JP3299787B2 - 放射免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、放射免疫測定法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来の免疫測定法として、不溶性固体上
に固定した第一抗体に抗原性物質を結合させ、それに放
射能、酵素などで標識した第二抗体を反応させ、その放
射能、酵素量を測定する方法（いわゆるサンドイッチ
法）が知られている。

【０００３】サンドイッチ法のうち、酵素で標識された
第二抗体を用いる酵素免疫測定法では標識された第二抗
体の使用量に制限がないために、高感度の第二抗体が得
られない場合でも高濃度に用いることによって標識第二
抗体の感度を補うことができる。この場合は、酵素活性
は放射性物質の放射比活性より小さいために高い感度が
得られない。そのため、抗原性物質に結合した第二抗体
の一分子あたりに多くの標識酵素を結合させる増感法が
とられている。〔たとえば、アビジン・ビオチン複合体
法（ピー・ティジッセン著「エンザイムイムノアッセ
イ」）〕など。しかしながら、これらの方法を用いても
酵素免疫測定法での測定感度は放射能で標識する方法ほ
どには向上せず、高感度の測定系を得ることは困難であ
る（特開昭６３−１１８６５６号公報参照）。

【０００４】一方、放射能で標識した第二抗体を用いる
放射免疫測定法は、放射能は酵素活性に比べ低い濃度で
も検出できるため、高い測定感度が得やすい方法であ
る。しかしながら、測定系に加えることのできる放射能
量に限りがあるため、第二抗体の濃度が低くなり、低感
度の第二抗体しか得られない場合、抗原性物質に第二抗
体が十分に結合せず、測定系の感度が充分に向上しな
い。

【０００５】さらに詳しく述べれば、反応液中において
第二抗体と結合した抗原性物質の濃度と、抗体と結合し
ていない抗原性物質の濃度の比（〔ＡｇＡｂ２〕／〔Ａ
ｇ〕）は、第二抗体の濃度（〔Ａｂ２〕）と解離定数
（Kd）によって次式のように決まる。

【０００６】

【数１】

【０００７】すなわち第二抗体の濃度が大きいほど、ま
た、解離定数が小さいほど抗原性物質に第二抗体が多く
結合し、測定感度が高くなる。

【０００８】ところが、測定系に用いることのできる放
射能量には限界があり、そのため第二抗体の濃度は制限
されるので、第二抗体の解離定数が大きい時には、充分
な感度の測定系が得られない〔小幡公道他「核医学」２
６巻３号（１９８９）〕。

【０００９】上記のとおり、従来、免疫測定法において
は、高感度の測定系を得るためには、高感度の第二抗体
を取得することが特に重要と考えられてきた。しかしな
がら、高感度の抗体を取得することは困難であり、その
ために多大の労力が費やされてきた。

【００１０】また、従来の技術では、第二抗体を直接標
識することから、二種類以上の抗原性物質を測定するた
めに二種類以上の測定系を作製しようとすれば、それぞ
れの抗原性物質を認識する二種類以上の第二抗体を別々
に標識しなければならないので、コストアップにつなが
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、放射免疫測
定法において第二抗体が低感度の場合にも高い感度の測
定法を得るため、放射能量にとらわれずに高濃度の第二
抗体を用いることのできる全く新しい概念による測定法
を提供するためになされたものである。さらに詳述すれ
ば、本発明は、従来感度の高い抗体を得ることが困難で
あった副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）
の放射免疫測定法を提供するためになされたものであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、副甲状腺ホル
モン関連タンパク質（Ｂ）を認識する不溶性固体上の第
一抗体（Ａ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質
（Ｂ）、及び前記第一抗体と異なる動物種由来の前記副
甲状腺ホルモン関連タンパク質を認識する第二抗体
（Ｃ）を、第二抗体の濃度が第二抗体と副甲状腺ホルモ
ン関連タンパク質との間の解離定数よりも高い濃度で反
応させて免疫複合体（Ｄ）を得、次にこの免疫複合体
と、前記第二抗体と特異的に反応するプローブを放射能
標識した放射能標識プローブ（Ｅ）とを反応させた後、
固体または反応液の放射能を測定することにより、前記
副甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｂ）を測定すること
を特徴とする放射免疫測定法である。

【００１３】本発明の測定方法は、被検試料中（例えば
血液中）の濃度が低いため高感度の測定法が要求され、
しかもサンドイッチ法で測定するために必要となる、分
子上の二カ所またはそれ以上の抗原決定部位の内の一カ
所または全ての部位に対する、感度の高い抗体を作製し
にくいといった問題点を有する抗原性物質を測定対象と
する場合に、特に有効である。

【００１４】上記のような問題点を有する抗原性物質と
しては、例えば副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴ
ＨｒＰ）、心房性ナトリウム利尿ホルモン（ＡＮＰ）、
エンドセリン（ＥＴ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴ
Ｈ）等のペプチドホルモン等を挙げることができるが、
中でもＰＴＨｒＰは特に血液中濃度が低く、感度の高い
抗体が得にくいので、本発明の測定法における抗原性物
質として特に最適である。

