JPH1072485A

JPH1072485A - 核酸の単離方法

Info

Publication number: JPH1072485A
Application number: JP9117203A
Authority: JP
Inventors: Willem R Boom; ウイレム・レネ・ボーム; Henriette M A Adriaanse; ヘンリエツテ・マリア・アレイダ・アドリアーンセ; Tim Kievits; テイム・キエフイツ; Peter F Lens; ペテル・フランクリン・レンス
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 1998-03-17
Also published as: EP0819696A2; DE69031237T2; ES2085245T5; GR3025351T3; AU641641B2; ES2085245T1; DE389063T1; DK0389063T3; KR900014594A; ATE156830T1; KR0148693B1; NL8900725A; GR960300019T1; JP2680462B2; EP0389063B1; ZA902190B; EP0389063B2; JPH02289596A; EP0819696A3; CA2012777C

Abstract

(57)【要約】【課題】複雑な生物出発材料から核酸を迅速かつ簡単
で、非損傷状態及び高純度で直接に単離する。【解決手段】核酸を含有する出発材料から核酸を単離
するための方法であって、出発材料、カオトロピック物
質及び核酸結合性固相を混合し、核酸が結合した固相を
液体から分離し、その後、こうして得られた固相- 核酸
複合体を洗浄し、必要に応じて核酸を該複合体から溶離
することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸を含有する出発
材料から核酸を単離するための方法及び手段の組み合わ
せ、並びに該方法により得られた核酸を増幅する(ampli
fy) するためのテストキットに係る。より特定的には、
本発明は全血、血清、バフィーコート（血液の炎症性痂
皮又は白血球フラクション）、尿、糞便、脳脊髄液、精
液、唾液、組織、細胞培養物等のような、核酸を含有す
る生物材料から核酸を単離するための方法及びキットに
係る。上記生物材料から単離された核酸は、サンプルを
採取した生物に内在する核酸及び外来性（ウイルス、真
菌、細菌又は寄生虫に由来する）核酸も含有し得る。

【０００２】

【従来の技術】全血、血清、尿又は糞便のような複雑な
出発材料から核酸(NA)を単離する既知の方法は通常、タ
ンパク質分解酵素の存在下で生物材料を洗剤により溶解
させた後、有機溶剤（例えばフェノール及び／又はクロ
ロホルム）で数回抽出し、エタノール沈降させ、核酸を
透析することにより実施される。例えば臨床材料から
（二重鎖）DNA を単離するこれらの既知の方法は多大な
労力と時間を必要とする。このような出発材料からNAを
精製するためには比較的多数の段階が必要とされるの
で、数個の臨床サンプルを同時に処理する場合、サンプ
ル間にNAが伝播される危険が大きい。核酸増幅法、例え
ば最も感受性の高いポリメラーゼ鎖反応（PCR,Saiki
他、Science 230 , 1985, 1350）により例えば病原体
（例えばウイルス又は細菌）におけるNAの存在を後で検
出するためにNAを単離する場合、このように異なるサン
プル間でNAが伝播される危険が大きいと、誤って陽性の
結果が生じ、重大な問題である。

【０００３】汚染に対して感受性のこのような既知の方
法の1 例は、組織及び細胞培養物から全RNA を単離する
ための方法としてAnalytical Biochemistry 162 , 198
7, 156 に記載されている方法である。この方法による
と、生物出発材料からRNA を酸性チオシアン酸グアニジ
ニウム- フェノール- クロロホルム混合物で1 回抽出す
る。相分離後、更に水相を処理することにより有用な条
件下で4 時間以内にRNAを回収することができる。

【０００４】Analytical Biochemistry 162 , 1987, 46
3 には、塩酸グアニジンを含有する緩衝液に細胞を分散
し、エタノール沈降させることにより、組織及び細胞系
からDNA を単離するための方法が記載されている。この
方法は汚染に対して感受性であるが、分離したDNA を更
に処理してから数時間以内に有用なNA産物を単離するこ
とができる。

【０００５】しかしながら、これらの既知の方法は複雑
な出発材料（例えば全血及び血清）中では首尾よく使用
することができない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、既知
の方法の欠点を解消するような方法を提供することであ
る。

【０００７】より特定的には本発明の目的は、種々の生
物材料のような複雑な出発材料から核酸（即ちDNA 及び
／又はRNA)を未曾有の迅速さで簡単且つ再現可能に、し
かもその後、分子生物反応における反応剤として使用可
能な非損傷状態及び高純度で直接（前処理を介さずに）
単離することが可能な方法を提供することである。

【０００８】本発明の別の目的は、他のサンプル及び人
体に対する汚染の危険が低いという点で既知の方法と異
なり、即ち異なるサンプル間におけるNAの伝播の危険を
最小にしながら数個の臨床サンプルを同時に処理するこ
とが可能な方法、並びに被処理サンプル中に存在し得る
ウイルス又は細菌が人体に伝染する危険を最小にするこ
とが可能な手段を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】これらの目的は本発明に
従い、出発材料をカオトロピック物質及び核酸結合性固
相と混合し、核酸が結合した固相を液体から分離し、そ
の後、こうして得られた固相- 核酸複合体を洗浄し、必
要に応じて核酸を該複合体から溶離することを特徴とす
る、核酸を含有する出発材料から核酸を単離するための
方法により実現される。

【００１０】広義には本発明はあらゆる核酸含有出発材
料（ウイルス又は細菌に感染した食品及び類似製品、ワ
クチン及びミルクを含む）に適用できるが、使用される
出発材料が全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳
脊髄液、精液、唾液、組織及び細胞培養物（例えば哺乳
動物細胞培養物及び細菌培養物）のような核酸含有生物
材料であるような方法に特に適用される。当然のことな
がら、本発明の方法はPCR 産物又は更に精製を要する別
の核酸回収方法の産物のような比較的純粋な出発材料に
も適用できる。しかしながら、核酸含有生物材料の種類
によっては（例えば植物材料、ある種のグラム陽性菌並
びにある種の酵母及びカビ）は特殊な細胞壁構造により
カオトロピック物質に溶解しないため、出発材料として
本発明の方法で直接使用することはできない。従って、
このような出発材料は入手形態の細胞に前処理を施す必
要があり、例えば予め細胞を溶解させてから得られた溶
解物に本発明の方法を実施すればよい。

【００１１】核酸（NA）なる用語は、任意の可能な構
造、即ち二重鎖(ds)核酸、又は一重鎖（ss）核酸、又は
その組み合わせ（部分的ds又はss）としてのDNA 及びRN
A を意味する。

【００１２】本発明の主眼は、カオトロピック物質の存
在下でNAと結合することが可能な核酸結合性固相、例え
ばシリカ粒子を使用する点にある。シリカなる用語は、
SiO₂結晶及び他の形態の酸化ケイ素、 SiO₂から構成
されるケイソウ植物の骨格、無定形酸化ケイ素並びにガ
ラス粉末を意味する。アルキルシリカ、ケイ酸アルミニ
ウム（ゼオライト）、−NH₂を有する活性シリカ、ラテ
ックス粒子、キュベットもしくは微量滴定プレートの内
壁を形成するある種のポリマー材料、又は例えばニトロ
セルロースから構成されるフィルター材料も本発明の核
酸結合性固相として使用できる。

【００１３】シリカ粒子の使用に関しては、カオトロピ
ック塩 NaI（ヨウ化ナトリウム）の高濃度溶液中のdsDN
A をアガロースから遊離させ、ガラスに結合できること
が PNAS 76, 1979, 615 により知見された。この文献は
アガロースゲルからDNA を単離するための2 種の方法に
ついて記載しており、そのいずれも第１段階でアガロー
スを溶解するためにNaI 溶液を使用している。一方の方
法では第２段階でDNAをアセトンで沈降させ、他方の方
法では第２段階でDNA をガラス粒子に結合し、その後、
水性緩衝液に溶離する。しかしながら、この方法では体
液及び他の生物出発材料のような複雑な出発材料を使用
できない。更にこの論文は、本発明の1段階方法につい
ては開示していない。

【００１４】本発明によると、結合し、その後、溶離さ
れる高純度の核酸を不純な出発材料から直接得られるよ
うに、適当に選択した粒径を有するシリカ粒子を使用す
ることが好ましい。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の好適態様は、実質的に0.
05〜500 μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子を使用す
ることを特徴とする。「実質的に」なる用語は、シリカ
粒子の80％以上、好ましくは90％が規定された粒径範囲
に該当することを意味する。結合したNAを容易に処理で
きるようにするためには、使用されるシリカ粒子は実質
的に 0.1〜200 μｍの範囲の粒径を有すると好適であ
り、使用されるシリカ粒子が実質的に 1〜200 μｍの範
囲の粒径を有するような方法が最適である。実際に、シ
リカ粒子のNA結合能は粒子が小さければ小さいほど高い
が、特にNA含有量の高い出発材料の場合、及びNA分子が
比較的長い場合は、過度に小さいシリカ粒子を使用する
と、形成されるNA- シリカ複合体をそれ以上有効に再分
散することができなくなる。換言するならば、結合した
NAを純粋な形で複合体から回収することができない。人
血を出発材料として使用する場合、 0.2〜10μｍの範囲
の粒径を有する非分画シリカを使用すると、このような
問題が生じることがある。それ以上再分散することがで
きない凝集物の形成は、粒径が 1〜10μｍの範囲の分画
したシリカを使用することにより避けることができる。
しかしながら、細菌培養物のように細胞中の濃度が高い
出発材料を使用する場合、このような粗いシリカフラク
ションの使用は再分散し難い凝集物の形成を避けるため
には不十分であり、 2〜200 μｍの粒径を有するケイソ
ウ土のようなもっと粗いシリカを使用すると、最適の結
果が得られることが判明した。

