KR0165550B1

KR0165550B1 - 온도, 산 및/또는 알칼리에 대한 안정성이 증가된 변이체 미생물 알파-아밀라아제

Info

Publication number: KR0165550B1
Application number: KR1019910700227A
Authority: KR
Inventors: 요하네스 크박 빌헬무스; 라로체 이페스; 빌헬무스 헤르마너스 폴레브레흐트 아드리아누스; 스탄센스 파트리크; 라우베리즈 마크
Original assignee: 마가렛트 에이. 호른; 제넨코르 인터내셔널 인코퍼레이티드
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1999-01-15
Also published as: IE902369L; WO1991000353A2; FI910907A0; ES2117625T3; FI103285B; ATE166922T1; BG93814A; US5364782A; CA2030554A1; FI103285B1; EP0410498A2; BR9006818A; DE69032360D1; CN1050220A; EP0410498A3; JPH04500756A; DE69032360T2; AU638263B2; AU5953890A; DK0410498T3

Abstract

미생물 바람직하게는 바실리(Bacilli) 균주에 속하는 미생물로부터 단리된, 유전적으로 조작된 α-아밀라제 유전자의 발현물로써 열안정적이며 산안정적인 α-아밀라제를 제공한다. 화학적 및 효소적 돌연변이 방법은 예컨대 아황산방법(bisulphite method) 및 상이한 헤테로듀플렉스 DNA의 오차삽입(misincorporation)이다. 변이 α-아밀라제는 산업적으로 전분 분해과정 및 직물 풀빼기에 이용되는 우수한 특성 예컨대 광범위 pH 범위에서 개선된 열안정성을 가진다.

Description

[발명의 명칭]

온도, 산 및/또는 알칼리에 대한 안정성이 증가된 변이체 미생물 α-아밀라아제

[기술분야]

본 발명은 유전공학 분야에 관한 것이며, α-아밀라아제 활성을 가진 효소를 코드하는 DNA 서열로 이루어진 신규한 DNA 분자를 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서는 직물의 풀빼기(desizing)에 있어서와 기타의 산업적 공정에 있어서 전분을 분해시키는데 사용되기 위한 향상된 특성을 갖는 변이체 미생물 α-아밀라아제를 개시한다. 개시된 α-아밀라아제는 열, 산 및/또는 알칼리에 대한 증가된 안정성을 나타내므로, 지금까지는 사용될 수 없었던 공정 조건에서 활성을 수행하기에 이상적으로 적합한 것이다.

[발명의 배경]

전분은 아밀로오스(15-30% W/W)와 아밀로펙틴(70-85% W/W)의 혼합물로 구성된다. 아밀로오스는 분자량(MW)이 약 60,000 내지 약 800,000인 α-1,4-결합 글루코오스 단위체의 선형 사슬로 구성된다. 아밀로펙틴은 24-30 글루코오스 단위당 α-1,6-분지점(branch point)을 함유하는 분지형의 중합체이고 이것의 MW는 1억 정도로 크다.

최근 농축된 덱스트로스 시럽 형태인 전분으로부터의 당은 다음의 효소 촉매화 공정에 의해 제조되었다:(1) 고체 전분을 α-아밀라아제로 평균 중합도가 약 7-10인 덱스트린으로 액화(또는 희석(thining))시키는 단계; 및 (2) 액화된 전분(즉, 전분가수분해물)을 아밀로 글루코시다아제(글루코시다아제 또는 AG로 명명)로 당화(saccharification)시키는 단계. 결과적으로 생성되는 시럽은 글루코오스 함량이 높다. 그리고 나서 상업적으로 제조되는 많은 글루코오스 시럽을 효소적으로 이성화시켜서 이소시럽(isosyrup)으로서 공지된 덱스트로오스/과당 혼합물로 제조하였다.

α-아밀라아제(EC 3.2.1.1)는 전분, 글리코겐 및 이와 관련된 다당을 내부의 α-1,4-글루코시드 결합의 임의적 절단에 의해 가수분해시킨다. 이 효소는 예를 들어 설탕, 양조공정, 알코올 및 직물 산업에 있어서 다수의 중요한 상업적 용도를 가진다. α-아밀라아제는 매우 다양한 박테리아, 균류, 식물 및 동물로부터 단리될 수 있다. 산업상의 가장 중요한 α-아밀라아제는 바실루스로부터 단리된 것이다.

전분 분해 공정의 제1단계에서는, 비교적 높은 온도(110℃이하)에서 당슬러리를 젤라틴화시킨다. 젤라틴화된 당을 연속적 2단계 공정에서 액화시키고 열안정성 α-아밀라아제에 의해 덱스트린화시킨다. 주된 공정의 변수는 당의 농도, α-아밀라아제 투여량, 온도 및 pH이다. 액화-덱스트린화 반응 과정에서 여과의 심각한 문제점이 도출될 수 있기 때문에 변수제한 범위는 좁게 유지되어야 한다(예를 들어, L. E. Coker 및 K. Venkatasu-bramanian, in: Biotechnology, p. 165-171, Ed. P. N. Cheremisinoff, P. B. Quellette, Technicom Publ. Corp. Lancaster Renn. 1985 참조). 빈번히 발생하는 문제점들 중의 한가지는 분해 공정의 초기 단계에서 온도를 적당히 조절하는 것이다: 과열은 가금 α-아밀라아제의 변성을 야기하여 최종희석이 충분하지 않다. 이를 피하기 위한 한가지 방법은 더욱 열안정성인 α-아밀라아제를 사용하는 것이다.

이러한 목적을 위해, 칼슘 이온이나 양쪽 친매성 화합물(amphiphile)을 첨가하는 것(예를 들어 EP-A-0189838호 참조)이 제안되었으나 이는 만족스럽지 못한 것으로 나타났다. 그러므로, 열안정성이 증가된 α-아밀라아제를 제공하고자 하는 실질적인 관심이 여전히 존해한다.

[관련문헌]

EP-A-057976호에는 바실루스 스테아로더모필러스로부터 열안정성 α-아밀라아제 코드화하는 유전자를 단리하고 이 유전자를 바실루스나 E. coli 복제기원을 함유하는 플라스미드에 클로닝하는 것이 기술되어 있다. 이렇게 하여 얻어진 키메라 플라스미드를 사용하여 α-아밀라아제를 제조하였다. α-아밀라아제를 단리하여 더 이상 변성시키지 않고 사용하였다.

EP-A-0134048호에는 산업상의 바실루스균주 내에 1개 또는 그 이상의 α-아밀라아제 유전자를 클로닝 및 발현시킴으로써 그 중에서도 열안정성이 증가된 α-아밀라아제의 상업적 제조물을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

EP-A-252666호에는 일반식이 Q-R-L인 키메라 α-아밀라아제가 개시되어 있으며, 여기에서 Q는 바실루스 아밀로리퀴패신스 α-아밀라아제의 37 N-말단 잔기와 적어도 75% 상동성인 55 내지 60개 아미노산 잔기의 N-말단 펩티드이고, R은 주어진 폴리펩티드이며, L은 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제의 395 C-말단 잔기와 적어도 75%가 상동성인 390 내지 400개 아미노산 잔기의 C-말단 폴리펩티드이다.

Gray 등(J. Bacteriol., 1986, 166, 635)은 바실루스 스테아로더모필루스 α-아밀라아제체의 NH₂-말단 부분과 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제의 COOH-말단 부분으로 이루어진 키메라 α-아밀라아제를 개시하였다. 대부분의 혼성체 효소분자는 어버이 야생형 효소보다 덜 안정한 것으로 나타났다. 또한 혼성체 분자 중의 어느 것도 향상된 안정성을 나타내는 것은 없다.

상기 인용된 참고문헌 중에서 단일 아미노산 치환을 이용하여 신규한 α-아밀라아제를 얻는 것에 관한 내용이 전혀 없다.

EP-A-0285123호에는 핵산 서열에 대하여 완전한 돌연변이를 유발시키는 방법이 개시되어 있다. 실례로서, 바실루스 스테아로더모필루스 α-아밀라아제의 돌연변이 유발이 개시되어 있다. 여기에는 상기 방법을 사용하여 바실루스 스테아로더모필루스 α-아밀라아제의 변이체를 얻을 수 있다는 것이 제안되어 있으나 실시예가 주어지지 않았다.

[본 발명의 요약]

본 발명은 변이체 α-아밀라아제 및 이 변이체를 얻는 방법을 제공한다. 상기 변이체 α-아밀라아제는 야생형 효소와 적어도 한 개의 아미노산이 다르다는 특징이 있다. 또한 이러한 변이체를 코드화하는 DNA, 이 DNA를 발현 가능한 형태로 함유하는 벡터, 및 이 벡터가 들어있는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일면에 있어서는, 클론된 α-아밀라아제 유전자에서의 임의적 돌연변이 유발이 개시된다. 변이된 유전자는 적당한 벡터를 사용하여 적당한 숙주 유기체 내에서 발현된다.

본 발명의 다른면에 있어서는, 변이체 α-아밀라아제의 스크리닝 방법을 개시하고 사용한다. 또한, 이 방법을 약간 변형하여 알칼리성에 더욱 안정한 α-아밀라아제를 얻는다. 이렇게 검출된 클론의 발현 생산물을 단리하고 정제한다.