【００１５】本発明において抗原性物質として用いられ
る副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）
（Ｂ）としては、測定に供される被検試料中で抗原性を
有するものであれば、いかなるものでもよい。また、該
タンパク質を従来既知の方法に従って取得して、抗体の
調製のための抗原として用いたり、検量線作成のための
標準液として用いることができる。該タンパク質を取得
する方法としては、例えば、従来既知の方法に従ってＰ
ＴＨｒＰ遺伝子を任意のベクターに組み込み、用いたベ
クターに好適な大腸菌等の宿主に導入して発現させ、こ
れを抽出・精製して取得する方法等が挙げられる。

【００１６】第一抗体（Ａ）としては、従来既知の方法
で、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の脊椎動物に
上記副甲状腺ホルモン関連タンパク質を免疫することに
よって得られる複クローン抗体、あるいは、富山朔二、
安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」（１９８
７）講談社発行に記載の方法などにより、該タンパク質
に対する抗体産生細胞（好ましくはマウス細胞）とミエ
ローマ細胞（好ましくは抗体産生細胞と同種同系の細
胞）を細胞融合して得られるハイブリドーマ細胞（好ま
しくはマウス由来）の単クローン抗体があげられる。こ
れらの抗体は、硫安分画、ＤＥＡＥセルロースクロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（松井
直、成内秀雄、臼井美津子著「免疫学実験入門」（１９
８１）学会出版センター）等の方法で精製して用いる。

【００１７】不溶性固体としては、無機担体、例えばガ
ラス（ポーラスガラス、つやけしガラスなど）、シリカ
ゲル、ベントナイトのような珪酸質担体、磁性体など、
及び有機担体、例えばプラスチック、高分子ゲル（デキ
ストラン、アガロースなどの多糖あるいはポリアクリル
アミドゲルなど）、濾紙等があげられる。これらのう
ち、好ましいものは、簡便かつ安定して抗体が結合で
き、さらに取扱いが容易なガラス（ガラスビーズ及びガ
ラス試験管）、及びプラスチック（プラスチックビー
ズ、プラスチックチューブ、プラスチックトレイ）であ
る。

【００１８】不溶性固体上に第一抗体を結合させる方法
としては、ガラスと抗体を化学的に結合させる方法、例
えばシランカップリング剤及び必要により架橋剤を用い
る方法（特開昭５４−１０８６９６号公報）、または物
理吸着させる方法（米国特許第４２８０９９２号及び第
３６８２７６１号明細書）、プラスチックに抗体を物理
吸着させる方法（ピー・ティジッセン著「エンザイムイ
ムノアッセイ」）、あるいは固体上に固定化したアビジ
ンと、抗体と化学的に結合したビオチンとを反応させる
ことによって、効率的に固定化する方法がある。

【００１９】第二抗体（Ｃ）としては、第一抗体と異な
る動物種由来で、かつ、上記タンパク質を認識する複ク
ローン抗体（例えば、第一抗体がウサギ由来の場合、ヤ
ギ、羊、モルモット等の抗体：第一抗体が羊由来の場
合、ウサギ、ヤギ、モルモット等の抗体）：または第一
抗体が上記タンパク質を認識する単クローン抗体の場
合、上記タンパク質に対する複クローン抗体が挙げられ
る。第二抗体には、抗血清、ハイブリドーマ培養液、腹
水、又はこれらを精製して得られる免疫グロブリン等が
ある。プローブとしてアビジンまたはストレプトアビジ
ンを用いる場合は、第二抗体を既知の方法で精製した
後、ビオチンを化学的に結合させる。

【００２０】本法により従来の放射免疫測定法と比較し
て測定感度を向上させるためには、特に第二抗体の感度
が低い場合、すなわち第二抗体と副甲状腺ホルモン関連
タンパク質との間の解離定数が大きい場合が有効であ
る。第二抗体と該タンパク質との間の解離定数が１０^-6
〜９×１０^-12 mol/l 、さらに好ましくは１０^-8〜１０
^-11 mol/l の場合に、従来の放射免疫測定法と比較して
特に測定感度の向上が達成可能であるが、測定される該
タンパク質の濃度等によりこの値に限定されない。

【００２１】第二抗体の濃度（免疫グロブリンとしての
濃度）は、主に第二抗体と上記タンパク質の間の反応の
解離定数（Kd）によって定まり、０．１Kd〜１００Kd、
好ましくは１Kd〜１０Kd（例えば、Kdが１×１０^-9mole
/lの値をとるとき、第二抗体の濃度は１×１０^-10 〜１
×１０^-7mole/l、好ましくは１×１０^-9〜１×１０^-8mo
le/l）が望ましいが、被検試料中の該タンパク質の濃度
及び放射標識プローブ（Ｄ）の標識率または濃度により
必ずしもこの値に限定されない。

【００２２】ここで、解離定数は、一般的な方法〔例え
ばピー・ティジッセン著「プラクティス・アンド・セオ
リー・オブ・エンザイムイムノアッセイ」(P. Tijssen,
“Practice and theory of enzyme immunoassays” (19
85) Elsevier Science Publishers)に記載されているス
キャッチャードプロット解析法など〕により容易に測定
することができる。

