JP2013500742A

JP2013500742A - 粒状物試料から微生物の核酸を回収するための方法およびデバイス

Info

Publication number: JP2013500742A
Application number: JP2012523679A
Authority: JP
Inventors: ジョン・スタイチェン; ダニエル・デマルコ; スティーヴン・バーキー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2009-08-04
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2013-01-10
Also published as: US20120271043A1; BR112012002401A2; MX2012001236A; CA2769219A1; AU2010279676A1; WO2011017251A1; EP2462226A1

Abstract

本明細書中に開示されているのは、粒状物試料から微生物の核酸を回収するための方法およびデバイスである。

Description

本出願は、２００９年８月４日に出願された米国仮特許出願番号第６１／２３１，１４６号に優先権を主張しており、その全体が本明細書中で参考として援用されている。

この分野は、粒状物試料に含まれる微生物から核酸を単離するための方法およびデバイスに関する。

細菌のような微生物に関するサンプルの分析は、公衆衛生において重要である。一般人の集団によって育てられ、購入され、そして消費され得る食物は、微生物を含んでいるかまたは捕らえている場合があり、それらが位置している環境の機能として繁茂または増殖する。この増殖は、食物製品の損傷を加速するかまたは毒素もしくはアレルゲンを生成し得る病原性生物の増殖をもたらし得る。

粒状物試料中の微生物を同定する１つの方法は、分子メカニズムを通じてであり、それによりこのような微生物の核酸が検出される。これらの検出方法は、１ミリリットル未満のサンプル量で生じるが、目的の病原体は、１００グラム以上のサンプルあたり１生物の濃度で存在し得る。病原体濃度を測定可能なレベルまで増加させるために、粒状物試料の病原体は、栄養ブロス中で濃縮される。頻繁に、このブロス体積は、２２５ｍｌ〜４Ｌであり、サンプル質量は、２５ｇ〜３７５ｇである。濃縮時間を短縮するために、この大量の濃縮された量から、検出可能な量まで、病原体を濃縮する方法が必要とされる。

病原体の濃縮は、親和性のリガンド−抗原相互作用を用いて、全ての病原性生物を捕捉することによって実施され得る。例えば、抗体は磁性粒子に結合され得る（例えば、特許文献１を参照のこと）。この粒子を濃縮したサンプルに曝露した後、標的生物がその粒子に結合され得、その後磁力によって残りの濃縮ブロスから分離されることにより単離され、濃縮される。このアプローチの欠点は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの病原性形態のような所定の株の病原体全てがそれらの抗原中に病原性を発現するわけではなく、従ってそれらは回収されないということである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７のラフ株（非特許文献１：非特許文献２）である。親和性リガンド（特に抗体）を用いる別の可能性のある欠点は、標的物の任意の所定のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の広範囲な親和性に起因して生じ得る。グラム陽性菌を標的化する多くの抗体は、例えば、低い親和性によって検出感度が低下する。

検出感度の低下は、言い換えるとより長い前濃縮時間が必要であるということであり、サンプル濃度によって達成される全ての潜在的な利益を上回り得る。

代替的なアプローチは、サンプルからの遊離核酸を捕捉することである。生物の病原性質は常にそのＤＮＡサインに含まれているため、このアプローチはこの目的の生物の表面上での乏しい発現または発現がないという問題を避ける。核酸結合技術はまた、抗体を使用することに関する親和性が乏しい問題の克服に通常非常に効率的である。ＤＮＡ検出は標的構造に対して非常に特異的であるため、特別ではない結合技術がこの目的のために用いられ得る。

微生物から核酸を分離および単離するために適用される典型的なアプローチは、核酸結合物質の使用である。例えば、核酸結合物質の１つの有名な例は、カオトロピック試薬の存在下で可逆的に核酸に結合するその能力に起因した、シリカ表面である（非特許文献３）。このような結合は、核酸のリン酸基と相互作用する酸化物表面（「Ｘ−ＯＨ」）によってもたらされると想定される。物理的な構造において、これらのシリカ表面は変化している。非磁性のシリカ粒子は、遠心分離で非粒状物試料と共に用いられるが、食物サンプルが存在する場合、その食物は粒子と共に遠心分離機にかけられ、分離が生じない。磁性のシリカ粒子が用いられているが、コンテナの表面領域で粒子を濃縮するために磁性システムを使用することが必要である。シリカフィルターを介したサンプルの濾過もまた可能であるが、良好なサンプルの場合は、食物粒子もまたフィルター上に捕捉され、分離が生じない。