본 발명의 또 다른 면에 있어서는, α-아밀라아제에 증가된 열안정성을 부여하고, 이 변이체 α-아밀라아제는 전분 분해의 적용 조건에서 여과의 문제점을 감소시킨다.

본 발명의 더욱 다른 면에 있어서는, α-아밀라아제에 개선된 산 안정성을 부여하고, 이는 아밀로글루코시다아제와 반응하기 전에 첨가되는 산의 양을 감소시킴과 동시에 예컨대 말툴로오스와 같은 원하지 않는 부산물의 형성을 저하시킨다. 신규한 α-아밀라아제는 바람직하게 열안전성과 산(acid) 안정성에 대한 향상된 특성 또는 열안정성과 알칼리 안정성에 대한 향상된 특성을 가진다.

본 발명의 또 다른 면에 있어서, 변이체 단백질은 전분액화의 사용 조건에서 우수한 효능을 가지는 것으로 밝혀졌다. 알칼리 안정성은 직물의 풀빼기에 사용하는데 특히 유용하다.

이러한 점을 이하 상세한 설명과 실시예에서 더욱 구체적으로 기술하기로 한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는, pMa 5-8의 뉴클레오티드 서열.

Stanssens 등(1987, EMBO Laboratory Course Martinsried, July 1987) 참조. 상이한 원소를 기술하기 위해서는 원문을 참조한다.

제2도는, 플라스미드 pPROM SPO2 삽입체의 뉴클레오티드 서열.

이 벡터의 구성은 EP-A-0224294호에 기술되어 있다.

α-아밀라아제의 아미노산 서열은 트리플렛(triplet)의 아래에 나타내었다. 번호는 성숙 단백질의 제1아미노산부터 시작된다(Kuhn등, 1982, J. Bacteriol, 149, 372). SPO2 프로모터는 61 내지 344 위치에 삽입되었다.

제3도는, pMaTLia6의 뉴클레오티드 서열.

이 벡터는 pPROM SPO2의 삽입체인 pMa5-8, 및 TAC 프로모터를 코드화하는 합성 DNA 단편으로부터 구성되었다. TAC 프로모터 DNA 단편은 위치 3757부터 위치 3859에 있다. α-아밀라아제의 아미노산 서열은 트리플렛의 아래에 도시되었다.

제4도는, pMaTLia6의 제한 지도.

다음의 독특한 제한효소 부위는 α-아밀라아제 유전자에서 갭(gap)을 구성하는 데에 유용하다; BamHI, SpeⅠ, SpcⅡ, KpnⅠ. ClaⅠ, NarⅠ, SalⅠ. Tht 111Ⅰ, XmaⅢ 및 BstEⅡ. 돌연변이를 용이하게 측정할 수 있도록 하기 위해 모든 가능한 갭의 서열화 프라이머를 합성하였다. 앰피실린 유전자에 앰버 코돈이 존재(ScaⅠ 부위를 제거)하고 클로람페니콜 유전자(PvuⅡ 부위가 존재할 때) 내에 앰버(amber) 코돈이 존재하지 않는다는 점을 제외하고, 플라스미드 pMcTLia6은 pMaTLia6과 동일하다.

제5도는, 바실루스/E.coli 셔틀벡터 pBMa/c의 개요.

pMa/c 부분(좌측)은 E.coli에서의 돌연변이가 일어나기 쉽게 한다. (우측의)바실루스 섭틸리스 카세트에는 α-아밀라아제 유전자(또는 기타의 바실루스 유전자)와 바실루스 섭틸리스 내에서의 증식을 위한 최소의 레플리콘(replicon)이 함유되어 있다. E.coli에서 성공적으로 돌연변이를 유발한 후에, 바실루스 섭틸리스 카세트는 바실루스로의 형질전환시에 환형으로 되어 SPO2 프로모터가 α-아밀라아제 유전자의 앞으로 이동할 수 있도록 한다.

제6도는, pBMa/c1의 제한 지도.

이 벡터는 제5도에 개괄된 돌연변이 유발 발현 벡터의 특이적 실례이다.

(1) 및 (2): 다중 클로닝 부위. 표적 유전자는 (2)에 삽입되어 있다. (1)와 (2)에서의 부위를 다양하게 함으로써, 갭이 있는 이중체의 발생을 위한 편의적인 제한 부위를 구성할 수 있다;

FDT: 전사 종결 유전자

F1. ORI: 파아지 F1에서 유래하는 복제 기원

E. coli ORI: pBR322로부터의 복제 기원

BLA: 앰피실린 내성 유전자

CAT: 클로람페니콜 내성 유전자

BAC ORI: pUB110의 복제 기원

가나미이신: pUB110의 가나마이신(네오마이신) 내성 유전자

SPO2: 파아지 SPO2의 프로모터

제7도는, pBMa/c6Lia6의 제한 지도.

바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제의 유전자를 pBMa/c1 내의 제6도의 다중 클로닝 부위(2)에 조작 처리하였다. 이 도면에 있어서, SPO2 프로모터는 (2)로 지시되었고 E. coli ORI는 (4)으로 표시되었다.

제8도는, pMa/c TPLia6에 있어서 phoA 신호 서열 단편의 서열.

TAC-프로모터 상류의 EcoRⅠ의 부위로부터 성숙된 α-아밀라아제의 제1아미노산까지의 서열을 도시하였다. phoA 아미노산 서열은 DNA 서열 아래쪽에 도시되었다.

제9도는, WT 및 2D5 α-아밀라아제에 대한 미카엘리스-멘텐 도표.

이 도표는 WT 및 2D5 α-아밀라아제의 기질농도에 대한 효소활성의 초기 비율을 나타낸다. 측정 조건은 실시예 8에 기술되어 있다.

제10도는, WT 및 D7 α-아밀라아제의 열불활성화.

이 도표는 pH 5.5 및 90.5℃에서 Ca²⁺의 함수로서 WT 및 D7 α-아밀라아제의 반감기를 나타낸다.

제11도는, WT 및 D7의 α-아밀라아제의 열불활성화.

제10도와 동일하고, 단 pH가 7.0이다.

제12도는, WT 및 2D5 α-아밀라아제의 열불활성화.

이 도표는 90℃ 및 pH 7.0에서 Ca²⁺농도의 함수로서 WT 및 2D5 α-아밀라아제의 반감기를 나타낸다.

제13도는, pH의 함수로서 WT 및 D7의 α-아밀라아제의 열불활성화.

제14도는, pH의 함수로서 WT 및 2D5 α-아밀라아제의 열불활성화.

제15도는, DE 대 110℃에서 액화된 후 측정된 최종 pH.

[발명의 상세한 설명]

본 발명을 서술하는데 있어서 변이체 α-아밀라아제와 관련하여 사용된 향상된 특성을 나타낸다는 의미는 α-아밀라아제가 전분의 액화, 직물의 풀빼기 및 다른 산업 공정의 사용 조건에서 효소 활성이 높고 반감기가 길다는 것이다.

향상된 열안정성은 변이체 효소가 원래의 야생화 효소보다 높은 공정온도에서 활성을 유지하거나, 동일한 공정 온도에서 더 오래 활성을 유지하는 것을 의미한다.

향상된 산(또는 알칼리) 안전성은 변이체 효소가 원래의 야생형 효소보다 더 낮은(또는 더 높은) pH 값에서 더 우수하게 작용하는 것을 의미한다.

향상된 특성은 1개 또는 그 이상의 아미노산을 치환함으로써 발생한다는 점을 이해하여야 한다.

염색체 DNA를 α-아밀라아제를 함유하는 미생물로부터 단리할 수 있다. 이 미생물로서는 바실루스 속(genus)에 속하는 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 바실루스 리케니포미스, 더욱 바람직하게는 바실루스 리케니포미스 T5를 사용한다(EP-A-1304048호 참조). 염색체 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고 벡터에 클로닝한다. 예를 들어 혼성화, 면역검출 및 효소활성의 검출과 같은 다수의 가능한 선별방법을 사용할 수 있다. 절단된 염색체 DNA를 클로닝하는데 사용되는 벡터의 선택은 사용가능한 방법의 선택에 의존한다. 만일 혼성화 방법을 사용한다면 특별한 주의가 필요하지 않다. 그러나, 만일 검출이 면역학적 방법에 의하거나 효소의 활성에 의거한 것이라면 벡터에는 반드시 적당한 발현 신호가 들어 있어야 한다. α-아밀라아제가 함유된 클론의 정확한 검출은 전분을 함유하는 한천 플레이트에서 수행한다. 성장시키고 I₂증기와 함께 배양시킨 후, 양성 클론 주변부에서 할로겐 화합물을 검출하였다. 다음 단계로서, 유전자의 서열을 결정하였다. 유도된 아미노산 서열을 사용하여 다른 공지의 α-아밀라아제 서열과 비교함으로써 중요한 아미노산의 1차적 개요(예를 들어, 활성부위, Ca²⁺결합, S-S 브리지)를 밝혔다. 3차원 구조를 측정하면 더 확실한 개요를 알 수 있다. 이 방법은 매우 곤란하므로 가끔 다른 접근방법이 사용된다. 3차원 구조에 관한 예상을 할 수 없는 경우에는 2차적 구조 요소(예를 들어, α-나선, β-쉬이트(sheet))의 측정 프로그램을 사용하여 3차 구조 요소, 예를 들어 β-배럴(barrel)을 성공적으로 측정하였다. 검토를 위해 Janin, J. 및 Wodack, S. J.(Prog. Biophys. molec. Biol. 1983, 42, 21-78)를 참조.