【００２３】すなわち、解離定数（Kd）は、抗体と結合
した抗原性物質の濃度〔ＡｂＡｇ〕、抗体と結合してい
ない抗原性物質の濃度〔Ａｇ〕および抗原性物質と結合
していない抗体の濃度〔Ａｂ〕によって次式のように表
される。

【００２４】

【数２】

【００２５】ここで、〔Ａｇ〕をＦ、〔ＡｂＡｇ〕を
Ｂ、反応液中の抗体の総濃度を〔Ａｂ〕_TOTAL とする
と、〔Ａｂ〕＝〔Ａｂ〕_TOTAL −Ｂであるから、上式は
次のように変形できる。

【００２６】

【数３】

【００２７】この式において、抗体と結合した抗原性物
質の濃度と溶液中の総抗原性物質の濃度の比（Ｂ／
Ｔ）、およびＢ／Ｆはトレーサー実験によって測定でき
る。また、Ｂは反応液に添加した総抗原性物質の量とＢ
／Ｔから計算できるので、反応液に添加する量を色々に
変化させながらＢおよびＢ／Ｔを測定することができ
る。この結果をＢを横軸にＢ／Ｆを縦軸にしたグラフに
プロットすると、その近似直線の傾きの逆数が解離定数
となる。

【００２８】免疫複合体（Ｄ）は、第一抗体（Ａ）、副
甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｂ）及び前記濃度の第
二抗体（Ｃ）を同時または順次反応させることによって
得ることができる。例えば、第一抗体を結合させた不溶
性固体またはアビジンを固定した不溶性固体とビオチン
化した第一抗体を含む緩衝溶液、副甲状腺ホルモン関連
タンパク質を含む被検試料、及び第二抗体含有緩衝液を
同時にあるいは順次保温することにより免疫複合体を得
ることができる。保温の後、反応液を不溶性固体から除
去する。次に、洗浄液（例えば蒸留水、生理食塩水、リ
ン酸緩衝液、界面活性剤の希薄溶液など）を加えた後、
不溶性固体を洗浄する操作を数回（例えば１から３回）
繰り返すことにより、免疫複合体を未反応物から単離す
ることができる。

【００２９】放射能標識プローブ（Ｅ）は、第二抗体と
特異的に反応するプローブを放射能標識して得られる。
このようなプローブとしては、第二抗体と同種の動物由
来の免疫グロブリンを認識する抗体（例えば、第二抗体
がウサギ由来である場合、抗ウサギ免疫グロブリン・ヤ
ギ抗体等）があげられる。また、第二抗体にビオチンが
結合している場合には、アビジン及びストレプトアビジ
ンを該プローブとして用いることができる。プローブは
放射性同位元素（例えば ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、 ³Ｈ、¹⁴Ｃ、
好ましくは、半減期が長く比活性が高くしかも測定が容
易な ¹²⁵Ｉ）によって放射能標識して用いられる。放射
能標識の方法としては、入江実編「ラジオイムノアッセ
イ」（１９７４）講談社発行に記載の方法などがあげら
れる。

【００３０】免疫複合体（Ｄ）と放射能標識プローブ
（Ｅ）との反応は、前記免疫複合体と該プローブ含有緩
衝溶液を保温することにより行うことができる。保温は
通常の条件（例えば、２〜５０℃、好ましくは２０〜３
０℃、５分〜２日間、好ましくは５時間〜１日間）で行
うことができる。保温の後、免疫複合体と放射能標識プ
ローブの反応生成物を洗浄液（蒸留水、生理食塩水、リ
ン酸緩衝液など）にて洗浄し、井戸型シンチレーション
ガンマーカウンター（アロカ社製、ＡＲＣ−１０００な
ど）により放射能を測定する。

【００３１】被検試料中の副甲状腺ホルモン関連タンパ
ク質の濃度は、あらかじめ該タンパク質の標準液等を用
いた測定を行って検量線を作成し、これと被検試料の放
射能とを比較して求めることができる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例及び比較例により、本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。

【００３３】実施例１ 副甲状腺ホルモン関連蛋白質
（ＰＴＨｒＰ）の測定 （ａ）ＰＴＨｒＰ標準液の調製 ビョルン・ニルソン、ラルス・アブラハムセン、メソド
・イン・エンザイモロジィ(Biorn Nilsson,Lars Abraha
msen, Method in Enzymol.) 185 (1990) 144に記載の方
法に準じ、米国イェール大学から入手したＰＴＨｒＰ遺
伝子（ｃＤＮＡ）〔アーサー・イー・ブローダス等、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Arthur E. Broadus, et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA) 85 (1988) 597 〕をプロテインＡ
融合タンパク質発現ベクター（ｐＲＩＴ２Ｔ、ファルマ
シア社製）に組み込み、大腸菌（Ｎ４８３０−１株）に
導入した。

