신경병리학의 치료;

m) 정신질환, 예를 들어 정신분열증, 양극성 질환, 우울증, 불안 및 정신병의 치료;

n) 신경근육 병리학, 예를 들어, 근위축성 측삭경화증의 저해;

o) 척수근육위축증의 치료;

p) 유전자 발현의 증진에 의한 치료가 가능한 다른 병리학적 상태의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지방 형성의 저해;

s) 말라리아와 같은 기생충증의 치료.

따라서, 본 발명은 하나 이상의 상술된 상태를 치료하기 위한 의약품의 제조용으로도, 약제 용도로의 화학식 (I)의 화합물을 개시하였다.

화학식 (I)의 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염 및 입체이성질체는, 표지된 화합물 및 HDAC 사이의 복합체 형성의 검출 또는 측정을 포함하며, 생물학적 샘플중 HDAC의 검출 또는 확인시 사용될 수 있다는 점에서 유익한 진단 특성을 가질 수 있다.

검출 또는 확인 방법은 표지제, 예를 들어 방사성동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질, 등으로 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 방사성동위원소의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H 및 ¹⁴C를 포함한다. 효소는 보통 적절한 기질의 컨쥬게이션으로 검출되도록 만들어지며, 차례로 검출가능한 반응을 촉진한다. 이의 예는, 베타-갈락토시다제 갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 및 말레이트 디하디드로게나제, 바람직하게 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다. 발광물질은 예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 애큐오린 및 루시페라제를 포함한다.

생물학적 샘플은 신체 조직 또는 체액으로 정의될 수 있다. 체액의 예는 뇌척수액, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 가래, 타액 등이다.

이들의 유용한 약리학적 특성의 관점에서, 주된 화합물은 투여 목적에 따라 다양한 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기 위해, 친숙한 혼합물중 활성 성분으로서 특정 화합물의 유효량을 염기 또는 산 부가염 형태로, 약제학적으로 허용가능한 담체와 결합시켰고, 이 담체는 투여용으로 원하는 제조 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 경구, 직장, 경피 또는 비경구적 투여하기에 적합한 단일 제형이 바람직하다. 예를 들면, 경구 제형의 조성물을 제조함에 있어서, 예를 들면, 서스펜션, 시럽, 엘릭시르 및 용액 등의 경구 액체 제제의 경우에는 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 또는 분제, 정제, 캡슐 및 환약의 경우에는 전분, 당, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등의 고체 담체와 같은 통상의 약제학적 매질 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

이들의 투여 용이성으로 인해, 환약 및 캡슐이 가장 유리한 경구용 단위 투약 형태를 나타내고, 이 경우에 고체 약제학적 담체가 두드러지게 사용된다. 비경구 조성물에 대해서는, 담체는 예를 들면 용해성을 돕기 위해 다른 성분이 포함될 수도 있으나, 통상적으로 적어도 대부분은 멸균수를 포함할 것이다. 예를 들면, 주사제는 담체가 식염수, 글루코스 용액, 또는 식염수와 글루코스 용액의 혼합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 주사 서스펜션도 제조될 수 있고, 이 경우에 적당한 액체 담체, 서스펜션 등이 사용될 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물에 있어서, 임의로 어떤 성질을 갖는 적절한 첨가제와 소량의 비율로 혼합된 침투촉진제 및/또는 적당한 습윤제를 포함하고, 상기 첨가제는 피부에 심각한 악영향을 끼치지 않는다. 상기 첨가제는 피부에의 투여를 용이하게 하고/하거나 원하는 조성물을 제조하는데 유용할 수 있다. 이들 조성물은 다양한 방법, 예를 들면 경피 패치, 스팟 온 (spot-on) 또는 연고로서 투여될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 단일성을 위해 상술한 약제학적 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 투약 단위 형태는 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위이며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 협력하여 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성성분을 함유한다. 이러한 투여량 단위 형태의 예로는 정제 (분할정 또는 코팅정을 포함), 캡슐, 정제, 분말 패킷, 웨이퍼, 주사제 또는 주사용 서스펜션, 티스푼펄 (teaspoonful), 테이블스푼펄 (tablespoonful) 등, 및 이들의 분리된 다중회분이 있다.

이하에 나타내는 시험 결과로부터 해당 분야의 숙련자는 유효량을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로 치료학적 유효량은 0.005 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중, 특히 0.005 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중으로 예상된다. 하루에 걸쳐 적당한 간격을 두고 2, 3, 4 이상의 아-투여량으로 필요한 투여량을 투여하는 것이 적당하다. 상기 아-투여량은 예를 들면, 단위 투약 형태 당 0.5 내지 500 mg, 특히 10 mg 내지 500 mg의 활성성분을 포함하는 단위 투약 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면으로서, 구체적으로는 암 또는 관련질환의 치료시에 특히 의약으로서의 사용을 위해, HDAC 저해제와 다른 항암제의 배합이 예기된다.

상기 증상의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 약제, 특히 다른 항암제와 병용하여 사용될 수 있다. 항암제의 예로는:

- 백금 배위 화합물, 예를 들면 시스플라틴, 카보플라틴 또는 옥살리플라틴;

- 탁산 화합물, 예를 들면 파클리탁셀 또는 도세탁셀;

- 캄프토테신 화합물 등의 토포이소메라제 I 저해제, 예를 들면 이리노테칸 또는 토포테칸;

- 항종양 포도필로톡신 유도체 등의 토포이소메라제 II 저해제, 예를 들면 에토포사이드 또는 테니포사이드;

- 항종양 빈카 알칼로이드, 예를 들면 빈플라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈;

- 항종양 뉴클레오시드 유도체, 예를 들면 5-플루오로우라실, 젬시타빈 또는 카페시타빈;

- 니트로겐 머스타드 또는 니트로소우레아 등의 알킬화제, 예를 들면 사이클로포스파미드, 클로람부실, 카르무스틴 또는 로무스틴;

- 항종양 안트라사이클린 유도체, 예를 들면 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신 또는 미톡산트론;

- HER2 항체, 예를 들면 트라스투주맙;

- 에스트로겐 수용체 길항제 또는 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터, 예를 들면 타목시펜, 토레미펜, 드롤록시펜, 파슬로덱스 또는 랄록시펜;

- 엑세메스탄, 아나스트로졸, 렉트라졸 및 보로졸 등의 아로마타제 저해제;

- 레티노이드, 비타민 D 및 레티노산 대사 차단약 (RAMBA) 등의 분화제, 예를 들면 아큐탄;

- DNA 메틸 트란스페라제 저해제, 예를 들면 아자사이티딘;

- 키나제 저해제, 예를 들면 플라보페리돌, 이마티닙메실레이트 또는 제피티닙;

- 파네실트란스페라제 저해제;

- 기타 HDAC 저해제;

- 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 저해제, 예를 들면 벨카드 (Velcade); 또는

- 욘델리스를 들 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "백금 배위 화합물"은 이온 형태의 백금을 제공하는 임의의 종양세포 증식을 저해하는 백금 배위 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "탁산 화합물"은 탁산환계를 갖고, 주목을 포함한 주목과의 특정 종(Taxus)의 추출물에 관련 또는 이로부터 유도된 화합물의 계열을 지칭한다.

용어 "토포이소메라제 저해제"는 진핵세포의 DNA 토폴로지를 변화시킬 수 있는 효소를 지칭하는 것으로 사용된다. 이들은 중요한 세포 기능 및 세포 증식에 대해 결정적이다. 진핵세포에는 두 종류의 토포이소메라제, 즉 I형 및 II형이 있다. 토포이소메라제 I은 약 100,000 분자량의 단량체 효소이다. 이 효소는 DNA에 결합하여 일시적인 1본쇄 절단을 도입하여, 이중 나선을 풀고 (또는 풀 수 있고), 그 후에 DNA 쇄로부터 분리되기 전에 절단을 다시 봉한다. 토포이소메라제 II는 DNA 쇄 절단 또는 자유 라디칼의 형성의 유도를 포함하는 유사한 작용 메카니즘을 갖는다.

용어 "캄프토테신 화합물"은 중국산 나무 캄프토테신 아큐미나타 (Chinese tree Camptothecin acuminata) 및 인도산 나무 노타포다이트 포에티다 (Indian tree Nothapodytes foetida)로부터 유도된 수불용성 알칼로이드인 모 캄포테신 화합물과 관련되거나 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "포도필로톡신 화합물"은 맨드레이크 식물로부터 추출된 모 포도필로톡신과 관련되거나 또는 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "항종양 빈카 알칼로이드"는 페리윙클 식물 (Vinca rosea (일일초))의 추출물과 관련되거나 또는 이로부터 유도된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "알킬화제"는 생리 조건 하에서, DNA 등의 생물학적으로 중대한 거대분자에 알킬기를 주는 능력을 가진 일반적인 특징을 갖는 다양한 그룹의 화학물질을 포함한다. 니트로겐 머스타드 및 니트로소우레아와 같은 대부분의 보다 중요한 약제와 함께, 활성 알킬화 부분은 그 중 일부가 효소로, 복합체 분해 반응 후에 생체 내에서 생성된다. 알킬화제의 가장 중요한 약리 작용은 세포 증식, 특히 DNA 합성 및 세포 분열에 관련된 기초적인 메카니즘을 방해하는 것이다. 빠르게 증식하는 조직내에서의 DNA 기능 및 완전성을 방해하는 알킬화제의 능력은 그의 치료학적 적용 및 다수의 그의 독성에 대한 기초를 제공한다.

용어 "항종양 안트라사이클린 유도체"는 글리코시드 결합에 의해 결합된, 이상 (unusual) 당, 다우노사민과 함께 테트라사이클린 환 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 균류 스트렙 페우티쿠스 바 카에시우스 (Strep . peuticus var . caesius)로부터 얻은 항생제 및 그의 유도체를 포함한다.

원발성 유암에서의 사람 상피 증식 인자 수용체 2 단백질 (HER 2)의 증폭은 특정 환자에 대한 낮은 임상 예후와 관련된다는 것이 보여져왔다. 트라스투주맙은 HER2 수용체의 세포외 도메인에 고 친화성 및 특이성을 갖고 결합하는 고도로 정제된 재조합 DNA-유도 사람화된 모노클로날 IgG1 카파 항체이다.

많은 유방암은 에스트로겐 수용체를 가지며, 이들 종양의 성장은 에스트로겐에 의해 자극될 수 있다. 용어 "에스트로겐 수용체 길항제" 및 "선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터"는 에스트로겐 수용체 (ER)에 결합하는 에스트라디올의 경쟁적 저해제를 지칭하는 것으로 사용된다. 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터는 ER에 결합될 때에 수용체의 삼차원 형상에 있어서의 변화를 유도하여, DNA상의 에스트로겐 응답 배열 (estrogen responsive element, ERE)에 대한 이의 결합을 모듈레이트한다.

폐경후의 여성에서, 순환 에스트로겐의 중요한 공급원은 말초 조직에서의 아로마타제 효소에 의한 부신 및 난소의 안드로겐 (안드로스테네디온 및 테스토스테론)의 에스트로겐 (에스트론 및 에스트라디올)로의 변환으로부터이다. 아로마타제 저해 또는 불활성화를 통한 에스트로겐 제거는 호르몬 의존성 유방암에 걸린 일부 폐경후의 환자들에 대해 효과적이며 선택적인 치료이다.

용어 "항에스트로겐제"는 에스트로겐 수용체 길항제 및 선택적 에스트로겐 수용체 모듈레이터 뿐만 아니라, 상술한 아로마타제 저해제를 포함하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.

용어 "분화제"는 다양한 방식으로, 세포 증식을 저해하고 분화를 유도할 수 있는 화합물을 포함한다. 비타민 D 및 레티노이드는 다종 다양한 정상 및 악성 세포 종류의 성장 및 분화를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 레티노산 대사 차단제 (RAMBA's)는 레티노산의 시토크롬 P450-매개 이화작용을 저해함으로써 내인성 레티노산의 레벨을 증가시킨다.

DNA 메틸화 변화는 사람 종양 형성에서의 가장 일반적인 이상이다. 선택된 유전자의 프로모터 내에서의 과잉 메틸화는 대개 관련된 유전자의 불활성화와 연관되어 있다. 용어 "DNA 메틸 트란스페라제 저해제"는 DNA 메틸 트란스페라제의 약리학적 저해 및 종양 억제 유전자 발현의 재활성화를 통해 작용하는 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다.

용어 "키나제 저해제"는 세포 주기 진행 및 프로그램된 세포사 (아폽토시스)에 포함된 키나제의 강력한 저해제를 포함한다.

용어 "파네실트란스페라제 저해제"는 라스 (Ras) 및 기타 세포내 단백질의 파네실화를 방해하도록 디자인된 화합물을 지칭하는 것으로 사용된다. 그들은 악성 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 것으로 보여져왔다.