米国特許第７，５０７，５２８号

Ｐ．Ｆｅｎｇｅｔａｌ．，ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＲｏｕｇｈＳｔｒａｉｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７Ｈ７ＴｈａｔＰｒｏｄｕｃｅｓＮｏＤｅｔｅｃｔａｂｌｅＯ１５７Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８Ａｕｇｕｓｔ；３６（８）：２３３９−２３４１ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢ．ａｎｄＧｉｌｌｅｓｐｉｅＤ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：６１５−１９（１９７９）

１つの局面は、粒状物試料から微生物の核酸を回収する方法であって、
（ａ）微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスのアリコートを、
（ｉ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を備え、少なくとも１次元に寸法を拡張することができる、チャンバー内部；および
（ｉｉ）核酸結合溶液；
を含んでなるデバイス中に移す工程であって、
繊維質で非磁性の核酸結合表面の繊維が、粒状物試料濃縮ブロスおよび核酸結合溶液で湿潤する際に該チャンバー内部を少なくとも部分的に満たすように広がる、該工程；
（ｂ）微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスと核酸結合溶液を混合する工程であって、それにより微生物を溶解させる、該工程；
（ｃ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することにより、核酸結合溶液を、デバイスから排出するが繊維質で非磁性の核酸結合表面をチャンバー内部に保持する工程；
（ｄ）溶離緩衝液のアリコートをデバイス中に移す工程；
（ｅ）溶離緩衝液と繊維質で非磁性の核酸結合表面とを混合する工程；および
（ｆ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することにより、溶離緩衝液をデバイスから排出するが繊維質で非磁性の核酸結合表面をチャンバー内部に保持する工程であって、それにより溶離緩衝液が微生物からの核酸を含む、該工程；
を含んでなる。

別の局面は、粒状物試料から微生物の核酸を回収する方法であって、
（ａ）核酸結合溶液の存在下で、微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスのアリコートを、非磁性の核酸結合表面に曝露する工程であって、該微生物は核酸を含んでなり、そして該非磁性の核酸結合表面は、湿潤の際に拡張し得る繊維材料を含んでなる、該工程；
（ｂ）微生物を溶解させる工程；
（ｃ）繊維材料を拡張することにより、核酸を非磁性の核酸結合表面に結合させる工程；（ｄ）繊維材料の圧縮により、非磁性の核酸結合表面に結合している核酸を含んでなるその表面から、粒状物試料濃縮ブロスを分離する工程；
（ｅ）非磁性の核酸結合表面を洗浄液で洗浄する工程であって、それにより該繊維材料が再び拡張される、該工程；
（ｆ）繊維材料を圧縮することにより、洗浄溶液を、非磁性の核酸結合表面に結合する核酸を含むその表面から分離する工程；
（ｇ）溶離緩衝液のアリコートを、非磁性の核酸結合表面に曝露する工程であって、それにより繊維材料が再び拡張される、該工程；および
（ｈ）繊維材料を圧縮することにより、溶離緩衝液で非磁性の核酸結合表面から核酸を溶離させる、工程、
を含んでなる、方法に関する。

他の目的および利点は、以下の詳細な記載を参照することで、当業者に明らかとなる。

本明細書中に記載されるシリンジ方法または標準的なＢＡＸ（登録商標）手順によって回収された場合の、１５％の霜降り牛挽肉と混合したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サンプル（細胞濃度：１０×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ）のＰＣＲプロファイルを示す線グラフである。本明細書中に記載されるシリンジ方法または標準的なＢＡＸ（登録商標）手順によって回収された場合の、１５％の霜降り牛挽肉と混合したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サンプル（細胞濃度：１０×１０³ＣＦＵ／ｍｌ）のＰＣＲプロファイルを示す線グラフである。本明細書中に記載されるシリンジ方法または標準的なＢＡＸ（登録商標）手順によって回収された場合の、１５％の霜降り牛挽肉と混合したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サンプル（細胞濃度：１０×１０⁵ＣＦＵ／ｍｌ）のＰＣＲプロファイルを示す線グラフである。本明細書中に記載されるシリンジ方法、標準的なＢＡＸ（登録商標）手順、または遠沈調製法（ｓｐｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって回収された場合の、１５％の霜降り牛挽肉と混合したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サンプル（細胞濃度：１０×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ）のＰＣＲプロファイルを示す線グラフである。「Ｃ」スパイクレベルは、試験した最も低い細胞濃度（１×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ）である。本明細書中に記載されるシリンジ方法、標準的なＢＡＸ（登録商標）、または遠沈調製法（ｓｐｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって回収された場合の、１５％の霜降り牛挽肉と混合したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サンプルのＰＣＲプロファイルを示す線グラフである。「スパイクなし」は、ネガティブコントロールである。