【００１６】別の好適態様によると、NA結合性固相はフ
ィルター形態であるか、又はサンプルとカオトロピック
物質とを収容する容器の一部を形成する。NA結合性固相
を後者の形態に選択すると、その後のサンプル処理及び
NA単離のために遠心分離又は濾過を実施する必要がなく
なる。

【００１７】本発明によると、シリカ粒子のような上記
核酸結合性固相以外にカオトロピック物質を使用するこ
とが不可欠である。カオトロピック物質なる用語は、タ
ンパク質及び核酸の二次、三次及び／又は四次構造を変
えることが可能であり且つ少なくとも一次構造を無傷に
しておくことが可能な任意の物質を意味する。具体例は
（イソ）チオシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジ
ンである。核酸を含有する出発材料からNAを単離するた
めに、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チ
オシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み合わせ
も核酸結合性固相と組み合わせて使用すると非常に好適
である。本発明によると、使用されるカオトロピックグ
アニジニウム塩は好ましくはチオシアン酸グアニジニウ
ム(GuSCN) である。

【００１８】本発明は通常、出発材料を十分大きい量の
カオトロピック物質（例えばグアニジニウム塩）及び例
えばシリカ粒子と混合し、出発材料中に存在する核酸の
ほぼ全体を遊離させ、該シリカ粒子に結合させるように
実施される。適当なプロトコールによると、例えば、反
応容器中に存在するGuSCN 緩衝溶液にシリカ粒子懸濁液
を加え、その後、サンプルを加えて十分に混合する。や
がて、細胞が溶解し、ウイルスが存在する場合はウイル
スも溶解し、遊離したNAがほとんど即座にシリカ粒子に
結合する。次に、形成されたシリカ- 核酸複合体を例え
ば迅速沈澱（遠心分離）及び上清の廃棄（例えば吸引に
よる）により液体から分離し、その後、複合体（例えば
シリカ- 核酸ペレットの形態）を例えばボルテックスミ
キサーを使用してカオトロピックグアニジニウム塩を含
有する洗浄用緩衝液で洗浄（再分散又は均質化）し、再
び沈澱させる。好ましくは、洗浄用緩衝液で洗ったシリ
カ- 核酸複合体を更にアルコール水溶液（収率の損失を
制限するために最適には約70％エタノール）及びアセト
ンで洗い、その後、（例えば加熱下に）乾燥してアセト
ンを除去する。次に、洗浄及び乾燥したシリカ- 核酸複
合体中に存在するNAを水性溶離用緩衝液(elution buffe
r)により溶離する。溶離用緩衝液の選択は単離されるNA
の使用目的に応じて決定される。適当な溶離用緩衝液の
例はTE緩衝液、2 回蒸留水(aqua bidest) 及びPCR 緩衝
液（「材料及び方法」の項参照）である。好ましくは、
これらの全段階を単一の反応容器（例えば容量1.5 mlの
ポリプロピレン製エッペンドルフチューブ）中で実施
し、比較的少量、例えば100 μl未満の精製NAを回収す
る。こうして単離したNAは核酸分解酵素を含有せず、DN
Aポリメラーゼ（例えばTaq -DNAポリメラーゼ）、DNA
制限酵素、DNA リガーゼ及び逆転写酵素（例えばAMV 逆
転写酵素）のような種々の酵素の基質として直接使用で
きるような高純度を有する。

【００１９】本発明の方法によると、PCR 法又はヨーロ
ッパ特許第EP0329822 号に記載されている所謂NASBA 法
（NASBA ＝核酸配列に基づく増幅）のような増幅方法に
よりNA配列を証明できる程に、例えば血漿及び血球を予
め分離することなく約45分間に50μl の全血から十分な
量のNAを単離することができる。一方、本発明は血清、
糞便、尿等のようなNAを含有する他の種々の生物材料に
も適用することができる。このため、本発明は細菌及び
ウイルス感染の診断において、並びに出生前診断及び遺
伝性腫瘍体質の診断の領域における遺伝的多形性の研究
において有用である。

【００２０】本発明のNA単離方法は、全手順を単一の反
応容器中で実施することができ、方法の第１段階で粗出
発材料から遊離したNAが完全な別の精製過程の間に少な
くとも固相の大部分に結合するので、汚染の危険が非常
に低い。ウイルス又は細菌に感染している可能性のある
材料の処理に伴う人体への危険は、サンプルを反応容器
に入れる単離過程の第１段階にほぼ限定される。この第
１の処理において、潜在的に存在する病原体は有効に不
活化される。本発明の方法は特殊な周辺技術（ボルテッ
クスミキサー、 12000ｇエッペンドルフ型の遠心分離機
及び水浴又はエッペンドルフ加熱ブロックが標準実験技
術に属する）も生化学の専門的知識も必要としないの
で、多数のサンプルから機械的にNAを単離するため、換
言するなら自動化に非常に適している。本発明の方法を
使用すると、10個以上、あるいは24個以上の異なるサン
プルを約1 時間で処理することができる。

【００２１】本発明は核酸を含有する出発材料から核酸
を単離するための方法のみならず、そのための手段の組
み合わせ及び該方法により得られた核酸を増幅するため
のテストキットにも係る。

【００２２】1 態様によると、本発明の手段の組み合わ
せは、(a) （イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有
する溶解用緩衝液(lysis buffer)、(b) 実質的に0.05〜
500μｍ、好ましくは 0.1〜200 μｍ、最適には 1〜200
μｍの範囲の粒径を有するシリカ粒子の水性懸濁液、
(c) （イソ）チオシアン酸グアニジニウムを含有する洗
浄用緩衝液、及び必要に応じて(d) 溶離用緩衝液を含
む。

【００２３】即ち、本発明の手段の組み合わせは例えば
次の4 成分、即ち成分 1： (イソ）チオシアン酸グアニジニウム緩衝溶
液、成分 2：シリカ粒子の懸濁液、成分 3：洗浄用緩衝液、及び（場合によって）成分 4：溶離用緩衝液から構成され得る。

【００２４】必要に応じて成分1 及び2 を一緒にしても
よいが、その場合、貯蔵寿命が制限される。

【００２５】本発明のNA単離方法で使用することが好ま
しい他の反応剤、例えばエタノール及びアセトンは標準
実験技術に属する。

【００２６】

【実施例】以下、多数の実施例により本発明を説明す
る。先ず、使用される材料と方法について説明する。

【００２７】材料及び方法Ａ）シリカ粗材(SC)の懸濁液粒径分布 0.5〜10μｍで且つその80％が 1〜5 μｍの、
Sigma 製の二酸化ケイ素(SiO₂) を使用した。

【００２８】シリカ60ｇを直径5cm のシリンダーに入れ
た２回蒸留水（最高500 ml）中に懸濁させると、水柱の
高さは27.5cmとなった。室温で25時間 1×ｇ沈降させた
後に、70mlを残して上澄みを吸引して除去した。２回蒸
留水を500ml になるまで加え、シリンダーを振盪するこ
とにより粒子を再度懸濁させた。５時間 1×ｇ沈降させ
た後、60mlを残して上澄みを吸引して除去した。32％(w
/v)HCl600 μl を加えた後、渦形成することにより再度
懸濁させた。この懸濁液を6ml 容器に入れて 4mlアリコ
ートをつくり、密封し、オートクレーブ内で121 ℃で20
分間加熱した。この沈降プロトコルによって、粒径１μ
ｍ以上のより大きなシリカ粒子を豊富に得ることができ
た。これは電子顕微鏡検査によって立証された。更に、
酸性（pH約 2）のシリカをオートクレーブ処理すると、
任意に存在する核酸が完全に分解される結果となる。こ
のように得られたシリカ粗材の懸濁液を以下SCと表記す
る。

【００２９】シリカ誘導体の懸濁液 2〜18個の炭素原子の長さのアルキル末端を有するメチ
ルアクリルアミド二酸化ケイ素を用いてシリカを誘導体
化した。誘導体化したシリカの粒径は63〜200μＭであ
った。使用した粒子の孔径は 500オングストロームであ
った。上記シリカ誘導体(12MAAMC₂-C₁₈）はDiosynth,O
ssから供給された。

