DE102008010692A1

DE102008010692A1 - Neue Matrices, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen

Info

Publication number: DE102008010692A1
Application number: DE102008010692A
Authority: DE
Inventors: Roland Fabis; Ralf Himmelreich
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2009-08-27
Also published as: WO2009103794A1; US20110054054A1; EP2255000A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige, funktionalisierte Matrices bzw. Matrixmaterialien, die Strukturen der allgemeinen Formel I aufweisen $F1 Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Isolierung von Biomolekülen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft funktionalisierte Matrices und Matrixmaterialien, die Strukturen der allgemeinen Formel I aufweisen Träger-Linker-Spacer-NR₃-NR₁R₂ (1),
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Isolierung von Biomolekülen.
Unter Biomolekülen werden gemäß der vorliegenden Erfindung ganz allgemein Moleküle verstanden, die als Produkte einer evolutionären Selektion durch geordnetes und selektives Zusammenwirken spezifische Aufgaben für einen Organismus erfüllen und die Grundlage seiner Lebensfunktionen ausmachen [vgl. Römpp, Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1999].
Insbesondere werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, wie z. B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, Gesamt-RNA, mRNA oder RNA/DNA Hybride als Biomoleküle angesehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Reinigung bzw. Isolierung dieser Biomoleküle aus wässrigen Systemen, die z. B. Verunreinigungen wie Fette oder Zelltrümmer enthalten.
Daneben betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung oder Reinigung von ggf. artifiziellen Biomolekülen aus Reaktionsmischungen, die aus Labor- oder Industriesynthetischen Umsetzungen resultieren.
Die Erfindung betrifft insbesondere Matrices, die die Fähigkeit aufweisen, Nukleinsäuren bei einem pH-Wert in einem ersten Intervall zu immobilisieren und bei einem pH-Wert in einem zweiten Intervall, der sich von dem ersten pH-Wert bzw. pH- Intervall unterscheidet, wieder freizusetzen. Die Erfindung betrifft daneben Verfahren zu ihrer Herstellung deren Verwendung zum Aufreinigen bzw. Isolieren der gewünschten Nukleinsäure(n).
Der enorme wissenschaftliche Fortschritt auf dem Gebiet der molekularen Biologie – u. a. auf dem Gebiet der Gentechnologie und der molekularen Diagnostik – hat einen hohen Bedarf an schnellen, sicheren und automatisierbaren Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren geweckt.
Dabei können die biologischen Proben, die u. a. zur DNA-Identifikation oder -Analyse eingesetzt werden, aus einer Vielzahl von Quellen stammen, wie z. B. Tier- und Pflanzenzellen, Faeces, Gewebe- und Knochenproben (Biopsien) oder Blut stammen. Daneben können die Proben aber auch aus dem Boden, aus Nahrungsmitteln oder aus synthetisch hergestellten Nukleinsäuremischungen gezogen werden.
Viele molekularbiologische Verfahren, wie die reverse Transskription, Klonierung Restriktionsanalyse, Amplifikation sowie Sequenzierung erfordern zwingend, dass die in den jeweiligen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuren im Wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, die die entsprechenden Reaktionsabläufe bzw. Analyseverfahren negativ beeinflussen könnten. Derartige Verunreinigungen umfassen im Allgemeinen Substanzen, die den Abbau oder die Depolymerisation einer Nukleinsäure katalysieren oder initiieren, oder Substanzen, die den Nachweis der Nukleinsäure blockieren oder die Nukleinsäure maskieren. Unerwünschte Verunreinigungen umfassen daneben makromolekulare Substanzen, wie z. B. Enzyme, Proteine, Polysaccharide oder Polynukleotide sowie Substanzen mit einem niedrigem Molekulargewicht, wie Lipide, Enzyminhibitoren oder Oligonukleotide.
Weitere Verunreinigungen sind Farbstoffe (Pigmente), Spurenelemente (Metalle) oder organische Lösungsmittel.
Diese Anforderungen haben dazu geführt, dass sich im Laufe der Jahre im Stand der Technik bereits eine Vielzahl von Aufreinigungs- und Isolierungsverfahren etabliert hat. So kann z. B. DNA durch Aussalzen in Gegenwart von Phenol und Trichiormethan gewonnen werden. Auf der anderen Seite können DNA und RNA durch den Einsatz chaotroper Salze an mineralischen Trägern (wie z. B. Silica) oder – derivatisierten – Kieselsäureharzen gewonnen werden. Dabei hat sich hinsichtlich der Verwendung in automatisierten Verfahren insbesondere der Einsatz von magnetischen Partikeln – den sog. 'Magnetic Beads' – etabliert.
Zunächst erkannten Marko et al. [Analyt. Biochem. 121 (1982) 382] sowie Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) 615], dass, falls die DNA in Nukleinsäureenthaltenden Extrakten hohen Konzentrationen von Natriumiodid oder Natriumperchlorat ausgesetzt wird, nur die DNA an den mechanisch fein zerkleinerten Glass-Scintillationsröhrchen sowie zerkleinerten Glasfasermembranen bzw. Glasfiberplatten bindet, während RNA und Proteine nicht binden. Die so gebundene DNA kann im einfachsten Fall mit Wasser eluiert werden. In der Folgezeit wurden demgemäß zahlreiche Schutzrechte, die auf dieser Art der DNA-Isolierung basieren, offengelegt.
So betrifft die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-0 389 063 ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Quelle. Gemäß dieser Methode werden die Nukleinsäuren-enthaltenden biologischen Quellen, wie Blut, Zellen, Plasma etc. in Gegenwart von chaotropen Salzen in hohen Konzentrationen aufgeschlossen. Anschließend werden die Nukleinsäuren an eine Silicaoberfläche gebunden. Die Nukleinsäuren werden danach gewaschen und eluiert.
Das in der U.S.-Patentschrift US-A-5,155,018 offenbarte Verfahren beschreibt die Isolierung von RNA aus biologischen Quellen, die neben RNA auch DNA sowie andere Inhaltsstoffe enthalten. Dabei wird die biologische Probe angesäuert und mit einem chaotropen Agens, wie z. B. einem Guanidiniumsalz vermischt. Der Probe werden Silikatpartikel zugegeben. Unter den gegebenen Bedingungen bindet RNA an die Silikatpartikel.