【００３４】この大腸菌を増殖させた後、ＰＴＨｒＰと
プロテインＡの融合タンパク質を産生させ、この融合タ
ンパク質を抽出し、ＢｒＣＮ処理によりＰＴＨｒＰとプ
ロテインＡを化学的に切断して粗ＰＴＨｒＰを得た。こ
の粗ＰＴＨｒＰをアフィニティークロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過によって
精製した。得られたＰＴＨｒＰは加水分解後アミノ酸分
析法により濃度を定量した後、５％ウシ血清アルブミ
ン、０．８％ウシガンマグロブリン及び０．０５％トゥ
イーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で０．３２〜１
０００pmole/l に調製した。

【００３５】（ｂ）抗ＰＴＨｒＰ単クローン抗体（第一
抗体）結合プラスチックビーズの作製 マウス(Balb/c)に、サイログロブリンと結合したＰＴＨ
ｒＰ（１−３４）（ペニンシュラ社製）で免疫して得ら
れた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞から、富山朔
二、安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」（１
９８７）講談社発行に記載の方法で単クローンハイブリ
ドーマを得た。次に得られた単クローンハイブリドーマ
を腹水化し、腹水を精製することにより、抗ＰＴＨｒＰ
単クローン免疫グロブリンを作製した。作製した抗ＰＴ
ＨｒＰ単クローン免疫グロブリンを、前記の文献「プラ
クティス・アンド・セオリー・オブ・エンザイムイムノ
アッセイ」に記載の方法によりプラスチックビーズ上に
コーティングした。

【００３６】（ｃ）抗ＰＴＨｒＰ複クローン抗体（第二
抗体）の作製 アプライド・バイオシステムズ社製の自動固相ペプチド
合成装置により合成したＰＴＨｒＰ（５０−８３）をサ
イログロブリンと結合させた後、ウサギを免疫して抗Ｐ
ＴＨｒＰ抗血清を得た。該抗血清をアフィニティークロ
マトグラフィーで精製することにより特異性の高い抗Ｐ
ＴＨｒＰ複クローン抗体を得、これを第二抗体とした。

【００３７】（ｄ）抗ＰＴＨｒＰ複クローン抗体（第二
抗体）のＰＴＨｒＰ（１−８７）（抗原性物質）との解
離定数の測定 （ｉ） ¹²⁵Ｉ−ＰＴＨｒＰ（１−８７）の作製 前記ＰＴＨｒＰ（１−８７）を、入江実編「ラジオイム
ノアッセイ」（１９７４）講談社発行に記載の方法に準
じて ¹²⁵Ｉで標識し、逆相高速液体クロマトグラフィー
にて精製した後、２％ウシ血清アルブミンを含むリン酸
緩衝生理食塩水で４００ Bq/０．１mlとなるように調製
した。

【００３８】（ii）Ｂ／Ｆ分離剤の調製 抗ウサギ免疫グロブリン・ヤギ血清（免疫生物研究所
製）１／２５６、正常ウサギ血清（免疫生物研究所製）
１／１０２４、及びポリエチレングリコール１２．５％
を含むリン酸緩衝生理食塩水を作製し、Ｂ／Ｆ分離剤と
した。

【００３９】(iii) 解離定数の測定 前記第二抗体（抗ＰＴＨｒＰ複クローン免疫グロブリ
ン）溶液０．１mlに、標準ＰＴＨｒＰ溶液０．１mlと
¹²⁵Ｉ−ＰＴＨｒＰ（１−８７）溶液０．１mlを加え、
４℃において４８時間保温した後、Ｂ／Ｆ分離剤０．５
mlを加え、遠心分離して上清を除き、沈殿の放射能を井
戸型シンチレーションガンマーカウンター（アロカ社
製、ＡＲＣ−１０００）で測定した。

【００４０】前記の文献「プラクティス・アンド・セオ
リー・オブ・エンザイムイムノアッセイ」に記載の方法
でスキャッチャード解析を行い、結合定数を求め、逆数
をとって解離定数とした。

【００４１】図１は本実施例によるスキャッチャードプ
ロットである。また、本実施例から求めた解離定数は次
の通りであった。 解離定数 ０．３ nmole/l

【００４２】（ｅ）第二抗体溶液の調製 前項で求めた解離定数より、第二抗体は１．５nmole/l
の濃度で用いることとした。第二抗体は２％ウシ血清ア
ルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で、反応液中での
最終濃度が該濃度になるように希釈して用いた。

【００４３】（ｆ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン
抗体の作製 抗ウサギ免疫グロブリン・ヤギ抗体（Ｄａｋｏ社製）
０．２５〜４０μg を、入江実編「ラジオイムノアッセ
イ」（１９７４）講談社発行に記載の方法に従い、１
８．５ MBqの ¹²⁵Ｉで標識し、ゲルろ過によって精製
し、４％ウシ血清アルブミン、０．５３％ウシガンマグ
ロブリンを含むリン酸緩衝生理食塩水で４KBq/０．３ml
になるように調製した。