용어 "기타 HDAC 저해제"는 이하의 것을 들 수 있으니, 이들에 제한되는 것은 아니다:

- 카르복실레이트, 예를 들면, 부티레이트, 4-페닐부티레이트 또는 발프로산;

- 히드록삼산, 예를 들면, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), SAHA 유사체를 함유하는 피페라진, 비아릴히드록사메이트 A-161906 및 이의 카보졸릴에테르 유사체, 테트라하이드로피리딘 유사체 및 테트라론 유사체, 비사이클릭 아릴-N-하이드록시카복사미드, 피록사미드, CG-1521, PXD-101, 설폰아미드 히드록삼산, LAQ-824, LBH-589, 트리코스타틴 A (TSA), 옥삼플라틴, 스크립타이드, 스크립타이드 관련된 트리사이클릭 분자, m-카복시신남산 비스히드록삼산 (CBHA), CBHA형 히드록삼산, 트라폭신-히드록삼산 유사체, R306465 및 관련된 벤조일- 및 헤테로아릴-히드록삼산, 아미노수베레이트 및 말로닐디아미드;

- 사이클릭 테트라펩티드, 예를 들면, 트라폭신, 아피디신, 뎁시펩티드, 스피루초스타틴 관련 화합물, RedFK-228, 술프히드릴 함유 사이클릭 테트라펩티드 (SCOPs), 히드록삼산 함유 사이클릭 테트라펩티드 (CHAPs), TAN-174s 및 아줌아미드;

- 벤즈아미드, 예를 들면, MS-275 또는 CI-994, 또는

- 데푸데신을 들 수 있다.

용어 "유비퀴틴-프로테아솜 경로의 저해제"는 세포 주기 조절 단백질을 포함하는 프로테아솜에 있어서의 세포 단백질의 타겟된 파괴를 저해하는 화합물을 동정하는데 사용된다.

암을 치료하기 위해, 본 발명의 화합물은 방사선 조사와 병행하여 상기 기술된 바와 같은 환자에게 투여될 수 있다. 방사선 치료는 특히 오늘날 일반적으로 사용되는 선형 가속기 또는 방사성 핵종에 의해 방출되는 이온화 방사선, 특히 감마 방사선을 의미한다. 방사성 핵종에 의한 종양의 방사선 치료는 외용 또는 내복용일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 HDAC 저해제와 항암제의 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 예를 들면 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 약물 요법에 사용하는 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 유효량의 배합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 피검자의 종양세포의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 유효량의 배합물을 투여함으로써, 형질변환 세포를 포함하는 세포의 이상 증식을 저해하기 위한 방법을 제공한다.

기타 약제 및 HDAC 저해제가 동시에 (예를 들면, 분리 또는 단위 조성물) 또는 각 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 두 화합물은 유리하거나 상승 효과가 달성되는 것을 확보하는 충분한 기간, 양 및 방식으로 투여될 것이다. 바람직한 방법, 투여의 순서, 각각의 투여량 및 조성물의 각 성분에 대한 처방은 투여되는 특정의 다른 약제 및 HDAC 저해제, 이들의 투여 경로, 치료할 특정 종양 및 치료할 특정의 숙주에 따라 결정될 것이다. 최적의 방법, 투여의 순서, 투여량 및 요법은 통상적인 방법을 사용하여, 그리고 본 명세서에 상세히 기술한 정보에 비추어 해당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

백금 배위 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 1 내지 500 mg (mg/m²), 예를 들면 50 내지 400 mg/m²의 투여량으로, 특히 시스플라틴에 대해서는 약 75 mg/m²의 투여량으로, 카보플라틴에 대해서는 약 300 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

탁산 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 50 내지 400 mg (mg/m²), 예를 들면 75 내지 250 mg/m², 특히 파클리탁셀에 대해서는 약 175 내지 250 mg/m²의 투여량으로, 도세탁셀에 대해서는 약 75 내지 150 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

캄프토테신 화합물은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 0.1 내지 400 mg (mg/m²), 예를 들면 1 내지 300 mg/m²의 투여량으로, 특히 이리노테칸에 대해서는 약 100 내지 350 mg/m²의 투여량으로, 토포테칸에 대해서는 약 1 내지 2 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 포도필로톡신 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 30 내지 300 mg (mg/m²), 예를 들면 50 내지 250 mg/m²의 투여량으로, 특히 에토포사이드에 대해서는 약 35 내지 100 mg/m²의 투여량으로, 테니포사이드에 대해서는 약 50 내지 250 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 빈카 알칼로이드는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 2 내지 30 mg (mg/m²)의 투여량으로, 특히 빈블라스틴에 대해서는 약 3 내지 12 mg/m²의 투여량으로, 빈크리스틴에 대해서는 약 1 내지 2 mg/m²의 투여량으로, 비노렐빈에 대해서는 약 10 내지 30 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 뉴클레오시드 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 200 내지 2500 mg (mg/m²), 예를 들면 700 내지 1500 mg/m²의 투여량, 특히 5-FU에 대해서는 약 200 내지 500 mg/m²의 투여량으로, 젬시타빈에 대해서는 약 800 내지 1200 mg/m²의 투여량으로, 카페시타빈에 대해서는 약 1000 내지 2500mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

니트로겐 머스타드 또는 니트로소우레아 등의 알킬화제는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 100 내지 500 mg (mg/m²)의 투여량, 예를 들면 120 내지 200 mg/m², 특히 사이클로포스파미드에 대해서는 약 100 내지 500 mg/m²의 투여량으로, 클로람부실에 대해서는 약 0.1 내지 0.2 mg/m²의 투여량으로, 카르무스틴에 대해서는 약 150 내지 200 mg/m²의 투여량으로, 로무스틴에 대해서는 약 100 내지 150 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항종양 안트라사이클린 유도체는 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 10 내지 75 mg (mg/m²), 예를 들면 15 내지 60 mg/m²의 투여량, 특히 독소루비신에 대해서는 약 40 내지 75 mg/m²의 투여량으로, 다우노루비신에 대해서는 약 25 내지 45 mg/m²의 투여량으로, 이다루비신에 대해서는 약 10 내지 15 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

트라스투주맙은 치료 코스당 체표면적 1 평방 미터당 1 내지 5 mg (mg/m²), 특히 2 내지 4 mg/m²의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다.

항에스트로겐제는 특정 약제 및 치료할 증상에 따라 매일 약 1 내지 100 mg 의 투여량으로 투여되는 것이 유리하다. 타목시펜은 치료 효과를 달성하고 유지하기에 충분한 시간 동안 치료를 계속하면서, 하루에 두번 약 5 내지 50 mg의 투여량으로, 바람직하게는 10 내지 20 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 토레미펜은 치료 효과를 달성하고 유지하기에 충분한 시간 동안 치료를 계속하면서, 하루에 한 번 약 60 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 아나스트로졸은 하루에 한 번 약 1 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 드롤록시펜은 하루에 한 번 약 20 내지 100 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 랄록시펜은 하루에 한 번 약 60 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다. 에세메스탄은 하루에 한 번 약 25 mg의 투여량으로 경구 투여하는 것이 유리하다.

이들 투여량은 예를 들면, 치료 코스당 1 회, 2 회 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 이는 7, 14, 21 또는 28일마다 반복될 수 있다.

이들의 유용한 약리학적 특성에 비추어, 본 발명에 따른 조성물의 성분, 즉 다른 약제 및 HDAC 저해제는 투여 목적에 따라 다양한 약제학적 제형으로 제형화될 수 있다. 성분들은 개개의 약제학적 조성물로 분리되거나 양 성분을 함유하는 단위 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적 담체와 함께 다른 약제 및 HDAC 저해제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적 담체와 함께 본 발명의 HDAC 저해제 및 항암제를 포함하는 약제학적 조성물 형태의 본 발명에 따른 배합물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 배합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 동시적, 분리적 또는 순차적 사용을 위한 복합 제제로서, 제 1 활성성분으로서의 본 발명의 HDAC 저해제 및 제 2 활성성분으로서의 항암제를 함유하는 약제에 관한 것이다.

실험부

하기 실시예는 예시의 목적으로 제공되었다.

이후, "DCM"은 디클로로메탄, "DIPE"는 디이소프로필 에테르, "DMA"는 N,N-디메틸아세트아미드, "DMSO"는 디메틸설폭시드, "EDC"는 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-l,3-프로판디아민, 모노하이드로클로라이드, "EtOAc"는 에틸 아세테이트, "EtOH"는 에탄올, "HOBt"는 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸, "MeOH"는 메탄올, "TFA"는 트리플루오로아세트산 및 "THF"는 테트라하이드로퓨란으로 정의된다.

A. 중간체 화합물의 제조

실시예 A1

a) 중간체 1의 제조

MeOH (80ml)중 2-[4-(아미노메틸)-l-피페리디닐]-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.0114 mol), l-메틸-lH-인돌-3-카복스알데히드 (0.017 mol) 및 MgSO₄ (0.5g)의 혼합물을 교반시키고, 15 시간 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 소듐 테트라하이드로보레이트 (0.018 mol)를 분할하여 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 교반하고, 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (6.6g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm) (용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 94/6/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 1을 4.3g (90%) 수득하였다.

b) 중간체 2의 제조

EtOH (60ml)중 중간체 1 (0.0037 mol) 및 수산화나트륨 (0.0074 mol)의 혼합물을 5O℃에서 15 시간 교반시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 건조해질 때까지 용매를 증발시켜 중간체 2를 1.5g (100%) 수득하였다.

c) 중간체 3의 제조

N₂ 유입하에서, DCM (100ml) 및 THF (100ml)중 중간체 2의 혼합물 (0.005 mol)에 EDC (0.0075 mol), 그 후 HOBt (0.0075 mol) 그 후 O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.015 mol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 4 시간 교반하고, 얼음 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시켜 용매를 증발시켰다. 잔기(4g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 3을 1 g (42%) 수득하였다. 일 분획 (0.051g)을 DIPE로부터 결정화시켰다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점이 70℃인 중간체 3을 0.03g 수득하였다.

실시예 A2

a) 중간체 4의 제조

THF (40ml) 및 수산화나트륨 1N (40ml)중 2-[4-(아미노메틸)-l-피페리디닐]- 5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.0072 mol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 염산 1N (40ml)을 첨가하여, 혼합물을 10분간 교반시켰다. 탄산나트륨 (0.0216 mol)을 첨가하고, 혼합물을 10분간 교반시키고, l-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]옥시]-2,5-피롤리딘디온 (0.0072 mol)을 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6 시간 교반한 후, 0℃로 냉각시키고, 염산으로 산성화하였다. 침전물을 여과시키고, 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜, 중간체 4 를 4.1g (100%) 수득하였다.

b) 중간체 5의 제조

트리에틸아민 (0.02 mol), EDC (0.0082 mol) 및 HOBt (0.0082 mol)를 실온에서 DCM/THF (200ml)중 중간체 4의 혼합물 (0.0068 mol)에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0082 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다.

유기층을 NaHCO₃ 10%으로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여, 용매를 증발시켰다. 잔기(4g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (15-40μ m)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 5를 3.4g (89%) 수득하였다.

c) 중간체 6의 제조

DCM (400ml)중 중간체 5 (0.0355 mol) 및 피페리딘 (0.089 mol)의 혼합물을 35℃에서 72 시간 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔기를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (15-40μm) (용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시키고, 6.7g (56%)을 수득하였다. 일부 잔기 (0.79g)를 디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 129℃인 중간체 6을 0.62g 수득하였다.

d) 중간체 7의 중간체

1,2-디클로로-에탄 (30ml)중 중간체 6 (0.0009 mol) 및 5-클로로-lH-인돌-3-카복스알데히드 (0.0012 mol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 트리스(아세테이토-α-O)하이드로-보레이트(l-), 소듐 (0.0013 mol)을 조금씩 첨가하였다. 혼 합물을 실온에서 4 시간 교반하고, 물/NaOH 3N에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.5g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액 DCM/MeOH/NH₄OH 93/7/0.5). 2 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 7을 0.07g (16%) 수득하였다.

실시예 A3

a) 중간체 8의 제조

아세토니트릴 (40ml)중 2-(메틸설포닐)-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.094 mol)의 용액을 10℃에서 아세토니트릴 (200ml)중 4-피페리딘메탄올 (0.086 mol) 및 포타슘 카보네이트 (0.172 mol)의 서스펜션에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 만들고, 그 후, 4 시간 동안 교반하여, 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여, 용매를 증발시켰다. 잔기 (23 g)를 아세토니트릴/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜, 중간체 8을 7.8g (34%) 수득하였다. 모층을 증발시켰다. 잔기 (17g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(20-45 μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 녹는점 129℃인, 중간체 9를 4.6g (20%) 수득하였다.

b) 중간체 9의 제조

트리에틸아민 (0.038 mol), 그 후, 메탄설포닐 클로라이드 (0.025 mol)을 0℃에서 DCM (80ml)중 중간체 8 (0.0189 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반하고, 얼음물에 부었다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켜, 중간체 9를 6.5g (100%) 수득하였다.

c) 중간체 10의 제조

아세토니트릴 (180ml)중 중간체 9 (0.0189 mol), N-메틸-lH-인돌-3-에탄아민 (0.0172 mol) 및 포타슘 카보네이트 (0.0344 mol)의 혼합물을 교반하고, 24 시간 환류시켜 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시켜, 용매를 증발시켰다. 잔기 (8.5g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(70-200μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0 - 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 10을 1.25g (20%) 수득하였다.

d) 중간체 11의 제조

EtOH (80ml)중 중간체 10(0.003 mol) 및 수산화나트륨 (0.006 mol)의 혼합물을 교반하고, 밤새 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 건조할 때까지 용매를 증발시켜, mp.>260℃인 중간체 11을 1.3g (100%) 수득하였다.

e) 중간체 12의 제조

EDC (0.0045 mol), 그 후 HOBt (0.0045 mol)를 실온에서 THF (100ml) 및 DCM (100ml)중 중간체 11의 혼합물 (0.003 mol)에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.012 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시켜, 용매를 증발시켰다. 잔기(3g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 94/6/0.1;). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.82g)를 디에틸 에테르중 녹였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 154℃인 중간체 12를 0.78g 수득하였다.

