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JPH081438B2 - 酵素免疫測定法 - Google Patents

酵素免疫測定法

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JPH081438B2
JPH081438B2 JP62083656A JP8365687A JPH081438B2 JP H081438 B2 JPH081438 B2 JP H081438B2 JP 62083656 A JP62083656 A JP 62083656A JP 8365687 A JP8365687 A JP 8365687A JP H081438 B2 JPH081438 B2 JP H081438B2
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tsh
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Sanyo Chemical Industries Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素免疫測定法に関する。
［従来の技術］ 従来、酵素免疫測定法として、不溶性固体上の第一抗
体に結合した抗原性物質に酵素を標識した第二抗体を反
応させ、その酵素量を測定する方法（いわゆる、サンド
イッチ法）がある［たとえば、石川栄治、河合忠、宮井
潔編、「酵素免疫測定法」医学書院P45（1982）］。
［発明が解決しようとする問題点］ しかし、この技術では、第二抗体の抗体価が低い場
合、十分な測定感度が得られない。
［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、抗体価の弱い第二抗体を使用した場合
においても、十分な測定感度が得られる酵素免疫測定法
につき、鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、 癌胎児性抗原（CEA）および甲状腺刺激ホルモン（TSH）
から選ばれる抗原性物質を認識する不溶性固体上の抗体
（第一抗体）、前記CEAおよびTSHから選ばれる抗原性物
質、および前記第一抗体とは異なる動物種由来の前記抗
原性物質を認識する抗体（第二抗体）を同時に反応させ
て得た免疫複合体と、 ペルオキシダーゼで標識された、前記第一抗体と同じ動
物種由来の抗体であり、第二抗体と同じ動物種由来の免
疫グロブリンを認識するペルオキシダーゼ標識抗体（第
三抗体） とを反応させたのち、ペルオキシダーゼ標識抗体と反応
させたのち、酵素量を測定することにより、前記抗原性
物質を定量することを特徴とする酵素免疫測定法であ
る。
本発明は、癌胎児性抗原（CEA）および甲状腺刺激ホ
ルモン（TSH）から選ばれる抗原性物質を測定対象とす
る方法である。CEAおよびTSHは特に高感度の測定系が要
求される抗原性物質である。
不溶性固体としては、ケイ酸質無機担体［ガラス（ポ
ーラスガラス，ツヤ消しガラスなど），シリカゲル，ベ
ントナイトなど］、磁性体、および有機担体（プラスチ
ック，デキストラン，口紙など）があげられる。これら
のうち、好ましくは、簡便かつ安定して抗体が結合で
き、さらに、取扱いが容易なガラス（ガラスビーズおよ
びガラス試験管），およびプラスチック（プラスチック
チューブおよびプラスチックトレイ）である。
第一抗体としては、従来既知の方法で、ウサギ，ヤ
ギ，ヒツジ，モルモットなどの哺乳類動物に上記抗原性
物質を免疫することによって得られた複クローン抗体、
あるいは上記抗原性物質に対する抗体産生細胞（マウス
由来）とミエローマ細胞（マウス由来）を細胞融合して
得られたハイブリドーマ細胞を培養もしくは腹水化して
得られたマウス由来の単クローン抗体があげられる。こ
れら抗体は、硫安文画,DEAE−セルロースクロマトグラ
フィー，アフィニティークロマトグラフィー等の従来既
知の精製方法で精製して用いる。
不溶性固体上に第一抗体を結合させる方法としては、
ガラスと抗体を化学的に結合させる（シランカップリン
グ剤および必要により架橋剤を用いて）方法（たとえば
特開昭54−108696号明細書）、または物理吸着させる方
法（たとえば米国特許第4280992号および第3652761号明
細書）、あるいはプラスチックに抗体を物理吸着させる
方法［たとえば、イー・エングバール，ジェー・ジョン
ソン，ピー・パールマン；バイオキム．バイオフィス．
アクタ（E.Engvall,J.Johnson,P.Parlmann;Biochim.Bio