【００３０】NA単離のために（実施例H1）、誘導体化し
たシリカ粒子 0.5ｇを２回蒸留水1ml 中に懸濁させた。
このシリカ懸濁液を、32％(w/v) HCl 120 μl を用いて
90℃で30分間予備処理した。

【００３１】ポリスチレンラテックス粒子の懸濁液２種類のポリスチレンラテックス粒子を使用した。ポリ
スチレンラテックスVQ69レッドはナトリウム−ドデシル
スクシネートスルフェート基を吸収させてあり、粒径は
424nm を有した。ポリスチレンラテックスVQ58B はより
小さい粒径(328nm) を有し、外側にスルフェート基を吸
収していなかった。

【００３２】３種の親水性のグリシジルメタクリレート
ポリスチレンラテックス粒子を使用した。AGF27G、ACN3
レッド及びAGY1515 の粒径はそれぞれ933nm 、206nm 及
び846nm であった。上記全てのポリスチレン粒子はARLA
-Arnhem より供給のものであった。

【００３３】市販フィルター以下のものを使用した。

【００３４】1. PVDF Millipore 提供のImmobilon Tran
sfer Membrane （疎水性）、 2. Schleicher and Schuell 提供のNitro-cellulose
（0.2 μM 参照番号 401.396）、 3. Hybond-N Amersham提供のNylon Hybiridi-zation 膜
（0.45ミクロン、ロット:16872）。

【００３５】Ｂ）L2緩衝液 TRIS(Boehringer)12.1ｇを２回蒸留水800 ml中に溶解
し、37％(w/v)HCl 8.1mlを加え、さらに容積１リットル
になるまで２回蒸留水を加えることにより、L2緩衝液
(0.1M Tris. Cl、pH6.4)を調製した。

【００３６】Ｃ）洗浄液L2 GuSCN （Fluka 製のチオシアン酸グアニジン）120 ｇを
L2緩衝液100 ml中に溶解することにより、洗浄液L2を調
製した。

【００３７】洗浄液L2* KI（Merck 製のヨウ化カリウム）12.45 ｇをL2緩衝液25
ml中に溶解することにより洗浄液L2* を調製した。

【００３８】NaI ベースのカオトロピック物質を調製す
るために、 NaI（Merck 製のヨウ化ナトリウム）11.25
ｇをL2緩衝液25ml中に溶解した。チオシアン酸ナトリウ
ムベースのカオトロピック物質を調製するために、NaSC
N(Baker)6.1gをL2緩衝液25ml中に溶解した。

【００３９】KI及び尿素(8M)を含有するカオトロピック
物質を調製するために、KI 12.45ｇ及び尿素12.0ｇをL2
緩衝液（25ml）中に溶解した。同様に、尿素及びNaI を
併有するカオトロピック物質と、尿素及びNaSCN を併有
するカオトロピック物質とを調製した。

【００４０】Ｄ）溶解用緩衝液L5 GuSCN 120 ｇをL2緩衝液100ml 中に（約60℃の温水浴中
で静かに振盪させて）溶解し、次いで40％(w/v) デキス
トランスルフェート(Pharmacia LKB) 溶液26.0ｇ、0.2M
EDTA pH8 22ml及びTriton X-100(Packard)2.6ｇを加
え、次に溶液を均質化することにより、溶解用緩衝液L5
を調製した。0.2M EDTA pH8 溶液は、EDTA37.2ｇ（Merc
k 製の Titriplex）37.2ｇ及び NaOH(Merck) 4.4ｇを水
500 ml中に溶解することにより調製した。

【００４１】Ｅ）溶解用緩衝液L6 GuSCN120ｇをL2緩衝液100ml 中に（60℃の水浴中で静か
に振盪させて）溶解し、次いで0.2M EDTA pH8 22ml及び
Triton X-100(Packard) 2.6ｇを加え、次に溶液を均質
化することにより、溶解用緩衝液L6を調製した。

【００４２】溶解用緩衝液L6* KI（ヨウ化カリウム、 Merck）12.45 ｇをL2緩衝液25ml
中に（40℃の水浴中で静かに振盪させて）溶解し、次い
で0.2M EDTA(pH8.0) 5.5ml及び Triton X-100(Boehring
er 789704) 0.65 ｇを加え、最後にこの溶液を均質化す
ることにより、溶解用緩衝液L6* を調製した。同じ方法
を適用して NaI（ヨウ化ナトリウム、Merck ）を含む溶
解用緩衝液L6* 、及び NaSCN（チオシアン酸ナトリウ
ム、Baker）を含む溶解用緩衝液L6* を調製した。

【００４３】KI及び尿素を併有する溶解用緩衝液L6*
を、KI（ヨウ化カリウム、Merck ）12.45 ｇ及び尿素
（Gibco BRL ）12.0ｇをL2緩衝液25ml中に溶解すること
により調製した。次いで、0.2M EDTA(pH8.0) 5.5ml及び
Triton X-100(Boehringer)0.65ｇを加え、この混合物を
均質化した。同じ方法を使用してNaI/尿素及びNaSCN/尿
素を調製した。

【００４４】Ｆ）溶解用緩衝液 GEDTA GEDTA とは、GuSCN 120 ｇを0.2M EDTA pH8 100ml 中に
溶解した溶液を意味する。

【００４５】Ｇ）TE緩衝液溶出(elution) に適した緩衝液は、所望であればRNAsin
(Promega)0.5U/μl を含有する、pH7.5 の10mM Tris.C
l、1mM EDTA溶液（TE緩衝液）である。

【００４６】Ｈ）試験管溶解用緩衝液900 μl 及びNAキャリヤ（ラテックスビー
ズもしくはSCのごときシリカ、または珪藻土）40μl を
Eppendorff遠心分離管（タイプ3810、1.5 ml）に加える
ことにより、抽出過程と同じ日に試験管を準備した。

【００４７】Ｉ）洗浄方法洗浄液1ml を加え、次いでペレットが再度懸濁するまで
渦形成し、 12000×ｇで15秒間遠心分離し、更に吸引に
よって上澄みを廃棄することにより、ペレットを洗浄し
た。

【００４８】Ｊ）溶出方法溶出は、少なくとも25μl 、好ましくは少なくとも40μ
l の溶出用緩衝液を加え、短時間（２秒間）渦形成し、
56℃で10分間インキュベートすることにより実施した。

【００４９】Ｋ）プロトコルＢこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からdsDNA を単離するのに適してお
り、GEDTA 900 μl 及びSC 40 μl を含むEppendorff試
験管を使用した。

【００５０】1 ．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2 ．出発材料（例えば血清、全血、便または尿）50μl
を加え、直ぐに渦形成して（ 5〜10秒間）均質化し、 3 ．室温に10分間放置し、5 秒間渦形成し、 4 ． 12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄
みを廃棄し、 5 ．ペレットをGEDTA で１回洗浄し、 6 ．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7 ．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8 ．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9 ．RNAsinを含まないTE緩衝液50μl を用いてNAを溶出
し、 10． 12000×ｇで2 分間遠心分離すると、上澄みはNAを
含有した。

【００５１】Ｌ）プロトコルＹこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からNAを単離する（同時にdsDNA 、
ssDNA 、dsRNA 及びssRNA を精製する）のに適してお
り、L6 900μl 及びSC 40 μl を含むEppendorff試験管
を使用した。

【００５２】1 ．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2 ．出発材料（血清、全血、便または尿）50μl を加
え、直ぐに渦形成（約5 秒間）して均質化し、 3 ．室温に10分間放置し、5 秒間渦形成し、 4 ． 12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄
みを廃棄し、 5 ．ペレットをL2で２回洗浄し、 6 ．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7 ．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8 ．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9 ．必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液50μl
を用いてNAを溶出し、 10． 12000×ｇで2 分間遠心分離すると、上澄みはNAを
含有した。

【００５３】プロトコルY* このプロトコルは、ヒト血清、尿またはバクテリア培養
液といった複合出発材料からNAを単離するのに適してい
る。

【００５４】方法:L6* 900 μl 及びSC 40 μl を含むE
ppendorff試験管を使用した。

【００５５】1 ．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2 ．出発材料（血清−プラスミド、尿−プラスミド混合
物または一晩培養したバクテリア培養液）50μl を加
え、直ぐに渦形成（5 秒間）して均質化し、 3 ．混合しながら室温に10分間放置し、 4 ．14,000ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄み
を廃棄し、 5 ．ペレットをL2* 洗浄液で２回洗浄し、 6 ．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7 ．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8 ．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9 ．必要によってはRNAsinの存在下に、TE緩衝液(10mM
Tris−1mM EDTA pH8.0)50μl を用いてNAを溶出し、 10．14,000ｇで2 分間遠心分離すると、上澄みはNAを含
有した。

【００５６】プロトコルY** このプロトコルは、カオトロピック物質としてのGuSCN
、及びNAを結合できるフィルター（材料及び方法の項
参照）の存在下に、NAを単離するのに適している。NA検
出は、このフィルターをポリメラーゼ連鎖反応混合物に
直接適用することによる、ポリメラーゼ連鎖反応によっ
て実施し、従ってフィルターからNAを予め溶出しない。