好ましい実施態様の詳細な説明
出願人らは、本開示中に引用された全ての参考文献の内容全体を具体的に援用する。さらに、量、濃度、または、他の値もしくはパラメータが範囲、好ましい範囲、または上方値および下方値の列挙として記載されている場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関わらず、いずれかの範囲上限または好ましい上方値と、いずれかの範囲下限または好ましい下方値とのいずれかの対から形成されるすべての範囲を特に開示していると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が言及されている場合、他に明記されていない限りにおいて、この範囲は、その端点、および、範囲内のすべての整数および少数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲が定義される場合において特定の値に限定されることは意図されない。

（定義）
本開示において、多くの用語および略語が用いられる。以下の定義が提供される。

本明細書中において用いられる場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所定の値または範囲の、２０％以内、好ましくは１０％以内、およびより好ましくは５％以内を意味する。

用語「含む」は、用語「本質的にからなる」および「からなる」によって包含される実施形態を含むことを意図される。同様に、用語「本質的にからなる」は、用語「からなる」によって包含される実施形態を含むことを意図される。

「ポリメラーゼ鎖反応」は、ＰＣＲと略される。

「カオトロープ」は、液体の水の規則正しい構造を乱す、あらゆる化学物質である。カオトロープは、例えば、タンパク質の変性、伸長、分離、および核酸の水素結合（ｈｙｄｒｏｇｅｎｂｏｄｉｎｇ）を促進する。カオトロピック塩の例としては、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジウム、および塩酸グアニジウムが挙げられる。

用語「単離された」は、天然に存在する環境における物質と通常付随しているかまたはその物質と相互作用する成分を実質的に含まないかまたは、その成分から除去された、核酸分子および／またはタンパク質のような物質を意味する。単離されたポリヌクレオチドは、天然に生じる宿主細胞から精製され得る。この用語はまた、組み換えポリヌクレオチドおよび化学合成されたポリヌクレオチドをも包含する。

用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、および「核酸フラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成の、非天然のまたは変えられたヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマー形態のポリヌクレオチドは、１本またはそれ以上の鎖の、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの混合物からなり得る。

用語「シリカ」は、本明細書中で用いられる場合、主にケイ素および酸素からなる物質を示している。これらの物質は、例えば、シリカ、二酸化ケイ素、シリカゲル、ヒュームドシリカゲル、珪藻土、セライト、タルク、石英、結晶石英、アモルファス石英、ガラス、これらの物質の異なる全ての形状を含むガラス粒子を含む。ガラス粒子は、例えば結晶シリカの粒子、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、および繊維質のガラス不織布を含み得る。

（回収方法）
粒状物試料濃縮物がチャンバー内の非磁性の核酸結合表面繊維と混合され、そのチャンバーを圧縮してその内容物がオリフィスを通して放出されると繊維がそのチャンバー内に留まるが、粒子は排出されることが発見された。この方法がカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在下で実施される場合、その非磁性の核酸結合表面繊維は、その濃縮物のバルクに浸透するために混合している間に拡張し、核酸の実質的な部分を回収する。また、その濃縮物が排出され、洗浄体積が、非磁性の核酸結合表面を伴うその繊維に導入された後、繊維は再びその体積まで拡張する。これらの洗浄体積が排出されると、残りの粒子もまた、小さく、圧縮された非磁性の核酸結合表面の塊が得られ、繊維は非常に小さな体積の元々の濃縮物となり、目的の生物核酸のほとんどが存在している。この核酸は、非磁性の核酸結合表面繊維表面から小量の溶出液中に放出され得、目的物の高濃度増幅がもたらされる。

