JP2000197491A - 枯草菌／大腸菌シャトルベクター - Google Patents
枯草菌／大腸菌シャトルベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 突然変異と発現のための枯草菌／大腸菌シャ
トルベクターを提供すること。 【解決手段】 構造遺伝子から調節配列を物理的に分離
することにより大腸菌内でクローン化した遺伝子の発現
を不可能にし、また枯草菌中でクローン化した遺伝子の
発現を１種の制限酵素による消化及びその後の再環状化
により回復することのできる枯草菌／大腸菌シャトルベ
クター。
トルベクターを提供すること。 【解決手段】 構造遺伝子から調節配列を物理的に分離
することにより大腸菌内でクローン化した遺伝子の発現
を不可能にし、また枯草菌中でクローン化した遺伝子の
発現を１種の制限酵素による消化及びその後の再環状化
により回復することのできる枯草菌／大腸菌シャトルベ
クター。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作技術分野
に関し、α−アミラーゼ活性を持つ酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を含む新しいＤＮＡ分子に関する。具体的に
は、澱粉の分解や繊維の糊抜き、他の工業的工程の使用
に優れた特長を有する細菌由来突然変異体α−アミラー
ゼが開示される。この開示されたα−アミラーゼは温
度、酸及びアルカリに対し高い安定性を示し、それによ
り今まで使われなかった工程においても理想的に適した
活性を示すことができる。
に関し、α−アミラーゼ活性を持つ酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を含む新しいＤＮＡ分子に関する。具体的に
は、澱粉の分解や繊維の糊抜き、他の工業的工程の使用
に優れた特長を有する細菌由来突然変異体α−アミラー
ゼが開示される。この開示されたα−アミラーゼは温
度、酸及びアルカリに対し高い安定性を示し、それによ
り今まで使われなかった工程においても理想的に適した
活性を示すことができる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】澱粉は
アミロース（１５−３０％重量／重量）と、アミロペク
チン（７０−８５％重量／重量）の混合物からなる。ア
ミロースは約６００００から８０００００の分子量を持
つ直鎖のα−１、４−結合グルコース単位から成る。ア
ミロペクチンは、２４−３０グルコース単位ごとにα−
１、６分岐点をもつ分岐状高分子であり、分子量は１億
に達すると思われる。澱粉由来の糖は、濃縮ブドウ糖シ
ロップの形で、現在、(1)α−アミラーゼを用い固体澱
粉を平均約７−１０の重合度を持つデキストリンへ液化
（または稀薄化(thinning)）する工程、及び(2)生じた
液化澱粉（すなわち澱粉水解物）をアミログルコシダー
ゼ（グルコアミラーゼまたはＡＧと呼ぶ）を用いて糖化
する工程を含む酵素触媒方法で生産されている。生じた
シロップは高濃度のブドウ糖を含む。工業的に生産した
ブドウ糖シロップの多くは次に酵素的にイソシロップと
いうブドウ糖／フルクトースの混合物へと異性化され
る。αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）は、澱粉と
グリコーゲン、類縁の多糖類を内部のα−１、４−グル
コシド結合を不規則に切断することによって加水分解す
る。この酵素は、例えば糖、醸造、アルコール、繊維産
業などにおいて多数の重要な工業的応用が図られてい
る。α−アミラーゼは、種々の細菌、真菌類、植物、動
物から単離される。工業的に最も重要なα−アミラーゼ
は枯草菌(Bacilli)から単離されるものである。澱粉の
加水分解過程の第一段階では、澱粉スラリーは比較的高
い温度（１１０度）まで熱することによりゼラチン化す
る。ゼラチン化した澱粉は、連続した２段階の工程で熱
に安定なα−アミラーゼにより液化されデキストリン化
される。主要な変動因子は澱粉濃度、α−アミラーゼ
量、温度そしてpHである。液化−デキストリン化反応で
は良い転換比率を得るために変動因子を狭い範囲に保つ
必要がある。さもなくば濾過の際重大な問題を生じるか
らである。例えば、コッカー(L. E. Coker)とフェンカ
ッタズブラマニアン(K.Venkatasubramanian)、バイオテ
クノロジー、１６５−１７１頁、シェレミシノフ(P. N.
Cheremisinoff)、ケレット(P. B. Quellette)編、テク
ニコム出版（株）ランカスター、１９８５年）参照。頻
繁に生じる問題の１つは分解過程の初期段階の適当な温
度調節である。すなわち過熱によりα−アミラーゼが変
性し最終の稀薄化が不充分になる。これを防ぐ１つの方
法は、さらに高い熱安定性のα−アミラーゼを用いるこ
とである。
アミロース（１５−３０％重量／重量）と、アミロペク
チン（７０−８５％重量／重量）の混合物からなる。ア
ミロースは約６００００から８０００００の分子量を持
つ直鎖のα−１、４−結合グルコース単位から成る。ア
ミロペクチンは、２４−３０グルコース単位ごとにα−
１、６分岐点をもつ分岐状高分子であり、分子量は１億
に達すると思われる。澱粉由来の糖は、濃縮ブドウ糖シ
ロップの形で、現在、(1)α−アミラーゼを用い固体澱
粉を平均約７−１０の重合度を持つデキストリンへ液化
（または稀薄化(thinning)）する工程、及び(2)生じた
液化澱粉（すなわち澱粉水解物）をアミログルコシダー
ゼ（グルコアミラーゼまたはＡＧと呼ぶ）を用いて糖化
する工程を含む酵素触媒方法で生産されている。生じた
シロップは高濃度のブドウ糖を含む。工業的に生産した
ブドウ糖シロップの多くは次に酵素的にイソシロップと
いうブドウ糖／フルクトースの混合物へと異性化され
る。αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）は、澱粉と
グリコーゲン、類縁の多糖類を内部のα−１、４−グル
コシド結合を不規則に切断することによって加水分解す
る。この酵素は、例えば糖、醸造、アルコール、繊維産
業などにおいて多数の重要な工業的応用が図られてい
る。α−アミラーゼは、種々の細菌、真菌類、植物、動
物から単離される。工業的に最も重要なα−アミラーゼ
は枯草菌(Bacilli)から単離されるものである。澱粉の
加水分解過程の第一段階では、澱粉スラリーは比較的高
い温度（１１０度）まで熱することによりゼラチン化す
る。ゼラチン化した澱粉は、連続した２段階の工程で熱
に安定なα−アミラーゼにより液化されデキストリン化
される。主要な変動因子は澱粉濃度、α−アミラーゼ
量、温度そしてpHである。液化−デキストリン化反応で
は良い転換比率を得るために変動因子を狭い範囲に保つ
必要がある。さもなくば濾過の際重大な問題を生じるか
らである。例えば、コッカー(L. E. Coker)とフェンカ
ッタズブラマニアン(K.Venkatasubramanian)、バイオテ
クノロジー、１６５−１７１頁、シェレミシノフ(P. N.
Cheremisinoff)、ケレット(P. B. Quellette)編、テク
ニコム出版（株）ランカスター、１９８５年）参照。頻
繁に生じる問題の１つは分解過程の初期段階の適当な温
度調節である。すなわち過熱によりα−アミラーゼが変
性し最終の稀薄化が不充分になる。これを防ぐ１つの方
法は、さらに高い熱安定性のα−アミラーゼを用いるこ
とである。
【０００３】そのためにカルシウムイオンや両親媒性化
合物（例えばＥＰ−Ａ−０１８９８３８参照）を加える
ことが提案されてきた。しかしこの解決法は不満足な結
果に終わったようである。従ってなおさら本質的に、よ
り高い熱安定性をもったα−アミラーゼを用いることに
興味がもたれる。 関連文献 ＥＰ−Ａ−０５７９７６では、熱安定なバチルス
（Ｂ）．ステアロテモルフィルスからのα−アミラーゼ
をコードする遺伝子の単離、そしてその遺伝子は枯草菌
または大腸菌の複製開始部位を含むプラスミドに組み込
んであることについて述べている。α−アミラーゼを産
生するのにそのようなキメラのプラスミドが用いられ
る。該α−アミラーゼ遺伝子は、単離後修飾を施さずに
使われた。ＥＰ−Ａ−０１３４０４８では、工業的に用
いられる枯草菌株の１つ以上のα−アミラーゼ遺伝子を
クローン化し発現することにより、α−アミラーゼをと
りわけ工業的に多量に生産する方法について述べてい
る。ＥＰ−Ａ−２５２６６６では、一般にＱ−Ｒ−Ｌと
書かれるキメラのα−アミラーゼについて説明してい
る。（式中、Ｑは、Ｂ．アミロリクエファシエンス由来
のα−アミラーゼのＮ末３７個のアミノ酸残基と最低７
５％一致するＮ末の５５から６０個のアミノ酸残基を示
し、Ｒは付け加えられたポリペプチドを示し、ＬはＢ．
リケニホルミスのα−アミラーゼのＣ末３９５個のアミ
ノ酸残基と最低７５％のホモロジーをもつ３９０から４
００個からなるＣ末のポリペプチドを示す）。
合物（例えばＥＰ−Ａ−０１８９８３８参照）を加える
ことが提案されてきた。しかしこの解決法は不満足な結
果に終わったようである。従ってなおさら本質的に、よ
り高い熱安定性をもったα−アミラーゼを用いることに
興味がもたれる。 関連文献 ＥＰ−Ａ−０５７９７６では、熱安定なバチルス
（Ｂ）．ステアロテモルフィルスからのα−アミラーゼ
をコードする遺伝子の単離、そしてその遺伝子は枯草菌
または大腸菌の複製開始部位を含むプラスミドに組み込
んであることについて述べている。α−アミラーゼを産
生するのにそのようなキメラのプラスミドが用いられ
る。該α−アミラーゼ遺伝子は、単離後修飾を施さずに
使われた。ＥＰ−Ａ−０１３４０４８では、工業的に用
いられる枯草菌株の１つ以上のα−アミラーゼ遺伝子を
クローン化し発現することにより、α−アミラーゼをと
りわけ工業的に多量に生産する方法について述べてい
る。ＥＰ−Ａ−２５２６６６では、一般にＱ−Ｒ−Ｌと
書かれるキメラのα−アミラーゼについて説明してい
る。（式中、Ｑは、Ｂ．アミロリクエファシエンス由来
のα−アミラーゼのＮ末３７個のアミノ酸残基と最低７
５％一致するＮ末の５５から６０個のアミノ酸残基を示
し、Ｒは付け加えられたポリペプチドを示し、ＬはＢ．
リケニホルミスのα−アミラーゼのＣ末３９５個のアミ
ノ酸残基と最低７５％のホモロジーをもつ３９０から４
００個からなるＣ末のポリペプチドを示す）。
【０００４】グレイらは（ジャーナル オブ バクテリ
オロジー、１６６号、６３５頁、１９８６年）Ｂ．ステ
アロテルモルフィルスのα−アミラーゼのアミノ末端部
位とＢ．リケニフォルミスのα−アミラーゼのＣ末端部
位からなるキメラα−アミラーゼについて報告してい
る。ほとんどのハイブリッド酵素は親株の酵素より不安
定であることが示されている。さらにいずれのハイブリ
ッド酵素についても、より高い安定性を有することは示
されていない。上に利用した関連文献のうち新規なα−
アミラーゼを得るために単一アミノ酸置換を利用したも
のは全くない。ＥＰ−Ａ−０２８５１２３は、塩基配列
の完全な突然変異の方法を開示している。Ｂ．ステアロ
テルモフィルスのα−アミラーゼが突然変異の例として
説明されている。この方法はこれまでより高い安定性を
もつＢ．ステアロモルフィルスのα−アミラーゼの変異
体を得るのに用いることができると示唆しているが、例
はあげられていない。
オロジー、１６６号、６３５頁、１９８６年）Ｂ．ステ
アロテルモルフィルスのα−アミラーゼのアミノ末端部
位とＢ．リケニフォルミスのα−アミラーゼのＣ末端部
位からなるキメラα−アミラーゼについて報告してい
る。ほとんどのハイブリッド酵素は親株の酵素より不安
定であることが示されている。さらにいずれのハイブリ
ッド酵素についても、より高い安定性を有することは示
されていない。上に利用した関連文献のうち新規なα−
アミラーゼを得るために単一アミノ酸置換を利用したも
のは全くない。ＥＰ−Ａ−０２８５１２３は、塩基配列
の完全な突然変異の方法を開示している。Ｂ．ステアロ
テルモフィルスのα−アミラーゼが突然変異の例として
説明されている。この方法はこれまでより高い安定性を
もつＢ．ステアロモルフィルスのα−アミラーゼの変異
体を得るのに用いることができると示唆しているが、例
はあげられていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明では、変異体α−
アミラーゼ及びその様な異変体の生産方法について述べ
る。該変異体α−アミラーゼは野生型α−アミラーゼと
少なくともアミノ酸１つが異なることを特徴とする。さ
らに、これらの変異体をコードするＤＮＡと、これらの
ＤＮＡを発現可能な形で含むベクター、及び該ベクター
を含む宿主細胞について報告する。本発明の第一の態様
として、クローン化されたα−アミラーゼ遺伝子の不規
則突然変異が開示される。該変異遺伝子は、適当なベク
ター系を用いて適したホストの細菌中で発現させる。発
明の第２の態様として、変異体α−アミラーゼをスクリ
ーニングする方法を説明し応用する。該方法は、より熱
安定でより酸耐性のα−アミラーゼを産生する。さら
に、この方法は、わずかに修正することによりアルカリ
耐性のα−アミラーゼを得るのにも用いられる。そのよ
うに検出されたクローンの発現産物は、単離、精製され
る。本発明の第三の態様として、熱安定性が上昇し、こ
れら変異体α−アミラーゼを澱粉分解に用いる条件下で
の濾過の問題を減少させたαアミラーゼが提供される。
アミラーゼ及びその様な異変体の生産方法について述べ
る。該変異体α−アミラーゼは野生型α−アミラーゼと
少なくともアミノ酸１つが異なることを特徴とする。さ
らに、これらの変異体をコードするＤＮＡと、これらの
ＤＮＡを発現可能な形で含むベクター、及び該ベクター
を含む宿主細胞について報告する。本発明の第一の態様
として、クローン化されたα−アミラーゼ遺伝子の不規
則突然変異が開示される。該変異遺伝子は、適当なベク
ター系を用いて適したホストの細菌中で発現させる。発
明の第２の態様として、変異体α−アミラーゼをスクリ
ーニングする方法を説明し応用する。該方法は、より熱
安定でより酸耐性のα−アミラーゼを産生する。さら
に、この方法は、わずかに修正することによりアルカリ
耐性のα−アミラーゼを得るのにも用いられる。そのよ
うに検出されたクローンの発現産物は、単離、精製され
る。本発明の第三の態様として、熱安定性が上昇し、こ
れら変異体α−アミラーゼを澱粉分解に用いる条件下で
の濾過の問題を減少させたαアミラーゼが提供される。
【０００６】本発明の第４の態様として、酸耐性が上昇
し、マルチュロースなどの好ましくない副産物の生成を
減少させ、それと同時にアミログルコシダーゼとの反応
の前に加える酸の量を減少させたα−アミラーゼが提供
される。新しいα−アミラーゼは、熱安定性と酸耐性の
点で、あるいは熱安定とアルカリ耐性の点で好ましくは
両者の優れた性質を有する。本発明の第５の態様として
は、変異蛋白が澱粉の液化に用いる条件下でより良い効
率を示すことである。該アルカリ耐性は特に繊維糊抜き
への応用に有用である。これらの点は後述する発明の開
示と実施例でさらに説明される。
し、マルチュロースなどの好ましくない副産物の生成を
減少させ、それと同時にアミログルコシダーゼとの反応
の前に加える酸の量を減少させたα−アミラーゼが提供
される。新しいα−アミラーゼは、熱安定性と酸耐性の
点で、あるいは熱安定とアルカリ耐性の点で好ましくは
両者の優れた性質を有する。本発明の第５の態様として
は、変異蛋白が澱粉の液化に用いる条件下でより良い効
率を示すことである。該アルカリ耐性は特に繊維糊抜き
への応用に有用である。これらの点は後述する発明の開
示と実施例でさらに説明される。
【０００７】
【発明の実施の形態】本説明中、「変異体α−アミラー
ゼ」に関連して「性質が向上した」と呼ぶ場合、高い酵
素活性、または澱粉液化、繊維の糊抜き、または他の工
業的生産への応用での条件下で長い半減期を有するα−
アミラーゼを意味する。「高い熱安定性」を有すると
は、変異体酵素が高い温度の工程で活性を保持する、あ
るいはその変異体酵素が由来する野生型の酵素より、同
じ酵素においてより長時間活性を保持することを意味す
る。「高い酸（あるいはアルカリ）安定性」を持つと
は、変異体酵素がより低い（あるいは高い）pH値でその
野生型の酵素より高い活性を示すことを意味する。向上
した性質は１つか２つのアミノ酸の置換により生じたも
のであることを理解すべきである。染色体ＤＮＡはα−
アミラーゼを含む微生物から単離できる。好ましくは枯
草菌属に属する細菌、さらに好ましくはバチルス リケ
ニホルミス、さらに好ましくはバチルス リケニホルミ
ス Ｔ５を用いる（ＥＰ−Ａ−１３４０４８参照）。染
色体ＤＮＡは適当な制限酵素で消化し、ベクターにクロ
ーン化した。クローンの選択にはハイブリダイゼイショ
ン、免疫学的検出、酵素活性など多くの方法を用いるこ
とができる。制限酵素消化した染色体ＤＮＡをクローニ
ングするのに用いるベクターの選択は、使用可能なクロ
ーン選択の方法に依存する。もしハイブリダイゼイショ
ンを用いるなら何も注意は必要でない。しかし、もし検
出が免疫学的なものまたは酵素活性に基づいたものであ
るならベクターは適当な発現シグナルを含んでいなけれ