실시예 A4

a) 중간체 13의 제조

아세토니트릴 (20ml)중 2-[4-(아미노메틸)-l-피페리디닐]-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.0049 mol), lH-인돌-3-에탄올, 메탄설포네이트 (에스테르) (0.0054 mol) 및 포타슘 카보네이트 (0.01 mol)의 혼합물을 교반하고, 밤새 환류시킨 후, 냉각시켜, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (2.2g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 녹는점 238℃인 중간체 13을 0.442g (22%) 수득하였다.

b) 중간체 14의 제조

DMSO (20ml)중 중간체 13 (0.0025 mol), (2-브로모에톡시)(l,l-디메틸에틸)디메틸-실란 (0.0034 mol) 및 N-에틸-N-(l-메틸에틸)-2-프로판아민 (0.0038 mol)의 혼합물을 50℃에서 15 시간 교반시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.7g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 14를 0.76g (54%) 수득하였다.

c) 중간체 15의 제조

EtOH (40ml)중 중간체 14 (0.0013 mol) 및 수산화나트륨 (0.0027 mol)의 혼합물을 8O℃에서 밤새 교반시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 용매를 증발시켜, 중간체 15를 0.75g (100%) 수득하였다.

d)중간체 16의 제조

EDC (0.002 mol), 그 후 HOBt (0.002 mol)를 실온에서 THF (80ml) 및 DCM (80ml)중 중간체 15의 혼합물 (0.0013 mol)에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0068 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시켜, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.3g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 16을 0.38g 수득하였다.

e) 중간체 17의 제조

THF (10ml)중 중간체 16 (0.0011 mol) 및 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (0.0032 mol)의 혼합물을 실온에서 72 시간 교반하고, 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켜, 중간체 17을 0.5g (88%) 수득하였다.

실시예 A5

a) 중간체 45의 제조

DMA (80ml)중 2-클로로-5-피리미딘카복실산, 메틸 에스테르 (0.058 mol) 의 용액을 DMA (150ml)중 4-피페리딘메탄아민 (0.116 mol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.145 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 30분 교반하고, 얼음물에 붓고, EtOAc로 추출하고, 그 후 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기를 DIPE로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 중간체 45를 1Og (65%) 수득하였 다.

b) 중간체 46의 제조

MeOH (80ml)중 중간체 45 (0.0024 mol), l-메틸-5-니트로-lH-인돌-3-카복스알데히드 (0.0036 mol) 및 MgSO₄ (0.25g)의 혼합물을 60℃에서 밤새 교반시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 소듐 테트라하이드로보레이트 (0.0041 mol)를 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18 시간 교반하고, 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (l.lg)를 아세토니트릴로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 150℃인 중간체 46을 0.9g (86%) 수득하였다.

c) 중간체 47의 제조

EtOH (60ml)중 중간체 46 (0.002 mol) 및 수산화나트륨 (0.008 mol)의 혼합 물을 60℃에서 밤새 교반시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르중 녹였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 중간체 47을 0.6g (67%) 수득하였다.

d) 중간체 48의 제조

EDC (0.0019 mol) 및 HOBt (0.0019 mol)를 실온에서 DCM/THF (50/50) (100ml)중 중간체 47 (0.0013 mol) 및 트리에틸아민 (0.0039 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0026 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (1g)을 크로마실 (5μm)상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.2 - 92/8/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 48을 0.101 g (15%) 수득하였다.

실시예 A6

a) 중간체 49의 제조

DCM (80ml)중 2-클로로-5-피리미딘카복실산, 메틸 에스테르 (0.033 mol)의 용액을 실온에서 DCM (100ml)중 4-피페리딘메탄올 (0.066 mol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.083 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 30분 동안 교반하고, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기를 펜탄에 녹였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 중간체 49를 7.88g (95%) 수득하였다.

b) 중간체 50의 제조

DMSO (0.058 mol)를 -78℃에서 DCM (50ml)중 에탄디오일 디클로라이드 (0.0278 mol)용액에 N₂ 유입하에서 적가하였다. 혼합물을 15분간 교반하였다. DCM (200ml)중 중간체 49 (0.023 mol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 1시간 30분간 교반하였다. 트리에틸아민 (0.118 mol)을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 1시간 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 중간체 50을 3.06g (54%) 수득하였다.

c) 중간체 51의 제조

중간체 50 (0.0122 mol)을 5℃에서 MeOH (270ml)중 1-메틸-lH-인돌-3-에탄아민 (0.0122 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 수 분간 교반하였다. 소듐시아노보로하이드라이드 (0.0183 mol) 및 아세트산 (0.0183 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하고, 포타슘 카보네이트 10%에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기(4.9g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 51을 1.2g (24%) 수득하였다.

d) 중간체 52의 제조

EtOH (60ml)중 중간체 51 (0.0009 mol) 및 수산화나트륨 (0.0039 mol)의 혼합물을 교반하고, 15 시간 환류시킨 후, 건조될 때까지 증발시켜, 중간체 52를 수득하였다. 이 중간체를 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

e) 중간체 53의 제조

HOBt (0.0019 mol), 그 후 EDC (0.0019 mol)를 실온에서 DCM/THF (130ml)중 중간체 52 (0.0009 mol) 및 O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0019 mol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.93g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 53을 0.155g (33%) 수득하였다.

실시예 A7

a) 중간체 54의 제조

EtOH중 1ml의 10% 티오펜 용액을 함유한 MeOH (20ml)중 2-[4-(아미노메틸)-l-피페리디닐]-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.0038 mol), 1-에틸-lH-인돌-3-카복스알데히드 (0.0049 mol) 및 Pd/C 10% (0.5g)의 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 3 bar의 압력하에서 수소화시키고, 그 후 셀라이트상에서 여과하였다. 건조될 때까지 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.8g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2 - 93/7/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 54를 0.7g (44%) 수득하였다.

b) 중간체 55의 제조

소듐 하이드라이드 60% (0.009 mol)를 0℃에서 THF (50ml)중 중간체 54 (0.0045 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. THF (10ml)중 아이오도-에탄 (0.0062 mol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.6g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 55를 0.16g (8%) 수득하였다.

c) 중간체 56의 제조

EtOH (15ml)중 중간체 55 (0.0003 mol) 및 수산화나트륨 (0.03g)의 혼합물을 80℃에서 6 시간 동안 교반한 후, 건조될 때까지 증발시켜, 중간체 56을 0.16g (100%) 수득하였다.

d) 중간체 57의 제조

EDC (0.0005 mol) 및 HOBt (0.0005 mol)를 실온에서 DCM (20ml) 및 THF (20ml)중 중간체 56 (0.0003 mol)의 혼합물에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 15분간 교반하였다. O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0007 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.3g)를 크로마실 (5μm)상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 93/7/0.35). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 57을 0.03g (16%) 수득하였다.

실시예 A8

a) 중간체 58의 제조

소듐 하이드라이드 (0.011 mol)를 5℃에서 THF (30ml)중 중간체 13 (0.0037 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 30분간 교반하였다. THF (10ml)중 아이오도메탄 (0.0081 mol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 10℃에서 2 시간 교반한 후, 1시간 30분간 실온으로 만들고, 얼음물에 부어, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.7g)를 크로마실상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₃OH 98/2/0.1). 2 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 58을 0.265g 및 중간체 10을 0.57g(17%)의 수득하였다.

b) 중간체 59의 제조

EtOH (30ml)중 중간체 58 (0.0006 mol) 및 수산화나트륨 (0.0012 mol)의 혼합물을 80℃에서 밤새 교반시킨 후, 실온으로 냉각하고, 용매를 증발시켜 중간체 59를 0.26g (100%) 수득하였다.

c) 중간체 60의 제조

EDC (0.0009 mol) 및 HOBt (0.0009 mol)를 실온에서 THF (30ml) 및 DCM (30ml)중 중간체 59 (0.0006 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실 온에서 15분 동안 교반하고, 0-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0012 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.6g)를 크로마실 (5μm)상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 99/1/0.05 및 94/6/0.3). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 60을 0.lg (33%) 수득하였다.

실시예 A9

a) 중간체 61의 제조

DMSO (0.127 mol)를 -78℃에서 DCM (110ml)중 에탄디오일 디클로라이드 (0.061 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 15분간 교반하였다. DCM (200ml)중 중간체 8 (0.051 mol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 -78℃에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 트리에틸아민 (0.26 mol)을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 15분간 교반한 후, 2 시간 30분 동안 실온으로 만들었다. 물을 첨가하고, 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (14g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (20-45 μm) (용리액: 사이클로헥산/EtOAc 70/30). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 61을 7.6g(57%) 수득하였다.

b) 중간체 62의 제조

소듐시아노보로하이드라이드 (0.049 mol) 및 아세트산 (0.034ml)를 실온에서 MeOH (700ml)중 5-클로로-l-메틸-lH-인돌-3-에탄아민 (0.031 mol) 및 중간체 61 (0.034 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 포타슘 카보네이트 10%에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (14.8g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(20-45μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 62를 4.52g (32%) 수득하였다.

c) 중간체 63의 제조

메탄설포닐 클로라이드 (0.0049 mol)를 5℃에서 DCM (150ml)중 중간체 62 (0.004 mol) 및 트리에틸아민 (0.008 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (2.39g)를 DIPE에 녹였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 162℃인, 중간체 63을 1.78g (84%) 수득하였다.

d) 중간체 64의 제조

EtOH (150ml)중 중간체 63 (0.0032 mol) 및 수산화나트륨 (0.0128 mol)의 혼합물을 교반하고, 5 시간 동안 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 디에틸 에테르중 녹였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점> 260℃인 중간체 64를 1.57g (99%) 수득하였다.

e) 중간체 65의 제조

EDC (0.0064 mol) 및 HOBt (0.0064 mol)를 실온에서 THF (160ml) 및 DCM (160ml)중 중간체 64 (0.0032 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0064 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (2.77g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.385g)를 CH₃CN/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 179℃인 중간체 65를 0.084g 수득하였다.

실시예 AlO

a) 중간체 66의 제조

아세토니트릴 (240ml)중 2-(메틸설포닐)-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르 (0.094 mol)의 용액을 실온에서 아세토니트릴 (120ml)중 4-피페리디닐-카밤산, 1,1-디메틸에틸 에스테르 (0.078 mol) 및 포타슘 카보네이트 (0.156 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 얼음물에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄),여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 16O℃인 중간체 66을 14.4g (53%) 수득하였다.

b) 중간체 67의 제조

TFA (20ml)를 실온에서 DCM (110ml)중 중간체 66 (0.0225 mol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15 시간 동안 교반하고, 물에 붓고 및 포타슘 카보네이트로 염기성화하였다. 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켜 중간체 67을 5.5g (98%) 수득하였다.

실시예 All

a) 중간체 68의 제조

오일 (0.0069 mol)중 소듐 하이드라이드 60%를 O℃에서 THF (10ml)중 2-메틸-lH-인돌-3-아세트산, 에틸 에스테르 (0.0046 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 아이오도-에탄 (0.006 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, EtOAc 및 포화 NaCl에 부었다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 건조될 때까지 증발시켰다. 잔기 (1.1g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: 사이클로헥산/EtOAc 80/20). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 68을 0.73g (65%) 수득하였다.

b) 중간체 69의 제조

톨루엔중 디이소부틸알루미늄 하이드라이드 용액(0.0045 mol)을 -78℃에서 DCM (15ml) 및 1,2-디메톡시에탄 (15ml) (분자체: 3 angstrom)중 중간체 68 (0.003 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 3 시간 교반한 후, HCl 3N으로 퀀칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 건조될 때까지 용매를 증발시켜 중간체 69를 0.7g (>100%) 수득하였다.

d) 중간체 70의 제조

티타늄 (IV) 에톡사이드 (0.0023 mol)를 1,2-디클로로-에탄 (25ml)중 중간체 67 (0.0021 mol) 및 중간체 69 (0.0021 mol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 트리스(아세테이토-α-O)하이드로-보레이트(l-), 소듐 (0.0023 mol)를 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, NaHCO₃으로 퀀칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 건조될 때까지 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.2g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(5μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 70을 0.2g (21 %) 수득하였다.

d) 중간체 71의 제조

EtOH (30ml)중 중간체 70 (0.0004 mol) 및 수산화나트륨 (0.0009 mol)의 혼합물을 6O℃에서 밤새 교반한 후, 실온으로 냉각시키고, 증발시켜 중간체 71을 0.2g (100%) 수득하였다.

e) 중간체 72의 제조

EDC (0.0007 mol) 및 HOBt (0.1 g)를 실온에서 DCM/THF (40ml)중 중간체 71 (0.0004 mol) 및 트리에틸아민 (0.0009 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0009 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.4g)를 크로마실상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(5μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 98/2/0.1 - 90/10/1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 72를 0.087g (37%) 수득하였다.

실시예 A12

a) 중간체 73의 제조

중간체 50 (0.0046 mol)을 5℃에서 MeOH (100ml)중 6-메톡시-l-메틸-lH-인돌-3-에탄아민(0.0046 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 30분간 교반하였다. 소듐시아노보로하이드라이드 (0.0068 mol), 그 후 아세트산 (0.0046 mol)을 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 포타슘 카보네이트 10%에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (4g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm))(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (2.2g)의 일부(0.7g)를 아세토니트릴로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 122℃인 중간체 73을 0.43g (61%) 수득하였다.

b) 중간체 74의 제조

EtOH (90ml)중 중간체 73 (0.0015 mol) 및 수산화나트륨 (0.006 mol)의 혼합물을 교반하고, 8 시간 동안 환류시키고, 건조될 때까지 증발시켜 중간체 74를 수득하였다.

c) 중간체 75의 제조

HOBt (0.003 mol), 그 후 EDC (0.003 mol)를 실온에서 THF/DCM (200ml)중 중간체 74 (0.0015 mol) 및 O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.003 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.1g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(lOμm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용 매를 증발시켰다. 잔기 (0.24g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(lOμm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 75를 0.17g (21%) 수득하였다.