Anschließend wird auch in diesem Verfahren die RNA von den Partikeln abgetrennt.
Colpan et al. beschreiben in der Internationalen Patentanmeldung WO-A-95/01359 ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen durch Adsorption der Nukleinsäure aus einer alkoholhaltigen Lösung mit hoher Ionenstärke.
Die Adsorptionslösung enthält neben Alkohol in einer Konzentration von 1 bis 50 Vol.-% Salze in einer Konzentration von 1 bis 10 M, wobei chaotrope Salze, wie z. B. Guanidiniumthiocyanat, Natriumperchlorat, oder Guanidiniumhydrochlorid bevorzugt werden.
Gegenstand der WO-A-95/21849 ist des Weiteren ein Verfahren zur Trennung von doppel- und oder einzelsträngigen Nukleinsäuren aus Quellen, welche diese Nukleinsäuren enthalten. Auch in diesem Verfahren werden die Nukleinsäuren an mineralischen Trägern adsorbiert unter Bedingungen, die eine Bindung der gewünschten Nukleinsäurespezies erlaubt, während die nicht gewünschte Nukleinsäurespezies nicht an diesen mineralischen Träger bindet.
Um überwiegend einzelsträngige Nukleinsäuren an einen mineralischen Träger zu binden und somit von doppelsträngigen Nukleinsäuren zu trennen, werden die Behandlungsbedingungen für die beide Nukleinsäurespezies enthaltenden Proben mit einem wässrigen Gemisch von Salzen, insbesondere chaotrope Salze und Alkohol entsprechend eingestellt. Die nicht adsorbierte doppelsträngige Nukleinsäure kann daraufhin mit bekannten Verfahren weiter aufgereinigt oder isoliert werden.
Weitere Verfahren werden beispielsweise in den Europäischen Offenlegungsschriften EP-A-512 767 und EP-A-515 484 , in den Internationalen Patentanmeldungen WO-A-95/13368 , WO-A-96/18731 und WO-A-97/10331 sowie in den US Patentschriften US-A-4,923,978 und US-A-5,057,426 offenbart.
Die Europäische Offenlegungsschrift EP-A-0 707 077 beschreibt das Binden sowie die nachfolgende selektive Freisetzung von Nukleinsäure aus einem Lysat mittels eines wasserlöslichen schwach basisch reagierenden Polymers, das mit der Nukleinsäure unter spezifischen Bedingungen einen Niederschlag bildet. Dieser Niederschlag kann aus der wässrigen Lösung abgetrennt werden und die Nukleinsäure kann unter Anwendung von hohen Salzkonzentrationen sowie unter Einwirkung von starken Basen oder durch Erhitzen freigesetzt werden.
Hinsichtlich aller oben beschriebener Isolierungs- bzw. Reinigungsverfahren ist mit Blick auf die biologischen Proben darauf hinzuweisen, dass Blut eine der in den größten Mengen verfügbare Quelle für DNA-Analysen ist, da Blutproben routinemäßig aus den unterschiedlichsten Gründen gezogen werden. Aufgrund der viskosen Beschaffenheit sowie wegen der äußerst proteinhaltigen Zusammensetzung, warf die Automatisierung der Isolierung von Nukleinsäuren aus diesem Ausgangsmaterial immer wieder unerwartete Schwierigkeiten auf – ein Umstand, der auch im Stand der Technik mehrfach belegt ist. Daneben erwies sich – hinsichtlich einer Automatisierung – die Handhabung großer Probenvolumina, die relativ geringe DNA-Mengen aufweisen, als schwierig.
Die vorliegende Patentanmeldung stellt sich somit die Aufgabe, die oben geschilderten und aus dem Stand der Technik bekannten Probleme wenigstens zum Teil einer Lösung zuzuführen. Somit zielt die vorliegende Erfindung im allgemeinsten Sinn auf den Bedarf an Materialien und Verfahren ab, die ein schnelles und effizientes Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus einer Mischung der gewünschten Nukleinsäuren mit Verunreinigungen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform durch funktionalisierte Matrices der allgemeinen Formel I sowie durch Verfahren zur Isolierung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, wie z. B. Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, Gesamt RNA, mRNA, oder RNA/DNA Hybride z. B. aus biologischen Proben die Verunreinigungen, wie Proteinen, Fetten, Zelltrümmern etc., enthalten, gelöst.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierte Matrixmaterialien bzw. Matrices, bei der die Hydrazin-Partialstrukturen über einen sog. Linker an den Träger gebunden sind sowie Verfahren zur Herstellung der Matrices der allgemeinen Formel (I).
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen – insbesondere von Nukleinsäuren – unter Verwendung der oben erwähnten mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrixmaterialien bzw. Matrices;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird.

Der Träger oder die Tägeroberfläche bzw. das ihm/ihr zugrundeliegende Trägermaterial kann aus jedem gewöhnlichen – polymeren – anorganischen oder organischen Material gebildet werden, einschließlich weichen Gel-artigen Trägern, wie Agarose, Polyacrylamid oder Cellulose oder hartem Trägermaterial, wie Polystyrol, Latexmethacrylat oder aus einem Metalloxid wie vorzugsweise Silica. Wenn das Trägermaterial durch Siliciumdioxid verkörpert wird, liegt es bevorzugt in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder in Gestalt einer Mischung dieser Stoffe vor. – Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Polymethacrylat als Homopolymer, aber auch als Copolymer mit weiteren Styrolmonomeren, Acrylaten oder Methacrylaten, sowie Quervernetzern, wie Divinylbenzol oder Ethylenglycoldimethacrylat besonders bevorzugt.
Bei der Verwendung von organischen, polymeren Materialien kann jedwedes Polymer ausgewählt werden, welches so funktionalisiert werden kann, dass die funktionellen Gruppen (Linker) – die ggf. bereits im Polymer als Precursor vorhanden sind oder, die innerhalb einer Folgereaktion noch erzeugt werden – mit Hydrazin bzw. mit dem gewünschten Hydrazinderivat unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren können.