ばならない。α−アミラーゼを含むクローンの実際の検
出は、澱粉を含む寒天プレート上で行った。ヨード蒸気
存在下で増殖、培養した後ポジティブクローンの周りち
ハロー(halo)が検出される。次の段階として遺伝子の配
列を決定する。そこから得られたアミノ酸配列を、重要
なアミノ酸についての最初の情報を得るために他の既知
のα−アミラーゼの配列と比較するのに用いる（例 活
性部位、Ｃａ2+結合、Ｓ−Ｓ結合の可能性など）。３次
元構造を決定するとさらに詳しい情報が得られる。これ
はしばしば手間がかかるので他の方法が用いられる。３
次元構造がなくとも２次元構造要素（例、α−ヘリック
ス、β−シート）を決定する予測プログラムをうまく用
い最終的に３次元構造要素、例えばベータバレル（β−
barrel）を決定できる。総説としジャニンとオダック、
プログレス イン バイオフィジックス アンド モレ
キュラーバイオロジー、４２巻、２１−７８頁、１９８
３年がある。
ゼ」に関連して「性質が向上した」と呼ぶ場合、高い酵
素活性、または澱粉液化、繊維の糊抜き、または他の工
業的生産への応用での条件下で長い半減期を有するα−
アミラーゼを意味する。「高い熱安定性」を有すると
は、変異体酵素が高い温度の工程で活性を保持する、あ
るいはその変異体酵素が由来する野生型の酵素より、同
じ酵素においてより長時間活性を保持することを意味す
る。「高い酸（あるいはアルカリ）安定性」を持つと
は、変異体酵素がより低い（あるいは高い）pH値でその
野生型の酵素より高い活性を示すことを意味する。向上
した性質は１つか２つのアミノ酸の置換により生じたも
のであることを理解すべきである。染色体ＤＮＡはα−
アミラーゼを含む微生物から単離できる。好ましくは枯
草菌属に属する細菌、さらに好ましくはバチルス リケ
ニホルミス、さらに好ましくはバチルス リケニホルミ
ス Ｔ５を用いる（ＥＰ−Ａ−１３４０４８参照）。染
色体ＤＮＡは適当な制限酵素で消化し、ベクターにクロ
ーン化した。クローンの選択にはハイブリダイゼイショ
ン、免疫学的検出、酵素活性など多くの方法を用いるこ
とができる。制限酵素消化した染色体ＤＮＡをクローニ
ングするのに用いるベクターの選択は、使用可能なクロ
ーン選択の方法に依存する。もしハイブリダイゼイショ
ンを用いるなら何も注意は必要でない。しかし、もし検
出が免疫学的なものまたは酵素活性に基づいたものであ
るならベクターは適当な発現シグナルを含んでいなけれ
ばならない。α−アミラーゼを含むクローンの実際の検
出は、澱粉を含む寒天プレート上で行った。ヨード蒸気
存在下で増殖、培養した後ポジティブクローンの周りち
ハロー(halo)が検出される。次の段階として遺伝子の配
列を決定する。そこから得られたアミノ酸配列を、重要
なアミノ酸についての最初の情報を得るために他の既知
のα−アミラーゼの配列と比較するのに用いる（例 活
性部位、Ｃａ2+結合、Ｓ−Ｓ結合の可能性など）。３次
元構造を決定するとさらに詳しい情報が得られる。これ
はしばしば手間がかかるので他の方法が用いられる。３
次元構造がなくとも２次元構造要素（例、α−ヘリック
ス、β−シート）を決定する予測プログラムをうまく用
い最終的に３次元構造要素、例えばベータバレル（β−
barrel）を決定できる。総説としジャニンとオダック、
プログレス イン バイオフィジックス アンド モレ
キュラーバイオロジー、４２巻、２１−７８頁、１９８
３年がある。
【０００８】重要なアミノ酸の置換を予想することがで
きる。蛋白質の構造の安定性はタンパク質の折りたたま
れた部分と伸びた部分の間の自由エネルギーの合計差に
より決定される。プロリン残基は他のアミノ酸よりとれ
る構造が限られているのでアミノ酸残基がプロリンに置
換されているときには蛋白質を伸ばそうとする空間配置
上のエントロピーは減少する（そしてそれにより安定性
は上昇する）。別の有用な置換はグリシンをアラニンに
置換することである。分枝したβ−炭素を持つトレオニ
ン、バリン、イソロイシンなどの残基は分枝していない
残基よりも骨格のコンフォメーションを制限する。ある
種の蛋白の熱安定性は部分的には塩橋によるのでリジン
とアルギニン残基を導入することは有用かもしれない
（トモジックとクリバノフ、ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー、２６３巻、３０９２−３０９
６頁、１９８８年）。さらにアルギニンは新たな水素結
合を形成することができるのでリジンをアルギニン残基
で置換することにより塩橋の安定性を高めるかもしれな
い。総説としてウイグビーら、バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチコミュニケーションズ、
１４９巻、９２７−９２９頁、１９８７年 参照。アス
パラギンとグルタミンの脱アミド化は酵素の構造を大幅
に破壊すると言われているので非アミド残基への置換は
このような破壊を防ぐかもしれない。アミノ酸の置換は
ＤＮＡレベルでの突然変異により最もうまくできる。原
則的に突然変異実験は単離したクローンに対しても即座
に行うことができる。しかし、挿入配列は突然変異／発
現ベクターにクローン化する方が好ましい。ランダム突
然変異は可能であり、また部位限定突然変異(site-dire
cted mutagenesis)もまた可能である。前者の方法によ
ると突然変異をおこしたクローンは莫大な数に上ること
を考慮し、また部位限定突然変異について経験に基づき
推測することができるα−アミラーゼの３次元構造は知
られていないので、特定の部位においてランダム突然変
異を行うことを決定した。
きる。蛋白質の構造の安定性はタンパク質の折りたたま
れた部分と伸びた部分の間の自由エネルギーの合計差に
より決定される。プロリン残基は他のアミノ酸よりとれ
る構造が限られているのでアミノ酸残基がプロリンに置
換されているときには蛋白質を伸ばそうとする空間配置
上のエントロピーは減少する（そしてそれにより安定性
は上昇する）。別の有用な置換はグリシンをアラニンに
置換することである。分枝したβ−炭素を持つトレオニ
ン、バリン、イソロイシンなどの残基は分枝していない
残基よりも骨格のコンフォメーションを制限する。ある
種の蛋白の熱安定性は部分的には塩橋によるのでリジン
とアルギニン残基を導入することは有用かもしれない
（トモジックとクリバノフ、ジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー、２６３巻、３０９２−３０９
６頁、１９８８年）。さらにアルギニンは新たな水素結
合を形成することができるのでリジンをアルギニン残基
で置換することにより塩橋の安定性を高めるかもしれな
い。総説としてウイグビーら、バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチコミュニケーションズ、
１４９巻、９２７−９２９頁、１９８７年 参照。アス
パラギンとグルタミンの脱アミド化は酵素の構造を大幅
に破壊すると言われているので非アミド残基への置換は
このような破壊を防ぐかもしれない。アミノ酸の置換は
ＤＮＡレベルでの突然変異により最もうまくできる。原
則的に突然変異実験は単離したクローンに対しても即座
に行うことができる。しかし、挿入配列は突然変異／発
現ベクターにクローン化する方が好ましい。ランダム突
然変異は可能であり、また部位限定突然変異(site-dire
cted mutagenesis)もまた可能である。前者の方法によ
ると突然変異をおこしたクローンは莫大な数に上ること
を考慮し、また部位限定突然変異について経験に基づき
推測することができるα−アミラーゼの３次元構造は知
られていないので、特定の部位においてランダム突然変
異を行うことを決定した。
【０００９】次に示すのは本発明を実行するための可能
な方法である。始めに遺伝子は「サイレント」制限酵素
切断部位の導入を行うことにより修飾する。非サイレン
ト切断部位の導入も可能である。このことにより遺伝子
の特定の部位を欠損させることができる。２番目に遺伝
子はファスミドにクローニングする。このファージとプ
ラスミドの結合により１本鎖のＤＮＡを産生することが
容易になる。１本鎖ＤＮＡを得る他の方法も可能であ
る。解離した２本鎖のベクター（挿入断片を含む）ＤＮ
Ａを挿入断片にギャップの入ったベクター／挿入断片の
結合体とハイブリダイゼイションすることにより、ギャ
ップの入ったヘテロ２本鎖ＤＮＡが得られた（詳しくは
森永ら、バイオテクノロジー、２巻、６３６頁、１９８
４年）。ギャップは化学的あるいは酵素による突然変異
においても用いられる。好ましくは我々はの用いた重亜
硫酸法（フォークとホフステッター、セル、３３巻、５
８５頁、１９８３年）と酵素的な偽導入(misincorporat
ion)法である（レートバアラら、プロテインエンジニア
リング、２巻、６３頁、１９８８年）である。これらの
方法はギャップ中の全ての１つのヌクレオチドを他の３
つのヌクレオチド全てと置換する（飽和突然変異）様に
行うことができる。後者の方法は数種の方法に応用する
ことができる。そのうちの一つは合成プライマーをギャ
ップとハイブリダイズする方法である。ついでプライマ
ーから３’側の最初のデオキシヌクレオチドに相補的な
デオキシヌクレオチドが欠けている部分において伸長反
応を行う。原則的に３つのデオキシヌクレオチド全てを
このように導入することができる。このことは３つのデ
オキシヌクレオチドの混合物を用いることにより、ある
いは１つのヌクレオチドを含む３つの別々の反応を用い
ることにより達成される。その方法を応用した別の方法
によりランダムクローンが得られる。つまりそれぞれ１
つの限られた量のデオキシヌクレオチドを含む４つの別
々の反応を行う。この方法により各１つのヌクレオチド
の前で止まる２番目の鎖を得ることができる。次の段階
は前述したように行うことができる。重亜硫酸法と酵素
的突然変異の方法の両者を変異体を得るのに用いた。
な方法である。始めに遺伝子は「サイレント」制限酵素
切断部位の導入を行うことにより修飾する。非サイレン
ト切断部位の導入も可能である。このことにより遺伝子
の特定の部位を欠損させることができる。２番目に遺伝
子はファスミドにクローニングする。このファージとプ
ラスミドの結合により１本鎖のＤＮＡを産生することが
容易になる。１本鎖ＤＮＡを得る他の方法も可能であ
る。解離した２本鎖のベクター（挿入断片を含む）ＤＮ
Ａを挿入断片にギャップの入ったベクター／挿入断片の
結合体とハイブリダイゼイションすることにより、ギャ
ップの入ったヘテロ２本鎖ＤＮＡが得られた（詳しくは
森永ら、バイオテクノロジー、２巻、６３６頁、１９８
４年）。ギャップは化学的あるいは酵素による突然変異
においても用いられる。好ましくは我々はの用いた重亜
硫酸法（フォークとホフステッター、セル、３３巻、５
８５頁、１９８３年）と酵素的な偽導入(misincorporat
ion)法である（レートバアラら、プロテインエンジニア
リング、２巻、６３頁、１９８８年）である。これらの
方法はギャップ中の全ての１つのヌクレオチドを他の３
つのヌクレオチド全てと置換する（飽和突然変異）様に
行うことができる。後者の方法は数種の方法に応用する
ことができる。そのうちの一つは合成プライマーをギャ
ップとハイブリダイズする方法である。ついでプライマ
ーから３’側の最初のデオキシヌクレオチドに相補的な
デオキシヌクレオチドが欠けている部分において伸長反
応を行う。原則的に３つのデオキシヌクレオチド全てを
このように導入することができる。このことは３つのデ
オキシヌクレオチドの混合物を用いることにより、ある
いは１つのヌクレオチドを含む３つの別々の反応を用い
ることにより達成される。その方法を応用した別の方法
によりランダムクローンが得られる。つまりそれぞれ１
つの限られた量のデオキシヌクレオチドを含む４つの別
々の反応を行う。この方法により各１つのヌクレオチド
の前で止まる２番目の鎖を得ることができる。次の段階
は前述したように行うことができる。重亜硫酸法と酵素
的突然変異の方法の両者を変異体を得るのに用いた。
【００１０】酵素的性質を調べるのに突然変異実験に用
いた宿主細胞と同じ宿主細胞中でクローニングした遺伝
子を発現させるのが都合がよいかもしれない。原則的に
宿主細胞は適当な突然変異／発現ベクター系がその細胞
に対して可能であればどんな細胞でもかまわない。多く
の場合大腸菌、例えば大腸菌ＷＫ６株などがとても便利
である。コロニーをマイクロタイタープレート中で増殖
させた後プレートのウェルからとったサンプルを異なっ
たpH値にバッファライズした澱粉を含む寒天プレートに
スポットする。陽性クローンはハロー(halo)形成により
検出することができる。熱安定性、酸安定性、アルカリ
安定性、生理食塩水安定性、スクリーニングできるその
他の安定性について選択するのに適当な緩衝液を用いた
スクリーニングを用いることができる。変異体α−アミ
ラーゼの産生に適当な宿主細胞株には、α−アミラーゼ
の発現が可能である形質転換可能な細胞がある。特に枯
草菌などのα−アミラーゼを得たのと同じ種あるいは属
の宿主細胞株が適する。好ましくはα−アミラーゼを含
まない枯草菌株であり、より好ましくはα−アミラーゼ
とプロテアーゼを含まない枯草菌株である。例えばバチ
ルス リケニホルミス Ｔ９を大量の変異体α−アミラ
ーゼを得るのに用いた。好ましくは産生されるα−アミ
ラーゼが培地中に（醗酵中に）分泌されることであり、
これによりα−アミラーゼの回収が容易になる。分泌さ
せるために、いずれの適当なシグナル配列も用いること
ができる。
いた宿主細胞と同じ宿主細胞中でクローニングした遺伝
子を発現させるのが都合がよいかもしれない。原則的に
宿主細胞は適当な突然変異／発現ベクター系がその細胞
に対して可能であればどんな細胞でもかまわない。多く
の場合大腸菌、例えば大腸菌ＷＫ６株などがとても便利
である。コロニーをマイクロタイタープレート中で増殖
させた後プレートのウェルからとったサンプルを異なっ
たpH値にバッファライズした澱粉を含む寒天プレートに
スポットする。陽性クローンはハロー(halo)形成により
検出することができる。熱安定性、酸安定性、アルカリ
安定性、生理食塩水安定性、スクリーニングできるその
他の安定性について選択するのに適当な緩衝液を用いた
スクリーニングを用いることができる。変異体α−アミ
ラーゼの産生に適当な宿主細胞株には、α−アミラーゼ
の発現が可能である形質転換可能な細胞がある。特に枯
草菌などのα−アミラーゼを得たのと同じ種あるいは属
の宿主細胞株が適する。好ましくはα−アミラーゼを含
まない枯草菌株であり、より好ましくはα−アミラーゼ
とプロテアーゼを含まない枯草菌株である。例えばバチ
ルス リケニホルミス Ｔ９を大量の変異体α−アミラ
ーゼを得るのに用いた。好ましくは産生されるα−アミ
ラーゼが培地中に（醗酵中に）分泌されることであり、
これによりα−アミラーゼの回収が容易になる。分泌さ
せるために、いずれの適当なシグナル配列も用いること
ができる。
【００１１】発現されたα−アミラーゼは宿主細胞から
分泌され、ついで適当な方法により精製することができ
る。例えばゲル濾過とモノＱクロマトグラフィーを挙げ
ることができる。単離されたα−アミラーゼは種々のＣ
ａ2+濃度（０．５−１５ｍＭ）、広いpH値範囲（５．５
−８．０）での熱失活について検討した。検討は実際の
適用条件下でも行った。特に変異体α−アミラーゼはpH
５．５からpH5.25での澱粉液化の条件下で試験した。さ
らに繊維の糊抜きへの応用についても検討を行った。ス
クリーニングされた変異体のいくつかの性質は期待する
適用条件下でより適しているであろう。本発明は熱安定
性、酸耐性、アルカリ耐性の上昇したα−アミラーゼに
ついて開示している。一般的に置換するアミノ酸の数は
変異体蛋白の活性が野生型の酵素の活性と同じかそれよ
り良い限り重要でない。変異体α−アミラーゼは野生型
酵素と少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは１つから
１０個のアミノ酸が異なる。向上した性質を持つ具体的
変異体として１１１、１３３、１４９番目（番号付けは
バチルス リケニホルミスのα−アミラーゼに従った）
のアミノ酸の１つかそれ以上の置換を含むα−アミラー
ゼがある。好ましいアミノ酸の置換にはＡｌａ−１１１
−Ｔｈｅ、Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−１４９−
Ｉｌｅがある。このような変異体酵素は6.5以下及び／
または7.5以上のpH値での活性が向上した。例えば１１
０度までの高い温度で半減期が長くなるなどの向上した
活性を示した。
分泌され、ついで適当な方法により精製することができ
る。例えばゲル濾過とモノＱクロマトグラフィーを挙げ
ることができる。単離されたα−アミラーゼは種々のＣ
ａ2+濃度（０．５−１５ｍＭ）、広いpH値範囲（５．５
−８．０）での熱失活について検討した。検討は実際の
適用条件下でも行った。特に変異体α−アミラーゼはpH
５．５からpH5.25での澱粉液化の条件下で試験した。さ
らに繊維の糊抜きへの応用についても検討を行った。ス
クリーニングされた変異体のいくつかの性質は期待する