phys.Acta），251（1971）427〜434］がある。
第二抗体としては、第一抗体と異なる動物種由来の上
記抗原性物質を認識する複クローン抗体（たとえば、第
一抗体がウサギの場合、ヤギ，ヒツジ，モルモットなど
の抗体；あるいは第一抗体がヒツジの場合、ウサギ，ヤ
ギ，モルモットなどの抗体）；または第一抗体がマウス
以外の動物種由来の上記抗原性物質を認識する複クロー
ン抗体の場合、上記抗原性物質に対する抗体産生細胞
（マウス由来）とミエローマ細胞（マウス由来）を細胞
融合して得られたハイブリドーマ細胞を、培養もしくは
腹水化して得られた単クローン抗体があげられる。第二
抗体の形には、抗血清，ハイブリドーマ培養液，腹水，
もしくはこれらを精製して得られる免疫グロブリンなど
がある。
第二抗体の免疫グロブリン濃度は、被検試料中の抗原
性物質の濃度およびペルオキシダーゼ標識抗体の濃度に
より種々の値をとりうるが、通常0.1〜1000μg/ml、好
ましくは１〜200μg/mlである。
免疫複合体は、不溶性固体上の第一抗体と、抗原性物
質と、第二抗体とを、同時に反応させる方法によって得
ることができる。たとえば、第一抗体を結合させた不溶
性固体、抗原性物質を含む被検試料、および第二抗体含
有緩衝液を同時にインキュベーションすることにより、
免疫複合体を得ることができる。インキュベーション
は、通常の条件下（例えば５〜50℃，好ましくは30〜40
℃の温度、５分〜２日間，好ましくは５〜30分）で行う
ことができる。
インキュベーションの後、洗浄液（たとえば蒸留水，
生理食塩水，リン酸緩衝液など）を加え、続けてアスピ
レーターで洗浄液を吸引除去する。この操作を数回（た
とえば２〜５回）行うことにより、免疫複合体を未反応
物と分離することができる。
第三抗体としては、第二抗体と同じ動物種由来の免疫
グロブリンを認識する抗体［たとえば、第二抗体がウサ
ギの場合、抗ウサギ免疫グロブリン抗体（モルモッ
ト）；第二抗体がヤギ抗体の場合、抗ヤギ免疫グロブリ
ン抗体（マウス）；あるいは第二抗体がマウスの場合、
抗マウス免疫グロブリン抗体（ウサギ）など］があげら
れる。
第一抗体、第二抗体、および第三抗体の組合わせとし
ては、非特異的吸着が少ないことから、第一抗体と第三
抗体は同じ動物種由来の抗体である。たとえば、第一抗
体ウサギ、第二抗体マウス単クローン、および第三抗体
ウサギ；第一抗体モルモット、第二抗体ヒツジ、および
第三抗体モルモット；第一抗体ヒツジ、第二抗体ウサ
ギ、および第三抗体ヒツジ；第一抗体ヤギ、第二抗体マ
ウス単クローン、および第三抗体ヤギなどがあげられ
る。特に好ましい組合わせは、抗原性物質に対して特異
性が高いことから、第一抗体ウサギ、第二抗体マウス単
クローン、および第三抗体ウサギ；あるいは第一抗体ヤ
ギ、第二抗体マウス単クローン、および第三抗体ヤギな
どである。
第三抗体に標識する酵素としてペルオキシダーゼを用
いるのは、アルカリフォスターゼやβ−ガラクトシダー
ゼを用いるのと比べ抗体標識が容易で、かつ高い感度が
得られることによる。
ペルオキシダーゼによる第三抗体の標識は、通常の方
法で行うことができ、例えばエス・ヨシタケ，エム・イ
マガワ，イーイシカワ，エトール，ジェー・バイオケム
（S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,et.al.,J.Bioche
m.,）92（1982）1413−1424記載の方法で行うことがで
きる。
本発明における、同時反応で得た免疫複合体とペルオ
キシダーゼ標識抗体との反応は通常の方法で行うことが
できる。例えば、ペルオキシダーゼ標識抗体溶液中に免
疫複合体を移し、インキュベーションすることにより行
なわれる。インキュベーションは、通常の条件下（例え
ば５〜50℃，好ましくは30〜40℃の温度、５分〜２日
間，好ましくは５〜30分）で行うことができる。
上記免疫複合体とペルオキシダーゼ標識抗体との反応
生成物は、洗浄液（例えば蒸留水，生理食塩水，リン酸
緩衝液など）にて洗浄後、基質［たとえば5-アミノサリ
チル酸,o-フェニレンジアミン,ABTS〔2,2′‐アジノジ
（3-エチルベンズチアゾリン）‐６′‐スルホン酸〕な
ど、好ましくはo-フェニレンジアミン］溶液中に移し、
インキュベーションを行う。インキュベーションは、通
常の条件下（例えば５〜50℃，好ましくは30〜40℃の温
度、５分〜１時間，好ましくは５〜30分）で行うことが
できる。インキュベーションしたのち、反応停止液（た
とえば硫酸，塩酸など）を加え、吸光度によりペルオキ
シダーゼの酵素活性を定量する。