In einer weiteren Ausführungsform können die Linker ggf. mit einem Spacer – vorzugsweise unter Ausbildung einer kovalenten Bindung – reagieren, wobei das Hydrazin bzw. das Hydrazinderivat bereits an den Linker gebunden ist oder erst in einer weiteren Reaktion noch gebunden wird. Die Linker können erfindungsgemäß auch direkt mit Hydrazin selbst bzw. mit der gewünschten Hydrazinverbindung reagieren.
Träger bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen ein polymeres Grundgerüst, das durch die Polymerisation der Ausgangsmonomeren ggf. mit einem Quervernetzer und ggf. mit anderen Hilfsstoffen aufgebaut wird. Unter Hilfsstoffen werden erfindungsgemäß in erster Linie Stoffe verstanden, die zum Beispiel auf die chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Polymers Einfluss nehmen. Dazu gehören beispielsweise Porenbildner, die die Porosität des Polymers beeinflussen oder Stoffe die dem Polymer magnetische Eigenschaften verleihen. Der Träger kann somit – je nach Wunsch – mit einem Material verbunden sein, das ein permanentes oder temporäres magnetisches Moment aufweist.
Die geometrische Form, in welcher das Polymer – welche die Matrix bildet – vorliegt, spielt hierbei weitestgehend keine Rolle. So können die Oberflächen beispielsweise in Eppendorff- oder Falcontubes, Mikrotiterplatten, PCR-Platten oder zum Beispiel auf Objektträgern erzeugt werden.
Die Matrix kann dabei auch als sog. Komposit ausgebildet sein, in dem das Matrixmaterial der allgemeinen Formel I beispielsweise in Kombination mit einem anorganischen Polymer – wie z. B. Silica (SiO₂) – vorliegen kann oder auf einer metallischen Oberfläche – wie z. B. Gold oder Eisen – aufgebracht bzw. in jedweder anderen Form mit anderen Materialien kombiniert sein kann.
Ganz allgemein ist es möglich, für die Herstellung der Matrix, die funktionalisierten Polymere (Matrixmaterialien) auf jedwede hydrophile oder hydrophobe – ggf. vorbeschichtete – Oberfläche aufzubringen, was in einem breiten Anwendungsspektrum resultiert (u. a. in Multiwellsystemen wie z. B. Mikrotiterplatten oder mikrofluidische Systeme).
Im Sinne der Erfindung wird der Träger der Matrix durch ein Polymer gebildet, wobei der Begriff Polymer in seiner weitesten Definition verstanden wird. Erfindungsgemäß verkörpern Polymere im Sinne der vorliegenden Erfindung Polymerisate, Polykondensate bzw. Polyaddukte. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Träger aus Homopolymeren, Copolymeren, Terpolymeren usw. oder aus Mischungen verschiedener polymerer Bestanteile aufgebaut sein. Die ggf. verschiedenen Polymere können – falls dies gewünscht ist oder zweckmäßig erscheint – untereinander mit einem sog. Crosslinker (Quervernetzer) vernetzt sein.
Beide Trägermaterialien – organisches wie auch anorganisches Trägermaterial – können dabei u. a. in Form von Partikeln, massiven Teilen – wie beispielsweise Gefäßwände von Reaktionsgefäßen –, Membranen oder in Form von Vliesen bzw. Geweben vorliegen.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Hydrazin – oder ein entsprechendes Derivat des Hydrazins – an ein (wasser)lösliches Polymer zu binden, wie es beispielsweise in der bereits eingangs erwähnten Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 707 077 offenbart ist.
Die mit Hydrazin bzw. mit einem oder mehrerer seiner Derivate modifizierten Oberflächen der Matrices zeigen somit prinzipiell folgenden Aufbau, wobei – wie bereits erwähnt – der Spacer ggf. entfallen kann, d. h., dass er lediglich eine Einfachbindung verkörpert: Träger-Linker-Spacer-NR₃-NR₁R₂ (1)
R₃ kann dabei auch mit dem Spacer oder ggf. direkt mit dem Linker eine weitere Bindung bzw. eine Doppelbindung ausbilden Träger-Linker-Spacer-N-NR₁R₂
Darin stellt die Trägeroberfläche einen Träger aus einem organischen oder anorganischen Material – vorzugsweise einem anorganischen oder organischen Polymeren – dar, die ggf. noch andere funktionelle Gruppen aufweisen kann.
Der Linker verkörpert im einfachsten Fall eine Einfachbindung, kann jedoch in Abhängigkeit von der gewählten Ausgangsfunktionalität eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die neben – ggf. mit Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen – substituierten Methylengruppen, Partialstrukturen ausgewählt aus der Gruppe folgender Strukturelemente, umfassend -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH- enthält.
Der Spacer stellt im einfachsten Fall eine Einfach- oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch Sauerstoff- oder Schwefelatome oder auch Aminogruppen unterbrochen sein kann, dar und die ggf. eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen aufweisen kann. Als Beispiele seien Dialdehyd-, Polyaldehyd-, Dicarboxy- oder Polycarboxy-Partialstrukturen genannt. Daneben seien Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-strukturen neben Ethylenglykol, Polyethylenglykol, Propylenglykol und Polpropylenglykol sowie deren Derivate als Spacer genannt.
An den ggf. vorhandenen Spacer ist über eine kovalente Einfach- oder über eine Doppelbindung die Hydrazin-Partialstruktur gebunden, in der die Substituenten R₁, R₂ und ggf. R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder einen Aryl- bzw. Aralkylrest bedeuten können.
Erfindungsgemäß kommt den oben genannten Substituenten – sofern nicht anders angegeben – im Sinne der vorliegenden Erfindung folgende Bedeutung zu:
C₁-C₆-Alkyl – im Allgemeinen auch nur als „Alkyl" bezeichnet – steht im allgemeinen für einen monovalenten, verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (iso-Propyl), Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1-Ethyl-2-methyl-propyl.
Entsprechendes gilt für andere – beispielsweise kleinere oder größere -Alkylreste, wie z. B. C₁-C₃-Alkyl oder C₄-C₆-Alkyl bzw. analog für höhere Alkylreste, welche für einen monovalenten verzweigten oder unverzweigten C₇-C₂₀-Alkyrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können, stehen können. Als Beispiele seien folgende bevorzugte unsubstituierten Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Dodecadecyl und Eicosyl.