適用条件下でより適しているであろう。本発明は熱安定
性、酸耐性、アルカリ耐性の上昇したα−アミラーゼに
ついて開示している。一般的に置換するアミノ酸の数は
変異体蛋白の活性が野生型の酵素の活性と同じかそれよ
り良い限り重要でない。変異体α−アミラーゼは野生型
酵素と少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは１つから
１０個のアミノ酸が異なる。向上した性質を持つ具体的
変異体として１１１、１３３、１４９番目（番号付けは
バチルス リケニホルミスのα−アミラーゼに従った）
のアミノ酸の１つかそれ以上の置換を含むα−アミラー
ゼがある。好ましいアミノ酸の置換にはＡｌａ−１１１
−Ｔｈｅ、Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−１４９−
Ｉｌｅがある。このような変異体酵素は6.5以下及び／
または7.5以上のpH値での活性が向上した。例えば１１
０度までの高い温度で半減期が長くなるなどの向上した
活性を示した。
【００１２】入手可能なα−アミラーゼ製品の多くは細
菌を原料として得られている。特に枯草菌、例えばバチ
ルス、ズブチリス、バチルス リケニホルミス、バチル
スステアロテルモフィリス、バチルス、コアギュラン
ス、バチルス アミロリクエンファシエンスである。こ
れらの酵素は高いホモロジーと類似性を示す（結城ら、
ジャーナル オブ バイオケミストリー、９８巻、１１
４７頁、１９８５年；中島ら、アプライド マイクロバ
イオロジー アンド バイオテクノロジー、２３巻、３
５５頁、１９８６年）。従って、これらのα−アミラー
ゼの１つから得た好ましい変異に関する情報は他のα−
アミラーゼを改良するのに用いることができる。本発明
はそのような情報を得るためのアプローチを提供する。
次に述べるのは用いた実験上の方法と発明を具体的に示
すための実施例である。これらの実施例は単に説明のた
めであり、従って発明の範囲を限定することを意図した
ものでは決してない。
菌を原料として得られている。特に枯草菌、例えばバチ
ルス、ズブチリス、バチルス リケニホルミス、バチル
スステアロテルモフィリス、バチルス、コアギュラン
ス、バチルス アミロリクエンファシエンスである。こ
れらの酵素は高いホモロジーと類似性を示す（結城ら、
ジャーナル オブ バイオケミストリー、９８巻、１１
４７頁、１９８５年；中島ら、アプライド マイクロバ
イオロジー アンド バイオテクノロジー、２３巻、３
５５頁、１９８６年）。従って、これらのα−アミラー
ゼの１つから得た好ましい変異に関する情報は他のα−
アミラーゼを改良するのに用いることができる。本発明
はそのような情報を得るためのアプローチを提供する。
次に述べるのは用いた実験上の方法と発明を具体的に示
すための実施例である。これらの実施例は単に説明のた
めであり、従って発明の範囲を限定することを意図した
ものでは決してない。
【００１３】実施例 材料と方法 1.一般的なクローニングの技術 クローニングの技術は以下のハンドブックに説明してあ
るものを用いた。マニアティスら、モレキュラー クロ
ーニング、コールド スプリング ハーバーラボラトリ
ー、１９８２年；アウスベルら、カレントプロトコール
ズインモレキュラーバイオロジー、ニューヨーク １９
８７年；パーバル、プラクティカルガイド ツウ モレ
キュラー クローニング、第２版、ジョンウィリーアン
ドサンズ（株）、ニューヨーク、１９８８年。これらの
ハンドブックは組み換え体ＤＮＡの構築とその増殖、遺
伝子ライブラリーを作る手順、ＤＮＡのシークエンスと
突然変異のためのプロトコール、およびＤＮＡ分子に関
する酵素の取扱いのプロトコールについて詳しく説明し
てある。 2.化学的突然変異 クローン化されたＤＮＡはＤＮＡ中に変異を導入するた
めに試験管内(invitro)で化学薬品で処理してよい。も
しこれらの変異をアミノ酸をコードするトリプレットコ
ドンに起こすならば、変異を起こしたクローン化ＤＮＡ
により変異体蛋白質が産生される。重亜硫酸ナトリウム
を用いた化学的突然変異の方法はショールとボートシュ
タインにより説明されている（メソーズ イン エンザ
イモロジー、１００巻、４５７頁、１９８３年）。好ま
しい方法はフォークとホッフシュテッター（セル、３３
巻、５８５頁、１９８３年）により説明されている。突
然変異を起こす他の方法はスミスによりアニュアル レ
ビュー オブ ジェネティックス、１９巻、４２３頁、
１９８５年 に説明されている。特に有用なプロトコー
ルはアウスベールらにより同誌に説明されている。
るものを用いた。マニアティスら、モレキュラー クロ
ーニング、コールド スプリング ハーバーラボラトリ
ー、１９８２年；アウスベルら、カレントプロトコール
ズインモレキュラーバイオロジー、ニューヨーク １９
８７年；パーバル、プラクティカルガイド ツウ モレ
キュラー クローニング、第２版、ジョンウィリーアン
ドサンズ（株）、ニューヨーク、１９８８年。これらの
ハンドブックは組み換え体ＤＮＡの構築とその増殖、遺
伝子ライブラリーを作る手順、ＤＮＡのシークエンスと
突然変異のためのプロトコール、およびＤＮＡ分子に関
する酵素の取扱いのプロトコールについて詳しく説明し
てある。 2.化学的突然変異 クローン化されたＤＮＡはＤＮＡ中に変異を導入するた
めに試験管内(invitro)で化学薬品で処理してよい。も
しこれらの変異をアミノ酸をコードするトリプレットコ
ドンに起こすならば、変異を起こしたクローン化ＤＮＡ
により変異体蛋白質が産生される。重亜硫酸ナトリウム
を用いた化学的突然変異の方法はショールとボートシュ
タインにより説明されている（メソーズ イン エンザ
イモロジー、１００巻、４５７頁、１９８３年）。好ま
しい方法はフォークとホッフシュテッター（セル、３３
巻、５８５頁、１９８３年）により説明されている。突
然変異を起こす他の方法はスミスによりアニュアル レ
ビュー オブ ジェネティックス、１９巻、４２３頁、
１９８５年 に説明されている。特に有用なプロトコー
ルはアウスベールらにより同誌に説明されている。
【００１４】3.ギャップの入った２本鎖ＤＮＡの突然変
異 ギャップの入った２本鎖ＤＮＡを用いる方法（クレイマ
ーら、ヌクレイックアシッズ リサーチ、１２巻、9441
頁、１９８４年）とファスミド（プラスミド／ファージ
のハイブリッド）を用いた。その方法は本質的に、野生
型遺伝子の抗生物質耐性マーカーの入ったギャップの入
った鎖（−鎖）と抗生物質耐性を与える遺伝子にアンバ
ー突然変異の入った鋳型鎖（＋鎖）からなるギャップの
入った２本鎖ＤＮＡの中間体を用いるものである。アニ
ール後は、変異を起こしたオリゴヌクレオチドを試験管
内のギャップ埋め(gap filling)と結合(sealing)反応の
間にギャップの入った鎖に組み込む。その結果生じた分
子を、目的とした突然変異と抗生物質耐性マーカー間の
連結を保持しているミスマッチ修復欠損宿主細胞株（Ｍ
ｕｔ Ｓ）を形質転換するのに用いた。この株から分離
した混合ファスミド群は、サプレッサーを持たない宿主
細胞株中で分離される。形質転換株は抗生物質を含む培
地のプレートにまくことにより、ギャップの入った鎖か
ら生じた子孫細胞を選択する。ツインベクター系ｐＭａ
／ｃ５−８は、スタンセンらにより記載されているが
（ヌクレイック アシッズ リサーチ、１７巻、４４４
１頁、１９８９年）次の領域からなっている。 ｐｏｓ１１−１０５：バクテリオファージ ｆｄ、ター
ミネーター ｐｏｓ１２１−２１５：バクテリオファージｆｄ、ター
ミネーター ｐｏｓ２２１−３０７：プラスミッドｐＢＲ３２２（ｐ
ｏｓ２０６９−２１５３） ｐｏｓ３１３−７６８：バクテリオファージｆｌ，複製
開始領域（ｐｏｓ５４８２−５９４３） ｐｏｓ７７２−２５７１：プラスミッド ｐＢＲ３２
２、複製開始領域及びβ−ラクタマーゼ遺伝子 ｐｏｓ２５７２−２６８５：トランスポゾン Ｔｎ９０
３ ｐｏｓ２５１９−２７７２：トリプトファンターミネー
タ（ダブル） ｐｏｓ２７７３−３２２９：トランスポゾン Ｔｎ９、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子 ｐｏｓ３７３０−３８０３：マルチプルクローニングサ
イト配列は図１に示している。
異 ギャップの入った２本鎖ＤＮＡを用いる方法（クレイマ
ーら、ヌクレイックアシッズ リサーチ、１２巻、9441
頁、１９８４年）とファスミド（プラスミド／ファージ
のハイブリッド）を用いた。その方法は本質的に、野生
型遺伝子の抗生物質耐性マーカーの入ったギャップの入
った鎖（−鎖）と抗生物質耐性を与える遺伝子にアンバ
ー突然変異の入った鋳型鎖（＋鎖）からなるギャップの
入った２本鎖ＤＮＡの中間体を用いるものである。アニ
ール後は、変異を起こしたオリゴヌクレオチドを試験管
内のギャップ埋め(gap filling)と結合(sealing)反応の
間にギャップの入った鎖に組み込む。その結果生じた分
子を、目的とした突然変異と抗生物質耐性マーカー間の
連結を保持しているミスマッチ修復欠損宿主細胞株（Ｍ
ｕｔ Ｓ）を形質転換するのに用いた。この株から分離
した混合ファスミド群は、サプレッサーを持たない宿主
細胞株中で分離される。形質転換株は抗生物質を含む培
地のプレートにまくことにより、ギャップの入った鎖か
ら生じた子孫細胞を選択する。ツインベクター系ｐＭａ
／ｃ５−８は、スタンセンらにより記載されているが
（ヌクレイック アシッズ リサーチ、１７巻、４４４
１頁、１９８９年）次の領域からなっている。 ｐｏｓ１１−１０５：バクテリオファージ ｆｄ、ター
ミネーター ｐｏｓ１２１−２１５：バクテリオファージｆｄ、ター
ミネーター ｐｏｓ２２１−３０７：プラスミッドｐＢＲ３２２（ｐ
ｏｓ２０６９−２１５３） ｐｏｓ３１３−７６８：バクテリオファージｆｌ，複製
開始領域（ｐｏｓ５４８２−５９４３） ｐｏｓ７７２−２５７１：プラスミッド ｐＢＲ３２
２、複製開始領域及びβ−ラクタマーゼ遺伝子 ｐｏｓ２５７２−２６８５：トランスポゾン Ｔｎ９０
３ ｐｏｓ２５１９−２７７２：トリプトファンターミネー
タ（ダブル） ｐｏｓ２７７３−３２２９：トランスポゾン Ｔｎ９、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子 ｐｏｓ３７３０−３８０３：マルチプルクローニングサ
イト配列は図１に示している。
【００１５】ｐＭｃ型ベクターでは２２３８番目のヌク
レオチドはＧからＣに変えられているのに対しｐＭａ型
ベクターで３４０９番目のヌクレオチドがＧからＡに変
えられているが、それは、それぞれアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子中にアンバー
停止コドンを作り、該遺伝子を不活性化するためであ
る。ここであげた全ての配列はジーンバンク(Genbank)
（ＴＭ）、ナショナル ヌクレイック アシッド シー
クエンス データ バンクＮＩＨ ＵＳＡから入手し
た。プラスミッドｐＭｃ５−８はＤＳＭ ４５６６とし
て登録されている。突然変異を行うために目的のＤＮＡ
断片はｐＭａ５−８のマルチプル クローニング サイ
トに組み入れた。次に目的のＤＮＡを含むｐＭａ５−８
とｐＭｃ５−８の間のギャップの入った二本鎖を構築し
た。目的のＤＮＡから成る一本鎖のギャップは、突然変
異誘発性オリゴヌクレオチド、長い合成オリゴヌクレオ
チド、低いレベルで偽導入された(misincorporated)ヌ
クレオチド、化学薬品、または不規則突然変異ＰＣＲを
適用できる酵素的なヌクレオチドの偽導入(misincorpor
ation)により突然変異を起こすことができる。詳細はア
ウスベールら、（同上）あるいは、パーバル（同上）参
照。試験管内突然変の他の方法としては、ＵＶ照射また
は化学薬品によるもの、あるいは大腸菌ミューテイター
株を用いる生体内(in vivo)突然変を用いることができ
る（ファウラーら、ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー、167巻、130頁、１９８６年）。突然変異誘発性ヌク
レオチドはアプライドバイオシステムから入手可能な装
置を用い、合成できる。
レオチドはＧからＣに変えられているのに対しｐＭａ型
ベクターで３４０９番目のヌクレオチドがＧからＡに変
えられているが、それは、それぞれアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子中にアンバー
停止コドンを作り、該遺伝子を不活性化するためであ
る。ここであげた全ての配列はジーンバンク(Genbank)
（ＴＭ）、ナショナル ヌクレイック アシッド シー
クエンス データ バンクＮＩＨ ＵＳＡから入手し
た。プラスミッドｐＭｃ５−８はＤＳＭ ４５６６とし
て登録されている。突然変異を行うために目的のＤＮＡ
断片はｐＭａ５−８のマルチプル クローニング サイ
トに組み入れた。次に目的のＤＮＡを含むｐＭａ５−８
とｐＭｃ５−８の間のギャップの入った二本鎖を構築し
た。目的のＤＮＡから成る一本鎖のギャップは、突然変
異誘発性オリゴヌクレオチド、長い合成オリゴヌクレオ
チド、低いレベルで偽導入された(misincorporated)ヌ
クレオチド、化学薬品、または不規則突然変異ＰＣＲを
適用できる酵素的なヌクレオチドの偽導入(misincorpor
ation)により突然変異を起こすことができる。詳細はア
ウスベールら、（同上）あるいは、パーバル（同上）参
照。試験管内突然変の他の方法としては、ＵＶ照射また
は化学薬品によるもの、あるいは大腸菌ミューテイター
株を用いる生体内(in vivo)突然変を用いることができ
る（ファウラーら、ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー、167巻、130頁、１９８６年）。突然変異誘発性ヌク
レオチドはアプライドバイオシステムから入手可能な装
置を用い、合成できる。
【００１６】4.ヌクレオチドの酵素的偽導入による不規
則突然変異 ｐＭａ／ｐＭｃのギャップの入った２本鎖に対しプライ
マー伸長と偽導入突然変異を行うことができる。これは
最初にショートルら（プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ＴＨ
Ｅ ＵＳＡ ７９巻、１５８８頁、１９８２年）、カニ
ングハムとウェルズ（プロテインエンジニアリング、１
巻、３１９頁、１９８７年）により報告されたもので、
この方法の改良法はトレバアラらにより報告されている
（プロテイン エンジニアリング、６３巻、２頁、１９
８８年）。この方法はポリメラーゼの制限的使用に基づ
いている。始めにＤＮＡ分子の４種を、ｐＭａ／ｐＭｃ
のギャップの入った２本鎖のプライマー伸長により、ギ
ャップの中で不規則に、しかしいつも決まった塩基種の
前で停止するように（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ
の前で）調製した。次に４つの各グループはそれぞれ別
々の、今度は正しい塩基を除去することができる偽導入
反応において突然変異を起こした。この方法で全ての型
の塩基置換型突然変異をギャップの全ての位置において
起こすことができる。クレノウポリメラーゼよりもシー
ケナーゼ（ＴＭ）（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルコーポレイ
ション）を好んで用いた。さらにレトバアラ（同上）ら
が用いたＭｏＭｕＬＶ逆転写酵素をＡ．Ｍ．Ｖ．逆転写
酵素の代わりに用いた。１塩基置換を確認するため、レ
トバアラら（同上）のプロトコールに次の改良点を導入
した。逆転写酵素緩衝液中に３種でなく１種のみ偽導入
ヌクレオチドを入れる。例えば、Ａ特異的に制限された
塩基伸長混合物は２５０μＭｄＣＴＰ、２５０μＭ ｄ
ＧＴＰ、２５０μＭ ｄＴＴＰとそれぞれ別々の３種の
反応液中でインキュベートする。４塩基特異的制限伸長
反応混合物の完全な組み合わせに対し、全部で１２種の
偽導入反応を行った。４２℃で1.5時間のインキュベー
ション後、４種全てのデオキシヌクレオチドを０．５ｍ
Ｍの濃度で加え、反応液をさらに最低２０分間３７℃で
インキュベートした。サンプルはレトバアラらの方法
（同上）により処理し、その中でウラシルを含むＤＮＡ
鎖へのカウンターセレクション(counterselection)でな
くｐＭＡ／ｃベクターに基づくカウンターセレクション
を適用するという変更を行った。
則突然変異 ｐＭａ／ｐＭｃのギャップの入った２本鎖に対しプライ
マー伸長と偽導入突然変異を行うことができる。これは
最初にショートルら（プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ＴＨ
Ｅ ＵＳＡ ７９巻、１５８８頁、１９８２年）、カニ
ングハムとウェルズ（プロテインエンジニアリング、１
巻、３１９頁、１９８７年）により報告されたもので、
この方法の改良法はトレバアラらにより報告されている
（プロテイン エンジニアリング、６３巻、２頁、１９
８８年）。この方法はポリメラーゼの制限的使用に基づ
いている。始めにＤＮＡ分子の４種を、ｐＭａ／ｐＭｃ
のギャップの入った２本鎖のプライマー伸長により、ギ
ャップの中で不規則に、しかしいつも決まった塩基種の
