KR100722155B1

KR100722155B1 - 효소적 방법에 의한 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 2-클로로만델릭산의 제조 방법

Info

Publication number: KR100722155B1
Application number: KR1020060001422A
Authority: KR
Inventors: 황순욱; 정선호
Original assignee: 엔자이텍 주식회사
Priority date: 2006-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2007-05-28
Also published as: WO2007078176A1

Abstract

본 발명은 하기 [반응식 1]에서 일반식(1)로 표시되는 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르(2-chloromandelic acid ester)로부터 주요 키랄 중간체로 사용되는 일반식(2)로 표시되는 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 일반식(3)으로 표시되는 산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 수용액상 또는 용매를 포함하는 수용액상에서 반응물인 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르를 가수분해 효소 또는 이를 포함하는 균주를 사용하여 입체선택적으로 가수분해 반응하여 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 광학활성 2-클로로만델릭산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 위에서 언급한 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르 및 산의 제조에 있어서 새로운 방법을 제시하며, 광학순도가 높고 생성물의 제조 및 분리가 용이하여 실제 공정에 유용한 것으로 판단된다.

[반응식1]

(상기 화합물의 치환체 R은 치환되거나 또는 치환되지 않은 탄소수 1 내지 8의 알킬기 또는 알케닐기, 벤질기, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 아릴알킬기, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬기로 이루 어진 군으로부터 선택되어진다.)

2-클로로만델릭산, 리파제, 광학활성, 가수분해 반응, 클로피도그렐

Description

효소적 방법에 의한 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 2-클로로만델릭산의 제조 방법{The method of making optically active 2-chloromandelic acid esters and 2-chloromandelic acids by enzymatic method}

본 발명은 효소 또는 미생물에 의한 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 이의 산의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 가수분해 효소 또는 가수분해 효소 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 [반응식 1]에서 일반식(1)로 표시되는 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르를 일반식(2)로 표시되는 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 일반식(3)으로 표시되는 2-클로로만델릭산으로 가수분해 하는 방법에 관한 것이다.

(상기 화합물의 치환체 R은 치환되거나 또는 치환되지 않은 탄소수 1 내지 8의 알킬기 또는 알케닐기, 벤질기, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 아릴알킬기, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되어진다.)

상기에서 언급한 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르는 주요 혈전용해제인 클로피도그렐 바이설파이트((S)-Clopidogrel bisulfate)의 합성에 필요한 키랄 중간체로서 활용범위가 넓다. 토실화 또는 메실화 된 화합물을 무기염 조건하에서 에폭시화하여 다양한 분야의 신약에 적용되는 중요한 의약중간체인 광학활성 2-클로로스틸렌 옥사이드(2-chlorostyrene oxide)로의 전환이 가능하다(대한민국 공개특허 10-2005-0035057).

Noda Hirobumi 등(일본특허 0072644)은 분할제(resolution agent)로 광학활성 N-벤질-2-페닐에틸아민(N-benzyl-1-phenylbutylamine)을 이용하여 라세믹 2-클로로만델릭산으로부터 부분입체이성질체 염(diastereomer salt)를 만들고 산성화하여 (R)-2-클로로만델릭산을 얻었다. 이 공정은 재결정 과정을 필요로 하는 단점이 있다. 비슷한 방법으로 Hyoda Toshiharu 등(일본특허 0114737)은 분할제로 광학활성 알라닌(alanine)을 사용하여 상기 물질을 얻은 바 있다.

North michael 등(국제공개특허 00210095)은 키랄 리간드와 키랄 촉매를 사용하여 2-클로로벤즈알데하이드의 시안산화(cyanation)와 아세틸화(acetylation) 과정을 거쳐 (R)-O-아세틸-시아노히드린을 얻고 가수분해하여 (R)-2-클로로만델릭산을 얻었다. 본 방법은 반응을 수행하는 조건이 까다롭고 재결정과정을 여러번 수행해야 한다.

한편 효소 및 균주를 이용하는 방법으로는 다음과 같은 방법들이 있다.

김종근 등(대한민국 공개특허 10-2004-0063264)은 효모(Baker´s yeast)를 이용하여 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 유도체를 제조하였다. 2-클로로만델릭산으로부터 2-클로로만델레이트 알킬 에스테르 화합물을 제조하고 다시 알킬 2-클로로-벤조일포메이트(Alkyl 2-chloro-benzoylformate)로 합성한 다음, 효모를 이용하여 비대칭 환원 반응(asymmetric reduction)하였다. 메틸 2-클로로-벤조일포메이트, 에틸 2-클로로-벤조일포메이트, 부틸 2-클로로-벤조일포메이트의 경우 4시간 반응 후 각각 전환율 99.9 %, 88.5 %, 99.7% 이었으며 광학순도는 각각 98.45 ee%, 98.5 ee%, 98.4 ee% 의 결과를 보였다. 이 공정은 효모를 이용한 반응 전에 여러번의 합성 단계를 거치는 단점이 있다.