【００５７】方法:L6溶解用緩衝液900μl及びフィルタ
ー（寸法1cm/1cm ）を含むEppendorff試験管を使用し
た。

【００５８】1 ．核酸含有溶液50μl を加え、試験管を
短時間渦形成し、 2 ．混合しながら室温に10分間放置し、 3 ．上澄みを廃棄し、 4 ．フィルターをL2洗浄液で２回洗浄し、 5 ．フィルターを70％エタノールで２回洗浄し、 6 ．フィルターを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 7 ．フィルターの小片をポリメラーゼ連鎖反応溶液に直
接加えた。

【００５９】Ｍ）プロトコルＺこのプロトコルは、ヒト血清、全血、水様便または尿と
いった複合出発材料からNAを単離するのに適しており、
L5 900μl 及びSC 40 μl を含むEppendorff試験管を使
用した。単離したNAはハイブリッド形成反応に使用する
ことができるが、制限酵素に対する基質としてはやや適
当でない。しかしながらT4 DNAリガーゼは活性である。
プロトコルＹと比較してプロトコルＺではNAの収率が高
くなる。

【００６０】1 ．ペレットが再度懸濁するまで試験管に
渦形成し、 2 ．出発材料（血清、全血、便または尿）50μl を加
え、直ぐに渦形成（約5 秒間）して均質化し、 3 ．室温に10分間放置し、5 秒間渦形成し、 4 ． 12000×ｇで15秒間遠心分離し、吸引によって上澄
みを廃棄し、 5 ．ペレットをL2で２回洗浄し、 6 ．ペレットを70％エタノールで２回洗浄し、 7 ．ペレットをアセトンで１回洗浄し、 8 ．ペレットを、蓋を開放して56℃で10分間乾燥し、 9 ．必要によってはRNAsinの存在下で、TE緩衝液50μl
を用いてNAを溶出し、 10． 12000×ｇで2 分間遠心分離すると、上澄みはNAを
含有した。

【００６１】Ｎ）出発材料実施例は、出発材料の性質に応じて（特にセクションＡ
〜Ｄ）、以下のようなセクションに分割した。

【００６２】セクションＡ: ヒト血清セクションＢ: ヒト全血セクションＣ: ヒト尿上記セクションＡ、Ｂ及びＣは特に、dsDNA 及びssRNA
の両方を純粋形態で単離できることを示す意味がある。

【００６３】セクションＤ: ヒト便このセクションＤは、特にdsRNA も単離できることを示
す。

【００６４】セクションＥ: 一重鎖DNA このセクションＥは、本発明が、ssDNA を単離するため
に使用できることを示す実験からなる。

【００６５】セクションＦ: 珪藻土このセクションＦは、珪藻土の骨格が本発明に使用する
シリカ粒子として非常に有効であることを示す。更に、
本発明が、種々のグラム陰性菌からNAを単離するために
使用できることも示す。

【００６６】セクションＧは、種々のカオトロピック物
質を使用し、細菌細胞からNAを精製できることを示す。

【００６７】セクションＨ及びＩは、別の固相を使用す
るDNA の単離を示す。

【００６８】常に50μl の量で使用した。セクションＢ
及びＦに使用した血液は常に、凝固を防止するためにED
TAの存在下に採取した鮮血とした（Terumo N.V., Louva
in,ベルギーのVenoject装置、タイプVT-574 TKZの採取
管を使用）。他のセクションに使用した出発材料（血
清、尿及び便）は冷凍物であった。実施例A1、A2、A3、
B1、B2、B5、B7及びF1において、血清または血液は同じ
被検体由来であった。

【００６９】Ｏ）他の方法ゲル電気泳動調査に対して、溶出した量のNAの一部を、
Aaij及びBorst が記載した（Biochim. Biophys. Acta
269,1972, 192）緩衝液系に臭化エチジウム1μg/mlを
含有する中性アガロースゲル上にロードした。ゲルにUV
照射して写真撮影した。

【００７０】いくつかの実験において、既知量の精製 D
NA（インプット DNA）を臨床試料に加えた。これらのケ
ースにおいて、抽出効率 100％に対応する量のインプッ
トDNA を同じゲルにロードした。

【００７１】Ish-Horowicz及びBurke が記載したように
（Nucleic Acids Res. 9,1981,2989）、Escherichia C
oli HB101から細菌プラスミドDNA を精製し、Sepharos
e CL2B(Pharmacia,Inc.) を用いたカラムクロマトグラ
フィーにかけ、エタノールで沈澱させた。Birnboim及び
Dolyが記載したように（Maniatis,T. ら，MolecularClo
ning, CSH, ニューヨーク）、Escherichia Coli JM101
(J.Messing,Rec.DNATechn.Bull.2:43-48(1979)) から細
菌プラスミドDNA を精製した。pCMV-Eは、 2kbベクター
pHC 624（Boros in gene 30,1984, 257）においてクロ
ーニングされた0.4kb ヒトサイトメガロウイルスDNA 断
片を含み、pEBV-10 は、同じベクターにおいてクローニ
ングされた0.9kb Epstein BarrウイルスDNA 断片を含
む。緩和環状(CII) 分子(relaxed circular molecules)
を豊富に含むプラスミド調製物を得るために、pEBV-10
DNA(2.9kb)をDNAse Ｉで処理した。成分II分子は、3.2k
b緩和環状DNA 分子としてビリオン中に存在するＢ型肝
炎ウイルスDNA の精製のためのモデルの役目をする。

【００７２】pGem3p24は1.45kb HIV配列を含むが、pGem
3p24の構成は以下に記述する。

【００７３】HIV HxB2 DNAの配列は数人が記述している
（J.Virol,61,633-637(1987); Nature 326, 711-713(19
87); Aids Res.Hum.Retrovirus 3,41-55(1987); Aids R
es.Hum.Retrovirus 3,33-39(1987)及びSience 237,888-
893(1987)）。

【００７４】HIV HxB2 DNAの一部をFok Ｉで、もとのHI
V HxB2配列の1189及び2613部位で切断した。ヌクレオチ
ド番号は遺伝子バンク指定を参照されたい。

【００７５】このフラグメントのFok Ｉ部位を、クレノ
ウ（Klenow）DNA ポリメラーゼ（Maniatias ，上記参
照）を使用して充填し、プラスミドpUC-19のポリリンカ
ーSmaＩ部位においてクローニングした（Maniatias ，
前記参照）。HIV HxB2 DNAフラグメントを担う得られた
プラスミドをpUC19-p24 と称した。

【００７６】プラスミドpGem3p24を得るために、pUC19-
p24 の1450bp EcoRI-BamHIフラグメントをEcoRI-BamHI
消化ベクターpGem3 においてクローニングした(2867bp;
Promega Corporation,Madison USA)。

【００７７】PCR 法に使用したプライマーをオリゴシン
セサイザー(oligo-synthesizer) 装置（Applied Biosys
tem 製）において合成した。プライマーES47（25mer ）
及びES75（47mer ）のヌクレオチド配列を以下に示す。

【００７８】_ES47 ₁₀ ₂₀ ^{ACAGGAGCAG ATGATACAGT ATTAG} _ES75 ₁₀ ₂₀ ₃₀ ₄₀ ^{AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCCTGG CTTTAATTTT ACTGGTA} ほとんどのRNA 単離実験において（実施例A3、B5、B6、
B7、C2、D1、E1、F1及びF2）、精製過程の間のRNA の分
解を回避するために溶出用緩衝液中にRNAsinを任意的に
使用する以外には、予防策を講じなかった。臨床試料を
試験管に付加する際にのみ手袋をはめ、試薬の調製に対
してはRNAse 阻害剤を使用せず、オートクレーブ処理し
ないEppendorff容器及びピペットチップを使用した。特
に実施例F1及びF2は、溶出の際のRNAsinの存在は厳密に
は必要でないことを示した。

【００７９】使用した酵素は市場入手可能であり、製造
業者が推奨するままに使用した。RNAse A 同様に全ての
制限酵素T4リガーゼ及びAMV 逆転写酵素はBoehringer(M
annheim)製であった。Tag -DNAポリメラーゼはCetus In
c 製とした。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR）はPerkin Elm
er Cetus DNA- 熱循環器を用いて実施した。

【００８０】種々の用途に対しては、本発明の方法に使
用する試薬、特にNAキャリヤー（例えばシリカ粒子）及
びカオトロピック物質を含む溶解用及び洗浄用緩衝液
は、核酸（例えばNA含有の細菌またはウイルス）によっ
て汚染されるべきではないことは基本的に重要である。
これは、NAキャリヤーに対しては、これをオートクレー
ブ内で 121℃で20分間加熱することにより保証され得
る。しかしながら、この方法はGuSCN 含有の溶解用及び
洗浄用緩衝液（GEDTA 、L5、L6及びL2）においては、活
性が失われる可能性があること、及び環境に対する付随
的な危険性があることから有効ではない。上記試薬を
（出来る限り）核酸を含有しないようにするために、か
かる試薬を本発明のシリカ粒子のカラムに通すことがで
きる。GuSCN 含有緩衝液の溶解(lysing)特性、及びカオ
トロピック物質GuSCN の存在下にNAを結合するシリカの
特性に起因し、かかる方法でNA非含有の緩衝液が得られ
る。カラム自体は、例えば500 ℃またはそれ以上で1 時
間以上加熱することにより、核酸非含有にすることがで
きる。