前で停止するように（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ
の前で）調製した。次に４つの各グループはそれぞれ別
々の、今度は正しい塩基を除去することができる偽導入
反応において突然変異を起こした。この方法で全ての型
の塩基置換型突然変異をギャップの全ての位置において
起こすことができる。クレノウポリメラーゼよりもシー
ケナーゼ（ＴＭ）（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルコーポレイ
ション）を好んで用いた。さらにレトバアラ（同上）ら
が用いたＭｏＭｕＬＶ逆転写酵素をＡ．Ｍ．Ｖ．逆転写
酵素の代わりに用いた。１塩基置換を確認するため、レ
トバアラら（同上）のプロトコールに次の改良点を導入
した。逆転写酵素緩衝液中に３種でなく１種のみ偽導入
ヌクレオチドを入れる。例えば、Ａ特異的に制限された
塩基伸長混合物は２５０μＭｄＣＴＰ、２５０μＭ ｄ
ＧＴＰ、２５０μＭ ｄＴＴＰとそれぞれ別々の３種の
反応液中でインキュベートする。４塩基特異的制限伸長
反応混合物の完全な組み合わせに対し、全部で１２種の
偽導入反応を行った。４２℃で1.5時間のインキュベー
ション後、４種全てのデオキシヌクレオチドを０．５ｍ
Ｍの濃度で加え、反応液をさらに最低２０分間３７℃で
インキュベートした。サンプルはレトバアラらの方法
（同上）により処理し、その中でウラシルを含むＤＮＡ
鎖へのカウンターセレクション(counterselection)でな
くｐＭＡ／ｃベクターに基づくカウンターセレクション
を適用するという変更を行った。
【００１７】5.変異体α−アミラーゼの生産 α−アミラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを持つ大腸菌
変異株ＷＫ６（ツエル、フリッツ、エンボジャーナル、
６巻、１８０９頁、１９８７年）を３０℃でＴＢ培地
（１０ｍｌ）に接種した。ＴＢ培地は０．０１７Ｍ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．０７２Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4、１２ｇ／Ｌバク
トトリプトン、２４ｇ／Ｌバクトイーストエクストラク
ト、０．４％グリセロールと抗生物質（ｐＭＡにはアン
ピシリンまたはｐＭｃにはクロラムフェニコール）を含
む。培養液の一部を２Ｌのフラスコ中の２５０ｍｌのＴ
Ｂ培地に植え付いだ。ＯＤ600が１０−１２のとき０．
１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクト
ピラノシド）を加え、さらに１２−１６時間培養を続け
た。 6.変異体α−アミラーゼの精製 菌体は遠心により集菌し、２０％ショ糖を含む緩衝液に
０℃で懸濁した。２回目の遠心の後、菌体は冷水に懸濁
した。菌体の残さは３回目により除き、上清を２０ｍＭ
トリス緩衝液でpH8.0に合わせた。ＣａＣｌ2を最終濃度
５０ｍＭになるよう加えた。サンプルは１５分間７０℃
で熱処理し、不溶物を遠心で除いた。上清は０．２２μ
ミリポアメンブレンによりろ過し、初期容量の１／１０
まで濃縮した。精製はさらに、ゲルろ過（ＴＳＫ ＨＷ
−５５−メルク社）とモノＱクロマトグラフィーにより
行った。ＭｏｎｏＳクロマトグラフィーの前に酵素活性
を含むフラクションについて、酢酸ナトリウムを用い、
pHを4.8に調整した。α−アミラーゼは２５０ｍＭＮａ
Ｃｌで溶出した。失活を防ぐため、pHを速やかに8.0に
調整した。
変異株ＷＫ６（ツエル、フリッツ、エンボジャーナル、
６巻、１８０９頁、１９８７年）を３０℃でＴＢ培地
（１０ｍｌ）に接種した。ＴＢ培地は０．０１７Ｍ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．０７２Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4、１２ｇ／Ｌバク
トトリプトン、２４ｇ／Ｌバクトイーストエクストラク
ト、０．４％グリセロールと抗生物質（ｐＭＡにはアン
ピシリンまたはｐＭｃにはクロラムフェニコール）を含
む。培養液の一部を２Ｌのフラスコ中の２５０ｍｌのＴ
Ｂ培地に植え付いだ。ＯＤ600が１０−１２のとき０．
１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクト
ピラノシド）を加え、さらに１２−１６時間培養を続け
た。 6.変異体α−アミラーゼの精製 菌体は遠心により集菌し、２０％ショ糖を含む緩衝液に
０℃で懸濁した。２回目の遠心の後、菌体は冷水に懸濁
した。菌体の残さは３回目により除き、上清を２０ｍＭ
トリス緩衝液でpH8.0に合わせた。ＣａＣｌ2を最終濃度
５０ｍＭになるよう加えた。サンプルは１５分間７０℃
で熱処理し、不溶物を遠心で除いた。上清は０．２２μ
ミリポアメンブレンによりろ過し、初期容量の１／１０
まで濃縮した。精製はさらに、ゲルろ過（ＴＳＫ ＨＷ
−５５−メルク社）とモノＱクロマトグラフィーにより
行った。ＭｏｎｏＳクロマトグラフィーの前に酵素活性
を含むフラクションについて、酢酸ナトリウムを用い、
pHを4.8に調整した。α−アミラーゼは２５０ｍＭＮａ
Ｃｌで溶出した。失活を防ぐため、pHを速やかに8.0に
調整した。
【００１８】実施例 実施例１ バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子のモレ
キュラークローニングバチルスリケニホルミスのＴ５
（ＥＰ−Ａ−１３４０４８；ＣＢＳ４７０．８３）から
単離した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＫＩで消化し、
ＰＵＢ１１０（グリンザンら、ジャーナルオブバクテリ
オロジー、１３４巻、３１８頁、１９７８年）のＥｃｏ
ＲＩ部位に組み込んだ。組換え体はバチルスズブチリス
ＩＡ４０（バチルス ジェネティック ストックセンタ
ー）にトランスフォームした。α−アミラーゼ産生につ
いて、ネオマイシン耐性コロニーを０．４ｇ／Ｌ澱粉
（ツルコフスキー澱粉、メルク社）を加えたＨＩ寒天プ
レートで検定した。ヨー素蒸気中で増殖、インキュベー
ション後、大きな透明のハロを作った陽性コロニーは次
の解析に選択された。この陽性コロニーから単離したプ
ラスミドはバチルスリクニホルミスＴ５から生じた３．
４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含むことが示さ
れた。このプラスミドはｐＧＢ３３（ＥＰ−Ａ−１３４
０４８；ＣＢＳ４６６．８３）と命名された。α−アミ
ラーゼをコードする挿入断片は合成シャインダルガル１
７配列とバクテリオファージＳＰＯ2プロモーターに組
み込み、その結果できたプラスミドをｐＲｒｏｍＳＰＯ
2とした（ＥＰ−Ａ−０２２４２９４参照。ＣＢＳ６９
６．８５）。サンガー法（プロシーティング オブ ナ
ショナル アカデミー サイエンス オブ Ｕ．Ｓ．
Ａ．７４巻、６４５３頁、１９７７年）により決定した
ｐＰｒｏｍＳＰＯ2の挿入断片のヌクレオチド配列は図
２に示した。配列はα−アミラーゼをコードする１つの
大きなオープンリーディングフレームを示し、これは、
結城ら（同上）により決定されたバチルスリケニホルミ
スのα−アミラーゼの配列と実質的に一致する。初めの
２９個のアミノ酸はα−アミラーゼが分泌される際切り
出されるシグナル配列である。この応用を通じて、アミ
ノ酸の番号づけは成熟蛋白に応じた番号である。結城の
配列は、次の箇所において異なっている。１３４番目、
ロイシンの代わりにアルギニンが存在し、３１０番目の
グリシンの代わりにセリンが存在し、３２０番目、セリ
ンの代わりにアラニンが存在する。
キュラークローニングバチルスリケニホルミスのＴ５
（ＥＰ−Ａ−１３４０４８；ＣＢＳ４７０．８３）から
単離した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＫＩで消化し、
ＰＵＢ１１０（グリンザンら、ジャーナルオブバクテリ
オロジー、１３４巻、３１８頁、１９７８年）のＥｃｏ
ＲＩ部位に組み込んだ。組換え体はバチルスズブチリス
ＩＡ４０（バチルス ジェネティック ストックセンタ
ー）にトランスフォームした。α−アミラーゼ産生につ
いて、ネオマイシン耐性コロニーを０．４ｇ／Ｌ澱粉
（ツルコフスキー澱粉、メルク社）を加えたＨＩ寒天プ
レートで検定した。ヨー素蒸気中で増殖、インキュベー
ション後、大きな透明のハロを作った陽性コロニーは次
の解析に選択された。この陽性コロニーから単離したプ
ラスミドはバチルスリクニホルミスＴ５から生じた３．
４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含むことが示さ
れた。このプラスミドはｐＧＢ３３（ＥＰ−Ａ−１３４
０４８；ＣＢＳ４６６．８３）と命名された。α−アミ
ラーゼをコードする挿入断片は合成シャインダルガル１
７配列とバクテリオファージＳＰＯ2プロモーターに組
み込み、その結果できたプラスミドをｐＲｒｏｍＳＰＯ
2とした（ＥＰ−Ａ−０２２４２９４参照。ＣＢＳ６９
６．８５）。サンガー法（プロシーティング オブ ナ
ショナル アカデミー サイエンス オブ Ｕ．Ｓ．
Ａ．７４巻、６４５３頁、１９７７年）により決定した
ｐＰｒｏｍＳＰＯ2の挿入断片のヌクレオチド配列は図
２に示した。配列はα−アミラーゼをコードする１つの
大きなオープンリーディングフレームを示し、これは、
結城ら（同上）により決定されたバチルスリケニホルミ
スのα−アミラーゼの配列と実質的に一致する。初めの
２９個のアミノ酸はα−アミラーゼが分泌される際切り
出されるシグナル配列である。この応用を通じて、アミ
ノ酸の番号づけは成熟蛋白に応じた番号である。結城の
配列は、次の箇所において異なっている。１３４番目、
ロイシンの代わりにアルギニンが存在し、３１０番目の
グリシンの代わりにセリンが存在し、３２０番目、セリ
ンの代わりにアラニンが存在する。
【００１９】実施例２ 突然変異／発現ベクターｐＭａＴＬｉａ６の構築 プラスミドｐＰＲＯＭ ＳＰＯ2はＥｃｏＲＩとＢｃｌ
Ｉで消化し、１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を
精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化したｐＭａ５−８
に組み込んだ。このｐＭａ５−８ベクターは改変したマ
ルチプルクローニングサイトを前もって付加しておい
た。図１の３７６７番目から３７８６番目のＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄIII断片は図３の５６４７番目から５６６０
番目にくるように合成ＤＮＡ配列と交換した。このこと
は、α−アミラーゼ遺伝子中の制限酵素部位のいくつか
を単一箇所にするために行った。生成したα−アミラー
ゼを含むｐＭａ５−８誘導体はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
とで消化し、ＴＡＣプロモーター（デュボアら、プロシ
ーディングス オブ ナショナルアカデミー オブサイ
エンスシズ オブＴｈｅU.S.A.80巻、２１頁、１９８３
年）のコピーをもつ合成ＤＮＡ断片と連結した。この合
成ＤＮＡ断片の配列は３７５７番目から３８５９番目ま
で、最終的なα−アミラーゼの突然変異／発現ベクター
のｐＭａＴＬｉａ６と共に図３に示した。この最終α−
アミラーゼ突然変異／発現ベクターは突然変異実験の際
にα−アミラーゼ遺伝子中にギャップを生じるよう数か
所サイレント制限酵素切断部位を導入することにより完
成した（図４）。この目的のため次の突然変異を部位限
定オリゴヌクレオチド突然変異を用いて行った。 −ＳｐｅＩ部位をサイレント突然変異により導入した。 Ｔ４９Ｔ と Ｓ５０Ｓ ＡＣＧ→ＡＣＴ ＡＧＣ→ＡＧＴ −ＮａｒＩ部位をサイレント突然変異により導入した。 Ａ２６９Ａ ＧＣＧ→ＧＣＣ −ＢｓｔＥII部位をＴＡＧ終止コドンの下流直後に導入
した。 ＴＡＧＡＡＧＡＧＣ→ＴＡＧＧＴＧＡＣＣ
Ｉで消化し、１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を
精製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化したｐＭａ５−８
に組み込んだ。このｐＭａ５−８ベクターは改変したマ
ルチプルクローニングサイトを前もって付加しておい
た。図１の３７６７番目から３７８６番目のＢａｍＨＩ
−ＨｉｎｄIII断片は図３の５６４７番目から５６６０
番目にくるように合成ＤＮＡ配列と交換した。このこと
は、α−アミラーゼ遺伝子中の制限酵素部位のいくつか
を単一箇所にするために行った。生成したα−アミラー
ゼを含むｐＭａ５−８誘導体はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
とで消化し、ＴＡＣプロモーター（デュボアら、プロシ
ーディングス オブ ナショナルアカデミー オブサイ
エンスシズ オブＴｈｅU.S.A.80巻、２１頁、１９８３
年）のコピーをもつ合成ＤＮＡ断片と連結した。この合
成ＤＮＡ断片の配列は３７５７番目から３８５９番目ま
で、最終的なα−アミラーゼの突然変異／発現ベクター
のｐＭａＴＬｉａ６と共に図３に示した。この最終α−
アミラーゼ突然変異／発現ベクターは突然変異実験の際
にα−アミラーゼ遺伝子中にギャップを生じるよう数か
所サイレント制限酵素切断部位を導入することにより完
成した（図４）。この目的のため次の突然変異を部位限
定オリゴヌクレオチド突然変異を用いて行った。 −ＳｐｅＩ部位をサイレント突然変異により導入した。 Ｔ４９Ｔ と Ｓ５０Ｓ ＡＣＧ→ＡＣＴ ＡＧＣ→ＡＧＴ −ＮａｒＩ部位をサイレント突然変異により導入した。 Ａ２６９Ａ ＧＣＧ→ＧＣＣ −ＢｓｔＥII部位をＴＡＧ終止コドンの下流直後に導入
した。 ＴＡＧＡＡＧＡＧＣ→ＴＡＧＧＴＧＡＣＣ
【００２０】このα−アミラーゼ突然変異ベクターｐＭ
ａＴＬｉａ６はギャップ入り２本鎖法を用いた突然変異
に適している。適当な制限酵素による消化により調製し
た二本鎖ｐＭａＴＬｉａ６ＤＮＡはアニールし１本鎖ｐ
ＭｃＴＬｉａ６ＤＮＡとした。生じた１本鎖ギャップに
対し、実験の項に説明した部位限定突然変異、化学的突
然変異、そして不規則酵素的突然変異を行った。α−ア
ミラーゼ遺伝子の前にＴＡＬプロモーターをつけること
によってＩＰＴＧを加えることにより大腸菌にα−アミ
ラーゼを誘導発現させ得る。大腸菌ＷＫ６中のプラスミ
ドｐＭａＴＬｉａ６は１９８９年６月２日にＣＢＳ２５
５．８９として寄託した。
ａＴＬｉａ６はギャップ入り２本鎖法を用いた突然変異
に適している。適当な制限酵素による消化により調製し
た二本鎖ｐＭａＴＬｉａ６ＤＮＡはアニールし１本鎖ｐ
ＭｃＴＬｉａ６ＤＮＡとした。生じた１本鎖ギャップに
対し、実験の項に説明した部位限定突然変異、化学的突
然変異、そして不規則酵素的突然変異を行った。α−ア
ミラーゼ遺伝子の前にＴＡＬプロモーターをつけること
によってＩＰＴＧを加えることにより大腸菌にα−アミ
ラーゼを誘導発現させ得る。大腸菌ＷＫ６中のプラスミ
ドｐＭａＴＬｉａ６は１９８９年６月２日にＣＢＳ２５
５．８９として寄託した。
【００２１】実施例３ 突然変異と発現のための枯草菌／大腸菌シャトルベクタ
ーの構築 このベクターは大腸菌内での挿入した遺伝子の突然変
異、及び枯草菌内での速やかな発現を可能にする。ベク
ターの構築のために選んだ方法はｐＵＢ１１０系プラス
ミド（グリクザン、同上）をｐＭａ／ｃツインベクター
系と次のような方法で結合することである。 1. バチルスサチリスの遺伝子単位(casette)は１回の
制限酵素切断及び再ライゲーション実験により除くこと
ができる。 2. 異なるα−アミラーゼ遺伝子と異なるプロモーター
を容易にこのベクターにクローン化することができる。 3. 再環状化の後、クローン化した遺伝子は適当な枯草
菌のプロモーターの制御下に置くことができる。 4. 大腸菌の突然変異の間、枯草菌のプロモーターと構
造α−アミラーゼ遺伝子は大腸菌内にα−アミラーゼを
蓄積させると致死的であるかもしれないのでそれを避け
るために物理的に分離する。シャトルベクターの図は図
５に示した。ベクターｐＢＭａ／ｃ１の最終的な構造は
図６に示した。ベクターｐＢＭａ１は1989年６月２日に
ＣＢＳ ２５２．８９として寄託してある。ベクターは
次のように構築された。 −ＲＥＰ遺伝子とＮｅｏR遺伝子を含むｐＵＢ１１０の
ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩ断片は精製しＥｃｏＲＩ−Ｓｍ
ａＩで消化したｐＵＣ８に組み込んだ。 −ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩポリリンカー断片はバクテリオ
ファージＳＰＯ2のＳＰＯ2プロモーターをコードするＤ
ＮＡ（ウィリアムズら、ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、１４６巻、１１６２頁、１９８１年）及びＳａ