【００４４】（ｇ）ＰＴＨｒＰの測定 （ｉ）検量線の作成 試験管に、標準ＰＴＨｒＰ溶液（０．３２〜１０００pm
ole/l)０．２mlをとり、第二抗体溶液０．１mlと抗ＰＴ
ＨｒＰ単クローン抗体（第一抗体）結合プラスチックビ
ーズ１個を加え、室温で２０時間保温した後、反応液を
除去し、蒸留水で洗浄した。次に、 ¹²⁵Ｉで標識した抗
ウサギ免疫グロブリン・ヤギ抗体溶液０．３mlを加え、
室温で２０時間保温した後に、反応液を除去し、蒸留水
で洗浄し、ビーズの放射能を井戸型シンチレーションガ
ンマーカウンター（アロカ社製、ＡＲＣ−１０００）で
測定した。

【００４５】図２は本実施例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲ならびにＰＴＨｒＰの濃度が８
pmole/l 及び２００pmole/l における測定精度（変動係
数）は次の通りであった。

【００４６】（ii）体液性高カルシウム血症患者試料中
のＰＴＨｒＰの測定 前項の測定法に準じて、標準ＰＴＨｒＰの代わりに体液
性高カルシウム血症患者血漿を被検試料として用い、測
定した。前項で作成した検量線と、被検試料による放射
能とを比較して、被検試料中のＰＴＨｒＰ濃度を求め
た。被検試料中のＰＴＨｒＰ濃度は次の通りであった。 患者試料測定値 ５．８ pmole/l及び６．０ pmole/l

【００４７】比較例１ 第二抗体が第二抗体と抗原性物
質との解離定数より低い濃度でのＰＴＨｒＰ（１−８
７）の測定 （ａ）ＰＴＨｒＰ標準液の調製 実施例１（ａ）に準じた。 （ｂ）抗ＰＴＨｒＰ単クローン抗体（第一抗体）結合プ
ラスチックビーズの作製 実施例１（ｂ）に準じた。 （ｃ）抗ＰＴＨｒＰ複クローン抗体（第二抗体）の作製 実施例１（ｃ）に準じた。

【００４８】（ｄ）第二抗体溶液の調製 実施例１（ｅ）に準じた。第二抗体は反応液中での最終
濃度が０．００１５nMになるように希釈して用いた。 （ｅ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体の作製 実施例１（ｆ）に準じた。 （ｆ）ＰＴＨｒＰの測定 実施例１（ｇ）に準じた。

【００４９】図３は本比較例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲ならびにＰＴＨｒＰの濃度が４
０pmole/l 及び２００pmole/l における測定精度（変動
係数）は次の通りであった。

【００５０】比較例２ 従来のサンドイッチ法（第二抗
体を直接標識する方法）でのＰＴＨｒＰ（１−８７）の
測定 （ａ）ＰＴＨｒＰ標準液の調製 実施例１（ａ）に準じた。 （ｂ）抗ＰＴＨｒＰ単クローン抗体（第一抗体）結合プ
ラスチックビーズの作製 実施例１（ｂ）に準じた。 （ｃ）抗ＰＴＨｒＰ複クローン抗体（第二抗体）の作製 実施例１（ｃ）に準じた。

【００５１】（ｄ） ¹²⁵Ｉ標識抗ＰＴＨｒＰ複クローン
抗体（標識第二抗体）の作製 抗ＰＴＨｒＰ複クローン抗体（第二抗体）を実施例１
（ｆ）に準じて標識及び精製し、２％ウシ血清アルブミ
ンを含むリン酸緩衝生理食塩水で４KBq/０．１mlになる
ように調製した。

【００５２】（ｅ）ＰＴＨｒＰの測定 試験管に、標準ＰＴＨｒＰ溶液（０．３２〜２００ pmo
le/l）または体液性高カルシウム血症患者血漿の被検試
料０．２mlをとり、 ¹²⁵Ｉ標識抗ＰＴＨｒＰ複クローン
抗体溶液０．１mlと抗ＰＴＨｒＰ単クローン抗体結合プ
ラスチックビーズ１個を加え、室温で２０時間保温した
後、反応液を除去し、蒸留水で洗浄し、ビーズの放射能
をカウンターで測定した。

【００５３】図４は本比較例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲、ＰＴＨｒＰの濃度が４０pmol
e/l 及び２００pmole/l における測定精度（変動係数）
ならびに患者試料測定値は次の通りであった。

【００５４】参考例１ 副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴ
Ｈ）の測定 （ａ）ＡＣＴＨ標準液の調製 シグマ社より入手したヒトＡＣＴＨを、加水分解後、ア
ミノ酸分析計（日立製作所製）で定量した値をもとに、
５％ウシ血清アルブミン、０．８％ウシガンマグロブリ
ンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて、２．２〜１４０pm
ole/l になるように調製した。

【００５５】（ｂ）抗ＡＣＴＨ単クローン抗体（第一抗
体）結合プラスチックビーズの作製 ＡＣＴＨ（シグマ社製）で免疫し得られたマウス脾臓細
胞と、マウスミエローマ細胞から得た単クローンハイブ
リドーマを腹水化し、腹水を精製することにより、抗Ａ
ＣＴＨ単クローン免疫グロブリンを作製した。作製した
抗ＡＣＴＨ単クローン免疫グロブリンを実施例１（ｂ）
に準じて、プラスチックビーズ上にコーティングした。