１つの実施態様において、微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスのアリコートは、繊維質で非磁性の核酸結合表面を含むチャンバー内部であって、このチャンバー内部は、少なくとも１次元に寸法を拡張することができるチャンバー内部；および核酸結合溶液を含むデバイス中に移され、その繊維質で非磁性の核酸結合表面の繊維は、粒状物試料濃縮ブロスおよび核酸結合溶液で湿潤する際にこのチャンバー内部を少なくとも部分的に満たすように広がっている。下痢原性Ｅ．Ｃｏｌｉの代表的なサンプル濃縮プロトコルは、ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭａｎｕａｌ「ＢＡＭ」（Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に記載される：無菌的に秤量した２５ｇのサンプルを２２５ｍｌの脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロス（希釈比１：１０）中に溶解した。必要な場合、サンプルサイズは、希釈が比例的に調節される限り、サンプルの状態によって２５ｇから外れてもよい。混ぜるかまたは簡単に消化させる（ｓｔｏｍａｃｈ）。そのホモジネートを、断続的に振盪しながら１０分間室温でインキュベートし、その後そのサンプルを１０分間重力により沈殿させた。培地を注意深く滅菌容器中にデカントし、３５℃で３時間インキュベートして傷ついた細胞を蘇生させた。内容物を、滅菌容器中の２２５ｍＬで２倍強度のトリプトンリン酸（ＴＰ）ブロスに移し、４４．０±０．２℃で２０時間インキュベートした。しかしながら、全てのサンプル濃縮手順が、本発明の方法において利用され得ることを言及しておく。

そのチャンバー内部には、繊維質で非磁性の核酸結合表面が存在している。いくつかの実施態様において、この繊維質で非磁性の核酸結合表面は、清浄なシリカ表面であり、いくつかの実施態様は清浄で活性化されたシリカ表面を利用している。このシリカの清浄化および活性化は、例えば塩酸で洗浄することによって達成されるが、別々の洗浄工程が全てのシリカタイプに必要とされない場合もある。この洗浄工程後、洗浄溶液が排出され、目的の標的生物を含む濃縮された粒状物試料（例えば食物サンプルまたは臨床サンプル）が吸引される。

あるいは、この非磁性の核酸結合表面は、例えばＮＯＭＥＸ（登録商標）繊維（メタ−アラミド；Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、ＫＥＶＬＡＲ（登録商標）（パラ−アラミド；Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、ポリアミド（例えばナイロン（例えば、ナイロン６，６、ナイロン６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン６１２））であり得る。

典型的には、サンプルの体積は、５００μＬ〜１０ｍＬの範囲、またはサンプルのタイプに応じてそれ以上であり得る。その後、いくつかの実施態様において、界面活性剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、緩衝成分ならびに結合および溶解を容易にする可能な他の成分を含む、等しい体積の核酸結合溶液がサンプルと共に吸引される。この核酸結合溶液は、典型的にはカオトロピック塩であるが、代替的には６ＭのＮａＣｌＯ₄、Ｔｒｉｓおよびトランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）のような塩のブレンド；または８ＭのＮａＣｌＯ₄およびＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）；またはＮａＩであり得る。

微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスと核酸結合溶液を混合することにより、微生物が溶解する。チャンバー内の溶液は（例えば、ボルテックスミキサーによって）徹底的に混合し、繊維質で非磁性の核酸結合表面を完全に分散させてその表面領域のバルクをチャンバー中の液体全体に曝露させる。その後、細胞溶解および核酸結合が生じている時間、インキュベートした。代表的な混合条件は、室温で、回転式ミキサーで１５分間である。

混合後、繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することによって、その核酸結合溶液を排出するが繊維質で非磁性の核酸結合表面をチャンバー内部に保持する。

例として、上記のチャンバーを用いて、微生物を含む食品サンプルインキュベーションブロスのアリコートをそのデバイスのチャンバー中に引き抜き、そのブロスをチャンバー内の核酸結合溶液と混合させる。混合後、その核酸結合溶液をチャンバーから排出するが、繊維質で非磁性の核酸結合表面に結合している微生物内の核酸は、それによってチャンバー内に保持される。

いくつかの実施態様において、その後この繊維質で非磁性の核酸結合表面は、洗浄溶液で洗浄される。最初のサンプルインキュベーションに続き、液体がデバイスから排出された後に、核酸結合溶液、界面活性剤および緩衝塩を含む等しい体積の洗浄用緩衝液がデバイス中に吸引され得る。その後、このデバイスは前出と同様、ボルテックスミキサーなどで混合され、繊維質で非磁性の核酸結合表面に完全に曝露され、その後この洗浄用流体がすぐに排出されるが、繊維質で非磁性の核酸結合表面はチャンバー内部に保持される。