Halogenalkyl steht für die entsprechenden C₁-C₆- oder die höheren Alkylreste, die mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – unabhängig voneinander gleich oder verschieden – substituiert sein können.
C₃-C₆-Alkenyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propenyl(Allyl), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl- 2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,crotyl1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl.
C₃-C₆-Alkinyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propinyl(Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2-butinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-propinyl, 1,2-Dimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3-pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-2-butinyl, 1,2-Dimethyl-3-butinyl, 1,3-Dimethyl-2-butinyl, 1,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3-butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyl-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3-butinyl, 2-Ethyl-1-butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propinyl.
Alkylen steht im Allgemeinen für einen unverzweigten, divalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder für einen verzweigten, divalenten Kohlenwasserstoffrest von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z. B. 2-Methylpropylen, Pentylen und ähnliche.
Entsprechendes gilt für die ungesättigten C₃-C₆-Alkenylen- und C₃-C₆-Alkinylenbrücken.
Cycloalkyl steht – sofern nicht anders definiert – für einen gesättigten monovalenten cyclischen Kohlenwasserstoffrest, der drei bis acht Kohlenstoffatome aufweisen und der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – oder einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien genannt: Cyclopropyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Dabei kann die Kohlenstoffkette durch ein oder mehrere Heteroatome – wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel – unterbrochen sein. Als Beispiele seien genannt 1,4-Dioxixan (Dioxan), 2,5-Dihydorfuran, Tetrahydrofuran, γ-Pyran, 2H-1,3-Dioxol, Tetrahydropyrrol, 2,5-Dihydropyrrol, Piperidin, Piperazin, Tetrahydrothiophen, Morpholin, 1,2-Oxathiolan, 1,3-Thiazol, 1H-4,1,2-Thiadiazin, 1,2-Oxathiepan, γ-Thiopyran, 1,4-Thiazixin (1,4-Thiazin).
Als bevorzugte Beispiele für sauerstoffhaltige, heterocyclische und Hydroxisubstituierte cyclische Systeme seien u. a. beispielsweise die Kohlenhydrate (Pentosen wie auch Hexosen) angeführt, wie z. B.: Arabinosen, Xylosen oder Ribosen bzw. Glucosen, Mannosen, Galactosen, Fructosen oder Sorbosen.
Aryl steht im allgemeinen für einen monovalenten monocyclischen oder bicyclischen aromatischen Substituenten mit 6 bis 10 Ringatomen, der ggf. unabhängig voneinander mit einem oder mehreren, vorzugsweise mit ein oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe enthaltend C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl, C₁-C₆-Alkenyl, C₁-C₆-Alkinyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Halogen, Cyano, Nitro, Acyloxy, Amino, mono-alkylsubstitutiertes Amin, di-alkylsubstituiertes Amin, Acylamino, Hydroxylamino, Amidino, Guanidino, -OR [worin R Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl], -S(O)nR [worin eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 bedeuten kann und R Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, Aycloalkyl, Cycloalkylalkyl bedeuten kann], -C(O)R [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl bedeuten kann], -COOR [worin R Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, Cycloalkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl bedeuten kann], -(Alkylen)COOR [worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl bedeuten kann], -CONR'R'' oder -(Alkylen)CONR'R'' [worin R' bzw. R" unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Halogenalkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl bedeuten können].
Aryl steht – sofern nicht anders angegeben – auch für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Kohlenstoffatomen, der ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrolyl, Furanyl, Thiophenyl, Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrazinyl.
Aralkyl bedeutet im Sinne der vorstehenden Definition einen ein- oder mehrkernigen Arylrest – wie oben definiert –, der über eine C₁-C₆-Alkylen-, C₃-C₆-Alkenylen- oder eine C₃-C₆-Alkinylenbrücke, für welche die Definition der C₁-C₆-Alkyl-, C₃-C₆-Alkenyl und C₃-C₆- Alkinylgruppen – wie oben ausgeführt – entsprechend gelten, an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.
Halogen steht – sofern nicht anders angegeben – für Fluor, Chlor, Brom oder Iod, vorzugsweise jedoch für Fluor und Chlor.
Die erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit seinen Abkömmlingen derivatisierten Trägeroberflächen lassen sich in Abhängigkeit von der chemischen Funktionalität der auf der Oberfläche befindlichen Gruppen in Analogie zu bereits aus dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren zu den gewünschten Produkten umsetzen.
Zunächst lassen sich die für die Derivatisierung des Trägers benötigten Hydrazinderivate mit aus dem Stand der Technik bekannten Standartmethoden leicht herstellen.
So liefert die Umsetzung von Hydrazin mit Alkylhalogeniden [Alkyl-X] (X = Halogen) und -sulfaten (X = Sulfat) im Normalfall das unsymmetrische bis-Substitutionsprodukt [H₂N-N(Alkyl)₃ ⁺X^– bzw. H₂N-N(Alkyl)₂].
Um auf der anderen Seite Monoalkylhydrazine zu erhalten, kann beispielsweise von Benzaldazin ausgegangen werden, das in einer möglichen Alternative mit einem Alkylsulfat zu dem entsprechenden Monoalkylsalz umgesetzt werden kann. Nach hydrolytischer Spaltung kann das gewünschte Hydrazinderivat vom Typ H₂N-NH(Alkyl) leicht zugänglich gemacht werden.
Symmetrisch substituierte Hydrazinderivate können unter Zuhilfenahme von Schutzgruppen ebenfalls auf unkomplizierte Weise synthetisiert werden. So lassen sich z. B. über zweifach Acyl-geschützte Hydrazinderivate vom Typ H(Acyl)N-NH(Acyl) durch Umsetzung mit Dimethylsulfat und nachfolgender saurer Verseifung das entsprechende symmetrisch substituierte Dimethylhydrazin herstellen.
Daneben erschließt die Reduktion von Dialkylnitrosaminen vom Typ R_aR_bN-NO einen weiteren einfachen Zugang zur Herstellung von unsymmetrisch substituierten Hydrazinderivaten.