실시예 A13

a) 중간체 76의 제조

톨루엔 (130ml)중 6-메톡시-lH-인돌-3-에탄아민 (0.053 mol) 및 1,3-이소벤조퓨란디온 (0.058 mol)의 혼합물을 교반하고, 48 시간 환류시킨 후, 여과하였다. 여과액을 증발시켜, 중간체 76을 5.4g (32%) 수득하였다.

b) 중간체 77의 제조

DMF (19ml)중 중간체 76 (0.017 mol)의 용액을 실온에서 DMF (11 ml)중 소듐 하이드라이드 (0.034 mol)의 서스펜션에 N₂ 유입하에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반하고, 1-아이오도-프로판 (0.034 mol)을 첨가하였다. 혼 합물을 실온에서 1시간 15분 동안 교반하고, 포화 NaCl을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켜, 중간체 77을 4.9g 수득하였다. 이 산물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

c) 중간체 78의 제조

EtOH (60ml)중 중간체 77 (0.068 mol) 및 히드라진, 모노하이드레이트 (0.068 mol)의 혼합물을 교반하고, 1시간 환류시켜 물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켜 중간체 78을 3.53g 수득하였다. 이 산물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

d) 중간체 79의 제조

소듐시아노보로하이드라이드 (0.024 mol) 및 아세트산 (0.0167 mol)을 실온에서 MeOH (380ml)중 중간체 61 (0 0167 mol) 및 중간체 78 (0.015 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 30분간 교반하고, 포타슘 카보네이트 10%에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (8.84g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 79를 2.85g (40%) 수득하였다.

e) 중간체 80의 제조

DMF (60ml)중 중간체 79 (0.0028 mol), 아이오도-에탄 (0.0056 mol) 및 트리에틸아민 (0.0085 mol)의 혼합물을 50℃에서 7 시간 동안 교반하고, 얼음물에 부어, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.8g)를 크로마실 상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(5μm)(용리액: DCM/MeOH 100/0 - 95/5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 80을 1.1g (78%) 수득하였다.

f) 중간체 81의 제조

EtOH (100ml)중 중간체 80 (0.0022 mol) 및 수산화나트륨 (0.0088 mol)의 혼합물을 교반하고, 6 시간 동안 환류시킨 후, 실온에서 밤새 교반하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르에 녹여, 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점> 260℃인 중간체 81을 0.965g (88%) 수득하였다.

g) 중간체 82의 제조

EDC (0.0038 mol) 및 HOBt (0.0038 mol)를 실온에서 THF (100ml) 및 DCM (100ml)중 중간체 81 (0.0019 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0038 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 물에 부어 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.2g)를 크로마실상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(5μ m)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 99/1/0.05 - 93/7/0.35). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 82를 0.114g 수득하였다.

실시예 Al4

a) 중간체 83의 제조

EtOH (150ml)중 중간체 62 (0.0034 mol) 및 수산화나트륨 (0.0134 mol)의 혼합물을 80℃에서 3 시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르에서 녹이고, 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점> 260℃인 중간체 83을 1.18g (78%) 수득하였다.

b) 중간체 84의 제조

EDC (0.0052 mol) 및 HOBt (0.0052 mol)를 실온에서 THF (120ml) 및 DCM (120ml)중 중간체 83 (0.0026 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0052 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6일 동안 교반하고, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔기 (2g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.75g, 55%)를 크로마실상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(10μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 96/4/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 84를 0.625g 수득하였다. 이 산물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

실시예 A15

중간체 85의 제조

4-피페리딘메탄아민 (0.65 mol) 및 포타슘 카보네이트 (96 g)를 아세토니트릴 (1000 ml)중 교반하고, 그 후, 아세토니트릴 (500 ml)중 2-(메틸설포닐)-5-피리미딘카복실산, 에틸 에스테르(0.37 mol)을 실온에서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 물 중 교반하고, 혼합물을 DCM (2 × 500 ml)으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 물로 세척하여, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(용리액 1 : EtOAc/헥산 1/1; 용리액 2: MeOH + 소량의 NH₄OH). 산물 분획을 수집하고, 포타슘 카보네이트 슬러리와 같이 교반하고, 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과하여 용매를 증발시키고 중간체 85를 31 g (32 %) 수득하였다.

실시예 Al6

a) 중간체 86의 제조

소듐 하이드라이드 (0.0095 mol)를 5℃에서 THF (52ml)중 5-클로로-lH-인돌-3-카복스알데히드 (0.0056 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 1-아이오도-프로판 (0.0067 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하고, 물에 부어 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켜, 중간체 86을 1.5g 수득하였다. 이 산물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

b) 중간체 87의 제조

소듐시아노보로하이드라이드 (0.0068 mol) 및 아세트산 (0.0046 mol)을 실온에서 MeOH (120ml)중 중간체 85 (0.0042 mol) 및 중간체 86 (0.0051 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 2일간 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켜, 포타슘 카보네이트 10%로 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (2.42g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 87을 1.2g (60%) 수득하였다.

c) 중간체 88의 제조

EtOH (120ml)중 중간체 87 (0.0025 mol) 및 수산화나트륨 (0.01 mol)의 혼합물을 교반하고, 4 시간 동안 환류시킨 후, 건조될 때까지 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르에 녹이고, 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점> 26O℃인 중간체 88을 0.845g (72%) 수득하였다.

d) 중간체 89의 제조

EDC (0.0036 mol) 및 HOBt (0.0036 mol)를 실온에서 THF (90ml) 및 DCM (90ml)중 중간체 88 (0.0018 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 30분간 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0036 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하고, 얼음물에 부어 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.3g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 92/8/0.5). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 89를 0.54g (56%) 수득하였다.

실시예 Al7

a) 중간체 90의 제조

메탄설포닐 클로라이드 (0.004 mol)를 10℃에서 DCM (10ml)중 1,2-디메틸- lH-인돌-3-에탄올 (0.0026 mol) 및 트리에틸 아민 (0.008 mol)의 용액에 N₂ 유입하에서 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 4 시간 동안 교반하고, 용매를 건조될 때까지 증발시켜 중간체 90을 수득하였다. 이 산물을 다음 반응 단계에서 직접 사용하였다.

b) 중간체 91의 제조

아세토니트릴 (150ml)중 중간체 85 (0.0054 mol), 중간체 90 (0.0075 mol) 및 포타슘 카보네이트 (0.021 mol)의 혼합물을 교반하고, 2일간 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켜, 얼음물에 부어, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시키고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (1.88g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(15-40μm)(용리액: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0.1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 중간체 91을 0.15g (7%) 수득하였다.

c) 중간체 92의 제조

수산화나트륨 (0.0014 mol) 및 EtOH (20ml)중 중간체 91 (0.0003 mol)의 혼합물을 교반하고, 하룻동안 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르에 녹이고, 침전물을 거르고, 건조시켜 녹는점>260℃인 중간체 92를 0.12g (82%) 수득하였다.

d) 중간체 93의 제조

EDC (0.0005 mol) 및 HOBt (0.0005 mol)를 실온에서 THF (15ml) 및 DCM (15ml)중 중간체 92 (0.0002 mol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15분간 교반하고, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)-하이드록실아민 (0.0005 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4일 동안 교반하고, 얼음물에 붓고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (MgSO₄), 여과시켜, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.14g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(lOμm)(용리액 DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0.3) 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 중간체 93을 0.035g (25%) 수득하였다.

표 F-1은 상기 실시예중 하나에 따라 제조된 중간체를 열거하였다.

표 F-1 (중간체)

B. 최종 화합물의 제조

실시예 B1

화합물 1a의 제조

TFA (2ml)를 MeOH (40ml)중 중간체 3 (0.0006 mol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30시간 동안 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 EtOAc/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 130℃인 화합물 1a를 0.31g (86%) 수득하였다.

화합물 1의 택일적 합성

화합물 1b의 제조

하이드록실아민 (물중 50%, 7.5ml) 및 그 후, NaOH 1N (15ml)을 10℃에서 to MeOH (10ml)중 중간체 1 (0.0098 mol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, HCl 1N의 용액을 첨가함으로서 혼합물을 pH5-6으로 산성화하였다. 침전물을 여과하고, 디에틸에테르로 세척하여 건조하였다. 잔기를(4.5g) 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(LiChroprep?NH₂(25-40μm))(용리액: DCM/MeOH/H₂O 90/10/1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 3.1g (80%)을 수득하였다. HCl 염을 EtOH중 분획 (0.5g)으로 제조하고, 침전물을 여과하여 디에틸에테르로 세척하고, 건조시켜 녹는점 220℃인 화합물 1b를 0.43g 수득하였다.

실시예 B2

화합물 2의 제조

TFA (0.5ml)를 MeOH (10ml)중 중간체 7 (0.0001 mol)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 아세토니트 릴/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 205℃인 화합물 2를 0.036g (50%)의 수득하였다.

실시예 B3

화합물 3의 제조

TFA (5ml)를 실온에서 MeOH (100ml)중 중간체 12 (0.0014 mol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 EtOAc/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 121℃인 화합물 3을 0.545g (74%) 수득하였다.

실시예 B4

화합물 4의 제조

TFA (0.5ml)를 MeOH (80ml)중 중간체 17 (0.0009 mol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4일간 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르 로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 103℃인 화합물 4를 0.19g (32%) 수득하였다.

실시예 B5

화합물 18의 제조

TFA (0.75ml) 및 MeOH (15ml)중 중간체 48 (0.0002 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 화합물 18을 0.071g (59%) 수득하였다.

실시예 B6

화합물 19의 제조

TFA (1ml) 및 MeOH (20ml)중 중간체 53 (0.0003 mol)의 혼합물을 실온에서 24 시간 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 MeOH/CH₃CN/디에틸 에 테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 174℃인 화합물 19를 133g (80%) 수득하였다.

실시예 B7

화합물 20의 제조

TFA (0.25ml) 및 MeOH (10ml)중 중간체 57 (0.00005 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.04g)를 CH₃CN/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켰다. 잔기 (0.04g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(LiChroprep? NH₂ (25-40μm))(용리액: DCM/MeOH/H₂O 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 녹는점 9O℃인 화합물 20을 0.02g (80%) 수득하였다.

실시예 B8

화합물 21의 제조

TFA (0.5ml) 및 MeOH (10ml)중 중간체 60 (0.0001 mol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기 (0.15g)를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(LiChroprep?NH₂(25-40μm))(용리액: DCM/MeOH/H₂O 80/20/2). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 녹는점 83℃인 화합물 21을 0.064g (78%) 수득하였다.

실시예 B9

화합물 22의 제조

TFA (6ml) 및 MeOH (120ml)중 중간체 65 (0.002 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 CH₃CN/MeOH/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 183℃인 화합물 22를 0.9g (87%) 수득하였다.

실시예 BlO

화합물 23의 제조

TFA (0.5ml) 및 MeOH (10ml)중 중간체 72 (0.0001 mol)의 혼합물을 실온에서 48시간 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 182℃인 화합물 23을 0.059g (59%) 수득하였다.

실시예 B1l

화합물 24의 제조

TFA (1ml) 및 MeOH (20ml)중 중간체 75 (0.0003 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 MeOH/CH₃CN/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 16O℃인 화합물 24를 0.147g (78%) 수득하였다.

실시예 Bl2

화합물 25의 제조

TFA (2.5ml) 및 MeOH (56ml)중 중간체 82 (0.0009 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(25-40μm)(용리액: DCM/MeOH/H₂O 90/10/1). 순수한 분획을 수집하고, 용매를 증발시켰다. 잔기를 DIPE로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 건조시켜 녹는점 8O℃인 화합물 25를 0.286g (53%) 수득하였다.

실시예 B13

화합물 26의 제조

TFA (3ml) 및 MeOH (60ml)중 중간체 84 (0.0012 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고, 용매를 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 DCM/MeOH로부터 결정 화하였다. 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하여 건조시키고, 녹는점 188℃인 화합물 26을 0.322g (50%) 수득하였다.

실시예 B14

화합물 27의 제조

TFA (2.5ml) 및 MeOH (50ml)중 중간체 89 (0.001 mol)의 혼합물을 실온에서 24시간 교반한 후, 건조할 때까지 증발시켰다. 잔기를 MeOH/CH₃CN/디에틸 에테르로부터 결정화하였다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하여 건조시키고, 녹는점 171℃인 화합물 27을 0.33g (55%) 수득하였다.

실시예 B15

화합물 28의 제조

TFA (0.2ml) 및 MeOH (4ml)중 중간체 93 (0.00007 mol)의 혼합물을 실온에서 3일간 교반한 후, 건조할 때까지 증발시켜, 녹는점 80℃인 화합물 28을 0.041 g (100%) 수득하였다.

표 F-2는 상기 실시예중 하나에 따라 제조된 화합물을 열거하였다. 표에서 하기 축약을 사용하였다: .C₂HF₃O₂는 트리플루오로아세테이트염을, mp.는 녹는점을 의미한다.

표 F-2(최종 화합물)

C. 약리학적 실시예 :

히스톤 디아세틸라제의 저해에 대한 시험관 내 분석에서 (실시예 C.1 참조) 화학식 (I)의 화합물로부터 얻은 HDAC 효소 활성의 저해를 측정한다.