さらに、その後等しい体積のエタノール（例えば、７０％エタノール）を吸引し、前出のように混合して、排出し得る。次に、等しい体積のアセトンを吸引し、前出のように混合して、排出し得る。

この洗浄溶液は、繊維質で非磁性の核酸結合表面からの核酸の放出が、好ましくは起こらないかまたは少なくとも有意な量で起きず、さらに存在するいかなる不純物も可能な限り洗浄して排出されるように選択される。汚染された洗浄溶液は、好ましくは核酸の結合の終わりに、核酸結合溶液と同じ方法で除去される。

任意の従来の洗浄緩衝液または任意の他の適切な培地が洗浄溶液として用いられ得る。一般的には、低いかまたは中程度のイオン強度を持つ緩衝液が好ましく、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０−１０ｍＭＮａＣｌである。

しかしながら、さらにより高い塩濃度の洗浄緩衝液−例えば３Ｍの塩酸グアニジウム−もまた用いられる。同時に、洗浄工程を実施するための他の標準的な培地が用いられ得、例えば１〜５個の炭素原子を有する低級アルカノール溶液、好ましくはエタノール水溶液および特に好ましくは７０％エタノール溶液のような培地を含むアセトンまたはアルコールである。別の好ましい実施態様において、この洗浄溶液は、イソプロパノールである。

いくつかの実施態様において、洗浄溶液は核酸結合溶液、特にカオトロピック物質がその中に含まれていないということで特徴づけられる。結果として、洗浄工程の後の回収工程中に取り込まれるカオトロピック物質を有する可能性を低減することができる。カオトロピック物質がその中に取り込まれる溶離工程において、このカオトロピック物質は、時々ＰＣＲ反応などのようなその後の酵素反応を妨げる；従って、後の酵素反応のことを考慮すると、洗浄溶液にカオトロピック物質を含まないことが好ましい。

チャンバーからの核酸結合溶液の排除に続き、または利用する場合には任意の洗浄工程に続いて、繊維質で非磁性の核酸結合表面を、例えばヒートブロック中のデバイスに配置することによって乾燥することができる（例えば、５５℃で１５分間）。別の実施態様において、この任意の乾燥工程は減圧により実施することができる。

この任意の乾燥工程に続き、捕捉された核酸は少量（７０〜１００μｌ）の溶離緩衝液に曝露されることにより溶離される。典型的な溶離緩衝液は、ＰＣＲに必要な全ての成分（すなわち、ＭｇＣｌ₂、緩衝塩など）を含むが、カオトロピック塩は含まないｐＨ８．３のＰＣＲ緩衝溶液である。溶離緩衝液の選択は、単離される核酸の企図される用途により一部決定される。適切な溶離緩衝液の例は、ＴＥ緩衝液、超純水（ａｑｕａｂｉｄｅｓｔ）およびＰＣＲ緩衝液である。溶離液のｐＨは、２〜１１が好ましく、より好ましくは５〜９である。さらに、イオン強度および塩濃度は、吸着された核酸の溶離に特に影響を及ぼす。この溶離液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満のイオン強度を有し、９０ｍｍｏｌ／Ｌまたはそれ未満の塩濃度を有していることが好ましい。その結果として、核酸の回収速度が増加し、より多くの核酸を回収することができる。

混合が完了すると、溶離緩衝液は、核酸結合表面に結合した核酸を含むその溶離緩衝液と共にシリンジより排出される。必要な場合、さらなる溶離緩衝液がシリンジ中に引かれ、核酸結合表面と混合され、そしてシリンジから排出されて結合した核酸の回収を最大にする。核酸結合表面との接触から得られる溶液は吸着した核酸を含んでいるので、回収された溶液は典型的にはその後の工程、例えば核酸のＰＣＲ増幅に供される。

また、この溶離工程において、核酸の溶離液中に回収された核酸の分解を防ぐための安定化剤を加えることができる。安定化剤として、抗菌剤、殺菌剤、核酸分解阻害剤などが加えられ得る。ヌクレアーゼ阻害剤として、ＥＤＴＡなどが示される。