Alle oben aufgezeigten Synthesewege sind – neben zahlreichen anderen – aus dem Stand der Technik wohlbekannt und verkörpern allgemeines Fachwissen [s. z. B.: R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Weinheim 1989].
Die so hergestellten Hydrazinderivate lassen sich mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, die der Träger per se schon aufweisen kann oder, die in einem eigenem Reaktionsschritt auf der Trägeroberfläche erzeugt werden – bzw. die über den Spacer eingebaut werden –, umsetzen.
So führt die Umsetzung von Carbonylfunktionen mit geeignet substituierten Hydrazinderivaten – wie aus dem Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt ist – zu den entsprechenden Hydrazonen, die – sofern gewünscht – in einem weiteren Schritt nochmals derivatisiert werden können.
Des Weiteren ist es möglich, geeignete Carboxylfunktionen – ggf. in Gegenwart eines Kopplungsreagenzes – wie z. B. EDC [N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid], HBTU [2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat] oder TSTU [N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(succinimidyl)uronium-Tetrafluoroborat] – mit Hydrazin bzw. mit dessen Derivaten umzusetzen.
Daneben können von vornherein aktivierte Carboxylgruppen auf dem Trägermaterial eingesetzt werden – wie z. B. Säurehalogenide oder -anhydride oder Carbonylimidazole.
Weitere Möglichkeiten umfassen den Einsatz von Tresylgruppen, Azlacton- und Pentafluorphenol-aktivierten Trägern. Dabei wird der Einsatz aktivierter Carboxylgruppen erfindungsgemäß bevorzugt.
Im Sinne der Erfindung werden Epoxidgruppen als funktionelle Gruppen für die Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat besonders bevorzugt.
Bei der Umsetzung mit Hydrazin bzw. mit Hydrazinderivaten tritt unter Ausbildung einer Hydroxylfunktion sowie einer kovalenten Bindung zur Hydrazin-Partialstruktur eine Öffnung des Epoxidrings ein.
Die oben erwähnten funktionellen Gruppen können dabei Partialstrukturen des Linkers – vorzugsweise wenn der Spacer lediglich eine kovalente Einfachbindung oder eine Doppelbindung verkörpert – darstellen, oder aber sie verkörpern ihrerseits Partialstrukturen des Spacers und werden somit erst nach der Einführung des Spacers verfügbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren beinhaltend: das Bereitstellen der erfindungsgemäßen mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix, die in dem Verfahren eingesetzt werden soll. Der nachfolgende Immobilisierungsschritt besteht in einem Zusammenführen der Matrix mit der Mischung, welche die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung enthält, bei einem ersten pH- Wert unter Bedingungen, unter denen die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix adsorbiert wird, trennen der Matrix mit der immobilisierten Nukleinsäure von der Mischung und desorbieren der Nukleinsäure bei einem Desorptions-pH, wobei die gewünschte(n) Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird (werden).
Entsprechend dem ersten Teilschritt des oben beschriebenen Verfahrens – nämlich der Adsorption der Nukleinsäure an die mit Hydrazin und/oder mit einem oder mehreren Hydrazinderivat(en) modifizierten Matrix – verkörpert der Komplex, der aus der Nukleinsäure mit der Partialstruktur des Hydrazins bzw. der Hydrazinderivate ausgebildet wird, einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Dabei hängen die exakten Reaktionsbedingungen die notwendig sind, um Adsorption und Desorption der Nukleinsäuren an bzw. Matrix sicher zu stellen – von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich von der Beschaffenheit der Matrix, der Natur der gewünschten Nukleinsäure (DNA oder RNA, Molekulargewicht und Nukleotidsequenz-Zusammensetzung, dem pK_b und pK_a der basischen bzw. ggf. vorhandenen sauren Partialstrukturen, der Dichte der dieser Strukturen auf der Oberfläche und nicht zuletzt von der Fähigkeit der so modifizierten Matrix an die Nukleinsäure(n) zu binden).
Weiterhin ist es nicht ausgeschlossen, dass Verunreinigungen in der Mischung bei der Adsorption der Nukleinsäure(n) nachteilig mit dem Bindungsschritt interferieren.
Die hier eingesetzten Mischungen, welche die gewünschten Nukleinsäuren enthalten, können zum einen aus synthetisch hergestellten Reaktionsmischungen – wie sie z. B. bei der PCR anfallen – oder – wie bereits eingangs erwähnt – aus biologischen Proben stammen.
Als biologische Proben mit Nukleinsäuren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung zellfreies Probenmaterial, Plasma, Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art – wie z. B. Biopsien –, Gewebeteile und Organe, Lebensmittelproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, Umweltproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-haltige Zellen enthalten – wie z. B. Organismen (Ein- oder Mehrzeller; Insekten etc.), Pflanzen und Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Hefen und andere Pilze, andere Eukaryonten und Prokaryonten etc. verstanden.
Bei der Verwendung derartiger Proben ist es allerdings zunächst erforderlich, die Zellen zu zerstören, um die Nukleinsäuren für den Adsorptionsschritt verfügbar zu machen.
Wenn es sich bei der gewünschten Nukleinsäure um RNA handelt, müssen die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass die Adsorption der gewünschten RNA gefördert wird. Wenn neben der RNA auch noch DNA in der Mischung zugegen ist, können die Adsorptionsbedingungen so eingestellt werden, dass bevorzugt die Bindung einer Spezies – in diesem Fall insbesondere RNA – an die Matrix gefördert wird. Die spezifischen Adsorptionsbedingungen, die allerdings erforderlich sind, um die Adsorption und letztendlich die Desorption von RNA zu ermöglichen, hängt von den Eigenschaften der Matrix ab und muss für jeden unterschiedlichen Typ einer Matrix bestimmt werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzte Matrix, liegt bevorzugt in einer Form vor, die von der Mischung, welche die gewünschte Nukleinsäure neben anderen Substanzen/Verunreinigungen enthält, durch Einwirken einer externen Kraft getrennt werden kann, nachdem die Mischung mit der Matrix vermischt worden ist. Für den Fachmann ist verständlich, dass die Art der externen Kraft, die sich für die Trennung der Matrix aus der Mischung eignet, von der Form und von den physikalischen Eigenschaften der Matrix, abhängig ist. Zum Beispiel kann im einfachsten Fall, die Trennung unter der Einwirkung von Schwerkraft erfolgen, wenn die Matrix beispielsweise in der Form der festen Phase eines chromatographischen Trennsystems vorliegt.