아미노산 치환은 가치있는 것으로 기대할 수 있다. 단백질 구조의 안정성은 단백질의 접히거나 펼쳐진 구조 사이의 자유 에너지간의 순수한 차이에 의해 결정될 수 있다. 프롤린 잔기는 다른 아미노산 보다 더 적은 형태로 제한되기 때문에, 한 아미노산이 프롤린으로 치환되면 펼쳐진 단백질의 구성상의 엔트로피가 감소된다(그리고 이에 따라 안정성이 증가된다.). 또 다른 유용한 치환은 글리신이 알라닌으로 치환되는 것이다. 분지된 β-탄소를 갖는 트레오닌, 발린 및 이소로이신과 같은 잔기들은 비-분지형 잔기들 보다 주골격 구조를 더 제한한다.

어떤 단백질의 열안정성의 일부는 염 브리지(salt bridge)에 기인하므로 라이신과 아르기닌 잔기를 도입하는 것이 유리하다(Tomozic S.J. and Kilbanov A. M., J. Biol. Chem., 1988, 263 3092-3096). 또한 아르기닌은 또 다른 수소결합을 형성하기 때문에 라이신을 아르기닌으로 치환하면 염 브리지의 안정성을 증가시킬 수 있다. 재검토를 위해 Wigby, D. B. 등의 Biochem. Biophys. Res. Comm. (1987, 149, 927-929)을 참고한다. 아스파라긴과 글루타민의 탈아미드화는 효소 구조의 심각한 분열을 야기하는 것으로 알려졌으며 아미노산 잔기를 치환함으로써 이러한 분열을 피할 수 있다. 아미노산 치환은 DNA 수준에서의 돌연변이 유발에 의해 최선으로 이루어질 수 있다.

원칙적으로, 돌연변이 유발 시험은 단리된 클론 상에서 즉시 수행될 수 있다. 그러나, 삽입체는 돌연변이 유발/발현 벡터에 클로닝되는 것이 바람직하다. 임의적 돌연변이 유발이 가능하고 부위-지정 돌연변이 유발도 또한 가능하다. 앞의 방법의 대량의 돌연변이 된 클론의 관점에서, 그리고 α-아밀라아제의 3차원 구조는 부위-지정 돌연변이를 유발할 수 있다고 공지된 바가 전혀 없으므로, 본 발명자는 특이적 영역에서 임의적 돌연변이를 수행하기로 결정하였다. 본 발명을 실행하기 위한 가능한 접근방법은 다음과 같다.

우선 잠재(silent) 제한 부위를 도입함으로써 유전자를 변성시킨다. 비-잠재 제한 부위를 도입하는 것도 또한 가능하다. 2번째로는 유전자를 플라스미드에 클로닝한다. 이렇게 파아지와 플라스미드를 조합하면 단일 스트랜드 DNA의 제조가 용이해진다. 단일 스트랜드 DNA를 얻기 위한 다른 방법도 또한 가능하다. 용융된(melted) 2중-스트랜드 벡터(+삽입체) DNA를 삽입체 내에 갭(gap)을 함유하는 벡터/삽입체의 조합과 혼성화 함으로써, 갭이 있는 이형이중체 DNA를 얻었다(상세한 설명에 관해서는 Morinaga, Y 등, 1984, Biotech-nology, 2, 636 참조).

갭은 화학적 또는 효소적 돌연변이 유발에 사용된다. 본 발명자는 바람직하게 아황산 수소염 방법(Folk 및 Hofstetter, Cel,l 1983, 33, 585)과 효소적 착오통합(misincorporation)법 (Lehtovaara등, Prot. Eng., 1988, 2, 63의 변형된 방법)을 사용하였다. 이러한 방법들은 갭에 있어서의 모든 단일 뉴클레오티드들을 모두 3개의 다른 뉴클레오티드들로 치환(포화 돌연변이 유발)하는 방법으로 응용될 수 있다. 후자의 방법은 몇 가지 방식에 사용될 수 있다. 이중의 한가지에 있어서는, 합성 프라이머를 갭에 혼성화시킨다. 그 다음에는 연장 반응을 수행하는데, 여기에서는 프라이머로의 첫 번째 데옥시뉴클레유오티드의 3'에 상보적인 데옥시뉴클레오티드가 빠져 있다. 원칙적으로, 이렇게 하여 모든 3개의 다른 데옥시뉴클레오티드를 통합시킬 수 있다. 이는 3개의 데옥시뉴클레오티드의 혼합을 이용하여, 또는 각각 단 하나의 데옥시뉴클레오티드가 포함된 3가지 별도의 반응을 이용하여 성취될 수 있다. 이 방법을 적용하는 또 다른 방식은 임의의 클론을 수득하는 것이다. 여기에서는 한 개의 제한적 데옥시뉴클레오티드가 포함된 4개의 별도의 반응이 수행된다. 이렇게 하여 각각의 단일 뉴클레오티드 앞에서 종지되는 제2의 스트랜드가 제조된다. 그 다음 단계는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 아황산수소염 및 효소적 돌연변이 유발 방법을 사용하여 변이체를 얻을 수 있다.

효소적 특성을 검사하기 위해서는, 클론된 유전자를 돌연변이 유발 실험에서 사용된 것과 동일한 숙주에서 발현시키는 것이 편리하다. 원칙적으로, 만일 이러한 세포를 위한 적절한 돌연변이 유발/발현 벡터를 사용할 수만 있다면 어떠한 숙주세포라도 가능하다. 대부분의 경우에, 예를 들어 E. coli WK6과 같은 E. coli가 실시에 매우 편리하다. 미세적정 플레이트에서 콜로니를 성장시킨 후, 이 플레이트의 웰로부터의 샘플을 전분이 첨가되고 상이한 pH 값에서 완충화된 한천 플레이트에 스포팅(spotting)하였다. 무리(halo)의 형성에 따라 양성 클론을 검출하였다. 적절한 완충액이 열안정성, 산안정성, 알칼리안정성, 염수안정성, 또는 스크리닝될 수 있는 기타의 모든 안전성이 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.

변이체 α-아밀라아제를 생산하기에 적합한 숙주는 α-아밀라아제가 발현될 수 있는 형질 전환 가능한 미생물을 포함한다. 구체적으로는 α-아밀라아제가 유래될 수 있는 예를 들어 바실루스 균주와 같은 종이나 속의 숙주가 적합하다. 바람직하게는 α-아밀라아제 음성바실루스 균주, 더욱 바람직하게는 α-아밀라아제 및 프로테아제 음성 바실루스 균주가 사용된다.

예를 들어 다량의 변이체 α-아밀라아제를 생산하기 위해 바실루스 리케니포미스 T9가 사용되어 왔다.

생산되는 α-아밀라아제는 회수가 용이하도록 배양 배지에 분비되는 것(발효동안)이 바람직하다. 적합한 모든 신호 서열을 사용하여 분비를 이행할 수 있다.

발현된 α-아밀라아제는 적당한 방법으로 세포로부터 분비되고 그 다음에 정제될 수 있다. 겔 여과법 및 모노 Q 크로마토그래피법은 이러한 방법의 실례이다. 단리된 α-아밀라아제를 상이한 Ca²⁺농도(0.5-15mM)와 넓은 pH 범위(5.5-8.0)에 걸쳐 열안정성에 대하여 검사하였다. 검사는 또한 적용 조건하에서 수행되었다. 구체적으로, 변이체 α-아밀라아제는 pH 5.5 및 5.25에서 전분의 액화 조건에서 검사되었다. 또한, 직물의 풀빼기에 대한 적용도 검사하였다.

스크리닝된 변이체의 일부 특성은 원하는 수행 조건에 더욱 적합할 것이다.

본 발명은 향상된 열안정성, 향상된 산안정성 및 향상된 알칼리 안전성을 갖는 α-아밀라아제를 개시한다. 일반적으로, 변이된 단백질의 활성이 야생형 효소와 같거나 더 우수할 경우에, 아미노산 치환의 수는 중요하지 않다. 변이체 α-아밀라아제는 야생형 효소와 최소한 한 개의 아미노산이 다르고, 1 내지 10개의 아미노산이 다른 변이체가 바람직하다. 특성이 향상된 특이적 변이체로서는 위치 111, 133 및 149에 아미노산이 치환된 변이체 α-아밀라아제가 있다(번호는 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제에 따라 매겨진다). 바람직한 아미노산 및 치환체는 Ala-111-Thr, His-133-Tyr 및 Thr-149-Ile이다.

이러한 변이체 효소들은 6.5 이하 및/또는 7.5 이상의 pH에서 향상된 효능을 나타낸다. 효능은 또한 고온에서도 향상되어, 예를 들어 110℃ 이하의 온도에서의 반감기가 향상된다.

많은 사용 가능한 α-아밀라아제 생성물은 박테리아로부터, 구체적으로는 예를 들어 바실루스 섭틸리스, 바실루스 리케니포미스, 바실루스 스테아로더모필루스, 바실루스 코아굴란스 및 바실루스 아밀로리퀴패신스와 같은 바실루스로부터 얻을 수 있다. 이러한 효소는 고도의 동질성과 유사성을 나타낸다(Yuuki 등, J. Biochem, 1985, 98, 1147; Nakagima 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1986, 23, 355). 그러므로 이러한 α-아밀라아제 중의 하나로부터 얻어진 바람직한 돌연변이에 대한 지식은 다른 아밀라아제를 개선시키기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명은 이러한 지식을 얻기 위한 접근방법을 제공한다.