溶離緩衝液の注入回数に対する制限はなく、１回または複数回であってもよい。通常、核酸が分離され、迅速かつ簡単に精製されると、１回の回収手段で実施されるが、大量の核酸が回収されると、溶離緩衝液は複数回注入される場合がある。

上記の方法によって、核酸は無数の微生物（例えば、細菌、真菌、藻類またはウイルス類を含む）から回収することができる。

本発明を以下の実施例で更に規定する。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示しているが、あくまで例示として示されていることが理解されるべきである。

略語の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日数を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ＣＦＵ」はコロニー形成単位を意味し、「ＭＰ」は多発性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）を意味し、「ＢＨＩ」は脳心臓浸出物を意味し、「ＢＰＷ」は緩衝ペプトン水を意味し、「ｎ．ｄ．」はデータなしを意味する。

（実施例１）
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を濃縮スパイク（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓｐｉｋｅ）した後の牛挽肉における、標準的なＢＡＸ（登録商標）プロトコル対シリカウールカオトロープ捕捉プロセス
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＤ１２６１の一晩培養物を、ＢＨＩ培地中で１．０×１０⁹ＣＦＵ／ｍＬまで増殖させ、その後４０μＬの細胞を４ｍＬのサンプルアリコート中に加えた。別に、２５ｇの１５％霜降り牛挽肉を２２５ｍＬのＢＡＸ（登録商標）ＭＰ培地（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）中で３７℃で一晩インキュベートした。次いで、このＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＤ１２６１細胞をＭＰ培地中で牛挽肉と簡単に混合し、このサンプルを４分間以上放置した。４ｍＬのアリコートを濃縮物の表面直下から取り出した。

この混合物から取り出した２つの５μＬのアリコートを、ＰｒｏＥを含む２００μＬのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液と混合し、３７℃で２０分間、その後９５℃で１０分間インキュベートした。５０μＬのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液／Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ／牛挽肉混合物をＢＡＸ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ錠剤上に加え、ＢＡＸ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍＱ７を実行した。

別に、シリンジサンプル準備のために１ｍＬのアリコートをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／牛挽肉混合物から取り出した。このシリンジを、３ｍｌシリンジ中に１０ｍｇのＱｕａｒｔｚｅｌ（登録商標）ウール（溶融石英繊維、４μｍ；Ｓａｉｎｔ−ＧｏｂａｉｎＱｕａｒｔｚ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を入れることにより準備した。約１ｍｌの溶解緩衝液Ｌ６および約１ｍｌのＭＰ濃縮物由来のシリンジサンプルを事前に混合し、その後シリンジ中に吸引した。その吸引液をボルテックスミキサーで混合し、そのミキサー上で１５分間インキュベートした。その後、シリンジ中の流体をシリンジ中から完全に排出した。

次に約２ｍｌの洗浄緩衝液Ｌ２をシリンジ中に吸引し、ボルテックスミキサーで混合し、その後流体をシリンジから完全に排出した。

次いで、約２ｍｌの７０％ＥｔＯＨをシリンジ中に吸引し、ボルテックスミキサーで混合し、その流体をシリンジから完全に排出した。

次に、約２ｍｌのアセトンをシリンジ中に吸引し、ボルテックスミキサーで混合し、その流体をシリンジから完全に排出した。次いでこのシリンジを、ピストン棒をせずにヒートブロック中で５５℃で１５分間インキュベートし、Ｑｕａｒｔｚｅｌ（登録商標）ウールを乾燥させた。

ＰＣＲ後、このカオトロープ捕捉シリンジ法により、標準的なＢＡＸ（登録商標）プロトコルよりもより高感度の検出が得られた（図１Ａ−Ｂを参照）。このカオトローププロトコルは、１．０×１０³ＣＦＵ／ｍｌでＳａｌｍｏｎｅｌｌａを検出することができたが、標準的なＢＡＸ（登録商標）プロトコルではできなかった。さらに、このカオトローププロトコルは、標準的なＢＡＸ（登録商標）プロトコルと比較して、１．０×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌレベルでより大きい標的ピークを得た。

１．０×１０⁵ＣＦＵ／ｍｌレベルにて、このシリンジプロトコルが任意の標的または内部ポジティブコントロール（ＩＮＰＣ）ピークを作製できなかった理由はあきらかではないことを記述しておく。