Auf der anderen Seite kann die Matrix – ggf. chargenweise – zu der Mischung aus der Nukleinsäure und Verunreinigung(en) – zugegeben werden und anschließend durch Dekantieren oder Filtrieren – wieder abgetrennt werden.
Die externe Kraft, die in dem erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren angewendet wird, kann eine Flüssigkeit darstellen, die unter einem hohen Druck steht, wobei die Matrix die stationäre Phase einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bildet.
Andere Formen von externen Kräften, die sich zum Einsatz in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eignen, beinhalten Vakuumfiltration, Zentrifugation oder bevorzugt Magnetkraft.
Bei dem Einsatz von Magnetkraft, kommen vorzugsweise Matrices in Frage, die ein permanent oder temporär magnetisches Material aufweisen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise ferro- oder ferrimagnetische Partikel verwendet, vorzugsweise: ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus: γ-Fe₂O₃ (Maghämit), Cr₂O₃, sowie Ferrite, insbesondere vom Typ (M²⁺O)Fe₂O₃, wobei M²⁺ ein divalentes Übergangsmetallkation und vorzugsweise Fe₃O₄ (Magnetit) ist. Andere ferro- oder ferrimagnetische Partikel können jedoch ebenfalls verwendet werden. Diese Partikel weisen einen mittleren Teilchendurchmesser von kleiner 5 μm, vorzugsweise von kleiner 1 μm und besonders bevorzugt in einem Intervall zwischen 0,0 und 0,8 μm sowie ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 7 bis 300 nm auf.
Beispiele geeigneter, kommerziell erhältlicher ferro- oder ferrimagnetischer Partikel werden durch magnetische Partikel auf der Basis von γ-Fe₂O₃ – wie Bayoxide^® E AB 21, auf der Basis von ferrimagnetischem Magnetit als Typ Bayoxide^® E 8706, E 8707, E 8710 und E 8713H (erhältlich von der Lanxess AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland) sowie als Magnetpigment 340 sowie als Magnetpigment 345 (erhältlich von der BASF AG, Ludwigshafen am Rhein, Bundesrepublik Deutschland) verkörpert.
Darüber hinaus können auch superparamagnetische Materialien eingesetzt werden. Als superparamagnetische Materialien kommen Fe, Fe₃O₄, Fe₂O₃, superparamagnetische Ferrite Co, Ni, sowie binäre und oder ternäre Verbindungen (Legierungen) in Frage.
Beispielhaft seien hier Eisenoxidkristalle mit einem Durchmesser von 300 Angström und kleiner genannt.
Die erfindungsgemäße Matrix kann in Reinigungs- oder Isolierungsverfahren von Nukleinsäuren eingesetzt werden, die in konventionellen Größenordnungen satt finden und die beispielsweise aus den eingangs erwähnten Stand der Technik bekannt sind. Die erfindungsgemäße Matrix eignet sich aber auch zur Verwendung in oder in Verbindung mit mikrofluidischen Systemen, wie sie aus dem Stand der Technik hinlänglich zur Nukleinsäureaufreinigung bzw. -detektion bekannt sind.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, ohne sie zu beschränken:
1. Herstellung von Hydrazin-modifizierten Beads
1.1. Direkte Modifizierung mit Hydrazin
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 10 ml Hydrazin-Hydrat versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70°C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden Hydrazin-modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.
1.2. Indirekte Modifizierung mit Hydrazin
5 g poröser magnetischer Beads, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Umhüllung bestehend aus einem Polymethacrylat umgeben sind, werden in einem 250 ml Kolben in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert und mit 5 g 6-Aminohexansäure versetzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf einer Temperatur von 70°C erhitzt. Die Suspension wird durch das zweimalige Anlegen eines Wasserstrahlvakuums entgast und über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden unter leichtem Rühren auf eine Temperatur von 70°C erhitzt. Die aus der Umsetzung resultierenden mit 6-Aminohexansäure (6-Aminocapronsäure) modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert. Danach werden 10 ml Hydrazin-Hydrat, 1 ml einer 100 mM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml N-Hydroxysuccinimid, 1 ml einer 100 mM Lösung von Natriumphosphat in Wasser (pH 6,0) enthaltend 50 mg/ml EDC zugefügt. Nach erfolgter Zugabe wird das Reaktionsgemisch am Rotationsverdampfer über einen Zeitraum von zwei Stunden bei Raumtemperatur (ca. 25°C) gerührt. Die aus der Umsetzung resultierenden indirekt mit Hydrazin modifizierten Beads werden in eine Glasfritte übergeführt und jeweils zweimal mit entsalztem Wasser, mit 10 mM Salzsäure sowie mit 100 mM Natriumphosphat (pH 6,0) und entsalztem Wasser gewaschen und anschließend in 100 ml entsalztem Wasser suspendiert.
2. Biologische Anwendungen
2.1. DNA-Aufreinigung Hydrazin-modifizierten Beads
10 μg pUC21 (1 μg/μl) werden jeweils zu den folgenden Puffersystemen zugefügt:

a) 390 μl 100 M Ammoniumacetat (pH 5,5)
b) 390 μl eines Puffergemischs aus einem Tris-haltigen EDTA Puffers (pH 7,8–8,2), einer Natriumhydroxidhaltigen SDS-Lösung (pH 13) und eines Essigsäure-haltigen Kaliumacetatpuffers (pH 5,4–5,6) [Puffer P1/P2/P3 der Fa. QIAGEN in Hilden (DE)], filtriert, P1: 50 mM Tris/Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA P2: 200 mM NaOH; 1% SDS P3: 3 M K-Acetat pH 5.5:

Nach der Zugabe von 20 μl einer Bead-Suspension (49 mg/ml) wird die Mischung über einen ein Zeitraum von zwei Minuten auf einem Thermorüttler bei 1100 rpm inkubiert. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 300 μl RNase-freies Wasser zugefügt und die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1100 rpm vermischt. Die Beads werden mittels Magnetkraft in der Suspension separiert und der Überstand wird verworfen. Danach werden 100 μl TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol) Puffer (pH 9.5) zugefügt und die die Suspension wird über einen ein Zeitraum von einer Minute auf einem Thermorüttler bei 1100 rpm vermischt. Danach wird die flüssige Phase (Eluat) von den Beads mittels einer handelsüblichen magnetischen Trennvorrichtung getrennt. Dieser Elutionsschritt wird wiederholt und danach der DNA-Gehalt durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) und Gelelektrophorese ermittelt.