ｃII、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、ＳｕｃＩ、ＢｇｌＩ、Ｍｌ
ｕＩとＸｂａＩの制限酵素認識部位の合成断片で置換し
た。
ーの構築 このベクターは大腸菌内での挿入した遺伝子の突然変
異、及び枯草菌内での速やかな発現を可能にする。ベク
ターの構築のために選んだ方法はｐＵＢ１１０系プラス
ミド（グリクザン、同上）をｐＭａ／ｃツインベクター
系と次のような方法で結合することである。 1. バチルスサチリスの遺伝子単位(casette)は１回の
制限酵素切断及び再ライゲーション実験により除くこと
ができる。 2. 異なるα−アミラーゼ遺伝子と異なるプロモーター
を容易にこのベクターにクローン化することができる。 3. 再環状化の後、クローン化した遺伝子は適当な枯草
菌のプロモーターの制御下に置くことができる。 4. 大腸菌の突然変異の間、枯草菌のプロモーターと構
造α−アミラーゼ遺伝子は大腸菌内にα−アミラーゼを
蓄積させると致死的であるかもしれないのでそれを避け
るために物理的に分離する。シャトルベクターの図は図
５に示した。ベクターｐＢＭａ／ｃ１の最終的な構造は
図６に示した。ベクターｐＢＭａ１は1989年６月２日に
ＣＢＳ ２５２．８９として寄託してある。ベクターは
次のように構築された。 −ＲＥＰ遺伝子とＮｅｏR遺伝子を含むｐＵＢ１１０の
ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩ断片は精製しＥｃｏＲＩ−Ｓｍ
ａＩで消化したｐＵＣ８に組み込んだ。 −ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩポリリンカー断片はバクテリオ
ファージＳＰＯ2のＳＰＯ2プロモーターをコードするＤ
ＮＡ（ウィリアムズら、ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、１４６巻、１１６２頁、１９８１年）及びＳａ
ｃII、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、ＳｕｃＩ、ＢｇｌＩ、Ｍｌ
ｕＩとＸｂａＩの制限酵素認識部位の合成断片で置換し
た。
【００２２】−ｐＭａ５−８０の単一のＥｃｏＲＩ部位
は、次の制限認識部位を構成するポリリンカーＤＮＡ断
片を挿入するのに用いた：ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、Ｓａ
ｃＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、及
びＨｉｎｄIII、特定の目的のために誘導体ｐＢＭａ／
ｃ２とｐＢＭａ／ｃ６がｐＢＭａ／ｃ１から開発され
た。 −ｐＢＭａ／ｃ２ではｐＢＭａ／ｃ１のＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄIIIポリリンカーはｐＵＣ１９の相当するポリリ
ンカーにより置換した。 −ｐＢＭａ／ｃ６ではさらにｐＢＭａ／ｃ１の右のポリ
リンカー中のＳａｃII部位をクレノー反応により除い
た。バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼに対する
部位限定突然変異はｐＢＭａ／ｃ６Ｌｉａ６を構築した
後行った。このベクターはｐＭａＴＬｉａ６から単離し
たＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片をＢａｍＨＩとＨｉｎ
ｄIIIにより開裂させた上述のｐＢＭａ／ｃ６に組み込
むことにより構築した。生じたプラスミド（図７）は大
腸菌の突然変異でギャップの入った２本鎖を構築するの
に用いることができる。生じた変異体はチャンとコーエ
ンの方法に従い（モレキュラー アンド ジェネラル
ジェネティックス、１６８巻、１１１頁、１９７９年）
ＳａｃＩによる制限酵素処理、再ライゲーション、及び
トランスフォーメーションによりバチルスズブチリス
１Ａ４０（ＢＧＳｃ １Ａ４０）で発現された。
は、次の制限認識部位を構成するポリリンカーＤＮＡ断
片を挿入するのに用いた：ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、Ｓａ
ｃＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、及
びＨｉｎｄIII、特定の目的のために誘導体ｐＢＭａ／
ｃ２とｐＢＭａ／ｃ６がｐＢＭａ／ｃ１から開発され
た。 −ｐＢＭａ／ｃ２ではｐＢＭａ／ｃ１のＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄIIIポリリンカーはｐＵＣ１９の相当するポリリ
ンカーにより置換した。 −ｐＢＭａ／ｃ６ではさらにｐＢＭａ／ｃ１の右のポリ
リンカー中のＳａｃII部位をクレノー反応により除い
た。バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼに対する
部位限定突然変異はｐＢＭａ／ｃ６Ｌｉａ６を構築した
後行った。このベクターはｐＭａＴＬｉａ６から単離し
たＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片をＢａｍＨＩとＨｉｎ
ｄIIIにより開裂させた上述のｐＢＭａ／ｃ６に組み込
むことにより構築した。生じたプラスミド（図７）は大
腸菌の突然変異でギャップの入った２本鎖を構築するの
に用いることができる。生じた変異体はチャンとコーエ
ンの方法に従い（モレキュラー アンド ジェネラル
ジェネティックス、１６８巻、１１１頁、１９７９年）
ＳａｃＩによる制限酵素処理、再ライゲーション、及び
トランスフォーメーションによりバチルスズブチリス
１Ａ４０（ＢＧＳｃ １Ａ４０）で発現された。
【００２３】実施例４ 完全な成熟蛋白としてのバチルスリケニホルミスのα−
アミラーゼの大腸菌における発現 ｐＭａＴＬｉａ６（例２）により産生されたα−アミラ
ーゼの解析によりα−アミラーゼの一部は分泌される間
に誤って修飾されることがわかった。アミノ末端シーク
エンスにより大腸菌ＷＫ６の産生するα−アミラーゼは
余分なアラニン残基があることがわかった。このことに
よりアミラーゼが異なる性質を持つか否かわからない
が、α−アミラーゼのシグナル配列をアルカリホスファ
ターゼＰｈｏＡのシグナル配列と交換した。この目的の
ためＦｓｐＩ制限酵素切断部位をｐＭａＴＬｉａ６のシ
グナルペプチドと成熟α−アミラーゼの連結部位に導入
するように突然変異実験を行った。ＦｓｐＩとＢａｍＨ
Ｉ消化の後、ｐｈｏＡシグナル配列（ミカエリスら、ジ
ャーナルオブバクテリオロジー、１５４巻、３６６頁、
１９８３年）をコードする合成ＤＮＡ断片を挿入した。
このプラスミドの配列は図８に示す。ｐＭａ／ｃＴＬＰ
ｉａ６が産生するα−アミラーゼは正確なアミノ末端配
列を持つことがわかった。
アミラーゼの大腸菌における発現 ｐＭａＴＬｉａ６（例２）により産生されたα−アミラ
ーゼの解析によりα−アミラーゼの一部は分泌される間
に誤って修飾されることがわかった。アミノ末端シーク
エンスにより大腸菌ＷＫ６の産生するα−アミラーゼは
余分なアラニン残基があることがわかった。このことに
よりアミラーゼが異なる性質を持つか否かわからない
が、α−アミラーゼのシグナル配列をアルカリホスファ
ターゼＰｈｏＡのシグナル配列と交換した。この目的の
ためＦｓｐＩ制限酵素切断部位をｐＭａＴＬｉａ６のシ
グナルペプチドと成熟α−アミラーゼの連結部位に導入
するように突然変異実験を行った。ＦｓｐＩとＢａｍＨ
Ｉ消化の後、ｐｈｏＡシグナル配列（ミカエリスら、ジ
ャーナルオブバクテリオロジー、１５４巻、３６６頁、
１９８３年）をコードする合成ＤＮＡ断片を挿入した。
このプラスミドの配列は図８に示す。ｐＭａ／ｃＴＬＰ
ｉａ６が産生するα−アミラーゼは正確なアミノ末端配
列を持つことがわかった。
【００２４】実施例５ 安定なα−アミラーゼのスクリーニング Ａ．酸耐性α−アミラーゼ突然変異体のスクリーニング 野生型α−アミラーゼよりも低いpHで良くも悪くも活性
を示すα−アミラーゼ突然変異体は、異なるpH値で緩衝
化した澱粉プレートにできるハローをヨウ素液ででんぷ
んを染色した後に比較することにより選択できる。 方法； 1.増殖 突然変異株の候補はマイクロタイタープレートで増殖さ
せる。増殖培地はブレインハートインフュージョンブロ
ス２５０μＬ（ディフコ社）である。補足したものは クロラムフェニコール ５０μｇ／ｍｌ Ｉ．Ｐ．Ｔ．Ｇ．（シグマ社） ０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 ２ｍＭ コロニーは滅菌つまようじで寒天プレートから拾いマイ
クロタイタープレートの各ウェル（９６）に植菌した。
各プレートには４つの野生型コロニーを対照として植菌
した。これらのマイクロタイタープレートは振とうせず
４０時間３７℃に置いた。
を示すα−アミラーゼ突然変異体は、異なるpH値で緩衝
化した澱粉プレートにできるハローをヨウ素液ででんぷ
んを染色した後に比較することにより選択できる。 方法； 1.増殖 突然変異株の候補はマイクロタイタープレートで増殖さ
せる。増殖培地はブレインハートインフュージョンブロ
ス２５０μＬ（ディフコ社）である。補足したものは クロラムフェニコール ５０μｇ／ｍｌ Ｉ．Ｐ．Ｔ．Ｇ．（シグマ社） ０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 ２ｍＭ コロニーは滅菌つまようじで寒天プレートから拾いマイ
クロタイタープレートの各ウェル（９６）に植菌した。
各プレートには４つの野生型コロニーを対照として植菌
した。これらのマイクロタイタープレートは振とうせず
４０時間３７℃に置いた。
【００２５】2.プレート試験 α−アミラーゼの産生されたインキュベーション後、各
ウェルからサンプル５μＬをとり２種の異なった種類の
寒天プレート（１４４×１４０ｎｍ）にスポットした。
第一のタイプは栄養分の多いハートインフュージョン寒
天プレート（ＤＩＦＩＯ社）＋０．４％澱粉（ツルコフ
スキー澱粉−メルク社）＋クロラムフェニコール５０μ
ｇ／ｍｌである。３７℃１６時間インキュベーションの
後、このプレートは突然変異体を保存するのに用いられ
た。第２のプレートのタイプは実際のスクリーニング用
のプレートで、バクトラガー（ＤＩＦＩＣＯ社）１．５
％スルコフスキー澱粉０．２％を含む。寒天と澱粉は合
成生水（ＳｔＷ）に溶解した。 これは脱金属水＋ＣａＣｌ2 ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２．５ｍＭ ＢＳＡ １０μｇ／ｍｌ である。 スクリーングプレートはこの培地中に５Ｍのストック用
酢酸カリウム緩衝液を１００倍希釈して緩衝化する。測
定した寒天プレート中の最終pH値はストック用溶液より
少し低い。各ウェルから５μＬの培養液を異なったpH値
の３種のスクリーニングプレートにスポットする。pH値
の範囲は最低pH値のプレートにおいて野生型のα−アミ
ラーゼに対し、ほとんどまたは全く活性が残存しないよ
うに選ぶ。 3.染色 スクリーニングプレートは５５℃で２時間インキュベー
トする。この後ヨー素液をプレートに注ぎかける。１０
倍ヨウ素液は１Ｌにつき３０ｇのヨウ素と７０ｇのＫＩ
を含む。スポットの透明な部分の面積はそのpHにおいて
残存するα−アミラーゼ活性と相関する。野生型株の対
照より高い活性を示した突然変異株は第２次のスクリー
ニングに選択する。野生型のハローはこの実験において
良好な再現性を示す。
ウェルからサンプル５μＬをとり２種の異なった種類の
寒天プレート（１４４×１４０ｎｍ）にスポットした。
第一のタイプは栄養分の多いハートインフュージョン寒
天プレート（ＤＩＦＩＯ社）＋０．４％澱粉（ツルコフ
スキー澱粉−メルク社）＋クロラムフェニコール５０μ
ｇ／ｍｌである。３７℃１６時間インキュベーションの
後、このプレートは突然変異体を保存するのに用いられ
た。第２のプレートのタイプは実際のスクリーニング用
のプレートで、バクトラガー（ＤＩＦＩＣＯ社）１．５
％スルコフスキー澱粉０．２％を含む。寒天と澱粉は合
成生水（ＳｔＷ）に溶解した。 これは脱金属水＋ＣａＣｌ2 ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２．５ｍＭ ＢＳＡ １０μｇ／ｍｌ である。 スクリーングプレートはこの培地中に５Ｍのストック用
酢酸カリウム緩衝液を１００倍希釈して緩衝化する。測
定した寒天プレート中の最終pH値はストック用溶液より
少し低い。各ウェルから５μＬの培養液を異なったpH値
の３種のスクリーニングプレートにスポットする。pH値
の範囲は最低pH値のプレートにおいて野生型のα−アミ
ラーゼに対し、ほとんどまたは全く活性が残存しないよ
うに選ぶ。 3.染色 スクリーニングプレートは５５℃で２時間インキュベー
トする。この後ヨー素液をプレートに注ぎかける。１０
倍ヨウ素液は１Ｌにつき３０ｇのヨウ素と７０ｇのＫＩ
を含む。スポットの透明な部分の面積はそのpHにおいて
残存するα−アミラーゼ活性と相関する。野生型株の対
照より高い活性を示した突然変異株は第２次のスクリー
ニングに選択する。野生型のハローはこの実験において
良好な再現性を示す。
【００２６】4.第２次スクリーニング 栄養分の高いプレートから陽性コロニーを拾い新たなＨ
Ｉプレート＋クロラムフェニコール上で精製する。各突
然変異株から４つのシングルコロニーを拾い、第一次ス
クリーニングの際と同様の方法で再度検定する。さら
に、これらの培養液の希釈系列をＳＴＷで作りそれを中
性pHのスクリーニングプレート(pH=7.0)にスポットす
る。野生型株の培養との比較から低いpHで高い活性を示
すのがα−アミラーゼの産生が全般に高かったためか本
質的により安定なα−アミラーゼのためであるのかを決
定することができる。第２次スクリーニングに「生き残
った」突然変異株は突然変異をおこされた遺伝子の部分
のヌクレオチド配列を決定することにより解析を行う。
Ｉプレート＋クロラムフェニコール上で精製する。各突
然変異株から４つのシングルコロニーを拾い、第一次ス
クリーニングの際と同様の方法で再度検定する。さら
に、これらの培養液の希釈系列をＳＴＷで作りそれを中
性pHのスクリーニングプレート(pH=7.0)にスポットす
る。野生型株の培養との比較から低いpHで高い活性を示
すのがα−アミラーゼの産生が全般に高かったためか本
質的により安定なα−アミラーゼのためであるのかを決
定することができる。第２次スクリーニングに「生き残
った」突然変異株は突然変異をおこされた遺伝子の部分
のヌクレオチド配列を決定することにより解析を行う。
【００２７】Ｂ．アルカリ耐性α−アミラーゼのスクリ
ーニング アルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニングは酸耐
性α−アミラーゼに用いられた方法と同様の方法で行わ
れる。マイクロタイタープレートで増殖後サンプル５μ
Ｌを各ウェルからとり保存用プレートと実際のスクリー
ニングプレートにスポットする。後者は バクトアガー（ＤＩＦＣＯ） １．５％ ツルコフスキーでん粉 ０．２％ を含み、脱金属水と ＣａＣｌ2 ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２．５ｍＭ ＢＳａ １０μｇ／ｍｌ を加え完成する。 スクリーニングプレートはpH値9.0、9.5、10.0の５０ｍ
Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液で緩衝化する。pH値の範囲は最も
高いpH値において野生型のα−アミラーゼがほとんどま
たは全く活性を示さなくなるように選ぶ。５５℃で２時
間培養後ヨー素液をプレートに注ぐ。野生型酵素よりよ
いハローを形成した突然変異株はスクリーニング第２段
階に選択する。この第２次スクリーニングは酸耐性株の
スクリーニングの際と同様の方法で行う。
ーニング アルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニングは酸耐
性α−アミラーゼに用いられた方法と同様の方法で行わ
れる。マイクロタイタープレートで増殖後サンプル５μ
Ｌを各ウェルからとり保存用プレートと実際のスクリー
ニングプレートにスポットする。後者は バクトアガー（ＤＩＦＣＯ） １．５％ ツルコフスキーでん粉 ０．２％ を含み、脱金属水と ＣａＣｌ2 ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＮａＨＣＯ3 ２．５ｍＭ ＢＳａ １０μｇ／ｍｌ を加え完成する。 スクリーニングプレートはpH値9.0、9.5、10.0の５０ｍ
Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液で緩衝化する。pH値の範囲は最も
高いpH値において野生型のα−アミラーゼがほとんどま
たは全く活性を示さなくなるように選ぶ。５５℃で２時
間培養後ヨー素液をプレートに注ぐ。野生型酵素よりよ
いハローを形成した突然変異株はスクリーニング第２段
階に選択する。この第２次スクリーニングは酸耐性株の