【００８１】Ｐ）DNA タイプ CI ：共有結合閉環状DNA(プラスミド）、 CII ：緩和（ニック）環状DNA(プラスミド）、 CIII：線状DNA(線状化プラスミド）、 LMW ：低分子量DNA(＜0.5kb);pHC 624のHpa II消化、47
1bp 、404bp 、 242bp（2 フラグメント）、190bp 、14
7bp 、110bp 、67bpのフラグメント及び数個のより小さ
い不定長のフラグメント、 MMW ：中分子量DNA(0.5 〜29kb);ファージλDNA のHind
III 消化、23kb、9.4kb、6.7kb 、4.4 kb、2.3kb 、2.0
kb 及び0.56kbのフラグメント、 HMW ：高分子量DNA(＞29kb）、 ssDNA ：ファージM13mp9一重鎖DNA(Boehringer) 。

【００８２】セクションＡ：ヒトの血清からのDNA/RNA
の精製ヒトの血清には例えばウイルス又は細菌中にNAが存在し
得る。これらの有機体は共に遊離形態で生じ得、更には
免疫複合物中に結合して生じ得る。NAの量は通常非常に
少ないので、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブ
ロミド／NA複合体の紫外線照射を通じての検出は不可能
である。DNA をヒトの血清から精製できることを示すた
めに、微量の精製DNA を血清に加え、次いでプロトコル
Ｂに基づいてDNA を単離した（実施例 A1,A2）。DNA 及
びRNA をヒトの血清から同時に精製できることを示すた
めに、培養した哺乳動物細胞又は（小さなプラスミドを
有する）細菌を血清に加え、次いでプロトコルＹに基づ
いてNAを単離した（実施例A3）。最後に実施例A4は、プ
ロトコルＹによりヒトの血清に存在するRNA を HIV（ヒ
トの免疫不全ウイルス）から精製でき、またPCR 法によ
り検出できることを示している。実施例A5は、ヒトの血
清中のDNA をプロトコルＹ＊により、核酸結合性固相と
してのシリカと共に種々のカオトロピック物質を使用し
て精製できることを示している。

【００８３】実施例A1：ヒトの血清からのDNA の精製ヒトの血清(500μl)を既知量の精製 DNA[100μl LMW(45
μg)、20μl MMW(20μg)、40μl CI/II(20μg)] と混合
し、10個の66μl 試料をプロトコルＢに基づき10個のDN
A 抽出物用インプット材料(input material)として使用
した。この実験では試験管中に存在するSC（Silica Coa
rse の懸濁液）の量を 2.5〜40μl で変動させた。抽出
を二重に実施し、各試料からの溶離DNA の半分（30μl
）を 1％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にか
けた。比較として、インプットＤＮＡの半分の量を同様
にコントロールレーン（ｌａｎｅｓ）の同一ゲル上に
ロードした。

【００８４】SCの量が10μl を越えると、二重鎖DNA 、
線状（23kb〜約60bp）共有結合閉鎖（CI）DNA も緩和環
状(CII) DNA も効率的に単離された。最大MMW フラグメ
ント（約23kb）の収率はより小さなフラグメントと比較
して比較的低いようである。このことは他の実験から考
慮すると、分子量の大きいフラグメントのせん断のせい
であろう。

【００８５】コントロールレーンはそれぞれ、 100％の
抽出効率の場合のLMW,CII/CI及びMMW DNA の量を示して
いる。前述した如く、CII に富む（DNAse Ｉで処理し
た）3kb プラスミド(pEBV-10) をインプット材料として
使用した。

【００８６】実施例A2：ヒトの血清から単離したDNA は
制限酵素及びT4DNA リガーゼに対して良好な基質である
こと精製DNA 調製物を50μl のヒトの血清試料12個に加え
た。プロトコルＢに基づいてこれら12個の混合物からDN
A を単離した。50μl のTEで溶離を実施した。溶離した
DNA の半分を以下の３種の制限酵素：Eco RI, Bam HI,
Bgl II（これらはそれぞれ低塩、中塩及び高塩緩衝液で
活性を有する）のいずれかで（二重に）処理するか、T4
DNAリガーゼで処理するか、又は処理しなかった。DNA
試料を１％アガロースゲルを支持体とする電気泳動にか
け、紫外線照射により可視化した。

【００８７】T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μl の
反応容量中に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNA フラ
グメントの分子量のシフトを示すと共に、ヒトの血清か
ら単離したDNA がエキソヌクレオリティックな(xonucle
olytic) 分解の影響をそれほど受けないことを示してい
る。

【００８８】精製プラスミド（pCMV-E；3.3 μg ；1.5
μl ）を加えた８個の血清試料の結果はそれぞれ、Eco
RI、Bam HI、Bgl IIダイジェストに対して総ての制限酵
素がプラスミドを線状化したことを示している。総ての
制限酵素は９単位の酵素と共に、37℃で１時間30μl の
反応容量中でインキュベートした。

【００８９】実施例A3：ヒトの血清からのDNA 及びssRN
A の同時単離ヒトの血清には（例えばウイルス、細菌又は細胞中
に）、エチジウムブロミドで染色したゲルの紫外線照射
によっては検出することのできない非常に少量のRNA し
か存在しないので、外因性RNA 源をヒトの血清試料に加
えた。哺乳動物の細胞又は細菌を外因性RNA 源として使
用した。プロトコルＹに基づいてNAを試料から単離し、
RNAseA(40ng/μl の溶離用緩衝液）の存在下で又は不在
下で、0.5U／μl のRNAsinを含む50μl のTEで溶離し
た。１％アガロースゲルを支持体とするその後の電気泳
動の結果は、RNA 及びDNA が検出できることを示してい
る。50μl の血清試料に対して加えた哺乳動物の細胞は
5×10⁵ラット10B 細胞(Boom 等、J.Gen.Virol.69,198
8,1179）であり、50μl の血清に対して加えた細菌はプ
ラスミドpCMV-Eを含むE.coli細胞株HB101 の100 μl 一
晩培養物の細胞ペレットであった。

【００９０】実施例A4：ヒトの血清から単離したヒトの
免疫不全ウイルスRNA の検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＹに基づいて各々が50μl のヒトの血清試料
２個（患者Ｆ，Ｈ）からNA（75μl ）を単離した。患者
Ｆの血清は（Abbott研究所のHIV P24 抗原固相免疫検定
法に基づく）多量(2700pg/ml) のHIV 抗原P24 を含んで
いたが、（Abbott研究所のHIV 抗体ELISA に基づく)HIV
抗体に対しては陰性であった。患者Ｈの血清は両方の試
験で陰性であった。

【００９１】単離したNAの一部（43μl ）を37℃で90分
RNAse を含まないDNAse(Boehringer;1U DNAse/μl)で処
理した。エタノールでの沈澱及び68℃で15分間の熱不活
化の後に、RNA を15μl のTE緩衝液に懸濁した。このRN
A 調製物の一部5 μl を、HIV 特異的プライマーの存在
下において、0.4U／μl のAMV 逆転写酵素（42℃で30
分；反応容量20μl ）で処理するか又は処理しなかっ
た。次いで、dNTPs を含む80μl の1.25×濃縮PCR 緩衝
液を加えて、反応容量を100 μl にした。1UのTaq-DNA
ポリメラーゼを加えて、増幅を開始した（１サイクルは
95℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間からな
る）。20、25、30、35サイクルで反応混合物から10μl
のアリコートを採取して、２％アガロースゲルに適用し
た。逆転写酵素で処理した患者ＦのRNA については既に
25サイクル後に予期される330 bp HIVアンプリマー(amp
limer)フラグメントが確認され、HIV RNA が患者の血清
に存在することを示唆していた。

【００９２】実施例A5：数種のカオトロピック物質を用
いるDNA 精製 50μl のヒトの血清試料10個を、CI及びCII 形態（方法
の項参照）からなるそれぞれが10μg の精製pGem3p24 D
NAと混合した。これら10個のプラスミド／血清混合物
を、プロトコルＹ＊に基づいて抽出用インプット材料と
して使用した。使用したカオトロピック物質の濃度につ
いては表A5.1を参照のこと。

【００９３】抽出後に、各試料から溶離したDNA の25％
を0.8 ％アガロースゲル上で分析した。プラスミドDNA
回収の定量化を可能とするために、インプットDNA を同
様に同一ゲル上に直接ロードした。