Proben Nr.	Substanz	OD 260	260/280	320	μg DNA
1	RSH 001 1. Eluat	0,0420	1,6437	0,0073	0,35
2	RSH 001 1. Eluat	0,0488	1,6185	0,0070	0,42
3	RSH 001 2. Eluat	0,1442	1,9549	0,1163	0,28
4	RSH 001 2. Eluat	0,0192	1,5809	0,0057	0,14
Σ					0,60
5	RSH 002 1. Eluat	0,0276	1,6379	0,0073	0,20
6	RSH 002 1. Eluat	0,0332	2,0450	0,0102	0,23
7	RSH 002 2. Eluat	0,0340	1,6273	0,0192	0,15
8	RSH 002 2. Eluat	0,0153	1,6281	0,0075	0,08
Σ					0,33
9	RSH 003 1. Eluat	0,0681	1,7274	0,0136	0,55
10	RSH 003 1. Eluat	0,0744	1,7390	0,0214	0,53
11	RSH 003 2. Eluat	0,0443	1,7028	0,0281	0,16
12	RSH 003 2. Eluat	0,0219	1,7216	0,0042	0,18
Σ					0,71

Proben Nr.	Substanz	CD 260	260/280	320	μg DNA
1	RSH 001 1. Eluat	0,0990	2,6876	0,0145	0,85
2	RSH 001 1. Eluat	0,1001	2,7022	0,0132	0,87
3	RSH 001 2. Eluat	0,0458	3,6169	0,0131	0,33
4	RSH 001 2. Eluat	0,0869	4,4566	0,0210	0,66
Σ					1,36
5	RSH 002 1. Eluat	0,0828	2,6531	0,0178	0,65
6	RSH 002 1. Eluat	0,1478	3,8327	0,0185	1,29
7	RSH 002 2. Eluat	0,0624	4,7887	0,0196	0,43
8	RSH 002 2. Eluat	0,0688	5,2687	0,0185	0,50
Σ					1,44
9	RSH 003 1. Eluat	0,1639	3,7625	0,0336	1,30
10	RSH 003 1. Eluat	0,2323	4,3711	0,0356	1,97
11	RSH 003 2. Eluat	0,0792	5,4754	0,0180	0,61
12	RSH 003 2. Eluat	0,0570	2,9812	0,0149	0,42
Σ					2,15

Proben Nr.	Substanz	OD 260	260/280	320	μg DNA
1	RSH 001 1. Eluat	0,2371	2,1917	0,0813	1,56
2	RSH 001 1. Eluat	0,1646	2,1971	0,0315	1,33
3	RSH 001 2. Eluat	0,1129	1,7942	0,0253	0,88
4	RSH 001 2. Eluat	0,0897	1,5896	0,0246	0,65
Σ					2,21
5	RSH 002 1. Eluat	0,0534	3,0997	0,0077	0,46
6	RSH 002 1. Eluat	0,0584	3,3729	0,0092	0,49
7	RSH 002 2. Eluat	0,0101	1,8410	0,0045	0,06
8	RSH 002 2. Eluat	0,0251	2,7947	0,0062	0,13
Σ					0,57
9	RSH 003 1. Eluat	0,2453	2,1139	0,0409	2,04
10	RSH 003 1. Eluat	0,1612	1,8893	0,0352	1,26
11	RSH 003 2. Eluat	0,0916	2,4295	0,0190	0,73
12	RSH 003 2. Eluat	0,0717	2,1919	0,0113	0,60
Σ					2,32

Proben Nr.	Substanz	OD 260	260/280	320	μg DNA
1	RSH 001 1. Eluat	0,2361	1,6969	0,0287	2,07
2	RSH 001 1. Eluat	0,2394	1,7228	0,0215	2,18
3	RSH 001 2. Eluat	0,0456	1,7574	0,0066	0,39
4	RSH 001 2. Eluat	0,0528	1,6575	0,0080	0,45
Σ					2,55
5	RSH 002 1. Eluat	0,0448	1,7728	0,0019	0,43
6	RSH 002 1. Eluat	0,0597	2,0174	0,0025	0,57
7	RSH 002 2. Eluat	0,0273	1,8611	0,0010	0,26
8	RSH 002 2. Eluat	0,0106	1,8458	0,0000	0,11
Σ					0,69
9	RSH 003 1. Eluat	0,4201	1,7599	0,0198	4,00
10	RSH 003 1. Eluat	0,4515	1,7748	0,0234	4,28
11	RSH 003 2. Eluat	0,0594	1,7749	0,0076	0,52
12	RSH 003 2. Eluat	0,0927	1,7582	0,0262	0,67
Σ					4,74

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Hydrazin-modifizierte Matrices gemäß der allgemeinen Formel I Träger-Linker-Spacer-NR₃-NR₁R₂ (1)worin
die Trägeroberfläche des Trägers aus einem anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird,
der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial gebunden ist und entweder über den Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist,
die Substituenten R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R₃ eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Matrix mit einer Trägeroberfläche, die aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Trägeroberfläche, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie ggf. mit Quervernetzern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die einen Quervernetzer besitzen, der aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat ausgewählt ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung Matrices, die eine Trägeroberfläche aufweisen, die ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer besitzt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices deren Matrixoberfläche aus Siliciumdioxid oder Silica ist bzw. Siliciumdioxid oder Silica aufweist.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices, deren Trägeroberfläche in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, der eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Linker, dessen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, der eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und die ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann, darstellt.