［実施例］ 以下、実施例および比較例により、本発明をさらに説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ ［癌胎児性抗原（CEA）の測定］ （ａ）ヒトCEA標準溶液の調製 大腸癌肝転移巣から過塩素酸抽出法により得られた高
値CEAをWHOのCEAインターナショナル リファレンス
スタンダード（63/701）を用いて、ダイナボット社製CE
A測定キット「CEA-EIA」により濃度を検定し、0.02Mリ
ン酸緩衝液で5,10,30および60ng/mlに調製した。
（ｂ）抗CEA単クローン抗体の製造 マウス（Balb/c）に高濃度のヒトCEAで免疫性を与え
た。６週間後、脾臓から細胞懸濁液を製造し、その後、
脾臓の約１×108個の細胞と約２×107個のマウスミエロ
ーマ（骨髄腫）細胞をPEG処理にて融合した。HAT培地中
で融合細胞を培養し、さらにスクリーニングにより、目
的とする抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を選択した。
このハイブリドーマをクローニングにより単一細胞群
（単クローン）として増殖させ、次に単クローンをマウ
スにて腹水化した。得られた腹水を精製することによ
り、特異性の高い抗CEA単クローン免疫グロブリンを作
製した。
（ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗
体の作製 抗マウス免疫グロブリン抗体（Dako社製）を前述の文
献［J.Biochem,92（1982）1413−1424］記載の方法にて
ペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス免疫グロブリン抗体を得た。この試薬は通常１％牛
血清アルブミン含有緩衝液で10〜5000倍に希釈して使用
した。
（ｄ）抗CEA複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 米国特許第3652761号明細書の方法に従い、ガラスビ
ーズの表面に抗CEA複クローン（ウサギ）抗体（Dako社
製）をコーティングした。
（ｅ）ヒトCEAの定量 試験管内にて抗CEA複クローン（ウサギ）抗体結合ガ
ラスビーズ１コとヒトCEA標準溶液60ng/ml、50μｌを抗
CEA単クローン抗体10〜100μg/ml含有0.02Mリン酸緩衝
液300μｌ中でインキュベーション（37℃,15分間）した
のち、蒸留水にてビーズを洗浄した。次に、ペルオキシ
ダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液300μｌ中
にビーズを移し、インキュベーション（37℃,15分間）
した。再度、蒸留水にてビーズを洗浄したのち、ビーズ
を基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミ
ン溶液）400μｌ中でインキュベーション（37℃,15分
間）した。次に、1.5規定硫酸3mlを加えて反応を停止し
た。この液の492nmの吸光度を測定し、ビーズに結合し
たペルオキシダーゼの酵素活性を定量した。
同様に、ヒトCEA標準溶液30,10,5および0ng/mlを使用
した場合の酵素活性を測定し、検量線を作成した。
第１図は本測定法によるヒトCEA測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域および測定精度は次のとお
りであった。
測定感度 1.0ng/ml 測定領域 ０〜60ng/ml 測定精度 5.0±0.4ng/ml（変動係数8.0％） 38.2±2.2ng/ml（変動係数5.8％） 比較例１ ［従来のサンドイッチ法によるヒトCEAの測
定］ 実施例１と比較するため、従来のサイドイッチ法によ
るヒトCEAの測定を行った。
（ａ）ヒトCEA標準溶液の調製 実施例１（ａ）に準じた。
（ｂ）抗CEA単クローン免疫グロブリンの製造 実施例１（ｂ）に準じた。
（ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗CEA単クローン免疫グロ
ブリンの作製 実施例１（ｃ）に準じて、上記抗CEA単クローン免疫
グロブリンをペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダ
ーゼ標識抗CEA単クローン免疫グロブリンを作製した。
この試薬は通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で10〜
5000倍に希釈して使用した。
（ｄ）抗CEA複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 実施例１（ｄ）に準じた。