화학식 (I)의 화합물의 세포 활성은 세포 독성 또는 생존에 대한 측색적 분석을 이용하여 A2780 종양 세포 상에서 결정된다 (Mosmann Tim, Journal of Immunological method 65: 55-63,1983) (실시예 C.2 참조).

화합물의 용해도는 용액 중에 잔류하는 화합물의 능력을 측정한다. 제 1 방법에 있어서, 희석 시에 수용액 중에 잔류하는 화합물의 능력 (실시예 C.3.a 참조)을 측정한다. DMSO-스톡 용액은 3 개의 연속적인 단계에서 단일한 수성 완충 용매로 희석된다. 모든 희석 탁도는 비탁계로 측정된다.

제 2 방법에 있어서, 상이한 pH에서의 화합물의 용해도는 화학발광 질소 검출기를 사용하여 측정될 수 있다 (실시예 C.3.b 참조).

약물 투과성은 한 배지로부터 다른 배지로 또는 다른 배지를 통해 이동하는 이의 능력을 표현한다. 구체적으로는 장관막을 통해 혈류 및/또는 혈류로부터 표적으로 이동하는 그의 능력이다. 투과성 (실시예 C.4 참조)은 필터 고정화 인공막 인지질 이중층의 형성을 통해 측정될 수 있다. 필터 고정화 인공막 분석에서, "샌드위치"가 96 웰 마이크로타이터 플레이트 및 96 웰 필터 플레이트로 형성되어, 각각의 복합 웰은 시스템이 완충 수용액과 접촉할 때에 다층 이중층이 필터 채널 내부에 형성되는 조건하에서, 디올레오일포스파티딜콜린의 2% (wt/v) 도데칸용액으로 코팅된 125 ㎛ 마이크로필터 디스크 (0.45 ㎛ 구멍)에 의해 분리되는 저부의 공여체 용액과 상부의 수용체 용액을 가진 2개의 챔버로 분리된다. 이 인공막을 통한 화합물의 투과성은 cm/s로 측정된다. 목적은 상이한 pH: 4.0 및 7.4에서의 평행 인공막을 통한 약물의 투과를 조사하는 것이다.

화합물 검출은 250과 500 nm 사이의 최적 파장에서 자외선 분광법으로 행해진다.

약물의 대사는 지용성 생체 이물 또는 생물체 내생 화합물이 (a) 극성, 수용성 및 분비가능한 대사 산물로 효소 변환된다.

약물 대사의 주요 기관은 간이다. 대사 산물은 종종 모약물 보다 덜 활성적이거나 불활성이다. 그러나, 일부 대사 물질은 향상된 활성 또는 독성 효과를 갖는다. 따라서, 약물 대사는 "해독" 및 "중독" 과정을 포함할 수 있다. 약물 및 화학 물질을 다루는 유기체의 능력을 결정하는 주요 효소계 중 하나는 NADPH 의존성 효소인 시토크롬 P450 모노옥시게나제로 나타낸다. 화합물의 대사적 안정성은 인간 세포내 조직을 사용한 시험관 내에서 결정될 수 있다 (실시예 C.5.a 참조). 여기에서 화합물의 대사적 안정성은 마이크로솜을 사용한 이들 화합물의 배양을 15분 후의 대사된 약물의 %로서 나타낸다. 화합물의 정량은 LC-MS 분석에 의해 결정된다. 화합물의 대사적 안정성은 또한 래트 간세포 중의 화합물의 반감기를 계산함으로써 측정될 수 있다 (실시예 C.5.b 참조).

다종 다양한 항종양제가 DNA 손상제 및 히스톤 디아세틸라제 저해제를 포함하는 p21 단백질을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. DNA 손상제는 종양 억제자 p53를 통해 p21 유전자를 활성화시키는 반면, 히스톤 디아세틸라제 저해제는 전사 인자 Sp1를 통해 p21 유전자를 전사적으로 활성화시킨다. 그리하여, DNA 손상제는 p53 응답 배열을 통해 p21 프로모터를 활성화시키는데 반해, 히스톤 디아세틸라제 저해제는는 sp1 부위 (TATA 박스에 대하여 -60bp 내지 +40bp 영역에 위치함)를 통해 p21 프로모터를 활성화시키며, DNA 손상제 및 히스톤 디아세틸라제 저해제는 p21 단백질의 증대된 발현을 가져온다. 세포 중의 p21 프로모터가 p53 응답 배열을 포함하지 않는 p21 1300 bp 프로모터 프레그먼트로 구성되면, 따라서 DNA 손상제에 대하여 비반응성을 나타낸다. p21을 유도하는 화합물의 능력은 여러가지 방법으로 평가될 수 있다. 제 1 방법은 목적으로 하는 화합물을 사용하여, 세포의 용해 후에 종양 세포를 처리하여, p21 효소면역측정법 (종양 유전자의 WAF1 ELISA)으로 p21 유도를 검출한다. p21 분석은 마우스 모노클로날 및 래빗 폴리클로날을 사용하는 "샌드위치" 효소면역측정법이다. 인간 p21 단백질에 특이적인 래빗 폴리클로날 항체는 키트에 제공되는 플라스틱 웰의 표면에 고정화되어 있다. 분석할 샘플에 존재 하는 p21은 포획 항체에 결합할 것이다. 비오틴화 검출 모노클로날 항체는 또한 인간 p21 단백질을 인지하고, p21에 결합되어, 포획 항체에 의해 유지된다. 그 다음에, 검출 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 스트렙타비딘에 의해 결합된다. 양고추냉이 퍼옥시다제는 무색 용액에서 청색 용액 (또는 정지 시약의 첨가 후에 황색)으로의 발색 기질 테트라메틸벤지딘의 변환을 촉진시키며, 이의 세기는 플레이트에 결합된 p21 단백질의 양에 비례한다. 착색된 반응 생성물은 분광광도계를 이용하여 정량화된다. 정량화는 기지 농도의 p21 (동결건조)을 사용하여 표준곡선을 구축하여 달성된다. 이러한 분석은 DNA 손상의 결과 또는 히스톤 디아세틸라제 저해의 결과로서 p21 유도를 측정할 수 있다 (실시예 C.6.a 참조).

또 하나의 방법은 세포 레벨에서의 HDAC 저해의 결과로서 p21을 유도하는 화합물의 능력을 테스트한다. 세포는 p53 응답 배열을 포함하지 않고, 수용체 유전자 발현의 증가로, 대조군 레벨과 비교하여, 화합물을 p21 유도 능력을 갖는 것으로서 동정되는 p21 1300bp 프로모터 프레그먼트를 함유하는 발현 벡터로 안정하게 도입될 수 있다. 수용체 유전자는 형광 단백질이고, 수용체 유전자의 발현은 방출된 형광량으로서 측정된다 (실시예 C.6.b 참조). 최종 방법은 마우스가 화합물의 약제 활성을 스크리닝하는데 사용되는 생체 내 방법이다. 상술한 안정하게 도입된 종양 세포는 종양을 형성시키는데 충분한 양으로 마우스에 투여될 수 있다. 종양 세포가 종양을 형성하는데 충분한 시간을 가진 후에, 잠재 활성을 지닌 화합물은 동물에 투여될 수 있고, 종양 세포에 대한 상기 화합물의 효과는 수용체 유전자의 발현을 측정함으로써 평가된다. 약제 활성을 지닌 화합물로 배양하면, 대조군 레벨에 비교 하여, 수용체 유전자 발현의 증가를 가져올 것이다 (실시예 C.6.c 참조).

특이성 HDAC 저해제는 풍부한 CYP P450 단백질과 같이, 다른 효소를 저해하지 않는다. CYP P450 (E. coli 발현된) 단백질 3A4, 2D6 en 2C9는 이의 특이적 기질을 형광분자로 변환한다. CYP3A4 단백질은 7-벤질옥시-트리플루오로메틸 쿠마린 (BFC)을 7-하이드록시-트리플루오로메틸 쿠마린으로 변환한다. CYP2D6 단백질은 3-[2-(N,N-디에틸-N-메틸아미노)에틸]-7-메톡시-4-메틸쿠마린 (AMMC)을 3-[2-(N,N-디에틸아미노)에틸]-7-하이드록시-4-메틸쿠마린 하이드로클로라이드로 변환하고, CYP2C9 단백질은 7-메톡시-4-트리플루오로메틸 쿠마린 (MFC)을 7-하이드록시-트리플루오로메틸 쿠마린으로 변환한다. 효소 반응을 저해하는 화합물은 형광 신호의 감소를 가져올 것이다 (실시예 C.7 참조).

실시예 C.l.: 히스톤 디아세틸라제에 대한 시험관내 분석;

실시예 C.1.a.: [ ³ H]- 표지된 기질로의 시험관내 분석:

HeLa 핵 추출물 (공급자: Biomol)을 75 μM의 기질을 사용하여 60 ㎍/ml로 배양하였다. HDAC 활성 측정용 기질로, 합성 펩티드, 즉, 히스톤 H4의 아미노산 14-21을 사용하였다. NH₂-종단부에서 6-아미노헥산산 간격자로 기질을 비오틴화하고, COOH-종단부에서 아미드 기로 보호하였고, 특히 리신 16에서 [³H]아세틸화하였다.

기질, 비오틴-(6-아미노헥산)Gly-Ala-([³H]-아세틸-Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH₂)은, pH 7.4에서 25 mM 헤페스, 1 M 수크로스, 0.1 mg/ml BSA 및 0.01% 트리톤 X-1OO을 함유한 완충제에 첨가되었다. 30분 후, HCl 및 아세트산의 첨가로 디아세틸화 반응을 종결하였다(최종 농도, 각각 0.035 mM 및 3.8 mM). 반응을 멈춘 후, 유리 ³H-아세테이트를 에틸아세테이트로 추출하였다. 혼합 및 원심 분리 후, 상위(유기)상의 분취량중의 방사능을 β-계수기로 계산하였다.

각 실험을 위해, 대조군 (화합물 없이 HeLa 핵 추출물 및 DMSO 함유), 블랭크 배양 (DMSO는 함유했으나, HeLa 핵 추출물 또는 화합물은 없음) 및 샘플 (DMSO중 용해된 화합물 및 HeLa 핵 추출물 함유)을 동시에 수행하였다. 제 1 예에서, 화합물을 10^-5M의 농도에서 시험하였다. 화합물이 10^-5M에서 활성을 나타내었을 때, 농도-반응 곡선이 작성되며, 여기에서 화합물을 10^-5M 및 10^-12M사이의 농도에서 시험하였다. 각 시험에서 블랭크 값을 대조군 및 샘플 값 모두에서 차감하였다. 대조군 샘플은 100%의 기질 디아세틸화를 나타내었다. 각각의 샘플에서 방사능은 대조군의 평균값의 퍼센트로 나타냈다.적당한 IC₅₀ 값 (대사물질의 양을 대조군의 50%로 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 등급화된 데이터에 대한 프로빗 분석을 이용하여 계산하였다. 여기에서 시험 화합물의 효과는 pIC₅₀ (IC₅₀값의 음의 로그 값)으로 나타낸다 (표 F-3 참조).

실시예 C.1.b: 형광- 표지된 기질로의 시험관내 분석

바이오몰 (Biomol)의 HDAC 형광 활성 분석/약물 디스커버리 키트 (cat. No: AK-500-0001)를 사용한다. HDAC 형광 활성 분석은 플루오르 디 리스 (Fluor de Lys (Fluorgenic Histone deAcetylase Lysyl)) 기질 및 현상제 배합에 기초한다. 플루오르 디 리스 기질은 아세틸화 리신 측쇄를 포함한다. 기질의 디아세틸화는 제 2 단계에서 플루오르 디 리스 기질로 처리하여, 형광단을 생성하도록 기질을 감작시킨다.

HeLa 핵 추출물 (공급자: Biomol)을 75 μM의 기질을 사용하여 60 ㎍/ml로 배양하였다. 플루오르 디 리스 기질을 pH 7.4에서 25 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl 및 1 mM MgCl₂·6H₂O을 함유하는 완충액에 가하였다. 30분 후에, 1 체적의 현상제를 가하였다. 형광단을 355 nm 광으로 여기하여, 방출된 광 (450 nm)을 형광 플레이트 리더에서 검출하였다.

각 실험에 대하여, 대조군 (HeLa 핵 추출물 및 완충액 함유), 블랭크 배양 (완충액을 함유하나 HeLa 핵 추출물을 함유하지 않음) 및 샘플 (DMSO 중에 용해되고 완충액으로 희석된 화합물 및 HeLa 핵 추출물 함유)을 병행하여 진행시켰다. 첫번째 예에서, 화합물을 10^-5M의 농도에서 테스트하였다. 화합물이 10^-5M에서 활성을 나타낼 때, 농도 반응 곡선이 작성되며, 여기에서 화합물을 10^-5M과 10^-9M 사이의 농도에서 테스트하였다. 각 샘플을 4회 테스트하였다. 각각의 시험에서, 블랭크 값을 대조군 및 샘플 값에서 뺐다. 대조군 샘플은 100%의 기질 디아세틸화를 나타냈다. 각각의 샘플에서 형광성은 대조군의 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 적당한 IC₅₀ 값 (대사물질의 양을 대조군의 50%로 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 등급화된 데이터에 대한 프로빗 분석을 이용하여 계산하였다. 여기에서 시험 화합물의 효과는 pIC₅₀ (IC₅₀값의 음의 로그 값)으로 나타낸다 (표 F-3 참조).