In einer bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carbonylgruppen durch Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen verkörpert werden können.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer, dessen Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können.
In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einem Spacer dessen Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Matrices mit einer Hydrazin-Partialstruktur, in der R₁, R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff und R₃ eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Matrices in dem auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird, der gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices zum Isolieren von Biomolekülen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit den erfindungsgemäßen Matrices, das folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix;
(b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül bzw. enthaltend vorzugsweise die zu isolierende Nukleinsäure neben mindestens einer Verunreinigung;
(c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül bzw. bevorzugt die gewünschte Nukleinsäure an der Matrix immobilisiert wird;
(d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) von der Mischung;
(e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül bzw. mit der/den immobilisierten Nukleinsäure(n) mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) bzw. Nukleinsäure(n) von der Matrix desorbiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure(n) mit den erfindungsmäßen Matrices.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren, die in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats der erfindungsgemäßen Matrix gebunden sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices in mikrofluidischen Systemen bzw. mikrofluidische Systeme, die die erfindungsgemäße Matrix enthalten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- EP 0389063 [0014]
- US 155018 [0015]
- WO 95/01359 A [0017]
- WO 95/21849 A [0019]
- EP 512767 A [0021]
- EP 515484 A [0021]
- WO 95/13368 A [0021]
- WO 96/18731 A [0021]
- WO 97/10331 A [0021]
- US 923978 [0021]
- US 5057426 A [0021]
- EP 0707077 [0022]
- EP 0707077 A [0037]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- vgl. Römpp, Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1999 [0003]
- Analyt. Biochem. 121 (1982) 382] sowie Vogelstein et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) 615 [0013]
- s. z. B.: R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Weinheim 1989 [0063]

Claims

Hydrazin-modifizierte Matrix gemäß der allgemeinen Formel I Träger-Linker-Spacer-NR3-NR₁R₂ (1)worin die Trägeroberfläche aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird, der Linker eine funktionelle Gruppe ist, die über eine kovalente Bindung mit der Trägeroberfläche oder mit dem Trägermaterial des Trägers gebunden ist und entweder über Spacer oder direkt an die Hydrazin-Partialstruktur gebunden ist, die Substituenten R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Alkinyl, einen höheren Alkylrest, einen Cycloalkylrest oder Aryl bzw. Aralkyl und im Falle von R₃ eine auch eine weitere kovalente Bindung bedeuten können.
Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einem polymeren anorganischen oder organischen Trägermaterial gebildet wird.
Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Agarosen, Polyacrylamide, Cellulosen, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polystyrole, Latexmethacrylate und/oder Metalloxide.
Matrix nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe Polymethacrylat-Homopolymer und Copolymeren des Polymethacrylats mit Styrolen, Acrylaten oder weiteren Methacrylatderivaten, sowie mit Quervernetzern.
Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, der Quervernetzer ausgewählt ist aus der Gruppe Divinylbenzol oder Ethylenglycol-dimethacrylat.
Matrix nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche ein poröses Polymethacrylat Homopolymer oder Copolymer ist.
Matrix nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Metalloxid Siliciumdioxid oder Silica ist.
Matrix nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Siliciumdioxid in Form von Kieselgel, festem Glas oder Diatomeenerde oder als Mischung dieser Stoffe vorliegt.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine kovalente Bindung oder eine bis zu sechsgliedrige Alkylenbrücke, die ggf. mit einer oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Amino- und Thiolgruppen substituiert sein kann und die ggf. durch eine oder mehrere weitere funktionelle Gruppen unterbrochen sein kann, ist.
Matrix nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe -O-, -NH-, -S-, -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-C(=O)-O-, -C(=S)-O-, -C(=O)-S-, -C(=O)-N-, -NH-C(=O)-NH-.
Matrix nach einem Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer eine Einfachbindung oder Doppelbindung, eine 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylenbrücke, die ggf. durch ein oder mehrere Sauerstoff- und/oder Schwefelatome und/oder Aminogruppen und ggf. durch eine oder mehrere Carbonyl- oder Carboxylgruppen unterbrochen sein kann.
Matrix nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylgruppen Dialdehyd- und Polyaldehydgruppen sein können.
Matrix nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxylgruppen Carboxyl-, Dicarboxy- oder Polycarboxylgruppen sein können.
Matrix nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkylenbrücke Ethylenglykol-diglycidylether-, Glycerol-diglycidylether-, Glycerol-triglycidylether-Ethylenglykol-, Polyethylenglykol-, Propylenglykol- und/oder deren substituierte Derivate aufweist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1–14, dadurch gekennzeichnet, dass R₁, R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff und R₃ eine weitere kovalente Bindung oder Wasserstoff bedeutet.
Verfahren zur Herstellung von Matrices gemäß einem der Ansprüche 1–15, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Trägermaterial oder auf der Trägermaterialoberfläche ein Linker erzeugt wird und gegebenenfalls mit einem Spacer oder direkt mit Hydrazin oder einem Hydrazinderivat umgesetzt wird.
Verwendung einer modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1–15 zum Isolieren von Biomolekülen.
Verfahren zum Isolieren von Biomolekülen mit einer mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix gemäß einem der Ansprüche 1–15, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen der mit Hydrazin bzw. mit einem Hydrazinderivat modifizierten Matrix; (b) Vereinigen der Matrix mit einer Mischung enthaltend das zu isolierende Biomolekül neben mindestens einer Verunreinigung; (c) Inkubieren der Matrix und der Mischung bei einem Adsorptions-pH, wobei das Biomolekül an der Matrix immobilisiert wird; (d) Trennen der Matrix mit dem Biomolekül von der Mischung; (e) Vereinigen der Matrix mit dem Biomolekül mit einer Elutionslösung bei einem Desorptions-pH, wobei das/die gewünschte(n) Biomolekül(e) von der Matrix desorbiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomolekül eine oder mehrere Nukleinsäure(n) darstellt.
Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form eines Komplexes mit einer Hydrazinpartialstruktur oder der Partialstruktur eines Hydrzinderivats einer Matrix gemäß einem der Ansprüche 1–15 gebunden ist.
Mikrofluidisches System enthaltend eine Matrix nach einem der Ansprüche 1–15.