KR19980702782A

KR19980702782A - 녹말 액화 방법

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Publication number: KR19980702782A
Application number: KR1019970706189A
Authority: KR
Inventors: 리차드 엘. 앤트림; 콜린 미친슨; 레이프 피. 솔레임
Original assignee: 혼 마가렛 에이.; 제넨코 인터내셔널, 아이엔씨.
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 1998-08-05
Also published as: BR9607474A; EP0813607B1; ATE258989T1; CA2214383A1; AU5298496A; NO974072D0; CN1177983A; EP0813607A1; CA2214383C; NO974072L; CN1112446C; CN1492045A; US5756714A; DE69631471D1; DE69631471T2; JPH11501813A; AU710631B2; DE69631471T3; EP0813607B2; WO1996028567A1

Abstract

본 발명은 (a) 녹말을 액화시키기 이전에 또는 이와 동시에 상기 녹말을 처리하여 녹말에 존재하는 효소 저해 조성물을 불활성화 및/또는 제거시켜 처리된 녹말(treated starch)을 제조하는 단계; (b) 상기 녹말에 α-아밀라제를 가하는 단계; 및 (c) 상기 처리된 녹말을 처리된 녹말이 효과적으로 액화되는 온도에서 1시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 녹말 액화 방법에 관한다. 상기 녹말을 처리하는 효과적인 방법에는 피테이트 분해 효소를 가한 후 열 처리시키고, 이후 입자성 녹말 또는 녹말 용액을 임의로 여과 또는 원심 분리시키는 것을 포함한다.

Description

녹말 액화 방법

본 발명은 곡물의 녹말을 다운 스트림 산물, 즉 덱스트로즈, 프록토즈 및 알콜과 같은 생성물로 전환시키는 경우의 α-아밀라제의 용도를 개질시키는 것에 관한다. 구체적으로, 본 발명은 액화 이전에 또는 액화시 입자형 녹말에서 얻은 효소 억제 조성물을 제거하는 방법, 및/또는 불활성화시키는 방법에 관한다.

옥수수와 같은 곡물은 녹말의 공급원으로서 오래 전부터 사용되어 왔다. 산업용 녹말을 분리 및 정제시키는, 널리 공지된 방법중의 하나는 습식-분쇄법(wet-milling process)이다. 본 방법은 가능한 한 완벽하게 곡물 낟알의 주성분을 분리시키도록 고안된 고도로 특이적이며 통합적인 시스템으로 개발되어 왔다.[Stanley A. Watson, Starch: Chemistry Technology, Vol.II, Industrial Aspects, Academic Press, New York, 1967, pp 30-51]

통상의 습식-분쇄 방법에서는, 처음에 녹말 생성에 사용되는 건조곡물을 담금 과정, 즉 스티핑(steeping) 시킨다. 스티핑스, 곡물 입자로부터 피테이트(phytate) 및 피트산(phytic acid), 당, 염 및 단백질을 포함하는 다수의 가용성 물질들을 분리해 내도록 역류 물 흐름(counter water current)에 도입시킨다. 스티핑된 곡물들을 상기 담금수(soaking water) (침지수; steepwater) 로부터 분리해낸 후 물리적으로 크래킹(cracking) 시킨 후 분쇄시킨다. 부양(flotation) 기술 및 원심 분리 기술을 적용시켜 녹말, 섬유질 및 단백질로부터 배종(germ)을 분리해낸다. 결과로 생성된 배젖(endosperm; 녹말) 섬유질 및 단백질 슬러리를 더욱 분쇄시킨 후 스크리닝시켜 섬유질을 분리해낸다. 마지막으로, 단백질 및 배젖 관련 성분들을 역류 세척 및 원심 분리시켜 밀도에 따라 분리하여 상기 단백질/글루텐 스트림으로부터 녹말을 분리해낸다. 이후 분리된 녹말 스트림을 세척시켜 무기염과 같은 가용성 물질을 포함하는 혹종의 비-입자성 녹말 관련 가용성 물질들, 및 피테이트 및 피트산과 같은 화합물들을 제거한다. 결과의 생성물은 매우 순도가 높은 불용성 슬러리로서 프록토즈로의 전화에 대한 출발 물질로서 사용된다.

일반적으로, 녹말로부터 프록토즈로의 전화 과정은 4단계로 구성되어 있다: 입자성 녹말을 액화시키는 단계, 상기 액화된 녹말을 덱스트로즈로 당화시키는 단계, 정제 단계, 및 프록토즈로의 이성화 단계.

본 녹말 액화 방법의 목적은 녹말 중합체 입자들의 농축 현탁액을 저점도의 더욱 단쇄인 가용성 덱스트린 용액으로 전화시키는 데에 있다.

상기 단계는 표준적인 장비를 편리하게 다루고 글루코즈 또는 기타 당으로 효과적으로 전화시키는 데에 필수적인 단계이다. 입자성 녹말을 액화시키기 위하여서는, 상기 입자성 녹말의 온도를 약 72℃ 이상으로 상승시켜 상기 입자들을 젤라틴화시켜야 한다. 상기 가열 방법은 즉시 불용성 녹말 입자를 파괴시켜 수용성 녹말 용액을 생성한다. 이후 가용화된 녹말 용액은 α-아밀라제에 의하여 액화된다.(EC 3.2.1.1.)

통상적인 효소적 액화법은 칼슘 하이드록시드, 소듐 하이드록시드 또는 소듐 카보네이트를 가하여 입자성 녹말 슬러리의 pH를 바실러스 라이커니포르미스(Bacillus liqueniformis)로부터 얻어진 α-아밀라제의 최적 pH인, pH 6.0-6.5로 맞추어야 한다. 칼슘 하이드록시드를 가하면 α-아밀라제를 불활성화로부터 안정화시키는 것으로 알려진 칼슘 이온을 공급하게 되어 또한 유리하다. α-아밀라제를 가하면, 현탁액은 스팀분출구를 통하여 펌핑되어 급속하게 온도를 80-150℃ 사이로 상승시킨다.

녹말은 즉시 젤라틴화되며, α-아밀라제로 작용으로 인하여 녹말의 (1-4) 글리코시드 결합은 랜덤하게 가수 분해되어 해중합화(depolymerization) 되면 용이하게 펌핑되는 다량의 유체가 생성된다.

본 액화법의 2차 변형으로서, α-아밀라제를 녹말 현탁액에 가하는 방법에 있는데, 이때 현탁액을 80-100℃의 온도에 방치시켜 상기 녹말 입자들을 부분적으로 가수 분해시키며, 상기 부분적으로 가수 분해된 녹말 현탁액은 약 105℃ 이상의 온도에서 분출구를 통하여 완전히 젤라틴화된 흑종의 잔류성 입자 구조체로 폄핑된다. 상기 젤라틴화된 녹말을 냉각시킨 후, α-아밀라제를 2차적으로 가하면 녹말을 더욱 가수 분해시킬 수 있게 된다.

상기 방법은 제 3 변형으로서, 건식 분쇄 방법(dry milling process)을 들 수 있다. 배종은 부양 분리 기술 또는 이와 동등한 기술로써 임의로 제거할 수 있다. 녹말, 섬유질, 단백질 및 기타 곡물의 성분들을 함유하는, 결과로 생성된 혼합물을 α-아밀라제를 사용하여 액화시킬 수 있다. 업계에서 일반적으로 수행되는 방법은 건식 분쇄 방법을 사용할 경우 더욱 낮은 온도에서 효소로 액화시키는 방법이다. 일반적으로, 녹말을 가용성 덱스트린으로 전화시키는 데에 있어서 저온 액화법은 고온 액화법보다 효율이 낮다고 사료된다.

통상적으로, 젤라틴화 이후 녹말 용액을 α-아밀라제 존재하 DE가 10-20이 될 때까지(보통 1-3시간) 고온에 방치시킨다. 덱스트로즈 당량(DE)이란 환원당의 총 농도를 측정하는 데에 사용되는 산업상 기준인데, D-글루코즈의 건조 중량을 기준으로 산정된다. 가수 분해되지 않은 입자성 녹말은 DE가 거의 0인 반면에, D-글루코즈의 DE는 100으로 정해져 있다.

α-아밀라제를 함유하는 녹말 용액의 최대 온도는 효소가 얻어진 미생물 공급원 및 α-아밀라제 분자의 분자 구조에 따라 결정될 수 있다.

비. 서브틸리스(B. Subtilis) 또는 비. 아밀로라이커패이션스(B. amyloliquefaciens)의 야생형 균주에 의하여 생성된 α-아밀라제는 통상적으로 약 90℃ 이하의 온도에서 사용되는데, 상기 온도 이상에서는 급속하게 불활성화되기 때문이다. 그러나, 야생형 비. 라이커니포르미스로부터 생성된 α-아밀라제는 약 110℃ 이하의 온도에서 사용될 수 있다.

녹말 및 칼슘 이온이 존재하면 불활성화에 대하여 α-아밀라제를 안정화시킨다고 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, α-아밀라제는 급속히 불활성화되는 것을 막기 위하여 pH 6 이상에서 사용된다. 저온에서는, 비. 라이커니포르미스로부터 얻어진 α-아밀라제는 pH 5 이하에서 녹말 기질에 대한 가수 분해 활성이 뛰어난 것으로 공지되어 있다. 그러나, 통상적인 분출 온도, 예를 들어 102-109℃에서 녹말을 가수 분해하는 데에 효소가 사용될 경우에는 급속하게 불활성화되는 것을 피하기 위하여 pH를 5.7 이상으로 맞추어야 한다. pH 수치가 6.0 이상일 경우에는 의도하지 않는 부산물, 예를 들어 말툴로즈가 생성되기 때문에 불행하게도 pH에 관한 요구 사항은 매우 까다롭다. 그러므로, 실재로는, 액화 pH를 5.9-6.0 사이로 유지시켜서 가수 분해된 녹말의 수율을 만족할 정도로 끌어내야 한다.