（実施例２）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの濃縮スパイク後の牛挽肉における遠心分離サンプル調製評価。Ｔａｑを追加したリオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）対シリカウールカオトロピック塩シリンジプロトコルでの評価
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＤ１２６１の一晩培養物を、ＢＨＩ培地中で１．０×１０⁹ＣＦＵ／ｍＬまで増殖させ、その後４０μＬの細胞を４ｍＬのサンプルアリコート中に加えた。別に、２５ｇの１５％霜降り牛挽肉を２２５ｍＬのＢＰＷ培地中で３７℃で一晩インキュベートした。次いで、このＳａｌｍｏｎｅｌｌａＤＤ１２６１細胞をＢＰＷ培地中で牛挽肉と簡単に混合し、このサンプルを４分間以上放置した。４ｍＬのアリコートを濃縮物の表面直下から取り出した。

この混合物から取り出した２つの５μＬのアリコートを、ＰｒｏＥを含む２００μＬのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液と混合し、３７℃で２０分間、その後９５℃で１０分間インキュベートした。その後３０μＬの混合物をリオスフェアＤＰＱ−ＴＣ上に加え、そこに０．７５μＬのＡｍｐｌｉｔａｑを加えた。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ／牛挽肉混合物の、２つの別々の３００μＬのアリコートを、５００μＬのサンプル調製試薬（８ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液、８０μＬの１００％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、４０μＬの２０％ＳＤＳ溶液）を含む１．５ｍｌのミクロチューブ中に入れた。

次いで、このミクロチューブを１２，０００ｇで３分間回転させ、上清を吸引によって完全に除去し、ペレットをプロテアーゼを加えた２００μＬのＢＡＸ（登録商標）緩衝液に再懸濁して、３７℃で２０分間、その後９５℃で１０分間インキュベートした。その後３０μｌの混合物をリオスフェアＤＰＱ−ＴＣ上に加え、そこに０．７５μＬのＡｍｐｌｉｔａｑを加えた。

別に、シリンジサンプル準備のために１ｍＬのアリコートをＳａｌｍｏｎｅｌｌａ／牛挽肉混合物から取り出した。このシリンジを、３ｍｌシリンジ中に１０ｍｇのＱｕａｒｔｚｅｌ（登録商標）ウール（溶融石英繊維、４μｍ；Ｓａｉｎｔ−ＧｏｂａｉｎＱｕａｒｔｚ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を入れることにより準備した。約１ｍｌの溶解緩衝液Ｌ６および約１ｍｌのＢＰＷ濃縮物由来のシリンジサンプルを事前に混合し、その後シリンジ中に吸引した。その後吸引液をボルテックスミキサーで混合し、その後そのミキサー上で１５分間インキュベートした。その後シリンジ中の流体をそのシリンジから完全に排出した。

乾燥後、１００μｌのＢＡＸ（登録商標）緩衝液（５５℃まで予熱したもの）をシリンジ中に吸引し、ピストン棒を再び挿入し、可能な限り多くの液体をシリンジから排出した。次いで、３０μｌの排出した液体をリオスフェアＤＰＱ−ＴＣ上に加え、そこに０．７５μＬのＡｍｐｌｉｔａｑを加えた。

ＩＮＰＣ応答は、概して、この遠沈調製物は他の２つの方法よりもより高いレベルの阻害をもたらしたことを示している。スパイクレベル「Ｃ」は、遠沈調製とシリンジ法の両方についての阻害を示している（図２Ａを参照）。目視検査により、「Ｃ」のスパイクチューブは、他のチューブよりもより濁っており、ペレットは遠沈調製法（これは最も高い阻害を示した）で最も大きいことが明らかとなった。これは、レベル「Ｃ」での結果に影響を与えたようである。

スパイクなしのデータは、この牛挽肉は本来Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａで汚染されていなかったことを示していた。

表１に示されるように、遠沈調製法は、Ｃｔ（交差閾値（Ｃｒｏｓｓｉｎｇｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）；ＰＣＲ効率と出発ターゲットのコピー数の基準。Ｃｔが低いほど、より多くのターゲットが反応を開始し、および／または反応効率が高い。３Ｃｔ＝１ｌｏｇ）に基づいて標準的なＢＡＸ（登録商標）法よりも１〜２ｌｏｇ高感度であった。シリンジ法は、Ｃｔに基づいて、標準的なＢＡＸ（登録商標）法よりも３〜４ｌｏｇ高感度であった。