【００５６】（ｃ）抗ＡＣＴＨ複クローン抗体（第二抗
体）の作製 実施例１（ｃ）に準じて、シグマ社より入手したＡＣＴ
Ｈでウサギを免疫して抗ＡＣＴＨ抗血清を得、精製し、
特異性の高い抗ＡＣＴＨ複クローン抗体を得た。

【００５７】（ｄ）抗ＡＣＴＨ複クローン抗体（第二抗
体）のＡＣＴＨ（抗原性物質）との解離定数の測定 実施例１（ｄ）に準じた。図５は本参考例によるスキャ
ッチャードプロットである。また、本参考例から求めた
解離定数は次の通りであった。 解離定数 ０．００９ nmole/l

【００５８】（ｅ）第二抗体溶液の調製 前項で求めた解離定数より、第二抗体は０．１５nmole/
l の濃度で用いることとした。第二抗体は２％ウシ血清
アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で反応液中での
最終濃度が該濃度になるように希釈して用いた。

【００５９】（ｆ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン
抗体の作製 実施例１（ｆ）に準じた。

【００６０】（ｇ）ＡＣＴＨの測定 試験管に標準ＡＣＴＨ溶液（１０〜６４０pg/ml ）０．
２ml、抗ＡＣＴＨ複クローン抗体溶液０．１mlと抗ＡＣ
ＴＨ単クローン抗体結合プラスチックビーズ１個を室温
で２０時間保温した後、反応液を除去し、蒸留水で洗浄
した。次に、 ¹²⁵Ｉで標識した抗ウサギ免疫グロブリン
・ヤギ抗体溶液０．３mlを加え、室温で２０時間保温し
た後に、反応液を除去し、蒸留水で洗浄し、ビーズの放
射能をカウンターで測定した。

【００６１】図６は本参考例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲ならびにＡＣＴＨの濃度が８．
９pmole/l 及び１４０pmole/l における測定精度（変動
係数）は次の通りであった。

【００６２】参考例２ 第二抗体が第二抗体と抗原性物
質との解離定数より低い濃度でのＡＣＴＨの測定 （ａ）ＡＣＴＨ標準液の調製 参考例１（ａ）に準じた。 （ｂ）抗ＡＣＴＨ単クローン抗体（第一抗体）結合プラ
スチックビーズの作製 参考例１（ｂ）に準じた。 （ｃ）抗ＡＣＴＨ複クローン抗体（第二抗体）の作製 参考例１（ｃ）に準じた。

【００６３】（ｄ）第二抗体溶液の調製 参考例１（ｅ）に準じた。第二抗体は反応液中での最終
濃度が０．００１５nMになるように希釈して用いた。 （ｅ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体の作製 実施例１（ｆ）に準じた。 （ｆ）ＡＣＴＨの測定 参考例１（ｇ）に準じた。

【００６４】図７は本参考例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲ならびにＡＣＴＨの濃度が３６
pmole/l 及び１４０pmole/l における測定精度（変動係
数）は次の通りであった。

【００６５】参考例３ 従来のサンドイッチ法（第二抗
体を直接標識する方法）でのＡＣＴＨの測定 （ａ）ＡＣＴＨ標準液の調製 参考例１（ａ）に準じた。 （ｂ）抗ＡＣＴＨ単クローン抗体（第一抗体）結合プラ
スチックビーズの作製 参考例１（ｂ）に準じた。 （ｃ）抗ＡＣＴＨ複クローン抗体（第二抗体）の作製 参考例１（ｃ）に準じた。

【００６６】（ｄ） ¹²⁵Ｉ標識抗ＡＣＴＨ複クローン抗
体（標識第二抗体）の作製 抗ＡＣＴＨ複クローン抗体（第二抗体）を実施例１
（ｆ）に準じて標識及び精製し、２％ウシ血清アルブミ
ンを含むリン酸緩衝生理食塩水で４KBq/０．１mlになる
ように調製した。

【００６７】（ｅ）ＡＣＴＨの測定 試験管に、標準ＡＣＴＨ溶液（２．２〜１４０pmole/l
）０．２mlをとり、 ¹²⁵Ｉ標識抗ＡＣＴＨ複クローン
抗体溶液０．１mlと抗ＡＣＴＨ単クローン抗体結合プラ
スチックビーズ１個を加え、室温で２０時間保温した
後、反応液を除去し、蒸留水で洗浄し、ビーズの放射能
をカウンターで測定した。

【００６８】図８は本参考例による検量線である。ま
た、測定感度、測定範囲ならびにＡＣＴＨの濃度が８．
９pmole/l 及び１４０pmole/l における測定精度（変動
係数）は次の通りであった。

【００６９】参考例４ エンドセリン（ＥＴ）の測定 （ａ）ＥＴ標準液の調製 （株）ペプチド研究所社より入手したヒトエンドセリン
（ＥＴ）を、５％ウシ血清アルブミン、０．８％ウシガ
ンマグロブリンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて、５〜
５００pmole/l になるように調製した。

【００７０】（ｂ）抗ＥＴ単クローン抗体（第一抗体）
結合プラスチックビーズの作製 実施例１（ｂ）に準じて作製した抗ＥＴ単クローン免疫
グロブリンを、プラスチックビーズ上にコーティングし
た。