엄기남 등(대한민국 공개특허 10-2005-0035057)은 2-클로로만델릭산 에스테르를 제조한 후 유기 용매 상에서 가수 분해 효소를 이용하여 에스테르 반응에 의해 (R)-2-클로로만델릭산 에스테르(100 ee%)와 (S)-2-클로로만델릭 디에스테르로 광학분할 하였다. 하지만 이 공정은 반응 후 각 생성물의 분리가 쉽지 않은 단점을 갖는다.

Van Langen 등(Organic Process Research & Development, 2003, 7, 828-831)은 2-클로로벤즈알데히드(2-chlorobenzaldehyde)로부터 옥시니트릴라제(oxynitrilase)를 사용하여 2-(2-클로로페닐)-2-히드록시아세토나이트릴(2-(2-chlorophenyl)2-hydroxyacetonitrile)을 제조하고, 다시 산 조건에서 가수분해하고 재결정하여 광학순도 99 ee%의 (R)-2-클로로만델릭산을 제조하였다.

이에 본 발명자들은 기존의 보고된 제조 방법 대신에 반응이 간단하며, 생성물의 회수가 쉬운 공정을 개발하고자 하였다. 본 발명에 의한 제조 방법은 가수 분해 효소 또는 이를 포함하는 균주를 이용하여 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르를 가수분해 반응하여 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 광학활성 2-클로로만델릭산을 제조하는 방법으로 현재까지 보고된 바가 없는 새로운 공정이다. 또한 본 발명에 의해 제조되는 2-클로로만델릭산 에스테르 및 그의 산은 분리 및 회수가 쉽기 때문에 실제 공정에 유리하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 전술한 바와 같이 본 발명은 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르로부터 가수분해 효소 또는 이를 포함하는 균주를 이용하여 입체선택적으로 가수분해하여 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 광학활성 2-클로로만델릭산을 제조하는 방법에 대한 것이다. 또한 반응을 통해 얻어진 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르는 수산화나트륨(NaOH) 등을 사용하여 가수분해하면 광학활성 2-클로로만델릭산으로 전환할 수 있다.

본 발명에 사용되는 효소는 CAL A(노보자임 735),고정화 리파제 CAL B(노보자임 435, Novozyme 사)와 알칼라제(Alcalase), 프로티아제 A(Protease A) 또는 이들 가수분해 효소를 포함하는 균주가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 반응에 사용되는 반응물 및 생성물들은 다음과 같은 조건에서 분석하였다.

라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르는 모세관 컬럼인 HP-FFAP(Agilent사)가 장착된 기체크로마토그래피(도남인스트루먼트사, 모델 DS6200)를 이용하여 분석하였다. 100 ℃에서 5 분간 가열 후 220 ℃ 까지 분당 20 ℃씩 올려주고, 220 ℃에서 10 분 동안 유지하였으며, 담체로는 헬륨기체를 사용하였고 컬럼 헤드 압력을 6 psi로 유지하면서 220 ℃에서 FID를 사용하여 검출하였다. 상기 조건에서 메틸 2-클로로만델레이트는 15.31 분, 에틸 2-클로로만델레이트는 14.89 분, 부틸 2-클로로만델레이트는 17.28 분에서 각각 검출되었다.

광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르는 키랄 컬럼 AD-H(Daicel 사)가 장착된 HPLC(Lab Aliance사, 모델 201)을 사용하여 분석하였다. 헥산과 이소프로파놀을 90:10의 비율로 혼합하여 분당 0.7 ml로 흘려주었고, UV 흡광도는 220 nm로하여 분석하였다. 이 때 (S)와 (R)-메틸 2-클로로만델레이트는 각각 12.71 분과 13.93 분에서 검출되었고, (S)와 (R)-에틸 2-클로로만델레이트는 각각 12.00 분과 13.95 분에서 검출되었으며, (S)와 (R)-부틸 2-클로로만델레이트는 10.36 분과 12.06 분에서 각각 검출되었다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 라세믹 알킬 2-클로로만델레이트의 제조

메탄올 40 ml에 라세믹 2-클로로만델릭산 2 g을 넣고 35 % 염산 용액을 첨가하여 75 ℃에서 3 시간 반응하였다. 생성물은 중화 후 유기층으로 추출한 뒤 감압 증류를 통해 용매를 제거하여 얻었다. 라세믹 에틸 2-클로로만델레이트와 부틸 2-클로로만델레이트는 메탄올 대신에 에탄올과 부탄올을 각각 사용하여 상기의 조건에서 반응 후 제조하였다. 이에 따라 제조된 생성물은 실리카겔 상에서 정제하고 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르임을 핵자기공명(Burker사, 모델 DRX300)으로 확인하였으며 분석결과는 다음과 같다.