【００９４】電気泳動後にゲルを紫外線照射下で撮影
し、DNA 回収効率をプラスミド帯強度（表A5.1の表の説
明を参照）を基に視覚的に評価した。

【００９５】カオトロピック物質としてNaI 及びNaSCN
を使用して、同様に実験を実施した（下記の試料の説明
を参照）。

【００９６】

【表１】

【００９７】表の説明：表に記載のカオトロピック物質
を使用して、前述したように10個の検出可能試料を製造
した。

【００９８】−：回収されない。

【００９９】±：ほとんど回収されない。

【０１００】＋：目に見えるほど回収される。

【０１０１】＋＋：定量的に回収される。

【０１０２】表A5.1での結果は、8M尿素を組み合わせた
3MKI、3M NaI又は3M NaSCNをカオトロピック物質として
使用すると、共有結合閉鎖(CI)及び緩和環状(CII)pGem3
p24DNA が効率的に単離されることを示している。CII
の収率はCIと比較して比較的高いようである。

【０１０３】セクションＢ：ヒトの全血からのDNA/RNA
の精製１mlのヒトの血液は、核生成せず従って血液のNA量に寄
与しない約5 ×10⁹の赤血球を含んでいる。血液のNA量
は主に白血球細胞（約4-10×10⁶/mｌ）により決定され
る。多量のタンパク質（血液中、約70mg／ml）を含む水
性媒体（血漿）にこれらの細胞が埋め込まれている。従
って、全血はNA精製にとって極めて不純な源である。セ
クションＢの実施例は、にもかかわらずNAをプロトコル
Ｂ及びＹにより全血から単離することができることを示
している。

【０１０４】実施例B1：ヒトの全血からのDNA の単離ヒトの血液(500μl)を、既知量の精製 DNA[100μl のLM
W(45μg)、80μl のCI/II(40μg)] と混合し、68μl の
試料10個をプロトコルＢにおける10個のDNA 抽出用イン
プット材料として使用した。この実験では、試験管に存
在するSC（シリカ粗材の懸濁液）の量を 2.5〜40μl の
間で変動させた。抽出を二重に行い、各試料からの溶離
DNA の半分（30μl ）を、１％アガロースゲルを支持体
とする電気泳動にかけた。比較のために、インプットDN
A の半分の量を同様に同一ゲル上にロードした。

【０１０５】10μl を越えるSCを使用すると、二重鎖DN
A 、線状共有結合閉鎖(CI)DNA も緩和環状(CII)DNAもヒ
トの全血から効率的に単離された。全血から回収される
DNAの量は、約10μl まではSCの量に比例していた。量
が多くなると飽和するようである。

【０１０６】実施例B2：ヒトの全血から単離したDNA は
制限酵素及びT4 DNAリガーゼに対して良好な基質である
こと精製DNA 調製物を、50μl のヒトの血液試料12個に加え
た。プロトコルＢに従ってこれら12個の混合物からDNA
を単離した。50μl のTEで溶離が生じた。溶離したDNA
の半分を以下の３種の制限酵素：Eco RI, Bam HI, Bgl
II（これらはそれぞれ低塩、中塩及び高塩緩衝液で活性
を有する）のいずれか１つで処理するか、T4 DNAリガー
ゼで処理するか、又は処理しなかった。DNA 試料を１％
アガロースゲルを支持体とする電気泳動にかけ、紫外線
照射により可視化した。

【０１０７】T4リガーゼ処理（37℃で１時間、30μl の
反応容量中に３単位のT4リガーゼ）の結果は、DNA フラ
グメントの分子量の増加を示すと共に、ヒトの血液から
単離したDNA がエキソヌクレオリティックな分解の影響
をそれほど受けないことを示している。

【０１０８】精製プラスミド（pCMV-E；3.3 μg ；1.5
μl ）を加えた８個の血液試料の結果はそれぞれ、Eco
RI、Bam HI、Bgl IIダイジェストに対して、総ての制限
酵素がプラスミドを線状化したことを示している。総て
の制限酵素は９単位の酵素と共に、37℃で１時間30μl
の反応容量中でインキュベートした。

【０１０９】実施例B3：10個の異なる血液試料からのDN
A の単離この実施例では、血液バンクから無作為に選択したヒト
の血液の異なる10個の試料を出発材料として使用した。
各試料において白血球細胞(WBC) の数は知られていた。
プロトコルＢに従って50μl の試料からDNA を精製し、
75μl のTEで溶離が生じた。単離したDNA の三分の一を
１％アガロースゲルに直接適用し、残余部分(2μl)をPC
R 用に使用した。

【０１１０】3 μl のLMW-DNA(6 μg)を50μl の各試料
に加えた後に、同一の試料で同一の単離作業を実施し
た。この場合も25μl の溶出液(eluate)(75 μl)をゲル
に直接適用した。25μl の溶出液の他の部分を最初にT4
DNAリガーゼで処理し（37℃で１時間、30μl の反応容
量中に2U）、次いで同一ゲルに適用した。

【０１１１】血液試料 1〜10の白血球細胞(WBC）の含量
は以下の通りであった。

【０１１２】

【表２】

【０１１３】実施例B4：ヒトの白血球細胞中のヒトのβ
- グロビン遺伝子検出用ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルＢに基づいてヒトの全血から単離したDNA が
Taq -DNAポリメラーゼに対して良好な基質であることを
示すために、実施例B3に従って10個の異なる血液試料か
ら単離した2 μl のDNA を、β- グロビン特異的プライ
マーを含むPCRで処理した。PCR は32サイクルからな
り、各サイクルは94℃で１分間、次いで65℃で３分間で
あった。アンプリマーの一部（50％）を２％アガロース
ゲルを支持体とする電気泳動にかけた。120 bpのアンプ
リマー及びプライマー帯を検出することができた。

【０１１４】実施例B5：ヒトの血液からのDNA 及びssRN
A の同時精製（再現性） DNA 及びRNA を再現し得る形でヒトの血液から精製でき
ることを示すために、一人のヒトから得た各々が50μl
の６個の血液試料をプロトコルＹに基づいて処理し、RN
Asin(0.5U/μl)を含む75μl のTEでNAを溶離した。溶出
液の一部25μlを中性１％アガロースゲルに適用して、
電気泳動にかけた。結果は、DNA 及びRNA が検出できる
ことを示している。

【０１１５】実施例B6：ヒトの血液（10個の異なる試
料）からのDNA 及びssRNA の同時精製 10人の異なるヒトから得た50μl の血液試料（実施例B3
参照）をプロトコルＹに基づいて処理し、0.5U／μl の
RNAsinを含む40μl のTEでNAを溶離した。溶出液の一部
30μl を中性１％アガロースゲルを支持体とする電気泳
動にかけた。結果は、DNA 及びRNA が検出できることを
示している。

【０１１６】実施例B7：ヒトの血液からのDNA 及びssRN
A の同時精製外因性RNA 源をヒトの血液試料に加えた。哺乳動物の細
胞又は細菌を外因性RNA 源として使用した。プロトコル
Ｙに基づいて試料からNAを単離し、RNAseA(40ng/μl の
溶離用緩衝液）の不存在下又は存在下において、50μl
TE＋0.5 U/μlRNAsinで溶離した。50μl の血液試料に
対して 5×10⁵ラット10B 細胞（Boom等、J.Gen.Virol.
69,1988,1179）を哺乳動物細胞として加え、50μl の血
液に対してプラスミドpCMV-Eを含むE.coli細胞株HB101
の100 μl 一晩培養物の細胞ペレットを細菌として加え
た。

【０１１７】結果は、哺乳動物の ssRNA(18S及び28S リ
ボソームRNA)も細菌性 ssRNA（16S及び23S リボソーム
RNA）もヒトの全血から精製され得ることを示してい
る。

【０１１８】更には、ゲノムDNA 及びプラスミド（形態
Ｉ）DNA が効率的に回収される。

【０１１９】セクションＣ：ヒト尿からのDNA/RNA 精製ヒトの尿ではNAは、例えばウイルスまたは細菌中や尿路
由来の細胞中に存在し得る。量は普通、エチジウムブロ
ミド／NA複合体のアガロースゲル電気泳動及びUV照射に
よる検出が不可能なほど少ない。ヒト尿からDNA を精製
し得ることを示すために、マイクログラム量の精製DNA
を尿に添加し、続いてプロトコルB に従ってDNA を単離
した（実施例C1）。ヒト尿からDNA とRNA とを同時に精
製し得ることを示すために、培養した細菌（小プラスミ
ド保有）を尿に添加し、続いてＮＡをプロトコルＹに
従って単離した（実施例C2）。

【０１２０】実施例C3は、プロトコルY*により核酸結合
性固相としてシリカと共に、GuSCNに替えてKI、NaI 及
びNaSCN のような別のカオトロピック物質を用いてもヒ
ト尿からDNA を精製し得ることを示す。