이하, 사용된 실험 방법과 본 발명을 상세히 설명하기 위한 실시예를 제공한다. 이 실시예들은 단지 상세한 설명을 위한 목적으로 제공되었으므로 어느 면에서나 조금이라도 본 발명의 영역을 제한하려는 것이 아니다.

[실험]

[재료 및 방법]

1. 일반적인 클로닝 기술

T. Maniatis 등(1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory); F. M. Ausubel 등(1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons Inc., New York); B. Perbal(1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley Sons Inc. New York)의 핸드북에 기술된 바대로 클로닝 기술을 사용하였다. 이러한 핸드북에는 재조합 DNA 분자의 구성 및 증식(propagation)방법, 유전자 라이브러리 제조방법, DNA의 서열화 및 돌연변이 방법 및 DNA 분자의 효소적 조작에 관한 프로토콜이 기술되어 있다.

2. 화학적 돌연변이의 유발

DNA에 돌연변이를 도입하기 위해 시험관에서 화학물질로 클론된 DNA를 처리할 수 있다. 만일 이 돌연변이가 아미노산을 코드화하는 트리플렛 코돈에 지정되면, 변이된 단백질을 변이된 클론된 DNA에 의해 제조할 수 있다. 아황산수소 나트륨염의 첨가에 의한 화학적 변이유발 방법은 Shortle 및 Botstein(Methods Enzymol., 1983, 100, 457)에 의해 기술되었다. 바람직한 방법은 Folk와 Hofstetter(Cell, 1983, 33, 585)에 의해 기술되었다. 돌연변이를 유발하기 위한 다른 방법은 Smith(Ann. Rev. Genet., 1985, 19, 423)에 의해 기술되었다. 특히 유용한 프로토콜은 Ausubel 등(상기 참조)에 의해 기술되었다.

3. 갭이 있는 이중체 DNA의 돌연변이 유발

갭이 있는 이중체 접근방법에 의거한 방법(Kramer 등, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 9441)과 파아스미드(phasmid; 플라스미드/파아지 혼성체)를 사용하였다. 기본적으로 이 방법은 야생형 항생물질 내성 마커가 함유된, 갭이 있는 스트랜드(-스트랜드)와, 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자에 엠버 돌연변이를 지니는 주형 스트랜드(+스트랜드)로 구성되는, 갭이 있는 이중체 DNA 중간체에 의존한다. 어닐링한 후, 변이원 올리고 뉴클레오티드는 시험관에서 갭을 메우고 봉합하는 반응과정 동안 갭을 가진 스트랜드에 통합된다.

결과적으로 생성된 분자를 사용하여 미스매치 수복결함(Mut S) 숙주를 형질 전환하되, 이때 의도했던 돌연변이와 항생물질 내성마커 사이의 결합은 유지된다. 그 다음에는, 이 스트레인으로부터 단리된 혼합 플라스미드 개체군이 억제인자(supressor) 내성 숙주 스트레인 내에 집합되게 한다. 형질전환체를 항생물질이 함유된 배지에 플레이팅하여, 갭이 있는 스트랜드로부터 유래된 자손을 선택한다.

P. Stanssens 등에 의해 기술(Nucl. Acids Res. 1989, 17, 4441)된 이 쌍생벡터 pMa/c5-8은 다음의 요소들로 구성된다:

위치 11-105: 박테리오파아지 fd, 종결유전자

위치 121-215: 박테리오파아지 fd, 종결유전자

위치 221-307: 플라스미드 pBR322(위치 2069-2153)

위치 313-768: 박테리오파아지 f1, 복제 기원(위치 5482-5943)

위치 772-2571: 플라스미드 pBR322, 복제 기원 및 β-락타마제 유전자

위치 2572-2685: 트랜스포손 Tn903

위치 2519-2772: 트립토판 종결유전자(2종)

위치 2773-3729: 트랜스포손 Tn9, 클로람페니콜 아세틸 전이효소 유전자 위치 3730-3803:

다중 클로닝 부위

이상의 서열은 제1도에 도시되어 있다.

pMa형 벡터에 있어서, 뉴클레오티드 3409가 G에서 A로 변화된 반면 pMc형 벡터에서는 뉴클레오티드 2238이 G에서 C로 변화되어 각각 아세틸 전이효소 유전자와 β-락타마제 유전자의 앰버 종지코돈을 발생시킴으로써 상기 유전자를 비활성화시켰다.

언급된 모든 서열은 Genebank(TM)(54개를 제공) National Nucleic Acid Seguence Data Bank, NIH USA로부터 구입하였다. 플라스미드 pMc5-8은 DSM 4566으로 기탁되었다. 돌연변이 유발하기 위해 표적 DNA 단편을 pMa5-8의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 그 다음에는 표적 DNA를 함유하는 pMa5-8과 pMc5-8 사이에 갭이 있는 이중체를 구성하였다.

표적 DNA로 이루어진 단일 스트랜드 갭은 변이원성 올리고뉴클레오티드, 긴 합성 올리고뉴클레오티드, 낮은 수준의 착오통합된 뉴클레오티드, 화학물질, 또는 뉴클레오티드의 효소적 착오통합을 이용하여 돌연변이가 유발될 수 있고, 또한 임의적 돌연변이 유발 PCR을 사용할 수도 있다. 상세한 설명으로서는 Ausubel 등(상기 참조)과 Perbal(상기 참조)을 참조하기로 한다. 시험관에서 돌연변이 유발의 대안으로 UV-광 또는 화학물질을 사용하거나 E. coli 변이유발 유전자 균주(Fowler 등, J. Bacteriol., 1986, 167, 130)을 사용하여 체내에서 돌연변이를 유발할 수 있다.

변이원성 뉴클레오티드는 Applied Biosystems사로부터 구입할 수 있는 장치를 이용하여 합성될 수 있다.

4. 뉴클레오티드의 효소적 착오통합에 의한 임의적 돌연변이 유발

갭이 있는 이중체 pMa/pMc를 프라이머 연장시키고, Shortle 등(Proc. Natl. Acad. sci. USA, 1982, 79, 1588)과 B. C. Cunningham 및 J. A. Wells(Prot. Eng., 1987, 1, 319)에 의해 최초 기술되고 Lehtovaara 등에 의해 변형(Prot. Eng., 1988, 2, 63)된 착오통합 돌연변이 유발방법을 수행하였다.

이 방법은 중합효소의 사용을 조절하는 것에 기초한다. 우선 갭이 있는 이중체 pMa/pMc의 프라이머 연장에 의해 DNA 분자의 4세대를 생성시키고, 갭 내의 공지유형의 염기 바로 앞(각각 A, C, G 또는 T 앞)에서 임의로 종결되도록 한다. 그 다음에는 각각의 4세대를 올바른 염기가 빠져 있는 별도의 착오통합 반응에서 변이된다. 이 방법에서 모든 유형의 염기치환 돌연변이는 갭의 어떠한 위치에서라도 발생될 수 있다. 클레노우 중합효소를 사용하기 위해서는 서열화효소(seguenase(TM), U. S. Biochemical Corporation)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 A. M. V. 역전사효소 대신 MoMuLV 역전사효소를 사용하며, 이는 Lehtovaara 등(상기 참조)에 의해 사용되었다.

단일 부위 치환을 보장하기 위해 본 발명자는 Lehtovaara 등(상기 참조)에 의해 기술된 프로토콜을 다음과 같이 변형하였다. 역전사효소 완충액에는 착오통합된 뉴클레오티드가 3개가 아니라 단 한 개가 존재한다. 예를 들어, A-특이적 제한된 염기연장 혼합물을 각각 250μM dCTP, 250μM dGTP 및 250μM dTTP와 3개의 별도의 반응에서 배양한다. 4염기 특이적 제한된 연장 혼합물의 완전한 세트를 위해, 총 12개의 별도의 착오통합세트의 반응을 수행한다. 42℃에서 1.5시간 동안 배양한 후, 0.5mM 농도의 4개 데옥시뉴클레오티드를 추가하고 37℃에서 최소한 20분 동안 반응물을 더 배양한다. 그리고 나서 Lehtovaara등(상기 참조)에 따라, 우라실-함유 DNA 스트랜드에 대해서가 아니라 pMa/c 벡터를 기초로 하여 역선택(counterselection)하는 방법을 사용하는 변형 방법으로 샘플을 더 공정처리 하였다.

5. 변이체 α-아밀라아제 생산

발현 벡터를 함유하고 α-아밀라아제 구성물 중의 어느 하나가 들어있는 E. coli 주 WK6균주의 형질전환체(Zell, R. 및 Fritz, H. Z., EMBO J., 1987, 6, 1809)를 30℃에서 TB배지(10mℓ)에 접종하였다. TB배지는 0.017M KH₂PO₄, 0.072M K₂HPO₄, 12g/ℓ 박토트립톤, 24g/ℓ 박토 효모 추출물, 0.4% 글리세롤 및 항생물질(pMa에 대해서 앰피실린, 또는 pMc 구성물에 대해서 클로르암페니콜)로 구성된다. 배양물의 샘플을 사용하여 2ℓ플라스크 내의 250mℓ TB에 접종하였다. 10-12의 OD₆₀₀에서 0.1mM IPTG(이소프로필-β-d-티오갈락토피라노시드)를 첨가하고 다시 12-16시간 동안 배양을 계속하였다.