（ｅ）CEAの定量 試験管内にて抗CEA複クローン（ウサギ）抗体結合ガラ
スビーズ１コとヒトCEA標準溶液60ng/ml、50μｌを0.02
Mリン酸緩衝液200μｌ中でインキュベーション（37℃,1
5分間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄した。次
に、ペルオキシダーゼ標識抗CEA単クローン免疫グロブ
リン溶液300μｌにビーズを移し、インキュベーション
（37℃,15分間）した。再度、蒸留水にてビーズを洗浄
したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オルト−
フェニレンジアミン溶液）400μｌ中でインキュベーシ
ョン（37℃,15分間）した。次に、1.5規定硫酸3mlを加
えて反応を停止した。この液の492nmの吸光度を測定
し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を定量した。同様
に、ヒトCEA標準溶液30,10,5および0ng/mlを使用した場
合の酵素活性を測定し、検量線を作成した。
第２図は比較例１によるヒトCEA測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域および測定精度は次のとお
りであった。
測定感度 4.5ng/ml 測定領域 ０〜60ng/ml 測定精度 5.3±0.9ng/ml（変動係数17.0％） 37.5±5.3ng/ml（変動係数14.1％） 比較例２ ［三抗体遂次反応法によるヒトCEAの測定］ 実施例１と比較するため、第一抗体と抗原性物質、抗
原性物質と第二抗体および第二抗体と第三抗体の反応を
遂次に行わせてヒトCEAの測定を行った。
（ａ）ヒトCEA標準溶液の調製 実施例１（ａ）に準じた。
（ｂ）抗CEA単クローン免疫グロブリンの製造 実施例１（ｂ）に準じた。
（ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗
体の作製 実施例１（ｃ）に準じた。
（ｄ）抗CEA複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 実施例１（ｄ）に準じた。
（ｅ）CEAの定量 試験管内にて抗CEA複クローン（ウサギ）抗体結合ガ
ラスビーズ１コとヒトCEA標準溶液60ng/ml50μｌを0.02
Mリン酸緩衝液300μｌ中でインキュベーション（37℃,1
5分間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄した。次
に、抗CEA単クローン抗体10〜100μg/ml含有0.02Mリン
酸緩衝液300μｌ中にビーズを移し、インキュベーショ
ン（37℃,15分間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄
した。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブ
リン抗体溶液300μｌ中にビーズを移し、インキュベー
ション（37℃,15分間）した。再度、蒸留水にてビーズ
を洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水素含有オ
ルト−フェニレンジアミン溶液）400μｌ中でインキュ
ベーション（37℃,15分間）した。次に、1.5規定硫酸3m
lを加えて反応を停止した。この液の492nmの吸光度を測
定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性を定量した。
同様に、ヒトCEA標準溶液30,10,5および0ng/mlを使用
した場合の酵素活性を測定し、検量線を作成した。
第３図は比較例２によるヒトCEA測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域および測定精度は次のとお
りであった。
測定感度 3.9ng/ml 測定領域 ０〜60ng/ml 測定精度 6.6±0.9ng/ml （変動係数 13.6％） 40.2±5.8ng/ml （変動係数 14.4％） 実施例２ ［甲状腺刺激ホルモン（TSH）の測定］ （ａ）ヒトTSH標準溶液の調製 UCBバイオプロダクツ社より入手したヒトTSH（50μg/
バイアル）を0.02Mリン酸緩衝液にて希釈し、50,25,5,
2.5および0 IU/mlのヒトTSH標準溶液を調製した。
（ｂ）抗TSH単クローン抗体の製造 上記ヒトTSHを使用し、実施例１（ｂ）の方法に従