메틸 2-클로로만델레이트

¹H-NMR(CDCl₃, 300MHz) δ(ppm)= 3.76(s,3H), 5.57(s,1H), 7.27(m,2H), 7.39(m,2H)

에틸 2-클로로만델레이트

¹H-NMR(CDCl₃, 300MHz) δ(ppm)=1.21(t,3H), 4.21(m,2H), 5.54(s,1H), 7.27(m,2H), 7.38(m,2H)

부틸 2-클로로만델레이트

¹H-NMR(CDCl₃, 300MHz) δ(ppm)=0.83(t,3H), 1.23(m,2H), 1.54(m,2H), 4.16(t,2H), 5.56(s,1H), 7.25(m,2H),7.38(m,2H)

실시예 2-3. 가수분해 반응을 통한 광학활성 메틸 2-클로로만델레이트의 제조

0.1 M 인산 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.0) 5 ml 이 들어있는 바이알에 실시예 1의 방법으로 생성된 라세믹 메틸 2-클로로만델레이트를 1 %(w/v)가 되도록 첨가하고 표 1에 기재된 효소 1 %(w/v)를 사용하여 30 ℃에서 반응을 수행하였다. 일정시간 반응 후 아세트산 에틸로 추출하여 생성물을 상기 분석방법에 따라 분석하였고 그 결과를 표1에 나타내었다.

실시예	효소종류	반응시간(hr)	전환율(%)	광학활성 메틸 2-클로로만델레이트(ee%)	형태
2	CAL A	67	94.5	>99	R
3	CAL B	67	79.5	95.9	R

실시예 4-7. 가수분해 반응을 통한 광학활성 에틸 2-클로로만델레이트의 제조

실시예 2에서 반응물로 사용된 메틸 2-클로로만델레이트 대신에 에틸 2-클로로만델레이트를 사용하여 표 2에 기재된 효소를 이용하여 반응하고 그 결과는 다음과 같다.

실시예	효소종류	반응시간(hr)	전환율(%)	광학활성 에틸 2-클로로만델레이트(ee%)	형태
4	Alcalase 2.5L	87	79.2	93.4	S
5	CAL A	46	89.3	99.3	R
6	CAL B	22	63.4	99.8	R
7	Protease A	87	92.4	99	S

실시예 8. 가수분해 반응을 통한 광학활성 부틸 2-클로로만델레이트의 제조

실시예 2에서 반응물로 사용된 메틸 2-클로로만델레이트 대신에 부틸 2-클로로만델레이트를 사용하고 CAL B로 48 시간 반응하여 전환율 93.1 % 일 때, 광학순도 76.0 ee%를 갖는 부틸 (R)-클로로만델레이트를 제조하였다.

실시예 9. 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산의 제조

라세믹 에틸 2-클로로만델레이트를 실시예 6에서 사용된 CAL B를 사용하여 가수분해 반응에 의해 광학순도 99 ee%의 에틸 (R)-2-클로로만델레이트로 얻었다. 회수한 에틸 (R)-2-클로로만델레이트를 메탄올에 녹이고 10 %(w/v) 수산화나트륨 용액을 첨가한 후 상온에서 충분히 반응한 후, 반응액을 염산 용액을 이용하여 pH 1로 조절하고 t-부틸 메틸에스테르(t-BME)를 사용하여 생성물로 흰색 고체를 수득하였다. 분석결과 광학순도 99 ee%의 (R)-2-클로로만델릭산임을 확인하였다.

상기 실시예 2-9을 통해 알 수 있는 것과 같이, 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르를 제조하는 방법에 있어서 본 발명에 따른 가수분해 반응은 반응이 용이하고, 높은 광학순도의 생성물을 얻을 수 있다. 또한 반응 후 각각의 광학활성 에스테르와 2-클로로만델릭산의 회수가 용이하여 산업적으로 대량생산에 적절한 제조 공정이다.

Claims

하기 [반응식 1]에서 일반식(1)로 표시되는 라세믹 2-클로로만델릭산 에스테르를 캔디다 앤타르크티카(Candida antarctica), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae)로부터 선택되는 미생물 유래의 리파제, 또는 캔디다 앤타르크티카, 바실러스 서브틸리스 또는 아스퍼질러스 오라이제로부터 선택되는 리파제 생성능을 갖는 미생물을 이용하여 가수분해시키는 것을 특징으로 하는 일반식(2)로 표시되는 광학활성 2-클로로만델릭산 에스테르와 일반식(3)으로 표시되는 광학활성 2-클로로만델릭산의 제조 방법.

[반응식 1]

(상기 화합물의 치환체 R은 치환되거나 또는 치환되지 않은 탄소수 1 내지 8의 알킬기 또는 알케닐기, 벤질기, 탄소수 3 내지 6의 싸이클로알킬기, 치환되거나 치환되지 않은 아릴알킬기, 및 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되어진다.)
삭제