6. 변이체 α-아밀라아제의 정제

원심분리에 의해 세포를 수확하고 수크로오스가 20% 함유된 완충액에 0℃에서 재현탁시켰다. 2번째 원심분리 후, 세포를 냉수 중에 다시 현탁시켰다. 3번째 원심분리에 의해 세포 파쇄물을 제거하고 20mM TRIS 완충액을 사용하여 상충액을 pH 8.0이 되게 하였다. CaCl₂를 첨가하여 최종 농도가 50mM이 되도록 하였다. 이 재료를 70℃에서 15분 동안 열처리하고 원심분리에 의해 불용성 물질을 제거하였다. 0.22μ 밀리포어(Millipore) 필터를 통해 상층액을 여과시키고 최초 부피의 1/10이 되도록 농축하였다.

겔 여과법(TSK HW-55-Merck 상에서)과 모노-Q-크로마토그래피법을 이용하여 더욱 정제하였다. 효소 활성함유분획을 모노 S에 크로마토그래피하기 전에 아세트산 나트륨을 사용하여 pH를 4.8로 조정하였다. 250mM NaCl을 사용하여 α-아밀라아제를 용출하였다. 비활성화를 피하기 위해 즉시 pH를 8.0으로 조정하였다.

[실시예]

[실시예 1]

바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제 유전자의 분자클로닝

바실루스 리케니포미스 T5(EP-A-134048; CBS 470.83)으로부터 단리된 염색체 DNA를 제한효소 EcoRI으로 절단하고 pUB110의 EcoRI 부위에 연결하였다(Gryczan, T. J., 등, J. Bacteriol, 1978, 134, p318). 연결 혼합물을 바실루스 섭틸리스 1A40(Bacillus Genetic Stock Center)에 형질전환시켰다. 네오마이신 내성 클로니를 전분(Zulkowsky 전분, Merck)이 0.4g/ℓ 첨가된 HI 한천 플레이트(DIFCO)에서 α-아밀라아제 생산에 대하여 검사하였다.

I₂증기와 함께 성장 및 배양한 후, 큰 맑은 무리를 형성하는 양성 콜로니를 선택하여 더욱 특성 확인하였다. 이 양성 콜로니에서 단리된 플라스미드는 바실루스 리케니포미스 T5에서 유래하는 3.4kb EcoRI-EcoRI 단편이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이 플라스미드는 pGB33(EP-A-134048; CBS 466.83)으로 명명되었다. α-아밀라아제를 코드화하는 삽입체를 합성된 신-달가노 서열과 박테리오파아지 SPO2 프로모터에 연결하여 플라스미드 pProm SPO2를 형성하였다(EP-A-0224294; CBS 696.85 참조). 생기의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, 74, 6463)에 의해 결정된 pProm SPO 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 제2도에 도시하였다. 이 서열은 α-아밀라아제를 코드화하는 단일한 큰 오픈리딩 프레임을 나타내며, 이것은 Yuuki 등(상기 참조)에 의해 측정된 바실루스 리케니포미스의 α-아밀라아제 서열과 실질적으로 동일하다. 처음의 29개 아미노산은 α-아밀라아제의 분비 과정에서 절단되는 신호서열이다. 이러한 사용의 전반에 걸친 아미노산의 번호는 성숙 단백질에 따른 번호에 관한 것이다.

Yuuki의 서열은 다음의 위치에서 상이하다: 위치 134에는 Leu 대신에 Arg이 존재한다; 위치 310에는 Gly 대신에 Ser가 존재한다; 위치 320에는 Ser 대신에 Ala이 존재한다.

[실시예 2]

돌연변이 유발/발현 벡터 pMaTLia6의 구성

EcoRI 및 BclI으로 플라스미드 pRromSPO2를 절단하고 1.8Kb EcoRI-BclI 삽입체를 정제하여 EcoRI-BamHI 절단된 pMa5-8에 클로닝하였다. 이 pMa5-8 벡터에는 미리 변형된 다중 클로닝 부위를 제공되었다. 제1도의 3637 위치부터 3786 위치까지에 걸친 BamHI-HindⅢ 단편을 제3도의 5647 위치로부터 5660위치까지에 걸친 것과 같은 합성 DNA 서열로 교환하였다. 이렇게 수행되면 α-아밀라아제 유전자 내에 몇 개의 독특한 제한부위가 발생된다. pMa5-8 유도체를 함유하는 결과의 α-아밀라아제를 EcoRI과 BamHI으로 절단하고, TAC 프로모터의 복사체를 지니는 합성 DNA 단편에 연결하였다(De Boer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80, 21). 이 합성 DNA 단편의 서열을 제3도의 최종 α-아밀라아제 돌연변이 유발/발현 벡터 pMaTLia6 제3757 위치부터 3859위치 까지와 함께 도시하였다. 돌연변이 유발 실험과정에서 α-아밀라아제 유전자에 갭을 도입하도록 의도된 몇 개의 잠재 제한 부위를 도입함으로써 이 최종 α-아밀라아제 돌연변이 유발/발현 벡터를 완성하였다(제4도). 이러한 목적으로 부위-지정 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발을 이용하여 다음과 같은 돌연변이를 일으켰다;

-잠재 돌연변이에 의해 SpeI 부위를 도입하였다:

-잠재 돌연변이에 의해 NarI 부위를 도입하였다:

-TAG 종지 코돈의 바로 하류에 BstEⅡ 부위를 도입하였다:

이 아밀라아제 돌연변이 유발 벡터 pMaTLia6은 갭이 있는 이중체 방법을 사용하여 돌연변이를 유발하기에 적합하다. 적당한 제한 효소로 절단함에 의해 제조된 이중 스트랜드 pMaTLia6 DNA가 단일 스트랜드 pMcTLia6 DNA에 어닐링되었다.

결과적으로 생성되는 단일 스트랜드 갭을 부위-지정 돌연변이 유발하여 실험 섹션에 기재된 바와 같이 화학적 돌연변이 유발 및 임의적인, 효소에 의한 돌연변이를 유발하였다.

α-아밀라아제 유전자의 앞에 있는 TAC 프로모터의 유용성은 IPTG를 첨가함으로써 E. coli 내에 α-아밀라아제의 유도 가능한 발현을 가능하게 하는 것이다.

E.coli WK6 내의 플라스미드 pMaTLia6를 1989년 6월 2일에 CBS 255.89로서 기탁하였다.

[실시예 3]

돌연변이 유발과 발현을 위한 바실루스/ E. coli셔틀 벡터의 구성

이 벡터는 E. coli에 삽입된 유전자의 돌연변이 유발을 가능하게 하고 바실루스 내에서의 발현을 중재한다. 이 벡터를 구성하기 위해 선택된 방법은 pUB110 유도체(Gryczan, 상기참조)를 pMa/c 쌍생 벡터와 다음과 같은 방법으로 결합시키는 것이다:

1. 바실루스 섭틸리스 카세트는 단일 제한/재연결 실험에 의해 제거될 수 있다.

2. 상이한 α-아밀라아제 유전자와 상이한 프로모터는 이 벡터 내에 용이하게 클로닝될 수 있다.

3. 다시 환형화 후, 클로닝된 유전자를 적당한 바실루스 프로모터의 지배하에 둘 것이다.

4. E. coli 내에서의 돌연변이 유발과정에서 바실루스 프로모터와 구조적 α-아밀라아제 유전자를 물리적으로 분리시켜서 E. coli 내의 α-아밀라아제의 가능한 치사량의 축적을 방지한다.

셔틀 벡터의 개괄적 도시를 제5도에 나타내었다. 벡터 pBMa/c1의 최종적 구조를 제6도에 도시하였다. 벡터 pBMa1을 1989년 6월 2일에 번호 CBS 252.89호로서 기탁하였다. 벡터를 다음과 같이 구성하였다:

-REP 유전자와 Neo^R유전자를 운반하는 pUB110의 EcoRⅠ-SnaBⅠ 단편을 정제하고 EcoRⅠ-SmaⅠ으로 절단된 pUC8에 클로닝하였다.

-이 pUC8 유도체의 EcoRⅠ-HindⅢ 단편을 EocRⅠ-HindⅢ로 절단된 pMa5-8에 클로닝하여 플라스미드 pMa5-80을 형성하였다.

-BamHⅠ-XbaⅠ 폴리링커 단편을 박테리오파아지 SPO₂의 SPO₂프로모터를 코드화하는 DNA의 합성단편(Williams 등, J. Bacteriol., 1981, 146, 1162) SacⅡ, ApaⅠ, XhoⅠ, SacⅠ, BgℓⅠ, MluⅠ 및 XbaⅠ에 대한 제한 인식 부위로 치환하였다.

-pMa5-80의 독특한 EcoRⅠ 부위를 사용하여 다음의 제한 부위를 구성하는 폴리링커 단편을 삽입하였다; EcoRⅠ, SmaⅠ, SacⅠ, EcoRⅤ, SphⅠ, KpnⅠ, XbaⅠ 및 HindⅢ.

특이적 목적을 위해 pBMa/c1으로부터 pBMa/c2 및 pBMa/c6를 제조하였다.