【００７１】（ｃ）抗ＥＴ複クローン抗体（第二抗体）
の作製 ＥＴでウサギを免疫して抗ＥＴ抗血清を得、精製し、特
異性の高い抗ＥＴ複クローン抗体を得た。

【００７２】（ｄ）抗ＥＴ複クローン抗体（第二抗体）
のＥＴ（抗原性物質）との解離定数の測定 実施例１（ｄ）に準じた。本参考例から求めた解離定数
は次の通りであった。 解離定数 ０．０８ nmole/l

【００７３】（ｅ）第二抗体溶液の調製 前項で求めた解離定数より、第二抗体は０．６nmole/l
の濃度で用いることとした。第二抗体は２％ウシ血清ア
ルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水で反応液中での最
終濃度が該濃度になるように希釈して用いた。

【００７４】（ｆ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン
抗体の作製 実施例１（ｆ）に準じた。 （ｇ）ＥＴの測定 試験管に、標準ＥＴ溶液（５〜５００pmole/l)０．２m
l、抗ＥＴ複クローン抗体溶液０．１mlと抗ＥＴ単クロ
ーン抗体結合プラスチックビーズ１個を室温で２０時間
保温した後、反応液を除去し蒸留水で洗浄した。次に
¹²⁵Ｉで標識した抗ウサギ免疫グロブリン・ヤギ抗体溶
液０．３mlを加え、室温で２０時間保温した後に、反応
液を除去し蒸留水で洗浄し、ビーズの放射能をカウンタ
ーで測定した。

【００７５】図９は本参考例による、総放射能量に対す
る結合放射能量の％で表わした検量線である。また、測
定感度、測定領域および測定精度は次の通りであった。 測定感度 ＜５ pmole/l 測定範囲 ５〜５００ pmole/l

【００７６】参考例５ 従来のサンドイッチ法（第二抗
体を直接標識する方法）でのＥＴの測定 （ａ）ＥＴ標準液の調製 実施例１（ａ）に準じた。 （ｂ）抗ＥＴ単クローン抗体（第一抗体）結合プラスチ
ックビースの作製 実施例１（ｂ）に準じた。 （ｃ）抗ＥＴ複クローン抗体（第二抗体）の作製 実施例１（ｃ）に準じた。

【００７７】（ｄ） ¹²⁵Ｉ標識抗ＥＴ複クローン抗体
（標識第二抗体）の作製 抗ＥＴ複クローン抗体（第二抗体）を実施例１（ｆ）に
準じて標識および精製し、２％ウシ血清アルブミンを含
むリン酸緩衝生理食塩水で４KBq/０．１mlになるように
調製した。

【００７８】（ｅ）ＥＴの測定 試験管に、標準ＥＴ溶液（５〜５００ pmole/l）０．２
mlをとり、 ¹²⁵Ｉ標識抗ＥＴ複クローン抗体溶液０．１
mlと抗ＥＴ単クローン抗体結合プラスチックビーズ１個
を加え、室温で２０時間保温した後、反応液を除去し蒸
留水で洗浄し、ビーズの放射能をカウンターで測定し
た。

【００７９】図１０は本参考例による、総放射能量に対
する結合放射能量の％で表わした検量線である。また、
測定感度、測定領域および測定精度は次の通りであっ
た。 測定感度 ２５ pmole/l 測定範囲 ２５〜５００ pmole/l

【００８０】参考例６ 心房性ナトリウム利尿ペプチド
（ＡＮＰ）の測定 第二抗体と抗原性物質との間の解離定数と測定感度の関
係を調べるために、第二抗体の濃度を変化させてＡＮＰ
を測定した。

【００８１】（ａ）ＡＮＰ標準液の調製 （株）ペプチド研究所社より入手したヒトＡＮＰを、
０．１％ウシ血清アルブミン等を含むリン酸緩衝液に
て、５０pg/ml になるように調製した。

【００８２】（ｂ）抗ＡＮＰ単クローン抗体（第一抗
体）結合プラスチックビーズの作製 実施例１（ｂ）に準じて作製した抗ＡＮＰ単クローン免
疫グロブリンを、プラスチックビーズ上にコーティング
した。

【００８３】（ｃ）抗ＡＮＰ複クローン抗体（第二抗
体）の作製 ＡＮＰでウサギを免疫して抗ＡＮＰ抗血清を得、精製
し、特異性の高い抗ＡＮＰ複クローン抗体を得た。

【００８４】（ｄ）抗ＡＮＰ複クローン抗体（第二抗
体）のＡＮＰ（抗原性物質）との解離定数の測定 実施例１（ｄ）に準じた。本参考例から求めた解離定数
は次の通りであった。 解離定数 ０．０７８ nmole/l

【００８５】（ｅ）第二抗体溶液の調製 前項で求めた解離定数より、第二抗体は０．００１５〜
１５ nmole/lの濃度で用いることとした。第二抗体は、
０．１％ウシ血清アルブミン等を含むリン酸緩衝液で反
応液中での最終濃度が該濃度になるように希釈して用い
た。