スクリーニングの際と同様の方法で行う。
【００２８】Ｃ．熱耐性α−アミラーゼ突然変異株のス
クリーニング 高温で野生型α−アミラーゼより高いあるいは低い活性
をもつα−アミラーゼ突然変異体は過熱後の培養液の残
存するα−アミラーゼ活性により生じた澱粉プレートの
ハローの比較により選択することができる。 方法： 1. 突然変異体はpHスクリーニングの際と同じ方法で増
殖させる。 2. 突然変異体をpHスクリーニングの際のようにＨＩ寒
天プレート上で増殖させる。 3. マイクロタイタープレートの各ウェルを加熱時に培
養液が蒸発しないよう使い捨てキャップ（フロウラボラ
トリーズ）で密閉する。 4. マイクロタイタープレートを水浴で９５℃１時間加
熱する。加熱後マイクロタイタープレートはサンプル全
てをマイクロタイタープレートの底に集めるため遠心し
た。 5. 熱耐性突然変異体のスクリーニングは次のように行
った。各ウェルから５μＬの培養液をとり中性のスクリ
ーニングプレート（pHスクリーニング参照）にスポット
した。このプレートは５５℃１時間培養した。ヨウ素液
で澱粉を染色した後突然変異体と対照はスポットの透明
部分（ハロー）を比較することにより残存するα−アミ
ラーゼ活性に対するスクリーニングを行うことができ
る。対照の残存する活性が高すぎる場合、野生型酵素よ
り耐熱性の突然変異体を識別するため希釈系列を作製し
スクリーニングプレートにスポットしなければならな
い。 6. 興味深い突然変異体である可能性のあるものはpHス
クリーニング法で行ったようにさらに試験する。スクリ
ーニングタイプＡまたはＢとＣの組み合わせは、組み合
わせた特長を望むならば用いることができる。例えばア
ルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニングの第一次
段階の後、熱耐性のスクリーニングの第２段階を行うこ
とができる。両方の試験で陽性の結果を示した突然変異
体は望まし性質を合わせ持った候補として選択すること
ができよう。
クリーニング 高温で野生型α−アミラーゼより高いあるいは低い活性
をもつα−アミラーゼ突然変異体は過熱後の培養液の残
存するα−アミラーゼ活性により生じた澱粉プレートの
ハローの比較により選択することができる。 方法： 1. 突然変異体はpHスクリーニングの際と同じ方法で増
殖させる。 2. 突然変異体をpHスクリーニングの際のようにＨＩ寒
天プレート上で増殖させる。 3. マイクロタイタープレートの各ウェルを加熱時に培
養液が蒸発しないよう使い捨てキャップ（フロウラボラ
トリーズ）で密閉する。 4. マイクロタイタープレートを水浴で９５℃１時間加
熱する。加熱後マイクロタイタープレートはサンプル全
てをマイクロタイタープレートの底に集めるため遠心し
た。 5. 熱耐性突然変異体のスクリーニングは次のように行
った。各ウェルから５μＬの培養液をとり中性のスクリ
ーニングプレート（pHスクリーニング参照）にスポット
した。このプレートは５５℃１時間培養した。ヨウ素液
で澱粉を染色した後突然変異体と対照はスポットの透明
部分（ハロー）を比較することにより残存するα−アミ
ラーゼ活性に対するスクリーニングを行うことができ
る。対照の残存する活性が高すぎる場合、野生型酵素よ
り耐熱性の突然変異体を識別するため希釈系列を作製し
スクリーニングプレートにスポットしなければならな
い。 6. 興味深い突然変異体である可能性のあるものはpHス
クリーニング法で行ったようにさらに試験する。スクリ
ーニングタイプＡまたはＢとＣの組み合わせは、組み合
わせた特長を望むならば用いることができる。例えばア
ルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニングの第一次
段階の後、熱耐性のスクリーニングの第２段階を行うこ
とができる。両方の試験で陽性の結果を示した突然変異
体は望まし性質を合わせ持った候補として選択すること
ができよう。
【００２９】実施例６ ｐＭａＴＬｉａ６の重亜硫酸突然変異 ４３１５番目から４５６９番目（図３）までのギャップ
の入ったヘテロ２本鎖を得るためｐＭａＴＬｉａ６の１
本鎖ＤＮＡをＳａｃII−ＣｌａＩで切断したｐＭｃＴＬ
ｉａ６と共にアニールした。このヘテロ二本鎖に対し重
亜硫酸突然変異を行った（実施例参照）。大腸菌ＷＫ６
ｍｕｔｓ（ツェルとフリッツ、同上）に導入し、クロラ
ムフェニコールを含む寒天プレート（５０μｇ／ｍｌ）
で選択後、プラスミドＤＮＡを単離し大腸菌ＷＫ６に導
入した。大腸菌ＷＫ６ＭｕｔＳはＣＢＳ４７２．８８と
して、大腸菌ＷＫ６はＣＢＳ４７３．８８として寄託さ
れている。生じた形質転換体は２．０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び０．２
０ｍＭ ＩＰＴＧ（シグマ社）を含むＢＨＩ培地（ＤＩ
ＦＣＯ社）中３７℃４０時間、マイクロタイタープレー
トで振とうせず培養する。pH耐性突然変異体のスクリー
ニングは実施例５で述べたようにして行った。約３００
個のクロラムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニ
ングした。ＤＮＡシークエンスにより決定した突然変異
頻度はギャップ上平均０．４回／分子であった。１つの
酸耐性突然変異体Ｄ７がpHスクリーニングの後同定され
た。この突然変異体の配列からトリプレットがＣＡＣか
らＴＡＣに変わったことによるＨ１３３Ｙの変異である
ことがわかった。
の入ったヘテロ２本鎖を得るためｐＭａＴＬｉａ６の１
本鎖ＤＮＡをＳａｃII−ＣｌａＩで切断したｐＭｃＴＬ
ｉａ６と共にアニールした。このヘテロ二本鎖に対し重
亜硫酸突然変異を行った（実施例参照）。大腸菌ＷＫ６
ｍｕｔｓ（ツェルとフリッツ、同上）に導入し、クロラ
ムフェニコールを含む寒天プレート（５０μｇ／ｍｌ）
で選択後、プラスミドＤＮＡを単離し大腸菌ＷＫ６に導
入した。大腸菌ＷＫ６ＭｕｔＳはＣＢＳ４７２．８８と
して、大腸菌ＷＫ６はＣＢＳ４７３．８８として寄託さ
れている。生じた形質転換体は２．０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び０．２
０ｍＭ ＩＰＴＧ（シグマ社）を含むＢＨＩ培地（ＤＩ
ＦＣＯ社）中３７℃４０時間、マイクロタイタープレー
トで振とうせず培養する。pH耐性突然変異体のスクリー
ニングは実施例５で述べたようにして行った。約３００
個のクロラムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニ
ングした。ＤＮＡシークエンスにより決定した突然変異
頻度はギャップ上平均０．４回／分子であった。１つの
酸耐性突然変異体Ｄ７がpHスクリーニングの後同定され
た。この突然変異体の配列からトリプレットがＣＡＣか
らＴＡＣに変わったことによるＨ１３３Ｙの変異である
ことがわかった。
【００３０】突然変異体Ｄ７は熱耐性スクリーニングア
ッセイ（実施例５）においても陽性であることがわかっ
た。ＳａｃII−ＣｌａＩ断片の直前から始まるよう計画
された特定のオリゴヌクレオチドを用い、１本鎖ＤＮＡ
のＤＮＡシークエンスが行われた。別々の突然変異実験
において１０００個のクロラムフェニコール耐性形質転
換体をスクリーニングした。他の酸耐性突然変異体であ
る２Ｄ５がpHスクリーニングの後同定された。この突然
変異体は次の変異を持つ。 Ｈ１３３Ｙ ＣＡＣ→ＴＡＣ Ｔ１４９Ｉ ＣＡＣ→ＡＴＡ 重亜硫酸突然変異を図３の４５６９番目から４９７６番
目までのＣｌａＩ−ＳａｌＩギャップに対してもこれま
で述べたのと同様の方法で行った。約３００個のクロラ
ムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニングした
（突然変異頻度０．６回／分子）。酸耐性形質転換体は
全く見出されなかった。多数の酸不安定な変異体を見出
した。この酸に不安定な突然変異体の中にはよりアルカ
リ耐性の表現型を生じるpHスペクトラムの移行があるも
のがあるのかもしれない。
ッセイ（実施例５）においても陽性であることがわかっ
た。ＳａｃII−ＣｌａＩ断片の直前から始まるよう計画
された特定のオリゴヌクレオチドを用い、１本鎖ＤＮＡ
のＤＮＡシークエンスが行われた。別々の突然変異実験
において１０００個のクロラムフェニコール耐性形質転
換体をスクリーニングした。他の酸耐性突然変異体であ
る２Ｄ５がpHスクリーニングの後同定された。この突然
変異体は次の変異を持つ。 Ｈ１３３Ｙ ＣＡＣ→ＴＡＣ Ｔ１４９Ｉ ＣＡＣ→ＡＴＡ 重亜硫酸突然変異を図３の４５６９番目から４９７６番
目までのＣｌａＩ−ＳａｌＩギャップに対してもこれま
で述べたのと同様の方法で行った。約３００個のクロラ
ムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニングした
（突然変異頻度０．６回／分子）。酸耐性形質転換体は
全く見出されなかった。多数の酸不安定な変異体を見出
した。この酸に不安定な突然変異体の中にはよりアルカ
リ耐性の表現型を生じるpHスペクトラムの移行があるも
のがあるのかもしれない。
【００３１】実施例７ ｐＭａＴＬｉａ６の酵素的突然変異 ４５６９番目から４９７６番目（図３）までに渡るヘテ
ロ２本鎖を得るため、ＣｌａＩ−ＳａｌＩで切断したｐ
ＭｃＴＬｉａ６と共に、１本鎖ｐＭａＴＬｉａ６（図
４）をアニールした。ギャップの入った２本鎖に対し実
施例に述べたように酵素的に偽導入し突然変異を行っ
た。ｄＡＴＰ制限プライマー伸長後に得たサンプルは３
つに分け、それぞれｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと共
に逆転写酵素存在下インキュベーションした。３７℃１
０分間インキュベーション後４つの全てのｄＮＴＰとク
レノウポリメラーゼを加え反応させ、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼを完全に２本鎖ＤＮＡに伸長させるために加えた。
このＤＮＡは大腸菌ＷＫ６ＭｕｔＳに導入し、プラスミ
ドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡは続いて大腸菌
ＷＫ６に導入しクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含む寒天プレート上でコロニーを選択した。得ら
れた突然変異株は実施例５で述べたようにα−アミラー
ゼの安定性に関してスクリーニングを行った。別の実験
でＳｐｅＩ−ＳａｃIIギャップに対し、それぞれｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰとの制限プライマー伸長を行っ
た。このプライマー群に対し偽導入（実験の項参照）に
より突然変異を行った。１００個のクロラムフェニコー
ル耐性形質転換株をpHプレート上で試験し（実施例５）
突然変異体Ｍ２９を低いpHでより耐性を示すと同定し
た。この変異は次の配列であると決定した。Ａ１１１Ｔ
→ＧＣＧ→ＴＣＧ
ロ２本鎖を得るため、ＣｌａＩ−ＳａｌＩで切断したｐ
ＭｃＴＬｉａ６と共に、１本鎖ｐＭａＴＬｉａ６（図
４）をアニールした。ギャップの入った２本鎖に対し実
施例に述べたように酵素的に偽導入し突然変異を行っ
た。ｄＡＴＰ制限プライマー伸長後に得たサンプルは３
つに分け、それぞれｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと共
に逆転写酵素存在下インキュベーションした。３７℃１
０分間インキュベーション後４つの全てのｄＮＴＰとク
レノウポリメラーゼを加え反応させ、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼを完全に２本鎖ＤＮＡに伸長させるために加えた。
このＤＮＡは大腸菌ＷＫ６ＭｕｔＳに導入し、プラスミ
ドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡは続いて大腸菌
ＷＫ６に導入しクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含む寒天プレート上でコロニーを選択した。得ら
れた突然変異株は実施例５で述べたようにα−アミラー
ゼの安定性に関してスクリーニングを行った。別の実験
でＳｐｅＩ−ＳａｃIIギャップに対し、それぞれｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰとの制限プライマー伸長を行っ
た。このプライマー群に対し偽導入（実験の項参照）に
より突然変異を行った。１００個のクロラムフェニコー
ル耐性形質転換株をpHプレート上で試験し（実施例５）
突然変異体Ｍ２９を低いpHでより耐性を示すと同定し
た。この変異は次の配列であると決定した。Ａ１１１Ｔ
→ＧＣＧ→ＴＣＧ
【００３２】実施例８ 耐性突然変異体の性質 重亜硫酸突然変異実験で得られた２つの突然変異体をさ
らに解析した。前述したようにＤＮＡシークエンスによ
り次のアミノ酸の置換が示唆された。−Ｄ７では１３３
番目のヒスチジンの代わりにチロシンを含み（Ｄ７＝Ｈ
１３３Ｙ）、−２Ｄ５はＤ７の変異とその他に１４９番
目のトレオニンがイソロイシンに置換されている（２Ｄ
５＝Ｈ１３３Ｙ、Ｔ１４９Ｉ）。 ａ）酵素活性の測定 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの野生型と突
然変異体の酵素活性を４−ニトロフェニル−マルトペン
タオシド（４ＮＰ−ＤＰ５）を基質として用い測定し
た。反応の結果４ニトロフェノールとマルトペンタオー
スが生じＯＤ４０５の変化を測定することにより活性を
調べることができる。アッセイは５０ｍＭＭＯＰＳ、５
０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ2(pH7.15)及び０−１
ｍＭ４ＮＰ−ＤＰ５存在下３５℃で行った。初速度を測
定し、Ｅ−ニトロフェノールは１０．０００Ｌ／Ｍ１ｃ
ｍと定めた。図９に野生型酵素と２Ｄ５α−アミラーゼ
についての結果を示す。ＶｍａｘとＫｍを計算し表１に
示した。 表１ Ｖｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ Ｋｍ（ｍＭ） ＷＴ ６６．７±０．９ ０．１１２±０．００５ ２Ｄ５ ６６．３±０．７ ０．１１９±０．００４ 表１はα−アミラーゼ２Ｄ５の変異が本質的に酵素活性
に影響を及ぼさないことを明らかにしている。
らに解析した。前述したようにＤＮＡシークエンスによ
り次のアミノ酸の置換が示唆された。−Ｄ７では１３３
番目のヒスチジンの代わりにチロシンを含み（Ｄ７＝Ｈ
１３３Ｙ）、−２Ｄ５はＤ７の変異とその他に１４９番
目のトレオニンがイソロイシンに置換されている（２Ｄ
５＝Ｈ１３３Ｙ、Ｔ１４９Ｉ）。 ａ）酵素活性の測定 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの野生型と突
然変異体の酵素活性を４−ニトロフェニル−マルトペン
タオシド（４ＮＰ−ＤＰ５）を基質として用い測定し
た。反応の結果４ニトロフェノールとマルトペンタオー
スが生じＯＤ４０５の変化を測定することにより活性を
調べることができる。アッセイは５０ｍＭＭＯＰＳ、５
０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ2(pH7.15)及び０−１
ｍＭ４ＮＰ−ＤＰ５存在下３５℃で行った。初速度を測
定し、Ｅ−ニトロフェノールは１０．０００Ｌ／Ｍ１ｃ
ｍと定めた。図９に野生型酵素と２Ｄ５α−アミラーゼ
についての結果を示す。ＶｍａｘとＫｍを計算し表１に
示した。 表１ Ｖｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ Ｋｍ（ｍＭ） ＷＴ ６６．７±０．９ ０．１１２±０．００５ ２Ｄ５ ６６．３±０．７ ０．１１９±０．００４ 表１はα−アミラーゼ２Ｄ５の変異が本質的に酵素活性
に影響を及ぼさないことを明らかにしている。
【００３３】ｂ）熱失活性に対するＣａ2+の効果 種々のカルシウム濃度下での熱失活性実験を野生型酵
素、Ｄ７、２Ｄ５に対し行った。方法は以下の通り。 １）脱金属 酵素（２−３ｍｇ／ｍｌ）は２４時間以下の緩衝液に対して透析 ３×１Ｌ ２０ｍＭ ＭＯＰＳ ５ｍＭ ＥＤＴＡ ５ｍＭ ＥＧＴＡ pH7.0 ３×１Ｌ ２０ｍＭ ＭＯＰＳ pH7.0 ２）再金属付加 −５００μＬ緩衝液１００ｍＭ（例ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＤＰＳ） −１４５μＬ脱金属化酵素（例、２．１５ｍｇ／ｍｌ） −１００μＬ ＣａＣｌ2（１００、５０、３０、２０、１０、５：または２． ５ｍＭ） −ＸμＬ Ｋ2ＳＯ4（１００ｍＭ） −（２５５−Ｘ）μＬＨ2Ｏ 〔ＣａＣｌ2〕最終濃度 〔Ｋ2ＳＯ4〕最終濃度 （ｍＭ） （ｍＭ） ０．２５ １４．７５ ０．５ １４．５ １ １４ ２ １３ ３ １２ ５ １０ １０ ０ ＊−ＭＥＳのpH・例、室温で６．７７は９０℃で６．０となる。 （ｐＫａ６．１５ ｐＫａ／℃＝−０．０１１）。 −ｐＫａ値はメルク社の表（２価イオン緩衝液）から採用した。