【０１２１】実施例C1: ヒト尿からのDNA 精製 3 μl のLMW DNA(6 μg)を、任意に選択した10の、様々
な混濁度の50μl ヒト尿試料に添加した（試料第4 号、
第5 号、第6 号及び第7 号は澄明であり、試料第1 号、
第2 号、第3 号及び第8 号は僅かに混濁し、試料第9 号
及び第10号は非常に混濁していた）。DNA をプロトコル
B に従って単離し、75μl のTE緩衝液で溶離した。各溶
出物の1/3 を 1％アガロースゲルに適用した。別の部分
25μl を1.8UのT4 DNAリガーゼで（反応量30μl におい
て37℃で1 時間）処理し、やはり上記ゲルに適用した。
マーカーレーンはLMW DNA 及びMMW DNA をそれぞれ含有
する。マーカーレーン中のLMW DNA の量(2μg)は、抽出
効率 100％で観察されるべき量を表す。

【０１２２】実験結果は、プロトコルB でヒト尿からDN
A を有効に精製し得、得られるDNAはT4 DNAリガーゼの
ための優れた基質であることを示す。

【０１２３】尿試料第10号から単離したLMW DNA は明ら
かに分解されていた。しかし、（この実験で用いたよう
な）裸のDNA は尿試料中にヌクレアーゼが豊富であれば
分解されるだろうと予想できた。従って、分解は精製時
にではなく、それ以前の尿／DNA 混合物調製時に起こっ
たと考えられる。次の実施例(C2)は、（裸の場合に反し
て）細胞中に存在するDNA は、特にssRNA までもが尿試
料第10号から有効に回収できることを示す。

【０１２４】実施例C2: ヒト尿からのDNA とssRNA との
同時精製この実験では、実施例C1で用いたのと同じ10の尿試料
を、2.4kb のプラスミド(pCMV-E)を保有する細菌と混合
した。混合物からNAをプロトコルY に従って単離し、か
つ75μl のTE緩衝液中に0.5U／μl RNAsinを用いて溶離
した。溶出物の1/3 を1 ％アガロースゲルでの電気泳動
に掛けた。溶出物の別の部分25μl を10Uの、pCMV-Eを
直鎖化する制限酵素Eco RIで処理した（反応量30μl に
おいて37℃で1 時間）。この処理は40ng／μl RNAse A
の存在下に行なった。電気泳動の結果は、23S 及び16S
リボソームRNA 、並びに共有結合で閉じた形態(CI)及び
直鎖形態(CIII)のプラスミドDNA を示す。

【０１２５】実施例C3: 他のカオトロピック物質を用い
るDNA 精製ヒト尿 (50μl)を、400 μl のカオトロピック物質、溶
菌(lysis) 緩衝液L6*及び1 μg のpGem3p24DNA と混合
した。得られた懸濁液を全部、プロトコルY*によりDNA
を精製するべく500 μl のカオトロピック物質（表C3.1
参照）及び40μl の SiO₂に混合添加した。尿から単離
したDNA の量を、アガロースゲル電気泳動を用いて解析
した。DNA 回収効率を実施例A5に述べたようにして判定
した結果を表C3.1にまとめる。

【０１２６】

【表３】

【０１２７】表C3.1は、 CＩ型及びC II型プラスミドDN
A のDNA バンドの収率が同じであったことを示す。

【０１２８】実施例D1: ヒト糞便からのロタウイルスds
RNA 精製レオウイルス(Reovirdae) 科のウイルスは、二重鎖RNA
から成るゲノムを有する。この科に属する重要な病原体
は、重症の下痢を惹起し得、従って糞便試料中に大量に
存在するロタウイルスである。ロタウイルスのゲノムは
11個のdsRNA セグメントから成り（Hishino in J. Cli
n. Microbiol.21, 1985, 425 参照）、これらのdsRNA
セグメントはプロトコルB によって糞便上清から単離可
能である。下痢試料を 12000×g で2 分間遠心分離して
得た上清100 μl を用いて単離を行なった。

【０１２９】ロタウイルスに感染したことが（Wellcome
ロタウイルスラテックス試験及びKallestad Path- find
erロタウイルス直接抗原検出系によって）確認された6
人の異なる患者から採取した試料を用いた結果、dsRNA
を抽出できることが判明した。

【０１３０】最初の遠心分離ステップを省略し、糞便試
料を直接プロトコルB またはY のためのインプット物質
として直接用いても同様の結果（普通、ロタウイルスds
RNA収率はより高い）が得られた。

【０１３１】実施例E1: ヒト血液、血清及び尿からのss
DNA 精製臨床試料から一重鎖DNA も単離できることを示すため
に、1 μg (4μl)の精製ファージ M13 DNA（Boehringer
社のM13mp9 DNA）を50μl のヒト血清、ヒト血液または
ヒト尿に添加し、プロトコルB またはプロトコルY によ
って精製した。いずれの抽出作業も4 回ずつ行なった。
DNA を50μl のTE緩衝液中に溶離し、25μl を 1％アガ
ロースゲルでの電気泳動に掛けた。マーカーレーンは50
0ng のM13ssDNA を含有する。

【０１３２】この実験の結果から、一重鎖DNA をヒト血
液、血清または尿からプロトコルＹによって、また程度
はより低いがプロトコルＢによっても単離できること
が判明した。

【０１３３】セクションＦ： NA のケイ藻土への結合ケイ藻土の組織はほぼ完全に SiO₂から成るので、ケイ
藻土が使用シリカとして有用であるかどうか調べた。5
種の異なる市販ケイ藻製品［JanssenBiochimica, Louva
in, Belgium のCelatom FW14、Celatom FW50、Celatom
FW60、Celite (AK) 及びCelite 521］各10g を50mlの2
回蒸留水及び500 μl の37％ HClと混合し、得られた懸
濁液をオートクレーブで20分間 121℃に加熱した。実施
例F1及びF2において、上記のように生成した懸濁液をプ
ロトコルY によるNA抽出に用いた。

【０１３４】実施例F1: ヒト血液からのNA単離ヒト血液を、プラスミドpCMV-Eを保有するE.coli HB101
細菌と混合し、一晩経過した培養物100 μl の細菌ペレ
ットを50μl の血液に添加した。50μl 試料を、プロト
コルY によるNA抽出のためのインプット物質として用い
た。40μl のSCに替えて、40μl の上記ケイ藻土懸濁液
を用いた。NAを75μl のTE緩衝液中に、RNAse 阻害物質
を用いずに溶離し、20μl の溶出物を直接ゲルに付与し
た。別の20μl の溶出物を、9UのBam HIを伴ったRNAse
A(40ng／μl)で反応量25μl において37℃で1 時間処理
してからゲルに付与した。

【０１３５】マーカーレーンは1 μg のMMW DNA を含有
する。

【０１３６】得られた結果から、ケイ藻土懸濁液がSCに
類似のNA結合特性を有することが判明した。dsDNA(成分
Ｉ分子）とssRNA(23S 及び16S rRNA) との両方が結合し
た。プラスミドDNA は、Bam HIによって完全に直鎖化さ
れる（成分 III）ほど十分に純粋であった。

【０１３７】実施例F2: グラム陰性菌からのNA精製ヒトにおいて疾病を惹起することが知られている9 種類
の異なるグラム陰性菌種を固形寒天プレート上で培養し
た。上記各細菌種を 5〜10μl ずつプレートから掻き取
って、プロトコルY によるNA抽出のためのインプット物
質として用い、また40μl のSCかまたは40μl のCelite
521懸濁液をNAキャリヤーとして用いた。

【０１３８】SCを用いた抽出は最初の洗浄の間に停止し
なければならなかったが、これは、たとえ（3 分を越え
る）長時間渦形成を行なったとしてももはやNAシリカ複
合体を均質化し得なくなったからである。他方、Celite
521を用いた抽出は問題無く続行することができたが、
これはおそらくケイ藻土の粒径がSC粒子の粒径より大き
かったためであろう。NAを70μl のTE緩衝液で、RNAsin
を用いずに溶離し、溶出物の一部（20μl ）を 1％アガ
ロースゲルでの電気泳動に掛けた。

【０１３９】マーカーレーンは1 μg のMMW DNA を含有
する。

【０１４０】次のような細菌に関する結果を得た。

【０１４１】1: Campylobacter pylori 2: Yersinia enterolytica type 3 3: Neisseria meningitidis 4: Neisseria gonorrhoeae 5: Haemophilus influenzae type b 6: Kelbsiella pneumoniae 7: Salmonella typhimurium 8: Pseudomonas aeruginosa 9: Escherichia coli K1-083 この方法で、HMW 細菌DNA 及びrRNAを検出することがで
きた。

【０１４２】セクションＧ：Escherichia coli JM101の
DNA/RNA 精製グラム陰性菌からのNAの単離が、本発明により可能であ
る。細菌細胞中には、高レベルの高分子量DNA(HMW DNA)
及びリボソームRNA が存在する。実施例G1は、細菌細胞
からNAを、NA結合性固相としてシリカと共に様々なカオ
トロピック物質を用いて精製できることを示す。