興味深いことに、このシリンジ法は、出願人らが追加のＭｇＣｌ₂をＬ２緩衝液に加えることを怠ったにもかかわらず良好に実施された。従って、食物マトリクスが存在する場合、さらなるＭｇ補足は必要ないようである。また、シリカからのＤＮＡ放出は、最適に及ばない結果が得られたが、より良い結果が将来的に可能となるであろう。

Claims

粒状物試料から微生物の核酸を回収する方法であって、
（ａ）微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスのアリコートを、
（ｉ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を備え、少なくとも１次元に寸法を拡張することができる、チャンバー内部；および
（ｉｉ）核酸結合溶液；
を含んでなるデバイス中に移す工程であって、
繊維質で非磁性の核酸結合表面の繊維が、粒状物試料濃縮ブロスおよび核酸結合溶液で湿潤する際に該チャンバー内部を少なくとも部分的に満たすように広がる、該工程；
（ｂ）微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスと核酸結合溶液を混合する工程であって、それにより微生物を溶解させる、該工程；
（ｃ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することにより、核酸結合溶液を、デバイスから排出するが、繊維質で非磁性の核酸結合表面をチャンバー内部に保持する工程；
（ｄ）溶離緩衝液のアリコートをデバイス中に移す工程；
（ｅ）溶離緩衝液と繊維質で非磁性の核酸結合表面とを混合する工程；および
（ｆ）繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することにより、溶離緩衝液をデバイスから排出するが、繊維質で非磁性の核酸結合表面をチャンバー内部に保持する工程であって、それにより溶離緩衝液が微生物からの核酸を含む、該工程；
を含んでなる、上記方法。
請求項１に記載の方法であって、工程（ｃ）の後かつ工程（ｄ）の前に、
前記繊維質で非磁性の核酸結合表面を洗浄溶液で洗浄する工程；および
該繊維質で非磁性の核酸結合表面を圧縮することにより、該洗浄溶液を排出するが、該繊維質で非磁性の核酸結合表面を該チャンバー内部に保持する工程；
をさらに含んでなる、上記方法。
前記排出は減圧により行われる、請求項２に記載の方法。
前記工程（ｃ）、（ｆ）、または（ｃ）および（ｆ）の排出は、減圧により行われる、請求項１に記載の方法。
前記繊維質で非磁性の核酸結合表面は清浄なシリカ表面である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記清浄なシリカ表面は清浄で活性化されたシリカ表面である、請求項５に記載の方法。
前記清浄で活性化されたシリカ表面はシリカウールを含んでなる、請求項６に記載の方法。
前記繊維質で非磁性の核酸結合表面は、メタ−アラミド表面、パラ−アラミド表面およびポリアミド表面からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸結合溶液はカオトロピック塩を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物は細菌、真菌、藻類、またはウイルス類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記粒状物試料は食品試料または臨床試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
粒状物試料から微生物の核酸を回収する方法であって、
（ａ）核酸結合溶液の存在下で、微生物を含む粒状物試料濃縮ブロスを、非磁性の核酸結合表面に曝露する工程であって、該微生物は核酸を含んでなり、そして該非磁性の核酸結合表面は、湿潤の際に拡張し得る繊維材料を含んでなる、該工程；
（ｂ）微生物を溶解させる工程；
（ｃ）繊維材料を拡張することにより、核酸を非磁性の核酸結合表面に結合させる工程；
（ｄ）繊維材料の圧縮により、非磁性の核酸結合表面に結合している核酸を含んでなるその表面から、粒状物試料濃縮ブロスを分離する工程；
（ｅ）非磁性の核酸結合表面を洗浄液で洗浄する工程であって、それにより該繊維材料が再び拡張される、該工程；
（ｆ）繊維材料を圧縮することにより、洗浄溶液を、非磁性の核酸結合表面に結合する核酸を含むその表面から分離する工程；
（ｇ）溶離緩衝液のアリコートを、非磁性の核酸結合表面に曝露する工程であって、それにより繊維材料が再び拡張される、該工程；および
（ｈ）繊維材料を圧縮することにより、溶離緩衝液で非磁性の核酸結合表面から核酸を溶離させる工程、
を含んでなる、上記方法。