-pBMa/c2에 있어서는, pBMa/c1의 EcoRⅠ-HindⅢ 폴리링커를 pCU19의 대응 폴리링커로 치환하였다.

-pBMa/c6에 있어서는, 또한 pBMa/c1의 우측 폴리링커에 있는 SacⅡ 부위를 클레노우 반응에 의해 제거하였다.

pBMa/c6 Lia6을 구성한 후 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제 유전자 상의 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하였다. pMaTLia6로부터 단리된 BamHⅠ-HindⅢ 단편을 BamHⅠ과 HindⅢ로 절단된 상기의 pBMa/c6에 연결함으로써 이 벡터를 구성하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드(제7도)를 E. coli 내에서의 돌연변이 유발을 위한 갭이 있는 이중체를 구성하기 위해 사용하였다.

결과적으로 생성되는 변이체를 SacⅠ으로 절단하고 Chang과 Cohen(Mol. Gen. Genet., 1979, 168, 111)에 따라 재연결 및 형질전환한 후, 바실루스 섭틸리스 1A40(BGSC 1A40) 내에서 발현시켰다.

[실시예 4]

정확하게 숙성된 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제의 E. coli에 있어서 발현

pMaTLia6에 의해 생산된 α-아밀라아제(실시예 2)에 대한 특성확인에서, α-아밀라아제의 일부는 분비과정에서 부정확하게 프로세스되는 것으로 밝혀졌다. NH₂-말단의 서열화에서는 E. coli WK6에서 생산된 α-아밀라아제에 대한 추가의 알라닌 잔기를 밝혀 내었다.

본 발명자는 이것이 아밀라아제에 다른 특성을 부여한다는 지침을 가지는 않았지만 α-아밀라아제 신호 서열을 알칼리 포스파타제 PhoA 신호서열로 치환하였다. 이 목적을 위해, 신호 펩티드와 성숙 α-아밀라아제의 접합부의 pMaTLia6에 FspⅠ 제한부위를 도입하기 위해 돌연변이 유발실험을 수행하였다. FspⅠ 및 BamHⅠ 절단후, phoA 신호서열(Michaelis 등, J. Bacteriol., 1983, 154, 366)을 코드화하는 합성 DNA 단편을 삽입하였다. 이 구성체의 서열을 제8도에 도시하였다. pMa/cTPLia6에 의해 생산된 α-아밀라아제는 정확한 NH₂-말단 서열을 가지는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 5]

안정한 α-아밀라아제에 대한 스크리닝

A. 산-안정성 α-아밀라아제 변이체의 스크리닝

야생형 α-아밀라아제보다도 낮은 pH에서도 더 잘 또는 더 나쁘게 효능을 나타내는 α-아밀라아제 변이체를, 전분을 요오드 용액으로 염색한 후 상이한 pH 값으로 완충화된 전분 플레이트 상에서 무리를 비교하여 선택할 수 있다.

방법:

1. 성장

미세적정 플레이트에서 변이체를 성장시킨다. 성장용 배지는 250μℓ Brain Heart Infusion 브로스(DIFCO)이다. 여기에 다음의 것을 첨가한다:

살균된 이쑤시개로 한천 플레이트에서 콜로니를 채취하여 미세적정 플레이트의 별개의 웰(96)들에 접종한다. 대조표준으로 각각의 플레이트에 4개의 야생형 콜로니를 포함시킨다.

이 미세적정 플레이트를 진동 없이 37℃에서 40시간 동안 방치한다.

2. 플레이트 실험

α-아밀라아제가 제조되는 시기 이후에 각각의 웰로부터 5μℓ씩의 샘플을 취하고 2개의 상이한 유형의 한천 플레이트(144×140mm)에 스포팅하였다. 첫 번째 유형은 풍부한 Heart-Infusion 한천 플레이트(DIFCO)+0.4% 전분(Zulkowsky starch-Merck)+클로람페니콜 50μg/mℓ이다. 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 이 플레이트를 변이체 저장용으로 사용하였다.

2번째 유형의 플레이트는 현재 사용되는 스크리닝용 플레이트로써 Batco 한천(DIFCO) 1.5%와 Zulkowsky 전분 0.2%를 함유한다. 한천과 전분을 수돗물 (STW) 용해시켰다.

즉, 탈염수+

이 배지에 5M의 아세트산 칼륨 완충용액 모액을 100배 희석시켜 스크리닝 플레이트를 완충화했다. 모액의 pH 값은 실온에서 4.80, 5.0 및 5.2이다. 측정시에 한천 플레이트의 최종 pH 값은 모액의 값보다 다소 낮다. 각각의 웰로부터 배양물 5μℓ를 pH 값이 서로 다른 3개의 스크리닝용 플레이트에 스포팅하였다.

pH-범위는 pH-값이 가장 낮은 플레이트 상에서 야생형 α-아밀라아제에 활성이 거의 남아있지 않거나 전혀 없는 방식으로 선택된다.

3. 착색

스크리닝 플레이트를 55℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 이시기 이후에 I₂용액을 플레이트에 쏟아붓는다. 10×I₂용액에는 리터 당 30g의 I₂와 70g의 KⅠ가 함유되어 있다.

스포트의 투명도의 양은 그때의 pH 값에서의 잔여 α-아밀라아제 활성과 상관 관계가 있다. 야생형 대조표준 보다 우수한 효능을 발휘하는 변이체를 스크리닝의 제2단계를 위해 선별한다. 야생형의 무리는 이 실험에서 매우 증식적이다.

4. 제2의 스크리닝

풍부한 플레이트에서 양성 변이체를 취하고 새로운 HI플레이트+클로람페니콜에서 정제하였다. 4개의 단일 콜로니를 각각의 변이체로부터 취하고 이것을 다시 첫 번째 스크리닝과 동일한 방법으로 시험하였다. 또한 수돗물 (STW)을 사용하여 이 배양물의 일련의 희석액을 제조하고 이 희석액들을 중성 pH의 스크리닝 플레이트(pH=7.0)에 스포팅하였다. 야생형 배양물과 비교함으로써, 낮은 pH에서의 우수한 효능이 전반적으로 우수한 α-아밀라아제의 제조에 기인한 것인지 또는 본래 더욱 안정한 α-아밀라아제에 기인한 것인지를 결정할 수 있다.

2차 스크리닝에서 생존된 변이체는 돌연변이가 유발된 유전자의 그 부분의 뉴클레오티드 서열을 측정함으로써 특성확인될 수 있다.

B. 알칼리에 안정한 α-아밀라아제 스크리닝

알칼리에 안정한 α-아밀라아제 스크리닝을 산에 안정한 α-아밀라아제에 사용한 것과 유사한 방법으로 수행한다. 미세적정 플레이트에서 성장시킨 후 각각의 웰로부터 샘플 5μl를 취한 후 저장 플레이트와 실제의 스크리닝 플레이트에 스포팅한다. 실제의 스크리닝 플레이트는 Bacto Agar(DIFCO) 1.5%와 Zulkowsky 전분 0.2%로 이루어지고 여기에 탈염수와

로 완성된다.

스크리닝 플레이트를 50mM 탄산염/중탄산염 완충액으로 완충시켜서 pH 값을 9.0, 9.5 및 10.0이 되게 한다. pH 범위는 최고의 pH 값에서 야생형 α-아밀라아제의 활성이 거의 없거나 전혀 없는 방식으로 선택한다. 55℃에서 2시간 동안 배양한 후, I₂용액을 플레이트에 쏟아 붓는다. 야생형 효소보다 더욱 우수한 무리 형성 효과를 나타내는 변이체를 스크리닝의 제2단계에서 선별한다. 이 스크리닝의 2단계를 산안전성에 대한 스크리닝과 유사한 방식으로 수행한다.

C. 열안정성 α-아밀라아제 변이체 스크리닝

고온에서 야생형 α-아밀라아제보다 더 높게 또는 더 낮게 효능을 나타내는 α-아밀라아제 변이체는 가열후 배양 브로스에 잔류하는 아밀라아제 활성에 의해 발생되는 전분 플레이트 상의 무리를 비교함으로써 선별될 수 있다.

방법:

1. pH-스크리닝에 사용된 것과 같은 방법으로 변이체를 성장시킨다.

2. pH-스크리닝에 사용된 HI 한천 플레이트에서 변이체를 복제한다.

3. 미세적정 플레이트의 별개의 웰들을 1회용 뚜껑(Flow laboratories)으로 막아 가열 단계에서 배양물 브로스의 증발을 방지한다.

4. 미세적정 플레이트를 95℃의 수조에서 1시간 동안 가열한다. 가열후, 미세적정 플레이트를 원심분리기에 넣고 미세적정 플레이트 바닥에 있는 샘플을 모두 수집한다.

5. 열안정성 변이체에 대한 스크리닝을 다음과 같이 실시한다:

각각의 웰로부터 배양물 5μℓ를 중성 스크리닝 플레이트에 스포팅하였다(pH-스크리닝 참조). 플레이트를 55℃로 1시간 동안 배양하였다. 요오드 용액으로 전분을 염색한 후, 스포트(무리)의 투명도를 비교함으로써 변이체와 대조표준을 잔여 α-아밀라아제 활성에 대하여 스크리닝할 수 있다.

대조표준의 잔여활성이 너무 높은 경우에는 야생형 효소보다 열안정성이 높은 변이체를 구별할 수 있도록 일련의 희석액을 제조하고, 스크리닝 플레이트에 스포팅하여야 한다.