【０１４３】実施例G1: NA結合性固相として様々なカオ
トロピック物質及びシリカを用いて行なう細菌細胞から
のNA単離／精製（内在）一晩経過した細菌培養物JM101 50μl からNAを、900 μ
l のカオトロピック物質及び40μl の SiO₂の存在下に
単離した。高レベルのHMW DNA 及び内在リボソーム RNA
（16S 及び 23S）が、エチジウムブロミドで染色したゲ
ルのUV照射によって単離NAを検出することを可能にす
る。単離はプロトコルY*に従って行ない、溶出NAの25％
（40μl 部分）をアガロースゲル上で解析した。

【０１４４】

【表４】

【０１４５】凡例：アガロースゲル解析の結果を表G1に
まとめる。HMW DNA 及びrRNA回収の定量を、シリカと共
に用いるカオトロピック物質がGuSCN であった場合と比
較した。表G1中の“1 ”は、DNA またはRNA 回収の効率
が同等であることを表す。表G1中の“＞1 ”は回収効率
がより高いことを表す。

【０１４６】細菌細胞からの内在RNA 単離のための基準
として、E. coli rRNAマーカー(Boehringer)を用いた。

【０１４７】セクションＨ：カオトロピック物質として
グアニジニウムチオシアネートと、NAを結合させ得る別
の固相とを用いる DNA精製 GuSCN 及び幾つかのシリカ誘導体またはラテックス粒子
（“材料及び方法”参照）を用いてNA単離／精製を行な
い得ることを示すために、純粋なプラスミドを低塩緩衝
液(Tris 10mM−EDTA 1mM, pH8.0)に添加し、その後プロ
トコルY に従って単離したが、その際ステップ7 及び9
は省略した（TEでの溶離を行なわなかった）。結合した
NAを伴ったシリカ／ラテックス粒子をPCR 反応混合物中
に導入した。単離したDNA はPCR 法によって検出し得
る。実施例H1は、カオトロピック物質としてのGuSCN と
共に別の固相を用い、かつPCR 法で検出を行なうことに
よってNAを精製し得ることを示す。

【０１４８】実施例H1: GuSCN 及び別の固相を用いるDN
A 精製 50μl のTris 10mM/EDTA 1mM(pH8.0) 中に存在する0.5
μg のpGem3p24を、80μl のシリカ懸濁液または80μl
のラテックス懸濁液（“材料及び方法”参照）及び900
μl の溶菌緩衝液L6と混合した。

【０１４９】プロトコルY により洗浄し、かつ56℃で乾
燥した後（溶離ステップ省略）、ペレットを50μl の水
に再懸濁した。プラスミド−シリカ懸濁液の20μl 部分
を、HIV 特異的プライマー（“材料及び方法”参照）の
存在下にPCR 混合物中に用い、5 μl の10倍濃縮PCR 緩
衝液と、1 μl の10mM dNTP と、2 単位のTaq DNAポリ
メラーゼと、最終量を50μl とする量の水とを添加して
増幅反応を開始させた（95℃で1 分、37℃で1 分、更に
72℃で 3分を1 周期とする）。

【０１５０】30周期後、反応混合物から10μl アリコー
トを取り分け、 2％アガロースゲル上で解析した。ラテ
ックス粒子でNAを単離した場合、シリカで単離した場合
のようなペレットは得られなかった。

【０１５１】1ml の洗浄液L2を300 μl の70％ EtOH と
混合したところ、二つの液相間にラテックス含有バンド
が見いだされた。ラテックス粒子はその色によって検出
可能である。単離したラテックス含有画分を70％ EtOH
で2 回洗浄し、遠心分離すると、該画分はEppendorff管
内で小さいペレットを形成した。

【０１５２】

【表５】

【０１５３】凡例：結果を表H1にまとめる。30周期後、
予想した290bp HIV アンプライマーフラグメントを総て
の事例で観察した。フラグメントのサイズを、やはりゲ
ル上に載置したマーカーφx 174 RFDNA Hae III digest
(Pharmacia) と比較した。

【０１５４】＋＋: 固相として粗シリカを用いた場合
（対照）と同じレベルのHIV 特異的290bp フラグメント
をアガロースゲル上に検出したことを表す。

【０１５５】＋: 290bp フラグメントの検出レベルが対
照の粗シリカの場合より低いことを表す。

【０１５６】セクションＩ： NA 結合フィルター及びGu
SCN を用いる精製プロトコルY** による核酸の単離では、 SiO₂の替わり
にNA結合フィルター（“材料及び方法”参照）を用い得
る。

【０１５７】低塩緩衝液(Tris 10mM−EDTA 1mM, pH8.0)
中では通常DNA の放出が起こらないが、場合によって生
起するこの問題点は、DNA を結合させたフィルターから
DNAを溶離する替わりに該フィルターをPCR 反応混合物
中に插入することによって排除できる。実施例I1は、NA
結合フィルター及びカオトロピック物質としてのGuSCN
を用い、かつPCR 法で解析することによってNAを精製し
得ることを示す。

【０１５８】実施例I1: DNA 結合フィルターを用い、か
つPCR 増幅による検出を行なうDNA単離／精製 Tris 10mM/EDTA 1mM(pH8.0) 50μl 中の純粋なpGem3p24
DNA（濃度1 μg 、0.01μg 及び0.005 μg)を、寸法 1
cm×1cm の3 個のDNA 結合フィルター及び900μl のGuS
CN(溶菌緩衝液L6) に添加した。

【０１５９】（プロトコルY** による）洗浄（遠心分離
ステップ省略）及び56℃での乾燥の後、DNA を結合させ
たフィルターを直接PCR 混合物中に導入した。HIV 特異
的プライマーの存在下に、PCR サイクラーで増幅を行な
った。

【０１６０】反応混合物は更に、5 μl の10倍濃縮PCR
緩衝液と、1 μl の10mM dNTP と、2 単位のTaq DNAポ
リメラーゼと、最終量を50μl とする量の水とを含有す
る。続いて、増幅反応を開始させた。

【０１６１】30周期後、反応混合物から10μl アリコー
トを取り分け（実施例H1参照）、 2％アガロースゲル上
で解析した。

【０１６２】

【表６】

【０１６３】凡例：結果を表I1にまとめた。予想した29
0bp HIV アンプライマーフラグメントを観察した。フラ
グメントを市販φx Hae IIと比較した。

【０１６４】＋＋: アガロースゲル上で、エチジウムブ
ロミドで強度に染色された290bp フラグメントを検出＋: 290bp フラグメントを検出 0: 290bp フラグメント検出せず比較として: PCR 増幅混合物に添加した7ng の精製pGem
3p24 DNAは、“＋＋”として定量される290bp フラグメ
ントをもたらす。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年６月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヘンリエツテ・マリア・アレイダ・アドリアーンセオランダ国、6828・ベー・エヌ・アーネム、イル・イエー・ペー・フアン・マイルウエイクストラート・87 (72)発明者テイム・キエフイツオランダ国、2593・ヘー・エー・デン・ハーグ、スタイフエサントストラート・183 (72)発明者ペテル・フランクリン・レンスオランダ国、1015・ヘー・カー・アムステルダム、ブラウエルスフラフト・823

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する出発材料から核酸を単離
するための方法であって、出発材料、カオトロピック物
質及びシリカとその誘導体を除く核酸結合性固相を混合
し、核酸が結合した固相を液体から分離し、その後、こ
うして得られた固相- 核酸複合体を洗浄し、必要に応じ
て核酸を該複合体から溶離することを特徴とする方法。
【請求項２】使用される出発材料が全血、血清、バフ
ィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織及
び細胞培養物のような、核酸を含有する生物材料である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】使用されるカオトロピック物質がグアニ
ジニウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イ
ソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素又はその相互の組み
合わせから構成される群から選択されることを特徴とす
る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】グアニジニウム塩が（イソ）チオシアン
酸グアニジニウムであることを特徴とする請求項３に記
載の方法。
【請求項５】使用される核酸結合性固相がポリマー材
料、フィルター材料、ポリスチレンビーズ又はニトロセ
ルロース紙から構成される群から選択されることを特徴
とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】 DNA 及び／又はRNA を単離することを特
徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】得られた固相- 核酸複合体を沈澱させ、
かつ上清を廃棄することにより分離し、その後、カオト
ロピック物質を含有する洗浄用緩衝液で複合体を洗浄す
ることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項８】洗浄用緩衝液で洗った固相- 核酸複合体
を更に1 種以上の有機溶剤で洗浄し、その後、乾燥する
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】洗浄及び乾燥した固相- 核酸複合体中に
存在する核酸を溶離用緩衝液により溶離することを特徴
とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】こうして得られた該固相- 核酸複合体
を増幅用の複数の成分の混合物と接触させ、該固相に結
合しているか又は該固相から溶離した核酸を増幅するこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】請求項１に記載の方法を実施するため
の手段の組み合わせ。
【請求項１２】請求項１０に記載の方法を実施するた
めのテストキット。