素、Ｄ７、２Ｄ５に対し行った。方法は以下の通り。 １）脱金属 酵素（２−３ｍｇ／ｍｌ）は２４時間以下の緩衝液に対して透析 ３×１Ｌ ２０ｍＭ ＭＯＰＳ ５ｍＭ ＥＤＴＡ ５ｍＭ ＥＧＴＡ pH7.0 ３×１Ｌ ２０ｍＭ ＭＯＰＳ pH7.0 ２）再金属付加 −５００μＬ緩衝液１００ｍＭ（例ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＤＰＳ） −１４５μＬ脱金属化酵素（例、２．１５ｍｇ／ｍｌ） −１００μＬ ＣａＣｌ2（１００、５０、３０、２０、１０、５：または２． ５ｍＭ） −ＸμＬ Ｋ2ＳＯ4（１００ｍＭ） −（２５５−Ｘ）μＬＨ2Ｏ 〔ＣａＣｌ2〕最終濃度 〔Ｋ2ＳＯ4〕最終濃度 （ｍＭ） （ｍＭ） ０．２５ １４．７５ ０．５ １４．５ １ １４ ２ １３ ３ １２ ５ １０ １０ ０ ＊−ＭＥＳのpH・例、室温で６．７７は９０℃で６．０となる。 （ｐＫａ６．１５ ｐＫａ／℃＝−０．０１１）。 −ｐＫａ値はメルク社の表（２価イオン緩衝液）から採用した。
【００３４】３）熱失活 約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の、室温でプレインキュベー
ションした酵素液１ｍｌを密閉したビアスバイアル（テ
フロンコートしたシール）中で９０．５℃または９５℃
で熱した。０から６時間後一定時間ごとにシリンジでサ
ンプル５０μＬをとり氷上で冷却した。残存する酵素活
性を４ＮＰ−ＤＤ５（０．５ｍＭ）を用い測定した。シ
ングル エフスポネンシャル デケイ フィティング
プログラム(Singleexponential Decay Fitting Progra
m)、（グラフパッド社 ＧＲＡＰＨＰＡＤ）を用い半減
期を計算した。図１０、１１に野生型酵素とＤ７α−ア
ミラーゼのpH5.5及びpH7.0各々での９０．５℃での半減
期をＣａ2+濃度の関数として示している。２Ｄ５のＣａ
2+依存性は９５℃においてはpH7.0において求めたのみ
である（図１２）。変異体のＣａ2+依存性も野生型酵素
の場合と変わらないことがわかる。 Ｃ．異なるpH値での突然変異体α−アミラーゼの熱耐性 Ｄ７と２Ｄ５両方の熱耐性のpH依存性を上述したように
１ｍＭＣａ2+を含む緩衝液中で９０．５℃及び９５℃各
々において求めた。Ｄ７と２Ｄ５両方について熱耐性は
pHの範囲全般において大きく向上した（２Ｄ５では２倍
まで）と結論できる。
ションした酵素液１ｍｌを密閉したビアスバイアル（テ
フロンコートしたシール）中で９０．５℃または９５℃
で熱した。０から６時間後一定時間ごとにシリンジでサ
ンプル５０μＬをとり氷上で冷却した。残存する酵素活
性を４ＮＰ−ＤＤ５（０．５ｍＭ）を用い測定した。シ
ングル エフスポネンシャル デケイ フィティング
プログラム(Singleexponential Decay Fitting Progra
m)、（グラフパッド社 ＧＲＡＰＨＰＡＤ）を用い半減
期を計算した。図１０、１１に野生型酵素とＤ７α−ア
ミラーゼのpH5.5及びpH7.0各々での９０．５℃での半減
期をＣａ2+濃度の関数として示している。２Ｄ５のＣａ
2+依存性は９５℃においてはpH7.0において求めたのみ
である（図１２）。変異体のＣａ2+依存性も野生型酵素
の場合と変わらないことがわかる。 Ｃ．異なるpH値での突然変異体α−アミラーゼの熱耐性 Ｄ７と２Ｄ５両方の熱耐性のpH依存性を上述したように
１ｍＭＣａ2+を含む緩衝液中で９０．５℃及び９５℃各
々において求めた。Ｄ７と２Ｄ５両方について熱耐性は
pHの範囲全般において大きく向上した（２Ｄ５では２倍
まで）と結論できる。
【００３５】実施例９ 枯草菌での突然変異体酵素の産生 バチルスリケンホルミスのα−アミラーゼでの突然変異
遺伝子は大腸菌ＷＫ−６において発現させることにより
同定されたが、これを２つの異なった方法で枯草菌の発
現ベクターに挿入した。 ａ）α−アミラーゼ遺伝子の単一の制限酵素切断部位を
用い（図４）、突然変異箇所を含むＤＮＡ断片をｐＭａ
ＴＬｉａ６突然変異株から単離しｐＢＭａ６、Ｌｉａ６
の相固な位置にサブクローンした。後者のプラスミドは
大腸菌、枯草菌いずれにおいても複製できるが、それを
次にＳａｃＩで切断しＴ４ＤＮＡリガーゼで再環状化し
た。バチルスサチリスＩＡ４０に導入後、ＳＰＯ2プロ
モーター制御下でα−アミラーゼの多量の産生が認めら
れた。再環状化したｐＢＭａ６、Ｌｉａ６はベクターの
大腸菌のＤＮＡ断片が除かれたのを示すためにｐＢ６、
Ｌｉａ６と命名する。 ｂ）ｐＢＭａ６、Ｌｉａ６の１本鎖ＤＮＡを大腸菌から
再回収し、α−アミラーゼ遺伝子上に目的のギャップを
もつ２本鎖ＤＮＡを得るために制限酵素で切断したｐＢ
Ｍｃ６、Ｌｉａ６の２本鎖ＤＮＡとアニールした。この
ギャップに対し望む突然変異をコードするオリゴヌクレ
オチドとの部位限定突然変異（実験の項で述べたよう
に）を行った。ｐＢＭｃ６、Ｌｉａ６ベクターは次に上
述したようにｐＢ６、Ｌｉａ６型ベクターに変換する。
ａ）においてはもし突然変異が異なるギャップで選択的
におこるならば、異なる単一部位突然変異(single site
mutation)の組み合わせを行うことができるが、方法
ｂ）を用いる。突然変異株Ｄ７と２Ｄ５の変異ＤＮＡ
は、方法ａ）により、ＳａｃII−ＳａｌＩＤＮＡ断片を
交換することによりｐＢＭａ６、Ｌｉａ６に挿入した。
そしてα−アミラーゼを形質転換したバチルスズブチリ
ス１Ａ４０の培養上清から回収した。両方の突然変異株
の培養上清に対し実施例のスクリーニング操作を行い、
両方の突然変異株の培養上清に対し実施例のスクリーニ
ング操作を行い、両方の突然変異株は野生型株のｐＢ
６、Ｌｉａにより産生されたα−アミラーゼより酸耐性
かつ熱耐性であるα−アミラーゼを産生することを確か
めた。
遺伝子は大腸菌ＷＫ−６において発現させることにより
同定されたが、これを２つの異なった方法で枯草菌の発
現ベクターに挿入した。 ａ）α−アミラーゼ遺伝子の単一の制限酵素切断部位を
用い（図４）、突然変異箇所を含むＤＮＡ断片をｐＭａ
ＴＬｉａ６突然変異株から単離しｐＢＭａ６、Ｌｉａ６
の相固な位置にサブクローンした。後者のプラスミドは
大腸菌、枯草菌いずれにおいても複製できるが、それを
次にＳａｃＩで切断しＴ４ＤＮＡリガーゼで再環状化し
た。バチルスサチリスＩＡ４０に導入後、ＳＰＯ2プロ
モーター制御下でα−アミラーゼの多量の産生が認めら
れた。再環状化したｐＢＭａ６、Ｌｉａ６はベクターの
大腸菌のＤＮＡ断片が除かれたのを示すためにｐＢ６、
Ｌｉａ６と命名する。 ｂ）ｐＢＭａ６、Ｌｉａ６の１本鎖ＤＮＡを大腸菌から
再回収し、α−アミラーゼ遺伝子上に目的のギャップを
もつ２本鎖ＤＮＡを得るために制限酵素で切断したｐＢ
Ｍｃ６、Ｌｉａ６の２本鎖ＤＮＡとアニールした。この
ギャップに対し望む突然変異をコードするオリゴヌクレ
オチドとの部位限定突然変異（実験の項で述べたよう
に）を行った。ｐＢＭｃ６、Ｌｉａ６ベクターは次に上
述したようにｐＢ６、Ｌｉａ６型ベクターに変換する。
ａ）においてはもし突然変異が異なるギャップで選択的
におこるならば、異なる単一部位突然変異(single site
mutation)の組み合わせを行うことができるが、方法
ｂ）を用いる。突然変異株Ｄ７と２Ｄ５の変異ＤＮＡ
は、方法ａ）により、ＳａｃII−ＳａｌＩＤＮＡ断片を
交換することによりｐＢＭａ６、Ｌｉａ６に挿入した。
そしてα−アミラーゼを形質転換したバチルスズブチリ
ス１Ａ４０の培養上清から回収した。両方の突然変異株
の培養上清に対し実施例のスクリーニング操作を行い、
両方の突然変異株の培養上清に対し実施例のスクリーニ
ング操作を行い、両方の突然変異株は野生型株のｐＢ
６、Ｌｉａにより産生されたα−アミラーゼより酸耐性
かつ熱耐性であるα−アミラーゼを産生することを確か
めた。
【００３６】従って、枯草菌でのα−アミラーゼ突然変
異株の表現型は大腸菌での表現型と異ならない。最終的
にｐＢ６、Ｌｉａ６突然変異体は、バチルスリヘニホル
ミスＴ９に導入された。この菌はバチルスリヘニホルミ
スＴ５のプロテアーゼ、α−アミラーゼ欠損類縁株であ
る（ＥＰ−０２５３４５５、ＣＢＳ４７０．８３）。宿
主のＴ９は宿主と同一の系でα−アミラーゼの突然変異
株を多量に産生するために用いられた。染色体のα−ア
ミラーゼ遺伝子がないためにこの株は野生型のα−アミ
ラーゼが全く混合して産生されないので突然変異株α−
アミラーゼを産生するのに非常に適している。この菌株
から回収した酵素は工業上の応用試験に用いた。突然変
異体ｐＢ６、Ｌｉａ６、２Ｄ５とｐＢ６、Ｌｉａ６、Ｄ
７の工業上の利用を示した。
異株の表現型は大腸菌での表現型と異ならない。最終的
にｐＢ６、Ｌｉａ６突然変異体は、バチルスリヘニホル
ミスＴ９に導入された。この菌はバチルスリヘニホルミ
スＴ５のプロテアーゼ、α−アミラーゼ欠損類縁株であ
る（ＥＰ−０２５３４５５、ＣＢＳ４７０．８３）。宿
主のＴ９は宿主と同一の系でα−アミラーゼの突然変異
株を多量に産生するために用いられた。染色体のα−ア
ミラーゼ遺伝子がないためにこの株は野生型のα−アミ
ラーゼが全く混合して産生されないので突然変異株α−
アミラーゼを産生するのに非常に適している。この菌株
から回収した酵素は工業上の応用試験に用いた。突然変
異体ｐＢ６、Ｌｉａ６、２Ｄ５とｐＢ６、Ｌｉａ６、Ｄ
７の工業上の利用を示した。
【００３７】実施例１０ 澱粉分解の条件下での突然変異株α−アミラーゼの応用
試験 突然変異株α−アミラーゼ２Ｄ５をより実際的状況で試
験するため、我々は限外濾過により発酵培養液（実施例
９）を精製し酵素を５０％プロピレングリコールで処理
した。３種のサンプルを試験した。 893701：野生型株 バチルスリヘニホルミスＴ５α−ア
ミラーゼ1530ＴＡＵ／ｇ 893703：２Ｄ５ 野生型と同様に調製した突然変異株
2820ＴＡＵ／ｇ Maxamyl 0819 工業用サンプル 7090ＴＡＵ／ｇ １ＴＡＵ（熱耐性α−アミラーゼ単位）は標準化した条
件下で１分間に１ｇの澱粉をヨウ素と反応後６２０ｎｍ
で対照の色と同一の吸収を持つ産物に変換する酵素の量
として定義する。標準条件はpH6.6、３０℃、反応時間
２０分である。対照の色は１００ｍｌ蒸留水中２５ｇＣ
ｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２．８４ｇ Ｋ2Ｃｒ2Ｏ7及び１ｍ
ｌＨＣｌ（１Ｍ）である。 1.低いpH（５．５及び５．２５）での液化試験 澱粉のスラリーの温度を１１０℃±０．５℃にできるだ
け急速に上げ６分間この温度に保つ。液化は連続的流路
（５．４Ｌ／ｎ）中で行う。１３５ｍｌ（液化１．５
分）の３種のサンプルを液化４５、６０、及び７５分後
取り、９５℃に２時間保つ。この後、サンプル５０ｍｌ
を１ＮＨ2ＳＯ4 ０．４ｍｌでpH３．５に調製し、Ｄ．
試験 突然変異株α−アミラーゼ２Ｄ５をより実際的状況で試
験するため、我々は限外濾過により発酵培養液（実施例
９）を精製し酵素を５０％プロピレングリコールで処理
した。３種のサンプルを試験した。 893701：野生型株 バチルスリヘニホルミスＴ５α−ア
ミラーゼ1530ＴＡＵ／ｇ 893703：２Ｄ５ 野生型と同様に調製した突然変異株
2820ＴＡＵ／ｇ Maxamyl 0819 工業用サンプル 7090ＴＡＵ／ｇ １ＴＡＵ（熱耐性α−アミラーゼ単位）は標準化した条
件下で１分間に１ｇの澱粉をヨウ素と反応後６２０ｎｍ
で対照の色と同一の吸収を持つ産物に変換する酵素の量
として定義する。標準条件はpH6.6、３０℃、反応時間
２０分である。対照の色は１００ｍｌ蒸留水中２５ｇＣ
ｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２．８４ｇ Ｋ2Ｃｒ2Ｏ7及び１ｍ
ｌＨＣｌ（１Ｍ）である。 1.低いpH（５．５及び５．２５）での液化試験 澱粉のスラリーの温度を１１０℃±０．５℃にできるだ
け急速に上げ６分間この温度に保つ。液化は連続的流路
（５．４Ｌ／ｎ）中で行う。１３５ｍｌ（液化１．５
分）の３種のサンプルを液化４５、６０、及び７５分後
取り、９５℃に２時間保つ。この後、サンプル５０ｍｌ
を１ＮＨ2ＳＯ4 ０．４ｍｌでpH３．５に調製し、Ｄ．
【００３８】Ｅ．決定の前に酵素活性を止めるために１
０分間沸騰水に入れる。 サンプルの残りは残存酵素活性を測定するため冷却す
る。 スラリー組成： ３．３ｋｇとうもろこしでん粉Ｄ．Ｓ．８８％（２．９
０４ｋｇ乾燥澱粉）。 ３．４５Ｌ 井戸水（４０Ｔ．Ｈ．） スラリーの乾燥物質は３３％。pHは１Ｎ硫酸または１Ｎ
ＮａＯＨにより調製する。 酵素濃度：４．４ＴＡＵ／ｇｒ乾燥澱粉。 流速は試験の間２、３回確認する。 2.Ｄ．Ｅ．測定 液化澱粉の乾燥物質を屈折率測定計により確認する（約
３４％）。Ｄ．Ｅ．は有名なレインエイノン法により決
定する。結果は図１５に示す。 3.残存酵素活性 液化澱粉中の残存アミラーゼ活性は、ブラベンダーアミ
ログラフを用いて測定した。 ４０ｇ ジャガイモ澱粉 ３９０ｍｌ 蒸留水５０℃ ５０ｍｌ トリス緩衝液 ０．０５Ｍ pH6.50 ５ｍＭ ３０ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ 粘度が安定したら（１０分）温度を８０℃に上げ（１．
５°／分）希釈した液化澱粉５ｍｌ（７ｇを蒸留水で５
０ｍｌにする）を加え、２０分後粘度の減少を測定す
る。この減少は酵素活性と相関している。既知の酵素濃
度を用いた標準曲線により、Ｔ．Ａ．Ｕ．で表される残
存活性を推定することができる。変異体２Ｄ５はpH5.5
以下及び１１０℃において野生型酵素より顕著に高い活
性を示す。変異体２Ｄ５についてpH5.25において２−３
ＤＥ単位の上昇が得られる。
０分間沸騰水に入れる。 サンプルの残りは残存酵素活性を測定するため冷却す
る。 スラリー組成： ３．３ｋｇとうもろこしでん粉Ｄ．Ｓ．８８％（２．９
０４ｋｇ乾燥澱粉）。 ３．４５Ｌ 井戸水（４０Ｔ．Ｈ．） スラリーの乾燥物質は３３％。pHは１Ｎ硫酸または１Ｎ
ＮａＯＨにより調製する。 酵素濃度：４．４ＴＡＵ／ｇｒ乾燥澱粉。 流速は試験の間２、３回確認する。 2.Ｄ．Ｅ．測定 液化澱粉の乾燥物質を屈折率測定計により確認する（約
３４％）。Ｄ．Ｅ．は有名なレインエイノン法により決
定する。結果は図１５に示す。 3.残存酵素活性 液化澱粉中の残存アミラーゼ活性は、ブラベンダーアミ
ログラフを用いて測定した。 ４０ｇ ジャガイモ澱粉 ３９０ｍｌ 蒸留水５０℃ ５０ｍｌ トリス緩衝液 ０．０５Ｍ pH6.50 ５ｍＭ ３０ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ 粘度が安定したら（１０分）温度を８０℃に上げ（１．
５°／分）希釈した液化澱粉５ｍｌ（７ｇを蒸留水で５
０ｍｌにする）を加え、２０分後粘度の減少を測定す
る。この減少は酵素活性と相関している。既知の酵素濃
度を用いた標準曲線により、Ｔ．Ａ．Ｕ．で表される残
存活性を推定することができる。変異体２Ｄ５はpH5.5
以下及び１１０℃において野生型酵素より顕著に高い活
性を示す。変異体２Ｄ５についてpH5.25において２−３
ＤＥ単位の上昇が得られる。
【００３９】実施例１１ 変異体α−アミラーゼの繊維糊抜きの条件下での適用試
験 アルカリ性α−アミラーゼ変異株の工業的応用を試験す
るため次の溶液中で２０℃での安定性に関して試験を行
う。 １．４％ 過酸化水素（３５％） １．０−１．５％ 苛性ソーダ（１００％） １５−２０ml／Ｌ ケイ酸ナトリウム（３８Ｂｅ） ０．３−０．５％ スルホン酸アルキルベンゼン(Lanaryl N.A.-ICI) ０．５−１．０％ 有機安定剤(Tinoclarite G) ２．５時間インキュベーション後、望ましい性質を有す
るために選んだ変異体α−アミラーゼにはいくらかの酵
素活性が残存するはずである。
験 アルカリ性α−アミラーゼ変異株の工業的応用を試験す
るため次の溶液中で２０℃での安定性に関して試験を行
う。 １．４％ 過酸化水素（３５％） １．０−１．５％ 苛性ソーダ（１００％） １５−２０ml／Ｌ ケイ酸ナトリウム（３８Ｂｅ） ０．３−０．５％ スルホン酸アルキルベンゼン(Lanaryl N.A.-ICI) ０．５−１．０％ 有機安定剤(Tinoclarite G) ２．５時間インキュベーション後、望ましい性質を有す
るために選んだ変異体α−アミラーゼにはいくらかの酵
素活性が残存するはずである。
【図１Ａ】ｐＭａ５−８のヌクレオチド配列を示した図
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
【図１Ｂ】ｐＭａ５−８のヌクレオチド配列を示した図
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
【図１Ｃ】ｐＭａ５−８のヌクレオチド配列を示した図
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
【図１Ｄ】ｐＭａ５−８のヌクレオチド配列を示した図
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
である。。スタンセンら、１９８７年、エンボラボラト
リーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプ
ラスミドの説明に関しては本文参照。
【図２Ａ】プラスミドｐＰＲＯＭ ＳＰＯ２ インサー
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
【図２Ｂ】プラスミドｐＰＲＯＭ ＳＰＯ２ インサー
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
【図２Ｃ】プラスミドｐＰＲＯＭ ＳＰＯ２ インサー
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
トのヌクレオチド配列を示した図である。このベクター
の構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。
α−アミラーゼのアミノ酸配列はトリプレットの下に書
かれている。番号付けは成熟蛋白の最初のアミノ酸から
始まっている（クーンら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー、１９４巻：３７２頁）。ＳＰＯ２プロモーター挿
入配列(insert)は６１番目から３４４番目までに組み込
まれている。
【図３Ａ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図３Ｂ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図３Ｃ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図３Ｄ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図３Ｅ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図３Ｆ】ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列を示し
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
た図である。このベクターはｐＭａ５−８と、ｐＰＲＯ
Ｍ ＳＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターを
コードする合成ＤＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプ
ロモーターＤＮＡフラグメントは3757番目から３８５９
番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ
酸配列はトリプレットの下に示す。
【図４】ｐＭａＴＬｉａ６の制限酵素地図を示した図で
ある。次の各１箇所の制限酵素切断部位がα−アミラー
ゼ遺伝子のギャップ形成に利用可能である：ＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｅＩ、ＳａｃII、ＫｐｎＩ、Ｃ１ａＩ、Ｎａｒ
Ｉ、Ｓａ１Ｉ、Ｔｈｔ１１１Ｉ、ＸｍａIII、そしてＢ
ｓｔＥII。変異配列を容易に決定するために可能性のあ
る全ての切断部位に対するシークエンシングプライマー
を合成した。プラスミドｐＭｃＴＬｉａ６はｐＭａＴＬ
ｉａ６とアンピシリン遺伝子中にアンバーコドンが存在
すること（ＳｃａＩ部位を除いた）とクロラムフェニコ
ール遺伝子中にアンバーコドンを含まないこと（Ｐｖｕ
II部位の存在に伴い）を除いて同一である。
ある。次の各１箇所の制限酵素切断部位がα−アミラー
ゼ遺伝子のギャップ形成に利用可能である：ＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｅＩ、ＳａｃII、ＫｐｎＩ、Ｃ１ａＩ、Ｎａｒ
Ｉ、Ｓａ１Ｉ、Ｔｈｔ１１１Ｉ、ＸｍａIII、そしてＢ
ｓｔＥII。変異配列を容易に決定するために可能性のあ
る全ての切断部位に対するシークエンシングプライマー
を合成した。プラスミドｐＭｃＴＬｉａ６はｐＭａＴＬ
ｉａ６とアンピシリン遺伝子中にアンバーコドンが存在
すること（ＳｃａＩ部位を除いた）とクロラムフェニコ
ール遺伝子中にアンバーコドンを含まないこと（Ｐｖｕ
II部位の存在に伴い）を除いて同一である。
【図５】枯草菌／大腸菌のシャトルベクターｐＭａ／ｃ
の概略を示した図である。（左）ｐＭａ／ｃ部分は大腸
菌に簡便に突然変異を起こすのを可能にする。（右）バ
チルスズブチリスの遺伝子単位(cassette)はα−アミラ
ーゼ遺伝子（または他の枯草菌遺伝子）とバチルスズブ
チリスの増殖に最小限のレプリコンを含む。大腸菌での
突然変異が成功した後はバチルスズブチリス遺伝子単位
は枯草菌にトランスフォーメーションする際環状化し、
ＳＰＯ２プロモーターをα−アミラーゼ遺伝子の前に動
かすことができる。
の概略を示した図である。（左）ｐＭａ／ｃ部分は大腸
菌に簡便に突然変異を起こすのを可能にする。（右）バ
チルスズブチリスの遺伝子単位(cassette)はα−アミラ
ーゼ遺伝子（または他の枯草菌遺伝子）とバチルスズブ
チリスの増殖に最小限のレプリコンを含む。大腸菌での
突然変異が成功した後はバチルスズブチリス遺伝子単位
は枯草菌にトランスフォーメーションする際環状化し、
ＳＰＯ２プロモーターをα−アミラーゼ遺伝子の前に動
かすことができる。
【図６】ｐＢＭａ／ｃ１の制限酵素地図を示した図であ
る。このベクターは図５に示した突然変異発現ベクター
の具体的な例である。(1)及び(2)：マルチプルクローニ
ングサイト。目的の遺伝子は(2)に組み込まれている。
(1)と(2)で制限酵素位置を変えることにより２本鎖への
ギャップ形成のために便利な制限酵素部位を構築するこ
とができる：ＦＤＴ：転写終結位置 ＦＩ．ＯＲＩ：ファージＦ１由来複製開始領域 Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＲＩ：ｐＢＲ３２２の複製開始領域 ＢＬＡ：アンピシリン耐性遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 ＢＡＣ ＯＲＩ：ｐＵＢ１１０の複製開始領域 ＫＡＮＡＭＡＹＣＩＮ：ｐＵＢ１１０のカナマイシン
（メオマイシン）耐性遺伝子 ＳＰＯ２：ファージＳＰＯ２のプロモーター
る。このベクターは図５に示した突然変異発現ベクター
の具体的な例である。(1)及び(2)：マルチプルクローニ
ングサイト。目的の遺伝子は(2)に組み込まれている。
(1)と(2)で制限酵素位置を変えることにより２本鎖への
ギャップ形成のために便利な制限酵素部位を構築するこ
とができる：ＦＤＴ：転写終結位置 ＦＩ．ＯＲＩ：ファージＦ１由来複製開始領域 Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＲＩ：ｐＢＲ３２２の複製開始領域 ＢＬＡ：アンピシリン耐性遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 ＢＡＣ ＯＲＩ：ｐＵＢ１１０の複製開始領域 ＫＡＮＡＭＡＹＣＩＮ：ｐＵＢ１１０のカナマイシン
（メオマイシン）耐性遺伝子 ＳＰＯ２：ファージＳＰＯ２のプロモーター
【図７】ｐＢＭａ／ｃ６Ｌｉａ６の制限酵素地図を示し
た図である。バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ
遺伝子を図６のｐＭａ／ｃ１のマルチプルクローニング
サイト(2)に組み込んだ。この図ではＳＰＯ２のプロモ
ーターは(2)と、大腸菌のＯＲＩは(4)と表されている。
た図である。バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ
遺伝子を図６のｐＭａ／ｃ１のマルチプルクローニング
サイト(2)に組み込んだ。この図ではＳＰＯ２のプロモ
ーターは(2)と、大腸菌のＯＲＩは(4)と表されている。
【図８】ｐＭａ／ｃＴＰＬｉａ６中のｐｈｏＡのシグナ
ル配列断片の配列を示した図である。ＴＡＣプロモータ
ーの上流のＥｃｏＲＩ部位から成熟α−アミラーゼの最
初のアミノ酸までを示してある。ｐｈｏＡのアミノ酸配
列はＤＮＡ配列の下に示す。
ル配列断片の配列を示した図である。ＴＡＣプロモータ
ーの上流のＥｃｏＲＩ部位から成熟α−アミラーゼの最
初のアミノ酸までを示してある。ｐｈｏＡのアミノ酸配
列はＤＮＡ配列の下に示す。
【図９】野生型と２Ｄ５α−アミラーゼのミカエリスメ
ンテンプロットを示した図である。このグラフは基質濃
度に対する酵素活性の初速度を野生型α−アミラーゼと
２Ｄ５α−アミラーゼについて表したものである。アッ
セイ条件は実施例８に説明する。
ンテンプロットを示した図である。このグラフは基質濃
度に対する酵素活性の初速度を野生型α−アミラーゼと
２Ｄ５α−アミラーゼについて表したものである。アッ
セイ条件は実施例８に説明する。
【図１０】野生型α−アミラーゼとＤ７α−アミラーゼ
の熱失活を示したグラフである。このプロットはpH5.
5、90.5℃において野生型とＤ７α−アミラーゼ両方の
半減期をＣａ2+濃度の関数として表している。
の熱失活を示したグラフである。このプロットはpH5.
5、90.5℃において野生型とＤ７α−アミラーゼ両方の
半減期をＣａ2+濃度の関数として表している。
【図１１】野生型及びＤ７α−アミラーゼの熱失活を示
したグラフである。pHが7.0であるのを除き図１０と同
様。
したグラフである。pHが7.0であるのを除き図１０と同
様。
【図１２】野性型及び２Ｄ５α−アミラーゼの熱失活を
示したグラフである。このプロットはpH7.0、95℃での
親株及び２Ｄ５α−アミラーゼ両方の半減期をＣａ2+濃
度の関数として表している。
示したグラフである。このプロットはpH7.0、95℃での
親株及び２Ｄ５α−アミラーゼ両方の半減期をＣａ2+濃
度の関数として表している。
【図１３】野生型及びＤ７α−アミラーゼの熱失活のpH
依存性を示したグラフである。
依存性を示したグラフである。
【図１４】野生型及び２Ｄ５α−アミラーゼの熱失活の
pH依存性を示したグラフである。
pH依存性を示したグラフである。
【図１５】１１０℃での液化後に測定した最終pHに対す
るＤＥを示したグラフである。
るＤＥを示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (71)出願人 599152658 プラント ジェネティック システムズ ナムローゼ フェンノートシャップ ベルギー国 ベー1040 ブリュッセル ビ ュス６ コロン ブールグストラート 106 (72)発明者 クワックス ウィルヘルムス ヨハネス オランダ国 エヌエル‐2253ヴェーベー フォールショッテン ヤン ファン ガレ ンラーン ８ (72)発明者 ラロッシュ イヴ ベルギー国 ベー1150 ブリュッセル リ ュー ベーメル 115 (72)発明者 ヴォーレブレヒト アドリアヌス ウィル ヘルムス ヘルマヌス オランダ国 エヌエル‐2671ウェーゼット ナールトウェイク ベレクラウ 13 (72)発明者 スタンサン パトリック ベルギー国 サン デニーズ ウェストラ ン ド ジェイラーン 13 (72)発明者 ローヴェレイ マルク ベルギー国 ベー2950 ハールテール ヴ ィルジャンストラート 22
Claims (1)
- 【請求項１】 構造遺伝子から調節配列を物理的に分離
することにより大腸菌内でクローン化した遺伝子の発現
を不可能にし、また枯草菌中でクローン化した遺伝子の
発現を１種の制限酵素による消化及びその後の再環状化
により回復することのできる枯草菌／大腸菌シャトルベ
クター。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89201735:1 | 1989-06-29 | ||
| EP89201735 | 1989-06-29 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02509959A Division JP3086249B2 (ja) | 1989-06-29 | 1990-06-27 | 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000197491A true JP2000197491A (ja) | 2000-07-18 |
Family
ID=8202426
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02509959A Expired - Lifetime JP3086249B2 (ja) | 1989-06-29 | 1990-06-27 | 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ |
| JP11305433A Pending JP2000197491A (ja) | 1989-06-29 | 1999-10-27 | 枯草菌／大腸菌シャトルベクター |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02509959A Expired - Lifetime JP3086249B2 (ja) | 1989-06-29 | 1990-06-27 | 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ |
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| JP (2) | JP3086249B2 (ja) |
| KR (1) | KR0165550B1 (ja) |
| CN (1) | CN1050220A (ja) |
| AT (1) | ATE166922T1 (ja) |
| BG (1) | BG61081B1 (ja) |
| BR (1) | BR9006818A (ja) |
| CA (1) | CA2030554C (ja) |
| DD (1) | DD301620A9 (ja) |
| DE (1) | DE69032360T2 (ja) |
| DK (1) | DK0410498T3 (ja) |
| ES (1) | ES2117625T3 (ja) |
| FI (1) | FI103285B1 (ja) |
| IE (1) | IE902369A1 (ja) |
| PT (1) | PT94560B (ja) |
| WO (1) | WO1991000353A2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| WO1994013792A1 (en) * | 1992-12-09 | 1994-06-23 | Yoshiyuki Takasaki | NOVEL ACID- AND HEAT-RESISTANT α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND METHOD OF LIQUEFYING STARCH BY USING THE SAME |
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| CA2155831C (en) * | 1993-02-11 | 2009-11-10 | Richard L. Antrim | Oxidatively stable alpha-amylase |
| EP0670367B1 (en) * | 1993-05-19 | 2003-08-13 | Kao Corporation | LIQUEFYING ALKALINE [alpha]-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME |
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| TW268980B (ja) * | 1994-02-02 | 1996-01-21 | Novo Nordisk As | |
| WO1995026397A1 (en) * | 1994-03-29 | 1995-10-05 | Novo Nordisk A/S | Alkaline bacillus amylase |
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| WO1995035382A2 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Genecor International Inc. | NOVEL AMYLOLYTIC ENZYMES DERIVED FROM THE B. LICHENIFORMIS α-AMYLASE, HAVING IMPROVED CHARACTERISTICS |
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| KR100511499B1 (ko) * | 1995-02-03 | 2005-12-21 | 노보자임스 에이/에스 | 소정 특성을 가지는 알파-아밀라제 돌연변이체를 디자인하는 방법 |
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