6. pH-스크리닝 방법에서 행한 것과 같은 방식으로 대상이 되는 변이체를 더 시험할 수 있다.

만일 특성을 조합하기를 원한다면 스크리닝 타입 A 또는 B를 타입 C와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 알칼리에 안정한 α-아밀라아제에 대한 스크리닝의 제1단계 후, 열안정성에 대한 제2단계의 스크리닝을 실시할 수 있다. 2가지 시험에서 모두 양성을 나타내는 변이체를, 원하는 특성의 조합을 나타내는 후보로서 선별할 수 있다.

[실시예 6]

pMaTLi6에 대한 아황산수소염 돌연변이 유발

SacⅡ-ClaⅠ으로 절단된 pMcTLia6을 사용하여 pMaTLia6의 단일 스트랜드 DNA를 어닐링함으로써 위치 4315부터 4569까지의 갭이 형성된 이형이중체를 얻었다(제3도). 이 이형이중체를 아황산수소염으로 돌연변이를 유발시켰다(실험 참조).

E. coli WK6 Mut S 내에 형질전환(Zell, R. 및 Fritz H. JU., 상기참조)시키고 클로람페니콜을 함유하는 한천 플레이트(50μg/mℓ)에서 선별한 후, 플라스미드 집합체를 단리하고 E. coli WK6에 형질전환시켰다. E. coli WK6 Mut S를 CBS 472.88로서 기탁하였고 E. coli WK6은 CSB 473.88로서 기탁되어 있다. 제조된 형질전환체를 2.0mM CaCl₂, 50μg/mℓ 클로람페니콜 및 0.02mM IPTG(SIGMA)가 함유된 미세적정 플레이트 내의 BHI 배지에서 37℃로 40시간 동안 진동 없이 성장시켰다.

실시예 5에 기술된 바와 같이 pH 안정성 변이체에 대한 스크리닝을 실시하였다. 약 300Cm^R형질전환체를 스크리닝하였다. DNA의 서열화에 의해 결정된 돌연변이 빈도는 갭 전체에 걸쳐서 평균 0.4변이/분자였다. pH 스크리닝 후에, 한 개의 산안정성 변이체 D7을 동정하였다. 이 변이체에 대한 서열화에서는, 코드화하는 트리플렛을 CAC에서 TAC로 변이시켜서 유래되는 돌연변이 H133Y가 밝혀졌다.

변이체 D7은 또한 열안정성 스크리닝 분석법에서 양성으로 밝혀졌다(실시예 5).

특이적 올리고뉴클레오티드가 SacⅡ-ClaⅠ 단편의 바로 앞에 오도록 설계된 단일 스트랜드 DNA로 DNA 서열화를 수행하였다. 별개의 돌연변이 유발 실험에 있어서는 1000Cm^R형질전환체를 스크리닝하였다. pH 스크리닝 후에는 다른 산안정성 변이체 2D5를 동정하였다. 이 변이체에는 다음의 돌연변이가 발생되었다;

아황산수소염 돌연변이 유발은 제3도의 4569 내지 4976 위치에 형성된 ClaⅠ-SalⅠ 갭에 관하여 기술된 바와 유사한 방법으로 사용될 수 있다. 약 300Cm^R의 형질전환체를 스크리닝하였다(돌연변이 빈도 0.6 돌연변이/분자). 산안정성 형질전화체는 전혀 발견되지 않았다.

이 산에 불안정한 변이체들 중에서 어떤 것을 pH 스펙트럼이 이동되어 알카리에 더욱 안정한 표현형을 나타내었다.

[실시예 7]

pMaTLia6의 효소적 돌연변이 유발

ClaⅠ-SalⅠ으로 절단된 pMcTLia6을 사용하여 단일 스트랜드 pMaTLia6(제4도)를 어닐링함으로써 4569위치부터 4976위치까지에 걸친 이형이중체(제3도)를 얻었다. 갭이 형성된 이중체를 실험 섹션에 기재된 바와 같이 효소적 착오 통합에 의해 돌연변이를 유발시켰다.

dATP-제한 프라이머 연장 후에 얻어진 샘플을 3개 부분으로 분할하고 역전사효소의 존재 하에 각각 dCTP, dGTP 및 dTTP와 함께 배양하였다. 37℃에서 10분간 배양한 후, 4개의 모든 dNTP와 클레노우 중합효소를 사용하여 추적(chose)하고 T4-DNA 리가아제를 첨가하여 완전한 이중 스트랜드 분자가 되도록 연장시켰다.

이 분자들을 E. coli WK6 Mut S에 형질전환시키고 플라스미드 집합체들을 회수하였다. 그 다음에는 이 플라스미드 집합체들을 E. coli WK6에 형질전환시키고 클로람페니콜(50μg/mℓ)함유 한천 플레이트에서 콜로니를 선별하였다. 결과적으로 생성되는 변이체들을 실시예 5에 기재된 바대로 α-아밀라아제의 안정성에 대하여 스크리닝하였다.

다른 실험에서는, SpeⅠ-SacⅡ 갭을 각각 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP로 제한된 프라이머 연장시켰다. 이 프라이머 집합체를 착오통합에 의해 변이원화하였다(실험참조). 100Cm^R형질전환체를 pH 플레이트에서 시험(실시예 5)하고 변이체 M29가 낮은 pH에서 더욱 안정한 것으로서 동정되었다. 돌연변이의 서열은 다음과 같이 결정되었다:

[실시예 8]

안정한 변이체의 특성

아황산수소염 돌연변이 유발 실험에서 얻어진 변이체 중의 2개에 대하여 더욱 특성확인하였다. 상기한 바와 같이, DNA 서열화에서는 다음과 같은 아미노산 치환이 시사되었다;

-D7에는 133위치에 히스티딘 대신에 티로신이 함유된다(D7=H133Y),

-2D5에는 D7 돌연변이가 함유되고, 또한 트레오닌 149가 이소로이신으로 치환되었다(2D5=H133Y, T149Ⅰ).

a) 효소 활성의 측정

바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제 WT와 변이체의 효소 활성을, 기질로서 4-니트로페닐-말토펜탄오시드(4NP-DP5)를 사용하여 측정하고, 4-니트로페놀과 말토펜타오스를 형성하고, OD 405에서의 변화를 측정함으로써 이 반응을 계속 수행할 수 있다. 이 검색을 35℃에서 50mM MOPS, 50mM NaCl, 2mM CaCl2(pH7.15) 및 0-1mM 4NP-DP5에서 수행할 수 있다. 초기 속도를 측정하고 E-니트로페놀을 10,000 1/M/cm로 취하였다. 제9도는 WT 및 2D5 α-아밀라아제에 대한 도시한 결과를 도시한다.

표 1은 α-아밀라아제에 2D5의 돌연변이가 실질적으로 효소활성에는 영향을 미치지 않음을 명백히 나타내는 것이다.

b) 열불성화에 대한 Ca⁺의 영향

다양한 칼슘농도에서 WT, D7 및 2D5에 대하여 열불활성화 실험을 수행하였다. 방법은 다음과 같다:

1) 탈금속화

에 대하여 효소(2-3mg/mℓ)를 24시간 동안 투석하였다.

2) 재금속첨가

- 500μℓ 완충액 100mM(예를 들어 MES, MOPS, EPPS)^*

- 145μℓ 탈금속효소(예를 들어 2.15mg/mℓ)

- 100μℓ CaCl₂(100, 50, 30, 20, 10, 5 또는 2.5mM)

- Xμℓ K₂SO₄(100mM)

- (255-X)μℓ H₂O

3)열-비활성화

실온에서 사전에 배양된 효소용액 1mℓ를 약 0.2mg/mℓ 농도의 밀폐된 Pierce-vials(테프론 피복밀봉)내에서 90.5℃ 또는 95℃로 가열하였다. 샘플 50μℓ를 0 내지 6시간 사이의 일정한 간격마다 주사기로 회수하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 4NP-DP5(0.5mM)로 잔여 활성을 측정하였다. 단일한 지수적 붕괴에 적합한 프로그램(GRAPHPAD)을 사용하여 반감기를 측정하였다.

제10도 및 제11도는 90.5℃에서 Ca농도의 함수에 따라 각각 pH 5.5와 7.0에서 WT와 D7α-아밀라아제 반감기를 도시한다. 2D5의 Ca의존성은 단지 95℃의 pH 7.0에서만 측정되었다(제12도). 변이체에 대한 Ca의존성은 또한 WT와 다르지 않음을 또한 알 수 있다.

C. 상이한 pH값에서 변이체 α-아밀라아제의 열안정성

D7과 2D5 모두에 대한 열불활성화의 pH의존성을, 상기의 1mM Ca농도에서 기재된 완충액을 사용하여 각각 90.5℃와 95℃에서 측정되었다. D7과 2D5 모두에 대한 열안정성이 pH의 모두 범위에서 현저히 상승(2배까지)되었다.(제13도 및 제14도)는 결론을 내릴 수 있다.

[실시예 9]

바실루스 내에서 변이체 효소의 생산

E. coli WK6내에서의 발현에 의해 확인된 바실루스 리케니포미스 α-아밀라아제의 돌연변이를 2가지 상이한 방법으로 바실루스 발현 벡터에 전이시켰다.

a) α-아밀라아제 유전자 내의 독특한 제한 부위의 보조(제4도)로, 돌연변이를 수반하는 단편을 pMaTLia6 변이체로부터 단리하고 pBMa6.Lia6의 동일구조 위치에 하위클로닝하였다. 그 다음에 E. coli나 바실루스에서 복제될 수 있는 후자의 플라스미드를 SacⅠ으로 절단하고 T4 DNA 리가아제로 다시 환형화하였다. 바실루스 섭틸리스1A40에 형질전환한 후, SPO프로모터의 제어 하에서 α-아밀라아제를 높은 수준으로 생산되었다. 다시 환형화된 pBMa6.Lia6은 pB6.Lia6으로 명명되며 E. coli 부분이 제거되었음을 제시한다.

b) pBMa6.Lia6 단일 스트랜드 DNA를 E. coli로부터 재수집하고 제한효소로 절단된 pBMc6.Lia6 2중 스트랜드 DNA로 어닐링하여 α-아밀라아제 상에 의도했던 갭이 형성된 이중체를 얻었다. 그 다음에는 원하는 돌연변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드(실험 섹션에 기재된 바와 같은)로 이 갭을 부위-지정 돌연변이시켰다. 그 다음에는 pBMc6.Lia6 벡터를 상기 pB6.Lia6 형 벡터에 형질 전환시켰다. 만일 돌연변이가 상이한 갭에 있다면 상이한 단일 부위 돌연변이를 a)방법에 의해 수행할 수 있으나 b)방법을 사용하는 것이 바람직하다.

SacⅡ-SalⅠ단편을 교환함으로써 a)방법에 의해 변이체 D7과 2D5의 돌연변이를 pBMa6.Lia6에 전이시키고, 형질 전환된 바실루스 섭틸리스 1A40의 배지에서 α-아밀라아제를 회수하였다. 2가지 변이체 상등액을 실시예들의 절차에 따라 스크린닝하였고 이들 모두는 야생형 pB6.Lia6에 의해 생산된 α-아밀라아제 보다 더 산에 안정하고 열안정성인 α-아밀라아제를 생산한다는 것이 확인되었다.

그러므로 바실루스에서 α-아밀라아제 돌연변이의 표현형은 E. coli의 표현형과 다르지 않다.

최종적으로, pB6.Lia6 변이체를 프로테아제 네거티브 및 바실루스 리케니포미스 T5의 α-아밀라아제 네거티브 유도체(EP-0253455, CBS 470.83)인 바실루스 리케니포미스 T9으로 형질 전환시켰다. 숙주 T9을 사용하여 동질의 체계에서 α-아밀라아제의 변이체를 높은 수준으로 생산하였다. 염색체 α-아밀라아제 유전자를 제거하면 오염원인 야생형 α-아밀라아제가 더 이상 제조되지 않으므로 이 스트레인은 변이체 α-아밀라아제의 제조에 매우 적합하게 된다. 이 스트레인으로부터 회수된 효소는 산업적 사용시험에 사용되었다. 변이체 pB6.Lia 6.2D5와 pB6.Lia6.D7의 산업적 사용이 증명되었다.

[실시예 10]

전분의 액화 조건하에서 변이체 α-아밀라아제의 이용시험

더욱 실제적인 상황에서 변이체 α-아밀라아제 2D5를 시험하기 위해, 본 발명자는 발효액(실시예 9의)을 한외여과에 의해 정제하고, 50% 프로필렌글리콜로 효소를 제조하였다.

3개의 샘플을 시험하였다:

ITAU(열안정성 α-아밀라아제 단위)는 표준조건에서 요오드와 반응한 후 620nm에서 참조색상과 동일한 흡광도를 갖는 생산물에서 분당 1mg의 전분을 변환시키는 효소량으로 정의된다. 표준조건은 pH 6.6; 30℃; 반응시간은 20분이다. 참조 색상은 증류수 100mℓ중의 CoCl₂·6H₂O 25g, K₂Cr₂O₇3.84g 및 HCl 1mℓ(1M)이다.

1. 낮은 pH(5.5 및 5.25)에서의 액화시험

전분 슬러리의 온도를 가능한 급히 110±0.5℃까지 상승시키고 6시간 동안 이 온도에서 유지시켰다. 액화는 연속흐름(5.4ℓ/h)에서 실험하였다. 액화 45,60 및 75분 후 135mℓ(액화 15분)의 3샘플을 채취하여 2시간동안 95℃에서 방치하였다. 이 시간 후, 50mℓ 샘플을 0.4mℓ H₂SO₄N으로 산성화하여 pH 3.5를 얻은 후, D. E.를 결정하기 전에 효소활성을 멈추기 위해 10분간 끓고 있는 가열탕에 넣었다.

샘플의 남은 부분을 잔여 효소활동을 결정하기 위해 냉각하였다.

슬러리 조성:

3.3kg 옥수수 전분 D. S. 88% (2.904kg 건조 전분)

5.45ℓ 정수(井水)(40 T. H.)

건조 슬러리 물질 33%

1N 황산 또는 1N NaOH로 pH5.5에 교정

효소농도:4.4 TAU/gr 건조전분

시험하는 동안 유속을 2,3회 확인하였다.

2. D. E. 의 측정

액화 전분의 건조물질은 굴절계로 확인하였다(34% 정도). 잘 알려진 Lane Eynon 방법으로 D. E.을 측정하였다. 결과는 도면 15에 나타나있다.

3. 잔류 효소활성

액화 전분에서 잔류 아밀라아제 활성은 Brabender amylograph로 측정하였다.

40g 감자전분

390mℓ 증류수, 50℃

50mℓ Tris 완충용액 0.05M pH 6.50

5mℓ CaCl 2H O, 30g/ℓ

점도가 안정될 때(10분) 온도는 80℃(1.5°/분)까지 상승시키고, 희석된 액화 전분(7g에 증류수 50mℓ까지) 5mℓ를 첨가하여 20분 후에 점도의 감소를 측정한다. 이 감소는 효소활성의 함수이다. 효소농도를 알 수 있는 표준 그래프에서 T. A. U의 잔류활성을 평가할 수 있다.

변이체 2D5는 WT 효소보다 pH5.5이하 및 110℃에서 훨씬 더 잘 수행한다. 변이체 2D5에 의하여 5.25pH에서 2-2 DE 단위의 향상이 달성된다.

[실시예 11]

직물 풀빼기 조건하에서 변이체 α-아밀라아제의 이용시험

알칼린 α-아밀라아제 변이체의 산업적 응용성을 시험하기 위하여 다음 용액에서 20℃상의 안정성 시험을 실시하였다.

2.5시간 배양후 바람직한 특성을 위해 선택된 α-아밀라아제 변이체는 잔류 효소활성을 가진다.

Claims

α-아밀라아제를 코드화 하는 DNA 서열의 발현 생성물인 변이체 α-아밀라아제에 있어서, 이 효소는 바실루스 리케니포미스로부터 얻어지는 야생형 α-아밀라아제의 111, 133 및 149 위치 또는 상동적인 α-아밀라아제의 대응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 다르게 되고 그리고, 상기 변이체 α-아밀라아제는 상기 아미노산 치환으로 인하여 전분의 분해 및/또는 직물 풀빼기에 이용될 때 향상된 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 변이체 α-아밀라아제.
제1항에 있어서, 향상된 열안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 α-아밀라아제.
제1항에 있어서, 6.5 이하 및/또는 7.5 이상의 pH에서 향상된 안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 α-아밀라아제.
제1항에 있어서, 향상된 열안정성 및 산안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 α-아밀라아제.
제1항에 있어서, 다음과 같은 아미노산 치환제:Ala-111-Thr, His-133-Tyr, Thr-149-Ile를 하나 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 α-아밀라아제.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 α-아밀라아제를 코드화 하는 변이체 유전자.
제6항에 따른 변이체 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제7항에 따른 발현 벡터를 수용하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
형질 전환 전에 세포의 전분분해 효소를 실질적으로 생산할 수 없는 숙주 세포로서, 제7항에 따른 발현 벡터로 형질 전환되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제9항에 있어서, 바실루스 리케니포미스 T9인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제1항에 따른 변이체 α-아밀라아제의 제조방법으로서, 바실루스 리케니포미스로부터 얻을 수 있는 α-아밀라아제를 코드화 하는 클론된 유전자 및 그의 단편을 돌연변이 시키고; 얻어진 변이체 α-아밀라아제 유전자 또는 유전자들을 단리하고; 상기 변이체 α-아밀라아제 유전자 또는 유전자들을 발현 및 생산에 적합한 숙주 균주로 도입하고; 그리고 생산된 변이체 α-아밀라아제를 회수하고 그 변이체 α-아밀라아제가 전분 분해 또는 직물 풀빼기에 이용되기 위한 향상된 특성을 갖는 것을 확인하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이체 α-아밀라아제 제조방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 적절한 배지에서 배양하고, 생산된 α-아밀라아제를 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변이체 α-아밀라아제의 제조방법.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전분분해 및 직물 풀빼기에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 α-아밀라아제.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 변이체 α-아밀라아제를 사용하는 것으로 이루어지는 전분 분해 방법.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 변이체 α-아밀라아제를 사용하는 것으로 이루어지는 직물 풀빼기 방법.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 변이체 α-아밀라아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 전분 분해 조성물.
제1항 내지 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 변이체 α-아밀라아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 직물 풀빼기 조성물.