い、抗ヒトTSH単クローン抗体を得た。
（ｃ）抗TSH複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 抗TSH複クローン（ウサギ）抗体（Dako社製）を使用
し、実施例１（ｄ）の方法により、抗TSH複クローン抗
体結合ガラスビーズを得た。
（ｄ）ヒトTSHの定量 試験管内にて、抗TSH複クローン（ウサギ）抗体結合
ガラスビーズ１コとヒトTSH標準50IU/ml溶液100μｌを
抗TSH単クローン抗体10〜100μg/ml含有0.02Mリン酸緩
衝液200μｌ中でインキュベーション（37℃,30〜60分
間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄した。実施例１
（ｃ）で作製したペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グ
ロブリン抗体溶液300μｌ中にビーズを移し、インキュ
ベーション（37℃,30〜60分間）した。再度、蒸留水に
てビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶液（過酸化水
素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）400μｌ中で
インキュベーション（10〜30℃,30分間）した。次に、
1.5規定硫酸3mlを加えて反応を停止した。この液の492n
mの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵素活性
を定量した。
同様に、ヒトTSH標準溶液25,5,2.5および0IU/mlを被
検試料とした場合の酵素活性を測定し、検量線を作成し
た。
第４図は、実施例２によるヒトTSH測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域、および測定精度は次のと
おりであった。
測定感度 2.0IU/ml 測定領域 ０〜50IU/ml 測定精度 2.8±0.2IU/ml（変動係数 7.1％） 26.0±1.4ng/ml（変動係数 5.4％） 比較例３ ［従来のサンドイッチ法によるヒトTSHの測
定］ 実施例２と比較するため、従来のサンドイッチ法によ
るヒトTSHの測定を行った。
（ａ）ヒトTSH標準溶液の調製 実施例２（ａ）に準じた。
ｂ）抗TSH単クローン免疫グロブリンの製造 実施例２（ｂ）に準じた。
（ｃ）ペルオキシダーゼ標識抗TSH単クローン免疫グロ
ブリンの作製 実施例１（ｃ）に準じて、上記抗TSH単クローン免疫
グロブリンをペルオキシダーゼと結合し、ペルオキシダ
ーゼ標識抗TSH単クローン免疫グロブリンを作製した。
この試薬は、通常１％牛血清アルブミン含有緩衝液で10
〜5000倍に希釈して使用した。
（ｄ）抗TSH複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 実施例２（ｃ）に準じた。
（ｅ）TSHの定量 試験管内にて抗TSH複クローン抗体結合ガラスビーズ
１コとヒトTSH標準50IU/ml溶液100μｌを抗TSH複クロー
ン抗体10〜100μg/ml含有0.02Mリン酸緩衝液200μｌ中
でインキュベーション（37℃,60分間）したのち、蒸留
水にてビーズを洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗
TSH単クローン免疫グロブリン溶液300μｌ中にビーズを
移し、インキュベーション（37℃,60分間）した。再
度、蒸留水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを基質溶
液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン溶液）
400μｌ中でインキュベーション（37℃,30分間）した。
次に、1.5規定硫酸3mlを加えて反応を停止した。この液
の492nmの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵素の酵
素活性を定量した。
同様に、ヒトTSH標準溶液25,5,2.5および0IU/mlを用
いた場合の酵素活性を測定し、検量線を作成した。
第５図は、比較例３によるヒトTSH測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域および測定精度は次のとお
りであった。