실시예 C.2: A2780 세포에 대한 항증식 활성의 측정

시험된 모든 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 추가로 배지에서 희석을 행하였다. 최종 DMSO 농도는 세포 증식 분석 중에서 0.1 % (v/v)를 초과하지 않았다. 대조군은 화합물 없이 DMSO 및 A2780 세포를 함유하였으며, 블랭크는 세포 없이 DMSO를 함유하였다. MTT를 PBS 중에서 5 mg/ml로 용해시켰다. NaOH (1N)로 pH 10.5로 완충된 0.1 M 글리신 및 0.1 M NaCl을 포함하는 글리신 완충액을 제조하였다 (모든 시약은 Merck사 제임).

인간 A2780 난소 암세포 (Dr. T. C. Hamilton의 기증 [Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, USA])를 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/ml 겐타마이신 및 10 % 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 내에서 배양했다. 세포를 보통 37℃에서 습기가 있는 5% C0₂ 분위기 중에서 단층 배양으로서 유지하였다. 세포를 1:40의 분할 비율에서의 트립신/EDTA 용액을 이용하여 1주에 1회 통과시켰다. 모든 배지 및 보충물은 라이프 테크놀러지 (Life Technologies)사로부터 얻었다. 젠-프로브 미코 플라즈마 조직 배양 키트 (Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture kit) (공급자: BioMerieux)를 이용하여 측정된 것으로서, 세포는 미코플라즈마 오염이 없었다.

세포를 NUNC^TM 96웰 배양 플레이트 (공급자: Life Technologies)에 파종하여, 하룻밤 플라스틱에 부착시켰다. 플레이팅에 사용된 농도는 총 체적 200 ㎕ 배지에서 웰당 1500개의 세포이었다. 플레이트에의 세포 부착 후, 배지를 바꾸고, 약물 및/또는 용매를 최종 체적 200 ㎕까지 가하였다. 4 일간 배양 후, 배지를 200 ㎕의 신선한 배지로 교체하고, 세포 밀도 및 생존율을 MTT 베이스 분석을 사용하여 측정했다. 각각의 웰에, 25 ㎕의 MTT 용액을 가하고 세포를 추가로 2 시간 동안 37℃에서 배양했다. 그 후, 배지를 조심스럽게 뽑아내고, 청색 MTT-포르마잔 산물을 25 ㎕ 글리신 완충액, 이어서 100 ㎕ DMSO의 첨가에 의해 가용화하였다. 마이크로테스트 플레이트를 10분 동안 마이크로플레이트 셰이커에서 진탕하고, 540 nm에서의 흡광도를 Emax 96웰 분광광도계 (공급자: Sopachem)로 측정하였다. 실험 중에서, 각각의 실험적 조건에 대한 결과는 3개의 복제 웰의 평균이다. 최초의 스크리닝 목적을 위해, 화합물을 단일 고정된 10^-6 M의 농도에서 테스트하였다. 활성 화합물에 대해, 실험을 완전한 농도 반응 곡선을 확증하도록 반복하였다. 각각의 실험에 대해, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)을 동시에 진행하였다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값으로부터 뺐다. 각각의 샘플에 대해, 세포 증식의 평균값 (흡광도 단위로)을 대조군의 세포 증식에 대한 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 적절한 경우에, IC₅₀값 (대조군의 50%로 세포 증식을 감 소시키는데 필요한 약물의 농도)을 등급화된 자료에 대한 프로빗 분석을 이용하여 측정했다 (Finney, D. J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). 여기에서 시험 화합물의 효과는 pIC₅₀ (IC₅₀의 음의 로그값)으로서 나타낸다 (표 F-3 참조).

실시예 C.3: 용해도/안정성

C.3.1. 수성 배지중 용해도

첫번째 희석 단계에서는 DMSO (5 mM) 중에 가용화된 활성 화합물의 10 ㎕의 농축 스톡 용액을 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4에 가해, 혼합하였다. 두번째 희석 단계에서는 첫번째 희석 단계의 일정 분량 (20 ㎕)를 추가로 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4에 분배하여 혼합하였다. 최종적으로, 세번째 희석 단계에서는 두번째 희석 단계의 샘플 (20 ㎕)을 추가로 100 ㎕ 포스페이트 시트레이트 완충액 pH 7.4 중에 희석시켜 혼합하였다. 모든 희석을 96웰 플레이트에서 수행하였다. 최종 희석 단계 후 즉시, 3개의 연속 희석 단계의 탁도를 비탁계로 측정했다. 우발적인 과실을 배제하기 위해 각각의 화합물에 대해 희석을 삼중으로 수행하였다. 탁도 측정에 기초하여, 랭킹은 3개의 부류로 행해진다. 높은 용해도를 지닌 화합물은 스코어 3을 얻었으며, 이들 화합물에 대한 첫번째 희석액은 맑다. 중간 용해도를 지닌 화합물은 스코어 2를 얻었다. 이들 화합물에 대한 첫번째 희석액은 맑지 않고, 두번째 희석액이 맑다. 낮은 용해도를 지닌 화합 물은 스코어 1을 얻었으며, 이들 화합물에 대한 첫번째, 두번째 희석액 모두 맑지 않다 (표 F-3 참조).

C.3.b. 다른 pH 에서의 용해도/안정성

상이한 pH에서의 화합물의 용해도는 또한 화학발광 질소 검출기를 사용하여 측정될 수 있다 (표 F-3 참조).

실시예 C.4: 평행 인공막 투과성 분석

스톡 샘플 (100% DMSO 중의 5 mM의 스톡 용액의 10 ㎕의 일정 분량)을 2 ml의 수성 완충계 pH 4 또는 pH 7.4을 함유하는 딥웰 (deep-well) 또는 프리-믹스 (Pre-mix) 플레이트에서 희석시켰다 (PSR4계 농축액 (pION)).

샘플을 기준 플레이트에 가하기 전에, 150 ㎕의 완충액을 웰에 가하고, 블랭크 UV 측정을 수행하였다. 그 후, 완충액을 제거하고, 그 플레이트를 기준 플레이트로 사용했다. 모든 측정을 자외선 저항성 플레이트에서 수행하였다 (공급자: Costar 또는 Greiner).

기준 플레이트의 블랭크 측정 후, 150 ㎕의 희석 샘플을 기준 플레이트에 가하였고, 200 ㎕의 희석 샘플을 도너 플레이트 (donor plate) 1에 가하였다. 어셉터 필터 플레이트 (acceptor filter plate) 1 (공급자: Millipore, 종류: MAIP N45)을 4 ㎕의 인공막 형성 용액 (0.1% 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀을 함유하는 도테칸 중의 1,2-디올레오일-sn-글리세르-3-포스포콜린)로 코팅하고, "샌드위치"를 형성하기 위해 도너 플레이트 1의 상부에 놓아 두었다. 완충액 (200 ㎕)을 상부의 어셉터 웰로 분배했다. "샌드위치"를 덮개로 덮고, 18시간 동안 어두운 곳에서 실온에서 저장하였다.

150 ㎕의 완충액을 웰에 가하고, 자외선 측정을 행함으로써 어셉터 플레이트 2의 블랭크 측정을 수행하였다. 어셉터 플레이트 2의 블랭크 측정 후, 완충액을 제거하고, 150 ㎕의 어셉터 용액을 어셉터 필터 플레이트 1에서 어셉터 플레이트 2로 옮겼다. 그리고 나서, 어셉터 필터 플레이트 1을 "샌드위치"로부터 제거했다. 도너 플레이트 2의 블랭크 측정 후 (상기 참조), 150 ㎕의 도너 용액을 도너 플레이트 1로부터 도너 플레이트 2로 옮겼다. 도너 플레이트 2, 어셉터 플레이트 2 및 기준 플레이트 웰의 UV 스펙트럼들을 스캔하였다 (SpectraMAX 190 사용). 모든 스펙트럼을 PSR4p 코맨드 소프트웨어 (PSR4p Command Software)로 투과성을 계산하기 위해 처리하였다. 모든 화합물을 삼중으로 측정하였다. 카바마제핀, 그리세오풀빈, 아사이클로구아니신, 아테놀롤, 푸로세미드 및 클로로티아지드를 각 실험에서 표준물질로서 사용하였다. 화합물을 낮은 투과성 (평균 효과 < 0.5 × 10^-6 cm/s; 스코어 1), 중간 투과성 (1 × 10^-6 cm/s > 평균 효과 ≥ 0.5 × 10^-6 cm/s; 스코어 2) 또는 높은 투과성(≥ 1 × 10^-6 cm/s; 스코어 3)을 갖는 것으로서 3 개의 카테고리로 분류하였다.

실시예 C.5: 대사적 안정성

실시예 C.5.a

조직의 기계적 균질화 후 원심분리에 의해 문헌 [참조: Gorrod et al., Xenobiotica 5: 453-462, 1975)에 따라 세포내 조직을 준비했다. 간 조직을 아이스 콜드 0.1 M 트리스-HCl (pH 7.4) 완충액으로 린스하여 과량의 혈액을 세척했다. 그 후, 조직을 건조시키고 (blot dry), 중량을 재고, 수술용 가위를 사용하여 굵게 잘랐다. 조직 조각을 테플론 페슬 (Teflon pestle)을 갖춘 포터-에스 (Potter-S (Braun, 이탈리아)) 또는 소르발 옴니-믹스 균질화기 (Sorvall Omni-Mix homogeniser)를 이용하여, 7 × 10 sec 동안 3개의 체적의 아이스 콜드 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 균질화시켰다. 모든 경우에서, 용기는 균질화 과정 동안 얼음 안/상에 놓여졌다.

조직 호모지네이트를 9000 × g로 20 분간 4℃에서 소르발 원심분리기 (Sorvall centrifuge) 또는 벡만 초원심분리기 (Beckman Ultracentrifuge)를 사용하여 원심분리했다. 생성된 상청액을 -80℃로 보존하고, 'S9'로 지칭한다.

S9 분획을 추가로 100,000 × g로 60 분간 (4℃) 벡만 초원심분리기를 이용하여 원심분리했다. 생성된 상청액을 조심스럽게 뽑아내고, 나누고 (aliquoted), '시토졸 (cytosol)'로 지칭한다. 펠릿을 최초 조직 중량 0.5 g 당 1 ml의 최종 체적으로 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에 재현탁시키고, '마이크로솜'으로 지칭한다.

모든 세포내 분획을 나누고, 즉시 액체 질소 중에서 동결시켜 사용할 때까지 -80℃로 저장했다.

테스트 샘플에 대해, 배양 혼합물은 PBS (0.1 M), 화합물 (5 μM), 마이크로솜 (1 mg/ml) 및 NADPH 생성계 (0.8 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.8 mM 염화마그네슘 및 0.8 유닛의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제)를 함유했다. 대조군 샘플은 동일한 물질을 함유했으나, 마이크로솜을 가열 불활성화한 (섭씨 95도에서 10분간) 마이크로솜으로 대체하였다. 대조군 샘플 내에서의 화합물의 회수는 항상 100%이었다.

혼합물을 섭씨 37도에서 5분 동안 전배양했다. 반응은 시점 0 (t = 0)에서 0.8 mM NADP의 첨가에 의해 시작되었으며, 샘플은 15 분 (t = 15) 동안 배양되었다. 2개의 체적의 DMSO의 첨가에 의해 반응을 종료되었다. 그리고 나서, 샘플을 10분 동안 900 × g로 원심분리하고, 상청액을 분석 전에 실온에서 24 시간 이하 동안 보관했다. 모든 배양을 이중으로 수행하였다. 상청액에 대한 분석을 LC-MS 분석으로 수행하였다. 샘플의 용리를 엑스테라 (Xterra) MS C18 (50 × 4.6 mm, 5㎛, Waters, US) 상에서 수행하였다. 얼라이언스 (Alliance) 2790 (공급자: Waters, US) HPLC 시스템을 사용하였다. 완충액 A (H₂0/아세토니트릴 (95/5) 중의 25 mM 아세트산암모늄 (pH 5.2)), 아세토니트릴인 용매 B, 메탄올인 용매 C로 2.4 ml/min의 유량으로 용리를 수행하였다. 사용된 그레디언트는 유기상 농도를 5분내의 50% B 및 50% C에서 0%로부터, 1분내에 100% B로 선형으로 증가시키고, 유기상의 농도를 추가 1.5분 동안 고정시켰다. 샘플의 총 주입량은 25 ㎕이었다.

쿼트로 (Quattro) (공급자: Micromass, Manchester, UK) 삼중 사중극자 질량 분석계를 설비하고, ESI 소스를 검출기로서 사용했다. 소스 및 탈용매화 온도를 각각 120 및 350℃로 설정했으며, 질소를 네불리저 (nebuliser) 및 건조 가스로 사용하였다. 데이터는 포지티브 스캔 모드로 얻었다 (단일 이온 반응). 콘 전압 (Cone voltage)은 10 V로 설정하고, 체류시간은 1초이었다.

대사적 안정성은 활성 마이크로솜 (E(act))의 존재하에서의 15 분간의 배양 후의 화합물의 대사 %로 나타냈다 (% 대사 = 100% - (t = 15에서의 E(act)의 총 이온 흐름 (TIC) / t = 0에서의 E(act)의 TIC) × 100)). 20 % 미만의 퍼센트 대사를 갖는 화합물을 고도의 대사적 안정성으로 정의하였다. 20%와 70% 사이의 대사를 갖는 화합물을 중간적 안정성으로 정의하고, 70% 이상의 대사를 갖는 화합물을 낮은 대사적 안정성으로 정의하였다. 3개의 기준 화합물을 대사적 안정성 스크리닝이 행해질 때마다 항상 포함하였다. 베라파밀 (Verapamil)을 낮은 대사적 안정성을 지닌 화합물로서 포함하였다 (% 대사 = 73 %). 시사프리드 (Cisapride)를 중간적 대사 안정성을 지닌 화합물로서 포함하였으며 (% 대사 = 45%), 프로판올을 중간 내지 높은 대사적 안정성을 지닌 화합물로서 포함하였다 (25% 대사). 이들 기준 화합물을 대사적 안정성 분석을 확인하는데 사용하였다.