【００８６】（ｆ） ¹²⁵Ｉ標識抗ウサギ免疫グロブリン
抗体の作製 実施例１（ｆ）に準じた。

【００８７】（ｇ）ＡＮＰの測定 試験管に、標準ＡＮＰ溶液（５０ pg/ml）０．２ml、抗
ＡＮＰ複クローン抗体溶液（最終濃度０．００１５〜１
５ nmole/l）０．１mlと抗ＡＮＰ単クローン抗体結合プ
ラスチックビーズ１個を室温で２０時間保温した後、反
応液を除去し、蒸留水で洗浄した。次に ¹²⁵Ｉで標識し
た抗ウサギ免疫グロブリン・ヤギ抗体溶液０．３mlを加
え、室温で２０時間保温した後に、反応液を除去し蒸留
水で洗浄し、ビーズの放射能をカウンターで測定した。

【００８８】図１１は本参考例による第二抗体用量曲線
である。第二抗体の濃度が第二抗体と抗原性物質との間
の解離定数を越えた点から、ビーズの放射能が著しく向
上している。

【００８９】

【発明の効果】実施例１と比較例１を比較することによ
り、本発明の方法において、第二抗体を第二抗体と副甲
状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）の解離定数
よりも高い濃度で反応させることにより、解離定数より
も低い濃度で反応させた場合に比し、著しく高感度にな
ることは明らかである。また、従来の方法（第二抗体を
直接標識する方法）（比較例２）と比較しても、著しい
測定感度の向上がみられ、感度の低い（解離定数の大き
い）第二抗体しか得られないＰＴＨｒＰの測定を高感度
で行えることが示された。また、参考例として示した感
度の高い抗体を得ることが困難な他のペプチドホルモン
においても、本法が有用であることが示されたが、比較
的感度の高い（Kd＝９×１０^-12 mole/l）第二抗体が得
られた場合（例えば、ＡＣＴＨの場合）においても、本
発明の方法による測定感度の向上が認められた。すなわ
ち、本発明の方法において、用い得る第二抗体の感度
（第二抗体と抗原性物質の間の解離定数）が少なくとも
９×１０^-12 mole/lよりも大きい場合に、本方法は特に
効果があると考えられる。

【００９０】また、参考例６では、第二抗体の濃度が第
二抗体と抗原性物質との間の解離定数を越えた点からビ
ーズの放射能が著しく上昇した。すなわち、第二抗体の
濃度を解離定数よりも大きくして用いることが重要であ
ることが解った。以上の結果より、本発明の方法によ
り、使用可能な第二抗体の感度に依存せずに、高感度な
測定系が構築できることは明らかである。本発明によ
り、感度の高い副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴ
ＨｒＰ）の測定法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１（ｄ）で得た抗ＰＴＨｒＰ抗体のスキ
ャッチャードプロット。

【図２】実施例１で得たＰＴＨｒＰ測定の検量線。

【図３】比較例１で得たＰＴＨｒＰ測定の検量線。

【図４】比較例２で得たＰＴＨｒＰ測定の検量線。

【図５】参考例１（ｄ）で得た抗ＡＣＴＨ抗体のスキャ
ッチャードプロット。

【図６】参考例１で得たＡＣＴＨ測定の検量線。

【図７】参考例２で得たＡＣＴＨ測定の検量線。

【図８】参考例３で得たＡＣＴＨ測定の検量線。

【図９】参考例４で得たＥＴ測定の検量線。

【図１０】参考例５で得たＥＴ測定の検量線。

【図１１】参考例６で得たＡＮＰ測定系の第二抗体用量
曲線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高田 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社 筑波総合研究所内 (72)発明者 後藤 真由美 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社 筑波総合研究所内 (56)参考文献 特開 平２−205774（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 副甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｂ）
   を認識する不溶性固体上の第一抗体（Ａ）、副甲状腺ホ
   ルモン関連タンパク質（Ｂ）、及び前記第一抗体と異な
   る動物種由来の前記副甲状腺ホルモン関連タンパク質を
   認識する第二抗体（Ｃ）を、第二抗体の濃度が第二抗体
   と副甲状腺ホルモン関連タンパク質との間の解離定数よ
   りも高い濃度で反応させて免疫複合体（Ｄ）を得、次に
   この免疫複合体と、前記第二抗体と特異的に反応するプ
   ローブを放射能標識した放射能標識プローブ（Ｅ）とを
   反応させた後、固体または反応液の放射能を測定するこ
   とにより、前記副甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｂ）
   を測定することを特徴とする放射免疫測定法。
2. 【請求項２】 第二抗体の濃度が、第二抗体と副甲状腺
   ホルモン関連タンパク質との間の解離定数（Kd）に対し
   て１Kd〜１０Kdの値である、請求項１に記載の放射免疫
   測定法。
3. 【請求項３】 第二抗体と該副甲状腺ホルモン関連タン
   パク質との間の解離定数が、１０^-6〜９×１０^-12 mol
   e/lの範囲に含まれる、請求項１又は２に記載の放射免
   疫測定法。