測定感度 6.5IU/ml 測定領域 ０〜50IU/ml 測定精度 2.6±0.7IU/ml（変動係数 26.9％） 25.5±4.3IU/ml（変動係数 16.9％） 比較例４ ［三抗体遂次反応法によるヒトTSHの測定］ 実施例２と比較するため、従来の三抗体サンドイッチ
遂次反応法によるヒトTSHの測定を行った。
（ａ）ヒトTSH標準溶液の調製 実施例２（ａ）に準じた。
（ｂ）抗TSH単クローン抗体の製造 実施例２（ｂ）に準じた。
（ｃ）抗TSH複クローン抗体結合ガラスビーズの作製 実施例２（ｃ）に準じた。
（ｄ）ヒトTSHの定量 試験管内にて、抗TSH複クローン（ウサギ）抗体結合
ガラスビーズ１コとヒトTSH標準50IU/ml溶液100μｌを
0.02Mリン酸緩衝液200μｌ中でインキュベーション（37
℃,30分間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄した。
次に抗TSH単クローン抗体10〜100μg/ml含有0.02Mリン
酸緩衝液300μｌ中にビーズを移し、インキュベーショ
ン（37℃,30分間）したのち、蒸留水にてビーズを洗浄
した。さらに実施例１（ｃ）で作製したペルオキシダー
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液300μｌ中にビ
ーズを移し、インキュベーション（37℃,30分間）し
た。再度、蒸留水にてビーズを洗浄したのち、ビーズを
基質溶液（過酸化水素含有オルト−フェニレンジアミン
溶液）400μｌ中でインキュベーション（37℃,30分間）
した。次に、1.5規定硫酸3mlを加えて反応を停止した。
この液の492nmの吸光度を測定し、ビーズに結合した酵
素の酵素活性を定量した。
同様に、ヒトTSH標準溶液25,5,2.5および0IU/mlを被
検試料とした場合の酵素活性を測定し、検量線を作成し
た。
第６図は比較例４によるヒトTSH測定の検量線であ
る。
また、測定感度、測定領域および測定精度は次のとお
りであった。
測定感度 5.7IU/ml 測定領域 ０〜50IU/ml 測定精度 3.0±0.6IU/ml （変動係数 20.0％） 28.2±4.7IU/ml （変動係数 16.6％） ［発明の効果］ 従来のサイドイッチ法では、酵素標識する第二抗体の
抗体価が低い場合、測定感度・精度とも低くなり、通常
の測定が不可能であった。そこで、三抗体遂次法による
測定を試みたが、若干の感度アップは認められるもの
の、有効な測定法とはなり得なかった。
本発明の測定法によれば、第二抗体の抗体価が低い場
合でも十分な測定感度が得られる。たとえば、第二抗体
が抗血清、培養液もしくは腹水などの未精製抗体の場合
でも高感度が得られる。また、第二抗体に単クローン抗
体を用いた場合は、目的とする抗原性物質に対して特異
性の高い測定が可能となる。
以上の点から、本発明は特に高感度の測定系が要求さ
れる抗原性物質であるCEAおよびTSHの診断試薬に応用で
きる。
【図面の簡単な説明】
第１図、第２図および第３図はヒトCEA測定の検量線、
第４図、第５図および第６図はヒトTSHの検量線であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−187861（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−163565（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−40568（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】癌胎児性抗原（CEA）および甲状腺刺激ホ
    ルモン（TSH）から選ばれる抗原性物質を認識する不溶
    性固体上の抗体（第一抗体）、前記CEAおよびTSHから選
    ばれる抗原性物質、および前記第一抗体とは異なる動物
    種由来の前記抗原性物質を認識する抗体（第二抗体）を
    同時に反応させて得た免疫複合体と、 ペルオキシダーゼで標識された、前記第一抗体と同じ動
    物種由来の抗体であり、第二抗体と同じ動物種由来の免
    疫グロブリンを認識するペルオキシダーゼ標識抗体（第
    三抗体） とを反応させたのち、ペルオキシダーゼ量を測定するこ
    とにより、前記抗原性物質を定量することを特徴とする
    酵素免疫測定法。
  2. 【請求項２】第二抗体が単クローン抗体である特許請求
    の範囲第１項記載の測定法。
  3. 【請求項３】不溶性固体がガラスまたはプラスチックで
    ある特許請求の範囲第１項または第２項に記載の測定
    法。
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