C.5.b: 래트 간세포 세포 배양을 이용한 대사적 안정성

래트 간세포는 수컷 스프라크 다울리 (Sprague Dowley) 래트에서 분리되었다. 화합물을 100% DMSO 중의 5 mM 스톡 용액으로 용해시키고, 24웰 플레이크를 이용하여 래트 간세포 세포 배양 (50만 생존세포/0.5 ml)으로 0, 15, 30, 60 및 120 분간 5 μM의 최종 농도로 배양하였다. 샘플을 2개의 체적의 DMSO를 가해 LC-MS에 대하여 준비하였다. 샘플을 충분히 진탕시키고, 이어서 10분간 900 × g으로 원심분리하였다 (실온). 모든 실험을 삼중으로 수행하였다. 얻어진 상청액 중, 50 ㎕를 LC-MS로 분석하였다.

LC-MC에 대해서는, 샘플 용리를 하이퍼실 (Hypersil) BDS C18 컬럼 (50 × 4.6 mm, 5 ㎛, Thermohypersil, UK)에서 행하였다. HPLC 시스템을 서베이어 (Surveyor) 오토샘플러 장치를 갖춘 서베이어 운반 시스템 (Surveyor Inc., San Jose, US)으로 구성하였다. 완충액 A (H₂0/아세토니트릴 (95/5) 중의 10 mM 아세트산암모늄 (pH 6.9)) 및 용매 B (아세토니트릴)로 1.2 ml/min의 유량으로 용리를 수행하였다. 사용된 그레디언트는 개시 상태로서 0.5 분간 용매 A로 하고, 유기상 농도를 2분간에 걸쳐서 0% B 내지 95% B로 선형으로 증가시켰다. 이 상을 추가로 2 분간 고정하였고, 다시 0.5분 이내에 0% B로 감소시켰다.

샘플의 총 주입량은 50 ㎕이었다. 컬럼 오븐 온도를 40℃로 유지하였다. LC 유량을 MS 검출에 대하여 분할하고 0.1 ml를 소스로 넣었다. ESI 소스를 장착한 삼중 사중극자 질량 분석계로서의 TSQ 퀀텀 (Quantum) (ThermoFinnigan, La Jolla, USA) 질량 분석계를 검출을 위해 사용하였다. 소스 전압을 3800 볼트로 설정하고, 모세관 온도를 300℃로 설정하였다. 질량 분석계를 정량화 용도를 위해 1 Da의 스캔 폭을 이용하여, M+H의 질량으로 조정된 SIM에서 양이온 모드로 작동시켰다. 엑스칼리버 (Xcalibur) 소프트웨어 (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)를 이용하여, 측정기 제어, 데이터 수집 및 프로세싱을 행하였다. 래트 간세포의 대사적 안정성을 시험관 내 반감기로서 나타내었다.

기준으로서, 화합물 R306465 (WO03/76422)을 사용하였다 (시험관 내 반감기: 8 분). 화합물 1 및 화합물 5를 시험하였고, 각각 81분 및 60분의 시험관내 반감기를 가졌다.

실시예 C.6: p21 유도 능력

실시예 C.6.a: p21 효소면역측정법

하기 프로토콜을 사람 A2780 난소 암세포 내의 p21 단백질 발현량을 측정하기 위해 적용하였다. A2780 세포 (20000개의 세포/180 ㎕)가 2 mM L-글루타민, 50㎍/ml 겐타마이신 및 10 % 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중의 96 마이크로웰 플레이트에 파종하였다. 세포 용해 24 시간 전에, 화합물을 최종 농도 10^-5, 10^-6, 10^-7및 10^-8M로 가했다. 시험한 모든 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 추가로 희석을 배지에서 수행하였다. 화합물 첨가 후 24 시간 후, 상청액을 세포로부터 제거했다. 세포를 200 ㎕ 아이스 콜드 PBS로 세척했다. 웰을 뽑아내고, 30 ㎕의 용해 완충액 (50 mM 트리스.HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% Nonidet p40 및 10 % 글리세롤)을 가했다. 플레이트를 -70℃에서 하룻밤 배양했다.

적당한 수의 마이크로타이터 웰을 포일 파우치 (foil pouch)로부터 제거하여, 빈 웰 홀더 (well holder)에 놓았다. 세척 완충액 (Wash Buffer) (20× 플레 이트 세척 농축액: PBS와 계면활성제의 100 ml의 20배 농축액. 2% 클로로아세트아미드를 함유)의 희석 표준용액 (1×)을 준비했다. 동결건조된 p21WAF 표준물질을 증류수로 용해시키고, 추가로 샘플 희석제 (키트 내에 제공)로 희석하였다.

샘플 희석제 중에 1:4로 희석시켜 샘플을 제조하였다. 샘플 (100 ㎕) 및 p21WAF1 표준물질 (100 ㎕)을 적당한 웰에 피펫하고, 실온에서 2 시간 동안 배양했다. 웰을 1× 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 100 ㎕의 검출 항체 시약 (비오틴화 모노클로날 p21WAF1 항체의 용액)을 각각의 웰에 피펫하였다. 웰을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 1× 세척 완충액으로 3회 세척했다. 400× 컨쥬게이트 (퍼옥시다제 스트렙타비딘 컨쥬게이트: 400배 농축액)를 희석하고, 100 ㎕의 1× 용액을 웰에 가했다. 웰을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 1× 세척 완충액으로 3회, 증류수로 1회 세척했다. 기질 용액 (발색 기질) (100 ㎕)을 웰에 가하고, 웰을 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양시켰다. 정지액을 이전에 가한 기질 용액과 동일한 순서로 각 웰에 가했다. 각 웰에서의 흡광도를 분광광도계 플레이트 리더를 사용하여 450/595 nm의 이파장에서 측정했다.

각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)을 동시에 진행시켰다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대하여, p21WAF1 유도에 대한 값 (흡광도 단위로)은 대조군에 존재하는 p21WAF1에 대한 값의 퍼센트로서 나타냈다. 130% 이상의 퍼센트 유도가 유의한 (significant) 유도로 정의되었다. 9개의 화합물을 테스트하고, 10^-6M에서 모두 유 의한 유도를 나타냈다.

실시예 C.6.b: 세포 방법

A2780 세포 (ATCC)를 5% C0₂를 갖는 습기가 있는 인큐베이터에서 37℃에서 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 겐타마이신이 보충된 RPMI 1640 배지 내에서 배양하였다. 모든 세포 배양액은 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD)에 의해 제공된다. 다른 물질은 Nunc에 의해 제공된다.

게놈 DNA을 증식하는 A2780 세포로부터 추출하여, p21 프로모터의 네스티드 (nested) PCR 분리에 대한 주형으로서 사용하였다. 주형으로서 게놈 DNA를 갖는 올리고뉴클레오티드쌍, GAGGGCGCGGTGCTTGG 및 TGCCGCCGCTCTCTCACC을 이용하여, 55℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 제 1 증폭을 수행하였다. TATA 박스에 대하여 -4551 내지 +88 프레그먼트를 포함하는 얻어진 4.5 kb 프레그먼트를, 4.5 kb 프레그먼트를 산출하는 88℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 올리고뉴클레오티드 TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG 및 ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC로, 계속해서 TATA 박스에 대하여 -1300 내지 +88 프레그먼트를 포함하는 1.3 kb 프레그먼트를 산출하는 88℃의 어닐링 온도에서 20 사이클동안 올리고뉴클레오티드쌍 TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC 및 ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC로 재증폭하였다. 올리고뉴클레오티드에 존재하는 제한 효소 인식 부위 XhoI 및 KpnI(밑줄친 시퀀스)를 서브클로닝을 위해 사용하였다.

루시페라제 리포터를 pGL3 기저 벡터로부터 제거하여, XhoI 및 KpnI 제한 효소 인식 부위에서 ZsGreen 리포터 (pZsGreen1-N1 플라스미드)로 교체하였다. XhoI 및 KpnI 부위에서 상술한 인간 p21 프로모터의 1.3 kb 프레그먼트를 pGL3 기저-ZsGreen으로 삽입함으로써, pGL3 기저-ZsGreen-1300을 구축하였다. 제한 효소는 베리어 맨하임 (Boehringer Manheim (Germany))에 의해 제공된다. A2780 세포를 2 × 10⁵ 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 플레이트하고, 24 시간 배양하여, 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Brussels, Belgium)을 이용하여 2 ㎍의 pGL3-basic-ZsGreen-1300 및 0.2 ㎍의 pSV2neo 벡터를 도입하였다. 트랜스펙트 세포를 G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)를 이용하여 10일간 선택하여, 단일 세포 서스펜션을 성장시켰다. 3주 후에, 단일 클론을 얻었다.

A2780 선택된 클론을 확대하여, 웰당 10000개의 세포로 96웰 플레이트에 파종하였다. 파종 24 시간 후에, 추가 24 시간 세포를 화합물 (근접한 p21 프로모터 영역의 sp1 부위에 영향을 줌)로 처리하였다. 그 후에, 세포를 4% PFA로 30분간 고정시키고, 훽스트 (Hoechst) 색소로 대비염색하였다. ZsGreen 생산, 그리하여 형광을 가져오는 p21 프로모터 활성화를 아센트 플루오로스칸 (Ascent Fluoroskan) (Thermo Labsystems, Brussels, Belgium)으로 모니터하였다. 각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (세포 또는 약물 비함유)을 동시에 진행시켰다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대하여, p21 유도에 대한 값은 대조군에 존재하는 p21에 대한 값의 퍼센트로서 나타냈다. 130% 이상의 퍼센트 유도를 유의한 (significant) 유도로 정의하였다. 71개의 화합물이 테스트되고, 10^-6M에서 모두 유의한 유도를 나타냈다.

실시예 C.6.c.: 생체 내 방법

선택된 클론을 벌거벗은 마우스의 옆구리로 피하 주사 (10⁷ 세포/200 ㎕)하고, 캘리퍼스로 측정할 수 있는 종양을 12일 후에 얻었다. 12일째에, 용매 및 20 내지 40 mpk 화합물을 동물에게 6일간 매일 경구 또는 정맥내 투여를 행하였다 (각각 4 내지 10 마리의 동물). 인하우스 디벨롭트 오토메이티드 호울 보디 이미징 시스템 (in-house developed Automated Whole Body Imaging System; 내쇼날 인스트루먼츠 (National Instruments)^? 제의 IMAQ 비젼 소프트웨어에 기초한 소프트 패키지에 의해 제어되는 CCD 카메라 타입 JAI^? CV-M90에 결합되고 GFP 필터를 갖춘 형광 입체 현미경 타입 올림푸스 (Olympus)^? SZX12))에 의해 형광에 대하여 종양을 평가하였다. 기준으로서, 화합물 R306465 (WO03/76422)을 사용하였다. 화합물을 R306465 보다 불활성 (형광 측정불가능), 약하고, 동일하거나 우수한 것으로 분류하였다. 화합물 1을 테스트한 결과, R306465 보다 우수하였다.

실시예 C.7: P450 저해 능력

시험된 모든 화합물을 DMSO (5 mM) 중에 용해시키고, 추가로 5 × 10^-4 M로의 희석이 아세토니트릴 중에서 이루어졌다. 추가의 희석이 분석 완충액 (0.1M NaK 포스페이트 완충액 pH 7.4) 중에서 이루어졌으며, 최종 용매 농도는 2% 보다 결코 높지 않았다.

CYP3A4 단백질에 대한 분석물은 웰당 15 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 1.3 mM NADP 및 3.3 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃에서 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 150 μM의 형광 프로브 기질 BFC의 첨가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 30분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종료시켰다. 형광 조사는 405 nm의 여기 파장 및 535 nm의 발광 파장에서 수행되었다. 케토코나졸 (IC₅₀값 = 3 × 10^-8M)을 이 실험에서 기준 화합물로 포함하였다.

CYP2D6 단백질에 대한 분석물은 웰당 6 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 0.41 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 0.0082 mM NADP 및 0.41 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃에서의 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 3 μM의 형광 프로브 기질 AMMC의 첨 가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 45분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종료시켰다. 형광 조사를 405 nm의 여기 파장 및 460 nm의 발광 파장에서 수행하였다. 퀴니딘 (IC₅₀값 < 5 × 10^-8M)을 이 실험에서 기준 화합물로 포함하였다.

CYP2C9 단백질에 대한 분석물은 웰당 15 pmol P450/mg 단백질 (0.01 M NaK 포스페이트 완충액 + 1.15% KCl 중), NADPH 생성계 (분석 완충액 중의 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 0.4 U/ml 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 1.3 mM NADP 및 3.3 mM MgCl₂·6H₂0) 및 화합물을 총 분석 체적 100 ㎕로 포함한다. 37℃에서의 5분간의 전배양 후, 분석 완충액 중의 200 μM의 형광 프로브 기질 MFC의 첨가로 효소 반응을 시작시켰다. 실온에서 30분간의 배양 후, 2개의 체적의 아세토니트릴의 첨가로 반응을 종결시켰다. 형광 조사를 405 nm의 여기 파장 및 535 nm의 발광 파장에서 수행하였다. 술파페나졸 (IC₅₀값 = 6.8 × 10^-7M)을 이 실험에서 기준 화합물로 포함하였다.