습식 분쇄 단계에서와 같이, 액화 pH, 즉 곡물 녹말 현탁액의 pH와 관련된 다른 문제점은 상기 녹말 현탁액의 pH를 약 4에서 5.9-6.0까지 상승시킬 필요가 있다는 것이다. 이와 같이 pH를 맞추려면 고비용 산 중화성 화학 물질을 가해야 할 뿐만 아니라 최종 녹말 전화산물을 이온-교환 정제시켜 화학 물질을 분리시킬 필요가 있다. 뿐만 아니라, 액화 이후의 단계는, 통상적으로 액화된 녹말을 글루코즈로 당화시키는 단계로서, pH를 4-4.5로 유지시킬 필요가 있으므로; pH는 5.9-6.0에서 4-4.5로 낮추어야 하며; 화학물질 및 정제 단계를 추가로 제공해야 한다.

다수의 식물 종자에 통상적인 바와 같이, 피트산, 미오이노시톨의 헥사포스페이트 에스테르는 포타슘, 칼슘 및 마그네슘 피테이트와 같은 피테이트 염의 형태로 곡물의 낟알에 존재한다고 공지되어 있다. 상기된 바와 같이, 일반적으로 다음 과정에 도입시키기 이전에 스티핑시 낟알로부터 곡물 낟알에 존재하는 피트산을 상당량 침출시켜 액화 스트림으로부터 분리해야 할 것으로 사료된다. 놀랍게도, 본원에 기술된 바와 같이, 본원의 출원인은 피테이트 형태가 스티핑 및 추가의 세척 과정 이후의 입자성 녹말(granular starch)에 존재하는 것으로 생각하여 왔다.

하지만 이론에 국한되지 않고, 잔류하는 피테이트는 실제로 녹말 입자 그 자체내에 존재하므로 상기 추가의 세척 과정동안에는 분리되지 않는다고 사료된다.

U.S. 특허 제 5,322,778호에서는, pH 4.0-6.0 사이에서 비설파이트 또는 이의 염과 같은 항산화제, 아스코르브산 또는 이의 염, 에리토르브산(erythrobic acid), 또는 부틸화된 하이드록시아니졸과 같은 페놀성 항산화제, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 또는 α-토코페놀페놀을 액화 슬러리에 가하여 액화를 수행시킨다. 본 특허에 의하면, 소듐 비설파이트는 5mM 이상의 농도로 가하여야 한다.

U.S. 특허 제 5,180,669호에서는, pH 5.0-6.0 사이에서 완충 용액에 필요로 하는 양의 초과량 만큼의 카보네이트 이온을 분쇄된 녹말 슬러리에 가하여 액화시킨다. 카보네이트 이온을 가하면 pH 효율이 증가되기 때문에, 일반적으로 예를 들어, 염산 또는 황산과 같은 무기산인 수소 이온 공급원을 가하여 상기 슬러리를 중화시킨다.

PCT 공개 공보 제 WO94/02597호에서는, 하나 이상의 메티오닌이 시스테인 또는 메티오닌을 제외한 아미노산과 대체되어 산화적 안정성이 개선된 돌연 변이형 α-아밀라제에 관하여 기술하고 있다.

PCT 공개 공보 제 94/18314호에서는, 하나 이상의 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 히스티딘 또는 티로신 잔기가 비-산화성 아미노산과 대체되어 산화적 안정성이 개선된 돌연 변이형 α-아밀라제에 관하여 기술하고 있다.

PCT 공개 공보 제 WO-91/00353호에서는, α-아밀라제의 열 안정성, 산 안정성 및 알카리 안정성을 증가시킨, 액화와 관련된 문제점들을 유전공학적으로 해결한 접근 방법에 관하여 기술하고 있다.

U.S. 특허 제 4,914,029호에서는, 곡물 침지액(steep liquor)에 피타제를 가하여 피트산의 양을 감소시켜, 동물 먹이내에서 상기 곡물 침지액을 더욱 효과적으로 활용하는 방법에 관하여 기술하고 있다.

선행 기술에서 개선되었음에도 불구하고, 시판되고 있는 α-아밀라제를 사용하여 낮은 pH에서 녹말을 효과적으로 액화시키는 방법에 대한 필요성은 여전히 존재한다. 이와 유사하게, 고온에서 분쇄된 건조 곡물을 액화시킬 수 있는 방법에 대한 필요성도 존재한다. 그럼에도 불구하고, 상기된 방법들 모두는 저 pH 녹말 액화(low pH liquefaction)를 보조하는 비효율적인 또는 미지의 효소와 관련된 조성물을 제거 및/또는 불활성화시키는 경우 중요한 이점을 제공하지 못한다. 뿐만 아니라, 상기 방법들 모두는 항산화제 또는 중화용 산을 가할 필요가 없으며, 유전 공학적으로 효소를 조작할 필요가 없으며, 또는 예상외로 낮은 pH에 대한 안정성을 갖는 신규의 α-아밀라제를 발견할 필요도 없는 액화법에 대하여 융통성 있게 접근할 수도 없도록 한다.

[발명의 요약]

용이하게 사용 가능한 돌연 변이체 또는 야생화 α-아밀라제 효소를 사용하여 녹말의 저 pH 액화법을 효과적으로 수행시키는 것은 본 발명의 제 1 목적이다.

입자성 녹말에 존재하며 낮은 pH에서 α-아밀라제에 의하여 비효율적으로 액화시키는데에 주로 관여하는 효소 억제 조성물을 불활성화 및/또는 제거시키는 방법을 제공하는 것은 본 발명의 제 2 목적이다.

고비용의 항산화제를 가하지 않고 녹말을 액화시키는 방법을 제공하는 것은 본 발명의 제 3 목적이다.

방법을 변형시킬 수 있으며 유전 공학적으로 조작된 α-아밀라제를 사용할 필요가 없는, 간단하고 효과적인 액화 방법을 제공하는 것은 본 발명의 제 4 목적이다.

본 발명에 의하면, 녹말에 존재하는 효소 억제 조성물을 불활성화 및/또는 제거하기 위하여 녹말을 액화시키는 이전에 또는 그와 동시에 녹말을 처리하여 처리된 녹말을 제조하는 단계; 상기 처리된 녹말에 α-아밀라제를 가하는 단계; 및 1시간 동안 상기 처리된 녹말을 액화시키기에 효과적인 온도에서 처리된 녹말을 반응시키는 단계를 포함하는 녹말 액화 방법을 제공한다. 본 발명의 제 1 구체예에 의하면, 불활성화된 효소 억제 조성물을 포함하거나 또는 실질적으로 효소 억제 조성물이 제거되었으며 pH 5.7 미만인 α-아밀라제 및 수성 녹말의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

하기에 더욱 상세하게 지적될 바와 같이, 본 발명을 수행하는 경우 상업적 규모의 녹말 액화 공정에 중요한 이점을 제공한다. 이론에 얽메이지 않고, 출원인은 입자성 녹말에 존재하는 특이 조성물, 즉 상기 언급된 바 없는 성분은 녹말을 α-아밀라제로 제 pH 액화시키는 것과 관련하여 몇가지 문제점이 존재한다는 것을 밝혀냈다. 분리된 조성물을 원소 분석해 보면, 본 조성물은 피테이트 형태를 포함하는 것으로 나타났다. 저 pH 액화법의 문제점과 관련된 조성물을 동정해내면 상기 관련제제를 불활성화 및/또는 제거시킬 수 있으므로 pH 4.5 정도로 낮은 pH에서, 널리 공지되어 특징화된 α-아밀라제로 입자성 녹말을 효과적으로 액화시킬 수 있다. 하기된 바와 같이, 본원 발명은 처음으로, α-아밀라제를 포함하는 상업적으로 유용한 시스템을 이용하여 낮은 pH에서 녹말을 액화시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 예상외의 저 pH 안정성(low pH stability)을 갖는, 특별히 고안된 돌연 변이체 또는 야생형 효소, 또는 항산화제를 가하거나 또는 산으로 중화(acid neutralization) 시키는 것과 같은 고비용 측정법으로 측정할 필요가 없다.

본 발명은 다른 목적 및 부수의 이점과 함께 도면을 참고로하여 하기 상세한 설명을 참고로 하여 그 자체로서 이해될 것이다.

본원은 1995년 3월 9일자 출원된 U.S. 출원 번호 제 08/401,325호의 부분 계속 출원으로서, 상기 출원은 본원에 참고 문헌으로서 포함되어 있다.

액화(liquefaction) 또는 액화시키다(liquefy)라는 말은 녹말이 더욱 짧은 사슬 및 점도가 낮은 덱스트린으로 전화되는 과정을 의미한다.

일반적으로, 상기 과정은 α-아밀라제를 가함과 동시에 또는 가한후에 녹말을 젤라틴화시키는 과정을 포함한다.

침지액(steep liquor)이란 스티핑시, 스티핑된 곡물 낟알들로부터 얻어진 액체를 의미한다. 상기 침지액은 곡물의 가용성 성분를 상당량 함유하고 있다.

입자성 녹말(granular starch) 또는 녹말 입자체(starch granules)란 외피, 섬유질, 단백질, 배종 및 가용성 물질들을 곡물의 습식-분쇄 공정에 통상적인 스티핑, 기계적 크래킹, 분리, 스크리닝, 역류 세척 및 원심 분리 단계들을 통하여 분리해낸 후 남은 가용 곡물의 수-불용성 성분을 의미한다. 입자성 녹말은 거의 대부분이 패킹된 녹말 문자(예를 들어, 아밀로펙틴 및 아밀로즈)를 함유하는 천연 그대로의 녹말 입자들을 포함한다. 곡물에서, 입자성 녹말 성분은 약 99%의 녹말을 포함하며; 나머지 1%는 입자체와 결합된 단백질, 재, 섬유질 및 미량 원소로 구성되어 있다. 입자성 녹말의 패킹 구조는 α-아밀라제의 녹말 가수 분해 능력을 심각하게 저해시킨다. 녹말의 젤라틴화는 상기 입자들을 파괴시켜 가용성 녹말 용액을 생성하고 효소에 의한 가수 분해를 촉진시키기 위하여 이용된다.

녹말 용액 (starch solution)이란 입자성 녹말을 가열시켜 얻어진 젤라틴화된 수용성 녹말을 의미한다. 상기 입자들을 약 72℃ 이상까지 가열시키면, 입자성 녹말은 분해되어 소한(loose) 녹말 문자의 수성 혼합물을 생성하게 된다. 예를 들어, 옐로우 덴트 콘(yellow dent corn) 내 약 75%의 아밀로펙틴 및 25%의 아밀로즈를 포함하는 상기 혼합물을 물에서 점성의 용액을 형성하게 된다. 글루코즈 또는 프록토즈를 제조하는 상업적 공정에서는, 액화되어 가용성 덱스트린 용액을 형성하는 것은 녹말 용액이다.

효소 억제 조성물 또는 EIC이란 저 pH 액화시 α-아밀라제가 녹말 용액을 가수 분해시키는 것을 억제하는, 입자성 녹말내의 조성물을 의미한다. 낮은 pH에서 α-아밀라제를 저해시키는 작용을 가지며 젤라틴화된 녹말 입자로부터 추출된 조성물(EIC)을 화학 분석한 결과 EIC는 피테이트 형태를 포함한다는 것을 밝혔다. 효소 억제 조성물을 포함하는 피테이트 형태는 피테이트의 마그네슘, 철, 포타슘, 망간, 징크 및/또는 칼슘 염이라 사료된다.

처리란 낮은 pH, 즉, pH 5.7 이하에서 녹말을 효소로 가수 분해시킬 경우 효소 억제 조성물에 의하여 발생하는 효율을 감소시키거나 또는 제거시키기 위하여 입자성 녹말 또는 녹말 용액을 처리하는 것을 의미한다. 처리에는 예를 들어, 효소 저해 조성물에 의한 불안정화, 불활성화 또는 α-아밀라제의 특징인 녹말 가수 분해 활성의 저해를 억제하는 기능을 갖는 화합물 또는 화합물들을 입자성 녹말 또는 녹말 용액에 가하는 단계; 저 pH 액화 이전에 효소 저해 조성물의 제해성을 상당히 감소시키거나 또는 제거시키기 위하여 입자성 녹말 또는 녹말 용액에 어떠한 조건을 적용시키거나 또는 분리 기술을 적용시키는 단계; 또는 EIC를 화학적으로 개질시켜 효소 저해 조성물을 용액으로부터 제거시키는 화합물 또는 화합물들을 비-EIC 화합물 (non-EIC compound)에 가하는 단계를 포함한다.

α-아밀라제란 녹말, 아밀로펙틴 또는 아밀로즈 중합체내의 α(1-4)글리코시드 결합을 절단시키거나 또는 가수 분해시키는 효소의 활성을 의미한다. 적당한 α-아밀라제는 녹말의 액화에 유용한 천연 α-아밀라제 및 재조합 아밀라제 또는 돌연 변이 α-아밀라제이다. 본 발명에서 바람직한 아밀라제는 바실러스(Bacillus), 구체적으로 바실러스 라이커니포르미스, 바실러스 아밀로라이커페이션스 또는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus thermophillus)로부터 유도된 α-아밀라제이다.

본 발명에 의한 녹말 처리법은 선행 기술에 의한 액화법과 대조적으로, pH 6.0 미만 또는 5.0 미만에서 효과적으로 수행될 수 있는, 액화 반응, 즉 녹말, 아밀로펙틴 또는 아밀로즈를 효소적으로 가수 분해시키는 방법을 의미한다. 바람직하게는 상기 액화 반응은 pH 약 4.5-약 5.7, 더욱 바람직하게는 약 4.5-약 5.5 및 가장 바람직하게는 약 4.5-약 5.2이다.

본 발명의 바람직한 제 2 구체예에서는, α-아밀라제를 가하기 이전에 열처리시켜 입자성 녹말 또는 녹말 용액은 처리되어 이의 내부에 존재하는 효소 저해 조성물을 불활성시킨다. 상기 구체예에서는, 제일 처음 상기 α-아밀라제를 가하지 않고 가열시켜 확실하게 효소 저해 조성물을 불활성화시킨후 상기 α-아밀라제를 상기 입자성 녹말 또는 녹말 용액에 가하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 처리 단계와 동시에 α-아밀라제를 가하는 것은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 사료된다.

이후 슬러리를 적당한 온도, pH 및 시간동안 인큐베이팅시키는데, 이는 녹말을 액화시키는 경우, 업계에 널리 공지된 사항이다.

본 발명에 의하면, 액화 이전에, 즉 α-아밀라제를 가하기 이전에, 녹말 용액을 가열시키면 상기 효소 저해 조성물의 α-아밀라제 활성을 저해하는 안정성은 상당히 감소된다.

이와는 달리, 처음에 저온, 예를 들어 60-90℃에서 상기 녹말 용액을 아밀라제와 함께 인큐베이팅시켜 액화가 완결되기 이전에 효소 저해 조성물을 녹말 또는 젤라틴화된 녹말 용액으로부터 방출시키는 것은 본 발명의 범위내에 있다. 이후, 실질적으로 녹말을 액화시키기에 충분한 시간 동안 온도를 적당한 온도까지 상승시켜 녹말을 액화시킨다.

상기 온도를 약 80-약 115℃까지 상승시키는 것이 바람직하다. 효소 저해 조성물은 저온에서 인큐베이팅시키거나, 또는 액화 동안 온도를 상승시킨후 유지시키는 때에 불활성화된다. 상기 구체예에서, α-아밀라제는 저온 α-아밀라제 인큐베이팅시 또는 이후의 액화과정시 또는 그 이후에 추가로 가하여질 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서와 같이, 본 구체예에서는 pH 5.7 이하에서 효율적으로 액화시킬 수 있을 것이다.

본 발명의 제 3 구체예에서, 효소 저해성을 제거하여 녹말로부터 상기 효소 저해 조성물을 제거해내기 위하여 효소 저해 조성물을 화학적으로 개질시키거나 도는 분해시킨 조성물로 상기 입자성 녹말 또는 녹말 용액을 처리시킨다. 바람직하게는 액화 이전에 피테이트 분해 효소를 녹말 입자 또는 녹말 용액에 가한다. 바람직한 피테이트 분해 효소는 피타제 또는 피트산 포스파타제를 포함한다. 미생물들에 의하여 생성되는, 피테이트를 이노시톨 및 무기 포스페이트로 전화시키는 것을 촉매화시키는 효소들중 다수는 피타제(phytase)로서 널리 공지되어 있다.

피타제 생성 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 수도모나스(Pseudomonas), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 아스퍼질러스 나이저(Aserpillus niger), 아스퍼질러스 나이저 변이체(Aspergillus niger var), 아우아모리(awamori), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus tereus), 아스퍼질러스 피큠(Aspergillus ficuum)을 포함하는 박테리아 및 사상 진균 및 이스트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 피타제는 아스퍼질러스 피큠으로부터 유도된다. 이와 같은 미생물 공급원으로부터 얻어진 피타제 효소는 업계에 공지된 기술로써 정제된다. 예를 들어, Ullah와 그의 동료에 의한, Preparative Biochemistry 18(4), pp. 443-458(1988)에는 아스퍼질러스 피큠으로부터 피타제를 정제하는 방법에 관하여 기술되어 있는데, 이는 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있다/

입자성 녹말 또는 녹말 용액에 가하여진 피타제 분해 효소의 농도는 용액내 효소 저해 조성물을 상당량 분해하는 데에 효율적이어야 한다.

물론, 적당한 피타제 분해 효소 농도는 pH, 온도, 반응 시간, 특이 효소 활성에 의존하며, 추가로, 입자성 녹말 또는 녹말 용액인지의 여부와 같은 입자의 형태에 의존한다. 그러나, 피타제 분해 효소 활성에 대한 최적 조건은 업계의 숙련자에 의하여 용이하게 확인될 것이다.

바람직하게는, 피타제 분해 효소의 농도는 녹말 1g당 약 0.1-약 100 unit 피타제(피타제 unit)이다. 더욱 바람직하게는, 피테이트 분해 효소 농도는 녹말 1g 당 약 1-약 25 unit 피타제이다. 1 피타제 unit (피테이트 분해 활성)란, 37℃에서 1분당 0.042M의 Mg-K 피테이트로부터 무기 포스포러스(P) 1㎛ole을 방출할 효소의 양으로서 정의된다. [Sigma Cehmical Co., St. Louis, Mo.] 피테이트 분해 효소는 입자성 녹말 또는 녹말 용액에 가하여진다고 사료된다. 피테이트 분해 효소는 녹말이 입자 형태인지 또는 용액내에서 가용성인지에 상관없이 본 발명의 목적에 효율적이라고 사료된다. 실제로, 출원인 피테이트 분해 효소를 즉, 젤라틴화되기 이전에, 입자성 녹말에 가하면 본 발명에 의한 용액을 처리하는 데에 효과적이라는 것을 밝혔다. 이와는 달리, 상기 피타제는 젤라틴화시 또는 젤라틴화된 이후에 녹말 용액에 가하여 질 수 있다.

본원의 제4 구체예에 의하면, 효소 저해 조성물은 불활성화되거나 또는 입자성 녹말 또는 녹말 용액으로부터 분리된 후 액화된다. 상기 효소 저해 조성물은 어떠한 기술에 의하여 피트산 또는 피테이트 염을 포함하는 화합물을 용액으로부터 분리하기에 효과적인 화학적 또는 기계적 분리법으로 제거 가능하다. 적당한 분리 방법에는 크로마토그래피, 이온-교환, 미소 여과 및 원심 분리법을 포함한다. 특히 바람직한 방법은 pH 의존성 피테이트 침전 또는 열 처리하여 분리시키는 단계, 및 이후의 여과법 또는 원심 분리법을 포함한다. 또한 바람직하게, 효소 저해 조성물은 고온 원심 분리법 또는 고온 여과법을 통하여 분리가능하다.

처리시, 입자성 녹말 또는 녹말 용액의 pH는 효소 저해 조성물을 제거시키거나 또는 불활성화시킨다. 상기 처리 단계는 어떠한 pH 수준에서도 수행될 수 있지만, pH 약 4- 약 6에서 효율적인데, 왜냐하면 습식-분쇄 공정으로부터 얻어진 상기 입자성 녹말 스트림의 pH 수준을 바람직하지 않도록 맞출 필요가 있기 때문이다. 바람직하게는, 상기 pH는 약 4.5-약 5.7; 더욱 바람직하게는 약 4.5-약 5.5; 및 가장 바람직하게는 약 4.5-약 5.2이다. 상기 범위에서 처리 단계의 pH를 유지시킴으로써, 상기 처리 단계의 pH는 습식 분쇄된 곡물 녹말 공정 스트림과 상호 관련되어 있으므로, 상기 습식 분쇄된 곡물의 pH를 맞추는 데에 과다한 비용이 지출되는 것을 피할 수 있을 것이다.

상기 처리 단계의 온도는 효소 저해 조성물을 분리시키거나 또는 불활성화시키는 데에 적당할 수 있으며, 선택된 특정 처리 방식에 의존적일 수 있다. 상기 처리 단계가피타제를 가하는 단계를 포함하는 경우, 특이 효소의 가수 분해 활성에 적당한 온도를 선택해야 할 것이다.

미생물성 피타제에 있어서, 온도는 일반적으로 약 20℃-60℃ 사이인 것이 적당할 것이며 바람직하게는 약 30℃-약 40℃ 사이인 것이 적당할 것이다. 그러나, 예를 들어 100-110℃의 온도에서 피테이트를 가수 분해시킬 수 있는 온도 저항성 피타제 효소를 개발하는 것은 본 발명의 범위내에 있는 것이 특히 바람직하다. 열 처리 단계, 임의적으로 이후에 여과시키거나 또는 원심 분리시키는 단계를 포함하는 처리 단계에서, 온도는 녹말이 젤라틴화되는 온도 이상이어야 하며; 바람직하게는 약80- 약 150℃, 더욱 바람직하게는 약 90-약 110℃, 및 가장 바람직하게는 약 95-약 110℃이다.

처리 단게에 소모되는 시간은 또한 선택된 처리법의 특정 타입에 따라 다양하다. 상기 처리 단계가 피타제를 가하는 단계를 포함하는 경우, 처리 시간은 가하여진 피타제 효소의 특이 활성 및 인큐베이팅 온도에 의존할 것이다. 미생물성 피타제를 사용하면, 반응 시간은 바람직하게는 약 1-약 24시간이며, 더욱 바람직하게는 약 3- 약6 시간인데, 조건에 따라 다르다. 상기 처리 단계가 가열 처리, 및 임의적으로 이후에 여과 또는 원심 분리시켜 입자성 녹말 또는 녹말 용액으로부터 효소 저해 조성물을 제거하는 단계를 포함하는 경우, 처리 시간은 바람직하게는 약 10초 - 약 60분, 및 더욱 바람직하게는 약 3-약 10분이다.

입자성 녹말로부터 피테이트를 불활성화시키는 것은 본질적으로, 예를 들어 열과 같은, 적당한 조건하에서는 순간적일 수 있으므로, 처리 시간은 기술적 억제 수단에 의하여 한정될 수 있다.

가열시킨 이후, 공지 기술에 의한 수단으로 상기 용액으로부터 불활성화 피테이트를 분리시키는데에 원심 분리법 또는 여과법이 사용딜 수 있다. 처리시, 상기 녹말로부터 피테이트를 분리시키는데에 원심 분리시키는 경우, 원심 분리법은 2000Xg 및 바람직하게는 약 5000Xg 및 약 10,000Xg의 g force로 수행될 수 있다.

처리 조건은 입자형 또는 사용된 분쇄에 의하여서도 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 고농도인 효소 저해 조성물을 함유하는 입자의 처리 시간은 효소 저해 조성물의 농도가 더욱 낮은 입자체의 경우보다 더욱 길다. 상이한 식물성 재료내 다양한 수준의 피트산 함량에 대하여서는 Lehrifield, J. Agric. Food Chem., Vol. 42, pp. 2726-2731(1994)에 기술되어 있는데, 이는 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있다. 상기 입자가 건식 분쇄 공정에 의하여 액화용으로 제조되는 경우, 섬유질 및 단백질 분획이 존재하므로 피테이트의 양은 습식 분쇄 공정의 경우보다 훨씬 많을 것이다. 그러므로, 건식 분쇄 녹말을 처리하는 때에는 습식 분쇄 녹말의 경우보다 더욱 극적인 조건이 필요하다.

효소 저해 조성물을 불활성화 및/또는 제거하기 위하여 입자성 녹말 또는 녹말 용액을 처리한 이후, 또는 처리와 동시에, α-아밀라제를 녹말에 가하면 녹말은 더욱 저분자량의 덱스트린으로 액화된다. 그러므로, 입자성 녹말 또는 녹말 용액을 처리한 이후 또는 그와 동시에 α-아밀라제를 사용하여 액화시키는 것은 본 발명의 범위내에 있을 것이라 사료된다. 상기 액화는 α-아밀라제를 사용하는 널리 공지된 혹종의 액화 기술에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명에 의한 액화 단계시 pH는 바람직하게는 약 5.7미만, 더욱 바람직하게는 5.3미만, 및 가장 바람직하게는 약 4.5-약 5 사이이다.

하기 실시예들은 본 발명을 사용함으로써 얻는 이점들에 대한 대표적인 예들로서, 제한적인 것은 아니다. 그러나, 업계의 통상적인 숙련자는 조건, 곡물, 온도, 효소 및 상기된 바와 같은 것들을 치환시킬 수 있을 것이다.

[실시예 1]

α-아밀라제 활성 측정 검정법

α-아밀라제 활성은 녹말이 요드와 반응하여 청색 복합체를 형성하는 능력 및 녹말이 더욱 단쇄인 덱스트린 분자로 가수 분해될 때 청색이 사라지는지의 여부에 의한 검정법을 통하여 측정된다. 상기 α-아밀라제 활성은 녹말이 덱스트린 상태로 되었음을 나타내는 색상의 변화에 요구되는 분해 시간이 따라 측정된다.

사용된 시약들은 다음과 같았다. : 포스페이트 완충액 - 포타슘 디하이드로겐 포스페이트(340g) 및 소듐 하이드록시드(25.3g)을 물에 용해시킨 후 약 2리터가 되도록 희석시켰다. 완충액을 실온으로 냉각시킨 후 pH를 6.2±0.1로 맞추었다. 상기 완충액을 용량 플라스크에서 2리터로 희석시켰다. 녹말 기질-가용성 린트너 녹말 (건조 기질) 10g을 50㎖ 물에 현탁시킨후 약 300㎖의 끓는 물로 세척시켰다. 현탁액을 계속 교반시키면서 5분 동안 끓였다. 상기 녹말 용액을 계속 교반시켜 실온으로 냉각시킨 후 125㎖의 포스페이트 완충액을 가하였다. 상기 용액을 물로써 500㎖로 희석시켰다. 녹말 기질은 사용할 때마다 신선한 상태로 공급된다. 스톡 요드 용액 - 요드 결정(5.5g) 및 포타슘 요드화물(11.0g)을 물에 용해시킨 후 용량이 250㎖가 되도록 희석시켰다. 상기 용액을 빛으로부터 차단시켰다. 요드 희석 용액 - 포타슘 요드화물(20g) 및 2㎖ 스톡 요드 용액을 물에 용해시킨후 용량이 500㎖가 되도록 희석시켰다. 상기 용액은 사용할 때마다 신선하게 공급된다. 효소 희석 용액 - 칼슘 클로라이드(11.1g)를 4리터의 물에 용해시켰다. 모든 시약에 사용된 물은 증류수 또는 탈염수이다.

미지의 α-아밀라제 샘플을 효소 희석 용액으로 10-15LU/㎖ (하기 정의된 바와 같이)로 희석시켰다. 시판되는 다수의 α-아밀라제 제조물에 대하여 적당한 희석율은 2000배인 것으로 밝혀졌다. 희석 요드 용액의 5 밀리리터 만큼의 분취량을 13×100㎜의 시험관에 넣은 후 녹말 기질 10㎖를 23×200㎜의 시험관에 넣었다. 시험관 모두를 30℃의 수조에 방치시켰다. 특정 α-아밀라제 색상 디스크(카타로그 번호 620-s5)가 장착된 Hellige 비교 측정기로 측정하였다. 상기 녹말 기질과 희석 효소 5㎖(30℃에서)를 혼합시킨 후 시간을 측정하기 시작하였다. 적당한 시간 간격, 예를 들어 반응 초기에는 1분의 시간 간격을 주고 반응 후기에는 15초의 간격을 주었다. 1㎖의 효소-기질 혼합물을 조절된 요드 희석 용액을 함유하는 튜브로 옮겼다. 상기 녹말 요드 용액을 혼합시켜 13㎟의 튜브로 옮긴 후 색상을 Hellige 비교 측정기에 장착된 표준적인 α-아밀라제 색상 디스크와 비교하였다. 종말점에 도달했을 때, 0.25분의 간격을 두고 샘플들을 취했다.

샘플의 색상 및 색상 디스크를 매치시키는 데에 필요한 시간을 기록한 후 활성 (그램당 또는 ㎖당 액화도)을 하기 식에 따라서 계산하였다.

LU/㎖ 또는 LU/g =

[상기 식중, LU = 액화 유니트, V = 효소 부피(5㎖), t = 덱스트린화 시간(분), D = 희석 인자 : 희석 부피 / 희석 효소 ㎖ 또는 g]

[실시예 2]

녹말 액화 조건

액화된 녹말 DE(덱스트로즈 당량) 측정

지름 24인치(0.21 inch i.d.)의 스테인레스 스틸 50 피트가 구부러져서 높이 약 5.5인치이고 지름 약 10인치인 코일로 구성된 반응기를 사용하여 녹말 액화 반응을 수행하였다. 상기 코일은 11.5 인치의 인-라인(in-line) 혼합기(Cole-Parmer # G-04669-60)에 전방 말단으로부터 약 4피트 떨어져서 장착되어 있다. 약 20psi의 크래킹 압력에서 상기 코일의 후방 말단은 Swagelok 인-라인 조절성 압력 안전 밸브(#SS-4CA-3)세트로 장착되었다. 녹말 슬러리를 상기 코일에 피스톤 계량 펌프를 사용하여 약 70㎖/분의 속도로 공급시켰다. 상기 코일은 105.5℃로 가열된 글리세를 수조에 침수시켜 가열하였다. 수조내 온도는 순환 가열기/온도 조절기를 사용하여 유지시켰다. [Fisher Scientific model 7305]

입자성 녹말을 곡물 습식 분쇄기로부터 얻어낸 후 2일 이내에 사용하였다. 다른 녹말 공급원으로서 본원에서 사용된, Hammond, Indiana 소재 American Maize-Products Company로부터 구입한 LO-DEX^TM10(곡물 녹말을 제한적으로 가수 분해시켜 제조한 수용성 정제 덱스트린)의 초기 DE는 약 9.5였다.

녹말 또는 말토덱스트린을 탈염수를 사용하여 바람직한 고체 수준인 약 30-35% dry solids까지 희석시킨 후 2.5%의 NaOH 또는 %의 HCI로 pH를 맞추었다. CaCl₂-2H₂O의 형태로 칼슘을 가하였다. 통상적인 액화 조건은 다음과 같았다:

녹말 또는 LO-DEX^TM1030-35% solids

칼슘40-60ppm (30ppm 가함)

pH5.0-6.0

α-아밀라제12-14LU/g 탄수화물 (drybasis)

녹말 또는 LO-DEX^TM10 함유 효소 및 CaCl₂-2H₂O 형태의 칼슘을 약 70㎖/min.으로 반응기내에 도입시켰다. 글리세롤 수조에 반응기를 침수시켜 반응기의 온도를 105.5℃로 유지시켰다. 녹말 샘플을 상기 반응기로부터 95℃의 제2 액화 수조로 옮긴후 90분 동안 방치시켰다.

녹말의 액화도는 Analytical Procedure Committe (1980) 사가 출판한 Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., 6판에 기재된 방법에 의하여 제 2 액화 단계 직후, 샘플의 덱스트로즈 당량(DE)을 측정하여 계산하였다.

[실시예 3]

피테이트의 HPLC 분석

HPLC (고성능 액체 크로마토그래피 : High Performance Liquid Chromatography)를 사용하여 하기와 같이 피테이트 분석을 실시하였다. Millipore/Waters로 구성된 HPLC 시스템, 모델 510 Waters Antomated Gradient Controller, Pros 20 pi/m 수지(PerSeptive Biosystems)로 패킹된 250×4.6㎜ 칼럼 및 Dionex 음이온 서프레서가 장착된 Dionex 유도율 검출기 및 Dionex SRS 조절기를 사용하였다. 시판되는 피테이트 샘플, 옥수수 글루텐 스트림으로부터 유도된 EIC, 분쇄된 옥수수, 침지, 분쇄된 밀가루, 분쇄된 쌀, 및 입자성 녹말로부터 얻은 EIC를 탈염수로 10-200㎎/L의 피테이트로 희석시킨 후 여과시켜 혹종의 불용성 물질을 제거하였다. 20-500㎖의 샘플(피테이트 농도에 의존성인)을 상기 칼럼에 주입시킨 후 1.3㎖/min.의 유속으로 2분 동안 상기 칼럼을 물로 세척시켰다. 2분후, NaOH를 유속 1.3㎖/min으로 20분에 걸쳐 0-40mM의 농도로 선상 구배를 걸어주었다.

15분후 상기 칼럼으로부터 피테이트가 용리되어 나왔다. 일련의 소듐 피테이트(Sigma Chemical Company, #P 8810) 희석액을 사용하여 유도율 검출기에 나타난 값을 측정하였다. 각각의 공금원으로부터 얻은 EIC는 시판되는 공업용 피테이트와 동일한 용리 피크를 보였다.

[실시예 4]

옥수수 글루텐 스트림으로부터 EIC의 분리

α-아밀라제를 저해시키거나 또는 불활성화시킨 조성물을 다음과 같은 옥수수 습식 분쇄 플랜트의 옥수수 배유 분획에서 생성된, 단백질이 풍부한 녹말 스트림(옥수수 글루텐 스트림이라 칭함)으로부터 분리하였다. 불용성 단백질 및 녹말 입자를 원심 분리(약 6000Xg에서 15분 동안)시켜 옥수수 글루텐 분획(약 18.6% solids)으로부터 분리시켰다. Whatman #3 요과지를 통하여 진공 여과법으로 상등액을 더욱 정화시켰다.

분자량 5000인 차단 폴리설폰 공동 섬유 카트리지(A/G Technology Corp., model UFP-5-D-4)를 사용하여 상기 여과액을 한외 여과법으로 분획시켰다. 1N의 NaOH를 가하여 한외 단계에서 얻은 약 1200㎖의 여과액의 pH를 9로 맞추었다. 원심 분리법 (약 6000Xg으로 10분 동안)으로 생성된 침전물을 회수한 후 물에서 재현탁시켜 세척시켰다.

원심 분리에 의하여 세척수로부터 침전물을 회수한 후, 침전물을 약 500㎖의 물에서 재현탁시킨 후 3M HCl을 적가시켜 pH를 서서히 5까지 상승시키면서 용해시켰다. Whatman #3 여과지를 통하여 용액을 여과하여 불용성 물질을 제거시킨 후 상기 여과액을 약 4℃까지 냉각시켰다. 상기 여과액을 2부피의 에탄올을 가한 후 (4℃) 결과로 생성된 침전물을 용융성 유리 필터를 통하여 여과시켜 회수하였다. 침전물을 냉 에탄올로 세척시킨 후, 회수하여 실온에서 진공하 건조시켰다.

EIC의 한외 여과 수율은 1200㎖였다.

[실시예 5]

저 pH에서 액화시 EIC에 의하여 α-아밀라제 저해

실시예 4에서와 같이 분리된 EIC (0-200㎎/L)를 50ppm 칼슘을 함유하는 35% LO-DEX^TM10(pH 5.2)에 가하였다. α-아밀라제 [SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에서 생성되며 캘리포니아 소재 South Sanfrancisco, GENENCOR International, Inc.에서 시판되는]를 12LU/g carbonate의 속도로 가한 후 2.5%의 NaOH 또는 6% HCl을 가하여 상기 용액의 pH를 맞추고 pH를 5.2로 유지시켰다. 실시예 2에 기술된 반응기 시스템을 사용하여 상기 용액을 가수 분해시켰다. 2차 방치후 즉시 LO-DEX^TM이 가수 분해된 정도를 덱스트로즈 당량에 의하여 측정하였다.

표 1은 α-아밀라제의 저해도가 증가되었음을 나타내는, EIC의 농도가 증가함에 따라 액화 LO-DEX^TM10(초기 DE 9.5)의 최종 DE가 감소되는 것을 나타낸다.

[표 1]

pH 5.2에서 LO-DEX^TM의 α-아밀라제 촉매하된 가수 분해에 대한 EIC의 효율

본 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, EIC가 존재하면 pH 5.2에서 α-아밀라제의 효율은 감소하게 된다.

[실시예 6]

α-아밀라제의 EIC저해에 대한 pH 의존성

실시예 4에서와 같이 분리된 EIC를 50ppm의 칼슘을 함유하는 35% LO-DEX^TM에 가한 후 pH를 약 6.0 또는 5.2로 맞추었다. α-아밀라제 [SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에서 생성되며 캘리포니아 소재 South Sanfrancisco, GENENCOR International, Inc.에서 시판되는]를 12LU/g carbonate의 속도로 가한 후 2.5%의 NaOH 또는 6% HCl을 가하여 상기 용액의 pH를 맞추고 pH를 5.2 또는 6.0으로 유지시켰다. 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 용액을 가수 분해 시켰다. EIC를 함유하지 않는 동일 조건의 대조구 샘플을 시험용 샘플과 함께 pH 5.2 및 pH 6.0에서 테스트하였다. 2차 방치후 즉시 LO-DEX^TM이 가수 분해된 정도를 덱스트로즈 당량에 의하여 측정하였다.

결과를 표 2에 나타내었다. 볼 수 있는 바와 같이, LO-DEX^TM10의 가수 분해시 EIC에 의한 α-아밀라제 저해도는 pH 의존성이었다. pH 6.0에서 200㎎/L의 EIC를 가하면 DE가 약 6%만이 감소되었다. pH 5.2에서 DE는 약 65%정도 감소하였다.

[표 2]

LO-DEX^TM10의 가수 분해시 α-아밀라제의 EIC 저해에 대한 pH의 효율.

[실시예 7]

EIC 원소 분석

실시예 4에서와 같이 원자 흡수 분광법에 의하여 옥수수 글루텐 분획물로부터 분리된 EIC를 원소 분석시켰다. [Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, TN] 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

EIC 원소 분석

상기 분석은 피트산의 마그네슘, 망간, 아연 또는 철 염 혼합물의 경우와 마찬가지였다. 결과적으로, EIC는 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 HPLC 분석에 의하여 피테이트 함량에 대하여 분석되었다. 상기 분석은 EIC의 음이온 성분이 실질적으로 피테이트로 구성되었다는 것을 나타낸다.

[실시예 8]

분쇄된 천연 옥수수로부터 EIC 분리

분쇄된 천연 옥수수 250g을 500g의 탈염수에 현탁시킨 후 6%의 HCl로 결과로 생성된 슬러리의 pH를 4로 맞추었다. 상기 슬러리를 약 8시간 동안 교반시킨후 약 10시간 동안 방치시켰다. Whatman #3 여과지상에서 여과시켜 상기 슬러리를 분리시킨 후 여과액 (약 310g)을 1M NaOH를 사용하여 pH를 9로 맞추었다. 생성된 침전물을 0.45m 멤브레인 필터로 여과시켜 회수한 후 물로 세척시켰다. 상기 침전물을 물에 현탁시켜 용액을 생성시킨 후 6%의 HCl을 서서히 가하여 pH를 5까지 맞추었다. 상기 용액을 여과시켜 혹종의 물질을 제거한 후 약 4℃로 냉각시켰다. 2부피의 냉 에탄올을 가한후 형성된 침전물을 원심 분리법으로 회수하였다. 침전물을 냉 에탄올로 한번 세척한 후 실온 및 진공하에서 밤새도록 건조시켰다.

분쇄된 천연산 옥수수 250g으로부터, EIC 0.772g을 회수하였다. 실시예 3에서와 같이 피테이트의 존부에 대한 HPLC 분석으로써 EIC를 확인하였다. 분리된 EIC를 pH 5.2에서 LO-DEX^TM10 액화 혼합물에 가하여 EIC를 동정하여 α-아밀라제가 저해되었는지 여부를 평가하였다.

분쇄된 천연 옥수수로부터 얻은 EIC(200㎎/L)를 50ppm의 칼슘 이온을 CaCl₂-2H₂O 형태로 함유하는 35% LO-DEX^TM10에 가한 후 pH를 약 5.0로 맞추었다. α-아밀라제 [SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에서 생성되며 캘리포니아 소재 South Sanfrancisco, GENENCOR International, Inc.에서 시판되는]를 12LU/g carbonate의 속도로 가한 후 2.5%의 NaOH 또는 6% HCl을 가하여 상기 용액의 pH를 5.2로 맞추었다. 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 용액을 가수 분해시켰다.

EIC를 함유하지 않는 동일 조건의 대조구 샘플을 시험용 샘플과 함께 pH 5.2에서 테스트하였다. 2차 방치후 즉시 LO-DEX^TM이 가수 분해된 정도를 덱스트로즈 당량에 의하여 측정하였다.

하기 표 4에 나타낸 실험 결과는 상기된 옥수수 글루텐 스트림으로부터 분리한 EIC를 사용한 경우 얻어진 결과와 동일하였다.

[표 4]

pH 5.2 에서 LO-DEX^TM10의 가수 분해시 α-아밀라제 안정성에 대한 분쇄된 천연 옥수수로부터 분리된 EIC의 효율.

실시예 3에서와 같이, 분쇄된 천연산 옥수수로부터 분리된 EIC에 대한 HPLC 분석을 수행하였다. 15㎎/L EIC 용액 100㎕를 HPLC 칼럼에 주입시켰더니, 피테이트 용리 시간에 따라서 측정된 오직 하나의 음이온 피크만이 물질에서 발견되었다. HPLC 곡선의 형태는 실질적으로 옥수수 글루텐 분획물에서 분리된 EIC의 곡선과 동일하였다.

[실시예 9]

옥수수 침지액으로부터 EIC의 분리

옥수수 습식 분쇄 공장에서 얻어진, 밀도 약 19 Be인 대량의 옥수수 침지액, 즉 증발된 침지액 농축물을 원심 분리에 의하여 정화시켰다.

1리터의 정화된 액체를 5M NaOH를 가하여 pH를 4.2로부터 8.1까지 맞추었다. 결과로 생성된 침전물을 원심 분리시켜 수집한 후, 물에 현탁시켜 상기 침전물을 세척시키고 다시 원심 분리시켜 수집하였다.

상기 침전물을 약 400㎖의 물에 현탁시킨 후 6%의 HCl을 가하여 상기 슬러리의 pH를 약 4로 맞추었다. 상기 침전물을 용해시킨 후 Whatman #3 여과지를 통하여 용액을 여과시켜 2부피의 흑종의 불용성 물질을 제거시키고 여과액을 약 4℃까지 냉각시켰다. 2부피의 얼음 냉각 에탄올을 가하여 용액으로부터 EIC를 침전시킨 후 원심 분리시켜 수집하였다. 침전물을 냉 에탄올로 한 번 세척시킨 후, 실온에서 원심 분리 및 진공 건조시켜 수집한다.

1리터의 대량 옥수수 침지액으로부터, 23.3g의 EIC를 회수하였다. pH 5.2 에서 LO-DEX^TM10를 가수 분해시켜 α-아밀라제 불활성도를 측정하고 피테이트에 대하여 HPLC 분석하여 EIC를 동정하였다.

α-아밀라제로써 액화시켜 옥수수 침지액으로부터 EIC 효율을 측정하기 위하여, 200㎎/L를 50ppm의 칼슘 이온을 CaCl₂-2H₂O의 형태로 함유하는 35% LO-DEX^TM10에 가한 후 pH를 약 5.2로 맞추었다. α-아밀라제 [SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에서 생성되며 캘리포니아 소재 South Sanfrancisco, GENENCOR International, Inc.에서 시판되는]를 12LU/g carbonate의 속도로 가한 후 2.5%의 NaOH 또는 6% HCl을 가하여 상기 용액의 pH를 5.2로 맞추었다. 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 용액을 가수 분해시켰다. EIC를 함유하지 않는 동일 조건의 대조구 샘플을 시험용 샘플과 함께 pH 5.2에서 테스트하였다. 2차 방치 후 즉시 LO-DEX^TM이 가수 분해된 정도를 덱스트로즈 당량에 의하여 측정하였다.

결과를 표 5에 나타내었다. 상기 결과들은 상기된 옥수수 글루텐 스트림으로부터 분리해낸 EIC를 사용할 때와 동일하였다.

[표 5]

pH 5.2 에서 LO-DEX^TM10의 가수분해시 α-아밀라제 안정성에 대한 옥수수 침지액으로부터 분리된 EIC의 효율.

옥수수 침지액으로부터 분리된 EIC의 HPLC 분석을 실시예 3에서와 같이 실시하였다. EIC 200㎎/L 용액 100㎕를 HPLC 칼럼으로 주입시켰더니 오로지 하나의 음이온성 피크만이 존재하였는데, 용리 시간으로써 물질내에 피테이트가 존재함을 발견하였다. HPLC 피크의 형태는 실질적으로 옥수수 글로텐 분획물로부터 분리된 EIC의 피크와 동일하였다.

[실시예 10]

입자성 옥수수 녹말내 EIC의 동정

옥수수 습식 분쇄기로부터 얻은 입자성 옥수수 녹말 슬러리를 Whatman #3 여과지를 통하여 여과시켜 상기 녹말 입자체로부터 물을 분리해 내었다. 입자성 녹말을 탈염수에 재현탁시킨 후 재여과시켜 흑종의 수불용성 성분을 상기 불용성 녹말로부터 분리하였다. 이후 입자성 녹말을 재현탁시킨 후 35% solids로 희석시켰다. 비. 라이커니포르미스에서 얻어진 α-아밀라제 (12LU/g carbohydrate) [SPEZYME AA20, GENENCOR International, Inc.에서 시판되는] 및 칼슘(50ppm)을 가한 후 실시예 32에서와 같이 입자성 녹말 슬러리를 pH 5.2에서 액화시켰다.

옥수수 녹말 슬러리의 1차 여과액으로부터 회수된 물을 사용하여 LO-DEX^TM10을 용해시켜 35%의 고체 용액을 생성하였다. α-아밀라제 (12LU/g carbohydrate) 및 CaCl₂-2H₂O (50ppm)으로서의 칼슘 이온을 가한 후 이 용액을 실시예 2에 기술된 바와 같이 pH 5.2에서 액화시켰다. LO-DEX^TM10을 함유하는 대조구 표본을, 옥수수 녹말로부터 얻은 여과액을 동시에 액화시키기 보다는, 탈염수에 용해시켰다.

HPLC에 의하여 피테이트의 존부를 분석하였더니 입자성 녹말 슬러리로부터 얻어진 여과액에서 EIC는 검출되지 않았다. 그러나, pH 6의 액화된 입자성 옥수수 녹말의 HPLC 분석에 의하여, 실시예 4의 옥수수 글루텐으로부터 분리된 EIC와 동일한 기질이 존재한다는 증거가 되는 용리 피크가 확인되었다. HPLC 분석은 액화된 입자성 녹말 30 중량 % 고체 1 리터당 피테이트 30-40㎎이 존재함을 보여주었다. 입자성 녹말 여과액과 혼합된 말토덱스트린내 α-아밀라제를 액화시킨 결과 및 탈염수와 혼합된 LO-DEX^TM10내 α-아밀라제를 비교한 결과 입자성 녹말에 존재하는 EIC는 세척으로써는 제거되지 않는다는 것을 확인하였다. 따라서, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 실험 결과는 녹말 액화시 α-아밀라제 불활성화된 관련 있는 EIC는 녹말 입자와 합체되어 있지, 용액내에 유리되어 있지는 않다는 것을 시사하는 것이었다.

[표 6]

세척된 옥수수 녹말 입자로부터 얻은 여과액으로 액화시킨 결과.

[실시예 11]

EIC의 피타제 불활성화

실시예 4에서와 같이 분리된 EIC 20㎖를 피타제 500 units [에이.피큠, Sigma Chemical Company, P 9792]로 pH 2.5, 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 상기 처리된 EIC 10㎖를 LO-DEX^TM10에 가하였더니 CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진 칼슘 이온 50 ppm 및 EIC 200㎎/L을 함유하는 35% LO-DEX^TM10 용액 1리터가 생성되었다. 비. 라이커니포르미스 (SPEZYME AA20, Genencor International, Inc. 시판)에서 유도된 α-아밀라제를 12LU/g carbohydrate의 속도로 가하여 상기 용액을 상기 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 pH 5.2에서 액화시켰다. EIC가 가하여지지 않은 LO-DEX^TM10으로 구성된 대조구 표본 및 200㎎/㎖의 처리되지 않은 EIC를 함유하는 LO-DEX^TM10을 동시에 액화시켰다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 피타제 처리는 EIC를 불활성화시켜 이것이 α-아밀라제의 활성을 저해시킨다.

[표 7]

α-아밀라제의 EIC 불활성화에 대한 피타제 처리

[실시예 12]

입자성 옥수수 녹말의 피타제 처리

피타제 (에이. 피큠 5㎖ 250 units/㎖, Sigma Chemical Co., MO., 제품 번호 P 9792)를 CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진 칼슘 이온 50 ppm를 함유하는 34% 입자성 옥수수 녹말 1리터에 가한 후 pH 4.0, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 이후 상기 입자성 녹말 슬러리의 pH를 pH 5.2 FH 맞추고 비. 라이커니포르미스 (SPEZYME AA20, Genencor International, Inc. 시판)을 상기 입자성 녹말 슬러리에 가하였다. 실시예 2에 기술된 반응기 시스템을 사용하여 상기 혼합물을 액화시켰다. 이와 동시에 피타제로 처리되지 않은 34% 입자성 옥수수 녹말 슬러리를 사용하여 pH 5.2 대조구를 액화시켰다.

두번째 실험에서는, 피타제 (밀로부터 추출함, Sigma Chemical Company P 1259, 160 units)를 pH 5.15, 55℃에서 6시간 동안 CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진 칼슘 이온 50 ppm를 함유하는 35% 입자성 옥수수 녹말 1리터와 함께 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅시킨 후 - 상기 입자성 녹말 슬러리의 pH를 5.5로 맞추고 비. 라이커니포르미스 (SPEZYME AA20, Genencor International 시판)에서 얻은 α-아밀라제 12LU/g carbohydrate을 상기 슬러리에 가하였다. 상기 혼합물을 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 액화시켰다. 피타제 처리하지 않은 입자성 옥수수 녹말 슬러리 35%를 사용하여 pH 5.5 대조구 샘플을 액화시켰다.

표 8에 나타낸 바와 같이, 액화시키기 위전에 입자성 옥수수 녹말을 피타제로 처리하면 낮은 pH에서 가수 분해하는 α-아밀라제의 능력을 증가시킨다.

[표 8]

저 pH 액화시 α-아밀라제 안정성에 대한 피타제의 효율

[실시예 13]

EIC 함유 말토덱스트린의 가열 여과 (heat filtration)

실시예 4에서와 같이 분리된 EIC (200㎎/L)를 CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진 칼슘 이온 50 ppm를 함유하는 35% LO-DEX^TM10에 가한 후 pH를 약 5.2로 맞추었다. 상기 용액을 2부분으로 나누었다. 한쪽 부분은 약 100℃로 가열시켰고 뜨거운 동안 Whatman #3 여과지를 통하여 진공 여과시켰다. α-아밀라제(비. 라이커니포르미스에 의하여 생성된 SPEZYME AA20, Genencor International, Inc. 시판)를 12LU/g carbohydrate의 속도로 각각의 용액에 가한 후 2.5% NaOH 또는 6% 각각의 용액의 pH를 5.2로 맞추었다. 각가그이 용액을 실시예 2에 기술된 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 가수 분해시켰다. 2차 방치후 즉시 상기 LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도는 덱스트로즈 당량(DE)으로써 측정하였다. 가수 분해전에 실시예 3에서와 같이 2가지 용액 모두에 대하여 분석을 실시하였다.

표 9에 나타낸 바와 같이, EIC-함유 LO-DEX^TM10를 약 100℃에서 여과시켜 약 75%의 EIC를 용액에서 분리하였다. 결과적으로, α-아밀라제가 조금 존재하는 용액은 pH 5.2에서 액화시 불활성화되었으며 결과로 생성된 가수 분해 물질의 DE는 실질적으로 그 이상이었다.

[표 9]

저 pH 액화시 α-아밀라제의 EIC 불활성화에 대한 가열 여과 효율

[실시예 14]

현미로부터 EIC 분리

Brown Basmati 쌀 (Lundburg Mills에서 시판됨)을 작은 커피 분쇄기를 사용하여 분쇄시켜 가루로 만들었다. 분쇄된 쌀 200g을 탈염수 500㎖에 가한 후 6%의 HCl로써 pH를 약 3으로 맞추었다. 상기 슬러리를 가끔씩 교반시키면서 30시간 동안 방치시킨 후 Whatman #3 여과지를 통하여 진공 여과하여 분획시켰다.

1M NaOH를 가하여 상기 여과액의 pH를 9까지 맞춘 후 원심 분리시켜 회수하였다. 상기 침전물을 물로 한 번 세척시키고, 원심 분리시켜 재회수한 후 물에 재현탁시켰다. 6% HCl을 적가하여 현탁액의 pH를 천천히 약 5까지 맞춘 후 상기 현탁액을 교반시켜 침전물을 용해시켰다. 용해되지 않은 물질을 5m 멤브레인 여과기를 통하여 여과시켜 분리시킨 후 상기 여과액을 약 4℃로 냉각시켰다. 냉 에탄올 2부피를 여과액에 가한 후 생성된 여과액을 원심 분리시켜 회수하였다. 상기 침전물을 냉 에탄올을 한번 세척시킨 후 실온에서 진공하여 건조시켰다.

분쇄된 쌀 200g으로 0.3571g EIC를 얻었다. pH 5.2에서 LO-DEX^TM가수 분해시의 α-아밀라제 불활성화 정도를 측정한 후 HPLC로써 피테이트를 분석하여 EIC를 동정하였다.

분쇄된 쌀로부터 얻은 EIC (200㎎/L)를 CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진 칼슘 이온 50 ppm를 함유하는 35% LO-DEX^TM10에 가한 후 pH를 약 5.2로 맞추었다. 비. 라이커니포르미스 (SPEZYME AA20, Genencor International, Inc. 시판)에서 유도된 α-아밀라제를 12LU/g carbohydrate의 속도로 가한 후 2.5% NaOH 또는 6% HCl을 가하여 pH를 5.2로 맞추었다. 실시예 2에서와 같은 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 상기 용액을 가수 분해시켰다. EIC를 함유하지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 조건의 대조구 샘플을 상기 테스트 샘플과 동시에 pH 5.2에서 수행시켰다. 2차 방치후 즉시 LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도를 덱스트로즈 당량으로써 측정하였다. 실험의 결과를 표 10에 나타내었다.

[표 10]

pH 5.2에서 LO-DEX^TM의 가수 분해시 α-아밀라제 안정도에 대한 분쇄된 쌀로부터 분리된 EIC의 효율

실시예 3에서와 같이 분쇄된 쌀로부터 분리된 EIC를 HPLC 분해시켰다. EIC의 15㎎/L 용액의 100㎕로 HPLC 칼럼으로 주입시켰더니, 상기 샘플에서는 용리 시간에 의하여 피테이트로서 동정되는 하나의 피크만이 나타났다. 상기 HPLC 형태는 실질적으로 옥수수 글루텐 분획물로부터 분리된 EIC와 동일하였다.

[실시예 15]

다량의 밀가루로부터 EIC의 분리

시판되는 대량의 밀가루(Arrowhead Mills) 200g을 12mM D, L-디티오트레이톨(Sigma Chemical Co.)을 함유하는 탈염수 500㎖에 가하였다. 6% HCl을 가하여 상기 슬러리의 pH를 약 3으로 맞춘 후 상기 슬러리를 때때로 교반시키면서 실온에서 약 30시간 동안 방치시켰다. 상기 슬러리를 원심 분리시켜 분획시켰다.

1M NaOH를 가하여 상기 여과액의 pH를 9로 맞춘 후 생성된 침전물을 원심 분리시켜 회수하였다. 상기 침전물을 물로 한 번 세척시킨 후, 원심 분리시켜 재회수한 후 물에 재현탁시켰다. 6% HCl을 적가하여 상기 현탁액의 pH를 서서히 약 5까지 맞춘 후 상기 현탁액을 교반시켜 상기 침전물을 용해시켰다. 용해되지 않은 물질은 5m 멤브레인 여과기를 통하여 여과시켜 제거시키고 여과액을 약 4℃로 냉각시켰다. 냉각 에탄올 2부피를 상기 여과액에 가한 후 형성된 침전물을 원심 분리시켜 회수하였다. 상기 침전물을 냉 에탄올로 한 번 세척시킨 후 실온, 진공하에서 건조시켰다.

대량의 밀가루 200g에서 EIC 수율은 0.385g이었다. pH 5.2에서 LO-DEX^TM10의 가수 분해시 α-아밀라제를 불활성화도를 측정하고 피테이트를 HPLC 분석시켜 EIC를 동정하였다.

대량의 밀가루로부터 얻은 EIC (150㎎/L)를 50 ppm의 칼슘을 함유하는 35% LO-DEX^TM10에 가한 후 pH를 약 5.2까지 맞추었다. 비. 라이커니포르미스 α-아밀라제(SPEZYME AA20, Genencor International, Inc.에서 시판)를 12LU/g carbohydrate의 속도로 가한 후 2.5% NaOH 또는 6% HCl을 가하여 용액의 pH를 약 5.2로 맞추었다. 실시예 2에서와 같은 반응기 시스템 및 방법을 사용하여 상기 용액을 가수 분해시켰다.

EIC를 함유하지 않는 대조구 샘플을 비교 샘플과 동일한 조건하에서 테스트하였다. LO-DEX^TM10의 가수 분해도는 2차 방치 직후의 덱스트로즈 당량(DE)으로써 측정하였다. 테스트 결과를 표 11에 나타냈다.

[표 11]

pH 5.2에서 LO-DEX^TM의 가수 분해시 α-아밀라제 안정도에 대한 밀가루로부터 분리된 EIC의 효율

실시예 3에서와 같이, 대량의 밀가루로부터 분리된 EIC를 HPLC 분석하였다. 15㎎/L EIC 용액 100㎕를 HPLC 칼럼에 주입시켰더니, 용리시간에 따른 피테이트로서 동정되는, 하나의 피크만이 관찰되었다. HPLC 그래프 형태는 실질적으로 옥수수 글루텐 분획물로부터 분리된 EIC의 그것과 동일하였다.

[실시예 16]

95℃까지 가열시켜 EIC를 침전시키는 방법

실시예 4에서와 같이 분리된 EIC (200㎎/L)를 50ppm의 칼슘 이온(CaCl₂-2H₂O의 형태로 가하여진)을 함유하는 35% w/w LO-DEX^TM10에 가한 후 2.5% NaOH를 가하여 pH를 5.2로 맞추었다. 상기 LO-DEX^TM10 용액을 2부분으로 나누었다. 일부분은 약 6분 동안 실시예 2에 기술된 반응기를 통과시켜 95℃까지 가열시켰다. 상기 반응기를 통과시킨 후, α-아밀라제(SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에 의하여 합성되며 Genencor International, Inc.)을 12LU/g carbohydrate의 속도로 가하였다. 이후 상기 용액을 95℃에서 90분 동안 인큐베이팅시켰다. LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도는 90분 인큐베이팅시킨 후 즉시 덱스트로즈 당량(DE)으로써 측정하였다.

EIC-함유 말토덱스트린 용액의 나머지 부분은 α-아밀라제 (SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에 의하여 합성되며 Genencor International, Inc.)를 가한 후 95℃에서 수행시킨다는 것을 제외하고 실시예 2에 기술된 바와 동일하게 반응기 시스템을 통과시켰다. 이후 용액을 90분 동안 95℃에서 인큐베이팅시켰다. LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도는 90분 인큐베이팅시킨 후 즉시 덱스트로즈 당량(DE)으로써 측정하였다. 이와 동시에, EIC를 함유하지 않는 동일 대조구 샘플을 pH 5.2에서 비교 테스트로서 수행하였다.

[표 12]

α-아밀라제의 EIC 불활성에 대한 가열의 효과

[실시예 17]

105.5℃까지 가열시켜 말토덱스트린으로부터 EIC 침전

실시예 4에서와 같이 분리한 EIC (200㎎/L)를 50 ppm의 칼슘 이온(CaCl₂2H₂O의 형태로 가하여짐)을 함유하는 35% w/w LO-DEX^TM10에 가한 후 2.5% NaOH를 가하여 pH를 5.2로 맞추었다. LO-DEX^TM10 용액을 2부분으로 나누었다. 일부는 약 6분 동안 실시예 2에 기술된 반응기를 통과시켜 105.5℃까지 가열시켰다. 상기 반응기에 통과시킨 후, α-아밀라제(SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에 의하여 합성되며 Genencor International, Inc.)를 12LU/g carbohydrate의 속도로 상기 용액에 가하였다. 이후 상기 용액을 90분 동안 95℃에서 인큐베이팅시켰다. 상기 LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도는 90분 동안의 인큐베이팅 직후 덱스트로즈 당량(DE)에 의하여 측정하였다.

EIC-함유 말토덱스트린 용액의 다른 부분은 α-아밀라제 (12LU/g carbohydrate, SPEZYME AA20, 비. 라이커니포르미스에 의하여 합성되며 Genencor International, Inc.)를 가하였고, 이후 실시예 2에서와 같이,105.5℃의 온도에서 반응기 시스템에 통과시켰다. 이후 상기 용액을 95℃에서 90분 동안 인큐베이팅시켰다. 상기 LO-DEX^TM10의 가수 분해 정도는 90분 동안의 인큐베이팅 직후 덱스트로즈 당량(DE)에 의하여 측정하였다. 비교하기 위하여, EIC를 함유하지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 조건의 대조구 샘플은 pH 5.2에서 이와 동시에 테스트하였다.

표 13에 나타낸, 상기 테스트의 결과는 액화시 EIC가 α-아밀라제를 불활성화시키는 능력은 α-아밀라제를 가하기 이전에 가열시킴으로써 감소될 수 있다는 것을 나타낸다.

[표 13]

저 pH 액화시 α-아밀라제의 EIC 불활성화에 대한 가열의 효과

LO-DEX^TM내 EIC가 존재하면 어떠한 EIC도 가하여지지 않았으며 열처리도 되지 않은 대조구 샘플과 비교할 때 EIC를 가하고 열 처리시킨 후에 관찰되는 DE가 증가한다고 사료된다.

물론, 상기 바람직한 구체예를 위하여 광범위의 변화와 수정이 가하여질 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 상기된 명세서 내용은 모든 균등 범위의 것을 포함하여, 본 발명의 범위를 한정하는 하기 청구 범위들을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

(a) 녹말을 액화시키기 이전에 또는 이와 동시에 상기 녹말을 처리하여 녹말에 존재하는 효소 저해 조성물을 불활성화 및/또는 제거시켜 처리된 녹말(treated starch)을 제조하는 단계;

(b) 상기 녹말에 α-아밀라제를 가하는 단계; 및

(c) 상기 처리된 녹말을 처리된 녹말이 효과적으로 액화되는 온도에서 1시간 동안 반응시키는 단계

를 포함하는 녹말 액화 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 피테이트 분해 활성을 포함하는 효소를 상기 녹말에 가하는 것을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 피테이트 분해 활성을 포함하는 효소가 상기 α-아밀라제와 동시에 가하여지는 방법.
제2항에 있어서, 피테이트 분해 활성을 포함하는 효소가 녹말 1g당 약 0.1-약 100 피타제 units의 농도로 가하여지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 약 80℃-약 150℃의 온도로 가열시킨후 α-아밀라제를 가하여 효소 저해 조성물을 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 원심 분리에 의하여 상기 효소 저해 조성물을 제거하는 것을 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 원심 분리가 수행된 이후 또는 이와 동시에 상기 녹말의 온도를 상승시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 상기 단계 (a)와 동시에 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)가 상기 단계 (a) 이후에 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)가 pH 6.0 미만에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)가 pH 약 4.5-약 5.7 사이에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)가 pH 약 4.5-약 5.7 사이에서 수행되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (a)를 수행하기 이전에, 약 60-약 90℃의 온도에서 α-아밀라제를 상기 녹말에 가하여 상기 녹말로부터 효소 저해 조성물을 방출시키는 방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 (a)가 열 처리 이후 상기 α-아밀라제를 가하고 상기 녹말을 상기 효소 저해 조성물을 불활성화시키기에 충분한 온도에서 1시간 동안 가열시켜 상기 녹말로부터 효소 저해 조성물을 방출시키는 것을 포함하는 방법.
효소 저해 조성물을 가수 분해 효소를 포함하는 수성 혼합물을 가하는 것을 포함하는 가수 분해 효소를 불활성화시키는 방법.
제13항에 있어서, 상기 가수 분해 효소가 α-아밀라제를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 효소 저해 조성물이 피테이트 또는 이의 염을 포함하는 방법.
pH 5.0 미만이며, 효소 저해 조성물이 실질적으로 존재하지 않는, α-아밀라제 및 수성 녹말의 혼합물을 포함하는 물질의 조성물.