초기 스크리닝 목적을 위해, 화합물을 단일 고정 농도 1 × 10^-5 M에서 시험했다. 활성 화합물에 대해, 실험을 완전한 농도 반응 곡선을 확증하도록 반복하였다. 각 실험에서, 대조군 (약물 비함유) 및 블랭크 배양 (효소 또는 약물 비함유)을 동시에 진행하였다. 모든 화합물을 4중으로 분석하였다. 블랭크 값을 모든 대조군 및 샘플값에서 뺐다. 각 샘플에 대해, 샘플의 P450 활성의 평균값은 (상대적 인 형광 유닛으로) 대조군의 P450 활성의 평균값의 퍼센트로 나타냈다. 퍼센트 저해는 100% 마이너스 샘플의 P450 활성의 평균값으로서 나타냈다. 적절한 경우에, IC₅₀값 (대조군의 50%로 세포 증식을 감소시키는데 필요한 약물의 농도)을 계산했다.

표 F-3: 실시예 C.1.a., C.1.b., C.2., C.3.a. 및 C.3.b.에 따라 시험된 화합물의 결과를 나열한 것이다.

D. 화합물 예: 필름-코팅 환약

환약 코어의 제조:

화학식 (I)의 화합물 100 g, 락토스 570 g 및 전분 200 g의 혼합물을 잘 혼합한 후, 약 200 ml의 물 중의 소듐도데실설페이트 5 g 및 폴리비닐-피롤리돈 10 g의 용액으로 습윤화시켰다. 습윤 분말 혼합물을 체질하고, 건조시켜, 다시 체질했다. 그 다음에, 미세결정성 셀룰로스 100 g 및 경화 식물유 15 g을 가했다. 전체를 잘 혼합하고, 환약으로 압축시켜, 각각이 화학식 (I)의 화합물 10 mg을 포함하는 10,000 개의 환약을 얻었다.

코팅:

변성 에탄올 75 ml 중의 메틸 셀룰로스 10 g의 용액에 디클로로메탄 150 ml 중의 에틸셀룰로스 5g을 가했다. 그 다음에, 디클로로메탄 75 ml 및 1,2,3-프로판트리올 2.5 ml를 가하고, 폴리에틸렌글리콜 10 g을 디클로로메탄 75 ml 중에 용융 용해시켰다. 후자의 용액을 전자에 가한 후, 마그네슘옥타데카노에이트 2.5 g, 폴리비닐피롤리돈 5 g 및 농축 착색 서스펜션 30 ml를 가하고, 전체를 균질화시켰다. 환약 코어를 이렇게 하여 얻어진 혼합물로 코팅 장치 내에서 코팅했다.

Claims

화학식 (I)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 또는 입체화학적 이성질체:

상기식에서,

각각의 n은 값 0, 1 또는 2인 정수이고, n이 0일 때, 직접 결합을 의미하고;

각각의 m은 값 1 또는 2인 정수이며;

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

각각의 Y는 독립적으로 O, S, 또는 NR⁴이며;

여기에서 각각의 R⁴는 수소, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬, C_3-6사이클로알킬, C_3-6사이클로알킬메틸, 페닐C_1-6알킬, -C(=O)-CHR⁵R⁶ 또는 -S(=O)₂-N(CH₃)₂이고;

여기에서 각각의 R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 수소, 아미노, C_1-6알킬 또는 아미노C_1-6알킬이며;

Y는 NR⁴이고, R²는 인돌릴의 7-위치에 있을 때, R² 및 R⁴는 함께 이가 라디칼

-(CH₂)₂- (a-1), 또는

-(CH₂)₃- (a-2)를 형성할 수 있고;

R¹은 수소, C_1-6알킬, 하이드록시C_1-6알킬, C_1-6알킬설포닐, C_1-6알킬카보닐 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노설포닐이며;

R²는 수소, 하이드록시, 아미노, 할로, C_1-6알킬, 시아노, C_2-6알케닐, 폴리할로C_1-6알킬, 니트로, 페닐, C_1-6알킬카보닐, 하이드록시카보닐, C_1-6알킬카보닐아미노, C_1-6알킬옥시, 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노이고;

R³은 수소, C_1-6알킬, 또는 C_1-6알킬옥시이며;

R² 및 R³이 인접한 탄소 원자상에 있을 때, 이들은 이가 라디칼 -O-CH₂-O-을 형성할 수 있다.
제1항에 있어서,

각각의 n은 값 0 또는 1인 정수이고;

각각의 R⁴는 수소, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬, C_3-6사이클로알킬 또는 페닐C_1-6알킬이며;

R¹은 수소, C_1-6알킬, 하이드록시C_1-6알킬, C_1-6알킬카보닐 또는 C_1-6알킬설포닐이고;

R²는 수소, 할로, C_1-6알킬, 시아노, 니트로, 폴리할로C_1-6알킬 또는 C_1-6알킬옥시인 화합물.
제1항에 있어서,

각각의 n은 값 1인 정수이고;

각각의 m은 값 1인 정수이며;

각각의 X는 독립적으로 N이고;

각각의 Y는 독립적으로 NR⁴이며;

각각의 R⁴는 C_1-6알킬이고;

R¹은 수소이며;

R²는 수소 또는 할로이고;

R³은 수소인 화합물.
제1항에 있어서, 1a번 화합물, 30번 화합물, 39번 화합물 또는 50번 화합물인 화합물:
약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는,

a) 종양 성장 저해;

b) 암 치료를 위해 방사선치료에 종양을 감작(sensitisation);

c) 류마티스 관절염, 골관절염, 연소성 관절염, 통풍, 다발관절염, 건성 관절염, 강직척추염 및 전신홍반루푸스를 포함하는 관절병증 및 골 병리학적 상태의 치료;

d) 혈관 증식성 질환(vascular proliferative disorders), 죽경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

e) 궤양 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 이식편대숙주 질환, 결막염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 베체트병, 이식 거부, 두드러기, 알레르기성 피부염, 원형 탈모증, 공피증, 발진, 습진, 피부근육염, 여드름, 당뇨병, 전신홍반루푸스, 가와사키병(Kawasaki's 질환), 다발경화증, 폐기종, 낭성 섬유증 및 만성기관지염을 포함하는 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

f) 자궁내막증, 자궁근종, 기능장애자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

g) 망막 및 맥락막 혈관에 침범하는 혈관병증을 포함하는 안혈관화(ocular vascularisation)의 치료;

h) 심기능 장애의 치료;

i) HIV 감염의 치료;

j) 신장기능장애의 치료;

k) 내분비 장애의 억제;

l) 글루코스신합성 장애의 저해;

m) 파킨슨병, 인지장애 및 알츠하이머병을 포함하는 신경병리학 증상의 치료;

n) 정신분열증, 양극성 질환, 우울증, 불안 및 정신병을 포함하는 정신질환의 치료;

o) 근위축성 측삭경화증을 포함하는 신경근육 병리학 증상의 저해;

p) 척수근육위축증의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지방 형성(adipogenesis)의 저해; 또는

s) 말라리아를 포함하는 기생충증 치료용 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 제5항의 화합물을 친밀하게 혼합하는 것을 특징으로 하는 제5항의 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는,

a) 종양 성장 저해;

b) 암 치료를 위해 방사선치료에 종양을 감작(sensitisation);

c) 류마티스 관절염, 골관절염, 연소성 관절염, 통풍, 다발관절염, 건성 관절염, 강직척추염 및 전신홍반루푸스를 포함하는 관절병증 및 골 병리학적 상태의 치료;

d) 혈관 증식성 질환(vascular proliferative disorders), 죽경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식의 저해;

e) 궤양 대장염, 크론병, 알레르기성 비염, 이식편대숙주 질환, 결막염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 베체트병, 이식 거부, 두드러기, 알레르기성 피부염, 원형 탈모증, 공피증, 발진, 습진, 피부근육염, 여드름, 당뇨병, 전신홍반루푸스, 가와사키병(Kawasaki's 질환), 다발경화증, 폐기종, 낭성 섬유증 및 만성기관지염을 포함하는 염증 상태 및 피부 상태의 치료;

f) 자궁내막증, 자궁근종, 기능장애자궁출혈 및 자궁내막증식증의 치료;

g) 망막 및 맥락막 혈관에 침범하는 혈관병증을 포함하는 안혈관화(ocular vascularisation)의 치료;

h) 심기능 장애의 치료;

i) HIV 감염의 치료;

j) 신장기능장애의 치료;

k) 내분비 장애의 억제;

l) 글루코스신합성 장애의 저해;

m) 파킨슨병, 인지장애 및 알츠하이머병을 포함하는 신경병리학 증상의 치료;

n) 정신분열증, 양극성 질환, 우울증, 불안 및 정신병을 포함하는 정신질환의 치료;

o) 근위축성 측삭경화증을 포함하는 신경근육 병리학 증상의 저해;

p) 척수근육위축증의 치료;

q) 유전자 치료의 향상;

r) 지방 형성(adipogenesis)의 저해; 또는

s) 말라리아를 포함하는 기생충증 치료용 약제.
항암제와, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물의 배합물.
Q가 테트라하이드로피라닐옥시아미노카보닐인 화학식 (II)의 중간체(여기에서, 화학식 (II-a)의 중간체로 명명됨)를 적절한 산과 반응시켜 화학식 (I)의 히드록삼산을 수득하는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물을 제조하는 방법:

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Q가 C_1-2알킬옥시카보닐인 화학식 (II)의 중간체(여기에서, 화학식 (II-c)의 중간체로 명명됨)를 염기의 존재하 적절한 용매 중에서 하이드록실아민과 반응시켜 화학식 (I)의 히드록삼산을 생성하는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물을 제조하는 방법:

.
화학식 (II)의 화합물, 이의 N-옥사이드 형태, 약제학적으로 허용가능한 부가염 또는 입체화학적 이성질체:

상기식에서,

각각의 n은 값 0, 1 또는 2인 정수이고, n은 0일 때, 직접 결합을 의미하고;

각각의 m은 값 1 또는 2인 정수이며;

각각의 X는 독립적으로 N 또는 CH이고;

각각의 Y는 독립적으로 O, S, 또는 NR⁴이며;

여기에서 각각의 R⁴는 수소, C_1-6알킬, C_1-6알킬옥시C_1-6알킬, C_3-6사이클로알킬, C_3-6사이클로알킬메틸, 페닐C_1-6알킬, -C(=O)-CHR⁵R⁶ 또는 -S(=O)₂-N(CH₃)₂이고;

여기에서, 각각의 R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 수소, 아미노, C_1-6알킬 또는 아미노C_1-6알킬이며;

Y는 NR⁴이고, R²는 인돌릴의 7-위치에 있을 때, R² 및 R⁴는 함께 이가 라디칼

-(CH₂)₂- (a-1), 또는

-(CH₂)₃- (a-2)를 형성할 수 있고;

R¹은 수소, C_1-6알킬, 하이드록시C_1-6알킬, C_1-6알킬설포닐, C_1-6알킬카보닐 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노설포닐이며;

R²는 수소, 하이드록시, 아미노, 할로, C_1-6알킬, 시아노, C_2-6알케닐, 폴리할로C_1-6알킬, 니트로, 페닐, C_1-6알킬카보닐, 하이드록시카보닐, C_1-6알킬카보닐아미노, C_1-6알킬옥시, 또는 모노- 또는 디(C_1-6알킬)아미노이고;

R³은 수소, C_1-6알킬, 또는 C_1-6알킬옥시이며;

R² 및 R³이 인접한 탄소 원자상에 있을 때, 이들은 이가 라디칼 -0-CH₂-O-를 형성할 수 있고;

Q는 C_1-2알킬옥시카보닐, 하이드록시카보닐 또는 테트라하이드로피라닐옥시아미노카보닐이다.
a) Q가 하이드록시카보닐인 화학식 (II)의 화합물(여기에서, 화학식 (II-b)의 화합물로 명명됨)을 N'-(에틸카본이미도일)-N,N-디메틸-1,3-프로판디아민, 모노하이드로클로라이드 (EDC) 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 (HOBT)과 같은 적절한 시약의 존재하에서 화학식 (III)의 중간체와 반응시켜 화학식 (II-a)의 화합물을 형성하거나,

b) 화학식 (IV)의 중간체를 적절한 시약의 존재하에서, t가 값 0 또는 1의 정수이고, t가 0일 때 직접 결합을 의미하는 화학식 (V)의 적절한 카복스알데히드와 반응시켜 화학식(II-a)의 화합물을 형성하거나,

c) Q가 메틸- 또는 에틸옥시카보닐(C_1-2알킬)인 화학식 (II)의 화합물(여기에서, 화학식 (II-c)의 화합물로 명명됨)을 적절한 산성 용액 또는 염기성 용액과 반응시켜 화학식 (II-b)의 화합물을 형성하거나,

d) 화학식 (IV)의 카복실산 에틸 에스테르를 적절한 시약의 존재하에서 화학식 (V)의 적절한 카복스알데히드와 반응시켜 화학식 (II-c)의 화합물을 형성하거나,

e) 화학식 (XIV)의 중간체를 적절한 시약의 존재하에서 적절한 용매중 화학식 (XV)의 적절한 중간체와 반응시켜 화학식 (II-c)의 화합물을 형성하거나,

f) 화학식 (X)의 중간체를 W가 적절한 이탈기인 화학식 (XI)의 중간체와 반응시켜 화학식 (II-c)의 화합물을 형성하거나,

g) 화학식 (XII)의 중간체를 W가 적절한 이탈기인 화학식 (XIII)의 중간체와 반응시켜, 화학식 (II-c)의 화합물을 형성하는 것을 특징으로 하는 제12항의 화합물을 제조하는 방법: